ES2687452T3 - Uso de "policétido sintasas" de tipo III (PKS III) recombinantes de algas pardas marinas - Google Patents

Abstract

Procedimiento para producir al menos un compuesto polifenólico, en el que: - una policétido sintasa de tipo III (PKSIII) de alga parda se pone en contacto con al menos un sustrato carbonoso en condiciones que permitan la producción mayoritaria de al menos un compuesto polifenólico, caracterizado por que dicha PKSIII comprende o consiste en: - la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 1, o una secuencia que puede codificarse por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 2, o - la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 3, o una secuencia que puede codificarse por la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 4. - dicho compuesto fenólico producido es floroglucinol o uno de sus derivados, - dicho sustrato se selecciona de malonil-CoA, hexanoil-CoA, decanoil-CoA, lauroil-CoA y/o palmitoil-CoA.

Description

DESCRIPCION

Uso de "policetido sintasas" de tipo III (PKS III) recombinantes de algas pardas marinas

5 [0001] La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir compuestos polifenolicos, es decir,

floroglucinol o uno de sus derivados, con una policetido sintasa de tipo III (PKSIII) de un alga parda marina. La invencion tambien se refiere a acidos nucleicos recombinantes que codifican una policetido sintasa de tipo III (PKSIII) del alga parda Ectocarpus siliculosus (E. siliculosus), vectores recombinantes que comprenden estos acidos nucleicos, as! como a celulas huesped que comprenden estos vectores. Finalmente, la invencion se refiere a un

10 procedimiento para preparar diversos compuestos por medio de compuestos polifenolicos producidos segun el procedimiento mencionado anteriormente.

[0002] Los metabolitos polifenolicos secundarios forman un amplio grupo de compuestos qulmicos diversos que existen tanto en plantas terrestres como en macrofitas acuaticas (Waterman et Mole, 1994, Analysis of phenolic

15 plant metabolites, Blackwell Scientific Publications: Oxford, Gran Bretana). Entre estos compuestos, floroglucinol, as! como sus derivados, se utilizan ampliamente en la industria, y particularmente en las industrias farmaceutica, cosmetica o agroalimentaria. Mas recientemente, el floroglucinol y sus derivados han mostrado actividades potencialmente interesantes para los seres humanos en farmacologla (produccion de intermedios de reaccion para la hemislntesis de compuestos qulmicos), en medicina (propiedades antimicrobiana, anti-VIH, anticancerosas,

20 antidiabeticas, antialergicas, antiinflamatorias) o cosmeticos (efecto antiedad), que los convierte en moleculas naturales con un potencial muy interesante (Singh IP y col., 2009, Expert Opin Ther Pat, 19: 847-66, para revesion). En la actualidad, solo el floroglucinol sintetizado qulmicamente se comercializa como un medicamento antiespasmodico musculotropico (con el nombre de Spasfon® en Francia). Ademas, las mezclas de productos tambien se comercializan como extractos de Ascophyllum nodosum por la empresa Algues & Mer d'Ouessant (29,

25 Francia), productos como Seanol™, extractos de Ecklonia cava o HealSea, extractos de Fucus vesiculosus por la corporation Diana Naturals (35, Francia) y algunas otras empresas en todo el mundo.

[0003] Una de las principales dificultades actuales es, por lo tanto, proporcionar procedimientos para producir floroglucinol o sus derivados, que sean eficaces y rapidos, y que ofrezcan la posibilidad de obtener estos

30 compuestos en grandes proporciones. Una de las posibilidades consiste en producirlo a traves de una ruta de bioslntesis aplicando el uso de enzimas.

[0004] Entre estas enzimas potencialmente capaces de sintetizar floroglucinol, se distinguen particularmente las policetido sintasas de tipo III (PKS III), que son enzimas clave del metabolismo secundario en plantas terrestres

35 (ruta de flavonoides, bioslntesis de fitoalexinas), pero tambien en bacterias, hongos y algunos protozoos. Las PKS III correspondientes (chalcona sintasas, estilbeno sintasas, pirona sintasas, etc.) comparten el mismo mecanismo de reaccion, pero difieren por su especificidad de sustrato para las moleculas "iniciadoras" y por la estereoqulmica de la reaccion de ciclacion que da lugar a un gran panel de metabolitos polifenolicos secundarios que tienen funciones muy diversas.

40

[0005] Por lo tanto, muchas policetido sintasas se aislaron a partir de diversos organismos, tales como el alga parda Sargassum binderi, las plantas terrestres Aloe arborescens y Arabidopsis thaliana, las amebas Dictyostelium discoideum, o incluso las bacterias Mycobacterium tuberculosis, Streptomyces coelicolor y Pseudomonas fluorescens (Baharum y col., Mar Biotechnol, 2011, 13(5): 845-856 ; Wanibuchi y col., Bioorg Med Chem Lett, 2011,

45 21: 2083-2086; Abe y col., J Am Chem Soc, 2005, 127(5):1362-1363 ; Mizuuchi y col., Biol Pharm Bull, 2008, 31(12): 2205-2210 ; Austin y col., Nat Chem Biol, 2006, 2(9): 494-502 ; Sankaranarayanan y col., Nat Struct Mol Biol, 2004, 11(9): 894-900 ; Izumikawa y col., J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30: 510-515 ; WO2006/044290). Entre estas policetido sintasas, solo la policetido sintasa PHID procedente de la bacteria Pseudomonas fluorescens es capaz de sintetizar floroglucinol usando malonil-CoA como molecula "iniciadora" (documento WO2006/044290). Las otras

50 policetidos sintasas, aunque tambien usan malonil-CoA como una molecula "iniciadora", son desafortunadamente incapaces de sintetizar floroglucinol.

[0006] Los inventores han identificado una novedosa policetido sintasa en el alga parda marina Ectocarpus siliculosus, que se denomino PKS1. Por primera vez, los inventores han producido una policetido sintasa de tipo III

55 (PKS III) de un alga parda marina de forma recombinante y activa en un sistema heterologo (la bacteria Escherichia coli) con un procedimiento de purification de homogeneidad establecido que permite la produccion de aproximadamente 5 a 10 mg de protelna pura por litro de cultivo. Los inventores tambien han demostrado que esta PKS1 era capaz de sintetizar floroglucinol in vitro a partir de la malonil-coenzima A (malonilCoA). Ademas, otros productos obtenidos de malonilCoA y de varios acilCoA con cadenas alifaticas mas o menos largas (hexanoilCoA,

decanoilCoA, lauroilCoA y palmitoilCoA) estan presentes en las reacciones.

[0007] La invencion es como se define en el objeto de las reivindicaciones 1 a 14.

5 Acido nucleico, protefna y procedimiento para producir la enzima

[0008] La presente invencion se refiere a un acido nucleico aislado que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2 o sEq ID NO: 4, o en una secuencia al menos un 85 % identica a la secuencia SEQ ID NO: 2 o al menos un 95 % identica a SEQ ID NO: 4, caracterizado por que codifica una policetido sintasa de tipo III (PKSIII), o en una

10 secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 4.

[0009] Preferentemente, dicho acido nucleico aislado codifica una policetido sintasa de tipo III.

[0010] La presente invencion se refiere adicionalmente a un acido nucleico aislado que codifica una policetido 15 sintasa de tipo III (PKS III) que consiste en:

a) la secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 2,

b) la secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 4,

c) la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 4,

20 d) una secuencia al menos un 85 % identica a SEQ ID NO: 2 o al menos un 95 % identica a la secuencia en SEQ ID NO: 4,

e) una secuencia que difiere de las secuencias a) a d) por la degeneracion del codigo,

f) una secuencia de nucleotidos que hibrida en condiciones de astringencia especlficas con al menos una de las secuencias a) a e).

25

[0011] Por "aislado", se entiende un compuesto que se ha aislado de un organismo vivo, tal como un alga o un animal, y/o una biblioteca de compuestos. Preferentemente, el acido nucleico aislado se deriva de un alga parda marina. Aun mas preferentemente, el acido nucleico aislado se deriva del alga parda marina Ectocarpus siliculosus (E. siliculosus).

30

[0012] Preferentemente, los acidos nucleicos segun la invencion son acidos nucleicos recombinantes. Por "acido nucleico recombinante", se entiende un acido nucleico, es decir, una molecula de ADN o ARN, que ha sido sometida a una manipulation molecular biologica.

35 [0013] Por "acido nucleico", se entiende la forma polimerica de ester fosfato de ribonucleosidos (adenosina,

guanosina, uridina o citidina; "moleculas de ARN") o desoxirribonucleosidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moleculas de ADN") en forma monocatenaria o en forma de una helice bicatenaria. Son posibles las helices bicatenarias ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El termino de acido nucleico, y en particular molecula de ADN o ARN, solo se refiere a la estructura primaria o secundaria de la molecula, y de ninguna manera 40 se limita a formas terciarias particulares. Por lo tanto, este termino comprende ADN bicatenario que, entre otros, se encuentra en las moleculas de ADN lineal o circular (por ejemplo, fragmentos de restriction), virus, plasmidos y cromosomas. Cuando se menciona la estructura de moleculas particulares de ADN bicatenario, las secuencias pueden describirse en el presente documento segun la convention normal que solo da la secuencia en la direction de 5' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita del ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa de 45 ARNm).

[0014] Por una secuencia al menos un 85 % identica a una secuencia de referencia, se entiende que la secuencia es identica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia puede incluir hasta quince alteraciones de nucleotidos cada 100 nucleotidos de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia al

50 menos un 85 % identica a la secuencia de referencia, hasta el 15 % de los nucleotidos de la secuencia pueden insertarse, eliminarse o sustituirse con otro nucleotido.

[0015] El porcentaje de identidad puede calcularse produciendo un alineamiento global de pares basado en el algoritmo de alineamiento Needleman-Wunsch para encontrar el alineamiento optico (incluyendo "espacios" o

55 "huecos") entre dos secuencias en toda su longitud, por ejemplo, usando Needle, y usando la matriz BLOSUM62 con una penalization de insertion de "huecos" de 10 y una penalization de extension de "huecos" de 0,5.

[0016] Preferentemente, la secuencia de nucleotidos de la invencion, en particular la secuencia c), es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % o un 99 % identica a la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID nO: 4.

[0017] Por "secuencia que difiere de las secuencias a) a c) por degeneracion del codigo", se entiende una

secuencia que difiere de la secuencia de referencia por una sustitucion conservativa como se indica en la tabla a continuacion.

Sustituciones conservativas

Tipo de aminoacido

Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp

Aminoacidos con cadenas laterales hidrofobas alifaticas

Ser, Tyr, Asn, Gln, Cys

Aminoacidos con cadenas laterales polares no cargadas

Asp, Glu

Aminoacidos con cadenas laterales acidas

Lys, Arg, His

Aminoacidos con cadenas laterales basicas

Gly

Cadena lateral neutra

[0018] Una molecula de acido nucleico "puede hibridarse" con otra molecula de acido nucleico tal como un ADN, un ADN genomico o un ARN, cuando la forma monocatenaria de la molecula de acido nucleico puede hibridarse con la otra molecula de acido nucleico en condiciones de temperatura adecuadas y fuerza ionica de la

10 solucion (vease Sambrook y col., anteriormente). Las condiciones de temperatura y fuerza ionica determinan la "astringencia" de la hibridacion. Las condiciones de hibridacion de baja rigurosidad corresponden a una Tm de 55 °C, por ejemplo, SSC 5x, SDS al 0,1 %, leche al 0,25 % y sin formamida; o formamida al 30 %, SSC 5x, SDS al 0,5 %). Las condiciones de hibridacion de astringencia moderada corresponden a una Tm mas alta (aproximadamente 60 °C), por ejemplo, formamida al 40 %, con SSC 5x o 6x. Las condiciones de hibridacion de alta astringencia

15 corresponden a la Tm mas alta (superior o igual a aproximadamente 65 °C), por ejemplo, formamida al 50 %, SSC 5x o 6x. La hibridacion requiere que ambas moleculas de acido nucleico contengan secuencias complementarias, aunque en funcion de la astringencia de la hibridacion son posibles las discordancias entre las bases. La astringencia apropiada para la hibridacion de las moleculas de acido nucleico depende de la longitud de las moleculas de acido nucleico y del grado de complementacion, variables bien conocidas por los expertos en la

20 tecnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homologla entre dos secuencias de nucleotidos, mayor es el valor de la Tm para los hlbridos de moleculas de acido nucleico que tienen estas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a una Tm superior) de hibridaciones de acido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN:ARN, ADN:ARN, ADN:ADN. Para hlbridos con una longitud de mas de 100 nucleotidos, se derivaron las ecuaciones para calcular la Tm (vease Sambrook y col., anteriormente, 9,50-0,51). Para la hibridacion con moleculas de acido

25 nucleico mas cortas, es decir, oligonucleotidos, la posicion de los desapareamientos se vuelve mas significativa, y la longitud del oligonucleotido determina su especificidad (vease Sambrook y col., anteriormente, 11,7-11,8). Preferentemente, una longitud minima para una molecula de acido nucleico que puede hibridarse es de al menos aproximadamente 10 nucleotidos; preferentemente, al menos aproximadamente 10 nucleotidos; y mas preferentemente, la longitud es de al menos aproximadamente 50 nucleotidos; aun mas preferentemente de al

30 menos 100 nucleotidos; incluso mas preferentemente de al menos 1000 nucleotidos.

[0019] El termino "condiciones de hibridacion especlficas" designa una Tm de 55 °C y usa las condiciones descritas anteriormente. En una realization preferida, la Tm es igual a 60 °C, en una realization incluso mas preferida, la Tm es igual a 65 °C.

35

[0020] Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN bicatenario que se transcribe y se traduce en un polipeptido in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Las fronteras de la secuencia codificante se determinan por un codon de inicio en el extremo 5' (amino) y por un codon de detention de la traduction en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificante puede incluir, sin limitation,

40 secuencias procariotas, ADNc procedente de ARNm eucariota, secuencias de ADN genomico de ADN eucariota (por ejemplo, de mamlferos) e incluso secuencias de ADN sinteticas. Si la secuencia codificante esta destinada a la expresion en una celula eucariota, una senal de poliadenilacion y una secuencia de termination de la transcription generalmente se localizaran 3' de la secuencia codificante.

45 [0021] Las secuencias para controlar la transcripcion y la traduccion son secuencias reguladoras del ADN,

tales como promotores, activadores, terminadores y otras secuencias similares, que permiten la expresion de una secuencia codificante en una celula huesped. En las celulas eucariotas, las senales de poliadenilacion son secuencias de control.

50 [0022] Una "secuencia promotora" es una region reguladora del ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa

en una celula y de iniciar la transcripcion de una secuencia codificante hacia la portion aguas abajo (direction 3'). En los objetivos que definen la presente invention, la secuencia promotora esta unida a su extremo 3' por el sitio de

inicio de la transcripcion y se extiende aguas arriba (direccion 5') mientras incluye el numero mlnimo de bases o elementos requeridos para iniciar la transcripcion a niveles detectables con respecto al ruido de fondo. En la secuencia promotora, se encuentra un sitio de inicio de la transcripcion (convenientemente definido, por ejemplo, por mapeo con la nucleasa S1), as! como dominios para unirse a protelnas (secuencias consenso) responsables de la 5 union de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo contienen, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT".

[0023] Una secuencia codificante esta "bajo el control" de secuencias de control de la transcripcion y la traduccion en una celula, cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm que luego se

10 traduce en una protelna codificada por la secuencia codificante.

[0024] Se puede incluir una "secuencia senal" antes de la secuencia codificante. Esta secuencia codifica un peptido senal, en la posicion N-terminal de la protelna, que ordena a la celula huesped transportar la protelna sobre la superficie celular o secretar la protelna en el medio, y este peptido senal generalmente se degrada de forma

15 selectiva por la celula despues de la exportacion. Las secuencias senal se pueden encontrar asociadas con diversas protelnas nativas de procariotas y eucariotas. Preferentemente, la secuencia senal consiste en o comprende la secuencia 5'-

ATGTCTTCTGCTGCGGTTGCTATGCTGGCTGACCCGACTGTCCAGATCGCTCTGGCGTGCCTGGTGGTGTCTCT CTTCGTTGTGCTGCAGTCGGTCAAAAAG-3' (SEQ ID NO:5). Preferentemente, la secuencia senal codifica el 20 peptido senal de la secuencia MSSAAVAMLADPTVQIALACLVVSLFVVLQSVKK (SEQ ID NO: 6).

[0025] Tambien se puede incluir una "secuencia etiqueta" (o "etiqueta") antes o despues de la secuencia codificante. Esta secuencia generalmente codifica una repeticion de histidina, en la posicion N-terminal de la protelna, y permite la purificacion de la protelna. Preferentemente, la secuencia etiqueta se coloca antes de la

25 secuencia codificante, y codifica la secuencia de seis histidinas SEQ ID NO: 7 (HHHHHH), la secuencia etiqueta puede tener, por lo tanto, como secuencia nucleotldica, la secuencia SEQ ID NO: 8 (5'-CAYCAYCAYCAYCAYCAY- 3'). Todavla mas preferentemente, la secuencia etiqueta tiene, para una secuencia de aminoacidos, la secuencia MRGSHHHHHHGS (SEQ ID NO: 9). La secuencia nucleotldica correspondiente a la secuencia etiqueta que codifica la secuencia SEQ ID NO: 9 puede ser la secuencia 5'-ATGCGCGGCAGCCATCATCATCATCATCATGGCAGC-3' 30 (SEQ ID NO: 10).

[0026] En una realizacion particularmente preferida, el acido nucleico segun la invencion codifica una PKSIII capaz de sintetizar floroglucinol a partir de malonil-CoA solo o en combinacion con otros sustratos, por ejemplo, acetil-CoA, hexanoil-CoA, decanoil-CoA, lauroil-CoA, o palmitoil-CoA.

35

[0027] La invencion tambien se refiere a una protelna codificada por un acido nucleico aislado segun la invencion. Preferentemente, dicha protelna esta codificada por un acido nucleico que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. Todavla mas preferentemente, dicha protelna consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3. Como alternativa, dicha protelna consiste en una secuencia que tiene al menos un 93 % de

40 identidad, preferentemente al menos un 95 % de identidad, o aun mas preferentemente un 99 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

[0028] Preferentemente, dicha protelna es una PKSIII capaz de sintetizar floroglucinol a partir de malonil-CoA solo o en combinacion con otros sustratos, por ejemplo, acetil-CoA, hexanoil-CoA, decanoil-CoA, lauroil-CoA, o

45 palmitoil-CoA.

[0029] Por una secuencia al menos un 93 % identica a una secuencia de referencia, se entiende que la secuencia es identica a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia puede incluir hasta siete alteraciones de aminoacidos por cada 100 aminoacidos de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una

50 secuencia al menos un 93 % identica a la secuencia de referencia, hasta el 7 % de los aminoacidos de la secuencia pueden insertarse, eliminarse o sustituirse con otro aminoacido. Preferentemente, la secuencia al menos un 93 % identica es una secuencia homologa a la secuencia de referencia, es decir, difiere de la secuencia de referencia en una o mas sustituciones conservativas.

55 [0030] El porcentaje de identidad puede calcularse produciendo un alineamiento global de pares basado en el

algoritmo de alineamiento Needleman-Wunsch para encontrar el alineamiento optico (incluyendo "espacios" o "huecos") entre dos secuencias en toda su longitud, por ejemplo, usando Needle, y usando la matriz BLOSUM62 con una penalizacion de insercion de "huecos" de 10 y una penalizacion de extension de "huecos" de 0,5.

[0031] Por "sustituciones conservatives", se entiende el reemplazo de un aminoacido por otro, sin alterar la

conformacion y la funcion de la protelna, incluyendo, pero sin limitation, el reemplazo de un aminoacido por otro aminoacido que tiene las mismas propiedades (tales como, por ejemplo, las mismas polaridades, potenciales de union a hidrogeno, propiedades acidas, basicas, hidrofobas, aromaticas, y similares). Los aminoacidos que tienen 5 las mismas propiedades se conocen por un experto en la tecnica. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina son aminoacidos hidrofilos basicos que pueden ser intercambiables. De manera similar, la isoleucina, un aminoacido hidrofilo, puede reemplazarse con leucina, metionina o valina. Los aminoacidos hidrofilos neutros que pueden estar sustituidos entre si, incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina.

10 [0032] Por "sustituido" o "modificado", la presente invention incluye los aminoacidos que se han alterado o

modificado a partir de aminoacidos naturales.

[0033] Por lo tanto, debe entenderse que dentro del contexto de la invencion se reconoce una sustitucion conservativa en el estado de la tecnica como una sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido que tenga las

15 mismas propiedades.

[0034] Se proporcionan ejemplos de sustituciones conservativas en la Tabla 1 a continuation:

Tabla 1: Sustituciones conservativas I

Caracterlsticas de la cadena lateral

Aminoacido

No polar

G A P I L V

Polar no cargado

C S T M N Q

Polar cargado

D E K R

Aromatico

H F W Y

Otros

N Q D E

20

[0035] Como alternativa, los aminoacidos pueden agruparse como se describe por Lehninger (1975,

Biochemistry, Segunda Edition, Worth Publishers, Inc. Nueva York: NY., pags. 71-77), como se describe en la Tabla 2 a continuacion:

25 Tabla 2: Sustituciones conservativas II

Caracterlsticas de la cadena lateral

Aminoacido

No polar

Alifatico A L I V P

Aromatico

F W

Contiene azufre

M

Caso especial

G

Polar no cargado

Hidroxilo S T Y

Amidas

N Q

Sulfhidrilo

C

Caso especial

G

Cargado positivamente (basico)

K R H

Cargado negativamente (acido)

D E

[0036] En otra alternativa, se dan ejemplos de sustituciones conservativas en la Tabla 3 a continuacion:

Tabla 3: Sustituciones conservativas III

Residuo original

Ejemplo de sustitucion

A

V L I

R

K Q N

N

Q H K R

D

E

C

S

G

N

E

D

H

N Q K R

I

L V M A F

L

I V M A F

K

R Q N

M

L F I

F

L V I A

P

G

S

T

T

S

W

Y

Y

W F T S

V

I L M F A

[0037] La invencion tambien se refiere a un vector que comprende un acido nucleico segun la invencion, en el que dicho acido nucleico se coloca bajo el control de senales (es decir, un promotor, un terminador y/o un potenciador) que permiten la expresion del acido nucleico segun la invencion. El vector puede comprender ademas

5 un gen para resistencia a un antibiotico, tal como ampicilina o kanamicina.

[0038] El termino de "vector" designa un elemento extracromosomico que puede portar un gen no esencial para el metabolismo celular, y que generalmente es un ADN circular bicatenario. El elemento extracromosomico puede ser una secuencia autorreplicante, una secuencia de fago o una secuencia nucleotldica, un ADN o ARN

10 monocatenario o bicatenario, un plasmido, un cosmido. Generalmente, un vector contiene secuencias reguladoras de la transcripcion o la traduccion, un marcador de seleccion o una secuencia que permite la autorreplicacion o una insercion cromosomica. Un vector adecuado incluye la region 5' de un gen que regula el inicio de la transcripcion (es decir, un promotor) y una region 3' que controla la terminacion de la transcripcion (es decir, un terminador). El promotor puede ser, por ejemplo, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, 15 LEU2, ENO, TPI, lac, trp, APl, APr, T7, tac, el bacteriofago T5 o trc. El terminador se puede derivar de muchos genes de una celula huesped preferida y opcionalmente se puede omitir. Preferentemente, el vector es un plasmido pQE-80L (Qiagen) que contiene el promotor del bacteriofago T5 que puede inducirse por isopropil-p-D- tiogalactopiranosido (IPTG).

20 [0039] Los acidos nucleicos y/o el vector segun la invencion pueden usarse para transformar una celula o un

organismo huesped, es decir, para expresar o producir una protelna segun la invencion.

[0040] Por lo tanto, otro aspecto de la invencion se refiere a un huesped o una celula huesped que contiene

un acido nucleico o un vector segun la invencion, o que expresa (o es capaz de expresar en las condiciones 25 apropiadas) una protelna segun la invencion. Los expertos en la tecnica conocen huespedes y celulas huesped adecuados y pueden ser, por ejemplo, cualquier hongo, celula o llnea celular eucariota o procariota, organismos eucariotas o procariotas. Por ejemplo, el huesped o la celula huesped puede ser (i) una cepa bacteriana, incluyendo, sin limitacion, las llneas de bacterias Gram-negativas tales como llneas de Escherichia, por ejemplo, Escherichia coli; de Proteus, por ejemplo, Proteus mirabilis; de Pseudomonas, por ejemplo, Pseudomonas fluorescens; y cepas 30 de bacterias gran-positivas tales como las llneas de Bacillus, por ejemplo, Bacillus subtilis o Bacillus brevis; de Streptomyces, por ejemplo, Streptomyces lividans; de Staphylococcus, por ejemplo, de Staphylococcus carnosus; y Lactococcus, por ejemplo, Lactococcus lactis; (ii) una celula fungica, que incluye, sin limitacion, celulas de la especie Trichoderma, por ejemplo, Trichoderma reesei; Neurospora, por ejemplo, Neurospora crassa; Sordaria, por ejemplo, Sordaria macrospore; Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger o Aspergillus sojae; u otros hongos filamentosos; 35 (iii) una levadura, incluyendo, sin limitacion, celulas de la especie Saccharomyces, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae; Schizosaccharomyces, por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe; Pichia, por ejemplo, Pichia pastoris o Pichia methanolica; Hansenula, por ejemplo, Hansenula polymorpha; Kluyveromyces, por ejemplo, Kluyveromyces lactis; Arxula, por ejemplo, Arxula adeninivorans; Yarrowia, por ejemplo, Yarrowia lipolytica; (iv) una celula o llnea celular de anfibio, tal como ovocitos de Xenopus; (v) una celula o llnea celular de insecto, tal como las llneas SF9 o 40 Sf21; (vi) una planta o una celula vegetal, por ejemplo, una planta de tabaco; y/o (vii) una celula o llnea celular de mamlfero, incluyendo, sin limitacion, celulas CHO, BHK, HeLa, COS (es decir, COS-7) y PER.C6. Preferentemente, la celula huesped es una bacteria del tipo Escherichia coli, y mas preferentemente la celula huesped es la cepa E. coli BL21-Codin Plus-RI LP (Stratagene).

45 [0041] Otro aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para producir una policetido sintasa, que

comprende las etapas de:

a) cultivar una celula huesped segun la reivindicacion 13, en condiciones que permitan la expresion de una policetido sintasa recombinante,

b) extraer y/o purificar dicha policetido sintasa recombinante.

[0042] El procedimiento comprende ademas una etapa para transformar una celula huesped con la ayuda de un vector recombinante se ha definido anteriormente antes de la etapa a). Por consiguiente, el procedimiento segun

5 la invencion puede comprender las etapas de:

a0) transformar una celula huesped por medio de un vector como se ha definido anteriormente;

a) cultivar dicha celula transformada en condiciones que permitan la expresion de una policetido sintasa

recombinante,

10 b) extraer y/o purificar dicha policetido sintasa recombinante.

[0043] La transformacion en la etapa a0) se puede realizar por procedimientos conocidos por un experto en la tecnica, por ejemplo, mediante transfeccion, electroporacion, electrotransferencia, microinyeccion, transduccion, fusion de celulas, DEAE-dextrano, precipitacion con fosfato de calcio, lipofeccion, uso de una pistola de genes, o un

15 vehlculo de vector de ADN (vease, por ejemplo, Wu y col., 1992, J. Biol Chem. 267:963-967 ; Wu y col., 1988, J. Biol Chem. 263:14621-14624 ; Hartmut y col., solicitud de patente canadiense N.° 2 012 311, publicada el 15 de marzo de 1990). Preferentemente, la transformacion en la etapa a0) se realiza por choque termico sobre las celulas hechas qulmicamente competentes, en un medio de cultivo adecuado. Preferentemente, el choque termico se realiza entre 35 °C y 50 °C durante 30 segundos a 1 minuto seguido de un retorno al hielo durante 1 a 3 minutos. Aun mas 20 preferentemente, el choque termico se realiza a 42 °C durante 45 segundos seguido de un retorno al hielo durante 2 minutos. Por medio de cultivo adecuado, se entiende un medio de cultivo que permite el crecimiento de celulas transformadas. Tal medio de cultivo es conocido por un experto en la tecnica. Por ejemplo, este es un medio que incluye, sin limitacion, un sustrato carbonoso o una fuente de carbono que puede metabolizarse por la celula transformada. El sustrato carbonoso o la fuente de carbono se puede seleccionar de monosacaridos, oligosacaridos, 25 polisacaridos, sustratos de carbono simple y una mezcla de estos compuestos. Opcionalmente, el medio de cultivo contiene un antibiotico, tal como ampicilina o kanamicina.

[0044] Preferentemente, la celula transformada en la etapa a0) es una bacteria del tipo E. coli tal como la cepa E. coli BL21-CodinPlus-RILP (Stratagene), transformada con un vector y/o un acido nucleico segun el

30 invencion, y se cultiva usando un medio adecuado, tal como el medio caldo Luria (LB), que contiene preferentemente al menos 100 pg/ml de ampicilina.

[0045] El cultivo realizado en la etapa a) tiene el proposito de permitir la expresion de la policetido sintasa recombinante. Se puede preparar mediante procedimientos conocidos por un experto en la tecnica, por ejemplo, por

35 medio de un biorreactor, tambien llamado fermentador. El biorreactor es un tanque sellado hermeticamente dotado de un sistema de agitacion, un sistema de ventilacion, con sondas utilizadas para medir diversos parametros (pH, temperatura, oxlgeno disuelto) y poros de alimentacion que permiten una dosificacion precisa de la composition del medio de cultivo durante la fermentation. La fermentation en el biorreactor se realiza en dos fases: una fase I de crecimiento durante la cual las celulas se dividen a una velocidad acelerada, y despues una fase II de acumulacion o 40 induction que conduce a la expresion de la protelna recombinante. Un experto en la tecnica es capaz de determinar las condiciones de cultivo adecuadas para permitir la fase I de crecimiento y la fase II de acumulacion o induccion. En una realization particular, las fases I y II pueden realizarse como se describe en el ejemplo 1.3.

[0046] La extraction y/o la purification en la etapa b) se realizar por medio de procedimientos conocidos por 45 un experto en la tecnica. Como modo de ejemplo no limitativo, la extraccion se puede lograr por lisis de las celulas

por medio de una prensa francesa, mediante sonicacion, o mediante una ruta enzimatica, o con cualquier otra tecnica estandar. La lisis de las celulas puede ir seguida de una etapa de filtration y/o centrifugation del lisado. A modo de ejemplo no limitativo, la purificacion se puede lograr por medio de cromatografla (en una columna de intercambio ionico, de afinidad o de separation por tamano), centrifugacion, solubilidad diferencial o mediante 50 cualquier otra tecnica estandar. En una realizacion particular, la extraccion y/o la purificacion se pueden lograr como se describe en el ejemplo 1.3.

[0047] Preferentemente, dicho procedimiento de production permite la production de al menos 1 mg/l a 20 mg/l de protelna pura, y aun preferentemente al menos de 5 a 10 mg/l de protelna pura.

55

Procedimiento para producir compuestos polifenolicos

[0048] Por lo tanto, los inventores han identificado que una policetido sintasa de tipo III (PKSIII) extralda de un alga parda era capaz de sintetizar floroglucinol y/o uno de sus derivados a partir de diversos sustratos

carbonosos, y mas particularmente de malonil-CoA.

[0049] Por lo tanto, la presente invencion describe un procedimiento para producir al menos un compuesto

polifenolico, en el que:

5

- una policetido sintasa de tipo III (PKSIII) de alga parda se pone en contacto con al menos un sustrato carbonoso en condiciones que permitan la produccion mayoritaria de al menos un compuesto polifenolico,

- dicho compuesto fenolico producido es floroglucinol y/o uno de sus derivados.

10 [0050] Por lo tanto, la presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para producir al menos un

compuesto polifenolico, en el que:

- una policetido sintasa de tipo III (PKSIII) de alga parda se pone en contacto con al menos un sustrato carbonoso en condiciones que permitan la produccion mayoritaria de al menos un compuesto polifenolico, caracterizado por que

15 dicha PKSIII comprende o consiste en:

- la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 1, o una secuencia que puede codificarse por la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 2, o

20 - la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 3, o una secuencia que puede codificarse por la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 4.

- dicho compuesto fenolico producido es floroglucinol o uno de sus derivados,

25 - dicho sustrato se selecciona de malonil-CoA, hexanoil-CoA, decanoil-CoA, lauroil-CoA y/o palmitoil-CoA.

[0051] Preferentemente, el procedimiento incluye una etapa de recuperacion de floroglucinol y/o uno de sus

derivados. Esta etapa de recuperacion puede comprender una etapa de extraccion y/o una etapa de purificacion.

30 [0052] Por "compuesto polifenolico", se entiende un compuesto derivado del metabolismo secundario del

reino vegetal, es decir, plantas terrestres y macrofitas acuaticas, que tienen al menos un anillo aromatico con 6 carbonos (fenol), que lleva una o mas funciones hidroxilo (OH). Se distinguen varias familias de moleculas, cuya estructura es relativamente estrecha: flavonoides (pigmentos vegetales de color amarillo anaranjado), antocianos (compuestos de color rojo a violeta responsables del color purpura de las uvas rojas) y taninos.

35

[0053] Por "policetido sintasa de tipo III", se entiende una enzima capaz de sintetizar floroglucinol y/o uno de sus derivados a partir de un sustrato carbonoso. Preferentemente, PKSIII se obtiene a partir de un alga parda marina, aun preferentemente, PKSIII se obtiene de un alga parda marina del genero Ectocarpus, y aun mas preferentemente, la PKSIII se deriva del alga parda marina Ectocarpus siliculosus.

40

[0054] En una realizacion preferida, PKSIII se produce mediante el procedimiento segun la invencion descrito anteriormente.

[0055] Segun un aspecto particular de la invencion, PKSIII comprende o consiste en una protelna segun la 45 invencion. Mas particularmente, la PKSIII comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o

una secuencia que tiene al menos un 93 %, 95 % o un 99 % de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

[0056] La secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 puede 50 diferir de la secuencia de referencia (es decir, SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3) por una o mas sustituciones

conservativas. El termino "sustituciones conservativas" es como se define anteriormente.

[0057] Segun un aspecto particularmente preferido, PKSIII consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

55

[0058] Segun otro aspecto particular de la invencion, dicha PKSIII comprende o consiste en una secuencia que puede codificarse mediante la secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, o un 99 % de identidad con SEQ ID NO: 2.

[0059] Segun otro aspecto particular de la invencion, dicha PKSIII comprende o consiste en una secuencia

que puede codificarse mediante la secuencia nucleotidica SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, o un 99 % de identidad con SEQ ID NO: 4.

5 [0060] La secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4 puede

diferir de la secuencia de referencia (es decir, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4) por una o mas sustituciones conservativas. El termino "sustituciones conservativas" es como se define anteriormente.

[0061] Por "substrato carbonoso", se entiende un compuesto utilizado como fuente de carbono. Por ejemplo, 10 el sustrato carbonoso incluye compuestos del tipo metabolito, tales como cadenas de carbono C1 a C18, acidos

grasos, mono-, di-, trigliceridos, polioles, fosfolipidos, fosfoacidos, monosacaridos, aminoacidos, nucleotidos, homo- o hetero-oligomeros o polimeros hidrolizables de estos compuestos, y las formas biologicamente activas de estos compuestos. Dichos metabolitos pueden ser de cualquier origen biologico o sintetico. Otros ejemplos de compuestos son compuestos C1-C18 aromaticos, alifaticos y cicloalifaticos.

15

[0062] Segun la invencion, el sustrato carbonoso se selecciona de malonil-CoA, acetil-CoA, hexanoil-CoA, decanoil-CoA, lauroil-CoA y/o palmitoil-CoA.

[0063] En una realizacion particularmente preferida, el sustrato carbonoso es malonil-CoA.

20

[0064] Por "floroglucinol", se entiende benceno-1,3,5-triol, numero CAS es 108-73-6.

[0065] Por "derivado de floroglucinol", se entienden particularmente los siguientes compuestos: acetil- floroglucinol, lauroil-floroglucinol, palmitoil-floroglucinol, hexanoil-floroglucinol, decanoil-floroglucinol.

25

[0066] En un aspecto particularmente preferido, el sustrato carbonoso es malonil-CoA y el compuesto fenolico producido consiste en o comprende floroglucinol.

[0067] En otro aspecto particularmente preferido, el sustrato carbonoso es malonil-CoA y acetil-CoA, y el 30 compuesto fenolico producido consiste en o comprende floroglucinol y acetil-floroglucinol.

[0068] En otro aspecto particularmente preferido, el sustrato carbonoso es malonil-CoA y lauroil-CoA, y el compuesto fenolico producido consiste en o comprende floroglucinol y lauroil-floroglucinol.

35 [0069] En otro aspecto particularmente preferido, el sustrato carbonoso es malonil-CoA y palmitoil-CoA, y el

compuesto fenolico producido consiste en o comprende floroglucinol y palmitoil-floroglucinol.

[0070] En otro aspecto particularmente preferido, el sustrato carbonoso es malonil-CoA y hexanoil-CoA, y el compuesto fenolico producido consiste en o comprende floroglucinol y hexanoil-floroglucinol.

40

[0071] En otro aspecto particularmente preferido, el sustrato carbonoso es malonil-CoA y decanoil-CoA, y el compuesto fenolico producido consiste en o comprende floroglucinol y decanoil-floroglucinol.

[0072] Por produccion mayoritaria de floroglucinol o uno de sus derivados, se entiende que el floroglucinol o 45 uno de sus derivados es el producto que se encuentra en la mayor concentration con respecto a los otros

compuestos producidos. Preferentemente, la produccion de floroglucinol o uno de sus derivados es de al menos el 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o el 100 %.

[0073] El experto en la tecnica conoce la etapa para poner la policetido sintasa en contacto con al menos un 50 sustrato carbonoso. Preferentemente, pero de una manera no limitativa, esta etapa se realiza como se describe en

los ejemplos 1.4 o 1.5. Mas particularmente, comprende las etapas de (i) poner la policetido sintasa en contacto con la fuente carbonosa en un medio adecuado, (ii) incubar la mezcla obtenida de este modo.

[0074] El medio adecuado en la etapa (i) puede ser un medio HCl-EDTA, cuyas concentraciones respectivas 55 estan comprendidas entre 30 y 70 mM de HCl y 0,5 y 2 mM de EDTA, comprende preferentemente entre 45 y 55 mM

de HCl y 0,8 y 1,2 mM de EDTA, incluso mas preferentemente, las concentraciones de HCl y EDTA son 50 mM y 1 mM, respectivamente. Preferentemente, el pH del medio esta comprendido entre 6 y 8, y aun preferentemente, el pH es de aproximadamente 7,5.

[0075] La incubacion (ii) se realiza preferentemente a temperatura ambiente, es decir, a una temperatura comprendida entre 20 °C y 30 °C, y durante una duracion comprendida entre 30 minutos y 8 horas. Aun preferentemente, la incubacion se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 22 °C y 28 °C, y todavla preferentemente la incubacion se lleva a cabo a aproximadamente 25 °C. Preferentemente, la incubacion se realiza

5 durante un tiempo comprendido entre 1 horas y 5 horas, y aun preferentemente la incubacion se realiza durante aproximadamente 1 h, 2 h, 3 h, 4 h o 5 h. En una realization particularmente preferida, la incubacion se lleva a cabo a aproximadamente 25 °C durante aproximadamente 1 h, 2 h, 3 h, 4 h o 5 h.

[0076] La etapa de extraction y/o purification puede llevarse a cabo con tecnicas conocidas por un experto 10 en la tecnica. Por ejemplo, la extraccion se puede lograr por medio de acetato de etilo. La etapa de purificacion

puede realizarse, por ejemplo, mediante cromatografla de capa fina (TLC) o por cromatografla de gases acoplada con espectrometrla de masas (GC-MS).

[0077] Los compuestos polifenolicos producidos por el procedimiento segun la invention, tales como el 15 floroglucinol y sus derivados, se pueden usar en muchas aplicaciones en los campos farmaceutico, nutraceutico,

cosmetico, agroalimentario o fitosanitario.

[0078] Por lo tanto, la invencion tambien se refiere a un procedimiento para producir un compuesto farmaceutico, nutraceutico, cosmetico, agroalimentario o fitosanitario, comprendiendo dicho procedimiento las etapas

20 de:

a) producir al menos un compuesto polifenolico mediante el procedimiento segun la invencion;

b) modificar opcionalmente dicho compuesto fenolico obtenido en la etapa a) para producir un compuesto farmaceutico, nutraceutico, cosmetico, agroalimentario o fitosanitario,

25 c) anadir un soporte, vehlculo, excipiente, diluyente y/o adyuvante que son aceptables para la aplicacion elegida.

[0079] La invencion tambien describe el uso de los compuestos polifenolicos producidos por el procedimiento segun la invencion para preparar composiciones farmaceuticas, nutraceuticas, cosmeticas, agroalimentarias o fitosanitarias.

30

[0080] La invencion describe tambien estas composiciones.

[0081] Mas particularmente, las composiciones farmaceuticas o nutraceuticas pueden contener soportes o similares (vehlculos, excipientes, diluyentes) y/o adyuvantes que son farmaceuticamente aceptables. Utilizado en el

35 presente documento, el termino "farmaceuticamente aceptable" significa preferentemente aprobado por un organo regulador del gobierno, en particular recomendado en la Farmacopea Americana o Europea, para un uso en animales, y mas particularmente en seres humanos. Los soportes farmaceuticos adecuados, o similares, se describen particularmente en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.

40 [0082] Estos soportes farmaceuticamente aceptables, o similares, pueden ser llquidos esteriles, tales como

agua y aceites, incluyendo llquidos derivados del petroleo, animales, plantas o de origen sintetico, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y otros aceites similares. El agua es un soporte preferido cuando la composition farmaceutica se administra por via intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol tambien pueden usarse como soportes llquidos, en particular para 45 soluciones inyectables. Los excipientes farmaceuticos adecuados comprenden manitol, albumina serica humana (HSA), almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sllice, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y otros excipientes similares. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, plldoras, capsulas, polvos, formulaciones de liberation prolongada 50 u otras formas similares.

[0083] Estas composiciones contendran una cantidad de diagnostico o terapeuticamente eficaz del compuesto activo con una cantidad adecuada del soporte o similar a fin de proporcionar una forma para una administracion adecuada al paciente. Aunque la inyeccion intravenosa es una forma de administracion altamente

55 eficiente, se pueden emplear otros modos, tal como una inyeccion, o administration oral, nasal o parenteral.

[0084] Mas particularmente, las composiciones cosmeticas pueden contener un vehlculo cosmeticamente aceptable. Por "vehlculo cosmeticamente aceptable", se entiende un vehlculo adecuado para su uso en contacto con celulas humanas y animales, en particular las celulas de la epidermis, sin ninguna toxicidad, irritation, respuesta

alergica inducida o similar, y en proporcion con una relacion beneficio/riesgo razonable. Como ejemplo de un vehlculo cosmeticamente aceptable, se puede mencionar especialmente agua, en particular agua destilada.

[0085] Las composiciones cosmeticas descritas pueden comprender adicionalmente cualquier aditivo usado 5 habitualmente en el campo cosmetico, tal como agentes secuestrantes, antioxidantes, conservantes, cargas,

electrolitos, humectantes, agentes colorantes, bases o acidos habituales, minerales u organicos, perfumes, aceites esenciales, activos cosmeticos, humectantes, vitaminas, acidos grasos esenciales, esfingollpidos, compuestos autobronceadores, agentes suavizantes y protectores de la piel. Por supuesto, un experto en la tecnica se asegurara de seleccionar este o estos compuestos complementarios opcionales y/o su cantidad, de manera que las 10 propiedades ventajosas de la composicion descrita no se alteren, o sustancialmente no se alteren. Estos aditivos pueden estar presentes en la composicion en una razon del 0,001 % al 20 % en peso con respecto al peso total de la composicion.

[0086] De forma conocida, las composiciones cosmeticas descritas pueden contener adyuvantes habituales 15 en el campo cosmetico o dermatologico, tales como emulsionantes, gelificantes hidrofilos o lipofilos, activos hidrofilos

o lipofilos, conservantes, antioxidantes, perfumes, cargas, filtros y materiales colorantes. Las cantidades de estos diferentes adyuvantes son las utilizadas convencionalmente en los campos cosmetico y/o dermatologico y, por ejemplo, son del 0,01 % al 20 % del peso total de la composicion. Estos adyuvantes, dependiendo de su naturaleza, pueden introducirse en la fase grasa, en la fase acuosa y/o en las veslculas lipldicas.

20

[0087] La aplicacion de una composicion cosmetica se lleva a cabo a traves de una ruta topica sobre la piel, que comprende las mucosas, especialmente los labios o faneras. La aplicacion de una composicion cosmetica tambien se puede llevar a cabo mediante inyeccion intradermica.

25 [0088] Las composiciones cosmeticas pueden aparecer en todas las formas galenicas normalmente usadas

para aplicacion topica, en forma de unguento, crema, aceite, leche, pomada, polvo, hisopo, solucion, gel, aerosol, locion, suspension, jabon.

[0089] Las composiciones pueden ser composiciones cosmeticas en forma de una emulsion de aceite en 30 agua o agua en aceite, o una emulsion multiple, una microemulsion, un gel de hidroalcohol, una crema, un aceite,

una locion hidroalcoholica.

[0090] Las composiciones cosmeticas son particularmente utiles para humedecer, suavizar, reparar y/o proteger la piel.

35

[0091] Estas composiciones cosmeticas tambien son particularmente ventajosas para controlar el envejecimiento de la piel, es decir, particularmente el fenomeno de arrugas, perdida de tonicidad y elasticidad debido a modificaciones estructurales de la piel debidas al envejecimiento.

40 [0092] Las composiciones cosmeticas descritas tambien son utiles para proteger la piel de las agresiones

exteriores, tales como, particularmente, los rayos ultravioleta o la contaminacion del aire.

[0093] Las composiciones fitosanitarias descritas pueden comprender ademas uno o mas tensioactivos, conservantes, dispersantes, humectantes, emulsionantes, antiespumantes, agua.

45

[0094] Las composiciones fitosanitarias descritas pueden formularse en diferentes formas, por ejemplo, en forma de polvos humectables, granulos dispersables, suspensiones concentradas, polvos para pulverizacion.

[0095] La invencion describe tambien el uso de floroglucinol y/o uno o mas de sus derivados producidos por 50 el procedimiento segun la invencion para tratar trastornos espasmodicos, enfermedades virales, enfermedades

parasitarias, enfermedades microbianas, enfermedades fungicas, trastornos dermatologicos, hipertension, osteoporosis, enfermedades inflamatorias, enfermedades vasculares, trastornos sexuales, canceres, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, depresion y alergia.

55 [0096] La invencion tambien describe procedimientos para tratar trastornos espasmodicos, enfermedades

virales, enfermedades parasitarias, enfermedades microbianas, enfermedades fungicas, trastornos dermatologicos, hipertension, osteoporosis, enfermedades inflamatorias, enfermedades vasculares, trastornos sexuales, canceres, diabetes, enfermedades neurodegenerativas, depresion y alergia, que comprenden la administracion de floroglucinol y/o uno o mas de sus derivados a un paciente que lo necesita.

[0097] Los trastornos espasmodicos pueden comprender particularmente problemas funcionales del tracto digestivo (colitis) y de los conductos biliares, colicos renales o hepaticos, dolores ginecologicos y contracciones durante el embarazo.

5

[0098] Las enfermedades virales pueden comprender, en particular, infecciones por el virus de la inmunodeficiencia humana adquirida (VIH) y por el virus del herpes.

[0099] Las enfermedades parasitarias pueden comprender particularmente malaria.

10

[0100] Las enfermedades microbianas pueden comprender particularmente infecciones debidas a bacterias Gram-negativas o Gram-positivas, y mas particularmente a bacterias de los tipos Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus.

15 [0101] Las enfermedades fungicas pueden comprender notablemente infecciones debidas a Aspergillus

niger, Aspergillus flavus, Mucor y Cladosporium.

[0102] Los trastornos dermatologicos pueden comprender particularmente psoriasis, alopecia cutanea, problemas de curacion de cicatrizacion y el envejecimiento de la piel, es decir, particularmente el fenomeno de

20 arrugas, perdida de tonicidad y elasticidad debido a modificaciones estructurales de la piel debidas al envejecimiento.

[0103] Las enfermedades vasculares pueden comprender particularmente la enfermedad de Raynaud y la acrocianosis.

25

[0104] Las enfermedades neurodegenerativas pueden comprender particularmente enfermedad de Alzheimer, slndrome de Kiloh Nevin, el slndrome del tunel carpiano, paralisis de Tardy Ulnar, slndrome del canal de Guyon.

30 [0105] Los trastornos sexuales pueden comprender particularmente trastornos de la ereccion.

[0106] El floroglucinol o sus derivados se pueden usar en solitario o junto con otros compuestos que tengan

una actividad terapeutica para tratar los trastornos mencionados anteriormente.

35 [0107] La invencion se explicara con mas detalle por los siguientes ejemplos, sin limitar el alcance de los

mismos.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS 40 [0108]

Figura 1. La Figura 1 representa el vector de expresion pQE-80L (Qiagen) que contiene el promotor del bacteriofago T5 inducible por isopropil-b-D-tiogalactopiranosido (IPTG) utilizado para la expresion de la protelna PKS1.

Figura 2. La Figura 2 representa el analisis de espectrometrla de masas de la protelna PKS1 recombinante 45 purificada de E. siliculosus.

Figura 3. La Figura 3 representa el analisis de cromatografla en capa fina de los productos formados durante la reaccion enzimatica utilizando los diferentes sustratos a continuacion: malonilCoA en solitario, malonilCoA + acetil- CoA, malonilCoA + hexanoil-CoA, malonilCoA + lauroil-CoA, malonilCoA + palmitoil-CoA y malonilCoA + decanoil- CoA.

50 Figura 4. La Figura 4 representa el analisis de espectrometrla de masas GC-MS de los productos formados durante la reaccion enzimatica utilizando los diferentes sustratos a continuacion: malonilCoA en solitario, malonilCoA + acetil- CoA, malonilCoA + hexanoil-CoA, malonilCoA + lauroil-CoA, malonilCoA + palmitoil-CoA y malonilCoA + decanoil- CoA.

Figura 5. La Figura 5 representa el analisis de espectrometrla de masas GC-MS de los productos formados durante 55 la reaccion enzimatica utilizando los diferentes sustratos a continuacion: malonilCoA en solitario, malonilCoA + acetil- CoA, malonilCoA + hexanoil-CoA, malonilCoA + lauroil-CoA, malonilCoA + palmitoil-CoA y malonilCoA + decanoil- CoA.

Figura 6. La Figura 6 representa el analisis de espectrometrla de masas LC-MS de los productos formados durante la reaccion enzimatica utilizando malonilCoA en solitario o malonilCoA + acetil-CoA. 1: Control negativo, 2: Protelna

desnaturalizada, 3: Malonil-CoA, 4: Acetil-CoA, 5: Lauroil-CoA, 6: Palmitoil-CoA, 7: Hexanoil-CoA, 8: Decanoil-CoA. Parametros NL: 2.10E4, m/z: 307.1877-307.1939, MS bl.

Figura 7. La Figura 7 representa el analisis de espectrometrla de masas LC-MS de los productos formados durante la reaccion enzimatica utilizando como sustrato malonilCoA y lauroil-CoA. 1: Control negativo, 2: Protelna 5 desnaturalizada, 3: Malonil-CoA, 4: Acetil-CoA, 5: Lauroil-CoA, 6: Palmitoil-CoA, 7: Hexanoil-CoA, 8: Decanoil-CoA.

Ejemplos

EJEMPLO 1: Material, metodos y procedimientos experimentales

10

1.1. Productos qmmicos

[0109] Los compuestos malonil-CoA, acetil-CoA, hexanoil-CoA, lauroil-CoA, palmitoil-CoA y decanoil-CoA son de Sigma. [2'14C] Malonil-CoA (55 mCi/mmol) es de Perkin Elmer (Estados Unidos).

15

1.2. Cepa bacteriana

[0110] La cepa Escherichia coli DH5a [fhuA2 _(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 080 _(lacZ)M15 gyrA96 recA1 relAI endA1 thi-1 hsdR17] (Stratagene) se uso como cepa huesped para el mantenimiento de plasmidos. Para la

20 expresion de protelnas, los derivados pQE-80L "reprimidos en cis" se transformaron en la cepa E. coli BL21 (DE3) codon Plus RILP [E. coli B F- ompT hsdS(rB- mB-) dcm+ Tetr gal I (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr]] (Stratagene) que contenla las copias complementarias de ARNt arginina, isoleucina, prolina y leucina.

1.3. Expresion y purificacion de la policetido sintasa de tipo III recombinante de Ectocarpus siliculosus

25

[0111] El gen codificante de la PKS1 de E. siliculosus se amplifico por PCR (30 ciclos de amplificacion) a partir del ADNc descrito en Cock y col., 2010, Nature 465(7298): 617-621. El vector de expresion pQE-80L (Qiagen) que contenla el promotor del bacteriofago T5 inducible por isopropil-b-D-tiogalactopiranosido (IPTG) se uso para la expresion de la protelna (Figura 1). La PKS1 E. siliculosus se clono en el vector en los sitios de restriccion SphI y

30 HindIII utilizando los oligonucleotidos PQECHSFowBis (5'-

GGCGGATCCGCATGCATGTCCAAGGACGAGCAGACGGTATACCCGGTCATCGCC-3'(SEQ ID NO: 11)) y PQECHSRev (5'-GGCTAAGCTTTTACTAGATCTGCCTGAGAAGGATGCCCTCTGCCCC-3' (SEQ ID NO: 12)). Las condiciones de PCR utilizadas para la clonacion son las siguientes: 50 ng de ADNc PKS1, 0,4 pM de cada oligonucleotido, mezcla de dNTP 0,4 mM en un medio de reaccion de 50 pl con la enzima Phusion (Finnzyme) con 35 su tampon HF segun las recomendaciones del proveedor. La reaccion se realizo en 3 etapas: desnaturalizacion del ADN y de los cebadores a 98 °C durante 5 minutos, 30 ciclos de PCR a 98 °C durante 30 s, 52 °C durante 30 s, 72 °C durante 2 min y luego finalmente una etapa del fin de la elongacion a 72 °C durante 7 minutos. Se llevo a cabo una etapa complementaria que consistla en anadir dA a los extremos del fragmento de la PCR durante 10 min a 72 °C con la adicion de 0,5 pl de la enzima GoTaq (Promega). El fragmento de ADN amplificado se purifica 40 directamente en una columna MinElute (Qiagen). La ligacion se realiza en una primera fase en pGEM-Teasy (Promega) segun condiciones estandar (una noche a temperatura ambiente en un medio de reaccion de 12 pl que contiene una relacion 10/1 del producto clonar/vector con la ADN ligasa T4 del kit Promega). El producto de ligacion se introduce mediante un choque termico en las celulas competentes DHSalpha preparadas en el laboratorio, y se selecciona un transformante para la produccion en masa de un vector recombinante que contiene el inserto PKS1. El 45 plasmido se purifica con el kit Miniprep SV (Promega). Despues de verificar la secuencia nucleotldica de PKS1, el inserto es digerido por SphI y HindIII, y luego se purifica en gel de agarosa con el kit MinElute (Qiagen) antes de ligarse al vector pQE80L (Qiagen) doblemente digerido con las mismas enzimas de restriccion y desfosforilado por SAP (NE Biolabs). Las condiciones de ligacion en pQE80L son las mismas que las descritas anteriormente.

50 [0112] Las construcciones codifican una protelna total a la que se anadio una etiqueta de seis histidinas

(etiqueta His) en su extremo N-terminal. Las construcciones se transformaron en la cepa E. coli BL21-CodonPlus- RILP (Stratagene) utilizando un medio LB solido que contenla 100 pg/ml de ampicilina. La expresion de la protelna recombinante se logro cultivando las bacterias en un medio ZYP a 20 °C usando un lote de fermentador de 5 l. Despues de 48 horas de cultivo, la induccion de la expresion de la protelna se continua anadiendo 0,5 mM de IPTG. 55 Despues de esta ultima induccion, las celulas se recogen por centrifugacion y se congelan a -80 °C.

[0113] Las celulas se vuelven a suspender en el medio A (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 300 mM e Imidazol

50 mM) complementado con una mezcla de inhibidor de proteasa, de lisozima (1 mg/ml) y DNasa (10 mg/ml). La lisis de las celulas se lleva a cabo luego con dos pases en una prensa francesa para reducir la viscosidad del

sobrenadante. Los desechos celulares se eliminan por centrifugacion a 20.000 rpm a 4 °C durante 1 h y 30 min. El sobrenadante se transfiere entonces a una columna de Ni-Sepharose (GE Healthcare). El extracto celular se fracciona luego mediante cromatografla de afinidad, denominada "IMAC" (cromatografla de afinidad de metal inmovilizado) en un aparato AKTA™-Avant (GE Healthcare). Despues de una etapa de lavado con un tampon A 5 (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 50 mM), las protelnas se eluyen segun un protocolo de gradiente de 50 mM a 500 mM de imidazol mezclando el tampon A con el tampon B (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM). Las fracciones C12 a E10 se concentraron entonces a 5 ml mediante ultrafiltracion en CentriPrep de 10 kDa (Millipore) y se intercambiaron simultaneamente en un tampon que contenla Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 NaCl 100 mM.

10

[0114] Las protelnas se transfirieron despues a una columna de filtracion sobre gel Superdex S-200 HR 16/60 (GE Healthcare) y se purificaron mediante cromatografla de exclusion esterica usando un aparato AKTA-Avant (GE Healthcare). La pureza y la integridad de todas las muestras de protelnas se analizaron mediante electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida al 12 % y mediante espectrometrla de masas MALDI-TOF.

15

1.4. Ensayos enzimaticos (cromatografla de capa fina (TLC))

[0115] Las pruebas enzimaticas se realizaron usando:

20 - a) malonil-CoA en solitario: Se anadieron 200 pM de malonil-CoA a la mezcla de ensayo que contenla 20 pM de malonil-CoA radiomarcada con [2'14C] (55 mCi/mmol), 50 pg de la enzima recombinante purificada PKS1 de E. siliculosus, en un volumen final de 500 pl de Tris HCI 50 mM pH 7,5 y 1 mM de EDTA, o

- b) los cinco substratos siguientes: acetil-CoA, hexanoil-CoA, lauroil-CoA, palmitoil-CoA y decanoil-CoA. Se anadieron 200 pM de cada sustrato a la mezcla de ensayo que contenla 20 pM de malonil-CoA radiomarcada con [225 14C] (55 mCi/mmol), 50 pg de la enzima recombinante purificada PKS1 de E. siliculosus, en un volumen final de 500

pl de Tris HCI 50 mM pH 7,5 y 1 mM de EDTA.

[0116] La incubacion de las mezclas en a) y b) se llevo a cabo a temperatura ambiente durante 1 h o 3 h y se detuvo mediante la adicion de HCl al 37 %. Los productos de las reacciones se extrajeron despues con 1 ml de

30 acetato de etilo y se separaron por cromatografla en capa fina (Merck Art. 1.11798 Gel de sllice 60 F254; acetato de etilo/hexano/AcOH, 65: 25: 5, v/v/v).

[0117] Las senales radiactivas se detectaron y se cuantificaron por medio de un sistema de formacion de imagenes Typhoon (Molecular Dynamics-GE Healthcare).

35

1.5. Ensayos enzimaticos (espectrometrfa de masas combinada con cromatografla de gases (GC-MS))

[0118] Las pruebas enzimaticas se realizaron usando:

40 - a) malonil-CoA en solitario: Se anadieron 200 pM de malonil-CoA a la mezcla de ensayo que contenla 50 pg de enzima recombinante purificada PKS1 de E. siliculosus, en un volumen final de 500 pl de Tris HCI 50 mM pH 7,5 y 1 mM de EDTA, o

- b) los cinco substratos siguientes: acetil-CoA, hexanoil-CoA, lauroil-CoA, palmitoil-CoA y decanoil-CoA. Se anadieron 200 pM de cada sustrato a la mezcla de ensayo que contenla 20 pM de malonil-CoA, 50 pg de la enzima

45 recombinante purificada PKS1 de E. siliculosus, en un volumen final de 500 pl de Tris HCI 50 mM pH 7,5 y 1 mM de EDTA.

[0119] La incubacion de las mezclas en a) y b) se llevo a cabo a temperatura ambiente durante 1, 2, 3, 4, o 5 h y se detuvo mediante la adicion de HCl al 37 %. Los productos de las reacciones se extrajeron a continuacion con

50 1 ml de acetato de etilo. Se anadieron 2,50 pg de vainillina como patron interno. Las muestras se agitaron vorticialmente durante 5 min y se centrifugaron durante 5 min a 1.000 g. La fase organica se transfirio a un matraz de vidrio y se evaporo bajo un flujo de nitrogeno. Se formaron trimetilsilil-eteres (TMS-eter) anadiendo 100 pl de acetonitrilo y 100 pl de Sylon-BFT durante 60 min a 60 °C y se evaporaron bajo un flujo de nitrogeno. Los metabolitos se resuspendieron en 100 pl de hexano y se analizaron mediante GC-MS en modo El en un Agilent GC 55 6890 acoplado con un detector "5973 MS Detector" (Agilent, Les Ulis, Francia) y equipado con una columna DB-5MS (30 m x 0,25 mm de diametro interno x 0,25 pm de espesor de pellcula (J y W Scientific, Agilent)). Las temperaturas del orificio de inyeccion y de la interfaz son de 250 y 280 °C respectivamente; la de la fuente de iones y el analizador MS se fijaron respectivamente a 230 y 150 °C. Las muestras se inyectaron en un modo "inyeccion sin division" o en un modo "sin division". La temperatura del horno se ajusto primero a 60 °C durante 5 minutos, y luego se aumento

en 10 °C/min hasta 100 °C, se elevo en 1 °C/min hasta 150 °C, y finalmente se elevo en 8 0C/min hasta 290 °C; luego se mantuvo durante 5 min. Los compuestos se ionizaron por impacto de electrones con una energla de 70 eV. Los analitos se detectaron por una corriente ionica total de 50 a 850 m/z. Todos los datos se procesaron con el software MSDchem (EMBL-EBI).

5

1.6. Ensayos enzimaticos (espectrometria de masas acoplada a cromatograffa de fase ifquida LC-MS)

[0120] Las pruebas enzimaticas se realizaron usando:

10 - a) malonil-CoA en solitario: Se anadieron 200 pM de malonil-CoA a la mezcla de ensayo que contenla 50 pg de enzima recombinante purificada PKS1 de E. siliculosus, en un volumen final de 500 pl de Tris HCI 50 mM pH 7,5 y 1 mM de EDTA, o

- b) los cinco substratos siguientes: acetil-CoA, hexanoil-CoA, lauroil-CoA, palmitoil-CoA y decanoil-CoA. Se anadieron 200 pM de cada sustrato a la mezcla de ensayo que contenla 20 pM de malonil-CoA, 50 pg de la enzima 15 recombinante purificada PKS1 de E. siliculosus, en un volumen final de 500 pl de Tris HCI 50 mM pH 7,5 y 1 mM de EDTA.

[0121] La incubacion de las mezclas en a) y b) se llevo a cabo a temperatura ambiente durante 1, 2, 3, 4, o 5 h y se detuvo mediante la adicion de HCl al 37 %. Los productos de las reacciones se extrajeron a continuacion con

20 1 ml de acetato de etilo. Se anadieron 2,50 pg de vainillina como patron interno. Las muestras se agitaron vorticialmente durante 5 min y se centrifugaron durante 5 min a 1.000 g. La fase organica se transfirio a un matraz de vidrio y se evaporo bajo un flujo de nitrogeno. Los metabolitos se resuspendieron en 100 pl de hexano. Para el analisis por LC-MS, se acopla un sistema de cromatografla llquida DionexUltiMate 3000 Rapid Separation LC (RSLC, Dionex) con un espectrometro de masas hlbrido LTQ-Orbitrap™ (Thermo Fisher Scientific). Todos los 25 disolventes y reactivos utilizados son de calidad analltica o calidad HPLC (Carlo Erba). La separacion cromatografica se logro en una columna Acclaim RSLC 120, C18, tamano de partlculas de 2 pm, columna de 2,1 x 100 mm (Dionex) mantenida a 20 °C. La fase movil es agua que contenla acido acetico al 0,1 % (A) y acetonitrilo que contenla acido acetico al 0,1 % (B). El flujo se ajusto a 0,25 ml.min-1. El gradiente de elucion (A:B, v/v) se realizo como se describe a continuacion: 80:20 de 0 a 1 min; y despues 0:100 de 1 a 10 min; despues 20:100 durante 10 min y de 20,1 30 minutos a 80:20 durante 10 minutos. El volumen inyectado es de 50 pl. La columna de HPLC se conecto sin desacoplamiento con la interfaz operativa de electronebulizacion en modo negativo. La tension de la pulverizacion fue de 3,5 kV y la temperatura del capilar de transferencia se mantuvo a 350 °C. El "llquido de la vaina" y el gas nitrogeno auxiliar se aplicaron para ayudar a la evaporacion del disolvente en un flujo de 25 y 5 unidades arbitrarias respectivamente. La totalidad de las exploraciones de los espectros de masas se obtuvo para m/z de 50 a 2.000 35 utilizando una resolution de masa de 30.000 FWHM a 400 m/z en un modo de perfil.

EJEMPLO 2: Resultados

2.1. Secuencias nucleotfdicas y proteicas de PKS1

40

[0122] El gen PKS1 presente en el genoma de E. siliculosus esta disponible en las bases de datos publicas desde junio de 2010 y corresponde a una secuencia de 1.245 nucleotidos, que codifica una protelna de 415 aminoacidos. Se predijo un peptido senal de direccionamiento segun el uso del software SIGNALP v.2.0 que usa los dos modelos de redes neuronales y ocultos de Markov (Nielsen y col., Protein Eng, 1999, 12: 3-9) y esta secuencia

45 de 102 nucleotidos, correspondiente a los primeros 34 aminoacidos, se elimino para obtener una protelna recombinante madura expresada en el citoplasma bacteriano.

2.2. Sobreexpresion en E. Coli y purificacion de la PKS1 recombinante

50 [0123] Segun los procedimientos de sobreexpresion y purificacion de PKS1 en E. coli, el gel de electroforesis

de las fracciones de elucion de la columna de afinidad "IMAC" tenidas con azul de Coomassie permite la detection de la production de una protelna recombinante al tamano esperado de aproximadamente 50 kDa. Para aumentar el nivel de pureza de la protelna recombinante y eliminar las formas inactivas de la enzima (por ejemplo, agregados solubles), una segunda purificacion en una columna de exclusion por tamano permite obtener la protelna 55 recombinante con una homogeneidad de mas del 99 % segun al analisis de DLS (dispersion de luz dinamica). Este analisis coincide con el volumen de elucion de la protelna en un gel de filtration y sugiere que la forma activa de la enzima es en realidad un dlmero como la mayorla de las PKSIII conocidas hasta el momento. La pureza de la enzima tambien se valido mediante analisis de espectrometria de masas MALDI-TOF de la banda recortada sobre gel y se digirio con tripsina. Las masas de los fragmentos obtenidos corresponden realmente a la secuencia de

PKS1 con 32 peptidos identificados que corresponden al 47 % de cobertura de la secuencia (Figura 2).

[0124] Se estimo que el rendimiento de produccion para un cultivo en un fermentador de 5 l era de

aproximadamente 5 a 10 mg de protelna recombinante activa por litro de cultivo y, por lo tanto, puede soportar un 5 nivel de produccion industrial. Ademas, la enzima demostro ser estable durante uno o dos meses a 4 °C y soporto la congelacion a -80 °C.

2.3. Actividad enzimatica: analisis de espectrometrfa de masas de los compuestos formados

10 [0125] El analisis de los productos formados por TLC indica que hay formacion de floroglucinol con o sin

iniciadores (malonilCoA en solitario, malonilCoA + acetil-CoA, malonilCoA + hexanoil-CoA, malonilCoA + lauroil-CoA, malonilCoA + palmitoil-CoA y malonilCoA + decanoil-CoA) y que los principales compuestos de la reaccion obtenidos son floroglucinol en el caso de malonilCoA en solitario o malonilCoA + acetil-CoA y un acil-floroglucinol en el caso de malonilCoA con los demas iniciadores (acetil-CoA, hexanoil-CoA, lauroil-CoA, palmitoil-CoA y decanoil-CoA) (Figura 15 3).

20

[0126] Estos resultados se confirmaron por analisis de espectrometrla de masas GC-MS que permitio la

identificacion clara de la produccion de floroglucinol a partir de malonil-CoA con una produccion optima situada entre 3 h y 5 h de reaccion (Figuras 4 y 5 y Tabla 5).

Tabla 5: Cantidad de floroglucinol producido por la PKS1 a partir de Malonil-CoA.

Tiempo (h)

Area m/z 194 Area m/z 342 Relacion 342/194 Floroglucinol/muestra (qg)

CB

6232490 0 0 0,00

1

5968432 955510 0,16009397 1,70

2

6169748 5641093 0,91431498 9,08

3

5847716 39184281 6,70078386 65,64

4

4159877 9789969 2,35342752 23,15

5

4452610 12232641 2,74729675 27,00

[0127] El analisis de espectrometrla de masas LC-MS tambien permitio la identificacion clara de la produccion de floroglucinol a partir de malonil-CoA y acetil-CoA (Figura 6).

25

[0128] La formacion de los acil-floroglucinoles se detecto extrayendo especlficamente los compuestos presentes por TLC y analizandolos con espectrometrla de masas LC-MS. Por lo tanto, por ejemplo, en presencia de malonilCoA y lauroil-CoA, la enzima PKS1 produce lauroil-floroglucinol (Figura 7).

30 [0129] Otros resultados del analisis por GC-MS para los productos formados en presencia de diferentes acil-

CoA tambien sugieren la formacion de compuestos del tipo tetracetido pironas como con Mycobacterium tuberculosis.

2.4. Cristalizacion y obtencion de la estructura de la enzima PKS1

35

[0130] Despues de obtener las condiciones de cristalizacion, varios cristales de la enzima PKS1 dieron la

posibilidad de obtener conjuntos de datos de difraccion de rayos X que permitlan la resolucion de la estructura a 2,85 A mediante la tecnica de reemplazo molecular (Tabla 6).

40 Tabla 6. Datos recopilados y estadisticas de pureza de la PKS a una resolucion de 2,85 A.

Recopilacion de datos

PKS de alta resolucion

Llnea del haz ESRF

ID23-1

Longitud de onda (A)

0,979239

Grupo espacial

P212121

Parametros de la malla (A)

A = 61,99, b = 83,92, c = 154,91

Resolucion (A)

83,920-2,85 (3,02-2,85)

Numero de observaciones (F>0)

93096 (12976)

Numero de reflexiones unicas

22949 (3105)

Finalizacion (%)

100 (100)

Promedio I/ (I)

3,8 (1,4)

Rpim (%)

13,3 (58,7)

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para producir al menos un compuesto polifenolico, en el que:

   5 - una policetido sintasa de tipo III (PKSIII) de alga parda se pone en contacto con al menos un sustrato carbonoso en condiciones que permitan la produccion mayoritaria de al menos un compuesto polifenolico, caracterizado por que dicha PKSIII comprende o consiste en:

   - la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ

   ID NO: 1, o una secuencia que puede codificarse por la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 2 o una secuencia

   10 que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 2, o

   - la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ

   ID NO: 3, o una secuencia que puede codificarse por la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO: 4 o una secuencia

   que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 4.

   - dicho compuesto fenolico producido es floroglucinol o uno de sus derivados,

   15 - dicho sustrato se selecciona de malonil-CoA, hexanoil-CoA, decanoil-CoA, lauroil-CoA y/o palmitoil-CoA.
2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que dicho sustrato es malonil-CoA y dicho compuesto fenolico producido es floroglucinol.

   20 3. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que dicho

   sustrato es malonil-CoA y lauroil-CoA y dicho compuesto de fenol producido es lauroil-floroglucinol.
3. 4. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha PKSIII se obtiene

   despues de las etapas de:

   25

   - cultivar una celula huesped recombinante que comprende un vector recombinante que codifica una PKSIII que comprende o consiste en (i) la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 1, o un vector recombinante que comprende la secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 2 o una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 2, o (ii) la secuencia de aminoacidos

   30 SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con SEQ ID NO: 3, o un vector recombinante que comprende la secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 4 o una secuencia que tiene al menos un 85 % de identidad con SEQ ID NO: 4 en condiciones que permiten la expresion de dicha PKSIII, y

   - extraer y/o purificar dicha PKSIII.

   35 5. Acido nucleico aislado que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
4. 6. Acido nucleico aislado que consiste en una secuencia al menos un 85 % identica a la secuencia SEQ

   ID NO: 2 o al menos un 95 % identica a SEQ ID NO: 4, caracterizada por que codifica una policetido sintasa de tipo III (PKSIII).

   40
5. 7. Acido nucleico aislado segun la reivindicacion 5 que codifica una policetido sintasa de tipo III (PKSIII).
6. 8. Acido nucleico aislado que comprende o que consiste en la secuencia complementaria de SEQ ID NO:

   2 o SEQ ID NO: 4.

   45
7. 9. Acido nucleico aislado que codifica una policetido sintasa de tipo III (PKSIII) que consiste en:

   a) la secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 2,

   b) la secuencia nucleotldica SEQ ID NO: 4,

   50 c) la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4,

   d) una secuencia al menos un 85 % identica a SEQ ID NO: 2 o al menos un 95 % identica a SEQ ID NO: 4,

   e) una secuencia que difiere de las secuencias a) a d) por la degeneracion del codigo,

   f) una secuencia de nucleotidos que hibrida en condiciones de astringencia especlficas con al menos una de las secuencias a) a e).

   55
8. 10. Policetido sintasa aislada caracterizada por que esta codificada por un acido nucleico aislado segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9.
9. 11. Policetido sintasa aislada caracterizada por que dicha protelna consiste en:

   - la secuencia SEQ ID NO: 1 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, o

   - la secuencia SEQ ID NO: 3 o una secuencia que tiene al menos un 93 % de identidad con la SEQ ID NO: 3.

   5 12. Vector recombinante, que comprende el acido nucleico aislado segun una cualquiera de las

   reivindicaciones 5 a 9.
10. 13. Celula huesped recombinante, caracterizada por que la celula se ha transformado por un vector recombinante segun la reivindicacion 12.

    10
11. 14. Procedimiento para producir una policetido sintasa, que comprende las etapas de:

    a) cultivar una celula segun la reivindicacion 13, en condiciones que permitan la expresion de una policetido sintasa recombinante,

    15 b) extraer y/o purificar dicha policetido sintasa recombinante.

    imagen1

    t x: u c ^ c _ 4_-c

    rO O-raQ-CCI rB ui • — 03 <_/0 OO X OO X l>0 O- 31

    RBS

    ATG 6X His MCS ■

    PQE-80L - pQE-81 L AC PQE-82L-C

    imagen2

    FIG.1

    Lista de picos (masa de los peptidos m/z)

    709,3434

    804,2637

    808,2713

    832,2990

    918,4548

    1026,5706

    1182,6604

    1269,5841

    1273,6055

    1480,7358

    1497,7590

    1559,6200

    1886,8108

    1891,7970

    2095,9417

    2223,0097

    2366,0989

    2356,0971

    2771,3205

    2785,3423

    3246,5380

    Cobertura de la secuencia de PKS1:

    SKDEQTVYPVIAGMAIGWPQYRCTQNEAIAVASKCPGLESIKPVLER

    IYGNSRIGSRYFAVPDFTPGRAAKGDPLFYPADGSYQVPVDVRLDKF

    KEKAVPLVSDVARRAIKEAGLNVEDISKLWVSSTGFLGPGLDCELI

    KNLGLTRSVDRTLIGFMGCAAAWNGFRNANDYVTANPGKYALMICVE

    LSSVHTTFDDNINDAIIiHAIFADGCAAAVLKGARKSECPKGTLAIVD

    NHAWLMEGTEDG XTLAIKPNGITCTLSKFLPQYIAKNIAFFADGFLK KHKLGRDDVDFWCVH PGGRRIIEEAQNGLGLSEEQTADSWAVLGEYG NML S PSVMFVLSRVFKBHNAALAQGKPGYQTGMAFS FSPGVGAEGIL LRGI

    Identificacion:

    Masa: 44433, Puntuacion: 163, Expectativa: 6e-10, Coincidencias: 32 gi|299471698 Policetido sintasa III [Ectocarpus siliculosus]

    FIG.2

    ACIL-FLOROGLUCINOLES

    imagen3

    Abundancia Analisis GC-MS

    i Control negativo

    ■ 1111111

    T-1-

    I 1 1 I

    i i t i | i i i i | i i i i | i i i i } i i i v Tf-|~r

    10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00

    FLOROGLUCINOL

    1 hora

    i

    10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00

    3 horas

    T*

    f*f“r

    10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 50,00 55,00 60,00 65,00 70,00 75,00

    5 horas

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    Analisis GC-MS

    Abundancia m/z 342 = FLOROGLUCINOL

    imagen4

    FIG.5

    Intensidad

    co

    imagen5

    Intensidad

    imagen6

    FIG.7