ES2690643T3 - Vectores virales adeno-asociados para el tratamiento de enfermedad de almacenamiento de glucógeno - Google Patents

Vectores virales adeno-asociados para el tratamiento de enfermedad de almacenamiento de glucógeno Download PDF

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Abstract

Un vector viral adeno-asociado (AAV) que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en el que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende los nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 3.

Description

Vectores virales adeno-asociados para el tratamiento de enfermedad de almacenamiento de glucógeno
5 CAMPO
La presente descripción se refiere a vectores de terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno, en particular enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo Ia.
10 ANTECEDENTES
La enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo Ia (GSD-Ia o enfermedad de Von Gierke, MIM232200) es causada por una deficiencia de la glucosa-6-fosfatasa-α (G6Pasa-α), una enzima que se expresa principalmente en el hígado, riñón e intestino (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). La G6Pasa-α, codificada por el gen 15 G6PC, es una proteína hidrófoba anclada en el retículo endoplasmático (RE) por nueve hélices transmembrana (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). Esta enzima cataliza la hidrólisis de la glucosa-6-fosfato (G6P) en la glucosa y el fosfato en la etapa terminal de la glucogenólisis y gluconeogénesis. Los pacientes afectados por GSD-Ia no pueden mantener la homeostasis de la glucosa y pueden presentar hipoglucemia en ayunas, retraso del crecimiento, hepatomegalia, nefromegalia, hiperlipidemia, hiperuricemia y acidemia láctica (Chou et al., Nat Rev
20 Endocrinol 6:676-688, 2010).
Actualmente no existe cura para la GSD-Ia. La hipoglucemia se puede controlar con el uso de terapias dietéticas (Greene et al., N Engl J Med 294:423-425, 1976; Chen et al., N Engl J Med 310:171-175, 1984) que permiten a los pacientes alcanzar un crecimiento casi normal y desarrollo puberal. Sin embargo, las complicaciones clínicas a largo 25 plazo, y sus procesos patológicos subyacentes, permanecen sin corregir. Uno de los riesgos crónicos más significativos es el adenoma hepatocelular (HCA), que se desarrolla en el 70-80% de los pacientes de más de 25 años de edad con GSD-I (Chou etal., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010; Labrune et al., J Pediatr Gastroenterol Nutr 24:276-279, 1997; Rake et al., Eur JPediatr 161(Suppl 1):S20-S34, 2002). Los HCA en pacientes con GSD-Ia son pequeños, múltiples y no encapsulados, incluyendo las complicaciones compresión local y hemorragia
30 intratumoral. En el 10% de pacientes con GSD-Ia, los HCA se someten a transformación maligna en carcinoma hepatocelular (HCC) (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010; Rake et al., Eur J Pediatr 161(Suppl 1):S20S34, 2002; Franco et al., J Inherit Metab Dis 28:153-162, 2005).
Se han realizado estudios de terapia génica que utilizan virus adeno-asociados (AAV) recombinantes que llevan
35 G6Pasa-α en modelos de animales de GSD-Ia, estos estudios han demostrado eficacia en la ausencia de toxicidad (revisado en Chou y Mansfield, Expert Opin Biol Ther 11:1011-1024, 2011). Estudios anteriores usando el modelo murino de GSD-Ia han demostrado que el AAV recombinante que expresa G6Pasa-α dirigida por el promotor de CBA/potenciador de CMV (Ghosh et al., Gene Ther 13:321-329, 2006), el promotor de G6PC canina (Koeberl et al., Gene Ther 13:1281-1289, 2006), o el promotor de G6PC humana en los nucleótidos -298 a +128 de la región
40 flanqueante de G6PC 5' (Koeberl et al., Mol Ther 16:665-672, 2008) administran el transgén de G6Pasa-α al hígado y logran una corrección prolongada de este trastorno. Sin embargo, y a pesar de que estos estudios han mostrado resultados prometedores, ninguno de estos estudios ha sido capaz de corregir completamente la deficiencia hepática de G6Pasa-α.
45 <Wai Han Yiu et al., Molecular Therapy, v. 18, n.º 6, pág. 1076-84, 2010, y Lee Young Mok et al., Molecular Genetics And Metabolism, v110, n.º 3, pág. 275-80, describen un promotor de AAV-8 que comprende la secuencia codificante de G6PC bajo el control del promotor/potenciador de G6PC.>
RESUMEN
50 La invención se define en las reivindicaciones.
En el presente documento se proporcionan moléculas recombinantes de ácido nucleico, vectores virales adenoasociados (AAV) y AAV recombinante que pueden utilizarse en aplicaciones de terapia génica para el tratamiento de
55 la enfermedad de almacenamiento de glucógeno, en especial GSD-Ia.
En algunas realizaciones, las moléculas recombinantes de ácido nucleico incluyen un promotor/potenciador de G6PC, un intrón sintético, y la región codificante de G6PC, siendo esta última opcionalmente optimizada por codones para la expresión en células humanas. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico incluyen además
una secuencia de ácido nucleico de relleno situada entre el promotor/potenciador de G6PC y el intrón, así como entre el intrón y la secuencia codificante de G6PC. En la invención, las moléculas de ácido nucleico recombinantes comprenden los nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 3.
5 En algunas realizaciones, las moléculas recombinantes de ácido nucleico incluyen además secuencias de repetición terminal invertida (ITR) 3' y 5'. En algunos ejemplos, las moléculas recombinantes de ácido nucleico comprenden los nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 3. En otras realizaciones, las moléculas recombinantes de ácido nucleico comprenden las secuencias completas de ácido nucleico de vector de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
10 También se proporcionan vectores que comprenden las moléculas recombinantes de ácido nucleico descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, los vectores son vectores de AAV, tales como vectores de AAV8. Se proporcionan además células huésped aisladas que comprenden las moléculas recombinantes de ácido nucleico o los vectores descritos en el presente documento. Por ejemplo, las células huésped aisladas pueden ser células
15 adecuadas para la propagación de AAV.
En el presente documento se proporciona también AAV recombinante (rAAV) que comprende las moléculas recombinantes de ácido nucleico descritas en el presente documento. Las composiciones que comprenden el rAAV también se proporcionan en la presente descripción.
20 Además, se proporciona un método para tratar un sujeto diagnosticado con una enfermedad de almacenamiento de glucógeno, que comprende seleccionar un sujeto con enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo la (GSD-Ia) y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del rAAV o composiciones que comprenden el rAAV, descritas en el presente documento.
25 Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que transcurre con referencia a las figuras adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
30 Las Figuras 1A-1B son gráficas que muestran los resultados del análisis de fenotipo de ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE. (Figura 1A) Se muestran pesos corporales de ratones G6pc-/-hembra con infusión de 1,2 x 1011 vg/ratón de AAV-GPE y sus compañeros de camada G6pc+/+/G6pc+/-hembra. La edad al momento de la infusión (2 días, 2 semanas o 4 semanas) se muestra encima arriba de la gráfica. (○),
35 ratones G6pc+/+/G6pc+/-; (●), ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE. (Figura 1B) Se muestran niveles de glucosa en sangre, colesterol, triglicéridos, ácido úrico y ácido láctico de ratones con infusión de AAV-GPE. Debido a las similitudes de los metabolitos respectivos de cada grupo, los datos que se muestran son datos agrupados de 6-24 semanas de edad. (+/+ y +/-), ratones G6pc+/+/G6pc+/-, (-/-), G6pc-/-, o (-/-GPE), G6pc-/con infusión de AAV-GPE a la edad de 2 días (n = 36), 2 semanas (n = 24), o 4 semanas (n = 9). Los datos
40 se presentan como media ± SEM. *p < 0,05, **p < 0,005. Las Figuras 2A-2B son gráficas que muestran la actividad de G6Pasa-α hepática y expresión de ARNm en ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE y de tipo salvaje después de un ayuno de 24 horas. Siete ratones G6pc-/-de 2 semanas, 11 de cuatro semanas, uno de 15 semanas (*) y uno de 30 semanas (**) se infundieron con dosis variables de AAV-GPE; la actividad de G6Pasa-α y la expresión de ARNm se
45 evaluaron cuando los ratones tenían 70-90 semanas de edad. (Figura 2A) Se muestra la actividad de G6Pasa-α hepática a las edades indicadas en semanas (S). Los ratones se agrupan basándose en su actividad de G6Pasa-α relativa a la actividad de tipo salvaje, tal como bajo (AAV-L), medio (AAV-M) y alto (AAV-H). (Figura 2B) G6Pasa-α hepática y la expresión de ARNm y su relación con la actividad de G6Pasaα en ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE. Los datos se presentan como media ± SEM. En la Figura 2B,
50 *P < 0,05, **P < 0,005. Las Figuras 3A-3C son gráficas que muestran los resultados de análisis de fenotipo de ratones G6pc-/tratados con AAV-GPE a la edad de 70 a 90 semanas. (Figura 3A) Niveles de glucosa en sangre, colesterol, triglicéridos, ácido úrico y ácido láctico. (Figura 3B) Peso corporal, longitud corporal e IMC. H, hembras; M, machos. (Figura 3C) Peso del hígado. Los tratamientos se indican como: (+/+), ratones de tipo salvaje; (-/
55 AAV), ratones G6pc-/-con infusión de diversas dosificaciones de AAV-GPE. AAV-L (n = 6), AAV-M (n = 9), y AAV-H (n = 5) son ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE que expresan el 3-9% (bajo, L), 22-63% (medio, M), y 81-128% (alto, H) de actividad de G6Pasa-α hepática normal, respectivamente. Los datos se presentan como media ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,005. Las Figuras 4A-4C son gráficas que muestran perfiles de glucosa en sangre en ayunas y de tolerancia a la
glucosa. (Figura 4A) Perfiles de glucosa en sangre en ayunas en ratones de tipo salvaje y G6pc-/-tratados con AAV-GPE a la edad de 70 a 90 semanas. (Figura 4B) Perfiles de glucosa en sangre en ayunas en ratones G6pc-/-sin tratar a la edad de 6-8 semanas. (Figura 4A) Perfiles de tolerancia a la glucosa en ratones de tipo salvaje y G6pc-/-tratados con AAV-GPE a la edad de 70 a 90 semanas. Ratones G6pc-/-de 5 tipo salvaje o con infusión de AAV-GPE se dejaron en ayunas durante 6 horas, se les inyectaron por vía intraperitoneal 2 mg/g de dextrosa, y después se les tomó muestras de sangre cada 30 minutos a través de la vena de la cola. Los datos se presentan como media ± SEM. (+/+), ratones de tipo salvaje; (-/-), ratones G6pc-/-sin tratar. AAV-L (n = 6), AAV-M (n = 9), y AAV-H (n = 5) son ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE con expresión al 3-9%, 22-63%, y al 81-129% de actividad de G6Pasa-α hepática normal, respectivamente. 10 Las Figuras 5A-5C son gráficas que muestran los niveles de insulina en sangre y de ARNm hepático para SREBP-1c y glucocinasa en ratones de 70 a 90 semanas de edad de tipo salvaje y G6pc-/-tratados con AAV-GPE después de 24 horas de ayuno. (Figura 5A) Niveles de insulina en sangre en ayunas y su relación con respecto al el peso corporal de los animales. (Figura 5B) Cuantificación de ARNm de SREBP1c por RT-PCR en tiempo real. (Figura 5C) Cuantificación de ARNm de glucocinasa y la relación de la
15 insulina en sangre en ayunas con respecto a los niveles hepáticos de ARNm de glucocinasa. (+/+, ○), ratones de tipo salvaje (n = 20); (-/-AAV, ●) ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE (n = 20). Los datos se presentan como media ± SEM. **P< 0,005. Las Figuras 6A-6D son gráficas que muestran los resultados de los análisis bioquímicos en ratones de 12 semanas de edad de tipo salvaje, tratados con rAAV-GPE y rAAV-miGPE G6pc-/-. rAAV-GPE y rAAV
20 miGPE son vectores de rAAV que expresan G6Pasa humana dirigida por 2864 pb del promotor/potenciador de G6PC (GPE) humano y los 382 pb de promotor/potenciador de G6PC mínimo (miGPE) humano, respectivamente. (Figura 6A) Actividad hepática de G6Pasa-α microsomal y su relación con respecto al número de copias del genoma del vector. (Figura 6B) Curva de crecimiento. (Figura 6C) Valores del IMC. (Figura 6D) Niveles de glucosa en sangre. Ratones G6pc-/-GPE-alto, tratados con rAAV-GPE en dosis alta
25 (○); miGPE-alto, tratados con rAAV-miGPE en dosis alta (●); GPE-bajo, tratados con rAAV-GPE en dosis baja (□); miGPE-bajo, tratados con rAAV-miGPE en dosis baja (■); (+/+), ratones de tipo salvaje (▼). Los datos son media ± SEM. *P < 0,05. Las Figuras 7A-7C son gráficas que muestran los resultados de análisis fenotípicos en ratones G6pc-/-de 12 semanas de tipo salvaje, tratados con rAAV-GPE y rAAV-miGPE. (Figura 7A) Peso del hígado. (Figura
30 7B) Contenido de glucógeno hepático. (Figura 7C) Contenido de triglicéridos hepáticos. Ratones G6pc-/GPE-alto (n = 6), tratados con rAAV-GPE en dosis alta; miGPE-alto (n = 6), tratados con rAAV-miGPE en dosis alta; GPE-bajo (n = 6), tratados con rAAV-GPE en dosis baja; miGPE-bajo (n = 6), tratados con rAAVmiGPE en dosis baja; (+/+), ratones de tipo salvaje. Los datos son media ± SEM. *P < 0,05. Las Figuras 8A-8C son gráficas que muestran los perfiles de glucosa en sangre en ayunas y de tolerancia
35 a la glucosa en ratones G6pc-/-de 12 semanas de edad de tipo salvaje, tratados con rAAV-GPE y rAAVmiGPE. (Figura 8A) Perfiles de glucosa en sangre en ayunas. (Figura 8B) Niveles de glucosa en sangre después de un ayuno de 24 horas. (Figura 8C) Perfiles de tolerancia a la glucosa. Ratones G6pc-/-GPEalto (n = 6), tratados con rAAV-GPE en dosis alta (○); miGPE-alto (n = 6), tratados con rAAV-miGPE en dosis alta (●); GPE-bajo (n = 6), tratados con rAAV-GPE en dosis baja (□); miGPE-bajo (n = 6), tratados con
40 rAAV-miGPE en dosis baja (■); (+/+), ratones de tipo salvaje (n = 24) (▼). Los datos son media ± SEM. *P < 0,05, **P < 0,005. La Figura 9 es un alineamiento de las secuencia de proteína G6Pasa-α canina (SEQ ID NO: 10) y humana (SEQ ID NO: 4). La Figura 10 es una tabla que muestra las diferencias de aminoácidos entre G6Pasa-α humana, de ratón,
45 de rata y canina. La Figura 11 es una gráfica que muestra una actividad de G6Pasa hepática en ratones con GSD-Ia transducidos con rAAV. Ratones con GSD-Ia se transdujeron con un vector de rAAV8 (1013 vg/kg), expresando la G6Pasa nativa o humana optimizada por codones dirigida por el promotor/potenciador de GPE. La actividad de G6Pasa hepática en ratones de 12 semanas de edad fue de 165,4 ± 18,2
50 nmol/min/mg. La Figura 12 es un gráfica que muestra el peso del hígado en ratones con GSD-Ia de 12 semanas de edad de tipo salvaje (+/+) y tratados con rAAV. Las Figuras 13A y 13B son gráficas que muestran los perfiles de tolerancia a la glucosa y de glucosa en sangre en ayunas, respectivamente, en ratones de 12 semanas de edad de tipos salvaje (○) y con GSD-Ia
55 tratados con rAAV8-GPE-co-G6Pasa (●).
LISTA DE SECUENCIAS
Las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos enumeradas en la lista de secuencias adjunta se muestran
usando abreviaturas de letras estándar para bases de nucleótidos, y un código de tres letras para aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solamente se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada. La lista de secuencias se envía como un archivo de texto ASCII, creado el miércoles, 12 de noviembre de 2014, 39,6 KB. En la 5 Lista de secuencias adjunta:
SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos del plásmido UF11-GPE-G6PC, incluyendo las siguientes características:
10 ITR -nucleótidos 17-163 promotor/potenciador de G6PC -nucleótidos 182-3045 Relleno -nucleótidos 3051-3184 Intrón -nucleótidos 3185-3321 Relleno -nucleótidos 3322-3367 15 Secuencia codificante de G6PC -nucleótidos 3368-4441 ITR -nucleótidos 4674-4819
SEQ ID NO: 2 es la secuencia de nucleótidos del plásmido UF11-K29-G6PC, incluyendo las siguientes características: 20 ITR -nucleótidos 17-163 promotor/potenciador de G6PC -nucleótidos 182-3045 Intrón -nucleótidos 3052-3188 Secuencia codificante de G6PC -nucleótidos 3202-4275 25 ITR -nucleótidos 4508-4653
SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótidos del plásmido UF11-GPE-co-G6PC, incluyendo las siguientes características:
30 ITR -nucleótidos 17-163 promotor/potenciador de G6PC -nucleótidos 182-3045 Relleno -nucleótidos 3051-3184 Intrón -nucleótidos 3185-3321 Relleno -nucleótidos 3322-3367 35 Secuencia codificante de G6PC -nucleótidos 3368-4441 ITR -nucleótidos 4674-4819
SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la proteína G6PC humana. SEQ ID NOs: 5-8 son secuencias de cebador. 40 SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleótidos de G6PC canina. SEQ ID NO: 10 es la secuencia de aminoácidos de G6PC canina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
45 I. Abreviaturas
AAV virus adenoasociado IMC índice de masa corporal CBA β-actina de pollo 50 CMV citomegalovirus ELISA ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas G6P glucosa-6-fosfato G6PC glucosa-6-fosfatasa, subunidad catalítica G6PT transportador de glucosa-6-fosfato 55 GPE promotor/potenciador de G6PC GSD enfermedad de almacenamiento de glucógeno H&E hematoxilina y eosina HCA adenoma hepatocelular HCC carcinoma hepatocelular
ITR repetición terminal invertida ORF marco de lectura abierto rAAV AAV recombinante vg genomas virales
5 vp partículas virales
II. Términos y métodos
A menos que se indique otra cosa, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las
10 definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
15 Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:
Virus adeno-asociado (AAV): Un virus pequeño sin envoltura de replicación defectuosa que infecta a
20 seres humanos y otras especies de primates. No se sabe que el AAV cause enfermedad y provoque una respuesta inmune muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto células divisorias como quiescentes y pueden persistir en un estado extracromosómico sin integrar en el genoma de la célula huésped. Estas características hacen del AAV un vector viral atractivo para la terapia génica. En este momento hay 11 serotipos reconocidos de AAV (AAV1-11).
25 Administración/Administrador: Proporcionar o dar a un sujeto un agente, tal como un agente terapéutico (por ejemplo un AAV recombinante), por cualquier vía eficaz. Vías de administración de ejemplo incluyen, pero sin limitación, inyección (tal como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), ruta oral, intraductal, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal e inhalación. Optimizado por codones: Un ácido nucleico "optimizado por codones" se refiere a una secuencia de ácido
30 nucleico que ha sido alterada de tal manera que los codones son óptimos para la expresión en un sistema en particular (tal como una especie o grupo de especies en particular. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico puede ser optimizada para la expresión en células de mamífero o en una especie de mamífero en particular (tales como células humanas). La optimización por codones no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.
35 Potenciador: Una secuencia de ácido nucleico que aumenta la velocidad de transcripción mediante el aumento de la actividad de un promotor. G6PC: Un gen localizado en el cromosoma humano 17q21 que codifica la glucosa-6-fosfatasa-α (G6Pasaα). La G6Pasa-α es una proteína hidrófoba de 357 aminoácidos que tiene 9 hélices que la anclan al retículo endoplasmático (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). La proteína G6Pasa-α cataliza la
40 hidrólisis de la glucosa 6-fosfato en glucosa y fosfato en la etapa terminal de la gluconeogénesis y la glucogenólisis, y es una enzima clave en la homeostasis de la glucosa. Las mutaciones en el gen G6PC causan la enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo la (GSD-Ia), que es un trastorno metabólico caracterizado por hipoglucemia severa en ayunas asociada con la acumulación de glucógeno y grasa en el hígado y los riñones.
45 Enfermedad de almacenamiento de glucógeno (GSD): Un grupo de enfermedades que son resultado de defectos en el procesamiento de la síntesis de glucógeno o ruptura dentro de los músculos, hígado y otros tejidos. La GSD puede ser genética o adquirida. La GSD genética es causada por cualquier error innato del metabolismo involucrado en estos procesos. En la actualidad hay 11 enfermedades de almacenamiento de glucógeno reconocidas (GSD de tipo I, II, III, IV, V, VI, VII, IX, XI, XII y XIII). La GSD-I consiste en dos
50 trastornos autosómicos recesivos, GSD-Ia y GSD-Ib (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). La GSD-Ia es resultado de una deficiencia en la glucosa-6-fosfatasa-α. Las deficiencias en el transportador de glucosa-6-fosfato (G6PT) son responsables de la GSD-Ib. Enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo Ia (GSD-Ia): También conocida como enfermedad de Von Gierke, GSD-Ia es la enfermedad de almacenamiento de glucógeno más común, que
55 posee una incidencia de aproximadamente 1 por cada 100.000 nacimientos vivos. La GSD-Ia es una enfermedad genética resultante de la deficiencia de la enzima glucosa-6-fosfatasa-α (G6Pasa-α). La deficiencia en la G6Pasa-α deteriora la capacidad del hígado para producir glucosa libre a partir del glucógeno y de la gluconeogénesis. Los pacientes afectados por GSD-Ia no pueden mantener la homeostasis de la glucosa y pueden presentar hipoglucemia en ayunas, retraso del crecimiento,
hepatomegalia, nefromegalia, hiperlipidemia, hiperuricemia y acidemia láctica (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). Actualmente no existe cura para la GSD-Ia. Intrón: Un fragmento de ADN dentro de un gen que no contiene información codificante para una proteína. Los intrones se eliminan antes de la traducción de un ARN mensajero.
5 Repetición terminal invertida (ITR): Secuencias simétricas de ácido nucleico en el genoma de los virus adeno-asociados necesarias para replicación eficiente. Las secuencias ITR se encuentran en cada extremo del genoma de ADN de AAV. Las ITR sirven como los orígenes de replicación para síntesis de ADN viral y son componentes cis esenciales para la generación de vectores de integración de AAV. Aislado: Un componente biológico "aislado" (tal como una molécula de ácido nucleico, proteína, virus o
10 célula) se ha separado o purificado sustancialmente aparte de otros componentes biológicos en la célula o tejido del organismo, o el propio organismo, en el que se produce naturalmente el componente, tales como otro ADN cromosómico y extracromosómico y ARN, proteínas y células. Moléculas de ácido nucleico y proteínas que se han "aislado" incluyen las purificas por métodos de purificación estándar. El término también incluye moléculas de ácidos nucleicos y proteínas preparadas por expresión recombinante en una
15 célula huésped, así como moléculas de ácido nucleico y proteínas sintetizadas químicamente. Unido operativamente: Una primera secuencia de ácido nucleico está operativamente unida a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripción o expresión de la
20 secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, están en el mismo marco de lectura. Vehículo farmacéuticamente aceptable: Los portadores farmacéuticamente aceptables (vehículos) útiles en la presente descripción son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15ª Edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas
25 para la administración farmacéutica de uno o más compuestos terapéuticos, moléculas o agentes. En general, la naturaleza del vehículo dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo,
30 formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los vehículos sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de vehículos biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato sódico o monolaurato de
35 sorbitán. Prevención, tratamiento o mejora de una enfermedad: "Prevenir" una enfermedad (tal como GSD Ia) se refiere a inhibir el desarrollo completo de una enfermedad. "Tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o afección patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. "Mejora" se refiere a la reducción en el número o la gravedad de los signos o
40 síntomas de una enfermedad. Promotor: Una región de ADN que dirige/inicia la transcripción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen). Un promotor incluye secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción. Típicamente, los promotores se encuentran cerca de los genes que transcriben. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales que pueden localizarse tanto como
45 varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción. Purificado: El término "purificado" no requiere pureza absoluta; más bien, pretende ser un término relativo. Por lo tanto, por ejemplo, un péptido, proteína, virus u otro compuesto activo purificado es uno que está aislado en su totalidad o en parte de proteínas asociadas de forma natural y otros contaminantes. En ciertas realizaciones, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un péptido, proteína, virus u otro
50 compuesto activo que se ha aislado de una célula, medio de cultivo celular u otra preparación en bruto y sometido a fraccionamiento para eliminar diversos componentes de la preparación inicial, tales como proteínas, restos celulares y otros componentes. Recombinante: Una molécula de ácido nucleico recombinante es una que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia que se hace mediante una combinación artificial de dos
55 segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial puede realizarse por síntesis química o por la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácidos nucleicos, tales como mediante técnicas de ingeniería genética. De forma similar, un virus recombinante es un virus que comprende la secuencia (tal como la secuencia genómica) que no es de origen natural o que se fabrica por la combinación artificial de al menos dos
secuencias de diferente origen. El término "recombinante" también incluye ácidos nucleicos, proteínas y virus que han sido alterados únicamente por adición, sustitución o deleción de una parte de una molécula de ácido nucleico, proteína o virus natural. Como se usa en el presente documento, "AAV recombinante" se refiere a una partícula de AAV en la que se ha empaquetado una molécula recombinante de ácido
5 nucleico (por ejemplo, un molécula recombinante de ácido nucleico que codifica G6Pasa-α). Identidad de secuencia: La identidad o similitud entre dos o más secuencias de ácido nucleico, o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de la identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencia se puede medir en términos de porcentaje de identidad; cuanto mayor sea el porcentaje, mayor es la identidad de las secuencias. La similitud de secuencia se puede medir en términos
10 de porcentaje de similitud (que toma en cuenta las sustituciones conservadoras de aminoácidos); cuanto mayor sea el porcentaje, mayor es la identidad de las secuencias. Los homólogos u ortólogos de secuencias de ácido nucleico o aminoácidos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia, cuando se alinean usando métodos estándar. Esta homología es más significativa cuando las proteínas ortólogas o ADNc se derivan de especies que están más estrechamente relacionadas (tales como
15 secuencias humanas y de ratón), en comparación con las especies más alejadas (tales como secuencias humanas y de C. elegans). Los métodos de alineación de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Se describen diversos programas y algoritmos de alineamiento en: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444,
20 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; y Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24: 307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de los métodos de alineamiento de secuencias y los cálculos de homología. La herramienta de búsqueda de alineamiento local básica del NCBI (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol.
25 215:403-10, 1990) está disponible a partir de de varias fuentes, incluyendo el National Center for Biological Information (NCBI) y en Internet, para su uso en relación con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Se puede hallar información adicional en el sitio web de NCBI. Serotipo: Un grupo de microorganismos estrechamente relacionados (tales como virus) que se distinguen por un conjunto característico de antígenos.
30 Secuencia de relleno: Se refiere a una secuencia de nucleótidos contenida dentro de una molécula de ácido nucleico más grande (tal como un vector), la cual se utiliza normalmente para crear espaciamiento deseado entre dos características de ácido nucleico (tales como entre un promotor y una secuencia codificante), o para extender una molécula de ácido nucleico, de manera que sea de una longitud deseada. Las secuencias de relleno no contienen información codificante de proteína y pueden ser de origen
35 desconocido/sintético y/o no estar relacionadas con otras secuencias de ácido nucleico dentro de una molécula de ácido nucleico más grande. Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos humanos y no humanos. Sintético: Producido por medios artificiales en un laboratorio, por ejemplo, un ácido nucleico sintético
40 puede sintetizarse químicamente en un laboratorio. Cantidad terapéuticamente eficaz: Una cantidad de un agente farmacéutico o terapéutico específico (por ejemplo un AAV recombinante) suficiente para lograr un efecto deseado en un sujeto, o en una célula, que está siendo tratado con el agente. La cantidad eficaz del agente dependerá de varios factores, incluyendo, pero sin limitación, el sujeto o células a tratar, y la forma de administración de la composición terapéutica.
45 Vector: Un vector es una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de ácido nucleico extraño sin interrumpir la capacidad del vector de replicarse y/o integrarse en una célula huésped. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector también puede incluir uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras
50 necesarias para permitir la transcripción y traducción del gen o genes insertados. En algunas realizaciones del presente documento, el vector es un vector de AAV.
A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. 55 Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente otra cosa. "Que comprende A o B" se refiere a que incluye A, o B, o A y B. Además, debe entenderse que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan para la descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o ensayo
de la presente descripción, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las explicaciones de los términos. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
5 III. Visión general de diferentes realizaciones
En el presente documento se proporcionan moléculas recombinantes de ácido nucleico, vectores de AAV y AAV recombinante que pueden utilizarse en aplicaciones de terapia génica para el tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno, en especial GSD-Ia.
10 Las moléculas recombinantes de ácido nucleico incluyen un promotor/potenciador de G6PC (GPE), un intrón sintético y la región codificante de G6PC. La región codificante de G6PC está opcionalmente optimizada por codones para la expresión en células humanas. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico incluyen además una secuencia de ácido nucleico de relleno situada entre el promotor/potenciador de G6PC y el intrón, así como
15 entre el intrón y la secuencia codificante de G6PC. Las moléculas recombinantes de ácido nucleico pueden además incluir secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) de 3' y 5' cuando se encuentran dentro de un vector de AAV.
En el presente documento se describe que una G6Pasa-α que expresa AAV recombinante con el
20 promotor/potenciador de G6PC (AAV-GPE) es significativamente más eficaz en el direccionamiento de la expresión de transgén hepática in vivo que otro AAV recombinante que expresa G6Pasa-α que tiene un promotor/potenciador alternativo (es decir, el promotor de β-actina de pollo/potenciador de CMV). Durante un período de estudio de 24 semanas, ratones con deficiencia en G6PC (un modelo para GSD-Ia) tratados con AAV-GPE presentaron normalización completa de deficiencia de G6PC hepática, tal como se demuestra por los niveles normales de
25 glucosa en sangre, metabolitos en sangre, glucógeno hepático y grasa hepática (véase el Ejemplo 1 y Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010). Además, un estudio a largo plazo de ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE demostró que la terapia génica mediada por AAV-GPE fue eficaz durante al menos 70-90 semanas en ratones que expresan más del 3% de G6Pasa-α hepática. En especial, los ratones tratados con AAV-GPE presentaron almacenamiento hepático normal de grasa, metabolitos en sangre normales y perfiles de tolerancia a la glucosa, niveles reducidos de
30 insulina en sangre en ayunas, y ninguna evidencia de anomalías hepáticas, tales como adenoma hepatocelular (véase el Ejemplo 2 y Lee et al., Hepatology 56:1719-1729, 2012).
Se describe adicionalmente en el presente documento el hallazgo de que los elementos potenciadores aguas arriba del promotor G6PC son críticos para la expresión óptima de G6PC en un modelo animal de GSD-Ia.
35 Específicamente, se demostró que el tratamiento con AAV-GPE, que comprende el promotor/potenciador de G6PC en los nucleótidos -2684 a -1 (con respecto al sitio de inicio de G6PC) produce niveles significativamente más altos de expresión hepática de G6Pasa-α, logró una mayor reducción en acumulación hepática de glucógeno y dio lugar a una mejor tolerancia de ayuno en un modelo murino con GSD-Ia, en comparación con un AAV recombinante de expresión de G6Pasa-α que contiene sólo un promotor/potenciador de G6PC mínimo de 383 pb (véase el Ejemplo 3
40 y Lee et al., Mol Genet Metab. 110(3): 275-280, 2013).
También se describe en el presente documento el hallazgo de que las secuencias de relleno de nucleótidos presentes entre el promotor/potenciador de G6PC y el intrón, así como entre el intrón y la secuencia codificante de G6PC, son importantes para la transducción del hígado y expresión de G6Pasa-α. En particular, el AAV
45 recombinante producido a partir del plásmido UF11-K29-G6PC (SEQ ID NO: 2) que carece las secuencias de relleno, presentaron la actividad de G6Pasa de 7,3 nmol/min/mg. En comparación, el AAV recombinante producido a partir del plásmido UF11-GPE-G6PC (SEQ ID NO: 1) presentó actividad de G6Pasa de 33,0 nmol/min/mg (véase el Ejemplo 4). La presente descripción proporciona la primera descripción de las secuencias de relleno presentes en los vectores de AAV, expuestos en el presente documento como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3.
50 Además, los datos descritos en el presente documento demuestran que la optimización por codones de la secuencia codificante de G6PC aumenta la eficiencia de traducción aproximadamente de 1,5 a 2,5 veces, dando como resultado una expresión de G6Pasa-α significativamente mayor en el hígado tras la administración de AAV-co-GPE (que contiene una secuencia de ácido nucleico de G6PC optimizada por codones), en comparación con la
55 administración de AAV-GPE, que codifica G6PC de tipo salvaje (véase el Ejemplo 5).
Tomados en conjunto, estos resultados indican que el AAV recombinante que comprende el promotor/potenciador de G6PC en los nucleótidos -2684 a -1, un intrón sintético, secuencias de relleno que flanquean el intrón, y la región codificante de G6PC (de tipo salvaje u optimizada por codones) son características críticas para la expresión del
transgén hepático eficiente y el tratamiento de GSD-Ia in vivo.
Se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al 5 menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a los nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede contener sustituciones de nucleótidos dentro de la región codificante de G6PC, tal como para optimización por codones. Como otro ejemplo, la región codificante de G6PC puede ser una G6PC de una especie diferente, tal como una G6PC canina o una versión optimizada por codones (para expresión en seres humanos) de G6PC canina. En 10 algunos ejemplos, la región codificante de G6PC expuesta como los nucleótidos 182-3045 SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 182-3045 de SEQ ID NO: 3 se reemplaza por la secuencia codificante de G6PC canina (SEQ ID NO: 9). Como alternativa, la región codificante de G6PC humana de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 puede contener sustituciones de nucleótidos que dan como resultado cambios codificantes en residuos que difieren entre las secuencias de proteínas G6PC humanas y caninas. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos pueden 15 introducirse para dar como resultado cambios codificantes en los residuos 3, 54, 139, 196, 199, 242, 247, 292, 298, 301, 318, 324, 332, 347, 349, 350 y/o 353 de la proteína G6PC humana (SEQ ID NO: 4). La Figura 9 muestra un alineamiento de las secuencias de proteínas G6Pasa-α humana y canina y la Figura 10 proporciona una tabla que muestra las diferencias de aminoácidos entre la G6Pasa-α humana, de ratón, de rata y canina. La presente descripción contempla sustituciones de nucleótidos que alteran la secuencia de aminoácidos en cualquiera de los
20 residuos enumerados en la Figura 10.
En otros casos, las sustituciones de nucleótidos pueden estar presentes en la secuencia de relleno o en la secuencia del intrón sintético. Las sustituciones de nucleótidos también son propensas a tolerarse dentro de la secuencia del vector, tal como la secuencia del vector aguas abajo (es decir, 3' a) la ITR de 3', o entre la ITR y GPE 25 5', o entre la región codificante de G6PC y la ITR de 3'. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico recombinantes comprenden los nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 3. Estas moléculas recombinantes de ácido nucleico incluyen la secuencia del promotor/potenciador de G6PC en nucleótidos -2684 a -1, un intrón sintético, secuencias de relleno que flanquean el intrón, y la región codificante de G6PC. SEQ ID NO: 1 incluye una secuencia codificante de G6PC de tipo salvaje, mientras que la SEQ ID NO: 3
30 incluye una secuencia codificante de G6PC optimizada por codones.
En algunas realizaciones, las moléculas recombinantes de ácido nucleico incluyen además secuencias de ITR 5' y 3'. Por lo tanto, se proporcionan moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al 35 menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a los nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico recombinantes comprenden los nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 3. En ejemplos no limitantes particulares, las moléculas de ácido nucleico recombinantes comprenden la secuencia completa de SEQ ID NO: 1 (el plásmido UF11-GPE-G6PC usado para generar AAV-GPE) o la SEQ ID NO: 3 (el plásmido UF11-GPE
40 co-G6PC usado para generar AAV-co-GPE optimizado por codones). En otros ejemplos, las moléculas de ácido nucleico recombinantes comprenden una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
45 En otras realizaciones, se proporciona una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a los nucleótidos 182-4275 de SEQ ID NO: 2. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende los nucleótidos 182-4275 de SEQ ID NO:
2. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que
50 es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a los nucleótidos 17-4653 de SEQ ID NO: 2. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende los nucleótidos 17-4653 de SEQ ID NO: 2. En ejemplos no limitantes específicos, la molécula de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia completa de SEQ ID NO: 2 (el plásmido UF11-K29-G6PC que carece de la secuencia de relleno). En otros ejemplos, la molécula de ácido
55 nucleico recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2.
Además se proporcionan vectores que comprenden las moléculas recombinantes de ácido nucleico descritas en el
presente documento. En algunas realizaciones, el vector es un vector de AAV. El serotipo de AAV puede ser cualquier serotipo adecuado para la administración de transgenes a un sujeto. En algunos ejemplos, el vector de AAV es un AAV de serotipo 8 (AAV8). En otros ejemplos, el vector de AAV es un vector de serotipo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11 o 12 (es decir, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11 o AAV12). En aún
5 otros ejemplos, el vector de AAV es un híbrido de dos o más serotipos de AAV (tales como, pero sin limitación, AAV2/1, AAV2/7, AAV2/8 o AAV2/9). La selección del serotipo de AAV dependerá en parte del tipo o tipos celulares que están dirigidos a terapia génica. Para el tratamiento de GSD-Ia, el hígado y riñón son los órganos diana relevantes.
10 También se proporcionan en el presente documento células huésped aisladas que comprenden las moléculas recombinantes de ácido nucleico o los vectores descritos en el presente documento. Por ejemplo, la célula huésped aislada puede ser una célula (o línea de célula) apropiada para la producción de AAV recombinante (rAAV). En algunos ejemplos, la célula huésped es una célula de mamífero, tal como una célula HEK-293, BHK, Vero, RD, HT1080, A549, Cos-7, ARPE-19, o MRC-5.
15 También se proporcionan rAAV que comprenden una molécula recombinante de ácido nucleico descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el rAAV es rAAV8 y/o rAAV2. Sin embargo, el serotipo de AAV puede ser cualquier otro serotipo de AAV adecuado, tal como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9, AAV10, AAV11 o AAV12, o un híbrido de dos o más serotipos de AAV (tales como, pero sin limitación,
20 AAV2/1, AAV2/7, AAV2/8 o AAV2/9). Las composiciones que comprenden un rAAV descrito en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable también se proporcionan por la presente descripción. En algunas realizaciones, las composiciones se formulan mediante administración intravenosa o intramuscular. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración de rAAV se pueden encontrar, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente N.º 2012/0219528.
25 Además, se proporcionan métodos para tratar un sujeto diagnosticado con una enfermedad de almacenamiento de glucógeno, que comprende seleccionar un sujeto con GSD-Ia y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un rAAV (o una composición que comprende un rAAV) descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el rAAV se administra por vía intravenosa.
30 En algunas realizaciones, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1011 a aproximadamente 1 x 1014 partículas virales (vp)/kg. En algunos ejemplos, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1012 a aproximadamente 8 x 1013 vp/kg. En otros ejemplos, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1013 a aproximadamente 6 x 1013 vp/kg. En ejemplos no limitantes específicos, el rAAV se administra a una dosis de
35 al menos aproximadamente 1 x 1011, al menos aproximadamente 5 x 1011, al menos aproximadamente 1 x 1012, al menos aproximadamente 5 x 1012, al menos aproximadamente 1 x 1013, al menos aproximadamente 5 x 1013, o al menos aproximadamente 1 x 1014 vp/kg. En otros ejemplos no limitantes, el rAAV se administra a una dosis de no más de aproximadamente 5 x 1011, no más de aproximadamente 1 x 1012, no más de aproximadamente 5 x 1012, no más de aproximadamente 1 x 1013, no más de aproximadamente 5 x 1013, o no más de aproximadamente 1 x 1014
40 vp/kg. En un ejemplo no limitante, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1012 vp/kg. El rAAV puede administrarse en una única dosis, o en múltiples dosis (tales como, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dosis) según sea necesario para los resultados terapéuticos deseados.
IV. AAV recombinante para aplicaciones de terapia génica
45 AAV pertenece a la familia Parvoviridae y el género Dependovirus. El AAV es un virus pequeño no envuelto que empaqueta un genoma lineal de ADN monocatenario. Ambas cadenas sentido y antisentido de ADN de AAV se empaquetan en cápsides de AAV de igual frecuencia.
50 El genoma de AAV está caracterizado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean dos marcos de lectura abiertos (ORF). En el genoma de AAV2, por ejemplo, los primeros 125 nucleótidos de la ITR son un palíndromo, que se pliega sobre sí mismo para maximizar el apareamiento de bases y forma una estructura de horquilla en forma de T. Las otras 20 bases de la ITR, denominada la secuencia D, siguen estando no apareadas. Las ITR son secuencias que actúan en cis importantes para la replicación del ADN de AAV; la ITR es el origen de
55 replicación y sirve como cebador para la síntesis de segunda cadena mediante ADN polimerasa. El ADN monocatenario formado durante esta síntesis, que se denomina monómero con forma replicante, se usa para un segundo ciclo de replicación autocebadora y forma un dímero con forma replicante. Estos intermedios monocatenarios se procesan a través de un mecanismo de desplazamiento de cadena, dando como resultado un ADN monocatenario que se usa para el empaquetamiento y ADN bicatenario usado para la transcripción. Los
elementos de unión Rep y un sitio de resolución terminal (TRS) se encuentran situados dentro de la ITR. Estas características se usan por la proteína reguladora viral Rep durante replicación de AAV para procesar los intermedios bicatenarios. Además de su papel en la replicación de AAV, la ITR es también esencial para el empaquetamiento del genoma de AAV, la transcripción, la regulación negativa en condiciones no permisivas y la
5 integración específica de sitio (Daya y Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).
El ORF izquierdo de AAV contiene el gen Rep, que codifica cuatro proteínas -Rep78, Rep 68, Rep52 y Rep40. El ORF derecho contiene el gen Cap, que produce tres proteínas de cápside viral (VP1, VP2 y VP3). La cápside de AAV contiene 60 proteínas de cápside viral dispuestas en una simetría icosaédrica. Las VP1, VP2 y VP3 están
10 presentes en una relación molar 1:1:10 (Daya y Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).
El AAV es actualmente uno de los virus que se utilizan con mayor frecuencia para terapia génica. Aunque el AAV infecta a los seres humanos y algunas otras especies de primates, no se sabe que cause enfermedad y que provoque una respuesta inmune muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto
15 células divisorias como quiescentes y persisten en un estado extracromosómico sin integrar en el genoma de la célula huésped. Debido a las características ventajosas del AAV, la presente descripción contempla el uso del AAV para las moléculas recombinantes de ácido nucleico y métodos descritos en el presente documento.
El AAV posee varias características deseables para un vector de terapia génica, que incluyen la capacidad de unirse
20 y entrar en células diana, entrar en el núcleo, la capacidad de expresarse en el núcleo durante un periodo prolongado de tiempo y su baja toxicidad. Sin embargo, el tamaño pequeño del genoma de AAV limita el tamaño del ADN heterólogo que se puede incorporar. Para minimizar este problema, los vectores de AAV se han construido para que no codifiquen Rep y el elemento de eficiencia de integración (IEE). Las ITR se conservan, ya que son señales cis requeridas para el empaquetamiento (Daya y Berns, Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008).
25 Se conocen bien en la técnica métodos para producir el rAAV adecuado para terapia génica (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos N.º 2012/0100606; 2012/0135515; 2011/0229971; y 2013/0072548; y Ghosh et al., Gene Ther 13(4):321-329, 2006), y pueden utilizarse con las moléculas recombinantes de ácido nucleico y métodos descritos en el presente documento.
30 Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ciertas características y/o realizaciones particulares. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la descripción a las características o realizaciones particulares descritas.
35 Ejemplos
Ejemplo 1: Normalización completa de deficiencia hepática de G6PC de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo Ia usando terapia génica
40 Este ejemplo describe una comparación de dos vectores de AAV que expresan G6Pasa-α, impulsada por dos promotores diferentes, en eficiencia de la administración génica hepática y la expresión de G6Pasa-α en ratones con deficiencia de G6PC. Los resultados demuestran que el vector de AAV con el promotor/potenciador de G6PC (AAVGPE) fue más eficiente en dirigir la expresión del transgén hepático in vivo persistente que el vector de AAV con el promotor de β-actina de pollo/potenciador de CMV (AAV-CBA). Además, los ratones con deficiencia de G6PC
45 tratados con AAV-GPE presentaron niveles normales de glucosa en sangre, metabolitos en sangre, glucógeno hepático y grasa hepática.
MATERIALES Y MÉTODOS
50 Construcción de pUF11-GPE-G6PC y preparación de vectores de AAV
El plásmido UF11-GPE-G6PC, que contiene G6Pasa-α humana bajo el control del promotor/potenciador de G6PC humano se construyó modificando pUF11-mG6Pasa-α-CBA (Ghosh et al., Gene Ther 13:321-329, 2006) donde la G6Pasa-α murina se impulsa por el promotor de CBA/potenciador de CMV (Xu et al., Hum Gene Ther 12:563-573,
55 2001) como se indica a continuación: El fragmento Tkp-neo de pUF11-mG6Pasa-α-CBA se eliminó por digestión XhoI/SphI, el vector restante se purificó en gel, se pulió con ADN polimerasa T4, después se autoligó para producir pUF11-mG6Pasa-α-CBA-[Tkp-neo]-/-. La mG6Pasa-α, junto con el promotor de CBA/potenciador de CMV, en pUF11mG6Pasa-α-CBA-[Tkp-neo]-/-después se sustituyó con el ADNc de G6Pasa-α humana en los sitios 5'-SbfI y 3'-NotI, produciendo pUF11-G6PC. Después, se usó PCR para clonar los nucleótidos -2864 a -1 de la región flanqueante 5'
de G6PC que contiene el promotor/potenciador de G6PC humano. La plantilla de PCR era un cromosoma bacteriano artificial que contenía el gen G6PC humano (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) y los pares de cebadores fueron: 1S (5'-CCTTTGAGAATCCACGGTGT-3'; SEQ ID NO: 5) y 2AS (5'-CCTCATTTCCTTGGCACCTC-3'; SEQ ID NO: 6), que contienen los sitios KpnI y XbaI adicionales en los extremos 5' y 3', respectivamente. El fragmento KpnI5 XbaI que contiene el promotor/potenciador de G6PC se ligó entonces en el pUF11-G6PC linealizado con KpnI-XbaI, para producir pUF11-G6PC-GPE-1. A continuación, se usó PCR para clonar el intrón quimérico del vector pCI (Promega, Madison, WI) usando el par de cebadores 3S (5'-AGGTAAGTATCAAGGTTACA-3'; SEQ ID NO: 7) y 4AS (5'-ACCTGTGGAGAGAAAGGCAA-3'; SEQ ID NO: 8) que contienen sitios SpeI y SbfI adicionales en los extremos 5' y 3', respectivamente. Después, este intrón quimérico se ligó como un fragmento SpeI-SbfI en el fragmento grande
10 linealizado con SpeI-SbfI de pUF11-G6PC-GPE-I, para producir pUF11-GPE-G6PC (SEQ ID NO: 1). Todas las construcciones se verificaron por secuenciación de ADN.
Se produjeron AAV-GPE y AAV-CBA usando pUF11-GPE-G6PC y pUF11-mG6Pasa-α-CBA, respectivamente, y se generaron, se purificaron y se titularon como se ha descrito previamente (Ghosh et al., Gene Ther 13:321-329,
15 2006). La cuantificación del genoma del vector se realizó mediante el uso de PCR en tiempo real con cebadores y sondas dirigidas contra la G6PC o el promotor de CBA.
Infusión de ratones G6pc-/-con vectores de AAV
20 Una terapia de glucosa, que consiste en una inyección intraperitoneal de 25-100 µl de glucosa al 15% cada 12 h, se administró a los ratones G6pc-/-como se ha descrito previamente (Lei et al., Nat Genet 13:203-209, 1996). A los ratones que sobrevivieron el destete se les dio acceso sin restricciones a comida (Zeigler Bros., Inc., Gardners, PA).
El vector AAV se infundió en ratones G6pc-/-de 2 días de edad a través de la vena temporal, y se infundieron en
25 ratones G6pc-/-de 2 o 4 semanas de edad a través del seno retro-orbital. Se usaron ratones G6pc+/+/G6pc+/emparejados por edad, así como ratones G6pc-/-de 4 a 6 semanas de edad, como control. Para los ratones con infusión de virus, la terapia de glucosa se terminó inmediatamente después de la infusión.
La prueba de tolerancia a la glucosa de ratones 12 o 14 semanas de edad G6pc-/-con infusión de AAV-GPE
30 consistió en un ayuno durante 6 horas antes de la toma de muestras de sangre, seguido de la inyección de 0,25 ml de dextrosa al 10% por vía subcutánea, y la repetición del muestreo de sangre a través de la vena de la cola cada 30 minutos durante 2 horas más.
Ensayos de fosfohidrolasa
35 Los ensayos del aislamiento de microsomas y de fosfohidrolasa se determinaron esencialmente como se ha descrito previamente (Lei et al., Nat Genet 13:203-209, 1996). Las mezclas de reacción (100 µl) contenían tampón de cacodilato 50 mM, a pH 6,5, G6P 10 mM y se incubaron cantidades apropiadas de preparaciones microsomales a 37 °C durante 10 minutos. Se prepararon membranas microsomales interrumpidas mediante incubación de membranas
40 intactas en desoxicolato al 0,2% durante 20 minutos a 0 °C. Se estimó actividad de fosfatasa no específica mediante pre-incubación de preparaciones microsomales interrumpidas a pH 5 durante 10 minutos a 37 °C, para inactivar la G6Pasa-α lábil de ácido.
Se realizó análisis histoquímico enzimático de G6Pasa-α mediante la incubación de secciones de tejido del hígado
45 de espesor de 10 µm durante 10 minutos a temperatura ambiente en una solución que contenía pH 6,5 de Trismaleato 40 mM, G6P 10 mM, sacarosa 300 mM y nitrato de plomo 3,6 mM (Teutsch, Prog Histochem Cytochem 14:1-92, 1981). El fosfato de plomo atrapado se visualizó después de la conversión en sulfuro de plomo de color marrón (Teutsch, Prog Histochem Cytochem 14:1-92, 1981).
50 Análisis fenotípico
Las muestras de sangre se recogieron de la vena de la cola. Se analizaron glucosa en sangre, colesterol total y ácido úrico usando kits obtenidos de Thermo Electron (Louisville, CO). Se midieron los triglicéridos con un kit de Sigma Diagnostics (St Louis, MO) y lactato medido mediante un kit de Trinity Biotech (St. Louis, MO).
55 Para hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de aceite rojo O, se conservaron secciones del hígado en formalina tamponada neutra al 10% y se seccionaron a 4-10 micrómetros de espesor. Las secciones teñidas se visualizaron utilizando el microscopio Axioskop2 plus y el software Axio Vision 4.5 (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Para la medición histoquímica cuantitativa de acumulación de lípidos, la tinción de aceite rojo O se convirtió en unidades de densidad
de píxeles utilizando Adobe Photoshop CS3 (Adobe System Incorporated, San Jose, CA).
Para determinar el contenido de glucógeno del hígado, el tejido se homogeneizó con HCl, se hirvió durante 10 minutos y se neutralizó con acetato sódico a un pH final de 4,5 (Teutsch, Prog Histochem Cytochem 14:1-92, 1981).
5 Después, el tejido hidrolizado se digirió con amilo-α-1,4-α-1,6-glucosidasa y la glucosa liberada se midió usando un kit obtenido de Sigma Diagnostics. El contenido de glucógeno se indica como nmol unidades de glucosilo por mg de proteína hepática.
Ensayos de anticuerpos
10 Los anticuerpos contra G6Pasa-α humana o murina se detectaron por análisis de transferencia Western. Las proteínas microsomales de células COS-1 infectadas con G6Pasa-α Ad-humana o G6Pasa-α Ad-murina (Ghosh et al., J Biol Chem 277: 32837-32842, 2002) se resolvieron por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida al 12%-SDS y se transfirió en trans en membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). La membrana
15 se puso en un aparato Multiscreen (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) que contenía de múltiples canales. La tira de membrana en cada canal se incubó con un suero de G6Pasa-α anti-humana de conejo (Ghosh et al., J Biol Chem
277: 32837-32842, 2002) diluido 1:3000, o muestras de suero de animales con infusión de AAV-GPE o con infusión de AAV-CBA diluidas 1:200. Se usaron muestras de suero de compañeros de camada sin tratar G6pc-/-y G6pc+/+/G6pc+/-diluidas 1:200 como controles. Después de incubación durante una noche, las tiras de membrana se
20 incubaron con IgG de cabra anti-conejo de conjugado de peroxidasa de rábano picante o IgG de cabra anti-ratón (Kirkegarrd & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). El inmunocomplejo se visualizó por el sistema quimioluminiscente usando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal™ West Pico de Pierce (Rockford, IL).
Inmunodetección de linfocitos CD8+
25 Los hígados de ratones se congelaron rápidamente, se incluyeron en O.C.T. (Sakura Finetek, Terrance, CA), y se seccionaron a 8 micrómetros de espesor. Las secciones se fijaron en acetona durante 10 minutos a -20 °C, se secaron, se lavaron con PBS, se bloquearon con PBS que contenía el 2% de BSA durante 30 minutos, y se incubaron a 4 °C durante una noche con un anticuerpo policlonal de conejo contra CD8 (Abeam Inc., Cambridge,
30 MA) en PBS complementado con BSA al 1%. Después de lavados con PBS, las secciones se incubaron durante 1 hora a 25 °C en la oscuridad con un anticuerpo IgG de cabra anti-rata conjugado con tinte Alexa Fluor® 488 (Invitrogen). Después de lavados con PBS, las células marcadas se montaron con un medio anti-desvanecimiento de montaje a base de agua que contenía DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se visualizaron usando el microscopio de fluorescencia Axioskop2 plus (Carl Zeiss, Thornwood, NY). Las células CD8+ se contaron en diez
35 campos seleccionados al azar con un aumento de 200 veces y se indicaron como la media aritmética.
Análisis estadístico
La prueba t no pareada se realizó utilizando el programa GraphPad Prism®, versión 4 (GraphPad Software, San 40 Diego, CA). Los valores se consideraron estadísticamente significativos en p < 0,05.
RESULTADOS
La infusión con AAV-GPE dirige la expresión hepática a largo plazo de G6Pasa-α
45 Con el fin de examinar el impacto in vivo de secuencias aguas arriba de nucleótidos -298 del elemento promotor de G6PC humano estudiado previamente (Koeberl et al., Mol Ther 16:665-672, 2008), AAV-GPE, se construyó un vector AAV8 que expresaba G6Pasa-α humana bajo el control de los nucleótidos -2864 a -1 de la región flanqueante 5' de G6PC 5' humana. Puesto que no hay edad estándar a la que iniciar la terapia génica mediada por AAV en
50 ratones (Ghosh et al., Gene Ther 13:321-329, 2006; Koeberl et al., Gene Ther 13:1281-1289, 2006; Koeberl et al., Mol Ther 16:665-672, 2008) y que hay evidencia de que la pérdida de eficacia y persistencia de la transferencia de genes se ve influenciada por el aumento de la tasa de proliferación hepatocelular asociada con el crecimiento del hígado (Cunningham et al., Mol Ther 16:1081-1088, 2008), los ratones G6pc-/-se infundieron a tres edades diferentes, 2 días de edad, 2 semanas de edad o 4 semanas de edad, y se examinó una expresión hepática de
55 G6Pasa-α a las 24 semanas de edad. A pesar de la diferencia de edad, cada grupo de ratones se infundió con la misma dosis de AAV-GPE (1,2 x 1011 genomas virales (vg)/ratón). Se controlaron los perfiles metabólicos de los animales infundidos durante el estudio de 24 semanas, y todas las mediciones se compararon con las de sus compañeros de camada G6pc+/+/G6pc+/-y ratones G6pc-/-de 4 a 6 semanas de edad sin tratar. La GSD-Ia es un trastorno autosómico recesivo, y estudios previos han demostrado que el fenotipo de los compañeros de camada
G6pc+/+ y G6pc+/-son indistinguibles y de tipo salvaje (Lei et al., Nat Genet 13:203-209, 1996).
No hubo muertes prematuras en los animales G6pc-/-infundidos a lo largo de la duración del estudio de 24 semanas, independientemente de la edad de infusión. En los ratones G6pc-/-infundidos a los 2 días de edad con AAV-GPE
5 (1,2 x 1011 vg/ratón, equivalente a 6 x 1013 vg/kg), la actividad hepática de G6Pasa-α fue del 77,6% de la actividad de control a las 2 semanas de edad, disminuyendo al 16,2% a las 4 semanas de edad y el 6,5% de actividad de control a las 6 semanas de edad (Tabla 1). Sin embargo, más allá de 6 semanas, los niveles de actividad hepática de G6Pasa-α se estabilizaron al cabo de 24 semanas (Tabla 1). Por lo tanto, la expresión se redujo 11,9 veces en todo el estudio de 24 semanas, teniendo lugar la mayor reducción en las primeras 6 semanas.
10 En contraste, en ratones G6pc-/-infundidos a las 2 semanas de edad con AAV-GPE (1,2 x 1011 vg/ratón, equivalente a 1,5 x 1013 vg/kg), la actividad hepática de G6Pasa-α a las 2 semanas de edad posterior a la infusión (a las 4 semanas de edad) fue 2,4 veces mayor que la actividad en sus compañeros de camada G6pc+/+/G6pc+/-(Tabla 1), alcanzando 433,4 ± 11,1 nmol/mg/min. A pesar de que la actividad hepática de G6Pasa-α se sometió posteriormente
15 a una reducción de 2,6 veces entre las edades de 4 a 6 semanas, dio como resultado una actividad hepática casi normal de G6Pasa-α (174,0 ± 22,4 nmol/mg/min) que se mantuvo desde la edad de 6 semanas durante la duración del estudio de 24 semanas (Tabla 1). De forma similar, en ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE a la edad de 4 semanas con la misma dosificación (1,2 x 1011 vg/ratón, equivalente a 1 x 1013 vg/kg), la actividad de G6Pasa-α hepática a la edad de 24 semanas fue de 335,6 ± 40,2 nmol/min/mg, 1,9 veces mayor que la actividad en los
20 compañeros de camada de control (Tabla 1). Estos hallazgos son consistentes con la propuesta anterior (Cunningham et al., Mol Ther 16:1081-1088, 2008) de que la pérdida de eficacia y persistencia de la transferencia génica se ve influenciada por el aumento de la tasa de proliferación hepatocelular asociada con el crecimiento del hígado. Las inyecciones en etapas posteriores de desarrollo, cuando la tasa de crecimiento del hígado es más baja, dieron como resultado una menor pérdida de la expresión génica.
25 Se investigó la distribución de la expresión de transgén de G6Pasa-α en el hígado. Como era de esperar, no hubo actividad teñible de G6Pasa-α en las secciones del hígado de ratones G6pc-/-sin tratar. En ratones G6pc+/+/G6pc+/-, el análisis histoquímico enzimático demostró G6Pasa-α distribuida por todo el hígado, pero con niveles significativamente más altos en proximidad a los vasos sanguíneos.
30 En ratones G6pc-/-infundidos a la edad de 2 días con AAV-GPE, se distribuyó la actividad de G6Pasa-α hepática por todo el hígado a las 2 semanas de edad. A diferencia de los ratones de tipo salvaje, la expresión era desigual con focos que se tiñeron con mayor fuerza que en los hígados de control. La actividad teñida de G6Pasa-α disminuyó notablemente de 2 a 4 semanas de edad, consecuente con una disminución de 4,8 veces la actividad de
35 fosfohidrolasa (Tabla 1). De nuevo, la actividad teñida de G6Pasa-α disminuyó y se estabilizó a las 6 semanas de edad o más.
En ratones G6pc-/-infundidos con AAV-GPE a las 2 o 4 semanas de edad, el análisis histoquímico enzimático mostró de nuevo que el transgén de G6Pasa-α se distribuyó por todo el hígado con focos que contenían niveles
40 significativamente más altos de actividad enzimática. De nuevo, las actividades de G6Pasa-α estimadas mediante análisis histoquímico estaban de acuerdo con ensayos cuantitativos de fosfohidrolasa (Tabla 1). En ratones G6pc-/infundidos con AAV-GPE a las 2 semanas de edad, habían células en el hígado que se tiñeron con menor intensidad que las células en los hígados de tipo salvaje. Por lo tanto, no se restauró un patrón normal de expresión hepática de G6Pasa-α en ratones infundidos con AAV-GPE, a pesar de presentar actividad de G6Pasa-α de tipo salvaje.
45 Tabla 1. Actividad hepática de G6Pasa en ratones G6pc-/-infundidos con 1,2 x 1011 vg/ratón de AAV-GPE Actividad de % (+/+ o +/-) de
Ratones Edad Actividad relativa
fosfohidrolasa actividad semanas nmol/mg/min %
+/+ o +/-(n = 16) 2-24 178,1 ± 10,0 100
Infusión a los 2 días de edad -/-/AAV-GPE (n =
2 138,3 ± 22,6 100 77,6
2) -/-/AAV-GPE (n =
4 28,8 ± 9,9 20,8 16,24)
Ratones
Edad Actividad de fosfohidrolasa Actividad relativa % (+/+ o +/-) de actividad
semanas
nmol/mg/min %
-/-/AAV-GPE (n = 7)
6-24 11,6 ± 5,0 8,4 6,5
Infusión a las 2 semanas de edad -/-/AAV-GPE (n =
4 433,4 ± 11,1 100 243,3
2) -/-/AAV-GPE (n =
6 156,1 ± 7,0 36,0 87,6
2) -/-/AAV-GPE (n =
24 174,0 ± 22,4 40,1 97,7
3) Infusión a las 4 semanas de edad -/-/AAV-GPE (n = 3) -/-/AAV-GPE (n =
24 335,6 ± 40,2 188,4
3) Los ratones G6pc-/-(-/-) se infundieron con 1,2 x 1011 vg/ratón de AAV-GPE a los 2 días, 2 semanas o 4 semanas de edad como se describe en MATERIALES y MÉTODOS. Se usaron ratones G6pc+/+/G6pc+/(+/+ y +/-) emparejados por edad como controles positivos y se usaron ratones G6pc-/-(-/-) de 4 a 6 semanas de edad como controles negativos. Los valores en la tabla se han corregido para determinar el antecedente, restando la actividad de G6Pasa-α (1,8 ± 0,2 nmol/min/mg) en los microsomas del hígado de ratones G6pc-/-sin tratar de los resultados respectivos. Los datos se presentan como media ± SEM.
La infusión de AAV-CBA se dirige a los niveles más bajos de expresión hepática de G6Pasa-α
El promotor de CBA/potenciador de CMV se ha usado ampliamente para dirigir altos niveles de la expresión transgén hepática (Xu et al., Hum Gene Ther 12:563-573, 2001). Sin embargo, se sabe que el promotor de CMV 5 está silenciado por metilación extensa de CpG y no CpG (Brooks et al., J Gene Med 6:395-404, 2004; Mehta et al., Gene 428: 20-24, 2009). Los experimentos anteriores in vivo que usaban AAV-CBA, un vector de AAV8 que expresaba G6Pasa-α murina bajo el control del promotor de CBA/potenciador de CMV híbrido habían mostrado una expresión deficiente (Ghosh et al., Gene Ther 13:321-329, 2006), posiblemente relacionada con la metilación del promotor de CMV. Con el fin de comparar la eficacia in vivo de la transferencia hepática génica entre AAV-CBA y
10 AAV-GPE, se infundieron ratones G6pc-/-con un aumento de la dosis de AAV-CBA a 4,8 x 1011 vg/ratón, de una manera similar a los experimentos de AAV-GPE, a los 2 días y 2 semanas de edad y seguido de las 24 semanas de edad.
Para los ratones G6pc-/-infundidos a los 2 días de edad, la actividad de G6Pasa-α hepática a la edad de 2 semanas
15 fue 2,8 veces mayor en ratones con infusión de AAV-CBA en comparación con ratones con infusión de AAV-GPE (Tablas 1 y 2), reflejando la dosificación 4 veces superior de la infusión de AAV-CBA. Sin embargo, la actividad hepática de G6Pasa-α en los animales con infusión de AAV-CBA en estado neonatal disminuyó rápidamente a 20,6 ± 1,1 nmol/mg/min a las 4 semanas de edad (Tabla 2), una disminución de 18,6 veces en 2 semanas, en comparación con una disminución de 4,8 veces en ratones G6pc-/-neonatales con infusión de AAV-GPE (Tabla 1).
20 Dado que CBA y GPE están en un fondo de vectores idénticos, este hallazgo sugiere que el promotor de CBA/potenciador de CMV es menos eficiente en el direccionamiento de la expresión hepática persistente del transgén in vivo que el promotor/potenciador de G6PC.
En ratones G6pc-/-con infusión de 4,8 x 1011 vg/ratón de AAV-CBA a la edad de 2 semanas, la actividad de G6Pasa
25 α hepática fue de 236,9 ± 64,7 a la edad de 4 semanas (Tabla 2), que fue 1,83 veces inferior que en ratones G6pc-/de 4 semanas de edad infundidos a la edad de 2 semanas con 1,2 x 1011 vg/ratón de AAV-GPE (Tabla 1). Además, la actividad de G6Pasa-α hepática continuó disminuyendo con el vector de CBA de 55,7 ± 2,7 nmol/mg/min a la edad de 6 semanas a 38,1 ± 1,7 nmol/mg/min a la edad de 24 semanas (Tabla 2). Esto estaba en contraste con los niveles expresados con el vector de GPE que se estabilizó durante este periodo de tiempo a niveles cercanos al tipo
30 salvaje (Tabla 1).
El análisis histoquímico enzimático de animales con infusión de AAV-CBA demostró que la tinción de actividad fue similar a la del vector de GPE, distribuida de forma desigual con numerosos focos que se tiñeron con mayor fuerza
que en los hígados de control. Sin embargo, en coherencia con los ensayos cuantitativos de fosfohidrolasa (Tabla 2), las intensidades generales de tinción fueron significativamente menores con el aumento de edad de los ratones infundidos.
Tabla 2. Actividad de G6Pasa hepática en ratones G6pc-/-infundidos con 4,8 x 1011 vg/ratón de AAV-CBA Actividad de % (+/+ o +/-) de
Ratones Edad Actividad relativa
fosfohidrolasa actividad semanas nmol/mg/min %
+/+ o +/-(n = 16) 2-24 178,1 ± 10,0
Infusión a los 2
días de edad
-/-/AAV-CBA (n = 2) -/-/AAV-CBA (n = 3)
2 4 382,3 ± 4,2 20,6 ± 1,1 100 5,4 214,7 11,6
Infusión a las 2 semanas de edad -/-/AAV-CBA (n =
4 236,9 ± 64,7 100 133,0
2) -/-/AAV-CBA (n =
6 55,7 ± 2,7 23,5 31,3
2) -/-/AAV-CBA (n =
24 38,1 ± 1,7 16,1 21,4
3) Los ratones G6pc-/-(-/-) se infundieron con 4,8 x 1011 vg/ratón de AAV-CBA a la edad de 2 días y 2 semanas como se describe en MATERIALES y MÉTODOS. Se usaron ratones G6pc+/+/G6pc+/-(+/+ y +/-) emparejados por edad como controles positivos y se usaron ratones G6pc-/-(-/-) de 4 a 6 semanas de edad como controles negativos. Los valores en la tabla se han corregido para determinar el antecedente, restando la actividad de G6Pasa-α (1,8 ± 0,2 nmol/min/mg) en los microsomas del hígado de ratones G6pc-/-sin tratar de los resultados respectivos. Los datos se presentan como media ± SEM.
La infusión de AAV-GPE corrige las manifestaciones patológicas de GSD-Ia
Los ratones G6pc-/-en terapia de glucosa tienen un crecimiento retardado y en 2 semanas de edad su peso corporal
10 promedio es de aproximadamente el 60% de sus compañeros de camada G6pc+/+/G6pc+/-(Lei et al., Nat Genet 13:203-209, 1996). Los ratones G6pC-/-neonatales con infusión de AAV-GPE tuvieron una tasa de crecimiento notablemente mejorada y los pesos corporales de los animales infundidos fueron comparables a los ratones de control (Figura 1A). Los ratones G6pc-/-con infusión a las 2 o 4 semanas de edad de AAV-GPE presentaron una curva de crecimiento paralelo a sus compañeros de camada G6pc-/-/G6pc+/-, pero a valores más bajos, lo que es
15 coherente con los pesos corporales inferiores de partida de ratones G6pc-/-antes de iniciar terapia génica (Figura 1A).
En terapia de glucosa, los ratones G6pc-/-continúan manifestando hipoglucemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperuricemia y acidemia láctica (Lei et al., Nat Genet 13:203-209, 1996; Kim et al., J Hepatol 48:
20 479-485, 2008). Por el contrario, los ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE tenían perfiles de glucosa en sangre normales (Figura 1B) y ninguno de los animales infundidos sufrió los ataques hipoglucémicos frecuentes típicos de los ratones G6pc-/-sin tratar (Lei et al., Nat Genet 13:203-209, 1996) y los pacientes con GSD-Ia humana (Chou et al., Curr Mol Med 2:121-143, 2002). Los niveles de glucosa en sangre en ratones G6pc-/-infundidos en estado neonatal fueron significativamente más bajos que en sus compañeros de camada de control (Figura 1B), lo que
25 sugiere que la actividad de G6Pasa-α hepática restaurada a un 6,5% de niveles de control es insuficiente para mantener un perfil normal de glucosa en sangre. En contraste, los niveles de glucosa en sangre en ratones G6pc-/con infusión de AAV-GPE a las 2 o 4 semanas de edad podían distinguirse de sus compañeros de camada de control (Figura 1B). La infusión con AAV-GPE también normalizó los niveles normalizados de colesterol sérico, triglicéridos, ácido úrico y ácido láctico, aunque los ratones G6pc-/-con infusión en fase neonatal tenían niveles
30 ligeramente más altos de colesterol en sangre y ácido láctico (Figura 1B).
La hepatomegalia es otra presentación clínica en GSD-Ia y es causada principalmente por el exceso de glucógeno y
deposición de lípidos (Chou et al., Curr Mol Med 2:121-143, 2002). No se observó anomalía histológica en las secciones de tejido del hígado de los ratones no afectados y transducidos con AAV-GPE de 24 semanas de edad. El contenido de glucógeno en el hígado de ratones G6pc+/+/G6pc+/-de 24 semanas de edad promedió unidades de glucosilo de 1,89 ± 0,17 nmol por mg de proteína en animales con infusión en fase neonatal de AAV-GPE, el 5 contenido de glucógeno a las 24 semanas de edad fue significativamente mayor en unidades de glucosilo de 4,65 ± 0,19 nmol por mg de proteína, indicativo del defecto de almacenamiento de glucógeno observado en ratones con GSD-Ia. En contraste, los ratones que recibieron infusiones a las 2 o 4 semanas de edad mostraron niveles de tipo salvaje de glucógeno a las 24 semanas de edad, concretamente, unidades de glucosilo de 1,61 ± 0,39 y 1,65 ± 0,19 nmol por mg de proteína, respectivamente, indicativo de la ausencia de la histología característica de la enfermedad
10 de GSD-Ia en esta fase de desarrollo.
La tinción de aceite rojo O mostró que el contenido de lípidos en animales con infusión de AAV-GPE fue similar al de los compañeros de camada G6pc+/+/G6pc+/-a las 24 semanas de edad. Para la medición histoquímica cuantitativa, se convirtieron los lípidos fotografiados con tinción de aceite rojo O en unidades de densidad de píxeles utilizando
15 Adobe Photoshop. Las unidades de densidad en el hígado de ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE eran más bajas que las de los ratones de control (aproximadamente 150 unidades de densidad de píxeles/µm2 en comparación con aproximadamente 300 unidades de densidad de píxeles/µm2), aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa. Tomados en conjunto, estos resultados indican que los ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE no presentaron ninguna anomalía histológica y tuvieron un contenido normal de glucógeno y de grasas en el hígado.
20 Los ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE presentan un perfil de glucosa en ayunas normal y de tolerancia a la glucosa
Los niveles de glucosa en sangre en ayunas se examinaron en ratones G6pc-/-de 12 y 14 semanas de edad
25 infundidos con AAV-GPE a la edad de 2 y 4 semanas, respectivamente. Los niveles de glucosa en sangre en ratones G6pc+/+/G6pc+/-no cambiaron después de 6 horas de ayuno. De forma importante, los niveles de glucosa en sangre en ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE, a las 2 o 4 semanas de edad, tampoco cambiaron después de 6 horas de ayuno, lo que demuestra que los ratones G6pc-/-infundidos ya no sufrieron más de hipoglucemia en ayunas, característica de la GSD-la (Chou et al., Curr Mol Med 2:121-143, 2002). Los experimentos similares en
30 ayunas con los ratones G6pc-/-sin tratar dieron lugar a hipoglucemia rápida seguida de ataques hipoglucémicos después de tan sólo un corto ayuno.
Los estudios han demostrado que la sobreexpresión de G6Pasa-α hepática puede inducir diabetes (Liu et al., Biochem Biophys Res Commun 205:680-686, 1994; Antinozzi et al., Annu Rev Nutr 19: 511-544, 1999; Clore et al., 35 Diabetes 49:969-974, 2000). Dado que la actividad de G6Pasa-α hepática en ratones cG6pc-/-de 24 semanas de edad infundidos a las 4 semanas de edad con AAV-GPE era casi 2 veces superior a la actividad en sus compañeros de camada G6pc+/+/G6pc+/-, se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en ratones G6pc-/-de 14 semanas de edad infundidos a la edad de 4 semanas con AAV-GPE. Como control, también se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa en ratones G6pc-/-de 12 semanas de edad infundidos a las 2 semanas de edad con AAV-GPE. Estos
40 animales presentaron niveles de tipo salvaje de actividad hepática de G6Pasa-α. Los perfiles de tolerancia a la glucosa en los ratones G6pc infundidos no se pudieron distinguir de los de los compañeros de camada de control.
Ausencia de respuesta inmune contra G6Pasa-α humana
45 Para determinar si se genera una respuesta humoral dirigida contra G6Pasa-α humana en los ratones G6pc-/infundidos, se realizó un análisis de transferencia Western usando sueros de ratones con infusión de AAV-GPE o AAV-CBA. Como control positivo, se utilizó un antisuero de G6Pasa-α anti-humana de conejo que reconoce también G6Pasa-α murina (Ghosh et al., J Biol Chem 277: 32837-32842, 2002). No se detectaron anticuerpos dirigidos contra G6Pasa-α en ninguno de los ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE o AAV-CBA que vivieron hasta las 24
50 semanas de edad. Además, no habían anticuerpos endógenos dirigidos contra G6Pasa-α presentes en el suero de compañeros de camada G6pc+/+/G6pc+/-o ratones G6pc-/-sin tratar
La infusión de AAV-CBA provoca un aumento de la infiltración hepática de linfocitos CD8+
55 La ausencia de anticuerpos detectables contra G6Pasa-α en el hígado de ratones G6pc-/-con infusión de AAV-CBA, sugiere que una respuesta inmune mediada por células con respecto al transgén de G6Pasa-α no es la causa de la disminución rápida de la expresión de transgén dirigida por este vector. Otra posibilidad es una respuesta inflamatoria inmune provocada por el vector de AAV-CBA. Por lo tanto, la infiltración hepática de linfocitos CD8+ se examinó 2 semanas después de la infusión de ratones G6pc-/-con AAV-CBA o AAV-GPE. En ratones G6pc-/-o de
tipo salvaje de 2 y 4 semanas de edad, los recuentos hepáticos de linfocitos CD8+ eran bajos. En ratones G6pc-/con infusión de AAV-CBA o AAV-GPE a los 2 días de edad, los recuentos hepáticos de linfocitos CD8+ a las 2 semanas de edad fueron similares para cada uno de los tipos de vectores y comparables con los recuentos en animales de tipo salvaje o G6pc-/-de 2 semanas de edad sin tratar. En ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE a
5 las 2 semanas de edad, los recuentos hepáticos de linfocitos CD8+ se mantuvieron bajos a las 4 semanas de edad. En contraste, en ratones G6pc-/-con infusión de AAV-CBA a las 2 semanas de edad, los recuentos hepáticos de linfocitos CD8+ se aumentaron notablemente a las 4 semanas de edad. Los resultados sugieren que una respuesta inflamatoria provocada por AAV-CBA puede explicar, al menos en parte, la disminución rápida y la baja eficacia de la expresión hepática de G6Pasa-α dirigida por el promotor de CBA/potenciador de CMV.
10 Ejemplo 2: Prevención de adenoma hepatocelular y corrección de anomalías metabólicas en enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo IA usando terapia génica
Este ejemplo describe estudios para evaluar la eficacia del vector de AAV-GPE en un estudio a largo plazo. La
15 terapia génica mediada por el vector de AAV-GPE en ratones G6pc-/-fue eficaz durante al menos 70-90 semanas en ratones que expresaban más del 3% de G6Pasa-α hepática de tipo salvaje. Los resultados demostraron que ratones tratados con AAV-GPE presentan almacenamiento hepático normal de grasa, metabolitos en sangre normales y perfiles de tolerancia a la glucosa, niveles reducidos de insulina en sangre en ayunas y ninguna evidencia de alteraciones hepáticas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Infusión de ratones G6pc-/-con AAV-GPE
25 El vector AAV-GPE (como se describe en el Ejemplo 1 y Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010) se infundió en ratones G6pc-/-(Lei et al., Nat Genet 13: 203-209, 1996) a través del seno retro-orbital. Se usaron ratones G6pc+/+/G6pc+/-emparejados por edad, así como ratones G6pc-/-de 6 a 10 semanas de edad, como control. Para ratones con infusión de virus, la terapia de glucosa (Lei et al., Nat Genet 13: 203-209, 1996) se determinó inmediatamente después de la infusión.
30 Las pruebas de tolerancia a la glucosa de ratones consistían en ayuno durante 6 horas, antes de la toma de muestras de sangre, seguido de inyección intraperitoneal de una solución de glucosa a un peso corporal de 2 mg/g, y se repite la toma de muestras de sangre a través de la vena de la cola durante 2 horas.
35 Ensayos de captación de fosfohidrolasa y de G6P microsomal
Se llevó a cabo aislamiento de microsomas, ensayos de fosfohidrolasa, análisis histoquímico enzimático de G6Pasaα, y ensayos de captación de G6P microsomal, como se ha descrito previamente (Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010; Lei et al., Nat Genet 13: 203-209, 1996).
Análisis fenotípico
Se examinaron primero ratones para nódulos hepáticos mediante ultrasonidos utilizando el sistema Vevo 2100 (VisualSonics, Ontario, Canadá) y se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola. Se analizaron glucosa en 45 sangre, colesterol total y ácido úrico utilizando kits obtenidos de Thermo Electron (Louisville, CO); triglicéridos, mediante un kit de Sigma Diagnostics (St Louis, MO); lactato, mediante un kit de Trinity Biotech (St. Louis, MO); e insulina, mediante un kit ELISA de insulina de ratón ultra sensible de Crystal Chem (Downers Grove, IL). Se midieron contenidos hepáticos de glucógeno como se ha descrito previamente (Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010). Para determinar contenidos hepáticos de triglicéridos, glucosa y G6P, se homogeneizaron tejidos del hígado en tampón
50 RIPA (Tris HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, Na-desoxicolato al 0,5% y SDS al 0,1%) (Thermo Scientific, Rockford, IL) y se midieron los triglicéridos usando un kit de Sigma Diagnostics; glucosa, mediante un kit de Thermo Electron y; G6P, mediante un kit de BioVision (Mountain View, CA).
Para hematoxilina y eosina (H&E) y tinción de aceite rojo O (Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010), se
55 conservaron secciones del hígado en formalina tamponada neutra al 10% y se seccionaron a 4-10 micrómetros de espesor. Las secciones teñidas se visualizaron utilizando el microscopio Axioskop2 plus y el software Axio Vision 4.5 (Carl Zeiss, Thornwood, NY).
RT-PCR cuantitativa en tiempo real y análisis de anticuerpos
Se aislaron los ARN totales de los tejidos del hígado usando el reactivo TRIzol™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se cuantificó la expresión de ARNm mediante RT-PCR en tiempo real en un sistema de PCR de tiempo real Applied Biosystems 7300 usando sondas TaqMan de Applied Biosystems (Foster City, CA). Se analizaron los datos
5 utilizando el software Applied Biosystems SDS v 1.3 y se normalizaron el ARN de β-actina. Se detectaron los anticuerpos contra G6Pasa-α humana mediante análisis de transferencia Western de la manera que se ha descrito previamente (Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010).
Análisis estadístico
10 La prueba t no pareada se realizó utilizando el programa GraphPad Prism®, versión 4 (San Diego, CA). Los valores se consideraron estadísticamente significativos en P < 0,05.
RESULTADOS La infusión con AAV-GPE se dirige a la expresión hepática a largo plazo de G6Pasa-α
Ratones -G6pc-/-de dos a cuatro semanas de edad (n = 18) se infundieron con dosis variables de AAV-GPE (5 x 1012 a 3 x 1013 partículas virales (vp)/kg) previstas para restaurar y mantener del 3% al 100% de la actividad de 20 G6Pasa-α hepática de tipo salvaje. También se infundieron un ratón de 15 semanas de edad (5 x 1012 vp/kg) y un ratón de 30 semanas de edad (1 x 1013 vp/kg) G6pc-/-. La baja tasa de supervivencia de ratones de GSD-Ia bajo terapia de glucosa restringió gravemente el número de ratones adultos disponibles para estudio (Lei et al., Nat Genet
13: 203-209, 1996). Se controlaron los perfiles histológicos y metabólicos de los 20 animales infundidos a lo largo de 70-90 semanas, y todas las mediciones se compararon con las de sus compañeros de camada G6pc+/+ y G6pc+/-. El
25 fenotipo de ratones tanto G6pc+/+ como G6pc+/-no se puede distinguir del tipo salvaje (Lei et al., Nat Genet 13: 203209, 1996).
No hubo muertes prematuras de los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE. Se evaluó el contenido de glucógeno y la actividad hepática de G6Pasa-α en ratones sacrificados después de 24 horas de ayuno. La actividad media 30 hepática de G6Pasa-α en ayunas de ratones de tipo salvaje de 70 a 90 semanas de edad (n = 20) fue de 185,8 ± 12,7 nmol/mg/min (Figura 2A). Como estaba previsto, hubo un intervalo de actividades hepáticas de G6Pasa-α restaurado en los ratones tratados. De los 20 ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE sacrificados a las 70 a 90 semanas de edad, 6 ratones tuvieron niveles bajos (3% al 9% de actividad de tipo salvaje) de actividad hepática de G6Pasa-α y se designaron con AAV-L, 9 ratones tuvieron niveles medios (22% al 63% de actividad de tipo salvaje)
35 de actividad hepática de G6Pasa-α, designados con AAV-M, y 5 ratones tuvieron niveles altos (81% al 128% de actividad de tipo salvaje) de actividad hepática de G6Pasa-α, designados AAV-H (Figura 2A). El análisis por RT-PCR en tiempo real mostró una relación lineal entre la expresión hepática de ARNm de G6Pasa-α y la actividad de G6Pasa-α (Figura 2B).
40 El análisis histoquímico enzimático demostró que la G6Pasa-α en ratones de tipo salvaje se distribuyó por todo el hígado con niveles significativamente más altos en proximidad a los vasos sanguíneos. No hubo actividad teñible de G6Pasa-α en las secciones del hígado de ratones G6pc-/-sin tratar. En ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE, se distribuyó también G6Pasa-α por todo el hígado, pero con focos, no relacionados con vasos sanguíneos, que contenían niveles considerablemente más altos de actividad enzimática. La distribución desigual de G6Pasa-α
45 hepática en los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE sugiere que una proporción sustancial de los hepatocitos albergaron baja o poca G6Pasa-α, incluyendo hígados de AAV-H que expresaban el 81-128% de la actividad de G6Pasa-α de tipo salvaje. No se requiere la expresión hepática de G6Pasa-α uniforme para el rescate del fenotipo de GSD-Ia.
50 La infusión de AAV-GPE corrige anomalías metabólicas en GSD-Ia
La GSD-Ia se caracteriza por hipoglucemia, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, hiperuricemia y acidemia láctica (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). Los niveles de glucosa en sangre en ratones de AAV-H que expresan actividad hepática de G6Pasa-α de tipo salvaje no pudieron distinguirse de los de los compañeros de 55 camada de control (Figura 3A). Los AAV-M y AAV-L que expresan el 22-63% y el 3-9% de actividad hepática normal de G6Pasa-α, respectivamente, también mantuvieron un estado de euglucemia (-100 mg/dl) (Yoshizawa et al., J Clin Invest 119:2807-2817, 2009) pero sus niveles de glucosa en sangre fueron sistemáticamente inferiores a la de los compañeros de camada de control (Figura 3A). Todo los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE presentaron perfiles séricos normales de colesterol y triglicéridos, mientras que los niveles séricos de ácido úrico y ácido láctico en los
ratones G6pc-/-tratados fueron inferiores a los de los compañeros de camada de control (Figura 3A).
Los pesos corporales promedio de los ratones hembra y macho tratados con AAV-GPE a las 70-90 semanas de edad fueron del 70% y 62%, respectivamente, de sus ratones de control emparejados por edad y sexo (Figura 3B). 5 Sin embargo, las longitudes corporales promedio de los ratones G6pc-/-tratados fue del 90% de los controles (Figura 3B). En consecuencia, los valores del índice de masa corporal (IMC) (Bahary et al., Proc Natl Acad Sci USA 87:8642-8646, 1990) de ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE fueron significativamente más bajos que los de los compañeros de camada de control (Figura 3B). Si bien los valores de IMC de ambos grupos de ratones indican un crecimiento normal (Bahary et al., Proc Natl Acad Sci USA 87:8642-8646, 1990), los ratones G6pc-/-tratados con 10 AAV-GPE fueron considerablemente más delgados. Los pesos del hígado en ratones de tipo salvaje fueron relativamente constantes (Figura 3C). En ratones con infusión de AAV-GPE, los pesos del hígado se correlacionaron inversamente con la actividad hepática de G6Pasa-α restaurada (Figura 3C). Cuando los pesos del hígado se expresaron como porcentaje del peso corporal, los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE tenían valores significativamente más altos a causa de su peso corporal más bajo. Sin embargo, cuando se compararon los pesos
15 absolutos del hígado de forma directa, no hubo diferencia significativa entre el AAV-M, el AAV-H y los compañeros de camada (Figura 3C). Sin embargo, los ratones de AAV-L continuaron mostrando hepatomegalia. El AAV-GPE suministra poco o ningún transgén al riñón (Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010). Sin embargo, los ratones inyectados que expresaban mayor actividad hepática de G6Pasa-α tuvieron pesos inferiores de riñón, lo que sugiere una buena nefromegalia normalizada de control metabólico hepático.
Ausencia de anomalías histoquímicas, esteatosis, o HCA en hígados G6pc-/-infundidos con AAV-GPE
Con el fin de determinar la presencia de nódulos de HCA en ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE, se realizó un análisis de ultrasonido, seguido de un examen amplio de los hígados y análisis histológico de muestras de biopsia 25 de hígado, utilizando 5 o más secciones separadas por hígado. Los análisis de ultrasonido y morfológicos no detectaron nódulos hepáticos de tipo salvaje (n = 20) y detectaron ratones (n = 20) G6pc-/-tratados con AAV-GPE que vivieron hasta las 70-90 semanas de edad. Los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE infundidos a las 2 o 4 semanas de edad (n = 18) no mostraron anomalías histológicas hepáticas, excepto un aumento de almacenamiento de glucógeno. El ratón de 84 semanas de edad infundido a las 15 semanas de edad, que expresaba el 6% de 30 actividad hepática normal de G6Pasa-α, presentó un almacenamiento elevado de glucógeno y pocos focos necróticos en una sección del hígado. A pesar de que la mayoría de las secciones de tejido del hígado de los ratones de 90 semanas de edad inyectados a las 30 semanas de edad, que expresaron el 38% de actividad hepática normal de G6Pasa-α, no presentaron anomalías histológicas, una sección del hígado tenía muchos focos necróticos. Dado que los focos necróticos son una patología hepática característica que se observa en ratones con GSD-Ia sin
35 tratar de 6 semanas de edad o mayores (Kim et al., J Hepatol 48: 479-485, 2008), es muy probable que los focos necróticos se hubiesen desarrollado antes de la iniciación de la terapia génica a las 15 o 30 semanas de edad.
Se indicó que los hígados de ratones con G6pc nula de hígado específico desarrollaban HCA con esteatosis marcada (Mutel et al., J Hepatol 54:529-537, 2011). Mientras que en unos pocos ratones de tipo salvaje había
40 aumento de almacenamiento hepático de grasas, hubo poco o ningún almacenamiento de grasas en los hígados de ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE. Además, el contenido hepático de triglicéridos en ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE (n = 20) no fueron estadísticamente diferentes de los ratones de tipo salvaje. La tinción de aceite rojo O confirmó que el contenido de lípidos en animales tratados con AAV-GPE (n = 20) fue similar al de los controles.
45 Se ha establecido bien que la ciclooxigenasa-2 (COX-2) es un marcador que se sobreexpresa en muchos cánceres pre-neoplásicos y neoplásicos, incluyendo HCC (Wu, Cancer Treat Rev 32:28-44, 2006). El análisis cuantitativo de RT-PCR demostró que los niveles similares de mensaje hepático de COX-2 se expresó en compañeros de camada G6pc-/-tratados con AAV-GPE y compañeros de camada de control.
50 Los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE presentan perfiles de glucosa en ayunas normal y de tolerancia a la glucosa
Los niveles medios de glucosa en sangre de los ratones de tipo salvaje (n = 20) antes de iniciar el ayuno fueron de 165,0 ± 3,0 mg/dl (tiempo cero), los cuales se redujeron a 113,3 ± 6,5 mg/dl después de 24 horas de ayuno (Figura 55 4A). Los perfiles de glucosa en sangre en ayunas de ratones de AAV-L y AAV-M eran paralelos a los de los ratones de control, pero los niveles de glucosa en sangre fueron consistentemente más bajos (Figura 4A), mientras que el perfil de glucosa en ayunas de ratones de AAV-H no se podía distinguir del de los ratones de control. En agudo contraste, los ratones G6pc-/-sin tratar mostraron hipoglucemia marcada dentro de 60 a 75 minutos de ayuno (Figura 4B), una característica distintiva de la GSD-Ia (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). En resumen, los
ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE ya no padecieron la hipoglucemia en ayunas característica de la GSD-Ia (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010).
No se pudieron distinguir los perfiles de tolerancia a la glucosa en sangre en ratones de AAV-M y AAV-H de los de
5 los compañeros de camada de tipo salvaje (Figura 4C). En ratones de AAV-L, después de la inyección de glucosa intraperitoneal, los niveles de glucosa en sangre se redujeron a un ritmo más rápido que en el de los controles de tipo salvaje.
Niveles reducidos de insulina en sangre en ayunas en ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE
10 La señalización de insulina regula la glucosa hepática y el metabolismo de lípidos (Leavens u Birnbaum, Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200-215, 2011). Después de 24 horas de ayuno, los niveles de insulina en sangre en ratones de 70-90 semanas de edad de tipo salvaje (n = 20) y G6pc-/-tratados con AAV-GPE (n = 20) fueron 1,84 ± 0,29 y 0,56 ± 0,09 ng/ml, respectivamente (Figura 5A). Ambos estaban dentro del intervalo normal (de Luca et al., J Clin
15 Invest 115:3484-3493, 2005), aunque los niveles de insulina en sangre en ayunas en los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE se encontraban más cerca de los valores normales promedio (de Luca et al., J Clin Invest 115:3484-3493, 2005). Si bien los niveles de insulina en sangre en ayunas en ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE no se correlacionaron con la G6Pasa-α hepática restaurada, los niveles de insulina en los ratones G6pc-/-de tipo salvaje y tratados presentaron una relación lineal con respecto a su peso corporal (Figura 5A).
20 El efecto de transcripción de la insulina está mediado por la proteína de unión del elemento regulador de esteroles-Ic (SREBP-1c) (Leavens y Birnbaum, Crit Rev Biochem Mol Biol 46:200-215, 2011). El análisis cuantitativo de RT-PCR demostró que los niveles similares de las transcripciones hepáticas de SREBP-1c se expresaron en los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE y de control en ayuno de 24 horas (Figura 5B). La glucocinasa es un sensor de
25 glucosa (Massa et al., IUBMB Life 63:1-6, 2011). La actividad hepática de glucocinasa disminuye cuando los niveles de insulina en sangre son bajos, tal como en el caso de ayuno (Massa et al., IUBMB Life 63:1-6, 2011). Como se observa con la insulina en sangre, después de 24 horas de ayuno, las transcripciones hepáticas de glucocinasa en ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE fueron significativamente inferiores que las de los compañeros de camada de control (Figura 5C). De forma interesante, los niveles de ARNm de glucocinasa hepática y de insulina en sangre en
30 ayunas presentaron una relación lineal tanto en los ratones de tipo salvaje como en los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE (Figura 5C).
Homeostasis de glucosa en el hígado de ratones G6pc-/-con infusión de AAV-GPE
35 Durante el ayuno, la homeostasis de glucosa en sangre se mantiene por glucosa endógena producida en el hígado a partir de hidrólisis de G6P mediante el complejo de G6Pasa-α/G6PT en la etapa terminal de la gluconeogénesis y glucogenólisis (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010). Los ratones G6pc-/-, que carecen de una G6Pasaα funcional, son incapaces de producir glucosa endógena en el hígado, riñón o intestino. Después de 24 horas de ayuno, los niveles de glucosa libre hepáticos en ratones de tipo salvaje (n = 20) fueron 389 ± 17 nmol/mg de proteína
40 y en ratones AAV-L (n = 6), AAV-M (n = 9), y AAV-H (n = 5) fueron del 61%, 68% y 90%, respectivamente, de aquellos en los ratones de tipo salvaje. Los niveles intracelulares de G6P en los hígados de AAV-M y AAV-L en ayunas fueron de 2,9 y 1,6 veces, respectivamente más altos que los hígados de tipo salvaje, pero los niveles intracelulares de G6P en los hígados de AAV-H en ayunas fueron estadísticamente similares a los de los hígados de tipo salvaje.
45 La G6P hepática participa en varias vías metabólicas, incluyendo la síntesis de glucógeno, la glucólisis, la vía pentosa-fosfato, en la producción de citoplasma y glucosa endógena en el lumen del RE. Se examinó la expresión hepática de varias enzimas clave implicadas en las vías antes mencionadas en ratones después de un ayuno de 24 horas. Estas incluyen la fosfoenolpiruvato carboxicinasa citosólica (PEPCK-C) que cataliza la primera etapa
50 comprometida en la gluconeogénesis hepática (Hanson y Reshef, Biochimie 85:1199-1205, 2003); fructosa-1,6bisfosfatasa (FBPasa-1) que convierte la fructosa-1,6-bisfosfato en fructosa-6-fosfato (Hers, J Inherit Metab Dis 13:395-410, 1990); fosfoglucomutasa (PGMasa) que cataliza la conversión reversible de glucosa-6-P y glucosa-1-P en la síntesis de glucogenólisis y glucógeno (Hers, J Inherit Metab Dis 13:395-410, 1990); fosfofructocinasa-1 (PFK1) que cataliza la etapa irreversible limitante de velocidad en la glucólisis mediante la conversión de fructosa-6-P en
55 fructosa-1,6-difosfato (Hers, J Inherit Metab Dis 13:395-410, 1990); G6P deshidrogenasa (G6PDH) que cataliza la primera reacción en la vía pentosa-fosfato mediante la conversión de G6P en 6-fosfogluconolactona (Wamelink et al., J Inherit Metab Dis 31:703-717, 2008); y G6PT que transporta la G6P citoplasmática al lumen del RE (Chou et al., Nat Rev Endocrinol 6:676-688, 2010).
El análisis cuantitativo de RT-PCR en tiempo real mostró que en los hígados de ayuno, las transcripciones de PEPCK-C y PGMasa se mantuvieron sin cambios, mientras que las transcripciones de FBPasa-1 se aumentaron en los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE, en comparación con los controles. Tanto las transcripciones de PFK-1 como G6PDH en hígados AAL-L se aumentaron, aunque en los hígados AAV-M y AAV-H todavía fueron 5 estadísticamente similares a las de los hígados de tipo salvaje. Los niveles hepáticos de ARNm de G6PT en los ratones G6pc-/-tratados con AAV-GPE fueron 2,2 veces mayores que los controles de tipo salvaje, independientemente de los niveles de actividad hepática de G6Pasa-α restaurada. La actividad hepática de captación de G6P microsomal mediada por G6PT es el limitante de velocidad en la producción de glucosa endógena (Arion et al., J Biol Chem 251:6784-690, 1976), pero es co-dependiente de la actividad de G6Pasa-α (Lei et al., Nat 10 Genet 13: 203-209, 1996). Los microsomas hepáticos preparados a partir de ratones G6pc-/-, con un G6PT intacto, mostraron actividad de captación de G6P notablemente menor en comparación con los microsomas hepáticos de tipo salvaje (Lei et al., Nat Genet 13: 203-209, 1996), que pueden invertirse si se restaura la actividad de G6Pasa-α a través de la transferencia de genes (Zingone et al., J Biol Chem 275:828-832, 2000). En hígados AAV-L, AAV-M, y AAV-H, las actividades de captación de G6P microsomales fueron del 43%, 50% y del 72%, respectivamente de la
15 actividad de tipo salvaje, lo que refleja el aumento de la actividad hepática de G6Pasa-α (Figura 2A), en paralelo a los niveles hepáticos de glucosa libre.
Ausencia de respuesta inmune contra G6Pasa-α humana
20 Con el fin de determinar si se genera una respuesta humoral dirigida contra G6Pasa-α humana en los ratones infundidos, se realizó un análisis de transferencia Western usando los sueros obtenidos de los ratones G6pc-/tratados con AAV-GPE y de 70-90 semanas de edad. Se utilizó un anticuerpo monoclonal contra G6Pasa-α humana que también reconoce G6Pasa-α murina (Yiu et al., Mol Ther 18:1076-1084, 2010) como control positivo. No se detectaron anticuerpos dirigidos contra G6Pasa-α en ninguno de los ratones de control de tipo salvaje o G6pc-/-con
25 infusión de AAV-GPE que vivieron hasta las 70 a 90 semanas de edad.
Ejemplo 3: Los elementos potenciadores aguas arriba del promotor G6PC son importantes para la expresiónóptima de G6PC en la enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo Ia
30 Este ejemplo describe estudios para evaluar además la eficacia del vector de AAV-GPE. El AAV-GPE, que es un vector monocatenario que comprende 2684 pb del promotor/potenciador de G6PC, se comparó con el AAV-miGPE, un vector bicatenario con contenía un promotor/potenciador de G6PC mínimo de 382 pb. Los resultados descritos en este ejemplo muestran que el vector de AAV-GPE se dirigió a niveles significativamente más altos de expresión hepática de G6Pasa-α, logrando una mayor reducción de acumulación hepática de glucógeno y dando lugar a una
35 mejor tolerancia de ayuno en ratones con GSD-Ia que el vector de AAV-miGPE.
MATERIALES Y MÉTODOS
Infusión de ratones G6pc-/-con vectores de rAAV
40 Todos los ratones de G6pc-/-se mantuvieron vivos con terapia de glucosa (Lei et al., Nat. Genet. 13:203-209, 1996). Los vectores de rAAV se infundieron en ratones de 2 semanas de edad G6pc-/-a través del seno retro-orbital. Se usaron ratones G6pc+/+/G6pc+/-emparejados por edad como controles. Para ratones infundidos con el vector de rAAV, la terapia de glucosa se terminó inmediatamente después de la infusión. Todas las transducciones virales se
45 realizaron en ratones G6pc-/-de 2 semanas de edad y la eficacia se evaluó a la edad de 12 semanas.
Ensayos de fosfohidrolasa
Los ensayos del aislamiento de microsomas y de fosfohidrolasa se determinaron esencialmente como se ha descrito
50 previamente (Lei et al., Nat. Genet. 13:203-209, 1996). Para los ensayos de fosfohidrolasa, las mezclas de reacción (100 µl) contenían tampón de cacodilato 50 mM, a pH 6,5, G6P de 10 mM y se incubaron cantidades apropiadas de preparaciones microsomales a 30°C durante 10 minutos. Se prepararon membranas microsomales interrumpidas mediante incubación de membranas intactas en desoxicolato al 0,2% durante 20 minutos a 0 °C. Se estimó actividad de fosfatasa no específica mediante pre-incubación de preparaciones microsomales interrumpidas a pH 5 durante 10
55 minutos a 37 °C, para inactivar la G6Pasa-α lábil de ácido.
Cuantificación del ADN y ARNm de vector
El ADN total de tejidos de ratón se aisló usando los kits GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep (Sigma
Aldrich, St Louis, MO) y se aislaron ARN totales de tejidos de ratón usando el reactivo TRIzol™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se cuantificaron los números del genoma del vector y la expresión de ARNm por PCR y RT-PCR en tiempo real, respectivamente en un sistema de PCR de tiempo real Applied Biosystems 7300 usando sondas TaqMan de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los números del genoma del vector del gen
5 de G6PC humano se normalizaron a β-actina de ratón usando conjuntos de sondas TaqMan Hs00609178_m1 para G6PC y Mm00607939_s1 para β-actina. El plásmido ADN correspondiente a 0,01 a 100 copias del gen G6PC humano se usó en una curva estándar. Para determinar el número de copias del genoma del vector, los valores de Ct de la muestra se compararon con la curva estándar. La expresión de ARNm G6PC se normalizó a ARN Rp119 usando conjuntos de sonda TaqMan® Hs00609178_m1 para G6PC y Mm02601633_g1 para Rp119.
Análisis fenotípico
Se analizó la glucosa en sangre usando kits obtenidos de Thermo Electron (Louisville, CO). Se midió el contenido hepático de glucógeno y triglicéridos de la manera en que se ha descrito previamente (véanse los Ejemplos 1 y 2, y
15 Yiu et al., Mol. Ther. 18:1076-1084, 2010; Lee et al., Hepatology 56:1719-1729, 2012). Para determinar los triglicéridos hepáticos, se homogeneizaron tejidos del hígado en tampón RIPA (Tris HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, Na-desoxicolato al 0,5% y SDS al 0,1%) (Thermo Scientific, Rockford, IL) y se midieron los triglicéridos usando un kit de Sigma Diagnostics (St Louis, MO).
20 Las pruebas de tolerancia a la glucosa de ratones consistían en ayuno durante 6 horas, antes de la toma de muestras de sangre, seguido de inyección intraperitoneal de una solución de glucosa a un peso corporal de 2 mg/g, y se repite la toma de muestras de sangre a través de la vena de la cola durante 2 horas.
Análisis estadístico
25 La prueba t no pareada se realizó utilizando el programa GraphPad Prism®, versión 4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Los valores se consideraron estadísticamente significativos en p <0,05.
RESULTADOS Expresión de G6Pasa-α hepática en ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE o rAAV-miGPE
Se realizaron estudios para examinar la eficacia de los vectores de rAAV-GPE (véase el Ejemplo 1 y Yiu et al., Mol. Ther. 18:1076-1084, 2010) y rAAV-miGPE (Koeberl et al., Mol. Ther. 16:665-672, 2008) en el tratamiento de ratones 35 G6pc-/-durante 12 semanas. Se usó cada vector en dos dosis, 1 x 1013 partículas virales (vp)/kg (dosis alta) y 2 x 1012 vp/kg (dosis baja) con 6 ratones por grupo, en dos centros de investigación diferentes. Se obtuvieron resultados similares de ambos centros. Mientras que la actividad hepática de G6Pasa-α en los ratones G6pc-/-transducidos representa los datos combinados de los dos centros, otros datos indicados se registran a partir de un solo estudio. Los estudios han demostrado que la eficacia y persistencia de la transferencia génica hepática mediada por rAAV es 40 más baja durante el desarrollo temprano debido a la rápida velocidad de proliferación hepatocelular asociada con el crecimiento del hígado, lo que diluye el número de células infectadas eficazmente con rAAV (Yiu et al., Mol. Ther. 18:1076-1084, 2010; Cunningham, Mol. Ther. 16:1081-1088, 2008). En este estudio, los vectores de rAAV se administraron a ratones G6pc-/-de 2 semanas de edad, momento en el que la proliferación hepatocelular se mantiene alta. En consecuencia, la expresión hepática de G6Pasa-α examinada a las 12 semanas de edad es
45 significativamente menor que la que se observa en ratones adultos con infusión de la misma dosis del vector. Aún no se ha establecido el mejor momento de intervención en la enfermedad humana.
Todo los ratones G6pc-/-tratados sobrevivieron a las 12 semanas de edad, sin muertes prematuras en ninguno de los centros. En el hígado de ratones de tipo salvaje de 12 semanas de edad, la actividad microsomal de G6Pasa-α 50 fue de 203,5 ± 10,3 nmol/min/mg (n = 24). Los datos combinados (n = 12 por tratamiento), determinados de manera independiente en los dos centros, mostraron que a las 12 semanas de edad, la terapia de rAAV-GPE de dosis alta reconstituyó aproximadamente el 18% de actividad hepática de G6Pasa-α de tipo salvaje que tenía 3,5 veces mayor actividad que rAAV-miGPE, mientras que la terapia de rAAV-GPE de dosis baja produjo más de 3,6 veces mayor actividad que rAAV-miGPE (Figura 6A). La actividad hepática de G6Pasa-α aumentó linealmente con el número
55 hepático de copias del genoma del vector, y el número de copias en ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE (n = 6) fueron significativamente más altos que en los ratones tratados con rAAV-miGPE (n = 6) (Figura 6A).
Perfiles metabólicos de ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE o rAAV-miGPE
Todos los ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE y rAAV-miGPE presentaron curvas de crecimiento paralelas a sus compañeros de camada de tipo salvaje, aunque a pesos más bajos (Figura 6B). Los valores del índice de masa corporal (IMC) de los ratones tratados no se pudieron distinguir de los de los ratones de tipo salvaje, independientemente del vector o el nivel de dosis (Figura 6C). Todo los ratones G6pc-/-tenían niveles de glucosa en
5 sangre consistentemente más bajos que los controles de tipo salvaje, pero todavía por encima del extremo inferior del intervalo normal (Figura 6D), 6D), y ninguno de los animales infundidos sufrió los ataques hipoglucémicos frecuentes típicos de la GSD-Ia (Chou et al., Curr. Mol. Med. 2:121-143, 2002; Chou et al., Nat. Rev. Endocrinol. 6: 676-688, 2010; Lee et al., Hepatology 56:1719-1729, 2012).
10 El peso relativo del hígado con respecto al cuerpo, una medida de glucógeno hepático y/o acumulación de grasa neutra (Chou et al., Curr. Mol. Med. 2:121-143, 2002; Chou et al., Nat. Rev. Endocrinol. 6: 676-688, 2010), fue mayor en los 4 grupos de ratones G6pc-/-tratados que el de los ratones de tipo salvaje, aunque los ratones tratados con rAAV-GPE de dosis alta estuvieron significativamente más cerca al normal que el de los otros grupos (Figura 7A). De acuerdo con esto, el contenido de glucógeno en ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE y rAAV-miGPE fueron
15 notablemente más altos que los de sus controles de tipo salvaje (Figura 7B) con las dosis más altas de vectores que disminuían el glucógeno mejor que las dosis más bajas de vectores, lo que demuestra que al restaurar una mayor expresión hepática de G6Pasa-α mejora la hepatomegalia. Sin embargo, al comparar sólo terapias de dosis altas, los ratones tratados con rAAV-miGPE tenían un 43% más de glucógeno que los ratones tratados con rAAV-GPE. A pesar de la elevación continua en el glucógeno hepático, no se observaron anomalías histológicas en las secciones
20 de tejido hepático de cualquiera de los ratones G6pc-/-tratados con rAAV a las 12 semanas de edad. Con la excepción de los ratones tratados con rAAV-miGPE a una dosis baja, el contenido hepático de triglicéridos no fue estadísticamente diferente entre el tipo salvaje y los otros 3 grupos de ratones G6pc-/-tratados con rAAV (Figura 7C).
25 Perfiles de glucosa en ayunas y de tolerancia a la glucosa en ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE o rAAV-miGPE
Para ratones de tipo salvaje (n = 24), el nivel medio de glucosa en sangre antes de ayuno fue de 172,2 ± 2,6 mg/dl (tiempo cero), el cual se redujo a 134,6 ± 3,8 mg/dl después de 8 horas de ayuno (Figura 8A). Los perfiles de 30 glucosa en sangre en ayunas de ratones de terapia de dosis alta (n = 6 por tratamiento) fueron significativamente mejores que los ratones de terapia de dosis baja (n = 6 por tratamiento), sin embargo, incluso a dosis altas, los ratones tratados con rAAV-GPE sostuvieron niveles de glucosa significativamente más altos que se estabilizaron a niveles de tipo salvaje 6 horas en el ayuno, mientras que los ratones tratados con rAAV-miGPE mostraron mucho se estabilizaron mucho menos del 60% de niveles de tipo salvaje (Figura 8A). Los ratones tratados con rAAV-GPE y
35 rAAV-miGPE de dosis alta también podrían mantener un ayuno de 24 horas, pero los niveles de glucosa en sangre en ayunas fueron significativamente mayores en ratones tratados con rAAV-GPE que en ratones tratados con rAAVmiGPE (Figura 8B). En resumen, los ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE estaban más cerca del tipo salvaje y fueron más capaces de tolerar el ayuno que los ratones G6pc-/-tratados con rAAV-miGPE.
40 Se controlaron los perfiles de tolerancia a la glucosa en sangre de los ratones G6pc-/-tratados (n = 6 por tratamiento) después de una inyección de glucosa intraperitoneal. En general, los perfiles paralelos a los de los ratones de tipo salvaje (Figura 8C) con los ratones tratados en dosis alta respondieron mejor que los ratones tratados de dosis baja.
45 La bio-distribución del transgén de G6PC humano en hígado, riñón, intestino, cerebro, testículos y ovarios en ratones G6pc-/-tratados con rAAV-GPE de dosis alta de 12 semanas de edad se analizó mediante PCR cuantitativo (Tabla 1). En el hígado transducido, el número de copias del genoma del vector/µg de ADN fue de 94,440 ± 7,624 (o 0,51 ± 0,04 copias del vector/genoma diploide). En el riñón e intestino transducido, los números eran drásticamente inferiores, con un promedio solo del 2,57% y el 0,64%, respectivamente del número de copias del hígado, lo que
50 muestra que el virus de rAAV8 no transdujo el riñón y el intestino de manera eficiente. El número de copias del genoma/µg de ADN en el cerebro y testículos fue incluso inferior al 0,12% y 0,02%, respectivamente del número de copias del hígado. Sólo los niveles de fondo de los genomas de G6PC humana se detectaron en el ovario.
El vector de rAAV-GPE contiene un elemento promotor/potenciador de tejido específico expresado principalmente en
55 el hígado, los túbulos proximales en el riñón y el intestino (Chou et al., Curr. Mol. Med. 2:121-143, 2002; Chou et al., Nat. Rev. Endocrinol. 6: 676-688, 2010). El análisis cuantitativo de RT-PCR en tiempo real de las transcripciones humanas de G6PC mostró una correlación entre el número de copias del genoma y la expresión génica (Tabla 3). En el hígado, los niveles del ARNm de G6PC humana en relación con la transcripción de Rpl 19 fue de 0,62740 ± 0,04445. Como era de esperar a partir del análisis de copias del genoma, el riñón expresó sólo 0,03% del ARNm
hepático de G6PC humana y sólo los niveles de fondo del ARNm de G6PC humana se detectaron en el intestino, cerebro, testículos y ovario.
Tabla 3. Distribución del genoma humano de G6PC y expresión de ARNm en ratones G6pc-/-de 12 semanas de edad tratados con rAAV-GPE en dosis alta
Número de copias de G6PC ARNm de G6PC humano relativo aTejido
humana/µg de ADN genómico
ARNm de RpI19 x 105
Tejidos de tipo salvaje, sin
8 ± 2 8 ± 1
transgén (n = 6) Hígado, -/-/rAAV-GPE (n = 6)
94.440 ± 7.624 (100)
62740 ± 4445 (100)
Riñón, -/-/rAAV-GPE (n = 6) 2.429 ± 626 (2,57) 22 ± 5 (0,033) Intestino, -/-/rAAV-GPE (n = 6) 601 ± 124 (0,64) 9 ± 1 Cerebro, -/-/rAAV-GPE (n = 6) 121 ± 23 (0,12) 8 ± 1 Testículos, -/-/rAAV-GPE (n =
25 ± 8 (0,02) 9 ± 16)
Ovario, -/-/rAAV-GPE (n = 6) 7 ± 2 9 ± 1 Los datos son medias ± SEM. Los valores de los tejidos de tipo salvaje, que no contienen transgén, eran la media ± SEM de hígado, riñón, intestino, cerebro, testículos y ovario. Los números entre paréntesis son el % del valor del hígado.
Ejemplo 4: Comparación de vectores de AAV con y sin secuencias de relleno
Este ejemplo describe el hallazgo de que la secuencia de relleno de nucleótidos que flanquea el intrón en vectores 10 de AAV que expresan G6Pasa-α es importante para la transducción hepática eficiente.
Para evaluar la contribución de la secuencia de relleno a la administración de transgén y la expresión hepática de G6Pasa-α, se construyó el plásmido UF11-K29-G6PC. UF11-K29-G6PC (SEQ ID NO: 2) difiere de UF11-GPEG6PC (SEQ ID NO: 1) en que carece de la secuencia de relleno alrededor del intrón. El promotor/potenciador de
15 G6PC (GPE) y las secuencias codificantes de G6PC son idénticos en cada plásmido.
A los ratones G6pc-/-se les administró 1 x 1013 vp/kg de AAV-K29-G6PC recombinante o AAV-GPE-G6PC recombinante. Los resultados indicaron que el AAV-K29-G6PC presentó una eficiencia de transducción hepática notablemente reducida en ratones con GSD-Ia, en comparación con AAV-GPE-G6PC. Las actividades de G6Pasa
20 en hígado traducido con AAV-K29-G6PC y AAV-GPE-G6PC eran de 7,3 y 33,0 nmol/min/mg, respectivamente. Estos resultados demuestran que la secuencia de relleno que flanquea el intrón es importante para una transducción hepática eficiente.
Ejemplo 5: Generación de un vector de AAV que codifica G6PC optimizada por codones
25 Este ejemplo describe la construcción y la caracterización de un vector de AAV que contiene G6PC optimizada por codones.
El plásmido UF11-GPE-co-G6PC (que comprende G6PC optimizada por codones; SEQ ID NO: 3) se derivó del
30 plásmido UF11-GPE-G6PC (SEQ ID NO: 1), pero la secuencia codificante de G6Pasa de tipo salvaje en AAV-GPEG6PC se reemplazó con una G6Pasa optimizada por codones sintética (nucleótidos 3368-4441 de SEQ ID NO: 3).
Los ensayos transitorios de expresión in vitro mostraron que la co-G6Pasa presentó una actividad enzimática 1,9 veces más alta que la G6Pasa humana de tipo salvaje. Además, se evaluaron dos lotes de AAV-GPE-CO-G6PC
35 recombinante para la determinar la actividad in vivo y se comparó con la actividad del AAV-GPE-G6PC recombinante en ratones con GSD-Ia. El primer lote de AAV-GPE-co-G6PC fue un 50% más eficiente que el AAVGPE-G6PC en la transducción del hígado que el AAV-GPE-G6PC. El segundo lote de AAV-GPE-co-G6PC fue 2,5 veces más eficiente en la transducción del hígado que el AAV-GPE-G6PC recombinante.
40 Estos resultados demuestran que la optimización por codones de G6PC aumenta la capacidad de transducción del hígado del AAV recombinante que expresa G6Pasa-α.
Ejemplo 6: Evaluación de la eficacia de un vector de AAV recombinante que expresa la G6Pasa humana optimizada por codones
El ejemplo describe un estudio para comparar la eficacia de la administración génica mediada por rAAV8-GPEG6Pasa y rAAV8-GPE-co-G6Pasa en ratones con GSD-Ia.
La eficacia de la administración génica en ratones con GSD-Ia se comparó usando 2-3 lotes independientes de dos
5 vectores de AAV: 1) rAAV8-GPE-G6Pasa (un vector de rAAV8 que expresa G6Pasa-α humana dirigida por el promotor/potenciador de G6PC humana ~3 kb (GPE); y 2) rAAV8-GPE-co-G6Pasa (un vector de rAAV8 que expresa una G6Pasa-α humana (co) optimizada por codones dirigida por el GPE). Los resultados en la Figura 11 muestran que las actividades hepáticas de G6Pasa tanto en los ratones de 4 semanas de edad como en los de 12 semanas de edad con GSD-Ia tratados con rAAV8-GPE-co-hG6Pasa fueron 1,9 veces mayores que las actividades
10 respectivas restauradas por el vector de rAAV8-GPE-G6Pasa.
Todos los ratones con GSD-Ia tratados presentaron perfiles séricos normales de colesterol, triglicéridos, ácido úrico y ácido láctico y los niveles normales de grasa hepática. En ratones con infusión de rAAV, los pesos del hígado se correlacionaron inversamente con la actividad hepática de G6Pasa restaurada. Los ratones tratados con rAAV-GPE
15 G6Pasa presentaron hepatomegalia significativamente más grave en comparación con los ratones tratados con rAAV-GPE-co-G6Pasa (Figura 12).
Funcionalmente, a las 12 semanas de edad, los ratones con GSD-Ia tratados con rAAV8-GPE-co-G6Pasa mostraron perfiles normales de tolerancia a la glucosa (Figura 13A) y mantuvieron la normoglucemia en un ayuno de 24 horas
20 (Figura 13B).
Ejemplo 7: Tratamiento de GSD-Ia humana usando terapia génica a base de AAV
Este ejemplo describe un método ejemplar para el uso clínico de vectores de AAV que codifican G6PC para el 25 tratamiento de GSD-Ia.
Se selecciona un paciente diagnosticado con GSD-Ia para tratamiento. Típicamente, el paciente tiene al menos 18 años de edad y puede o no haber tenido una exposición previa a la inmunomodulación. Al paciente se le administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un AAV recombinante que expresa G6PC, tal como AAV-GPE-G6PC o 30 AAV-GPE-co-G6PC, como se describe en el presente documento. El AAV recombinante se puede administrar por vía intravenosa. Una dosis terapéutica apropiada puede seleccionarse por un médico. En algunos casos, la dosis terapéuticamente eficaz está en el intervalo de 1 x 1011 a 1 x 1014 partículas virales (vp)/kg, tal como aproximadamente 1 x 1012 vp/kg. En la mayoría de casos, al paciente se le administra una única dosis. En ausencia de la inmunomodulación, es probable que el paciente sólo tolere una única infusión de rAAV. Si el sujeto tuvo
35 exposición previa a la inmunomodulación, se pueden administrar dos o más dosis. La salud del sujeto se puede controlar en el tiempo para determinar la eficacia del tratamiento.
En vista de las muchas realizaciones posibles a las que se pueden aplicar los principios de la invención descrita, se ha de reconocer que las realizaciones ilustradas son solamente ejemplos preferidos de la invención y no deben
40 interpretarse como limitantes del alcance de la invención. En su lugar, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones. Por lo tanto, se reclama como invención propia todo lo que se encuentra dentro del alcance de estas reivindicaciones.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES
<120> VECTORES VIRALES ADENO-ASOCIADOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD DE 50 ALMACENAMIENTO DE GLUCÓGENO
<130> 4239-91776-02
<150> US 61/908.861 55 <151>
<160> 10
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211> 7671
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Construcción sintética (plásmido UF11-GPE-G6PC)
10 <220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(163)
<223> Repetición terminal invertida
15 <220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(3045)
<223> promotor/potenciador de G6PC
20 <220>
<221> misc_feature
<222> (3051)..(3184)
<223> Secuencia de relleno
25 <220>
<221> misc_feature
<222> (3185)..(3321)
<223> Intrón
30 <220>
<221> misc_feature
<222> (3322)..(3367)
<223> Secuencia de relleno
35 <220>
<221> misc_feature
<222> (3368)..(4441)
<223> Secuencia codificante de G6PC
40 <220>
<221> misc_feature
<222> (4674)..(4819)
<223> Repetición terminal invertida
45 <400> 1
<210> 2
<211> 7505
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 5 <223> Construcción sintética (plásmido UF11-K29-G6PC)
<220>
<221> misc_feature
<222>
(17)..(163) 10 <223> Repetición terminal invertida
<220>
<221> misc_feature
<222>
(182)..(3045) 15 <223> promotor/potenciador de G6PC
<220>
<221> misc_feature
<222>
(3052)..(3188) 20 <223> Intrón
<220>
<221> misc_feature
<222>
(3202)..(4275) 25 <223> Secuencia codificante de G6PC
<220>
<221> misc_feature
<222>
(4508)..(4653) 30 <223> Repetición terminal invertida
<400> 2
<210> 3
<211> 7671 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223>
Construcción sintética (plásmido UF11-GPE-co-G6PC) 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(163)
<223>
Repetición terminal invertida 15
<220>
<221> misc_feature
<222> (182)..(3045)
<223>
promotor/potenciador de G6PC 20
<220>
<221> misc_feature
<222> (3051)..(3184)
<223>
Secuencia de relleno 25
<220>
<221> misc_feature
<222> (3185)..(3321)
<223> Intrón
5 <220>
<221> misc_feature
<222> (3322)..(3367)
<223> Secuencia de relleno
10 <220>
<221> misc_feature
<222> (3368)..(4441)
<223> Secuencia codificante de G6PC optimizada por codones
15 <220>
<221> misc_feature
<222> (4674)..(4819)
<223> Repetición terminal invertida
20 <400> 3
<210> 4
<211> 357
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220> <223> Polinucleótido sintético <400> 5 cctttgagaa tccacggtgt 20
10
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Polinucleótido sintético
<400> 6 cctcatttcc ttggcacctc
20
20
<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial
25
<220> <223> Polinucleótido sintético
30 35
<400> 7 aggtaagtat caaggttaca <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Polinucleótido sintético 20
40
<400> 8 acctgtggag agaaaggcaa 20
45
<210> 9 <211> 1074 <212> ADN <213> Canis familiaris familiaris
<400> 9
<210> 10
<211> 357
<212> PRT
<213> Canis lupus familiaris
<400> 10

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un vector viral adeno-asociado (AAV) que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante,
    en el que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende los nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 1 o 5 nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 3.
  2. 2. El vector de AAV de la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende los nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 17-4819 de SEQ ID NO: 3.
    10 3. El vector de AAV de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la molécula de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
  3. 4. El vector de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el vector de AAV es un
    vector de AAV de serotipo 8 (AAV8). 15
  4. 5.
    Una célula huésped aislada que comprende el vector de AAV de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
  5. 6.
    Un AAV recombinante (rAAV) que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante, en el que
    20 el ácido nucleico recombinante comprende los nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 1 o nucleótidos 182-4441 de SEQ ID NO: 3.
  6. 7. Un AAV recombinante (rAAV) de la reivindicación 6, en el que el rAAV es rAAV8.
    25 8. Una composición que comprende el rAAV de la reivindicación 6 o 7 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  7. 9. La composición de la reivindicación 8 formulada para administración intravenosa.
    30 10. El rAAV de la reivindicación 6 o 7 para su uso en un método para tratar un sujeto diagnosticado con una enfermedad de almacenamiento de glucógeno, comprendiendo el método seleccionar un sujeto con enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo Ia (GSD-Ia) y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del rAAV.
    35 11. La composición de la reivindicación 8 o 9 para su uso en un método para tratar un sujeto diagnosticado con una enfermedad de almacenamiento de glucógeno, comprendiendo el método seleccionar un sujeto con enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo Ia (GSD-Ia) y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición.
    40 12. El rAAV o la composición para el uso de la reivindicación 10 u 11, en el que el rAAV se administra por vía intravenosa.
  8. 13. El rAAV o la composición para el uso de la reivindicación 10, 11 o 12, en el que el rAAV se administra
    a una dosis de aproximadamente 1 x 1011 a aproximadamente 1 x 1014 partículas virales (vp)/kg. 45
  9. 14. El rAAV o la composición para el uso de la reivindicación 13, en el que el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1012 a 8 x 1013 vp/kg.
  10. 15. El rAAV o la composición para el uso de la reivindicación 13, en el que el rAAV se administra a una 50 dosis de aproximadamente 1 x 1013 a 6 x 1013 vp/kg.
  11. 16. El rAAV o la composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en el que la administración de rAAV comprende la administración de una única dosis de rAAV.
    55 17. El rAAV o la composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-15, en el que la administración de rAAV comprende la administración de múltiples dosis de rAAV.
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