ES2686780T3

ES2686780T3 - Vacuna de toxinas bacterianas

Info

Publication number: ES2686780T3
Application number: ES09738819.3T
Authority: ES
Inventors: Kazutoshi Sawada; Kazuya Yoshida; Takeshi Matsui
Original assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd; Nara Institute of Science and Technology NUC
Current assignee: Idemitsu Kosan Co Ltd; Nara Institute of Science and Technology NUC
Priority date: 2008-05-02
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2029-04-28
Also published as: US8846052B2; EP2728004B1; MX2010011938A; JPWO2009133882A1; KR20110009197A; EP2287300A4; US20110231960A1; CN102016034A; DK2728004T3; AR071232A1; DK2287300T3; EP2287300A1; CN103626876A; US20150133635A1; KR101540496B1; WO2009133882A1; ES2691985T3; EP2728004A3; CN103626876B; TW201005093A

Abstract

Una proteína híbrida que comprende (a) dos proteínas toxinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína toxina Shiga (Stx), proteína toxina del cólera (CT) o proteína toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT), en donde dichas proteínas toxinas se unen en tándem a través de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84, y (b) un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84 unido al extremo C de las proteínas toxinas unidas en tándem de (a), en donde la proteína Stx es una proteína Stx2eB, en donde la proteína CT es una subunidad B de la proteína CT, y en donde la proteína LT es una subunidad B de la proteína LT.

Description

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DESCRIPCION

Vacuna de toxinas bacterianas Campo técnico

La presente invención se refiere a una proteína híbrida usada para vacunas para enfermedades causadas por toxinas bacterianas tal como toxinas Shiga, toxinas del cólera, y toxinas lábiles al calor de Escherichia coli, y una construcción de ADN para producir la proteína híbrida.

Antecedentes técnicos

Las toxinas Shiga (Stx, verotoxinas) son exotoxinas proteinaceas producidas por Escherichia coli enterohemorrágica de especies de Escherichia coli patógenas. Las toxinas Shiga causan enteritis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico, encefalopatía y similares.

Las toxinas Shiga se clasifican ampliamente en Stx1 y Stx2, cada una de las cuales se clasifica adicionalmente en subclases. Un ejemplo de Stx2 incluye Stx2e que produce la enfermedad de edemas del cerdo. Se sabe que la enfermedad de edemas del cerdo se produce con frecuencia en cerdos recién nacidos una o dos semanas después del destete. La letalidad debido a infección con las bacterias de la enfermedad de edemas es del 50 al 90%, que es extremadamente alta.

Además, las toxinas del cólera (CT) son exotoxinas proteinaceas producidas por Vibrio cholerae. Se sabe que las CT producen diarrea y emesis graves.

Aún más, las toxinas lábiles al calor de Escherichia coli (LT) son endotoxinas proteinaceas producidas por Escherichia coli enterotoxigénica. Se sabe que las LT producen diarrea y emesis.

Se sabe que las toxinas bacterianas, Stx, LT y CT incluyen todas un pentámero subunidad B implicado en adhesión a las células y un monómero subunidad A que tiene una toxicidad. También se sabe que las LT y las CT son estructural y funcionalmente similares.

Como método de prevenir las enfermedades causadas por esas toxinas bacterianas, se conocen métodos de administrar una vacuna mediante una inyección o un espray nasal y administrar la vacuna por vía oral.

Por ejemplo, se conoce una tecnología donde se produce una proteína Stx2e atenuada usando Escherichia coli recombinante y se administra a cerdos mediante una inyección (documento de no patente 1). Sin embargo, por ejemplo, una cantidad de la proteína Stx2e atenuada producida por la Escherichia coli recombinante no es suficiente y la administración de la vacuna mediante inyección requiere trabajo humano. Esto ha sido un problema.

Además, el método de administrar la vacuna por vía oral atrae atención creciente en términos de reducir el trabajo en un campo de ganadería. En tal contexto, se ha desarrollado una tecnología donde la proteína de toxina bacteriana se produce por plantas usando una tecnología transgénica. Por ejemplo, se ha descrito una planta transgénica que contiene ADN que codifica una subunidad B de la proteína LT (LTB) y expresa el ADN (documentos de patente 1 y 2). También se ha descrito una planta transgénica que expresa ADN que codifica la proteína LT o la proteína CT (documento de patente 3). Sin embargo, ha habido un problema que la cantidad de la proteína producida no es suficiente en esas tecnologías. Se ha descrito un ejemplo de producir la LTB en Lactuca sativa (documento de no patente 2). En este estudio, un gen de la subunidad B de la proteína LT incluyendo codones modificados se expresa en Lactuca sativa usando tanto un promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) que es un promotor que se expresa mucho en una planta como una secuencia de Kozak que es un potenciador. Como resultado, se ha descrito que la subunidad B de la proteína LT se acumula en una cantidad de aproximadamente el 2,0% en masa de la proteína soluble total de Lactuca sativa. Sin embargo, se piensa que este nivel de la proteína acumulada es insuficiente para prevenir eficazmente una enfermedad bacteriana utilizando la planta transgénica. Es decir, es necesario producir y acumular de forma eficaz la proteína de la toxina bacteriana diana en células vegetales. Se proporciona una subunidad de toxina bacteriana híbrida por el documento WO 2005/011733. Se proporciona un híbrido adicional que comprende la subunidad A de LT-A y la subunidad B de CT-B por el documento WO 2001/89456. La inmunogenicidad de un híbrido que comprende la subunidad B de la toxina Shiga 2 y la subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de E. coli ha sido estudiada por Ran (2007) Veterinary Microbiology 127, no.1-2, páginas 209-215.

Los inventores de la presente invención encontraron que la proteína Stx2e se podría producir de forma eficaz en una planta tal como Lactuca sativa y acumular a una alta concentración en un cuerpo vegetal expresando la proteína Stx2e donde un péptido señal secretor derivado de una planta se ha añadido a su extremo amino, usando una región 5' no traducida (ADH 5'-UTR) de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, y presentaron la patente (documento de patente 4).

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[Documento de patente 1] JP 10-5077916 A [Documento de patente 2] JP 2000-166411 A [Documento de patente 3] JP 2002-533068 A [Documento de patente 4] WO 2009/004842 A1

[Documento de no patente 1] Makino et al., Microbial Pathogenesis, Volumen 31, Número 1, Julio 2001, pp. 1-8(08) [Documento de no patente 2] Kim et al., Protein Expression and Purification, Volumen 51, Número 1, Enero 2006, pp. 22-27(06)

Compendio de la invención

Es un objeto de la presente invención producir de forma más eficaz una proteína Stx y otras proteínas toxinas bacterianas que tienen una conformación similar a la misma usando células vegetales.

Mediante la producción de una proteína híbrida en la que dos o tres proteínas toxinas bacterianas tales como Stx2e y CT se unen en tándem a través de un péptido que tiene una secuencia particular en células vegetales, los inventores han tenido éxito en acumular la proteína toxina bacteriana a una alta concentración en células vegetales y han completado la presente invención.

La presente invención es como sigue:

(1) Una proteína híbrida que comprende

(a) dos proteínas toxinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína toxina Shiga (Stx), proteína toxina del cólera (CT) o proteína toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT), en donde dichas proteínas toxinas se unen en tándem a través de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84, y

(b) un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84 unido al extremo C de las proteínas toxinas unidas en tándem de (a),

en donde las proteínas Stx es una proteína Stx2eB, en donde la proteína CT es una subunidad B de la proteína CT, y en donde la proteína LT es una subunidad B de la proteína LT.

(2) La proteína híbrida según el punto 1, en donde dichas proteínas toxinas están unidas en tándem a través de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2.

(3) La proteína híbrida según el punto 1 o 2, que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14 o 16.

(4) La proteína híbrida según el punto 1, que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 90, 92, 98 o 100.

(5) La proteína híbrida según cualquiera de los puntos 1 a 4, en donde un péptido señal secretor derivado de una planta se añade a su extremo amino.

(6) La proteína híbrida según cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde un péptido señal de retención en el retículo endoplásmico se añade en su extremo carboxilo.

(7) Una construcción de ADN que comprende ADN que codifica la proteína híbrida según cualquiera de los puntos 1 a 6.

(8) La construcción de ADN según el punto 7, que comprende ADN que tiene una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 13, 15, 89, 91, 97 o 99.

(9) La construcción de ADN según el punto 7 o 8, en donde el ADN que codifica una proteína híbrida está operativamente unido a una región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta.

(10) La construcción de ADN según el punto 9, en donde la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta deriva de Nicotiana tabacum.

(11) La construcción de ADN según el punto 10, que comprende una secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 28, 29, 101, 102, 103, 104, 108, 109, 110 o 111.

(12) Un vector recombinante que comprende la construcción de ADN según cualquiera de los puntos 7 a 11.

(13) Un transformante transformado con el vector recombinante según el punto 12.

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(14) El transformante según el punto 13, en donde el transformante es una célula vegetal transformada o una planta transformada.

(15) Una semilla, que se obtiene del transformante según el punto 13 o 14.

(16) Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de SEQ ID NO: 2, 82 o 84.

La divulgación se refiere a:

(1) una proteína híbrida, en la que dos o tres de proteínas toxina Shiga, proteínas de toxina del cólera, o proteínas toxina lábil al calor de Escherichia coli están cada una unida en tándem a través de un péptido que tiene las siguientes características (A) y (B):

(A) el número de aminoácidos es de 12 a 30; y

(B) el contenido de prolina es del 20 al 35%;

(2) la proteína híbrida según el punto (1), en la que el péptido además tiene la siguiente característica (C):

(C) la prolina está distribuida cada dos o tras aminoácidos;

(3) la proteína híbrida según el punto (2), en la que el péptido tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84;

(4) la proteína híbrida según el punto (3), en la que dos de las proteínas toxinas Shiga, proteínas toxinas del cólera, o proteínas toxina lábil al calor de Escherichia coli están unidas en tándem a través de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2;

(5) la proteína híbrida según cualquiera de los puntos (1) a (4), en la que las proteínas toxinas Shiga son subunidades B de la proteína toxina Shiga;

(6) la proteína híbrida según cualquiera de los puntos (1) a (5), en la que las proteínas toxinas Shiga son proteínas Stx2e;

(7) la proteína híbrida según cualquiera de los puntos (1) a (4), en la que las proteínas toxinas del cólera son subunidades B de la proteína toxina del cólera;

(8) la proteína híbrida según el punto (4), que incluye una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10, 12, 14 o 16;

(9) la proteína híbrida según el punto (3), que incluye una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, o 100;

(10) la proteína híbrida según cualquiera de los puntos (1) a (9), en la que un péptido señal secretor derivado de una planta se añade en su extremo amino;

(11) la proteína híbrida según el punto (10), en la que un péptido señal de retención en el retículo endoplásmico se añade en su extremo carboxilo;

(12) la proteína híbrida según cualquiera de los puntos (1) a (9), en la que un péptido señal de transito al cloroplasto se añade a su extremo amino;

(13) una construcción de ADN que incluye ADN que codifica la proteína híbrida según cualquiera de los puntos (1) a (12);

(14) la construcción de ADN según el punto (13), que incluye ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 9, 11, 13, o 15;

(15) la construcción de ADN según el punto (13), que incluye ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, o 99;

(16) la construcción de ADN según cualquiera de los puntos (13) a (15), en la que el ADN que codifica una proteína híbrida está operativamente unida a una región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta;

(17) la construcción de ADN según el punto (16), en la que la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta deriva de Nicotiana tabacum;

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(18) una construcción de ADN según el punto (17), que incluye una secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 24 a 29;

(19) una construcción de ADN según el punto (17), que una secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 101 a 111;

(20) un vector recombinante, que incluye la construcción de ADN según cualquiera de los puntos (13) a (19);

(21) un transformante transformado con el vector recombinante según el punto (20);

(22) un transformante según el punto (21), en el que el transformante es una célula vegetal transformada o una planta transformada;

(23) una semilla, que se obtiene del transformante según el punto (21) o (22); y

(24) un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos acompañantes:

La figura 1 es una vista que ilustra un diseño de vectores de expresión de Stx2eB, en los que una flecha indica un sitio de inicio de la traducción, y un triángulo invertido indica un sitio que se va a cortar después de la traducción;

La figura 2 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de expresión transitoria usando protoplastos de Lactuca sativa;

La figura 3 es una fotografía que ilustra los niveles de CTB acumulados obtenidos en un experimento de expresión transitoria usando protoplastos de Lactuca sativa;

La figura 4 es una vista que ilustra un diseño de construcciones de ADN que codifican una proteína de fusión Stx2eB-YFP, en las que una flecha indica un sitio de inicio de la traducción, y un triángulo invertido indica un sitio que se va a cortar después de la traducción;

La figura 5 es una fotografía que ilustra la localización de la proteína de fusión Stx2eB-YFP obtenida en un experimento de expresión transitoria usando protoplastos de células de tabaco cultivadas;

La figura 6 es una fotografía que ilustra la localización de la proteína de fusión Stx2eB-YFP obtenida en un experimento de expresión transitoria usando protoplastos de células de tabaco cultivadas;

La figura 7 es una fotografía que ilustra la localización de GFP de tipo vacuola y la proteína de fusión Stx2eB-YFP en coexpresión de ARF1pWT y ARFpDN obtenida en un experimento de expresión transitoria usando los protoplastos de células de tabaco cultivadas;

La figura 8 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando células de tabaco cultivadas (BY2), en la que el número en cada carril indica un número de clon;

La figura 9 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando células de tabaco cultivadas (BY2), en la que el número en cada carril indica un número de clon;

La figura 10 es fotografías que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando células de tabaco cultivadas (BY2), en la que el número en cada carril indica el número de clon;

La figura 11 es un gráfico que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando células de tabaco cultivadas (BY2), en la que cada número indica el número de clon;

La figura 12 es un gráfico que ilustra una relación entre los niveles de ARNm de Stx2eB y los niveles de Stx2eB acumulados;

La figura 13 es una vista que ilustra un diseño de construcciones de ADN que codifican Stx2eB, en la que A, B y C indican los diseños de un tipo de retículo endoplásmico, un tipo citoplásmico y un tipo de cloroplasto de las construcciones de ADN, respectivamente;

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La figura 14 es una vista que ilustra un diseño de construcciones de ADN que codifican CTB, en la que A, B y C indican los diseños de un tipo de retículo endoplásmico, un tipo citoplásmico y un tipo de cloroplasto de las construcciones de ADN, respectivamente;

La figura 15 es una fotografía que ilustra los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de expresión transitoria usando los protoplastos de Lactuca sativa;

La figura 16 es una fotografía que ilustra los niveles de CTB acumulados obtenidos en un experimento de expresión transitoria usando los protoplastos de Lactuca sativa;

La figura 17 es fotografías que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando células de tabaco cultivadas (BY2), en la que el número en cada carril indica el número de clon;

La figura 18 es fotografías que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando un cuerpo de planta de tabaco, en la que el número en cada carril indica el número de clon;

La figura 19 es fotografías que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando un cuerpo de planta de tabaco, en la que el número en cada carril indica el número de clon;

La figura 20 es una vista que ilustra el diseño de construcciones de ADN que codifican Stx2eB;

La figura 21 es una vista que ilustra el diseño de construcciones de ADN que codifican CTB;

La figura 22 es fotografías que ilustran los niveles de Stx2eB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando células de tabaco cultivadas (BY2), y

La figura 23 es fotografías que ilustran los niveles de CTB acumulados obtenidos en un experimento de transformación usando células de tabaco cultivadas (BY2).

Descripción de formas de realización

En una proteína híbrida de la presente invención, dos o tres de proteínas toxina Shiga (Stx), proteínas toxina del cólera (CT), o proteínas toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT) están cada una unida en tándem a través de un péptido que tiene las siguientes características (A) y (B):

(A) el número de aminoácidos es de 12 a 30; y

(B) el contenido de prolina es del 20 al 35%.

Las proteínas toxinas Shiga (Stx) se clasifican en tipo 1 (Stx1) y tipo 2 (Stx2). La Stx1 se clasifica adicionalmente en subclases desde a hasta d, y la Stx2 se clasifica adicionalmente en subclases de a hasta g, respectivamente. La toxina Shiga incluye una subunidad A que es un cuerpo principal de toxina y cinco subunidades B implicadas en la invasión en la mucosa intestinal.

De estas, por ejemplo, se conoce Stx2e como una toxina de enfermedad de edemas del cerdo, y su subunidad A (Stx2eA) está representada por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 y su subunidad B (Stx2eB) está representada por una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

En Stx2eA y Stx2eB, uno o varios aminoácidos se pueden sustituir, delecionar, insertar o añadir en las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 4 o 6 siempre que puedan producir una respuesta inmunitaria administrándolas a cerdos. Por ejemplo, el término “varios” significa el número de preferiblemente 2 a 30, más preferiblemente de 2 a 20, y aún más preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 5, y aún más preferiblemente de 2 a 3, en Stx2eB.

Además, Stx2eA y Stx2eB pueden ser las que tienen una identidad de preferiblemente el 85% o más, más preferiblemente el 90% o más, y aún más preferiblemente del 95% o más respecto a las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 4 y 6, y ser capaces de producir la respuesta inmunitaria administrándolas al cerdo.

La toxina del cólera (CT) incluye una subunidad A (CTA) que es el cuerpo principal de la toxina y cinco subunidades B (CTB) representada por SEQ ID NO: 8 e implicadas en la invasión en la mucosa intestinal.

En CTB, uno o varios aminoácidos se pueden sustituir, delecionar, insertar o añadir en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 8 siempre que CTB pueda producir la respuesta inmunitaria administrándola a animales. El término “varios” significa preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 5, y aún más preferiblemente de 2 a 3.

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Además, CTB pueden ser las que tienen una identidad de preferiblemente el 85% o más, más preferiblemente el 90% o más, y aún más preferiblemente del 95% o más respecto a las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 8, y ser capaces de producir la respuesta inmunitaria administrándolas a animales.

La proteína toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT) incluye una subunidad A que es el cuerpo principal de la toxina y cinco subunidades B implicadas en la invasión en la mucosa intestinal.

La toxina Shiga, la toxina del cólera y la toxina lábil al calor de Escherichia coli también se denominan colectivamente “toxinas bacterianas” en el presente documento.

El número de aminoácidos en el péptido es preferiblemente de 12 a 25 y más preferiblemente de 12 a 22. El contenido de prolina en el péptido es preferiblemente del 20 al 27% y más preferiblemente del 20 al 25%.

Además, la prolina se distribuye preferiblemente cada dos o tres residuos en el péptido. Pero, en este caso, los aminoácidos diferentes de prolina pueden ser consecutivos en 5 residuos y preferiblemente 4 residuos en el extremo del péptido.

Además, el contenido total de serina, glicina, arginina, lisina, treonina, glutamina, asparragina, histidina, y ácido aspártico en los aminoácidos diferentes de prolina es preferiblemente del 70% o más, más preferiblemente el 80% o más, y aún más preferiblemente del 90% o más en el péptido. Además, el contenido total de serina, glicina y asparragina en los aminoácidos diferentes de prolina es preferiblemente del 70% o más, más preferiblemente el 80% o más, y aún más preferiblemente del 90% o más en el péptido. Aún más, el contenido total de serina y glicina en los aminoácidos diferentes de prolina es preferiblemente del 70% o más, más preferiblemente el 80% o más, y aún más preferiblemente del 90% o más en el péptido. Esto es porque el péptido que contiene esos aminoácidos abundantemente es difícil que forme una estructura secundaria (estructura de lámina p y estructura de hélice).

Mientras tanto, el contenido total de alanina, metionina, y ácido glutámico en los aminoácidos diferentes de prolina es preferiblemente el 30% o menor, más preferiblemente el 20% o menor, y aún más preferiblemente el 10% o menor en el péptido. Esto es porque el péptido que contiene esos aminoácidos abundantemente forma fácilmente la estructura de hélice. El contenido total de triptófano, leucina, isoleucina, tirosina, fenilalanina, y valina en los aminoácidos diferentes de prolina es preferiblemente el 20% o menor, más preferiblemente el 10% o menor, y aún más preferiblemente el 5% o menor en el péptido. Esto es porque el péptido que contiene esos aminoácidos abundantemente forma fácilmente la estructura de lámina p y la estructura de hélice.

El péptido se selecciona preferiblemente del péptido (PG12) que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, el péptido (PG17) que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 82, y el péptido (PG22) que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 84.

En la proteína híbrida de la presente invención, dos o tres proteínas híbridas de la subunidad A y la subunidad B se pueden unir en tándem a través del péptido anterior, o dos o tres subunidades A se pueden unir en tándem a través del péptido, o dos o tres subunidades B se pueden unir en tándem a través del péptido. Cuando la proteína híbrida contiene la subunidad A, la subunidad A está preferiblemente atenuada. En la proteína híbrida de la presente invención, preferiblemente dos o tres subunidades B se unen en tándem a través del péptido. En la proteína híbrida de la presente invención, preferiblemente dos subunidades B se unen en tándem a través de PG12.

Además, en la proteína híbrida de la presente invención, el péptido se añade preferiblemente en su extremo C. PG12 en particular se añade preferiblemente a su extremo C en la proteína híbrida de la presente invención.

La proteína híbrida de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, o 100, por ejemplo. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 10, dos Stx2eB están unidas en tándem a través de PG12. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 12, dos CTB están unidas en tándem a través de PG12. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14, dos Stx2eB están unidas en tándem a través de PG12 y además PG12 está unido al extremo C de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 16, dos CTB están unidas en tándem a través de PG12 y además PG12 está unido al extremo C de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 86, tres Stx2eB están cada una unidas en tándem a través de PG12. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 88, tres Stx2eB están cada una unidas en tándem a través de PG12 y además PG12 está unida al extremo C de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 90, dos Stx2eB están unidas en tándem a través de PG17 y además PG12 está unida al extremo C de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 92, dos Stx2eB están unidas en tándem a través de PG22 y además PG12 está unida al extremo C de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 94, tres CTB están cada una unidas en tándem a través de PG12. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 96, tres CTB están cada una unidas en tándem a través de PG12 y además PG12 está unida al extremo C de la misma. En la

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proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 98, dos CTB están unidas en tándem a través de PG17 y además PG12 está unida al extremo C de la misma. En la proteína híbrida que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 100, dos CTB están unidas en tándem a través de PG22 y además PG12 está unida al extremo C de la misma.

Usando el péptido tal como PG12, PG17 o PG22 como un enlazador para unir las proteínas toxinas bacterianas, el nivel de la proteína toxina bacteriana acumulado en la célula vegetal se aumenta.

En la proteína híbrida de la presente invención, un péptido señal secretor derivado de una planta o un péptido señal de transito al cloroplasto preferiblemente se añade a su extremo amino. Aquí, el término “adición” es un concepto que incluye tanto el caso donde el péptido señal secretor se une directamente al extremo amino de las dos o tres proteínas toxinas bacterianas unidas a través del péptido como el caso donde el péptido señal secretor se une a la misma a través de otro péptido.

El péptido señal secretor deriva de preferiblemente una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae, o Asteraceae, más preferiblemente una planta que pertenece al género Nicotiana, Arabidopsis, Lactuca, etc., y más preferiblemente Nicotiana tabacum o Arabidopsis thaliana, Lactuca sativa, etc.

Además, preferiblemente deriva de una p-D-glucano exohidrolasa de Nicotiana tabacum o una peroxidasa de 38 kDa de Nicotiana tabacum (Acceso de GenBank D42064).

Un ejemplo del péptido señal secretor incluye un péptido que deriva de una p-D-glucano exohidrolasa de Nicotiana tabacum y tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 18.

Un ejemplo del péptido señal de transito al cloroplasto incluye un péptido señal de transito al cloroplasto (péptido de tránsito, TP, SEQ ID NO: 79) derivado de Rbcs (subunidad pequeña de Rubisco) de Lactuca sativa (acceso de GenBank D14001). Una secuencia de bases de ADN que codifica el péptido señal de transito al cloroplasto derivado de Rbcs de Lactuca sativa está representada por SEQ ID NO: 80. En el presente documento, la proteína híbrida que incluye el péptido señal de tránsito al cloroplasto añadido a su extremo amino también se denomina como una proteína híbrida de tipo cloroplasto (Chl), y una construcción de ADN que codifica la proteína híbrida de tipo cloroplasto (Chl) también se denomina una construcción de ADN de tipo cloroplasto. La proteína híbrida de tipo cloroplasto se acumula de forma eficaz particularmente en una planta cuyo cloroplasto se desarrolla bien tal como Nicotiana tabacum.

La proteína híbrida en la que no se añade ni el péptido señal secretor ni la proteína señal de tránsito al cloroplasto en su extremo amino se denomina una proteína híbrida de tipo citoplasma (Cyt), y la construcción de ADN que codifica la proteína híbrida de tipo citoplasma se denomina como una construcción de ADN de tipo citoplasma. En la proteína híbrida de tipo citoplasma, en particular preferiblemente tres subunidades B de proteína toxina bacteriana se unen en tándem a través del péptido.

En la proteína híbrida de la presente invención, el péptido señal tal como un péptido señal de retención en el retículo endoplásmico y un péptido señal de transporte vacuolar se puede añadir al extremo carboxilo. Aquí, el término “adición” es un concepto que incluye tanto el caso donde el péptido señal se une directamente al extremo carboxilo de la proteína híbrida como el caso donde el péptido señal se une a la misma a través de otro péptido. En el presente documento, la proteína híbrida en la que el péptido señal secretor se añade a su extremo amino y el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico se añade al extremo carboxilo también se denomina una proteína híbrida de tipo retículo endoplásmico (Er), y la construcción de ADN que codifica la proteína híbrida de tipo retículo endoplásmico también se denomina una construcción de ADN de tipo retículo endoplásmico. La proteína híbrida de tipo retículo endoplásmico se acumula de forma eficaz en particular en una planta tal como Lactuca sativa.

En la proteína híbrida de la presente invención, el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico preferiblemente se añade a su extremo carboxilo. Los ejemplos de péptido señal de retención en el retículo endoplásmico incluyen un péptido señal de retención en el retículo endoplásmico que incluye la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 19), la secuencia HDEL (SEQ ID NO: 20), la secuencia KDEF (SEQ ID NO: 21), o la secuencia HDEF (SEQ ID NO: 22).

El péptido señal de transporte vacuolar deriva preferiblemente de una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae, o Asteraceae, más preferiblemente una planta que pertenece al género Nicotiana, Arabidopsis, Armoracia, etc., y más preferiblemente Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Armoracia rusticana, etc. Además, el péptido deriva preferiblemente de una quitinasa. La secuencia de aminoácidos de un péptido señal de transporte vacuolar derivada de una quitinasa de tabaco está representada por SEQ ID NO: 76. Mientras tanto, la secuencia de bases del ADN que codifica un péptido señal de transporte vacuolar derivada de una quitinasa de tabaco está representada por SEQ ID NO: 75, por ejemplo.

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Además, el péptido preferiblemente deriva de una isozima C1a de peroxidasa de rábano picante. La secuencia de aminoácidos de un péptido señal de transporte vacuolar derivada de una isozima C1a de peroxidasa de rábano picante está representada por SEQ ID NO: 78. Mientras tanto, la secuencia de bases del ADN que codifica un péptido señal de transporte vacuolar derivada de una isozima C1a de peroxidasa de rábano picante está representada por SEQ ID NO: 77, por ejemplo. En el presente documento, la proteína híbrida en la que el péptido señal secretor se añade a su extremo amino, y el péptido señal de transporte vacuolar se añade a su extremo carboxilo también se denomina proteína híbrida de tipo vacuola (Vac), y una construcción de ADN que codifica la proteína híbrida de tipo vacuola también se denomina una construcción de ADN de tipo vacuola.

La proteína híbrida de la presente invención se puede sintetizar químicamente, o se puede producir por ingeniería genética. Un método de producción por ingeniería genética se describe posteriormente.

La construcción de ADN de la presente invención se caracteriza por contener ADN que codifica la proteína híbrida de la presente invención.

Es decir, la construcción de ADN de la presente invención incluye ADN en el que los ADN que codifican las dos o tres proteínas toxinas bacterianas están unidos en tándem a través de ADN que codifica el péptido. El ADN que codifica el péptido está representado por, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 (PG12), sEq ID NO: 81 (Pg17), y SEQ ID No: 83 (PG22). Los ejemplos del ADN que codifica la proteína toxina bacteriana incluyen ADN (SEQ ID NO: 3) que codifica Stx2eA, ADN (SEQ ID NO: 5) que codifica Stx2eB, y ADN (SEQ ID NO: 7) que codifica CTB. El AdN que codifica el péptido y el ADN que codifica la proteína toxina bacteriana se unen haciendo coincidir sus marcos de lectura excepto los codones de terminación.

El ADN que codifica la proteína toxina bacteriana se puede obtener por una técnica de ingeniería genética común basada en la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3, 5 o 7, por ejemplo. Específicamente, se prepara una genoteca de ADNc de una bacteria que produce cada toxina bacteriana según un método convencional, y se selecciona un clon deseado usando una sonda preparada de la genoteca basada en la secuencia de bases. Alternativamente, el ADN también se puede sintetizar químicamente basado en la secuencia de bases, o sintetizar por PCR con ADN genómico como molde usando una secuencia de bases 5' y 3'-terminal de la secuencia de bases como cebadores, por ejemplo.

El ADN que codifica la proteína híbrida de la presente invención está representado por SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 97 o 99.

En el ADN que codifica la proteína híbrida, preferiblemente, se modifica apropiadamente un codón correspondiente a un aminoácido que compone la proteína híbrida de modo que la cantidad de la proteína híbrida traducida se aumente dependiendo de una célula huésped en la que se produce la proteína híbrida.

Como el método de modificar el codón, un método de Kang y col. (2004) puede servir de referencia, por ejemplo, Y, el método de seleccionar el codón frecuentemente usado en la célula huésped, el método de seleccionar el codón en el que el contenido de GC es alto, o el método de seleccionar el codón frecuentemente usado en genes de mantenimiento en la célula huésped se ejemplifica.

Además, el ADN que codifica la proteína híbrida puede ser ADN que hibrida con ADN que tiene la secuencia de bases de SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, o 99 en condiciones rigurosas. El término “condiciones rigurosas” se refiere a la condición donde se forma un denominado híbrido específico mientra s que no se forma ningún híbrido no específico. Se ejemplifica la condición donde dos ADN con alta identidad, por ejemplo, dos ADN que tienen la identidad de preferiblemente el 80% o más, más preferiblemente el 90% o más, y en particular preferiblemente el 95% o más hibridan entre sí mientras que dos ADN con menor identidad que esa no hibridan. Además, se ejemplifica la condición de SSX 2* (NaCl 330 mM, ácido cítrico 30 mM) a 42°C y preferiblemente SSC 0,1* (NaCl 330 mM, ácido cítrico 30 mM) a 60°C.

En la construcción de ADN de la presente invención, preferiblemente el ADN que codifica la proteína híbrida está operativamente unido a un potenciador. El término “operativamente” se refiere al hecho de que la proteína híbrida se produce en células huéspedes cuando un vector obtenido insertando la construcción de ADN de la presente invención en un vector que incluye un promotor adecuado se introduce en células huéspedes adecuadas. Además, el término “unido” se refiere tanto a un caso donde los dos ADN están directamente unidos como al caso donde dos ADN están unidos a través de otra secuencia de bases.

Los ejemplos del potenciador incluyen la secuencia de Kozak y una región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta. En particular preferiblemente, el ADN que codifica la proteína híbrida está operativamente unido a la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta.

La región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa se refiere a una regió n que incluye una secuencia entre la base en el sitio de inicio de la transcripción de un gen que codifica una alcohol deshidrogenasa y la base antes del sitio de inicio de la traducción (ATG, metionina). La región tiene una función de aumentar un nivel de

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traducción. La frase “función de aumentar un nivel de traducción” se refiere a una función para aumentar una cantidad de una proteína producida por la traducción cuando la información codificada en un gen estructural se transcribe y después se traduce para producir una proteína. La región puede derivar de una planta, y preferiblemente deriva de una planta que pertenece a la familia Solanaceae, Brassicaceae, o Asteraceae, más preferiblemente derivada de una planta que pertenece al género Nicotiana, Arabidopsis, Lactuca, etc., y más preferiblemente derivada de Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, Lactuca sativa, etc.

La región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa es en particular preferiblemente una región que incluye la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 23, que es la región 5' no traducida de un gen alcohol deshidrogenasa (NtADH 5'-UTR) derivado de Nicotiana tabacum, por ejemplo.

La región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta se puede aislar de un gen de alcohol deshidrogenasa de una célula vegetal cultivada donde una alcohol deshidrogenasa se expresa mucho, por ejemplo (véase el documento JP 2003-79372 A). Mientras tanto, en el caso de una región que tiene una secuencia de bases determinada, tal como la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de Nicotiana tabacum, la región también se puede sintetizar mediante síntesis química, PCR usando un ADN genómico como molde y usando las secuencias de bases de los extremos 5' y 3' de la región como cebadores, o similar. Además, si una parte de la región que tiene una secuencia de bases determinada se usa como sonda, se puede buscar y aislar la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de otra planta.

La región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa representada por la secuencia de bases de SEQ ID NO: 23 puede tener sustitución, deleción, inserción o adición de una o varias bases siempre que la región tenga una función para aumentar un nivel de traducción. El término “varias” significa el número de preferiblemente 2 a 10, más preferiblemente 2 a 5, y en particular preferiblemente 2 a 3.

Además, se puede usar ADN que tiene una identidad de preferiblemente el 85% o más y en particular preferiblemente el 90% o más respecto a la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa y que tiene capacidad de aumentar un nivel de traducción.

Si la región tiene una función pretendida para aumentar un nivel de traducción o no se puede confirmar mediante, por ejemplo, un ensayo transitorio usando un gen GUS (p-glucuronidasa) o un gen luciferasa como un gen indicador en células de tabaco cultivadas, o un ensayo en células transformadas manipuladas para que porten esos genes en un cromosoma.

La construcción de ADN de la presente invención tiene la secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 24 a 29 y SEQ ID NO: 101 a 111, por ejemplo.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 24 es la construcción de ADN en la que el ADN (SEQ ID NO: 9) que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas en tándem a través de PG12 está unido a la región 5' no traducida (NtADH 5'-UTR, SEQ ID NO: 23) de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de Nicotiana tabacum. Además, la construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 25 es la construcción de ADN en la que el ADN (SEQ ID NO: 11) que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB están unidas en tándem a través de PG12 está unido a NtADH 5'- UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 26 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas en tándem a través de pG12, el péptido señal secretor está añadido a su extremo amino, y el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido en su extremo carboxilo está unido a NtADH 5' -UTR. Además, la construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 27 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB están unidas en tándem a través de PG12, el péptido señal secretor está añadido a su extremo amino, y el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido en su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 28 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas en tándem a través de PG12, el péptido señal secretor está añadido a su extremo amino, PG12 está unido en su extremo carboxilo y además el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido en su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR. Además, la construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 29 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB están unidas en tándem a través de PG12, el péptido señal secretor está añadido a su extremo amino, PG12 está unido en su extremo carboxilo, y además el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido en su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR.

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La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 101 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas en tándem a través de PG12 y PG12 está unido a su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 102 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas en tándem a través de PG17 a NtADH 5'-UTR, el péptido señal secretor está añadido en su extremo amino, PG12 está unido a su extremo carboxilo, y además el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido a su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR. Además, la construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 103 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas en tándem a través de PG22, el péptido señal secretor está añadido en su extremo amino, PG12 está unido a su extremo carboxilo, y además el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido a su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 104 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas en tándem a través de pG12, el péptido señal de tránsito al cloroplasto está añadido en su extremo amino, PG12 está unido a su extremo carboxilo, está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 105 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que tres proteínas Stx2eB están cada una unidas en tándem a través de PG12, y PG12 está unido a su extremo carboxilo, está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 106 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que tres proteínas Stx2eB están cada una unidas en tándem a través de PG12, el péptido señal secretor está añadido en su extremo amino, y PG12 está unido a su extremo carboxilo, y además el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido a su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 107 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que tres proteínas Stx2eB están cada una unidas en tándem a través de PG12, el péptido señal de tránsito al cloroplasto está añadido en su extremo amino, y PG12 está unido a su extremo carboxilo, está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 108 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB están unidas en tándem a través de PG12, y PG12 está unido a su extremo carboxilo, está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 109 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB están unidas en tándem a través de PG17, el péptido señal está añadido a su extremo amino, PG12 está unido a su extremo carboxilo, y además el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido a su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'- UTR. Además, la construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 110 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB están unidas en tándem a través de PG22, el péptido señal está añadido a su extremo amino, PG12 está unido a su extremo carboxilo, y además el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico está añadido a su extremo carboxilo está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 111 es la construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB están unidas en tándem a través de PG12, el péptido señal de tránsito al cloroplasto está añadido a su extremo amino, y PG12 está unido a su extremo carboxilo, está unido a NtADH 5'-UTR.

La construcción de ADN de la presente invención se puede preparar por una técnica de ingeniería genética general, que incluye los siguientes procedimientos: digerir los ADN incluyendo la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta, un ADN que codifica un péptido señal secretor derivado de una planta, un ADN que codifica un péptido señal de tránsito al cloroplasto, un ADN que codifica una proteína toxina bacteriana, y un aDn que codifica un péptido señal de retención en el retículo endoplásmico con enzimas de restricción adecuadas; y ligar los fragmentos resultantes con un ligasa adecuada.

El vector recombinante de la presente invención se caracteriza por incluir la construcción de ADN de la presente invención. El vector recombinante de la presente invención puede ser un vector obtenido insertando un ADN que codifica una proteína híbrida de la presente invención en un vector de modo que el ADN se pueda expresar en células huéspedes en las que se va introducir el vector. El vector no está particularmente limitado siempre que se pueda replicar en células huéspedes, y los ejemplos del mismo incluyen un ADN de plásmido y un ADN vírico. Además, el vector preferiblemente incluye un marcador selectivo tal como un gen de resistencia a fármaco. El ADN

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de plásmido se puede preparar de Escherichia coli o Agrobacterium por el método de extracción alcalina (Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7:1513) o un método modificado de la misma. Se pueden usar plásmidos comercialmente disponibles tal como pBI221, pBI121, pBI101, y pIG121Hm. El ADN vírico puede ser, por ejemplo, pTB2 (Donson et al., 1991) (véase Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tabacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208).

Los promotores que se van a usar en los vectores se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo de las células huéspedes en las que se van a introducir los vectores. Los promotores son preferiblemente un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al., 1985, Nature 313:810), un promotor de actina de arroz (Zhang et al.1991 Plant Cell 3:1155), un promotor de ubiquitina de maíz (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol., 23:567), etc. por ejemplo. Mientras tanto, los terminadores que se van a usar en vectores se pueden seleccionar apropiadamente dependiendo de las células huéspedes en las que se van a introducir los vectores. Los terminadores son preferiblemente un terminador de la transcripción del gen de la nopalina sintasa, un terminador 35S del virus del mosaico de la coliflor, etc.

El vector recombinante de la presente invención se puede preparar como sigue.

Primero, una construcción de ADN de la presente invención se digiere con una enzima de restricción adecuada, o se añade un sitio de enzima de restricción a la construcción de ADN por PCR. Posteriormente, la construcción de ADN se inserta en el sitio de la enzima restricción o sitio de clonación múltiple de un vector.

El transformante de la presente invención se caracteriza por ser transformado con el vector recombinante de la presente invención. Las células hospedes que se van a usar pueden ser células eucariotas o células procariotas.

Las células eucariotas son preferiblemente células vegetales, en particular preferiblemente células de plantas que pertenecen a la familia Asteraceae, Solanaceae, Brassicaceae, y Chenopodiaceae. Además, las células eucariotas son preferiblemente células de plantas que pertenecen al género Lactuca, en particular preferiblemente células de Lactuca sativa. En el caso de usar células de Lactuca sativa como células huéspedes, se puede usar un promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor o similar, en el vector.

Las células procariotas pueden ser células de Escherichia coli o Agrobacterium tumefaciens, etc.

El transformante de la presente invención se puede preparar por una técnica de ingeniería genética general introduciendo un vector de la presente invención en células huéspedes. Por ejemplo, el transformante se puede preparar por el método de introducción usando Agrobacterium (Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2:218, Hiei, et al., 1994 Plant J. 6:271), un método de electroporación (Tada, et al., 1990, Theor.Appl.Genet, 80:475), un método de polietilenglicol (Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81:437), un método de bombardeo de partículas (Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5:27), un método de policatión (Ohtsuki), etc.

Después de la introducción del vector de la presente invención en células huéspedes, un transformante de la presente invención se puede seleccionar basado en el fenotipo de un marcador selectivo. Si el transformante seleccionado se cultiva, se puede producir la proteína toxina bacteriana. El medio de cultivo y condiciones para el cultivo se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo de transformante.

Además, en el caso de usar una célula vegetal como célula huésped, el cultivo de la célula vegetal seleccionada según un método convencional puede regenerar una planta y acumular la proteína toxina bacteriana en las células vegetales o fuera de las membranas celulares de las células vegetales. El método depende del tipo de célula vegetal, y los ejemplos del mismo incluyen el método de Visser et al. (Theor.Appl.Genet, 78:594(1989)) para patata y el método de Nagata y Takebe (Planta, 99:12(1971)) para Nicotiana tabacum.

En el caso de Lactuca sativa, se puede regenerar un brote en medio MS que contiene NAA 0,01 mg/l (ácido naftaleno acético), BA 0,05 mg/l (benciladenina), y polivinilpirrolidona 0,5 g/l, y el cultivo del brote regenerado en medio 1/2 MS que contiene polivinilpirrolidona 0,5 g/l puede producir enraizamiento.

La semilla de la presente invención se puede obtener recogiendo una semilla de una planta regenerada como anteriormente. Si la semilla de la presente invención se siembra y cultiva por un método adecuado, se puede obtener una planta capaz de producir una proteína toxina bacteriana y se incluye en el transformante de la presente invención.

Ejemplos

<1> Experimento de expresión transitoria

(1) Construcción del vector de expresión transitoria de Stx2eB

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Un vector que contiene una construcción de ADN en el que el ADN (SEQ ID NO: 5) que codifica una subunidad B de la proteína Stx2e (Stx2eB) se unió a una región 5' no traducida (NtADH 5'-UTR) de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se preparó como sigue.

Se muestra un diseño del vector en la figura 1.

1 *Stx2eB (PG12) indica una construcción de ADN que contiene ADN en el que el ADN que codifica PG12 está unido a ADN que codifica Stx2eB. 2*Stx2eB (PG12) indica una construcción de ADN que contiene ADN en el que dos ADN que codifican Stx2eB están unidos usando ADN que codifica PG12 como un enlazador.

Además, una construcción de ADN, 3*Stx2eB (PG12) en la que tres ADN que codifican Stx2eB están unidos usando ADN que codifica PG12 como un enlazador, y una construcción de ADN, 4*Stx2eB (PG12) en la que cuatro ADN que codifican Stx2eB están unidos usando ADN que codifica PG12 como un enlazador también se prepararon.

Las técnicas específicas se muestran a continuación.

Se realizó PCR usando un cebador Kozak-stx2eb-F (SEQ ID NO:30) y un cebador stx2eb-R (SEQ ID NO: 31) para amplificar un fragmento de ADN que codifica una región madura (excepto por un péptido señal secretor al periplasma, Ala 19 a Asn 87) de Stx2eB. El fragmento de ADN resultante se clonó en un hueco EcoRV en pBluescript II SK. El plásmido resultante se cortó con HindIII, y se trató como ADN polimerasa de T4, seguido por autoligación para convertir un sitio HindIII a un sitio NheI (plásmido 1).

Se insertó Stx2eB como sigue en el sitio de clonación múltiple (MCS) de un vector de expresión transitoria en células vegetales, pBI221 (Clontech).

Para introducir sitios SalI, KpnI y SmaI en el MCS, SalKpnSma-F (SEQ ID NO: 32) y SalKpnSma-R (SEQ ID NO: 33) se hibridaron y fosforilaron con polinucleótido quinasa de T4 (T4 PNK) (TaKaRa) y se insertó en el hueco SacI de pBI221 (plásmido 2). Se cortó Stx2eB del plásmido 1 usando XbaI y KpnI para insertarlo en el plásmido 2, y el producto resultante se dispuso entre un promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y un terminador de la transcripción del gen de la nopalina sintasa (NOS-T) (plásmido 3).

La región 5' no traducida (NtADH 5'-UTR, SEQ ID NO: 23) de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se amplificó por PCR con ADH-221 (Sato et al., 2004, (véase posteriormente)) como molde usando cebador ADH XbaI- F (SEQ ID NO: 34) y cebador ADH NsiI-R (SEQ ID NO: 35). Una región de ADN (SEQ ID NO: 17) que codifica un péptido señal secretor (SEQ ID NO: 18) de p-D-glucano exohidrolasa (Acceso de GenBank AB017502) se amplificó con ADN genómico de tabaco como molde usando cebador pD Nsil-F (SEQ ID NO: 36) y cebador pD BamHI-R (SEQ ID NO: 37). Los fragmentos de ADN respectivos obtenidos de NtADH 5'-UTR y el péptido señal secretor se trataron con NsiI (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se ligaron usando Ligation High (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), seguido por hacerlos romos, y clonarlos en el hueco EcoRV en pBluescript II SK (fabricado pro Stratagene) (plásmido 4).

Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98,1-8

El plásmido 4 se trató con NsiI, y se hizo romo con ADN polimerasa de T4 (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), seguido por realizar autoligación para ligarse de modo que el codón de iniciación (atg) de NtADH coincidiera con el codón de iniciación del péptido señal secretor (plásmido 5).

Un ADN obtenido por ligación de un fragmento NtADH 5'-UTR y un péptido señal secretor se amplificó usando el plásmido 5 como molde y usando cebador ADH XbaI-F (SEQ ID NO: 34) y cebador pDNsiI-R (SeQ ID NO: 35). El fragmento de ADN resultante se trató con XbaI y BamHI y se insertó en el hueco XbaI-BamHI del plásmido 3 (plásmido 6).

Para añadir una señal de retención en el retículo endoplásmico (SEQ ID NO: 38), un cebador HDEL-F (SEQ ID NO: 39) y un cebador HDEL-R (SEQ ID NO: 40) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK, y el producto resultante se insertó en hueco BglII del plásmido 6, que se había desfosforilado con fosfatasa alcalina (AP) (TaKaRa) (plásmido 7).

Se añadió una etiqueta HA como una etiqueta peptídica para detectar Stx2eB. Para añadir la etiqueta HA, un cebador HA-F (SeQ ID NO: 41) y un cebador HA-R (SEQ ID NO: 42) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento HA fosforilado resultante se insertó en el hueco BglII del plásmido 7 (plásmido 8).

Se insertó un espaciador PG12 (SEQ ID NO: 2) entre Stx2eB y la etiqueta HA. Un cebador PG12-F (SEQ ID NO:43) y un cebador pG12-R (SEQ ID NO:44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se insertó en el hueco BglII del plásmido 8 (1*Stx2eB (PG12)).

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Se obtuvo 2*Stx2eB (PG12) cortando un fragmento 2eB-PG12 de 1*Stx2eB (PG12) con BamHI y BglII y después insertando el fragmento en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12). Se obtuvo 3*Stx2eB (PG12) cortando un fragmento Stx2eB-PG12 de 1*Stx2eB (PG12) con BamHI y BglII y después insertando el fragmento en el hueco BamHI de 2*Stx2eB (PG12). Además, se obtuvo 4*Stx2eB (PG12) cortando un fragmento 2 x (Stx2eB-PG12) de 2xStx2eB (PG12) con BamHI y BglII y después insertando el fragmento en el hueco BamHI de 2xStx2eB (PG12).

(2) Construcción de un vector de expresión transitorio de CTB

Un vector que contenía una construcción de ADN (2xCTB (PG12)) en el que el ADN que codifica una subunidad B de una proteína CT (CTB) se había unido a la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa de tabaco se preparó como sigue.

Se preparó un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 7) que codifica la región madura (excepto la señal secretora al periplasma, Thr 22 a Asn 124) (SEQ ID NO: 8) de CTB. Primero, se prepararon los siguientes diez cebadores.

CTB1: SEQ ID NO: 45 CTB2: SEQ ID NO: 46 CTB3: SEQ ID NO: 47 CTB4: SEQ ID NO: 48 CTB5: SEQ ID NO: 49 CTB6: SEQ ID NO: 50 CTB7: SEQ ID NO: 51 CTB8: SEQ ID NO: 52 CTB9: SEQ ID NO: 53 CTB10: SEQ ID NO: 54

Se realizó PCR usando los cebadores sintetizados anteriormente en las condiciones descritas en Kang et al., (2004). Es decir, se realizó PCR en combinación de CTB1 y CTB2, CTB3 y CTB4, CTB5 y CTB6, CTB7 y CTB8, y CtB9 y CTB10, y se sintetizaron fragmentos de 72 pb (1+2), 74 pb (3+4), 67 pb (5+6), 82 pb (7+8) y 68 pb (9+10), respectivamente. Posteriormente, la segunda PCR se realizó en combinación de CTB1+2 y CTB3+4, CTB3+4 y CTB5+6, CTB5+6 y CTB7+8, y CTB7+8 y CTB9+10 y se sintetizaron fragmentos de ADN de 135 pb (1+2+3+4), 132 pb (3+4+5+6), 138 pb (5+6+7+8), y 141 pb (7+8+9+10), respectivamente. A continuación, se realizó la tercera PCR en combinación de CTB1+2+3+4 y CTB3+4+5+6, y CTB5+6+7+8 y CTB7+8+9+10, y se sintetizaron fragmentos de ADN de 194 pb (1+2+3+4+5+6) y 198 pb (5+6+7+8+9+10), respectivamente. Por último, se realizó PCR en combinación de cTb1+2+3+4+5+6 y CTB5+6+7+8+9+10, y se sintetizó un fragmento de ADN de 315 pb en el que un sitio BamHI y un sitio BglII se añadieron a una región codificante de CTB.

El fragmento de ADN preparado anteriormente se trató con BamHI y BglII y se insertó en un hueco BamHI-BglII en el plásmido 8 (plásmido 9).

El espaciador PG12 (SEQ ID NO: 2) se insertó entre CTB y la etiqueta HA. Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se insertó en el hueco BglII del plásmido 9 (1xCTB (PG12)).

Se cortó un fragmento CTB-PG12 de 1xCTB (PG12) usando BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI del 1 xCTB (PG12) (2xCTB (PG12)).

(3) Prueba de expresión transitoria usando protoplasto de Lactuca sativa

Una hoja de Lactuca sativa en maceta (Green wave) (aproximadamente 1 g) se cortó en trozos cuadrados de 0,5 cm usando un bisturí, para preparar de esta manera discos de hojas. Los discos de hojas se sumergieron en manitol 500 mM, y se agitaron durante 1 hora. Los discos de hoja se sumergieron en 50 ml de una solución de enzima de protoplastización (Celulosa RS (Yakult Honsha Co., Ltd.) al 1,0%, macerozima R-10 (Yakult Honsha Co., Ltd.) al 0,25%, manitol 400 mM, CaCl2 8 mM, y Mes-KOH 5 mM, pH 5,6), y el conjunto se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La suspensión de protoplastos se pasó a través de mallas de 100 pm y 40 pm para eliminar los discos de hoja. La suspensión de protoplastos se centrifugó a 60 g durante 5 minutos para precipitar el protoplasto. El protoplasto se resuspendió en una solución acuosa que contenía manitol 167 mM y CaCU 133 mM, y la suspensión se centrifugó a 40 g durante 5 minutos. El protoplasto se resuspendió en una solución acuosa que contenía manitol 333 mM y CaCl2 66,7 mM, y la suspensión se centrifugó a 40 g durante 5 minutos. El protoplasto se resuspendió en solución W5 (NaCl 154 mM, CaCl2 125 mM, KCl 5 mM, Mes-KOH 2 mM, pH 5,6), y la suspensión se dejó reposar en hielo durante 1 hora. La suspensión de protoplasto se centrifugó a 40 g durante 5 minutos, y el protoplasto se resuspendió en una solución MaMa (manitol 400 mM, MgCh 15 mM, y Mes-KOH 4 mM, pH 5,6) para tener una concentración de protoplastos de 2x10° células/ml.

Cada uno de los vectores de expresión transitoria de Stx2eB y el vector de expresión transitoria de CTB preparados anteriormente se mezcló con 120 pl de una suspensión de protoplastos, posteriormente se añadieron a la misma

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140 |jl de solución PEG (manitol 400 mM, Ca(NO3)2 100 mM y PEG al 40%), y la mezcla resultante se mezcló suavemente y se incubó durante 7 minutos. A continuación, 1 ml de solución W5 se añadió a la suspensión de protoplastos a lo largo de aproximadamente 20 minutos. Se añadió una solución (1 ml) obtenida mezclando manitol 400 mM y la solución W5 en una proporción de 4:1 al protoplasto precipitado por centrifugación. Se añadió medio LS (1 ml) que contenía sacarosa al 1%, manitol 400 mM y carbenicilina 0,3 mM al protoplasto precipitado por centrifugación, y la mezcla se cultivó después en un lugar oscuro a 25°C durante 24 horas.

(4) Análisis de inmunotransferencia

Al protoplasto recogido por centrifugación se añadieron 30 jl de tampón de muestra de SDS (SDS al 4% (p/v), glicerol al 20% (p/v), azul de bromofenol al 0,05% (p/v), p-mercaptoetanol 300 mM, Tris-HCl 125 mM, pH 6,8), seguido por desnaturalización térmica a 95°C durante 2 minutos, para preparar las muestras de esta manera. Las proteínas se separaron usando un gel de acrilamida al 15% y se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) usando un sistema de electrotransferencia. Se usó un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche) para detectar Stx2eB y CTB.

(a) Efectos del número de unión de Stx2eB

Se muestra un resultado en la figura 2. Cuando se expresó 1*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en una posición de aproximadamente 8,5 kDa. Cuando se expresó 2*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en una posición de aproximadamente 17 kDa al mismo nivel que cuando se expresó 1*Stx2eB (PG12). Cuando se expresó 3*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en una posición de aproximadamente 26 kDa, siendo la señal menor que cuando se expresó 1*Stx2eB (PG12). Estas corresponden a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN. Cuando se expresó 4*Stx2eB (PG12), la señal específica estaba por debajo del límite de detección.

Del resultado anterior, se demostró que cuando se expresaron 2*Stx2eB (PG12) y 3*Stx2eB (PG12), se pudieron producir proteínas híbridas en las que múltiples proteínas Stx2eB estaban unidas.

Puesto que cada una de las construcciones de ADN anteriores contiene una molécula de la etiqueta HA (véase la figura 1), es concebible que una cantidad de proteína correspondiente a aproximadamente 2 veces la cantidad de proteína Stx2eB cuando se expresa 1*Stx2eB (PG12) se acumule cuando se expresa 2*Stx2eB (PG12). Es decir, se ha encontrado que cuando dos ADN que codifican la proteína Stx2eB están unidos a través del ADN que codifica PG12, la proteína Stx2eB se puede producir con una eficacia muy alta.

Mientras tanto, también se ha encontrado que cuando tres ADN que codifican la proteína Stx2eB o cuatro ADN que codifican la proteína Stx2eB están unidos a través del ADN que codifica PG12, la cantidad de proteína Stx2eB producida es igual a o menor que la cantidad cuando una proteína Stx2eB está unida a PG12.

Se ha encontrado que el nivel de proteínas acumuladas tiende a ser mayor en la proteína Stx2eB (1*Stx2eB (PG12)) que tiene PG12 añadido en su extremo carboxilo preparada en este experimento, comparada con la proteína Stx2eB que no tiene PG12. Esto especula que es una forma favorable que PG12 se añada al extremo carboxilo en la proteína híbrida de la presente invención.

(b) Efectos del número de unión de CTB Los resultados se muestran en la figura 3.

Cuando se expresó 1*CTB (PG12), se detectó una señal en una posición de aproximadamente 20 kDa. Cuando se expresó 2*CTB (PG12), se detectó una señal mayor que cuando se expresó 1*CTB (PG12) en las posiciones de aproximadamente 33 kDa y aproximadamente 35 kDa.

De los resultados anteriores, se demostró que la proteína híbrida en la que dos proteínas CTB está unidas se pudo producir cuando se expresó 2*CTB (PG12). Estas correspondían a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN.

Puesto que cada una de las construcciones de ADN anteriores contiene una molécula de la etiqueta HA, es concebible que la cantidad de proteína correspondiente a la cantidad de proteína CTB que es mayor de dos veces la cantidad de proteína cuando se expresa 1*cTb (PG12) se acumule cuando se expresa 2*CTB (PG12). Es decir, se ha encontrado que cuando dos ADN que codifican la proteína CTB están unidos a través del ADN que codifica PG12, la proteína CTB se puede producir con una eficacia muy alta.

(5) Análisis de localización de Stx2eB

Para analizar la localización de Stx2eB en la célula, se preparó un vector de expresión transitoria para la proteína híbrida de Stx2eB y una proteína fluorescente amarilla YFP. El diseño para el vector se muestra en la figura 4. 1*Stx2eB (PG12)-YFP indica una construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína Stx2eB está unida

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al ADN que codifica YFP. 2*Stx2eB (PG12)-YFP indica una construcción de ADN en la que el ADN que codifica la proteína híbrida en la que dos proteínas Stx2eB están unidas a través de PG12 está unida al ADN que codifica YFP. También se preparó 2*Stx2eB (RS)-YFP que usa RS (Arg Ser) en lugar de PG12 como espaciador.

Una técnica específica se muestra a continuación.

Primero, un fragmento de ADN de YFP se amplificó por PCR con pEYFP (Clontech) como molde usando un cebador YFP-F (SEQ ID NO: 55) y un cebador YFP-R (SEQ ID NO: 56). El fragmento de aDn resultante se trató con BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI-BglII del plásmido 8 (ER-YFP).

Se cortó un fragmento Stx2eB del plásmido 1 con BamHI y BglII, y después se insertó en el hueco BamHI de 1 ><Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (RS)).

Se cortaron un fragmento Stx2eB-PG12, un fragmento 2 x (Stx2eB-RS) y un fragmento 2 x (Stx2eB-PG12) de 1xStx2eB (PG12), 2xStx2eB (RS) y 2xStx2eB (PG12) con BamHI-BglII, respectivamente, y cada fragmento se insertó en el hueco BamHI de ER-YFP (1 xStx2eB (PG12)-YFP, 2xStx2eB (RS)-YFP y 2xStx2eB (PG12)-YFP).

Mientras tanto, se preparó un vector de expresión para una proteína fluorescente roja (mRFP, Campbell R. E. et al., 2002, (véase posteriormente)) localizado en el retículo endoplásmico como un vector para visualizar el retículo endoplásmico. Se realizó PcR usando un cebador mRFP-F (SEQ ID NO: 57) y un cebador mRFP-R (SEQ ID NO: 58). El fragmento de ADN resultante se trató con BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI-BglII del plásmido 8 (ER-mRFP).

Campbell R. E. et al., A monomeric red fluorescent protein (2002), Proc. Nat. Acad. Sci., 99: 7877-7882.

El vector de expresión de Stx2eB y el vector de expresión de mRFP se introdujeron en los protoplastos de células de tabaco cultivadas (BY2) de la misma manera que los métodos anteriores, y se observó usando un sistema de observación de microscopio confocal (LSM510, Zeiss).

Los resultados se muestran en las figuras 5 y 6.

La figura 5 muestra la localización de la proteína híbrida de Stx2eB-YFP. Cuando se expresó 2xStx2eB (PG12)-YFP, se observó que la proteína híbrida de Stx2eB-YFP estaba localizada granularmente a aproximadamente 100 gránulos/célula. Cuando se expresaron 1xStx2eB (PG12)-YFP y 2xStx2eB (RS)-YFP, no se observaron gránulos.

En la figura 6, una imagen A en la columna más a la izquierda muestra la localización de mRFP en un cierto protoplasto. La localización de mRFP refleja la localización del retículo endoplásmico. Una imagen B en una columna media muestra la localización de la proteína híbrida de Stx2eB-YFP en el protoplasto idéntico. Una imagen en la columna más a la derecha es una imagen compuesta de la imagen A y la imagen B. Se determina de esta imagen compuesta que la proteína híbrida de Stx2eB-YFP está localizada granularmente en el retículo endoplásmico.

(6) Efecto de la función de transporte vesicular

Se examinó en qué proceso después de la traducción de proteínas se produce la acumulación y agregación de 2xStx2eB (PG12).

2xStx2eB (PG12)-YFP se coexpresó con una proteína de regulación de transporte vesicular de Arabidopsis ARF1 o un mutante negativo de la misma ARF1 (Q71L) (ARF1DN). Como un indicador para la inhibición del transporte de proteínas al aparato de Golgi por la coexpresión con ARF1DN, se coexpresó vacuola-GFP con cada ARF1. Se construyó un vector de expresión para cada ARF1 como sigue. Se puede preparar un vector de expresión para vacuola-GFP con referencia al siguiente documento.

Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457

Como la proteína de regulación de transporte vesicular, se construyeron vectores de expresión para ARF1 de Arabidopsis (acceso de GenBank No. M95166) y para el mutante dominante negativo de la misma ARF1 (Q71L) (Misaki Takeuchi et al., 2002 (véase posteriormente)). Se realizó PCR usando ADNc preparado de embrión de Arabidopsis como molde usando un cebador ARF1-F (SEQ ID NO: 59) y un cebador ARF1-R (SEQ ID NO: 60). El fragmento de ADN resultante se subclonó en el hueco EcoRV en pBluescript (Stratagene). Se realizó otra PCR usando un cebador ARFQL-F (SEQ ID NO: 61) y un cebador ARFQL-R (SEQ ID No: 62) para sustituir un residuo de glutamina en la posición 71 con un residuo de leucina. Cada fragmento ARF1 resultante se subclonó en un vector de expresión transitoria pBI221.

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Cada uno de los vectores preparados se introdujo en el protoplasto de célula de tabaco cultivada de la misma manera que se ha descrito anteriormente, y las proteínas respectivas se coexpresaron para examinar la localización de 2*Stx2eB (PG12).

El resultado se muestra en la figura 7.

Tanto cuando 2*Stx2eB (PG12)-YFP se coexpresó con ARF1 como se coexpresó con ARF1 (Q71L), se formaron gránulos como se observó en una expresión de 2*Stx2eB (PG12)-YFP sola. Por otra parte, la coexpresión de ARF1 (Q71L) inhibió la salida de vacuola-GFP del ER. Se especuló de esto que la formación de gránulos no depende del proceso de transporte vesicular del ER al aparato de Golgi.

<2> Experimentos de transformación usando células de tabaco cultivadas

(1) Construcción de vectores para la transformación

Se prepararon 1*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (PG12), 3*Stx2eB (PG12), y 4*Stx2eB (PG12) de la misma manera que anteriormente.

Además, usando RS (Arg, Ser), PG7 (SEQ ID NO: 63), o SG12 (SEQ ID NO: 64) como espaciador en lugar de PG12, se prepararon construcciones de ADN, 2*Stx2eB (RS), 2*Stx2eB (PG7), y 2*Stx2eB (SG12) por los siguientes métodos.

Se insertó un espaciador PG7 (SEQ ID NO: 63) entre Stx2eB y la etiqueta HA en el plásmido 8. Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ iD NO: 66) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado obtenido se insertó en el hueco BglII del plásmido 8 (plásmido 10).

Se insertó un espaciador SG12 (SEQ ID NO: 64) entre Stx2eB y la etiqueta HA. Un cebador SG12-F (SEQ ID NO: 67) y un cebador SG12-R (SEQ ID NO: 68) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado obtenido se insertó en el hueco BglII del plásmido 8 (plásmido 11).

Se cortó un fragmento Stx2eB del plásmido 1 con BamHI y BglII y después se insertó en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (RS)). Se cortó un fragmento Stx2eB-PG7 del plásmido 10 con BamHI y BglII y después se insertó en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (PG7)). Se cortó un fragmento Stx2eB-SG12 del plásmido 11 con BamHI y BglII y después se insertó en el hueco BamHI de 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (SG12)).

Para producir Stx2eB usando un transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de ADN del anterior Stx2eB se subclonó en un vector para transformación (para el diseño de vectores, véase la figura 1). Cada uno de 1*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (PG12), 3*Stx2eB (PG12), 4*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (RS), 2*Stx2eB (PG7), y 2*Stx2eB (SG12) se insertó en pBI121 (Clontech) usando XbaI y SacI, y se repartió entre un promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y un terminador de la transcripción del gen de nopalina sintetasa (NOS-T).

(2) Transformación de células de tabaco cultivadas

El vector producido para transformación se introdujo en Agrobacterium tumefacience EHA105 usando un método de electroporación. Un medio de Agrobacterium (100 pl) cultivado en 5 ml de medio LB que contenía 100 mg/l de kanamicina a 28°C durante 2 noches se mezcló con de 5 a 10 ml de una suspensión de células de tabaco cultivadas (Nicotiana tabacum, cv BY2) el cuarto día del cultivo en una placa de Petri, y la mezcla se cocultivó dejándola reposar en un lugar oscuro a 25°C durante 2 noches. Para eliminar Agrobacterium, el medio en la placa de Petri se transfirió a un tubo de centrifugación de 15 ml, que después se centrifugó (1.000 rpm, 5 minutos, 4°C), y el sobrenadante se eliminó. Se cargó un medio LS modificado, y el tubo se centrifugó (1.000 rpm, 5 minutos, 4°C) para lavar las células. Esta operación de lavado se repitió cuatro veces para eliminar Agrobacterium. Las células BY2 resultantes se colocaron después en un medio LS agar modificado que contenía kanamicina (100 mg/l), y se cultivaron dejándolas reposar en un lugar oscuro a 25°C. Después de aproximadamente 2 a 3 semanas, las células que han formado un callo se transfirieron a una placa nueva, y se seleccionó un clon en crecimiento.

(3) Semicuantificación de proteína Stx2eB usando análisis por inmunotransferencia.

Se recogieron células de tabaco cultivadas en un medio en placa en un tubo de centrífuga, y se añadió 1 pl de tampón de muestra de SDS por mg de peso celular. Las células se desnaturalizaron a 95°C durante 2 minutos para hacer una muestra para electroforesis. Las proteínas se separaron usando un gel de acrilamida al 15%, y después se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) usando un aparato de electrotransferencia. Se detectó una proteína Stx2eB usando un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche). Se prepararon diluciones en serie de Stx2eB que tenía la etiqueta HA a concentraciones conocidas, y se cargaron en el gel. Se preparó una

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curva de calibración basada en sus intensidades de señal, y se calculó la cantidad de proteínas Stx2eB en cada muestra.

Los resultados se muestran a continuación.

(a) Efectos del número de unión de Stx2eB Los resultados se muestran en las figuras 8 y 9.

Cuando se expresó 1*Stx2eB (PG12), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 17 kDa. Se presume que son Stx2eB en la que el péptido señal se cortó y Stx2eB en la que el péptido señal no se cortó, respectivamente. Cuando se expresó 2*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 19 kDa a un nivel similar que cuando se expresó 1*Stx2eB (PG12). Cuando se expresó 3*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 26 kDa, siendo la señal menor que cuando se expresó 1*Stx2eB (PG12). Estas corresponden a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN. Cuando se expresó 4*Stx2eB (PG12), una señal específica estaba por debajo del límite de detección (datos no mostrados).

Se ha encontrado de lo anterior que 2*Stx2eB (PG12) acumula la cantidad mayor de Stx2eB que 1*Stx2eB (PG12) y 3*Stx2eB (PG12).

(b) Efectos del espaciador

Los resultados se muestran en las figuras 10 y 11.

Basado en la intensidad de la señal correspondiente a Stx2eB, el nivel de Stx2eB acumulada era el más alto cuando se usó PG12 como espaciador. Los niveles eran en segundo lugar altos cuando se usaron PG7 y SG12, que estaban en grado similar. El nivel fue el más bajo cuando se usó RS. Esto indica que la longitud y la secuencia de aminoácidos del espaciador entre dos Stx2eB afecta el nivel de proteína 2*Stx2eB acumulada.

(4) Cuantificación de ARNm por PCR a tiempo real

Se examinó si el nivel de la proteína acumulada estaba influido por un nivel de trascripción o no.

Se preparó ARN usando RNeasy Mini Kit (Qiagen) de cada una de las células BY2 transformadas obtenidas anteriormente. El ARN resultante se trató con DNasa, y después se sometió a transcripción inversa usando Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche). Se realizó pCr a tiempo real usando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Se usó un conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 69 y SEQ ID NO: 70) que amplificaba la región que contenía NtADH 5'-UTR y el péptido señal que eran comunes en las construcciones respectivas para la cuantificación del ARNm de Stx2eB. Se cuantificó la cantidad de un gen de ubiquitina de BY2 expresada usando un cebador UBQ-F (SEQ ID NO: 71) y un cebador UBQ-R (SEQ ID NO: 72) para compensar el nivel de ARNm de un gen Stx2eB. Nótese que el nivel de ARNm de 1*Stx2eB (PG12) se calculó multiplicando un valor cuantificado por 1/2.

Los resultados se muestran en la figura 12.

Los niveles de acumulación de proteína Stx2eB por ARNm tienden a ser mayores en células que expresan 2*Stx2eB (PG12) que esos en células que expresan 2*Stx2eB (RS) o 1*Stx2eB (PG12). Esto indica que la diferencia del espaciador no influye en el nivel transcripción, pero influye en un nivel de traducción. Considerando junto el resultado de que la proteína 2*Stx2eB se localizaba granularmente, es concebible que el espaciador influye en la estabilidad de la proteína después de la traducción.

<3> Experimentos de expresión transitoria

(1) Construcción de vectores de expresión transitoria de Stx2eB

Se construyeron vectores de expresión transitoria para 1*Stx2eB (PG12), 2*Stx2eB (PG12), 3*Stx2eB (PG12), y 4*Stx2eB (PG12) de la misma manera que anteriormente por el método en el anterior <1> (1) (Fig. 13-A). Estos vectores se denominan ER-1 *Stx2eB (PG12), ER-2*Stx2eB (PG12), ER-3*Stx2eB (PG12), y ER-4*Stx2eB (PG12), respectivamente. Nótese que “ER” significa el tipo retículo endoplásmico.

Además, se construyeron vectores de expresión transitoria que contenían el tipo citoplásmico (Cyt) de la construcción de ADN (Fig. 13-B) y vectores de expresión que contenían el tipo cloroplasto (Chl) de la construcción de ADN (Fig. 13-C) mediante el siguiente método. Estas construcciones de ADN se diseñaron para contener ADN que codifica el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico, para el fin de expresar la proteína híbrida que tiene una estructura tan cercana posible a la del tipo de retículo endoplásmico de la proteína híbrida. Pero, puesto

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que estas construcciones de ADN no contienen ADN que codifica el péptido señal secretor, el péptido señal de retención en el retículo endoplásmico no ejerce su función (la retención de la proteína en el retículo endoplásmico) en la proteína híbrida producida.

Se amplificó un fragmento NtADH 5'-UTR por PCR usando un cebador ADH XbaI-F (SEQ ID NO: 34) y un cebador ADH BamHI-R (SEQ ID NO: 112), y el fragmento de ADN resultante se trató con XbaI y BamHI. El fragmento Xbal- BamHI de NtADH 5'-UTR se insertó en el hueco XbaI-BamHI de cada una de ER-1*Stx2eB (PG12), ER-2*Stx2eB (PG12), ER-3*Stx2eB (PG12), y ER-4*Stx2eB (PG12) para preparar Cyt-1xStx2eB (PG12), Cyt-2*Stx2eB (PG12), Cyt-3*Stx2eB (PG12), y Cyt-4*Stx2eB (PG12) que eran vectores Stx2eB de tipo citoplásmico.

Se amplificó un fragmento NtADH 5'-UTR por PCR usando un cebador ADH XbaI-F (SEQ ID NO: 34) y un cebador ADH NsiI-R (SEQ ID NO: 35). Un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 80) que codifica el péptido señal de tránsito, derivando el cloroplasto de Rbcs (subunidad pequeña de Rubisco) de Lactuca sativa (acceso de GenBank D14001) (péptido de tránsito, T.P.), se amplificó por PCR con ADNc de una hoja de Lactuca sativa como molde usando un cebador TP NsiI-F (SEQ ID NO: 113) y un cebador TP BamHI-R (SEQ ID NO: 114). Cada fragmento de ADN resultante de NtADH 5'-UTR y cada fragmento de ADN del péptido señal secretor se trató con NsiI (fabricada por Toyobo Co., Ltd ), se ligó usando Ligation High (Toyobo Co., Ltd.) seguido por hacerlo romo, y clonarlo en el hueco EcoRV de pBluescript II SK (fabricado por Stratagene) (plásmido 12). El plásmido 12 se trató con NsiI, se hizo romo con ADN polimerasa de T4 (Toyobo Co., Ltd.), y después se autoligó para fusionarse de modo que el codón de iniciación de NtADH y el codón de iniciación de Rbcs fueran coincidentes (plásmido 13). Un fragmento de fusión NtADH 5'-UTR-T.P. se cortó del plásmido 13 usando XbaI y BamHI, y se insertó en el hueco XbaI-BamHI de cada uno de ER-1 *Stx2eB (PG12), ER-2*Stx2eB (PG12), ER-3*Stx2eB (PG12), y ER-4*Stx2eB (PG12) para preparar Chl-1 *Stx2eB (PG12), Chl-2xStx2eB (PG12), Chl-3xStx2eB (PG12), y Chl-4xStx2eB (PG12) que eran vectores Stx2eB de tipo cloroplasto.

(2) Producción de vectores de expresión transitorios de CTB

Se construyeron vectores de expresión transitoria para 1*CTB (PG12) y 2*CTB (PG12) por el método en el anterior <1> (2) (Fig. 14-A). De aquí en adelante, estos vectores se denominan ER-1 xCTB (PG12) y ER-2*CTB (PG12).

Se construyeron vectores de expresión transitoria del tipo citoplásmico (Cyt) de construcción de ADN (Fig. 14-B) y vectores de expresión que contenían el tipo cloroplasto (Chl) de construcción de ADN (Fig. 14-C) por los siguientes métodos.

Se cortó un fragmento CTB-PG12 de ER-1 xCTB (PG12) usando BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI-BglII de Cyt-1*Stx2eB (PG12) y el hueco BamHI-BglII de Chl-1*Stx2eB (PG12) producidos en el anterior <3> (1) para preparar el tipo citoplásmico de 1*CTB (PG12) y el tipo cloroplasto de 1*CTB (PG12) (Cyt-1*CTB (PG12), Chl- 1 xCTB (PG12)).

Posteriormente, se cortó un fragmento 2 x (CTB-PG12) de ER-2xCTB (PG12) usando BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI-BglII de Cyt-1xStx2eB (PG12) y el hueco BamHI-BglII de Chl-1xStx2eB (PG12) para preparar el tipo citoplásmico de 2xCTB (PG12) y el tipo cloroplasto de 2xCTB (PG12) (Cyt-2xCTB (PG12), Chl-2xCTB (PG12)).

(3) Experimentos de expresión transitoria y análisis de inmunotransferencia

Los experimentos de expresión transitoria se llevaron a cabo usando protoplastos de Lactuca sativa de la misma manera que en el anterior <1> (3). Posteriormente, Stx2eB y CTB se detectaron de la misma manera que en el anterior <1> (4).

(a) Efectos del número de unión de Stx2eB Los resultados se muestran en la figura 15.

Cuando se expresó ER-1xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 10 kDa. Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 19 kDa, siendo la señal mayor que cuando se expresó ER-1xStx2eB (PG12). Cuando se expresó ER-3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 27 kDa, siendo la señal mayor que cuando se expresó ER-1xStx2eB (PG12). Estas corresponden a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN. Cuando se expresó ER-4xStx2eB (PG12), una señal específica estaba por debajo del límite de detección.

Cuando se expresó Cyt-1xStx2eB (PG12), una señal específica estaba por debajo del límite de detección. Cuando se expresó Cyt-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 20 kDa. Cuando se expresó Cyt-3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 30 kDa. Estas correspondían a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN. Además, cuando se expresó Cyt-4xStx2eB (PG12), una señal específica estaba por debajo del límite de detección.

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Cuando se expresó Chl-1*Stx2eB (PG12), se detectó una señal débilmente en la posición de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expresó Chl-2*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 22 kDa, estando la señal a un nivel similar que esa cuando se expresó ER-3*Stx2eB (PG12). Cuando se expresó Chl- 3*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 30 kDa, estando la señal a un nivel similar que esa cuando se expresó Chl-2*Stx2eB (PG12). Estas correspondían a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN. Cuando se expresó Chl-4*Stx2eB (PG12), se detectó una señal débilmente en la posición de 34 kDa.

Puesto que cada una de las construcciones de ADN anteriores contiene una molécula de la etiqueta HA (véase la figura 13), cuando se expresa ADN que codifica dos Stx2eB y cuando se expresa ADN que codifica tres Stx2eB, se piensa que las cantidades de las proteínas acumuladas corresponden a aproximadamente dos veces y aproximadamente tres veces, respectivamente, la cantidad cuando se expresa ADN que contiene una Stx2eB.

Por tanto, se ha encontrado que cuando se expresa cualquiera del tipo retículo endoplásmico (ER), tipo citoplásmico (Cyt) y tipo cloroplasto (Chl) de las construcciones de ADN, la proteína Stx2eB se puede acumular de forma más eficaz cuando se expresa la proteína en la que dos o tres Stx2eB están unidas en tándem a través del espaciador que cuando se expresa una proteína Stx2eB.

(b) Efectos del número de unión de CTB

Los resultados se muestran en la figura 16.

Cuando se expresó ER-1*CTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 17 kDa. Cuando se expresó ER-2*CTB (PG12), se detectó una señal mayor que cuando se expresó ER-1*CTB (PG12) en las posiciones de aproximadamente 28 kDa y aproximadamente 30 kDa. Estas correspondían a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN.

Cuando se expresó Cyt-1*CTB (PG12), se detectó una señal débilmente en la posición de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expresó Cyt-2*CTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 26 kDa, la señal estaba a un nivel similar que esa cuando se expresó ER-2*CTB (PG12). Estas correspondían a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN.

Cuando se expresó Chl-1*CTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 14 kDa. Cuando se expresó Chl-2*CTB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 26 kDa, la señal estaba a un nivel similar que esa cuando se expresó ER-2*CTB (PG12). Estas correspondían a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN.

De lo anterior, se ha encontrado que cuando se expresa cualquiera del tipo retículo endoplásmico (ER), tipo citoplásmico (Cyt) y tipo cloroplasto (Chl) de las construcciones de ADN, las proteínas CTB se pueden acumular de forma más eficaz cuando se expresa la proteína en la que dos CTB están unidas en tándem a través del espaciador que cuando se expresa una proteína CTB.

<4> Experimentos de transformación usando células de tabaco cultivadas

(1) Construcción de vectores para la transformación

Los experimentos de transformación se realizaron usando ER-2*Stx2eB (PG12), Cyt-1*Stx2eB (PG12), Cyt- 2*Stx2eB (PG12), y Cyt-3*Stx2eB (PG12) preparados anteriormente.

Los vectores para la transformación se prepararon de la misma manera que el método en el anterior <2> (1).

(2) Transformación y análisis por inmunotransferencia de células de tabaco cultivadas

Los experimentos de transformación y el análisis por inmunotransferencia se llevaron a cabo de la misma manera que los métodos en los anteriores <2> (2) y (3).

Los resultados se muestran en la figura 17.

Cuando se expresó ER-2*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en las posiciones de aproximadamente 19, 21 y 23 kDa. Cuando se expresó Cyt-1*Stx2eB (PG12), una señal específica estaba por debajo del límite de detección. Cuando se expresó Cyt-2*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 19 kDa. Cuando se expresó Cyt-3*Stx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 27 kDa, siendo la señal mayor que esa cuando se expresó Cyt-2*Stx2eB (PG12).

De lo anterior, se ha determinado que también en el transformante de la célula de tabaco cultivada, las proteínas Stx2eB se pueden acumular de forma más eficaz cuando se expresa la proteína en la que dos o tres Stx2eB están

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unidas en tándem a través del espaciador que cuando se expresa una proteína Stx2eB. También se ha encontrado que cuando se expresa el tipo citoplásmico de construcción de ADN en el transformante de células de tabaco cultivadas, en particular cuando se expresa la proteína en la que tres Stx2eB están unidas en tándem a través del espaciador, las proteínas Stx2eB se pueden acumular de forma más eficaz.

También se ha encontrado que, en el transformante de la célula de tabaco cultivada, las proteínas Stx2eB se pueden acumular de forma más eficaz cuando se expresa el tipo de retículo endoplásmico de construcción de ADN que cuando se expresa el tipo citoplásmico de construcción de ADN.

<5> Experimentos de transformación usando cuerpo de planta de tabaco

(1) Construcción de vectores para la transformación

Los experimentos de transformación se realizaron usando ER-2*Stx2eB (PG12), Chl-1*Stx2eB (PG12), Chl- 2*Stx2eB (PG12), y Chl-3*Stx2eB (PG12) preparados anteriormente.

(2) Transformación de cuerpo de planta de tabaco

Se transformaron cuerpos de plantas de tabaco por el siguiente método usando los vectores preparados anteriormente.

Se esterilizaron semillas de cuerpo de planta de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Petit habana SR1) y se sembraron en un medio MS. Una porción de hoja de Nicotiana tabacum esterilizada se cortó en trozos, cada uno tenía un tamaño de aproximadamente 1^1 cm sin incluir venas de la hoja, y se colocaron con la parte trasera de la hoja hacia arriba en una placa de Petri que contenía agua estéril. Una suspensión de Agrobacterium cultivada durante dos noches en el medio LB que contenía 100 mg/l de kanamicina y obtenida en el anterior <2> (2) se echó en la placa de Petri, y el trozo de hoja se sumergió en la misma durante 3 a 5 minutos. El trozo de hoja se recogió, y un medio bacteriano extra en el trozo de hoja se secó con una toalla de papel estéril. El trozo de hoja se colocó en un medio de formación de callo y se cultivó a 25°C. Después de 2 a 3 días, cuando Agrobacterium se volvió visible en el medio, el trozo de hoja se transfirió a un tubo de 50 ml, se lavó cinco veces con agua estéril, se colocó en un medio de formación de callo (que contenía 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina), y se cultivó a 25°C durante 1 a 2 semanas. Cuando el trozo de hoja se curvó comparado con la original y mostró una superficie cóncavoconvexa, el trozo de hoja se transfirió a un medio de formación de brotes (que contenía 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina). Después de 4 a 6 semanas adicionales, se cortó un brote que tenía un tallo desarrollado y una porción de hoja, se transfirió a un medio de formación de raíz (que contenía 100 mg/l de kanamicina y 250 mg/l de carbenicilina), y se cultivó a 25°C hasta que se observó rizogénesis. Un cuerpo de planta crecido hasta un cierto tamaño se hizo crecer como una planta en maceta.

(3) Análisis de inmunotransferencia

La hoja del cuerpo de planta de tabaco manipulada genéticamente producida anteriormente se tomó como muestra, y se añadió tampón de muestra de SDS a la misma en la proporción de 1 pl de SDS respecto a 1 mg de hoja. La muestra se desnaturalizó térmicamente a 95°C durante 2 minutos para servir como la muestra para electroforesis. Las proteínas se separaron usando un gel de acrilamida al 15%, y después se transfirieron a una membrana de PVDF (Hybond-P; Amersham) usando un aparato de electrotransferencia. La proteína Stx2eB se detectó usando un anticuerpo anti-HA (No. 11 867 423 001, Roche).

Los resultados se muestran en las figuras 18 y 19.

Se obtuvieron clones en los se acumuló Stx2eB con alta eficacia en el cuerpo de planta transformado con uno de ER-2xStx2eB (PG12), Chl-1xStx2eB (PG12), Chl-2xStx2eB (PG12), y Chl-3xStx2eB (PG12). También en el tipo cloroplasto de construcciones de ADN, se ha encontrado que se obtuvo el clon que acumula Stx2eB de forma eficaz con una mayor probabilidad cuando se expresa la proteína en que dos o tres Stx2eB están unidas en tándem a través del espaciador que cuando se expresa una proteína Stx2eB.

Cuando se expresó ER-2xStx2eB (PG12), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 19 kDa, y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expresó Chl-1xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 12 kDa. Cuando se expresó Chl-2xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 19 kDa. Cuando se expresó Chl-3xStx2eB (PG12), se detectó una señal en la posición de aproximadamente 27 kDa. Estas correspondían a los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN.

<6> Experimentos de transformación usando células de tabaco cultivadas

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(1) Construcciones de vectores para la transformación de Stx2eB

Se preparó ER-2*Stx2eB (PG12) por el método en el anterior <1> (1). Se prepararon ER-2*Stx2eB (PG17) y ER- 2*Stx2eB (PG22) por el siguiente método. El diseño de las construcciones de ADN se muestra en la figura 20.

Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ ID NO: 66) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se insertó en el hueco BglII de ER-1*Stx2eB (PG12) obtenido en <1> (1) (plásmido 14).

Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se insertó en el hueco BglII de ER-1*Stx2eB (PG12) (plásmido 15).

Se cortó un fragmento Stx2eB-PG17 del plásmido 14 usando BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI de ER- 1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (PG17)). Se cortó un fragmento Stx2eB-PG22 del plásmido 15 usando BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI de ER-1*Stx2eB (PG12) (2*Stx2eB (PG22)).

Para producir Stx2eB usando el transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de ADN anteriores para Stx2eB se subclonó en un vector para la transformación. Es decir, cada una de ER-2*Stx2eB (PG12), ER-2*Stx2eB (PG17) y ER-2*Stx2eB (PG22) se insertó en pBI121 (Clontech) usando XbaI y SacI, y se repartió entre el promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y el terminador de la transcripción del gen de nopalina sintetasa (NOS-T).

(2) Construcciones de vectores para la transformación de CTB

Se preparó ER-2*CTB (PG12) por el método en el anterior <1> (2). Se prepararon ER-2*CTB (PG17) y ER-2*CTB (PG22) por el siguiente método. El diseño de las construcciones de ADN se muestra en la figura 21.

Un cebador PG7-F (SEQ ID NO: 65) y un cebador PG7-R (SEQ ID NO: 66) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se insertó en el hueco BglII de ER-1*CTB (PG12) obtenido en <1> (2) (plásmido 16). Un cebador PG12-F (SEQ ID NO: 43) y un cebador PG12-R (SEQ ID NO: 44) se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK. El fragmento de ADN fosforilado resultante se insertó en el hueco BglII de ER-1*CtB (PG12) (plásmido 17).

Se cortó un fragmento CTB-PG17 del plásmido 16 usando BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI de ER- 1*CTB (PG12) (2*CTB (PG17)). Se cortó un fragmento CTB-PG22 del plásmido 17 usando BamHI y BglII, y se insertó en el hueco BamHI de ER-1*CTB (PG12) (2*CTB (PG22)).

Para producir CTB usando el transformante estable de la planta, cada una de las construcciones de ADN anteriores para CTB se subclonó en un vector para la transformación. Es decir, cada una de ER-2*CTB (PG12), ER-2*CTB (PG17) y ER-2*CTB (PG22) se insertó en pBI121 (Clontech) usando XbaI y SacI, y se repartió entre el promotor del ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S pro.) y el terminador de la transcripción del gen de nopalina sintetasa (NOS-T).

(3) Experimentos de transformación y análisis por inmunotransferencia

(a) Efectos de la longitud de espaciador en la unión en tándem de Stx2eB Los resultados se muestran en la figura 22.

Cuando se expresó uno de ER-2*Stx2eB (PG17) y ER-2*Stx2eB (PG22), se detectó una señal a un nivel similar a la esa cuando se expresó uno de ER-2*Stx2eB (PG12). Esto indica que cualquiera de PG17 y PG22 muestra el mismo efecto que PG12.

Cuando se expresó ER-2*Stx2eB (PG12), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 19 kDa y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expresó ER-2*Stx2eB (PG17), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 19 kDa y aproximadamente 22 kDa. Cuando se expresó ER-2*Stx2eB (PG22), se detectaron señales en las posiciones de aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 23 kDa. Estas correspondían con los pesos moleculares estimados del diseño de las construcciones de ADN.

(b) Efectos de la longitud de espaciador en la unión en tándem de CTB Los resultados se muestran en la figura 23.

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REIVINDICACIONES

1. Una proteína híbrida que comprende

(a) dos proteínas toxinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína toxina Shiga (Stx), proteína toxina del cólera (CT) o proteína toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT), en donde dichas proteínas toxinas se unen en tándem a través de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84, y

(b) un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 82 o 84 unido al extremo C de las proteínas toxinas unidas en tándem de (a),

en donde la proteína Stx es una proteína Stx2eB, en donde la proteína CT es una subunidad B de la proteína CT, y en donde la proteína LT es una subunidad B de la proteína LT.
2. La proteína híbrida según la reivindicación 1, en donde dichas proteínas toxinas están unidas en tándem a través de un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
3. La proteína híbrida según la reivindicación 1 o 2, que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14 o 16.
4. La proteína híbrida según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 90, 92, 98 o 100.
5. La proteína híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde un péptido señal secretor derivado de una planta se añade a su extremo amino.
6. La proteína híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un péptido señal de retención en el retículo endoplásmico se añade a su extremo carboxilo.
7. Una construcción de ADN que comprende ADN que codifica la proteína híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. La construcción de ADN según la reivindicación 7, que comprende ADN que tiene la secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 13, 15, 89, 91, 97 o 99.
9. La construcción de ADN según la reivindicación 7 o 8, en donde el ADN que codifica una proteína híbrida está operativamente unido a una región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta.
10. La construcción de ADN según la reivindicación 9, en donde la región 5' no traducida de un gen de alcohol deshidrogenasa derivado de una planta deriva de Nicotiana tabacum.
11. La construcción de ADN según la reivindicación 10, que comprende ADN que tiene la secuencia de bases representada por cualquiera de SEQ ID NO: 28, 29, 101, 102, 103, 104, 108, 109, 110 o 111.
12. Un vector recombinante que comprende la construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
13. Una célula huésped transformada con el vector recombinante según la reivindicación 12.
14. La célula huésped según la reivindicación 13, en donde el transformante es una célula vegetal transformada o una planta transformada.
15. Una semilla, que se obtiene del transformante según la reivindicación 13 o 14.
16. Un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de SEQ ID NO: 2, 82, o 84.