ES2683071T3 - Direccionamiento mediado por nucleasas con grandes vectores de direccionamiento - Google Patents

Abstract

Un método para modificar un locus genómico objetivo en una célula madre embrionaria (ES) de ratón, que comprende: (a) introducción en la célula ES de ratón: (i) una nucleasa de dedo de zinc (ZFN) que provoca un rompimiento de doble cadena en o cerca de el locus genómico objetivo; y (ii) un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende un ácido nucleico insertado flanqueado por un brazo de homología secuencia arriba y un brazo de homología secuencia abajo, en el que el ácido nucleico insertado varía de 5 kb a 30 kb de longitud, en el que la suma total de los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo tiene una longitud de al menos 10 kb, en el que los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo están entre 5 kb y 200 kb de longitud, y en el que el LTVEC varía de 50 kb a 300 kb de longitud; y (b) seleccionar una célula ES de ratón dirigida que comprende el ácido nucleico insertado en el locus genómico objetivo, en el que la integración del ácido nucleico insertado en el locus genómico objetivo da como resultado la sustitución de una secuencia de ácido nucleico endógeno en el locus genómico objetivo con el ácido nucleico insertado.

Description

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En una realización, el agente nucleasa es una construcción de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una nucleasa, en la que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor. En una realización, el promotor es un promotor constitutivamente activo. En una realización, el promotor es un promotor inducible. En una realización, el promotor es activo en la célula procariota. En una realización, el agente nucleasa es un ARNm que codifica una endonucleasa.

En una realización, el agente nucleasa es una nucleasa de dedo de cinc (ZFN). En una realización, cada monómero de la ZFN comprende 3 o más dominios de unión a ADN basados en dedos de cinc, en donde cada dominio de unión a ADN basado en dedos de cinc se une a un subsitio de 3 pb. En una realización, la ZFN es una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN basado en dedos de cinc operativamente unido a una nucleasa independiente. En una realización, la endonucleasa independiente es una endonucleasa Fok1. En una realización, el agente nucleasa comprende una primera ZFN y una segunda ZFN, en donde cada una de la primera ZFN y la segunda ZFN está unida operativamente a una nucleasa Fokl, en donde la primera y la segunda ZFN reconocen dos secuencias de ADN objetivo contiguas en cada cadena de la secuencia de ADN objetivo separada por un sitio de escisión de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 40 pb, y en el que las nucleasas Fokl se dimerizan y hacen un rompimiento de doble cadena.

En una realización, el agente nucleasa es una nucleasa efectora similar al activador de la transcripción (TALEN). En una realización, cada monómero de TALEN comprende 12-25 repeticiones de TAL, en donde cada repetición de TAL se une a un subsitio de 1 pb. En una realización, el agente nucleasa es una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN basado en la repetición de TAL operativamente unido a una nucleasa independiente. En una realización, la nucleasa independiente es una endonucleasa Fok1. En una realización, el agente nucleasa comprende un primer dominio de unión a ADN basado en la repetición de TAL y un segundo dominio de unión a ADN basado en la repetición de TAL, en el que cada uno del primer y segundo dominio de unión a ADN basado en la repetición de TAL está operativamente unido a una nucleasa Fokl, en la que el primer y el segundo dominio de unión de ADN basado en la repetición de TAL reconocen dos secuencias de ADN objetivo contiguas en cada cadena de la secuencia de ADN objetivo separadas por aproximadamente 6 pb a aproximadamente 40 pb del sitio de escisión, y en donde las nucleasas Fokl se dimerizan y producen una ruptura de doble cadena en una secuencia objetivo.

En una realización, cada monómero de la nucleasa reconoce una secuencia objetivo de al menos 9 nucleótidos. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 12 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 15 a aproximadamente 18 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 18 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.

En una realización, una secuencia objetivo del agente nucleasa está localizada en un intrón. En una realización, la secuencia objetivo está ubicada en un exón. En una realización, la secuencia objetivo está ubicada en un promotor. En una realización, la secuencia objetivo está en una región que no codifica proteínas. En una realización, la región que no codifica proteínas es una región reguladora. En una realización, la secuencia objetivo está ubicada en una región reguladora del promotor. En una realización, la secuencia objetivo está localizada en una región potenciadora.

En una realización, el agente nucleasa es una meganucleasa. En una realización, la meganucleasa reconoce secuencias de ADN de cadena doble de 12 a 40 pares de bases. En una realización, la meganucleasa reconoce una secuencia objetivo perfectamente coincidente en el genoma. En una realización, la meganucleasa es una nucleasa de asentamiento. En una realización, la nucleasa de asentamiento es una familia LAGLIDADG de nucleasa de asentamiento. En una realización, la familia LAGLIDADG de nucleasa de asentamiento se selecciona de I-Scel, I-Crel e I-Dmol.

En una realización, el vector de direccionamiento es un vector de direccionamiento grande (LTVEC).

En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 300 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 75 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 75 kb a aproximadamente 100 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 100 kb a 125 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 125 kb a aproximadamente 150 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 175 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 175 kb a aproximadamente 200 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 200 kb a aproximadamente 225 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 225 kb a aproximadamente 250 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 250 kb a aproximadamente 275 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 275 kb a aproximadamente 300 kb.

En una realización, los brazos de homología del vector de direccionamiento se derivan de una biblioteca de BAC, una biblioteca de cósmidos o una biblioteca de fagos P1. En una realización, los brazos de homología se derivan de un locus genómico del animal no humano que no puede direccionarse usando un método convencional. En una realización, los brazos de homología se derivan de un ADN sintético.

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En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un alelo condicional. En una realización, el alelo condicional es un alelo multifuncional, como se describe en el documento US 2011/0104799. En una realización, el alelo condicional comprende: (a) una secuencia activadora en orientación sentido con respecto a la transcripción de un gen objetivo, y un casete de selección de fármaco en orientación sentido o antisentido; (b) en orientación antisentido una secuencia de nucleótidos de interés (NSI) y un módulo condicional por inversión (COIN, que utiliza un intrón de división de exones y un módulo de tipo trampa génica invertible; véase, por ejemplo, el documento US 2011/0104799,); y (c) unidades recombinables que se recombinan tras la exposición a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que (i) carece de la secuencia activadora y la DSC, y (ii) contiene el NSI en orientación sentido y el COIN en orientación antisentido.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un casete de selección. En una realización, el casete de selección comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección, en el que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor. En una realización, el promotor es activo en una célula procariota. En una realización, el ácido nucleico es activo en células tanto procariotas como eucariotas. En una realización, el casete de selección está flanqueado con secuencias objetivo de recombinación específicas del sitio. En una realización, el marcador de selección se selecciona de neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S desaminasa (bsrr) , xantina / guanina fosforribosil transferasa (gpt), y timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-k), y una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un gen informador unido operativamente a un promotor, en el que el gen informador codifica una proteína informadora seleccionada del grupo que consiste en LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed , mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina y una combinación de las mismas. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor inducible. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor endógeno. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor exógeno. En una realización, el gen informador se expresa en un tipo de célula específico. En una realización, el gen informador se expresa de una manera específica del tejido. En una realización, el gen informador se expresa en una etapa específica de la etapa de desarrollo.

En una realización, la integración del ácido nucleico insertado en el locus genómico objetivo introduce una o más modificaciones genéticas como se describe en este documento. En una realización, la modificación genética es una eliminación de una secuencia de ácido nucleico endógeno. En una realización, la modificación genética es una adición de una secuencia de ácido nucleico exógeno en el locus genómico objetivo. En una realización, la modificación genética es un reemplazo de una secuencia de ácido nucleico endógeno con una secuencia de ácido nucleico exógeno en el locus genómico objetivo. En una realización, la secuencia de ácido nucleico exógeno no es una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, la secuencia de ácido nucleico exógeno es una secuencia de ácido nucleico humano. En una realización, la modificación genética es una desactivación, una eliminación, una inserción, un reemplazo ("activación"), una mutación puntual, un intercambio de dominios, un intercambio de exones, un intercambio de intrones, un intercambio de secuencias reguladoras, un intercambio de genes, o una combinación de los mismos.

En una realización, el ácido nucleico insertado es homólogo a una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado es un ácido nucleico humano. En una realización, el ácido nucleico insertado es un fragmento de un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico es un ácido nucleico genómico de ratón, un ácido nucleico genómico humano o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb como se describió anteriormente.

En una realización, el ácido nucleico insertado es ortólogo a una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado es un ácido nucleico humano. En una realización, el ácido nucleico insertado es un fragmento de un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico es un ácido nucleico genómico de ratón, un ácido nucleico genómico humano o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb como se describió anteriormente.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, el sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductivo o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una médula ósea o una célula derivada de médula ósea. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula de bazo. En una realización, el locus genómico comprende una secuencia de ácido nucleico genómico de ratón, una secuencia de ácido nucleico genómico humano, o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B

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humana es un alelo recesivo. En una realización, el alelo de la enfermedad humana comprende un alelo de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia reguladora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia promotora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia potenciadora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia de unión a represor transcripcional. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano, en el que la secuencia de ácido nucleico humano comprende una eliminación de una secuencia que no codifica una proteína, pero no comprende una eliminación de una secuencia que codifica una proteína. En una realización, la eliminación de la secuencia que no codifica proteína comprende una eliminación de una secuencia reguladora. En una realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia promotora. En una realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia potenciadora.

En un aspecto, se proporciona un método para modificar un locus genómico objetivo en una célula madre de embrión de ratón (ES), que comprende: (a) introducir en la célula ES de ratón: (i) una nucleasa de dedo de cinc (ZFN) que realiza un rompimiento de doble cadena en o cerca de un locus genómico objetivo; y (ii) un vector de direccionamiento grande (LTVEC) que comprende un ácido nucleico insertado flanqueado por un brazo de homología secuencia arriba y un brazo de homología secuencia abajo, donde el ácido nucleico insertado varía de 5 kb a 30 kb de longitud, en el que la suma total de los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo tienen una longitud de al menos 10 kb, en los que los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo tienen una longitud de entre 5 kb y 200 kb, y en los que el LTVEC varía de 50 kb a 300 kb de longitud; y (b) seleccionar una célula ES de ratón específica que comprende el ácido nucleico insertado en el locus genómico objetivo, donde la integración del ácido nucleico insertado en el locus genómico objetivo da como resultado el reemplazo de una secuencia de ácido nucleico endógeno en el locus genómico objetivo con el ácido nucleico insertado.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un gen informador unido operativamente a un informador exógeno.

En una realización, la célula ES de ratón es una célula madre pluripotente inducida (iPS). En una realización, la célula pluripotente inducida (iPS) se deriva de un fibroblasto. En una realización, la célula pluripotente es una célula madre hematopoyética (HSC). En una realización, la célula pluripotente es una célula madre neuronal (NSC). En una realización, la célula pluripotente es una célula madre epiblasto. En una realización, la célula pluripotente es una célula progenitora restringida en el desarrollo.

En una realización, la ES de ratón es una célula cancerosa.

En una realización, el locus genómico objetivo se selecciona de un locus FcER1a, un locus TLR4, un locus PRLR, un locus Notch4, un locus Accn2, un locus Adamts5, un locus TRPA1, un locus FoIH1, un locus LRP5, y un locus ERBB4.

En una realización, el locus genómico objetivo comprende una secuencia de ácido nucleico genómico de un ratón.

En una realización, la ZFN se introduce junto con el vector de direccionamiento grande (LTVEC). En una realización, la ZFN se introduce por separado del LTVEC durante un período de tiempo. En una realización, la ZFN se introduce antes de la introducción del LTVEC. En una realización, la ZFN se introduce después de la introducción del LTVEC.

En una realización, el uso combinado del LTVEC con la ZFN da como resultado una eficacia de direccionamiento aumentada en comparación con el uso del LTVEC solo, opcionalmente en donde la eficacia de direccionamiento del LTVEC se incrementa al menos dos veces en comparación con el uso del LTVEC solo. En una realización, cuando el LTVEC se usa junto con la ZFN, la eficacia de direccionamiento del LTVEC se incrementa al menos tres veces en comparación con cuando el LTVEC se usa solo. En una realización, cuando el LTVEC se usa junto con la ZFN, la eficacia de direccionamiento del LTVEC se incrementa al menos cuatro veces en comparación con cuando el LTVEC se usa solo.

En una realización, (I) la ZFN es una construcción de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína ZFN, y en la que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor activo en la célula; o (II) la ZFN es un ARNm que codifica una proteína ZFN. En una realización, el promotor es un promotor constitutivamente activo. En una realización, el promotor es un promotor inducible. En una realización, el promotor es activo en la célula de mamífero. En una realización, el agente nucleasa es un ARNm que codifica una endonucleasa.

En una realización, cada monómero de ZFN comprende 3 o más dominios de unión a ADN basados en dedos de cinc, en donde cada dominio de unión a ADN basado en dedos de cinc se une a un subsitio de 3 pb. En una realización, la ZFN es una proteína quimérica que comprende un dominio de unión a ADN basado en dedos de cinc operativamente unido a una nucleasa independiente. En una realización, la endonucleasa independiente es una endonucleasa Fok1. En una realización, el agente nucleasa comprende una primera ZFN y una segunda ZFN, en

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donde cada una de la primera ZFN y la segunda ZFN está unida operativamente a una nucleasa Fokl, en donde la primera y la segunda ZFN reconocen dos secuencias de ADN objetivo contiguas en cada cadena de la secuencia de ADN objetivo separada por un sitio de escisión de aproximadamente 6 pb a aproximadamente 40 pb, y en el que las nucleasas Fokl se dimerizan y forman un rompimiento de doble cadena.

En una realización, cada monómero de ZFN reconoce una secuencia objetivo de al menos 9 nucleótidos. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 12 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 15 a aproximadamente 18 nucleótidos de longitud. En una realización, la secuencia objetivo es de aproximadamente 18 a aproximadamente 21 nucleótidos de longitud.

En una realización, una secuencia de ácido nucleico objetivo de la ZFN está localizada en un intrón, un exón, un promotor, una región que no codifica proteínas, una región reguladora, una región reguladora del promotor o una región potenciadora en el locus genómico objetivo.

La familia LAGLIDADG de nucleasa de asentamiento se selecciona de I-Scel, I-Crel e I-Dmol.

En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 300 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 75 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 75 kb a aproximadamente 100 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 100 kb a 125 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 125 kb a aproximadamente 150 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 175 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 175 kb a aproximadamente 200 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 200 kb a aproximadamente 225 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 225 kb a aproximadamente 250 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 250 kb a aproximadamente 275 kb. En una realización, el LTVEC varía de aproximadamente 275 kb a aproximadamente 300 kb.

En una realización, los brazos de homología del LTVEC se derivan de una biblioteca de BAC, una biblioteca de cósmidos o una biblioteca de fagos P1. En una realización, los brazos de homología se derivan de un locus genómico del animal no humano que no puede direccionarse usando un método convencional. En una realización, los brazos de homología se derivan de un ADN sintético.

En una realización, una suma total del brazo de homología secuencia arriba y el brazo de homología secuencia abajo es de al menos 10 kb. En una realización, el brazo de homología secuencia arriba varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 100 kb. En una realización, el brazo de homología secuencia abajo varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 100 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 30 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 30 kb a aproximadamente 40 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 40 kb a aproximadamente 50 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 50 kb a aproximadamente 60 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 60 kb a aproximadamente 70 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 70 kb a aproximadamente 80 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 80 kb a aproximadamente 90 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 90 kb a aproximadamente 100 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 100 kb a aproximadamente 110 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 110 kb a aproximadamente 120 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 120 kb a aproximadamente 130 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 130 kb a aproximadamente 140 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 140 kb a aproximadamente 150 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 150 kb a aproximadamente 160 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 160 kb a aproximadamente 170 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 170 kb a aproximadamente 180 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 180 kb a aproximadamente 190 kb. En una realización, los brazos de homología secuencia arriba y secuencia abajo varían de aproximadamente 190 kb a aproximadamente 200 kb.

En una realización, el vector de direccionamiento comprende un casete de selección. En una realización, el casete de selección comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección, en el que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor. En una realización, el promotor es activo en una célula de mamífero. En una realización, el promotor es activo tanto en células procariotas como en células

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eucariotas. En una realización, el marcador de selección se selecciona de neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S desaminasa (bsrr) , xantina / guanina fosforribosil transferasa (gpt), y timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-k), y una combinación de los mismos.

En una realización, el ácido nucleico insertado es de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 10 kb. En una realización, el ácido nucleico insertado es de aproximadamente 10 kb a aproximadamente 20 kb. En una realización, el ácido nucleico insertado es de aproximadamente 20 kb a aproximadamente 30 kb.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un ácido nucleico flanqueado con secuencias objetivo de recombinación específicas del sitio. En una realización, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico se deriva de un ratón, un ser humano o una combinación de los mismos. En una realización, las secuencias objetivo de recombinación específicas del sitio se seleccionan del grupo que consiste en loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox y una combinación de los mismas.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un alelo condicional. En una realización, el alelo condicional es un alelo multifuncional, como se describe en el documento US 2011/0104799. En una realización, el alelo condicional comprende: (a) una secuencia activadora en orientación sentido con respecto a la transcripción de un gen objetivo, y un casete de selección de fármaco en orientación sentido o antisentido; (b) en orientación antisentido una secuencia de nucleótidos de interés (NSI) y un módulo condicional por inversión (COIN, que utiliza un intrón de división de exones y un módulo de tipo trampa génica invertible; véase, por ejemplo, el documento US 2011/0104799); y (c) unidades recombinables que se recombinan tras la exposición a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que (i) carece de la secuencia activadora y la DSC, y (ii) contiene el NSI en orientación sentido y el COIN en orientación antisentido.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un casete de selección. En una realización, el casete de selección comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección, en el que la secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a un promotor. En una realización, el promotor es activo en una célula de mamífero. En una realización, el ácido nucleico es activo en una célula eucariota. En una realización, el casete de selección está flanqueado con secuencias objetivo de recombinación específicas del sitio. En una realización, el marcador de selección se selecciona de neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S desaminasa (bsrr) , xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt), y timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-k), y una combinación de los mismos.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un gen informador unido operativamente a un promotor, en el que el gen informador codifica una proteína informadora seleccionada del grupo que consiste en LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed , mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina y una combinación de las mismas. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor inducible. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor endógeno. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor exógeno. En una realización, el gen informador se expresa en un tipo de célula específico. En una realización, el gen informador se expresa de una manera específica de tejido. En una realización, el gen informador se expresa en una forma específica de la etapa de desarrollo.

En una realización, la integración del ácido nucleico insertado en el locus genómico objetivo introduce una o más modificaciones genéticas como se describe en este documento. En una realización, la modificación genética es una eliminación de una secuencia de ácido nucleico endógena. En una realización, la modificación genética es una adición de una secuencia de ácido nucleico exógeno en el locus genómico objetivo. En una realización, la modificación genética es un reemplazo de una secuencia de ácido nucleico endógeno con una secuencia de ácido nucleico exógeno en el locus genómico objetivo. En una realización, la secuencia de ácido nucleico exógeno no es una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, la secuencia de ácido nucleico exógeno es una secuencia de ácido nucleico humano. En una realización, la integración del ácido nucleico insertado en el locus genómico objetivo da como resultado una desactivación, una eliminación, una inserción, un reemplazo ("activación"), una mutación puntual, un intercambio de dominios, un intercambio de exones, un intercambio de intrones, un intercambio de secuencias reguladoras, un intercambio de genes, o una combinación de los mismos.

En una realización, el ácido nucleico insertado es homólogo a una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico homóloga a la secuencia de ácido nucleico reemplazada en el locus genómico objetivo de la célula ES de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado es un ácido nucleico humano. En una realización, el ácido nucleico insertado es un fragmento de un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico es un ácido nucleico genómico de ratón, un ácido nucleico genómico humano o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb como se describió anteriormente.

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En una realización, el ácido nucleico insertado es ortólogo a una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico ortóloga a la secuencia de ácido nucleico reemplazada en el locus genómico objetivo de la célula ES de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado es un ácido nucleico humano. En una realización, el ácido nucleico insertado es un fragmento de un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico es un ácido nucleico genómico de ratón, un ácido nucleico genómico humano o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico de una especie diferente.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, el sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductivo o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una médula ósea o una célula derivada de médula ósea. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula de bazo. En una realización, el locus genómico comprende una secuencia de ácido nucleico genómico de ratón, una secuencia de ácido nucleico genómico humano, o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B inmadura. En una realización, el ácido nucleico comprende un locus genómico que codifica una proteína expresada en una célula B madura.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico genómico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana.

En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico comprende una secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada funcionalmente unida a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón o secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana, o una combinación de las mismas. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y una combinación de las mismas. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada comprende un CH1-bisagra-CH2-CH3. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico comprende una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reordenada operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina es una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón o una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana o una combinación de las mismas. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y una combinación de las mismas. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada comprende CH1-bisagra-CH2-CH3.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico genómico que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico comprende una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera λ y/o κ humana no reordenada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico comprende una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera λ o κ humana reordenada operablemente unida a una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana o de ratón seleccionada de una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera λ y una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena ligera κ. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera λ o κ no reordenada o reordenada se une operativamente a una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana o de ratón seleccionada de una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera λ y una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera κ.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano codifica una proteína extracelular. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano codifica un ligando para un receptor. En una realización, el ligando es una citoquina. En una realización, la citoquina es una quimioquina seleccionada de CCL, CXCL, CX3CL y XCL. En una realización, la citoquina es un factor de necrosis tumoral (TNF). En una realización, la citoquina es una interleuquina (IL). En una realización, la interleuquina se selecciona de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL -11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, y IL-36. En una realización, la interleuquina es IL-2. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico humano codifica una proteína citoplasmática. En una realización, la

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secuencia de ácido nucleico genómico humano codifica una proteína de membrana. En una realización, la proteína de membrana es un receptor. En una realización, el receptor es un receptor de citoquina. En una realización, el receptor de citoquina es un receptor de interleuquina. En una realización, el receptor de interleuquina es un receptor alfa de interleuquina 2. En una realización, el receptor de interleuquina es un receptor beta de interleuquina 2. En una realización, el receptor de interleuquina es un receptor gamma de interleuquina 2. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico humano codifica una proteína nuclear. En una realización, la proteína nuclear es un receptor nuclear.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una modificación genética en una secuencia codificante. En una realización, la modificación genética comprende una mutación por eliminación de una secuencia codificante. En una realización, la modificación genética comprende una fusión de dos secuencias codificantes endógenas.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano que codifica una proteína humana mutante. En una realización, la proteína humana mutante se caracteriza por una característica de unión alterada, localización alterada, expresión alterada y/o patrón de expresión alterado. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano comprende al menos un alelo de enfermedad humana. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad neurológica. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad cardiovascular. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad renal. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad muscular. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad de la sangre. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de un gen causante de cáncer. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad del sistema inmune. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo dominante. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo recesivo. En una realización, el alelo de la enfermedad humana comprende un alelo de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia reguladora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia promotora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia potenciadora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia de unión a represor transcripcional. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano, en el que la secuencia de ácido nucleico humano comprende una eliminación de una secuencia que codifica una proteína, pero no comprende una eliminación de una secuencia que codifica una proteína. En una realización, la eliminación de la secuencia de codificación no proteica comprende una eliminación de una secuencia reguladora. En una realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia promotora. En una realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia potenciadora. En una realización, la etapa de selección (b) se lleva a cabo mediante una modificación del ensayo de alelos (MOA). En una realización, el método de acuerdo con este aspecto comprende adicionalmente (c) introducir la célula ES de ratón modificada en un embrión en estadio de premórula; y (d) incubar el embrión hasta la etapa de blastocisto, opcionalmente en el que el método comprende producir un ratón F0 a partir del embrión implantado en una madre sustituta; y (e) identificar un ratón que porta el locus genómico genéticamente modificado.

La divulgación se refiere a una célula de mamífero hecha con un método como se describe en la presente memoria. En una realización, la célula de mamífero comprende un ácido nucleico insertado que comprende una o más modificaciones genéticas como se describe en este documento en un locus genómico objetivo.

En una realización, la célula de mamífero es una célula pluripotente. En una realización, la célula pluripotente es una célula madre embrionaria (ES). En una realización, la célula pluripotente es una célula madre pluripotente inducida (iPS). En una realización, la célula pluripotente inducida (iPS) se deriva de un fibroblasto. En una realización, la célula pluripotente inducida (iPS) se deriva de un fibroblasto humano. En una realización, la célula pluripotente es una célula madre hematopoyética (HSC). En una realización, la célula pluripotente es una célula madre neuronal (NSC). En una realización, la célula pluripotente es una célula madre de epiblasto. En una realización, la célula pluripotente es una célula progenitora restringida en el desarrollo.

En una realización, la célula pluripotente es una célula pluripotente de ratón. En una realización, la célula pluripotente es una célula madre embrionaria (ES) de ratón.

En una realización, la célula de mamífero es una célula inmortalizada de ratón o de rata. En una realización, la célula de mamífero es una célula inmortalizada humana. En una realización, la célula de mamífero es un fibroblasto humano. En una realización, la célula de mamífero es una célula cancerosa. En una realización, la célula de mamífero es una célula cancerosa humana.

En una realización, el locus genómico objetivo se selecciona a partir de un locus FcER1a, un locus TLR4, un locus PRLR, un locus Notch4, un locus Accn2, un locus ADAMTS5, un locus TRPA1, un locus FoIH1, un locus de LRP5, y un locus ERBB4.

En una realización, el locus genómico objetivo comprende una o más modificaciones genéticas como se describe en

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este documento. En una realización, la modificación genética es una eliminación de una secuencia de ácido nucleico endógena. En una realización, la modificación genética es una adición de una secuencia de ácido nucleico exógeno en el locus genómico objetivo. En una realización, la modificación genética es un reemplazo de una secuencia de ácido nucleico endógeno con una secuencia de ácido nucleico exógeno en el locus genómico objetivo. En una realización, la secuencia de ácido nucleico exógeno no es una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, la secuencia de ácido nucleico exógeno es una secuencia de ácido nucleico humano. En una realización, el locus genómico objetivo comprende una modificación seleccionada de una desactivación, una eliminación, una inserción, un reemplazo ("activación"), una mutación puntual, un intercambio de dominios, un intercambio de exones, un intercambio de intrones, un intercambio de secuencias reguladoras, un intercambio de genes, o una combinación de los mismos.

En una realización, el locus genómico objetivo comprende un ácido nucleico insertado que es homólogo a una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado es un ácido nucleico humano. En una realización, el ácido nucleico insertado es un fragmento de un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico es un ácido nucleico genómico de ratón, un ácido nucleico genómico humano o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb como se describió anteriormente.

En una realización, el locus genómico objetivo comprende un ácido nucleico insertado que es ortólogo a una secuencia de ácido nucleico de ratón. En una realización, el ácido nucleico insertado es un ácido nucleico humano. En una realización, el ácido nucleico insertado es un fragmento de un ácido nucleico genómico. En una realización, el ácido nucleico genómico es un ácido nucleico genómico de ratón, un ácido nucleico genómico humano o una combinación de los mismos. En una realización, el ácido nucleico insertado varía de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 200 kb como se describió anteriormente.

En una realización, el locus genómico objetivo comprende un alelo condicional. En una realización, el alelo condicional es un alelo multifuncional, como se describe en el documento US 2011/0104799. En una realización, el alelo condicional comprende: (a) una secuencia activadora en orientación sentido con respecto a la transcripción de un gen objetivo, y un casete de selección de fármaco en orientación sentido o antisentido; (b) en orientación antisentido una secuencia de nucleótidos de interés (NSI) y un módulo condicional por inversión (COIN, que utiliza un intrón de división de exones y un módulo de tipo trampa génica invertible; véase, por ejemplo, el documento US 2011/0104799,); y (c) unidades recombinables que se recombinan tras la exposición a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que (i) carece de la secuencia activadora y la DSC, y (ii) contiene el NSI en orientación sentido y el COIN en orientación antisentido.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende un gen informador unido operativamente a un promotor, en el que el gen informador codifica una proteína informadora seleccionada del grupo que consiste de LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed , mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, proteína fluorescente amarilla (EYFP), Emerald, proteína fluorescente verde potenciada (EGFP), CyPet, proteína fluorescente cian (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferasa, fosfatasa alcalina, y una combinación de las mismas. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor inducible. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor endógeno. En una realización, el gen informador se expresa bajo el control de un promotor exógeno. En una realización, el gen informador se expresa en un tipo de célula específico. En una realización, el gen informador se expresa de una manera específica del tejido. En una realización, el gen informador se expresa en una forma específica de la etapa de desarrollo.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano que codifica una proteína expresada en el sistema nervioso, el sistema esquelético, el sistema digestivo, el sistema circulatorio, el sistema muscular, el sistema respiratorio, el sistema cardiovascular, el sistema linfático, el sistema endocrino, el sistema urinario, el sistema reproductivo o una combinación de los mismos. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano codifica una proteína expresada en una médula ósea o una célula derivada de médula ósea. En una realización, el genoma de la célula ES de ratón comprende un locus genómico humano que codifica una proteína expresada en una célula de bazo. En una realización, el ácido nucleico humano codifica una proteína expresada en una célula B. En una realización, el ácido nucleico humano codifica una proteína expresada en una célula B inmadura. En una realización, el ácido nucleico humano codifica una proteína expresada en una célula B madura.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano comprende una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana no reordenada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina no reordenada está operativamente unida a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y una combinación de las mismos. En una realización, la secuencia de ácido nucleico

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de la región constante de cadena pesada comprende una CH1-bisagra-CH2-CH3. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano comprende una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana reordenada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana está unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón, a una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina humana. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina se selecciona de un CH1, una bisagra, un CH2, un CH3 y una combinación de las mismas. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena pesada comprende una CH1-bisagra-CH2-CH3.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano que codifica una secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano comprende una secuencia de ácido nucleico de región variable de cadena ligera λ y/o κ humana no reordenada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano comprende una secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera λ y/o κ humana reordenada. En una realización, la secuencia de ácido nucleico de la región variable de cadena ligera λ y/o κ no reordenada está unida operativamente a una secuencia de ácido nucleico de región constante de cadena ligera de inmunoglobulina humana o de ratón seleccionada de una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena ligera λ y una secuencia de ácido nucleico de la región constante de cadena ligera κ.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano codifica una proteína extracelular. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano codifica un ligando para un receptor. En una realización, el ligando es una citoquina. En una realización, la citoquina es una quimioquina seleccionada de CCL, CXCL, CX3CL y XCL. En una realización, la citoquina es un factor de necrosis tumoral (TNF). En una realización, la citoquina es una interleuquina (IL). En una realización, la interleuquina se selecciona de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, y IL-36. En una realización, la interleuquina es IL-2. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico humano codifica una proteína citoplasmática. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico humano codifica una proteína de membrana. En una realización, la proteína de membrana es un receptor. En una realización, el receptor es un receptor de citoquina. En una realización, el receptor de citoquina es un receptor de interleuquina. En una realización, el receptor de interleuquina es un receptor alfa de interleuquina 2. En una realización, el receptor de interleuquina es un receptor beta de interleuquina 2. En una realización, el receptor de interleuquina es un receptor gamma de interleuquina 2. En una realización, la secuencia de ácido nucleico genómico humano codifica una proteína nuclear. En una realización, la proteína nuclear es un receptor nuclear.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una modificación genética en una secuencia codificante. En una realización, la modificación genética comprende una mutación por eliminación de una secuencia codificante. En una realización, la modificación genética comprende una fusión de dos secuencias codificantes endógenas.

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano que codifica una proteína humana mutante. En una realización, la proteína humana mutante se caracteriza por una característica de unión alterada, localización alterada, expresión alterada y/o patrón de expresión alterado. En una realización, la secuencia de ácido nucleico humano comprende al menos un alelo de enfermedad humana. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad neurológica. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad cardiovascular. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad renal. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad muscular. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad de la sangre. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de un gen causante de cáncer. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo de una enfermedad del sistema inmune. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo dominante. En una realización, el alelo de la enfermedad humana es un alelo recesivo. En una realización, el alelo de la enfermedad humana comprende un alelo de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP).

En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia reguladora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia promotora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia potenciadora. En una realización, la secuencia reguladora es una secuencia de unión a represor transcripcional. En una realización, el ácido nucleico insertado comprende una secuencia de ácido nucleico humano, en el que la secuencia de ácido nucleico humano comprende una eliminación de una secuencia que no codifica una proteína, pero no comprende una eliminación de una secuencia que codifica una proteína. En una realización, la eliminación de la secuencia que no codifica proteína comprende una eliminación de una secuencia reguladora. En una realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia promotora. En una realización, la eliminación del elemento regulador comprende una eliminación de una secuencia potenciadora.

La divulgación se refiere a un método para fabricar un animal no humano que comprende en su línea germinal una o

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