ES2683725T3 - Método de preparación de un alimento hipoalergénico - Google Patents

Abstract

Método de preparación de un alimento con alergenicidad reducida a partir de una matriz alimentaria sólida con partículas de alergenicidad más elevada, que contiene proteínas alergénicas, dicha matriz alimentaria siendo a base de granos de cacahuete sin procesar, frutos secos sin procesar o frutas, caracterizado por que dicho método comprende una etapa de tratamiento de una dispersión de dicha matriz alimentaria sólida en un vehículo acuoso, por homogeneización a alta presión en condiciones hidrodinámicas a una presión comprendida entre 200 y 1000 bares (20 y 100 MPa) y a una temperatura comprendida entre 15 y 90 ºC, con el fin de obtener un homogenado constituido por una dispersión de proteínas alergénicas contenidas inicialmente en la matriz en mezcla con partículas sólidas de dicha matriz.

Description

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DESCRIPCION

Metodo de preparacion de un alimento hipoalergenico

La presente invencion se inscribe en el campo de la preparacion de alimentos hipoalergenicos. Se refiere a un metodo de preparacion de un alimento con alergenicidad reducida a partir de una matriz alimentaria solida con mayor alergenicidad, tal como se define en las reivindicaciones.

En la actualidad la Organizacion Mundial de la Salud clasifica las alergias en el 3er puesto mundial de las enfermedades cronicas mas extendidas. En los pafses industrializados, se calcula que afectan a uno de cada tres personas, y una proporcion de una persona con respecto a dos podna ser posible hacia 2030 si el aumento de casos de alergia registrados durante los ultimos diez anos continua al mismo ritmo. Las alergias alimentarias representan aproximadamente un 5 % de las alergias y hasta un 10 % en los ninos. Desde hace varios anos estan aumentando constantemente.

En particular, las alergias a los cacahuetes y a los frutos secos (nuez, avellana, anacardo, nuez pacana, pistacho, etc.) ocupan un lugar importante en la clase de alergias alimentarias debido a su alta prevalencia y especialmente a su gravedad. Con frecuencia se traducen en edemas bucarofarmgeos o shocks anafilacticos generalizados. Por consiguiente, estas alergias exigen el cumplimiento de un regimen alimentario estricto en el que se excluyan todos los productos susceptibles de contener cacahuetes o frutos secos. Algunas regulaciones europeas o internacionales requieren la mencion de la presencia de estos productos en el etiquetado de los alimentos. Los alergenos principales implicados en estas alergias corresponden esencialmente a protemas de reserva, que se acumulan en cantidades apreciables en las semillas en maduracion, que son inseparables de la semilla. Durante la germinacion de la semilla, estas protemas de reserva tienen el papel de proporcionar a la planta joven los aminoacidos necesarios para su crecimiento.

En la presente memoria se definen como alergenos principales los alergenos para los cuales al menos un 50 % de las personas alergicas poseen los anticuerpos IgE correspondientes. Hasta la fecha se ha identificado la mayor parte de los alergenos proteicos principales en cacahuetes y frutos secos. Estos alergenos principales corresponden esencialmente a vicilinas, leguminosas y albuminas 2S.

Por ejemplo, hasta la fecha, se han identificado once protemas alergenicas diferentes en el cacahuete, denominadas Ara h 1 a Ara h 11. Entre ellas, Ara h 1 (vicilina con un peso molecular de 63,5 kDa) y Ara h 2 (albumina 2S con un peso molecular de 16-17 kDa) representan aproximadamente de aproximadamente un 12 a un 16 % y de un 6 a un 9 %, respectivamente, de protemas del cacahuete. Mas de un 95 % de las personas alergicas al cacahuete presentan anticuerpos IgE espedficos para estas dos protemas. Ara h 3, una leguminosa, tambien se ha identificado como un alergeno principal del cacahuete.

La tecnica anterior ha propuesto diferentes metodos para reducir el grado de alergenicidad de los alimentos a base de materias primas altamente alergenicas, de forma espedfica a base de cacahuete.

A modo de ejemplo se pueden mencionar la mejora genetica, mediante seleccion cruzada de variedades de bajo nivel de alergenos o la produccion de cacahuetes geneticamente modificados con bajo contenido de alergenos. Estas tecnicas, sin embargo, no dan resultados satisfactorios, en la medida en que la smtesis y la acumulacion de los principales alergenos del cacahuete obedecen a sistemas multifactoriales cuya expresion es diffcil de modificar. Ademas, la modificacion mediante tecnicas de ingeniena genetica se enfrenta al problema del uso de organismos geneticamente modificados en el campo de la agroalimentacion.

Tambien se han propuesto diversos metodos de tratamiento fisicoqmmico de semillas de cacahuete, pero, hasta la fecha, ninguno ha proporcionado resultados concluyentes, especialmente en el caso de los tratamientos con calor (Davis et al., 1998), por radiacion UV (Chung et al., 2008), por proteasas digestivas tales como tripsina o pepsina (van Boxtel et al., 2008) o por adicion de otros compuestos, tales como agentes formadores de complejos, por ejemplo, acido fftico (Chung et al., 2007).

De otro modo con la tecnica anterior, de forma espedfica en la publicacion cientffica de Kato et al. (Kato, 2000), o en los documentos de patente WO 92/11772, JP 3.653.132 y US 5 476 677, se han propuesto metodos para reducir la alergenicidad de ciertas semillas, mas particularmente arroz y cereales, por tratamiento de estas semillas mediante presurizacion hidrostatica, con el objeto de liberar las protemas alergenicas contenidas en las mismas. Estos metodos, sin embargo, no permiten liberar mas que una parte de estas protemas alergenicas, tanto mas baja cuando estas ultimas estan poco disponibles en la naturaleza para la extraccion, ya que estan presentes en las semillas en forma de cuerpos proteicos compactos.

La presente invencion tiene como objetivo solucionar los inconvenientes de los metodos para la preparacion de alimentos de alergenicidad reducida propuestos por la tecnica anterior, de forma espedfica los que se han descrito anteriormente, proponiendo un metodo tal que permita obtener, a partir de una matriz alimentaria solida que presenta naturalmente una alergenicidad elevada, un alimento de alergenicidad fuertemente reducida, o incluso nula.

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Un objeto adicional de la invencion es que este metodo, ademas de ser compatible con los alimentos, no es contaminante, y de forma espedfica que usa ningun disolvente ni aditivo ionizante, de modo que se respecta totalmente no solo la seguridad, sino tambien las propiedades gustativas y nutricionales de la matriz alimenticia inicial.

Para este fin, segun la presente invencion se propone un metodo para preparar un alimento con alergenicidad reducida a partir de una matriz alimentaria solida con partmulas con una alergenicidad mas elevada, que contiene protemas alergenicas. Este metodo comprende una etapa de tratamiento de una dispersion de la matriz alimentaria solida en un vehmulo acuoso, por homogeneizacion a alta presion, de preferencia a presion ultra elevada, es decir, en condiciones hidrodinamicas, con el fin de obtener un homogenado constituido por una dispersion de protemas alergenicas contenidas inicialmente en la matriz, en mezcla con partmulas solidas de la matriz. De forma ventajosa, esta etapa permite extraer de la matriz casi todas las protemas alergenicas que estaban inicialmente contenidas en la misma, y de forma espedfica los alergenos principales.

Por “con partmulas”, en la presente memoria se hace referencia a que el material alimentario solido esta formado por partmulas, sin limitacion de tamano para estas partmulas. Por lo tanto, el termino partmulas engloba en la presente memoria las semillas, granos, nueces, etc., enteros, sea cual sea su tamano. Este termino tambien engloba por ejemplo las celulas, organulos celulares, etc.

Par matriz alimentaria solida, se hace referencia a una materia prima comestible en forma solida, de forma espedfica de origen vegetal, o un derivado solido de tal materia prima. Preferiblemente, la matriz alimentaria solida es una, o es a base de una, materia prima sin procesar, es decir, que no se ha sometido a ninguna etapa de purificacion o de separacion de sus componentes. De forma mas particular, la matriz alimentaria solida puede estar constituida por granos alimentarios que presentan una alergenicidad, de forma espedfica granos de cacahuete y/o de frutos denominados secos tales como nueces, avellanas, anacardos, nueces pacanas, nueces de macadamia, nueces de Brasil, pistachos, almendras, pinones, castanas, etc.

La matriz alimentaria tambien puede estar constituida por otros productos distintos a los denominados frutos secos, tales como manzanas, uvas, etc., estos ultimos pudiendo haberse sometido a etapas de transformacion previamente a la realizacion del metodo segun la invencion, por ejemplo de pelado, troceado, recorte, etc.

En el caso en donde la matriz alimentaria solida es a base de cacahuete, se trata de granos sin procesar.

Es lo mismo en los casos donde la matriz alimentaria es a base de frutos secos, entonces la matriz consiste en frutos secos sin procesar.

La alergenicidad se define en la presente memoria de forma clasica en sf misma, como la capacidad de una sustancia para provocar una reaccion alergica, es decir, una reaccion problematica del sistema inmunitario en algunos de todos que muestran una hipersensibilidad con respecto a esta sustancia. La reaccion alergica pone en juego varios anticuerpos, entre ellos las inmunoglobulinas E (IgE), una clase espedfica de inmunoglobulinas secretadas por los linfocitos B. En presencia del alergeno, sustancia biologica o qrnmica reconocida por el sistema inmunitario humano que provoca una reaccion o una respuesta alergica, el anticuerpo desencadena la liberacion de mediadores qrnmicos que causan la reaccion alergica, que se puede traducir en diversos smtomas mas o menos graves, tales como pruritos, erupciones cutaneas, dificultad para respirar, vomitos, diarrea, un edema bucarofarmgeo o reaccion anafilactica generalizada (choque anafilactico).

La tecnica de homogeneizacion a alta presion que se usa en el contexto de la presente invencion es conocida por sf misma, y consiste en proyectar a caudal constante un producto lfquido o pastoso, a alta presion, por lo general entre 30 y 40000 bares (3 y 4000 MPa), a traves de un cabezal de homogeneizacion, a traves de un espacio de varios pm dejado libre por una valvula de contrapresion. La presion corriente arriba de esta valvula se vuelve muy fuerte, y la descompresion repentina corriente abajo de la valvula provoca fenomenos que causan una modificacion en el producto disperso, de forma espedfica fenomenos de cizallamiento, microturbulencia y cavitacion. En particular se describe que esta tecnica permite estabilizar emulsiones grasas u obtener granulometnas pequenas en el seno de una emulsion o una dispersion de solidos en una fase lfquida. Su modo de operacion detallado se describe de forma espedfica en la publicacion de Lecluse, 1979.

De forma inesperada, los presentes inventores han descubierto en la actualidad que el tratamiento por homogeneizacion a alta presion de una dispersion en un vehmulo acuoso de una matriz alimentaria solida emitfa solubilizar las protemas alergenicas contenidas en esta matriz, incluyendo cuando, como en el caso de las semillas de cacahuete sin procesar, estas protemas alergenicas estan naturalmente poco disponibles para la extraccion, ya que estan incluidas en la matriz en forma de cuerpos proteicos compactos.

Esta etapa de tratamiento, realizada en condiciones hidrodinamicas, por proyeccion de la dispersion de la matriz alimentaria a alta presion a traves de un cabezal de homogeneizacion, resulta de forma espedfica mucho mas ventajosa que los tratamientos simples de presurizacion, en condiciones hidrostaticas, propuestos por la tecnica anterior, en terminos de cantidad de protemas alergenicas extrafdas de la matriz.

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Un tratamiento posterior del homogenado obtenido, por degradacion de estas protemas alergenicas, permite de forma ventajosa obtener, directamente o despues de la transformacion, un producto alimentario hipoalergenico, que conserva intactas las propiedades gustativas y nutricionales iniciales de la matriz alimentaria.

El termino hipoalergenico se usa en la presente memoria, en referencia a un alimento, como significan una tendencia menor a provocar una reaccion alergica, con respecto a la matriz alimentaria que sirve de base para su preparacion. En modos de realizacion de la invencion, el metodo de preparacion de un alimento que incluye una etapa de tratamiento por homogeneizacion a alta presion de la matriz alimentaria solida constituida por granos de cacahuete sin procesar o frutos secos sin procesar, permitio obtener una solubilizacion importante, superior a un 95 %, de las protemas alergenicas contenidas inicialmente en la matriz. En particular, en el caso de los granos de cacahuete, las tres protemas alergenicas principales, Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3, se solubilizan de ese modo de forma ventajosa casi totalmente en el vehmulo acuoso. A partir de ello resulta, despues de una etapa posterior de degradacion de estas protemas, una disminucion significativa, hasta mas de un 90 %, de la alergenicidad de estas protemas alergenicas.

En la presente memoria no se anticiparan mecanismos que sean la base de un resultado ventajoso de ese tipo. En el caso particular de los granos de cacahuete, las protemas alergenicas se almacenan en las vacuolas del grano que, una vez saturadas, se deshidratan a continuacion para formar los cuerpos proteicos. Esta deshidratacion conduce a un empaquetado de las protemas que se colocan entonces en estructuras pseudo-cristalinas, que las hacen por lo tanto poco disponibles para la extraccion de los tampones usados normalmente para solubilizar las protemas. Se puede suponer que el tratamiento por homogeneizacion a alta presion, mediante una desestructuracion de la matriz alimentaria solida, aumenta la disponibilidad y el grado de solvatacion de estas protemas, asf como su susceptibilidad a experimentar modificaciones biologicas y qmmicas que tienen como objeto su desnaturalizacion y degradacion.

La alergenicidad del alimento obtenido se puede evaluar con cualquier medio conocido por el experto en la tecnica, de forma espedfica mediante cuantificacion de su contenido de alergenos principales mediante dosificaciones inmunologicas, por ejemplo con la tecnica conocida con el nombre de ELISA (para el ingles Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), Por medio de anticuerpos espedficos de estos alergenos.

Siguiendo modos de realizacion preferidos, la invencion responde ademas a las siguientes caractensticas, realizadas por separado o en cada una de sus combinaciones tecnicamente operativas.

En particular, la eleccion de los parametros de operacion preferidos se realiza con el fin de obtener el mejor rendimiento de extraccion de las protemas alergenicas contenidas en la matriz alimentaria solida durante la etapa de homogeneizacion a alta presion.

En modos de realizacion de la invencion, la matriz alimentaria solida se somete a una etapa de trituracion previamente a la etapa de tratamiento por homogeneizacion a alta presion, de preferencia despues de su dispersion en el vehmulo acuoso. Una caractenstica de ese tipo mejora de forma ventajosa el rendimiento de extraccion de las protemas alergenicas contenidas en la matriz, de forma espedfica en los casos en los que la matriz esta formada inicialmente por semillas o granos enteros de diametro relativamente elevado.

Preferiblemente, esta trituracion se realiza con el fin de obtener una granulometna de la matriz solida inferior a 1500 pm, de diametro de las partmulas que la forman.

En este sentido, se puede realizar de forma espedfica en una mezcladora de rotor, clasica en sf misma, que permite, gracias a fuerzas de cizallamiento, reducir la granulometna de la matriz solida y dispersar aproximadamente las partmulas solidas en el vehmulo acuoso.

La trituracion se puede realizar a una temperatura comprendida entre 15 y 90 °C, de preferencia aproximadamente igual a 25 °C. La velocidad del rotor se puede regular a un valor comprendido entre 100 y 10 000 vueltas/minuto, de preferencia a aproximadamente 800 vueltas/minuto. La duracion de la trituracion puede estar comprendida entre 2 y 60 minutos, y es preferiblemente de aproximadamente 10 minutos.

En modos de realizacion particulares de la invencion, la dispersion de la matriz alimentaria solida en el vehmulo acuoso comprende una proporcion en peso de matriz alimentaria solida, por volumen de vehmulo acuoso, comprendida entre 50/50 y 5/95, y de preferencia igual a 20/80.

El vehmulo acuoso es preferiblemente agua.

La etapa de tratamiento por homogeneizacion a alta presion se realiza a una presion comprendida entre 200 y 1000 bares (20 y 100 MPa), preferiblemente a aproximadamente 500 bares (50 MPa).

La homogeneizacion a alta presion se realiza a una temperatura comprendida entre 15 y 90 °C, preferiblemente a aproximadamente 35 °C.

En modos de realizacion preferidos de la invencion, la etapa de tratamiento por homogeneizacion a alta presion se realiza con el fin de obtener una granulometna del homogenado inferior a 20 pm, de preferencia aproximadamente

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Igual a 10 pm, de diametro de las partroulas que lo componen. La obtencion de una granulometna de ese tipo esta asociada de forma ventajosa con un rendimiento optimo de extraccion de las protemas alergenicas de la matriz. Ademas es compatible con los homogeneizadores de alta presion que normalmente se proponen en el mercado.

Un solo ciclo de homogeneizacion a alta presion generalmente suficiente para obtener un rendimiento de extraccion de las protemas alergenicas de la matriz alimentaria solida superior a un 95 %, sea cual sea el estado inicial de estas protemas en la matriz.

Al final de esta etapa de homogeneizacion a alta presion se obtiene una dispersion exenta de cualquier partroula que se pueda detectar a simple vista, que conserva el sabor inicial de la matriz alimentaria solida de partida.

En modos de realizacion preferidos de la invencion, la etapa de tratamiento por homogeneizacion a alta presion va seguido por una etapa de tratamiento del homogenado obtenido por un agente de degradacion/desnaturalizacion de las protemas, para degradar las protemas alergenicas contenidas en el homogenado y disminuir de ese modo su alergenicidad, de preferencia de al menos un 70 %, preferiblemente de al menos un 90 %, e incluso preferiblemente de al menos un 95 %.

El agente de degradacion de las protemas puede ser un agente qmmico o biologico, de forma espedfica un agente proteolttico, que se puede obtener a partir de un microorganismo, y de forma espedfica una proteasa. Los agentes biologicos son de forma espedfica particularmente preferidos en el contexto de la invencion.

El agente de degradacion de las protemas puede ser un microorganismo, cuya actividad enzimatica, proteolttica de forma espedfica, puede ser superior a la de las enzimas aisladas, y de preferencia un microorganismo probiotico. Con el termino probiotico, se hace referencia a designar microorganismos vivos que, cuando se integran en cantidad suficiente, ejercen un efecto positivo en la salud, mas alla de los efectos nutricionales normales.

De ese modo se evita de forma ventajosa el recurso a agentes o disolventes qmmicos, para esta etapa de la preparacion del alimento hipoalergenico.

Los microorganismos seleccionados segun la invencion pueden ser bacterias u hongos, unicelulares tales como las levaduras o pluricelulares.

Preferiblemente, se eligen con el fin de que presenten propiedades organolepticas de modo que no alteren las cualidades gustativas iniciales del homogenado.

Los ejemplos de especies de bacterias que se pueden usar en el contexto de la invencion son Lactobacillus plantarum y Bacillus subtilis. Los ejemplos de hongos son Saccharomyces cerevisiae, Rhizopus oligosporus y Aspergillus oryzae.

Uno o varios microorganismos de especies o de generos diferentes se pueden usar de forma simultanea o de forma consecutiva.

En modos de realizacion preferidos de la invencion, el microorganismo se inocula en el homogenado, y el medio obtenido de ese modo se deja fermentar durante un periodo de tiempo suficiente como para disminuir al menos en un 70 %, de preferencia al menos en un 90 %, la alergenicidad de las protemas alergenicas contenidas inicialmente en el homogenado.

La cantidad inicial de microorganismos usada para la inoculacion y las condiciones de fermentacion se determinan de forma espedfica en funcion de la matriz alimentaria solida de partida y de las protemas alergenicas que incluye.

Preferiblemente, cuando el microorganismo es un hongo, la inoculacion se realiza a razon de 1.104 a 1.108 esporas por ml de homogenado. Cuando el microorganismo es una bacteria, la inoculacion se realiza por ejemplo por medio de un cultivo bacteriano de densidad optica a 600 nm de aproximadamente 0,5, que se anade en el homogenado En una concentracion de un 10 a un 70 % en volumen, preferiblemente de aproximadamente un 50 % en volumen. Una eleccion de las condiciones de inoculacion de ese tipo permite de forma ventajosa obtener la mejor actividad de degradacion de las protemas alergenicas contenidas en el homogenado por el microorganismo.

La fermentacion se puede realizar en un sistema aireado, con una agitacion orbital, bajo una temperatura comprendida entre 20 y 45 °C, de preferencia de aproximadamente 37 °C, de 2 a 300 horas, de preferencia durante aproximadamente 72 horas.

Antes de la inoculacion, el homogenado se lleva de preferencia a una temperatura superior o igual a 100 °C, de 10 a 30 minutos, a continuacion se enfna a la temperatura ambiente.

En modos de realizacion de la invencion, al homogenado se le anade azucar, por ejemplo sacarosa, glucosa, maltosa; almidon, por ejemplo de trigo, de mafz, de patata, en una concentracion comprendida entre un 0,5 y un 10% en peso/volumen; y/o acido, tal como acido acetico, antes de la fermentacion, con el fin de favorecer la actividad enzimatica, proteolftica de forma espedfica, del microorganismo.

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Mas generalmente, la etapa de tratamiento por un microorganismo probiotico, con el fin de disminuir la alergenicidad de las protemas alergenicas contenidas en una matriz solida, se puede realizar bajo cualquier forma de esta matriz solida, comprendida en la misma en formas que no se hayan sometido a homogeneizacion a alta presion, pero que se hayan sometido a cualquier otro tipo de tratamiento previo, o a ningun tratamiento previo de ese tipo. En particular, esta etapa de tratamiento por un microorganismo probiotico se puede realizar sobre una dispersion de partmulas y protemas obtenidas a partir de la matriz solida, obtenida mediante una tecnica distinta a la homogeneizacion alta presion. Las caractensticas de esta etapa de tratamiento por un microorganismo probiotico entonces pueden ser tal como se han descrito anteriormente.

La fraccion de fermentado obtenida al final de la fermentacion se puede usar de forma ventajosa como alimento como tal, o como compuesto intermedio para la fabricacion de alimentos.

Por ejemplo, en el caso en el que la matriz alimentaria solida inicial esta constituida a base de cacahuete, la fraccion de fermentado se puede incorporar, despues de una deshidratacion opcional, en el aceite de cacahuete, de forma espedfica refinado, que no presenta en sf misma caracter alergenico, para la preparacion de mantequilla de cacahuete.

El alimento final presenta una alergenicidad fuertemente reducida con respecto a la matriz alimentaria solida inicial, las ser esta reduccion superior hasta un 95 %. Sus cualidades gustativas, organolepticas y nutricionales son similares a las de esta matriz.

El metodo segun la invencion constituye un avance principal en la gestion diaria de las exclusiones alimentarias impuestas a los individuos alergicos en los problemas que estan relacionados con los mismos, que se refieren de forma espedfica al etiquetado de los productos alimentarios.

Las caractensticas y ventajas del metodo segun la invencion apareceran de forma mas clara a la vista de los ejemplos de realizacion que siguen a continuacion, proporcionado simplemente a modo ilustrativo y no limitantes de la invencion, con el apoyo de las figuras 1 a 10, en las que:

- la figura 1 representa una microfotograffa con un aumento de 20x de de y obtenidas por una trituracion de granos de cacahuete crudos segun modos de realizacion particulares de la invencion;

- la figura 2 muestra una microfotograffa con un aumento de 20x de partmulas de un homogenado obtenido a partir de granos de cacahuete crudos segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion;

- la figura 3 es un histograma que muestra la masa en mg de protemas dosificadas en una suspension de 100 mg de granos de cacahuete crudos, respectivamente antes y despues de una etapa de homogeneizacion segun un modo de realizacion particular de la invencion;

- la figura 4 muestra un gel SDS-PAGE (del ingles Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) coloreado con Azul de Coomassie, obtenido despues de migracion de, Pista 1 un marcador de peso molecular, Pista 2 un extracto de suspension de granos de cacahuete despues de trituracion y antes de homogeneizacion a alta presion, y Pista 3 un extracto de suspension de granos de cacahuete despues de homogeneizacion a alta presion segun modos de realizacion particulares de la invencion;

- la figura 5 muestra un gel SDS-PAGE coloreado con Azul de Coomassie, obtenido despues de migracion de, Pista 1 un marcador de peso molecular; Pista 2 un extracto proteico sin procesar de granos de cacahuete crudos no tratados; Pistas 3 a 5, extractos de protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete crudos mediante etapas de trituracion, homogeneizacion a alta presion despues de 72 horas de fermentacion por Rhizopus oligosporus, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 3, Fraccion soluble para la Pista 4 y Fraccion insoluble para la Pista 5 (deposicion de 20 |jg de protemas por pocillo);

- la figura 6 representa un gel SDS-PAGE seguido por una transferencia de Western obtenido despues de migracion de, Pista 1 un extracto proteico sin procesar de granos de cacahuete crudos no tratados; Pistas 2 a 4, extractos de protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete crudos mediante etapas de trituracion, homogeneizacion a alta presion despues de 72 horas de fermentacion por Rhizopus oligosporus, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 2, Fraccion soluble para la Pista 3 y Fraccion insoluble para la Pista 4 (deposicion de 20 jg de protemas por pocillo, combinacion de anticuerpos de conejo anti-Ara h 1, anti-Ara h 2, anti-Ara h 3); el marcador de peso molecular se representa a la izquierda en la figura;

- la figura 7 muestra un gel SDS-PAGE coloreado con Azul de Coomassie, obtenido despues de migracion de, Pista 1 un marcador de peso molecular; Pista 2 un extracto proteico sin procesar de granos de cacahuete crudos no tratados; Pistas 3 a 5, extractos de protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete crudos mediante etapas de trituracion, homogeneizacion a alta presion despues de 72 horas de fermentacion por Aspergillus oryzae, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 3, Fraccion soluble para la Pista 4 y Fraccion insoluble para la Pista 5; Pistas 6 a 8, extractos de protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete tostados mediante etapas de trituracion, homogeneizacion a alta presion despues de 72 horas

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de fermentacion por Aspergillus oryzae, segun el mismo modo de realizacion del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 6, Fraccion soluble para la Pista 7 y Fraccion insoluble para la Pista 8 (deposicion de 20 |jg de protemas por pocillo);

- la figura 8 representa un gel SDS-PAGE seguido por una transferencia de Western obtenido despues de

migracion de, Pista 1 un marcador de peso molecular; Pista 2 un extracto proteico sin procesar de granos de cacahuete crudos no tratados; Pistas 3 a 5, extractos de protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete crudos mediante etapas de trituracion, homogenizacion a presion ultra elevada despues de 72 horas de fermentacion por Aspergillus oryzae, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 3, Fraccion soluble para la Pista 4 y Fraccion insoluble para la Pista 5; Pistas 6 a 8, extractos de protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete tostados mediante etapas de trituracion, homogenizacion a presion ultra elevada despues de 72 horas de fermentacion por Aspergillus oryzae, segun el

mismo modo de realizacion del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 6, Fraccion

soluble para la Pista 7 y Fraccion insoluble para la Pista 8 (deposicion de 20 jg de protemas por pocillo, combinacion de anticuerpos de conejo anti-Ara h 1, anti-Ara h 2, anti-Ara h 3);

- la figura 9 muestra un gel SDS-PAGE coloreado con Azul de Coomassie, obtenido despues de migracion de,

Pista 1, un extracto proteico sin procesar de granos de cacahuete crudos no tratados; Pistas 2 a 4, extractos de

protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete crudos mediante etapas de trituracion, homogeneizacion a alta presion despues de 72 horas de fermentacion por Bacillus subtilis, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 2, Fraccion soluble para la Pista 3 y Fraccion insoluble para la Pista 4 (deposicion de 20 jg de protemas por pocillo); el marcador de peso molecular se representa a la izquierda en la figura;

- y la figura 10 representa un gel SDS-PAGE seguido por una transferencia de Western obtenido despues de migracion de, Pista 1 un extracto proteico sin procesar de granos de cacahuete crudos no tratados; Pistas 2 a 4, extractos de protemas obtenidos a partir de granos de cacahuete crudos mediante etapas de trituracion, homogenizacion a presion ultra elevada despues de 72 horas de fermentacion por Bacillus subtilis, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, fraccion de Sobrenadante para la Pista 2, Fraccion soluble para la Pista 3 y Fraccion insoluble para la Pista 4 (deposicion de 20 jg de protemas por pocillo, combinacion de anticuerpos de conejo anti-Ara h 1, anti-Ara h 2, anti-Ara h 3); el marcador de peso molecular se representa a la izquierda en la figura.

EJEMPLO A - Tratamiento de una matriz alimentaria solida formada por granos sin procesar de cacahuete por homogeneizacion a alta presion

1/ Materiales y metodos

Para la trituracion inicial de la matriz se usa una mezcladora de inmersion a alto cizallamiento Silverson®. La velocidad del rotor se fija a 700 vueltas/minuto, la duracion del tratamiento en 5 minutos. La temperatura es de aproximadamente 25 °C.

La homogeneizacion a alta presion se realiza por medio de un homogeneizador a alta presion Lab-1000 de la comparua APV, a una presion de 500 bars (50 MPa), y a una temperatura de 35 °C.

El analisis microscopico se realiza sobre una dispersion de la matriz alimentaria solida, respectivamente despues de trituracion y despues de homogeneizacion a alta presion. En este sentido, 10 jl de la dispersion se depositan sobre Un portaobjetos de vidrio y se seca a una temperatura de 60 °C durante 10 minutos. Esto permite que los solidos residuales se adhieran al portaobjetos de vidrio y que se pueda proceder a una coloracion. Los portaobjetos se sumergen a continuacion en la solucion de naranja de acridina a un 1 % (m/v) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Despues de lavar con agua destilada, los portaobjetos se sumergen en una solucion de rojo Congo a un 1 % (m/v) durante 5 minutos, a continuacion se aclara intensamente con agua destilada. Los portaobjetos se sumergen a continuacion en una solucion de verde luz a un 1 % (m/v) durante 2 minutos y a continuacion se aclaran con agua destilada. La observacion se realiza a continuacion al microscopio con un aumento de 20x, por medio del microscopio Leica DM IRBE invertido de campo grande y de fondo claro. La coloracion permite identificar los diferentes compuestos de la dispersion: el almidon se colorea de color violeta, las protemas de color verde/azul (visible en color gris oscuro en las figuras 1 y 2) y las paredes celulares en color marron/naranja.

El analisis cuantitativo de las protemas presentes en la dispersion se realiza antes y despues del tratamiento por homogeneizacion a alta presion. En este sentido, a 980 jl de la dispersion (a proporciones identicas de masa/volumen) se anaden 20 jl de una solucion tampon de Tris(2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol) a 1 mol/l a un pH de 8,5, en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Las suspensiones se agitan a continuacion en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 1 h. Los tubos se centrifugan a 4 °C a una velocidad de 16 100 g durante 10 minutos, y el sobrenadante se extrae. Este sobrenadante se diluye a la 10a en agua ultra pura, y el analisis cuantitativo de las protemas se realiza con la ayuda del kit de analisis cuantitativo de protemas BCA (para el ingles Bi-Cinchoninic Acid, acido bicinconmico) de Pierce, en una microplaca de fondo plano de 96 pocillos. La gama patron es una solucion de BSA (para el ingles Bovine Serum Albumin, albumina de suero bovino) en concentraciones que vanan de 2 mg/ml a

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0 mg/ml. Despues de la incubacion de la solucion proteica (25 jl despues de dilucion) y del reactivo del kit (200 |jl) Durante 30 minutos a 37 °C, se hace la lectura de la microplaca en un lector espectrofotometrico a una longitud de onda de 562 nm. Las concentraciones de protema se calculan a partir de la gama patron.

La separacion de las proteinas en gel se realiza en gel de poliacrilamida en condiciones de desnaturalizacion (SDS- PAGE). Las electroforesis se realizan en geles planos de porosidad de un 12,5 % de acrilamida. Esta malla permite separar bien las proteinas de pesos moleculares medios y bajos (entre 100 y 10 kDa).

Los geles estan constituidos por un gen de separacion (acrilamida al 12,5 %; bis-acrilamida al 0,4 %; 0,125 mol/l de Tris-HCI a pH 8,8; dodecil sulfato sodico (SDS) al 0,1 %) y un gel de concentracion (acrilamida al 4,8%; bis- acrilamida al 0,3%; 0,375 mol/l de Tris-HCI a pH 6,8; SDS al 0,1 %). La migracion se desarrolla a un amperaje constante de 30 mA durante aproximadamente 1 hora.

Las soluciones proteicas se depositan a volumen constante: 1 jl + 19 jl de agua ultra pura + 4 microlitros de una solucion de tampon de carga [SDS al 2 %; Tris 0,125 M; glicerol al 10 %; p-mercaptoetanol al 5 %] y se calientan 5 minutos a 100 °C antes de su deposicion sobre el gel.

Las proteinas separadas sobre geles se colorean a continuacion segun el siguiente protocolo: fijacion en una solucion de etanol al 40 %, acido acetico al 10 % y H2O al 50 % durante 30 minutos; coloracion en una solucion de Azul de Coomassie (1 g de azul de Coomassie R250, 250 ml de etanol, 80 ml de acido acetico, 670 ml de H2O); decoloracion en una solucion de etanol al 25 %, acido acetico al 8 %, H2O al 67 %, hasta que el fondo del gel sea transparente.

2/ Resultados

Los granos de cacahuete sin procesar se ponen en suspension en agua, en una proporcion de peso de granos por volumen de agua igual a 20/80.

Esta suspension se somete a trituracion, segun el metodo que se ha indicado anteriormente. Al final de esta etapa se obtiene una suspension en agua de partfculas de grano de cacahuete.

Esta suspension se somete a analisis microscopico, segun el metodo que se ha indicado anteriormente. Despues de la coloracion, se obtiene la microfotograffa representada en la figura 1. Ah se observa que todas las partfculas solidas presentan un diametro inferior a 1500 jm.

La suspension obtenida se somete a homogeneizacion a alta presion, segun el metodo que se ha indicado anteriormente (pasaje unico en el homogeneizador).

El homogenado Obtenidos se somete a analisis microscopico, segun el metodo que se ha indicado anteriormente. Despues de la coloracion, se obtiene la microfotograffa representada en la figura 2. Ah se observa claramente una desagregacion de los cuerpos proteicos, con respecto a la suspension antes de la homogeneizacion que forma el objeto de la figura 1. A partir de la gran mayoria de las proteinas alergenicas del cacahuete, de forma espedfica Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3/4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 8 y Ara h 9, que estan contenidas en estos cuerpos protemicos, se puede deducir que la homogeneizacion a alta presion condujo a la dispersion de estas proteinas en el vehfculo acuoso.

Un analisis cuantitativo de las proteinas contenidas en la suspension, antes y despues de la homogeneizacion, se realizo segun el metodo que se ha descrito anteriormente. El resultado, en masa de proteinas dosificadas en una suspension de 100 mg de granos de cacahuete, se muestra en la figura 3.

Aid se observa que despues de la homogeneizacion, para la misma cantidad en peso inicial de grano de cacahuete, Se dosifica una cantidad de proteinas en la suspension que es de un 42 % mas elevada que antes de la homogeneizacion a alta presion. Este resultado demuestra claramente que la homogeneizacion a alta presion conduce a una solubilizacion importante de las proteinas contenidas inicialmente en las partfculas de la fraccion triturada de granos de cacahuete.

Las proteinas contenidas en la suspension, respectivamente despues de la trituracion y antes de la homogeneizacion, y despues de la homogeneizacion a alta presion, se separaron sobre gel de poliacrilamida SDS- PAGE, segun el metodo que se ha indicado anteriormente. Despues de la coloracion, se obtiene el gel que se muestra en la figura 4. En este gel, la Pista 1 corresponde a un marcador de peso molecular, la Pista 2 a las proteinas de la suspension antes de la homogeneizacion y la Pista 3 a las proteinas de la suspension despues de la homogeneizacion a alta presion. En esta figura, las bandas atribuidas a los alergenos principales del cacahuete, Es decir, Ara h 1 (de peso molecular de aproximadamente 63 kDa), Ara h 3 (subunidad acida, duplete con pesos moleculares de aproximadamente 42 y 45 kDa) y Ara h 2 (duplete con pesos moleculares de aproximadamente 16 y 17 kDa) se han indicado con flechas.

En esta figura 4 se observa que, para condiciones de operacion identicas, la intensidad de las bandas que corresponde a los alergenos principales del cacahuete, Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3, es claramente mas pronunciado

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para el extracto proteico obtenido despues de la homogeneizacion a alta presion, que para el obtenido a partir de la fraccion triturada antes de la homogeneizacion. Tambien se observa la presencia, en la Pista 3, de bandas entre 35 y 20 kDa, entre 55 y 45 kDa y mas alla de 70 kDa, que no son visibles en la Pista 2. Se puede deducir que la homogeneizacion a alta presion ha permitido liberar en el vehmulo acuoso una cantidad importante de protemas, y de forma espedfica los alergenos principales del cacahuete Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3.

La homogeneizacion a alta presion por lo tanto permitio mejorar de manera significativa la disponibilidad y el grado de solvatacion de las protemas de reserva contenidas en los granos de cacahuete, y aumentar por la misma su susceptibilidad a experimentar posteriormente un tratamiento, de forma espedfica biologica, que tiene como objeto su desnaturalizacion o su degradacion.

EJEMPLO B - Preparacion de anticuerpos dirigidos contra las protemas alergenicas Ara h 1, Ara h 2 y Ara h 3 del cacahuete

Con el fin de cuantificar el contenido de alergenos principales del homogenado obtenido en el Ejemplo A, se preparan anticuerpos dirigidos contra las protemas alergenicas Arahl, Ara h 2 y Ara h 3 del cacahuete de la siguiente forma.

1/ Purificacion de la protema Ara h 1

Los granos de cacahuete crudos se dispersan en tampon Tris 20 mM a pH 7,4. El extracto sin procesar obtenido de ese modo se somete a precipitacion en una solucion acuosa de sulfato de amonio ((NH^SO4) a un 40 % (m/v). El sobrenadante se somete a dialisis contra un tampon fosfato 20 mM a pH 7, a traves de la membrana de lfmite de exclusion de 3,5 kDa.

Se obtiene un extracto de protemas que contiene principalmente Ara h 1, a que se anade un 2 % en volumen de polivinilpolipirrolidona (PVPP).

La protema Ara h 1 se purifica a continuacion por medio de una columna de Sepharose a la que se injerta concanavalina A. Esta lectina permite la fijacion de los motivos gluddicos, estos mismos motivos encontrandose en la protema Ara h 1. La fijacion se realiza en un 20 mmol.l-1 de tampon Tris, pH 7,4, con adicion de 0,5 mol.l-1 de NaCl, 1 mmol.l-1 de MnCh y CaCh. La elucion se realiza en el mismo tampon, al que se le anaden 200 mmol.l-1 de glucosa.

La concanavalina A residual se encuentra en las fracciones recuperadas. Con el fin de eliminar y aumentar la pureza de Ara h 1, las fracciones se reunen y se dializan durante 48 h contra el tampon Tris a 20 mmol.l-1 a pH 7,4, con el fin de eliminar en un primer tiempo la glucosa que impide la fijacion de la Concanavalina A sobre el dextrano.

A continuacion, las muestras de ensayo se pasan sobre una columna Sephadex G-25 en circuito cerrado durante 24 h a 4 °C, con un caudal de 0,5 ml/min. La concanavalina A se fija sobre los motivos de dextrano, y el eluato contiene exclusivamente Ara h 1.

La identidad de esta protema y su estado de pureza se verifican por SDS-PAGE y caracterizacion de las fracciones peptfdicas obtenidas despues de hidrolisis tnpsica por espectrometna de masas por medio de un espectrometro de tipo MALDI-TOF.

2/ Purificacion de la proteina Ara h 2

Los granos de cacahuete crudos se dispersan en tampon Tris 20 mM a pH 7,4, al que se le anade cloruro sodico (NaCl) 150 mM. El extracto sin procesar obtenido de ese modo se somete a una deslipidacion con cloroformo, a continuacion un extracto sin procesar deslipidado de ese modo se somete a dialisis contra un tampon Tris 20 mM a pH 8, a traves de una membrana de lfmite de exclusion de 3,5 kDa.

Se obtiene un extracto de protemas que contiene principalmente Ara h 2.

La protema Ara h 2 se purifica a continuacion a partir de este extracto en una columna HiTrap® Q FF (Amersham) de 5 ml, columna anionica que permite separar las protemas segun su carga, a un pH ligeramente basico.

La fijacion se realiza por interaccion ionica, y la elucion mediante un gradiente creciente de NaCI. La protema Ara h 2 se eluye a una concentracion de NaCI de 240 mmol.l-1. Las facciones recuperadas en la salida de la columna se dializan a continuacion contra un tampon Tris de 20 mmol.l-1, pH 7,4.

La identidad de la protema Ara h 2 y su estado de pureza se verifican por SDS-PAGE y la caracterizacion de las fracciones peptfdicas obtenidas despues de la hidrolisis tnpsica por espectrometna de masas por medio de un espectrometro de tipo MALDI-TOF.

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3/ Purificacion de la protema Ara h 3

Los granos de cacahuete crudos se deslipidan con eter de petroleo en un extractor de Soxhlet, a continuacion se dispersan en un tampon Tris 20 mM a pH 8.

Se obtiene un extracto de protemas que contiene principalmente Ara h 3.

La proteina Ara h 3 se purifica a continuacion a partir de este extracto en dos etapas, sobre dos columnas distintas.

La primera columna es la que se al escrito para la purificacion de Ara h 2 mencionada anteriormente, es decir, una columna anionica HiTrap® Q FF de 5 ml. Las condiciones usadas son las mismas que para la purificacion de Ara h 2 que se ha mencionado anteriormente, aislada de modo que la elucion de Ara h 3 se produce a una concentracion de NaCI de 400 mmol.l-1.

A continuacion de este pasaje sobre la primera columna, y despues de verificacion mediante separacion de las protemas en SDS-PAGE, las fracciones que contienen Ara h 3 se reunen y se dializan contra un tampon Fosfato De 50 mmol.l-1 a pH 7,0 durante 48 h a 4 °C.

La separacion final de Ara h 3 de las otras protemas eluidas a 400 mmol.l-1 NaCI sobre HiTrap® Q FF 5 ml se realiza mediante cromatograffa en una columna HiTrap® Phenyl HP 5 ml (Amersham), cromatograffa denominada « hidrofoba ». Para la fijacion y la elucion de las protemas en este tipo de columna, se juega con la hidrofobia de las protemas, afectada por la concentracion mas o menos importante de sales caotropicas ((NH4)2SO4 por ejemplo). Para esto, despues de la dialisis, se anade, a la muestra de ensayo, una solucion de (NH4)2SO4 de 2,5 mol.l-1 con el fin de obtener una concentracion final de (NH4)2SO4 de 1 mol.l-1. La muestra de ensayo se fija a continuacion en la columna HiTrap® Phenyl HP, y despues del lavado, la elucion se realiza con un gradiente decreciente de sal (NH4)2SO4en tampon Fosfato 50 mM a pH 7,0.

Las protemas contenidas en las fracciones recuperadas se especifican a continuacion con acido tricloroacetico y se paran sobre gel SDS-PAGE con el fin de verificar su pureza.

La identidad de la protema Ara h 3 y su estado de pureza se verifican por SDS-PAGE y la caracterizacion de las fracciones peptfdicas obtenidas despues de la hidrolisis tnpsica por espectrometna de masas por medio de un espectrometro de tipo MALDI-TOF.

4/ Inmunizacion de conejos

Para cada una de las tres protemas alergenicas purificadas, la produccion de antigenos policlonales se realiza mediante la inmunizacion de los conejos de Nueva Zelanda. El programa de inmunizacion se extiende durante 63 dfas, con 4 inyecciones de 150 a 300 |jg de protemas purificadas extrafdas en adyuvante completo de Freund. Se realizan tres tomas de muestras con el fin de seguir la produccion de los anticuerpos deseados: a J0 para la verificacion de la no reactividad del suero pre-inmunizacion, a J49 y a J63 para el seguimiento de la respuesta inmunitaria y la eleccion de la exanguinacion total o no de los conejos.

Despues de decidir la exanguinaccion total de los conejos, estos se sacrifican en un periodo que no supera 40 dfas despues del programa de inmunizacion de 63 dfas.

La especificidad de la sensibilidad de los sueros obtenidos, para la protema alergenica asociada, se verifica mediante analisis de transferencia de Western, contra un extracto total de cacahuete.

EJEMPLO C - Tratamiento del homogenado del Ejemplo A con microorganismos

El homogenado obtenido en el Ejemplo A se somete a una fermentacion respectivamente para cada uno de los siguientes microorganismos probioticos: Aspergillus oryzae, Rhizopus oligosporus, Bacillus subtilis.

Al final de esta fermentacion, las contenidas en el homogenado obtenido de ese modo se extraen, se dosifican y se separan por SDS-PAGE. A continuacion se analizan mediante transferencia de Western y ensayo ELISA (para el ingles Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), con el fin de evaluar su grado de alergenicidad.

1/ Material y Metodos

Cultivo de los microorganismos

Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus se cultivan en un medio PDA (para el ingles Potato Dextrose Agar) (para un litro: 4 g de infusion de Patata; 20 g de Dextrosa, 15 g de Agar - esterilizado en autoclave durante 15 minutos a 121 °C/1 bar (0,1 MPa)) en placa de Petri a 37 °C, en una atmosfera humeda (95% de humedad relativa) durante 7 dfas.

Bacillus subtilis se pone en cultivo en un medio CASO (Casema SOja Tnpsica) (para un litro: 17,0 g/l de peptona de casema; 3,0 g/l de peptona de harina de soja; 2,5 g/l de D(+)- glucosa; 5,0 g/l de cloruro sodico; 2,5 g/l de fosfato

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dipotasico - esterilizado en autoclave durante 15 minutes a 121 °C/1 bar (0,1 MPa)) a 37 °C durante 12 horas. Puesta en fermentacion

Se tratan 10 ml de homogenado, en un frasco Erlenmeyer de 100 ml.

Para Aspergillus oryzae y Rhizopus oligosporus, el pH del homogenado se ajusta a 4,5 con acido acetico. Las esporas cultivadas en placa de Petri se cosechan con la ayuda de agua esteril a la que se anaden varias botas de Tween 20. Despues del desprendimiento de las esporas del medio de cultivo con la ayuda de una rasqueta de vidrio, la suspension se filtra en Miracloth con el fin de no conservar mas que las esporas y separarlas del micelio. La suspension se somete a una agitacion vorticial y se hace el recuento con el microscopio gracias a una celda de recuento (celda de Malassez). Las esporas se anaden al homogenado, a razon de 1.106 esporas/ml, a continuacion el medio resultante se somete a calentamiento a una temperatura de 100 °C durante 10 minutos, a continuacion se deja enfriar hasta la temperatura ambiente. El cultivo se pone a fermentar en un sistema aireado hasta la temperatura ambiente. El cultivo se pone a fermentar en un sistema aireado con una agitacion orbital (a la velocidad de 50 vueltas/minuto), a una temperatura de 37 °C, durante 72 horas.

Las bacterias Bacillus subtilis se ponen en cultivo en los medios de cultivo correspondientes hasta obtener una densidad optica de 0,5 a 600 nm (12 horas a 37 °C). El homogenado se calienta a 100 °C durante 10 minutos y a continuacion se enfna a temperatura ambiente. Ademas se anade maltosa al 2 % (m/v). Las bacterias se inoculan en el homogenado a una concentracion de un 50 % (v/v). A continuacion el cultivo se pone a fermentar sin agitacion, a una temperatura de 37 °C, durante 72 horas.

Extraccion de las proteinas despues de fermentacion del homogenado

Despues de un tiempo de fermentacion dado, 1,5 ml de la fraccion de fermentado obtenidos se colocan en un tubo Eppendorf de 2 ml, y se centnfuga a 16 100 x g durante 10 minutos a 4 °C. La capa lipfdica superior se elimina y el sobrenadante se extrae y se almacena a -20 °C hasta el analisis. En lo sucesivo se hara referencia al mismo con el termino « Sobrenadante ».

El sedimento se vuelve a suspender en 1 ml de tampon Tris 20 mM, pH 8,5 y la solucion se somete a agitacion durante 1 h a temperatura ambiente en una rueda de agitacion, a razon de 20 revoluciones por minuto. La solucion se centnfuga a continuacion a 16 100 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se extrae y se almacena a - 20 °C hasta el analisis. En lo sucesivo se hara referencia al mismo con la expresion « Fraccion soluble ».

El sedimento entonces se vuelve a suspender en 1 ml de un tampon de desnaturalizacion (500 |jl de Tris 1,25 M, pH 6,5; 500 jl de glicerol; 500 jl de SDS al 20 %; 25 jl de ditiotreftol 1 M; 3 475 jl de H2O) con el fin de solubilizar las proteinas que se hubieran podido agregar durante una etapa cualquiera de tratamiento anterior. La solucion se calienta durante 5 minutos a 100 °C, y se centrifuga a 16 100 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se extrae y se almacena a -20 °C hasta el analisis. En lo sucesivo se hara referencia al mismo con la expresion « Fraccion insoluble ».

El cacahuete crudo no tratado se somete a las mismas etapas de extraccion de las proteinas.

Dosificacion de las proteinas

Las diferentes fracciones extrafdas (Sobrenadante, Fraccion soluble y Fraccion insoluble) se someten a un analisis cuantitativo de proteinas.

El Sobrenadante y la Fraccion soluble se diluyen a la 10a en agua ultra-pura. La Fraccion insoluble se diluye a la 10a en una solucion de yodoacetamida 50 mM y se calienta a 37 °C durante 15 minutos (lo que permite oxidar el ditiotreftol y no interferir con los reactivos de la dosificacion de BCA). El analisis cuantitativo de las proteinas se realiza con la ayuda del kit BCA de Pierce, en una microplaca de fondo plano de 96 pocillos. La gama patron es una solucion de BSA que vana de 0 mg/ml a 2 mg/ml.

Despues de la incubacion de la solucion proteica (25 jl despues de dilucion) y del reactivo de Pierce (200 jl) durante 30 minutos a 37 °C, se hace la lectura de la absorbancia por medio de un lector espectrofotometrico a una longitud de onda de 562 nm.

Las concentraciones de proteinas para las diferentes carceles obtenidas se calculan a partir de la gama patron. Separacion de las proteinas sobre gel

Las proteinas extrafdas previamente se separan sobre geles de poliacrilamida en condiciones de desnaturalizacion. Los geles se constituyen segun las composiciones indicadas en el Ejemplo A que se ha mencionado anteriormente.

Las soluciones proteicas se depositan a concentraciones iguales (20 jg por pocillo) y las diluciones se calculan a partir de la dosificacion al BCA. Las diluciones se llevan a un volumen de 20 jl, con agua como diluyente. Para las fracciones de Sobrenadante y Fraccion soluble, a estos 20 jl se le anaden 4 jl de una solucion de tampon de carga

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(SDS al 2 %; Tris 0,125 M; glicerol al 10 %; p-mercaptoetanol al 5 %, varios cristales de azul de bromofenol) y se calientan durante 5 minutes a 100 °C antes de su deposicion sobre Argel. Para las Fracciones insolubles, a estos 20 |jl se le anaden 4 |jl de una solucion (Tris 0,125 M; glicerol al 10 %, varios cristales de azul de bromofenol) y se depositan directamente sobre el gel.

Las protemas separadas sobre geles a continuacion se colorean segun el protocolo que se ha indicado anteriormente en el Ejemplo A.

Transferencia de Western de las fracciones proteicas despues de fermentacion

Para todas las fracciones (Sobrenadante, Fraccion soluble y Fraccion insoluble), despues de la migracion de las protemas sobre gel de electroforesis SDS-PAGE como se ha indicado anteriormente, el gel no se colorea, y las protemas se electrotransfieren desde este gel sobre una membrana de nitrocelulosa en modo semi-seco, en un tampon de transferencia (Tris 48 mM, glicina 39 mM, metanol al 20% (v/v)) a 20 voltios durante 20 minutos (TransBIot® Turbo®, Biorad®). A continuacion la membrana se colorea en una solucion que contiene un 0,2 % de rojo Ponceau con el fin de verificar la eficacia de la transferencia. Despues de la decoloracion en tampon fosfato salino (PBS) 1x (para 1 litro: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, pH 7,4). Los sitios de fijacion potenciales no utilizados en la membrana se saturan con una solucion de tampon PBS al que se le anade un 5 % (m/v) de leche desatada en polvo, durante una noche a 4 °C.

A continuacion la membrana se expone a un anticuerpo primario espedfico de la protema de interes, obtenido en el Ejemplo B: el anticuerpo primario (combinacion de suero de conejo: Anti-Ara h 1 diluido a 1:40 000, Anti-Ara h 2 diluido a 1:5 000, Anti-Ara h 3 diluido a 1:10 000, diluciones en el tampon de saturacion) se deposita en la membrana durante 2 horas en camara humeda a temperatura ambiente. La membrana se lava a continuacion 3 veces durante 10 minutos en el tampon de saturacion con agitacion (PBS, leche desnatada al 5 % (m/v), Tween 20 al 0,1 % (v/v)) a continuacion se incuba durante 1 hora con un anticuerpo secundario (anti-lgG de conejo) acoplado a la peroxidasa de rabano picante (diluido a 1:2000 en la solucion de saturacion).

Despues de 2 lavados en PBS, Tween 20 al 0,1 %, y dos lavados en PBS solo, las membranas se incuban con un sustrato generando una reaccion quimioluminiscente ECL Plus® (Amersham) durante 1 minuto, y la senal quimioluminescente obtenida se registra con una camara.

Ensayo de ELISA

El ensayo de ELISA permite cuantificar los alergenos residuales despues de la fermentacion por los microorganismos, en cada una de las fracciones, Sobrenadante, Fraccion Soluble y Fraccion insoluble. Este ensayo se realiza por triplicado.

Todas las muestras de ensayo se diluyen en PBS. Las diluciones de los diferentes extractos (Sobrenadante, Fraccion soluble y Fraccion insoluble), asf como un extracto sin procesar de cacahuete no tratado (control) se depositan sobre una placa de 96 pocillos, a razon de 50 jl por pocillo, y a diferentes concentraciones comprendidas entre 0 y 100 ng/jl para la deteccion por el anticuerpo anti-Ara h 1, 0 y 250 ng/jl para anti-Ara h 2 y anti-Ara h 3 en lo que respecta a las fracciones de Sobrenadante y Fraccion soluble, y entre 0 y 600 ng/jl para la Fraccion insoluble, sea cual sea el anticuerpo usado para la deteccion.

Despues de esta primera deposicion, la placa se pone a incubar a 4 °C durante una noche. Despues de la incubacion, la placa se lava tres veces (200 jl/pocillo) con PBS. Los pocillos se ponen a saturar a continuacion con una solucion de PBS, BSA al 1 % (w/v) y Tween al 0,1 % (v/v) (100 jl por pocillo), durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se vuelcan y los pocillos se vadan, y los diferentes sueros se incuban entonces (anti-Ara h 1 diluido a 1:10 000, anti-Ara h 2 diluido a 1:5 000, anti-Ara h 3 diluido a 1:10 000 en PBS/Tween/BSA) durante 2 h a temperatura ambiente, con agitacion (50 jl/pocillo). Las placas se vuelcan enseguida y se lavan 3 veces con una solucion de PBS/Tween/BSA (200 jl/pocillo).

El anticuerpo secundario (anti-lgG de conejo acoplado a la fosfatasa alcalina) se anade a continuacion, a razon de 50 jl por pocillo despues de dilucion a 1:2 000 en PBS/Tween/BSA, y la placa se pone a incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se aclaran a continuacion tres veces con PBS/Tween/BSA (200 jl por pocillo). El sustrato anadido es fosfato de 4-nitrofenilo (pNPP, Sigma), a razon de 100 jl por pocillo. La placa se pone a incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad con agitacion. A continuacion se hace una lectura de la absorbancia a 450 nm en un espectrometro para microplacas.

2/ Resultados

2.1/ Fermentacion por Rhizopus oliaosporus

Despues de 72 horas de fermentacion por Rhizopus oligosporus, y extraccion proteica, siguiendo el protocolo que se ha indicado anteriormente, las protemas de cada fraccion obtenida (Sobrenadante, Fraccion soluble y Fraccion insoluble) se separan por electroforesis SDS-PAGE. El control usado es un extracto proteico de granos de cacahuete crudos.

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El gel obtenido despues de coloracion se muestra en la figura 5.

Ah se observa que para todas las fracciones proteicas obtenidas despues de fermentacion del homogenado (Pistas 3 a 5), con respecto al extracto sin procesar de granos de cacahuete no tratados (Pista 2), las bandas que corresponden a los alergenos principales del cacahuete (aproximadamente 63 kDa para Ara h, aproximadamente 42 y 45 kDa para Ara h 3 y aproximadamente 16 y 17 kDa para Ara h 2) han desaparecido. Estas protemas ya no estan presentes en el fermentado obtenido.

El resultado del analisis por transferencia de Western de estas mismas fracciones se muestra en la figura 6. Ah no se observan, para todos los extractos obtenidos despues de tratamiento por fermentacion (Pistas 2 a 4), ninguna banda de control del enlace de protemas a uno cualquiera de los tres anticuerpos anti-Ara h 1, anti-Ara h 2 o anti- Ara h 3.

Los resultados obtenidos por analisis cuantitativo de ELISA, para cada uno de los anticuerpos anti-Ara h 1, anti- Ara h 2 o anti-Ara h 3, despues de respectivamente 24, 48 y 72 horas de fermentacion, se muestran en la Tabla 1 que sigue a continuacion.

Tiempo de fermentacion Ara h 1 A % Ara h 1 Ara h 2 A % Ara h 2 Ara h 3 A % Ara h 3

Sobrenadante

No tratado 302,7 337 365

24 h

55 -82 % 94 -72 % 79 -78 %

48 h

17 -94 % 58 -83 % 46 -87 %

72 h

10 -97 % 14 -96 % 11 -97 %

Fraccion soluble

No tratado 602,67 337 365

24 h

90 -85 % 85 -75 % 92 -75 %

48 h

48 -92 % 48 -86 % 64 -82 %

72 h

18 -97 % 13 -96 % 16 -96 %

Fraccion insoluble

No tratado 121,33 190 183,33

24 h

78 -36 % 74 -61 % 92 -50 %

48 h

34 -72 % 42 -78 % 36 -80 %

72 h

5 -96 % 9 -95 % 8 -96 %

Tabla 1 - Contenido de Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 de los extractos proteicos despues de fermentacion del homogenado del Ejemplo A por Rhizopus oligosporus, determinado por ensayo ELISA

en el que A representa absorbancia a 450 nm.

Con respecto al extracto proteico obtenido a partir de granos de cacahuete no tratados, se observa, despues de 24 horas de fermentacion, una disminucion significativa del contenido de protemas alergenicas principales, Ara h 1, Ara h 2, y Ara h 3. Para todas las fracciones de extraccion, despues de 72 h de fermentacion con esta disminucion es superior o igual a un 95 % con respecto a los granos de cacahuete no tratados.

El conjunto de los resultados que se ha mencionado anteriormente muestra claramente que la fraccion de fermentado obtenida despues de la trituracion de granos de cacahuetes crudos, homogeneizacion a presion ultra elevada y fermentacion por Rhizopus oligosporus, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, presenta un grado de alergenicidad fuertemente reducido con respecto al cacahuete crudo no tratado de partida. Las principales protemas alergenicas del cacahuete, Ara h 1, Ara h 2, y Ara h 3, se extrajeron de forma eficaz de la matriz solida inicial mediante la homogeneizacion a presion ultra elevada, y fueron degradadas de

5

10

15

20

25

manera eficaz por el microorganismo. Despues de 72 horas de fermentacion, la alergenicidad de la matriz inicial se redujo en al menos un 95 %.

2.2/ Fermentacion por Aspergillus oryzae

Para este microorganismo, se realizaron ensayos, aplicando los protocolos experimentales que se han mencionado anteriormente, por una parte a partir de granos de cacahuete crudos, y por otra parte a partir de granos de cacahuete tostados. El protocolo que se describe en el Ejemplo A se aplico del mismo modo en estos ultimos, con el fin de obtener un homogenado denominado de cacahuete tostado.

Los granos de cacahuete tostados se obtuvieron segun las ensenanzas del documento FR-A-2 713 447.

Despues de 72 horas de fermentacion por Aspergillus oryzae, y extraccion proteica, siguiendo el protocolo que se ha indicado anteriormente, las protemas de cada fraccion obtenida (Sobrenadante, Fraccion soluble y Fraccion insoluble) se separan por electroforesis SDS-PAGE. El control usado es un extracto proteico de granos de cacahuete crudos.

El gel obtenido despues de coloracion se muestra en la figura 7.

Se observa que con respecto al extracto sin procesar de granos de cacahuete no tratados (Pista 2), para todas las fracciones proteicas obtenidas despues de la fermentacion del homogenado, tanto si este ultimo hubiera obtenido a partir de granos de cacahuete crudos (Pistas 3 a 5) o tostados (Pistas 6 a 8), las bandas que corresponden a los alergenos principales del cacahuete (aproximadamente 63 kDa para Ara h, aproximadamente 42-45 kDa para Ara h 3 y aproximadamente 16 y 17 kDa para Ara h 2) han desaparecido. Estas protemas ya no estan presentes en las fracciones fermentadas obtenidas, o estan en cantidad muy baja.

El resultado del analisis por transferencia de Western de estas mismas fracciones se muestra en la figura 8. Aim se observa claramente, para todos los extractos obtenidos despues de tratamiento por fermentacion de granos de cacahuete crudos (Pistas 3 a 5) como de granos de cacahuete tostados (Pistas 6 a 8), que una cantidad claramente menor de protemas interactuan con los anticuerpos anti-Ara h 1, anti-Ara h 2 o anti-Ara h 3, con respecto al extracto obtenido a partir de granos de cacahuete crudos no tratados (Pista 2).

Los resultados obtenidos por analisis cuantitativo de ELISA, para cada uno de los anticuerpos anti-Ara h 1, anti- Ara h 2 o anti-Ara h 3, despues de 72 horas de fermentacion, se muestran en la Tabla 2 que sigue a continuacion.

Ara h 1 A % Ara h 1 Ara h 2 A % Ara h 2 Ara h 3 A % Ara h 3

Sobrenadante

Crudos no tratados 450 493 372

Crudos tratados

26 -94 % 24 -95 % 28 -92 %

Tostados no tratados

181 128 134

Tostados tratados

26 -86 % 23 -82 % 21 -84 %

Fraccion soluble

Crudos no tratados 450 493 372

Crudos tratados

12 -97 % 21 -96 % 16 -96 %

Tostados no tratados

181 128 134

Tostados tratados

30 -83 % 18 -97 % 27 -80 %

5

10

15

20

25

30

Ara h 1 A % Ara h 1 Ara h 2 A % Ara h 2 Ara h 3 A % Ara h 3

Fraccion insoluble

Crudos no tratados 539 273 280

Crudos tratados

47 -91 % 31 -89 % 24 -91 %

Tostados no tratados

301 293 175

Tostados tratados

67 -78 % 65 -78 % 46 -74 %

Tabla 2 - Contenido de Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 de los extractos proteicos despues de fermentacion del homogenado del Ejemplo A (granos crudos) y de un homogenado obtenido con un protocolo similar a partir de granos de cacahuete tostados, por Aspergillus oryzae, determinado por ensayo ELISA

en el que A representa absorbancia a 450 nm.

Con respecto al extracto proteico obtenido a partir de granos de cacahuete no tratados, se observa, despues de 72 h de fermentacion por Aspergillus oryzae, una disminucion muy significativa del contenido de protemas alergenicas principales Ara h 1, Ara h 2, y Ara h 3 en los extractos proteicos obtenidos asf como a partir de granos de cacahuete crudos como de granos de cacahuete tratados.

Estos resultados demuestran que las fracciones fermentadas obtenidas despues de trituracion de granos de cacahuete crudos o tostados, homogeneizacion a presion ultra elevada y fermentacion por Aspergillus oryzae, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, presentan un grado de alergenicidad fuertemente reducido con respecto al cacahuete crudo no tratado. Las principales protemas alergenicas del cacahuete, Ara h 1, Ara h 2, y Ara h 3, se extrajeron de forma eficaz de la matriz solida inicial mediante la homogeneizacion a presion ultra elevada, y fueron degradadas de manera eficaz por el microorganismo. En particular, para los granos crudos, despues de 72 horas de fermentacion, la alergenicidad de la matriz inicial se redujo en al menos un 90 %.

2.3/ Fermentacion por Bacillus subtilis

Despues de 72 horas de fermentacion por Bacillus subtilis, y extraccion proteica, siguiendo el protocolo que se ha indicado anteriormente, las protemas de las dos fracciones obtenidas (Fraccion soluble y Fraccion insoluble) se separan por electroforesis SDS-PAGE. El control usado es un extracto proteico de granos de cacahuete crudos.

El gel obtenido despues de coloracion se muestra en la figura 9.

Ah se observa que para las fracciones proteicas obtenidas despues de la fermentacion del homogenado (Pistas 2 a 4), con respecto al extracto sin procesar de granos de cacahuete no tratados (Pista 1), las bandas que corresponden a los alergenos principales del cacahuete (aproximadamente 63 kDa para Ara h, aproximadamente 42-45 kDa para Ara h 3 y aproximadamente 16 y 17 kDa para Ara h 2) han desaparecido.

El resultado del analisis portransferencia de Western de estas mismas fracciones se muestra en la figura 10. Aim no se observa, para los extractos obtenidos despues de tratamiento por fermentacion (Pistas 2 a 4), ninguna banda de control de la union de protemas a uno cualquiera de los tres anticuerpos anti-Ara h 1, anti-Ara h 2 o anti-Ara h 3.

Los resultados obtenidos por analisis cuantitativo de ELISA, para cada uno de los anticuerpos anti-Ara h 1, anti- Ara h 2 y anti-Ara h 3, despues de 72 horas de fermentacion, se muestran en la Tabla 3 que sigue a continuacion.

Ara h 1 A % Ara h 1 Ara h 2 A % Ara h 2 Ara h 3 A % Ara h 3

No tratado

456 351 382

Sobrenadante Tratado

23 -95 % 18 -95 % 17 -96 %

5

10

15

20

25

30

Ara h 1 A % Ara h 1 Ara h 2 A % Ara h 2 Ara h 3 A % Ara h 3

Fraccion Tratada soluble

24 -95 % 19 -95 % 21 -95 %

Fraccion Tratada insoluble

12 -97 % 15 -96 % 13 -97 %

Tabla 3 - Contenido de Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 de los extractos proteicos despues de fermentacion del homogenado del Ejemplo A por Bacillus subtilis, determinado por ensayo ELISA

en el que A representa absorbancia a 450 nm.

Con respecto al extracto proteico obtenido a partir de granos de cacahuete no tratados, se observa, despues de 72 h de fermentacion, una disminucion significativa del contenido de protemas alergenicas principales Ara h 1, Ara h 2, y Ara h 3. Para todas las facciones de extraccion con esta disminucion es superior o igual a un 95 %.

Los resultados que se han presentado anteriormente muestran claramente que la fraccion de fermentado obtenida despues de la trituracion de granos de cacahuete crudos, homogeneizacion a presion ultra elevada y fermentacion por Bacillus subtilis, segun un modo de realizacion particular del metodo segun la invencion, presenta un grado de alergenicidad fuertemente reducida con respecto al cacahuete crudo no tratado de partida. Las principales protemas alergenicas del cacahuete, Arahl, Ara h 2, y Ara h 3, se extrajeron de forma eficaz de la matriz solida inicial mediante la homogeneizacion a presion ultra elevada, y fueron degradadas de manera eficaz por el microorganismo. Despues de 72 horas de fermentacion, la alergenicidad de la matriz inicial se redujo en al menos un 95 %.

La descripcion que se ha mencionado anteriormente ilustra claramente que, por sus diferentes caractensticas y sus ventajas, la presente invencion consiguio los objetivos que se habfa fijado. En particular, proporciona un metodo de preparacion de un alimento hipoalergico, a partir de una matriz alimentaria solida de alergenicidad elevada, que no es contaminante, y que permite conservar en el alimento las propiedades gustativas, organolepticas y nutricionales de la matriz de partida.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Chung S.-Y., Yang W. (2008) Effects of pulsed UV-light on peanut allergens in extracts and liquid peanut butter. J. Food Chem. 73: C400

Davis P., Williams, S (1998) Protein modification by thermal processing. Allergy 53: 102-105

Kato T., et al. (2000) Release of allergenic proteins from rice grains induced by high hydrostatic pressure. J. Agric. Food Chem. 48: 3124-3129

Lecluse W.J. (1979) Homogeneisateurs a haute pression. Informations Chimie 191: 1-8

Van Boxtel E.L., Koppelman S.J. et al. (2008) Determination of pepsin-susceptible and pepsin-resistant epitopes in native and heat-treated peanut allergen ara h 1. J. Agric. Food Chem. 56: 2223-2230

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo de preparacion de un alimento con alergenicidad reducida a partir de una matriz alimentaria solida con partmulas de alergenicidad mas elevada, que contiene protemas alergenicas, dicha matriz alimentaria siendo a base de granos de cacahuete sin procesar, frutos secos sin procesar o frutas, caracterizado por que dicho metodo comprende una etapa de tratamiento de una dispersion de dicha matriz alimentaria solida en un vehmulo acuoso, por homogeneizacion a alta presion en condiciones hidrodinamicas a una presion comprendida entre 200 y 1000 bares (20 y 100 MPa) y a una temperatura comprendida entre 15 y 90 °C, con el fin de obtener un homogenado constituido por una dispersion de protemas alergenicas contenidas inicialmente en la matriz en mezcla con partmulas solidas de dicha matriz.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado por que la matriz alimentaria solida esta constituida por granos de cacahuete sin procesar y/o frutos secos sin procesar.
3. 3. Metodo segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la matriz alimentaria solida se somete a una etapa de trituracion previamente a la etapa de tratamiento por homogeneizacion a alta presion.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 3, segun el cual la matriz alimentaria solida se somete a dicha etapa de trituracion despues de dispersion en el vehmulo acuoso.
5. 5. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la dispersion de dicha matriz

   alimentaria solida en un vehmulo acuoso comprende una proporcion en peso de matriz alimentaria solida por

   volumen de vehmulo acuoso comprendida entre 50/50 y 5/95.
6. 6. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la etapa de tratamiento por homogeneizacion a alta presion va seguida por una etapa de tratamiento del homogenado obtenido con un agente de degradacion de las protemas.
7. 7. Metodo segun la reivindicacion 6, caracterizado por que el agente de degradacion de las protemas es un agente proteolttico.
8. 8. Metodo segun una de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizado por que el agente de degradacion de las protemas es un microorganismo.
9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, segun el cual dicho microorganismo es un microorganismo probiotico.
10. 10. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, segun el cual dicho microorganismo es una bacteria.
11. 11. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, segun el cual dicho microorganismo es un hongo.
12. 12. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado por que al homogenado se le anade azucar, almidon y/o acido antes de la fermentacion.