ES2686968T3 - Proteínas de fusión bifuncionales para inhibir la angiogénesis en el microambiente tumoral y para activar las respuestas inmunitarias adaptativas y los genes y usos de las mismas - Google Patents

Proteínas de fusión bifuncionales para inhibir la angiogénesis en el microambiente tumoral y para activar las respuestas inmunitarias adaptativas y los genes y usos de las mismas Download PDF

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Abstract

Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L, caracterizada porque la proteína comprende las secuencias de aminoácidos de los fragmentos activos de tumstatina y la región extracelular de CD137L, en la que las secuencias de tumstatina y CD137L se fusionan a través de un enlazador peptídico flexible, en la que la secuencia de aminoácidos del fragmento activo de tumstatina se selecciona de la SEQ ID NO.65 a la SEQ ID NO.68, en la que la secuencia de aminoácidos del enlazador peptídico se selecciona de la SEQ ID NO.69 a la SEQ ID NO.76, en la que la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CD137L se selecciona de la SEQ ID NO.77 a la SEQ ID NO.80.

Description

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DESCRIPCION
Proteínas de fusión bifuncionales para inhibir la angiogénesis en el microambiente tumoral y para activar las respuestas inmunitarias adaptativas y los genes y usos de las mismas
Resumen: Se desvelan proteínas de fusión bifuncionales que tienen fragmentos activos de tumstatina y regiones extracelulares CD137L. Las proteínas muestran actividades para inhibir la proliferación de las células endoteliales de la vena umbilical humana y para estimular la proliferación de los linfocitos T. Se pueden usar para el tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con tumores y la regulación de la angiogénesis y los efectos inmunológicos en seres humanos.
Campo de la técnica
La presente invención pertenece al campo de la ingeniería biomédica y terapéutica. La presente invención se refiere en general a una serie de proteínas de fusión bifuncionales (CD137L-Tumstatina) y a sus genes, en la que las proteínas tienen las funciones de inhibir la angiogénesis en el microambiente tumoral y activar las respuestas inmunes adaptativas. La presente invención también se refiere al vector de expresión que contiene los genes, a las cepas transformadas por el vector de expresión y al procedimiento de preparación de las proteínas de fusión bifuncionales. Además, la presente invención se refiere generalmente a la aplicación de las proteínas de fusión bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L en la preparación de agentes farmacéuticos para inhibir la angiogénesis en el microambiente tumoral y para tratar diversas enfermedades relacionadas con tumores (por ejemplo, melanoma, cáncer rectal, cáncer de pulmón y otros cánceres) mediante la activación de las respuestas inmunes adaptativas, así como todas las posibles vías de administración (por ejemplo, administración oral, administración de pulverizaciones y otras).
Antecedentes de la invención
La aparición de cáncer es un proceso que abarca múltiples genes y diferentes vías de señal. En cuanto a su esencia, el cáncer es un tipo de enfermedad molecular. En la actualidad, la terapia molecular dirigida a un solo objetivo ha demostrado gradualmente muchas deficiencias, mientras que las estrategias terapéuticas que combinan múltiples objetivos o múltiples mecanismos muestran mejores efectos terapéuticos.
En 1971, el profesor Folkman de la Universidad de Harvard propuso la teoría de que "el crecimiento y la metástasis de los tumores dependen de la angiogénesis en el microambiente". Postuló la hipótesis de que el crecimiento y la metástasis de los tumores podrían inhibirse suprimiendo la angiogénesis en el microambiente y cortando el suministro de nutrientes y oxígeno a los tumores. Hasta ahora, esta teoría se ha verificado mediante numerosos datos clínicos y experimentales en todo el mundo, y, por tanto, recientemente se ha convertido en una nueva estrategia en el campo de la terapia del cáncer. La tumstatina, una proteína que consiste en 244 aminoácidos, es un inhibidor de la angiogénesis tumoral derivado del C-terminal de la cadena a3 del colágeno de tipo IV en la membrana basal vascular.
Entre todas las membranas basales vasculares, el marco reticular tridimensional formado por colágeno de tipo IV desempeña un papel predominante como endoprótesis vasculares, que pueden promover la adhesión, la migración, la diferenciación y el crecimiento de las células. Las 6 cadenas (al ~ a6) están codificadas por 6 genes distintos, formando un trímero a través de las mismas cadenas a o diferentes, formando además el marco reticular. Cada cadena a3 de colágeno de tipo IV consiste en tres unidades funcionales (dominio 7S, región de triple hélice, dominio NC1 no colagenoso) y se distribuye en las membranas basales de los capilares glomerulares, los capilares alveolares, la cóclea, la cápsula del cristalino, los ovarios y testiculares.
La angiogénesis es una etapa crítica en el crecimiento tumoral y la metástasis, que incluye una serie de procesos complejos. La hipoxia en los tejidos tumorales produce el aumento de los factores estimulantes de la angiogénesis, estimulando así la angiogénesis en el microambiente tumoral. Estudios recientes muestran que la tumstatina puede inhibir específicamente la síntesis de las proteínas de las células endoteliales vasculares del tumor, lo que da como resultado en la apoptosis de las células endoteliales y la inhibición de la angiogénesis, y, por lo tanto, inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis. Además, la tumstatina también tiene un efecto directo sobre las células tumorales para inhibir su proliferación. La acción del mecanismo de la tumstatina es inhibir la síntesis de las proteínas de las células endoteliales vasculares localizadas específicamente en el microambiente tumoral a través de la unión al receptor de la integrina avp3 que inhibe la síntesis de proteínas en las células endoteliales vasculares del tumor; de este modo, el crecimiento y la metástasis de las células tumorales pueden inhibirse inhibiendo la angiogénesis.
En el campo se ha reconocido que la inmunoterapia contra el cáncer muestra efectos ventajosos contra tumores malignos en seres humanos y animales a través de las respuestas inmunes. Las células inmunitarias de los pacientes con cáncer reconocen diferentes antígenos expresados por las células tumorales, tales como el antígeno de diferenciación tisular, el antígeno carcinoembrionario, los productos genéticos mutados y otros. Con la comprensión de los mecanismos sobre el reconocimiento de antígenos tumorales y la respuesta inmunitaria, se ha demostrado que las respuestas inmunitarias antitumorales pueden mejorarse proporcionando la señal de inmunocoestimulación a través de correceptores de linfocitos T. Los linfocitos T específicos del antígeno tumoral
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requieren una señal coestimuladora para ayudar a la primera señal iniciada por el antígeno para activar las células efectivas. Por lo tanto, la terapia adyuvante mediante moléculas coestimuladoras se puede usar para regular las respuestas inmunitarias dirigidas a tumores malignos.
Las moléculas coestimuladoras desempeñan un papel extremadamente importante en la respuesta inmunitaria. En general, se requieren dos señales en la activación de los linfocitos T. La primera señal es proporcionada por el receptor de linfocitos T (TCR) y el péptido antígeno-MHC presentado por las células presentadoras de antígeno (CPA), y la segunda señal es la señal coestimuladora proporcionada por las moléculas de adhesión en la superficie celular. Una de las formas importantes de mejorar la respuesta inmunitaria antitumoral mediada por linfocitos T es proporcionar señales coestimuladoras para lograr la activación completa de los linfocitos T. Además de CD28/B7, CD137 y su ligando CD137L es otro par de moléculas coestimuladoras de linfocitos T importantes descubiertas recientemente.
De acuerdo con sus estructuras, las moléculas coestimuladoras se pueden dividir en dos tipos, que incluyen el receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) y la superfamilia de las inmunoglobulinas. CD137, un miembro del TNFR, desempeña un papel importante en la regulación de la proliferación, diferenciación y apoptosis celular. Su ligando, CD137L, también es miembro de la familia de TNF, que pertenece a las proteínas transmembrana de tipo II en la superficie celular y comparte una secuencia de aminoácidos en el extremo C-terminal similar con otros miembros de la familia de TNF. El gen que codifica el CD137L humano se encuentra en 19p3.3, y su producto consiste en 254 aminoácidos, en el que el dominio citoplasmático consiste en 28 aminoácidos, la región transmembrana consiste en 21 aminoácidos y el dominio extracelular consiste en 205 aminoácidos. El CD137L fue descubierto por primera vez por Goodwin y col. usando la detección selectiva de la expresión de las células de timoma en ratones y más tarde se aisló en clones de linfocitos T CD4 + humanos.
Es bien sabido que la interacción entre CD137 y su ligando, CD137L, desempeña un papel importante en la activación de los linfocitos T. En linfocitos T humanos y de ratón, en presencia del anticuerpo CD3 (primera señal), CD137 puede inducir la proliferación de linfocitos T, la síntesis de citocinas (tales como IFN-a) y la supervivencia de las células activadas. La señal coestimuladora puede mejorar la función efectora aumentando la especificidad antigénica y aumentar el número de linfocitos T cD8+. En ausencia de anticuerpo CD3, la estimulación de CD137 no cambia las funciones de los linfocitos T, lo que indica que la interacción entre CD137 y CD137L solo proporciona una señal coestimuladora. El documento WO2013025846 desvela una proteína de fusión de transferrina-tumstatina con propiedades anti-angiogénicas. Los estudios de Kim y col., demostraron que la inmunidad antitumoral mediada por el anticuerpo monoclonal CD137 depende de la participación de los linfocitos T CD4+ T y CD8+. CD137 participa en la activación de NF-k B para regular por aumento la expresión de bcl-xL y bfl-1, para extender la supervivencia de los linfocitos T CD8+ y T CD4+ y para estimular su proliferación. Utilizando el anticuerpo monoclonal CD137L murino agonista, Melero y otros llevaron a cabo la inmunoterapia dirigida a CD137. Sus resultados mostraron que el anticuerpo monoclonal frente a CD137 podría eliminar la presencia de tumores sólidos P815 inoculados en ratones. De acuerdo con los efectos antitumorales del anticuerpo monoclonal agonista frente a CD137, CD137L también puede coestimular el linfocito citotóxico (CTL) y sus efectos antitumorales. El ratón CD137L -/- es una buena ilustración del importante papel del sistema CD137/CD137L en las respuestas inmunitarias mediadas por os linfocitos T contra virus y tumores, que muestra que la coestimulación de CD137/CD137L es vital en la enfermedad del injerto contra el huésped y en las respuestas de los linfocitos T antivirales.
En resumen, la señal coestimuladora proporcionada por CD137/CD137L puede cooperar con la de CD28/B7 para la activación adicional de los linfocitos T y el mantenimiento de la proliferación y supervivencia de los linfocitos T CD8+. La tumstatina puede inhibir eficazmente la angiogénesis tumoral, que puede bloquear las células tumorales frente a la supervivencia y la metástasis. Por lo tanto, para combinar las estrategias de antiangiogénesis e inmunoterapia, la proteína de fusión tumstatina-CD137L indicada en la presente invención puede suprimir el crecimiento tumoral y la metástasis mediante la combinación de dos mecanismos, que podrían evitar la resistencia a fármacos de la terapia de agente único y proporcionar una nueva terapia para el cáncer.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una proteína recombinante bifuncional según cualquiera de las reivindicaciones 1-2. La presente invención proporciona además un gen de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5.
En la presente invención, las proteínas bifuncionales y de doble objetivo, que poseen actividades para potenciar la inmunidad de linfocitos T e inhibir la angiogénesis, se preparan fusionando los fragmentos activos antiangiogénicos de la tumstatina con las regiones extracelulares de CD137L a través de enlaces peptídicos flexibles cortos. Diferentes fragmentos activos de la tumstatina (tumstatina 1 contiene los restos de aminoácidos de 45 a 98, tumstatina 2 contiene los restos de aminoácidos de 60 a 132, tumstatina 3 contiene los restos de aminoácidos de 60 a 98, tumstatina 7 contiene los restos de aminoácidos de 74 a 98) y las secuencia de aminoácidos extracelulares de CD137L (CD137L1 contiene los restos de aminoácidos de 46 a 254, CD137L4 contiene los restos de aminoácidos de 50 a 240, CD137L5 contiene los restos de aminoácidos de 83 a 254, CD137L6, un fragmento combinado, contiene los restos de aminoácidos de 46 a 85 y de 167 a 254, como se indica en la Figura 2) están conectados por un enlazador peptídico, y se preparan usando sistemas de expresión procariotas o eucariotas. Las proteínas de fusión tienen las ventajas de la preparación simple y efectos secundarios reducidos de la tumstatina de longitud
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completa y el y CD137L, respectivamente. La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-7. La presente invención también proporciona una proteína recombinante bifuncional para su uso de acuerdo con la reivindicación 8. La presente invención muestra excelentes potenciales en la preparación de agentes farmacéuticos para la inhibición de la angiogénesis, todos los tipos de enfermedades asociadas a tumores (tales como melanoma, cáncer de próstata, cáncer broncopulmonar, cáncer colorrectal y cáncer de vejiga y otros), cambios patológicos de la retina, la proliferación celular, la síntesis y secreción de citocinas y la regulación de la inmunidad, así como en la preparación de agentes farmacéuticos con diferentes formulaciones, incluyendo administración oral o mediante inyección.
El fin de la presente invención es proporcionar proteínas que poseen ambas funciones de la tumstatina y de CD137L.
El otro fin de la presente invención es proporcionar genes que codifican proteínas con las funciones de tumstatina y CD137L.
Otro fin de la presente invención es proporcionar procedimientos de preparación para las proteínas que poseen las funciones de tumstatina y CD137L.
Otro fin de la presente invención es proporcionar las aplicaciones de los genes y proteínas que poseen las funciones de tumstatina y CD137L en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la oncología (tales como melanoma, cáncer rectal, cáncer de pulmón y otros) y en las vías de administración de los agentes farmacéuticos (tales como administración oral, administración por pulverización y otros).
El esquema técnico de la presente invención se describe de la siguiente manera:
Las proteínas de fusión bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L, caracterizadas porque las proteínas comprenden las secuencias de aminoácidos de los fragmentos activos de tumstatina y los dominios extracelulares de CD137L, en las que las secuencias de tumstatina y CD137L se fusionan a través de enlazadores peptídicos flexibles, en las que la secuencia de aminoácidos del fragmento activo de tumstatina se selecciona de la SEQ ID NO.65 a la SEQ ID NO.68, en las que la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CD137L se selecciona de la SEQ ID NO.77 a la SEQ ID NO.80.
Las secuencias de aminoácidos del enlazador peptídico descrito anteriormente se pueden diseñar con las técnicas bien conocidas en la materia y las secuencias de aminoácidos preferentes se seleccionan de la SEQ ID NO.69 a la SEQ ID NO.76.
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas recombinantes bifuncionales descritas en la presente invención se seleccionan de la SEQ ID NO.25 a la SEQ ID NO.48. En la Figura 1 se muestra una representación esquemática de las estructuras de las proteínas recombinantes.
La presente invención también proporciona genes que codifican las proteínas recombinantes que poseen las funciones de la tumstatina y CD137L, que incluye el gen que codifica un fragmento activo de la tumstatina, el gen que codifica un enlazador peptídico y el gen que codifica una región extracelular de CD137L, en el que los genes que codifican la región extracelular de CD137L se seleccionan de la SEQ ID NO.61 a la SEQ ID NO.64, en los que los genes que codifican el fragmento activo de tumstatina se seleccionan de la SEQ ID NO.49 a la SEQ ID NO.52.
El gen que codifica el enlazador peptídico descrito anteriormente se selecciona, preferentemente, de la SEQ ID NO.53 a la SEQ ID NO.60
La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína recombinante descrita anteriormente se selecciona, preferentemente, de la SEQ ID nO.1 a la SEQ ID NO.24.
La presente invención también proporciona un gen que codifica una proteína recombinante tumstatina-CD137L, que tiene una homología del 70 % o más en comparación con las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente y produce una proteína recombinante descrita anteriormente, su polipéptido variante conservador, su fragmento activo o sus derivados activos.
La presente invención también proporciona un procedimiento de preparación para las proteínas recombinantes bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L, que incluye las siguientes etapas:
(1) Diseñar y obtener las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas recombinantes que poseen las actividades de tumstatina y CD137L descritas en la presente invención;
(2) Construir el sistema de expresión que contiene las secuencias de nucleótidos descritas anteriormente, incluyendo construir el vector de expresión y transformar el vector de expresión en una célula huésped para formar células recombinantes que pueden expresar las proteínas de fusión bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L;
(3) Cultivar las células recombinantes obtenidas de la etapa (2);
(4) Aislar y purificar las proteínas recombinantes que poseen las actividades de tumstatina y CD137L descritas en la presente invención.
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El sistema de expresión descrito anteriormente podría seleccionar un sistema de expresión procariota o un sistema de expresión eucariota. El sistema de expresión procariota se selecciona, preferentemente, de Escherichia coli o Bacillus subtilis, ambos generalmente aplicables a la expresión de las proteínas recombinantes descritas en la presente invención. El vector de expresión se selecciona, preferentemente, de pET-11a o pET-22b para el sistema de expresión d Escherichia coli, mientras que pP43 es el vector preferido para el sistema de expresión de Bacillus. La levadura es el sistema de expresión eucariota preferido, el vector de expresión se selecciona, preferentemente, de pPIC9K o pPICZaA, y las células huésped se seleccionan, preferentemente, de GS115 o SMD1168.
Un procedimiento de preparación preferente descrito anteriormente incluye el proceso de doble digestión de los genes que codifican las proteínas recombinantes que poseen las actividades de tumstatina y CD137L con las enzimas Ndel y Nhel, ligándolos con el vector de expresión pET-11a y transformando los vectores ligados en BL21(DE3) de E. coli. Después del cultivo de las bacterias modificadas genéticamente, las proteínas recombinantes se producen en forma de cuerpo de inclusión y se obtienen mediante renaturalización por dilución que incluye un proceso de lavado del cuerpo de inclusión mediante tampón que contiene bajas concentraciones de urea, solubilizando el cuerpo de inclusión mediante una solución desnaturalizante que contiene urea 8 M a 50 °C y renaturalización por dilución con la solución de replegamiento que contiene L-Arg a la concentración de 0,4 M. La pureza de los productos deseados es mayor que 80 %.
Otro procedimiento de preparación preferente descrito anteriormente incluye el proceso de doble digestión de los genes que codifican las proteínas recombinantes que poseen las actividades de tumstatina y CD137L con las enzimas PstI y HindlII, ligándolos con el vector de expresión pP43, transformando los vectores ligados en Bacillus subtilis WB800 por electroporación. Después del cultivo de las bacterias modificadas genéticamente, las proteínas recombinantes se producen en una forma soluble secretada. Las proteínas recombinantes descritas en la presente invención se obtienen por purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico DEAE-sephadex y la pureza es mayor que 80 %.
Otro procedimiento de preparación preferente descrito anteriormente incluye el proceso de doble digestión de los genes que codifican las proteínas recombinantes que poseen las actividades de tumstatina y CD137L con las enzimas EcoRI y Notl, ligándolos con el vector de expresión pPICZaA, transformando los vectores ligados en Pichia pastoris GS115 por electroporación. Después del cultivo de las bacterias modificadas genéticamente, las proteínas recombinantes se producen en una forma soluble secretada. Las proteínas recombinantes descritas en la presente invención se obtienen por purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico DEAE-sephadex y la pureza es mayor que 90 %.
La presente invención también proporciona las proteínas recombinantes bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L para su uso en un procedimiento para inhibir la angiogénesis en el microambiente tumoral, tratando diversas enfermedades relacionadas con tumores (tales como melanoma, cáncer rectal, cáncer de pulmón y otros), regulando la inmunidad corporal, estimulando la proliferación de linfocitos T y sintetizando y secretando citocinas.
En las aplicaciones descritas anteriormente, las proteínas recombinantes descritas en la presente invención pueden usarse solas o en forma de composiciones farmacéuticas. La composición farmacéutica comprende la proteína recombinante descrita en la presente invención como un componente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, la composición farmacéutica comprende de 0,1 % a 99,9 % en peso de una proteína recombinante descrita en la presente invención como principio activo. El vehículo farmacéuticamente aceptable no interferirá con la actividad farmacéutica y la dosificación efectiva de una proteína recombinante descrita en la presente invención, lo que significa que la dosificación del vehículo no es tóxica para el cuerpo humano.
El vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, aunque no de forma limitante, uno o más de los siguientes: materiales de intercambio iónico; óxido de aluminio; estearato de aluminio; lecitina; sistema de administración de fármacos autoemulsionante (SEDDS), tales como vitamina D y E, polietilenglicol 1000, succinato, Tween y otros medios de polimerización con funciones similares; otros tensioactivos farmacéuticamente aceptables; seroalbúminas, tales como seroalbúmina humana; tampones, tal como solución salina tamponada con fosfato; ácido aminoacético; ácido sórbico; ácido sórbico potásico; ácido graso vegetal saturado; mezclas de glicéridos; agua; sales; electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, geles de sílice, silicato de magnesio y otros. polivinilpirrolidona, celulosa, alcohol de polivinilo, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato, etileno, polioxietileno, copolímero de bloque (tales como lanolina) y ciclodextrina (tales como a-, p-, Y-ciclodextrina, derivados químicamente modificados, por ejemplo, 2- y 3- hidroxipropil-p -ciclodextrina, u otros derivados solubles) también son aplicables para la administración de las proteínas recombinantes descritas en la presente invención.
También podrían incorporarse otros excipientes farmacéuticamente aceptables en las composiciones farmacéuticas, que incluyen cargas (tales como lactosa anhídrica, almidón, lactosa o glucosa), aglutinantes (tales como celulosa microcristalina), agente disgregante (tal como carboximetil almidón de sodio reticulado, carboximetilcelulosa sódica reticulada, hidroxipropilcelulosa de baja sustitución (L-HPC) o PVP reticulada), agentes lubricantes (tales como estearato de magnesio), potenciador de la absorción, agentes aromatizantes, agentes edulcorantes, diluyentes, vehículos, agentes humectantes, disolventes, solubilizantes y agentes colorantes y otros.
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Las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente podrían usarse en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, administración oral, tales como comprimidos, cápsulas, gránulos, polvo o preparaciones líquidas, administración parenteral, tales como inyecciones, administraciones locales o supositorios, que podrían prepararse por procedimientos bien conocidos en la técnica o por procedimientos no convencionales tales como liposomas y otros.
Cuando las proteínas recombinantes descritas en la presente invención se usan como un agente terapéutico, la dosis diaria para adultos puede variar de 0,01 mg a 1 g, que depende de la edad, el sexo, el peso y el grado de enfermedad de los pacientes. Además, la dosis diaria total puede dividirse y administrarse en porciones durante el día.
Las proteínas recombinantes descritas en la presente invención también incluyen los derivados proteicos que se modifican mediante procedimientos bien conocidos en la materia del presente campo técnico.
En la mayoría de las circunstancias, la mayoría de los fármacos proteicos y peptídicos se pueden digerir paso a paso desde los dos extremos de los péptidos lineales mediante aminopeptidasa y carboxipeptidasa.
La modificación de los polipéptidos es un medio importante para cambiar la estructura de la cadena principal y la cadena lateral. En un gran número de estudios se ha indicado que los fármacos polipeptídicos modificados mostraron una mejor eficacia que exhibe una inmunogenicidad significativamente reducida, efectos secundarios reducidos, una mayor solubilidad en agua, semividas biológicas prolongadas in vivo y cambios en la distribución tisular, etc.
Los procedimientos de modificación descritos en la presente invención consisten en las modificaciones en restos de aminoácidos intermedios, sustituciones de aminoácidos, modificación de glicosilación y modificación de PEG y otros, cuyos principios básicos aumentan el peso molecular relativo y el impedimento estérico de las moléculas polipeptídicas y mejoran la estabilidad del polipéptido a la hidrolasa, y la reducción de la función de filtración del glomérulo.
La sustitución de aminoácidos es otro procedimiento para prolongar la semivida de los fármacos polipeptídicos posponiendo la digestión de las enzimas. Los restos del objeto generalmente son aquellos aminoácidos fácilmente digeridos. Con detalle, los restos intermedios de las proteínas recombinantes podrían estar glicosilados, fosforilados, metilados, acetilados, nitrados, sulfonados, PEG-ilados o acoplados con otras proteínas, en la que:
Para la glicosilación, N-glicosilación y O-glicosilación se usan habitualmente. Los péptidos glicosilados son, preferentemente, para unir uno o más hidroxilo oxígeno a restos de tirosina, serina o treonina o uno o más nitrógenos de la cadena lateral de asparagina de las proteínas recombinantes descritas en la presente invención con glicanos.
Los péptidos fosforilados son, preferentemente, proteínas recombinantes fosforiladas descritas en la presente invención en uno o más restos de Tyr, Ser o Thr.
Los péptidos metilados incluyen péptidos metilados en la cadena lateral y metilados en N-terminal. La metilación de la cadena lateral es, preferentemente, metilato de las proteínas recombinantes descritas en la presente invención en una o más cadenas laterales de Lys, Tyr o Arg, tales como Lys(For), Lys(Me), Lys(Me)2, Lys(Me)3, Arg(Me)2 simétrica, D-Tyr(Me), D-Tyr(Et);
Los péptidos acetilados son, preferentemente, acetilato de las proteínas recombinantes descritas en la presente invención en una o más cadenas laterales de Lys o Ser, tales como Ser (Ac) o Lys (Ac).
Los péptidos nitrados o sulfonatados son, preferentemente, nitrato o sulfonato de las proteínas recombinantes descritas en la presente invención en una o más cadenas laterales de Tyr, tal como, Tyr (3-NO2), Tyr (SO3H2).
Los péptidos PEG-ilados son, preferentemente, PEG-ilato de las proteínas recombinantes descritas en la presente invención en una o más cadenas laterales de Lys. El peso molecular del PEG es, preferentemente, de aproximadamente 2000-10.000.
Como alternativa, uno o más restos de aminoácidos de las proteínas recombinantes o las proteínas modificadas descritas anteriormente en la presente invención podrían sustituirse con los derivados de aminoácidos o aminoácidos inusuales, tales como sustituyendo alanina por p-alanina, homofenilalanina o naftilalanina, sustituyendo prolina por hidroxiprolina, sustituyendo leucina por norleucina, sustituyendo valina por norvalina, sustituyendo treonina por alotreonina, sustituyendo isoleucina por aloisoleucina, sustituyendo asparagina por Asn(GlcNac(Ac)3-p- D)), sustituyendo lisina por Lys(palmitoilo).
Como alternativa, uno o más restos de aminoácidos de las proteínas recombinantes o las proteínas modificadas descritas anteriormente en la presente invención podrían sustituirse con aminoácidos de tipo D.
El gen que codifica las proteínas recombinantes bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L (GenBank: AAF72632.1 y NP_003802.1) podría obtenerse mediante estrategias bien conocidas en la materia, tales como síntesis génica, pCr o la combinación de ellas, en las que la secuencia de nucleótidos completa de CD137L
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podría obtenerse a través del procedimiento publicado (Wang Shuzhen, J Ind MicrobioBiotechnol.2012Mar; 39(3):471-6.doi:10.1007/s10295-011-1045-1).
La presente invención construye los vectores de expresión que codifican las proteínas recombinantes bifuncionales descritas anteriormente que poseen las actividades de tumstatina y CD137L, en el que el vector de expresión correcto se obtiene por amplificación por PCR, digestión y unión de rutina que incluye doble digestión del gen que codifica tumstatina-enlazador peptídico-dominio extracelular de CD137L con NdeI y NheI, ligando el fragmento de ADN obtenido anteriormente en los sitios correspondientes del vector de expresión procariota pET-11a, y el vector se secuencia para verificar.
La presente invención construye las bacterias modificadas genéticamente que contienen los vectores de expresión descritos anteriormente, que incluyen transformar un gen objetivo en BL21, cultivo líquido, y seleccionar las cepas modificadas positivamente.
La presente invención proporciona procedimientos para obtener las proteínas bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L, en donde el procedimiento es cultivar y fermentar las cepas manipuladas positivamente, inducir la expresión de una proteína bifuncional con las actividades de tumstatina y CD137L a temperatura ambiente, recolectar las células e interrumpen las células con alta presión. Después de disolver la desnaturalización y el replegamiento por dilución del precipitado centrifugado, se puede obtener una proteína bifuncional con las actividades de tumstatina y CD137L.
En la presente invención, el ensayo de actividad para las proteínas de fusión bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L se lleva a cabo mediante ensayo HUVEC y ensayo de activación de linfocitos T de ratón. Los resultados del ensayo HUVEC mostraron que la proliferación de células endoteliales se inhibía significativamente. El ensayo de activación de linfocitos T de ratón mostró que las proteínas de fusión descritas anteriormente pueden mantener la actividad biológica de CD137L y estimular la proliferación de células T mediante cooperación con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 y el anticuerpo monoclonal anti-CD28.
Las ventajas de la presente invención:
La presente invención muestra que las proteínas que poseen las actividades de tumstatina y CD137L pueden prepararse usando el sistema de expresión procariota para expresar las proteínas de fusión que comprenden los fragmentos activos de tumstatina y las regiones extracelulares de CD137L. Las proteínas recombinantes tumstatina- enlazador peptídico-CD 137L (proteínas que poseen las actividades tanto de tumstatina como de CD137L) preparadas de acuerdo con la presente invención tienen las ventajas de alta eficacia de expresión y nivel, ciclo de expresión corto, fácil purificación y otras. Paralelamente, la presente invención proporciona proteínas de fusión que podrían inhibir significativamente la proliferación de células endoteliales de vena umbilical humana de una manera dependiente de la dosis, y también podría estimular la proliferación de linfocitos T de ratón cooperando con el anticuerpo monoclonal anti CD3 y anti-CD28. Por lo tanto, la presente invención proporciona un procedimiento novedoso y seguro para la producción a gran escala de proteínas de fusión que poseen las actividades de tumstatina y CD137L, y sienta una base sólida para la investigación y desarrollo en una nueva generación de fármacos contra el cáncer, y tiene una amplia aplicación en el tratamiento de pacientes con cáncer.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es una representación esquemática que muestra las estructuras de las proteínas recombinantes que poseen las actividades de tumstatina y CD137L descritas en la presente invención. La secuencia de aminoácidos del enlazador peptídico flexible se selecciona de una cualquiera del grupo de SEQ ID NO.69 a SEQ ID NO.76.
La Figura 2 es una vista esquemática que ilustra la ubicación de las secuencias de aminoácidos de CD137L1 (SEC ID NO.77), CD137L5 (SEQ ID NO.78), CD137L6 (SEQ ID NO.79) y CD137L4 (SEQ ID NO.80) en la longitud completa de CD137L.
La Figura 3 muestra la expresión de las proteínas recombinantes tumstatina-enlazador peptídico-CD 13 7L en E. coli, cuyas secuencias de aminoácidos son de SEQ ID NO.25 a SEQ ID NO.48. Las calles 1-24 corresponden a las SeQ ID NO.25-48, respectivamente.
La figura 4 muestra la expresión representativa de las proteínas recombinantes tumstatina-enlazador peptídico- CD137L (SEQ ID NO.29 a SEQ ID No.38) en Bacillus subtilis. Las calles 1-8 corresponden a las SEQ ID NO.29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 38, respectivamente.
La Figura 5 muestra la expresión representativa de las proteínas recombinantes Tumstatina-enlazador peptídico- CD137L (SEQ ID NO.29 a SEQ ID No.36) en Pichia pastoris. Las calles 1-16 corresponden a las SEQ ID NO.29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, respectivamente.
La figura 6 es la SDS-PAGE de las muestras representativas renaturalizadas de Tumstatina-enlazador peptídico- CD137L por dilución. en los que, las secuencias de aminoácidos de la Calle 1-6 corresponden a la SEQ ID NO.25, 26, 27, 37, 38 y 41, respectivamente; las secuencias de aminoácidos de las calles 7 y 10 corresponden a la SEQ ID NO.43; las secuencias de aminoácidos de las calles 8 y 11 corresponden a la SEQ ID NO.44; las secuencias de aminoácidos de las calles 9 y 12 corresponden a la SEQ ID NO.48; las secuencias de aminoácidos de las calles 13 y 15 corresponden a la SEQ ID NO.45; las secuencias de aminoácidos de las calles 14 y 16 corresponden a la SEQ ID N0.46; las secuencias de aminoácidos de las calles 17 y 18 corresponden a la
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SEQ ID NO.47.
La figura 7 muestra los efectos de las muestras representativas de Tumstatina-enlazador peptídico-CD137L sobre la proliferación de células endoteliales de vena umbilical humana.
La figura 8 muestra los efectos de las muestras representativas de Tumstatina-enlazador peptídico-CD137L sobre la proliferación de linfocitos T de ratón.
Descripción detallada de las realizaciones preferentes
A continuación en el presente documento, la invención se explicará con más detalle por medio de los siguientes ejemplos y dibujos.
La presente invención proporciona 24 tipos de proteínas recombinantes bifuncionales que poseen actividades de Tumstatina y CD137L. Las secuencias de nucleótidos de estas proteínas se muestran de la SEQ ID NO.1 a la SEQ ID NO.24, y las secuencias de aminoácidos se muestran de la SEQ ID NO.25 a SEQ ID NO.48. Este grupo de proteínas se compone de un fragmento activo de tumstatina (tumstatina 1 contiene restos de aminoácidos de 45 a 98, tumstatina 2 contiene los restos de aminoácidos de 60 a 132, tumstatina 3 contiene los restos de aminoácidos de 60 a 98, tumstatina 7 contiene los restos de aminoácidos de 74 a 98), un dominio extracelular de CD137L (CD137L1 contiene los restos de aminoácidos de 46 a 254, CD137L4 contiene los restos de aminoácidos de 50 a 240, CD137L5 contiene los restos de aminoácidos de 83 a 254, CD137L6, un fragmento combinado, contiene los restos de aminoácidos de 46 a 85 y de 167 a 254), y un enlazador peptídico con cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO.69 a SEQ ID NO.76. En la presente invención, se diseñan dos sitios de enzimas de restricción que consisten en 5'-EcoRI y 3'-BamHI en las secuencias de nucleótidos (mostradas de SEQ ID NO.81 a SEQ ID NO.94) que contienen el fragmento activo de Tumstatina y el enlazador peptídico descrito anteriormente. Las secuencias se sintetizaron y se ligaron con el plásmido pBluescriptI I SK (+) que contenía los mismos sitios de restricción de Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
Todos los otros vectores de expresión se compraron de Novagen, y la cepa de E. coli Top 10 y BL21 (DE3) fueron de Invitrogen. El vector pMD18-T, la solución I (# D103A), la transcriptasa inversa, la aDn ligasa de T4, la endonucleasa de restricción, tal como, NdeI y NheI, se obtuvieron de TAKARA Bio. La síntesis de los cebadores y la secuenciación de nucleótidos fue completada por Shanghai Invitrogen Biotechnology Company. La urea (Ar) utilizada para la desnaturalización y el replegamiento de la dilución se adquirió de Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd. Las células endoteliales de vena umbilical humana se adquirieron de Nanjing KGI Biological Technology Development Co., Ltd. El kit de selección negativa EasySep™ usado para el ensayo de proliferación de linfocitos T de ratón se adquirió de Stem Cell Company. El anticuerpo monoclonal anti-CD3 y anti-CD28 se adquirió de Santa Cruz Company. Otros reactivos fueron de grado analítico fabricados en China.
Ejemplo 1: La expresión de la proteína recombinante tumstatina-CD137L que posee actividades de tumstatina y CD137L en E. coli
1. Construcción de los sistemas de expresión
La presente invención proporciona 24 tipos de proteínas recombinantes bifuncionales que poseen actividades de Tumstatina y CD137L, que es una fusión de Tumstatina 1/Tumstatina 2/Tumstatina 3/Tumstatina 7 y CD137L1/CD137L4/CD137L5/CD137L6 mediante la combinación de un enlazador peptídico (Figura 1). en los que, CD137L1, CD137L4, CD137L5 y CD137L6 son los restos de aminoácidos 46-254, 50-240, 83-254, 46-85 más 167254 del CD137L de longitud completa (Figura 2), respectivamente. Las secuencias de nucleótidos de la proteína se muestran en las SEQ ID NO.1 a SEQ ID NO.24, las secuencias de aminoácidos se muestran de la SEQ ID NO.25 a la SEQ ID NO.48 y el enlace peptídico se selecciona de una de las secuencias de SEQ ID NO.69 a SEQ ID NO.76.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular de CD137 (CD137L1 contiene los restos de aminoácidos de 46 a 254, CD137L4 contiene los restos de aminoácidos de 50 a 240, CD137L5 contiene los restos de aminoácidos de 83 a 254, CD137L6, un fragmento combinado, contiene los restos de aminoácidos de 46 a 85 y de 167 a 254) se muestran de la SEQ ID NO.61 a SEQ ID NO.64, y se obtienen a partir de la amplificación por PCR. en los que, la secuencia de nucleótidos completa de CD137L podría obtenerse a través del procedimiento publicado (Wang Shuzhen, J Ind Microbiol Biotechnol.2012 Mar; 39(3):471-6, Doi: 10.1007/s10295-011-1045-1.).
Preparación del molde de CD137 usado en la presente invención empleando el procedimiento publicado descrito anteriormente. Usando el cebador aguas arriba de SEQ ID NO.61 (SEQ ID NO.95) y el cebador aguas abajo de SEQ ID NO.61 (SEQ ID NO.96) como cebadores, CD137L1 (SEQ ID NO. 61) (con dos sitios de restricción que consisten en 5'-BamHI y 3'-NotI) se obtuvo por amplificación por PCR con ADN polimerasa de rTaq y se ligó con el plásmido pMD18-T. Empleando los procedimientos tradicionales de biología molecular (tales como digestión enzimática y unión), el CD137L1 se cortó después del plásmido pMD18-T y se subclonó en el plásmido pBluescriptII SK (+), que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (sEq ID NO. 87-SEQ ID NO.94) y fue sintetizado por Shanghai Generay BiologicalEngineering CO. Ltd. A continuación, las secuencias de nucleótidos completas de la proteína de fusión (SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12) se clonaron en el plásmido pBluescriptII SK (+ ). Utilizando la SEQ ID NO.97 como cebador aguas arriba y la SEQ ID NO.98 como cebador aguas abajo, los genes de las proteínas de
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fusión con dos sitios de restricción que consisten en 5'-NheI y 3'-NdeI se amplificaron por PCR y se subclonaron en la vector de expresión pET-11a.
Preparación del molde de CD137L usado en la presente invención empleando el procedimiento publicado descrito anteriormente. Usando los cebadores aguas arriba de la SEQ ID NO.62 (SEQ ID No.99) y el cebador aguas abajo de la SEQ ID NO.62 (SEQ ID NO.100) como cebadores, CD137L5 (SeQ ID NO. 62) (con dos sitios de restricción que consisten en 5'-BamHI y 3'-NotI) se obtuvo por amplificación por PCR con ADN polimerasa de rTaq y se ligó con el plásmido pMD18-T. Empleando los procedimientos tradicionales de biología molecular (tales como digestión enzimática y unión), el CD137L5 se cortó después del plásmido pMD18-T y se subclonó en el plásmido pBluescriptII SK (+), que contiene los genes de tumstatina y el enlazador peptídico (SEQ ID NO. 81-SEQ ID NO.96) y fue sintetizado por Shanghai Generay BiologicalEngineering CO. Ltd. A continuación, las secuencias de nucleótidos completas de las proteínas de fusión (SEQ ID NO.1 a SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16) se clonaron en el plásmido pBluescriptII SK (+). Usando las SEQ ID NO.101-104 como cebadores aguas arriba y la SEQ ID NO.105 como cebadores aguas abajo, los genes de las proteínas de fusión con dos sitios de restricción que consisten en 5'- NheI y 3'-NdeI se amplificaron por PCR y se subclonaron en el vector de expresión pET-11a.
Preparación del molde de CD137L usado en la presente invención empleando el procedimiento publicado descrito anteriormente. Usando el cebador aguas arriba 1 de la SEQ ID NO.63 (SEQ ID NO.106) y el cebador aguas abajo 1 de la SEQ ID NO.63 (SEQ ID NO. 107), el cebador aguas arriba 2 de la SEQ ID NO.63 (SEQ ID NO.108) y el cebador aguas abajo 2 de la SEQ ID NO.63 (SEQ ID NO.109) como cebadores, se obtuvieron dos fragmentos de CD137L6 (SEQ ID NO. 63) por amplificación por PCR con ADN polimerasa de rTaq y se recuperaron del gel de agarosa. Empleando estos dos fragmentos como moldes, el cebador aguas arriba 1 de CD137L6 (SEQ ID NO. 107) y el cebador aguas abajo 2 de CD137L6 (SEQ ID NO. 109) como cebadores, CD137L6 (con dos sitios de restricción que consisten en 5'-BamHI y 3 '-NotI) se obtuvo a través de la amplificación OverlapPCR y se ligó con el plásmido pMD18-T. El CD137L6 (SEQ ID NO. 63) se cortó a continuación del plásmido pMD18-T y se subclonó en el plásmido pBluescriptII SK (+), que contiene los genes de tumstatina y enlazador peptídico (SeQ ID NO.81, SEQ iD NO.82, SEQ ID NO.84 y SEQ ID NO.86) y fueron sintetizados por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd. Usando la SEQ ID NO.112-113 como cebador, los genes de las proteínas de fusión (SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.17 y SEQ ID NO.18) se obtuvieron por amplificación por PCR y se subclonaron en el vector de expresión pET-11a.
Todos los cebadores implicados en los procedimientos experimentales descritos anteriormente se enumeran de la siguiente manera: Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.61
5'-GGATCCGCCGTCCTTCTCGCCTGCC-3 '(el sitio de restricción BamHI está subrayado) Cebador aguas abajo de la SEQ ID NO.61
5'-GCGGCCGCTTCCGACCTCGGTGAAGGGAGT-3 '(el sitio de restricción NotI está subrayado) Cebador aguas arriba del gen de la proteína de fusión (SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12)
5'-GCTAGCACAATGCCATTCTTATTCTGCAATG-3 '(el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas abajo del gen de la proteína de fusión (SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.12)
5'-CATATGTTCCGACCTCGGTGAAGGGAGTCCG-3 '(el sitio de restricción Ndel está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.62
5'-CGGGATCCGCCTCTTGGACCTGCGCGGCAG-3 '(el sitio de restricción BamHI está subrayado) Cebador aguas abajo de SEQ ID NO.62
5'-GCGGCCGCTTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3 '(el sitio de restricción NotI está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.1
5'-GCTAGCGGTTTTTCTTTCTATTTGTTCAAG-3 '(el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.3
5'-GCTAGCGGTTTTTCTTTCTTATTTGTTCAAG-3 '(el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.14
5'-GCTAGCCAAGATTTAGGTACTTTGGGCTCTT-3 '(el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.15-SEQ ID NO.16
5'-GCTAGCAAGAGCCCAAAGTACCTAAATCTTG-3' (el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas abajo de SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, and SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16
5'-CATATGTTCCGACCTCGGTGAAGGAG-3 '(el sitio de restricción Ndel está subrayado) cebador 1 aguas arriba de SEQ ID NO.63
5'-CGGGATCCGCCGTCTTCCTCGCCTGC-3 '(el sitio de restricción BamHI está subrayado) cebador aguas abajo de SEQ ID NO.63
5'-CGCAAACATGCCCTGCCCTG-3' Cebador 2 aguas arriba de SEQ ID NO.63
5'-CAGGGCAGGGCATGTTTGCGGGTTTCCAGGGCCGCTTGC-3' Cebador 2 aguas abajo de SEQ ID NO.63 5'-GCGGCCGCTTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3' (el sitio de restricción NotI está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.2 y SEQ ID NO.4
5'-GCTAGCGGTTTTTCTTTCTTATTTGTTCAAG-3' (el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.17
5'-GCTAGCCAAGATTTAGGTACTTTG-3 '(el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas arriba de SEQ ID NO.18
5'-GCTAGCCAAGATTTAGGTACTTTGGGCTCTT-3' (el sitio de restricción NheI está subrayado) Cebador aguas
abajo de SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.17 y SEQ ID NO.18
5'-CATAGTTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3' (el sitio de restricción NdeI está subrayado) Las amplificaciones por PCR se realizaron usando las siguientes condiciones:
94 °C 5 min
5 94 °C 1 min, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s, 30 ciclos
72 °C 5 min 4 °C, Retención
Después de recuperarse del gel, los productos de la PCR se ligaron con el plásmido pMD-18T en un volumen total de 20 |jl que contenía 1 jl de pMD-18T, 4 jl de gen diana y 15 jl de solución. La unión se llevó a cabo a 16 °C 10 durante 16 horas. La mezcla de unión se usó luego para transformar la cepa Top10 de E. coli mediante el procedimiento del cloruro de calcio. Después de cultivar en el medio de cultivo LB sólido con ampicilina durante 12 horas, se escogieron clones individuales. Los plásmidos extraídos se verificaron después mediante digestión enzimática doble con NdeI y NheI. Para determinar la corrección de las secuencias génicas, las colonias fueron secuenciadas por Shanghai Invitrogen Biotechnology Co. Los genes diana con las secuencias esperadas se ligaron 15 con el vector de expresión procariota pET-11a, en el que el sistema de reacción contiene 1 jl de ligasa T4 10x tampón, 1 jl de pET-11a, 7 jl del gen diana y 1 jl de ligasa T4, y la ligadura se llevó a cabo a 16 °C durante 16 horas. Después de verificarse por digestión enzimática doble, el gen se transformó en el sistema de expresión E.coli BL21 (DE3).
2. La expresión de las proteínas recombinantes
20 Se inoculó 1 ml de E. coli BL21 (DE3) que llevaba un plásmido recombinante positivo a 100 ml de medio LB que contenía 100 jg/ml de ampicilina en un banco súper limpio y se cultivó a 37 °C en un agitador de incubadora establecido a 250 rpm durante la noche. El caldo de siembra activado se transfirió a medio LB esterilizado, en el que se añadieron 100 jM de IPTG a una DO600 de 0,9. Después, las células se recogieron mediante centrifugación (12.000 rpm, 30 minutos) a temperatura ambiente después de cultivar durante 8 ha 37 °C. Las muestras (1 g) se 25 volvieron a suspender en 10 ml de PBS y se sometieron a lisis mediante sistemas de rotura celular de alta presión. El lisado se centrifugó durante 30 minutos a 12.000 rpm a 4 °C y el sobrenadante se descartó y el precipitado se analizó con SDS-PAGE.
El procedimiento de SDS-PAGE se describe de la siguiente manera:
1) Lavar la cantidad apropiada del precipitado con 1 ml de ddH2O y centrifugar a 12.000 rpm durante 1 minuto.
30 Después de descartar el sobrenadante, el precipitado se resuspendió con 100 jl de ddH2O.
2) Mezclar 5 jl de 5 x tampón de carga SDS-PAGE con 20 jl de las muestras resuspendidas y calentarlas en agua hirviendo durante 5 minutos.
3) Preparar el gel de apilamiento al 5 %, gel de separación al 12 % y tampón de carrera 1xTri-Gly de acuerdo con el "Molecular Cloning: A Laboratory Manual".
35 4) Cargar 20 jl de las muestras preparadas en los pocillos. Ejecutar la electroforesis a 90 V durante 30 minutos y
otra a 130 V durante 1 hora. Retirar el gel de SDS-PAGE y usar azul Coomassie para teñir durante 1-2 h. A continuación, el gel se lava tres veces con ddH2O y se coloca en la solución de blanqueo durante la noche.
5) Los resultados de la electroforesis de proteínas se muestran en dibujos complementarios. La expresión de las proteínas diana aumentó significativamente en las bacterias positivas en comparación con el control negativo.
40 Las expresiones detalladas de las proteínas diana se muestran en la Figura 3. Se puede observar que todas las proteínas descritas anteriormente se expresaron en E. coli BL (DE3).
3. Purificación de las proteínas recombinantes Investigación sobre la renaturalización de cuerpos de inclusión
Las células de bacterias se trituraron mediante sistemas de rotura celular de alta presión como se ha descrito 45 anteriormente. Los precipitados se recogieron y se lavaron dos veces con la solución de lavado A y B por centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos cada vez. La solución A consiste en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, urea 2 M y 2 % de TritonX-100. La solución B consiste en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, urea 2 M y EDTA 5 mM. Después del lavado, los precipitados se solubilizaron a 50 °C durante la noche con una solución de disolución (Tris 20 mM, pH 8,5, urea 8 M). Después de que se desnaturalizó por completo, la solución desnaturalizante se añadió a la solución 50 de replegamiento mediante un aparato de flujo constante en una cabina de cromatografía a 4 °C, la solución se agitó al mismo tiempo y el proceso duró 12 horas. La solución de replegamiento consiste en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, urea 2 M, L-Arg 0,4-0,6 M y EDTA 1 mM. La solución descrita anteriormente se sometió a ultrafiltración a 4.500 rpm durante 30 minutos usando unidades de concentración Amico Ultra-15 (Millpore) para concentrar a 1 ml a 4 °C. Al mismo tiempo, la solución se sustituyó en PBS (pH 7,4, 100 mM). El producto se conservó a 4 °C (Figura 6). Se 55 calculó que la pureza de los productos diana después de la renaturalización era mayor del 80 %, lo que indica que los cuerpos de inclusión desnaturalizados descritos anteriormente se volvieron a plegar bien.
Ejemplo 2: La expresión de las proteínas recombinantes tumstatina-CD137L que poseen actividades de
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tumstatina y CD137L en Bacillus subtilis
1. Construcción del sistema de expresión
Usando el plásmido pBluescriptlI SK (+) que alberga las secuencias génicas completas (SEQ ID NO.1-24) de las proteínas recombinantes construidas en el Ejemplo 1 como molde, amplificación por PCR de los diferentes genes de fusión con diferentes cebadores con PstI y HindIII en los extremos 5 ' y 3', respectivamente. Después de una doble digestión enzimática, los productos de PCR se subclonaron en el plásmido pP43. El procedimiento experimental para PCR, la digestión enzimática y la unión fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 1. El plásmido construido se transformó luego en Bacillus subtilis WB800 por electroporación (los procedimientos detallados se pueden encontrar en el manual de funcionamiento del instrumento de electroporación, Bio-Rad).
2. Expresión de la proteína recombinante
Cultivo de caldo de siembra: 10 pl de la cepa WB800 de Bacillus subtilis que alberga el gen diana que contiene el plásmido se incubaron en 5 ml de medio líquido LB que contenía 50 pg/ml de kanamicina en un banco súper limpio y se cultivaron a 37 °C en un agitador rotatorio a 250 rpm durante 12 horas. Fermentación del WB800 modificado: el caldo de semilla activado se transfirió al medio aséptico 2xYT que contenía 50 pg/ml de kanamicina con un volumen de inoculación del 10 % y se cultivó a 37 °C durante 96 horas, pH 7,0. Las células se recogieron por centrifugación a 4 °C y se analizaron mediante SDS-PAGE.
3. Purificación de las proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía de intercambio aniónico DEAE-sephadex (GE) con PBS, pH 8,5.
Ejemplo 3: La expresión de las proteínas recombinantes tumstatina-CD137L que poseen actividades de tumstatina y CD137L en Pichia pastoris
1. Construcción del sistema de expresión
Los genes (SEQ ID NO.1-24) de las proteínas recombinantes se obtuvieron por digestión enzimática doble del plásmido pPIC9K con EcoRI y Notl y se ligaron con el plásmido pPIC9K. El plásmido construido se transformó después en la cepa GS115 de Pichia pastoris por electroporación (los procedimientos detallados se pueden encontrar en el manual de funcionamiento del instrumento de electroporación, Bio-Rad).
2. Expresión de las proteínas recombinantes
P. pastoris se cultivó en primer lugar en medio BMGY rico y luego en medio BMMY para la inducción de la expresión de proteína diana. El primer día, las cepas modificadas por ingeniería construidas anteriormente se inocularon en medio de siembra YPD y se cultivaron a 37 °C durante la noche. El segundo día, se inoculó la cantidad apropiada de caldo de siembra se inoculó en medio BMGY y se cultivó durante 48 horas. Cuando el valor de la DO600 alcanzó 10, el medio fue reemplazado por medio BMMY. Las cepas se cultivaron en medio BMMY durante 96 horas. Las células se recogieron por centrifugación a 12.000 rpm durante 30 minutos y se analizaron por SDS-PAGE.
3. Purificación de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes se purificaron por cromatografía de aniones DEAE-sephadex (GE) con PBS, pH 8,5. La pureza de los productos fue mayor que 80 %.
Ejemplo 4: Efectos de las proteínas recombinantes bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L sobre la proliferación de células endoteliales de la vena umbilical humana
1) Cultivo celular: Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) se cultivaron a 37 °C en humedad constante saturada con 5 % de CO2 en medio RPMI1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicinas durante 2 ~ 3 días. Las células bajo crecimiento de fase exponencial se usaron para los siguientes experimentos.
2) ensayo MTT: Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5.000 células por pocillo añadiendo 100 pl de suspensión celular a cada pocillo y se cultivaron en una incubadora de cultivo celular durante 12 horas. Después, se agregaron 100 pl de muestras de proteínas con diferentes concentraciones. Las HUVEC tratadas con TNP-470 se usaron como control positivo y se trataron con PBS como controles negativos. Las células se cultivaron por triplicado durante 48 horas. Después de iniciar los cultivos durante 44 horas, se añadieron 20 pl de MTT (5 mg/ml). A continuación, el medio se retiró suavemente a las 48 horas y se añadieron 150 pl de DMSo a cada pocillo. Los precipitados azul-púrpura se disolvieron completamente después de agitar la placa de 96 pocillos durante 10 minutos. A continuación, se midió la absorbancia de cada pocillo a 490 nm mediante un lector de microplacas.
Los resultados se muestran en la Figura 7, en la que, TNP-470 es el control positivo, "115" es tumstatina 1-enlazador peptídico 1-CD137L 5 (SEQ ID NO.25), "155" es tumstatina 1-enlazador peptídico 5-CD137L 5 (SEQ ID NO.27),
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"116" es tumstatina 1-enlazador peptídico 1-CD137L6 (SEQ ID NO.26), "215" es tumstatina 2-enlazador peptídico 1- CD137L5 (SEQ ID NO.37), "255" es tumstatina 2-enlazador peptídico 5-CD137L5 (SEQ ID NO.38), "256" es tumstatina 2-enlazador peptídico 5-CD137L 6 (SEQ ID NO.41), "711" es tumstatina 7-enlazador peptídico 1- CD137L1 (SEQ ID NO.29), "721" es tumstatina 7-enlazador peptídico 2-CD137L1 (SEQ ID NO.30), "731" es tumstatina 7-enlazador peptídico 3-CD137L1 (SEQ ID NO.31), "741" es tumstatina 7-enlazador peptídico 4-CD137L1 (SEQ ID NO.32), "751" es tumstatina 7-enlazador peptídico 5-CD137L1 (SEQ ID NO.33), "761" es tumstatina 7- enlazador peptídico 6-CD137L1 (SEQ ID NO.34), "771" es tumstatina 7-enlazador peptídico 7-CD137L1 (SEQ ID NO.35), "781" es tumstatina 7-enlazador peptídico 8-CD137L1 (SEQ ID NO.36), "114" es tumstatina 1-enlazador peptídico 1-CD137L4 (SEQ ID NO.43), "214" es tumstatina 2-enlazador peptídico 1-CD137L4 (SEQ ID NO.44), "314" es tumstatina 3-enlazador peptídico 1-CD137L4 (SEQ ID NO.45), "154" es tumstatina 1-enlazador peptídico 5- CD137L4 (SEQ ID NO.46), "254" es tumstatina 2-enlazador peptídico 5-CD137L4 (SEQ ID NO.47), "354" es tumstatina 3-enlazador peptídico 5-CD137L4 (SEQ ID NO.48). Los resultados indicaron que estas proteínas recombinantes representativas que poseen actividades de tumstatina y CD137L podrían inhibir la proliferación de células endoteliales de vena umbilical humana, en las que las SEQ ID No.26, SeQ ID NO.37, SEQ ID NO.41, SEQ ID NO.30 y SEQ ID NO.31 mostraron mejores efectos inhibidores que el control positivo.
Ejemplo 5: Efectos de las proteínas recombinantes bifuncionales que poseen las actividades de tumstatina y CD137L sobre la proliferación de linfocitos T de ratón
Los linfocitos T de ratón se purificaron a partir de suspensiones de células individuales de esplenocitos de ratón usando el kit EasySep Negative Selection Mouse T Cell Enrichment (Stemcell), de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Se sembraron en placas linfocitos T purificados a 105 por pocillo en 100 pl de medio y se cultivaron en placas de 96 pocillos que se habían recubierto con anticuerpo monoclonal anti - CD3 a 7,5 pg/ml durante la noche a 4 °C. Se diseñaron cuatro grupos: 1) Grupo en blanco sin ninguna estimulación (medio + linfocitos T); 2) el grupo de coestimulación en presencia del anticuerpo monoclonal anti-CD3 (7,5 pg/ml) y anti-CD28 (2,5 pg/ml) (CD3/CD28); 3) el grupo de coestimulación en presencia de anticuerpo monoclonal anti-CD137, anti-CD3 y anti- CD28 (CD3/CD28/anti-CD137mAb); 4) el grupo de coestimulación en presencia de proteínas recombinantes, anticuerpo monoclonal anti-CD3 y anti-CD28 (CD3/CD28/Tumstatina 1-CD137L). Las células se cultivaron por triplicado durante 96 horas. Después de iniciar los cultivos durante 92 horas, se añadieron 10 pl de azul de Alamar. Después, las absorbancias de cada pocillo a 570 nm y una longitud de onda de referencia de 600 nm se determinaron mediante un lector de microplacas. Los resultados se muestran en la Figura 8, en la que "115" es tumstatina 1-enlazador peptídico 1-CD137L5 (SEQ ID NO.25), "155" es tumstatina 1-enlazador peptídico 5-CD137L5 (SEQ ID NO.27), "116" es tumstatina 1-enlazador peptídico 1-CD137L6 (SEQ ID NO.26), "215" es tumstatina 2- enlazador peptídico 1-CD137L5 (SEQ ID NO.37), "255" es tumstatina 2-enlazador peptídico 5-CD137L5 (SEQ ID NO.38), "256" es tumstatina 2-enlazador peptídico 5-CD137L6 (SEQ ID NO.41), "711" es tumstatina 7-enlazador peptídico 1-CD137L1 (SEQ ID NO.29), "721" es tumstatina 7-enlazador peptídico 2-CD137L1 (SEQ ID NO.30),"731" es tumstatina 7-enlazador peptídico 3-CD137L1 (SEQ ID NO.31), "741" es tumstatina 7-enlazador peptídico 4- CD137L1 (SEQ ID NO.32), "751" es tumstatina 7-enlazador peptídico 5-CD137L1 (SEQ ID NO.33), "761" es tumstatina 7-enlazador peptídico 6-CD137L1 (SEQ ID NO.34), "771" es tumstatina 7-enlazador peptídico 7-CD137L1 (SEQ ID NO.35), "781" es tumstatina 7-enlazador peptídico 8-CD137L1 (SEQ ID NO.36), "114" es tumstatina 1- enlazador peptídico 1-CD137L4 (SEQ ID NO.43), "214" es tumstatina 2-enlazador peptídico 1-CD137L4 (SEQ ID NO.44), "314" es tumstatina 3-enlazador peptídico 1-CD137L4 (SEQ ID NO.45), "154" es tumstatina 1-enlazador peptídico 5-CD137L4 (SEQ ID NO.46), "254" es tumstatina 2-enlazador peptídico 5-CD137L4 (SEQ ID NO.47), "354" es tumstatina 3-enlazador peptídico 5-CD137L4 (SEQ ID NO.48).
Los resultados sugirieron que estas proteínas recombinantes representativas que poseen las funciones de tumstatina y CD137L a una concentración final de 2 pg/ml mostraron mayores efectos estimuladores sobre la proliferación de linfocitos T que el grupo coestimulante "CD3 más CD28", que demostró los efectos sinérgicos significativos entre CD137L y CD28. Por lo tanto, las proteínas recombinantes representativas que tienen las actividades de tumstatina y CD137L preparadas en la presente invención poseen buenas bioactividades en la estimulación de la proliferación de linfocitos T.
Se entiende que los ejemplos y las realizaciones descritos en este documento son solo para fines ilustrativos adicionales. Además, los ejemplos mostraron solo varios tipos de uniones entre diferentes fragmentos activos de tumstatina y las regiones extracelulares de CD137L.
Listado de secuencias
<110> China Pharmaceutical University
<120> Proteína de fusión que tiene funciones dobles para inhibir la angiogénesis en
el microambiente tumoral y activar la respuesta inmunitaria adaptativa y el gen y el uso de la misma
<130> U30692WOEP
<140> PCT/CN2014/076768
<141> 05/05/2014
<150> CN201210162738.3, CN201310163407.1 <151> 06/05/2013 <150> CN201310163407.1
5
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<151> 06/05/2013 <160> 113 <210> 1 <211> 729 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 1-CD137L5)
<400> 1
ggtttttctt tcttatttgt tcaaggcaat cagcgtgctc atggacaaga tttggggact cttggttcct gtctccagcg cttcaccaca atgccttttc tattctgcaa cgtcaatgac gtatgtaact ttgcctcacg aaatgattat tcgtactggc tgggaggtgg tggatcaggt ggaggtggat ctggtggagg tggaagtgga tccggcctct tggacctgcg gcagggcatg tttgcgcagc tggtggccca aaatgttctg ctgatcgatg ggcccctgag ctggtacagt gacccaggcc tggcaggcgt gtccctgacg gggggcctga gctacaaaga ggacacgaag gagctggtgg tggccaaggc tggagtctac tatgtcttct ttcaactaga gctgcggcgc gtggtggccg gcgagggctc aggctccgtt tcacttgcgc tgcacctgca gccactgcgc tctgctgctg gggccgccgc cctggctttg accgtggacc tgccacccgc ctcctccgag gctcggaact cggccttcgg tttccagggc cgcttgctgc acctgagtgc cggccagcgc ctgggcgtcc atcttcacac tgaggccagg gcacgccatg cctggcagct tacccagggc gccacagtct tgggactctt ccgggtgacc cccgaaatcc cagccggact cccttcaccg aggtcggaa
<210> 2 <211>597 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 1-CD137L6)
<400> 2
ggtttttctt tcttatttgt tcaaggcaat cagcgtgctc atggacaaga tttggggact cttggttcct gtctccagcg cttcaccaca atgccttttc tattctgcaa cgtcaatgac gtatgtaact ttgcctcacg aaatgattat tcgtactggc tgggaggtgg tggatcaggt ggaggtggat ctggtggagg tggaagtgga tccgccgtct tcctcgcctg cccctgggcc gtgtccgggg ctcgcgcctc gcccggctcc gcggccagcc cgagactccg cgagggtccc gagctttcgc ccgacgatcc cgccggcctc ttgctgcagc cactgcgctc tgctgctggg gccgccgccc tggctttgac cgtggacctg ccacccgcct cctccgaggc tcggaactcg gccttcggtt tccagggccg cttgctgcac ctgagtgccg gccagcgcct gggcgtccat cttcacactg aggccagggc acgccatgcc tggcagctta cccagggcgc cacagtcttg ggactcttcc gggtgacccc cgaaatccca gccggactcc cttcaccgag gtcggaa
<210> 3 <211>750 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
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ggtttttctt tcttatttgt tcaaggcaat cagcgtgctc atggacaaga tttggggact cttggttcct gtctccagcg cttcaccaca atgccttttc tattctgcaa cgtcaatgac
gtatgtaact ttgcctcacg aaatgattat tcgtactggc tggctgaagc tgctgccaaa gaagccgctg ctaaggaagc agctgccaag gaagccgctg ccaaggccgg atccggcctc ttggacctgc ggcagggcat gtttgcgcag ctggtggccc aaaatgttct gctgatcgat gggcccctga gctggtacag tgacccaggc ctggcaggcg tgtccctgac ggggggcctg agctacaaag aggacacgaa ggagctggtg gtggccaagg ctggagtcta ctatgtcttc tttcaactag agctgcggcg cgtggtggcc ggcgagggct caggctccgt ttcacttgcg ctgcacctgc agccactgcg ctctgctgct ggggccgccg ccctggcttt gaccgtggac ctgccacccg cctcctccga ggctcggaac tcggccttcg gtttccaggg ccgcttgctg cacctgagtg ccggccagcg cctgggcgtc catcttcaca ctgaggccag ggcacgccat gcctggcagc ttacccaggg cgccacagtc ttgggactct tccgggtgac ccccgaaatc ccagccggac tcccttcacc gaggtcggaa
<210>4 <211> 618 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 5-CD137L6)
<400> 4
ggtttttctt tcttatttgt tcaaggcaat cagcgtgctc atggacaaga tttggggact cttggttcct gtctccagcg cttcaccaca atgccttttc tattctgcaa cgtcaatgac gtatgtaact ttgcctcacg aaatgattat tcgtactggc tggctgaagc tgctgccaaa gaagccgctg ctaaggaagc agctgccaag gaagccgctg ccaaggccgg atccgccgtc ttcctcgcct gcccctgggc cgtgtccggg gctcgcgcct cgcccggctc cgcggccagc ccgagactcc gcgagggtcc cgagctttcg cccgacgatc ccgccggcct cttgctgcag ccactgcgct ctgctgctgg ggccgccgcc ctggctttga ccgtggacct gccacccgcc tcctccgagg ctcggaactc ggccttcggt ttccagggcc gcttgctgca cctgagtgcc ggccagcgcc tgggcgtcca tcttcacact gaggccaggg cacgccatgc ctggcagctt acccagggcg ccacagtctt gggactcttc cgggtgaccc ccgaaatccc agccggactc ccttcaccga ggtcggaa
<210>5 <211> 747 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 1-CD137L1)
<400> 5
acaatgccat tcttattctg caatgtcaat gatgtatgta attttgcatc tcgtaatgat tattcatact ggctgggagg tggtggatca ggtggaggtg gatctggtgg aggtggaagt gccgtcttcc tcgcctgccc ctgggccgtg tccggggctc gcgcctcgcc cggctccgcg gccagcccga gactccgcga gggtcccgag ctttcgcccg acgatcccgc cggcctcttg gacctgcggc agggcatgtt tgcgcagctg gtggcccaaa atgttctgct gatcgatggg cccctgagct ggtacagtga cccaggcctg gcaggcgtgt ccctgacggg gggcctgagc tacaaagagg acacgaagga gctggtggtg gccaaggctg gagtctacta tgtcttcttt caactagagc tgcggcgcgt ggtggccggc gagggctcag gctccgtttc acttgcgctg cacctgcagc cactgcgctc tgctgctggg gccgccgccc tggctttgac cgtggacctg ccacccgcct cctccgaggc tcggaactcg gccttcggtt tccagggccg cttgctgcac ctgagtgccg gccagcgcct gggcgtccat cttcacactg aggccagggc acgccatgcc tggcagctta cccagggcgc cacagtcttg ggactcttcc gggtgacccc cgaaatccca gccggactcc cttcaccgag gtcggaa
<210>6 <211> 759 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
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20
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 2-CD137L1) <400>6
acaatgccat tcttattctg caatgtcaat gatgtatgta attttgcatc tattcatact ggctgggagg tggtggatca ggtggaggtg gatctggtgg ggtggaggat ccgccgtctt cctcgcctgc ccctgggccg tgtccggggc cccggctccg cggccagccc gagactccgc gagggtcccg agctttcgcc
gccggcctct tggacctgcg gcagggcatg tttgcgcagc tggtggccca ctgatcgatg ggcccctgag ctggtacagt gacccaggcc tggcaggcgt gggggcctga gctacaaaga ggacacgaag gagctggtgg tggccaaggc tatgtcttct ttcaactaga gctgcggcgc gtggtggccg gcgagggctc tcacttgcgc tgcacctgca gccactgcgc tctgctgctg gggccgccgc accgtggacc tgccacccgc ctcctccgag gctcggaact cggccttcgg cgcttgctgc acctgagtgc cggccagcgc ctgggcgtcc atcttcacac gcacgccatg cctggcagct tacccagggc gccacagtct tgggactctt cccgaaatcc cagccggact cccttcaccg aggtcggaa
<210>7 <211> 735 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 3-CD137L1) <400> 7
acaatgccat
tattcatact
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ggcatgtttg
tacagtgacc
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cggcgcgtgg
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tggacctgcc
tgctgcacct
gccatgcctg
aaatcccagc
<210>8 <211> 750 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 4-CD137L1) <400> 8
tcgtaatgat
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tcgcgcctcg
cgacgatccc
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gtccctgacg
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aggctccgtt
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cctgcggcag
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cctgcagcca
acccgcctcc
gagtgccggc
gcagcttacc
cggactccct
5
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acaatgccat
tattcatact
tccgccgtct
gcggccagcc
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gggcccctga
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cacctgagtg
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ctggtggccc
ctggcaggcg
gtggccaagg
ggcgagggct
ggggccgccg
tcggccttcg
catcttcaca
ttgggactct
attttgcatc
ctggatcagg
ctcgcgcctc
ccgacgatcc
aaaatgttct
tgtccctgac
ctggagtcta
caggctccgt
ccctggcttt
gtttccaggg
ctgaggccag
tccgggtgac
<210>9 <211> 774 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 5-CD137L1) <400> 9
acaatgccat
tattcatact
aaggaagccg
ggggctcgcg
tcttattctg
ggctggctga
ctgccaaggc
cctcgcccgg
caatgtcaat
agctgctgcc
cggatccgcc
ctccgcggcc
gatgtatgta attttgcatc aaagaagccg ctgctaagga gtcttcctcg cctgcccctg agcccgagac tccgcgaggg
tcgcccgacg atcccgccgg cctcttggac ctgcggcagg gcatgtttgc gcccaaaatg ttctgctgat cgatgggccc ctgagctggt acagtgaccc ggcgtgtccc tgacgggggg cctgagctac aaagaggaca cgaaggagct aaggctggag tctactatgt cttctttcaa ctagagctgc ggcgcgtggt ggctcaggct ccgtttcact tgcgctgcac ctgcagccac tgcgctctgc gccgccctgg ctttgaccgt ggacctgcca cccgcctcct ccgaggctcg ttcggtttcc agggccgctt gctgcacctg agtgccggcc agcgcctggg cacactgagg ccagggcacg ccatgcctgg cagcttaccc agggcgccac ctcttccggg tgacccccga aatcccagcc ggactccctt caccgaggtc
<210> 10 <211> 789 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 6-CD137L1) <400> 10
acaatgccat tcttattctg caatgtcaat gatgtatgta attttgcatc tattcatact ggctggctga agctgctgcc aaagaagccg ctgctaagga aaggaagccg ctgccaaggc cgctgcagcc aaggctggat ccgccgtctt ccctgggccg tgtccggggc tcgcgcctcg cccggctccg cggccagccc gagggtcccg agctttcgcc cgacgatccc gccggcctct tggacctgcg tttgcgcagc tggtggccca aaatgttctg ctgatcgatg ggcccctgag gacccaggcc tggcaggcgt gtccctgacg gggggcctga gctacaaaga gagctggtgg tggccaaggc tggagtctac tatgtcttct ttcaactaga gtggtggccg gcgagggctc aggctccgtt tcacttgcgc tgcacctgca tctgctgctg gggccgccgc cctggctttg accgtggacc tgccacccgc gctcggaact cggccttcgg tttccagggc cgcttgctgc acctgagtgc ctgggcgtcc atcttcacac tgaggccagg gcacgccatg cctggcagct gccacagtct tgggactctt ccgggtgacc cccgaaatcc cagccggact aggtcggaa
tcgtaatgat
tggaggtgga
gcccggctcc
cgccggcctc
gctgatcgat
ggggggcctg
ctatgtcttc
ttcacttgcg
gaccgtggac
ccgcttgctg
ggcacgccat
ccccgaaatc
tcgtaatgat
agcagctgcc
ggccgtgtcc
tcccgagctt
gcagctggtg
aggcctggca
ggtggtggcc
ggccggcgag
tgctggggcc
gaactcggcc
cgtccatctt
agtcttggga
ggaa
tcgtaatgat
agcagctgcc
cctcgcctgc
gagactccgc
gcagggcatg
ctggtacagt
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cggccagcgc
tacccagggc
cccttcaccg
5
10
15
20
25
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 7-CD137L1) <400> 11
acaatgccat
tattcatact
aaggctggat
cccggctccg
gccggcctct
ctgatcgatg
gggggcctga
tatgtcttct
tcacttgcgc
accgtggacc
cgcttgctgc
gcacgccatg
cccgaaatcc
tcttattctg
ggctggctga
ccgccgtctt
cggccagccc
tggacctgcg
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gctacaaaga
ttcaactaga
tgcacctgca
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acctgagtgc
cctggcagct
cagccggact
caatgtcaat
agctgctgcc
cctcgcctgc
gagactccgc
gcagggcatg
ctggtacagt
ggacacgaag
gctgcggcgc
gccactgcgc
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tacccagggc
cccttcaccg
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aaagaagccg
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gtggtggccg
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gctcggaact
ctgggcgtcc
gccacagtct
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agctttcgcc
tggtggccca
tggcaggcgt
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gggccgccgc
cggccttcgg
atcttcacac
tgggactctt
<210> 12 <211> 777 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 7-Enlazador peptídico 8-CD137L1) <400> 12
acaatgccat tcttattctg caatgtcaat gatgtatgta attttgcatc tattcatact ggctggctga agctgctgcc aaagaagccg ctgctaagga aaggaagccg ctgccaaggc ccctggatcc gccgtcttcc tcgcctgccc
tccggggctc gcgcctcgcc cggctccgcg gccagcccga gactccgcga
ctttcgcccg acgatcccgc cggcctcttg gacctgcggc agggcatgtt
gtggcccaaa atgttctgct gatcgatggg cccctgagct ggtacagtga
gcaggcgtgt ccctgacggg gggcctgagc tacaaagagg acacgaagga
gccaaggctg gagtctacta tgtcttcttt caactagagc tgcggcgcgt
gagggctcag gctccgtttc acttgcgctg cacctgcagc cactgcgctc
gccgccgccc tggctttgac cgtggacctg ccacccgcct cctccgaggc
gccttcggtt tccagggccg cttgctgcac ctgagtgccg gccagcgcct
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<213> Secuencia artificial <220>
tcgtaatgat
agcagctgcc
tcgcgcctcg
cgacgatccc
aaatgttctg
gtccctgacg
tggagtctac
aggctccgtt
cctggctttg
tttccagggc
tgaggccagg
ccgggtgacc
tcgtaatgat
agcagctgcc
ctgggccgtg
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tgcgcagctg
cccaggcctg
gctggtggtg
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tcggaactcg
gggcgtccat
cacagtcttg
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<210> 14 <211> 807 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 5-CD137L5)
<400> 14
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 1-CD137L5)
<400> 15
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ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctaggaggtggtggatcaggtggaggtggatctggtggag
gtggaagtggatccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatc
gatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagagga
cacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccg
gcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggct
ttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacct
gagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcg
ccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaa
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5
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25
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 5-CD137L6)
<400> 17
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctatcgacgcccgccctgatgccaatgaatatggcaccga ttactggacgagcgttagaaccttatatcagtcggtgcaccgtatgtgaggggcccgctatagccgctgaagctgct gccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggccggatccgccgtcttcctcgcctg cccctgggccgtgt ccggggct cgcgcct cgcccggct ccgcggccagcccgagact ccgcgagggt cccgagct11 cgcccgacgatcccgccggcctcttgctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtg gacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccgg ccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtct tgggact ctt ccgggtgacccccgaaat cccagccggact ccctt caccgaggt cggaa
<210> 18 <211>573 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 5-CD137L6)
<400> 18
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<210> 19 <211> 786 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
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gcgcttcaccacaatgccttttctattctgcaacgtcaatgacgtatgtaactttgcctcacgaaatgattattcgt actggctgggaggtggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggaagtggatccgcctgcccctgggccgtg t ccggggct cgcgcct cgcccggct ccgcggccagcccgagact ccgcgagggt cccgagct11 cgcccgacgat cc cgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccc tgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggag ctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctc aggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtgg acctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggc cagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtctt gggactcttccgggtg
<210> 20 <211> 843 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 1-CD137L4)
<400> 20
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 1-CD137L4)
<400> 21
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gcctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtg
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<213> Secuencia artificial <220>
5
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20
25
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
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<210> 24 <211> 762 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Un gen que codifica una proteína recombinante bifuncional que posee
las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 5-CD137L4)
<400> 24
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt
ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctagctgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaag
cagctgccaaggaagccgctgccaaggccggatccgcctgcccctgggccgtgtccggggctcgcgcctcgcccggc
tccgcggccagcccgagactccgcgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggca
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cctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgagg
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<210> 25 <211>243 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
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Phe
Leu Phe 35 Cys Asn Val Asn Asp 40 Val Cys Asn Phe Ala 45 Ser Arg Asn
Asp
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Gly 65
Gly Gly Gly Ser Gly 70 Ser Gly Leu Leu Asp 75 Leu Arg Gln Gly Met 80
Phe
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Ser
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225
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Arg
Ser Glu 245 250 255
<210> 26 <211> 197 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 1-CD137L6) <400> 26
5
10
Gly
Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln
1
5 10 15
Asp
Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro
20 25 30
Phe
Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn
35 40 45
Asp
Tyr Ser Tyr Trp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
50 55 60
Gly
Gly
Gly
Gly
Ser Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser
65
70 75 80
Gly
Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu
85 90 95
Gly
Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gln Pro
100 105 110
Leu
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
Leu
115 120 125
Pro
Pro
Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly
130 135 140
Arg
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His
145
150 155 160
Thr
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
Thr
165 170 175
Val
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie Pro Ala Gly Leu Pro
180 185 190
Ser
Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 27 <211> 250 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 5-CD137L5) <400> 27
Gly 1
Phe Ser Phe Leu 5 Phe Val Gln Gly Asn 10 Gln Arg Ala His Gly 15 Gln
Asp
Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro
20 25 30
Phe
Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn
35 40 45
Asp
Tyr Ser Tyr Trp Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala
50 55 60
Lys
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly Leu
65
70 75 80
Leu
Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
85 90 95
Leu
Leu
lie Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
100 105 110
Gly
Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
115 120 125
Leu
Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
130 135 140
Leu
Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
145
150 155 160
Leu
His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
165 170 175
Leu
Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
180 185 190
Phe
Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
195 200 205
Gly
Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
210 215 220
Thr
Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie
225
230 235 240
Pro
Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250 255
<210> 28 <211> 204 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 5-CD137L6) <400> 28
Gly
Phe Ser Phe Leu Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln
1 Asp
Leu Gly Thr 5 Leu Gly Ser Cys Leu 10 Gln Arg Phe Thr Thr 15 Met Pro
Phe
Leu Phe 20 Cys Asn Val Asn Asp 25 Val Cys Asn Phe Ala 30 Ser Arg Asn
Asp
Tyr 35 Ser Tyr Trp Leu Ala 40 Glu Ala Ala Ala Lys 45 Glu Ala Ala Ala
Lys
50 Glu Ala Ala Ala Lys 55 Glu Ala Ala Ala Lys 60 Ala Ala Val Phe Leu
65 Ala
Cys Pro Trp Ala 70 Val Ser Gly Ala Arg 75 Ala Ser Pro Gly Ser 80 Ala
Ala
Ser Pro Arg 85 Leu Arg Glu Gly Pro 90 Glu Leu Ser Pro Asp 95 Asp Pro
Ala
Gly Leu 100 Leu Leu Gln Pro Leu 105 Arg Ser Ala Ala Gly 110 Ala
Ala
Ala
Leu
Ala 115 Leu Thr Val Asp Leu 120 Pro Pro Ala Ser Ser 125 Glu Ala Arg Asn
Ser
130 Ala Phe Gly Phe Gln 135 Gly Arg Leu Leu His 140 Leu Ser Ala Gly Gln
145 Arg
Leu Gly Val His 150 Leu His Thr Glu Ala 155 Arg Ala Arg His Ala 160 Trp
Gln
Leu Thr Gln 165 Gly Ala Thr Val Leu 170 Gly Leu Phe Arg Val 175 Thr Pro
Glu
lie Pro 195 180 Ala Gly Leu Pro Ser 200 185 Pro Arg Ser Glu 205 190
<210> 29 <211> 249 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 1-CD137L1)
<400> 29
5
10
Thr
Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala
1
5 10 15
Ser
Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly
Gly
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp
35 40 45
Ala
Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg
50 55 60
Leu
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
Leu
Leu
65
70 75 80
Asp
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu
85 90 95
Leu
lie Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly
100 105 110
Val
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu
115 120 125
Val
Val
Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu
130 135 140
Arg
Arg
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu
145
150 155 160
His
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu
165 170 175
Thr
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe
180 185 190
Gly
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
Gly
195 200 205
Val
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr
210 215 220
Gln
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie Pro
225
230 235 240
Ala
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250 255
<210> 30 <211> 253 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 2-CD137L1)
<400> 30
Thr 1
Met Pro Phe Leu 5 Phe Cys Asn Val Asn 10 Asp Val Cys Asn Phe 15 Ala
Ser
Arg Asn Asp 20 Tyr Ser Tyr Trp Leu 25 Gly Gly Gly Gly Ser 30 Gly Gly
Gly
Gly
Ser 35 Gly Gly Gly Gly Ser 40 Gly Gly Gly Ser Ala 45 Val Phe Leu
Ala
Cys 50 Pro Trp Ala Val Ser 55 Gly Ala Arg Ala Ser 60 Pro Gly Ser
Ala
Ala 65
Ser Pro Arg Leu Arg 70 Glu Gly Pro Glu Leu 75 Ser Pro Asp Asp Pro 80
Ala
Gly Leu Leu Asp 85 Leu Arg Gln Gly Met 90 Phe Ala Gln Leu Val 95
Ala
Gln
Asn Val Leu 100 Leu lie Asp Gly Pro 105 Leu Ser Trp Tyr Ser 110 Asp Pro
Gly
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
5
10
Thr
Lys 115 Glu Leu Val Val Ala 120 Lys Ala Gly Val Tyr 125 Tyr Val Phe Phe
Gln
130 Leu Glu Leu Arg Arg 135 Val Val Ala Gly Glu 140 Gly Ser Gly Ser Val
145 Ser
Leu Ala Leu His 150 Leu Gln Pro Leu Arg 155 Ser Ala Ala Gly Ala 160 Ala
Ala
Leu Ala Leu 165 Thr Val Asp Leu Pro 170 Pro Ala Ser Ser Glu 175 Ala Arg
Asn
Ser Ala 180 Phe Gly Phe Gln Gly 185 Arg Leu Leu His Leu 190 Ser Ala Gly
Gln
Arg 195 Leu Gly Val His Leu 200 His Thr Glu Ala Arg 205 Ala Arg His Ala
Trp
210 Gln Leu Thr Gln Gly 215 Ala Thr Val Leu Gly 220 Leu Phe Arg Val Thr
225 Pro
Glu lie Pro Ala 245 230 Gly Leu Pro Ser Pro 250 235 Arg Ser Glu 255 240
<210>31 <211> 245 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 3-CD137L1)
<400> 31
Thr
Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala
1
5 10 15
Ser
Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly
Pro Gly Ser Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser
Gly
35 40 45
Ala
Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly
50 55 60
Pro
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln
65
70 75 80
Gly
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu lie Asp
Gly
85 90 95
Pro
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr
100 105 110
Gly
Gly
Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys
115 120 125
Ala
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val
130 135 140
Ala
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro
145
150 155 160
Leu
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
Leu
165 170 175
Pro
Pro
Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly
180 185 190
Arg
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His
195 200 205
Thr
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
Thr
210 215 220
Val
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie Pro Ala Gly Leu Pro
225
230 235 240
Ser
Pro Arg Ser Glu
245 250 255
<210> 32 <211> 250 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
10
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 4-CD137L1)
<400> 32
Thr
Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala
1
5 10 15
Ser
Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly
Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro
35 40 45
Trp
Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro
50 55 60
Arg
Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
65
70 75 80
Leu
Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
85 90 95
Leu
Leu
lie Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
100 105 110
Gly
Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
115 120 125
Leu
Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
130 135 140
Leu
Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
145
150 155 160
Leu
His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
165 170 175
Leu
Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
180 185 190
Phe
Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
195 200 205
Gly
Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
210 215 220
Thr
Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie
225
230 235 240
Pro
Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250 255
<210> 33 <211> 258 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 5-CD137L1)
<400> 33
Thr 1
Met Pro Phe Leu 5 Phe Cys Asn Val Asn 10 Asp Val Cys Asn Phe 15 Ala
Ser
Arg Asn Asp 20 Tyr Ser Tyr Trp Leu 25 Ala Glu Ala Ala Ala 30 Lys Glu
Ala
Ala
Ala 35 Lys Glu Ala Ala Ala 40 Lys Glu Ala Ala Ala 45 Lys Ala Gly
Ser
Ala 50 Val Phe Leu Ala Cys 55 Pro Trp Ala Val Ser 60 Gly Ala Arg Ala
Ser 65
Pro Gly Ser Ala Ala 70 Ser Pro Arg Leu Arg 75 Glu Gly Pro Glu Leu 80
Ser
Pro Asp Asp Pro 85 Ala Gly Leu Leu Asp 90 Leu Arg Gln Gly Met 95 Phe
Ala
Gln Leu Val 100 Ala Gln Asn Val Leu 105 Leu lie Asp Gly Pro 110 Leu Ser
Trp
Tyr Ser 115 Asp Pro Gly Leu Ala 120 Gly Val Ser Leu Thr 125 Gly Gly Leu
Ser
Tyr 130 Lys Glu Asp Thr Lys 135 Glu Leu Val Val Ala 140 Lys Ala Gly Val
Tyr 145
Tyr Val Phe Phe Gln 150 Leu Glu Leu Arg Arg 155 Val Val Ala Gly Glu 160
Gly
Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
Ala
Ala
Gly Ala 165 Ala Ala Leu Ala Leu 170 Thr Val Asp Leu Pro 175 Pro
Ala
Ser
Ser
Glu 180 Ala Arg Asn Ser Ala 185 Phe Gly Phe Gln 190 Gly Arg Leu Leu
His
Leu 195 Ser Ala Gly Gln Arg 200 Leu Gly Val His Leu 205 His Thr Glu Ala
Arg
210 Ala Arg His Ala Trp 215 Gln Leu Thr Gln Gly 220 Ala Thr Val Leu Gly
225 Leu
Phe Arg Val Thr 230 Pro Glu lie Pro Ala 235 Gly Leu Pro Ser Pro 240 Arg
Ser
Glu 260 245 265 250 270 255
<210> 34 <211> 263 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 6-CD137L1)
<400> 34
Thr
Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala
1
5 10 15
Ser
Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu
20 25 30
Ala
Ala
Ala
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
Ala
Ala
35 40 45
Ala
Ala
Lys Ala Gly Ser Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val
50 55 60
Ser
Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg
65
70 75 80
Glu
Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu
85 90 95
Arg
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu lie
100 105 110
Asp
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser
115 120 125
Leu
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val
130 135 140
Ala
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg
145
150 155 160
Val
Val
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu
165 170 175
Gln
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val
180 185 190
Asp
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe
195 200 205
Gln
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His
210 215 220
Leu
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly
225
230 235 240
Ala
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie Pro Ala Gly
245 250 255
Leu
Pro Ser Pro Arg Ser Glu
260 265 270
<210> 35 <211> 253 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 7-CD137L1)
<400> 35
Thr
Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala
1
5 10 15
Ser
Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu
20 25 30
Ala
Ala
Ala
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Ala Val Phe Leu
35 40 45
Ala
Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
Ala
50 55 60
Ala
Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
65
70 75 80
Ala
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
Ala
85 90 95
Gln
Asn Val Leu Leu lie Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
100 105 110
Gly
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
115 120 125
Thr
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
130 135 140
Gln
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
145
150 155 160
Ser
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
165 170 175
Ala
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
180 185 190
Asn
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
195 200 205
Gln
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
210 215 220
Trp
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
225
230 235 240
Pro
Glu lie Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250 255
<210> 36 <211> 259 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (tumstatina 7-Enlazador peptídico 8-CD137L1)
<400> 36
Thr 1
Met Pro Phe Leu 5 Phe Cys Asn Val Asn 10 Asp Val Cys Asn Phe 15 Ala
Ser
Arg Asn Asp 20 Tyr Ser Tyr Trp Leu 25 Ala Glu Ala Ala Ala 30 Lys Glu
Ala
Ala
Ala 35 Lys Glu Ala Ala Ala 40 Lys Glu Ala Ala Ala 45 Lys Ala Pro
Gly
Ser 50 Ala Val Phe Leu Ala 55 Cys Pro Trp Ala Val 60 Ser Gly Ala Arg
Ala 65
Ser Pro Gly Ser Ala 70 Ala Ser Pro Arg Leu 75 Arg Glu Gly Pro Glu 80
Leu
Ser Pro Asp Asp 85 Pro Ala Gly Leu Leu 90 Asp Leu Arg Gln Gly 95 Met
Phe
Ala Gln Leu 100 Val Ala Gln Asn Val 105 Leu Leu lie Asp Gly 110 Pro Leu
Ser
Trp Tyr 115 Ser Asp Pro Gly Leu 120 Ala Gly Val Ser Leu 125 Thr Gly Gly
Leu
Ser 130 Tyr Lys Glu Asp Thr 135 Lys Glu Leu Val Val 140 Ala Lys Ala Gly
Val 145
Tyr Tyr Val Phe Phe 150 Gln Leu Glu Leu Arg 155 Arg Val Val Ala Gly 160
Glu
Gly Ser Gly Ser 165 Val Ser Leu Ala Leu 170 His Leu Gln Pro Leu 175 Arg
Ser
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro
Ala
Ser Ser 180 Glu Ala Arg Asn Ser 185 Ala Phe Gly Phe Gln 190 Gly Arg Leu
Leu
His 195 Leu Ser Ala Gly Gln 200 Arg Leu Gly Val His 205 Leu His Thr Glu
Ala
210 Arg Ala Arg His Ala 215 Trp Gln Leu Thr Gln 220 Gly Ala Thr Val Leu
225 Gly
Leu Phe Arg Val 230 Thr Pro Glu lie Pro 235 Ala Gly Leu Pro Ser 240 Pro
Arg
Ser Glu 260 245 265 250 270 255
<210> 37 <211> 262 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 1-CD137L5) <400> 37
5
10
Gln
Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met
1
5 10 15
Pro
Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg
20 25 30
Asn
Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met
Asn
35 40 45
Met
Ala Pro lie Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr lie Ser Arg Cys
50 55 60
Thr
Val Cys Glu Gly Pro Ala lie Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65
70 75 80
Gly
Gly
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Leu Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Gln
Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu lie Asp
100 105 110
Gly
Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
115 120 125
Thr
Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
130 135 140
Lys
Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
145
150 155 160
Val
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
165 170 175
Pro
Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
180 185 190
Leu
Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
195 200 205
Gly
Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
210 215 220
His
Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
225
230 235 240
Thr
Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie Pro Ala Gly Leu
245 250 255
Pro
Ser Pro Arg Ser Glu
260 265 270
<210> 38 <211> 269 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 5-CD137L5)
<400> 38
Gln Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met 15 10 15
Pro
Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg
20 25 30
Asn
Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met
Asn
35 40 45
Met
Ala Pro lie Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr lie Ser Arg Cys
50 55 60
Thr
Val Cys Glu Gly Pro Ala lie Ala Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu
65
70 75 80
Ala
Ala
Ala
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly
85 90 95
Ser
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
100 105 110
Gln
Asn Val Leu Leu lie Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
115 120 125
Gly
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
130 135 140
Thr
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
145
150 155 160
Gln
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
165 170 175
Ser
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
180 185 190
Ala
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
195 200 205
Asn
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
210 215 220
Gln
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
225
230 235 240
Trp
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
245 250 255
Pro
Glu lie Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
260 265 270
<210> 39 <211> 228 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 1-CD137L5) <400> 39
5
Gln 1
Asp Leu Gly Thr 5 Leu Gly Ser Cys Leu 10 Gln
Pro
Phe Leu Phe 20 Cys Asn Val Asn Asp 25 Val Cys
Asn
Asp Tyr 35 Ser Tyr Trp Leu Gly 40 Gly Gly Gly
Ser
Gly 50 Gly Gly Gly Ser Gly 55 Ser Gly Leu Leu
Met 65
Phe Ala Gln Leu Val 70 Ala Gln Asn Val Leu 75
Leu
Ser Trp Tyr Ser 85 Asp Pro Gly Leu Ala 90 Gly
Gly
Leu Ser Tyr 100 Lys Glu Asp Thr Lys 105 Glu Leu
Gly
Val Tyr 115 Tyr Val Phe Phe Gln 120 Leu Glu Leu
Gly
Glu 130 Gly Ser Gly Ser Val 135 Ser Leu Ala Leu
Arg 145
Ser Ala Ala Gly Ala 150 Ala Ala Leu Ala Leu 155
Pro
Ala Ser Ser Glu 165 Ala Arg Asn Ser Ala 170 Phe
Leu
Leu
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly
Arg Phe Thr Thr Met 15
Asn Phe Ala Ser Arg 30
Ser Gly Gly Gly Gly 45
Asp Leu Arg Gln Gly 60
Leu lie Asp Gly Pro 80
Val Ser Leu Thr Gly 95
Val Val Ala Lys Ala 110
Arg Arg Val Val Ala 125
His Leu Gln Pro Leu 140
Thr Val Asp Leu Pro 160
Gly Phe Gln Gly Arg 175
Val His Leu His Thr

180 185 190

Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val 195 200 205

Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu lie Pro Ala Gly Leu Pro Ser 210 215 220
Pro Arg Ser Glu

225 230 235 240
<210> 40 <211> 235 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 5-CD137L5)
<400> 40
5
10
Gln
Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met
1
5 10 15
Pro
Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg
20 25 30
Asn
Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala
35 40 45
Ala
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly Ser Gly
50 55 60
Leu
Leu
Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
65
70 75 80
Val
Leu Leu lie Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
85 90 95
Ala
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
100 105 110
Glu
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
115 120 125
Glu
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
130 135 140
Ala
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
145
150 155 160
Ala
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
165 170 175
Ala
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
180 185 190
Leu
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
195 200 205
Leu
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
210 215 220
lie
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
225
230 235 240
<210>41 <211> 225 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 5-CD137L6)
<400> 41

Gln Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met 15 10 15

Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg 20 25 30

Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn 35 40 45

Met Ala Pro lie Thr Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr lie Ser Arg Cys 50 55 60

Thr Val Cys Glu Gly Pro Ala lie Ala Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu 65 70 75 80
5
10
Ala
Ala
Ala
Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly
85 90 95
Ser
Ala Val Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala
100 105 110
Ser
Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu
115 120 125
Ser
Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala
130 135 140
Ala
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser
145
150 155 160
Ser
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His
165 170 175
Leu
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
180 185 190
Ala
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
195 200 205
Phe
Arg Val Thr Pro Glu lie Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
210 215 220
Glu
225
230 235 240
<210> 42 <211> 191 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 5-CD137L6) <400> 42
Gln
1
Pro
Asn
Ala
Val
65
Gly
Asp
Ala
Ala
Ala
145
His
Val
Asp
Leu Gly Thr 5 Leu Gly Ser Cys Leu 10 Gln Arg Phe Thr Thr 15 Met
Phe
Leu Phe 20 Cys Asn Val Asn Asp 25 Val Cys Asn Phe Ala 30 Ser Arg
Asp
Tyr 35 Ser Tyr Trp Leu Ala 40 Glu Ala Ala Ala Lys 45 Glu Ala Ala
Lys 50
Glu Ala Ala Ala Lys 55 Glu Ala Ala Ala Lys 60 Ala Gly Ser Ala
Phe
Leu Ala Cys Pro 70 Trp Ala Val Ser Gly 75 Ala Arg Ala Ser Pro 80
Ser
Ala Ala Ser 85 Pro Arg Leu Arg Glu 90 Gly Pro Glu Leu Ser 95 Pro
Asp
Pro Ala 100 Gly Leu Leu Leu Gln 105 Pro Leu Arg Ser Ala 110 Ala Gly
Ala
Ala 115 Leu Ala Leu Thr Val 120 Asp Leu Pro Pro Ala 125 Ser Ser Glu
Arg 130
Asn Ser Ala Phe Gly 135 Phe Gln Gly Arg Leu 140 Leu His Leu Ser
Gly
Gln Arg Leu Gly 150 Val His Leu His Thr 155 Glu Ala Arg Ala Arg 160
Ala
Trp Gln Leu 165 Thr Gln Gly Ala Thr 170 Val Leu Gly Leu Phe 175 Arg
Thr
Pro Glu 180 lie Pro Ala Gly Leu 185 Pro Ser Pro Arg Ser 190 Glu
<210> 43 <211> 263 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 1-CD137L4) <400> 43
Met 1
Gly Phe Ser Phe 5 Leu Phe Val Gln Gly 10 Asn Gln Arg Ala His 15 Gly
Gln
Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met
Pro
Phe Leu 20 Phe Cys Asn Val Asn 25 Asp Val Cys Asn Phe 30 Ala Ser Arg
Asn
Asp 35 Tyr Ser Tyr Trp Leu 40 Gly Gly Gly Gly Ser 45 Gly Gly Gly Gly
Ser
50 Gly Gly Gly Gly Ser 55 Gly Ser Ala Cys Pro 60 Trp Ala Val Ser Gly
65 Ala
Arg Ala Ser Pro 70 Gly Ser Ala Ala Ser 75 Pro Arg Leu Arg Glu 80 Gly
Pro
Glu Leu Ser 85 Pro Asp Asp Pro Ala 90 Gly Leu Leu Asp Leu 95 Arg Gln
Gly
Met Phe 100 Ala Gln Leu Val Ala 105 Gln Asn Val Leu Leu 110 lie Asp
Gly
Pro
Leu 115 Ser Trp Tyr Ser Asp 120 Pro Gly Leu Ala 125 Gly Val Ser Leu Thr
Gly
130 Gly Leu Ser Tyr Lys 135 Glu Asp Thr Lys Glu 140 Leu Val Val Ala Lys
145 Ala
Gly Val Tyr Tyr 150 Val Phe Phe Gln Leu 155 Glu Leu Arg Arg Val 160 Val
Ala
Gly Glu Gly 165 Ser Gly Ser Val Ser 170 Leu Ala Leu His Leu 175 Gln Pro
Leu
Arg Ser 180 Ala Ala Gly Ala Ala 185 Ala Leu Ala Leu Thr 190 Val Asp
Leu
Pro
Pro
195 Ala Ser Ser Glu Ala 200 Arg Asn Ser Ala Phe 205 Gly Phe Gln Gly
Arg
210 Leu Leu His Leu Ser 215 Ala Gly Gln Arg Leu 220 Gly Val His Leu His
225 Thr
Glu Ala Arg Ala 230 Arg His Ala Trp Gln 235 Leu Thr Gln Gly Ala 240 Thr
Val
Leu Gly Leu 260 245 Phe Arg Val 250 255
<210> 44 <211> 282 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 1-CD137L4) <400> 44
Met 1
Gln Asp Leu Gly 5 Thr Leu Gly Ser Cys 10 Leu Gln Arg Phe Thr 15 Thr
Met
Pro Phe Leu 20 Phe Cys Asn Val Asn 25 Asp Val Cys Asn Phe 30 Ala Ser
Arg
Asn Asp 35 Tyr Ser Tyr Trp Leu 40 Ser Thr Pro Ala Leu 45 Met Pro Met
Asn
Met 50 Ala Pro lie Thr Gly 55 Arg Ala Leu Glu Pro 60 Tyr lie Ser Arg
Cys 65
Thr Val Cys Glu Gly 70 Pro Ala lie Ala Gly 75 Gly Gly Gly Ser Gly 80
Gly
Gly
Gly
Ser Gly 85 Gly Gly Gly Ser Gly 90 Ser Ala Cys Pro Trp 95 Ala
Val
Ser Gly Ala 100 Arg Ala Ser Pro Gly 105 Ser Ala Ala Ser Pro 110 Arg Leu
Arg
Glu Gly 115 Pro Glu Leu Ser Pro 120 Asp Asp Pro Ala Gly 125 Leu Leu Asp
Leu 130
Arg Gln Gly Met Phe Ala 135 Gln Leu Val Ala Gln 140 Asn Val Leu Leu
lie 145
Asp Gly Pro Leu Ser 150 Trp Tyr Ser Asp Pro 155 Gly Leu Ala Gly Val 160
Ser
Leu Thr Gly Gly 165 Leu Ser Tyr Lys Glu 170 Asp Thr Lys Glu Leu 175 Val
Val
Ala Lys Ala 180 Gly Val Tyr Tyr Val 185 Phe Phe Gln Leu Glu 190 Leu Arg
Arg
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
195 200 205
Leu
Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
210 215 220
Val
Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
225
230 235 240
Phe
Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
245 250 255
His
Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
260 265 270
Gly Ala
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
275 280
<210> 45 <211> 248 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 1-CD137L4) <400> 45
5
10
Met
Gln Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr
1
5 10 15
Met
Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser
20 25 30
Arg
Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
35 40 45
Gly
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser
50 55 60
Gly
Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu
65
70 75 80
Gly
Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
85 90 95
Gln
Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu lie Asp
100 105 110
Gly
Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
115 120 125
Thr
Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
130 135 140
Lys
Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
145
150 155 160
Val
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
165 170 175
Pro
Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
180 185 190
Leu
Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
195 200 205
Gly
Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
210 215 220
His
Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
225
230 235 240
Thr
Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
245
<210> 46 <211> 270 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 1-Enlazador peptídico 5-CD137L4) <400> 46
Met 1
Gly Phe Ser Phe 5 Leu Phe Val Gln Gly 10 Asn Gln Arg Ala His 15 Gly
Gln
Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met
Pro
Phe Leu 20 Phe Cys Asn Val Asn 25 Asp Val Cys Asn Phe 30 Ala Ser Arg
Asn
Asp 35 Tyr Ser Tyr Trp Leu 40 Ala Glu Ala Ala Ala 45 Lys Glu Ala Ala
Ala
50 Lys Glu Ala Ala Ala 55 Lys Glu Ala Ala Ala 60 Lys Ala Gly Ser
Ala
65 Cys
Pro Trp Ala Val 70 Ser Gly Ala Arg Ala 75 Ser Pro Gly Ser Ala 80 Ala
Ser
Pro Arg Leu 85 Arg Glu Gly Pro Glu 90 Leu Ser Pro Asp Asp 95 Pro Ala
Gly
Leu Leu 100 Asp Leu Arg Gln Gly 105 Met Phe Ala Gln Leu 110 Val Ala Gln
Asn
Val 115 Leu Leu lie Asp Gly 120 Pro Leu Ser Trp Tyr 125 Ser Asp Pro Gly
Leu
130 Ala Gly Val Ser Leu 135 Thr Gly Gly Leu Ser 140 Tyr Lys Glu Asp Thr
145 Lys Glu
Leu Val Val 150 Ala Lys Ala Gly Val 155 Tyr Tyr Val Phe Phe 160 Gln
Leu
Glu Leu Arg 165 Arg Val Val Ala Gly 170 Glu Gly Ser Gly Ser 175 Val Ser
Leu
Ala Leu 180 His Leu Gln Pro Leu 185 Arg Ser Ala Ala 190 Gly Ala Ala Ala
Leu
Ala 195 Leu Thr Val Asp Leu 200 Pro Pro Ala Ser Ser 205 Glu Ala Arg Asn
Ser
210 Ala Phe Gly Phe Gln 215 Gly Arg Leu Leu His 220 Leu Ser Ala Gly Gln
225 Arg
Leu Gly Val His 230 Leu His Thr Glu Ala 235 Arg Ala Arg His Ala 240 Trp
Gln
Leu Thr Gln 260 245 Gly Ala Thr Val Leu 265 250 Gly Leu Phe Arg Val 270 255
<210> 47 <211> 289 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 2-Enlazador peptídico 5-CD137L4) <400> 47
Met 1
Gln Asp Leu Gly 5 Thr Leu Gly Ser Cys 10 Leu Gln Arg Phe Thr 15 Thr
Met
Pro Phe Leu 20 Phe Cys Asn Val Asn 25 Asp Val Cys Asn Phe 30 Ala Ser
Arg
Asn Asp 35 Tyr Ser Tyr Trp Leu 40 Ser Thr Pro Ala Leu 45 Met Pro Met
Asn
Met 50 Ala Pro lie Thr Gly 55 Arg Ala Leu Glu Pro 60 Tyr lie Ser Arg
Cys 65
Thr Val Cys Glu Gly 70 Pro Ala lie Ala Ala 75 Glu Ala Ala Ala Lys 80
Glu
Ala Ala Ala Lys 85 Glu Ala Ala Ala Lys 90 Glu Ala Ala Ala Lys 95 Ala
Gly
Ser Ala Cys 100 Pro Trp Ala Val Ser 105 Gly Ala Arg Ala Ser 110 Pro
Gly
Ser
Ala Ala 115 Ser Pro Arg Leu Arg 120 Glu Gly Pro Glu Leu 125 Ser Pro Asp
Asp
Pro 130 Ala Gly Leu Leu Asp 135 Leu Arg Gln Gly Met 140 Phe Ala Gln Leu
Val 145
Ala Gln Asn Val Leu 150 Leu lie Asp Gly Pro 155 Leu Ser Trp Tyr Ser 160
Asp
Pro Gly Leu Ala 165 Gly Val Ser Leu Thr 170 Gly Gly Leu Ser Tyr 175 Lys
Glu
Asp Thr Lys 180 Glu Leu Val Val Ala 185 Lys Ala Gly Val Tyr 190 Tyr Val
Phe
Phe
Gln 195 Leu Glu Leu Arg Arg 200 Val Val Ala Gly Glu 205 Gly Ser Gly
Ser
Val 210 Ser Leu Ala Leu His 215 Leu Gln Pro Leu Arg 220 Ser Ala Ala Gly
Ala 225
Ala Ala Leu Ala Leu 230 Thr Val Asp Leu Pro 235 Pro Ala Ser Ser Glu 240
Ala
Arg Asn Ser Ala 245 Phe Gly Phe Gln Gly 250 Arg Leu Leu His Leu 255 Ser
Ala
Gly Gln Arg 260 Leu Gly Val His Leu 265 His Thr Glu Ala Arg 270 Ala Arg
His Val
Ala Trp 275 Gln Leu Thr Gln Gly 280 Ala Thr Val Leu Gly 285 Leu Phe Arg
<210> 48 <211> 255 <212> PRT
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223>Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L (Tumstatina 3-Enlazador peptídico 5-CD137L4) <400> 48
5
10
15

Met Gln Asp Leu Gly Thr Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr 15 10 15

Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala 20 25 30

Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu 35 40 45

Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Gly 50 55 60

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 65 70 75

Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 85 90 95

Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 100 105 110

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Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 130 135 140

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Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 165 170 175

Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 180 185 190

Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 195 200 205

Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 210 215 220

Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 225 230 235

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 245 250 255
<210> 49 <211> 162 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Tumstatina 1 <400> 49
Thr
Ser
Ala
Ser
Ala
80
Pro
Ala
Pro
Asp
Phe
160
Val
Ala
Arg
Gly
Ala
240
ggtttttctttcttatttgttcaaggcaatcagcgtgctcatggacaagatttggggactcttggttcctgtctcca
gcgcttcaccacaatgccttttctattctgcaacgtcaatgacgtatgtaactttgcctcacgaaatgattattcgt
actggctg
<210> 50 <211> 219 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Tumstatina 2 <400> 50
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt
ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctatcgacgcccgccctgatgccaatgaatatggcaccga
ttactggacgagcgttagaaccttatatcagtcggtgcaccgtatgtgaggggcccgctatagcc
<210> 51 <211> 117 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Tumstatina 3 <400> 51
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
imagen1
<210> 52 <211> 75 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Tumstatina 7 <400> 52
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctg <210> 53 <211> 45 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 1 <400> 53
ggaggtggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggaagt <210> 54 <211> 51 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 2 <400> 54
ggaggtggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctggtgga <210> 55 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 3 <400> 55
ggaggtggtggatcaggtggaggtcct <210> 56 <211> 42 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 4 <400> 56
ggaggtggtggatcaggtggaggtcctggatcaggtggaggt <210> 57 <211> 66 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
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gctgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggcc <210> 58 <211> 81 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 6 <400> 58
gctgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggccgctgcagccaa
ggct
<210> 59 <211>51 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
<220>
<223> Enlazador peptídico 7 <400> 59
gctgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggct <210> 60 <211> 69 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 8 <400> 60
gctgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggcccct <210> 61 <211> 627 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L1 <400> 61
gccgt ctt cct cgcctgcccctgggccgtgt ccggggct cgcgcct cgcccggct ccgcggccagcccgagact ccg cgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtgg cccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacgggg ggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactaga gctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctg ctggggccgccgccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttc cagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgc ctggcagcttacccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcac cgaggtcggaa
<210> 62 <211> 516 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L5 <400> 62
ggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttctgctgatcgatgggcccctgag ctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctacaaagaggacacgaaggagctgg tggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgtggtggccggcgagggctcaggc tccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccgccctggctttgaccgtggacct gccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttgctgcacctgagtgccggccagc gcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttacccagggcgccacagtcttggga ct ctt ccgggtgacccccgaaat cccagccggact ccctt caccgaggt cggaa
<210> 63 <211> 384 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L6 <400> 63
gccgt ctt cct cgcctgcccctgggccgtgt ccggggct cgcgcct cgcccggct ccgcggccagcccgagact ccg cgagggtcccgagctttcgcccgacgatcccgccggcctcttgctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccg ccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttg ctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttac ccagggcgccacagtcttgggactcttccgggtgacccccgaaatcccagccggactcccttcaccgaggtcggaa
<210> 64 <211>573 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L4
5
10
15
20
25
<400> 64
gcctgcccctgggccgtgt ccggggct cgcgcct cgcccggct ccgcggccagcccgagact ccgcgagggt cccga gctttcgcccgacgatcccgccggcctcttggacctgcggcagggcatgtttgcgcagctggtggcccaaaatgttc tgctgatcgatgggcccctgagctggtacagtgacccaggcctggcaggcgtgtccctgacggggggcctgagctac aaagaggacacgaaggagctggtggtggccaaggctggagtctactatgtcttctttcaactagagctgcggcgcgt ggtggccggcgagggctcaggctccgtttcacttgcgctgcacctgcagccactgcgctctgctgctggggccgccg ccctggctttgaccgtggacctgccacccgcctcctccgaggctcggaactcggccttcggtttccagggccgcttg ctgcacctgagtgccggccagcgcctgggcgtccatcttcacactgaggccagggcacgccatgcctggcagcttac ccagggcgccacagt ctt gggact ctt ccgggtg
<210> 65 <211> 54 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Tumstatina 1 <400> 65
Gly
1
Asp
Phe
Asp
Phe
Ser Phe Leu 5
Leu
Gly Thr 20
Leu
Leu
Phe 35 Cys Asn
Tyr 50
Ser Tyr Trp
<210> 66 <211> 73 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Tumstatina 2 <400> 66
Gln
1
Pro
Asn
Met
Thr
65
<210> 67 <211> 39 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Tumstatina 3 <400> 67
Asp
Leu Gly Thr 5
Phe
Leu Phe 20 Cys
Asp
Tyr 35 Ser Tyr
Ala 50
Pro lie Thr
Val
Cys Glu Gly
imagen2
<210> 68

Phe Val Gln Gly Asn Gln Arg Ala His Gly Gln 10 15

Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met Pro 25 30

Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg Asn 40 45
Leu

55 60

Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met 10 15

Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg 25 30

Trp Leu Ser Thr Pro Ala Leu Met Pro Met Asn 40 45

Gly Arg Ala Leu Glu Pro Tyr lie Ser Arg Cys 55 60
Pro Ala lie Ala

70 75 80
Leu Gly Ser Cys Leu Gln Arg Phe Thr Thr Met

10 15

Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala Ser Arg 25 30
Trp Leu

40 45
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<211> 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Tumstatina 7 <400> 68
Val Cys Asn Phe Ala 15
30
Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp 15 10
Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu 20 25
<210> 69 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 1 <400> 69
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15
<210> 70 <211> 17 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 2 <400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15
Gly
20 25 30
<210> 71 <211>9 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 3 <400> 71
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro
15 10 15
<210> 72 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 4 <400> 72
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Pro Gly Ser Gly Gly Gly 15 10 15
<210> 73 <211> 22 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 5 <400> 73
5
10
15
20
25
30
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 15 10 15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala
20 25 30
<210> 74 <211> 27 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 6 <400> 74
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys 15 10
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala Lys Ala 20 25
imagen3
<210> 75 <211> 17 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 7 <400> 75
Lys Glu Ala Ala Ala Lys 15
30
<210> 76 <211> 23 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Enlazador peptídico 8 <400> 76
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 15 10
Ala
20 25
imagen4
<210> 77 <211>209 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L1 <400> 77
5
Ala 1
Val Phe Leu Ala 5 Cys Pro Trp
Pro
Gly Ser Ala 20 Ala Ser Pro Arg
Pro
Asp Asp 35 Pro Ala Gly Leu Leu 40
Gln
Leu 50 Val Ala Gln Asn Val 55 Leu
Tyr 65
Ser Asp Pro Gly Leu 70 Ala Gly
Tyr
Lys Glu Asp Thr 85 Lys Glu Leu
Tyr
Val Phe Phe 100 Gln Leu Glu Leu
Ser
Gly Ser 115 Val Ser Leu Ala Leu 120
Ala
Gly 130 Ala Ala Ala Leu Ala 135 Leu
Ser 145
Glu Ala Arg Asn Ser 150 Ala Phe
Leu
Ser Ala Gly Gln 165 Arg Leu Gly
Ala
Arg His Ala 180 Trp Gln Leu Thr
Phe Glu
Arg 210 Val 195 Thr Pro Glu lie 215 Pro 200
Ala
Val 10 Ser Gly Ala Arg Ala 15 Ser
Leu 25
Arg Glu Gly Pro Glu 30 Leu Ser
Asp
Leu Arg Gln Gly 45 Met Phe Ala
Leu
lie Asp Gly 60 Pro Leu Ser Trp
Val
Ser Leu 75 Thr Gly Gly Leu Ser 80
Val
Val 90 Ala Lys Ala Gly Val 95 Tyr
Arg 105
Arg Val Val Ala Gly 110 Glu Gly
His
Leu Gln Pro Leu 125 Arg Ser Ala
Thr
Val Asp Leu 140 Pro Pro Ala Ser
Gly
Phe Gln 155 Gly Arg Leu Leu His 160
Val
His 170 Leu His Thr Glu Ala 175 Arg
Gln 185
Gly Ala Thr Val Leu 190 Gly Leu
Ala
Gly Leu Pro Ser 205 Pro Arg Ser
220
<210> 78 <211> 172 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L5 <400> 78
Gly
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln
1
5 10 15
Asn
Val Leu Leu lie Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly
20 25 30
Leu
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr
35 40 45
Lys
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
50 55 60
Leu
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
65
70 75 80
Leu
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
85 90 95
Leu
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
100 105 110
Ser
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
115 120 125
Arg
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
130 135 140
Gln
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
145
150 155 160
Glu
lie Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170 175
<210> 79 <211> 128
10
15
20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L6 <400> 79
Ala
1
Pro
Pro
Gly
Glu
65
Ser
Arg
Arg
<210> 80 <211> 187 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> CD137L4 <400> 80
Val
Phe Leu Ala 5 Cys Pro Trp Ala Val 10 Ser Gly Ala Arg Ala 15 Ser
Gly
Ser Ala 20 Ala Ser Pro Arg Leu 25 Arg Glu Gly Pro Glu 30 Leu Ser
Asp
Asp 35 Pro Ala Gly Leu Leu 40 Leu Gln Pro Leu Arg 45 Ser Ala Ala
Ala 50
Ala Ala Leu Ala Leu 55 Thr Val Asp Leu Pro 60 Pro Ala Ser Ser
Ala
Arg Asn Ser Ala 70 Phe Gly Phe Gln Gly 75 Arg Leu Leu His Leu 80
Ala
Gly Gln Arg 85 Leu Gly Val His Leu 90 His Thr Glu Ala Arg 95
Ala
His
Ala Trp 100 Gln Leu Thr Gln Gly 105 Ala Thr Val Leu Gly 110 Leu Phe
Val
Thr 115 Pro Glu lie Pro Ala 120 Gly Leu Pro Ser Pro 125 Arg Ser Glu
Ala
Cys Pro Trp Ala 5 Val Ser Gly Ala Arg 10 Ala Ser Pro Gly Ser 15
Ala
Ala
Ser Pro Arg 20 Leu Arg Glu Gly Pro 25 Glu Leu Ser Pro Asp 30 Asp Pro
Ala
Gly Leu 35 Leu Asp Leu Arg Gln 40 Gly Met Phe Ala Gln 45 Leu Val
Ala
Gln
Asn 50 Val Leu Leu lie Asp 55 Gly Pro Leu Ser Trp 60 Tyr Ser Asp Pro
Gly 65
Leu Ala Gly Val Ser 70 Leu Thr Gly Gly Leu 75 Ser Tyr Lys Glu Gly 80
Gly
Leu Ser Tyr Lys 85 Glu Asp Thr Lys Glu 90 Leu Val Val Ala Lys 95 Ala
Val
Tyr Tyr 100 Val Phe Phe Gln Leu 105 Glu Leu Arg Arg Val 110 Val Ala Gly
Gly 105
Ser Gly Ser Val Ser 110 Leu Ala Leu His Leu 115 Gln Pro Leu Arg Ser 120
Ala
Gly Ala Ala 125 Ala Leu Ala Leu Thr 130 Val Asp Leu Pro Pro 135 Ala Ser
Glu
Ala 140 Arg Asn Ser Ala Phe 145 Gly Phe Gln Gly Arg 150 Leu Leu His Leu
Ala 155
Gly Gln Arg Leu Gly 160 Val His Leu His Thr 165 Glu Ala Arg Ala Arg 170
His Val
Ala Trp Gln 190 Leu 175 Thr Gln Gly Ala Thr 180 Val Leu Gly Leu Phe 185 Arg
Gly
Glu
Ala
Ser
<210> 81 <211> 207 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 1-
5
10
15
20
25
30
35
40
Enlazador peptídico 1) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400>81
ggtttttctttcttatttgttcaaggcaatcagcgtgctcatggacaagatttggggactcttggttcctgtctcca gcgcttcaccacaatgccttttctattctgcaacgtcaatgacgtatgtaactttgcctcacgaaatgattattcgt act ggct gggaggt ggt ggat caggt ggaggt ggat ct ggt ggaggt ggaagt
<210> 82 <211> 228 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 5- Enlazador peptídico 1) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 82
ggtttttctttcttatttgttcaaggcaatcagcgtgctcatggacaagatttggggactcttggttcctgtctcca
gcgcttcaccacaatgccttttctattctgcaacgtcaatgacgtatgtaactttgcctcacgaaatgattattcgt
actggctggctgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggcc
<210> 83 <211> 264 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 2- Enlazador peptídico 1) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 83
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctatcgacgcccgccctgatgccaatgaatatggcaccga ttactggacgagcgttagaaccttatatcagtcggtgcaccgtatgtgaggggcccgctatagccggaggtggtgga t caggt ggaggt ggat ct ggt ggaggt ggaagt
<210> 84 <211> 285 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 2- Enlazador peptídico 5) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 84
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt
ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctatcgacgcccgccctgatgccaatgaatatggcaccga
ttactggacgagcgttagaaccttatatcagtcggtgcaccgtatgtgaggggcccgctatagccgctgaagctgct
gccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggcc
<210> 85 <211> 162 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 3- Enlazador peptídico 1) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 85
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt
ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctaggaggtggtggatcaggtggaggtggatctggtggag
gtggaagt
<210> 86 <211> 183 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 3- Enlazador peptídico 5) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 86
caagatttaggtactttgggctcttgtcttcagcgttttaccacaatgcctttcctcttttgcaatgttaacgacgt
ctgtaatttcgcttcccgcaacgattattcatactggctagctgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaag
cagctgccaaggaagccgctgccaaggcc
<210> 87 <211> 120 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 7- Enlazador peptídico 1) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 87
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggg aggt ggt ggat caggt ggaggt ggat ct ggt ggaggt ggaagt
<210> 88 <211> 126 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 7- Enlazador peptídico 2) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 88
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggg
aggtggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatctggtgga
<210> 89 <211> 102 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 7- Enlazador peptídico 3) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 89
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggg aggt ggt ggat caggt ggaggt cct
<210> 90 <211> 117 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 7- Enlazador peptídico 4) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 90
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggg aggt ggt ggat caggt ggaggt cct ggat caggt ggaggt
<210> 91 <211> 141 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 7- Enlazador peptídico 5) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 91
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggc
tgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggcc
<210> 92 <211> 156 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 7- Enlazador peptídico 6) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 92
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggc
tgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggccgctgcagccaagg
ct
<210> 93 <211> 126 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 7- Enlazador peptídico 7) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 93
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggc
tgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggct
<210> 94 <211> 144 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> La secuencia de nucleótidos que contiene el gen de tumstatina y el enlazador peptídico (Tumstatina 8- Enlazador peptídico 7) sintetizado por Shanghai Generay Biological Engineering CO. Ltd.
<400> 94
acaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgtaatgattattcatactggctggc
tgaagctgctgccaaagaagccgctgctaaggaagcagctgccaaggaagccgctgccaaggcccct
<210> 95 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas arriba de SEQ ID NO. 49 <400> 95
5¡--GGATCCGCCGTCTTCCTCGCCTGCC-3¡- <210> 96 <211> 30 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas abajo de SEQ ID NO. 49 <400> 96
5¡“-GCGGCCGCTTCCGACCTCGGTGAAGGGAGT-3¡_
<210> 97 <211>31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Cebador aguas arriba del gen de fusión (SEQ ID NO.5- SEQ ID NO.12)
<400> 97
5■ CGCTAGCACAATGCCATTCTTATTCTGCAATG -3 ¡"
<210> 98 <211> 31 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Cebador aguas abajo del gen de fusión (SEQ ID NO.5- SEQ ID NO.12) <400> 98
5f"CCATATGTTCCGACCTCGGTGAAGGGAGTCCG-3f <210> 99 <211> 28 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas arriba de SEQ ID NO. 50 <400> 99
5f-CGGGATCCGCCTCTTGGACCTGCGGCAG-3f <210> 100 <211> 29 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas abajo de SEQ ID NO. 50 <400> 100
5¡--GCGGCCGCTTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3¡- <210> 101 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.1 <400> 101
5 ¡--G CTAG CGGTTTTTCTTTCTTATTTGTTCAAG-3 ¡<210> 102 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.3 <400> 102
5¡-G CTAG CGGTTTTTCTTTCTTATTTGTTCAAG-3 ¡"
<210> 103 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.13- SEQ ID NO.14 <400> 103
5¡--GCTAGCCAAGATTTAGGTACTTTGGGCTCTT-3¡- <210> 104 <211> 31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.15- SEQ ID NO.16 <400> 104
5 ¡ _-G CTAG C AAG AG CCC AAAGTACCT AAAT CTTG -3 ¡_
<210> 105 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas abajo de la SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.13- SEQ ID NO.16 <400> 105
5¡--CATATGTTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3¡- <210> 106 <211> 27 <212> ADN
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador 1 aguas arriba de la SEQ ID NO.51 <400> 106
5¡--CGGGATCCGCCGTCTTCCTCGCCTGC-3¡- <210> 107 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas abajo 1 de la SEQ ID NO.51 <400> 107
5¡--CGCAAACATGCCCTGCCCTG-3¡- <210> 108 <211> 39 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador 2 aguas arriba de la SEQ ID NO.51 <400> 108
5¡--CAGGGCAGGGCATGTTTGCGGGTTTCCAGGGCCGCTTGC-3¡- <210> 109 <211> 29 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas abajo 2 de la SEQ ID NO.51 <400> 109
5¡--GCGGCCGCTTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3¡- <210> 110 <211>31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223>Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.2- SEQ ID NO.4 <400> 110
5 ¡--G CTAG CGGTTTTTCTTTCTTATTTGTTCAAG-3 j- <210> 111 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.17 <400> 111
5 ¡ --G CTAG CC AAG ATTTAG G TACTTTG-3 ¡ - <210> 112 <211>31 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas arriba de la SEQ ID NO.18 <400> 112
5¡--GCTAGCCAAGATTTAGGTACTTTGGGCTCTT-3¡- <210> 113 <211> 27 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador aguas abajo de la SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.4, SEQ ID NO.17 y SEQ ID NO.18 <400> 113
5¡--CATATGTTCCGACCTCGGTGAAGGGAG-3¡-

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Una proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L, caracterizada porque la proteína comprende las secuencias de aminoácidos de los fragmentos activos de tumstatina y la región extracelular de CD137L, en la que las secuencias de tumstatina y CD137L se fusionan a través de un enlazador peptídico flexible, en la que la secuencia de aminoácidos del fragmento activo de tumstatina se selecciona de la SEQ ID NO.65 a la SEQ ID No.68, en la que la secuencia de aminoácidos del enlazador peptídico se selecciona de la SEQ ID NO.69 a la SEQ ID NO.76, en la que la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de CD137L se selecciona de la SEQ ID NO.77 a la SEQ ID NO.80.
  2. 2. Una proteína recombinante bifuncional de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína contiene la secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO.25 a SEQ ID NO.48.
  3. 3. Un gen que codifica la proteína recombinante bifuncional de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gen comprende el gen que codifica el fragmento activo de tumstatina, el enlazador peptídico y la región extracelular de CD137L, en el que el gen que codifica el fragmento activo de tumstatina se selecciona de la SEQ ID NO.49 a la SEQ ID NO.52, en el que el gen que codifica el enlazador peptídico se selecciona de la SEQ ID NO.53 a la SEQ ID NO.60, en el que el gen que codifica la región extracelular de CD137L se selecciona de la SEQ ID NO.61 a la SEQ ID NO.64.
  4. 4. Un gen que codifica la proteína recombinante bifuncional de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de la SEQ ID NO.1 a la SEQ ID NO.24.
  5. 5. Un gen que codifica la proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L, caracterizado porque tiene una homología del 70 % o superior en comparación con la secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4.
  6. 6. Un procedimiento de preparación para la proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el procedimiento incluye las siguientes etapas:
    (1) Diseñar y obtener una secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5;
    (2) Construir un sistema de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que incluye construir el vector de expresión y transformar el vector de expresión en una célula huésped para formar una célula recombinante que puede expresar la proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L de acuerdo con la reivindicación 1;
    (3) Cultivar la célula recombinante obtenida de la etapa (2);
    (4) Aislar y purificar la proteína recombinante bifuncional que posee las actividades de tumstatina y CD137L de acuerdo con la reivindicación 1.
  7. 7. Un procedimiento de preparación de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el sistema de expresión es un sistema de expresión procariota o un sistema de expresión eucariota, en el que el sistema de expresión procariota se selecciona de Escherichia coli o Bacillus subtilis, en el que el sistema de expresión eucariota se selecciona de levadura.
  8. 8. La proteína recombinante bifuncional de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de inhibición de la angiogénesis en el microambiente tumoral, tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con tumores, regulación de la inmunidad corporal, estimulación de la proliferación de linfocitos T y síntesis y secreción de citocinas.
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