ES2689953T3 - Procedimientos, kits y composiciones para la detección de mrsa - Google Patents

Abstract

Un ensayo multiplex para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS, que comprende tres conjuntos de cebadores para detectar la expresión de tres genes diana directamente de una muestra, una o más sondas diferenciales de secuencia asociadas con cada uno de los conjuntos de cebadores, un gen de referencia y un conjunto de cebadores para detectar la expresión del gen de referencia; en el que el ensayo multiplex está configurado para evaluar un nivel de expresión de cada uno de los genes diana para determinar la presencia de cada gen diana en la muestra, en el que el nivel de expresión de cada uno de los genes diana se evalúa mediante la comparación de uno del valor de ciclo umbral y el valor de punto de cruce de los genes diana y el gen de referencia; en el que un gen diana comprende un gen mecA y dos de los genes diana comprenden genes seleccionados del grupo que comprende un gen femA-S. epidermidis, un gen tuf-S. aureus y un gen tuf-CNS; en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen femA-S. epidermidis comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 7 y la SEQ ID NO. 8; en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen tuf-S. aureus comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 10 y la SEQ ID NO. 11; en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen tuf-CNS comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 13 y la SEQ ID NO. 14; en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen mecA comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 16 y la SEQ ID NO. 17; en el que el ensayo multiplex comprende además al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que incluye la SEQ ID NO. 9, la SEQ ID NO. 12, la SEQ ID NO. 15 o la SEQ ID NO. 18; en el que la SEQ ID NO. 9 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen femA-S. epidermidis y diferencia S. epidermidis de otras especies de estafilococo; en el que la SEQ ID NO. 12 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen tuf-S. aureus y diferencia S. aureus de CNS y otras especies; en el que la SEQ ID NO. 15 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen tuf-CNS y diferencia CNS de la especie S. aureus y otras especies; y en el que la SEQ ID NO. 18 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen mecA y diferencia la resistencia a meticilina y penicilina de fenotipos sensibles de las especies de S. aureus o CNS.

Description

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DESCRIPCION

Procedimientos, kits y composiciones para la detección de mrsa Campo de la invención

La presente invención generalmente proporciona composiciones y procedimientos para determinar si existe presencia de Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA, de sus siglas en inglés) en una muestra dada. Más particularmente, la presente invención proporciona ensayos basados en secuencias de genes identificados, cebadores y sondas diseñados en consecuencia para detectar la presencia de MRSA. La presente invención comprende además ensayos útiles para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, mRcNS y MSCNS en muestras.

Antecedentes de la invención

El Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) se ha convertido en uno de los agentes infecciosos más peligrosos en los EE. UU. y en otros lugares, con una tasa de mortalidad más alta que el VIH-SIDA. El MRSA es una cepa de la bacteria Staphylococcus aureus (S. aureus), un tipo común de bacteria que puede vivir en la piel y en las fosas nasales de personas sanas. El MRSA no responde a algunos de los antibióticos generalmente utilizados para tratar estafilococos y otras infecciones bacterianas.

Las infecciones por MRSA asociadas a la atención sanitaria (HA-MRSA, de sus siglas en inglés) se producen en personas que están o han estado recientemente en un hospital u otro centro de atención de la salud. Muchas personas pueden estar en riesgo de infección por MRSA debido a que reciben servicios de atención médica en un ambiente en el que las bacterias MRSA colonizan las superficies, los trabajadores de la salud, el paciente u otros pacientes. Las infecciones por MRSA asociadas a la comunidad (CA-MRSA, de sus siglas en inglés) ocurren, por el contrario, en personas sanas que no han estado recientemente en el hospital. De hecho, el MRSA se ha convertido en la principal causa de infecciones de piel y tejidos blandos entre personas sin exposición extensa a entornos de atención médica, y los brotes han ocurrido en instalaciones de equipos atléticos, instalaciones correccionales y campamentos de entrenamiento básico militar.

Además de las cepas de S. aureus sensible a meticilina (MSSA, de sus siglas en inglés) y S. aureus resistente a meticilina (MRSA), existen especies de CNS o CoNS (estafilococos coagulasa negativos), parientes cercanos de la bacteria Staphylococcus aureus, que se encuentran comúnmente en seres humanos. Muchas cepas de CNS también son resistentes a meticilina (MRCNS, de sus siglas en inglés) que contiene un mecanismo de casete del gen SCCmec similar a MRSA. Específicamente, S. epidermidis resistente a meticilina (MRSE, de sus siglas en inglés) es la especie en el complejo de especies del CNS más comúnmente visto entre los vehículos del MRCNS. Entre los pacientes inmunocomprometidos, el MRCNS, especialmente el MRSE, puede causar infecciones y es una causa común de heridas, sangre e infecciones respiratorias. El MRSE puede causar infecciones graves en pacientes inmunodeprimidos y en aquellos con catéteres venosos centrales.

Las intervenciones para la colonización del MRSA a través de la descolonización, los procedimientos de aislamiento o las restricciones en las actividades laborales entre los médicos y los pacientes serían más eficaces si hubiera una forma de identificar rápidamente a los pacientes entre los trabajadores de la salud que están infectados por el MRSA. Sin embargo, los sistemas de identificación actuales se basan en tecnologías desactualizadas, engorrosas y que requieren mucho tiempo, como el cultivo, y están enfocadas solo en MRSA. Por lo tanto, existe una necesidad continua de tecnologías que permitan la identificación y diferenciación positiva de MRSA, MSSA, MRCNS y MSCNS utilizando pruebas más rápidas e informativas con un alto nivel de precisión tanto para la detección de colonización como para el diagnóstico de infecciones.

Kilic y col. (2010) Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 66, 349-355 describe un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa tríplex en tiempo real para la detección simultánea de Staphylococcus aureus y estafilococos coagulasa negativos y la determinación de la resistencia a meticilina directamente de los frascos de hemocultivos positivos.

Sumario de la invención

En resumen, por lo tanto, un aspecto de la presente invención proporciona un ensayo multiplex para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MScNs en una muestra, como se define en las reivindicaciones. El ensayo multiplex comprende el ensayo mecA y dos ensayos elegidos entre el ensayo femA-Se, el ensayo tuf-Sa y el ensayo tuf-CNS.

Otro aspecto de la invención abarca un ensayo multiplex para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE y MSSE en una muestra, y el ensayo multiplex comprende el ensayo femA-Se; el ensayo mecA; y al menos un ensayo elegido entre el ensayo nuc-Sa y el ensayo femA-Sa, como se define en las reivindicaciones.

Un aspecto adicional de la invención abarca un procedimiento para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS en una muestra. El procedimiento comprende obtener una muestra; cribar la muestra

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como se define en las reivindicaciones; e identificar las bacterias contenidas en la muestra como MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS basándose en el análisis de cada ensayo elegido.

Aún otro aspecto de la invención proporciona un kit para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS en una muestra a través de un ensayo multiplex, como se define en las reivindicaciones.

Se describen otros aspectos e iteraciones de la invención con más detalle a continuación.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 representa los resultados de cuatro ensayos de PCR en tiempo real que comprenden los ensayos nuc- Sa, femA-SA (lo mismo que femA-Sa, lo mismo a continuación), femA-Sepi (lo mismo que fem-Se, lo mismo a continuación) y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6604.

La FIG. 2 representa los resultados de cuatro ensayos de PCR en tiempo real que comprenden los ensayos nuc- Sa, femA-SA, femA-Sepi y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6608.

La FIG. 3 representa los resultados de cuatro ensayos de PCR en tiempo real que comprenden los ensayos nuc- Sa, femA-SA, femA-Sepi y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6588.

La FIG. 4 representa los resultados de cuatro ensayos de PCR en tiempo real que comprenden los ensayos nuc- Sa, femA-SA, femA-Sepi y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6607.

La FIG. 5 representa los resultados de cuatro ensayos de PCR en tiempo real que comprenden los ensayos nuc- Sa, femA-SA, femA-Sepi y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6759.

La FIG. 6 representa los resultados de cuatro ensayos de PCR en tiempo real que comprenden los ensayos Nuc- SA, femA-SA, femA-Sepi y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6775.

La FIG. 7 representa los resultados y el patrón de curva de amplificación de un ensayo multiplex de PCR en tiempo real que comprende los ensayos femA-Sa, nuc-Sa, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar las muestras del grupo MRSA/MSSA que incluyen mezclas de MRSA y MSSA en relación 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1.

La FIG. 8 representa los resultados y el patrón de curva de amplificación de un ensayo multiplex de PCR en tiempo real que comprende los ensayos femA-Sa, nuc-Sa, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar las muestras del grupo MRSA/MSCNS que incluyen mezclas de MRSA y MSCNS en relación 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1.

La FIG. 9 representa los resultados y el patrón de curva de amplificación de un ensayo multiplex de PCR en tiempo real que comprende los ensayos femA-Sa, nuc-Sa, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar las muestras del grupo MRSA/MRCNS que incluyen mezclas de MRSA y MRCNS en relación 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1.

La FIG. 10 representa los resultados y el patrón de curva de amplificación de un ensayo multiplex de PCR en tiempo real que comprende los ensayos femA-Sa, nuc-Sa, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar las muestras del grupo MSSA/MRCNS que incluyen mezclas de MSSA y MRCNS en relación 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1.

La FIG. 11 representa los resultados y el patrón de curva de amplificación de un ensayo multiplex de PCR en tiempo real que comprende los ensayos femA-Sa, nuc-Sa, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar las muestras del grupo MRSA/MSSA que incluyen mezclas de MRSA y MSSA en relación 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1.

La FIG. 12 representa los resultados y el patrón de curva de amplificación de un ensayo multiplex de PCR en tiempo real que comprende los ensayos femA-Sa, nuc-Sa, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar las muestras del grupo MRSA/MRCNS que incluyen mezclas de MRSA y MRCNS en relación 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1.

La FIG. 13 representa los resultados y el patrón de curva de amplificación de un ensayo multiplex de PCR en tiempo real que comprende los ensayos femA-Sa, nuc-Sa, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA; el ensayo multiplex se utilizó para analizar las muestras del grupo MRSA/MRCNS que incluyen mezclas de MRSA y MSCNS en relación 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1.

Descripción detallada de la invención

La presente invención desvela ensayos, procedimientos y kits diseñados para identificar y diferenciar entre MSSA, MRSA, MRCNS y MSCNS, que incluyen los MRSE y MsSe de las especies del CNS, en muestras mixtas utilizando un ensayo multiplex que comprende una combinación de ensayos individuales variables o utilizando un ensayo individual según la aplicación.

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(I) Detección de MRSA y otras especies o cepas

(a) Moléculas que identifican y diferencian MRSA y otras especies o cepas

Además de S. aureus sensible a meticilina (MSSA) y S. aureus resistente a meticilina (MRSA), existen CNS o CoNS, (estafilococos coagulasa negativos) que se encuentran comúnmente en seres humanos, que son parientes cercanos de Staphylococcus aureus. Muchos CNS también son resistentes a meticilina (MRCNS) que contienen un mecanismo de casete del gen SCCmec similar a MRSA. Entre las especies de CNS, los ejemplos ejemplares incluyen: S. capitis, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. simulans, y S. warneri. Específicamente, el S. epidermidis resistente a meticilina (MRSE) es la especie de CNS más comúnmente vista entre los vehículos del MRCNS. Entre los pacientes inmunocomprometidos, el MRCNS, especialmente el MRSE, puede causar infecciones y es causa común de heridas, sangre, dispositivos médicos e infecciones respiratorias.

Un sujeto puede mostrar signos o síntomas de infección bacteriana, incluida la infección por MRSA. Sin embargo, estos signos o síntomas no son fiables en el diagnóstico de MRSA, MSSA, MRCNS o MRCNS. En comparación, utilizar secuencias de ácido nucleico específicas de especies o cepas, alelos de esas secuencias o biomarcadores procedentes de productos transcripcionales o traduccionales de las secuencias de ácido nucleico específicas de especies o cepas y sus alelos para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS es mucho más rápido, preciso e informativo.

(i) Secuencias de ácido nucleico específicas de especies o cepas

Las secuencias específicas de especies o cepas son secuencias únicas de la especie o cepa, es decir, no compartidas por otras especies o cepas previamente caracterizadas. Una sonda o cebador que contiene una secuencia complementaria a una secuencia específica para una especie de S. aureus, S. epidermidis, CNS o cepas de los mismos, normalmente, no se hibridará con la porción correspondiente del genoma de otras especies o cepas en condiciones rigurosas. Cuando se identifica una secuencia de especie o cepa en particular, las sondas o cebadores pueden diseñarse en función de cualquier parte de la secuencia. Las sondas o cebadores también pueden ser la totalidad de la secuencia. Los cebadores o sondas diseñados de acuerdo con una secuencia de especie o cepa particular también pueden representarse en forma degenerada, o que comprenden ácidos nucleicos modificados químicamente, o cualquier otro componente que facilite la identificación de la secuencia identificadora de una cepa o especie. El concepto de una secuencia identificada como específica de una especie o cepa abarca además secuencias de ácido nucleico que son menos del 100 % idénticas a la secuencia específica, pero que aún son capaces de detectar específicamente la especie o cepa. Obsérvese que en una secuencia de ácido nucleico, T o U pueden utilizarse indistintamente dependiendo de si el ácido nucleico es ADN o ARN. Una secuencia que tiene menos del 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia identificadora puede estar todavía abarcada por la invención si es capaz de unirse a su secuencia complementaria y/o facilitar la amplificación de ácidos nucleicos de una secuencia diana deseada. Los cebadores o sondas diseñados de acuerdo con una secuencia de especie o cepa particular también pueden representarse en forma degenerada, o que comprenden ácidos nucleicos modificados químicamente, o cualquier otro componente que facilite la identificación de la secuencia identificadora de una cepa o especie.

La identificación de las secuencias específicas de especie o cepa y el desarrollo de las sondas o cebadores para detectar la presencia de esas secuencias para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRCNS o MRCNS se desvelan en el presente documento. Un aspecto de la presente invención desvela que el gen nuc-S. aureus se puede utilizar para detectar específicamente S. aureus. Otro aspecto de la presente invención desvela que el gen femA-S. aureus también se puede utilizar para detectar específicamente S. aureus. Otro aspecto de la presente invención desvela que las diferencias en los genes tuf en S. aureus y CNS se pueden utilizar para diferenciar los dos parientes cercanos. Aún otro aspecto de la presente invención desvela que el gen femA-S. epi también se puede utilizar para detectar específicamente Staphylococcus epidermidis, es decir, MSSE o MRSE. Un aspecto adicional de la presente invención desvela que el gen mecA se puede utilizar para determinar específicamente la resistencia a meticilina/penicilina en S. aureus y CNS.

(ii) Alelos de ácidos nucleicos específicos de especies o cepas

La identificación de alelos para una secuencia específica para una especie de S. aureus, S. epidermidis, CNS o cepas de las mismas, es otro aspecto de la presente invención. Un alelo incluye cualquier forma de un ácido nucleico particular que pueda reconocerse como una forma del ácido nucleico particular a causa de su ubicación, secuencia o cualquier otra característica que pueda identificarlo como una forma del gen particular. Los alelos incluyen, pero no se limitan a, formas de un gen que incluyen mutaciones puntuales, mutaciones silenciosas, deleciones, mutaciones del marco de lectura, polimorfismos de nucleótido único (SNP, de sus siglas en inglés), inversiones, translocaciones, inserciones heterocromáticas y secuencias metiladas diferencialmente en relación con un gen de referencia, ya sea solo o en combinación. Un alelo de un gen puede producir o no una proteína funcional; puede producir una proteína con función, localización, estabilidad, dimerización o interacción proteína-proteína alterada; puede tener sobreexpresión, subexpresión o no expresión; puede haber alterado la especificidad de expresión temporal o espacial. La presencia o ausencia de un alelo puede detectarse mediante la utilización de

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cualquier procedimiento conocido en la materia, que incluye la utilización de cebadores y sondas diseñados en consecuencia para PCR, secuenciación, análisis de hibridación. Un alelo también puede llamarse mutación o mutante. Un alelo puede compararse con otro alelo que puede denominarse forma de tipo silvestre de un alelo. En algunos casos, el alelo de tipo silvestre es más común que el mutante.

Un aspecto de la presente invención proporciona que los alelos del gen nuc-S. aureus pueden utilizarse para detectar específicamente S. aureus. Otro aspecto de la presente invención proporciona que los alelos del gen femA- S. aureus también pueden utilizarse para detectar específicamente S. aureus. Otro aspecto de la presente invención proporciona que las diferencias en los genes tuf en S. aureus y CNS pueden utilizarse para diferenciar los dos parientes cercanos. Aún otro aspecto de la presente invención proporciona que los alelos del gen femA-S. epi pueden utilizarse para detectar específicamente Staphylococcus epidermidis, es decir, MSSE o MRSE. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona que el alelo del gen mecA se puede utilizar para determinar específicamente la resistencia a meticilina/penicilina en S. aureus y CNS. La presente invención también proporciona secuencias de ADN adicionales que pueden utilizarse para desarrollar ensayos de identificación y diferenciación de MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS (véase el Ejemplo 5 y las SEQ ID NO. 19-30)

(iii) Biomarcadores como indicaciones de la presencia de especies o cepas específicas

Las moléculas, que incluyen, pero no se limitan a, ARN pequeños, péptidos y proteínas, procedentes del procedimiento de transcripción o traducción de MRSA, MSSA, MRSE, MsSE, el MRCNS, MsCNS u otras secuencias de ácido nucleico específicas de especies o cepas y alelos de los mismos pueden servir como biomarcadores que indican la presencia de una especie o cepa particular. También pueden servir como biomarcadores algunas moléculas que son producidas por el sistema inmune para defenderse contra MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS. Los procedimientos para detectar un alelo, generalmente, implican evaluar la expresión del material creado a partir de una plantilla de ADN genómico tal como una molécula de proteína o ARN. Dicha expresión puede evaluarse mediante cualquiera de una serie de procedimientos utilizados actualmente en la materia y aún por desarrollar.

Una vez que se identifican los genes específicos de cepa, alelos de los mismos u otros biomarcadores basados en ácido nucleico de los mismos, pueden diseñarse cebadores y sondas para seleccionar muestras para detectar específica y selectivamente la presencia o ausencia de estos genes, alelos o biomarcadores y, por lo tanto, puede determinarse una especie o cepa particular de Staphylococcus a través de diversos procedimientos, que incluyen procedimientos basados en PCR tales como PCR en tiempo real, PCR cuantitativa, PCR cuantitativa en tiempo real; ligación específica de alelos; hibridación genómica comparativa; secuenciación; y otros procedimientos conocidos en la materia. En un ejemplo ejemplar, el gen tuf de la especie CNS se alineó para diseñar los cebadores utilizados en el ensayo para detectar CNS. El mecanismo de trabajo de los cebadores en RT-PCR/PCR es conocido en la materia. Un aspecto de la invención proporciona ensayos de RT-PCR multiplex que combinan varios números de ensayos que comprenden conjuntos de cebadores y sondas específicos dependiendo de la aplicación para diferenciar entre mRsA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS en muestras mixtas.

En cuanto a las sondas, pueden utilizarse para el análisis de una sola sonda o un análisis multiplex combinado de RT-PCR/PCR de sonda/cebador. Pueden diseñarse sondas de oligonucleótidos complementarias a una secuencia seleccionada dentro de la secuencia diana. En un ejemplo ejemplar, las sondas de oligonucleótidos que facilitan la detección del producto RT-PCR/PCR son complementarias de una secuencia seleccionada dentro de la secuencia diana cadena abajo del cebador cadena arriba o cadena abajo. Por lo tanto, estas sondas hibridan con una secuencia interna del fragmento amplificado de una secuencia diana.

El concepto de oligonucleótidos incluye cualquier molécula de ADN o ARN de dos o más nucleótidos, ya sea de origen natural, sintetizada artificialmente o producida mediante la utilización de tecnología de ADN recombinante. Un nucleótido es una base de desoxirribonucleótido o ribonucleótido individual. Los ejemplos de nucleótidos incluyen, pero sin limitación: adenina, timina, guanina, citosina y uracilo, que pueden abreviarse como A, T, G, C o U en representaciones de la secuencia de oligonucleótidos. La longitud del oligonucleótido depende de cómo se utilizará el oligonucleótido. Un experto en la materia entenderá la longitud aproximada de oligonucleótido necesaria en cualquier procedimiento dado. Dependiendo del procedimiento, un oligonucleótido puede tener de 0 a 1000 bases de longitud. En otros aspectos, puede tener de 5 a 500 bases de longitud, de 5 a 100 bases de longitud, de 5 a 50 bases de longitud, o de 10 a 30 bases de longitud. Los cebadores o sondas diseñados de acuerdo con una secuencia de especie o cepa particular también pueden representarse en forma degenerada, o que comprenden ácidos nucleicos modificados químicamente, o cualquier otro componente que facilite la identificación de la secuencia identificadora de una cepa o especie. Un oligonucleótido puede estar en cualquier formulación física que incluye un sólido (incluyendo sales cristalinas si es necesario) o puede estar en una solución tal como en una solución tamponada.

(b) Muestras que pueden contener MRSA y otras especies o cepas

Las muestras a menudo vienen con una mezcla de especies de bacterias. Además de MSSA y MRSA, existen CNS o CoNS. Entre las especies de CNS, el MRSE es la cepa más comúnmente observada entre los vehículos de MRCNS. La presente invención desvela ensayos multiplex que utilizan conjuntos de cebadores y/o sondas,

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procedimientos y kits diseñados para diferenciar entre MSSA, MRSA, MRCNS y MSCNS, que incluyen los MRSE y MSSE de las especies del CNS, en una muestra utilizando un ensayo multiplex que comprende una combinación de ensayos individuales variables según la aplicación.

Una muestra sometida a los ensayos, procedimientos o kits desvelados en el presente documento puede o no puede sospecharse que contenga un ácido nucleico de una bacteria de interés. Los ácidos nucleicos pueden incluir, pero no se limitan a, ARN, ADNc, ARNt, ADN mitocondrial, ADN plásmido, ARNip, ADN genómico o cualquier otra molécula de ácido nucleico de origen natural o artificial que se origina a partir de una bacteria. Puede sospecharse que las muestras contienen una bacteria si proceden de un sujeto que presenta síntomas de una infección bacteriana, o de una muestra ambiental de un área en la que se cree que una bacteria es endémica, o de un sujeto recientemente presente en un hospital u otro ambiente que contiene MRSA o MRSE. Un sujeto puede mostrar signos o síntomas de infección por MRSA, que incluyen áreas rojas, hinchadas y dolorosas en la piel, drenaje de pus u otros fluidos del sitio, fiebre, abscesos cutáneos, calidez alrededor del área infectada, dolor de pecho, resfriado, tos, fatiga, malestar, dolor de cabeza, dolor muscular, sibilancias y dificultad para respirar.

Una muestra puede proceder de cualquier lugar en el que se encuentre una bacteria o cualquier parte de una bacteria, que incluye, pero no se limita a, el suelo, aire, agua, superficies sólidas (naturales o artificiales), medios de cultivos, productos alimenticios, dispositivos, incluidos los dispositivos utilizados en procedimientos médicos y/o procedimientos de embellecimiento corporal (tales como agujas para tatuajes o agujas para perforar el cuerpo). Además, una muestra puede proceder de un sujeto, o de fuentes agrícolas, ambientales o de cualquier otra fuente.

Un sujeto puede ser cualquier organismo que pueda estar infectado por una bacteria, tales como plantas; animales, que incluye, pero no se limita a, seres humanos, animales de compañía tales como perros, gatos, pájaros o mamíferos pequeños, animales de granja, tales como ganado vacuno, cerdos, ovejas, aves de corral y cualquier otro animal domesticado o salvaje. Las muestras procedentes de sujetos incluyen, pero no se limitan a, una colección de ácidos nucleicos en todas sus formas, biopsia u otro análisis in vivo o ex vivo de próstata, pecho, piel, músculo, fascia, cerebro, endometrio, pulmón, cabeza y cuello, páncreas, intestino delgado, sangre, hígado, testículos, ovarios, colon, piel, estómago, esófago, bazo, ganglio linfático, médula ósea, riñón, placenta o feto. Las muestras procedentes de sujetos también pueden tomar la forma de una muestra de fluido tal como sangre periférica, líquido linfático, ascitis, fluido seroso, derrame pleural, esputo, lavado bronquial, líquido de lavado bronquioalveolar (BALF, de sus siglas en inglés), líquido cerebroespinal, semen, líquido amniótico, líquida lagrimal, heces, orina, cabello o cualquier otra fuente en la que una bacteria o cualquier parte de una bacteria pueda estar presente.

Las muestras pueden recolectarse mediante cualquiera y todos los procedimientos ahora conocidos o aún por desvelar, que incluyen deslizar o limpiar con un hisopo un área u orificio, extraer un pedazo de tejido como en una biopsia, cualquier procedimiento conocido para recolectar fluidos corporales, limpiar una superficie, recoger una muestra de líquido, recoger una muestra de aire o cualquier otro procedimiento que pueda utilizarse para recolectar bacterias de manera que se preserve el material biológico, como ADN, ARN o proteínas, para su análisis.

(c) Realizaciones preferidas

Como se muestra en la Tabla A, en una realización preferida de la presente invención, el conjunto de cebadores 1, representado por las SEQ ID NO. 1 y 2, es selectivo para la secuencia nucleica específica de S. aureus que porta el gen nuc, por lo que S. aureus, CNS y otras especies se pueden diferenciar.

En una realización preferida, el conjunto de cebadores 2 representado, por las SEQ ID NO. 4 y 5, es selectivo para la secuencia nucleica específica de S. aureus que porta el gen femA-S. aureus, por lo que S. aureus, CNS y otras especies se pueden diferenciar.

En una realización preferida, el conjunto de cebadores 3, representado por las SEQ ID NO. 7 y 8, es selectivo para la secuencia nucleica específica de S. epi que porta el gen femA-S. epi, por lo que S. epidermidis y otras especies de Staphylococcus se pueden diferenciar.

En una realización preferida, el conjunto de cebadores 4, representado por las SEQ ID NO. 10 y 11, es selectivo para la secuencia nucleica específica de S. aureus que porta el gen tuf-S. aureus, por lo que S. aureus se puede detectar.

En una realización preferida, el conjunto de cebadores 5, representado por las SEQ ID NO. 13 y 14, es selectivo para la secuencia nucleica específica de CNS que porta el gen tuf-CNS, por lo que CNS se puede detectar.

En todavía otra realización preferida, el conjunto de cebadores 6, representado por las SEQ ID NO. 16 y 17, es selectivo para la resistencia a meticilina o penicilina, un fenotipo determinado por la presencia o ausencia de la secuencia nucleica que porta el gen mecA, de modo que los fenotipos de resistencia a meticilina y penicilina se pueden diferenciar.

En todavía otra realización preferida, la sonda 1, representada por la SEQ ID NO. 3, es selectiva para la secuencia nucleica específica de S. aureus que porta el gen nuc, por lo que S. aureus, CNS y otras especies se pueden diferenciar.

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En una realización preferida, la sonda 2, representada por la SEQ ID NO. 6, es selectiva para la secuencia nucleica específica de S. aureus que porta el gen femA-S. aureus, por lo que S. aureus, CNS y otras especies se pueden diferenciar.

En una realización preferida, la sonda 3, representada por la SEQ ID NO. 9, es selectiva para la secuencia nucleica específica de S. epi que porta el gen femA-S. epi, por lo que se puede diferenciar S. epidermidis de otras especies de Staphylococcus.

En una realización preferida, la sonda 4, representada por la SEQ ID NO. 12, es selectiva para la secuencia nucleica específica de S. aureus que porta el gen tuf-S. aureus, por lo que S. aureus se puede detectar.

En todavía otra realización preferida, la sonda 5, representada por la SEQ ID NO. 15, es selectiva para la secuencia nucleica específica de CNS que porta el gen tuf-CNS, por lo que CNS se puede detectar.

En todavía otra realización preferida, la sonda 6, representada por la SEQ ID NO. 18, es selectiva para la resistencia a meticilina o penicilina, un fenotipo determinado por la presencia o ausencia de la secuencia nucleica que porta el gen mecA, de modo que los fenotipos de resistencia a meticilina y penicilina se pueden diferenciar.

Los oligonucleótidos para los cebadores y las sondas pueden sintetizarse químicamente mediante cualquiera de una serie de procedimientos que incluyen la síntesis secuencial, la síntesis en fase sólida o cualquier otro procedimiento de síntesis ahora conocido o aún por desvelar. Como alternativa, los oligonucleótidos pueden producirse mediante procedimientos basados en ADN recombinante. Un experto en la materia entenderá la longitud del oligonucleótido necesaria para realizar una tarea particular.

Tabla A: Ensayos, cebadores y sondas

Ensayo N.°

Cebador/Sonda N.° SEQ ID NO. Descripción

Ensayo 1: ensayo nuc-Sa

Conjunto de cebadores 1 1 Identificar y diferenciar S. aureus y otras especies

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Sonda 1

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Ensayo 2: ensayo femA-Sa

Conjunto de cebadores 2 4 Identificar y diferenciar S. aureus y otras especies

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Sonda 2

6

Ensayo 3: ensayo femA-Se

Conjunto de cebadores 3 7 Identificar y diferenciar S. epidermidis de otras especies de Staphylococcus

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Sonda 3

9

Ensayo 4: ensayo tuf-Sa

Conjunto de cebadores 4 10 Identificar S. aureus

11

Sonda 4

12

Ensayo 5: ensayo tuf-CNS

Conjunto de cebadores 5 13 Identificar CNS

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Sonda 5

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Ensayo 6: ensayo mecA

Conjunto de cebadores 6 16 Identificar y diferenciar fenotipos de resistencia a meticilina y penicilina

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(II) Procedimientos para detectar MRSA y otras especies o cepas

Los procedimientos que se pueden utilizar para identificar ácidos nucleicos específicos de cepa, alelos de ácidos nucleicos específicos de cepa y biomarcadores procedentes de productos transcripcionales y traduccionales de los ácidos nucleicos específicos de cepa y los alelos de los mismos, incluyen PCR, RT-PCR, hibridación, secuenciación y cualquier combinación de los procedimientos anteriores.

Se puede añadir un ácido nucleico a una muestra mediante cualquiera de una serie de procedimientos, que incluyen procedimientos manuales, procedimientos mecánicos o cualquier combinación de los mismos. La presencia del alelo puede representarse mediante cualquiera de una serie de procedimientos, que incluyen la amplificación de una secuencia de ácido nucleico específica, secuenciación de un ácido nucleico nativo o amplificado, o la detección de un marcador unido o liberado del ácido nucleico. La adición del ácido nucleico a la muestra también abarca la adición del ácido nucleico a una muestra en la que el alelo diana, al que tiene especificidad el ácido nucleico, está ausente.

(a) PCR

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Los ácidos nucleicos pueden amplificarse selectiva y específicamente a partir de un ácido nucleico molde contenido en una muestra. En algunos procedimientos de amplificación nucleica, las copias se generan exponencialmente. Los procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos no limitantes conocidos en la materia incluyen: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés), reacción en cadena de la ligasa (LCR, de sus siglas en inglés), replicación de secuencia autosostenida (3SR, de sus siglas en inglés), amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, de sus siglas en inglés), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA, de sus siglas en inglés), amplificación con Qp replicasa, amplificación del genoma completo con enzimas tales como 029, PCR del genoma completo, transcripción in vitro con Klenow o cualquier otra ARN polimerasa, o cualquier otro procedimiento mediante el cual se generan copias de una secuencia deseada.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento altamente eficaz para amplificar ADN molde, que generalmente implica la mezcla de una muestra de ácido nucleico, dos o más cebadores diseñados para reconocer el ADN molde, una ADN polimerasa, que puede ser una ADN polimerasa termoestable tal como Taq o Pfu, y desoxirribosa nucleósido trifosfatos (dNTP, de sus siglas en inglés). La PCR de transcripción inversa, la pCr de transcripción inversa cuantitativa y la PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real son otros ejemplos específicos de PCR. En general, la mezcla de reacción se somete a ciclos de temperatura que comprenden una etapa de desnaturalización, (normalmente 80-100 °C) una etapa de alineamiento con una temperatura que se selecciona basándose en la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores y la degeneración de los cebadores, y etapa de extensión (por ejemplo, 40-75 °C). En el análisis de PCR en tiempo real, se utilizan reactivos, procedimientos, sistemas de detección óptica y dispositivos adicionales conocidos en la materia que permiten una medición de la magnitud de la fluorescencia en proporción a la concentración de ADN amplificado. En dichos análisis, puede detectarse o medirse la incorporación de colorante fluorescente en las cadenas amplificadas.

Como alternativa, las sondas marcadas que se unen a una secuencia específica durante la fase de alineamiento de la PCR pueden utilizarse con cebadores. Las sondas marcadas liberan sus marcadores fluorescentes durante la fase de extensión para que el nivel de fluorescencia pueda detectarse o medirse. Generalmente, las sondas son complementarias de una secuencia dentro de la secuencia diana cadena abajo del cebador cadena arriba o cadena abajo. Las sondas pueden incluir uno o más marcadores. Un marcador puede ser cualquier sustancia capaz de ayudar a una máquina, detector, sensor, dispositivo u ojo humano mejorado o no mejorado a diferenciar una composición marcada de una composición no marcada. Los ejemplos de marcadores incluyen, pero sin limitación: un isótopo radioactivo o quelato del mismo, colorante (fluorescente o no fluorescente), tinte, enzima o metal no radiactivo. Los ejemplos específicos incluyen, aunque no de forma limitativa: fluoresceína, biotina, digoxigenina, fosfatasa alcalina, biotina, estreptavidina, 3H, 14C, 32 P, 35S o cualquier otro compuesto capaz de emitir radiación, rodamina, ácido 4-(4'-dimetilamino-fenilazo)benzoico ("Dabcyl"); ácido 4-(4'-dimetilamino-fenilazo)sulfónico (cloruro de sulfonilo) ("Dabsyl"); ácido 5-((2-aminoetil)-amino)-naftaleno-1-sulfónico ("EDANS"); derivados de psoraleno, haptenos, cianinas, acridinas, derivados de rodol fluorescentes, derivados del colesterol; ácido etilendiaminotetraacético ("EDTA") y derivados de los mismos o cualquier otro compuesto que pueda detectarse diferencialmente. El marcador también puede incluir uno o más colorantes fluorescentes optimizados para su uso en genotipado. Los ejemplos de dichos colorantes incluyen, aunque no de forma limitativa: CAL-Fluor Red 610, CAL- Fluor Orange 560, dR110, 5-FAM, 6FAM, dR6G, JOE, HEX, VIC, TET, dTAMRA, TAMRA, NED, dROX, PET, BHQ+, Gold540y LIZ.PCR que facilitan la lectura de la amplificación diana.

Cualquiera de los cebadores o cebadores junto con las sondas, como se ha descrito anteriormente, permitirán una cuantificación de la cantidad de ADN molde específico presente en la muestra inicial. Además, el ARN puede detectarse mediante análisis de PCR creando primero una plantilla de ADN a partir de ARN a través de una enzima transcriptasa inversa. En algunos aspectos de la invención, el alelo puede detectarse mediante análisis de PCR cuantitativo que facilita el análisis de genotipado de las muestras.

Como ejemplo ejemplar, en la patente de EE.UU. N.° 5.716.784 para DiCesare se desvela la utilización de sondas de oligonucleótidos doblemente marcadas en reacciones de PCR. En la etapa de PCR de la reacción multiplex de RT-PCR/PCR de la presente invención, la sonda de oligonucleótidos fluorescente doblemente marcada se une al ácido nucleico diana entre los cebadores de oligonucleótidos flanqueantes durante la etapa de alineamiento de la reacción de PCR. El extremo 5' de la sonda de oligonucleótidos contiene el fluoróforo donador de transferencia de energía (flúor indicador) y el extremo 3' contiene el fluoróforo aceptor de transferencia de energía (flúor de extinción). En la sonda de oligonucleótidos intacta, el flúor de extinción en 3' apaga la fluorescencia del flúor indicador en 5'. Sin embargo, cuando la sonda de oligonucleótidos se une al ácido nucleico diana, la actividad exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa, por ejemplo, ADN polimerasa Taq, digerirá eficazmente la sonda de oligonucleótido marcada unida durante la etapa de amplificación. La digestión de la sonda de oligonucleótidos separa el flúor indicador en 5' del efecto de bloqueo del flúor de extinción en 3'. La aparición de fluorescencia por el flúor indicador se detecta y se controla durante la reacción, y la cantidad de fluorescencia detectada es proporcional a la cantidad de producto fluorescente liberado. Los aparatos adecuados para detección incluyen la plataforma de PCR en tiempo real Applied Biosystems™ 7900HT y el 480 LightCycler de Roche, el detector de secuencia ABI Prism 7700 con placas de reacción de 96 pocillos o el sistema de emulación 9600 o 9700 de GENEAMP PC en modo de emulación 9600 seguido de análisis por el detector de secuencia ABA Prism o sistema de detección por PCR TAQMAN LS-50B. La RT-PCR/PCR multiplex facilitada con sonda marcada también se puede realizar en otros sistemas de PCR en tiempo real con capacidades de multiplexación.

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En ensayos de PCR multiplex, la cuantificación relativa se utiliza a menudo para determinar los cambios en los niveles de ARNm en estado estable de un gen en múltiples muestras, y describe el nivel de ARNm en referencia a los niveles de un ARN de control interno (referencia). El ARN de control puede coamplificarse en el mismo tubo en un ensayo multiplex o puede amplificarse en un tubo separado. Generalmente, el ARN de control puede ser un gen de mantenimiento, o un gen con expresión constitutiva, o un patrón con concentración conocida. En cuantificación relativa, sin embargo, no requiere patrones con concentraciones conocidas y la referencia puede ser cualquier transcripción, siempre que se conozca su secuencia. La cuantificación relativa se basa en los niveles de expresión de un gen diana frente a uno o más genes de referencia, y en muchos experimentos, es adecuada para investigar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión génica. Para calcular la expresión de un gen diana en relación con un gen de referencia adecuado, se establecen varios modelos matemáticos. Los cálculos se basan en la comparación del ciclo distinto determinado por varios procedimientos, por ejemplo, puntos de cruce (CP, de sus siglas en inglés) y valores de ciclo umbral (Ct, de sus siglas en inglés) a un nivel constante de fluorescencia; o adquisición de CP de acuerdo con el algoritmo matemático establecido.

El algoritmo para los valores de Ct en RT-PCR calcula el ciclo en el que cada amplificación de PCR alcanza un umbral significativo. El valor de Ct calculado es proporcional al número de copias diana presentes en la muestra, y el valor de Ct es una medida cuantitativa precisa de las copias de la diana encontrada en cualquier muestra. En otras palabras, los valores de Ct representan la presencia de la diana respectiva que los conjuntos de cebadores están diseñados para reconocer. Si la diana falta en una muestra, no debería haber amplificación en la reacción de RT- PCR.

Como alternativa, puede utilizarse el valor de Cp. El valor de Cp representa el ciclo en el cual el aumento de fluorescencia es más alto y en el que comienza la fase logarítmica de una PCR. El software LightCycler® 480 calcula las segundas derivadas de curvas de amplificación enteras y determina dónde este valor es máximo. Al utilizar el algoritmo de segunda derivada, los datos obtenidos son más fiables y reproducibles, incluso si la fluorescencia es relativamente baja.

(b) Hibridación

Además de la PCR, el análisis de genotipado también puede realizarse utilizando una sonda que es capaz de hibridarse con una secuencia de ácido nucleico de interés. Las sondas pueden incluir ácidos nucleicos, oligonucleótidos (ADN o ARN), proteínas, complejos proteicos, conjugados, ligandos naturales, moléculas pequeñas, nanopartículas o cualquier combinación de moléculas que incluye una o más de las anteriores, o cualquier otra entidad molecular capaz de unirse específicamente a cualquier alelo, si tal entidad molecular existe ahora o aún está por desvelar. En un aspecto de la invención, la sonda comprende un oligonucleótido. La descripción del oligonucleótido se encuentra en la Sección I (ii).

Los procedimientos para detectar un gen o un alelo, generalmente, implican evaluar su nivel de expresión a través de sus productos transcripcionales o traduccionales tales como una molécula de proteína o ARN. La expresión de un gen o un alelo puede evaluarse mediante cualquiera de una serie de procedimientos utilizados actualmente en la materia y aún por desarrollar. Los ejemplos incluyen cualquier procedimiento de detección de ácido nucleico, que incluye los siguientes ejemplos no limitantes, análisis de micromatriz, hibridación de ARN in situ, ensayo de protección de RNasa, transferencia de Northern. Otros ejemplos incluyen cualquier procedimiento de detección de expresión que utiliza un anticuerpo que incluye los siguientes ejemplos no limitantes, citometría de flujo, inmunohistoquímica, ELISA, transferencia de Western, transferencia de Northwestern y cromatografía de inmunoafinidad. Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales o cualquier fragmento de anticuerpo, por ejemplo, Fab, F(ab)2, Fv, scFv, anticuerpo de presentación en fago, pepticuerpo, ligando multiespecífico o cualquier otro reactivo con unión específica a una diana. Otros procedimientos para evaluar la expresión de proteínas incluyen los siguientes ejemplos no limitantes: HPLC, espectrometría de masas, análisis de micromatriz de proteínas, análisis PAGE, enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel 2-D y ensayos enzimáticos.

En algunos aspectos de la invención, la presencia de un alelo puede establecerse mediante la unión a sondas en una micromatriz tal como un chip de ADN. Los ejemplos de chips de ADN incluyen chips en los que varias sondas de oligonucleótidos monocatenarias se fijan a un sustrato sólido tal como vidrio de silicio. Los oligonucleótidos con una secuencia complementaria a un alelo son capaces de unirse específicamente a ese alelo con la exclusión de los alelos que difieren del alelo específico por uno o más nucleótidos. El ADN de muestra marcado se hibrida con los oligonucleótidos y la detección del marcador se correlaciona con la unión de la muestra y, en consecuencia, la presencia del alelo en la muestra.

En la hibridación específica de alelo, las secuencias de oligonucleótidos que representan todas las variaciones posibles en un sitio polimórfico se incluyen en un chip. El chip y la muestra están sujetos a condiciones bajo las cuales el ADN de muestra marcado se unirá solamente a un oligonucleótido con una coincidencia de secuencia exacta. En la extensión de cebador específico de alelo, el ADN de muestra hibridado con el chip puede utilizarse como una plantilla de síntesis con el oligonucleótido fijado como cebador. En este procedimiento, solo los dNTP agregados están marcados. La incorporación del dNTP marcado sirve entonces como la señal que indica la presencia del alelo. El marcador fluorescente puede detectarse mediante cualquiera de una serie de instrumentos configurados para leer al menos cuatro marcadores fluorescentes diferentes en un chip de ADN. En otra alternativa,

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la identidad del dNTP final añadido al oligonucleótido puede evaluarse mediante espectrometría de masas. En esta alternativa, los dNTP pueden, pero no es necesario, marcarse con un marcador de peso molecular conocido.

Una sonda de ácido nucleico puede fijarse a un sustrato. Como alternativa, una muestra puede fijarse al sustrato. Una sonda o muestra puede unirse covalentemente al sustrato o puede unirse mediante alguna interacción no covalente que incluye electrostática, hidrófoba, enlaces de hidrógeno, Van der Waals, magnética o cualquier otra interacción mediante la cual una sonda, tal como una sonda de oligonucleótidos, puede unirse a un sustrato mientras se mantiene su capacidad de reconocer el alelo al que tiene especificidad. Un sustrato puede ser cualquier material sólido o semisólido sobre el que se pueda fijar una sonda, ya sea sola o en presencia de una o más sondas o muestras adicionales, como se ejemplifica en una micromatriz. Los ejemplos de materiales de sustrato incluyen, pero sin limitación, polivinilo, poliestireno, polipropileno, poliéster o cualquier otro plástico, vidrio, dióxido de silicio u otros silanos, hidrogeles, oro, platino, microperlas, micelas y otras formaciones de lípidos, nitrocelulosa o membranas de nailon. El sustrato puede tomar cualquier forma, incluyendo una perla esférica o superficie plana. Por ejemplo, la sonda puede unirse a un sustrato en el caso de una matriz o una reacción de PCR in situ. La muestra puede unirse a un sustrato en el caso de una transferencia Southern.

Una sonda de ácido nucleico puede incluir un marcador. Un marcador puede ser cualquier sustancia capaz de ayudar a una máquina, detector, sensor, dispositivo u ojo humano mejorado o no mejorado a diferenciar una composición marcada de una composición no marcada. Los ejemplos de marcadores incluyen, aunque no de forma limitativa: un isótopo radioactivo o quelato del mismo, colorante (fluorescente o no fluorescente), tinte, enzima o metal no radiactivo. Los ejemplos específicos incluyen, aunque no de forma limitativa: fluoresceína, biotina, digoxigenina, fosfatasa alcalina, biotina, estreptavidina, 3H, 14C, 32P, 35S o cualquier otro compuesto capaz de emitir radiación, rodamina, ácido 4-(4'-dimetilamino-fenilazo)benzoico ("Dabcyl"); ácido 4-(4'-dimetilamino- fenilazo)sulfónico (cloruro de sulfonilo) ("Dabsyl"); ácido 5-((2-aminoetil)-amino)-naftaleno-1-sulfónico ("EDANS"); derivados de psoraleno, haptenos, cianinas, acridinas, derivados de rodol fluorescentes, derivados del colesterol; ácido etilendiaminotetraacético ("EDTA") y derivados de los mismos o cualquier otro compuesto que pueda detectarse diferencialmente. El marcador también puede incluir uno o más colorantes fluorescentes optimizados para su uso en genotipado. Los ejemplos de dichos colorantes incluyen, aunque no de forma limitativa: dR110, 5-FAM, 6FAM, dR6G, JOE, HEX, VIC, TET, dTAMRA, TAMRA, NED, dROX, PET, BHQ+, Gold540 y LIZ.

(c) Secuenciación

Los procedimientos para detectar la presencia de un gen o un alelo incluyen, además, aunque no de forma limitativa, cualquier forma de secuenciación de ADN incluyendo Sanger, secuenciación de próxima generación, pirosecuenciación, secuenciación SÓLIDA, secuenciación masivamente paralela, secuenciación de ADN agrupada y con código de barras o cualquier otro procedimiento de secuenciación ahora conocido o aún por desvelar; o cualquier otro procedimiento que permita la detección de una secuencia de ácido nucleico particular dentro de una muestra o que permita la diferenciación de un ácido nucleico de otro ácido nucleico que difiera del primer ácido nucleico por uno o más nucleótidos, o cualquier combinación de estos.

En la secuenciación Sanger, una plantilla de ADN monocatenario, un cebador, una ADN polimerasa, nucleótidos y un marcador, tal como un marcador radioactivo conjugado con la base de nucleótidos o un marcador fluorescente conjugado con el cebador, y una base de terminación de cadena que comprende un didesoxinucleótido (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP) se añaden a cada una de las cuatro reacciones (una reacción para cada una de las bases de terminación de la cadena). La secuencia puede determinarse por electroforesis de las cadenas resultantes. En la secuencia de terminación de colorante, cada una de las bases de terminación de cadena está marcada con un marcador fluorescente de una longitud de onda diferente que permite que la secuenciación se realice en una única reacción.

En la pirosecuenciación, la adición de una base a una plantilla monocatenaria para ser secuenciada por una polimerasa da como resultado la liberación de un pirofosfato tras la incorporación de nucleótidos. Una enzima ATP sulfurilasa convierte el pirofosfato en ATP que, a su vez, cataliza la conversión de luciferina en oxiluciferina que da como resultado la generación de luz visible que luego es detectada por una cámara.

En la secuenciación SÓLIDA, la molécula a secuenciar se fragmenta y se utiliza para preparar una población de perlas magnéticas clonales (en la que cada perla se conjuga con una pluralidad de copias de un solo fragmento) con una secuencia adaptadora y, alternativamente, una secuencia de códigos de barras. Las perlas se unen a una superficie de vidrio. La secuenciación se realiza entonces a través de una codificación de 2 bases.

En la secuenciación masivamente paralela, el ADN diana aleatoriamente fragmentado se une a una superficie. Los fragmentos se amplían y se amplifican en puente para crear una celda de flujo con agrupaciones, cada una con una diversidad de copias de una secuencia de fragmento único. Las plantillas se secuencian mediante la sintetización de los fragmentos en paralelo. Las bases se indican mediante la liberación de un colorante fluorescente que se correlaciona con la adición de la base particular al fragmento.

(d) Realizaciones preferidas

En la Tabla A se muestra un grupo de realizaciones ejemplares. La presente invención proporciona, en una

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realización, que el ensayo 1, ensayo nuc-Sa, que utiliza el conjunto de cebadores 1 representado por las SEQ ID NO. 1 y 2 y/o la sonda 1 representada por la SEQ ID NO. 3, puede llevarse a cabo para identificar y diferenciar S. aureus, CNS y otras especies.

En otra realización, el ensayo 2, ensayo femA-Sa, que utiliza el conjunto de cebadores 2 representado por las SEQ ID NO. 4 y 5 y/o la sonda 2 representada por la SEQ ID NO. 6, puede llevarse a cabo para identificar y diferenciar S. aureus, CNS y otras especies.

En una realización, el ensayo 3,ensayo femA-Se, que utiliza el conjunto de cebadores 3 representado por las SEQ ID NO. 7 y 8 y/o la sonda 3 representada por la SEQ ID NO. 9, puede llevarse a cabo para identificar y diferenciar S. epidermidis de otras especies de Staphylococcus.

En una realización, el ensayo 4, ensayo tuf-Sa, que utiliza el conjunto de cebadores 4 representado por las SEQ ID NO. 10 y 11 y/o la sonda 4 representada por la SEQ ID NO. 12, puede llevarse a cabo para identificar S. aureus.

En una realización, el ensayo 5, ensayo tuf-CNS, que utiliza el conjunto de cebadores 5 representado por las SEQ ID NO. 13 y 14 y/o la sonda 5 representada por la SEQ ID NO. 15, puede llevarse a cabo para identificar CNS.

En una realización, el ensayo 6, ensayo mecA, que utiliza el conjunto de cebadores 6 representado por las SEQ ID NO. 16 y 17 y/o la sonda 6 representada por la SEQ ID NO. 18, puede llevarse a cabo para identificar y diferenciar fenotipos de resistencia a meticilina y penicilina.

En una realización preferida, un ensayo multiplex diferencial, ensayo multiplex tuf, que combina el ensayo tuf-Sa (ensayo 4) y el ensayo tuf-CNS (ensayo 5) ilustrados anteriormente mediante la utilización de conjuntos de cebadores y sondas en una reacción de RT-PCR, puede utilizarse para diferenciar S. aureus y CNS.

Otro ensayo multiplex preferido para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE o MSSE en una muestra comprende el ensayo femA-Se (ensayo 3); el ensayo mecA (ensayo 6); y al menos un ensayo elegido entre el ensayo nuc-Sa (ensayo 1) y el ensayo femA-Sa (ensayo 2).

Aún otro ensayo multiplex preferido para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS en una muestra comprende el ensayo mecA (ensayo 6) y dos ensayos elegidos entre ensayo femA-Se (ensayo 3), el ensayo tuf-Sa (ensayo 4) y el ensayo tuf-CNS (ensayo 5).

La combinación de ensayos en un ensayo de RT-PCR/PCR multiplex es mediante la utilización de múltiples conjuntos de cebadores y/o sondas, respectivamente, en una reacción de RT-PCR. El ensayo de RT-PCR/PCR multiplex puede comprender cualquier número o cualquier combinación de ensayos individuales, incluso si algunos de los ensayos son redundantes en fines pero sirven como una herramienta de verificación.

En algunas otras realizaciones, los ensayos individuales (ensayos 1-6) desvelados en el presente documento también pueden llevarse a cabo por separado, sin embargo, los resultados de estos ensayos individuales pueden superponerse y compararse después de la normalización del control interno. (III) Kits.

Aún otro aspecto de la invención abarca kits para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS en una muestra. Los kits comprenden conjuntos de cebadores y sondas para el ensayo mecA y dos ensayos elegidos entre el ensayo FemA-Se, el ensayo tuf-Sa, y el ensayo tuf-CNS. Como se describe en detalle en las secciones anteriores y en la Tabla A: el ensayo de femA-Se para identificar y diferenciar S. epidermidis de otras especies de Staphylococcus mediante la aplicación del conjunto de cebadores 3, representado por las SEQ ID NO. 7 y 8 y/o la sonda 3, representada por la SEQ ID NO. 9; el ensayo tuf-Sa para identificar S. aureus mediante la aplicación del conjunto de cebadores 4, representado por las SEQ ID NO. 10 y 11 y/o la sonda 4, representada por la SEQ ID NO. 12; el ensayo tuf-CNS para identificar CNS mediante la aplicación del conjunto de cebadores 5, representado por las SEQ ID NO. 13 y 14 y/o la sonda 5, representada por la SEQ ID NO. 15; y el ensayo mecA para identificar y diferenciar fenotipos de resistencia a meticilina y penicilina mediante la aplicación del conjunto de cebadores 6, representado por las SEQ ID NO. 16 y 17 y/o la sonda 6, representada por la SEQ ID NO. 18.

El ensayo multiplex es un tipo de análisis elegido de PCR, RT-PCR, secuenciación, hibridación y cualquier combinación de los mismos, en el que se utiliza un conjunto de cebadores o una sonda o ambos para detectar la presencia o ausencia de secuencias diana. Los ensayos que detectan genes diana respectivos pueden llevarse a cabo individualmente en sistemas de reacción separados múltiples, o en un sistema de reacción combinado y mixto para PCR, RT-PCR, secuenciación, hibridación o cualquier combinación de los mismos.

El kit para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS en una muestra mediante un ensayo multiplex comprende conjuntos de cebadores y sondas para el ensayo mecA y otros dos ensayos elegidos entre el ensayo femA-Se, el ensayo tuf-Sa y el ensayo tuf-CNS.

Los kits que facilitan los ensayos basados en ácido nucleico pueden comprender además uno o más de los siguientes: reactivos de extracción de ácido nucleico, controles, cartuchos desechables, reactivos de marcaje, enzimas que incluyen reactivos de amplificación para PCR tales como las ADN polimerasas Taq o Pfu, transcriptasa

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En otra realización, el kit puede comprender además un marcador que se puede utilizar para marcar el oligonucleótido del cebador o de la sonda. Un marcador puede ser cualquier sustancia capaz de ayudar a una máquina, detector, sensor, dispositivo u ojo humano mejorado o no mejorado, para diferenciar una muestra que exhibe una expresión positiva de una muestra que exhibe una expresión reducida. Los ejemplos de marcadores incluyen, aunque no de forma limitativa: un isótopo radioactivo o quelato del mismo, un colorante (fluorescente o no fluorescente), tinte, enzima o metal no radiactivo. Los ejemplos específicos incluyen, aunque no de forma limitativa: fluoresceína, biotina, digoxigenina, fosfatasa alcalina, biotina, estreptavidina, 3H, 14C, 32P, 35S o cualquier otro compuesto capaz de emitir radiación, rodamina, ácido 4-(4'-dimetilamino-fenilazo)benzoico ("Dabcyl"); ácido 4-(4'- dimetilamino-fenilazo)sulfónico (cloruro de sulfonilo) ("Dabsyl"); ácido 5-((2-aminoetil)-amino)-naftaleno-1-sulfónico ("EDANS"); derivados de psoraleno, haptenos, cianinas, acridinas, derivados de rodol fluorescentes, derivados del colesterol; ácido etilendiaminotetraacético ("EDTA") y derivados de los mismos, o cualquier otro compuesto que indique la presencia del ácido nucleico marcado. En una realización de la invención, el marcador incluye uno o más colorantes optimizados para su uso en genotipado. Los ejemplos de dichos colorantes incluyen, aunque no de forma limitativa: dR110, 5-FAM, 6FAM, dR6G, JOE, HEX, VIC, TET, dTAMRA, TAMRA, NED, dROX, PET, BHQ+, Gold540 y LIZ.

En aún otra realización, los cebadores y las sondas en el kit pueden haber sido marcados, y pueden aplicarse sin un procedimiento de marcaje en PCR, reacción de secuenciación o unión a un sustrato sólido tal como una matriz de oligonucleótidos.

Un kit para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS en una muestra también puede comprender instrucciones para su uso. En una realización, el kit puede comprender además una indicación que vincula el resultado de los ensayos proporcionados por el kit a un resultado particular. Por ejemplo, una indicación puede proporcionar una guía para asociar la presencia o ausencia de una o más secuencias a la identificación de un filo bacteriano particular, clase, orden, familia, especie de género, subespecies, cepa o cualquier otra definición de un grupo de bacterias. La indicación puede contener una curva estándar configurada para cuantificar la cantidad de bacteria presente en una muestra. El resultado del ensayo puede estar en forma de una secuencia particular, un genotipo particular, un nivel de ACt particular en una reacción de PCR cuantitativa en tiempo real, un nivel de fluorescencia o desintegración radiactiva, un valor procedente de una curva estándar, o de un control positivo o negativo, o cualquier combinación de estos y otros resultados. La indicación puede estar impresa en un escrito que puede estar incluido en el kit, o puede publicarse en Internet o incorporarse en un paquete de software. El escrito puede incluir representaciones gráficas de resultados tales como una fotomicrografía o un diagrama de amplificación.

Un kit para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS en una muestra puede comprender además un dispositivo utilizado para recoger la muestra. Dichos dispositivos pueden incluir, pero no se limitan a: hisopos, agujas, tubos de recogida de sangre, toallitas húmedas o cualquier otro aparato que pueda utilizarse para recoger una muestra biológica de un paciente o del medio ambiente ahora conocido o aún por desvelar.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran ciertos aspectos de la invención.

Ejemplo 1- Especificidad y Selectividad

La presente invención desvela ensayos de PCR en tiempo real diseñados para diferenciar entre MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS en muestras mixtas utilizando combinaciones específicas de hasta 4 ensayos dependiendo de la aplicación. El rendimiento de los ensayos individuales que utiliza paneles de aislados bacterianos se muestra en las tablas 2-6. Todos los ensayos han demostrado ser altamente sensibles y específicos. Los ensayos para identificar MSSA y MRSA se incluyen en el ensayo de detección. Si bien las infecciones de MSSA generalmente son más fáciles de tratar, siguen siendo un factor significativo en las infecciones adquiridas en el hospital. Además, se ha demostrado que la colonización con MRSA o MSSA aumenta el riesgo de infección. Los ensayos de MSSA, MRSA y CoNS se incluyen en el ensayo de diagnóstico ya que todos son factores importantes en la infección quirúrgica, la bacteriemia y la infección del dispositivo implantable, y tanto el MRCNS como el MSCNS se están convirtiendo en un problema creciente.

Estos ensayos pueden utilizarse en combinación para identificar MRSA que utiliza los genes nuc y femA-S.aureus como marcadores para detectar S. aureus, que utiliza el gen tuf como marcador para diferenciar S. aureus del estafilococo coagulasa negativo (CNS), que utiliza el gen femA-S. epi como marcador para descartar la presencia de Staphylococcus epidermidis y que utiliza el gen mecA como marcador para determinar la resistencia a la meticilina/penicilina. Para el estafilococo coagulasa negativo, los cebadores representados por la SEQ ID NO. 13, la SEQ ID NO. 14 y la SEQ ID NO. 15, del gen tuf de la especie del CNS Staphylococcus capitis, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. saprophyticus, S. simulans y S. warneri se alinearon para diseñar los cebadores utilizados en el ensayo para detectar CNS (Tabla 1 y Tabla 5). El ensayo que utiliza la sEq ID NO. 13, la

SEQ ID NO. 14 y la SEQ ID NO. 15 puede detectar el gen tuf en cualquiera de las especies de CNS enumeradas.

Tabla 1 - Conjunto de cebadores y sondas

Diana

Descripción Secuencia SEQ ID NO.

nuc

nuc_directo CCAAGCCTTGACGAACTAAAGCT 1

nuc_inverso

GGTCCTGAAGCAAGTGCATTTAC 2

Sonda nuc

CAGCATAAATATACGCTAAGCCACGT CCA 3

femA-S. aureus

femA_S.aureus_D TCAAATCGCGGTCCAGTGAT 4

femA_S.aureus_I

ATTACCTGTAATCTCGCCATCATGA 5

sonda femA_Sa

CATCGTTGTCTATACCTACATATC 6

femA-S. epi

femA_S.epi_D GCTGGTGGAACTTCAAATCGTTA 7

femA_S.epi_I

CG ATT AAT ACC AT GTT CAATT GC AT A G 8

sonda femA_S.epi

TTT G C AG G G AG CTATG CG GTT CAA 9

tuf*

tuf-S.aureus_D AGAATTAATGGAAGCT GTAGATACTT ACATTC 10

tuf-S.aureus_I

CT GT AAC AGTT GTTTT AG AT GT GT C A TGTAA 11

sonda tuf-S.aureus

CTCCAGAACGTGATTCTGACAAACCA TTCA 12

tuf-CNS_D

G CT C AAAAG AAC AT G CCAAT ATT G 13

tuf-CNS_I

TAATACAGTTGCGATAGCAGCTGTT 14

sonda tuf-CNS

AAAGTWGTTTTACCAT GGT CAACGT GACCG 15

mecA

mecA_D G G AACG AT G CCTATCT CAT ATG CT 16

mecA_I

ATAGCGTCATTATTCCAGGAATGCA 17

sonda mecA

TTGGCCAATTCCACATTGTTTCGGTC 18

Tabla 2: Detección de S. aureus, CNS y otras especies utilizando el ensayo femA-S. aureus (SEQ ID NO. 4,

SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6).

Resultados:

S. aureus CNS Otro

Detectados

55 3 0

No detectados

4 94 83

Total cribado

59 97 83

5 Tabla 3: Detección de S. aureus, CNS y otras especies utilizando el ensayo nuc (SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2

y SEQ ID NO. 3)

Resultados:

S. aureus CNS Otro

Detectados

56 3 0

No detectados

3 94 83

Total cribado

59 97 83

Tabla 4. Detección de S. epidermidis utilizando el ensayo FemA-S. epidermidis (SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 y

SEQ ID NO. 6).

Resultados:

S. epidermidis Otro estafilococo Otro

Detectados

34 25 2

(continuación)

Resultados:

S. epidermidis Otro estafilococo Otro

No detectados

4 93 81

Total cribado

38 118 83

Tabla 5: Detección de S. aureus(SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID NO. 12) o CNS utilizando el ensayo multiplex diferencial tuf (SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14 y SEQ ID NO. 15).

Resultados:

S. aureus CNS Otro

Ensayo S. aureus detectado

55 3 0

Ensayo S. aureus no detectado

4 94 83

Ensayo CNS detectado

2 92 4

Ensayo CNS no detectado

57 5 79

Tabla 6: Detección de Staphylococcus aureus resistente a meticilina utilizando el ensayo mecA (SEQ ID NO. 5 16, SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO. 18).

Resultados:

Resistente Susceptible Desconocido

Detectados

60 1 3

No detectados

0 25 0

Total cribado

60 26 3

Los ensayos desvelados, como se muestra en las tablas anteriores, incluyen: (1) ensayo FemA-S. aureus para detectar S. aureus, CNS y otras especies utilizando los cebadores representados por las sEq ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 (Tabla 2); (2) ensayo nuc para detectar S. aureus, CNS y otras especies utilizando los cebadores representados por las SeQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3 (Tabla 3); (3) ensayo femA-S. epidermidis para 10 detectar S. epidermidis utilizando los cebadores representados por la SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6 (Tabla 4); (4) ensayo multiplex diferencial tuf para detectar S. aureus utilizando la SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11 y SEQ ID nO. 12 o para detectar CNS utilizando los cebadores representados por la SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14 y SEQ ID NO. 15 (Tabla 5); y (5) ensayo mecA para detectar Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) utilizando los cebadores representados por la SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO. 18 (Tabla 6).

15 Además, se estaba utilizando un ensayo CoNS más amplio y el rendimiento del ensayo CoNS se refleja en la siguiente Tabla 7 A-D.

Tabla 7 A: Ensayo S. Aureus 1 para la identificación de S. aureus

Resultados:

S.aureus CNS Otro

Detectados

57 0 0

No detectados

1 97 83

Total cribado

58 97 83 238

Tabla 7 B: Ensayo S. Aureus 2 para la identificación de S. aureus

Resultados:

S.aureus CNS Otro

Detectados

58 0 0

No detectados

0 97 83

Total cribado

58 97 83 238

Tabla 7 C: Ensayo mecA para la detección del gen mecA

Resultados:

Resistente Susceptible Desconoci do

mecA detectado

86 0 0

mecA no detectado

4* 53 0

S. aureus total cribado

90 53 0 143

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tabla 7 D: Detección de S. aureus o CNS utilizando multiplex diferencial

Resultados:

S.aureus CNS Otro

Ensayo S. aureus detectado

58 0 0

Ensayo S. aureus no detectado

0 97 83

Ensayo CNS detectado

0 96 2

Ensayo CNS no detectado

58 1 81

Total cribado

58 97 83 238

Los ensayos anteriores que se muestran en la Tabla 2-7 pueden utilizarse individualmente, en cualquier combinación entre sí, o con ensayos adicionales, para determinar si MRSA está presente o no en una muestra. Esto incluye la realización de todos los ensayos por separado, en una única ejecución de PCR, en una única reacción de secuenciación, en una única matriz, o en cualquier otra combinación ahora conocida o aún por desvelar. Las especies evaluadas en estos ensayos incluyen, aunque no de forma limitativa: S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus, S. capitis, S. lugdunensis, S. xylosus, S. equorum, S. hominis, S. kloosi, S. galliharium, S. chonii, y S. arlettae.

Ejemplo 2 - Valores diferenciales de Ct que diferencian a MRSA, MSSA, MRSE y MSSE, incluidas las mezclas de los mismos

Empleando múltiples ensayos con eficiencias similares, el gen mecA puede vincularse a SA o CoNS mediante la utilización de valores relativos de Ct. Los diagramas de amplificación ilustrados en las Figuras 1-6, muestran cómo las amplificaciones del ensayo se unen para producir un resultado. Las muestras utilizadas para generar estos diagramas de ejemplo fueron una cohorte de 50 muestras respiratorias remanentes; hisopos faríngeos, hisopos nasales o esputos. Los resultados muestran una fuerte correlación entre los resultados del cultivo y los resultados de la PCR, véase la Tabla 8.

El procedimiento para identificar y diferenciar MSSA, MRSA y CoNS empleados en los ensayos desvelados en el presente documento evitan algunos de los inconvenientes que se han documentado al utilizar la inserción del casete SCCmec como una diana, tal como, falsos positivos de casete vacío (Wang H. JCM 2010; 48: 3528) y se han omitido los falsos negativos de tipo clonal. (Peterson LR. JCM 2010; 48:1661). Además, los ensayos desvelados en el presente documento proporcionan información clínica, tanto para el cribado como para el diagnóstico, que es altamente relevante para preguntas clínicas y no está disponible a partir de otros ensayos de MRSA disponibles comercialmente.

Las figuras 1-6 muestran un conjunto de diagramas de amplificación combinados que ilustran cómo funcionan los ensayos desvelados en combinación para identificar directamente MRSA, MSSE, MRSE y MSSE en muestras clínicas. Los resultados son ensayos separados superpuestos en un único diagrama de amplificación. Dado el tipo de muestra, respiratoria, muchas fueron muestras mezcladas que sirvieron para desafiar e ilustrar la capacidad de los ensayos para identificar y diferenciar S. aureus y S. epidermidis con y sin el gen mecA. Si bien se muestran dos ensayos diferentes de S. aureus, es decir, ensayos femA y nuc, ambos son redundantes y útiles para el fin de evaluar comparativamente el rendimiento del ensayo. Un ensayo S. aureus, ya sea femA o nuc, y el ensayo mecA pueden utilizarse para identificar y diferenciar MSSA y MRSA. Los diagramas particulares en las Figuras 1-6 utilizan un ensayo de S. epidermidis. Se utilizó un ensayo CoNS más amplio y el rendimiento de ese ensayo se refleja en el ejemplo 1, Tabla 7 A-D.

La Figura 1 representa los resultados de un conjunto de ensayos de PCR en tiempo real utilizados para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6604. El ensayo utilizado para detectar la presencia de nuc (SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3) dio como resultado un Ct de 33,2. El ensayo utilizado para detectar la presencia de femA de S. aureus (SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 y SEQ ID NO. 6) dio como resultado un Ct de 33,6. Ambos resultados indican que la muestra incluía S. aureus. El ensayo utilizado para detectar la presencia de mecA (SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO. 18) no mostró amplificación. El ensayo para detectar la presencia de femA de S. epidermidis (SEQ ID No. 7, SEQ ID nO. 8 y SEQ ID No. 9) tampoco mostró amplificación. En resumen, esta muestra contenía S. aureus, pero el S. aureus presente no era resistente a la meticilina. La muestra no contenía S. epidermidis. Por lo tanto, las muestras que muestran este patrón de amplificación pueden clasificarse como S. aureus sensibles a meticilina (MSSA).

La Figura 2 representa los resultados de un conjunto de ensayos de PCR en tiempo real utilizados para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6608. El ensayo para detectar la presencia de nuc dio como resultado un Ct de 33,6. El ensayo para detectar la presencia de femA de S. aureus dio como resultado un Ct de 33,5. El ensayo para detectar la presencia de mecA dio como resultado un Ct de 33,9. El ensayo para detectar la presencia de femA de S. epidermidis no mostró amplificación. En resumen, la muestra contenía S. aureus que es resistente a meticilina. La muestra no contenía S. epidermidis. Las muestras que muestran este patrón de amplificación pueden clasificarse como S. aureus resistentes a meticilina (MRSA). La presencia de MRSA se confirmó mediante cultivo

5

10

15

20

25

30

35

40

bacteriano.

La Figura 3 representa los resultados de un conjunto de ensayos de PCR en tiempo real utilizados para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6588. El ensayo para detectar la presencia de nuc dio como resultado un Ct de 32,0. El ensayo para detectar la presencia de femA de S. aureus dio como resultado un Ct de 31,3. El ensayo para detectar la presencia de mecA dio como resultado un Ct de 35,2. El ensayo para detectar la presencia de femA de S. epidermidis dio como resultado un Ct de 35,9. En resumen, esta muestra contenía tanto S. aureus como S. epidermidis. Debido a que la amplificación de mecA tiene un Ct similar a la de femA de S. epidermidis, la resistencia a la meticilina es una característica de S. epidermidis y no de S. aureus. Las muestras que muestran este patrón de amplificación pueden clasificarse como que contienen una mezcla de S. aureus sensible a meticilina (MSSA) y S. epidermidis resistente a meticilina (MRSE).

La Figura 4 representa los resultados de un conjunto de ensayos de PCR en tiempo real utilizados para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6607. El ensayo para detectar la presencia del gen nuc dio como resultado un Ct de 30,1. El ensayo para detectar la presencia de femA de S. aureus dio como resultado un Ct de 30,3. El ensayo para detectar la presencia del gen mecA dio como resultado un ACt de 30,8. El ensayo para detectar la presencia del gen femA de S. epidermidis dio como resultado un ACt de 34,6. En resumen, esta muestra contiene tanto S. aureus como S. epidermidis. Debido a que la amplificación de mecA tiene un Ct similar a la de femA de S. aureus, la resistencia a meticilina es una característica de S. aureus y no de S. epidermidis. Las muestras que muestran este patrón de amplificación pueden clasificarse como que contienen una mezcla de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) y S. epidermidis sensible a meticilina (MSSE, de sus siglas en inglés).

La Figura 5 representa los resultados de un conjunto de ensayos de PCR en tiempo real utilizados para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6759. El ensayo para detectar la presencia del gen nuc dio como resultado un Ct de 31,9. El ensayo para detectar la presencia del gen femA de S. aureus dio como resultado un Ct de 32,1. El ensayo para detectar la presencia del gen mecA dio como resultado un Ct de 28,8. El ensayo para detectar la presencia del gen femA de S. epidermidis dio como resultado un Ct de 34,8. En resumen, esta muestra contenía tanto S. aureus como S. epidermidis. Debido a que la amplificación de mecA se produjo antes que la de nuc, los ensayos femA de S. aureus y femA de S. epidermidis, la resistencia a la meticilina es una característica tanto de S. aureus como de S. epidermidis que se encuentran en la muestra. Esto se debe al efecto aditivo del gen mecA que se produce tanto en S. aureus como en S. epidermidis. Las muestras que muestran este patrón de amplificación pueden clasificarse como que contienen una mezcla de S. aureus resistente a meticilina (MRSA) y S. epidermidis resistente a meticilina (MRSE).

La Figura 6 representa los resultados de un conjunto de ensayos de PCR en tiempo real utilizados para analizar la muestra de hisopos faríngeos designada TG6775. El ensayo para detectar la presencia de nuc dio como resultado un Ct de 30,2. El ensayo para detectar la presencia de femA de S. aureus dio como resultado un Ct de 30,1. El ensayo para detectar la presencia de mecA dio como resultado un Ct de 26,8. El ensayo para detectar la presencia del gen femA de S. epidermidis dio como resultado un Ct de 34,1. Esta muestra que mostró el mismo patrón de amplificación que en la Figura 5, y por lo tanto, puede caracterizarse como que contiene tanto MRSA como MRSE. Los valores Ct que representan la presencia de genes respectivos de muestras de pacientes se resumen en la Tabla 8. La plataforma de PCR en tiempo real Applied Biosystems™ 7900HT y el 480 LightCycler de Roche se utilizaron para el análisis de valores de Ct.

Tabla 8: Valores de Ct que representan la presencia de genes respectivos

Muestra

16s nuc femA-S. aureus mecA femA-S. epi. Ct del alelo tuf nomenclatur a de alelo tuf Clasificación

TG6582

15,7 34,9 34,5 33,8 ID 36,1 S. aureus MRSA

TG6586

19,6 36,7 35,4 35,3 ID 36,4 S. aureus MRSA

TG6587

15,2 34,5 33,1 32,8 ID 34,5 S. aureus MRSA

TG6588

15,0 32,0 31,3 35,2 35,9 33,3 S. aureus MSSA/MRSE

TG6590

18,0 ID ID ID 35,9 ID ID MSSE

TG6592

16,4 36,5 35,6 ID ID 35,9 S. aureus MSSA

TG6595

18,7 30,1 29 ID ID 29,2 S. aureus MSSA

TG6597

18,5 ID 36,8 ID ID MSSA

TG6598

18,8 ID ID 36,3 ID ID ID MR en CNS

TG6599

19,4 29,5 29 ID ID MSSA

TG6604

17,3 33,2 33,6 ID ID 36,0 S. aureus MSSA

TG6607

22,4 30,1 30,3 30,8 34,6 31,6 28,4 S. aureus S. epi MRSA/MSSE*

TG6608

22,1 33,6 33,5 33,9 ID 36,1 S. aureus MRSA

TG6612

24,1 30,2 30,6 29,9 ID 31,2 S. aureus MRSA

5

10

15

20

25

30

35

(continuación)

Muestra

16s nuc femA-S. aureus mecA femA-S. epi. Ct del alelo tuf nomenclatur a de alelo tuf Clasificación

TG6615

15,9 37,3 35,7 ID ID 36,9 S. aureus MSSA

TG6752

16,2 28,7 27,1 ID 37,1 28,2 S. aureus MSSA/MSSE

TG6754

18,5 29,0 29,0 ID 37,1 30,6 S. aureus MSSA/MSSE

TG6759

14,7 31,9 32,1 28,8 34,8 ID ID MRSA/MRSE

TG6775

17,5 30,2 30,1 26,8 34,1 25,8 CNS MRSA/MRSE

TG6776

24,4 36,8 ID ID ID ID ID MSSA

TG6777

15,7 28,7 28,0 ID ID 29,6 S. aureus MSSA

TG6778

17,1 32,8 31,7 ID ID 33,6 S. aureus MSSA**

TG6779

17,1 32,9 32,1 ID ID 34,1 S. aureus MSSAf

16s es un ensayo destinado a detectar la presencia de cualquier bacteria.

ID significa que la amplificación era indetectable.

CNS significa estafilococos coagulasa negativos.

No SA/No SE significa que no se detectó S. aureus ni S. epidermidis. * significa para hisopo nasal, ** significa para muestra nasofaríngea, y

f significa para muestra de esputo. Las muestras restantes fueron hisopos de garganta.

Ejemplo 3: Cribado de PCR en tiempo real multiplex utilizando valores de Cp

Este ejemplo describe el procedimiento, el equipo y los reactivos necesarios para realizar una PCR multiplex en tiempo real en el instrumento Lightcycler 480 para determinar la presencia o ausencia de ADN genómico de Staphylococcus aureus resistente y/o susceptible a meticilina y Staphylococcus coagulasa negativo (CNS) extraído de muestras o aislados clínicos utilizando valores relativos de Cp de los ensayos desvelados en el presente documento.

Artículos necesarios: PerfeCTa® MultiPlex qPCR SuperMix (Quanta Cat # 95063); Cebadores y sondas del ensayo (Tabla 1); Agua de calidad de biología molecular; Tubos de microcentrífuga; Placas de reacción ópticas compatibles con instrumentos en tiempo real; Película y aplicador adhesivo óptico; Micropipetas y puntas; Plantilla de ADN y controles apropiados (ADNg de MRSA y CNS); Centrífuga con rotores para tubos y placas; Roche Lightcycler 480.

Preparación de reacción:

i. Compensación de color: Si se ejecuta el ensayo por primera vez en el instrumento, se debe generar un archivo de compensación de color. Deben realizarse reacciones con al menos 5 réplicas de ADN de control positivo para cada ensayo en singleplex, tuf-Sa, tuf-CNS y mecA y 5 réplicas totales de controles sin plantilla. Solo debe generarse un archivo de compensación de color para este ensayo multiplex una vez. Véase el manual de usuario LC480 para más detalles. Preparar reacciones de compensación de color de la siguiente manera.

ii. Procedimiento de ensayo: (1) calcular el volumen de mezcla maestra necesaria (volumen de reacción x número de muestras x 1,1); (2) mezclar los reactivos a ese volumen para una concentración de reacción final de: PerfeCTa® MultiPlex qPCR SuperMix 1X; cebador directo 300 nM; cebador inverso 300 nM; sonda 125 nM; añadir agua para aumentar el volumen, de modo que se alcancen las concentraciones finales tras agregar la plantilla; (3) transferir la mezcla maestra de la matriz a la placa de reacción óptica; (4) agregar la plantilla de control: añadir la plantilla de ADN de MRSA a cada pocillo de reacción de tuf-Sa y mecA; añadir la plantilla de ADN de CNS a cada pocillo de reacción de tuf-CNS; añadir agua a los pocillos de reacción de control sin plantilla. Para ejecuciones posteriores en el mismo instrumento, no es necesario realizar ensayos singleplex. El archivo de compensación de color generado anteriormente se puede aplicar a todos los ensayos multiplex posteriores que utilizan estos fluoróforos.

iii. Configuración multiplex: (1) calcular el volumen de mezcla maestra necesaria (volumen de reacción x número de muestras x 1,1); (2) mezclar los reactivos a ese volumen para una concentración final de: PerfeCTa® MultiPlex qPCR SuperMix 1X; cada cebador 300 nM; cada sonda 125 nM; luego, añadir agua para aumentar el volumen, de modo que se alcancen las concentraciones finales tras agregar la plantilla; (3) transferir la mezcla maestra de la matriz a la placa de reacción óptica; (4) añadir 0,5 a 10 ng de aDn extraído del cultivo, y añadir más si el ADN se extrae de las muestras (puede ser necesaria la optimización de la cantidad de la plantilla); sellar la placa óptica con una película adhesiva óptica y centrifugar el líquido.

Ciclo térmico: en primer lugar, cargar la placa del instrumento; luego, en el software LC480, crear un nuevo experimento con el siguiente programa: (1) en el menú Formato de detección (Detection Format), seleccionar Sonda de hidrólisis multicolor (Multi Color Hydrolysis Probe); (2) seleccionar Personalizar (Customize) y seleccionar los colores FAM (483-533), Hex (523-568) y Rojo 610 (558-610), anular la selección de otros; (3) introducir el volumen

5

10

15

20

25

30

35

de reacción apropiado; (4) comenzar a ejecutar y nombrar el archivo. Un ejemplo de programa se ilustra aquí en la Tabla 9:

Tabla 9: Ciclo térmico

Programas

Nombre del programa

Ciclos Modo de análisis

Comienzo en caliente

1 Ninguno

Amplificación

40 Cuantificación

Agente de enfriamiento

1 Ninguno

Objetivos de temperatura

Objetivo (°C)

Modo de adquisición Mantenimiento (hh:mm:ss) Velocidad de aumento (°C/s) Adquisición (por °C)

Comienzo en caliente

95

Ninguno 0:03:00 4,8

Amplificación

95

Ninguno 0:00:15 4,8

65

Único 0:01:00 2,5

Agente de enfriamiento

40

Ninguno 0:00:10 2,5

Configuración del software para compensación de color: Para la generación del archivo de compensación de color, designar las reacciones de compensación de color de la siguiente manera: (1) en Editor de muestras (Sample Editor), luego en el menú de flujo de trabajo (Workflow), seleccionar Comp. de color (Color Comp); (2) resaltar muestras de comp. de color de control positivo de un ensayo; (3) elegir el detector para ese ensayo en el menú desplegable Canal Dominante (Dominant Channel); (4) hacer clic en Hacer réplicas (Make Replicate); (5) repetir para los otros dos ensayos; (6) resaltar que no hay controles de plantilla, y elegir Agua (Water) en el menú Canal Dominante (Dominant Channel); (7) crear un subconjunto que incluya todos los pocillos de reacción de compensación de color. Después de los pasos anteriores, el procedimiento de configuración continúa con la configuración normal del software para nombrar muestras y designar subconjuntos para muestras que se ejecutan en el ensayo multiplex.

Análisis:

i. Compensación de color: desde el menú Crear nuevo análisis (Create New Analysis), elegir Compensación de color (Color Compensation) y seleccionar el subconjunto de reacciones de compensación de color, luego seleccionar Calcular (Calculate); a continuación, guardar (Save) este archivo para aplicarlo a análisis posteriores de este ensayo multiplex.

ii. Multiplex: (1) desde el menú Crear nuevo análisis (Create New Analysis), elegir AbxQuant/2nd Derivative Max, y seleccionar el subconjunto de muestras para analizar; (2) en el menú desplegable Compensación de color (Color Compensation), elegir En la base de datos (In Database), luego elegir el archivo de compensación de color generado anteriormente; (3) seleccionar Calcular (Calculate) y seleccionar las reacciones para las cuales se necesitan datos, luego exportar los resultados; (4) seleccionar el siguiente color en Filter Comb y Calcular (Calculate), luego seleccionar reacciones y resultados de exportación; (5) repetir para el último color.

Resultados: La Tabla 10 presenta los datos de Cp de singleplex y multiplex recopilados de varias muestras mezcladas con diferente combinación y proporciones de MRSA, MSSA, MRCNS o MSCNs. Por ejemplo, en el grupo 1, se mezclaron MRSA y MSSA en 5 proporciones diferentes: 1:1, 1:0,1, 0,1:1, 1:0,01 y 0,01:1. Cada mezcla tiene un duplicado en el mismo experimento para reproducibilidad. Para las muestras del grupo 1, se llevaron a cabo los ensayos singleplex femA, mecA, nuc, tuf-Sa y tuf-CNS, y el valor de Cp para cada ensayo se incluyó en la Tabla 10. Luego se llevaron a cabo tres ensayos multiplex: 1) femA y mecA; 2) nuc y mecA; y 3) tuf y mecA. El valor relativo de Cp entre femA y mecA, nuc y mecA, tuf y mecA se recopilaron y enumeraron luego en la Tabla 10. Cada diferencia de valor de Cp relativa esperada basada en el algoritmo y los resultados singleplex se proyectaron y enumeraron en la Tabla 10. La diferencia de valores de Cp observada es la información real de los resultados del multiplex. La proximidad entre la diferencia de valores de Cp esperada y la observada refleja la precisión y fiabilidad del ensayo multiplex desvelado en el presente documento. De forma similar, los ensayos singleplex y multiplex se llevaron a cabo para los Grupos 2-6: MRSA/MSCNS, MRSA/MRCNS, MSSA/MRCNS, MRSA/MSSA y MSCNS/MRCNS, con los valores de Cp incluidos en la Tabla 10. Además, las curvas de amplificación de los ensayos multiplex para los Grupos 1-5, y MRSA/MSCNS, MRSA/MRCNS se muestran en las Figuras 7-13. En las Figuras 7 -13, se muestran

una combinación diferente de patrones de curva de amplificación de los ensayos tuf-Sa, tuf-CNS, femA o mecA para cada grupo que comprenden muestras con diferentes proporciones de mezcla. Estos patrones de curva son útiles para interpretar los resultados de los ensayos multiplex desvelados en el presente documento, y luego identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRCNS, MSCnS en cualquier muestra dada en el ensayo multiplex.

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Un ensayo multiplex para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS, que comprende tres conjuntos de cebadores para detectar la expresión de tres genes diana directamente de una muestra, una o más sondas diferenciales de secuencia asociadas con cada uno de los conjuntos de cebadores, un gen de referencia y un conjunto de cebadores para detectar la expresión del gen de referencia;

   en el que el ensayo multiplex está configurado para evaluar un nivel de expresión de cada uno de los genes diana para determinar la presencia de cada gen diana en la muestra, en el que el nivel de expresión de cada uno de los genes diana se evalúa mediante la comparación de uno del valor de ciclo umbral y el valor de punto de cruce de los genes diana y el gen de referencia; en el que un gen diana comprende un gen mecA y dos de los genes diana comprenden genes seleccionados del grupo que comprende un gen femA-S. epidermidis, un gen tuf-S. aureus y un gen tuf-CNS;

   en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen femA-S. epidermidis comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 7 y la SEQ ID NO. 8;

   en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen tuf-S. aureus comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 10 y la SEQ ID NO. 11;

   en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen tuf-CNS comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 13 y la SEQ ID NO. 14;

   en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen mecA comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 16 y la SEQ ID NO. 17;

   en el que el ensayo multiplex comprende además al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que incluye la SEQ ID NO. 9, la SEQ ID NO. 12, la SEQ ID NO. 15 o la SEQ ID NO. 18;

   en el que la SEQ ID NO. 9 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen femA-S. epidermidis y diferencia S. epidermidis de otras especies de estafilococo;

   en el que la SEQ ID NO. 12 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen tuf-S. aureus y diferencia S. aureus de CNS y otras especies;

   en el que la SEQ ID NO. 15 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen tuf-CNS y diferencia CNS de la especie S. aureus y otras especies; y

   en el que la SEQ ID NO. 18 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen mecA y diferencia la resistencia a meticilina y penicilina de fenotipos sensibles de las especies de S. aureus o CNS.
2. 2. El ensayo multiplex de la reivindicación 1, en el que el nivel de expresión de los tres genes diana se evalúa mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en PCR, RT-PCR, PCR cuantitativa, PCR cuantitativa en tiempo real y cualquier combinación de los mismos.
3. 3. El ensayo multiplex de la reivindicación 1 o 2, en el que los tres conjuntos de cebadores comprenden oligonucleótidos de cebador directo que incluyen la SEQ ID NO. 7, la SEQ ID NO. 16 y la SEQ ID NO. 10, oligonucleótidos de cebador inverso que incluyen la SEQ ID NO. 8, la SEQ ID NO. 17 y la SEQ ID NO. 11.
4. 4. El ensayo multiplex de la reivindicación 3, que comprende además oligonucleótidos de sonda que incluyen la SEQ ID NO. 9, la SEQ ID NO. 18 y SEQ ID NO. 12.
5. 5. El ensayo multiplex de la reivindicación 1 o 2, en el que los tres conjuntos de cebadores comprenden oligonucleótidos de cebador directo que incluyen la SEQ ID nO. 16, la SEQ ID NO. 10 y la SEQ ID NO. 13, y que comprenden además oligonucleótidos de cebador inverso que incluyen la SEQ ID NO. 17, la SEQ ID NO. 11 y la SEQ ID NO. 14.
6. 6. El ensayo multiplex de la reivindicación 5, que comprende además oligonucleótidos de sonda que incluyen la SEQ ID NO. 18, la SEQ ID NO. 12 y la SEQ ID NO. 15.
7. 7. Un ensayo multiplex para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRCNS o MSCNS que comprende

   un primer oligonucleótido de cebador directo que comprende la SEQ ID NO. 7, un segundo oligonucleótido de cebador directo que comprende la SEQ ID NO. 16, y un tercer oligonucleótido de cebador directo que comprende al menos una de la SEQ ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 4; un primer oligonucleótido de cebador inverso que comprende la SEQ ID NO. 8, un segundo oligonucleótido de cebador inverso que comprende la SEQ ID NO. 17, y un tercer oligonucleótido de cebador inverso que comprende al menos una de la SEQ ID NO. 2 y la SEQ ID NO. 5; y un primer oligonucleótido de sonda que comprende la SEQ ID NO. 9, un segundo oligonucleótido de sonda que comprende la SEQ ID NO. 18, y un tercer oligonucleótido de sonda que comprende al menos una de la SEQ ID NO. 3 y la SEQ ID NO. 6;

   en el que el primer oligonucleótido de sonda está asociado con el primer oligonucleótido de cebador directo y el primer oligonucleótido de cebador inverso para la detección del gen femA-S. epidermidis y diferencia S. epidermidis de otras especies de estafilococo directamente de una muestra mediante la evaluación del nivel de expresión del gen femA-S. epidermidis; y en el que el segundo oligonucleótido de sonda está asociado con el segundo oligonucleótido de cebador directo y el segundo oligonucleótido de cebador inverso para la detección del gen mecA y diferencia la resistencia a meticilina y penicilina de fenotipos sensibles de las especies S. aureus o CNS directamente de una muestra mediante la evaluación del nivel de expresión del gen mecA,

   en el que el nivel de expresión de cada uno de los genes mecA y femA-S. epidermidis se evalúa mediante la

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   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   comparación de uno del valor de ciclo umbral y el valor de punto de cruce del gen mecA y el gen femA-S. epidermidis.
8. 8. Un procedimiento para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS y MSCNS que comprende

   a. obtener una muestra;

   b. cribar la muestra mediante la realización de un ensayo multiplex en la muestra que comprende tres conjuntos de cebadores para detectar tres genes diana en una muestra, una o más sondas diferenciales de secuencia asociadas con cada uno de los tres conjuntos de cebadores, y un gen de referencia;

   en el que el ensayo multiplex está configurado para evaluar un nivel de expresión de cada uno de los genes diana para determinar la presencia de cada gen diana en la muestra, en el que el nivel de expresión de cada uno de los genes diana se evalúa mediante la comparación de uno del valor de ciclo umbral y el valor de punto de cruce de los genes diana; en el que uno de los genes diana comprende un gen mecA y dos de los genes diana comprenden dos de un gen femA-S. epidermidis, un gen tuf-S. aureus y un gen tuf-CNS,

   en el que el conjunto de cebadores que comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 7 y la SEQ ID NO. 8 es para la detección del gen femA-S. epidermidis; en el que la sonda diferencial de secuencia asociada comprende la SEQ ID NO. 9;

   en el que el conjunto de cebadores que comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 10 y la SEQ ID NO. 11 es para la detección del gen tuf-S. aureus; en el que la sonda diferencial de secuencia asociada comprende la SEQ ID NO. 12;

   en el que el conjunto de cebadores que comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 13 y la SEQ ID NO. 14 es para la detección del gen tuf-CNS; en el que la sonda diferencial de secuencia asociada comprende la SEQ ID NO.15;

   en el que el conjunto de cebadores que comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO.16 y la SEQ ID NO. 17 es para la detección del gen mecA; y en el que la sonda diferencial de secuencia asociada comprende la SEQ ID NO. 18; y

   c. identificar al menos una bacteria contenida en la muestra como MRSA, MSSA, MRCNS o MSCNS basándose en la evaluación del ensayo multiplex.
9. 9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el nivel de expresión de los genes diana se evalúa mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en PCR, RT-PCR, PCR cuantitativa, PCR cuantitativa en tiempo real y cualquier combinación de los mismos.
10. 10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la muestra es una muestra biológica o una muestra ambiental.
11. 11. Un kit para identificar y diferenciar MRSA, MSSA, MRSE, MSSE, MRCNS o MSCNS en una través de un ensayo multiplex, que comprende tres conjuntos de cebadores para detectar tres genes diana directamente de una muestra, una o más sondas diferenciales de secuencia asociadas con cada uno de los conjuntos de cebadores, un gen de referencia y un conjunto de cebadores para detectar la expresión del gen de referencia;

    en el que el ensayo multiplex está configurado para evaluar un nivel de expresión de cada uno de las diana para determinar la presencia de cada gen diana en la muestra, en el que el nivel de expresión de cada uno de los genes diana se evalúa mediante la comparación de uno del valor de ciclo umbral y el valor de punto de cruce de los genes diana y el gen de referencia; en el que uno de los genes diana comprende un gen mecA y dos de los genes diana comprenden genes seleccionados del grupo que comprende un gen femA-S. epidermidis, un gen tuf-S.aureus, un gen tuf-CNS;

    en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen femA-S. epidermidis comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 7 y la SEQ ID NO. 8;

    en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen tuf-S.aureus comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 10 y la SEQ ID NO. 11;

    en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen tuf-CNS comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 13 y la SEQ ID NO. 14;

    en el que un conjunto de cebadores para detectar el gen mecA comprende oligonucleótidos que incluyen la SEQ ID NO. 16 y la SEQ ID NO. 17;

    en el que el kit comprende además al menos una sonda que comprende un oligonucleótido que incluye la SEQ ID NO. 9, la SEQ ID NO. 12, la SEQ ID NO. 15 o la SEQ ID NO. 18;

    en el que la SEQ ID NO. 9 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen femA-S. epidermidis y diferencia S. epidermidis de otras especies de estafilococo;

    en el que la SEQ ID NO. 12 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen tuf-S. aureus y diferencia S. aureus de CNS y otras especies;

    en el que la SEQ ID NO. 15 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen tuf-CNS y diferencia CNS de la especie S. aureus y otras especies; y

    en el que la SEQ ID NO. 18 está asociada con un conjunto de cebadores para la detección del gen mecA y diferencia la resistencia a meticilina y penicilina de fenotipos sensibles de las especies de S. aureus o CNS.
12. 12. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los tres genes diana comprenden el gen mecA, el gen tuf-CNS y el gen tuf-S. aureus, en el que el nivel de expresión del gen tuf-CNS y el gen tuf-S.aureus son iguales, y en el que el nivel de expresión del gen mecA es un valor de punto de cruce inferior que el nivel de expresión del gen tuf-CNS,

    lo que indica la presencia de MRCNS y MRSA.
13. 13. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que los tres genes diana comprenden el gen mecA, el gen tuf-CNS y el gen tuf-S. aureus, en el que el nivel de expresión del gen tuf-CNS es igual al nivel de expresión del gen mecA, en el que el nivel de expresión del gen tuf-S.aureus es inferior que o dentro de tres valores de punto de cruce 5 superior que el nivel de expresión del gen mecA, lo que indica la presencia de MRCNS y MSSA.

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