ES2683316T3 - Vacunas que comprenden colesterol y CpG como únicas moléculas transportadoras de adyuvante - Google Patents

Vacunas que comprenden colesterol y CpG como únicas moléculas transportadoras de adyuvante Download PDF

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Abstract

Una vacuna que comprende uno o más antígenos y un adyuvante, en la que el uno o más antígenos son cada uno de forma independiente, un antígeno microbiano, un autoantígeno, un antígeno tumoral, un alérgeno, o una sustancia adictiva y el adyuvante consiste en uno o más oligonucleótidos CpG aislados o un agonista del TLR que es un oligorribonucleótido, y colesterol.

Description

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DESCRIPCION
Vacunas que comprenden colesterol y CpG como unicas moleculas transportadoras de adyuvante Campo de la invencion
La invencion se refiere a vacunas que tienen uno o mas antfgenos y un adyuvante, en la que el adyuvante consiste en uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados y colesterol, y los usos de las mismas.
Antecedentes de la invencion
Se ha descubierto que el colesterol puede potenciar la actividad de las moleculas inmunomoduladoras y, por tanto, la combinacion de colesterol y moleculas inmunomoduladoras puede utilizarse en el tratamiento y/o la prevencion de trastornos humanos y animales. Se describen vacunas que comprenden uno o mas antigenos y colesterol, y vacunas que comprenden uno o mas antigenos, una o mas moleculas inmunomoduladoras y colesterol. El documento WO 2009/15960 desvela vacunas que contienen formulaciones adyuvantes que comprenden una saponina, un esterol, un compuesto de amonio cuaternario y un polfmero.
Sumario de la invencion
La invencion se refiere a una vacuna que comprende uno o mas antfgenos y un adyuvante, en el que el adyuvante consiste en uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados y colesterol. El uno o mas antigenos son cada uno de forma independiente, un antigeno microbiano, un autoantigeno, un antigeno tumoral, un alergeno, o una sustancia adictiva.
En aspectos, la vacuna comprende ademas un transportador farmaceutico. En algunos aspectos, el uno o mas antfgenos son cada uno de forma independiente, un antigeno microbiano, un autoantfgeno, un antfgeno tumoral, un alergeno, o una sustancia adictiva.
En determinados aspectos, la invencion se refiere a una vacuna que comprende uno o mas antigenos y un adyuvante, en la que el adyuvante consiste en uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados y colesterol para su uso en un procedimiento de inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno en el sujeto.
Descripcion de las figuras
Figura 1: Graficos que representan secrecion de citoquinas espedfica de antfgeno por linfocitos T sin presencia de adyuvante o en presencia de CpG o CpG + colesterol como adyuvante. Figura 1a. Grafico de linfocitos T CD4+ que secretan de citoquinas unicas o dobles. Figura 1b. Grafico de linfocitos T CD4+ que secretan citoquinas triples. Figura 1c. Grafico de linfocitos T CD8+ que secretan de citoquinas unicas o dobles. Figura 1d. Grafico de linfocitos T CD8+ que secretan citoquinas triples.
Figura 2: Grafico de produccion de IL-2 (Figura 2a) e IFN-y (Figura 2b) sin presencia de adyuvante, CpG y CpG + colesterol.
Figura 3: Grafico de respuestas de linfocitos T CD8+ espedficos de ovoalbumina sin presencia de adyuvante o en presencia de CpG o CpG + colesterol como adyuvante. Figuras 3a-3b: respuestas de linfocitos T citotoxicos, Figuras 3c-3d: poblacion de linfocitos T CD8+ espedficos de antfgeno.
Figura 4: Grafico de tttulos de anticuerpo espedficos de ovoalbumina sin presencia de adyuvante o en presencia de CpG o CpG + colesterol como adyuvante. Los numeros encima de cada barra representan la relacion de IgG2c/IgG1.
Figura 5: Imagen de microscopio electronico por transmision del antfgeno, CpG y colesterol.
Figura 6: Grafico que representa las reacciones en los sitios de inyeccion en terneros inmunizados con la vacuna vmca inactivada pentavalente BVDV 1 y 2, IBRV, PI3V y BRSV en presencia de CpG + colesterol (en las relaciones 1:1 o 1:10 de CpG:colesterol), Advasure-DEAE/Dextrano, QCDCR o QCDCR + CpG. Algunos animales se inmunizaron con la vacuna comercial. Los animales placebo recibieron solucion salina esteril. La Tabla 1 representa graficamente el porcentaje de terneros con enfermedad clmica, fiebre, leucopenia o viremia tras la estimulacion con BVDV-2 despues de la vacunacion con la vacuna vmca inactivada pentavalente BVDV 1 y 2, IBRV, PI3V y BRSV en presencia de CpG + colesterol (en las relaciones 1:1 o 1:10 de CpG:colesterol), Advasure-DEAE/Dextrano, QCDCR o QCDCR + CpG. Algunos animales se inmunizaron con la vacuna comercial. Los animales placebo recibieron solucion salina esteril.
Figura 7: Grafico de respuesta del anticuerpos espedfico de antfgeno en cerdos inmunizados con pertactina (p68) formulada con diversos adyuvantes que incluyen CPG + colesterol.
Descripcion de secuencias
SEQ ID NO:1 - CPG 7909 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3'.
SEQ ID NO:2 - CpG 24555 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3'.
SEQ ID NO:3 - CPG 10104 5' TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3'.
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35
40
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SEQ ID NO:4 - CPG 10101 5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3'.
SEQ ID NO:5 - CPG 10109 5' TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTCCCG 3'.
SEQ ID NO:6 - CpG 23407
5' T*C-G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'
SEQ ID NO:7 -CPG 21798
5' T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:8 -CPG 23430
5' T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:9 -CpG 24558
5' T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'.
SEQ ID NO:10 -CPG 23871
5' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:11 - CPG 23873
5' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'.
SEQ ID NO:12 -CPG 23874
5' *C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3'.
SEQ ID NO:13 -CPG 23875
5' EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:14 -CpG 23877
5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3'.
SEQ ID NO:15 -CpG 23878
5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3'.
SEQ ID NO:16 - poli I:C ODN1a 5'- ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC-3'.
SEQ ID NO:17 - 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3'.
SEQ ID NO:18 - 5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3'.
SEQ ID NO:19 - 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3'.
SEQ ID NO:20 - 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3'.
SEQ ID NO:21 - 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3'.
SEQ ID NO:22 - 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3'.
SEQ ID NO:23 - 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3'.
SEQ ID NO:24 - 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3'.
SEQ ID NO:25 - 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3'.
SEQ ID NO:26 - 5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:27 - 5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:28 - 5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:29 - 5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:30 - 5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:31 - 5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:32 - 5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:33 - 5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:34 - 5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:35 - 5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:36 - 5' TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3'.
SEQ ID NO:37 - 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:38 - 5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:39 - 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:40 - 5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:41 - 5' T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:42 - 5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:43 - 5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:44 - 5' T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:45 - 5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:46 - 5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'.
SEQ ID NO:47 - 5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3'.
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(*) representa la presencia de un enlace internucleotido estabilizado y _ representa un enlace fosfodiester. J representa un nucleotido modificado con yodo y E representa un nucleotido modificado con etilo.
Descripcion detallada de la invencion
La invencion se refiere a vacunas que tienen uno o mas antfgenos y un adyuvante, en el que el adyuvante consiste en uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados y colesterol. En aspectos de la invencion, se desvela el uso de la vacuna de la invencion en procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno en un sujeto que lo necesita administrando la vacuna de la invencion. Se desvela tambien el uso de vacunas de la invencion en la
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fabricacion de un medicamento para el tratamiento de un trastorno.
El uno o mas antigeno(s) son cada uno de forma independiente, un antigeno microbiano, un autoantigeno, un antfgeno tumoral, un alergeno, o una sustancia adictiva. En algunos aspectos de la invencion, un agente microbiano es de origen bacteriano, vmco o parasttico. En algunos aspectos de la invencion, el antigeno es un peptido, un peptido conjugado a una protema transportadora, un polipeptido, una protema recombinante, una protema purificada, un patogeno muerto completo, un virus atenuado vivo, una bacteria atenuada viva, un antigeno expresado en un vector vmco o bacteriano, un polisacarido, un polisacarido conjugado a una protema transportadora, una protema conjugada a una partfcula analoga a virus, un hapteno, un hapteno conjugado a una protema transportadora o a una molecula pequena.
En aspectos de la invencion, cuando el antfgeno es de origen bacteriano, el antfgeno bacteriano es una bacteria muerta completa, una bacteria atenuada viva o protemas purificadas bacterianas.
En aspectos de la invencion, una bacteria incluye, aunque no de forma limitativa, Acinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinomyces israelii, Actinomyces viscosus, Aeromonas hydrophila, Alcaliges eutrophus, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, especies de Bacillus, Bacillus antracis, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, especies de Bacteroides, especies de Bordetella, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, especies de Brucella, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, especies de Brachyspira. Brachyspira hyodysenteria, Brachyspira pilosicoli, especies de Camphylobacter, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, especies de Chlamydophila, Chromobacterium viscosum, especies de Clostridium, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, especies de Corynebacterium, Corynebacterium diphtheriae, Ehrlichia canis, especies de Enterobacter, Enterobacter aerogenes, especies de Enterococcus, Erysipelothrix rhusiopathieae, especies de Escherichia, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, especies de Haemophilus, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, especies de Helicobacter, Helicobacter pylori, Helicobacter suis, especies de Klebsiella, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus acidophilis, Lawsonia intracellularis, especies de Legionella, Legionella pneumophilia, especies de Leptospira, such as Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjoprajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira, Leptospira bratislava, especies de Listeria, Listeria monocytogenes, Meningococcal bacteria, especies de Moraxella, especies de Mycobacterium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansaii, Mycobacterium gordonae, especies de Mycoplasma, tales como, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, especies de Neisseria, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Odoribacter denticanis, especies de Pasteurella, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas gulae, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, especies de Proteus, Proteus vulgaris, especies de Pseudomonas, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Psychrobacter immobilis, Rickettsia spp, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsia, especies de Salmonella, Salmonella bongori, Salmonella choleraeuis, Salmonella dublin, Salmonella enterica, Salmonella newport, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Serratia marcescens, especies de Shigella, Spirlina platensis, especies de Staphylococci, Staphyloccoccus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, especies de Streptococcus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus beta hemolfticos, Streptococcus pyogenes (Grupo A de Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B de Streptococcus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus (subespecies anaerobias), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., especies de Treponema, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema palladium, Treponema pertenue, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, especies de Vibrio, Vibrio cholerae, especies de Yersinia y combinaciones de las mismas.
Los polipeptidos o polisacaridos de patogenos bacterianos incluyen, aunque no de forma limitativa, una protema de membrana externa regulada por hierro (IROMP), una protema de membrana externa (OMP), y una protema A de Aeromonis salmonicida que produce forunculosis, una protema p57 de Renibacterium salmoninarum que produce enfermedad renal bacteriana (BKD), un antfgeno asociado a superficie mayor (msa), una citotoxina expresada superficialmente (mpr), una hemolisina expresada superficialmente (ish), y un antfgeno flagelar de yersiniosis; una protema extracelular (ECP), una IROMP, y una protema estructural de pasteurelosis; una OMP y una protema flagelar de Vibrosis anguillarum y V. ordalii; una protema flagelar, una protema OMP, aroA, y purA de Edwardsiellosis ictaluri y E. tarda; y un antfgeno superficial de Ichthyophthirius; y una protema estructural y reguladora de Cytophaga columnari; y una protema estructural y reguladora de Rickettsia, IsdA, ClfA, ClfB, Opp3A, HLA y polisacaridos capsulares de Staphylococcus aureus.
En aspectos de la invencion, cuando el antfgeno es de origen vmco, el antfgeno vmco es un virus muerto o inactivado completamente, un virus atenuado vivo o protemas o peptidos purificados vmcos.
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En algunos aspectos, el virus es uno que infecta animales incluyendo, aunque no de forma limitativa, Virus del herpes aviar, Gripe aviar, Virus de la leucosis aviar, Paramixovirus aviar, Virus de la enfermedad de Border, Coronavirus bovino, Virus de la fiebre effmera bovina, Virus del herpes bovino, Virus de la inmunodeficiencia bovina, Virus de la leucemia bovina, Virus 3 paragripal bovino, Virus sincitial respiratorio bovino, Virus de la diarrea vmca bovina (BVDV), BVDV de Tipo I, BVDV de Tipo II, Adenovirus canino, Coronavirus canino (CCV), Virus del moquillo canino, Virus del herpes canino, Virus del herpes equino, Virus de la gripe canina, Virus paragripal canino, Parvovirus canino, Coronavirus respiratorio canino, Virus de la peste porcina clasica, Virus de la encefalitis equina oriental (EEE), Virus de la anemia infecciosa equina, Virus de la gripe equina, Virus del Nilo occidental, Calicivirus de felino, Coronavirus enterico de felino, Virus de la inmunodeficiencia felina, Virus de la peritonitis infecciosa felina, Virus del herpes felino, Virus de la gripe felina, Virus de la leucemia felina (FeLV), Virus de la rinotraqueftis vmca de felino, Lentivirus, Virus de la enfermedad de Marek, Virus de la enfermedad de Newcastle, Virus del herpes ovino, Paragripal 3 de ovino, Virus de la neumoma progresiva, Virus de adenocarcinoma pulmonar ovino, VCC pantropico, Circovirus de porcino (PCV) de Tipo I, PCV de Tipo II, Virus de la diarrea epidermica de porcino, Virus de la encefalomielitis hemaglutinante de porcino, Virus del herpes porcino, Parvovirus de porcino, Virus del smdrome reproductor y respiratorio de porcino (PRRS), Virus de la pseudorrabia, Rabia, Rotovirus, Rinovirus, Virus de la peste bovina, Virus de la gripe porcina, Virus de lagastroenteritis transmisible, Coronavirus de pavo, Virus de la encefalitis equina venezolana, Virus de la estomatitis vesicular, Virus del Nilo occidental, Virus de la encefalitis equina occidental y combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, el virus es uno que infecta seres humanos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, Adenoviridae (la mayona de los adenovirus); Arena viridae (virus de las fiebres hemorragicas); Astrovirus; Bungaviridae (por ejemplo, Virus Hantaan, Virus bunga, Flebovirus y virus Nairo); Calciviridae (por ejemplo, cepas que producen gastroenteritis); Coronoviridae (por ejemplo, coronavirus); Filoviridae (por ejemplo, virus ebola); Flaviridae (por ejemplo, virus de la hepatitis C, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Hepadnaviridae (virus de la hepatitis B); Herpesviridae (virus del herpes simple (VHS) 1 y 2, virus de la varicela zoster, citomegalovirus (CMV), virus del herpes); Iridoviridae (por ejemplo, Virus de la peste porcina africana); Virus de Norwalk y relacionados; Ortomixoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus paragripales, virus de las paperas, virus del sarampion, virus sincitial respiratorio); Parvoviridae (parvovirus); Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Poxviridae (virus variola, virus vaccinia, virus de la viruela); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotavirus); Retroviridae (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana, tales como VIH-1o VIH-2 (denominado tambien HTLV-III, lAv o HTLV-III/LAV, o VIH-III; y otros aislados, tales como VIH-LP); Rhabdoviradae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubeola); y virus sin clasificar (por ejemplo, los agentes etiologicos de las encefalopatfas espongiformes, el agente de la hepatitis delta (se piensa que es un satelite defectivo del virus de la hepatitis B).
En aspectos de la invencion, cuando el antfgeno es de origen parasttico, el parasito es una protema procedente de Anaplasma, Ancylostoma (anquilostomas), Ascaris, Babesia, Coccidia, Cryptosporidium parvum, Dirofilaria (filarias), especies de Eimeria, Fasciola hepatica(parasito hepatico), Giardia, Hammondia, Isopsora, especies de Leishmania, Neospora caninum, Sarcocystis, Schistosoma, Strongyloides, Taenia, Toxoplasma gondii, especies de Trichinella, especies de Trichomonas o especies de Trypanosoma sus combinaciones.
En algunos aspectos, el parasito es un parasito externo. En algunos aspectos, un parasito externo incluye, aunque no de forma limitativa, garrapatas, incluyendo especies de Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, o Haemaphysalis, y combinaciones de los mismos.
En aspectos de la invencion, cuando un antfgeno es un autoantfgeno, es un antfgeno de las propias celulas o productos celulares de un sujeto que produce una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunos aspectos, un autoantfgeno incluye, aunque no de forma limitativa, un antfgeno tumoral, un antfgeno asociado con la enfermedad de Alzheimer, un antfgeno contra un anticuerpo, o un antfgeno que se expresa a partir de elementos retrovmcos endogenos humanos. Un antfgeno asociado con la enfermedad de Alzheimer puede ser tau o p-amiloide. Un antfgeno contra un anticuerpo puede ser un antfgeno contra un anticuerpo humano, por ejemplo, en algunas realizaciones, el antfgeno es IgE.
En aspectos de la invencion, cuando el antfgeno es un antfgeno tumoral, el antfgeno tumoral es uno o mas de WT1, MUC1, LMP2, VPH E6 o VPH E7, EGFR o una forma variante, por ejemplo, EGFRvIII, HER-2/neu, Idiotipo, MAGE A3, p53 no mutante, NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MARTI, Mutante de Ras, gp100, mutante de p53, Proteinasa3 (PR1), bcr-abl, Tirosinasa, Survivina, PSA, hTERT, Puntos de rotura de la translocacion del sarcoma, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG (gen de fusion TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, Receptor de androgenos, Ciclina B1, acido polisialico, MYCN, RhoC, TRP-2, GD3, Fucosil GM1, Mesotelina, PSCA, MAGE A1, sLe (animal), CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, Anhidrasa carbonica IX, PAX5, OY-TES1, protema de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumain, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, fAp, PDGFR-beta, MAD-CT-2, o antfgeno 1 relacionado con Fos. Dichos antfgenos tumorales se han clasificado segun criterios tales como a) la funcion terapeutica, b) la inmunogenicidad, c) el papel del antfgeno en la oncogenicidad, d) la especificidad, nivel de expresion y porcentaje de celulas positivas al antfgeno, e) la expresion de los citoblastos, f) el numero de pacientes con canceres positivos a
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antigenos, g) el numero de epttopos antigenicos y h) la localizacion celular de la expresion antigenica (vease Cheever, M. A. y col., Clinical Cancer Research, 1 de septiembre de 2009, 15(17):5323-5337). En algunas realizaciones, el antigeno tumoral es uno o mas de survivina, Her-2, EFGRvIII, PSA, PAP o PMSA.
En aspectos de la invencion, cuando un antigeno es un alergeno, este se refiere a una sustancia (antigeno) que puede inducir una respuesta alergica o asmatica en un sujeto susceptible. La lista de alergenos es enorme y puede incluir polenes, venenos de insectos, polvo de caspa de animales, esporas y farmacos fungicos (por ejemplo, penicilina). Los ejemplos de alergenos naturales, animales y vegetales, incluyen, aunque no de forma limitativa, protemas espedficas de los siguientes generos: Agropyron (por ejemplo, Agropyron repens); Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba); Alder; Alnus (Alnus glutinosa); Alternaria (Alternaria alternata); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum); Apis (por ejemplo, Apis multiflorum); Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius); Artemisia (Artemisia vulgaris); Avena (por ejemplo, Avena sativa); Betula (Betula verrucosa); Blattella (por ejemplo, Blattella germanica); Bromus (por ejemplo, Bromus inermis); Caninos (Canis familiaris); Chamaecyparis (por ejemplo, Chamaecyparis obtusa); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa); Dactylis (por ejemplo, Dactylis glomerata); Dermatophagoides (por ejemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Festuca (por ejemplo, Festuca elatior); Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus); Juniperus (por ejemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium multiflorum); Olea (Olea europeae); Parietaria (por ejemplo, Parietaria officinalis o Parietaria judaica); Paspalum (por ejemplo, Paspalum notatum); Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana); Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea); Phleum (por ejemplo, Phleum pratense); Plantago (por ejemplo, Plantago lanceolata); Poa (por ejemplo, Poa pratensis o Poa compressa); Quercus (Quercus alba); Secale (por ejemplo, Secale cereale); Sorghum (por ejemplo, Sorghum halepensis); Thuya (por ejemplo, Thuya orientalis); y Triticum (por ejemplo, Triticum aestivum), y sus combinaciones.
En aspectos de la invencion, cuando un antfgeno es una sustancia adictiva, es cualquier sustancia qmmica o biologica, incluyendo sustancias sinteticas o artificiales, que hace que un sujeto desarrolle una adiccion a esta sustancia. En algunos aspectos, una sustancia adictiva es nicotina o cocama. En algunas realizaciones, el antfgeno en una vacuna contra una adiccion de nicotina es nicotina o un hapteno analogo a nicotina conjugado con un transportador. En algunas realizaciones, el transportador al cual se conjuga la nicotina o el hapteno analogo a nicotina es el toxoide de la difteria.
En aspectos de la invencion, un antfgeno o un hapteno se conjuga a una protema transportadora. En algunos aspectos, la protema transportadora es un toxoide o derivado bacteriano, una exotoxina de Pseudomonas, KLH o una partmula analoga a virus. En algunos aspectos, un toxoide bacteriano es el toxoide de la difteria o uno de sus derivados. En algunos aspectos, un toxoide bacteriano es CRM197. En algunos aspectos, la partmula analoga a virus es HBsAg, HBcAg, bacteriofago Qp de E. coli, virus de Norwalk o gripe HA.
Los aspectos de la invencion se refieren a vacunas que tienen colesterol. El colesterol es una sustancia cristalina de color blanco con una formula qmmica de C27H45OH. Es un alcohol de hidrocarburo dclico que se clasifica como un lfpido. Un lfpido es cualquier grupos de compuestos organicos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, las grasas, aceites, ceras, esteroles y trigliceridos, que son insolubles en agua pero que son solubles en disolventes organicos no polares, son oleosos al tacto y junto con los hidratos de carbono y las protemas son el material estructural principal de las celulas vivas. El colesterol en insoluble en agua, pero es soluble en numerosos disolventes organicos.
Los esteroles se refieren a compuestos en animales que se producen biologicamente a partir de precursores perpenoides. Comprenden una estructura de anillo esteroide, que tiene un grupo hidroxilo (OH). En algunos aspectos, el grupo hidroxilo puede unirse al carbono-3. La cadena de hidrocarburo del sustituyente de acido graso vana de longitud. En algunos aspectos, la cadena de hidrocarburo puede tener de 16 a 20 atomos de carbono. En algunos aspectos, la cadena de hidrocarburo puede estar saturada o insaturada. Los esteroles pueden contener uno o mas dobles enlaces en la estructura del anillo y pueden incluir tambien una variedad de sustituyentes unidos a los anillos. Los esteroles y sus esteres de acidos grasos pueden ser insolubles en agua. Los esteres de acidos grasos se refieren a cualquier clase de compuestos organicos que corresponden a sales inorganicas, que se forman a partir de una reaccion de condensacion en la que una molecula de un acido organico se une con una molecula de alcohol con la eliminacion de una molecula de agua. En algunos aspectos, los esteroles se refieren a esteroles sinteticos.
En algunos aspectos, los esteroides sinteticos incluyen, aunque no de forma limitativa, glucocorticoides (por ejemplo, prednisona, dexametasona, triamcinolona), mineralocorticoides (por ejemplo, fludrocortisonas), vitamina D (por ejemplo, dihidrotaquiesterol), androgeno (por ejemplo, oxandrolona, nandrolona, esteroides anabolicos), estrogenos (por ejemplo, dietilestilbestrol) y progestinas (por ejemplo, noretindrona, acetato de medroxiprogesterona). En algunos aspectos, se puede usar un colato, por ejemplo, desoxicolato de sodio.
Los esteroles incluyen, aunque no de forma limitativa, esteroides naturales tales como, p-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol, y colesterol. dichos esteroles pueden adquirirse comercialmente. Colesterol, por ejemplo, se desvela en el fndice Merck, 12a Ed., pag. 369.
Los esteroles pueden utilizarse como adyuvante. En algunos aspectos, la cantidad de esterol puede ser de
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aproximadamente 1 pg a aproximadamente 5.000 pg por dosis de vacuna. En algunos aspectos, la cantidad de esterol puede ser de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 4.000 pg por dosis de vacuna, de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 3.000 pg por dosis de vacuna, de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 2.000 pg por dosis de vacuna, o de aproximadamente 1 pg a aproximadamente 1.000 pg por dosis de vacuna. En algunos aspectos, la cantidad de esterol puede ser de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 750 pg por dosis de vacuna, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 500 pg por dosis de vacuna, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 250 pg por dosis de vacuna, de aproximadamente 5 pg a aproximadamente 100 pg por dosis de vacuna, de aproximadamente 15 pg a aproximadamente 100 pg por dosis de vacuna, o de aproximadamente 30 pg aproximadamente 75 pg por dosis de vacuna.
La vacuna tiene uno o mas antfgenos y colesterol. En algunos aspectos, la cantidad de colesterol con respecto a la cantidad de antfgeno es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 veces mayor en peso. En algunos aspectos, la cantidad de colesterol es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces mayor en peso que el antfgeno. En algunos aspectos, la cantidad de colesterol es igual en peso al antfgeno.
En aspectos de la invencion, una vacuna incluye ademas un transportador farmaceutico.
Como se usa en el presente documento, "junto con" o "conjuntamente con" se refiere a una premezcla, una combinacion o estar muy cerca de uno o mas antfgenos, y uno o mas antfgenos y una o mas moleculas inmunomoduladoras. En aspectos, el uno o mas antfgenos y el uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados pueden unirse al colesterol por medios ffsicos a traves de uno o mas enlazadores. Un enlazador incluye, aunque no de forma limitativa, enlazadores directos o indirectos. En aspectos, el uno o mas antfgenos y/o uno o mas oligonucleotidos de CpG y colesterol pueden encapsularse juntos.
En aspectos de la invencion, uno o mas antfgenos pueden premezclarse con uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados. En aspectos, uno o mas antfgenos pueden premezclarse con colesterol. En aspectos, uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados pueden premezclarse con colesterol. En aspectos, una o mas moleculas inmunomoduladoras pueden premezclarse con antfgeno y colesterol. En aspectos, una o mas moleculas inmunomoduladoras pueden premezclarse con colesterol y uno o mas antfgenos pueden estar separados. En aspectos, uno o mas antfgenos pueden premezclarse con colesterol uno o mas oligonucleotidos de CpG pueden estar separados. En aspectos, uno o mas antfgenos y/o uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados pueden estar junto con colesterol.
En aspectos de la invencion, la cantidad de colesterol con respecto a la cantidad de antfgeno es mayor que la cantidad de antfgeno. En algunos aspectos, la cantidad de colesterol con respecto a la cantidad de antfgeno es de aproximadamente 0,1 a 50 veces mayor en peso que el antfgeno. En aspectos, la cantidad de colesterol con respecto a la cantidad de antfgeno es de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 veces, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 veces, de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 veces mayor en peso que el antfgeno. En aspectos, la cantidad de colesterol con respecto a la cantidad de antfgeno es de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces mayor en peso que el antfgeno. En aspectos, la cantidad de colesterol con respecto a la cantidad de antfgeno es igual en peso al antfgeno. En aspectos, el antfgeno puede ser uno o mas antfgenos y el peso del antfgeno es el peso total del uno o mas antfgenos.
Como se desvela en el presente documento, una molecula inmunomoduladora (una o mas moleculas inmunomoduladoras) es una molecula que modula celulas inmunitarias en un sujeto. Este efecto puede estar mediado directamente, por ejemplo, a traves de un receptor, o indirectamente, por ejemplo, a traves de las citoquinas o quimioquinas liberadas desde otra celula inmunitaria que se modula directamente. Una induccion de una respuesta inmunitaria se refiere a cualquier aumento en el numero o actividad de una celula inmunitaria, o un aumento en la expresion o los niveles absolutos de un factor inmunitario, tal como una citoquina. Las celulas inmunitarias incluyen, aunque no de forma limitativa, linfocitos NK, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos B, celulas dendnticas, macrofagos y otras celulas presentadoras de antfgenos. Las citoquinas incluyen, aunque no de forma limitativa, interleuquinas, TNF-a, iFN-a,p y y. En aspectos, un modulador inmunitario es una molecula que cuando se usa con un antfgeno potencia las respuestas inmunitarias humorales (por ejemplo, anticuerpos) y/o celulares (por ejemplo, linfocitos T) espedficas de antfgenos.
En algunos aspectos, una molecula inmunomoduladora es un agonista de TLR, un peptido antimicrobiano, una citoquina, una quimioquina, un ligando de NOD o un oligonucleotido. En algunos aspectos, un agonista de TLR es un oligorribonucleotido (ORN) o una molecula pequena que activa TLR 7 y/o TLR 8. En algunos aspectos, un agonista de TLR es un oligodesoxinucleotido (ODN) que se activa a traves de TLR 9. En algunos aspectos, un agonista de TLR 9 es un ODN que contiene motivos de CpG sin metilar, un oligodesoxinucleotido de Clase B, un oligodesoxinucleotido de Clase C o un oligodesoxinucleotido de Clase P. En algunos aspectos, un agonista de TLR 9 es IMO-2055, IMO-2125 o IMO-2134 (QAX935). en otros aspectos, un agonista de TLR es un poli I:C que activa TLR 3. En algunos aspectos, el poli I:C ODN1a tiene la secuencia 5'- ICI CIC ICI CIC ICI CIC ICI CIC IC-3' SEQ ID NO:16).
En aspectos de la invencion, un oligonucleotido puede abarcar diversas modificaciones y sustituciones qrnmicas, en comparacion con ARN y ADN natural, que implica un puente internucleosido fosfodiester, una unidad de p-D-ribosa
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y/o una base nucleosfdica natural (adenina, guanina, citosina, timina, uracilo). Las personas expertas conocen ejemplos de modificaciones qmmicas, por ejemplo, en Uhlmann E y col. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST y col. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; y Hunziker J y col. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. En algunos aspectos, un oligonucleotido puede tener una o mas modificaciones, en la que cada modificacion se localiza en un puente internucleosido de fosfodiester concreto y/o en una unidad de p-D-ribosa concreta y/o de una base nucleosfdica natural concreta en comparacion con un oligonucleotido de la misma secuencia que esta compuesta de ADN o ARN natural.
En algunos aspectos, los oligonucleotidos pueden comprender una o mas modificaciones y en las que cada modificacion se selecciona independientemente entre:
a) la sustitucion de un puente internucleosido fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido mediante un puente internucleosido modificado,
b) la sustitucion de un puente fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido mediante un puente defosfo,
c) la sustitucion de una unidad de azucar fosfato procedente de la estructura principal de azucar fosfato por otra unidad,
d) la sustitucion de una unidad p-D-ribosa por una unidad de azucar modificada, y
e) la sustitucion de una base nucleosfdica natural por una base nucleosfdica modificada. En aspectos de la invencion, los oligonucleotidos pueden incluir enlaces internucleotidos modificados,
tales como los descritos en a) o b) anteriormente. Estos enlaces modificados pueden ser parcialmente resistentes a la degradacion (por ejemplo, estan estabilizados). Una "molecula de oligonucleotido estabilizada" es un oligonucleotido que es relativamente resistente a la degradacion in vivo (por ejemplo, mediante una exonucleasa o endonucleasa) resultante de dichas modificaciones. Los oligonucleotidos que tienen enlaces fosforotioato, en algunos aspectos, pueden proporcionar una actividad maxima y proteger el oligonucleotido de la degradacion mediante exonucleasas y endonucleasas intracelulares.
Un puente internucleosido fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido puede estar sustituido mediante un puente internucleosido modificado, en el que el puente internucleosido modificado se selecciona, por ejemplo, entre fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, a-hidroxibencil fosfonato, fosfato- alquil (C-i-C21)-O-ester, fosfato-[aril (C6-C-i2)-alquil (C-i-C21)-O-]ester, puentes de alquilfosfonato (C1-C8) y/o arilfosfonato (C6-C12), aril (C7-C12)-a-hidroximetilo (por ejemplo, desvelados en el documento WO 95/01363), en el que arilo (C6-C12), arilo (C6-C20)y arilo (C6-C14) estan opcionalmente sustituidos por halogeno, alquilo, alcoxi, nitro, ciano, y donde R1 y R2 son, independientemente entre sf, hidrogeno, alquilo (C1-C18), arilo (C6-C20), aril (C6-C14)- alquilo-(C1-C8), preferentemente hidrogeno, alquilo (C1-C8), preferentemente alquilo (C1-C4) y/o metoxietilo, o R1 y R2 forman, junto con el atomo de nitrogeno que los contiene, un anillo heterodclico de 5-6 miembros que puede contener ademas un heteroatomo adicional procedente del grupo O, S y N.
La sustitucion de un puente fosfodiester localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleosido mediante un puente defosfo (se describen puentes defosfo, por ejemplo, en Uhlmann E y Peyman A en "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Capttulo 16, pag. 355 ff), en el que se selecciona, por ejemplo, un puente defosfo entre los puentes defosfo de los grupos formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetil-hidrazo, dimetilensulfona y/o sililo.
Una unidad de azucar fosfato (es decir, una p-D-ribosa y un puente internucleosido de fosfodiester juntos forman una unidad de azucar fosfato) procedente de la estructura principal del azucar fosfato (es decir una estructura principal de azucar fosfato esta compuesta de unidades de azucar fosfato) puede estar sustituida por otra unidad, en el que la otra unidad es, por ejemplo, adecuada para construir un oligomero "derivado de morfolino" (como se describe, por ejemplo, en Stirchak EP y col. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), es decir, por ejemplo, la sustitucion por una unidad derivada de morfolino; o para construir un acido nucleico de poliamida ("PNA"; como se describe por ejemplo, en Nielsen PE y col. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), es decir, por ejemplo, la sustitucion por una unidad de la estructura principal de PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina. El oligonucleotido puede tener otras modificaciones y sustituciones de la estructura principal del hidrato de carbono, tales como acidos nucleicos peptfdicos con grupos fosfato (PHONA), acidos nucleicos bloqueados (LNA), y oligonucleotidos que tienen secciones de la estructura principal con enlazadores de alquilo o enlazadores de amino. El enlazador de alquilo puede estar ramificado o no ramificado, sustituido o no sustituido, y ser quiralmente puro o una mezcla racemica.
Una unidad de p-ribosa o una unidad de p-D-2'-desoxirribosa puede estar sustituida por una unidad de azucar modificado, en el que la unidad de azucar modificado se selecciona, por ejemplo, entre p-D-ribosa, a-D-2'- desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-F-arabinosa, 2'-O-alquil (C1-C6)-ribosa, preferentemente 2'-O-alquil (C1-C6)-ribosa es 2'-O-metilribosa, 2'-O-alquenil (C2-C6)-ribosa, 2'-[O-alquil (C1-C6)-O-alquil (C1-C6)]- ribosa, 2'-NH2-2'-desoxirribosa, p-D-xilofuranosa, a-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-p-D-eritro-hexopiranosa, y carbodclico (descrito, por ejemplo, en Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320) y/o analogos de azucares de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche y col. (1993) Tetrahedron 49:7223) y/o analogos de bicicloazucares (descritos, por ejemplo, en Tarkov M y col. (1993) Helv Chim Acta 76:481).
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En algunos aspectos, el azucar es 2'-O-metilribosa, para uno o ambos nucleotidos unidos por un enlace internucleosido de tipo fosfodiester o fosfodiester.
Los acidos nucleicos incluyen tambien, aunque no de forma limitativa, purinas y pirimidinas sustituidas tales como C- 5 propina pirimidina y bases modificadas de purina sustituida con 7-desaza-7. Wagner RW y col. (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Las purinas y pirimidinas incluyen, aunque no de forma limitativa, adenina, citosina, guanina, y timina, y otras nucleobases que se producen de forma natural y no naturalmente, restos aromaticos sustituidos y no sustituidos.
Una base modificada es cualquier base que es qmmicamente distinta de las bases naturales que se encuentran normalmente en el ADN y el aRn tales como T, C, G, A, y U, pero que comparten estructuras qrnmicas basicas con estas bases naturales. La base de nucleosido modificada puede seleccionarse, por ejemplo, entre hipoxantina, uracilo, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquil (Ci-C6)-uracilo, 5-alquenil (C2- C6)-uracilo, 5-alquinil (C2-C6)-uracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- hidroxicitosina, 5-alquil (Ci-C6)-citosina, 5-alquenil (C2-C6)-citosina, 5-alquinil (C2-C6)-citosina, 5-clorocitosina, 5- fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, una 7-desazapurina sustituida, preferentemente purina sustituida con 7-desaza-7 y/o purina sustituida con 7-desaza-8, 5-hidroximetilcitosina, N4- alquilcitosina, por ejemplo, N4-etilcitosina, 5-hidroxidesoxicitidina, 5-hidroximetildesoxicitidina, N4-
alquildesoxicitidina, por ejemplo, N4-etildesoxicitidina, 6-tiodesoxiguanosina, y desoxirribonucleosidos de nitropirrol, C5-propinilpirimidina, y diaminopurina, por ejemplo, 2,6-diaminopurina, inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2- amino-6-cloropurina, hipoxantina u otras modificaciones de bases de nucleosidos naturales.
Para algunas formulas descritas en el presente documento, se define un conjunto de bases modificadas. Por ejemplo, la letra Y se usa para referirse a un nucleotido que contiene una citosina o una citosina modificada. Una citosina modificada es un analogo de una base de pirimidina que se produce naturalmente o que no se produce naturalmente que puede sustituir esta base sin deteriorar la actividad inmunoestimuladora o inmunomoduladora del oligonucleotido. Las citosinas modificadas incluyen, aunque no de forma limitativa citosinas 5-sustituidas (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxicitosina, 5- hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina, y 5-alquinil-citosina no sustituida o sustituida), citosinas 6-sustituidas, citosinas N4-sustituidas (por ejemplo, N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo- isocitosina, los analogos de citosina con sistemas de anillos condensados (por ejemplo, N,N'-propileno citosina o fenoxazina), y uracilo y sus derivados (por ejemplo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-bromoviniluracilo, 4-tiouracilo, 5-hidroxiuracilo, 5-propiniluracilo). En algunos aspectos, citosinas incluyen 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5- hidroxicitosina, 5-hidroximetilcitosina, y N4-etilcitosina. En algunos aspectos, la base de citosina esta sustituida por una base universal (por ejemplo, 3-nitropirrol, base-P), un sistema de anillo aromatico (por ejemplo, fluorobenceno o difluorobenceno) o un atomo de hidrogeno (Separador d).
La letra R se usa para referirse a guanina o una base de guanina modificada. Una guanina modificada es un analogo de una base de purina que se produce naturalmente o que no se produce naturalmente que puede sustituir esta base sin deteriorar la actividad inmunoestimuladora o inmunomoduladora del oligonucleotido. Las guaninas modificadas incluyen, aunque no de forma limitativa 7-desazaguanina, guanina sustituida con 7-desaza-7 (tal como, 7-desaza-7-alquinil (C2-C6)guanina), guanina sustituida con 7-desaza-8, hipoxantina, guaninas sustituidas con N2 (por ejemplo, N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidina-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2- aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas sustituidas (por ejemplo, N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina) guanina 8 sustituida (por ejemplo, 8-hidroxiguanina y 8-bromoguanina), y 6-tioguanina. En algunos aspectos, la base de guanina esta sustituida por una base universal (por ejemplo, 4-metil-indol, 5-nitroindol, y base K), un sistema de anillo aromatico (por ejemplo, bencimidazol o dicloro-bencimidazol, amida del acido 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3- carboxflico) o un atomo de hidrogeno (Separador d).
En algunos aspectos, Se contemplan tambien otras modificaciones de bases. Por ejemplo, los restos T en cualquiera de los extremos de un oligonucleotido pueden estar sustituidos por desoxiuridina (U), el G de uno o mas motivos CpG puede estar sustituido con desoxiinosina (I), y la modificacion de los restos G como 7-desaza desoxiguanosina. En algunos aspectos, el T del extremo 5' de un oligonucleotido puede incluir una sustitucion de halogeno. En algunos aspectos, la sustitucion de halogeno es etil-uridina, bromo-uridina, cloro-uridina o yodo-uridina.
Los oligonucleotidos pueden sintetizarse de novo utilizando cualquiera de numerosos procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el procedimiento de la b-cianoetil fosforamidita (Beaucage, S.L., y Caruthers, M.H., Tet. Let. 22:1859, 1981); el procedimiento del nucleosido de H-fosfonato (Garegg y col., Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler y col., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407, 1986, ; Garegg y col., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney y col., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988). Estas qrnmicas se pueden llevar a cabo mediante una variedad de sintetizadores de acido nucleico automatizados disponibles en el mercado. Estos oligonucleotidos se denominan oligonucleotidos sinteticos. Un oligonucleotido aislado se refiere generalmente a un oligonucleotido que esta separado de los componentes con los que esta normalmente asociado en la naturaleza. Como ejemplo, un oligonucleotido aislado puede ser uno que esta separado de una celula, de un nucleo, de una mitocondria o de cromatina.
Los enlaces internucleotidos en el oligonucleotido pueden ser un enlace no estabilizado o estabilizado (frente a las nucleasas), un fosfodiester (no estabilizado), un fosforotioato (estabilizado) u otra estructura principal cargada, o un
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enlace fosfodiester. En algunos aspectos, si el enlace internucleotido en Y-R es un fosforotioato, la quiralidad de este enlace puede ser aleatoria, o es preferentemente un enlace fosforotioato de configuracion Rp.
Pueden sintetizarse estructuras principales modificadas, tales como fosforotioatos, utilizando tecnicas automatizadas que emplean tanto las qmmicas del fosforoamidato como del H-fosfonato. Se pueden preparar aril y alquil fosfonatos, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 4.469.863; y se pueden preparar alquilfosfotriesteres (en el que el resto de oxfgeno cargado esta alquilado, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 5.023.243 y en la patente Europea n.° 0.092.574) mediante smtesis en fase solida automatizada utilizando reactivos comercialmente disponibles. Se han descrito procedimientos para preparar otras modificaciones y sustituciones de la estructura principal del ADN (por ejemplo, Uhlmann, E. y Peyman, A., Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, J., Bioconjugate Chem. 1:165, 1990). El sfmbolo * se refiere a la presencia de un enlace internucleosido estabilizado y _ se refiere a la presencia de un enlace fosfodiester. En aspectos, la una o mas moleculas inmunomoduladoras pueden tener cada una de manera independiente, una estructura principal de fosfodiester completamente natural.
En aspectos de la invencion, los oligonucleotidos de CpG incluyen al menos un dinucleotido de CpG sin metilar. Un oligonucleotido que contiene al menos un dinucleotido de CpG sin metilar es una molecula de acido nucleico que contiene una secuencia de un dinucleotido de citosina-guanina sin metilar (es decir, "ADN de CpG" o ADN que contiene una 5' citosina seguida por 3' guanina y unida mediante un enlace fosfato) y activa el sistema inmunitario. El oligonucleotido de CpG completo puede estar sin metilar o las partes pueden estar sin metilar, pero al menos el C del 5' CG 3' debe estar sin metilar. CPG. Las expresiones oligonucleotido de CpG o acido nucleico de CpG como se usa en el presente documento se refieren a un oligonucleotido de CpG inmunoestimulador o a un acido nucleico salvo que se indique otra cosa.
En aspectos de la invencion, Los oligonucleotidos de CpG son de Clase A, Clase B, Clase C, Clase T, Clase P o cualquier Clase con una modificacion E.
Los oligonucleotidos de Clase A son potentes para inducir la activacion de IFN-a y de los linfocitos NK, pero son relativamente debiles en la estimulacion de linfocitos B. Los oligonucleotidos de Clase A tienen normalmente secuencias polio-G estabilizadas en los extremos 5' y 3' y una secuencia que contiene un dinucleotido de fosfodiester CpG palindromico de al menos 6 nucleotidos y forma estructuras multimericas. Se han descrito oligonucleotidos de Clase A en la patente de Estados Unidos n.° 6.949.520, otorgada el 27 de septiembre de 2005 y en la solicitud PCT publicada n.° PCT/US00/26527 (documento WO 01/22990), publicada el 5 de abril de 2001. Los oligonucleotidos de Clase A no contienen necesariamente un hexamero GACGTC, AGCGCT, o AACGTT palindromico, descrito por Yamamoto y sus colaboradores. Yamamoto S y col. J Immunol 148:4072-6 (1992). En aspectos, un oligonucleotido de CpG de "Clase A" tiene la siguiente secuencia de acido nucleico: 5' GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3' (SEQ ID NO:17). En aspectos, un oligonucleotido de Clase A incluye, aunque no de forma limitativa, 5' G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3' (SEQ ID NO:18); en el que * se refiere a un enlace de fosforotioato y _ se refiere a un enlace fosfodiester.
Los oligonucleotidos de Clase B son potentes en activar linfocitos B pero son relativamente debiles en inducir la activacion de IFN-a y los linfocitos nK. Los oligonucleotidos de Clase B son monomericos y pueden estabilizarse totalmente con una estructura principal completa de fosforotioato. Los oligonucleotidos de Clase B pueden tener tambien algunos enlaces de fosfodiester naturales, por ejemplo, entre el C y G del CpG, en cuyo caso se denominan semiblandos. En aspectos, un oligonucleotido de CpG de clase B puede representarse por al menos la formula: 5' X1X2CGX3X4 3', en la que X1, X2, X3, y X4 son nucleotidos. En aspectos, X2 es adenina, guanina, o timina. En aspectos, X3 es citosina, adenina, o timina. En aspectos, un oligonucleotido de CpG de clase B puede representarse por al menos la formula: 5' N1X1X2CGX3X4N2 3', en la que X1, X2, X3, y X4 son nucleotidos y N es cualquier nucleotido y N1 y N2 son secuencias de acidos nucleicos compuestas por entre aproximadamente 0-25 N cada una. En aspectos, X1X2 es un dinucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT y TpG; y X3X4 es un dinucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA y CpA. En algunos aspectos, X1X2 es GpA o GpT y X3X4 es TpT. En aspectos, X1 o X2 o ambos son purinas y X3 o X4 o ambos son pirimidinas o X1X2 es GpA y X3 o X4 o ambos son pirimidinas. En algunos aspectos, X1X2 es un dinucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en TpA, ApA, ApC, ApG y GpG. En algunos aspectos, X3X4 es un dinucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en TpT, TpA, TpG, ApA, ApG, GpA y CpA. X1X2, en algunos aspectos, es un dinucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en TpT, TpG, ApT, GpC, CpC, CpT, TpC, GpT y CpG; X3 es un nucleotido seleccionado entre el grupos que consiste en A y T, y X4 es un nucleotido, pero cuando X1X2 es TpC, GpT o CpG, X3X4 no es TpC, ApT o ApC. En aspectos, el oligonucleotido de CpG tiene la secuencia 5' TCN1TX1X2CGX3X4 3'. Los oligonucleotidos de CpG de la invencion, pueden incluir, por ejemplo, X1X2 seleccionado entre el grupo que consiste en GpT, GpG, GpA y ApA y X3X4 seleccionado entre el grupo que consiste en TpT, CpT y TpC. Se han descrito oligonucleotidos de Clase B en las patentes de Estados Unidos numeros 6.194.388 B1 y 6.239.116 B1, otorgadas el 27 de febrero de 2001 y 29 de mayo de 2001, respectivamente, y en la solicitud PCT publicada n.° WO/1996/002555, publicada el 1 de febrero de 1996 y en la solicitud PCT publicada n.° WO/1998/018810, publicada el 7 de mayo de 1998. En algunos aspectos, un oligodesoxinucleotido de Clase B es
CPG 7909 5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO:1),
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CpG 24555 5' TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3' (SEQ ID NO:2),
CPG 10104 TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO:3),
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3' (SEQ ID NO:19),
5' TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3' (SEQ ID NO:20),
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T"C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO:21),
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*TT*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3' (SEQ ID NO:22),
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO:23),
5' T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3' (SEQ ID NO:24), o 5' t*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3' (SEQ ID NO:25) en el que * se refiere a un enlace de fosforotioato.
Los oligonucleotidos de Clase C tienen una secuencia CpG "estimuladora" tradicional y un motivo "rico en GC" o "que neutraliza los linfocitos B". Los oligonucleotidos de CpG de Clase A tienen propiedades intermedias a las Clases A y B de tal manera que activan los linfocitos B y los linfocitos NK e inducen IFN-a (Krieg AM y col. (1995) Nature 374:546-9; Ballas ZK y col. (1996) J Immunol 157:1840-5; Yamamoto S y col. (1992) J Immunol 148:4072-6). Los oligonucleotidos de Clase C, contienen un unico palmdromo, de tal manera que pueden formar estructuras secundarias tales como de bucles-tallo o estructuras terciarias tales como dfmeros. La estructura principal de los oligonucleotidos de Clase C puede tener una estructura principal completamente estabilizada, quimerica o semiblanda. Los oligonucleotidos de Clase C incluyen una secuencia de tipo Clase B y un palmdromo rico en GC o un palmdromo cercano. Esta Clase se ha descrito en la solicitud publicada de Estados Unidos n.° 20030148976, publicada el 7 de agosto de 2003 y en la solicitud PCT publicada n.° WO2008/068638, publicada el 12 de junio de 2008. En algunos aspectos, un oligonucleotido de Clase C es CPG 10101 5' TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3' (SEQ ID NO:4), CPG 10109 5' TCGTC-GTTTTAC-GGCGCC-GTCCCG 3' (SEQ ID NO:5 donde las lmeas punteadas representan enlaces de fosfodiester semiblandos), CpG 23407 5' TC-GTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3' (SEQ ID nO:6 donde la lmea punteada representa un enlace de fosfodiester semiblando), 5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:26), 5' TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:27), 5' TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:28), 5' TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:29), 5' TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:30), 5' TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:31), 5' TCGACGTTCGGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:32), 5' TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3' (SEQ ID NO:33), 5' TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:34), o 5' TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3' (SEQ ID NO:35).
En aspectos, un oligonucleotido de CpG de Clase C es 5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'
(SEQ ID NO:38), 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C
T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G
T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G
G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3'

3' (SEQ ID

3' (SEQ ID

3' (SEQ ID

3' (SEQ ID
T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:44), 5' T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_ (SEQ ID NO:45), 5' T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ

T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID

T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID

(SEQ ID NO:39), 5'

NO:40), 5'

NO:41), 5'

NO:42), 5'

NO:43), 5'

G*G*C*G*C*C*G 3' ID NO:46), 5'

NO:47), 5'

NO:48), 5'
NO:49) o 5' se refiere a un enlace de
T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3' (SEQ ID T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:50) en el que fosfootioato y _ se refiere a un enlace de fosfodiester. En cualquiera de estas secuencias, una etil-uridina o un halogeno pueden sustituir el 5' T; los ejemplos de sustituciones de halogeno incluyen, aunque no de forma limitativa, sustituciones de bromo-uridina o yodo-uridina.
Los oligonucleotidos de Clase P tienen la capacidad en algunos casos de inducir niveles mucho mayores de secrecion de IFN-a que los oligonucleotidos de Clase C. Los oligonucleotidos de Clase P tienen la capacidad de autoensamblarse de forma espontanea en concatameros ya sea in vitro y/o in vivo. Los oligonucleotidos de Clase P se desvelan adicionalmente en la solicitud PCT publicada n.° WO2008/068638, publicada el 12 de junio de 2008. En algunos aspectos, un oligodesoxinucleotido de Clase P es
CpG 21798 5' T*C-G*T*C-G*A*C-G*A*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:7),
CpG 23430 5' T*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:8),
CpG 24558 5' t*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:9),
CpG 23871 5' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:10),
CpG 23873 5' JU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G"C*G*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:11),
CpG 23874 5' JU*C*G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:12),
CpG 23875 5' EU*C-G*A*C*G*T*C*G*A*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:13), CpG 23877 5' JU*C-G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:14),
CpG 23878 5' JU*C*G*T*C*G*A*C*G*A*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G*T 3' (SEQ ID NO:15) o 5' T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3' (SEQ ID NO:37).
Los oligonucleotidos de Clase T inducen la secrecion de niveles bajos de citoquinas y quimioquinas relacionadas con IFN-alfa e IFN y que los oligonucleotidos de Clase B o Clase C, reteniendo a la vez la capacidad de inducir niveles de IL-10 similares a los oligonucleotidos de Clase B. Los oligonucleotidos de Clase T se desvelan ademas en la
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solicitud PCT publicada WO2008/068638, publicada el 12 de junio de 2008.
Se pueden realizar modificaciones E en cualquier clase de oligonucleotidos de CpG. Estos son oligonucleotidos con analogos de nucleotidos sustituidos lipofilos fuera del motivo CpG y tienen una capacidad potenciada para estimular la produccion de interferon-a (IFN-a) e inducir la activacion de TLR9. Los oligonucleotidos modificados en E se desvelan ademas en la publicacion pCt publicada WO2008/068638, publicada el 12 de junio de 2008.
En aspectos de la invencion, Los oligonucleotidos de CpG estan en una cantidad eficaz para inducir o potenciar una respuesta inmunitaria espedfica de antigeno. En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria espedfica de antigeno potenciada es una respuesta inmunitaria Th1. En algunos aspectos, la respuesta inmunitaria Th1 da como resultado la induccion espedfica de antigeno de IFN-y, o la induccion de linfocitos T polifuncionales que secretan dos o mas citoquinas. En algunos aspectos, las citoquinas incluyen, aunque no de forma limitativa, IL-2 e IFN-y o IFN-y, TNF-a y IL-2.
En aspectos de la invencion, la cantidad de oligonucleotido de CpG es de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 5 mg por dosis de vacuna. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 4 mg por dosis de vacuna, de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 3 mg por dosis de vacuna, aproximadamente 1 jg a aproximadamente 2 mg por dosis de vacuna, o aproximadamente 1 jg a aproximadamente 1 mg por dosis de vacuna. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 750 jg por dosis de vacuna, de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 500 jg por dosis de vacuna, de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 250 jg por dosis de vacuna, de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 100 jg por dosis de vacuna, de aproximadamente 20 jg a aproximadamente 100 jg por dosis de vacuna, o de aproximadamente 30 jg aproximadamente 100 jg por dosis de vacuna. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 500 jg por dosis de vacuna. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 250 jg por dosis de vacuna.
En aspectos de la invencion, la cantidad de oligonucleotido de CpG con respecto a la cantidad de colesterol es mayor que la cantidad de colesterol. En aspectos de la invencion, la relacion de la cantidad del oligonucleotido de CpG a la cantidad de colesterol es aproximadamente 100:1, o aproximadamente 75:1, o aproximadamente 50:1, o aproximadamente 25:1, o aproximadamente 15:1, o aproximadamente 10:1, o aproximadamente 5:1 en peso. En aspectos de la invencion, la cantidad del oligonucleotido de CpG con respecto a la cantidad de colesterol es aproximadamente la misma que la cantidad de colesterol. Es decir, la cantidad del oligonucleotido de CpG a la cantidad de colesterol esta en una relacion de aproximadamente 1:1 en peso. En aspectos de la invencion, la cantidad del oligonucleotido de CpG con respecto a la cantidad de colesterol es menor que la cantidad de colesterol. En aspectos de la invencion, la relacion de la cantidad del oligonucleotido de CpG a la cantidad de colesterol es de aproximadamente 1:100, o aproximadamente 1:75, o aproximadamente 1:50, o aproximadamente 1:25, o aproximadamente 1:15, o aproximadamente 1:10, o aproximadamente 1:5 en peso. En un aspecto, la relacion de la cantidad del oligonucleotido de CpG a la cantidad de colesterol es de aproximadamente 1:10 en peso. Un experto en la materia se dana cuenta de que las relaciones dadas pueden ser como se muestra o pueden ser aproximadamente como se muestra.
Como se usa en el presente documento, Los terminos "trastorno", "dolencia" y "enfermedad" se usan de manera indistinta.
En aspectos de la invencion, las vacunas son utiles como vacuna profilactica para la prevencion de una infeccion (por ejemplo, una enfermedad infecciosa), un trastorno asociado con un autoantfgeno, o un trastorno asociado con una sustancia adictiva. Preferentemente, se usa la vacunacion profilactica en sujetos a los que no se les ha diagnosticado la dolencia para la cual se busca la vacuna, y mas preferentemente, los sujetos se consideran en riesgo de desarrollar una de estas dolencias. Por ejemplo, el sujeto puede ser uno que esta en riesgo de desarrollar una infeccion con un organismo infeccioso, o susceptible a un trastorno asociado con un autoantfgeno, o susceptible a un trastorno asociado con una sustancia adictiva.
Un sujeto en riesgo, como se usa en el presente documento, es un sujeto que tiene algun riesgo de exposicion a un patogeno que produce una infeccion, un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa cronica o resistente al tratamiento, un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar cancer, un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una alergia, un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar asma, un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con una sustancia adictiva, un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar un trastorno que implica un plegamiento anomalo de la protema, o un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar un trastorno autoinmunitario. Un sujeto en riesgo incluye tambien sujetos que tienen una predisposicion a desarrollar dichos trastornos. Algunas predisposiciones pueden ser geneticas (y pueden por tanto identificarse tanto mediante analisis genetico como mediante los antecedentes familiares). Algunas predisposiciones son ambientales (por ejemplo, exposicion previa a agentes infecciosos, autoantfgenos o sustancias adictivas). Para un sujeto en riesgo de desarrollar una infeccion, un ejemplo de dicho sujeto es un sujeto vivo en o que espera viajar a una zona donde esta o se ha encontrado un tipo particular de agente infeccioso o puede ser un sujeto que debido al estilo de vida o a procedimientos medicos esta expuesto a un organismo tanto directa como indirectamente por contacto con fluidos corporales que pueden contener organismos infecciosos. Los sujetos en riesgo de desarrollar infeccion incluyen tambien poblaciones generales a las cuales un organismo medico recomienda la vacunacion para
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un organismo infeccioso concreto.
Un sujeto es un ser humano o un animal no humano tratado mediante medicina veterinaria. Los sujetos animales no humanos incluyen, aunque no de forma limitativa, un perro, un gato, un pajaro, un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un pollo, un primate no humano (por ejemplo, mono, chimpance) y un pescado (especies de acuicultura, por ejemplo, salmon).
Una enfermedad infecciosa, como se usa en el presente documento, es una enfermedad que surge de la presencia de un microorganismo extrano en el cuerpo, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parasito o un hongo.
En aspectos de la invencion, una bacteria incluye, aunque no de forma limitativa, Acinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinomyces israelii, Actinomyces viscosus, Aeromonas hydrophila, Alcaliges eutrophus, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, especies de Bacillus, Bacillus antracis, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, especies de Bacteroides, especies de Bordetella, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, especies de Brucella, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, especies de Brachyspira. Brachyspira hyodysenteria, Brachyspira pilosicoli, especies de Camphylobacter, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter jejuni, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, especies de Chlamydophila, Chromobacterium viscosum, especies de Clostridium, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, especies de Corynebacterium, Corynebacterium diphtheriae, Ehrlichia canis, especies de Enterobacter, Enterobacter aerogenes, especies de Enterococcus, Erysipelothrix rhusiopathieae, especies de Escherichia, Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum, especies de Haemophilus, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, especies de Helicobacter, Helicobacter pylori, Helicobacter suis, especies de Klebsiella, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus acidophilis, Lawsonia intracellularis, especies de Legionella, Legionella pneumophilia, especies de Leptospira, such as Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjoprajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira, Leptospira bratislava, especies de Listeria, Listeria monocytogenes, Meningococcal bacteria, especies de Moraxella, especies de Mycobacterium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansaii, Mycobacterium gordonae, especies de Mycoplasma, tales como, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, especies de Neisseria, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Odoribacter denticanis, especies de Pasteurella, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas gulae, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, especies de Proteus, Proteus vulgaris, especies de Pseudomonas, Pseudomnas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Psychrobacte rimmobilis, Rickettsia spp, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsia, especies de Salmonella, Salmonella bongori, Salmonella choleraeuis, Salmonella dublin, Salmonella enterica, Salmonella newport, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Serratia marcescens, especies de Shigella, Spirlina platensis, especies de Staphylococci, Staphyloccoccus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, especies de Streptococcus, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus beta hemolfticos, Streptococcus pyogenes (Grupo A de Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B de Streptococcus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus (subespecies anaerobias), Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus sanguis, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., especies de Treponema, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema palladium, Treponema pertenue, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, especies de Vibrio, Vibrio cholerae, especies de Yersinia y combinaciones de las mismas.
En aspectos de la invencion, un virus incluye, aunque no de forma limitativa, Virus del herpes aviar, Gripe aviar, Virus de la leucosis aviar, Paramixovirus aviar, Virus de la enfermedad de Border, Coronavirus bovino, Virus de la fiebre effmera bovina, Virus del herpes bovino, Virus de la inmunodeficiencia bovina, Virus de la leucemia bovina, Virus 3 paragripal bovino, Virus sincitial respiratorio bovino, Virus de la diarrea vmca bovina (BVDV), BVDV de Tipo I, BVDV de Tipo II, Adenovirus canino, Coronavirus canino (CCV), Virus del moquillo canino, Virus del herpes canino, Virus del herpes equino, Virus de la gripe canina, Virus paragripal canino, Parvovirus canino, Coronavirus respiratorio canino, Virus de la peste porcina clasica, Virus de la encefalitis equina oriental (EEE), Virus de la anemia infecciosa equina, Virus de la gripe equina, Virus del Nilo occidental, Calicivirus de felino, Coronavirus enterico de felino, Virus de la inmunodeficiencia felina, Virus de la peritonitis infecciosa felina, Virus del herpes felino, Virus de la gripe felina, Virus de la leucemia felina (FeLV), Virus de la rinotraqueftis vmca de felino, Lentivirus, Virus de la enfermedad de Marek, Virus de la enfermedad de Newcastle, Virus del herpes ovino, Paragripal 3 de ovino, Virus de la neumoma progresiva, Virus de adenocarcinoma pulmonar ovino, VCC pantropico, Circovirus de porcino (PCV) de Tipo I, PCV de Tipo II, Virus de la diarrea epidermica de porcino, Virus de la encefalomielitis hemaglutinante de porcino, Virus del herpes porcino, Parvovirus de porcino, Virus del smdrome reproductor y respiratorio de porcino (PRRS), Virus de la pseudorrabia, Rabia, Rotovirus, Rinovirus, Virus de la peste bovina, Virus de la gripe porcina, Virus de lagastroenteritis transmisible, Coronavirus de pavo, Virus de la encefalitis equina venezolana, Virus de la estomatitis vesicular, Virus del Nilo occidental, Virus de la encefalitis equina occidental y combinaciones de los
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mismos.
En aspectos de la invencion, un parasito incluye, aunque no de forma limitativa, una protema de Anaplasma, Fasciola hepatica (parasito hepatico), Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (filarias), Ancylostoma (anquilostomas), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongyloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia, o Isopsora, y sus combinaciones. En aspectos, un parasito incluye, aunque no de forma limitativa, garrapatas, incluyendo especies de Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, o Haemaphysalis, y combinaciones de los mismos.
En aspectos de la invencion, Un hongo incluye, aunque no de forma limitativa, esporas, mohos y levaduras (por ejemplo, especies de Candida).
Una enfermedad infecciosa cronica o resistente al tratamiento, como se usa en el presente documento, es una enfermedad que tiene un periodo de infeccion prolongado, que dura algunas veces semanas, meses e incluso toda la vida, o una infeccion que resiste otros tratamientos que son normalmente satisfactorios. En algunos aspectos, una infeccion vmca cronica o resistente al tratamiento incluye, aunque no de forma limitativa, VHB, VHC, VIH, VPH, VHS-1 o VHS-2.
En aspectos de la invencion, un sujeto que tiene un cancer es un sujeto que tiene celulas cancerosas detectables. El cancer puede ser un cancer maligno o no maligno. los canceres o tumores incluyen, aunque no de forma limitativa, cancer del tracto biliar; cancer de vejiga; cancer de cerebro; cancer de mama; cancer de cuello de utero; coriocarcinoma; cancer de colon; cancer colorrectal; cancer de endometrio; cancer de esofago; cancer gastrico; gliobastoma; neoplasmas intraepiteliales; linfomas (por ejemplo, linfoma folicular); cancer de Idgado; cancer de pulmon (por ejemplo, microcftico y no microcftico); leucemia (por ejemplo, leucemia de celulas pilosas, leucemia mielogena cronica, leucemia cutanea de linfocitos T); melanoma (por ejemplo, melanoma maligno); mieloma multiple; neuroblastomas; cancer oral; cancer de ovario; cancer de pancreas; cancer de prostata; cancer de recto; cancer renal; sarcomas; cancer de piel; cancer de testfculos; cancer de tiroides; y cancer renal, asf como otros carcinomas y sarcomas (por ejemplo, carcinoma escamocelular, carcinoma de celulas renales, carcinoma de prostata, carcinoma de celulas de vejiga, o carcinoma de colon).
En aspectos de la invencion, un sujeto que tiene una alergia es un sujeto que tiene o esta en riesgo de desarrollar una reaccion alergica en respuesta a un alergeno. Una alergia se refiere a hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alergeno). Las dolencias alergicas incluyen, aunque no de forma limitativa, eczema, rinitis alergica o rinitis, fiebre del heno, conjuntivitis, asma bronquial, urticaria (ronchas) y alergias alimentarias, y otras dolencias atopicas.
En la actualidad, las enfermedades alergicas se tratan generalmente mediante la inyeccion de pequenas dosis de antfgeno seguido por una dosificacion creciente posterior de antfgeno. Se cree que este procedimiento induce la tolerancia al alergeno para evitar reacciones alergicas adicionales. Estos procedimientos, sin embargo, pueden tardar algunos anos en ser eficaces y se asocian con el riesgo de efectos secundarios tales como choque anafilactico.
Las alergias estan producidas generalmente por la generacion de anticuerpos IgE contra alergenos perjudiciales. Las citoquinas que estan inducidas por la administracion sistemica o mucosal de acidos nucleicos inmunoestimuladores son predominantemente de una clase denominada Th1 (los ejemplos son IL-12 e IFN-gamma) y estas inducen respuestas inmunitarias humorales y celulares. Los tipos de anticuerpos asociados con una respuesta Th1 son generalmente mas protectores debido a que tienen altas capacidades de neutralizacion y opsonizacion. El otro tipo mayor de respuesta inmunitaria, que se asocia con la produccion de las citoquinas IL-4, IL- 5 e IL-10, es una respuesta inmunitaria Th2. Las respuestas Th2 implican predominantemente anticuerpos y estos tienen menos efecto protector frente a la infeccion y algunos isotipos Th2 (por ejemplo, IgE) se asocian con alergia. En general, parece que las enfermedades alergicas estan mediadas por respuestas inmunitarias de tipo Th2 mientras que las respuestas Th1 proporcionan la mejor proteccion frente a la infeccion, aunque respuestas de Th1 excesivas se asocian con una enfermedad autoinmunitaria. Basandose en la capacidad de la una o mas moleculas moduladoras de cambiar la respuesta inmunitaria en un sujeto desde una Th2 (que se asocia con la produccion de anticuerpos IgE y alergia) a una respuesta Th1 (que es protectora frente a reacciones alergicas), una dosis eficaz para inducir una respuesta inmunitaria de una molecula inmunomoduladora puede administrarse a un sujeto para tratar o prevenir una alergia.
En aspectos de la invencion, un alergeno se refiere a una sustancia (por ejemplo, un antfgeno) que puede inducir una respuesta alergica o asmatica en un sujeto susceptible. Los alergenos incluyen, aunque no de forma limitativa, polenes, venenos de insectos, polvo de caspa de animales, esporas y farmacos fungicos (por ejemplo, penicilina). Los ejemplos de alergenos naturales, animales y vegetales incluyen, aunque no de forma limitativa, proternas espedficas de los siguientes generos: Caninos (Canis familiaris); Dermatophagoides (por ejemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (por ejemplo, Lolium perenne o Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus glutinosa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europeae); Artemisia (Artemisia
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vulgaris); Plantago (por ejemplo, Plantago lanceolata); Parietaria (por ejemplo, Parietaria officinalis o Parietaria judaica); Blattella (por ejemplo, Blattella germanica); Apis (por ejemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por ejemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica y Cupressus macrocarpa); Juniperus (por ejemplo, Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis y Juniperus ashei); Thuya (por ejemplo, Thuya orientalis); Chamaecyparis (por ejemplo, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por ejemplo, Periplaneta americana); Agropyron (por ejemplo, Agropyron repens); Secale (por ejemplo, Secale cereale); Triticum (por ejemplo, Triticum aestivum); Dactylis (por ejemplo, Dactylis glomerata); Festuca (por ejemplo, Festuca elatior); Poa (por ejemplo, Poa pratensis o Poa compressa); Avena (por ejemplo, Avena sativa); Holcus (por ejemplo, Holcus lanatus); Anthoxanthum (por ejemplo, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por ejemplo, Arrhenatherum elatius); Agrostis (por ejemplo, Agrostis alba); Phleum (por ejemplo, Phleum pratense); Phalaris (por ejemplo, Phalaris arundinacea); Paspalum (por ejemplo, Paspalum notatum); Sorghum (por ejemplo, Sorghum halepensis); y Bromus (por ejemplo, Bromus inermis).
En aspectos de la invencion, el asma se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamacion, que estrecha las vfas aereas y aumenta la reactividad de las vfas aereas a los agentes inhalados. Las citoquinas Th2, por ejemplo, IL-4 e IL-5 estan elevadas en las vfas aereas de los sujetos asmaticos. Estas citoquinas promueven importantes aspectos de la respuesta inflamatoria asmatica, incluyendo el cambio de isotipo IgE, la quimiotaxia de los eosinofilos y la activacion y el crecimiento de los mastocitos. Las citoquinas Th1, especialmente IFN-.gamma. e IL-12, pueden suprimir la formacion de los clones Th2 y la produccion de citoquinas Th2. Es frecuente el asma. aunque no se asocia exclusivamente con smtomas atopicos o alergicos.
En aspectos de la invencion, un trastorno que implica un plegamiento anomalo de la protema es un trastorno resultante de una protema asociada plegada tanto incorrectamente o bien un error en el ADN de un sujeto que conduce al plegamiento incorrecto de una protema. En aspectos, Un trastorno que implica un plegamiento anomalo de la protema es un trastorno de amiloidosis, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, EM, o un trastorno prionico, por ejemplo, encefalopatfas espongiformes transmisibles (TSE), que incluye, aunque no de forma limitativa, encefalopatfa espongiforme bovina (BSA, enfermedad de las vacas locas), y enfermedad de Creutzfeld Jakob (CJD) en seres humanos. En aspectos, un trastorno que implica un error en el ADN de un sujeto que conduce al plegamiento incorrecto de una protema incluye, aunque no de forma limitativa, fibrosis qrnstica y canceres asociados con la protema p53.
En aspectos de la invencion, un trastorno autoinmunitario es cualquier trastorno que implica una respuesta inmunitaria una respuesta inmunitaria hiperactiva del cuerpo del sujeto frente a sustancias y tejidos (por ejemplo, un autoantfgeno) normalmente presentes en el sujeto. En algunos aspectos, un trastorno autoinmunitario es artritis reumatoide (AR), lupus o enfermedad de Crohn.
En aspectos de la invencion, un trastorno asociado con un autoantfgeno es cualquier trastorno que esta producido por un antfgeno de las propias celulas o productos celulares de un sujeto que produce una respuesta inmunitaria en dicho sujeto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un autoantfgeno es un antfgeno tumoral, un antfgeno asociado con la enfermedad de Alzheimer, un antfgeno contra un anticuerpo, o un antfgeno que se expresa a partir de elementos retrovmcos endogenos humanos. En algunos aspectos, el antfgeno tumoral es uno o mas de WT1, MUC1, LMP2, VPH E6 o VPH E7, EGFR o una de sus formas variantes, por ejemplo, EGFRvIII, HER-2/neu, Idiotipo, MAGE A3, p53 no mutante, NY-ESO-1, PSMA, GD2, CEA, MelanA/MARTI, Mutante de Ras, gp100, mutante de p53, Proteinasa3 (PR1), bcr-abl, Tirosinasa, Survivina, PSA, hTERT, Puntos de rotura de la translocacion del sarcoma, EphA2, PAP, ML-IAP, AFP, EpCAM, ERG (gen de fusion TMPRSS2 ETS), NA17, PAX3, ALK, Receptor de androgenos, Ciclina B1, acido polisialico, MYCN, RhoC, TRP-2, GD3, Fucosil GM1, Mesotelina, PSCA, MaGe A1, sLe (animal), CYP1B1, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GloboH, ETV6-AML, NY-BR-1, RGS5, SART3, STn, Anhidrasa carbonica IX, PAX5, OY-TES1, protema de esperma 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, Legumain, Tie 2, Page4, VEGFR2, MAD-CT-1, FaP, PDGFR-beta, MAD-CT-2, o antfgeno 1 relacionado con Fos. Un antfgeno asociado con la enfermedad de Alzheimer puede ser tau o p-amiloide. Un antfgeno contra un anticuerpo puede ser un antfgeno contra un anticuerpo humano, por ejemplo, en algunas realizaciones, el antfgeno es IgE.
En aspectos de la invencion, las vacunas pueden utilizarse en la prevencion de una infeccion vmca respiratoria en un animal. En algunos aspectos, la infeccion vmca respiratoria es BVDV 1, BVDV 2, IBRV, P13V o BRSV.
En aspectos de la invencion, un trastorno asociado con una sustancia adictiva es cualquier trastorno que implica el desarrollo en un sujeto de una adiccion a una sustancia adictiva qrnmica o biologica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una sustancia adictiva puede ser nicotina o cocama. En algunas realizaciones, la vacuna para prevenir o tratar la adiccion contiene nicotina o un hapteno analogo a nicotina conjugado con un transportador. En algunas realizaciones, el transportador al cual se conjuga la nicotina o el hapteno analogo a nicotina es un toxoide o derivado bacteriano, una exotoxina de Pseudomonas, KLH o una partmula analoga a virus, En algunos aspectos, el toxoide bacteriano es un toxoide de la difteria o uno de sus derivados, por ejemplo, CRM197. En algunos aspectos, la partmula analoga a virus es HBsAg, HBcAg, bacteriofago Qp de E. coli, virus de Norwalk o gripe HA.
Como se usa en el presente documento, el termino "tratar", "tratado" o "que trata" cuando se utiliza con respecto a una enfermedad infecciosa se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de infeccion) a la infeccion con un patogeno, o en otras palabras, disminuye la probabilidad de que el sujeto llegue a infectarse con el patogeno, asf como un tratamiento despues que el sujeto haya llegado a infectarse
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(un sujeto que se ha infectado) a fin de luchar contra la infeccion, por ejemplo, reducir o eliminar la infeccion o evitar que esta llegue a empeorar.
El termino "tratar", "tratado" o "que trata", cuando se usa con respecto a un cancer se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de desarrollar cancer) al cancer, o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle cancer, asf como un tratamiento despues que el sujeto (un sujeto que tiene o se ha diagnosticado con cancer) ha desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o smtomas del desarrollo de dicho trastorno, para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o smtomas asociados con el trastorno o evitar que lleguen a empeorar.
El termino "tratar", "tratado" o "que trata", cuando se usa con respecto a asma o alergia se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de desarrollar asma o alergia) a desarrollar dicho trastorno o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle asma o alergia asf como un tratamiento despues que el sujeto (un sujeto que tiene o se ha diagnosticado con asma o alergia) ha desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o smtomas de desarrollo de dicho trastorno, para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o smtomas asociados con el trastorno o evitar que lleguen a empeorar.
El termino "tratar", "tratado" o "que trata", cuando se usa con respecto a un trastorno asociado con una sustancia adictiva se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de un trastorno asociado con una sustancia adictiva) a desarrollar dicho trastorno o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el trastorno asociado con una sustancia adictiva asf como el tratamiento despues de que el sujeto (un sujeto que tiene o se ha diagnosticado con un trastorno asociado con una sustancia adictiva) ha desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o smtomas de desarrollo de dicho trastorno, para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o smtomas asociados con el trastorno o evitar que lleguen a empeorar.
El termino "tratar", "tratado" o "que trata", cuando se usa con respecto a un plegamiento anomalo de la protema se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de un trastorno asociado a un plegamiento anomalo de la protema) a desarrollar dicho trastorno, o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el trastorno asociado con el plegamiento anomalo de la protema, asf como un tratamiento despues que el sujeto (un sujeto que tiene o se ha diagnosticado con un trastorno asociado con un plegamiento anomalo de la protema) ha desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o smtomas del desarrollo de dicho trastorno, para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o smtomas asociados con el trastorno o evitar que lleguen a empeorar.
El termino "tratar", "tratado" o "que trata", cuando se usa con respecto a trastorno autoinmunitario se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de una enfermedad autoinmunitaria) a desarrollar dicho trastorno o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el trastorno autoinmunitario asf como tratamiento despues que el sujeto (un sujeto que tiene o se ha diagnosticado con un trastorno autoinmunitario) ha desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o smtomas de desarrollo de dicho trastorno, para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o smtomas asociados con el trastorno o evitar que lleguen a empeorar.
El termino "tratar", "tratado" o "que trata", cuando se usa con respecto a un trastorno asociado con un autoantfgeno se refiere a un tratamiento profilactico que aumenta la resistencia de un sujeto (un sujeto en riesgo de un trastorno asociado con autoantfgeno) a desarrollar dicho trastorno o disminuye la probabilidad de que el sujeto desarrolle el trastorno asociado con un autoantfgeno asf como el tratamiento despues de que el sujeto (un sujeto que tiene o se ha diagnosticado con un trastorno asociado con un autoantfgeno) ha desarrollado dicho trastorno o comience a desarrollar signos o smtomas de desarrollo de dicho trastorno, para reducir el efecto del trastorno, por ejemplo, reducir o eliminar los signos o smtomas asociados con el trastorno o evitar que lleguen a empeorar.
El tratamiento de un sujeto o con las vacunas como se describe en el presente documento, da como resultado la reduccion de la infeccion o la eliminacion completa de la infeccion, la reduccion de los signos/smtomas asociados con un trastorno asociado con un autoantfgeno o la completa eliminacion del trastorno, o la reduccion de los signos/smtomas asociados con un trastorno relacionado con una sustancia adictiva o la completa eliminacion del trastorno. Un sujeto puede considerarse como tratado si dichos smtomas relacionados con la enfermedad infecciosa, cancer, alergia, asma, trastorno asociado con el plegamiento anomalo de la protema, trastorno autoinmunitario, trastorno asociado con un autoantfgeno o trastorno asociado con una sustancia adictiva si se reducen, se gestionan o se eliminan como resultado de dicho tratamiento. Para una enfermedad infecciosa, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en la cantidad de agente infeccioso presente en el sujeto (por ejemplo, dichas cantidades pueden medirse utilizando ensayos normalizados tales como ELISA conocidos por las personas normalmente expertas en la materia). Para un cancer, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en las celulas o tejidos cancerosos, y/o una reduccion en los signos/smtomas asociados con el cancer. Para una alergia, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en los signos/smtomas asociados con la alergia. Para un asma, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en los signos/smtomas asociados con el asma. Para un trastorno autoinmunitario, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en la respuesta inmunitaria frente al trastorno autoinmunitario, y/o una reduccion en los signos/smtomas asociados con el trastorno. Para un trastorno asociado con el plegamiento
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anomalo de la protema, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en la cantidad de protema anomala, y/o una reduccion o reversion en los signos/smtomas asociados con el trastorno. Para un trastorno asociado con un autoantigeno, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en la cantidad de autoantigeno presente en el sujeto o una reduccion en la respuesta inmunitaria inducida como resultado del autoantigeno. Para un trastorno asociado con una sustancia adictiva, dicho tratamiento abarca tambien una reduccion en los signos/smtomas asociados con la adiccion a la sustancia adictiva.
Las formulaciones de la invencion se administran en soluciones farmaceuticamente aceptables, que pueden contener de manera rutinaria concentraciones farmaceuticamente aceptables de sal, agentes tamponantes, conservantes, transportadores compatibles, adyuvantes, y, opcionalmente, otros ingredientes terapeuticos. Para determinadas formulaciones de vacunas que utilizan colesterol, el etanol puede estar sustituido con un tensioactivo farmaceuticamente aceptable y una solucion acuosa para solubilizar el colesterol en la formulacion acuosa.
Para su uso en terapia, puede administrarse una cantidad eficaz de la una o mas moleculas inmunomoduladoras a un sujeto mediante cualquier modo que administre la molecula inmunomoduladora a la superficie deseada. Se puede llevar a cabo la administracion de la composicion farmaceutica de la presente invencion mediante cualquier medio conocido por el tecnico experto. Las rutas de administracion preferidas incluyen, aunque no de forma limitativa la parenteral (por ejemplo, inyeccion intramuscular, subcutanea, intradermica, intravenosa), topica a la piel (por ejemplo, transdermica) o mucosal (por ejemplo, oral, intranasal, intravaginal, intrarrectal, transbucal, intraocular o sublingual). En el caso de tratamiento de canceres, esto puede incluir administraciones intratumorales.
En aspectos de la invencion, "cantidad eficaz" de un oligonucleotido de CpG se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para realizar un efecto biologico deseado. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un oligonucleotido de CpG para tratar un trastorno sena la cantidad necesaria para eliminar una infeccion microbiana o un tumor. Una cantidad eficaz para su uso como un adyuvante de vacuna sena la cantidad util para reforzar la respuesta inmunitaria de un sujeto a una vacuna. Una "cantidad eficaz" para tratar una enfermedad infecciosa, un cancer, una alergia, asma, un trastorno autoinmunitario, un trastorno asociado con el plegamiento anomalo de la protema, un trastorno asociado con un autoantfgeno o un trastorno asociado con una sustancia adictiva puede ser la cantidad util para inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno. La cantidad eficaz para cualquier aplicacion concreta puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o dolencia que se esta tratando, la molecula inmunomoduladora concreta que se esta administrando, el tamano del sujeto, o la gravedad de la enfermedad o dolencia. Una persona normalmente experta en la materia puede determinar empmcamente la cantidad eficaz de una molecula inmunomoduladora concreta sin necesitar una experimentacion excesiva.
Las dosis sujeto de los compuestos descritos en el presente documento para la administracion local vanan normalmente de aproximadamente 0,1 |jg a aproximadamente 50 mg por administracion que, dependiendo de la aplicacion, se podna administrar diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otro lapso de tiempo entre los citados. De forma mas normal, las dosis locales vanan de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 10 mg por administracion, y, opcionalmente, de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1 mg, con 2-4 administraciones separadas dfas o semanas entre sf. Mas normalmente, las dosis inmunoestimuladoras vanan de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 10 mg por administracion, y, lo mas normalmente, de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 1 mg, con administraciones diarias o semanales. Las dosis sujeto de los compuestos descritos en el presente documento para la administracion parenteral con el fin de inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno, en las que los compuestos se administran con un antfgeno pero no con otro agente terapeutico son normalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces mayores que la dosis local eficaz para aplicaciones de adyuvantes de vacunas o de inmunoestimuladores, y mas normalmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 1.000 veces mayores, y lo mas normalmente de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 veces mayores. Las dosis de los compuestos descritos en el presente documento para la administracion parenteral, por ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria innata, para aumentar ADCC, para inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno cuando la una o mas moleculas inmunomoduladoras se administran combinadas con otros agentes terapeuticos o en vehmulos de administracion especializados vanan normalmente de aproximadamente 0.1 jg a aproximadamente 10 mg por intervalo de administracion que, dependiendo de la aplicacion, se podna administrar diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otro lapso de tiempo entre los citados. de forma mas normal, las dosis parenterales para estos fines vanan de aproximadamente 10 jg a aproximadamente 5 mg por administracion, y, mas normalmente, de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1 mg, con 2-4 administraciones separadas dfas o semanas entre sf. En algunas realizaciones, sin embargo, las dosis parenterales para estos fines pueden utilizarse en un intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10.000 veces mayor que las dosis tfpicas descritas anteriormente.
Para cualquier compuesto descrito en el presente documento, la cantidad terapeuticamente eficaz puede determinarse inicialmente a partir de modelos animales. Una dosis terapeuticamente eficaz puede determinarse tambien a partir de datos humanos de las moleculas inmunomoduladoras que se han ensayado en seres humanos (por ejemplo, se han iniciado ensayos clmicos en seres humanos) y para los compuestos que se sabe que presentan actividades farmacologicas similares, tales como otros adyuvantes, por ejemplo, LT y otros antfgenos a fines de vacunacion. Se pueden requerir dosis mayores para la administracion parenteral. La dosis aplicada puede ajustarse basandose en la biodisponibilidad y potencia relativas del compuesto administrado. Ajustar la dosis para conseguir la eficacia maxima basandose en los procedimientos descritos anteriormente y otros procedimientos como es bien
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conocido en la tecnica esta bien comprendido en las capacidades del tecnico normalmente experto.
Las vacunas de la presente invencion pueden administrarse mediante cualquier ruta descrita en el presente documento.
Las vacunas de la presente invencion, cuando es deseable administrarlas sistemicamente, pueden formularse para su administracion parenteral mediante inyeccion, por ejemplo, mediante inyeccion en bolo o infusion continua. Las formulaciones para inyeccion pueden presentarse en una forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante anadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vetnculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspension, estabilizacion y/o dispersion.
Las formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral incluyen soluciones acuosas de las moleculas inmunomoduladoras en forma soluble en agua. Ademas, pueden prepararse suspensiones de las moleculas inmunomoduladoras como suspensiones oleosas adecuadas para inyeccion. Los disolventes o vetnculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos como aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyeccion pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetilcelulosa sodica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspension puede contener tambien estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de las moleculas inmunomoduladoras para permitir la preparacion de soluciones muy concentradas.
Se puede diluir o aumentar el volumen del agente terapeutico con un material inerte. Estos diluyentes incluinan hidratos de carbono, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos y/o almidon modificado. Se pueden usar tambien determinadas sales inorganicas como cargas que incluyen trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y/o cloruro de sodio. Algunos diluyentes comercialmente disponibles son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell.
Para ayudar a la disolucion del agente terapeutico en el entorno acuoso, puede anadirse un tensioactivo como un agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes anionicos tales como lauril sulfato de sodio, dioctil sulfosuccinato de sodio y/o dioctil sulfonato de sodio. Pueden usarse detergentes cationicos e incluinan cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. La lista de detergentes no ionicos potenciales que se incluina en la formulacion como tensioactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxil 40, aceite de ricino hidrogenado con polioxietileno 10, 50 y/o 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 y/u 80, ester de sacarosa acido graso, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. En aspectos, los detergentes no ionicos incluyen, aunque no de forma limitativa, octoxinoles, por ejemplo, t-octilfenoxi polietoxietanol (TRITON X-100™), esteres de polioxietileno, por ejemplo, polioxietileno monooleato de sorbitan (TWEEN 80™), derivados de sales biliares y acido colico, por ejemplo, desoxicolato de sodio o taurodesoxicolato. En aspectos, una formulacion puede comprender 3D-MPL, laureth 9, TRITON X-100™, TWEEN 80™, y desoxicolato de sodio. Estos tensioactivos estanan presentes en la formulacion de las moleculas inmunomoduladoras tanto solos o como en una mezcla en diferentes relaciones.
Las formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral incluyen soluciones acuosas de las moleculas inmunomoduladoras en forma soluble en agua. Ademas, pueden prepararse suspensiones de las moleculas inmunomoduladoras como suspensiones oleosas adecuadas para inyeccion. Los disolventes o vetnculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos como aceite de sesamo, o esteres de acidos grasos sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyeccion pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetilcelulosa sodica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspension puede contener tambien estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de las moleculas inmunomoduladoras para permitir la preparacion de soluciones muy concentradas.
Alternativamente, las moleculas inmunomoduladoras pueden estar en forma de polvo para su constitucion con un vetnculo adecuado, por ejemplo, agua esteril exenta de pirogenos, antes del uso.
Para la administracion oral, los compuestos (por ejemplo, moleculas inmunomoduladoras solas o con uno o mas antfgenos, colesterol y/u otros agentes terapeuticos) pueden formularse facilmente combinando las moleculas inmunomoduladoras con transportadores farmaceuticamente aceptables bien conocidos en la tecnica. Dichos transportadores permiten a las moleculas inmunomoduladoras de la invencion formularse como comprimidos, pfldoras, grageas, capsulas, lfquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para la ingestion oral por un sujeto que se va a tratar. Pueden obtenerse preparaciones farmaceuticas para uso oral como un excipiente solido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, tras anadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener nucleos de comprimidos o grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidon de mafz, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden anadirse agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, o acido algmico o una de sus sales tal como alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones orales pueden tambien formularse en solucion salina o tampones, es decir, EDTA para neutralizar las condiciones acidas internas o pueden administrarse sin ningun transportador.
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Se contemplan tambien formas de dosificacion orales de los agentes o formulaciones anteriores. Los agentes o formulaciones pueden modificarse qmmicamente para que la administracion oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificacion qmmica contemplada es la union de al menos un resto al propio agente o formulacion, donde dicho resto permite (a) la inhibicion de la proteolisis; y (b) la captacion en el torrente sangumeo desde el estomago o el intestino. Se desea tambien el aumento en la estabilidad global del agente o formulacion y el aumento en el tiempo de circulacion en el cuerpo. Los ejemplos de dichos restos incluyen: polietilenglicol, copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivimlico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski y Davis, 1981, "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nueva York, N.Y., pags. 367-383; Newmark, y col., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185189. Otros polfmeros que podnan utilizarse son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Preferidos para la utilizacion farmaceutica, como se ha indicado anteriormente, son los restos de polietilenglicol.
Se contempla tambien la administracion intranasal de una composicion farmaceutica de la presente invencion. La administracion intranasal permite el paso de una composicion farmaceutica de la presente invencion al torrente sangumeo directamente tras administrar el producto terapeutico a la nariz, sin la necesidad de deposicion del producto en el pulmon. Las formulaciones para la administracion nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. En aspectos, una formulacion para la administracion intranasal (o administracion mucosal) puede comprender 3D-MPL, laureth 9, TRITON X-100™, TWEEN 80™, y desoxicolato de sodio. En aspectos, dicha formulacion puede combinarse con un antfgeno, por ejemplo, un antfgeno del virus de la gripe.
Para la administracion intranasal, un dispositivo util es una botella dura pequena a la cual se une un pulverizador de dosis medida. En aspectos, la dosis medida se administra extrayendo la composicion farmaceutica de la presente solucion de la invencion a una camara de volumen definido, donde dicha camara tiene una apertura dimensionada para aerosolizar una formulacion en aerosol formando una pulverizacion cuando se comprime un lfquido en la camara. La camara se comprime para administrar la composicion farmaceutica de la presente invencion. En aspectos, la camara tiene es una disposicion de tipo piston. Dichos dispositivos estan comercialmente disponibles.
Alternativamente, una botella de plastico flexible con una apertura o abertura dimensionada para aerosolizar una formulacion en aerosol formando una pulverizacion cuando se aprieta la botella. La abertura se encuentra usualmente en la parte superior de la botella, y la parte superior de la botella es generalmente conica para encajar parcialmente en los pasos nasales para una administracion eficaz de la formulacion en aerosol. En aspectos, el inhalador nasal proporcionara una cantidad medida de la formulacion en aerosol, para la administracion de una dosis medida del farmaco.
Para la administracion transbucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de una manera convencional.
Los compuestos pueden tambien formularse en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retencion, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros gliceridos.
Ademas de las formulaciones descritas, los compuestos tambien pueden formularse como una preparacion de deposito. Dichas formulaciones de accion prolongada pueden formularse con materiales polimericos o hidrofobos adecuados (por ejemplo, como una emulsion en un aceite aceptable) o resinas de intercambio ionico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
Las composiciones farmaceuticas pueden comprender tambien transportadores o excipientes solidos o en fase gel adecuados. Los ejemplos de dichos transportadores o excipientes incluyen, aunque no de forma limitativa, carbonato calcico, fosfato calcico, diversos azucares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polfmeros tales como polietilenglicoles.
Las formas de preparacion farmaceutica lfquida o solida adecuadas son, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para inhalacion, microencapsuladas, encocleadas, revestidas sobre partmulas de oro microscopicas, contenidas en liposomas, nebulizadas, aerosoles, aglomeradas para implante en la piel, o secas en un objeto puntiagudo para que se raspen en la piel. Las composiciones farmaceuticas incluyen tambien granulos, polvos, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)capsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberacion prolongada de compuestos activos, en cuya preparacion excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes o solubilizantes se usan habitualmente como se ha descrito anteriormente. Las composiciones farmaceuticas son adecuadas para su uso en una variedad de sistemas de administracion de farmacos. Para una breve revision de los procedimientos para la administracion de farmacos, vease Langer, Science 249:1527-1533, 1990.
Las moleculas inmunomoduladoras y opcionalmente otros agentes terapeuticos y/o antfgenos pueden administrarse per se (puros) o en la forma de una sal farmaceuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmaceuticamente aceptables, pero pueden usarse de forma conveniente sales no farmaceuticamente aceptable para preparar sus sales farmaceuticamente aceptables. Dichas sales incluyen, aunque no de forma
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limitativa, aquellas preparadas a partir de los siguientes acidos: clortftdrico, bromtftdrico, sulfurico, nftrico, fosforico, maleico, acetico, salidlico, p-tolueno sulfonico, tartarico, cftrico, metano sulfonico, formico, malonico, sucdnico, naftaleno-2-sulfonico, y benceno sulfonico. Ademas, dichas sales pueden prepararse como sales de metales alcalinos o alcalinoterreos, tales como las sales de sodio, potasio o calcio del grupo acido carboxflico.
Las formulaciones pueden comprender tambien un acido biliar o uno de sus derivados. En aspectos, este puede estar en la forma de una sal. En aspectos, los derivados incluyen, aunque no de forma limitativa, derivados de acido colico y sus sales. En aspectos, se contemplan sales de sodio de acido colico o derivados de acido colico. En aspectos, los acidos biliares y sus derivados incluyen, aunque no de forma limitativa, acido colico, acido desoxicolico, acido quenodesoxicolico, acido litocolico, acido ursodesoxicolico, acido hiodesoxicolico y sus derivados, por ejemplo, derivados glico-, tauro-, amidopropil-1-propanosulfonico-, amidopropil-2-hidroxi-1- propanosulfonico de los acidos biliares anteriormente mencionados, o N,N-bis(3D gluconoamidopropil) desoxicolamida. En aspectos, desoxicolato de sodio (NaDOC) puede estar presente en una vacuna de la invencion.
Los agentes tamponantes adecuados incluyen: acido acetico y una sal (1-2 % p/v); acido cftrico y una sal (1-3 % p/v); acido borico y una sal (0,5-2,5 % p/v); y acido fosforico y una sal (0,8-2 % p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0,003-0,03 % p/v); clorobutanol (0,3-0,9 % p/v); parabenos (0,01-0,25% p/v) y timerosal (0,004-0,02 % p/v).
Las composiciones farmaceuticas de la invencion contienen una cantidad eficaz de uno o mas oligonucleotidos de CpG aislados y uno o mas anftgenos, colesterol y, opcionalmente, otros agentes terapeuticos incluidos opcionalmente en un transportador farmaceuticamente aceptable. La expresion transportador farmaceuticamente aceptable significa una o mas cargas solidas o ftquidas compatible, diluyentes, o sustancias encapsulantes que son adecuadas para la administracion a un ser humano u otro animal vertebrado. El termino transportador denota un ingrediente organico o inorganico, natural o sintetico, con el que el principio activo se combina para facilitar la aplicacion. Los componentes de las composiciones farmaceuticas son tambien capaces de mezclarse con los compuestos de la presente invencion, y entre sf, de una manera tal que no existe interaccion que pudiera deteriorar sustancialmente la eficacia farmaceutica deseada.
La presente invencion se ilustra ademas mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Colesterol como vehculo de administracion para obtener datos de inmunogenicidad y eficacia de CpG ODN
El uso de liposomas que contienen ftpidos cationicos con colesterol ha mostrado una eficacia potenciada de CpG ODN. Se ensayo el uso de microesferas de colesterol, sin ftpidos adicionales, como adyuvante para aumentar la inmunidad celular. Se inmunizaron ratones C57BI/6 (n = 5 por grupo) por via intramuscular en los dfas 0, 14 y 21 con ovoalbumina (10 |jg), CpG solo (CPG 24555, 10 |jg), y CpG (CpG 24555, 10 |jg) con colesterol (1 |jg). Se midieron linfocitos T espedficos de anftgeno (CD4+ y CD8+) que secretan citoquinas unicas, dobles o triples (IL-2, IFN-y y TNF-a) en el dfa 28 utilizando citometna de flujo.
Resultados y discusion:
CpG + colesterol potencio la poblacion de linfocitos CD8+ polifuncionales en comparacion con CpG solo. CpG solo y CpG + colesterol dieron como resultado linfocitos CD4+ que producen citoquinas unicas y dobles (Figura 1a). CpG + colesterol dio como resultado linfocitos CD4+ que producen citoquinas triples (Figura 1b). CpG solo y CpG + colesterol dieron como resultado linfocitos CD8+ que producen citoquinas unicas, dobles y triples (Figuras 1c y 1d).
Se mostro una secrecion potenciada de IL-2 espedfica de anftgeno (Figura 2a) e IFN-y (Figura 2b) (citoquinas sesgadas a Th1) con CpG + colesterol. No se mostro potenciacion en las citoquinas proinflamatorias o sesgadas a Th2.
Se midieron las respuestas de los linfocitos T citotoxicos a CpG solo y CpG + colesterol. CpG + colesterol potencio las respuestas de los linfocitos T citotoxicos espedficas de ovoalbumina (Figuras 3a y 3b) y se aumento la poblacion de linfocitos T CD8 espedficos de anftgeno (Figuras 3c y 3d) en comparacion con CpG solo. El colesterol solo mostro niveles similares al control sin adyuvante.
Se midieron las respuestas humorales a CpG solo y CpG + colesterol. CpG + colesterol mostro un tftulo de anticuerpo espedfico de ovoalbumina potenciado y un sesgo a Th1 sobre CpG solo (Figura 4). Los numeros encima de cada barra representan la relacion de IgG2c/lgG1. En ratones, una IgG2a o 2c mayor es indicativa de una respuesta inmunitaria sesgada a Th1 mientras que un tftulo de IgG1 mayor es indicativo de una respuesta inmunitaria sesgada a Th2. Para CpG y CpG + colesterol, la cantidad de IgG2c fue mayor que IgG1 (2,04 y 4,66 respectivamente) que es indicativo de una respuesta inmunitaria sesgada a Th1.
En cada caso, el colesterol solo no mostro significativa actividad adyuvante.
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La administracion simultanea de antigeno y CpG, y de antigeno con CpG + colesterol, no mostro retardo de la movilidad de CpG en electroforesis. Se observo la misma cantidad de CpG en sobrenadantes de CpG + colesterol cuando se cuantifico mediante UV en comparacion con CpG libre. Esto sugiere que no hubo una fuerte asociacion de CpG con colesterol.
La inmunizacion subcutanea fue menos eficaz que la inyeccion intramuscular, lo que no sugiere evidencias de administracion simultanea. Sin embargo, la administracion simultanea parece tener algun papel, ya que una formulacion simultanea del antigeno y CpG demuestra la respuesta mas fuerte.
Sin pretender quedar limitado a teoria particular alguna, la microscopfa de transmision de electrones (TEM) sugirio que el colesterol formo micelas helicoidales insolubles que pueden interactuar con las membranas celulares para permitir la administracion de CpG (Figura 5).
Ejemplo 2: Inmunogenicidad, seguridad y eficacia de una vacuna inactivada pentavalente (IBR, BRSV, P13, BVDV1 y 2) en terneros frente al estimulo de BVDV-2
Se midieron las reacciones en los sitios de inyeccion en terneros inmunizados con la vacuna vmca inactivada pentavalente del virus de la diarrea bovina (BVDv 1 y 2, rinotraqueitis bovina infecciosa (IBRV), virus paragripal 3 (PI3V) y virus sincitial respiratorio de bovino (BRSV) (con respecto al antigeno vmco al 15 % de una dosis de 2 ml) en presencia de un adyuvante. Se administraron adyuvantes de CpG + colesterol (a relaciones de 1:1 o 1:10 CpG:colesterol), Advasure-DEAE/Dextrano, QCDCR (complejo de saponina transportador) o QCDCR + CpG. Algunos animales se inmunizaron con la vacuna comercial. Los animales placebo recibieron solucion salina esteril. Se vacunaron terneros (7/gp); de 9-12 meses de edad) en el dfa 0 y el dfa 22 por via subcutanea con 2 ml de BVDV 1 y 2, IBRV, PI3V y BRSV inactivados y se estimularon con 4 ml de BVDV-2 (Virus de la diarrea vmca bovina no citopatico de Tipo 2; Cepa 24515) por via intranasal en el dfa 42.
Los adyuvantes usados en las vacunas de cada grupo de tratamiento fueron del siguiente modo: El Grupo de Tratamiento T01 recibio solucion salina esteril (sin adyuvante). El Grupo de Tratamiento T02 recibio una vacuna en la que el adyuvante era la emulsion oleosa contenida en una vacuna comercial. El Grupo de Tratamiento T03 recibio una vacuna en la que el adyuvante era CpG-23877 (250 |jg)/colesterol (250 |jg), proporcionando por tanto una relacion de CpG:colesterol de 1:1. El Grupo de Tratamiento T04 recibio una vacuna en la que el adyuvante era CpG- 23877 (250 jg)/colesterol (2.500 jg), proporcionando por tanto una relacion de CpG:colesterol de 1:10. El Grupo de Tratamiento T05 recibio una vacuna en la que el adyuvante era AdvaSure®, una emulsion oleosa que contiene DEAE-DEXTRANO (100 mg) e ISC (800 jg). El Grupo de Tratamiento T06 recibio una vacuna en la que el adyuvante era Quil A (250 jg), colesterol (250 jg), bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA; 100 jg), Carbopol® (0,0375 jg), e hidroacetato de N-(2-Desoxi-2-L-leucilamino-b-D-glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida, conocido tambien por el nombre comercial Bay R1005® (1.000 jg). Esta combinacion de componentes se denomina en el presente documento QCDCR. El Grupo de Tratamiento T07 recibio una vacuna en la que el adyuvante era QCDCR (en las cantidades proporcionadas en T06) y CpG 23877 (250 jg).
Se recogieron muestras de sangre en los dfas 0, 22, 42 y 56 y se analizaron utilizando ELISA para los titulos del anticuerpo IgG. Se desarrollo el ELISA de BVDV y se optimizo a PAH utilizando el fragmento p67 H de BVDV como antigeno. En resumen, placas NUNC Maxisorp se revistieron con 0,2 ug/ml de fragmento p67 H recombinante de antigeno de BVDV en tampon carbonato-bicarbonato pH 9,6 y se incubaron durante la noche a 4 °C. A continuacion se descarto el antigeno de revestimiento y las placas se humedecieron y bloquearon utilizando ovoalbumina al 1 % en PBS-Tween (300 jl/pocillo) durante 1 h a 37 °C. A continuacion se retiro el tampon de bloqueo y se anadieron las muestras de suero diluidas (siete diluciones en serie de 5 veces; comenzando a 1:50) y se incubaron las placas durante 1 h a 37 °C. Se lavaron las placas cuatro veces en PBS-T (0,05 %Tween 20) antes de anadir 100 jl de anticuerpo de oveja dirigido contra IgG de bovino conjugado con h+I-HRP en tampon de bloqueo (1:4.000) y se incubo durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Se lavaron las placas de nuevo en PBS-T como se ha descrito anteriormente y se anadio sustrato TMB (100 jl/pocillo). Tras la incubacion durante 5-10 minutos, se detuvo la reaccion utilizando acido sulfurico 2 N (50 jl/pocillo)y se midio la densidad optica (DO) DO a 450 nM. Los resultados se expresaron como la media geometrica de los titulos.
Resultados y discusion
Los smtomas del estimulo de BVDV-2 son fiebre, leucopenia (aproximadamente una disminucion del 40 % en el recuento de WBC a partir de la media del recuento de WBC previo al estimulo) desde el dfa 3 al 12 tras el estimulo y la inmunomodulacion, trombocitopenia, insuficiencia respiratoria, depresion, trastornos de la reproduccion (aborto) y diarrea. La inmunidad protectora frente a BVDV es una respuesta inmunitaria de tipo Th-1. La inmunidad mediada por celulas esta mediada por linfocitos T CD4+. Los linfocitos T CD8+ son importantes para el aclaramiento del virus y las respuestas de memoria. IFN-a e IFN-y son protectores frente a la infeccion por BVDV. Las vacunas deben generalmente inducir CMI y la inmunidad humoral frente a BVDV. La Tabla 1 representa el porcentaje de terneros con enfermedad clmica, fiebre, leucopenia o viremia tras la estimulacion con BVDV-2 despues de la vacunacion con la vacuna vmca inactivada pentavalente BVDV 1 y 2, IBRV, PI3V y BRSV en presencia de CpG + colesterol (en las relaciones 1:1 (T03) o 1:10 (T04) de CpG:colesterol), Advasure-DEAE/Dextrano (T05), QcDcR (T06), QcDcR + CpG (T07), vacuna comercial (T02) o solucion salina esteril (T01).
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Tabla 1. Porcentaje de terneros con enfermedad clinica, fiebre, leucopenia o viremia
Grupo de tratamiento
% clmicamente enfermo % de fiebre % leucopenico % viremico
Control no vacunado (PBS)
42,9 85,7 100 100
vacuna comercial
57,1 14,3 100 85,7
5V+CpG Colesterol (1:1)
14,3 0 42,9 28,6
5V+CpG Colesterol (1:10)
0 14,3 71,4 0
5V + Advasure DEAE-Dextrano/ISC
66,7 33,3 83,3 33,3
5V+QCDCR
57,1 28,6 85,7 42,9
5V+QCDCR-CpG (1:1)
42,9 14,3 71,4 0
Las vacunas administradas a terneros en los grupos T02 (vacuna comercial), T03 (CpG:colesterol 1:1), T04 (CpG colesterol 1:10), T05 (Advasure-DEAE/Dextrano), T06 (qCdCR) y T07 (QCDCR + CpG) fueron superiores en la supresion de la fiebre en comparacion con los controles de solucion salina. Las vacunas administradas a terneros en T03 (CpG:colesterol 1:1), T04 (CpG:colesterol 1:10), T05 (Advasure-DEAE/Dextrano), T06 (QCDCR) y T07 (QCDCR + CpG) fueron superiores en la supresion de la viremia en comparacion con la vacuna comercial (T02) y los grupos con solucion salina (T01). T04 y T07 suprimieron la viremia completamente y los terneros con la vacuna comercial (T02) fueron viremicos durante un periodo mas corto que los controles. Aunque no se evito totalmente la leucopenia en ninguno de los grupos vacunados, se observo un efecto vacuna durante multiples dfas entre T03 (CpG:colesterol 1:1), T04 (CpG:colesterol 1:10), T05 (Advasure-DEAE/Dextrano), T06 (QCDCR) y T07 (QCDCR + CpG) en comparacion con los grupos del control y la vacuna comercial (T02). Los terneros en los grupos T03 y T04 experimentaron menos enfermedad clinica en comparacion con los otros grupos. En su conjunto, los datos sugieren que las vacunas que contienen CpG (T03, T04 y T07), tales como CpG de clase P modificado en E, demostraron una eficacia potenciada y estas vacunas fueron mas eficaces que la vacuna comercial.
En la Figura 6a se muestran las reacciones en el sitio de inyeccion que se desarrollaron tras la administracion de los adyuvantes. La vacuna comercial (T02) y las vacunas Advasure-DEAE/Dextranos (T05) fueron mas reactivas que las otras vacunas ensayadas. Las vacunas que contienen QCDCR + CpG (T07) y CpG + colesterol (T03 y T04) fueron las mas seguras. En terneros inmunizados con CpG + colesterol, todos los smtomas del estimulo de BVDV-2 se redujeron en comparacion con los animales del control no vacunados.
La primera dosis de vacuna administrada indujo un bajo nivel de tttulos de anticuerpos neutralizantes en suero. Todas las vacunas ensayadas indujeron una seroconversion del 100 % en los antfgenos de BVDV 1 e IBRV en el dfa 42. Todas las vacunas ensayadas, excepto la vacuna Advasure-DEAE/Dextrano (T05), indujeron una seroconversion del 100 % en BVDV 2 en el dfa 42. La vacuna Advasure-DEAE/Dextrano (T05) indujo una seroconversion del 83 % en el dfa 42. Tras el estfmulo, las respuestas de los anticuerpos contra BVDV 1 y BVDV 2 se reforzaron hasta niveles significativamente mayores en todos los grupos (Tabla 2).
Tabla 2, parte A
Grupo
tftulos con SN de BVDV 2 tftulos con SN de BVDV 1
Dfa 22 42 56 Dfa 22 42 56
T01
1,4 (0/7) 1,0 (0/7) 109,6 (5/7) 1,2 (0/7) 1,0 (0/7) 5,8 (2/7)
T02
2,9 (2/7) 211,5 (7 de 7) 18207,5 (7 de 7) 1,8 (0 de 7) 76,3 (7 de 7) 3119,4 (7 de 7)
T03
2,3 (0 de 7) 69,3 (7 de 7) 4783 (7 de 7) 3,4 (0 de 7) 163,9 (7 de 7) 3530,5 (7 de 7)
T04
3,2 (0 de 7) 129,2 (7 de 7) 11979,8 (7 de 7) 10,8 (7 de 7) 371,1 (7 de 7) 8823,7 (7 de 7)
T05
1,7 (0 de 7) 16,6 (5 de 6) 2598,3 (6 de 6) 3,4 (2 de 7) 362,4 (6 de 6) 8689,6 (6 de 6)
T06
3,1 (0 de 7) 153,6 (7 de 7) 17379,6 (7 de 7) 15,1 (4 de 7) 1217,7 (7 de 7) 24346,5 (7 de 7)
T07
6,7 (3 de 7) 228,3 (7 de 7) 20162,6 (7 de 7) 25,5 (7 de 7) 1103 (7 de 7) 19972,2 (7 de 7)
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Tabla 2, parte B
Grupo
titulos con SN de IBR (BHV-1)
Dfa 22
42 56
T01
1,0 (0/7) 1,0 (0/7) 1,0 (0/7)
T02
3,1 (6 de 7) 110,4 (7 de 7) 78,1 (7 de 7)
T03
2,0 (6 de 7) 7,8 (7 de 7) 7,2 (7 de 7)
T04
2,1 (5 de 7) 10,3 (7 de 7) 8,4 (7 de 7)
T05
20,3 (7 de 7) 100,7 (6 de 6) 63,3 (6 de 6)
T06
3,9 (6 de 7) 67 (7 de 7) 46,2 (7 de 7)
T07
5,0 (7 de 7) 57,9 (7 de 7) 41 (7 de 7)
SN - Neutralizacion del suero
La vacunacion primaria respectiva (T02-T07) estimulo las respuestas de anticuerpos IgG espedficos de BVDV que se aumentaron mediante la vacunacion de refuerzo y mediante el estimulo de BVDV2. No hubo diferencias significativas entre los titulos de IgG entre los grupos.
Todas las formulaciones de vacunas fueron inmunogenas e indujeron la neutralizacion del suero (BVDV 1 y BVDV 2) y los anticuerpos IgG espedficos de BVDV que se reforzaron mediante revacunacion y estimulo. La proteccion frente al estimulo de BVDV es mediante inmunidad mediada por celulas (CM); secrecion de IFNy y activacion de linfocitos T CD4+ y CD8+ espedficos de BVDV), aunque el anticuerpo puede neutralizar el virus libre y proteger por tanto frente al estimulo si esta presente a altos niveles, por ejemplo, en el calostro del que se alimentan los terneros en el nacimiento. Se detectaron respuestas de CMI (tipo Th-1) mediante la secrecion de la citoquina IFNy in vitro y se determinaron las respuestas humorales (tipo Th-2) detectando IL-4.
Los antigenos de BVDV 1 y BVDV 2 indujeron un bajo nivel de respuestas IFNy y no hubo diferencias significativas (P>0,1) entre los grupos de tratamiento (no se muestran los datos). El antigeno de BSRV indujo respuesta de IFNy en todos los grupos excepto en los grupos T01 (solucion salina) y T03 (CpG:colesterol 1:1), El antigeno de IBR indujo las respuestas de IFNy mas fuertes en T05 (Advasure-DEAE/Dextrano) y T06 (QCDCR) en todos los dfas ensayados tras la vacunacion y respuestas debiles, pero positivas en T02 (vacuna comercial), T04 (CpG:colesterol 1:10), y T07 (QCDCR + CpG). el antigeno de PI3 indujo respuestas de IFNy en T02 (vacuna comercial), T05 (Advasure-DEAE/Dextrano), T06 (QCDCR) y T07 (QCDCR + CpG).
Ejemplo 3: Inmunogenicidad en cerdo de una subunidad de vacuna (Pertactina) de Bordetella bronchiseptica formulada con diferentes adyuvantes
Se evaluaron las respuestas inmunitarias espedficas de antigeno de cerdos inmunizados con pertactina (p68) formulada con diversos adyuvantes, incluyendo CpG + colesterol.
Los productos veterinarios de investigacion (IVP) utilizados en el estudio fueron del siguiente modo: Las vacunas se administraron en dosis de 1 ml. El Grupo de Tratamiento T01 recibio solucion salina tamponada con fosfato 20 mM. El Grupo de Tratamiento T02 recibio una vacuna que contema Quil A (250 pg), colesterol (250 pg), bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA; 100 pg), Carbopol® (0,075 %), Hidroacetato de N-(2-Desoxi-2-L-leucilamino-b-D- glucopiranosil)-N-octadecildodecanoilamida, conocido tambien por el nombre comercial Bay R1005® (1.000 pg). Esta combinacion de componentes se denomina en el presente documento QCDCR. La composicion contema tambien CpG 23878 (250 pg) y pertactina (10 pg). El Grupo de Tratamiento T03 recibio una vacuna que contema colesterol (2.500 pg), CpG 23877 (250 pg), y pertactina (10 pg). El Grupo de Tratamiento T04 recibio una vacuna que contema colesterol (2.500 pg), CpG 23878 (250 pg), y pertactina (10 pg) El Grupo de tratamiento T05 recibio una vacuna que contema 6 % de aluminio como Al(OH)3 y pertactina (10 pg).
Sesenta y cuatro (64) cerdos clmicamente sanos con un estado de salud alto de ambos sexos se utilizaron en el estudio. Los cerdos o sus madres no teman antecedentes de vacunacion contra o exposicion a B. bronchiseptica. Ninguno de los cerdos tema un titulo de pertactina positivo (definido como > 200) en el suero recogido en la granja de origen, o en el Dfa -1.
En el Dfa 0, se vacunaron los cerdos en la parte izquierda del cuello con una dosis de 1,0 ml proporcionada mediante inyeccion IM. En el Dfa 21, Se volvieron a vacunar los cerdos con el mismo IVP y dosis como anteriormente, administrada en la parte derecha del cuello. En el lapso de una hora desde cada vacunacion, el investigador o el tecnico cualificado observaron los cerdos para determinar los eventos adversos inmediatos relacionados con la vacunacion.
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La variable de resultado principal fueron los tftulos del anticuerpo de pertactina en suero (IgG total). Se ensayaron las muestras de suero para determinar los anticuerpos de pertactina utilizando un ELISA. Se revistieron placas Nunc Maxisorp con 50 ng/pocillo de pertactina en tampon carbonato (pH 9,1). Se lavaron las placas y se bloquearon con 1x PBS con Tween 20 al 0,05 % y leche desnatada al 1 % (1 h, TA). Las muestras de suero, diluidas en tampon de bloqueo, se anadieron a las placas, se incubaron (1 h, TA), se lavaron y se incubaron (1 h, TA) con anticuerpo de cabra Bethyl dirigido contra IgG de cerdo (h+I)) conjugado con HRP diluido 1:1250 en tampon de bloqueo. Tras un lavado final, se anadio sustrato ABTS (KPL 50-62-00) y se leyeron los valores de la DO despues de una incubacion de 12 minutos a TA. Los tftulos se calcularon basandose en un corte del 20 % del valor de la DO de una dilucion 1:1000 de un combinado serico del control positivo.
Se ensayaron tambien muestras de suero de T01, T03, T04, T05, y T08 para los anticuerpos IgG1 e IgG2 espedficos de pertactina utilizando un ELISA. Se revistieron placas Nunc Maxisorp con 50 ng/pocillo de pertactina en tampon carbonato (pH 9,1). Se lavaron las placas y se bloquearon con 1x PBS con Tween 20 al 0,05 % y leche desnatada al 1 % (1 h, TA). Las muestras de sueros, diluidas en tampon de bloqueo, se anadieron a las placas, se incubaron (1 h, TA), se lavaron y se incubaron (1 h, TA) con anticuerpos monoclonales (IgG1-Serotec MCA635 o IgG2-Sertec MCA636) diluido 1:100 en tampon de bloqueo. Se incubaron las placas (1 h, TA), se lavaron y se anadio un anticuerpo dirigido contra Ig de raton conjugado con HRP (Jackson Laboratories) diluido 1:5000 en tampon de bloqueo. Tras un lavado final, se anadio sustrato ABTS (KPL 50-62-00) y se leyeron los valores de la DO despues de una incubacion de 20 minutos a TA. Se calcularon los tftulos de IgG1 basandose en un corte del 50 % del valor de la DO de una dilucion 1:1000 de un combinado serico del control positivo. Se calcularon los tftulos de IgG2 basandose en un corte de una DO de 0,2.
Se recogieron PBMC procedentes de sangre heparinizada, se ensayaron para determinar la produccion de IFN-y espedfica de antfgeno. Se ensayo la respuesta de IFN-y mediante eLiSPOT (Th1) para determinar la frecuencia de celulas secretoras de INF-Y/millones de celulas SFC/106 a partir de las PBMC (tras sustraer el fondo en los controles del medio). Ademas, se ajustaron las respuestas de IFN-y segun el mdice de estimulacion (SI) de las celulas estimuladas con pertactina en comparacion con el control del medio. Se requirio un mdice de estimulacion de al menos 2X para que la muestra se considerara positiva.
Resultados y discusion
Se vacunaron los cerdos en el dfa 0 y 21 con las vacunas que se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Grupo de vacuna
Adyuvante (Dosis) Transportado r
T01
Ninguno Ninguno
T02
CpG23878 (250 jg) QCDCR
T03
CpG23877 (1:10) Colesterol
T04
CpG23878 (1:10) Colesterol
T05
Alhidrogel Ninguno
Las muestras de sangre para el aislamiento de PBMC y las muestras de suero se tomaron en el dfa -1, dfa 7, dfa 20, dfa 28 y dfa 35 y se analizaron. Las muestras de suero se ensayaron para determinar la IgG total, utilizando los anticuerpos IgG1 e IgG2 mediante un ELISA para la pertactina recombinante purificada exenta de LPS. Se obtuvieron anticuerpos isotipantes de Bethyl Labs o AbD Serotec.
Se aumentaron los niveles de IgG espedficos de pertactina en los grupos T02 (CpG + QCDCR), T03 (CpG 23877 + colesterol; 1:10) y T04 (CpG 23878 + colesterol; 1:10) en comparacion con las otras vacunas ensayadas.
No se notificaron efectos adversos posteriores a la vacunacion durante el tiempo de observacion inmediatamente despues de la vacunacion. No se registraron observaciones de reacciones producidas por la vacunacion. Los cerdos en el grupo de tratamiento T01 siguieron siendo negativos para los anticuerpos ELISA espedficos de pertactina a lo largo del estudio.
todos los cerdos tuvieron tftulos ELISA espedficos de pertactina negativos (< 200) en el Dfa -1. El porcentaje de cerdos con seroconversion en algun momento despues de la vacunacion fue del 0 % para T01, 100 % para T02, T03, T04 y T08. El grupo de tratamiento (T02) con el adyuvante CpG n.° 23878 y el transportador QcDcR, tuvo GMT de 906,0 y 24728,5 en los Dfas 20 y 35 respectivamente, y las GMT en ambos dfas fueron significativamente mayores (P < 10) que todos los otros grupos de tratamiento (Tablas 4 y 5). T01, el control negativo, tuvo medias que fueron significativamente menores que los otros grupos en los Dfas 20 y 35. Las GMT de T08 (formuladas con hidroxido de aluminio) fueron significativamente menores que las GMT de las vacunas de pertactina formuladas con los CpG utilizando los transportadores QCDCR o colesterol (T02, T03, T04) en ambos puntos temporales posteriores
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a la vacunacion. En la Figura 7 se presenta un grafico de la respuesta del anticuerpo espedfico de antigeno en cerdos inmunizados con pertactina (p68) formulada con diversos adyuvantes que incluyen cPg + colesterol.
Tabla 4. Titulos ELISA de IgG total especificos de pertactina en el Dia 20
Ajustes por mmimos cuadrados de las medias geometricas, errores estandar, e intervalos de titulos de anticuerpo de cerdos 20 dfas despues de administrar un IVP.
Grupo de tratamiento
Adyuvante Transportador Media geometrica Error estandar Intervalo
T01
Ninguno Ninguno 250a 6,88 25 a 25
T02
CpG n.° 23878 QCDCR 906,0b 265,29 428 a 3188
T03
(250 pg) Colesterol 367,4c 101,10 57 a 973
T04
CpG n.° 23878 (250 Mg) Colesterol 254,2c 69,97 66 a 473
T05
Alhidrogel Ninguno 46,5d 12,79 25 a 163
a bcd las medias geometricas con diferentes supermdices son significativamente diferentes (P< 0,10)
Tabla 5. Titulos ELISA de IgG total especificos de pertactina en el Dia 35
Ajustes por mmimos cuadrados de las medias geometricas, errores estandar, e intervalos de titulos de anticuerpo de cerdos 35 dfas despues de administrar un IVP.
Grupo de tratamiento
Adyuvante Transportador Media geometrica Error estandar Intervalo
T01
Ninguno Ninguno 25,0a 5,79 25 a 25
T02
CpG n.° 23878 (250 Mg) QCDCR 24728,5b 6077,46 10450 a 46473
T03
CpG n.° 23877 (250 Mg) Colesterol 7608,8c 1763,31 4619 a 17106
T04
CpG n.° 23878 (250 Mg) Colesterol 4360,1d 1010,43 1968 a 11829
T05
Alhidrogel Ninguno 625,68 144,97 233 a 1997
a.b,c,d,e las medias geometricas con diferentes supermdices son significativamente diferentes (P< 0,10)
Se ensayaron muestras procedentes solo de tratamientos seleccionados para los titulos de anticuerpos en suero contra pertactina especificos de isotipo (Tabla 6). La relacion IgG2/IgG1 fue de 0,40 para T03 (CpG 23878 formulada con QCDCR) y 2,64 (CpG23878 formulada con colesterol).
Tabla 6. Titulos de anticuerpos en suero contra pertactina especificos de isotipo
Titulo de la media geometrica de LS
Dia-1 Dia 20 Dia 35
Trt
IgG1 igG2 Relacion * IgG1 igG2 Relacion * IgG1 igG2 Relacion *
T01
29,7 25,0 0,84 25,0 25,0 1,00 25,0 25,0 1,00
T02
29,3 25,0 0,85 76,9 51,4 0,67 3255,3 1316,1 0,40
T03
36,5 25,0 0,68 33,6 89,3 2,66 767,7 2027,3 2,64
T04
25,0 25,0 1,00 30,1 29,9 0,99 360,8 501,2 1,39
T05
37,1 25,0 0,67 25,0 25,0 1,00 142,1 215,9 1,52
* relacion IgG2/IgG1
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se midieron las respuestas promedio de IFN-y espedficas de pertactina mediante el indice de Estimulacion (SI) y las celulas formadoras de manchas (SFC/106). Hubo una considerable variabilidad de las respuestas de iFN-y espedficas de pertactina de los cerdos dentro de los grupos y entre puntos temporales, debido en parte a que solo hada 8 sujetos por grupo. Hubo diferencias significativas (P < 0,10) entre tratamientos en todos los puntos temporales, incluyendo la prevacunacion (Dfa -1). Para todos los puntos temporales posteriores a la vacunacion (Dfas 7, 20, 28 y 35) la media de SI para T02 fue significativamente mayor que T01 y T03. Por el contrario, el SI para T05 no fue diferente de T01 en cualquier punto temporal posterior a la vacunacion. El SI par T04 fue significativamente mayor que T01 en los Dfas 20 y 35. La media de SFC/106 para T02 fue significativamente mayor que T01 y T05 en 3 de 4 puntos temporales posteriores a la vacunacion. Las respuestas de IFN-y (SI y SFC/106) de T03 y T08 no fueron diferentes de T01 en cualquier punto temporal posterior a la vacunacion.
Los expertos en la materia reconoceran, o seran capaces de discernir no utilizando mas que la experimentacion rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones espedficas de la invencion descritos en el presente documento. Se pretende que dichos equivalentes sean abarcados por las siguientes reivindicaciones.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Davis, Heather L Weeratna, Risini
<120> ANTfGENOS Y VACUNAS INMUNOMODULADORAS JUNTO CON COLESTEROL Y SUS USOS
<130> PC33995
<140> Aun no asignado <141> Aun no asignado
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 1
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 2 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 2
tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21
<210> 3 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 3
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24
<210> 4 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<220>
<223> Secuencia sintetica <400> 4
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210>5 <211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 5
tcgtcgtttt acggcgccgt cccg 24
<210>6 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 6
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23
<210>7 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 7
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210>8 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 8
tcgacgtcga tcggcgcgcg ccg 23
<210>9 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 9
tcgacgtcga tcggcgcgcg ccgt 24
<210> 10 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> N es un nucleotido modificado con yodo <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> N es uracilo
<400> 10
nncgacgtcg atcggcgcgc gccg 24
<210> 11 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> N es un nucleotido modificado con yodo <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> N es uracilo
<400> 11
nncgacgtcg atcggcgcgc gccgt 25
<210> 12 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 12
cgacgtcgat cggcgcgcgc cgt 23
<210> 13 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> N es un nucleotido modificado con etilo <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> N es uracilo
<400> 13
nncgacgtcg atcggcgcgc gccg 24
<210> 14 <211> 25 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> N es un nucleotido modificado con yodo <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> N es uracilo
<400> 14
nncgtcgacg atcggcggcc gccgt 25
<210> 15 <211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> N es un nucleotido modificado con yodo <220>
<221> misc_feature <222> (2)..(2)
<223> N es uracilo
<400> 15
nncgtcgacg atcggcggcc gccgt 25
<210> 16 <211> 26 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (3)..(3)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (5)..(5)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (7)..(7)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc feature
5
10
15
20
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30
35
40
45
50
<222> (9)..(9)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (11)..(11)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (13)..(13)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (15)..(15)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (17)..(17)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (19).. (19)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (21)..(21)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (23)..(23)
<223> N es inosina
<220>
<221> misc_feature <222> (25)..(25)
<223> N es inosina
<400> 16
ncncncncnc ncncncncnc ncncnc 26
<210> 17 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 17
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 18 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 18
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 19
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<211> 24 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 19
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 20 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 20
tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24
<210> 21 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 21
tcgtcgtttt tcggtgcttt t 21
<210> 22 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 22
tcgtcgtttt tcggtcgttt t 21
<210> 23 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 23
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 24 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 24
tcgtcgtttc gtcgttttgt cgtt 24
<210> 25 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<220>
<223> Secuencia sintetica <400> 25
tcgtcgtttt gtcgtttttt tcga 24
<210> 26 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 26
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 27 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 27
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 28 <211> 21 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 28
tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 29 <211> 19 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 29
tcggacgttc ggcgcgccg 19
<210> 30 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 30
tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20
<210> 31 <211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<400> 31
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 32 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 32
tcgacgttcg gcgcgccg 18
<210> 33 <211> 18 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 33
tcgcgtcgtt cggcgccg 18
<210> 34 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 34
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 35 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 35
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 36 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 36
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
<210> 37 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 37
tcgtcgacga tcggcgcgcg ccg 23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<210> 38 <211> 22 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 38
tcgcgtcgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 39 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 39
tcgtcgacgt tcggcgcgcg ccg 23
<210> 40 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 40
tcggacgttc ggcgcgcgcc g 21
<210> 41 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 41
tcggacgttc ggcgcgccg 19
<210> 42 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 42
tcgcgtcgtt cggcgcgccg 20
<210> 43 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 43
tcgacgttcg gcgcgcgccg 20
<210> 44 <211> 18 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 44
tcgacgttcg gcgcgccg 18
<210> 45 <211> 18 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 45
tcgcgtcgtt cggcgccg 18
<210> 46 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 46
tcgcgacgtt cggcgcgcgc cg 22
<210> 47 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 47
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 48 <211> 22 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 48
tcgtcgtttt cggcggccgc cg 22
<210> 49 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 49
tcgtcgtttt acggcgccgt gccg 24
<210> 50 <211> 23 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintetica <400> 50
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cgt 23

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Una vacuna que comprende uno o mas antigenos y un adyuvante, en la que el uno o mas antigenos son cada uno de forma independiente, un antigeno microbiano, un autoantigeno, un antigeno tumoral, un alergeno, o una sustancia adictiva y el adyuvante consiste en uno o mas oligonucleotidos CpG aislados o un agonista del TLR que es un oligorribonucleotido, y colesterol.
  2. 2. La vacuna de la reivindicacion 1, en la que el uno o mas antigenos son cada uno de forma independiente, un peptido, un peptido conjugado a una protema transportadora, un peptido conjugado a una partmula analoga a virus, un polipeptido, una protema recombinante, una protema purificada, un patogeno muerto completo, un virus atenuado vivo o un vector vmco que expresa un antfgeno, una bacteria atenuada viva o un vector bacteriano que expresa un antfgeno, un polisacarido, un polisacarido conjugado a una protema transportadora, un hapteno, un hapteno conjugado a una protema transportadora o a una molecula pequena.
  3. 3. La vacuna de la reivindicacion 2, en la que el antfgeno es de origen bacteriano, de origen vmco o de origen parasttico.
  4. 4. La vacuna de la reivindicacion 3, en la que
    a) el antfgeno bacteriano es una bacteria muerta completa, una bacteria atenuada viva o protemas bacterianas purificadas; o
    b) el antfgeno vmco es un virus muerto completo, un virus atenuado vivo o protemas vmicas purificadas.
  5. 5. La vacuna de la reivindicacion 2, en la que la protema transportadora es un toxoide o derivado bacteriano, una exotoxina de Pseudomonas, KLH o una partmula analoga a virus.
  6. 6. La vacuna de la reivindicacion 5, en la que
    a) el toxoide bacteriano es un toxoide de la difteria o uno de sus derivados; o
    b) la partmula analoga a virus es HBsAg, HBcAg, bacteriofago Qp de E. coli, virus de Norwalk o gripe HA.
  7. 7. La vacuna de la reivindicacion 1, en la que
    a) la sustancia adictiva es nicotina o una molecula analoga a nicotina; o
    b) el antfgeno tumoral es uno o mas de survivina, Her-2, EFGRvIII, PSA, PAP o PMSA.
  8. 8. La vacuna de la reivindicacion 2, en la que el hapteno conjugado a una protema transportadora es nicotina o una molecula analoga a nicotina conjugada con el toxoide de la difteria o derivado del mismo.
  9. 9. La vacuna de la reivindicacion 1, en la que la cantidad de colesterol con respecto a la cantidad de antfgeno es de 0,1 a 50 veces mayor en peso, de 1 a 10 veces mayor en peso o igual en peso al antfgeno.
  10. 10. La vacuna de la reivindicacion 1, que comprende ademas un transportador farmaceutico.
  11. 11. Una vacuna de acuerdo con un cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en un procedimiento de induccion de una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno en un sujeto que lo necesita, en la que la vacuna se administra en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmunitaria espedfica de antfgeno en el sujeto.
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