ES2683334T3 - Nuevas bacterias aisladas del tracto productor de miel de abejas melíferas - Google Patents

Nuevas bacterias aisladas del tracto productor de miel de abejas melíferas Download PDF

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Abstract

Una cepa bacteriana aislada del género Lactobacillus o Bifidobacterium, aislada del tracto productor de miel de al menos una abeja, consistiendo el tracto productor de miel de una abeja en el tronco, la boca, el esófago y el saco de miel, y cepa que tiene la capacidad de inhibir el crecimiento del deterioro de los alimentos y de organismos patógenos, siendo la cepa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en: cepa Biut2 de Lactobacillus (LMG P-24094), cepa Hma2 de Lactobacillus (LMG P-24093), cepa Hma8 de Lactobacillus (LMG P-24092), cepa Bma5 de Lactobacillus (LMG P-24090), cepa Hon2 de Lactobacillus (LMG P- 24091), siendo dichas cepas depositadas en la Colección de Bacterias BCCM/LMG de Bélgica el 3 de abril de 2007, la cepa Bin7 de Bifidobacterium (LMG P-23986), la cepa Hma3 de Bifidobacterium (LMG P-23983), la cepa Bin2 de Bifidobacterium (LMG P-23984), la cepa Bma6 de Bifidobacterium (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Colección de Bacterias BCCM/LMG de Bélgica el 15 de enero de 2007, y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Colección de Bacterias BCCM/LMG de Bélgica el 28 de abril de 2008.

Description

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DESCRIPCION
Nuevas bacterias aisladas del tracto productor de miel de abejas meKferas Campo de invencion
La invencion se refiere a nuevas cepas aisladas de Lactobacillus y Bifidobacterium. La invencion se refiere ademas a composiciones y a productos que comprenden estas cepas.
Antecedentes de la invencion
La miel, el misterioso alimento usado en medicina desde la antiguedad, ha desconcertado a las personas durante siglos con sus efectos curativos en heridas humanas, documentados por los egipcios 2.000 anos a.c.
La miel es producida por abejas tales como la abeja melifera Apis mellifera. El nectar que las abejas recogen de las plantas es un liquido dulce que se compone principalmente de sacarosa. Para cuando la abeja regresa a la colmena, gran parte de la sacarosa se ha convertido en glucosa y fructosa. La miel contiene ademas proteinas, vitaminas y minerales.
Actualmente, las propiedades terapeuticas de la miel, ademas de la osmolaridad y la acidez, se explican por el contenido de peroxido de hidrogeno como accion de la peroxidasa oxidasa (White et al., 1963, Biochem Biophys Acta 73, 57-70), el origen del nectar, por su diferente contenido de acidos flavonoides y fenolicos (Taormina et al., 2001. Int J Food Microbiol 69(3), 217-225; Wahdan H. A. 1998. “Infection" 26(1), 26-31), y un componente sin identificar (Molan, P. C. 2001. “World Wide Wounds" (en linea); disponible en la URL:
http://www.worldwidewounds.com/2001/november/Molan/honey-as-topical-agent.html). A pesar de los esfuerzos cientificos realizados durante los ultimos 30 anos (Lusby, P. E., et al. 2005 Arch Med Res 36(5), 464-467; Molan, P. C. 2006. Int J Low Extrem Wounds 5(1), 40-54 Int J Low Extrem Wounds 5(2), 122; Mundo, M. A., et al. 2004 Int J Food Microbiol 1, 97(1), 1-8) aun no se ha resuelto el misterio relativo a muchos de los modos de accion de la miel.
Las propiedades antimicrobianas poseidas por miel hacen que la miel sea adecuada para su uso en apositos para heridas, en los que ayuda a prevenir la infeccion, el desbridamiento de tejido necrotico, la desodorizacion de heridas malolientes y la minimizacion de la formacion de cicatrices. Los productos que contienen miel para el cuidado de las heridas y la piel se conocen a traves de los documentos W02004000339 y WO03047642.
En la practica medica de hoy en dia, los antibioticos son los mas usados para el tratamiento de las infecciones. Sin embargo, el uso extensivo de antibioticos ha llevado a que las bacterias patogenas resistentes a los antibioticos se conviertan en un gran problema. En la industria alimentaria, los conservantes se usan ampliamente para prolongar la vida util de los alimentos y prevenir el crecimiento de microorganismos patogenos nocivos. Sin embargo, las personas estan tomando conciencia de los efectos secundarios de los aditivos de los alimentos, tales como las alergias, y existe una creciente demanda de alimentos mas naturales. Estos hechos han despertado un interes en la medicina tradicional y el deseo de encontrar nuevas soluciones de tratamiento y tratamientos preventivos, asi como aditivos basados en la sabiduria antigua.
Un objetivo de la invencion es obtener productos medicos, productos alimentarios y piensos que aporten sus propiedades beneficiosas de la miel.
Un objetivo adicional es producir sinteticamente miel.
Otro objetivo es obtener nuevas cepas de bacterias que tengan actividad antimicrobiana.
Sumario de la invencion
Estos objetivos se han cumplido ahora de acuerdo con la presente invencion al proporcionar nuevas cepas aisladas de Lactobacillus y Bifidobacterium que se han aislado de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja, y composiciones y productos que comprenden estas cepas y un metodo de produccion de miel. Ademas, se proporciona un metodo de aislamiento de las cepas bacterianas.
Por lo tanto, los presentes inventores han descubierto las cepas bacterianas que participan estrechamente en la produccion de miel. Las cepas bacterianas tienen propiedades unicas que las hacen utiles en muchos productos tales como productos medicos, productos alimentarios, bebidas y piensos. Las cepas bacterianas aisladas crecen rapidamente, a baja temperatura y en un ambiente acido, y son capaces de crecer en soluciones de azucar muy concentradas. Las cepas bacterianas pueden combatir eficazmente otros organismos, en especial, los organismos que estropean los alimentos y que son patogenos para los seres humanos (tales como las especies de Listeria, Bacillus y Staphylococcus) y las abejas meliferas (tales como las larvas de Paenibacillus). Con un origen unico relacionado con la miel, las cepas bacterianas son adecuadas para su uso en productos que contienen miel. Estos
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productos tienen propiedades unicas buenas para la salud.
Hasta la fecha, no se han aislado cepas bacterianas de la miel fresca o del tracto productor de miel de una abeja. El tracto productor de miel de una abeja incluye el tronco, la boca, el esofago y el saco de miel de una abeja melifera tal como la especia Apis. Por lo tanto, las tripas o el intestino no forman parte del tracto productor de miel de una abeja. La miel fresca es miel que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso, preferentemente superior al 20 % en peso. La miel que tiene un contenido de agua inferior al 18 % en peso es miel madurada, es decir, la miel que normalmente se consume.
El Lactobacillus kunkeei aparecio en la literatura en relacion con las abejas. Un informe se refiere al examen de la ecologia microbiana de las tripas de larvas de avispa social Vespula germanica (Reeson A. F. et al., 2003, Insect Mol Biol 12 (1), 85-91), y un segundo informe se refiere a un solo clon de la flora intestinal de larvas de abeja solitaria Osmia bicornis (Mohr K. I. y Tebbe C. C., 2006. Environ Microbiol 8(2), 258-272). Estos dos organismos carecen de via de produccion de miel, no producen miel y, por lo tanto, no son abejas meliferas.
Las enfermedades de las abejas son infecciones y afecciones parasitarias que se relacionan con una enorme perdida de la economia agricola. Las larvas de Paenibacillus causantes de la loque americana (AFB) se consideran uno de los agentes patogenos mas peligrosos para las abejas meliferas, provocando la destruccion de colonias infectadas en muchos paises (Genersch, E., et al., 2005. Appl Environ Microbiol 71(11), 7551-7555). El documento JP2222654 sugiere el uso de especies de Lactobacillus en el intestino de abejas meliferas en un pienso para mejorar la funcion inmunologica de las abejas meliferas. Estas especies de bacterias se aislan del intestino de la abeja melifera y, por lo tanto, no estan adaptadas a un ambiente similar a la miel.
El documento JP 2222654 desvela Lactobacillus bifidus aislado del intestino de una abeja melifera. El documento desvela ademas pienso para abejas que contienen esta bacteria, asi como Lactobacillus lactis (es decir, animalis), Streptococcus lactis, Bacillus subtilis para la estimulacion del intestino de abejas meliferas.
Un primer aspecto de la invencion se refiere a una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, aislada del tracto productor de miel de al menos una abeja, en el que el tracto productor de miel de una abeja consiste en el tronco, la boca, el esofago y el saco de miel, y en el que la cepa tiene la capacidad de inhibir el crecimiento del deterioro de los alimentos y microorganismos patogenos, en el que la cepa bacteriana se selecciona del grupo que consiste en: la cepa de Lactobacillus Biut2 (LMG P-24094), la cepa de Lactobacillus Hma2 (LMG P-24093), la cepa de Lactobacillus Hma8 (LMG P-24092), la cepa de Lactobacillus Bma5 (LMG P-24090), la cepa de Lactobacillus Hon2 (LMG P-24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 3 de abril de 2007; la cepa de Bifidobacterium Bin7 (LMG P-23986), la cepa de Bifidobacterium Hma3 (LMG P-23983), la cepa de Bifidobacterium Bin2 (LMG P-23984), la cepa de Bifidobacterium Bma6 (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007; y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica.
Otro aspecto de la invencion se refiere a una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, aislada de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja, en el que la cepa bacteriana se selecciona del grupo que consiste en: la cepa de Lactobacillus Biut2 (LMG P-24094), la cepa de Lactobacillus Hma2 (LMG P-24093), la cepa de Lactobacillus Hma8 (LMG P24092), la cepa de Lactobacillus Bma5 (LMG P-24090), la cepa de Lactobacillus Hon2 (LMG P-24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 3 de abril de 2007, la cepa de Bifidobacterium Bin7 (LMG P-23986), la cepa de Bifidobacterium Hma3 (LMG P-23983), la cepa de Bifidobacterium Bin2 (LMG P-23984), la cepa de Bifidobacterium Bma6 (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007; y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica.
Un segundo aspecto de la invencion se refiere a una composicion que comprende una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, siendo dicha cepa seleccionada del grupo descrito anteriormente, aislada de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja, en el que dicha composicion puede ser una composicion farmaceutica.
Un tercer aspecto se refiere a un producto medico que comprende una composicion farmaceutica como se describe anteriormente.
Un cuarto aspecto de la invencion se refiere a un producto alimentario o un pienso que comprende una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, siendo dicha cepa seleccionada del grupo descrito anteriormente, aislada de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja.
Un quinto aspecto de la invencion se refiere a la cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, siendo dicha cepa seleccionada del grupo descrito anteriormente, aislada de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja para su uso en la preparacion de un producto medico, un producto alimentario, una bebida o una composicion farmaceutica para prevenir y/o tratar
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infecciones o enfermedades gastrointestinales.
Un sexto aspecto de la invencion se refiere a una cepa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en la cepa de Lactobacillus Biut2 (LMG P-24094), la cepa de Lactobacillus Hma2 (LMG P-24093), la cepa de Lactobacillus Hma8 (LMG P-24092), la cepa de Lactobacillus Bma5 (LMG P-24090), la cepa de Lactobacillus Hon2 (LMG P24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 3 de abril de 2007; la cepa de Bifidobacterium Bin7 (LMG P-23986), la cepa de Bifidobacterium Hma3 (LMG P-23983), la cepa de Bifidobacterium Bin2 (LMG P-23984), la cepa de Bifidobacterium Bma6 (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007; y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica.
Un septimo aspecto se refiere a un metodo de produccion de miel que comprende anadir al menos una cepa bacteriana del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, siendo dicha cepa seleccionada del grupo descrito anteriormente, aislada de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja, a una fuente de azucar.
Un octavo aspecto de la invencion se refiere a un metodo de aislamiento de una cepa bacteriana de acuerdo con la invencion que comprende: a) la separacion del tracto productor de miel de una abeja, siendo el tracto productor de miel separado pasado el esofago y antes del proventriculo para evitar la contamination procedente de las tripas o del intestino; y sacudir el tracto en un medio esteril; b) el cultivo bacteriano de la muestra de a) en un medio adecuado; c) el cultivo puro y el aislamiento de la/s cepa/s bacteriana/s obtenida/s en b) en un medio adecuado y la evaluation de la capacidad de la/s cepa/s para inhibir el deterioro de los alimentos y los microorganismos patogenos. Otras ventajas y objetivos de la presente invencion se describiran con mas detalle, entre otros, con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 ilustra un arbol filogenetico que incluye las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion.
La Fig. 2 ilustra los patrones de rApD de la cepa tipo de Lactobacillus kunkeei (muestra 1) y Fhon 2 de Lactobacillus kunkeei (muestra 2).
La Fig. 3 ilustra la resistencia al azucar de diferentes cepas en una solution de azucar al 65 % que contiene sacarosa al 65 % y agua al 35 %.
La Fig. 4 ilustra la resistencia al azucar de diferentes cepas en una solucion de azucar al 70 % que contiene fructosa al 19 %, glucosa al 19 %, sacarosa al 37 % y agua al 25 %.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
En el contexto de la presente solicitud y de la invencion, se aplican las siguientes definiciones: El termino "miel" significa el liquido dulce y viscoso producido en el tracto productor de miel de diversas abejas a partir del nectar de las flores.
El termino "bacteriocina" se refiere a una sustancia antibacteriana producida por una bacteria. Las bacteriocinas son proteinas o complejos proteicos biologicamente activos (agregados proteicos, proteinas lipocarbohidratadas, glicoproteinas, etc.) que muestran un modo de action bactericida hacia microorganismos estrechamente relacionados. Varias bacteriocinas producidas por bacterias del acido lactico son activas contra el deterioro de los alimentos y los microorganismos patogenos transmitidos por los alimentos.
La expresion "fuente de azucar" significa, en general, un disacarido soluble dulce o pequeno hidrato de carbono oligosacarido. Son ejemplos de fuentes de azucar la miel, el azucar, la glucosa, la fructosa, la sacarosa y la maltosa.
El termino "UFC" significa unidad formadora de colonias.
La expresion "bacterias del acido lactico, BAL" se refiere a bacterias productoras de acido lactico, tales como las bacterias pertenecientes a los generos Lactobacillus, Lactococcus y Bifidobacterium.
La expresion "microorganismo probiotico" se refiere a un microorganismo que forma al menos una parte de la flora transitoria o endogena y, por lo tanto, presenta un efecto profilactico y/o terapeutico beneficioso sobre el organismo hospedador.
La expresion "marcador molecular" pretende significar un tramo de una secuencia de nucleotidos que se puede usar para identificar una cepa bacteriana o cepas bacterianas relacionadas. El marcador molecular puede usarse en ensayos de hibridacion, asi como en ensayos de amplification tales como en la PCR.
El termino "excipiente" significa cualquier ingrediente no activo anadido a un producto o a una composition.
En la presente memoria descriptiva, a menos que se especifique lo contrario, "un" o "una" significa "uno/a o mas".
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Cepas bacterianas especificas de la abeja melifera
La invencion se refiere a una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, aislada del tracto productor de miel de al menos una abeja o de la miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso, siendo la cepa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en: la cepa de Lactobacillus Biut2 (LMG P24094), la cepa de Lactobacillus Hma2 (LMG P-24093), la cepa de Lactobacillus Hma8 (LMG P-24092), la cepa de Lactobacillus Bma5 (LMG P-24090), la cepa de Lactobacillus Hon2 (LMG P-24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCm/LMG de Belgica el 3 de abril de 2007; la cepa de Bifidobacterium Bin7 (LMG P-23986), la cepa de Bifidobacterium Hma3 (LMG P-23983), la cepa de Bifidobacterium Bin2 (LMG P23984), la cepa de Bifidobacterium Bma6 (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007; y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica. Una cepa bacteriana aislada implica al menos una cepa y, por lo tanto, puede implicar una o mas cepas bacterianas. El tracto productor de miel de una abeja se puede definir ademas como aquel compuesto del tronco, de la boca, del esofago y del saco de miel, excluyendo asi las tripas y el intestino. La abeja es preferentemente una abeja melifera de la especie Apis, preferentemente Apis mellifera. La expresion "miel fresca" se puede definir como miel de la que no han pasado mas de tres dias de la recoleccion del nectar por parte de una abeja melifera a la colmena. Ademas, la "miel fresca" puede tener preferentemente un contenido de agua superior al aproximadamente 20 % en peso y puede residir en celdas aun no selladas con cera. El contenido de agua del nectar, la materia prima para la production de miel natural, recogido por las abejas puede ser de hasta el 93 % en peso. Normalmente, el contenido de agua del nectar puede ser del aproximadamente 30-50 % en peso. Por el contrario, la miel madura tiene un contenido de agua inferior al aproximadamente 18 % en peso.
La cepa tiene preferentemente la capacidad de ser viable durante al menos 8 dias en una solution de azucar al 65 % en peso, preferentemente durante 8 dias en una solucion de azucar al 70 % en peso, lo que es de gran importancia en muchas aplicaciones industriales. La cepa bacteriana de acuerdo con la invencion puede tener la capacidad de inhibir el crecimiento del deterioro de los alimentos y de microorganismos patogenos, tales como especies de Staphylococcus, especies de Listeria, especies de Clostridium, especies de Pseudomonas, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y larvas de Paenibacillus.
Una cepa bacteriana de acuerdo con la invencion se selecciona del grupo que consiste en la cepa de Lactobacillus Biut2 (LMG P-24094), la cepa de Lactobacillus Hma2 (LMG P-24093), la cepa de Lactobacillus Hma8 (LMG P24092), la cepa de Lactobacillus Bma5 (LMG P-24090), la cepa de Lactobacillus Hon2 (LMG P-24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica (Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstraat 35, B-0999 Gent, BELGICA) el 3 de abril de 2007, la cepa de Bifidobacterium Bin7 (LMG P-23986), la cepa de Bifidobacterium Hma3 (LMG P-23983), la cepa de Bifidobacterium Bin2 (LMG P-23984), la cepa de Bifidobacterium Bma6 (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007; y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de bacterias BCCM/LMG antes de la presentation de la presente solicitud.
La composition de acuerdo con la invencion comprende una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, siendo dicha cepa seleccionada del grupo descrito anteriormente, aislada de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja. La composicion comprende al menos una cepa bacteriana o una mezcla de varias cepas bacterianas. La composicion puede comprender ademas una fuente de azucar, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en miel, azucar, fructosa, sacarosa, dextrina, maltosa o glucosa. La composicion puede ser un producto alimentario que pueda prevenir enfermedades gastrointestinales, tal como la miel producida sinteticamente usando la cepa de acuerdo con la invencion o un producto alimentario que comprenda la cepa tal como una bebida. El alimento o la bebida se puede usar como una composicion o un producto probiotico, prebiotico o simbiotico. La composicion puede ser ademas un pienso tal como un pienso para abejas.
La composicion puede ser una composicion farmaceutica que pueda prevenir y/o tratar infecciones o enfermedades gastrointestinales, que comprenda un vehiculo y/o diluyente farmaceuticamente aceptable. La composicion farmaceutica puede estar en forma de suspension, gel, crema, polvo o capsula.
Un producto farmaceutico de acuerdo con la invencion comprende una cepa bacteriana aislada del genero Lactobacillus o Bifidobacterium, siendo dicha cepa seleccionada del grupo descrito anteriormente, aislada de miel fresca que tiene un contenido de agua superior al 18 % en peso o del tracto productor de miel de al menos una abeja, que puede prevenir y/o tratar infecciones o enfermedades gastrointestinales, y puede estar en forma de apositos, vendajes o pulverizados.
El metodo de produccion de una composicion de acuerdo con la invencion comprende anadir al menos una cepa bacteriana de acuerdo con la invencion a una fuente de azucar. La fuente de azucar se puede seleccionar preferentemente del grupo que consiste en miel, azucar, fructosa, sacarosa, dextrina, maltosa o glucosa. Dicho metodo puede ser la produccion de miel sintetica, en el que se permita que dicha al menos una cepa fermente al menos parte de una fuente de azucar.
Estas composiciones y productos mencionados anteriormente pueden contener bacterias vivas, liofilizadas o muertas. Ademas, pueden contener metabolitos y/o bacteriocinas producidos por las bacterias. Un producto que contiene cepas bacterianas liofilizadas se puede activar mediante la adicion de agua.
El metodo para el aislamiento de una cepa bacteriana de acuerdo con la invencion comprende: a) separation del tracto productor de miel de una abeja y sacudir el tracto en un medio esteril; b) cultivo bacteriano de la muestra de a)
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en un medio adecuado; c) cultivo puro y aislamiento de la/s cepa/s bacteriana/s obtenida/s en b) en un medio adecuado. El tracto productor de miel se separa pasado el esofago y antes del proventriculo para evitar la contaminacion procedente de las tripas o del intestino. El metodo comprende ademas: d) la evaluacion de la capacidad de la/s cepa/s para inhibir el deterioro de los alimentos y los microorganismos patogenos. Los medios para el cultivo se pueden seleccionar entre agar a base de miel, agar a base de caldo de soja triptica (TSB) (tal como el de Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Inglaterra), agar de zumo de tomate (TJ) (tal como el de Oxoid), medio de multiples usos con Tween® (APT) (tal como de Merck, Darmstadt, Alemania) y agar Rogosa (tal como de Merck). Las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion se desvelan en la Tabla 1. Las cepas bacterianas son cepas productoras de acido lactico, negativas en catalasa, gram positivas, no esporuladas y que cumplen con la designacion taxonomica de Lactobacillus sp. y Bifidobacterium sp. Tambien son de rapido crecimiento y tienen potentes propiedades inhibidoras de patogenos. Ademas, las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion no son perjudiciales para los seres humanos.
Tabla 1: Cepas bacterianas aisladas
Bacterias
Cepa Numero de acceso de BCCM/LMG
Lactobacillus kunkeei
Fhon2 LMG P-23987
Lactobacillus sp.
Hon2 LMG P-24091
Lactobacillus sp.
Biut2 LMG P-24094
Lactobacillus sp.
Hma2 LMG P-24093
Lactobacillus sp.
Hma8 LMG P-24092
Lactobacillus sp.
Bma5 LMG P-24090
Lactobacillus sp.
Hma11 LMG P-24612
Bifidobacterium sp.
Bin7 LMG P-23986
Bifidobacterium sp.
Hma3 LMG P-23983
Bifidobacterium sp.
Bin2 LMG P-23984
Bifidobacterium sp.
Bma6 LMG P-23985
Las cepas bacterianas que figuran en la Tabla 1 se depositaron en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica de conformidad con los depositos internacionales en virtud del Tratado de Budapest. Un analisis filogenetico en el que se compararon las secuencias de ARNr 16S de las cepas con otras cepas bacterianas de acido lactico confirmo que las cepas aisladas pertenecian al genero Lactobacillus y Bifidobacterium. Como se especifica ademas en los ejemplos, se determinaron las secuencias casi completas del gen de ARNr 16S y se usaron las secuencias para buscar similitudes en la secuencia de ARNr 16S en el proyecto de la base de datos ribosomal (RDP) (Cole, J. R., et al., 2005. Nucleic Acids Res 1, 33). Esta base de datos se usa para la identificacion de bacterias por sus genes de ARNr 16S. La comparacion de las secuencias de ARNr 16S, que estan altamente conservadas entre todos los organismos, puede usarse para evaluar la relacion filogenetica entre organismos.
La Figura 1 desvela un arbol filogenetico basado en el analisis de la matriz de distancia de aproximadamente 1.400 posiciones en los genes de ARNr 16S. El arbol se construyo usando el metodo de union de vecinos, y las distancias evolutivas se estimaron usando el metodo Log Det/Paralinear en PAUP. Abreviaturas: (B.) Bifidobacterium, (L.) Lactobacillus, (P.) Pediococcus, (Paral.) Paralactobacillus. Numeros de cepas tipo: L. buchneri JCM1115, L. helveticus DSM 20075, L. crispatus ATCC 33820, L. gasseri ATCC 33323, L. versmoldensis KU-3, L. kalixensis DSM 16043, Paral. selangorensis LMG 17710, P. parvulus JCM 5889, P. inopinatus DSM 20285, L. kitasatonis JCM 1039, L. hamsteri DSM 5661, L. amylolyticus DSM 1664, L. kunkeei YH-15, B. thermacidophilum subesp. porcinum P3-14, B. asteroides ATCC 25910, B. coryneforme ATCC 25911, L. acidophilus DSM 20079, L. rhamnosus JCM 1136, L. plantarum JCM 1149, L. casei JCM 1134, L. fermentum ATCC 14931, L. reuteri DSM 20016, B. animalis subesp. lactis DSM 10140, B. breve ATCC 15700, B. infantis ATCC 15697.
Las cepas de lactobacilos Biut2, Hma2, Hma8 y Bma5 son nuevas especies pertenecientes al genero Lactobacillus como se representa por el arbol filogenetico. Estas cepas bacterianas constituyen un grupo sin otros parientes cercanos dentro de Lactobacillus. El grupo se encuentra dentro del grupo filogenetico L. delbrueckii. Hon2 de Lactobacillus constituye un segundo grupo con una nueva especie dentro del genero Lactobacillus. Sin embargo, este grupo se encuentra entre el grupo filogenetico de Lactobacillus casei-Pediococcus y el grupo filogenetico de L. delbrueckii. La secuencia del gen de ARNr 16S de Fhon2 de Lactobacillus kunkeei es identica a una cepa del tipo Lactobacillus kunkeei descrita anteriormente, y se encuentra dentro del grupo filogenetico de Lactobacillus casei- Pediococcus. Sin embargo, cuando se compara el ADN completo de los microorganismos, vease la Figura 2, es evidente que estos dos organismos no se corresponden entre si. Las bifidobacterias Bin2, Hma3 y Bin7 estan relacionadas con Bifidobacterium asteroides, y podrian asignarse como cepas dentro de esta especie o como nuevas especies dentro del genero Bifidobacterium. La bifidobacteria Bma6 esta estrechamente relacionada con Bifidobacterium coryneforme.
Hma11 tambien es una nueva especie perteneciente al genero Lactobacillus.
Las cepas bacterianas de la Tabla 1 se han identificado como especificas de la abeja melifera, y se encuentran en el tracto productor de miel de la abeja melifera o en la miel fresca. Las cepas se transfieren a la miel desde el tracto
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productor de miel de la abeja durante la produccion de miel. Tambien se han encontrado en la miel fresca la cepa Bin2 de Bifidobacterium, la cepa Hon2 de Lactobacillus y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei. Cuando el contenido de agua de la miel disminuye por debajo del aproximadamente 18 %, no sobreviviran bacterias no esporuladas, y por lo tanto, el aislamiento de bacterias sera imposible. La miel despues de 3-7 dias contiene bacterias muertas, y componentes bacterianos tales como bacteriocinas y metabolitos.
Las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion tienen un intervalo de temperaturas relativamente bajas para su crecimiento optimo, entre aproximadamente 20 y 35 °C, tal como entre aproximadamente 21 y 32 °C, que es la temperatura del saco miel cuando las abejas meliferas reunen el nectar. Ademas, a diferencia de muchas otras bacterias de acido lactico, las cepas bacterianas crecen rapidamente. Tambien son tolerantes a ambientes acidos tales como a pH 2-5, que es el pH de la miel natural.
La cepa Fhon2 de Lactobacilli kunkeei aislada es un anaerobio facultativo, debilmente positivo en catalasa, produce gas a partir de glucosa, utiliza citrato o malato en presencia de glucosa, y produce manitol a partir de fructosa. Ademas, la mayoria de las veces no produce amoniaco a partir de la arginina ni reduce el nitrato. Por otra parte, fermenta fructosa, glucosa, sacarosa y rafinosa.
Las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion son capaces de crecer en medios tales como el agar de zumo de tomate con la posible adicion de uno o mas de agar APT, agar Rogosa y agar de soja triptico (TSB), veanse los ejemplos. La aplicacion de estos tipos de medios es de vital importancia para el crecimiento de las cepas bacterianas. El crecimiento de las cepas bacterianas tambien se puede lograr en placas de agar a base de miel.
Las cepas bacterianas enumeradas en la Tabla 1 son productoras de diacetilo, peroxido de hidrogeno y acidos organicos tales como acido lactico y acido acetico. Se ha demostrado que todas estas moleculas estan presentes en la miel y, por lo tanto, se pueden atribuir a las propiedades antibacterianas, al sabor y a la calidad de la miel. Estos inhibidores, junto con las bacteriocinas y otras sustancias antibacterianas producidas por las cepas bacterianas, sugieren la produccion de antagonistas proteicos de amplio espectro contra otras especies de bacterias y levaduras. Las cepas bacterianas son inhibidores muy potentes de levaduras pertenecientes al genero Saccharomyces que se encuentran comunmente en la miel. Debido a la sensibilidad extrema de las mieles a la levadura, cabe esperar que fermenten incluso con solo 1 espora por gramo de miel si su contenido de agua es superior al 18 %. La conservacion de la miel por las cepas bacterianas descritas es, por tanto, crucial para el almacenamiento a largo plazo de la miel. Las capacidades de conservacion de las cepas bacterianas enumeradas en la Tabla 1 las hace utiles en muchas aplicaciones de conservacion, no solo para la conservacion de la miel, sino tambien para la conservacion de alimentos y bebidas en general. La inhibition bacteriana es eficaz contra muchas bacterias tal como contra el deterioro de alimentos y microorganismos patogenos transmitidos por los alimentos, incluyendo Clostridium tyrobutyricum, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomonas fluorescens, Lactobacillus sakei, Bacillus cereus, Listeria inocua, Enterococcus faecalis, Saccharomyces cerevisiae, Paenibacillus larvae.
La invencion tambien se refiere a cultivos puros aislados de las cepas bacterianas que se presentan en la Tabla 1. Dichos cultivos puros se pueden proporcionar en forma de colonias en placas de agar, en forma de suspension liquida de celulas o en forma de un preparado congelado, secado por pulverization o liofilizado. Los cultivos se pueden usar solos o en combination en cualquier aplicacion, tal como en un producto alimentario o una bebida, un pienso o un producto medicinal. Ademas, el cultivo puede contener y puede usarse para producir metabolitos, compuestos antibacterianos y/o bacteriocinas, que se pueden usar en varios productos o composiciones, tales como los ilustrados anteriormente.
Ademas, los productos o las composiciones de acuerdo con la invencion pueden comprender dos o mas cepas de bacterias diferentes enumeradas en la Tabla 1. Mediante la combinacion de al menos dos o mas de las cepas, los efectos de las bacterias se pueden utilizar de una manera sinergica, por lo que se combatiran mas especies de patogenos. Ademas, se mejorara la eficacia de los productos, ya que se produciran muchas bacteriocinas diferentes. Por consiguiente, se obtendra una mezcla mas natural de cepas bacterianas como la mezcla natural del estomago de miel y de la miel fresca.
El producto puede contener una fuente de azucar, en el que la fuente de azucar se selecciona del grupo que comprende miel, azucar, fructosa, sacarosa, dextrina, maltosa o glucosa. Al producir un producto que contiene las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion en combinacion con la miel, las cepas bacterianas realizaran sus funciones de forma sinergica con la miel. Por lo tanto, se puede desear combinar los efectos de la miel con cepas bacterianas anadidas de acuerdo con la invencion.
Producto alimentario o bebida
Un producto o una composition de la invencion comprenden al menos una cepa de acuerdo con la invencion, y se puede preparar en forma de un producto alimentario o una bebida mediante el uso de los componentes o nutrientes alimentarios o de la bebida adecuados. El alimento o la bebida se puede usar como una composicion o un producto probiotico, prebiotico o simbiotico.
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Mediante la adicion de una o mas de las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion se obtienen productos nuevos y mejorados. Estos productos pueden contener bacterias vivas, liofilizadas o muertas. Ademas, el producto puede contener metabolitos y/o bacteriocinas producidas por las bacterias. Un producto que contiene cepas bacterianas liofilizadas se puede activar mediante la adicion de agua.
Mediante el uso de las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion, se puede producir un producto altamente natural. Combinando al menos dos o mas de las cepas bacterianas de la invencion, los efectos de las bacterias pueden usarse de forma sinergica. De este modo, se puede obtener una mezcla mas natural de cepas bacterianas como las de la miel. El uso de una mezcla de cepas bacterianas tambien aumenta la posibilidad de desactivar diversos patogenos no deseados.
Un producto puede comprender una fuente de azucar seleccionada del grupo que comprende miel o, por ejemplo, azucar, fructosa, sacarosa, maltosa y glucosa. Al producir un producto o una composition que contiene al menos una cepa bacteriana de acuerdo con la invencion en combination con una fuente de azucar tal como la miel, las cepas bacterianas realizaran sus funciones de forma sinergica con la fuente de azucar. Es deseable combinar los efectos de la miel con las cepas bacterianas anadidas de acuerdo con la invencion. De acuerdo con una realization, se pueden preparar bebidas que contengan miel y bacterias tales como una bebida de agua con miel. La bebida de agua con miel se puede preparar mezclando agua, miel, cepas bacterianas de acuerdo con la invencion y un zumo de fruta tal como zumo de limon, zumo de lima, zumo de naranja o zumo de manzana. La concentration de cepas bacterianas en la bebida puede ser de aproximadamente 101 a 1014 UFC/g de producto, tal como de 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 o 1013 UFC/g producto. Esta concentracion de cepas bacterianas tambien se puede usar en una bebida sin miel anadida. Se puede usar una concentracion de aproximadamente 105 UFC/g de producto en un producto que imite la concentracion natural de cepas bacterianas de la miel fresca. La bebida de agua con miel tambien puede prepararse en forma de un concentrado, con menos o sin contenido de agua, y con cepas bacterianas liofilizadas y zumo como se ha mencionado anteriormente.
Un producto alimentario con miel se puede usar ademas como un ingrediente para la production de otros productos alimentarios.
Es un objetivo de la invencion hacer uso de alimentos o bebidas que contengan cepas bacterianas mas facilmente accesibles, frecuentes y habituales para cualquier consumidor con el fin de aumentar, complementar y equilibrar la flora intestinal, lo que dara lugar a ventajas en terminos salud y actividad deportiva diaria.
De acuerdo con otra realizacion, se proporcionan alimentos o bebidas funcionales que contienen mezclas de cepas bacterianas que son capaces de llegar al intestino de una forma viva o viable, y tambien sus bacteriocinas y/o metabolitos, estableciendose en la flora bacteriana, influyendo o creciendo, realizando asi importantes acciones beneficiosas para la salud humana. Las cepas bacterianas que llegan al intestino tambien pueden estar en estado no vivo, y luego realizar una action beneficiosa a traves de sus bacteriocinas y/o metabolitos producidos. El alimento o la bebida pueden usarse para la prevention y/o el tratamiento de enfermedades gastrointestinales.
Los ejemplos de bebidas son productos lacteos, zumos, vino, vinagre, Glogg sueca, cerveza, refrescos, limonada y productos de sidra. Una bebida que comprende una o mas cepas bacterianas de acuerdo con la invencion y la adicion de miel puede estar en forma de agua con miel contra el resfriado o el dolor de garganta, como recuperation para atletas, para personas con estres o para la recuperacion de pacientes inmunosupresores hospitalizados. Una bebida puede caracterizarse por su constitution especial con minerales y otras sustancias que aportan el efecto natural deseado como en la miel fresca.
La bebida o el alimento con las cepas bacterianas anadidas de acuerdo con la invencion se beneficiaran del efecto de conservation de las cepas bacterianas. La fermentation de la levadura se inhibira potentemente. Ademas, las cepas bacterianas se pueden usar en la produccion de vino para finalizar la fermentacion de la levadura. Las bacterias se mantendran como bacterias beneficiosas para la salud de origen natural en el producto.
El alimento o la bebida tambien puede contener aditivos tales como, a modo de ejemplo, vitaminas, minerales, antioxidantes, fenoles, fibras, oligosacaridos, fructooligosacaridos o inulina.
Los ejemplos de productos alimentarios son productos carnicos, productos lacteos, productos de frutas, productos de pescado, productos de panaderia o productos vegetales. Un producto alimentario puede contener una fuente de azucar tal como la miel. El producto alimentario puede ser miel fresca o miel madura con bacterias anadidas de acuerdo con la invencion. El producto alimentario de miel puede prepararse mediante la adicion de las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion o una mezcla de cepas bacterianas de acuerdo con la invencion a la miel u otros productos. La concentracion de cepas bacterianas se puede seleccionar de manera adecuada para lograr una concentracion de aproximadamente 101 a 1014 UFC/g de producto tal como de 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,
109, 1010, 1011, 1012 o 1013 UFC/g de producto.
Las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion tambien se pueden usar como cultivos iniciadores para la fermentacion de alimentos y bebidas. Los ejemplos de alimentos y bebidas son pan, suero de leche, cacao, vainilla,
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cafe, queso, queso verde, pepinos, aditivos para piensos, productos de pescado fermentado, leches fermentadas, aceite de oliva, chucrut, salchichas, yogurt , vino, cerveza, sidra y miel.
Producto medicinal
Una cepa bacteriana de acuerdo con la invencion es valiosa para prevenir o tratar infecciones, ya que inhibe el crecimiento de microorganismos patogenos. Las cepas y los productos que las contienen pueden transferirse a la piel humana o animal en formas tales como pomadas, cremas, pulverizados, geles y soluciones liquidas. Las cepas bacterianas tambien se pueden incluir en productos tales como apositos, parches dermicos, geles o vendajes que contengan cantidades eficaces de cepas bacterianas en diversas partes de los productos con el fin de lograr el resultado deseado de prevenir o inhibir las infecciones. Los productos se pueden usar para el tratamiento de heridas, llagas, quemaduras, cicatrices, ulceras por decubito, lesiones diabeticas, acne, eccema, dermatitis, cancer, catarro, erupcion cutanea, infecciones por hongos, sindrome de choque toxico, infecciones fungicas, infecciones viricas y ulceras.
El producto se puede usar en el tratamiento de infecciones bacterianas, viricas, por levaduras o por hongos. Las infecciones viricas de interes pueden ser infecciones por el virus del herpes, incluyendo el herpes labial. Las infecciones bacterianas que se deben combatir mediante las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion pueden ser infecciones por especies seleccionadas del grupo que comprende especies de Staphylococcus, especies de Clostridium, especies de Bacillus, especies de Enterococcus, especies de Pseudomonas, especies de Listeria y Escherichia coli.
Los productos medicinales pueden incluir las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion en combinacion con una fuente de azucar tal como la miel o miel sintetica. El producto se beneficiara de los efectos conocidos de la miel en combinacion con los efectos de las cepas bacterianas. El producto puede incluir porcentajes variables en peso de miel cremosa o cristalizada, miel secada por pulverizacion, liofilizada, secada al aire y/o liquida. La miel puede ser fresca o madura.
El producto medicinal puede incluir los metabolitos y/o bacteriocinas producidos por las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion. Este producto tambien puede esterilizarse de manera conocida para lograr un producto esteril sin ninguna bacteria viable. El producto se beneficiara de las bacteriocinas y/o los metabolitos previamente producidos por las cepas bacterianas.
Los principios activos, es decir, las cepas bacterianas vivas o muertos, y las bacteriocinas y/o los metabolitos pueden comprender del aproximadamente 0,1 % al aproximadamente 100 %, tal como del 1 % al 70 %, tal como del 5 % al 50 % en peso del producto final. Un producto tipico contendra en una formulacion farmaceutica de un gramo una concentracion de 101 a 1014 UFC, tal como de 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 o 1013
UFC de bacterias viables o muertas.
El producto medicinal puede incluir al menos una o mas de las cepas bacterianas de la invencion o bacteriocinas producidas a partir de una o mas de las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion. Una mezcla de cepas bacterianas o bacteriocinas de diferentes cepas bacterianas puede ser beneficiosa con respecto a la eficacia de la inhibition del patogeno.
El producto medicinal tambien puede incluir las cepas bacterianas en un chicle. Este producto puede usarse en el tratamiento de, por ejemplo, la gingivitis y la placa. Los ingredientes de un producto de chicle pueden ser uno o mas de miel, cera de abeja, goma y otros ingredientes conocidos en la tecnica.
Los ingredientes opcionales del producto medicinal incluyen productos farmaceuticos tales como antibioticos, fungicidas y otros agentes antibacterianos, vitaminas, agentes de tamponamiento, agentes colorantes, minerales, aromas, fragancias, agentes gelificantes u otros compuestos quimicos tales como antioxidantes o calcio.
El producto medicinal puede incluir un material base en forma de pelicula, aposito tejido, aposito laminar estratificado, parche, tira, configuration cuerda o envoltorio. Las opciones para el material base incluyen pelicula de gel de agar, aposito de alginato, hidrocoloide, aposito de espuma, etcetera. Ademas, el producto puede comprender las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion junto con vehiculos, excipientes y/o diluyentes farmaceutica o fisiologicamente aceptables. Los vehiculos para formulaciones secas pueden ser trehalosa, maltodextrina, harina de arroz, celulosa microcristalina, estearato de magnesio, inositol y otros. Los vehiculos liquidos o a base de gel pueden ser agua, soluciones salinas, alcoholes y similares. Despues, se puede formar un producto medicinal aplicando las cepas bacterianas a un absorbente o similar.
El producto medicinal puede estar en forma de producto farmaceutico usando vehiculos farmaceuticamente aceptables junto con las bacterias de acuerdo con la invencion. Los ejemplos de vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen diversos diluyentes y excipientes tales como cargas, extendedores, aglutinantes, humectantes, disgregantes, tensioactivos, lubricantes y otros vehiculos conocidos en la tecnica. La dosis puede estar en forma de una pildora, un comprimido, un polvo, una solution, una suspension, una emulsion o granulos. Los comprimidos
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pueden estar recubiertos con un material de recubrimiento convencional. La cantidad de cepas bacterianas del producto farmaceutico puede seleccionarse de aproximadamente 105 a 1014 UFC/dosis del producto, tal como 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 o 1013 UFC. El producto medicinal puede usarse para la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades gastrointestinales.
Pienso
Las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion pueden ser valiosas en los piensos para las abejas y las larvas de abeja. Estos productos pueden estar en forma de un pienso probiotico usado para fortalecer o restablecer la flora microbiana de las abejas o larvas de abejas. Las cepas bacterianas usadas son cepas bacterianas naturales del tracto productor de miel de una abeja. Por lo tanto, las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion no desactivaran ninguna cepa bacteriana de origen natural dentro del nicho del tracto productor de miel. El uso de otras cepas bacterianas beneficiosas que no se originan en el tracto productor de miel, en productos similares, podria alterar la flora bacteriana natural de la abeja melifera de manera negativa.
Por lo tanto este tipo de pienso de acuerdo con la invencion sera particularmente interesante.
El pienso puede incluir una o varias de las cepas bacterianas enumeradas en la Tabla 1. Una mezcla de cepas bacterianas puede ser beneficiosa en cuanto a la eficiencia del tratamiento.
La concentracion de cepas bacterianas se puede seleccionar adecuadamente a fin de lograr una concentracion de aproximadamente 101 a 1014 UFC/g de producto tal como 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012 o
1013 UFC/g de producto.
El pienso puede usarse para la proteccion de la abeja melifera o larvas de abeja melifera de las bacterias patogenas, virus, hongos o acaros. Los organismos que conducen comunmente a infecciones letales y que deben ser combatidos por el producto son larvas de Paenibacillus, Melissococcus plutonius, Ascosphaera apis, Varroa destructor, virus de ala deformada o Nosema apis.
La cepa bacteriana o la mezcla de cepas bacterianas se puede administrar a la abejas meliferas o larvas de abejas meliferas en forma de un polvo, una solucion o un solido. Un polvo puede estar en forma liofilizada, secada por pulverizacion o secada al aire. Un polvo es sencillo de manejar, transportar, almacenar y tiene una fecha de caducidad mas expandida. El polvo o la solucion se pueden rociar o pulverizar sobre las abejas o larvas. La administracion eficaz tambien se puede lograr pulverizando o rociando un polvo o una solucion directamente sobre el nido de abejas.
El pienso tambien puede contener una fuente de azucar. La fuente de azucar puede ser miel, azucar, sacarosa, glucosa, fructosa, dextrina, maltosa u otras formas de azucar. La fuente de azucar puede ser usada por las abejas meliferas o las larvas de abejas meliferas como fuente de energia. Al usar miel en la solucion de azucar se obtienen varias ventajas. En primer lugar, las abejas estan mas ansiosas por usar una solucion que contenga miel que una solucion que contenga sacarosa pura. En segundo lugar, la miel contiene componentes beneficiosos adicionales tales como minerales, vitaminas y proteinas.
Cuando se usan las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion, un pienso para abejas meliferas que las contienen se beneficiara de las propiedades de inhibicion de bacterias y levadura de las bacteriocinas y los metabolitos. Por consiguiente, la solucion de azucar no fermentara, como suele ser el caso de las soluciones de azucar.
El pienso tambien puede contener polen, soja, pan de abejas o pan de abejas sintetico, importantes fuentes de alimentacion para las abejas meliferas y larvas de abeja melifera durante el otono, invierno y primavera. El pienso tambien puede contener otros aditivos tales como vitaminas, minerales, grasas, hidratos de carbono y proteinas.
La administracion de las cepas bacterianas es particularmente importante en el otono o el invierno, cuando las colonias de abejas meliferas estan debiles y descansando. Las cepas bacterianas tambien funcionaran como conservantes de la miel o del azucar presente en la colonia. En el periodo del otono, invierno y principios de la primavera, cuando no hay nectar disponible, las abejas y las larvas de abejas son particularmente vulnerables a las infecciones bacterianas, viricas, fungicas y parasitarias. Mediante la administracion de las cepas bacterianas de acuerdo con la invencion a las abejas meliferas y larvas de abejas meliferas, las bacterias creceran hasta un estado viable cuando lleguen al tracto productor de miel de la abeja melifera, que es su entorno natural original. De este modo, las abejas y las larvas habran adquirido una proteccion mas eficaz contra los patogenos de las abejas meliferas y las larvas.
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no pretenden limitar de ninguna manera ni forma la invencion, ya sea explicita o implicitamente.
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Ejemplos
EJEMPLO 1 - Cosecha de colmenas de abejas
Se traslado una pequena colmena de abejas con aproximadamente 12.000 abejas a un campo de flores silvestres de frambuesa situado en la reserva natural Kullaberg que se encuentra en el noroeste de Skane, en el sur de Suecia. No florecieron otras flores en el area inmediata durante ese tiempo, y la colmena de abejas se vacio de su miel al iniciarse el experimento. En la segunda semana, se realizaron muestreos en flores frescas de frambuesa de alrededor de la colmena, en abejas obreras salientes y entrantes, y en la miel fresca de flores de frambuesa de la colmena. Ademas de esas muestras, la miel de frambuesa cosechada se guardo y se analizo tras dos meses de almacenamiento. Las muestras se cultivaron en cuatro tipos diferentes de medios de incubacion para todos los fines bacterianos y para la seleccion de laboratorio. La identidad bacteriana se revelo mediante el analisis de los genes de ARNr 16S usando tanto las tecnicas de clonacion como los cultivos puros.
EJEMPLO 2 - Aislamiento de bacterias de la abeja melifera
Se recogieron 20 flores de frambuesa, 10 abejas obreras entrantes y 10 abejas obreras salientes, y 10 abejas nodrizas, y se clasificaron en diferentes tubos esteriles de 10 ml que contenian 5 ml de solucion salina fisiologica esteril (NaCl al 0,9 % p/v, Tween 80 al 0,1 % p/v y peptona al 0,1 % p/v). Ademas, se recogieron 0,5 ml de miel fresca, cinco larvas de abeja melifera (2-5 dias de vida), cinco cabezas de abeja melifera, cinco estomagos de abeja melifera y el intestino posterior de una abeja melifera, por separado en un tubo esteril de 1,5 ml que contenia 0,9 ml de solucion salina fisiologica. Se realizo el analisis de la boca y del tronco de la abeja separando la cabeza del cuerpo con un bisturi y pinzas esteriles. Se agitaron las cabezas en medio de dilucion esteril seguido de cultivo bacteriano. El analisis del estomago de la abeja melifera se llevo a cabo mediante la escision del estomago de abeja melifera lleno de nectar pasado el esofago y antes del proventriculo con un bisturi esteril y pinzas esteriles, garantizando que ninguna parte del intestino contaminara las muestras. Se agitaron los tubos y se transportaron de inmediato al laboratorio. Se congelaron tubos con 0,5 ml de suspension y se almacenaron a -20 °C para el analisis directo del gen de ARNr 16S.
Las cepas bacterianas que figuran en la Tabla 1 se aislaron viables de las abejas meliferas sanas. Se descubrio que la flor productora de nectar que da lugar al mayor numero de bacterias de acuerdo con la invention es la flor de frambuesa. Las muestras intestinales de cepas bacterianas demostraron que no hay numeros de las cepas de acuerdo con la invencion.
EJEMPLO 3 - Cultivo de bacterias del estomago con miel
A partir de las muestras descritas en el Ejemplo 2 se realizo una serie de dilucion con solucion salina fisiologica esteril, y se extendio un volumen de 0,1 ml sobre diferentes medios de cultivo. Se obtuvieron cultivos en crecimiento y puros en diferentes medios (vease la Tabla 2) a partir de diferentes diluciones con agar de caldo de soja triptica (TSB) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Inglaterra), agar de zumo de tomate (TJ) (Oxoid), medio de multiples usos con Tween® (APT) (Merck, Darmstadt, Alemania) y agar Rogosa (Merck). Los medios se produjeron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La combination usada de medios de aislamiento demostro ser de vital importancia para el crecimiento de las bacterias. Todos los aislamientos crecieron muy bien en Rogosa a exception de Bma5, que tuvo un crecimiento restringido, y Fhon2, que apenas crecio en Rogosa. Por el contrario, Fhon2 (Lactobacillus kunkeei) crecio muy bien en agar de zumo de tomate junto con las cepas pertenecientes al genero Bifidobacterium (Bin2, Bin7, Bma6 y Hma3). (Biut2, Hon2, Hma2, Hma8, Hma11 y Bma5) tuvieron un crecimiento restringido en agar de zumo de tomate. Los aislados se cultivaron tanto aerobica como anaerobicamente durante 2-3 dias a 37 °C. Se seleccionaron aleatoriamente de diez a treinta colonias de todos los medios usados, que contenian de 30 a 300 colonias cada uno, y se volvieron a cultivar para obtener pureza (aislamientos).
Tabla 2: Cultivo de bacterias en medios especificos
Bacterias
Medios de cultivo
Cepa de Bifidobacterium Bin2
Tomate, APT, Rogosa, TSB
Cepa de Bifidobacterium Bin7
Tomate, APT, Rogosa, TSB
Cepa de Lactobacillus Biut2
Tomate, APT, Rogosa, TSB
Cepa de Bifidobacterium Hma3
Tomate, Rogosa
Cepa de Lactobacillus Hon2
Tomate, APT, Rogosa
Cepa de Lactobacillus Hma8
Tomate, Rogosa, APT
Cepa de Bifidobacterium Bma6
Tomate, TSB, Rogosa
Cepa de Lactobacillus Bma5
Tomate, Rogosa, APT
Cepa de Lactobacillus Hma2
Tomate, Rogosa, APT
Lactobacillus kunkeii Fhon2
Tomate, APT, TSB, Rogosa
Cepa de Lactobacillus Hma11
Tomate, Rogosa, APT
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EJEMPLO 4 - Clonacion y amplificacion por PCR
Se dispuso una colonia de los aislados purificados en tiras Thermo-Strips 0.2 (Abgene, Surrey, RU) junto con 0,1 ml de agua esteril y perlas de vidrio (0,106 mm, Sigma-Aldrich, St Louis, EE.UU.). Se desintegraron celulas agitando durante 45 min en un miniagitador MS1 (IKA Works, INC, Wilmington, EE.UU.). Tras la centrifugacion, 20.200 xg durante 5 minutos en una minicentrifugadora Galaxy (VWR, Pensilvania, EE.UU.), se uso 1 pl del sobrenadante en la siguiente reaccion de PCR.
La amplificacion se realizo con cebadores disenados para hibridarse con regiones conservadas de genes bacterianos de ARNr 16S. El cebador directo ENV1 (5'-AGA GTT TGA TII TGG CTC AG-3') correspondia a las posiciones 8-27 del ARNr 18S de Escherichia coli, y el cebador inverso ENV2 (5'-CGG ITA CCT TGT TAC GAC TT- 3') correspondia a las posiciones 1511-1492 (Brosius et al., 1978). La reaccion de PCR contenia 5 pl de 10 x tampon de PCR (Tris-HCI 100 mM, MgCh 15 mM, KCl 500 mM, pH 8,3), 200 pmol 1-1 de cada desoxirribonucleotido trifosfato, 2,5 U de ADN polimerasa de Taq (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 10 pmol de cada cebador y 1-10 pl de molde en un volumen total de 50 pl. La amplificacion se realizo con un Mastercycler (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) de la siguiente manera: 30 ciclos a 95 °C durante 15 s, a 48 °C durante 30 s y a 72 °C durante 90 s, seguidos de una etapa de elongacion a 72 °C durante 10 min. El producto de la PCR se almaceno a -20 °C para la secuenciacion.
De acuerdo con el procedimiento para el kit de ADN tisular EZ1 (Qiagen, Hilden, Alemania), se anadieron 190 pl de tampon G2 y 10 pl de proteinasa K a los microgranulos, y se mezclaron con un miniagitador MS1 durante 2 min. Las muestras se incubaron en un bano de agua a 56 °C (Julabo SW1, Alemania) hasta que se disolvieron los microgranulos. Cada 15 minutos, las muestras se mezclaron durante 1 minuto para acelerar el proceso. Se anadieron perlas de vidrio (0,106 mm) y se desintegraron las celulas agitando durante 45 minutos en un miniagitador MS1. Tras la centrifugacion a 20.200 xg durante 5 minutos en una minicentrifugadora Galaxy, Se trataron adicionalmente 0,1 ml del sobrenadante de acuerdo con el procedimiento para el kit de ADN tisular EZ1 en una version 1.3 de BioRobot EZI (Qiagen Instruments AG, Alemania), usando la tarjeta de tejido de Qiagen. Al final del proceso, el ADN se eluyo en 200 pl de agua esteril.
Se realizaron amplificaciones por PCR en cuatro duplicados para cada muestra para reducir al minimo los sesgos introducidos por la PCR. La amplificacion se llevo a cabo de la misma manera que para los aislados, pero con una temperatura de hibridacion de 50 °C. Se agruparon entre si los cuatro productos de PCR de cada preparacion de ADN y se comprobaron procesandolos en geles de agarosa al 1,5 % (p/v) (Tipo III, High EEO, Sigma, ST Louis, EE.UU.). Los geles se tineron con bromuro de etidio y se visualizaron con luz Uv.
Los productos de PCR agrupados se purificaron mediante el kit de purification de bandas de gel y ADN de PCR GFX™ (Amersham Biosciences, RU). Se ligaron los productos purificados en un vector de clonacion TOPO TA (Invitrogen, EE. UU.) y se transformaron en celulas competentes de E. coli pCR II-TOPO de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las colonias se detectaron de color azul/blanco en agar LB con Kanamicina (Sigma) y X-gal (Promega). Se escogieron veinticuatro colonias blancas al azar de cada muestra y se volvieron a cultivar.
Para recuperar el ADN clonado, se llevo a cabo la amplificacion con los cebadores universales M13 directo (5'-GTA AAA CGA CGG CCA G-3') y M13 inverso (5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3') disenados para hibridarse al principio y al final del vector. La reaccion de PCR contenia 5 pl de 10 x tampon PCR (Tris-HCl 100 mM, MgCl2 15 mM, KCI 500 mM, pH 8,3), 200 pmol 1-1 de cada desoxirribonucleotido trifosfato, 2,5 U de ADN polimerasa de Taq (Roche Diagnostics, Mannheim), Alemania), 10 pmol de cada cebador y 1-10 pl de molde en un volumen total de 50 pl. La amplificacion se realizo con un Mastercycler (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), usando una etapa de desnaturalizacion a 94 °C durante 10 minutos, seguida de 28 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, a 55 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 1 minuto, seguidos de una etapa de elongacion a 72 °C durante 10 min. El producto de la PCR se almaceno a -20 °C para la secuenciacion.
EJEMPLO 5 - Secuenciacion y analisis filogenetico de ARNr 16S
Los productos de la PCR procedentes de bacterias aisladas fueron secuenciados por una compania de secuenciacion (MWG Biotech AB, Ebersberg, Alemania) con cebadores universales ENV1 y ENV2. La busqueda de estas secuencias de ARNr 16S parciales se realizo frente al GenBank (Centro Nacional de Information Biotecnologica, Rockville Pike, Bethesda, MD) usando la option de busqueda de similitud Advanced BLAST (Altschul, S. F., et al. Nucleic Acids Res 25, 3389-3402), accesible desde la pagina de inicio del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). A modo comparativo, las secuencias tambien se buscaron en otro software, el Ribosomal Database Project II, accesible desde la pagina de inicio (http: // rdp.cme.msu.edu). Las secuencias parciales fueron de aproximadamente 1.400 pares de bases (intervalo de 50-1.500 pb).
El arbol filogenetico de la Figura 1 se obtuvo usando los siguientes programas informaticos de software: Clustal X (version 1.81) (Thompson, J. D., et al., 1997. Nucleic Acids Res 24, 4876-4882) para la alineacion, BioEdit (version 6.0.7) (Hall, T., BioEdit Sequence Alignment Editor, Isis Pharmaceuticals, Inc) para la edition, y PAUP (version 4.0 beta) (creado por D. Swofford) para el calculo del arbol filogenetico. El arbol se construyo usando el metodo de union
de vecinos (Saitou N. y Nei M. 1987. Mol Biol Evol 4, 406-425) en PAUP con el modelo LogDet/Paralinear de estimacion de distancia evolutiva.
EJEMPLO 6 - Patrones de fermentacion
5
Se uso el sistema API 50CHL (BioMerieux SA, Francia) para identificar provisionalmente las cepas bacterianas por sus patrones de fermentacion de hidratos de carbono, vease la Tabla 3. Se recogieron cultivos en agar de zumo de tomate y se suspendieron en el medio de suspension proporcionado con el kit. Se inocularon tiras API y se analizaron (despues de 48 y 82 h) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Claims (14)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una cepa bacteriana aislada del genera Lactobacillus o Bifidobacterium, aislada del tracto productor de miel de al menos una abeja, consistiendo el tracto productor de miel de una abeja en el tronco, la boca, el esofago y el saco de miel, y cepa que tiene la capacidad de inhibir el crecimiento del deterioro de los alimentos y de organismos patogenos, siendo la cepa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en:
    cepa Biut2 de Lactobacillus (LMG P-24094), cepa Hma2 de Lactobacillus (LMG P-24093), cepa Hma8 de Lactobacillus (LMG P-24092), cepa Bma5 de Lactobacillus (LMG P-24090), cepa Hon2 de Lactobacillus (LMG P24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 3 de abril de 2007, la cepa Bin7 de Bifidobacterium (LMG P-23986), la cepa Hma3 de Bifidobacterium (LMG P-23983), la cepa Bin2 de Bifidobacterium (LMG P-23984), la cepa Bma6 de Bifidobacterium (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007, y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 28 de abril de 2008.
  2. 2. Cepa bacteriana de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el tracto productor de miel de una abeja no incluye las tripas ni el intestino.
  3. 3. Cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la cepa tiene la capacidad de ser viable durante al menos 8 dias en una solucion de azucar al 65 % en peso, preferentemente durante 8 dias en una solucion de azucar al 70 % en peso, cuando la cepa bacteriana se mezcla con una solucion de azucar que contiene sacarosa al 65 % y agua al 35 %, y se incuba a 22 °C.
  4. 4. Una composition que comprende una cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  5. 5. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende una fuente de azucar, preferentemente seleccionada del grupo que consiste en miel, azucar, fructosa, sacarosa, dextrina, maltosa o glucosa.
  6. 6. Composicion farmaceutica que comprende una cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y un vehiculo y/o un diluyente farmaceuticamente aceptables.
  7. 7. Composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 6, que es una suspension, un gel, una crema, un polvo o una capsula.
  8. 8. Producto farmaceutico que comprende una composicion farmaceutica de acuerdo con las reivindicaciones 6 o 7, en forma de aposito, vendaje o pulverizado.
  9. 9. Producto alimentario o pienso que comprende una cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
  10. 10. Producto alimentario o pienso de acuerdo con la reivindicacion 9, en el que dicho producto es un pienso para abejas.
  11. 11. Metodo de production de miel sintetica que comprende anadir al menos una cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 a una fuente de azucar, en donde se permite que dicha al menos una cepa fermente al menos parte de una fuente de azucar.
  12. 12. Cepa bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para su uso en la preparation de un producto medicinal, un producto alimentario, una bebida o una composicion farmaceutica para prevenir y/o tratar infecciones o enfermedades gastrointestinales.
  13. 13. Un metodo de aislamiento de una cepa bacteriana del genera Lactobacillus o Bifidobacterium, estando dicha cepa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en: cepa Biut2 de Lactobacillus (LMG P-24094), cepa Hma2 de Lactobacillus (LMG P-24093), cepa Hma8 de Lactobacillus (LMG P-24092), cepa Bma5 de Lactobacillus (LMG P24090), cepa Hon2 de Lactobacillus (LMG P-24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 3 de abril de 2007, la cepa Bin7 de Bifidobacterium (LMG P-23986), la cepa Hma3 de Bifidobacterium (LMG P-23983), la cepa Bin2 de Bifidobacterium (LMG P-23984), la cepa Bma6 de Bifidobacterium (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007, y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 28 de abril de 2008, que comprende:
    a) la separation del tracto productor de miel de una abeja, separandose el tracto productor de miel pasado el esofago y antes del proventriculo para evitar la contamination procedente de las tripas o del intestino, y agitar el tracto en un medio esteril;
    b) el cultivo bacteriano de la muestra de a) en un medio adecuado;
    c) el cultivo puro y el aislamiento de la/s cepa/s bacteriana/s obtenidas en b) en un medio adecuado;
    d) la evaluation de la capacidad de la/s cepa/s de inhibir el deterioro de los alimentos y microorganismos
    patogenos.
  14. 14. Cepa bacteriana seleccionada del grupo que consiste en: cepa Biut2 de Lactobacillus (LMG P-24094), cepa Hma2 de Lactobacillus (LMG P-24093), cepa Hma8 de Lactobacillus (LMG P-24092), cepa Bma5 de Lactobacillus 5 (LMG P-24090), cepa Hon2 de Lactobacillus (LMG P-24091), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de Bacterias BCCM/lMg de Belgica el 3 de abril de 2007, cepa Bin7 de Bifidobacterium (LMG P-23986), cepa Hma3 de Bifidobacterium (LMG P-23983), cepa Bin2 de Bifidobacterium (LMG P-23984), cepa Bma6 de Bifidobacterium (LMG P-23985) y Fhon2 de Lactobacillus kunkeei (LMG P-23987), siendo dichas cepas depositadas en la Coleccion de Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 15 de enero de 2007, y Hma11 (LMG P-24612) depositada en la Coleccion de 10 Bacterias BCCM/LMG de Belgica el 28 de abril de 2008.
    imagen1
    i— Lcrispatus
    Lictiasatonts
    p— L acidophilus
    — L Helvetica5
    L kalnsemls
    L, ncnnstzYi
    . amtomicus
    r- BILII2
    L HmaE
    r- Hmas
    L Bma5
    L. gasseri
    Hcn2
    L bj»kp.p.i
    R10ri2
    L buchnsri
    P. parvuhis
    P. inopinaius
    Paras salangorensii
    L rtemnosus
    1— L. cases
    L. vzrsmoidensis
    L. plantarum
    L ferrr.Grttur]
    L renter!
    — 0,01 sustituciones/sitio
    Biri2
    Dm 7
    Hmad
    L- B asteroiridi
    Bmafi
    B CQYvnehrme
    B. thermae! dophitum
    B animat is
    subesp. lactis
    B. breve
    r
    B, mftmtis
    imagen2
    UFC
    Fhoi3
    Solucion de sacarosa
    imagen3
    -----fhanl
    ---- Biut2
    ------Bma5
    - Hma® —“'Himai -—- Hon2
    -----Bin?
    -----Bin2 |
    —“Hma3 —— Bmafi
    B.anlmalis
    - - - L.delbrueckii
    - - - L.acidophilus
    Lease!
    - — - L.reuteri
    UFC
    imagen4
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