ES2683021T3 - Compuestos activadores de la PKC para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

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Abstract

Compuesto que es un éster de ácido graso cis-poliinsaturado para su utilización en la reducción de la neurodegeneración, caracterizado por que, como mínimo. uno de los dobles enlaces en el compuesto se reemplaza por un anillo/grupo de ciclopropano, y se da a conocer en una cantidad eficaz.

Description

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DESCRIPCION
Compuestos activadores de la PKC para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas SECTOR DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a compuestos y composiciones para activar una isoforma de la proteina quinasa C (PKC). La presente divulgacion tambien da a conocer procedimientos para reducir la neurodegeneracion y para el tratamiento de enfermedades neurologicas, incluidas la enfermedad de Alzheimer y el accidente cerebrovascular, que no estan cubiertas por el alcance de las reivindicaciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Activadores de la PKC en la enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular y trastornos depresivos
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la disminucion progresiva de la memoria y las funciones cognitivas. La demencia asociada con la EA se conoce como demencia senil del tipo Alzheimer (DSTA) en uso con la enfermedad de Alzheimer. La EA se caracteriza clinicamente por la perdida progresiva de la memoria, la cognicion, el razonamiento, el juicio y la estabilidad emocional, que conduce gradualmente a un deterioro mental profundo y, en ultima instancia, a la muerte. Aunque existen muchas hipotesis para los posibles mecanismos de la EA, una teoria central es que la formacion y acumulacion excesiva de peptidos beta-amiloides (Ap) toxicos afecta directa o indirectamente a diversos eventos celulares y conduce a dano neuronal y muerte celular. Selkoe, Neuron. 1991 ;6(4):487-98 1991; Selkoe, J Clin Invest. 2002; 110(10):1375—81.
La EA es un trastorno progresivo con una duracion media de alrededor de 8-15 anos entre el inicio de los sintomas clinicos y la muerte. Se cree que la EA representa la septima causa medica mas comun de muerte y afecta aproximadamente a 5 millones de personas en Estados Unidos. Se espera que la prevalencia alcance los 7,7 millones para el ano 2030. Aproximadamente 1 de cada 8 personas mayores de 65 anos, el 13% de esta poblacion, tienen EA (Alzheimer's Association 2008 Alzheimer's Disease Facts and Figures). La EA actualmente afecta a alrededor de 15 millones de personas en todo el mundo (incluyendo todas las razas y grupos etnicos) y, debido al aumento relativo de las personas mayores, en la poblacion es probable que su prevalencia aumente en las proximas dos o tres decadas. La Ea es actualmente incurable.
La proteina quinasa C (PKC) es una de las familias de genes mas grandes de proteina quinasa. Varias isozimas de la PKC se expresan en el cerebro, incluidas PKC, PKCp1, PKCpIl, PKCS, PKCe y PKCy. La PKC es principalmente una proteina citosolica, pero con la estimulacion se transloca a la membrana. Se ha demostrado que la PKC participa en numerosos procesos bioquimicos relevantes para la enfermedad de Alzheimer. La activacion de la PKC tambien tiene un papel crucial en el aprendizaje y la mejora de la memoria y se ha demostrado que los activadores de la PKC aumentan la memoria y el aprendizaje. Sun y Alkon, Eur J Pharmacol. 2005;512:43-51; Alkon y otros, Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102:16432-16437. Tambien se ha demostrado que la activacion de la PKC induce sinaptogenesis en el hipocampo de rata, lo que sugiere el potencial de antiapoptosis y sinaptogenesis mediada por PKC durante las afecciones de neurodegeneracion. Sun y Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(36): 13620-13625. El tratamiento postisquemico/hipoxico con briostatina-1, un activador de la PKC, rescato eficazmente los deficits inducidos por la isquemia en la sinaptogenesis, la actividad neurotrofica y el aprendizaje espacial y la memoria. Sun y Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2008. Este efecto se acompana de aumentos en los niveles de las proteinas sinapticas espiniofilina y sinaptofisina y cambios estructurales en la morfologia sinaptica. Hongpaisan y Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:19571-19576. La sinaptogenesis inducida por briostatina para la memoria asociativa a largo plazo tambien esta regulada por la activacion de la PKC. Hongpaisan y Alkon, PNAS 2007. La PKC tambien activa la produccion de neurotrofinas. Las neurotrofinas, particularmente el factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF) y el factor de crecimiento neural (NGF), son factores de crecimiento clave que inician la reparacion y el recrecimiento de neuronas danadas y sinapsis. La activacion de algunas isoformas de la PKC, particularmente la PKC y la PKCa, protege contra la lesion neurologica, muy probablemente regulando por aumento la produccion de neurotrofinas. Weinreb y otros, FASEB Journal. 2004;18:1471-1473). Tambien se ha notificado que los activadores de la PKC inducen la expresion de la tirosina hidroxilasa e inducen la supervivencia neuronal y el sobrecrecimiento de neuritas. Du y lacovitti, J. Neurochem. 1997; 68:564-69; Hongpaisan y Alkon, PNAS 2007; Lallemend y otros, J. Cell Sci. 2005; 118: 4511-25.
La EA tambien se caracteriza por hiperfosforilacion de tau. Tau se expresa principalmente en el cerebro, donde regula la orientacion y la estabilidad de los microtubulos en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. En la EA, la tau soluble normal se transforma en filamentos helicoidales apareados insolubles. Esto esta relacionado con el cambio postraduccional en tau, principalmente la hiperfosforilacion de tau por una serie de proteinas quinasas. Los estudios han demostrado que el Ap sintetico promueve la fosforilacion de tau a traves de la activacion de la glucogeno sintasa quinasa-3 GSK-3. Wang y otros, Journal of Neurochemistry. 2006; 98(4): 1167-1175. Se ha demostrado que la activacion de la PKC protege a las neuronas del hipocampo primario de rata de la neurotoxicidad mediada por Ap, a traves de la inhibicion de la GSK-3p. Garrido y otros, FASEB J. 2002: 1982.
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La PKC tambien activa la enzima convertidora de TNF-alfa (TACE, tambien conocida como ADAM17), que es una enzima que participa en la conversion proteolitica de la proteina precursora amiloide (APP) ligada a la membrana en su forma soluble no patogena, conocida como APP-alfa soluble o sAPPa. Alkon y otros, Trends in Pharmacological Sciences. 2007; 28(2): 51-60; Hurtado y otros, Neuropharmacology. 2001; 40(8): 1094-1102. Estas enzimas productoras de sAPPa se denominan genericamente alfa-secretasas. La activacion de TACE por la PKC tambien reduce los niveles celulares de Ap patogenico, que se produce por la escision de la APP por la enzima beta- secretasa (BACE). Esto se debe, probablemente, al hecho de que el sitio de escision de TACE esta dentro del dominio Ap de la APP. Se ha demostrado que la sobreexpresion de PKCe aumenta selectivamente la actividad de la enzima convertidora de endotelina (ECE), que degrada el Ap. Choi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(21): 8215-8220. Ademas, se ha descubierto que las concentraciones subnanomolares de briostatina y un potente analogo sintetico (picolog), ambos activadores de la PKC, causan la estimulacion de vias no amiloidogenicas aumentando la TaCe y, por lo tanto, disminuyendo la cantidad de Ap toxico producido. Khan y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009; 34(2):332-9.
La reduccion de los niveles de Ap es un objetivo terapeutico principal en la enfermedad de Alzheimer. Se ha especulado que la inhibicion de la formacion de Ap por los activadores de la PKC puede estar producida por la competencia de TACE y BACE por su sustrato comun, la APP.
La estrategia de activacion de a-secretasas mediada por la PKC tiene la ventaja de tres consecuencias beneficiosas paralelas en la EA: aumentar la produccion de sAPP-a y reducir el Ap, mejorar la memoria a traves de la fosforilacion mediada por PKC de los sustratos aguas abajo y disminuir la fosforilacion de tau mediante la inhibicion de GSK-3p.
Los pacientes con EA ya tienen niveles reducidos de fosforilacion mediada por PKCa/£ de Erk1/2, un sustrato principal de la PKC aguas abajo. Khan y Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103:13203-13207. Ademas, la aplicacion de Ap a los fibroblastos normales reduce la actividad de PKC porque el Ap regula por disminucion directamente la PKC a/e. Los activadores de la PKC, especialmente los especificos para PKC a/e, contrarrestarian el efecto de Ap y, de ese modo, invertirian o evitarian los cambios inducidos por el Ap.
El accidente cerebrovascular es una de las principales causas de discapacidad y muerte en Estados Unido, aunque existen opciones terapeuticas limitadas. Se ha demostrado que varias isoformas de la PKC tienen un papel central en la mediacion del dano isquemico y de reperfusion despues del accidente cerebrovascular. Los estudios con modelos experimentales de accidente cerebrovascular, genetica de raton e inhibidores y activadores peptidicos selectivos han demostrado que la PKCe esta implicada en la induccion de tolerancia isquemica y previene el dano, mientras que la PKCS y y estan implicadas en la lesion. Takayoshi y otros, Stroke. 2007; 38(2):375-380; y Bright y otros, Stroke. 2005;36: 2781. Un posible mecanismo para el efecto isquemico protector de la PKCe es que la PKCe mantiene la funcion mitocondrial a traves de la actividad de ERK y mediando los canales de potasio sensibles a ATP mitocondriales inducidos por adenosina. Otro mecanismo potencial es que la PKCe provoca un efecto neuroprotector a traves de la induccion de COX-2. Kim y otros, Neuroscience. 2007; 145(3): 931-941. La prostaglandina E2 (PGE2), producto de la actividad de la COX-2, conduce a la neuroproteccion en la isquemia cerebral. Tal como se ha mencionado anteriormente, el tratamiento postisquemico/hipoxico con briostatina-1, un activador de la PKC, rescato eficazmente los deficits inducidos por la isquemia en la sinaptogenesis, la actividad neurotrofica y el aprendizaje espacial y la memoria. Sun y Alkon, Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(36): 13620-13625.
Se ha demostrado que la proteina Ap circulante esta elevada en pacientes con accidente cerebrovascular isquemico agudo. El nivel de Ap-40 circulante estaba marcadamente elevado en pacientes con accidente cerebrovascular isquemico, en comparacion con los controles. Lee y otros, Journal of Neural Transmission. 2005; 112(10): 1371-79. Tambien se ha demostrado una fuerte asociacion positiva entre el Ap vascular que se acumula progresivamente y los aumentos en los pacientes con EA del grosor de la pared de la arteriola y la corteza frontal, lo que sugiere que la angiopatia progresiva asociada con Ap a nivel arteriolar dana el aparato contractil y la autorregulacion del flujo sanguineo cerebral, haciendo que los capilares aguas abajo sean vulnerables al dano. Stopa y otros, Stroke. 2008;39:814.
Ademas, algunas formas de accidente cerebrovascular estan causadas por el Ap, tales como las asociadas con la angiopatia amiloide cerebral, tambien conocida como angiopatia amiloide congofilica (AAC). Este trastorno es una forma de angiopatia en la que los mismos depositos de Ap que se encuentran en la EA se acumulan en las paredes de las leptomeninges y los vasos sanguineos corticales cerebrales superficiales del cerebro. La deposicion de amiloide predispone al fallo de estos vasos sanguineos, lo que aumenta el riesgo de un accidente cerebrovascular hemorragico. La AAC tambien se asocia con ataques isquemicos transitorios, hemorragia subaracnoidea, sindrome de Down, necrosis posterior a la irradiacion, esclerosis multiple, leucoencefalopatia, encefalopatia espongiforme y demencia pugilistica.
La evidencia sugiere que las PKCa y e son las isoformas de PKC mas importantes para provocar los efectos beneficiosos antes mencionados en la EA, el accidente cerebrovascular y los trastornos depresivos. Se ha demostrado que la inhibicion antisentido de la PKCa bloquea la secrecion de sAPPa, mientras que la PKCe es la isozima que mas eficazmente suprime la produccion de Ap. Racci y otros, Mol. Psychiatry. 2003; 8:209-216; y Zhu y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001; 285: 997-1006. De este modo, los activadores de PKC especificos
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de isoforma son altamente deseables como potenciales farmacos anti-Alzheimer. Los activadores especificos son preferentes con respecto a compuestos, tales como la briostatina, que muestran menos especificidad debido a que la activacion no especifica de PKC8 o p puede producir efectos secundarios indeseables.
Ademas, la PKs tambien se expresa a niveles muy bajos en todos los tejidos normales, excepto en el cerebro. Mischak y otros, J Biol. Chem. 1993; 268: 6090-6096; Van Kolen y otros, J Neurochem. 2008;104:1-13. La gran abundancia de PKCs en las fibras nerviosas presinapticas sugiere un papel en el sobrecrecimiento de las neuritas o la liberacion de neurotransmisores. Shirai y otros, FEBS J. 2008; 275: 3988-3994). Por lo tanto, los efectos de los activadores de PKCs especificos estarian restringidos en gran medida al cerebro y es poco probable que produzcan efectos secundarios perifericos indeseados.
PUFA como activadores de la PKC
Algunos PUFA, tales como el acido araquidonico (vease la figura 1), se conocen desde hace muchos anos como activadores naturales de la PKC. El acido docosahexaenoico (DHA) tambien es un conocido activador de la PKC y recientemente se ha demostrado que ralentiza la acumulacion de proteinas Ap y tau asociadas con las placas y ovillos que obstruyen el cerebro implicados en la EA. Sahlin y otros, Eur J Neurosci. 2007; 26(4):882-9.
Kanno y otros describieron el efecto del acido 8-[2-(2-pentil-ciclopropilmetil)ciclopropil]-octanoico (DCP-LA), un derivado del acido linoleico recien sintetizado con anillos de ciclopropano en lugar de dobles enlaces cis, en la actividad de la proteina quinasa C (PKC). Journal of Lipid Research. 2007; 47: 1146-1156. La PKCs activada por DCP-LA, con una potencia superior a 7 veces sobre otras isozimas PKC. Esto indica que DCP-LA es altamente especifico para pKCe. Este compuesto tambien facilito la transmision sinaptica del hipocampo al potenciar la actividad de los receptores presinapticos de acetilcolina en las neuronas o terminales glutamatergicos. Sin embargo, DCP-LA requiere concentraciones relativamente altas para producir su efecto maximo.
El documento WO 2002/50113 de Nishizaki y otros da a conocer compuestos de acido carboxilico y sus correspondientes sales que tienen anillos de ciclopropano para la potenciacion similar a LTP de la transmision sinaptica o para su utilizacion como farmaco potenciador de la cognicion o un farmaco para tratar la demencia. Sus ejemplos sinteticos dan a conocer la preparacion de esteres, pero sus resultados experimentales ensenan la utilizacion de acidos libres. La razon es que el grupo de acido carboxilico del material de partida de acido graso reaccionaria con el dietilcinc utilizado en la reaccion de Simmons-Smith. El ester metilico actua como un grupo protector y se puede escindir por hidrolisis o dejar que permanezca, segun sea necesario.
Los inconvenientes con el hallazgo de la tecnica anterior incluyen la necesidad de administrar altas concentraciones para lograr los efectos anteriores, la activacion no especifica de isoformas de la PKC, o metabolismo rapido y secuestro de PUFA no modificados en tejidos grasos y otros organos donde se incorporan a los trigliceridos y los quilomicrones. J Pharmacobiodyn. 1988;11(4):251-61. Ademas, la utilizacion de PUPA no modificados tendria una miriada de efectos secundarios adversos. Por ejemplo, el acido araquidonico es un precursor bioquimico de las prostaglandinas, los tromboxanos y los leucotrienos, que tienen potentes efectos proinflamatorios. Esto seria indeseable para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer donde la patologia probablemente implica inflamacion. Otros acidos grasos esenciales tambien pueden poseer una multitud de otros efectos biologicos, incluida la potenciacion de la senalizacion del oxido nitrico, los efectos antiinflamatorios y la inhibicion de la HMG- CoA reductasa, que interferiria con la biosintesis del colesterol.
Debido a las limitadas opciones existentes para tratar tanto la EA como el accidente cerebrovascular, se necesitan nuevas terapias que puedan activar selectivamente solo las isoformas de la PKC que provocan neuroproteccion.
PUFA y MUFA y enfermedad
Un numero creciente de estudios ha sugerido que los PUFA omega-3 pueden ser beneficiosos para otros trastornos de la alteracion del estado de animo, tal como la depresion clinica, el trastorno bipolar, los trastornos de personalidad, la esquizofrenia y los trastornos por deficits de atencion. Ross y otros, Lipids Health Dis. 2007; 18;6:21. Existe una gran cantidad de evidencia que relaciona los acidos grasos omega-3, particularmente los acidos docosahexaenoico y eicosapentaenoico, y un equilibrio saludable de acidos grasos omega-3 a omega-6, para reducir el riesgo de depresion. Logan y otros. Lipids Health Dis. 2004; 3: 25. Se ha descubierto que los niveles de acidos grasos omega-3 eran mensurablemente bajos y la proporcion entre acidos grasos omega-6 y acidos grasos omega-3 era particularmente alta en un estudio clinico de pacientes hospitalizados por depresion. Un estudio reciente demostro que habia un deficit selectivo de acido docosahexaenoico en la corteza orbitofrontal de pacientes con trastorno depresivo mayor. McNamara y otros, Biol Psychiatry. 2007;62(1):17-24. Varios estudios tambien han demostrado que los sujetos con trastorno bipolar tienen niveles mas bajos de acidos grasos omega-3. En varios estudios recientes, se demostro que los acidos grasos omega-3 son mas eficaces que el placebo para la depresion tanto en adultos como en ninos con depresion bipolar. Osher y Belmaker, CNS Neurosci Ther. 2009;15(2):128-33; Turnbull y otros Arch Psychiatr Nurs. 2008;22(5):305-11.
Una amplia investigacion tambien indica que los acidos grasos omega-3 reducen la inflamacion y ayudan a prevenir
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los factores de riesgo asociados con enfermedades cronicas, tales como cardiopatia, cancer, enfermedad inflamatoria intestinal y artritis reumatoide. Calder y otros, Biofactors. 2009;35(3):266-72; Psota y otros, Am J Cardiol. 2006;98(4A):3i-18i; Wendel y otros, Anticancer Agents Med Chem. 2009;9(4):457-70. La publicacion recuperada de Internet en pubchem.ncbi.nlm.nih.gov "CID 554084" da a conocer el ester de acido graso poliinsaturado cis 4-(2-([2-((2-[(2-pentilciclopropil)metil]ciclopropil)metil)ciclopropil]metil)ciclopropil)butanoato de metilo.
Tambien se ha demostrado que los acidos grasos monoinsaturados son beneficiosos en los trastornos. Existe un buen respaldo cientifico para las dietas de MUFA como una alternativa a las dietas bajas en grasa para la terapia de nutricion medica en la diabetes de tipo 2. Ros, American Journal of Clinical Nutrition. 2003; 78(3): 617S-625S. High— monounsaturated fatty acid diets lower both plasma cholesterol and triacylglycerol concentrations. Kris-Etherton y otros, Am J Clin Nutr. 1999 Dec;70(6):1009-15.
DESCRIPCION BREVE DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Figura 1. Estructuras de moleculas contempladas para su utilizacion de acuerdo con la presente invencion (BR-101 a BR-118).
Figura 2. La figura 2 muestra los resultados de una activacion de PKCs in vitro por BR-101 (DCP-LA) y dos derivados menos activos, BR-102 y BR-103.
Figura 3. La figura 3 muestra la activacion de PKCs con diversas concentraciones de BR-111 (ester metilico de DHA-CP6); BR-114 (ester metilico EPA-CP5); y BR-115 (ester metilico AA-CP4).
Figura 4. La figura 4 muestra la activacion de PKCs con diversas concentraciones de otros esteres metilicos de acidos grasos ciclopropanados y epoxidados: alcohol linolenilico ciclopropanado (BR-104); alcohol linoleilico ciclopropanado (BR-105); acido epoxiestearico (BR-116); ester metilico del acido vemolico (BR-117); y ester metilico del acido vemolico ciclopropanado (BR-109).
Figura 5. La figura 5 muestra un transcurso de tiempo de activacion de PKC mediante diversas concentraciones de briostatina en neuronas de hipocampo de rata H19-7/IGF-IR.
Figura 6. La figura 6 muestra un curso de tiempo de activacion de PKC en neuronas primarias de hipocampo de rata por briostatina y DCP-LA.
Figura 7. La figura 7a y b representan niveles disminuidos de Ap intracelular ((7a) o secretado (7b) en celulas neuro2a (N2A) expuestas a los activadores de la PKC briostatina, BR-101 (DCP-lA), o BR-111 (DHA-CP6).
Figura 8. La figura 8 muestra el efecto de BR-111 (DHA-CP6) (0,1 a 10 pM) en la degradacion de Ap exogenamente aplicado en celulas de neuroblastoma SH-SY5Y.
Figura 9. Las figuras 9a-c representan los efectos de los activadores de PKC briostatina, BR-101 (DCP-LA) y BR-111 (DHA-CP6) sobre la actividad TACE en celulas de neuroblastoma N2a transfectadas con APPS/PSiD humana (9a); los efectos de diversas concentraciones de briostatina en la actividad de TACE en neuronas primarias corticales de rata (9b) y los efectos de BR-111 (DHA-CP6) sobre la actividad de TACE en neuronas primarias corticales de rata (9c).
Figura 10. La figura 10 muestra la activacion de la enzima convertidora de endotelina (ECE) por los activadores de PKC briostatina (0,27 nM), BR-101 (DCP-LA) (1 pM), BR-111 (DHA-CP6) (1 pM) o etanol en celulas de neuroblastoma SH-SY5Y.
Figura 11. Las figuras 11a-b representan el efecto de BR-101 (DCP-LA) y BR-111 (DHA-CP6) (1-100 pM) sobre la supervivencia celular y la proliferacion celular, respectivamente, de celulas de neuroblastoma SH-SY5Y.
La presente invencion da a conocer un compuesto que es un ester de acidos grasos cis-poliinsaturados (PUFA) caracterizado por que, como minimo, uno de los dobles enlaces en el compuesto se reemplaza por un anillo/grupo de ciclopropano para utilizar en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o un trastorno del estado de animo o en la reduccion de la neurodegeneracion de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 10. Ademas, se dan a conocer, adicionalmente, compuestos seleccionados de ester metilico del acido docosahexaenoico ciclopropanado (BR-111), ester metilico del acido eicosapentaenoico (BR-114) o una combinacion de los mismos segun la reivindicacion 18 y composiciones que comprenden tales compuestos segun la reivindicacion 8. Ademas, tambien se dan a conocer, composiciones para su utilizacion en neurodegeneracion que comprenden un compuesto seleccionado de ester metilico de acido docosahexaenoico ciclopropanado (BR-111), ester metilico de acido eicosapentaenoico (BR-114), ester metilico de acido araquidonico ciclopropanado (BR-115) o una combinacion de los mismos de acuerdo con la reivindicacion 9. Estos compuestos activan la PKCs a concentraciones nanomolares, lo que los hace excelentes candidatos para el tratamiento de la EA, el accidente cerebrovascular y otras enfermedades neurologicas en las que la PKCs es neuroprotectora.
Definiciones
Un "acido graso" es un acido carboxilico con una cadena alifatica no ramificada que contiene de aproximadamente 4 a 30 carbonos; la mayoria de los acidos grasos de cadena larga contienen entre 10 y 24 carbonos. Los acidos grasos pueden ser saturados o insaturados. Los acidos grasos saturados no contienen dobles enlaces ni otros grupos funcionales a lo largo de la cadena. Los acidos grasos insaturados contienen uno o mas grupos funcionales alquenilo, es decir, dobles enlaces, a lo largo de la cadena. La expresion "acido graso poliinsaturado" o "PUFA" significa un acido graso que contiene mas de un doble enlace. Hay tres clases de PUFA, PUFA omega-3, PUFA
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omega-6 y PUFA omega-9. En los PUFA omega-3, el primer doble enlace se encuentra a 3 carbonos del ultimo carbono de la cadena (el carbono omega). En los PUFA omega-6, el primer doble enlace se encuentra a 6 carbonos de la cadena y en los PUFA omega-9 el primer doble enlace esta a 9 carbonos del carbono omega.
Los PUFA tambien se llaman "acidos grasos polienoicos". Tal como se utiliza en el presente documento, el termino PUFA incluye acidos grasos tanto naturales como sinteticos. Una fuente importante de PUFA proviene de peces marinos y aceites vegetales derivados de cultivos de semillas oleaginosas, aunque los PUFA encontrados en aceites vegetales comercialmente desarrollados se limitan, tipicamente, a acido linoleico y acido linolenico (18:3 delta 9,12,15).
UN "c/s-PUFA "es uno en el que los atomos de carbono adyacentes estan en el mismo lado del doble enlace.
La abreviatura X:Y indica un grupo acilo que contiene X atomos de carbono e Y dobles enlaces. Por ejemplo, el acido linoleico se abreviaria 18:2.
Un "polieno interrumpido por metileno" se refiere a un PUFA que tiene dos o mas dobles enlaces cis separados entre si por un solo grupo metileno.
Un "polieno no interrumpido con metileno" o "acido graso interrumpido con polimetileno" se refiere a un PUFA que tiene dos o mas dobles enlaces cis separados por mas de un grupo metileno.
Un "acido graso monoinsaturado" (MUFA) es un acido graso que tiene un solo doble enlace en la cadena de acido graso y todos los atomos de carbono restantes en la cadena son de enlace sencillo. Ejemplos de MUFA incluyen acido oleico, acido miristoleico y acido palmitoleico.
Un "acido graso monoinsaturado cis" significa que los atomos de hidrogeno adyacentes estan en el mismo lado del doble enlace.
Los acidos grasos conjugados, tales como acido linoleico conjugado (acido 9-cis, 11-transoctadecadienoico) poseen un dieno conjugado, es decir, dos enlaces dobles en carbonos adyacentes. Alguna evidencia sugiere que el acido linoleico conjugado tiene actividad antitumoral.
Ejemplos de PUFA incluyen acido linoleico (acido 9,12-octadecadienoico); acido Y-linolenico (acido GLA, 6,9,12- octadecatrienoico); acido a-linolenico (acido 9,12,15-octadecatrienoico); acido araquidonico (acido 5,8,11,14- eicosatetraenoico); acido eicosapentanoico (EPA; acido 5,8,11,14,17-eicosapentanoico); acido docosapentaenoico (DPA; acido 7,10,13,16,19-docosapentaenoico); acido docosahexaenoico (DhA; acido 4,7,10,13,16,19- docosahexanoico); y acido estearidonico (acido 6,9,12,15-octadecatetraenoico).
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "ciclopropano" se refiere a una molecula de cicloalcano con la formula molecular C3H6, que consiste en tres atomos de carbono unidos entre si para formar un anillo, teniendo cada atomo de carbono dos atomos de hidrogeno.
Un "epoxido" se refiere a un eter ciclico con tres atomos en el anillo.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "derivado de PUFA" se refiere a un PUFA, o alcohol o ester del mismo, en el que, como minimo, uno de los dobles enlaces se ha ciclopropanado o epoxidado.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "derivado de MUFA" se refiere a un MUFA, o alcohol o ester del mismo, en el que el doble enlace se ha ciclopropanado o epoxidado.
La "activacion selectiva" de PKCe significa que el compuesto derivado de PUFA de la presente invencion activa PKCe en una extension detectable mayor que cualquier otra isozima de PKC. En realizaciones especificas, el derivado de PUFA activa la PKCe, como minimo, 1, 2 o 5 sobre las otras isozimas de PKC, tal como se mide utilizando, por ejemplo, el ensayo de activacion de la PKC descrito en el presente documento. Tras la activacion, las enzimas proteina quinasa C son translocadas a la membrana plasmatica por las proteinas RACK (receptor unido a membrana para proteinas de proteinas quinasas C activadas). En general, tras la activacion, las enzimas RACK translocan las enzimas proteina quinasa C a la membrana plasmatica. Otros indicios de activacion de la PKC incluyen la fosforilacion en residuos de serina/treonina C-terminales especificos por la quinasa dependiente de fosfatidilinositol-trisfosfato (PDK1), con, como minimo, dos fosforilaciones adicionales y/o autofosforilaciones de secuencias bien conservadas en cada enzima de la familia de PKC. La activacion de PKC se describe en Sun y Alkon, Recent Patents CNS Drug Discov. 2006; 1(2): 147-56.
“Neurodegeneracion” se refiere a la perdida progresiva de la estructura o la funcion de las neuronas, incluyendo la muerte de las neuronas.
Para los fines de la presente invencion, una "enfermedad neurologica" se refiere a cualquier enfermedad del sistema
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nervioso central (SNC) o del sistema nervioso periferico (SNP) que esta asociada con el procesamiento p- amiloidogenico de la APP. Esto puede dar como resultado defectos en las neuronas o en las celulas gliales, incluyendo, pero sin limitaciones, perdida neuronal, degeneracion neuronal, desmielinizacion neuronal, gliosis (es decir, astrogliosis), o acumulacion neuronal o extraneuronal de proteinas aberrantes o toxinas (por ejemplo, Ap).
Una enfermedad neurologica de ejemplo es la EA. Otra enfermedad neurologica de ejemplo es la angiopatia congenita (AAC), tambien denominada angiopatia amiloide cerebral.
La expresion "enfermedad de Alzheimer" o "EA" se refiere a cualquier afeccion en la que la deposicion de Ap terminara llegando a las celulas del sistema nervioso central. En una realizacion no limitante, el peptido Ap, particularmente Ap1-42, se forma a partir del metabolismo p-amiloidogenico de la APP. La EA puede ser heredable en una manifestacion familiar, o puede ser esporadica. En el presente documento, la EA incluye factores familiares, esporadicos, asi como intermedios y subgrupos de los mismos en funcion de las manifestaciones fenotipicas
Otra enfermedad neurologica es el sindrome de Down (SD). Los sujetos con SD invariablemente desarrollan (en su tercera o cuarta decada) placas de amiloide cerebral (Ap) y ovillos neurofibrilares (NFT), las lesiones caracteristicas de la EA. Estudios recientes han demostrado que el Ap42 es la forma mas temprana de esta proteina depositada en los cerebros de sindrome de Down y puede verse en sujetos de tan solo 12 anos de edad, y que el Ap soluble se puede detectar en los cerebros de sujetos con SD ya a las 21 semanas de edad gestacional, mucho antes de la formacion de placas de AP. Gyure y otros, Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 2000; 125:. 489-492.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "sujeto" incluye un mamifero.
La frase "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiologicamente tolerables y normalmente no producen reacciones adversas cuando se administran a un sujeto. Preferentemente, tal como se utiliza en el presente documento, la expresion “farmaceuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para utilizacion en animales y, mas particularmente, en seres humanos. La expresion "vehiculo farmaceuticamente aceptable" significa una composicion quimica con la que se puede combinar el ingrediente activo y que, despues de la combinacion, puede utilizarse para administrar el principio activo a un sujeto y puede hacer referencia a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehiculo con el cual se administra el compuesto.
Las expresiones "dosis terapeuticamente eficaz" y "cantidad eficaz" se refieren a una cantidad de un agente terapeutico que da como resultado una respuesta terapeutica medible. Una respuesta terapeutica puede ser cualquier respuesta que un usuario (por ejemplo, un medico) reconocera como una respuesta eficaz a la terapia, incluyendo la mejoria de los sintomas y de los marcadores clinicos indirectos. Por lo tanto, una respuesta terapeutica generalmente sera una mejora o inhibicion de uno o mas sintomas de una enfermedad o afeccion, por ejemplo, EA. Una respuesta terapeutica medible tambien incluye un hallazgo de que un sintoma o enfermedad se previene o tiene un inicio retardado o es atenuada de otra manera por el agente terapeutico.
Los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" generalmente significaran un grado de error aceptable para la cantidad medida dada la naturaleza o precision de las mediciones. Normalmente, los grados de error de ejemplo estan dentro del 20 por ciento (%), preferentemente dentro del 10%, y, mas preferentemente, dentro del 5% de un valor o intervalo de valores dado. Como alternativa y, particularmente, en sistemas biologicos, los terminos "alrededor de" y "aproximadamente" pueden significar valores que estan dentro de un orden de magnitud, preferentemente dentro de 5 veces y, mas preferentemente, dentro de 2 veces de un valor dado. Las cantidades numericas dadas en el presente documento son aproximadas a menos que se indique lo contrario, lo que significa que el termino "alrededor de" o "aproximadamente" puede deducirse cuando no se indica expresamente.
La presente invencion se refiere a compuestos que son ester de acido graso cis-poliinsaturado para su utilizacion en la reduccion de la neurodegeneracion y en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o un trastorno del estado de animo segun las reivindicaciones 1 y 10, caracterizado por que, como minimo, uno de los dobles enlaces en el compuesto es reemplazado por un anillo/grupo de ciclopropano. Ademas, la presente invencion se refiere a compuestos de ester metilico de acido docosahexaenoico ciclopropano (BR-111), ester metilico del acido eicosapentaenoico ciclopropano (BR 114), segun la reivindicacion 18, y composiciones que comprenden dichos compuestos, segun la reivindicacion 8. Ademas, se dan a conocer, adicionalmente, composiciones para su utilizacion en neurodegeneracion que comprende un compuesto seleccionado de ester metilico de acido docosahexaenoico ciclopropanado (BR-111), ester metilico de acido eicosapentaenoico (BR-114), ester metilico de acido araquidonico ciclopropanado (BR-115) o una combinacion de los mismos segun la reivindicacion 9. La presente divulgacion incluye la utilizacion de derivados ciclopropanados de PUFA de la invencion y otros derivados ciclopropanados de MUFA y derivados epoxidados de PUFA o MUFA que no estan cubiertos por el alcance de las reivindicaciones, en las que uno, algunos o todos los dobles enlaces son reemplazados por un grupo ciclopropano o un grupo epoxido. La funcion terminal puede ser un acido carboxilico libre o un ester metilico, ester etilico, o algun otro ester alquilico con un alcohol alifatico o aromatico. Este alcohol especificamente tambien puede incluir glicerol y derivados del mismo. Los derivados de glicerol son biologicamente importantes porque los acidos grasos se
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encuentran con mayor frecuencia conjugados con glicerol en forma de fosfatidilcolina, fosfatidilserina o acidos fosfatidicos. Por ejemplo, los triacilgliceroles son compuestos en los que los grupos carboxilo de los acidos grasos se esterifican a los hidroxilos de los tres carbonos que se encuentran en el glicerol se denominan triacilgliceroles o trigliceridos.
El objetivo de esterificar el acido carboxilico es facilitar el transporte a traves de la barrera hematoencefalica eliminando la carga negativa. El objetivo de un grupo de alcohol es tambien facilitar el transporte a traves de la barrera hematoencefalica.
En una realizacion, el acido graso que forma la base para los compuestos utilizados en la presente invencion es un acido graso poliinsaturado que tiene la siguiente estructura:
CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH
en la que X esta entre 2 y 6, e Y esta entre 2 y 6, e incluye polienos interrumpidos con metileno o polimetileno. Ejemplos de acidos grasos poliinsaturados incluyen acido linoleico, Y-linoleico, acido araquidonico y acido adrenico que tienen las siguientes estructuras:
Linoleico
Y-Linoleico
Araquidonico
Adrenico
CH3(CH2)4(CH= CHCH2)2(CH2)6COOH CH3(CH2)4(CH= CHCH2)3(CH2)3COOH CH3(CH2)4(CH= CHCH2)4(CH2)2COOH CH3(CH2)4(CH= CHCH2)4(CH2)4COOH
Estos son PUFA omega-6.
En otra realizacion, el acido graso que forma la base para los compuestos utilizados en la presente invencion es un acido graso poliinsaturado que tiene la siguiente estructura:
CH3CH2(CH= CHCH2)x(CH2)yCOOH
en la que X esta entre 2 y 6, e Y esta entre 2 y 6, e incluye polienos interrumpidos con metileno o polimetileno. Ejemplos de acidos grasos poliinsaturados incluyen acido a-lineoleico, acido docosahexaenoico, acido eicosapentaenoico, acido eicosatetraenoico que tiene las siguientes estructuras:
Alfa-linolenico
Eicosatetraenoico
Eicosapentaenoico
Docosahexaenoico
CH3CH2(CH= CHCH2)3(CH2)6COOH CH3CH2(CH=CHCH2)4(CH2)5COOH CH3CH2(CH=CHCH2)5(CH2)2COOH CH3CH2(CH=CHCH2)6(CH2)2COOH
Estos se conocen como PUFA omega-3.
En una realizacion especifica, el compuesto de la presente invencion es un ester de un c/s-PUFA, en el que el grupo hidroxilo esta reemplazado por un grupo alcoxi, y en el que, como minimo, uno de los dobles enlaces se ha ciclopropanado. El material de partida para esta realizacion tiene las siguientes estructuras:
CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOR o CH3CH2(CH= CHCH2)x(CH2)yCOOR
en la que R es el grupo alquilo de un alcohol que incluye alcoholes monohidricos y alcoholes polihidricos, incluyendo, entre otros, metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, glicerol, manitol y sorbitol.
En una realizacion adicional, el compuesto contiene, como minimo, tres dobles enlaces ciclopropanados.
El acido graso adicional que forma la base para los compuestos que no estan cubiertos por el alcance de las reivindicaciones es un acido graso monoinsaturado que tiene la siguiente estructura:
CH3(CH2)xCH=CH(CH2)yCOOH en el que X e Y son numeros impares entre 3 y 11.
Ejemplos de acidos grasos monoinsaturados que pueden ser la base de los compuestos incluyen acidos grasos cis y trans-monoinsaturados, tales como acido oleico, acido elaidico, acido obtusilico, acido caproleico, acido lauroleico, acido linderico, acido miristoleico, acido palmitoleico, acido vaccenico, acido gadoleico, acido erucico y acido petroselinico.
Un ester de acuerdo con la presente invencion, significa un monoester o un poliester. Los esteres de acidos grasos incluyen esteres de metilo, propilo y butilo, y tambien esteres resultantes de alcoholes mas complejos, tales como
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propilenglicol. En realizaciones no limitantes, R' es lineal o ramificado e incluye metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, secbutilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo, y tetradecilo. Tambien se puede formar un ester a partir de un acido graso unido a un alcohol graso en un enlace ester.
El ester puede ser un ester de alcohol, incluyendo, pero sin limitaciones al mismo, un ester de alcohol alifatico. En una realizacion, el ester de alcohol es un ester de glicerol. Los esteres de glicerol de acidos grasos incluyen ester de acido graso de glicerol, ester de acido graso de acido acetico de glicerol, ester de acido graso de acido lactico de glicerol, ester de acido graso de acido citrico de glicerol, ester de acido graso de acido succinico de glicerol, ester de acido graso de acido diacetiltartarico de glicerol, ester de acido acetico de glicerol, ester de acido graso de poliglicerol y ester de acido ricinoleico condensado con poliglicerol.
En otra realizacion especifica, el compuesto es un alcohol de un c/s-PUFA en el que, como minimo, uno de los enlaces dobles se ha ciclopropanado. En una realizacion adicional, el compuesto es un alcohol de un c/s-PUFA que contiene, como minimo, tres enlaces dobles ciclopropanados. Estos compuestos incluyen, pero no se limitan a los mismos, alcohol linoleico diciclopropano (BR-105) o alcohol linolenico triciclopropano (BR-104). En esta realizacion, R' puede ser un alcohol de cadena normal o ramificada o un alcohol fenolico.
Se da a conocer adicionalmente un compuesto que es un acido graso cis-poliinsaturado, o derivado del mismo, en el que, como minimo, uno de los dobles enlaces se reemplaza por un grupo epoxilo. El compuesto contiene, como minimo, tres dobles enlaces epoxidados.
El compuesto es un ester epoxidado de un c/s-PUFA, incluyendo, pero sin limitaciones al mismo, un ester de alcohol graso. Los esteres pueden ser los mismos esteres que los descritos anteriormente para los PUFA ciclopropanados. El alcohol puede ser un ester de alcohol alifatico, tal como glicerol.
Se da a conocer, adicionalmente, un compuesto que es un alcohol graso cis-poliinsaturado epoxidado, tal como alcohol linoleico diciclopropano o alcohol linolenico triciclopropano. Los alcoholes pueden ser los mismos que los descritos anteriormente para los PUFA ciclopropanados.
En otra realizacion, el compuesto incluye lipidos ciclopropanados o epoxidados derivados de acidos grasos cis- monoinsaturados (acidos c/s-monoenoicos), tales como acido oleico, acido elaidico, alcohol elaidico, alcohol oleico y 1 -monolinoleil rac-glicerol. Los compuestos de ejemplo incluyen alcohol eliadico ciclopropano (BR-106), acido eliadico ciclopropano (BR-107) y alcohol oleilico ciclopropano (BR-108).
Una realizacion adicional incluye lipidos ciclopropanados derivados de acidos grasos cis-monoinsaturados o acidos grasos insaturados, esteres de acidos grasos o alcoholes de acidos grasos, que contienen uno o mas residuos de epoxido, tal como ester metilico del acido vernolico ciclopropano (por ejemplo, Br-109).
En realizaciones especificas, los PUFA que forman la base de los compuestos ciclopropanados utilizados en la presente invencion incluyen, pero sin limitaciones a los mismos, acido araquidonico (AA), acido docosahexaenoico (DHA) y acido eicosapentaenoico (EPA). Los compuestos de ejemplo para su utilizacion en el procedimiento de la presente invencion incluyen el ester metilico de acido docahexaenoico hexaciclopropano (BR-111); ester metilico de acido eicosapentaenoico pentaciclopropano (BR-114); y ester metilico de acido araquidonico tetraciclopropano (BR-115).
En una realizacion especifica adicional, el compuesto es un derivado de PUFA ciclopropanado de acido docosahexaenoico que tiene la siguiente estructura:
vVWWW"
o
en la que R es H o un grupo alquilo. En una realizacion especifica, R es CH3 (BR-111 o ester metilico de DHA-CP6 o 3-(2-((2-((2-((2-((2-((2-etilciclopropil)metil)ciclopropil)metil)ciclopropil)metil)ciclopropil)metil)-
ciclopropil)metil)ciclopropil)propanoato de metilo.
En otra realizacion especifica, el derivado de PUFA tiene la siguiente estructura:
imagen1
Este compuesto es BR-114 (EPA-CP5 o ester metilico de 4-(2((2-((2-((2- etilciclopropil)metil)ciclopropil)metil)ciclopropil)metil)ciclopropil)metil)-ciclopropil)butanoato de metilo).
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En aun otra realizacion especifica, el derivado de PUFA tiene la siguiente estructura:
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Este compuesto es BR-115 (AA-CP4 o ester metilico de 4-(2((2-((2-((2- pentilciclopropil)metil)ciclopropil)metil)ciclopropil)metil)ciclopropil)metil)-ciclopropil)butanoato de metilo).
En todavia otra realizacion especifica, el derivado de PUFA tiene la siguiente estructura:
O O O O O O
vWWVVV
OR
en la que R es H o un ester de alquilo. En una realizacion especifica, R es CH3.
Los MUFA ciclopropanados o epoxidados de forma natural o derivados ester o alcohol de los mismos incluyen acido malvenico, acido vernolico y acido esterculico. Un compuesto de ejemplo es ester metilico del acido vernolico (BR-117).
Procedimientos de si'ntesis
Los acidos grasos, y esteres y alcoholes de los mismos, pueden obtenerse o prepararse a partir de la purificacion a partir de fuentes naturales, por ejemplo, aceite de pescado, aceite de linaza, soja, aceite de colza o algas, o sintetizarse utilizando una combinacion de sintesis enzimatica microbiana y sintesis quimica. Como ejemplo, los esteres metilicos de acidos grasos se pueden producir mediante la transesterificacion de trigliceridos de aceites de tipo refinado/comestible utilizando metanol y un catalizador alcalino homogeneo.
Los procedimientos de ciclopropanacion de dobles enlaces en hidrocarburos son bien conocidos. Como ejemplo, la reaccion modificada de Simmons-Smith es un procedimiento estandar para convertir enlaces dobles en ciclopropanos. Tanaka y Nishizaki, Bioorg. Med. Chem. Let. 2003; 13: 1037-1040; Kawabata y Nishimura, J Tetrahedron. 1967; 24: 53-58; y Denmark y Edwards, J Org Chem. 1991; 56: 6974. En esta reaccion, el tratamiento de alquenos con carbenoides metalicos, por ejemplo, yoduro de metileno y dietilcinc, da como resultado la ciclopropanacion del alqueno. Vease tambien, Ita y otros, Organic Syntheses. 1988; 6:327. La ciclopropanacion de esteres metilicos tambien se efectuo utilizando diazometano en presencia de acetato de paladio (II) como catalizador. Gangadhar y otros, Journal of the American Oil Chemists' Society. 1988; 65(4): 601-606.
Los procedimientos de epoxidacion tambien son bien conocidos y normalmente implican la reaccion de dioxiranos de acidos grasos en disolventes organicos. Sonnet y otros, Journal of the American Oil Chemists' Society. 1995; 72(2):199-204. Como ejemplo, se puede lograr la epoxidacion de dobles enlaces de PUFA utilizando dimetildioxirano (DMD) como agente epoxidante. Grabovskiy y otros, Helvetica Chimica Acta. 2006; 89(10): 2243-53.
Procedimientos de tratamiento
La presente divulgacion contempla el tratamiento de enfermedades neurologicas asociadas con Ap patogenico, tal como EA y accidente cerebrovascular, utilizando los derivados de PUFA dados a conocer en el presente documento. La presente divulgacion tambien contempla la prevencion de enfermedades neurologicas asociadas con Ap patogenico utilizando los derivados de PUFA dados a conocer en el presente documento. Sin estar limitado a ningun mecanismo particular, la activacion selectiva de PKCe puede dar como resultado una activacion incrementada de TACE, con una disminucion concomitante en la produccion de Ap. Sin embargo, esto parece ocurrir principalmente en celulas no neuronales, tales como fibroblastos. La activacion de PKC tambien puede reducir la hiperfosforilacion de la proteina tau patogenica en la EA. La activacion de PKC tambien puede inducir sinaptogenesis o prevenir la apoptosis en la EA o despues de un accidente cerebrovascular. La activacion de PKC tambien puede proteger las neuronas de rata de la neurotoxicidad mediada por Ap a traves de la inhibicion de GSK-3p. Los activadores de PKC tambien pueden contrarrestar el efecto del Ap sobre la regulacion por disminucion de la PKC a/£, y de ese modo invertir o prevenir los cambios inducidos por Ap. Otro posible mecanismo de accion es la activacion de enzimas de degradacion de Ap, tales como la enzima convertidora de endotelina. Los resultados de los experimentos presentados en los ejemplos sugieren que este puede ser el mecanismo de accion.
Otro mecanismo mas puede ser mediante la estimulacion de receptores muscarinicos M1 y M3 acoplados a PKC, que se ha notificado que aumenta el procesamiento de APP no amiloidogenico por TACE. Rossner y otros, Prog. Neurobiol. 1998; 56: 541-569. Los agonistas muscarinicos rescatan ratones con EA transgenicos 3x de deficits cognitivos y reducen las patologias de Ap y tau, en parte mediante la activacion de la ruta no amiloidogenica de
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TACE/ADAM17. Caccamo y otros, Neuron. 2006; 49:671-682. La senalizacion del receptor muscarinico esta estrechamente relacionada con la PKC. El ARNm del receptor muscarinico esta regulado por la PKC y la diferenciacion neuronal producida por la activacion del receptor muscarinico M1 esta mediada por la PKC. Barnes y otros, Life Sci. 1997; 60:1015-1021; Vandemark y otros, J Pharmacol. Exp. Ther. 2009; 329(2): 532-42.
Otros trastornos contemplados para el tratamiento mediante los procedimientos de la presente descripcion incluyen trastornos del estado de animo, tales como trastornos depresivos y trastorno bipolar, esquizofrenia, artritis reumatoide, cancer, enfermedad cardiovascular, diabetes de tipo 2 y cualquier otro trastorno en el que se haya demostrado que los PUFA o MUFA son beneficiosos, incluidos, pero sin limitaciones a los mismos, los mencionados en segundo plano.
Formulacion y administracion
Los derivados de PUFA se pueden producir en unidades de dosificacion utiles para administracion por cualquier via que les permita cruzar la barrera hematoencefalica. Se ha demostrado que los PUFA del plasma pueden atravesar y llegar al cerebro. Rapoport y otros, J Lipid Res. 2001. 42: 678-685. Las vias de ejemplo incluyen las vias oral, parenteral, transmucosa, intranasal, inhalacion o transdermica. Las vias parenterales incluyen la administracion intravenosa, intraarteriolar, intramuscular, intradermica, subcutanea, intraperitoneal, intraventricular, intratecal e intracraneal.
Los compuestos de la presente invencion se pueden formular de acuerdo con metodos convencionales. Los compuestos derivados de PUFA se pueden dar a conocer a un sujeto en formulaciones estandar y pueden incluir cualquier aditivo farmaceuticamente aceptable, tal como excipientes, lubricantes, diluyentes, aromatizantes, colorantes, tampones y disgregantes. Las formulaciones estandar son bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20s edicion, Mack Publishing Company, 2000.
En una realizacion, el compuesto se formula en una forma de dosificacion oral solida. Para la administracion oral, por ejemplo, para PUFA, la composicion farmaceutica puede tomar la forma de un comprimido o capsula preparadas por medios convencionales con excipientes farmaceuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidon de maiz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactasa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato calcico); lubricantes (tales como estearato de magnesio, talco o silice); disgregantes (por ejemplo, almidon de maiz o glicolato de almidon sodico); o agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato sodico). Los comprimidos pueden recubrirse mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica. Las preparaciones liquidas para administracion oral pueden tomar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para reconstituir con agua u otro vehiculo adecuado antes de utilizar. Dichas preparaciones liquidas se pueden preparar mediante medios convencionales con aditivos farmaceuticamente aceptables, tales como agentes de suspension (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o goma arabiga); vehiculos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, esteres oleosos, alcohol etilico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, metil o propil-p-hidroxibenzoatos o acido sonico). Las preparaciones pueden tambien contener sales tampones, aromatizantes, colorantes y edulcorantes, segun sea adecuado.
Como un ejemplo, el farmaco Omacor® contiene combinaciones concentradas de esteres etilicos de un PUFA omega-3. Cada capsula de 1 g contiene, como minimo, 900 mg de esteres etilicos de acidos grasos omega-3, principalmente EpA (465 mg) y DHA (375 mg), de acuerdo con el prospecto del farmaco. Omacor® se administra hasta 4 veces al dia en forma de capsulas de gelatina blanda transparentes de 1 gramo llenas de aceite amarillo claro. Se puede utilizar una composicion similar para administrar los compuestos de PUFA de la presente invencion, aunque la presente invencion contempla la utilizacion de una dosis inferior de los derivados de PUFA. Tambien se han descrito formulaciones estables de cera-ester de PUFA mediante transesterificacion de cantidades estequiometricas de esteres etilicos enriquecidos con PUFA n-3 y alcoholes de cadena larga (18-22 atomos de carbono) mediante transesterificacion de cantidades estequiometricas de esteres etilicos enriquecidos con PUFA n-3 y alcoholes de cadena larga (18-22 atomos de carbono). Goretta y otros, Lebensmittel-Wissenschafi und- Technologie. 2002; 35(5):458-65.
En otra realizacion, el compuesto de PUFA se formula para administracion parenteral. El compuesto se puede formular para administracion parenteral mediante inyeccion, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion se pueden presentar en monodosis en, por ejemplo, ampollas o envases con multiples dosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden tomar formas, tales como suspensiones, soluciones, dispersiones o emulsiones en vehiculos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulacion tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o dispersantes.
Los derivados de PUFA de la presente invencion se pueden administrar con un vehiculo hidrofobo. Los vehiculos hidrofobos incluyen complejos de inclusion, dispersiones (tales como micelas, microemulsiones y emulsiones) y liposomas. Ejemplos de vehiculos hidrofobos son complejos de inclusion, micelas y liposomas. Estas formulaciones son conocidas en la tecnica Remington: ciencia y practica de la farmacia (“Remington's: The Science and Practice of Pharmacy” 20a ed., ed. Gennaro, Lippincott: Philadelphia, PA 2003). Los derivados de PUFA de la presente
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invencion se pueden incorporar en vehiculos hidrofobos, por ejemplo, como minimo, el 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% del peso total del vehiculo en peso. Ademas, se pueden incluir otros compuestos en el soporte hidrofobo o la solucion, por ejemplo, para estabilizar la formulacion.
Ademas de las formulaciones descritas anteriormente, el derivado de PUFA tambien pueden formularse como una preparacion de liberacion lenta. Dichas formulaciones de accion prolongada pueden administrarse mediante implantacion (por ejemplo subcutanea o intramuscular) o mediante inyeccion intramuscular. Por tanto, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo en forma de una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o en forma de derivados escasamente solubles, por ejemplo en forma de una sal escasamente soluble.
En otra realizacion, el derivado de PUFA puede administrarse en una vesicula, particularmente una micela, un liposoma o una particula de LDL artificial, tal como se describe en la solicitud de Patente de Estados Unidos No. de serie 11/648,808 de Alkon y otros,
Las dosis para administracion pueden prepararse adecuadamente para administrar de 1 mg a 10 g, preferentemente de 10 mg a 1 g, y, muy preferentemente, de 250 mg a 500 mg del compuesto al dia. Cuando se preparan para administracion topica o formulaciones parenterales, se pueden preparar en formulas que contienen del 0,01% al 60% en peso de la formulacion final, preferentemente del 0,1% al 30% en peso, y, muy preferentemente, del 1% al 10% en peso. La dosis diaria optima se determinara mediante metodos conocidos en la tecnica y se vera influenciada por factores tales como la edad del paciente y otros factores clinicamente relevantes.
Terapia farmacologica combinada
El compuesto PUFA puede utilizarse para tratar pacientes con EA u otros trastornos neurologicos asociados con Ap en combinacion con otros farmacos que tambien se utilizan para tratar el trastorno. Los ejemplos de agentes farmacologicos no limitantes aprobados en Estados Unidos para el tratamiento de la EA incluyen inhibidores de la colinesterasa, tales como Aricept® (donepezilo), Exelon® (rivastigmina), Reminyl® (galantamina) y antagonistas del receptor de NMDA, tal como Namenda® (memantina). Otros posibles agentes terapeuticos incluyen inhibidores de la proteasa (veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos No. 5.863.902; 5.872.101; inhibidores de la produccion de Ap, tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos No. 7.011.901; 6.495.540; 6.610.734; 6.632.812; 6.713.476; y 6.737.420; moduladores de la agregacion de Ap, descritos en 6.303.567; 6.689.752; e inhibidores de BACE, tal como se da a conocer en las Patentes de Estados Unidos No. 6.982.264; 7.034.182; 7.030.239.Los farmacos de ejemplo utilizados para el tratamiento del accidente cerebrovascular incluyen aspirina, medicamentos antiagregantes plaquetarios, tales como el activador del plasminogeno tisular u otros anticoagulantes.
La presente divulgacion contempla la terapia de combinacion con otros activadores de la PKC, incluyendo, pero sin limitaciones, lactonas macrociclicas de benzolactama. La briostatina-1 es una lactona macrociclica que se ha demostrado que modula la PKC y da como resultado un aumento en la escision de la APP mediante TACE en la ruta no amiloidogenica. La briostatina pudo aumentar la duracion de la retencion de memoria de la babosa marina Hermissenda crassicornis en mas del 500%, y pudo aumentar drasticamente la velocidad de aprendizaje en ratas. Vease la solicitud de Patente de Estados Unidos 10/919.110; Kurzirian y otros, Biological Bulletin, 2006; 210(3): 201-14; Sun y Alkon, European Journal of Pharmacology. 2005;512(1): 43-51. Otros activadores de la PKC no limitantes se describen en la solicitud de Patente de Estados Unidos con numero de serie 12/068.742 de Alkon y otros,
Las combinaciones con farmacos que aumentan indirectamente la TACE, tal como mediante la inhibicion de los inhibidores de TACE endogenos o el aumento de los activadores de TACE endogenos. Un enfoque alternativo para activar la PKC directamente es aumentar los niveles del activador endogeno, el diacilglicerol. Los inhibidores de la diacilglicerol quinasa, tales como 6-(2-(4-[(4-fluorofenil)fenilmetileno]-1-piperidinil)etil)-7-metil-5H-tiazolo[3,2- a]pirimidin-5-ona (R59022) y [3-[2-[4-(bis-(4-fluorofenil)metilen]piperidin-1 -il)etil]-2,3-dihidro-2-tioxo-4 (1H)- quinazolinona (R59949) aumentar los niveles del ligando endogeno diacilglicerol, produciendo de este modo la activacion de la PKC. Meinhardt y otros, (2002) Anti-Cancer Drugs 13: 725.
Adicionalmente se da a conocer la terapia de combinacion con inhibidores de BACE. Los inhibidores de BACE se conocen e incluyen CTS-21166, propiedad de CoMentis Inc., que ha mostrado resultados positivos en un ensayo clinico en humanos. Otros inhibidores de BACE se describen en la solicitud de PCT internacional publicada W02007/019080 y en Baxter y otros, Med. Chem. 2007;50(18): 4261-4264.
Los compuestos utilizados en la terapia de combinacion pueden administrarse en la misma formulacion que el compuesto de PUFA de la presente invencion, cuando sea compatible, o se pueden administrar en formulaciones separadas.
Evaluacion del tratamiento
La evaluacion del tratamiento con los derivados de PUFA de la presente invencion puede realizarse mediante la
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evaluacion de la mejora de los sintomas o los marcadores clinicos indirectos de la enfermedad. Por ejemplo, la mejora en la memoria o las habilidades cognitivas en un sujeto con EA tratado puede sugerir que hay una reduccion de la acumulacion de Ap patogenico. Los ejemplos de fenotipos cognitivos incluyen, pero no se limitan a los mismos, amnesia, afasia, apraxia y agnosia. Los ejemplos de sintomas psiquiatricos incluyen, pero no se limitan a los mismos, cambios de personalidad, depresion, alucinaciones y delirios. Como un ejemplo no limitante, el Manual diagnostico y estadistico de los trastornos mentales, (“Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders”) 4a edicion (DSM-IV-TR) (publicado por la Asociacion Americana de Psiquiatria)) contiene criterios para la demencia del tipo Alzheimer.
Las manifestaciones fenotipicas de la EA tambien pueden ser fisicas, tal como mediante la deteccion directa (por imagen) o indirecta (bioquimica) de las placas de Ap. La obtencion de imagenes in vivo de Ap puede realizarse utilizando derivados de flavona radioyodados como agentes de formacion de imagenes (Ono y otros, J Med Chem. 2005;48(23):7253-60) y con colorantes de union al amiloide, tales como putrescina conjugada a un peptido A radioyodado de 40 residuos (que produce 1251-PUT-A 1-40), que se demostro que cruzaba la barrera hematoencefalica y se unfa a las placas de Ap. Wengenack y otros, Nature Biotechnology, 2000;18(8): 868-72. Las imagenes de Ap tambien se mostraron utilizando estilbeno [11 C]SB-13 y el benzotiazol [11C]6-OH-BTA-1 (tambien conocido como [11 C]PIB). Verhoeff y otros, Am J Geriatr Psychiatry. 2004; 12:584-595.
La cuantificacion de Ap (1-40) en la sangre periferica se ha demostrado utilizando cromatografia liquida de alto rendimiento acoplada con espectrometria de masas en tandem en una trampa de iones lineales. Du y otros, J Biomol Tech. 2005;16(4):356-63. Tambien se ha descrito la deteccion de agregados de proteina Ap individuales en el liquido cefalorraquideo de pacientes con Alzheimer mediante espectroscopia de correlacion de fluorescencia. Pitschke y otros, Nature Medicin, 1998; 4: 832-834. La Patente de Estados Unidos 5.593.846 da a conocer un procedimiento para detectar Ap soluble. Tambien se ha descrito la deteccion indirecta del peptido Ap y el receptor para productos finales de glicacion avanzada (RAGE) utilizando anticuerpos. Por ultimo, la deteccion bioquimica del aumento de la actividad de BACE-1 en el liquido cefalorraquideo utilizando sustratos cromogenicos tambien se ha postulado como un indicador de diagnostico o pronostico de EA. Verheijen y otros, Clin Chem. 2006; 52:1168-1174.
Las medidas actuales para la evaluacion de la EA incluyen la observacion de un nucleo clinico de perdida de memoria episodica temprana, progresiva y significativa mas uno o mas biomarcadores anormales (indicadores biologicos) caracteristicos de la EA, incluyendo atrofia (degeneracion) del lobulo temporal, tal como se muestra en la RMI; concentraciones anormales de proteina Ap en el liquido cefalorraquideo; un patron especifico que muestra un metabolismo reducido de la glucosa en las exploraciones PET del cerebro; y una mutacion genetica asociada con dentro de la familia inmediata.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Sintesis de esteres metilicos de acidos grasos y esteres metilicos de acidos grasos ciclopropanados.
Sintesis de acidos grasos ciclopropanados. Los esteres metilicos de acidos grasos poliinsaturados se ciclopropanaron utilizando la reaccion modificada de Simmons-Smith utilizando cloroyodometano y dietilcinc (Tanaka y otros, Bioorg. Med. Chem. Let. 2003; 13: 1037-40; Furukawa y otros, Tetrahedron. 1967; 53-58; Denmark y otros, J Org. Chem. 1991; 56:6974-81). Todos los aparatos se cocieron a 60°C durante 1 hora y se secaron utilizando una llama con nitrogeno seco. Un matraz de fondo redondo de 3 bocas de 100 ml con una barra de agitacion y una sonda de temperatura se rodeo con una mezcla de hielo y hielo seco y se cargo con 1,25 g (4,24 mmol) de ester metilico de acido linoleico o ester metilico de acido docosahexaenoico en 25 ml de diclorometano y se introdujeron burbujas de N2. Se anadio anaerobicamente una solucion 1M de dietilcinc (51 ml, 54,94 mmol) en hexano utilizando una aguja de calibre 20 de 24 pulgadas de largo y la solucion se enfrio a -5°C. Se anadio diyodometano (8,2 ml, 101,88 mmol) o cloroyodometano (ClCH2 I) gota a gota, una gota por segundo, con agitacion constante. Se redujo la velocidad de adicion en caso necesario para mantener la mezcla de reaccion por debajo de 2°C. La mezcla de reaccion se volvio turbia durante la reaccion y se libero un producto de cinc de color blanco insoluble. El matraz se sello y la mezcla se dejo reaccionar durante 1 hora y, despues, se dejo que alcanzara la temperatura ambiente gradualmente durante 2 horas.
Para evitar la formacion de un residuo explosivo en la campana, el dietilcinc no se evaporo. La mezcla se vertio lentamente en 100 ml de agua en agitacion para descomponer cualquier exceso de dietilcinc. Se desprendio etano. La mezcla se centrifugo a 5.000 rpm en tubos de centrifuga de vidrio y se desecho la capa acuosa superior. El precipitado blanco se extrajo con CH2Cl2 y se combino con la fase organica. La fase organica se lavo con agua y se centrifugo. El producto se analizo mediante TLC en gel de silice G utilizando hexano mas el 1% de acetato de etilo y se purifico por cromatografia sobre gel de silice utilizando concentraciones crecientes del 1-10% de acetato de etilo en n-hexano y se evaporo en nitrogeno, dejando el ester metilico como un aceite incoloro.
La reaccion de Simmons-Smith conserva la estereoquimica de los materiales de partida. Furukawa y otros, Tetrahedron. 1967; 53-58. El ester metilico de acido docosahexaenoico se convirtio en DHA-CP6 con un rendimiento del 90-95%. El producto fue un aceite incoloro con un maximo de absorbancia unico a 202 nm en etanol
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y sin reaccion con I2. El espectro IR mostro la absorcion del anillo de ciclopropano a 3.070 y 1.450 cm-1. En las mismas condiciones, el ester metilico de acido eicosapentaenoico se convirtio en EPA-CP5 y el ester metilico de acido araquidonico se convirtio en AA-CP4. El ester metilico de acido linoleico se convirtio en ester metilico de DCP- LA, que era identico a una muestra conocida.
Hidrolisis de ester metilico. El ester metilico (0,15 g) se disolvio en 1 ml de LiOH IN y 1 ml de dioxano. Se anadieron dioxano y metanol hasta que se volvio homogeneo y la solucion se agito a 60°C durante la noche. El producto fue extraido en CH2Cl2 y se centrifugo. La capa acuosa y la interfaz blanca se volvieron a extraer con agua y se lavaron hasta que ya no se formo la capa blanca. El producto se evaporo en N2 y se purifico por cromatografia sobre gel de silice. El producto, un aceite incoloro, se eluyo en EtOAc al 20% en n-hexano. Se verifico su pureza mediante TLC en EtOAc al 10%/hexano y mediante C18 RP-HPLC utilizando deteccion de UV a 205 nm.
Los grupos epoxido se pueden introducir por medios convencionales, por ejemplo, por oxidacion del alqueno apropiado con acido m-cloroperbenzoico o hidroperoxido de t-butilo.
Otros compuestos sintetizados incluyen los representados en la figura 1 (BR-101 a BR-118).
Ejemplo 2: Activacion de la PKC Epsilon purificada utilizando acido docosahexanoico
Ensayo de protefna quinasa C. Se mezclo PKC recombinante (1 ng de la isoforma alfa o epsilon) con el BR-101 (DCP-LA) en presencia de histonas 10 micromolar, CaCl2 5 mM, 1,2 pg/pl de fosfatidil-L-serina, 0,18 pg/pl de 1,2- dioctanoil-sn-glicerol (DAG), MgCl2 10 mM, HEPES 20 mM (pH 7,4), EdTa 0,8 mM, EGTA 4 mM, glicerol al 4%, 8 pg/ml de aprotinina, 8 pg/ml de leupeptina y se anadio benzamidina 2 mM, [y32P]ATP 0,5 micro Ci. La mezcla de incubacion se incubo durante 15 minutos a 37 grados en un volumen total de 10 microlitros. La reaccion se detuvo pasando las mezclas de reaccion en tiras de 1x2 cm de papel de fosfato de celulosa (Whatman P81) e inmediatamente lavando dos veces durante 1 hora en H3PO4 al 0,5%. Las tiras de fosfato de celulosa se contaron en un contador de centelleo. En algunos experimentos, se retiraron fosfatidilserina, diacilglicerol y/o calcio.
El ester metilico de DHA se adquirio de Cayman Chemical (Ann Arbor, ME). Las isoenzimas de PKC eran de Calbiochem (San Diego, CA). La PKCs purificada se adquirio en Calbiochem.
Resultados
Las mediciones de PKC utilizando PKCs purificada mostraron que, a la concentracion mas baja probada (10 nM), el compuesto BR-101 produjo una activacion de las PKC por 2,75 veces (figura 2). La PKCa no se vio afectada (datos no mostrados). El compuesto BR-102 tambien indujo selectivamente la activacion de PKCs a aproximadamente 1,75 veces sobre la PKCs inactivada. La eficacia de estos compuestos en la activacion de PKCs a concentraciones bajas sugiere que seran buenos candidatos terapeuticos.
Ejemplo 3: Activacion de PKC epsilon purificada o celular utilizando otros activadores de PKC
Materiales. Los medios de cultivo se obtuvieron de K-D Medical (Columbia, MD) o Invitrogen (Carlsbad, CA). Apl-42 se adquirio en Anaspec (San Jose, CA). Los esteres metilicos de acidos grasos poliinsaturados se obtuvieron de Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI. Otros productos quimicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO) Las isoenzimas de PKC eran de Calbiochem (San Diego, CA). La PKCs purificada se adquirio en Calbiochem.
Cultivo celular. Se sembraron en placas celulas H19-7/IGF-IR de hipocampo de rata (ATCC, Manassas, VA) sobre placas revestidas con poli-L-lisina y se cultivaron a 35°C en DMEM/FCS al 10% durante varios dias hasta que se obtuvo una cobertura de aproximadamente el 50%. A continuacion, se indujo la diferenciacion de las celulas en un fenotipo neuronal reemplazando el medio con 5 ml de medio N2 que contenia 10 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico a 39°C y se cultivaron en matraces T-75 a 37°C. Se cultivaron celulas de neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC) en F12K al 45%/MEM al 45% /FCS al 10%. Se cultivaron celulas de neuroblastoma de raton N2A en DMEM/FCS al 10% sin glutamina.
Se sembraron en placas neuronas del hipocampo de rata de cerebros embrionarios de ratas Sprague Dawley de 18 dias de edad en placas de 12 o 96 pocillos revestidas con poli-D-lisina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en medio neurobasal B-27 que contenia glutamina 0,5 mM y glutamato 25 pM (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se cultivaron durante tres dias en el medio sin glutamato. Las celulas neuronales se cultivaron con CO2 al 5% en una incubadora mantenida a 37°C durante 14 dias.
Todos los experimentos en celulas cultivadas se llevaron a cabo por triplicado a menos que se indique lo contrario. Todos los puntos de datos se muestran como media ± SE. BR-101 (DCP-LA) se utilizo como su acido libre en todos los experimentos, mientras que BR-111 (DHA-CP6), BR-114 (EPA-CP5), y BR-116 (AA-CP4) se utilizaron como sus esteres metilicos.
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Ensayo de protefna quinasa C. Se cultivaron celulas de hipocampo de rata y se rasparon en 0,2 ml de tampon de homogeneizacion (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, NaF 50 mM, leupeptina 1 pg/ml y PMSF 0,1 mM) y se homogeneizaron mediante ultrasonidos en un sonicador de microondas de Marsonix (5 sec, 10W). Para medir la PKC, se incubaron 10 pl de homogeneizado celular o isozima de PKC purificada (adquirida de Calbiochem) durante 15 minutos a 37°C en presencia de histonas 10 pM, CaCl2 4,89 mM, 1,2 pg/pl de fosfatidil-L-serina, 0,18 pg/pl de 1,2-dioctanoil-sn- glicerol, MgCl2 10 mM, HEPES 20 mM (pH 7,4), EDTA 0,8 mM, EGTA 4 mM, glicerol al 4%, 8 pg/ml de aprotinina, 8 pg/ml de leupeptina y benzamidina 2 mM. Se anadio [r32P]ATP 0,5 pCi y la formacion de 32P-fosfoproteina se midio por adsorcion sobre fosfocelulosa, tal como se ha descrito previamente. Nelson y Alkon, J Neurochemistry. 1995; 65: 2350-57. Para las mediciones de activacion por BR-101 (DCP-LA) y compuestos similares, la actividad de PKC se midio en ausencia de diacilglicerol y fosfatidilserina, tal como describen Kanno y otros, y las midieron PKC 6, £, n y p se midieron en ausencia de EGTA y CaCl2 anadidos, tal como describen Kanno y otros, J Lipid Res. 2006; 47: 1146-50. Se utilizan concentraciones bajas de Ca2+ porque niveles altos de Ca2+ interaccionan con el sitio de union de la fosfatidilserina a PKC e impide la activacion. Para las mediciones de la activacion de la briostatina, se omitio el 1,2-diacilglicerol, a menos que se indique lo contrario.
Resultados y discusion
Para determinar su especificidad de isozima PKC, los nuevos compuestos se preincubaron con PKC purificada durante cinco minutos y la actividad de PKC se midio radiometricamente. Tal como se muestra para el ejemplo 2, anteriormente, BR-101 (DCP-LA) fue un activador eficaz de PKC a 10 pM, pero tuvo efectos relativamente pequenos sobre las otras isoformas de la PKC (datos no mostrados). A concentraciones mas altas, BR-101 (DCP-LA) inhibio parcialmente la PKC6 (aproximadamente 1-100 pM) y activo PKCy (50-100 pM) (datos no mostrados).
BR-111 (DHA-CP6), BR-114 (EPA-CP5) y BR-115 (AA-CP4), que son derivados ciclopropanados de acido docosahexaenoico, acido eicosapentaenoico y acido araquidonico, respectivamente, activaron la PKC purificada en un grado similar (figura 3). La concentracion necesaria para activar la PKC fue aproximadamente 100 veces menor que para BR-101 (DCPLA), lo que sugiere una mayor afinidad. Los alcoholes linolenilico y linoleilico ciclopropanados (BR-104 y BR-105), acido epoxiestearico (BR-116) y ester metilico de acido vernolico (BR-117) tuvieron poco o ningun efecto sobre la PKC (figura 4). El ester metilico del acido vernolico ciclopropanado (BR-109) inhibio la PKC a concentraciones superiores a 1 pM (figura 4).
Los activadores de la PKC que se unen al sitio de union a diacilglicerol, incluidos briostatina, gnidimacrina y los esteres de forbol, producen una activacion transitoria de la actividad de PKC, seguida de una regulacion por disminucion prolongada. Nelson y otros, Trends in Biochem. Sci. 2009; 34: 136-45. Esto se confirmo en celulas cultivadas de hipocampo de rata. La incubacion de celulas H19-7/IGF-IR de rata con briostatina (0,04 nM y 0,2 nM) produjo una activacion multiplicada por 2 que duro 30 minutos, seguido de una regulacion por disminucion del 20% que retorno al valor basal en 24 horas (datos no mostrados). Por el contrario, la pKc expuesta a DCP-LA permanecio elevada durante, como minimo, cuatro horas (figura 5). Esta activacion sostenida solo se observo en las neuronas primarias.
Aunque la briostatina tiene una mayor afinidad por la PKC que el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (CE50 = 1,35 nM frente a 10 nM), la briostatina fue mucho menos eficaz que los PMA a la regulacion por disminucion de la PKC. La actividad PKC esta fuertemente regulada por disminucion por el ester de forbol a las 8 horas, mientras que la PKC en celulas tratadas con briostatina esta en o cerca del valor basal (datos no mostrados). Esta diferencia puede explicar los aumentos de Ap producidos por PdBu notificados por Cruz e Silva y otros. J Neurochem. 2009: 108: 319-30. Estos investigadores aplicaron PdBu 1 pM a celulas COS cultivadas durante 8 horas y observaron un aumento en Ap. Este aumento se atribuyo a la regulacion por disminucion de la PKC por el ester de forbol, que es consistente con estos resultados. La regulacion por disminucion no se pudo medir para DCP-LA y compuestos relacionados.
Ejemplo 4: Efectos de los activadores de PKC en la produccion y degradacion de AB
Cultivo celular. El cultivo celular se realizo, tal como se ha descrito anteriormente para el ejemplo 3.
Ensayo de medicion de AP y viabilidad celular. Se midio el Ap utilizando un kit ELISA fluorimetrico humano de Ap 1-42 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se midieron en un lector de microplacas Biotek Synergy HT. AlamarBlue y CyQuant NF (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados y discusion
Para medir los efectos de la activacion de PKC en la produccion de Ap, se utilizaron celulas de neuroblastoma neuro2a (N2a) de raton transfectadas con APPSwe/PS1 D humanas, que producen grandes cantidades de Ap. Petanceska y otros, J Neurochem. 1996; 74: 1878-84. La incubacion de estas celulas durante 24 horas con diversas concentraciones de activadores de PKC, la briostatina, BR-101 (DCPLA) y BR-111 (DHA-CP6) redujo notablemente
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los niveles de Ap tanto intracelular (figura 7a) como secretado (figura 7b). Con la briostatina, que activa la PKC al unirse al sitio de union a diacilglicerol, la inhibicion fue bifasica, con concentraciones de 20 nM o superiores que no producian ningun efecto neto. Esto se puede explicar por la capacidad de esta clase de activadores de PKC para regular por disminucion la PKC cuando se utilizo a altas concentraciones. Por el contrario, BR-101 (DCP-LA) y BR-111 (DHA-CP6), que se unen al sitio de la fosfatidilserina de la PKC, mostraron una inhibicion monotonamente creciente a concentraciones de hasta 10 a 100 pM, sin evidencia de regulacion por disminucion a concentraciones mas altas.
Para determinar si los niveles reducidos de Ap causados por los activadores de PKC se debian a la inhibicion de la sintesis de Ap o a la activacion de la degradacion de Ap, se aplico BR-111 (DHACP6) (0,01 a 10 pM) y concentraciones bajas (100 nM) de Ap-42 monomerico exogeno a celulas SH-SY5Y cultivadas. Esta concentracion de Ap es demasiado baja para producir toxicidad medible o muerte celular. Dado que las celulas SH-SY5Y producen solo cantidades minimas de Ap, este experimento fue una prueba eficaz de la capacidad de los activadores de PKC para mejorar la degradacion de Ap. A las 24 horas, la mayoria del Ap habia sido captado por las celulas y la concentracion de Ap en el medio de cultivo era indetectable. La adicion de 0,01 a 10 pM de DHA-CP6 a las celulas redujo los niveles celulares de Ap en un 45-63%, lo que indica que el activador de PKCe aumento la velocidad de degradacion del Ap exogeno (figura 8).
DHA-CP6, briostatina y DCP-LA no tuvieron ningun efecto sobre la supervivencia celular o sobre la proliferacion medida por tincion con Azul de Alamar y CyQuant (figuras 11a y b), indicando que la reduccion en la produccion de Ap no era consecuencia de la proliferacion celular o cambio en la supervivencia celular.
Ejemplo 5: Efectos de los activadores de PKC en la actividad de TACE
Ensayo TACE. La TACE se midio incubando 5 pl de homogeneizado celular, 3 pl de tampon (Tris-HCl 50 mM 7,4 mas NaCl 25 mM mas glicerol al 4%) y 1 pl de sustrato IV de TACE 100 pM (Apz-LAQAVRSSSR-DPa) (Calbiochem) durante 20 minutos a 37°C en tubos de centrifuga de polipropileno de 1,5 ml (Jin y otros, Anal. Biochem. 2002; 302: 269-75). La reaccion se detuvo por enfriamiento a 4°C. Las muestras se diluyeron a 1 ml y la fluorescencia se midio rapidamente (ex = 320 nm, em = 420 nm) en un espectrofluorometro Spex Fluorolog 2.
Resultados y discusion
Investigadores previos han notificado que los activadores de la PKC, tales como forbol 12-miristato 13-acetato, producen grandes aumentos en la actividad de TACE que se correlacionan con un aumento de sAPPa y una disminucion de Ap, lo que sugiere que TACE y BACE1 compiten por la disponibilidad de sustrato de APP y que los activadores PKC cambian la competencia en favor de TACE. Buxbaum y otros, J. Biol. Chem. 1998; 273: 27765-67; Etcheberrigaray y otros, Proc. Natl. Acad Sci. USA. 2006: 103:8215-20. Sin embargo, muchos de estos estudios anteriores se llevaron a cabo en fibroblastos y otros tipos de celulas no neuronales, que parecen responder de manera diferente a los activadores de PKC que a las neuronas. Por ejemplo, Etcheberrigaray y otros descubrieron que la activacion de PKC en fibroblastos humanos por briostatina de 10 pM a 100 pM multiplico la tasa inicial de actividad de a-secretasa por 16 y por 132, respectivamente (Etcheberrigaray y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006). Sin embargo, en celulas de neuroblastoma SH-SY5Y humanas, celulas de neuroblastoma de raton N2a (figura 9a) y neuronas primarias de hipocampo de rata (figuras 9b, c), los activadores de la PKC, briostatina, BR-101 (DCP-LA) y/o BR-111 (DHA-CP6) solo produjeron pequenos incrementos en la actividad de TACE. Esto sugiere que cualquier reduccion de los niveles de Ap en las neuronas por los activadores de PKC debe ser causada por algun otro mecanismo ademas de la activacion de TACE.
Ejemplo 6: Efectos de los activadores de PKC en la actividad enzimatica convertidora de endotelina
Ensayo ECE. Las celulas de neuroblastoma SH-S757 se incubaron con briostatina (0,27 nM), BR-101 (DCP-LA) (1 pM), y BR-111 (DHA-CP6) (1 pM). La enzima convertidora de endotelina (ECE) se midio fluorimetricamente utilizando el metodo de Johnson y Ahn, Anal. Biochem. 2000; 286: 112-118. Una muestra de homogeneizado celular (20 pl) se incubo en MES-KOH 50 mM, pH 6,0, C12E10 al 0,01% (eter de polioxietileno-10-laurilo) y McaBK2 15 pM (7-metoxicoumarin-4-acetilo [sal de trifluoroacetato de Ala7-(2, 4-dinitrofenil)Lys9] bradiquinina) (Sigma-Aldrich). Despues de 60 minutos a 37°C, la reaccion se detuvo anadiendo acido trifluoroacetico al 0,5%. La muestra se diluyo a 1,4 ml con agua y la fluorescencia se midio a ex = 334 nm, em = 398 nm.
Resultados y discusion
Ap puede degradarse en vivo mediante varias enzimas, incluida la enzima de degradacion de insulina (insulisina), neprilisina y ECE. Debido a que la sobreexpresion de PKC se ha notificado que activa la ECE (Choi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 8215-20), los presenten inventores examinaron el efecto de los activadores de PKC en ECE. La briostatina, BR-101 (DCP-LA) y BR-111 (DHA-CP6) produjeron un aumento sostenido de la actividad de ECE (figura 10). Dado que ECE no posee un dominio C1 de union a diacilglicerol, esto sugiere que la activacion por briostatina no se debio a la activacion directa de ECE, sino que debe ser el resultado de la fosforilacion de ECE o de algun intermedio activador de ECE por PKC. Este resultado tambien sugiere que la
activacion indirecta de ECE por activadores de PKC podria ser un medio util para reducir los niveles de Ap en pacientes.
Una ventaja de compuestos tales como los derivados de PUFA de la presente invencion que activan 5 especificamente PKCe es que producen menos regulacion por disminucion que los esteres de forbol y analogos de 1,2-diacilglicerol (DAG) similares. La respuesta bifasica de los activadores basados en PKC a DAG significa que un activador de PKC puede reducir los niveles de Ap en un punto de tiempo y aumentarlos en otro. Da Cruz e Silva y otros, J Neurochem. 2009; 108: 319-330. Se requerira una dosificacion y un control cuidadosos de los pacientes para evitar efectos opuestos a los previstos. Debido a la relativa incapacidad de esta nueva clase de activadores de 10 PKC para regular por disminucion la PKC, este problema puede evitarse.

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    REIVINDICACIONES
    1. Compuesto que es un ester de acido graso cis-poliinsaturado para su utilizacion en la reduccion de la neurodegeneracion, caracterizado por que, como mmimo. uno de los dobles enlaces en el compuesto se reemplaza por un anillo/grupo de ciclopropano, y se da a conocer en una cantidad eficaz.
  2. 2. Compuesto, para su utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que la concentracion del compuesto esta entre 5 nanomolar y 10 micromolar.
  3. 3. Compuesto, para su utilizacion segun reivindicacion 1, en el que el compuesto activa la isoforma epsilon de protema quinasa C, como mmimo, 2 veces sobre la isoforma alfa de protema quinasa C o en comparacion con la actividad de una isoforma epsilon de protema quinasa C que no ha estado en contacto con el compuesto.
  4. 4. Compuesto, para su utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que todos los enlaces dobles estan reemplazados por un anillo/grupo de ciclopropano.
  5. 5. Compuesto, para su utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que el acido graso cis-poliinsaturado del que se deriva el ester de acido graso ciclopropanado se elige de acido araquidonico, acido docosapentaenoico, acido docosahexaenoico, acido eicosapentaenoico, acido linoleico, acido v-linoleico, acido a-linolenico, acido eicosatetraenoico o acido adrenico.
  6. 6. Compuesto, para su utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que el compuesto es ester metflico de acido docosahexaenoico ciclopropanado (BR-111), ester metflico de acido eicosapentaenoico (BR114) o ester metflico de acido araquidonico ciclopropanado (BR-115).
  7. 7. Compuesto, para su utilizacion segun la reivindicacion 1, en el que el acido graso cis-poliinsaturado del que se deriva el ester de acido graso ciclopropanado tiene una estructura de
    CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH
    o
    CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH en la que X esta entre 2 y 6, e Y esta entre 2 y 6.
  8. 8. Composicion que comprende:
    un compuesto elegido DE ester metflico de acido docosahexaenoico ciclopropanado (BR-111), ester metflico de acido eicosapentaenoico (BR-114), o combinaciones de los mismos, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  9. 9. Composicion para su utilizacion en la reduccion de la neurodegeneracion, caracterizado por que la composicion comprende:
    un compuesto elegido DE ester metflico de acido docosahexaenoico ciclopropanado (BR-111), ester metflico de acido eicosapentaenoico (BR-114), ester metflico de acido araquidonico ciclopropanado (BR-115) o combinaciones de los mismos,
    y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
  10. 10. Compuesto que es un ester de acido graso cis-poliinsaturado para su utilizacion en el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo o trastorno del estado de animo, caracterizado por que, como mmimo, uno de los dobles enlaces en el compuesto se reemplaza por un anillo/grupo de ciclopropano.
  11. 11. Compuesto, para su utilizacion segun la reivindicacion 10, en el que el trastorno se elige de enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular y depresion.
  12. 12. Compuesto, para utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que el compuesto es ester metflico de acido docosahexaenoico ciclopropano (BR-111), ester metflico de acido eicosapentaenoico ciclopropano (BR-114), o ester metflico de acido araquidonico ciclopropano (BR-115).
  13. 13. Compuesto, para su utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la concentracion del compuesto esta entre 5 nanomolar y 10 micromolar.
  14. 14. Compuesto, para su utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que el compuesto activa la isoforma epsilon de protema quinasa C, como mmimo, 2 veces sobre la isoforma alfa de protema quinasa C o en
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    comparacion con la actividad de una isoforma epsilon de proteina quinasa C que no ha estado en contacto con el compuesto.
  15. 15. Compuesto, para su utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que todos los enlaces dobles estan reemplazados por un anillo/grupo de ciclopropano.
  16. 16. Compuesto, para su utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que el acido graso cis- poliinsaturado del que se deriva el ester de acido graso ciclopropanado se elige de acido araquidonico, acido docosapentaenoico, acido docosahexaenoico, acido eicosapentaenoico, acido linoleico, acido v-linoleico, acido a- linolenico, acido eicosatetraenoico o acido adrenico.
  17. 17. Compuesto, para su utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en el que el acido graso cis- poliinsaturado del que se deriva el ester de acido graso ciclopropanado tiene una estructura de
    CH3(CH2)4(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH
    o
    CH3CH2(CH=CHCH2)x(CH2)yCOOH en la que X esta entre 2 y 6, e Y esta entre 2 y 6.
  18. 18. Compuesto seleccionado de ester metilico de acido docosahexaenoico ciclopropanado (BR-111), ester metilico de acido eicosapentaenoico (BR-114), o combinaciones de los mismos.
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