ES2684549T3 - Polipéptidos que contienen Fc con glicosilación alterada y función efectora reducida - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado que comprende un dominio Fc de IgG1 humana, en donde el dominio Fc de IgG1 humana comprende un residuo asparagina glicosilada en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE.

Description

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DESCRIPCION

Polipéptidos que contienen Fc con glicosilación alterada y función efectora reducida.

Aplicaciones relacionadas

Esta aplicación reivindica la prioridad para la aplicación internacional N.° PCT/EP2012/003819, titulada "Anti-Alpha Beta TCR Antibodies", presentada el 12 de septiembre de 2012 y la solicitud provisional de EE.UU. 61/776.715, titulada "Fc Containing Polypeptides With Altered Glycosylation and Reduced Effector Function", presentada el 11 de marzo de 2013.

Esta aplicación está también relacionada con la solicitud provisional de Estados Unidos 61/776.724, titulada "Site- Specific Antibody Drug Conjugation Through Glycoengineering", presentada el 11 de marzo de 2013, y la solicitud provisional de EE.UU. 61/776.710, titulada "Hyperglycosilated Binding Polypeptides", presentada el 11 de marzo de 2013.

Antecedentes

Los anticuerpos con la glicosilación de la Fc reducida o suprimida se han empleado para el tratamiento de enfermedades o trastornos inflamatorios y autoinmunes con el fin de reducir los efectos secundarios o la toxicidad asociada con la función efectora no deseada (véase, p. ej., Chan y Carter, Nat. Reviews Immunology, 2010). Sin embargo, la glicosilación del dominio Fc de anticuerpos es importante para la estructura, la estabilidad y la función de los anticuerpos, y la aglicosilación puede dar como resultado anticuerpos con malas propiedades biofísicas. En consecuencia, hay una necesidad en la técnica de proteínas de unión modificada por ingeniería genética con función efectora reducida, pero que también conservan las propiedades deseables de un dominio Fc glicosilado.

La solicitud de patente internacional WO 2004/099249 divulga variantes de la Fc, procedimientos para su generación, y anticuerpos y fusiones de la Fc que comprenden dichas variantes de la Fc. Sin embargo, no se divulgan las variantes de la Fc que tienen glicosilación alterada y función efectora reducida.

Compendio

La presente divulgación mejora la técnica anterior proporcionando polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o fusión) y, opcionalmente, conjugados de los mismos con fármacos, que comprenden un dominio Fc con glicosilación alterada y función efectora reducida. En ejemplos de realizaciones, el dominio Fc comprende: un residuo asparagina en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE. La presente divulgación también proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de unión a antígeno, vectores de expresión recombinante y células anfitrionas para preparar tales polipéptidos de unión a antígeno. También se proporcionan procedimientos para el uso de polipéptidos de unión a antígeno divulgados en el presente documento para tratar la enfermedad.

Los autores de la invención han encontrado sorprendentemente que los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos) de la presente divulgación muestran perfiles de la glicosilación alterada que son ventajosos en que suprimen la unión del polipéptido de unión a los receptores Fcy, alterando así la función efectora del polipéptido de unión mientras conserva las deseables propiedades biofísicas que son otorgadas por la glicosilación. Por otra parte, el sitio de la glicosilación ligada a N modificada por ingeniería genética en la posición 298 de aminoácido se puede utilizar también como un sitio para la conjugación de restos efectores, tal como fármacos citotóxicos.

La invención está definida por las reivindicaciones.

En consecuencia, la aplicación describe un polipéptido de unión aislado que comprende un dominio Fc con glicosilación alterada, en donde el dominio Fc comprende: un residuo asparagina en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE, y en donde el polipéptido de unión exhibe función efectora reducida debido a dicha glicosilación alterada. En una realización, el polipéptido de unión comprende además un residuo alanina en la posición 299 de aminoácido, según la numeración de la UE. En otra realización, el polipéptido de unión comprende, además, un residuo glutamina en la posición 297 de aminoácido, según la numeración de la UE. Según la invención, el dominio Fc es un dominio IgG1 Fc. Según la invención, el dominio Fc es humano.

En una realización, la cadena lateral del residuo asparagina está ligado a un glicano a través de un acoplamiento p- glicosilamida. En otra realización, el glicano es un glicano biantenario. En otra realización, el glicano es una glicoforma de mamífero de origen natural.

En otra realización, el polipéptido de unión tiene una menor afinidad por un receptor Fcy que un polipéptido de unión que tiene un dominio Fc nativo. En una realización, el receptor Fcy es FcyRI y/o FcYRIIIa. En otra realización, el polipéptido de unión tiene una afinidad similar por un receptor FcRn como un polipéptido de unión que tiene un dominio Fc nativo.

En otra realización, el glicano comprende un grupo aldehído reactivo. En otra realización, el glicano comprende un

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residuo sacárido oxidado que comprende un grupo aldehido reactivo. En otra realización, el residuo sacárido oxidado es un ácido siálico o galactosa terminales.

En otra realización, el glicano está ligado a un resto efector. En otra realización, el resto efector es una citotoxina. En otra realización, la citotoxina se selecciona del grupo de citotoxinas enumeradas en la Tabla 1. En otra realización, el resto efector es un agente de detección. En otra realización, el resto efector está ligado a través de un acoplamiento oxima o hidrazona a un residuo sacárido del glicano. En otra realización, el residuo sacárido es un residuo terminal de ácido siálico o galactosa del glicano. En otra realización, el resto efector comprende un enlazador sensible al pH, un enlazador disulfuro, un enlazador sensible a enzimas u otro resto enlazador escindible. En otra realización, el resto efector comprende un resto enlazador seleccionado del grupo de restos enlazadores representados en las Tablas 2 o 14.

Además, se divulga un polipéptido de unión que es un anticuerpo o inmunoadhesina.

En otro aspecto, la aplicación describe un polipéptido de unión aislado que comprende un dominio Fc, en donde el dominio Fc comprende: un residuo asparagina libre en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina libre en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE.

En otro aspecto, la aplicación describe un polipéptido de unión aislado que comprende un dominio Fc, en donde el dominio Fc comprende: un residuo asparagina modificado en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina libre en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE.

En otra realización, el resto efector está ligado a través de una cadena lateral del residuo asparagina modificado a un residuo sacárido de un glicano. En una realización, el sacárido es un residuo terminal de ácido siálico o galactosa del glicano. En una realización, el resto efector está ligado a través de un acoplamiento oxima o hidrazona al residuo sacárido del glicano. En una realización, el sacárido es un residuo terminal de ácido siálico o galactosa del glicano. En otra realización, el residuo asparagina modificado está ligado a un resto efector fármaco para formar un conjugado de fármaco anticuerpo (ADC).

En otro aspecto, una composición comprende un polipéptido de unión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la aplicación describe el tratamiento de un paciente comprendiendo la misma la administración de una cantidad efectiva de la composición de la invención.

En otro aspecto, la aplicación describe un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de unión de la invención. En otro aspecto, la aplicación describe un vector que comprende el polinucleótido o una célula anfitriona que comprende el polinucleótido o vector.

En otro aspecto más, la aplicación describe un procedimiento de preparar un polipéptido de unión que comprende la expresión del polinucleótido o vector en una célula.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una ilustración esquemática de la síntesis de un conjugado de fármaco anticuerpo donde un resto toxina está enlazado a un residuo de ácido siálico oxidado del anticuerpo glicano mediante un acoplamiento oxima.

La figura 2 es un gel teñido de Coomassie-azul que muestra la expresión y purificación de los mutantes de glicosilación.

La figura 3 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial utilizados para evaluar la unión de los mutantes de anticuerpos apTCR HEBE1 IgG a la FcYRIIIa humana recombinante (V158 y F158).

La figura 4 muestra los resultados de los experimentos de resonancia de plasmón superficial utilizados para evaluar la unión de los mutantes de anticuerpos apTCR HEBE1 IgG a los FcyRI humanos recombinantes.

La figura 5 muestra el perfil de liberación de citocinas a partir de PBMCs para TNFa, GM-CSF, IFNy e IL10 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 2).

La figura 6 muestra el perfil de liberación de citocinas a partir de PBMCs para IL6, IL4 e IL2 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 2).

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La figura 7 muestra el perfil de liberación de citocinas a partir de PBMCs para TNFa, GM-CSF, IFNy e IL10 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 4).

La figura 8 muestra el perfil de liberación de citocinas de PBMCs para IL6, IL4 e IL2 en presencia de anticuerpos anti-apTCR mutantes (día 4).

La figura 9 muestra los resultados de los experimentos que investigan el nivel de expresión de los mutantes 2C3 por inmunotransferencia y resonancia de plasmón superficial.

La figura 10 muestra los resultados de los experimentos que investigan la glicosilación de los mutantes 2C3 antes y después del tratamiento con PNGasa F.

La figura 11 muestra los resultados de los experimentos en SDS-PAGE que investigan sitios de glicosilación sobre mutantes 2C3 aislados del cultivo celular.

La figura 12 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial utilizados para evaluar la unión de los anti-CD52 modificado con FcyRIIIa humana recombinante (V158). El anti-CD52 que comprende mutaciones S298N/Y300S en el dominio Fc se utilizaron para evaluar la función efectora de la molécula modificada, la unión al péptido CD52 (A), la unión a FcyRIIIa (V158, B), y la unión de control con FcRn de ratón (C).

La figura 13 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial que investigan las propiedades de unión a Fc de los mutantes 2C3.

La figura 14 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón superficial que investigan la unión de anti-CD52 modificados tanto con FcyRIIIa (Val158) (como antes) como con FcyRIIIa (Phe158). Los anticuerpos anti-CD52 que comprenden mutaciones S298N/Y300S en el dominio Fc se utilizaron para evaluar la función efectora de la molécula modificada que se une a FcyRIIIa (Val158, Fig. 14a) y FcyRIIIa (Phe58, Fig. 14B).

La figura 15 muestra el análisis de unión de C1q en el mutante S298N/Y300S y el control WT 2C3 (A) y los resultados de un análisis de Elisa que confirmaba la capa equivalente de los pocillos.

La figura 16 muestra los resultados de experimentos de resonancia plasmón que miden la cinética de unión de los mutantes 2C3 al péptido 741 del CD-52.

La figura 17 muestra los resultados de experimentos de resonancia de plasmón que comparan la afinidad de unión a antígeno de WT 2C3 anti-CD-52 y el mutante de hiperglicosilación A114n.

La figura 18 muestra los resultados de los experimentos de caracterización de carga por isoelectroenfoque y espectrometría de masas para determinar el contenido de glicano de los mutantes 2C3.

La figura 19 muestra los resultados de concentración (Octet) y experimentos de resonancia de plasmón que comparan la afinidad de unión a antígeno de WT 2C3 anti-CD-52 y mutantes.

La figura 20 muestra los resultados de experimentos en SDS-PAGE para determinar el contenido de glicano del mutante A114N anti-TME1.

La figura 21 muestra los resultados en SDS-PAGE y el análisis de cromatografía de interacción hidrófoba del mutante A114N anti-Her2.

La figura 22 muestra los resultados de los experimentos en SDS-PAGE para demostrar la conjugación de PEG al mutante A114N 2C3 a través de un acoplamiento aminooxi.

La figura 23 muestra los resultados de experimentos de LC-MS para determinar los contenidos de glicano del mutante de hiperglicosilación A114N anti-TEM1.

La figura 24 muestra los resultados de los experimentos de LC-MS para determinar los contenidos de glicano de un anticuerpo HER2 de tipo salvaje y un mutante de hiperglicosilación A114N anti-Her2.

La figura 25 muestra un procedimiento de ejemplo para realizar la conjugación específica en el sitio de un anticuerpo

según los procedimientos de la invención.

La figura 26 muestra una síntesis de restos efectores de ejemplo de la invención: aminooxi-Cys-MC-VC-PABC- MMAE y aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10.

La figura 27 muestra la información de caracterización para un anticuerpo HER2 sialilado.

5 La figura 28 muestra la información de caracterización para anticuerpo anti-HER2 sialilado oxidado.

La figura 29 muestra cromatogramas de interacción hidrófoba de glicoconjugados preparados con tres diferentes anticuerpos sialilados con dos diferentes grupos aminooxi.

La figura 30 muestra un cromatograma de HIC del conjugado mutante de glicosilación A114 anti-Her2 con AO- MMAE preparado mediante química GAM(+).

10 La figura 31 muestra una comparación de la potencia in vitro de un glicoconjugado anti-HER2 y conjugado tiol.

La figura 32 muestra una comparación de la potencia in vitro de un glicoconjugado anti FAP B11 y conjugado tiol.

La figura 33 muestra una comparación de la eficacia in vivo de los glicoconjugados anti-HER2 y conjugados tiol en un modelo de xenoinjerto de células tumorales Her2+.

La figura 34 muestra los resultados de los experimentos de LC-MS para determinar el contenido de glicano de un 15 anticuerpo anti-apTCR mutante que contiene la mutación S298N/Y300S.

La figura 35 muestra los resultados de experimentos de dicroísmo circular para determinar la estabilidad térmica relativa de un anticuerpo anti-apTCR de tipo salvaje y anticuerpo anti-apTCR mutante que contiene la mutación S298N/Y300S.

La figura 36 muestra los resultados de un ensayo de proliferación celular para ADC preparada con el anticuerpo anti- 20 HER que lleva la mutación de hiperglicosilación A114N y AO-MMAE.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos) y conjugados de los mismos con fármacos, que comprenden un dominio Fc, en donde el dominio Fc comprende: un residuo asparagina en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, 25 según la numeración de la UE. La presente divulgación proporciona también ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de unión a antígeno, los vectores de expresión recombinante y las células anfitrionas para preparar tales polipéptidos de unión a antígeno. También se proporcionan procedimientos para el uso de polipéptidos de unión a antígeno divulgados en el presente documento para tratar la enfermedad.

I. Definiciones

30 Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido enlazante" o "polipéptido de unión" se referirá a un polipéptido (p. ej., un anticuerpo) que contiene al menos un sitio de unión que es responsable de unirse selectivamente a un antígeno diana de interés (p. ej., un antígeno humano). Los sitios de unión de ejemplo incluyen un dominio variable de anticuerpo, un sitio de unión del ligando de un receptor, o un sitio de unión del receptor de un ligando. En algunos aspectos, los polipéptidos de unión de la invención comprenden múltiples (p. ej., dos, tres, 35 cuatro o más) sitios de unión.

Como se usa en el presente documento, el término "residuo nativo" se referirá a un residuo de aminoácido que aparece de forma natural en una posición de aminoácido particular de un polipéptido de unión (p. ej., un anticuerpo o fragmento de éste) y que no haya sido modificado, introducido o alterado por la mano del hombre. Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido enlazante alterado" o "polipéptido de unión alterado" incluye 40 polipéptidos de unión (p. ej., un anticuerpo o fragmento de ellos) que comprende al menos un residuo del aminoácido mutado no nativo.

El término "se une específicamente" usado en el presente documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo para unirse a un antígeno con una constante de disociación (Kd) de como máximo aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10'8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10'1° M, 1 x 10'11 M, 1 x 10'12 M, o 45 menos, y/o para unirse a un antígeno con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad por un

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antígeno no específico.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo " se refiere a tales ensamblajes (p. ej., moléculas de anticuerpos intactos, fragmentos de anticuerpos o variantes de los mismos) que tienen una actividad significativa inmunorreactiva específica muy conocida por un antígeno de interés (p. ej., un antígeno asociado a un tumor). Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un acoplamiento covalente intercadenas entre ellos. Las estructuras básicas de la inmunoglobulina en sistemas vertebrados son relativamente bien entendidas.

Como se discutirá con más detalle a continuación, el término genérico "anticuerpo" comprende cinco clases distintas de anticuerpos que se pueden distinguir bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están claramente dentro del alcance de la presente divulgación, la discusión siguiente se referirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 Dalton, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración de "Y" en donde las cadenas ligeras agrupan las cadenas pesadas comenzando en la boca de la "Y" y continuando a través de la región variable.

Las cadenas ligeras de inmunoglobulina se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede estar unida con una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están covalentemente unidas entre sí, y las partes de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas, células B, o células anfitrionas modificadas por ingeniería genética. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos funcionan de un N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración de Y al C-terminal en la parte inferior de cada cadena. Los expertos en la técnica comprenderán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (p. ej., Y1-Y4). Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG, o IgE, respectivamente. Las subclases de isotipo de inmunoglobulina (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc.) están bien caracterizadas y se sabe que confieren una especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases y los isotipos son fácilmente discernibles para el experto en la técnica en vista de la presente divulgación y, por consiguiente, están dentro del alcance de la presente divulgación.

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. El término "región" se refiere a una parte o porción de una cadena de inmunoglobulina o anticuerpo e incluye región constante o regiones variables, así como partes o porciones más discretas de dichas regiones. Por ejemplo, las regiones variables de cadena ligera incluyen "regiones determinantes de complementariedad" o "CDRs" intercaladas entre "regiones de entramado" o "FRs", tal como se define en el presente documento.

Las regiones de una cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina se pueden definir como región "constante " (C) o regiones "variables" (V), basándose en la relativa falta de variación de la secuencia dentro de las regiones de varios miembros de la clase en el caso de una "región constante", o la variación significativa dentro de las regiones de varios miembros de la clase en el caso de "regiones variables". Los términos "región constante" y "región variable" también se pueden utilizar de forma funcional. En este sentido, se comprenderá que las regiones variables de una inmunoglobulina o anticuerpo determinan el reconocimiento y especificidad del antígeno. A la inversa, las regiones constantes de una inmunoglobulina o anticuerpo confieren funciones efectoras importantes tales como secreción, movilidad transplacentaria, unión del receptor Fc, unión del complemento, y similares. Las estructuras de la subunidad y configuraciones tridimensionales de las regiones constantes de las varias clases de la inmunoglobulina son bien conocidas.

Las regiones constantes y variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina están plegadas en dominios. El término "dominio" se refiere a una región globular de una cadena pesada o ligera que comprende bucles de péptidos (p. ej., comprendiendo bucles de 3 a 4 péptidos) estabilizados, por ejemplo, por la hoja p-plisada y/o el enlace disulfuro intracadena. Los dominios de la región constante de la cadena ligera de una inmunoglobulina se denominan indistintamente "dominios de la región constante de la cadena ligera", "regiones CL" o "dominios CL". Los dominios constantes en la cadena pesada (p. ej., dominios de bisagra, CH1, CH2 o CH3) se denominan indistintamente "dominios de la región constante de la cadena pesada ", dominios de la región "CH" o "dominios CH". Los dominios variables de la cadena ligera se denominan indistintamente "dominios de la región variable de la cadena ligera", "dominios de la región VL” o "dominios VL". Los dominios variables de la cadena pesada se denominan indistintamente "dominios de la región de la cadena pesada", "dominios de la región VH" o "dominios VH".

Por convenio, la numeración de los dominios de región constante y variable aumenta a medida que se vuelven más distales del sitio de unión a antígeno o del término amino de la inmunoglobulina o anticuerpo. El N-terminal de cada cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina es una región variable y en el C-terminal es una región constante; los dominios CH3 y CL comprenden en realidad el carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente. Por consiguiente, los dominios de una inmunoglobulina de cadena ligera se disponen en una orientación VL-CL, mientras que los dominios de la cadena pesada se disponen en la orientación VH-CH1-bisagra-CH2-CH3.

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Las posiciones de aminoácidos en una región constante de la cadena pesada, incluyendo posiciones del aminoácido en los dominios CH1, bisagra, CH2, CH3, y CL, se pueden numerar según el sistema de numeración del índice de Kabat (véase Kabat y col., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Dept. Health and Human Services de los EE.UU., 5a edición, 1991). Como alternativa, las posiciones de aminoácidos de anticuerpos pueden numerarse según el sistema de numeración del índice de la UE (véase Kabat y col., ibid).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio de VH" incluye el dominio variable de terminal amino de una cadena pesada de inmunoglobulina, y el término "dominio de VL” incluye el dominio variable de terminal amino de una cadena ligera de inmunoglobulina.

Como se usa en el presente documento, el término "dominio de CH1" incluye el primer dominio de la región constante (la mayor parte de amino terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina que se extiende, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 114-223 en el sistema de numeración de Kabat (posiciones 118-215 de la UE). El dominio CH1 es adyacente al dominio de VH y el terminal amino a la región bisagra de una molécula de cadena pesada de la inmunoglobulina, y no forma una parte de la región de Fc de una cadena pesada de la inmunoglobulina.

Como se usa en el presente documento, el término "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo así que las dos regiones de unión a antígeno N-terminal se muevan independientemente. Las regiones bisagra pueden subdividirse en tres dominios distintos: los dominios bisagra superior, medio e inferior (Roux y col., J. Immunol. 1998, 161:4083).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 244-360 en el sistema de numeración de Kabat (posiciones 231-340 de la UE). El dominio CH2 es único en que no está estrechamente emparejado con otro dominio. Más bien, dos cadenas de carbohidratos ramificadas N-ligadas se interponen entre los dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Un polipéptido de unión de la presente divulgación comprende un dominio CH2 derivado de una molécula de IgG1 (p. ej., una molécula de IgG1 humana).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio CH3" incluye la porción de una molécula de inmunoglobulina de cadena pesada que se extiende aproximadamente 110 residuos desde el N-terminal del dominio CH2, p. ej., desde aproximadamente las posiciones 361-476 del sistema de numeración Kabat (posiciones 341-445 de la UE). El dominio CH3 forma típicamente la porción C-terminal del anticuerpo. En algunas inmunoglobulinas, sin embargo, dominios adicionales pueden extenderse desde el dominio CH3 para formar la porción C-terminal de la molécula (p. ej., el dominio CH4 en la cadena p de IgM y la cadena e de IgE). Un polipéptido de unión de la presente divulgación comprende un dominio CH3 derivado de una molécula de IgG1 (p. ej., una molécula de IgG1 humana).

Como se usa en el presente documento, el término "dominio CL" incluye el dominio de la región constante de una cadena ligera de inmunoglobulina que se extiende, p. ej., desde aproximadamente la posición 107A-216 de Kabat. El dominio CL es adyacente al dominio VL. En una realización, un polipéptido de unión de la presente divulgación comprende un dominio CL derivado de una cadena ligera kappa (p. ej., una cadena ligera kappa humana).

Como se usa en el presente documento, el término "región Fc" se define como la porción de una región constante de cadena pesada que comienza en la región bisagra justo aguas arriba del sitio de escisión con papaína (es decir, el residuo 216 en la IgG, tomando el primer residuo la región constante cadena pesada para ser 114) y que termina en el C-terminal del anticuerpo. En consecuencia, una región Fc completa comprende al menos un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3.

El término "Fc nativo" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento que no se une al antígeno resultante de la digestión de un anticuerpo o producida por otros medios, ya sea en forma monomérica o multimérica, y puede contener la región bisagra. La fuente original de inmunoglobulina del Fc nativo es preferiblemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1 e IgG2. Las moléculas de Fc nativa están compuestas de polipéptidos monoméricos que se pueden ligar en formas diméricas o multiméricas mediante asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalentes. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativa varía de 1 a 4 según la clase (p. ej., IgG, IgA e IgE) o subclase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 e IgGA2). Un ejemplo de un Fc nativo es un dímero unido por disulfuro que resulta de la digestión con papaína de una IgG. El término "Fc nativo" usado en el presente documento es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.

El término "variante de Fc" usado en el presente documento se refiere a una molécula o secuencia que está modificada a partir de una Fc nativa pero aún comprende un sitio de unión para el receptor de rescate, FcRn (receptor Fc neonatal). Son conocidas en la técnica las variantes de Fc de ejemplo, y su interacción con el receptor de rescate. Por ello, el término "variante de Fc" puede comprender una molécula o secuencia que se humaniza a partir de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende regiones que se pueden eliminar porque

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proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridas para los polipéptidos de unión de tipo anticuerpo de la invención. Por ello, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos Fc nativos, o en la que uno o más sitios o residuos Fc han sido modificados, que afectan o están involucrados en: (1) formación de enlace disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula anfitriona seleccionada, (3) heterogeneidad N-terminal tras la expresión en una célula anfitriona seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con complemento, (6) unión a un receptor Fc distinto de un receptor de rescate, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

El término "dominio Fc" usado en el presente documento abarca Fc nativo y variantes de Fc y secuencias como se definió anteriormente. Como con las variantes de Fc y las moléculas de Fc nativas, el término "dominio Fc" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sean digeridas a partir de anticuerpos completos o producidas por otros medios.

Como se indicó anteriormente, las regiones variables de un anticuerpo le permiten reconocer selectivamente y unir específicamente epítopos a antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH de un anticuerpo se combinan para formar la región variable (Fv) que define un sitio de unión a antígeno tridimensional. Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de unión a antígeno presente en el extremo de cada brazo de la Y. Más específicamente, el sitio de unión a antígeno se define por tres regiones determinantes complementarias (CDRs) en cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera. Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio de unión a antígeno" incluye un sitio que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno (p. ej., una superficie celular o antígeno soluble). El sitio de unión a antígeno incluye una región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera de inmunoglobulina y el sitio de unión formado por estas regiones variables determina la especificidad del anticuerpo. Un sitio de unión a antígeno está formado por regiones variables que varían de un anticuerpo a otro. Los anticuerpos alterados de la presente divulgación comprenden al menos un sitio de unión a antígeno.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de unión de la presente divulgación comprenden al menos dos dominios de unión a antígeno que proporcionan la asociación del polipéptido de unión con el antígeno seleccionado. Los dominios de unión a antígeno no necesitan derivarse de la misma molécula de inmunoglobulina. A este respecto, la región variable puede derivarse de cualquier tipo de animal que pueda inducirse para montar una respuesta humoral y generan inmunoglobulinas contra el antígeno deseado. Como tal, la región variable del polipéptido de unión puede ser, por ejemplo, de origen mamífero, p. ej., puede ser humano, murino, de rata, de cabra, de oveja, de primate no humano (tal como monos cynomolgus, macacos, etc.), lupino o camélido (p. ej., de camellos, llamas y especies relacionadas).

En los anticuerpos de origen natural, las seis CDRs presentes en cada anticuerpo monomérico son secuencias cortas, no contiguas, de aminoácidos que están colocadas específicamente para formar el sitio de unión a antígeno como el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los dominios variables pesado y ligero muestran una menor variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos y se denominan regiones de entramado. Las regiones de entramado adoptan en gran parte una conformación de hoja p y las CDRs forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte, de la estructura de hoja p. Por lo tanto, estas regiones de entramado actúan para formar un andamiaje que proporciona el posicionamiento de seis CDRs en la orientación correcta mediante interacciones entre cadenas, no covalentes. El dominio de unión a antígeno formado por las CDRs posicionadas define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria promueve la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo.

Los polipéptidos de unión de ejemplo de la invención incluyen variantes de anticuerpos. Como se usa en el presente documento, el término "variante de anticuerpo" incluye formas de anticuerpos sintéticas y de ingeniería que están alteradas de forma que no son de origen natural, p. ej., anticuerpos que comprenden al menos dos porciones de cadena pesada pero no dos cadenas pesadas completas (tal como anticuerpos de dominio deprimido o minicuerpos); formas multiespecíficas de anticuerpos (p. ej., biespecíficas, triespecíficas, etc.) alteradas para unirse a dos o más antígenos diferentes o a epítopos diferentes en un único antígeno); moléculas de cadena pesada unidas a moléculas scFv y similares. Además, el término "variante de anticuerpo" incluye formas multivalentes de anticuerpos (p. ej., anticuerpos trivalentes, tetravalentes, etc., que se unen a tres, cuatro o más copias del mismo antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "valencia" se refiere al número de sitios potenciales de unión a diana en un polipéptido. Cada sitio de unión a diana se une específicamente a una molécula diana o sitio específico en una molécula diana. Cuando un polipéptido comprende más de un sitio de unión a diana, cada sitio de unión a diana puede unirse específicamente a moléculas iguales o diferentes (p. ej., puede unirse a diferentes ligandos o diferentes antígenos, o diferentes epítopos en el mismo antígeno). Los polipéptidos de unión a sujeto tienen preferiblemente al menos un sitio de unión específico para una molécula de antígeno humano.

El término "especificidad" se refiere a la capacidad de unirse específicamente (p. ej., inmunoreaccionar con) un antígeno diana dado (p. ej., un antígeno diana humano). Un polipéptido de unión puede ser monoespecífico y contener uno o más sitios de unión que se unen específicamente a una diana, o un polipéptido puede ser multiespecífico y contener dos o más sitios de unión que se unen específicamente a la misma o diferentes dianas. En algunas realizaciones, un polipéptido de unión de la invención es específico para dos porciones diferentes (p. ej.,

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no superpuestas) de la misma diana. En algunas realizaciones, un polipéptido de unión de la invención es específico para más de una diana. Los polipéptidos de unión de ejemplo (p. ej., anticuerpos) que comprenden sitios de unión a antígeno que se unen a antígenos expresados en células tumorales son conocidos en la técnica y uno o más CDRs de tales anticuerpos se pueden incluir en un anticuerpo de la invención.

El término "resto de enlace" incluye restos que son capaces de enlazar el resto efector con los polipéptidos de unión descritos en el presente documento. El resto de enlace puede seleccionarse de manera que sea escindible (p. ej., escindible enzimáticamente o sensible al pH) o no escindible. Los restos de enlace de ejemplo se muestran en la Tabla 2 del presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "resto efector" comprende agentes de diagnóstico y terapéuticos (p. ej., proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, restos fármacos y fragmentos de los mismos) con actividad biológica u otra actividad funcional. Por ejemplo, un polipéptido de unión modificado que comprende un resto efector conjugado con un polipéptido de unión tiene al menos una función o propiedad adicional en comparación con el anticuerpo no conjugado. Por ejemplo, la conjugación de un fármaco citotóxico (p. ej., un resto efector) con el polipéptido de unión da como resultado la formación de un polipéptido de unión con citotoxicidad del fármaco como segunda función (es decir, además de la unión a antígeno). En otro ejemplo, la conjugación de un segundo polipéptido de unión con el polipéptido de unión puede conferir propiedades de unión adicionales. En algunas realizaciones, cuando el resto efector es una proteína o ácido nucleico terapéutico o de diagnóstico codificado genéticamente, el resto efector se puede sintetizar o expresar mediante síntesis peptídica o procedimientos de ADN recombinante que son bien conocidos en la técnica. En otro aspecto, cuando el efector es un péptido no codificado genéticamente, o un resto fármaco, el resto efector puede sintetizarse artificialmente o purificarse a partir de una fuente natural. Como se usa en el presente documento, el término "resto fármaco" incluye agentes terapéuticos antiinflamatorios, anticancerígenos, antiinfecciosos (p. ej., antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivíricos, etc.) y anestésicos. En una realización adicional, el resto fármaco es un agente anticancerígeno o citotóxico. Los restos fármacos compatibles también pueden comprender profármacos. Ejemplos de restos efectores se muestran en la Tabla 1 del presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "profármaco" se refiere a un precursor o forma derivada de un agente farmacéuticamente activo que es menos activo, reactivo o propenso a efectos secundarios en comparación con el fármaco original y puede activarse enzimáticamente o de otro modo transformarse en una forma más activa in vivo. Los profármacos compatibles con las composiciones de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, profármacos que contienen fosfatos, profármacos que contienen aminoácidos, profármacos que contienen tiofosfatos, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos que contienen p- lactámicos, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden transformar en el fármaco libre citotóxico más activo. Un experto en la técnica puede realizar modificaciones químicas en el resto del fármaco deseado o en su profármaco con el fin de hacer que las reacciones de ese compuesto sean más convenientes para los fines de preparar polipéptidos de unión modificados de la presente divulgación. Los restos fármacos incluyen también derivados, sales, ésteres, amidas y éteres, farmacéuticamente aceptables, de los restos de fármacos descritos en el presente documento. Los derivados incluyen modificaciones a fármacos identificados en el presente documento que pueden mejorar o no reducir significativamente una actividad terapéutica deseada de un fármaco particular.

Como se usa en el presente documento, la expresión "agente anticancerígeno" incluye agentes que son perjudiciales para el crecimiento y/o la proliferación de células neoplásicas o tumorales y puede actuar para reducir, inhibir o destruir la malignidad. Los ejemplos de tales agentes incluyen, pero sin limitación, agentes citostáticos, agentes alquilantes, antibióticos, nucleósidos citotóxicos, agentes de unión a tubulina, hormonas, antagonistas de hormonas, agentes citotóxicos y similares. Los agentes citotóxicos incluyen derivados de tomaimicina, derivados de maitansina, derivados de criptoficina, derivados de antraciclina, derivados de bisfosfonato, derivados de leptomicina, derivados de estreptonigrina, derivados de auristatina y derivados de duocarmicina. Cualquier agente que actúa retardando o ralentizando el crecimiento de células inmunorreactivas o células malignas está dentro del alcance de la presente divulgación.

El término "antígeno" o "antígeno diana", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula o una porción de una molécula que puede unirse al sitio de unión de un polipéptido de unión. Un antígeno diana puede tener uno o más epítopos.

II. Polipéptidos de unión

En un aspecto, la presente divulgación proporciona polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, variantes de anticuerpos y proteínas de fusión) que comprenden un dominio Fc, en donde el dominio Fc comprende: un residuo asparagina en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE.

Los dominios Fc de cualquier clase de inmunoglobulina (p. ej., IgM, IgG, IgD, IgA e IgE) y las especies se pueden usar en los polipéptidos de unión descritos en el presente documento. También se pueden emplear dominios Fc

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quiméricos que comprenden porciones de dominios Fc de diferentes especies o clases de Ig. El dominio Fc es un dominio Fc de IgG1 humana. En el caso de un dominio Fc de IgG1 humana, la mutación del aminoácido de tipo salvaje en la posición 298 de Kabat para una asparagina y la posición 300 de Kabat para una serina o treonina da como resultado la formación de un sitio de consenso de glicosilación ligada a N (es decir, el sequon N-X-T/S, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina). Sin embargo, en el caso de dominios Fc de otras especies y/o clases o isotipos de Ig, el experto en la materia comprenderá que puede ser necesario mutar la posición 299 de Kabat del dominio Fc si está presente un residuo prolina para recrear un sequon N-X-T/S.

Los polipéptidos de unión descritos en el presente documento abarcan cualquier polipéptido de unión que comprende un dominio Fc que tiene un sitio de glicosilación ligado a N en la posición 298, según la numeración de Kabat. En algunos aspectos, el polipéptido de unión es un anticuerpo, o fragmento o derivado del mismo. Se puede emplear cualquier anticuerpo de cualquier fuente o especie en los polipéptidos de unión descritos en el presente documento. Los anticuerpos adecuados incluyen, sin limitación, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.

En algunos aspectos, el polipéptido de unión de la presente divulgación puede comprender un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. El término "fragmento de unión a antígeno" se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que derivaban) para la unión a antígeno (es decir, unión específica). Los fragmentos de unión a antígeno se pueden producir por procedimientos recombinantes o bioquímicos que son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fv, Fab, Fab' y (Fab')2. En aspectos preferidos, el fragmento de unión a antígeno de la presente divulgación es un fragmento de unión a antígeno alterado que comprende al menos un sitio de glicosilación modificado por ingeniería genética. En un aspecto de ejemplo, un fragmento de unión a antígeno alterado de la presente divulgación comprende un dominio de VH alterado descrito anteriormente. En otro aspecto de ejemplo, un fragmento de unión a antígeno alterado de la presente divulgación comprende un dominio de CH1 alterado descrito anteriormente.

En realizaciones de ejemplo, el polipéptido de unión comprende una secuencia de región variable de cadena sencilla (ScFv). Las secuencias de región variable de cadena sencilla comprenden un único polipéptido que tiene uno o más sitios de unión a antígeno, p. ej., un dominio VL ligado mediante un enlazador flexible a un dominio VH. Las moléculas de ScFv se pueden construir en una orientación VH-enlazador-VL o una orientación VL-enlazador-VH. La bisagra flexible que liga los dominios VL y VH que constituyen el sitio de unión a antígeno comprende preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos. Los péptidos de conexión son conocidos en la técnica. El polipéptido de unión de la invención puede comprender al menos una scFv y/o al menos una región constante. En una realización, un polipéptido de unión de la presente divulgación puede comprender al menos una scFv unido o fusionado a un anticuerpo o fragmento que comprende un dominio CH1 (p. ej., un dominio CH1 que comprende un residuo asparagina en la posición 114 de Kabat) y/o dominio CH2 (p. ej., un dominio CH2 que comprende un residuo asparagina en la posición 298 de la UE, y un residuo serina o treonina en la posición 300 de la UE).

En algunas realizaciones de ejemplo, un polipéptido de unión de la presente divulgación es un anticuerpo multivalente (p. ej., tetravalente) que se produce fusionando una secuencia de ADN que codifica un anticuerpo con una molécula de ScFv (p. ej., una molécula de ScFv alterada). Por ejemplo, en una realización, estas secuencias se combinan de manera que la molécula de ScFv (p. ej., una molécula de ScFv alterada) se enlaza en su N-terminal o en su C-terminal a un fragmento Fc de un anticuerpo a través de un enlazador flexible (p. ej., un enlazador gly/ser). En otra realización, se puede preparar un anticuerpo tetravalente de la presente divulgación fusionando una molécula de ScFv a un péptido de conexión, que se fusiona con un dominio CH1 (p. ej., un dominio CH1 que comprende un residuo asparagina en la posición 114 de Kabat) para construir una molécula tetravalente ScFv-Fab.

En otra realización, un polipéptido de unión de la presente divulgación es un minicuerpo alterado. Los minicuerpos alterados de la presente divulgación son moléculas diméricas formadas por dos cadenas polipeptídicas comprendiendo cada una a una molécula ScFv (p. ej., una molécula ScFv alterada que comprende un dominio VH alterado descrito anteriormente) que se fusiona con un dominio CH3 o una porción del mismo a través de un péptido de conexión. Los minicuerpos pueden prepararse construyendo un componente ScFv y componente CH3 de péptido de conexión utilizando procedimientos descritos en la técnica (véase, p. ej., la patente de EE.UU. 5.837.821 o el documento WO 94/09817A1). En otra realización, se puede construir un minicuerpo tetravalente. Los minicuerpos tetravalentes se pueden construir de la misma manera que los minicuerpos, excepto que dos moléculas de ScFv se enlazan utilizando un enlazador flexible. La construcción scFv-scFv enlazada se une luego a un dominio CH3.

En otra realización, un polipéptido de unión de la presente divulgación comprende un diacuerpo. Los diacuerpos son moléculas diméricas, tetravalentes, teniendo cada una un polipéptido similar a las moléculas scFv, pero que habitualmente tienen enlazadores de residuo de aminoácido corto (menos de 10 y preferiblemente de 1- 5) que conectan ambos dominios variables, de manera que los dominios VL y VH en la misma cadena polipeptídica no pueden interactuar. En cambio, el dominio VL y VH de una cadena polipeptídica interactúa con el dominio VH y VL (respectivamente) en una segunda cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, el documento WO 02/02781). Los diacuerpos de la presente divulgación comprenden una molécula scFv fusionada a un dominio CH3.

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En otras realizaciones, los polipéptidos de unión de la invención comprenden anticuerpos multiespecíficos o multivalentes que comprenden uno o más dominios variables en serie en la misma cadena polipeptídica, p. ej., polipéptidos de dominio variable en tándem (TVD). Los polipéptidos de TVD de ejemplo incluyen la configuración de "doble cabeza" o "Dual-Fv" descrita en la patente de los EE.UU. N.° 5.989.830. En la configuración Dual-Fv, los dominios variables de dos anticuerpos diferentes se expresan en una orientación en tándem en dos cadenas separadas (una cadena pesada y una cadena ligera), en donde una cadena polipeptídica tiene dos veces una VH en serie separada por un enlazador peptídico (VH1-enlazador-VH2) y la otra cadena polipeptídica consiste en dominios VL complementarios conectados en serie por un enlazador peptídico (VL1-enlazador-VL2). En la configuración cruzada de doble cabeza, los dominios variables de dos diferentes anticuerpos se expresan en una orientación en tándem en dos cadenas polipeptídicas separadas (una cadena pesada y una cadena ligera), en donde una cadena polipeptídica tiene dos VH en serie separadas por un enlazador peptídico (VH1-enlazador-VH2) y la otra cadena polipeptídica consiste en dominios VL complementarios conectados en serie por un enlazador peptídico en la orientación opuesta (VL2-enlazador-VL1). Variantes de anticuerpos adicionales basadas en el formato "Dual-Fv" incluyen el anticuerpo biespecífico de IgG de Dominio Variable Dual (DVD-IgG) (véase la patente de EE.UU. N.° 7.6l2.181 y el formato TBTI (véase el documento US 2010/0226923 A1). La adición de dominios constantes a cadenas respectivas de Dual-Fv (CH1-Fc a la cadena pesada y dominio constante kappa o lambda a la cadena ligera) conduce a anticuerpos biespecíficos funcionales sin necesidad de modificaciones adicionales (es decir, la adición obvia de dominios constantes para potenciar la estabilidad).

En otra realización de ejemplo, el polipéptido de unión comprende un anticuerpo biespecífico de IgG de dominio variable dual cruzado (CODV-IgG) basado en una configuración de "doble cabeza" (véase el documento US20120251541 A1). Las variantes del anticuerpo CODV-IgG tienen una cadena polipeptídica con dominios VL conectados en serie a un dominio CL (VL1-L1-VL2-L2-CL) y una segunda cadena polipeptídica con dominios VH complementarios conectados en serie en la orientación opuesta a un dominio CH1 (VH2-L3-VH1-L4-CH1), donde las cadenas polipeptídicas forman un par cruzado de cadena pesada y cadena ligera. En cierta realización, el segundo polipéptido puede estar conectado además a un dominio Fc (VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc). En algunas realizaciones, el enlazador L3 es al menos dos veces la longitud del enlazador L1 y/o el enlazador L4 es al menos dos veces la longitud del enlazador L2. Por ejemplo, L1 y L2 pueden tener una longitud de 1-3 residuos de aminoácidos, L3 puede tener una longitud de 2 a 6 residuos de aminoácidos, y L4 puede tener una longitud de 4 a 7 residuos de aminoácidos. Los ejemplos de enlazadores adecuados incluyen un único residuo glicina (Gly); un péptido de diglicina (Gly-Gly); un tripéptido (Gly-Gly-Gly); un péptido con cuatro residuos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con cinco residuos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con seis restos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con siete residuos glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly); un péptido con ocho residuos glicina (Gly-Gly-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly-Gly). Se pueden usar otras combinaciones de residuos de aminoácidos tales como el péptido Gly- Gly-Gly-Gly-Ser y el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.

En algunos aspectos, el polipéptido de unión comprende una molécula de inmunoadhesina que comprende una región de unión que no es anticuerpo (p. ej., un receptor, ligando o molécula de adhesión celular) fusionada a una región constante de anticuerpo (véase, p. ej., Ashkenazi y col., Methods, 1995 8 (2), 104-115).

En algunos aspectos, el polipéptido de unión comprende dominios de tipo inmunoglobulina. Los dominios de tipo inmunoglobulina adecuados incluyen, sin limitación, dominios de fibronectina (véase, por ejemplo, Koide y col., (2007), Methods Mol. Biol. 352: 95-109), DARPin (véase, por ejemplo, Stumpp y col., 2008) Drug Discov. Today 13 (15-16): 695-701), dominios Z de proteína A (véase, Nygren y col., (2008) FEBS J. 275 (11): 2668-76), Lipocalinas (véase, por ejemplo, Skerra y col., (2008) FEBS J. 275 (11): 2677-83), Affilins (véase, por ejemplo, Ebersbach y col., (2007) J. Mol. Biol. 372 (1): 172-85), Affitins (véase, por ejemplo, Krehenbrink y col., (2008). J. Mol. Biol. 383 (5): 1058-), Avimers (véase, por ejemplo, Silverman y col., (2005) Nat. Biotechnol 23 (12): 1556-61), Fynomers, (véase, por ejemplo, Grabulovski y col., (2007) J Biol Chem 282 (5): 3196-3204), y péptidos del dominio Kunitz (véase, por ejemplo, Nixon y col., (2006) Curr Opin Drug Discov Devel 9 (2): 261-8).

III. Glicanos ligados a N

El dominio Fc de los polipéptidos de unión descritos en el presente documento está glicosilado en la arginina modificada por ingeniería genética en la posición 298 (N298), según la numeración de la UE. El glicano ligado a N generalmente se enlaza mediante un acoplamiento p-glicosilamida al grupo nitrógeno de la cadena lateral N298. Sin embargo, también se pueden emplear otros acoplamientos adecuados reconocidos en la técnica.

Cualquier tipo de glicano ligado a N de origen natural o sintético (es decir, no natural) se puede ligar a N114. Por ejemplo, el glicano puede ser un glicano nativo o un glicano modificado por ingeniería genética que contiene acoplamientos no nativos. En algunas realizaciones, el glicano comprende un sacárido que se puede oxidar (p. ej., mediante tratamiento con peryodato) para producir un grupo adecuado para la conjugación con un resto efector (p. ej., un grupo aldehído reactivo). Los sacáridos oxidable adecuados incluían, sin limitación, galactosa y ácido siálico (p. ej., ácido N-acetilneuramínico). En algunas realizaciones, el glicano es un glicano biantenario. En algunas realizaciones, el glicano es una glicoforma de mamífero de origen natural.

La glicosilación se puede lograr a través de cualquier medio conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la glicosilación se consigue mediante la expresión de los polipéptidos de unión en células capaces de glicosilación

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ligada a N. Se puede emplear cualquier célula natural o modificada por ingeniería genética (p. ej., procariota o eucariota). En general, las células de mamífero se emplean para efectuar la glicosilación. Los N-glicanos que se producen en células de mamífero se denominan habitualmente N-glicanos complejos (véase, por ejemplo, Drickamer K, Taylor ME (2006). Introduction to Glycobiology, 2a ed.). Estos N-glicanos complejos tienen una estructura con típicamente dos a seis ramificaciones externas con una secuencia de sialil-lactosamina enlazada a una estructura central interna Man3GlcNAc2. Un N-glicano complejo tiene al menos una ramificación, y preferiblemente al menos dos, de residuos GlcNAc y galactosa (Gal) alternantes que terminan en oligosacáridos tales como, por ejemplo: NeuNAc-; NeuAc a2,6 GalNAc al-; NeuAc a2,3 Gal p1,3 GalNAc al-; y NeuAc a2,3/6 Gal p1,4 GlcNAc p1. Además, los ésteres de sulfato pueden aparecer en los residuos galactosa, GalNAc y GlcNAc, y los ésteres de fosfato pueden aparecer en los residuos manosa. NeuAc puede ser O-acetilado o reemplazado por NeuGl (ácido N-glicolilneuramínico). Los N-glicanos complejos pueden tener también sustituciones intracadena de GlcNAc bisecante y fucosa central (Fuc).

De forma adicional o como alternativa, la glicosilación se puede lograr o modificar a través de medios enzimáticos, in vitro. Por ejemplo, se pueden emplear una o más glicosiltransferasas para añadir residuos de sacáridos específicos para N298, y se pueden emplear una o más glicosidasas para eliminar sacáridos no deseados del glicano ligado a N. Dichos medios enzimáticos son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., el documento WO/2007/005786).

IV. Funciones efectoras inmunológicas y modificaciones Fc

En algunos aspectos, los polipéptidos de unión pueden comprender una región constante de anticuerpo (p. ej., una región constante de IgG, p. ej., una región constante de IgG humana, p. ej., una región constante de IgGl o IgG4 humana) que media una o más funciones efectoras. Por ejemplo, la unión del componente C1 del complemento a una región constante del anticuerpo puede activar el sistema complemento. La activación del complemento es importante en la opsonización y lisis de los patógenos celulares. La activación del complemento también estimula la respuesta inflamatoria y puede estar involucrada también en la hipersensibilidad autoinmune. Además, los anticuerpos se unen a receptores en diversas células a través de la región Fc, con un sitio de unión al receptor Fc en la región Fc del anticuerpo que se une a un receptor Fc (FcR) en una célula. Hay varios receptores Fc que son específicos de diferentes clases de anticuerpo, que incluyen IgG (receptores gamma), IgE (receptores épsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). La unión del anticuerpo a los receptores Fc en las superficies celulares desencadena una serie de importantes y diversas respuestas biológicas que incluyen el envolvimiento y la destrucción de partículas recubiertas de anticuerpos, la eliminación de complejos inmunes, la lisis mediante células asesinas de células diana recubiertas de anticuerpos (denominada citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, o ADCC), liberación de mediadores inflamatorios, transferencia placentaria y control de la producción de inmunoglobulinas. En realizaciones preferidas, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos, o fragmentos de los mismos, de unión a antígeno) de la invención se unen a un receptor Fc-gamma. En realizaciones alternativas, los polipéptidos de unión de la invención pueden comprender una región constante que está desprovista de una o más funciones efectoras (p. ej., actividad ADCC) y/o es incapaz de unirse al receptor Fcy.

Algunas realizaciones de la invención incluyen anticuerpos en los que al menos un aminoácido en uno o más de los dominios de la región constante se ha eliminado o, si no, alterado para proporcionar características bioquímicas deseadas tales como funciones efectoras reducidas o potenciadas, la capacidad para dimerizar de forma no covalente, capacidad aumentada para localizarse en el sitio de un tumor, semivida en suero reducida o semivida en suero aumentada cuando se compara con un anticuerpo completo, inalterado, de aproximadamente la misma inmunogenicidad. Por ejemplo, algunos anticuerpos para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento son anticuerpos suprimidos en el dominio que comprenden una cadena polipeptídica similar a una cadena pesada de inmunoglobulina, pero que carecen al menos de una porción de uno o más dominios de cadena pesada. Por ejemplo, en algunos anticuerpos, se eliminará un dominio completo de la región constante del anticuerpo modificado, por ejemplo, se suprimirá todo o parte del dominio CH2.

En algunas otras realizaciones, los polipéptidos de unión comprenden regiones constantes derivadas de diferentes isotipos de anticuerpos (p. ej., regiones constantes de dos o más de una IgG1 humana). En otros aspectos, los polipéptidos de unión comprenden una bisagra quimérica (es decir, una bisagra que comprende porciones de bisagra derivadas de dominios de bisagra de diferentes isotipos de anticuerpo, p. ej., un dominio de bisagra superior de una molécula de IgG4 y un dominio de bisagra medio de IgG1). En un aspecto, los polipéptidos de unión comprenden una región Fc o una porción de la misma a partir de una molécula de IgG4 humana y una mutación Ser228Pro (numeración de la UE) en la región de bisagra central de la molécula.

En algunas realizaciones, la porción Fc puede ser mutada para aumentar o disminuir la función efectora utilizando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, la eliminación o inactivación (a través de mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión del receptor Fc del anticuerpo modificado circulante, aumentando así la localización del tumor. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la región constante consistentes con la presente invención moderen la unión al complemento y, por ello, reduzcan la semivida en suero y la asociación inespecífica de una citotoxina conjugada. Aún otras modificaciones de la región constante se pueden usar para modificar acoplamientos de disulfuro o restos de oligosacáridos que permitan una localización potenciada debido a una mayor especificidad o flexibilidad del antígeno. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización del tumor, la

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biodistribución y la semivida en suero, pueden medirse y cuantificarse fácilmente y usando técnicas inmunológicas bien conocidas sin una excesiva experimentación.

En algunas realizaciones, un dominio Fc empleado en un anticuerpo de la invención es una variante de Fc. Como se usa en el presente documento, el término "variante de Fc" se refiere a un dominio Fc que tiene al menos una sustitución de aminoácido en relación con el dominio Fc de tipo salvaje del que se deriva dicho dominio Fc. Por ejemplo, en donde el dominio Fc se deriva de un anticuerpo IgG1 humano, la variante de Fc de dicho dominio Fc IgG1 humano comprende al menos una sustitución de aminoácido relativa a dicho dominio Fc.

La sustitución o sustituciones de aminoácidos de una variante de Fc se puede localizar en cualquier posición (es decir, cualquier posición de aminoácido de la convención de la UE) dentro del dominio Fc. En una realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio de bisagra o porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH2 o porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH3 o porción del mismo. En otra realización, la variante de Fc comprende una sustitución en una posición de aminoácido situada en un dominio CH4 o porción del mismo.

Los polipéptidos de unión de la invención pueden emplear cualquier variante de Fc reconocida en la técnica que se sabe que comunica una mejora (p. ej., reducción o potenciación) en la función efectora y/o unión a FcR. Dichas variantes de Fc pueden incluir, por ejemplo, una cualquiera de las sustituciones de aminoácidos descritas en las publicaciones PCT internacionales WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1,

WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2,

WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2,

WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2,

WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, y WO06/085967A2 o en las patentes de EE.UU. N.°

5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871; 6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124; 6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; y 7.083.784. En una realización de ejemplo, un polipéptido de unión de la invención puede comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido en la posición 268 de la UE (p. ej., H268D o H268E). En otra realización de ejemplo, un polipéptido de unión de la invención puede comprender una sustitución de aminoácido en la posición 239 de la UE (p. ej., S239D o S239E) y/o la posición 332 de la UE (p. ej., I332D o I332Q).

En algunas realizaciones, un polipéptido de unión de la invención puede comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altera las funciones efectoras del anticuerpo independientes del antígeno, en particular la semivida circulante del polipéptido de unión. Dichos polipéptidos de unión muestran una unión aumentada o disminuida a FcRn cuando se comparan con los polipéptidos de unión que carecen de estas sustituciones, por lo tanto, tienen una semivida aumentada o disminuida en suero, respectivamente. Se anticipa que las variantes de Fc con afinidad mejorada por FcRn tienen semividas en suero de mayor duración, y tales moléculas tienen aplicaciones útiles en procedimientos de tratamiento de mamíferos donde se desea una semivida de mayor duración del anticuerpo administrado, p. ej., para tratar una enfermedad o trastorno crónico. Por el contrario, se espera que las variantes de Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida tengan semivida de menor duración, y tales moléculas también son útiles, por ejemplo, para su administración a un mamífero cuando puede ser ventajoso un tiempo de circulación acortado, p. ej., para imágenes de diagnóstico in vivo o en situaciones cuando el anticuerpo de partida tiene efectos secundarios tóxicos cuando está presente en la circulación durante períodos prolongados. Las variantes de Fc con afinidad de unión a FcRn disminuida también tienen menos probabilidades de atravesar la placenta y, por ello, también son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos en mujeres embarazadas. Además, otras aplicaciones en las que puede desearse una afinidad de unión a FcRn reducida incluyen aquellas aplicaciones en las que se desea la localización en cerebro, riñón y/o hígado. En una realización de ejemplo, los polipéptidos de unión alterados (p. ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión a antígeno) de la invención muestran un transporte reducido a través del epitelio de los glomérulos renales de la vasculatura. En otra realización, los polipéptidos de unión alterados (p. ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión a antígeno) de la invención muestran un transporte reducido a través de la barrera hematoencefálica (BBB) desde el cerebro hacia el espacio vascular. En una realización, un anticuerpo con unión a FcRn alterada comprende un dominio Fc que tiene una o más sustituciones de aminoácidos dentro del "bucle de unión a FcRn" de un dominio Fc. El bucle de unión a FcRn está compuesto por los residuos de aminoácidos 280-299 (según la numeración de la UE). Ejemplos de sustituciones de aminoácidos con actividad de unión a FcRn alterada se describen en la publicación internacional PCT N.° WO05/047327. En algunas realizaciones de ejemplo, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión a antígeno) de la invención comprenden un dominio Fc que tiene una o más de las siguientes sustituciones: V284E, H285E, N286D, K290E y S304D (numeración de la UE). Todavía en otros ejemplos de realizaciones, las moléculas de unión de la invención comprenden un dominio de Fc humano con la doble mutación H433K/N434F (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 8.163.881).

En otros aspectos, los polipéptidos de unión, para uso en los procedimientos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento tienen una región constante, p. ej., una región constante de cadena pesada de IgG1 o IgG4, que es alterada para reducir o eliminar la glicosilación. Por ejemplo, los polipéptidos de unión (p. ej., anticuerpos o fragmentos de los mismos de unión a antígeno) de la invención también pueden comprender una variante de Fc que comprende una sustitución de aminoácido que altera la glicosilación del anticuerpo Fc. Por

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ejemplo, dicha variante de Fc puede tener glicosilación reducida (p. ej., glicosilación ligada a N o a O). En realizaciones de ejemplo, la variante de Fc comprende glicosilación reducida del glicano ligado a N encontrado normalmente en la posición de aminoácido 297 (numeración de la UE). En otra realización, el anticuerpo tiene una sustitución de aminoácido cerca o dentro de un motivo de glicosilación, por ejemplo, un motivo de glicosilación ligado a N que contiene la secuencia de aminoácidos NXT o NXS. En una realización particular, el anticuerpo comprende una variante de Fc con una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 228 o 299 (numeración de la UE). En realizaciones más particulares, el anticuerpo comprende una región constante de IgG1 o IgG4 que comprende una mutación S228P y una mutación T299A (numeración de la UE).

VIII. Restos efectores

En algunas realizaciones, los polipéptidos de unión de la presente divulgación comprenden restos efectores. En general estos restos efectores están conjugados (o directamente o a través de un resto enlazador) a un glicano ligado a N en el polipéptido de unión (p. ej., un glicano ligado a N enlazado a N298 (numeración de la UE) del dominio CH2 y/o N114 (numeración Kabat) de un dominio CH1). En algunas realizaciones, el polipéptido de unión es un anticuerpo de longitud completa que comprende dos dominios CH1 con un glicano en la posición 114 de Kabat, en donde ambos glicanos están conjugados con uno o más restos efectores.

Se puede añadir cualquier resto efector a los polipéptidos de unión divulgados en el presente documento. Los restos efectores añaden preferiblemente una función no natural a un anticuerpo alterado o a fragmentos del mismo, sin alterar significativamente la actividad intrínseca del polipéptido de unión. El resto efector puede ser, por ejemplo, pero no se limita a, un agente terapéutico o de diagnóstico. Un polipéptido de unión modificado (p. ej., un anticuerpo) de la presente divulgación puede comprender uno o más restos efectores, que pueden ser iguales o diferentes.

En una realización, el resto efector puede ser de Fórmula (I):

H2N-Q-CON-X Fórmula (I),

en donde:

A) Q es NH u O; y

B) CON es un resto conector; y

C) X es un agente terapéutico como se define en el presente documento.

El resto conector conecta el agente terapéutico a H2N-Q-. El resto conector puede incluir al menos uno de cualquiera de los componentes adecuados conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, un componente alquilenilo, un componente polietilenglicol, un componente poli(glicina), un componente poli(oxazolina), un componente carbonilo, un componente derivado de cisteinamida, un componente derivado de valina acoplada con citrulina, y un componente derivado de 4-aminobencilcarbamato, o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, el resto efector de Fórmula (I) puede ser de Fórmula (Ia):

H2N-Q-CH2-C(O)-Z-X Fórmula (Ia),

en donde:

A) Q es NH u O; y

B) Z es -Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32OsC2H4)f, en donde

i. Cys es un componente derivado de cisteinamida;

ii. MC es un componente derivado de maleimida;

iii. VC es un componente derivado de valina acoplada con citrulina;

iv. PABC es un componente derivado de 4-aminobencilcarbamato;

v. X es un agente terapéutico como se define en el presente documento;

vi. a es 0 o 1;

vii. b es 0 o 1;

viii. c es 0 o 1; y

ix. f es 0 o 1

El "componente derivado de cisteinamida" es el punto de unión a H2N-Q-CH2-C(O)-. En una realización, el "componente derivado de cisteinamida" puede referirse a una o más porciones del resto efector que tiene la estructura:

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En una realización, el componente "Cys" de un resto efector puede incluir una de dichas porciones. Por ejemplo, la siguiente estructura muestra un resto efector con una de dichas porciones (en donde el componente "Cys" se indica con el recuadro de la línea de puntos):

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En otra realización, el componente "Cys" de un resto efector puede incluir dos o más de dichas porciones. Por ejemplo, el siguiente resto contiene dos de dichas porciones:

(MC)a-(VC)b-CPABC)c(ClsH32OaC2H4)fX

^o^(MC)a-(VC)b-(PABC)c(C16H3208C2H4)fX

R-N

H

H

N,

NH,

Como puede verse a partir de la estructura, cada componente "Cys" lleva un grupo 10 -(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X.

En una realización, la frase "componente derivado de maleimida" puede referirse a cualquier porción del resto efector que tiene la estructura:

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en donde d es un número entero de 2 a 5. El número de componentes de MC incluidos en cualquier grupo 15 Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C-i6H32O8C2H4)f-X en el resto efector está indicado por subíndice "a", y puede ser 0 o 1.

En una realización, a es 1. En otra realización, b es 0.

En una realización, el componente "Cys" se puede conectar al componente "MC" a través del átomo de azufre en el componente "Cys", como se indica con el recuadro de líneas de puntos en la estructura siguiente:

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En una realización, la frase "componente derivado de valina acoplada con citrulina" puede referirse a cualquier porción del resto efector con la siguiente estructura:

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El número de componentes de VC incluidos en cualquier grupo Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X en el 5 resto efector se indica mediante el subíndice "b", y puede ser 0 o 1. En una realización, b es 1. En otra realización, b es 0.

En una realización, la frase "componente derivado de 4-aminobencilcarbamato" puede referirse a cualquier porción del resto efector con la siguiente estructura:

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10 El número de componentes PABC incluidos en cualquier grupo Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X en el resto efector se indica mediante el subíndice "c", y puede ser 0 o 1. En una realización, c es 1. En otra realización, c es 0.

En una realización, "C16H32O8C2H4" se refiere a la siguiente estructura:

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15 El número de unidades C16H32O8 incluidas en cualquier grupo Cys-(MC)a-(VC)b-(PABC)c-(C16H32O8C2H4)f-X en el resto efector se indica mediante el subíndice "f'. En una realización, f es 1. En otra realización, f es 0.

En una realización, a es 1, b es 1, c es 1 y f es 0.

a) Restos efectores terapéuticos

En algunas realizaciones, los polipéptidos de unión de la presente divulgación se conjugan con un resto efector que 20 comprende un agente terapéutico, p. ej., un resto fármaco (o profármaco del mismo) o compuesto radiomarcado. En una realización, el agente terapéutico es una citotoxina. Ejemplos de restos efectores citotóxicos se muestran en la Tabla 1 en el presente documento.

Tabla 1. Restos efectores citotóxicos de ejemplo

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Ri= alquilo, arilo, alcoxi, ariloxi, R2, R3= alquilo, arilo

Otros ejemplos de restos fármacos incluyen agentes terapéuticos antiinflamatorios, anticancerígenos, antiinfecciosos (p. ej., antifúngicos, antibacterianos, antiparasitarios, antivíricos, etc.) y anestésicos. En una realización adicional, el resto fármaco es un agente anticancerígeno. Los ejemplos de agentes anticancerígenos incluyen, pero no se limitan 5 a, citostáticos, inhibidores de enzimas, reguladores de genes, nucleósidos citotóxicos, agentes de unión a tubulina o inhibidores de tubulina, inhibidores de proteasoma, hormonas y antagonistas de hormonas, agentes antiangiogénicos y similares. Los ejemplos de agentes anticancerígenos citostáticos incluyen agentes alquilantes tales como la familia de fármacos antraciclina (p. ej., adriamicina, carminomicina, ciclosporina A, cloroquina, metopterina, mitramicina, porfiromicina, estreptonigrina, porfiromicina, antracenodionas y aziridinas). Otros agentes

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anticancerígenos citostáticos incluyen inhibidores de la síntesis de ADN (p. ej., metotrexato y diclorometotrexato, 1,4-dióxido de 3-amino-1,2,4-benzotriazina, aminopterina, citosina p-D-arabinofuranosida, 5-fluoro-5'-desoxiuridina, 5-fluorouracilo, ganciclovir, hidroxiurea, actinomicina-D y mitomicina C), intercaladores de ADN o reticuladores (p. ej., bleomicina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida, dicloruro de cis-diaminoplatino(M) (cisplatino), melfalán, mitoxantrona y oxaliplatino) y reguladores de la transcripción de ADN-ARN (p. ej., actinomicina D, daunorrubicina, doxorrubicina, homoharringtonina e idarrubicina). Otros ejemplos de agentes citostáticos que son compatibles con la presente divulgación incluyen los compuestos de ansamicin-benzoquinonas, derivados quinonoides (p. ej., quinolonas, genisteína, bactaciclina), busulfano, ifosfamida, mecloretamina, triazicuona, diazicuona, carbazilquinona, indoloquinona EO9, diaziridinil-metilbenzoquinona DZQ, trietilenfosforamida y nitrosourea (p. ej., carmustina, lomustina y semustina).

Los ejemplos de agentes anticancerígenos nucleósidos citotóxicos incluyen, por ejemplo, arabinosida de adenosina, citarabina, arabinosida de citosina, 5-fluorouracilo, fludarabina, floxuridina, ftorafur y 6-mercaptopurina. Los ejemplos de agentes de unión a tubulina anticancerígenos incluyen taxoides (p. ej., paclitaxel, docetaxel y taxano), nocodazol, rizoxina, dolastatinas (p. ej., Dolastatin-10, -11, o -15), colchicina y colchicinoides (p. ej., ZD6126), combretastatinas (p. ej., Combretastatina A-4, AVE-6032) y alcaloides de la vinca (p. ej., vinblastina, vincristina, vindesina y vinorelbina (navelbina)). Ejemplos de hormonas y antagonistas de hormonas anticancerígenas incluyen corticosteroides (p. ej., prednisona), progestinas (p. ej., hidroxiprogesterona o medroprogesterona), estrógenos (p. ej., dietilestilbestrol), antiestrógenos (p. ej., tamoxifeno), andrógenos (p. ej., testosterona), inhibidores de aromatasa (p. ej., aminoglutetimida), 17-(alilamino)-17-demetoxigeldanamicina, 4-amino-1,8-naftalimida, apigenina, brefeldina A, cimetidina, ácido diclorometilen-difosfónico, leuprolida (leuprorelina), hormona liberadora de hormona luteinizante, pifitrina-a, rapamicina, globulina de unión a hormona sexual, y tapsigargina. Los ejemplos de compuestos anticancerígenos y antiangiogénicos incluían Angiostatina K1-3, DL-a-difluorometil-ornitina, endostatina, fumagilina, genisteína, minociclina, estaurosporina y (±)-talidomida.

Ejemplos de inhibidores de enzimas anticancerígenas incluyen, pero no se limitan a, S(+)-camptotecina, curcumina, (-)-deguelina, 1-p-D-ribofuranosida de 5,6-diclorobenz-imidazol, etopósido, formestano, fostriecina, hispidina, ácido 2-imino-1-imidazolidinacético (ciclocreatina), mevinolina, tricostatina A, tirfostina AG 34 y tirfostina AG 879.

Ejemplos de reguladores génicos anticancerígenos incluyen 5-aza-2'-desoxicitidina, 5-azacitidina, colecalciferol (vitamina D3), 4-hidroxitamoxifeno, melatonina, mifepristona, raloxifeno, trans-retinal (aldehídos de la vitamina A), ácido retinoico, ácido de vitamina A, ácido 9-cis-retinoico, ácido 13-cis-retinoico, retinol (vitamina A), tamoxifeno y troglitazona.

Otras clases preferidas de agentes anticancerígenos incluyen, por ejemplo, la familia de fármacos de pteridinas, diynenes y podofilotoxinas. Miembros particularmente útiles de esas clases incluyen, por ejemplo, derivados de metopterina, podofilotoxina o derivados podofilotoxina tales como etopósido o fosfato de etopósido, leurosidina, vindesina, leurosina y similares.

Todavía otros agentes anticancerígenos que son compatibles con las enseñanzas en el presente documento incluyen auristatinas (p. ej., auristatina E y monometilauristán E), geldanamicina, calicheamicina, gramicidina D, maitansanoides (p. ej., maitansina), neocarcinostatina, topotecán, taxanos, citocalasina B, bromuro de etidio, emetina, tenopósido, colchicina, dihidroxi-antracindiona, mitoxantrona, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Todavía otros agentes anticancerígenos que son compatibles con las enseñanzas del presente documento incluyen derivados de tomaimicina, derivados de maitansina, derivados de criptoficina, derivados de antraciclina, derivados de bisfosfonato, derivados de leptomicina, derivados de estreptonigrina, derivados de auristatina y derivados de duocarmicina.

Otra clase de agentes anticancerígenos compatibles que se pueden usar como restos fármacos son fármacos radiosensibilizantes que pueden dirigirse de manera eficaz a células tumorales o inmunorreactivas. Dichos restos fármacos potencian la sensibilidad a la radiación ionizante, aumentando de ese modo la eficacia de la radioterapia. No debe estar limitado por la teoría, pero un anticuerpo modificado con un resto fármaco radiosensibilizante e internalizado por la célula tumoral entregaría el radiosensibilizador más cerca del núcleo donde la radiosensibilización sería máxima. Los anticuerpos que pierden el resto radiosensibilizador se limpiarían rápidamente de la sangre, localizando el agente de radiosensibilización restante en el tumor diana y proporcionando una absorción mínima en los tejidos normales. Después de la limpieza de la sangre, la radioterapia adjunta podría administrarse mediante radiación de haz externo dirigido específicamente al tumor, radioactividad directamente implantada en el tumor o radioinmunoterapia sistémica con el mismo anticuerpo modificado.

En una realización, el agente terapéutico comprende radionucleidos o radiomarcadores con radiación ionizante de alta energía que son capaces de causar múltiples roturas de cadena en el ADN nuclear, lo que conduce a la muerte celular. Ejemplos de radionucleidos de alta energía incluyen: 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re y 188Re. Estos isótopos producen típicamente partículas a o p de alta energía que tienen un camino óptico corto. Dichos radionucleidos destruyen las células a las que se encuentran muy próximos, por ejemplo, las células neoplásicas a las que se ha unido o ha entrado el conjugado. Tienen poco o ningún efecto

sobre las células no localizadas y son esencialmente no inmunogénicos. Como alternativa, se pueden generar isótopos de alta energía mediante irradiación térmica de un isótopo que, de otro modo, sería estable como, por ejemplo, en la terapia por captura de neutrones de boro (Guan y col., PNAS, 95: 13206-10, 1998).

En una realización, el agente terapéutico se selecciona de MMAE, MMAF y PEG8-Dol10.

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Ejemplos de restos efectores terapéuticos incluyen las estructuras:

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En algunas realizaciones, el resto efector contiene más de un agente terapéutico. Estos agentes terapéuticos múltiples pueden ser iguales o diferentes.

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i. Restos efectores de diagnóstico

En algunas realizaciones, los polipéptidos de unión de la presente divulgación están conjugados con un resto efector que comprende un agente de diagnóstico. En una realización, el agente de diagnóstico es un marcador detectable de molécula pequeña, p. ej., biotina, fluoróforos, cromóforos, sondas de resonancia de espín o radiomarcadores. Ejemplos de fluoróforos incluyen colorantes fluorescentes (p. ej., fluoresceína, rodamina y similares) y otras moléculas luminiscentes (p. ej., luminal). Un fluoróforo puede ser ambientalmente sensible de modo que su fluorescencia cambie si se encuentra cerca de uno o más residuos en el polipéptido de unión modificado que experimente cambios estructurales al unirse a un sustrato (p. ej., sondas de dansilo). Ejemplos de radiomarcadores incluyen moléculas pequeñas que contienen átomos con uno o más núcleos de baja sensibilidad (13C, 15N, 2H, 125I, 124I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 64Cu, 68Ga, 111In y similares). Preferiblemente, el radionucleido es un radionucleido emisor de rayos gamma, fotones o positrones con una semivida adecuada para permitir la actividad o detección después del tiempo transcurrido entre la administración y la localización en el sitio de formación de imágenes.

En una realización, el agente de diagnóstico es un polipéptido. Ejemplos de polipéptidos de diagnóstico incluyen enzimas con actividad fluorogénica o cromogénica, p. ej., la capacidad para escindir un sustrato que forma un fluoróforo o cromóforo como un producto (es decir, proteínas informadoras tales como luciferasa). Otras proteínas de diagnóstico pueden tener actividad fluorogénica o cromogénica intrínseca (p. ej., proteínas de aecuorinas bioluminiscentes fluorescentes verdes, rojas y amarillas de organismos marinos bioluminiscentes) o pueden comprender una proteína que contiene uno o más núcleos radiactivos de baja energía (13C, 15N, 2H, 125I, 124I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 64Cu, 68Ga, 111In y similares).

Con respecto al uso de conjugados radiomarcados junto con la presente divulgación, los polipéptidos de unión de la presente divulgación pueden marcarse directamente (tal como por yodación) o pueden marcarse indirectamente mediante el uso de un agente quelante. Como se usa en el presente documento, las frases "marcaje indirecto" y "planteamiento de marcaje indirecto" significan que un agente quelante se une covalentemente a un polipéptido de unión y al menos un radionucleido está asociado con el agente quelante. Dichos agentes quelantes se denominan típicamente agentes quelantes bifuncionales ya que se unen tanto al polipéptido como al radioisótopo. Ejemplos de agentes quelantes comprenden derivados de ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen-triaminopentaacético ("MX- DTPA") y de ácido ciclohexil-dietilentriamino-pentaacético ("CHX-DTPA"). Otros agentes quelantes comprenden derivados de P-DOTA y AEDT. Radionucleidos particularmente preferidos para el marcado indirecto incluyen 111In y 90Y. La mayoría de los estudios de imagen utilizan 5 mCi de anticuerpo marcado con 111In, porque esta dosis es segura y tiene una mayor eficiencia de imagen en comparación con dosis más bajas, y la óptima formación de imágenes que se produce entre tres y seis días después de la administración del anticuerpo. Véase, por ejemplo, Murray, (1985), J. Nuc. Med. 26: 3328 y Carraguillo y col. (1985), J. Nuc. Med. 26:67. Un radionucleido particularmente preferido para el marcado directo es 131I. Los expertos en la técnica comprenderán que conjugados no radiactivos también se pueden ensamblar dependiendo del agente seleccionado para conjugarse.

En algunas realizaciones, el resto efector de diagnóstico es una sonda FRET (Transferencia de Energía de Resonancia de Fluorescencia). FRET se ha utilizado para una variedad de aplicaciones de diagnóstico, incluido el diagnóstico del cáncer. Una sonda FRET puede incluir un enlazador escindible (enlazador enzimático o sensible al pH) que conecta los restos dador y aceptor de la sonda FRET, en donde la escisión da como resultado un aumento de la fluorescencia (que incluye el infrarrojo cercano) (véase, por ejemplo, A. Cobos-Correa y col., Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation, Nature Chemical Biology (2009), 5(9), 628-63; S. Gehrig y col., Spatially Resolved Monitoring of Neutrophil Elastase Activity with Ratiometric Fluorescent Reporters (2012) Angew. Chem. Int. Ed., 51,6258 -6261).

En una realización, el resto efector se selecciona de:

imagen34

imagen35

imagen36

En algunas realizaciones, los restos efectores de la invención se pueden funcionalizar para que contengan grupos 5 adicionales además del resto efector en sí. Por ejemplo, el resto efector puede contener enlazadores escindibles que liberen el resto efector del polipéptido de unión en condiciones particulares. En realizaciones de ejemplo, el resto efector puede incluir un enlazador que sea escindible por enzimas celulares y/o sea sensible al pH. Además o alternativamente, el resto efector puede contener un enlace disulfuro que sea escindido mediante glutatión intracelular tras la incorporación en la célula. Ejemplos de enlazadores de disulfuro y sensibles al pH se 10 proporcionan a continuación:

imagen37

En aún otras realizaciones, el resto efector puede incluir restos hidrófilos y biocompatibles tales como poli(glicina), poli(oxazolina) o restos de PEG. Las estructuras de ejemplo ("Y") se proporcionan a continuación:

imagen38

imagen39

R = H, grupo no sustituido o funcional que contiene grupos alquilo

P y Q = grupos funcionales iguales o diferentes para unir fármacos, moléculas informadoras y proteínas

5 En algunas realizaciones, el resto efector contiene un grupo aminooxi que facilita la conjugación con un polipéptido de unión a través de un acoplamiento oxima estable. Ejemplos de restos efectores que contienen grupos aminooxi se muestran en la Tabla 2 del presente documento.

Tabla 2. Ejemplos de restos enlazadores funcionalizados aminooxi

Tabla 2. Ejemplos de restos efectores aminooxi (en donde X puede ser cualquier enlazador, Y es cualquier 10 espaciador, y en donde X y/o Y son opcionales)

Fármaco, en el presente documento, puede ser cualquier fármaco de la tabla 1 en el texto. Fármaco 1 y Fármaco 2 pueden ser fármacos iguales o diferentes.

Z-Y-X-Fármaco

imagen40

W-N

X- Fármaco O^N'^v^0'NH2

imagen41

Claims (54)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo aislado que comprende un dominio Fc de IgG1 humana, en donde el dominio Fc de IgG1 humana comprende un residuo asparagina glicosilada en la posición 298 de aminoácido, según la numeración de la UE; y un residuo serina o treonina en la posición 300 de aminoácido, según la numeración de la UE.
2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el dominio Fc de IgG1 humana comprende además un residuo alanina en la posición 299 de aminoácido, según la numeración de la UE; o el dominio IgG1 Fc humana comprende además un residuo glutamina en la posición 297 de aminoácido, según la numeración de la UE.
3. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, en donde se cumplen una o más de las siguientes condiciones:

   a) la cadena lateral del residuo asparagina en la posición 298 de aminoácido, según la numeración UE, está enlazada a un glicano a través de un acoplamiento de p-glicosilamida;

   b) la cadena lateral del residuo asparagina en la posición 298 de aminoácido, según la numeración UE, está enlazada a un glicano a través de un acoplamiento de p-glicosilamida, y:

   i) el glicano es un glicano biantenario;

   ii) el glicano es una glicoforma de mamífero de origen natural;

   iii) el glicano comprende un grupo aldehido reactivo;

   iv) el glicano comprende un residuo sacárido oxidado que comprende un grupo aldehido reactivo; o

   v) el glicano está unido a un resto efector.

   de la de la

   El anticuerpo según la reivindicación 3, en donde se cumplen una o más de las siguientes condiciones:

   a) el residuo sacárido oxidado es un ácido siálico o galactosa terminales;

   b) el resto efector es una citotoxina;

   c) el resto efector es un agente de diagnóstico;

   d) el resto efector es un agente terapéutico, en donde opcionalmente el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un resto fármaco, un resto profármaco y un compuesto radiomarcado

   e) el resto efector comprende un enlazador sensible al pH, un enlazador disulfuro, un enlazador sensible a enzima u otro resto enlazador escindible que libera el resto efector del anticuerpo cuando se escinde; y

   f) el resto efector comprende un resto de enlazador seleccionado del grupo de restos de enlazador representados a continuación:

   o

   A,

   (¡)

   “ R'V

   (ii)

   (iii)

   imagen1

   4

   (v)

   imagen2

   (vi)

   imagen3

   imagen4

   (vii)

   imagen5

   (viii)

   imagen6

   imagen7

   5

   y (ix)

   imagen8

   imagen9

   donde R1, R2, R3, R4 y R5 son H, alquilo o arilo.
4. 5. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 3-4, en donde se cumplen una o más de las siguientes condiciones:

   a) la citotoxina se selecciona del grupo de citotoxinas representadas a continuación:

   imagen10

   imagen11

   5

   imagen12

   imagen13

   imagen14

   y

   arilo

   i

   en donde R = alquilo, arilo, alcoxi, ariloxi, R2, R3 = alquilo,

   b) el resto efector está ligado mediante un acoplamiento oxima o hidrazona a un residuo sacárido del glicano; y

   c) el resto efector está enlazado mediante un acoplamiento oxima o hidrazona a un residuo sacárido del glicano, en donde el residuo sacárido es un residuo terminal de ácido siálico o galactosa del glicano.
5. 6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende un dominio Fc de IgG1 humano que comprende un residuo asparagina en la posición 297, según la numeración de la UE; un residuo asparagina

   5 glicosilado en la posición 298, según la numeración de la UE; un residuo alanina en la posición de aminoácido 299, según la numeración de la UE; y un residuo serina en la posición de aminoácido 300, según la numeración de la UE.
6. 7. Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
7. 8. Una cantidad efectiva de la composición de la reivindicación 7 para usar como un medicamento.

   10 9. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. 10. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9.
9. 11. Una célula anfitriona que comprende el polinucleótido de la reivindicación 9 o el vector de la reivindicación 10.
10. 12. Un procedimiento para preparar un anticuerpo que comprende expresar en una célula el polinucleótido de la reivindicación 9 o el vector de la reivindicación 10.

    15

    en

    co

    Carbohidratos existentes

    Sitios de glicosilación modificados genéticamente

    imagen15

    imagen16

    imagen17

    imagen18

    Fig. 1

    O)

    o

    kDa M wt N297Q T299A NSY STY SY Agly Aab M wt N297Q T299A NSY STY SY Agly Aab

    imagen19

    Fig.2

    No reducida

    Reducida

    Respuesta relativa (UR) ^ Respuesta relativa (UR)

    Unión a FcgRIIIa VAL158 humano de a(5TCR HEBE1 IgG mutantes

    imagen20

    -------WT

    ------- N297Q

    ........T299A

    -------N297Q/S298N/Y300S

    S298N/T299A/Y300S S298N/Y300S Agly ---------Aab

    0 100 200 300 400 500 600

    Tiempo (s)

    Unión a FcgRllla-Val158 humano de afJTCR HEBE1 IgG mutantes

    imagen21

    --------WT

    -------- N297Q

    ..........T299A

    --------N297Q/S298N/Y300S

    --------S298N/T299A/Y300S

    --------S298N/Y300S

    -------Agly

    -------Aab

    imagen22

    0 100 200 300 400 500 600

    Tiempo (s)

    Respuesta relativa (UR) ¿f Respuesta relativa (UR)

    Unión a FcgRllla-Phe158 humano de apTCR HEBE1 IgG mutantes

    imagen23

    Tiempo (s)

    Unión a FcgRllla-Phe158 humano de OpTCR HEBE1 IgG mutantes

    150

    125

    100

    75

    50

    25

    0

    -25

    100 200 300 400 500 600

    WT

    N297Q ■T299A

    N297Q/S298N/Y300S

    S298N/T299A/Y300S

    S298N/Y300S

    ■Agly

    Tiempo (s)

    Unión a FcyRI humano de apTCR HEBE1 IgG mutantes

    imagen24

    Tiempo (s)

    imagen25

    Ampliada en:

    Unión a FcyRI humano de a|STCR HEBE1 IgG mutantes

    imagen26

    Tiempo (s)

    imagen27

    imagen28

    imagen29

    imagen30

    A

    Inmunotransferencia

    CD

    -v]

    Campath (ng) 2C3 anti-CD52

    imagen31

    11

    10 fjl CM/calle

    1 - WT

    2- WT

    3- A114N

    4 - Y436S

    5 - Y436T

    6 - S440N

    7 - S442N 8-NGT

    9 - 298N/Y300S

    10 - Simulación

    11 - Medio

    imagen32

    B

    ESiacore

    Desconocido

    Conc. (|jg/ml) Respuesta Relativa (UR) Conc. Calc.(M) Conc. Cale. (Mg/ml)

    2C3 en el medio

    3,00 855,75 2,45E-08 3,669

    2C3 en el medio

    3,00 860,96 2.47E-08 3,710

    2C3 en el medio

    3,00 866,89 2,51 E-08 3,758

    A114N

    146,5 1.60E-09 0,240

    Simulación

    87,84 8,62E-10 0,129

    NGT

    124,52 1.30E-09 0,196 I

    S298N/Y300S

    112,14 1,15E-09 0,172

    S440N

    146,36 160E-09 0,240 ¡

    S442N

    121,21 1.26E-09 0,189 ¡

    WT (Katya)

    148,41 1.63E-09 0,244

    WT ÍTim)

    148,08 1.62E-09 0,244

    Y436S

    158,72 1.78E-09 0,267

    Y436T

    84,27 8,23E-10 0,123

    Medio incubado

    87,38 8,57E-10 0,129

    PNGasa F

    wt A114N Y436S Y436T S440N _ + _ + _+ _+ _ +

    imagen33

    imagen34

    10 |jCM/calle

    S298N/

    me Campath, ng wt S442N NGT Y300S me Campath, ng

    -2 1 0,5 ;í - + - + - + - + + 2 1 0,5

    imagen35

    Fig. 10

    Calle

    Mutante mg/ml

    1

    wt 2,66

    2

    A114N 2,99

    3

    Y436S 1,61

    4

    S298N/Y300S 0,99

    5

    Y436T 0,41

    6

    S440N 1,21

    7

    S442N 1,62

    8

    NGT 2,21

    M12 345678

    imagen36

    Fig. 11

    imagen37

    Union peptidica CD52

    120-1

    a

    100-

    3

    S298N/Y300S

    50-

    40

    50 0 50 100 150200250 300 350400450 500

    Tiempo (s)

    Unión FcyRIIIa-Vall58

    120

    Tipo salvaje

    0£

    100-

    3

    smmms

    Tiempo (s)

    Union a FcRn de ratón

    □£ 800-

    > 600

    400-

    S298N/Y300S

    200-

    Q.

    50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

    Tiempo (s)

    Fig

    .12

    Respuesta Respuesta

    imagen38

    100

    200

    300

    Tiempo

    400

    500

    600

    | nnn

    imagen39

    Fig.13

    Respuesta Respuesta

    A

    imagen40

    B

    imagen41

    Fig.14

    imagen42

    Muestra

    ka(x106/Ms) kd(x10'2/s) Rmáx(RU) KD(nM)

    GLD52

    7,0 1,7 67,0 2,44

    WT2C3

    6,0 1,1 64,2 1,75

    A114N

    4,7 1,1 59,5 2,45

    Y436S

    5,9 1,0 66,9 1,73

    S298N7Y300S

    5,7 1,0 63,3 1,80

    Y436T

    4,8 0,9 65,7 1,95

    S440N

    5,8 1,1 66,8 1,84

    S442N

    5,7 1,1 66,2 1,85

    NGT

    7,9 1,1 70,2 1,35

    Fig. 16

    Muestra K on (x106M'1s'1) K off (x10V) KD (nM)

    WT2C3 5,2 1,1 2,1

    A114N 5,3 1,3 2,4

    Fig. 17

    imagen43

    Reconstrucción de masas de Deconvolucion de +TOF

    Max. 24.73,3 cps

    Ms: 34,114 a 45,998 min de aCD52_147.wiff
11. 49962.0000
12. 2473 .

    2400-

    2300-
13. 50124.0000

    2200-

    2100-

    2000

    1900

    3298N/Y300S

    1800

    1700

    1600-

    1500-

    : 1400

    T3

    re 1300-

    T3

    5 1200-

    1100

    S 1000-
14. 50157.0000

    800-

    700-

    600
15. 50287.0000
16. 49991.0000

    500

    400
17. 49921.0000

    300-

    200-

    100-
18. 4.90e4 4.92e4 4.94e4 4.90(4 4.98e4 5.00e4 5.02e 5.04e4 5.00 • 5.08e4 5.10e4 5.12e4

    Masa, urna

    Fia. 18

    555

    540 •

    520 ■

    500

    480

    460 ■

    440

    420

    400 ■

    380

    360 ■

    340 ■

    320 ■

    300 ■

    280 •

    260

    240 ■

    220 •

    200 ■

    180 ■

    160 ■

    140 ■

    120 •

    100

    80 ■

    60 ■

    40 ■

    20 ■

    0

    m

    GOF + Biant/Fuc 51823,0000 0 G2F + G0F

    A114N

    GOF - Gn +Biant./Fuc
19. 51499.0000
20. 51661.0000 GOF + GOF? 51620.0000
21. 51042.0000
22. 51701.0000.

    jnnnn

    imagen44

    G1F +Biant7Fuc

    5^ 984 0000 ^,G0F + bisecar Biant./Fuc

    o GOF + Triant/Fuc
23. 51863.0000

    GoF + Biant./Fuc/Monosial
24. 52116.0000

    G1F + bisecar Biant./Fuc o G1F +Triant./Fuc
25. 52277.0000

    G1F + Biant./Fuc/Monosial
26. 52188.0000
27. 52147.0000

    y GOF +Biant./Fuc/Bisial

    291 /

    524150000 G1F+Biant./Fuc/Bisial

    i
28. 5.06e4 5.08e4 5.10e4 5.12e4 5.14e4 5.16e4 5.18e4 5.20e4 5.22e4 5.24e4 5.26e4 5.28e4

    ^ § (continuación) Masa, urna

    Ü8

    5200

    5000

    4800

    4600

    4400

    4200

    4000

    3800

    3600

    3400

    3200

    3000

    2800

    2600

    2400

    2200

    2000

    1800

    1600

    1400

    1200

    1000

    800

    600

    400

    200

    0

    4

    X
29. 50010.0000

    Máx. 55.199 cps

    GOF

    WT (2C3)

    G1F
30. 50173.0000

    0e4
31. 4.92e4
32. 4.94e4
33. 4.96e4
34. 4.98e4

    G2F
35. 50295.0000

    ii____JL

    Uh
36. 5.00e4
37. 5.02e4
38. 5.04e4
39. 5.06e4
40. 5.08e4
41. 5.10e4

    I I
42. 5.12e4

    (continuación)

    Masa, urna

    imagen45

    Con. de octet

    (ug/ml)

    Muestra

    Lote n.°

    11/23/2009

    Medio de prueba

    demasiado bajo

    wt2C3

    11/23/2009

    A114N

    11/23/2009

    S293N/Y300S

    11 23 2009

    S440N

    11 23 2009

    S442N

    11/23/2009

    Y436S

    11 23 2009

    Y436T

    11/23/2009

    NGT

    11/23/2009

    tampon - 0

    Union peptidicaCD52

    GLD52-2.00nM

    control 2C3 - ¿.OOnM

    WT 2C3 - 2.00nM

    - A114N -2.00nM

    S298N/Y300S - 2.00nM

    S440N -2.00nM

    S442N -2.00nM

    Y436S - 2.00nM

    . Y436T - 2.00nM

    NGT-2.00nM

    Tiempo

    Fia.

    Anti-TEM1

    wt A114N

    imagen46

    ___►Cadena pesada hiperglicosilada

    * Cadena pesada Cadena ligera

    Cadena ligera

    Fig. 20

    .__

    "— ^

    - suero

    O i— (D 3 cn + co o N <D E

    ^'

    --—'

    CO

    co co

    □

    O O

    No reductor

    imagen47

    CO CO CO

    □ O o

    Reductor

    imagen48

    Fig. 21

    35

    30

    25

    20

    15

    10

    5

    0

    20

    15

    10

    5

    0

    30

    20

    10

    0

    25

    20

    15

    10

    5

    0

    Análisis HIC de Herceptina A114N purificada k ~~

    --------1---------1---------1---------1------ 4 5 J

    6 " 7 ' 8 \ Herceptina A114N \ Día 3 Lipo + HP

    --------1---------1---------1---------1------ 4 5 J

    —i---------1---------1---------1---------1 i 6 7 8 \ Herceptina A114N \ y/ Día 6 Lipo (- suero)

    --------1---------1---------1---------1------ 4 5 1

    --1---------1---------1---------1---------1---------i 6 7 8 \ Herceptina A114N I Día 6 HP (+ suero)

    T-----------------------------1-----------------------------1-----------------------------1-----------------------------1-----------------------------1-----------------------------1-----------------------------1-----------------------------1----------------------------1

    4

    5

    6

    7

    8

    Marcador

    1—

    ----1 1---- —1 A114N WT

    E E E E "E "E

    O) ~S) ~S) O) c

    E E E E O) O)

    __

    O LO O LO E E

    o

    o LO LO

    U

    . « ■ ■ . «

    c

    c' c' c c' c c"

    o

    o

    s o © o © ©

    O

    o o o o o O o

    imagen49

    GAM+ SAM

    Fig. 22

    728

    700

    650

    600

    550

    500

    450

    400

    350

    300

    250

    200

    150

    100

    50

    0
43. 5.

    - 1

    Máx. 1.8e4 cps

    nstrucción de masas de Deconvolución de +TOF Ms:25,984 a 39,985 min de TEM_0065.wiff
44. 53344.00 G0F+

    Cadena Pesada

    A114N

    Anti-TEM1

    G0F+

    Biant./Fuc/Monosial
45. 53055.00

    Biant./Fue/Bísial

    G1F+

    Biant/Fuc/Bisial
46. 53507.00

    G0+

    Biant./Fuc/Monosial

    G0F+G0 G0F+G2F 52292.00 o G1F+G1F G0F+G0F

    GOF+Biant/Bisial o G0+B¡ant./Fuc/Bisíal

    imagen50

    GOF+núcleo+GIcNac
47. 5.35e4
48. 5.40e4
49. 5.45e4

    1—i
50. 5.50e4

    Masa, urna

    Intensidad, cps Intensidad, cps

    imagen51

    imagen52

    B

    Amlnooxi -Cys_MC-VC-PABC-MMAE

    imagen53

    00

    CD

    Amínooxi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Doi10

    imagen54

    Fig. 25

    (continuación)

    Región

    variable

    imagen55

    imagen56

    Fig. 25

    (continuación)

    Síntesis de aminooxi -Cys-MC-VC-PABC-MMAE y aminooxi-Cys-MC-VC-PABC-PEG8-Dol10

    oo

    oo

    imagen57

    +

    imagen58

    DMF

    imagen59

    imagen60

    DMF,DiPEA ------------►

    Aminooxi-Cys-MC-

    VC-RABC-MMAE

    imagen61

    imagen62

    Fig. 26

    imagen63

    imagen64

    imagen65

    Peryodato, mM

    Union a FcRn humana de

    herceptina siahlada oxidada

    100

    L ST-HER

    L OX ST-HER

    L2 ST-HER

    L2 OX ST-HER

    ------------HEROmM (Dec)

    ------------OX HER 1mM Dec

    ---------Herceptina

    Tiempo (s)

    Fia. 28

    imagen66

    herceptina sialilada oxidada

    L1 ST-HER

    L1 OX ST-HER

    L2 ST-HER

    L2 0X ST-HER

    - HEROmM (Dec)

    OXHERImM Dec

    Herceptina

    Tiempo (s

    D

    Union a FcRn de herceptina siahlada oxidada

    FcRn humana FcRN de ratón

    110 n

    100 -

    70

    50-

    30

    0 —

    Fia. 28

    (continuación)

    imagen67

    DAD1 A, Sig=280,4 Ref=§00,50 (AP111011\AP111011 2011-11-10 33-0501.D)

    Norm.
51. 17.5 15
52. 12.5 10
53. 7.5 5
54. 2.5 0

    -2,5

    1 A. Anti FAP B11-AO-MMAE

    DAR 1.5

    0

    1 2 ^ ———-----------

    mn

    DAD1 A, S¡g

    280,4 Ref=500,50 AP1110111AP111011 2011-11-10 34-0601.D

    Norm.

    B. Anti FAP G11-AO-MMAE DAR 1.32

    mn

    DAD1 A, Sig

    280,4 Ref=500,50 AP0126121AP012612 2012-01-26 22-0201.D

    Norm

    C. Trastuzumab-Au-MMAE DAR 1.88

    min

    Norm.iDAD1A’S'9

    280,4 Ref=500,50 AP0126121AP012612 2012-01-26 22-0201.D

    D. Trastuzumab-AO-PEG8-Dol10

    12,5 -

    D

    min

    Fig.29

    imagen68

    imagen69

    A SK-Br-3 (Her2+) 72h

    imagen70

    Anticuerpo |jg/ml

    B MBA-MB-231 (Her2) 72h

    imagen71

    Anticuerpo (jg/ml

    Fig.

    % de células viables % de células viables

    C SK-Br-3 (Her2*) 72h

    imagen72

    Anticuerpo yglm\

    D MBA-MB-231 (Her2) 72h

    imagen73

    Anticuerpo [jg/ml

    % Viable

    Proliferación de células de CHO ± FAP

    imagen74

    Fig.32

    Volumen de tumor (mm3)

    Crecimiento tumoral AO-MMAE

    imagen75

    Días después inyectar células tumorales

    lili

    10mpk i.v.

    Supervivencia AO-MMAE

    C

    o

    ro’

    +■»

    c

    a)

    o

    I—

    o

    imagen76

    Días en el estudio

    B Crecimiento tumoral AO-DoMO

    2000

    'e

    TiolMMAE

    & 1500- L_

    Glico MMAE

    O

    Trastuzumab

    I 1000-

    Vehículo

    de 1 en O o _l__

    c

    a>

    E

    O

    >

    imagen77

    TiolDoUO 10mmpk Glico DoMO 10mpk Tiol Dolí O 3mpk Vehículo

    T-------1-------1-------1-------1-------1-------1-------1—

    O 20 40 60 80 100

    Días después inyectar células tumorales

    lili

    10mpk i.v.

    imagen78

    Fig.

    Días en el estudio

    LC/MC de cadena pesada S298N/T299A/Y300S (NNAS)

    imagen79

    Masa, urna

    Fig. 34

    control Aab

    imagen80

    Señal CD

    S298N/T299A/Y300S

    imagen81

    Temperatura (°C)

    Fig. 35

    % de células viables % de células viables

    SK-BR-3 (Her2+) 72h

    imagen82

    MDA-MB-231 (HER2nes) 72h

    imagen83

    F/g. 36