ES2683745T3 - Método eficiente y universal para inducir la diferenciación de células nerviosas a partir de células madre pluripotentes - Google Patents
Método eficiente y universal para inducir la diferenciación de células nerviosas a partir de células madre pluripotentes Download PDFInfo
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Abstract
Un método para inducir la diferenciación neural de células madre seleccionadas del grupo que consiste en células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), que comprende las etapas de: (a) inhibir la ruta de señalización de BMP (proteína morfogenética ósea) y activina/nodal en la células madre usando dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamidina; y (b) cultivar las células madre.
Description
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DESCRIPCION
Metodo eficiente y universal para inducir la diferenciacion de celulas nerviosas a partir de celulas madre pluripotentes
Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para inducir la diferenciacion neural de celulas madre seleccionadas del grupo que consiste en celulas madre embrionarias humanas (hESC) y celulas madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC). En mas detalle, la presente invencion se refiere a un metodo para inducir la diferenciacion neural de celulas madre usando dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-iMH-imidazol-2-il)benzamida.
Antecedentes de la tecnica
Las BMP (protemas morfogeneticas oseas) pertenecen a una subfamilia de la superfamilia de TGF-beta (factor de crecimiento transformante beta). La ruta del TGF-beta desempena un papel central en diversas rutas de transducciones de senales que regulan el crecimiento y la diferenciacion en vertebrados e invertebrados. La familia de TGF-beta esta dividida en dos grupos principales; (a) grupo de BMP, y (b) grupo de TGF-beta/activina. Inicialmente, las BMP se han aislado como protemas que inducen la formacion de hueso y condrocito en un cuerpo, y despues se encontro que teman muchas actividades reguladoras durante la morfogenesis del desarrollo de vertebrados e invertebrados. Hasta ahora, se han identificado no menos de 30 tipos de BMP en una variedad de especies incluyendo Drosophila y C. elegans (Ducy P et al, The family of bone morphogenetic proteins. Kidney Int., 57 (6):2207-14 (2000)).
Aunque las BMP se encontraron primero como protemas que inducen la formacion de hueso y cartflago en un cuerpo, varias BMP tienen una actividad biologicamente cntica en varios tipos de celulas incluyendo celulas neurales. Por ejemplo, las BMP se asocian con crecimiento y diferenciacion celular, apoptosis, formacion de neuroectodermo y mesodermo, diferenciacion del sistema nervioso (por ejemplo, testmulos, organos digestivos, rinon, pulmon, dientes, etc.) y la asimetna derecha-izquierda (Wozney JM et al. The bone morphogenetic protein family: multifunctional cellular regulators in the embryo and adult. Eur J Oral Sci., 106: 160-6 (1998)).
La ruta de senalizacion de activina/nodal (miembro de la superfamilia de TGF-p) es esencial para retener la pluripotencia en celulas madre embrionarias humanas y celulas madre de epiblasto de raton. Ademas, la ruta de senalizacion de activina/nodal es importante para desarrollar el mesodermo en vertebrados.
Las celulas madre son un nombre generico para celulas indiferenciadas de una fase anterior a la diferenciacion hacia cada celula que consiste en tejido, y despues diferenciadas a celulas espedficas por estfmulos de diferenciacion espedficos. Comparadas con celulas diferenciadas con division celular detenida, las celulas madre tienen caractensticas de proliferacion (expansion) capaces de producir celulas que se autorrenuevan a traves de division celular, y tambien se pueden diferenciar en otros linajes por estfmulos medioambientales o diferenciales debido al potencial de diferenciacion en celulas espedficas por estfmulos de diferenciacion, lo que sugiere que las celulas madre tiene plasticidad para la diferenciacion.
Recientemente, las celulas madre se han enfocado enormemente en agentes celulares terapeuticos. Practicamente, se han ejecutado activamente muchos estudios para celulas madre como agentes terapeuticos celulares para tratar numerosas enfermedades neurologicas causadas por danos a neuronas. En particular, las enfermedades de nervios craneales se han supuesto como la diana mas adecuada para tratamiento de trasplante celular que otras enfermedades en los sentidos de que se espera que celulas externamente trasplantadas tengan supervivencia a largo plazo ya que el tejido de nervio craneal no muestra casi inmunorechazo a diferencia de otros tejidos.
En relacion a esto, se ha intentado actualmente aplicar celulas madre para tratar un trastorno tal como ictus, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad desmielizante y lesion de la medula espinal (Isacon O, Deacon T, Trends. Neurosci., 10: 477-482 (1997); Studer et al., Nat. Neurosci., 1: 290-295 (1998)).
Mientras tanto, se ha demandado con urgencia una tecnica para diferenciar las celulas madre a celulas espedficas de una manera eficaz para aumentar la utilidad clmica de las celulas madre como agentes terapeuticos celulares.
El documento WO 2005/003320 divulga un metodo para la diferenciacion neural de celulas madre, y en mas detalle, un metodo para inducir que celulas madre se diferencien a celulas neurales que comprende las etapas de: (a) cultivar las celulas madre con factor de crecimiento de fibroblastos basico; (b) cultivar las celulas de la etapa (a) con factor de crecimiento de fibroblastos 8 y Sonic Hedgehog; (c) cultivar las celulas de la etapa (b) con factor neurotrofico derivado de cerebro; y (d) cocultivar las celulas de la etapa (c) con astrocitos. El documento WO 2004/093812 divulga que una nueva clase de compuestos que tiene una formula particular funciona como inductores potentes de neurogenesis en celulas madre embrionarias.
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El documento WO 2004/05308 divulga un metodo para preparar celulas dopaminergicas interrumpiendo la ruta de senalizacion de TGF-p en celulas madre.
Chambers y col. (2009) describe la conversion neural de celulas ES e iPS humanas por inhibicion dual de la senalizacion de SMAD (Chambers et al. (2009) "Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling." Nat Biotechnol; 27(3):275-80).
Desafortunadamente, no se ha descrito todavfa una tecnologfa con mayor eficacia para diferenciar todas las celulas madre a celulas espedficas (en particular, celulas neurales).
Descripcion detallada de la invencion
Los presentes inventores han hecho estudios intensos para desarrollar un metodo para inducir de forma eficaz la diferenciacion de celulas madre pluripotentes a celulas precursoras neurales de una manera muy eficaz. Como resultados, hemos descubierto un metodo para minimizar la probabilidad intrincada de que otros linajes celulares y celulas indiferenciadas esten contenidos en las celulas diferenciadas a partir de celulas madre y para inducir diferenciacion neural directa de las celulas madre para reducir el desarrollo de teratoma que puede estar causado por el trasplante.
Segun esto, es un objeto de esta invencion proporcionar un metodo para inducir diferenciacion neural de celulas madre.
Es otro objeto de esta invencion proporcionar una composicion para inducir la diferenciacion neural de celulas madre.
Otros objetos y ventajas de la presente invencion seran aparentes a partir de la siguiente descripcion detallada junto con las reivindicaciones y dibujos adjuntos.
En un aspecto de esta invencion, se proporciona un metodo para inducir la diferenciacion neural de celulas madre seleccionadas del grupo que consiste en celulas madre embrionarias humanas (hESC) y celulas madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), que comprende las etapas de: (a) inhibir la ruta de senalizacion de bMp (protema morfogenetica osea) y activina/nodal en celulas madre usando dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il- 1H-imidazol-2-il)benzamida; y (b) cultivar las celulas madre.
En otro aspecto de esta invencion, se proporciona un uso de dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il- 1H-imidazol-2-il)benzamida para fabricar una composicion para inducir la diferenciacion neural de celulas madre seleccionadas del grupo que consiste en celulas madre embrionarias humanas (hESC) y celulas madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).
Los presentes inventores han hecho estudios intensos para desarrollar un metodo para inducir de forma eficaz la diferenciacion de celulas madre pluripotentes a celulas precursoras neurales de una manera muy eficiente. Como resultados, hemos descubierto un metodo para minimizar la probabilidad intrincada de que otros linajes celulares y celulas indiferenciadas esten contenidos en las celulas diferenciadas a partir de celulas madre y para inducir diferenciacion neural directa de las celulas madre para reducir el desarrollo de teratoma que puede estar causado por el trasplante.
El termino “diferenciacion neural dirigida de celulas madre” usado en el presente documento incluye no solo una diferenciacion completa de celulas madre a celulas espedficas, sino tambien que se formen celulas precursoras neurales en un estadio intermedio antes de la diferenciacion completa. En otras palabras, el metodo de la presente invencion para inducir una diferenciacion dirigida de celulas madre no solo contribuye a una diferenciacion completa de las celulas madre a celulas espedficas de una manera eficaz, sino que tambien tiene una eficacia mucho mayor en la formacion de precursores neurales a partir de celulas madre. Espedficamente, el metodo descrito en el presente documento para formar precursores neurales usando inhibicion de la ruta de senalizacion de BMP y activina/nodal no tiene limitacion tecnica y se puede usar junto con metodos convencionales para diferenciar precursores neurales de una manera muy eficaz.
Las celulas madre que se pueden diferenciar por la presente invencion se seleccionan del grupo que consiste en celulas madre embrionarias humanas (hESC) y celulas madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), y las celulas a las que se puede aplicar la presente invencion tienen propiedades de celulas madre: (a) no diferenciacion; (b) potencial para proliferacion indefinida; y (c) capacidad de diferenciacion a celulas espedficas. Las celulas madre incluyen celulas madre embrionarias y celulas madre pluripotentes inducidas. El termino “celulas madre pluripotentes inducidas” usado en el presente documento se refiere a un tipo de celulas madre pluripotentes artificialmente derivadas de celulas no pluripotentes (por ejemplo, celulas somaticas) por insercion de un gen espedfico. En general, se ha aceptado en la tecnica que las celulas madre pluripotentes inducidas son equivalentes a celulas madre pluripotentes (por ejemplo, celulas madre embrionarias), dado que las celulas madre pluripotentes inducidas
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tienen las caractensticas de: (a) expresion genica y de protemas de celulas madre; (b) metilacion cromosomica; (c) tiempo de duplicacion; (d) formacion de embrion; (e) formacion de teratoma; (f) formacion de quimera variable; (g) hibridoma; y (h) diferenciacion.
Como se demuestra en los ejemplos posteriormente, es una de las ventajas de la presente invencion proporcionar un protocolo de diferenciacion universal que se puede aplicar a todos los tipos de celulas madre incluyendo celulas madre embrionarias y celulas madre pluripotentes inducidas.
Segun el metodo descrito en el presente documento, la ruta de senalizacion de BMP y activina/nodal se bloquea para la diferenciacion neural de celulas madre.
Una sustancia para bloquear la ruta de senalizacion de BMP incluye varios inhibidores de la ruta de senalizacion de BMP que conocen los expertos en la materia. El termino “un inhibidor de la ruta de senalizacion de BMP” usado en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe preferiblemente BMP en si misma o la union de BMP a un receptor de BMP. El inhibidor de la ruta de senalizacion de BMP utilizado en la presente invencion incluye dorsomorfina.
Para bloquear la ruta de senalizacion de BMP de celulas madre en la presente invencion, una concentracion adecuada de dorsomorfina esta en un intervalo de preferiblemente 1-20 jM, mas preferiblemente 3-10 jM, y lo mas preferiblemente, 4-6 jM.
Una sustancia para inhibir la ruta de senalizacion de activina/nodal puede incluir varios inhibidores de la ruta de senalizacion de activina/nodal que conocen los expertos en la materia. El termino “ruta de senalizacion de activina/nodal” usado en el presente documento se refiere a la ruta de senalizacion de activina y/o la ruta de senalizacion de nodal. El termino “un inhibidor para la ruta de senalizacion de activina/nodal” usado en el presente documento significa una sustancia que inhibe preferiblemente activina/nodal en sf mismo o la union de activina/nodal a un receptor de activina/nodal. El inhibidor de la ruta de senalizacion de activina/nodal utilizado en la presente invencion es 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamida. El tratamiento con el compuesto mencionado anteriormente es mas eficaz que el tratamiento con protema.
Para inhibir la ruta de senalizacion de activina/nodal de celulas madre en la presente invencion, una concentracion adecuada de 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamida esta un intervalo de preferiblemente 1-50 jM, mas preferiblemente de 5-30 jM, mucho mas preferiblemente 8-20 jM, y los mas preferiblemente, 9-11 jM.
La anteriormente descrita 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamida esta representada por la siguiente formula 1:
En la descripcion detallada de la presente invencion, el compuesto representado por la formula 1 se puede usar de forma intercambiable con SB431542.
Segun una forma de realizacion preferible, la etapa (a) se realiza cultivando las celulas madre durante la embriogenesis o un proceso de cultivo de embriones formados, e incluye ademas la etapa en la que se forman los embriones en los que el neuroectodermo esta muy desarrollado por la etapa (a).
Segun una forma de realizacion preferible, la etapa (b) para cultivar incluye ademas las etapas de: (b-1) proliferacion de celulas precursores neurales cultivando en presencia de bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos basico) los embriones en los que el neuroectodermo esta muy desarrollado; (b-2) inducir celulas precursoras de dopamina cultivando las celulas precursoras neurales en presencia de Sonic hedghog (Shh) y FGF 8 (factor de crecimiento de fibroblastos 8); y (b-3) formar neuronas dopaminergicas cultivando las celulas precursoras de dopamina en presencia de factor de crecimiento neurotrofico derivado de glfa (GDNF), factor neurotrofico derivado de cerebro (BDNF) y acido ascorbico.
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Preferiblemente, la concentracion de bFGF anadido en la etapa para proliferar los precursores neurales se utiliza en un intervalo de 5-100 ng/ml, mas preferiblemente 10-50 ng/ml, mucho mas preferiblemente 15-30 ng/ml, y lo mas preferiblemente, 19-21 ng/ml.
Preferiblemente, la concentracion de Sonic hedghog anadido en la etapa para proliferar los precursores dopaminergicos se utiliza en un intervalo de 50-500 ng/ml, mas preferiblemente 100-300 ng/ml, mucho mas preferiblemente 150-250 ng/ml, y lo mas preferiblemente, 190-210 ng/ml.
La concentracion de FGF8 anadido en la etapa para proliferar los precursores dopaminergicos se utiliza en un intervalo de 10-300 ng/ml, mas preferiblemente 50-100 ng/ml, mucho mas preferiblemente 80-150 ng/ml, y lo mas preferiblemente, 90-110 ng/ml.
Preferiblemente, la concentracion de BDNF anadido en la etapa para formar las neuronas dopaminergicas se utiliza en un intervalo de 5-100 ng/ml, mas preferiblemente 10-80 ng/ml, mucho mas preferiblemente 15-50 ng/ml, y lo mas preferiblemente, 19-21 ng/ml.
Preferiblemente, la concentracion de GDNF anadido en la etapa para formar las neuronas dopaminergicas se utiliza en un intervalo de 5-100 ng/ml, mas preferiblemente 10-80 ng/ml, mucho mas preferiblemente 15-50 ng/ml, y lo mas preferiblemente, 19-21 ng/ml.
La concentracion de GDNF anadido en la etapa para formar las neuronas dopaminergicas se utiliza en un intervalo de 50-500 ng/ml, mas preferiblemente 100-300 ng/ml, mucho mas preferiblemente 150-250 ng/ml, y lo mas preferiblemente, 190-210 ng/ml.
Segun una forma de realizacion preferible, la expresion de Sox1, Pax6, y nestina esta muy aumentada en la diferenciacion neural de celulas madre en la presente invencion comparado con esas tratadas sin dorsomorfina y 4- (5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamida
Segun una forma de realizacion preferible, la expresion de Id1, Id3, GCM1 y GATA2 se reduce significativamente en la diferenciacion neural de celulas madre en la presente invencion comparado con esas tratadas sin dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamida.
Segun la presente invencion, puede ser posible diferenciar varias celulas madre (por ejemplo, celulas madre embrionarias y celulas madre pluripotentes inducidas) a nivel similar de neuronas dopaminergicas.
Las celulas neurales obtenidas por la presente invencion se pueden aplicar a tratar trastornos neurodegenerativos, por ejemplo, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad desmielizante y esclerosis lateral amiotrofica.
Las caractensticas y ventajas de esta invencion se resumen como sigue:
(a) La presente invencion proporciona un metodo y una composicion para inducir diferenciacion neural de celulas madre.
(b) La presente invencion permite que dos tipos de celulas madre se diferencien de forma eficaz en celulas precursoras neurales independientemente de metodos convencionales para la diferenciacion de celulas madre incluyendo cultivo flotante y cultivo adherente.
(c) Ademas, puesto que las celulas precursoras neurales inducidas por la presente invencion se pueden diferenciar en celulas espedficas (por ejemplo, neuronas dopaminergicas) u oligodendrocitos de una manera mas eficaz, se pueden aplicar para el tratamiento de enfermedades nerviosas incurables (por ejemplo, enfermedad de Parkinson o lesion de la medula espinal) y ademas proporcionar datos fundamentales sobre desarrollo de nuevos farmacos.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1a-1d representan los resultados de examinar la propension a la diferenciacion de un total de 6 lmeas de hESC (H9, Miz-hES4 y 6, SNU-hES3 y 16, CHA-hES3) y 3 lmeas de iPSC humanas (BJ1-iPS12, MSC-iPS2-3, dHif- iPS2-2) usando qRT-PCR. La figura 1a representa los niveles de expresion de neuroectodermo representativo (Sox1), y la figura 1b represente los niveles de mesodermo representativo (Brachyury). La figura 1c y la figura 1d representan los niveles de expresion de endodermo representativo (GATA4) y marcador de no diferenciacion (Oct4), respectivamente. El eje y representa medias ± e.e.m de nivel de expresion relativo de cada gen sobre el menor (designado arbitrariamente como 1) entre las lmeas celulares ensayadas. La significacion estadfstica se estimo usando la prueba ANOVA (analisis de varianza) unidireccional con multiples comparaciones entre las lmeas. Para reducir una tasa de error de tipo I, se aplico la correccion de Bonferroni como post hoc. Sfmbolo: Miz6, Miz-hES6; Miz4, Miz-hES4; SNU3, SNU-hES3; SNU16, SNU-hES16; CHA3, CHA-hES3; B31-12, B31-iPS12; MSC2-3, MSC- iPS2-3; dHlf2-2, dHlf-iPS2-2.
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Las figuras 2a-2b representan los resultados de reducir la diferenciacion neural de celulas madre por tratamiento de DM que inhibe de forma eficaz la cascada de senalizacion de BMP endogena. Cuatro d^as despues de la diferenciacion espontanea en presencia o ausencia de DM, se midio el nivel de expresion de varios marcadores desde EB por qRT-PCR. La figura 2a muestra que los niveles de expresion de los genes Id1 e Id3, indicadores de actividad senalizadora de BMP, disminuyeron por el tratamiento de DM (0,1-5 jM) de una manera dependiente de la dosis. Se uso un jg/ml de nogina como control positivo, La figura 2b representa que los niveles de expresion de marcadores neuroectodermicos (Pax6 y Nestina) aumentaron el dfa 4 de tratamiento de DM. El eje y de los graficos representa el nivel de expresion relativo de cada gen despues de tratamiento con DM o nogina comparado con tratamiento con DMSO (dimetilsulfoxido). Sfmbolo: DM, dorsomorfina; NOG, nogina (* p<0,05, ** p<0,01 comparado con el grupo control, prueba ANOVA).
La figura 3 es un resultado de inhibir la diferenciacion de hECS (H9) a trofoblastos por modulacion de las rutas de senalizacion tanto de BMP como de activina/nodal. Se cultivaron EB durante 10 dfas con o sin DM (5 jM) y SB431542 (5-10 jM) y se examino el nivel de expresion de dos marcadores representativos de trofoblastos (GATA2 y GCM1) por qRT-PCR.
Las figuras 4a-4c representan que la inhibicion de las rutas de senalizacion tanto de BMP como de activina/nodal fomenta significativamente la diferenciacion de hECS (H9) a linaje neuroectodermico, ademas de inducir diferenciacion a neuronas. Despues de cultivar durante 4 dfas con o sin Dm (5 jM) y SB431542 (5-10 jM), los EB se adhirieron a una placa de cultivo y se cultivaron adicionalmente en medio de induccion neural (medio N2 suplementado con bFGF 20 ng/ml) durante 6 dfas. H9 y Miz-hES6 se desarrollaron hasta aproximadamente el 90% de colonias numerosas con una estructura de roseta neural (figuras 4a-4b). Por el contrario, el 2,6-25,5% de las colonias desarrolladas de celulas Miz-hES4, BJI-iPS12 y MSC-iPS2-3 teman varias formas celulares no neurales con una estructura de roseta neural. Estos resultados demuestran que la propension a la diferenciacion de hPSC se mantiene todavfa despues de realizar un protocolo de diferenciacion por induccion, asf como diferenciacion espontanea (panel superior en la figura 4a). Sorprendentemente, el tratamiento qmmico (DM y SB431542) a EB durante 4 dfas lleva a la induccion eficaz e igual de la formacion de roseta neural en la mayona de las colonias de celulas usadas en los experimentos (panel inferior en la figura 4a). Las estructuras de roseta neural se inmunotineron con anticuerpo anti-nestina (verde) y anti-Sox1 (rojo) (vease una foto insertada en BJI-iPS12 en la figura 4a). La figura 4b representa un porcentaje de colonias con estructura de roseta neural despues de la diferenciacion neural de 5 lmeas celulares de hPSC en presencia o ausencia de DM y SB431542. La figura 4c es qRT-PCR que representa que la expresion de los marcadores de neuroectodermo (Sox1, Pax6 y nestina) estan significativamente aumentados en celulas Miz-hES4, BJI-iPS12 y MSC-iPS2-3 qmmicamente tratadas (DM+SB431542) comparadas con celulas tratadas con vehfculo (DMSO) en la induccion de diferenciacion. Por el contrario, la expresion de marcadores de endodermo, mesodermo, trofoblasto y no diferenciacion se redujo en celulas Miz-hES4, BJI-iPS12 y MSC-iPS2-3 qmmicamente tratadas (DM+SB431542) comparadas con celulas tratadas con vehfculo (DMSO). El aumento en veces relativo de la expresion genica en el grupo qmmicamente tratado (DM+SB431542) sobre el grupo tratado con vehfculo (DMSO) se represento en una escala logantmica. Al menos se llevaron a cabo tres experimentos (Barra de escala: 20 jm).
Las figuras 5a-5c muestran la diferenciacion eficaz de NP producidos por la inhibicion de la ruta de BMP y activina/nodal a neuronas DA. La figura 5a representa esquematicamente un protocolo de diferenciacion hacia neurona DA. La figura 5b muestra que el numero de neuronas Tuj1 y TH positivas (que expresan una tirosina hidroxilada que sintetiza dopamina) esta notablemente aumentado en el grupo qmmicamente tratado (DM+SB431542) comparado con el grupo tratado con vehfculo (DMSO) usando analisis inmunocitoqmmicos. La figura 5c representa el aumento marcado en celulas neurales Tuj1-postivas a partir de las celulas iPSC humanas (MSC-iPS2-3) tratadas con (DM+SB431542) (50,7 ± 2,2% de celulas totales) comparado con las celulas tratadas con vehfculo (DMSO) (2,6 ± 0,5% de las celulas totales). El numero de celulas de cada grupo tratado con (DM+SB431542) y vehfculo (DMSO) es 17.711 y 9.233, que se calcula de tres experimentos independientes. La mayona de las celulas Tuj1-positivas (49,5 ± 6,8%) son neuronas TH+. las neuronas Th+ casi no se detectaron en el grupo control tratado con DMSO (** p<0,01; barra de escala: 50 jm).
Las figuras 6a-6d muestran la diferenciacion de hECS (H9) a linaje neuroectodermico por modulacion de las rutas de senalizacion tanto de BMP como actina/nodal. La figura 6a representa que la expresion de marcadores neuroectodermicos (Sox1, y nestina) esta aumentada despues de cultivar EB en medio EB tratado con DM durante 10 dfas mientras que la expresion de marcadores de mesodermo (Brachyury y Cerberus), endodermo (GATA4 y AFP) y no diferenciacion (Oct4 y Nanog) esta inhibida. La figura 6b es un analisis inmunocitoqmmico que muestra que celulas indiferenciadas (doble positivo para Oct4 y SSEA4) y celulas de endodermo (positivas para AFP; puntas de flecha rojas) se detectan en una porcion de EB tratados con Dm 10 jM durante 10 dfas. La figura 6c muestra que la expresion de marcadores neurales estaba notoriamente aumentada por tratamiento tanto con DM como SB431542 durante 10 dfas, mientras que la expresion de marcadores de otros linajes e indiferenciadas estaba significativamente reducida, La figura 6d es un analisis inmunocitoqmmico que muestra que la expresion de Pax6 y nestina esta aumentada en celulas tratadas con (DM+SB431542) comparada con EB tratados con DMSO. El eje y en el grafico de la figura 6a y 6c representa el cambio en veces en expresion genica entre muestras tratadas qmmicamente y control de tres experimentos independientes. DM y SB indican dorsomorfina y SB431542, respectivamente. barra de escala, 100 jm.
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Las figuras 7a-7b representan los resultados de inducir diferenciacion neural de varias lmeas celulares de hPSC que tienen propension a la diferenciacion por inhibicion de las rutas de senalizacion tanto de BMP como actina/nodal. La figura 7a es un grafico que representa que la expresion de marcadores de neuroectodermo esta marcadamente aumentada en lmeas celulares de hPSC qmmicamente tratadas (DM+SB431542), mientras que la expresion de marcadores de endodermo, mesodermo, trofoblasto e indiferenciada estaban significativamente reducidos en celulas tratadas con vehmulo (DMSO). El eje y es una escala logantmica que muestra medias ± e.e.m del aumento en veces relativo de la expresion genica entre celulas tratadas con moleculas pequenas y tratadas con vehmulo (DMSO) (designado arbitrariamente como 1). La figura 7b es fotograffas de secciones de EB de 4 lmeas de hPSC (H9, Miz- hES6, BJ1-iPS12, y MSC-iPS2-3) inmunotenidas con anticuerpo anti-nestina. DM y SB indican dorsomorfina y SB431542, respectivamente. Barra de escala, 100 pm.
La figura 8 es un analisis de inmunotincion que muestra que se recogen NPC de celulas madre embrionarias humanas (Miz-hES6) y celulas madre pluripotentes inducidas humanas (BJ1-iPS12) por ruta de senalizacion de BMP y ruta de senalizacion de activina/nodal, respectivamente, induciendo diferenciacion de NPC a neuronas (Tuj1- positivas), celulas de neuroglia (GFAP-positivas) y oligodendrocitos (O4-positivos). Barra de escala, 25 pm.
La presente invencion se describira ahora en mas detalle mediante ejemplos. Sena obvio para los expertos en la materia que se pretende que estos ejemplos sean ilustrativos.
Ejemplos
Materiales y metodos
Cultivo de hESC (no ilustrativo del objeto reivindicado) y hiPSC
Las 6 lmeas de hESC usadas en este estudio, H9 (P31-45, WiCell Inc, Madison, EE UU), Miz-hES4 (P67-75) y Miz- hES6 (P34-45) (MizMedi Hospital, Seul, Corea), CHA-hES3 (P88-93, CHA Hospital, Seul, Corea), SNU-hES3 (P3036) y SNU-hES16 (P71-76) (Hospital de la Universidad National de Seul, Seul, Corea), se cultivaron rutinariamente en medio DMEM-F12 suplementado con KSR al 20% (sustituto de suero knockout; Invitrogen, Carlsbad, EE UU), aminoacidos no esenciales 1x (Invitrogen), beta-mercaptoetanol 0,1 mM (Sigma St. Louis, EE UU), y 4 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF; Invitrogen, EE UU). La mayona de las lmeas celulares hESC se hicieron crecer sobre la capa de fibroblastos embrionarios de raton mitoticamente detenidos (MEF; MCTT; Seul), excepto las lmeas celulares SNU-hES3 y SNU-hES16 que se cultivaron en celulas soporte STO (ATCC, Manassas, EE UU). Las colonias de hESC se transfirieron a una capa de celulas soporte reciente cada 5-7 dfas por pase mecanico como se ha descrito previamente [1]. Tres iPSC humanas, dHlf-iPS2-2, MSC-iPS2-3, y BJ1-iPS12 [2] eran del laboratorio del Dr. George Daley en la Facultad de Medicina de Harvard y se cultivaron en las mismas condiciones que las hESC (Vease, Nature, 451 (7175): 141-6 (2008); Nat Protoc., 3 (7): 1180-6 (2008)).
Diferenciacion espontanea de hPSC a celulas neurales
La formacion de EB (cuerpos embrioides) a partir de colonias de hESC y hiPSC se inicio separando las colonias de las celulas soporte por tratamiento de 2 mg/ml de colagenasa de tipo IV (Invitrogen, EE UU) durante 30 min y transferencia de las colonias a placas Petri que contienen medio de cultivo de hESC normal sin bFGF (medio EB). Para examinar el efecto de dorsomorfina (DM) (tambien conocida como compuesto C; Sigma, EE UU) y SB431542 (Calbiochem, San Diego, CA, EE UU) en la diferenciacion espontanea, varias concentraciones de DM y SB431542 se anadieron en el medio EB durante el cultivo de EB de 10 dfas con cambio de medio cada 2 dfas. La expresion de varios marcadores se analizo por qRT-PCR e inmunocitoqmmica.
Diferenciacion espontanea de hPSC a neuronas DA (dopaminergicas)
Despues de la diferenciacion espontanea durante 10 dfas, las celulas precursoras neurales (NPC) formadas en los EB se expandieron en cultivo en suspension en medio N2 (DMEM-F12 & suplemento N2 1x, Invitrogen) que contema bFGF (20 ng/ml, Invitrogen) durante 8-10 dfas adicionales, con cambio de medio en dfas alternos. Las NPC expandidas se trituraron despues con pipeteo suave y se sembraron en cubreobjetos recubiertos con Matrigel (BD Scientific, Bedford, EE UU) a una densidad de 0,5-2 * 106 celulas/cm2. Despues de ello, las celulas precursoras de DA se cultivaron durante 8 dfas en medio N2 suplementado con medio N2 que contema 500 ng/ml de Sonic hedgehog (Shh; R&D Systems, Minneapolis, MN, EE UU) y 100 ng/ml de FGF8 (factor de crecimiento de fibroblastos 8; R&D Systems). Para la maduracion dopaminergica, las celulas precursoras de DA se pusieron en medio DMEM/F12 suplementado con N2 1x, factor neurotrofico derivado de glfa (GDNF; R&D Systems) 20 ng/ml, factor neurotrofico derivado de cerebro (BDNF; R&D Systems) 20 ng/ml y acido ascorbico (Sigma) 200 pM.
Diferenciacion neural dirigida de hPSC
La diferenciacion dirigida de hPSC en celulas de linaje neural se realizo usando el metodo previamente descrito con modificacion menores [3]. Brevemente, los EB se cultivaron en suspension durante 4 dfas en medio EB con y sin DM
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5 |jM y SB431542 5-10 |jM, y despues se cultivaron en placa recubierta de Matrigel en medio N2 suplementado con bFGF 20 ng/ml durante 6 d^as adicionales. Se analizaron muestras por recuento de colonias, inmunocitoqmmica y qRT-PCR.
Inmunotincion y analisis cuantitativo
Las celulas se fijaron en solucion de paraformaldetHdo al 4%/PBS durante 10 min. Los EB tambien se fijaron en el mismo fijador durante 1 h, se crioprotegieron con sacarosa al 20%, se congelaron en compuesto O.T.C. (Tissue Tek, Torrance, EE UU), y se hicieron secciones a un espesor de 10 jm con un criostato. Las secciones se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1%/PBS (para marcadores intracelulares), se bloquearon con suero de burro normal al 5% (Calbiochem, CA, EE UU) durante 1 h a temperatura ambiente, y despues se trataron con anticuerpos primarios a 4°C durante la noche. Los anticuerpos primarios usados en nuestro estudio fueron como sigue: Oct4 (dilucion 1:100; Santa Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, EE UU); SSEA4 (dilucion 1:500; Santa Cruz Biotechnology); Sox1 (dilucion 1:200; Millipore, Billerica, MA, EE UU); Pax6 (dilucion 1:200; DSHB, Iowa, IA, EE UU), Nestina (dilucion 1:1000; Millipore); a-fetoprotema (AFP; dilucion 1:100; Santa Cruz Biotechnology); Tuj1 (dilucion 1:1000; Covance, Berkeley, Ca, EE UU); GFAP (dilucion 1:300; Millipore), O4 (dilucion 1:200; R&D systems) y tirosina hidroxilasa (TH; dilucion 1:500, Millipore; o 1:300, Pelfreez, Rogers, AR, EE UU). Despues de la incubacion con el anticuerpo primario, los anticuerpos secundarios etiquetados con fluorescencia (Alexa-Fluor®-488 o 594) apropiados (Molecular Probes, Eugene, OR, EE UU) se usaron para visualizacion. Las celulas se trataron con DAPI (4',6-diamino-2-fenilindol; Vector, Burlingame, CA, EE UU) durante 5 min durante el procedimiento de tincion para visualizar los nucleos. Las imagenes celulares se capturaron con microscopio Olympus IX17 y camara digital DP71, y se analizaron mediante Image-Pro Plus ver 5.1 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, Ee UU). La evaluacion cuantitativa se realizo por recuento de celulas o colonias inmunomarcadas de tres experimentos independientes. Los valores se expresaron como medias ± e.e.m. Se uso la prueba de la t de Student o la prueba ANOVA unidireccional usando el software SPSS version 12.0 para determinar la significacion estadfstica.
RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) y analisis de datos
Se extrajeron ARN totales usando un kit de purificacion de ARN total Easy-Spin® (iNtRON Bioitechnology, Seul, Corea) segun las instrucciones del fabricante y despues 1 jg de los ARN totales se sometieron a transcripcion inversa con el kit de smtesis de ADNc Power (iNtRON Bioitechnology). Se realizo qRT-PCR usando SYBR Premix Ex Taq™ (Takara Bio Inc., Shiga, Japon) y la reaccion se llevo a cabo usando el sistema de tiempo real My-iQ o CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE uU) en las siguientes condiciones: (etapa 1) 1 min a 95°C; (etapa 2) 40 ciclos de 20 s a 95°C, 20 s a 63°C y 20 s a 72°C; (etapa 3) extension final durante 1 min a 72°C. Se recogieron valores de expresion (valores Ct) de genes marcadores espedficos y se normalizaron segun los de p-actina. A continuacion, los niveles de expresion normalizados de los marcadores se compararon entre muestras qmmicamente tratadas y muestras control tratadas con vehfculo segun el metodo AACt [4]. Todos los datos se confirmaron mediante al menos tres experimentos independientes. Las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla 1.
Tabla 1
- Gen
- Secuencia del cebador (5'^3')
- Id-120
- Directo ggtgcgctgtctgtctgag (SEQ ID NO:1)
- Inverso
- ctgatctcgccgttgagg (SEQ ID NO:2)
- Id-320
- Directo ctggacgacatgaaccactg (SEQ ID NO:3)
- Inverso
- gtagtcgatgacgcgctgta (SEQ ID NO:4)
- Sox1
- Directo gagattcatctcaggattgagattcta (SEQ ID NO:5)
- Inverso
- ggcctactgtaatcttttctccac (SEQ ID NO:6)
- Pax6
- Directo gcggaagctgcaaagaaata (SEQ ID NO:7)
- Inverso
- tttggctgctagtctttctcg (SEQ ID NO:8)
- Nestina
- Directo tgcgggctactgaaaagttc (SEQ ID NO:9)
- Inverso
- aggctgagggacatcttgag (SEQ ID NO:10)
- Brachyury
- Directo aggtacccaaccctgagga (SEQ ID NO:11)
- Inverso
- gcaggtgagttgtcagaataggt (SEQ ID NO:12)
- Cerberus21
- Directo acagtgcccttcagccagact (SEQ ID NO:13)
- Inverso
- acaactactttttcacagccttcgt (SEQ ID NO:14)
- AFP
- Directo tgcaaacgatgaagcaagag (SEQ ID NO:15)
- Inverso
- aacaggcctgagaaatctgc (SEQ ID NO:16)
- GATA4
- Directo gtcatctcactacgggcaca (SEQ ID NO:17)
- Inverso
- cttcagggccgagaggac (SEQ ID NO:18)
- Sox17
- Directo ggcgcagcagaatccaga (SEQ ID NO:19)
- Inverso
- ccacgacttgcccagcat (SEQ ID NO:20)
- GCM122
- Directo ctctgaagctcatcccttgcc (SEQ ID NO:21)
- Inverso
- tggacgccttcctggaaagac (SEQ ID NO:22)
- GATA222
- Directo agaaccgaccactcatcaagcc (SEQ ID NO:23)
- Inverso
- tgctcttcttggacttgttggac (SEQ ID NO:24)
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- Oct4
- Directo tgggctcgagaaggatgtg (SEQ ID NO:25)
- Inverso
- gcatagtcgctgcttgatcg (SEQ ID NO:26)
- Nanog
- Directo ccaacatcctgaacctcagc (SEQ ID NO:27)
- Inverso
- gctattcttcggccagttgt (SEQ ID NO:28)
- B-actina
- Directo gctcttttccagccttcctt (SEQ ID NO:29)
- Inverso
- cttctgcatcctgtcagcaa (SEQ ID NO:30)
Los supermdices indican referencia contenida en los ejemplos de la presente invencion.
Resultados
Para aplicaciones terapeuticas, la diferenciacion eficaz de hPSC (es decir, hESC y iPSC humanas) a tipos celulares deseables espedficos es un prerrequisito. Un artmulo reciente demostro que cada lmea de hESC tiene su propia inclinacion de diferenciacion hacia linajes celulares espedficos [5]. Tambien se pudieron detectar diferencias significativas en la propension a la diferenciacion entre 6 lmeas de hESC (no ilustrativo del objeto reivindicado) generadas por 4 instituciones. Ademas, notamos que 3 lmeas de iPSC humanas derivadas de diferentes tipos celulares somaticos tambien reteman su propio potencial para diferenciarse en linajes celulares espedficos (Fig. 1). Puesto que esta propension innata con frecuencia afectana de forma negativa a la diferenciacion en linajes celulares deseados, todas las lmeas de hESC y iPSC podnan necesitar ser examinadas para su propension a la diferenciacion de modo que se puedan elegir lmeas celulares apropiadas para cada aplicacion terapeutica. Puesto que este proceso de cribado es laborioso, lleva mucho tiempo, y es costoso, sena de gran beneficio si hay una manera de inducir la diferenciacion de todas la hPSC a un linaje celular espedfico de interes, independientemente de su propension a la diferenciacion original. Como un experimento de prueba de principio, pretendimos establecer un protocolo universal que dirige todas las lmeas de hPSC con varias propensiones a la diferenciacion hacia el linaje neural (es decir, la formacion de precursores neurales (NP)). Nuestra estrategia para generar tal protocolo tan ampliamente aplicable para diferenciacion neural era manipulando rutas de senalizacion implicadas de forma cntica en induccion neural embrionaria con pequenas moleculas.
Para iniciar la diferenciacion, fragmentos de colonias de hESC H9 mecanicamente cortados se cultivaron en suspension como cuerpos embrioides (EB). Normalmente, los EB hechos crecer en una condicion de diferenciacion espontanea que no contienen ningun factor de crecimiento inductor de linaje dan baja eficiencia de diferenciacion neural, aunque la eficiencia vana dependiendo de la propension a la diferenciacion de cada lmea de hESC. En un intento de fomentar la diferenciacion neural a costa de otros linajes celulares, primero determinamos bloquear la ruta de senalizacion de la protema morfogenetica osea (BMP) durante la formacion de EB. Se sabe que la inhibicion de la senalizacion de BMP desempena un papel en la induccion neural durante el desarrollo embrionario temprano [6, 7]. Para este fin, se uso dorsomorfina (DM), un antagonista de BMP de molecula pequena selectivo [8], en lugar de nogina, un inhibidor de BMP polipeptfdico, ya que las moleculas pequenas son mas facilmente accesibles a las celulas dentro de los EB [9]. Primero confirmamos la eficacia de DM mostrando que un tratamiento de 4 dfas de EB con DM (0,1-5 jM) disminrna el nivel de expresion de los genes Id1 e Id3, los indicadores de la actividad senalizadora de BMP, de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2a). A continuacion, encontramos que el tratamiento con DM aumento los marcadores neurales tal como Pax6 y nestina en EB en diferenciacion de forma dependiente de la dosis, lo que indica que la inhibicion de la ruta de senalizacion de BMP con DM fomenta la diferenciacion de hESC H9 hacia el linaje neural (Fig. 2b).
Para investigar si la inhibicion de la ruta de BMP induce suficientemente la diferenciacion neural y al mismo tiempo reduce la diferenciacion a lo largo de otros linajes, los efectos de DM en el cambio de destino de hESC se examinaron mas estrechamente. En este experimento, se cultivaron EB en medio de diferenciacion espontanea que contema DM (1 y 5 jM) durante 10 dfas y se examino la expresion de marcadores representativos de tres capas germinales, asf como de hESC no diferenciadas por RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) e inmunocitoqmmica (Figs. 1). El tratamiento con DM durante la formacion de EB significativamente aumento la expresion se marcadores neurales (Sox1 y nestina) de forma dependiente de la dosis, mientras que los marcadores para mesodermo (Brachyury, Cerberus), endodermo (alfa-fetoprotema (AFP), GATA4) y hESC indiferenciadas (Oct4 y Nanog) estaban reducidos (figs. 1a-1d). Sin embargo, algunos marcadores endodermicos (es decir, AFP) y de celulas indiferenciadas (es decir, Oct4 y SSEA4) todavfa se detectaron (Figs. 1b-1d). Estos resultados implican que bloquear la ruta de BMP sola no es suficiente para producir una poblacion muy pura de celulas neurales que tiene contaminacion minima de celulas endodermicas, mesodermicas e indiferenciadas restantes. Esta conclusion nos motivo a buscar rutas de senalizacion adicionales cuya inhibicion aumentana ademas la diferenciacion de hESC hacia el linaje neural. Se sabe que la ruta de activina/nodal desempena un papel central durante el desarrollo embrionario temprano induciendo la diferenciacion endodermica y mesodermica [10], mientras que suprime la diferenciacion en el linaje neuroectodermico [11, 12]. Ademas, artmulos recientes demostraron que la senalizacion de activina/nodal tambien es importante para mantener la capacidad de celula madre (“sternness”) de las hESC [13, 14]. Por tanto, postulamos que bloquear la senalizacion de activina/nodal dirigina la diferenciacion de hESC mas favorablemente hacia neuroectodermo con reduccion de los otros linajes y celulas indiferenciadas.
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Basado en esta idea, probamos si bloquear la senalizacion de activina/nodal ademas de la inhibicion de la ruta de BMP producina induccion adicional de celulas neurales con reduccion de las otras celulas no deseadas a un nivel mmimo. Cuando se cultivaron los EB en el medio de diferenciacion espontanea que contema tanto SB431542 (5 o 10 |jM), un inhibidor espedfico de la senalizacion de activina/nodal, como DM (5 jM), la expresion de marcadores neurales (Sox1, Pax6 y nestina) estaba significativamente aumentada, mientras que marcadores tanto endodermicos (AFP y GATA4) como mesodermicos (Brachyury y Cerberus) estaban drasticamente reducidos (Figs. 1b-1c). De forma mas importante, los marcadores para celulas pluripotentes indiferenciadas (Oct4 y Nanog) tambien estaban muy reducidos (Fig. Id), El aumento de celulas neurales en este experimento tambien se confirmo por inmunocitoqmmica (Fig. Id).
La expresion de marcadores de trofoblasto (GATA2 y GCM1) tambien estaba disminuida por la inhibicion de bien la ruta de BMP sola (tratamiento con DM) o tanto la ruta de Bmp como activina/nodal (tratamiento DM+SB431542) (Fig. 3). Este resultado esta en lmea con el artmulo previo que bloquear la ruta de activina/nodal produce la diferenciacion de hESC a trofoblastos solo cuando la ruta de BMP es activa [15].
De forma acumulativa, nuestros datos sugenan que la induccion neural eficiente y exclusiva de hPSC requerina la inhibicion de las rutas de senalizacion tanto de BMP como de activina/nodal. Estos resultados estan en lmea con el trabajo reciente que muestra que se requiere la supresion simultanea y continua de la senalizacion de BMP y activina/nodal para la induccion neural en el desarrollo del embrion de Xenopus [16].
La siguiente pregunta es si el tratamiento simultaneo de DM y SB431542 podna dirigir los destinos de lmeas tanto de hESC como de iPSC hacia el linaje neural, independientemente de su propension a la diferenciacion innata. Para este fin, los EB generados de 9 lmeas de hPSC (6 lmeas de hESC (no ilustrativo del objeto reivindicado) y 3 lmeas de iPSC humanas) se trataron tanto con DM (5 jM) como SB431542 (10 jM) durante el proceso de diferenciacion espontanea. Nuestros analisis por qRT-PCR demostraron que el tratamiento con DM y SB431542 aumento significativamente la induccion neural con reduccion concomitante de celulas de otros linajes (Fig. 2a). De forma interesante, los aumentos en veces de expresion de marcador neural entre celulas control (celulas tratadas con vehmulo (DMSO)) y tratadas con (DM+SB431542) eran mucho mayores en las lmeas celulares que teman inclinacion a la diferenciacion innata desfavorable hacia el destino neural tal como celulas Miz-hES4, SNU-hES3, SNU-hES16, CHA-hES3, y BJ1-iPS12 (Fig. 1a y Fig. 2a). Los analisis inmunocitoqmmicos tambien demostraron claramente que mas celulas expresaban nestina, un marcador de precursor neural, cuando se supriirnan las rutas de senalizacion tanto de BMP como de activina/nodal (Fig. 2b). No hemos detectado ninguna celula indiferenciada despues de tratamiento de DM+SB por inmunocitoqmmica (datos no mostrados).
Ademas de sus efectos durante la diferenciacion espontanea, DM y SB431542 tambien aumentaron la generacion de celulas neurales cuando se usaron con un protocolo de diferenciacion directa que se habfa disenado para inducir la diferenciacion neural de hESCs13 (Fig. 4) [17]. Se mostro que los precursores neurales generados en nuestros experimentos reteman la multipotencia para convertirse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Fig. 8).
En conjunto, estos resultados sugenan que la inclinacion a la diferenciacion significativamente diferente entre lmeas de hESC y iPSC se podna superar de forma eficiente por la modulacion simultanea de las rutas de senalizacion de BMP y activina/nodal se usara un protocolo de diferenciacion espontanea o directa: en ambas condiciones, todas las hPSC estaban destinadas de forma eficiente al linaje neural.
Para examinar si los NP generados por bloqueo simultaneo de las senales de BMP y activina/nodal retienen la capacidad de convertirse en un subtipo neural especificado, intentamos la diferenciacion adicional en neuronas de dopamina (DA) mediante la modificacion de protocolos existentes (Fig. 5) [18, 19]. Los analisis inmunocitoqmmicos mostraron aumento marcado en el numero de celulas neurales Tuj1-positivas de las celulas iPSC humanas (MSC- iPS2-3) tratadas con (DM+SB431542) (50,7 ± 2,2% de las celulas totales) comparado con las celulas tratadas con vehmulo (2,6 ± 0,5% de las celulas totales) (Figs. 5b-5h). Una porcion significativa (49,5 ± 6,8%) de las celulas Tuj1 positivas eran neuronas TH+. Estos datos indicaban que las celulas neurales generadas por la modulacion de la senalizacion de BMP y activina/nodal tambien retienen la capacidad para diferenciarse en un tipo neural espedfico tal como neuronas de DA.
En resumen, mostramos en este artmulo que las hPSC con una variedad de propension a la diferenciacion se pueden diferenciar de forma eficiente al linaje neural mediante la modulacion de las rutas de BMP y activina/nodal. Este estudio sugiere que la modulacion de rutas de senalizacion puede ser capaz de superar el potencial de diferenciacion innato de hESC y iPSC humanas. Esto simplificana la necesidad para generar multiples lmeas de iPSC independientes de pacientes en necesidad de terapia de sustitucion de celulas.
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Claims (4)
- REIVINDICACIONES1. Un metodo para inducir la diferenciacion neural de celulas madre seleccionadas del grupo que consiste en 5 celulas madre embrionarias humanas (hESC) y celulas madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), quecomprende las etapas de:10(a) inhibir la ruta de senalizacion de BMP (protema morfogenetica osea) y activina/nodal en la celulas madre usando dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamidina; y(b) cultivar las celulas madre.
- 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde la etapa (b) comprende ademas las etapas de: (b-1) hacer proliferar celulas precursoras neurales cultivando en presencia de bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos basico) las celulas madre obtenidas en la etapa (a) en las que el neuroectodermo esta muy desarrollado; (b-2) 15 inducir celulas precursoras de dopamina cultivando las celulas precursoras neurales en presencia de Sonichedgehog (Shh) y FGF 8 (factor de crecimiento de fibroblastos 8); y (b-3) formar neuronas dopaminergicas cultivando las celulas precursoras de dopamina en presencia de factor de crecimiento neurotrofico derivado de glfa (GDNF), factor de crecimiento neurotrofico derivado de cerebro (BDNF) y acido ascorbico.20 3. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde la expresion de Sox1, Pax6 y nestina esta mucho masaumentada en las celulas madre de la etapa (b) comparadas con las tratadas sin dorsomorfina y 4-(5- benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamidina.
- 4.25El metodo segun la reivindicacion 1, en donde la expresion de Id1, Id3, GCM1 y GATA2 estan significativamente reducidas en las celulas madre de la etapa (b) comparadas con las tratadas sin dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamidina.
- 5. Un uso de dorsomorfina y 4-(5-benzo[1,3]dioxol-5-il-4-piridin-2-il-1H-imidazol-2-il)benzamidina para fabricar una composicion para inducir diferenciacion neural de celulas madre seleccionadas del grupo que consiste en 30 celulas madre embrionarias humanas (hESC) y celulas madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).
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