ES2691086T3 - Composiciones y métodos para el tratamiento de carboxihemoglobinemia - Google Patents

Composiciones y métodos para el tratamiento de carboxihemoglobinemia Download PDF

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Abstract

Una molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad, para su uso en un método de tratamiento de carboxihemoglobinemia en un sujeto, comprendiendo el método: la selección de un sujeto con carboxihemoglobinemia; y la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad, en donde la molécula de globina recombinante comprende: una neuroglobina recombinante humana con una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W, la numeración correspondiéndose a la SEQ ID NO: 1; o una citoglobina recombinante humana con una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W, correspondiendo la numeración a la SEQ ID NO: 4, tratando, de este modo, la carboxihemoglobinemia en el sujeto.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y métodos para el tratamiento de carboxihemoglobinemia Campo
La presente divulgación se refiere a moléculas de globina recombinantes, tales como formas mutantes de neuroglobina y citoglobina, que unen monóxido de carbono con una alta afinidad y su uso para el tratamiento de carboxihemoglobinemia e intoxicación por monóxido de carbono.
Antecedentes
La exposición por inhalación a monóxido de carbono representa una causa principal de intoxicación medioambiental. Los individuos pueden estar expuestos a monóxido de carbono en el aire bajo varias circunstancias, tal como estufas caseras, el uso de generadores o parrillas de barbacoa de uso exterior que se usan dentro de la casa o durante intentos de suicidio haciendo funcionar automóviles dentro de espacios cerrados. El monóxido de carbono se une a hemoglobina y hemoproteínas en las células, en particular, las enzimas de la cadena de transporte respiratoria. La acumulación de monóxido de carbono unido a la hemoglobina y otras hemoproteínas afecta al suministro de oxígeno y la utilización de oxígeno para la fosforilación oxidativa. Esto resulta finalmente en una lesión hipóxica o isquémica grave en los órganos vitales tales como el cerebro o el corazón. Los individuos que acumulan más del 15 % de carboxihemoglobina de carbono en su sangre tiene riesgo de padecer daño cerebral y disfunción neurocognitiva. Los individuos con niveles más altos de carboxihemoglobina tienen riesgo de fallecimiento. Los pacientes con niveles muy altos de carboxihemoglobina padecen normalmente lesiones cerebrales irreversibles y muerte cerebral.
A pesar de la disponibilidad de métodos para diagnosticar rápidamente la intoxicación por monóxido de carbono con análisis estándar de gasometría arterial y venosa y cooximetría, y a pesar del conocimiento de los factores de riesgo de la intoxicación por monóxido de carbono, no existen antídotos disponibles para esta exposición tóxica. La terapia actual es proporcionar 100 % de oxígeno mediante mascarilla facial y, cuando es posible, exponer a los pacientes a oxígeno hiperbárico. El mecanismo de la terapia de oxígeno hiperbárico es que el oxígeno aumentará el índice de liberación de monóxido de carbono de la hemoglobina y de los tejidos y acelerará la eliminación natural de monóxido de carbono. Sin embargo, esta terapia solo tiene un efecto modesto sobre los índices de eliminación de monóxido de carbono y basándose en la complejidad de las instalaciones de oxígeno hiperbárico, esta terapia no está disponible en el campo.
Sumario
Existe la necesidad de una terapia eficaz, rápida y fácilmente disponible para tratar carboxihemoglobinemia, también conocida como intoxicación por monóxido de carbono. Se proporciona mediante la presente divulgación moléculas de globina modificadas, tales como formas recombinantes de neuroglobina y citoglobina, que unen monóxido de carbono con una alta afinidad, funcionando, de este modo, como limpiadores de monóxido de carbono. Los datos desvelados en el presente documento demuestran que las globinas modificadas pueden usarse, por ejemplo, en métodos para retirar monóxido de carbono de hemoglobina en sangre o tejido y en métodos de tratamiento de carboxihemoglobinemia. La invención es como se define en las reivindicaciones.
En el presente documento se proporciona un método de tratamiento de carboxihemoglobinemia en un sujeto seleccionando un sujeto con carboxihemoglobinemia y administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad. En algunas realizaciones, la molécula de globina recombinante es una neuroglobina humana recombinante con una mutación en el resto 64, tal como una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W o una citoglobina recombinante humana con una mutación en el resto 81, tal como una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W. En algunos ejemplos, las moléculas de globina recombinantes comprenden adicionalmente una o más sustituciones de aminoácidos de cisteína para conferir una solubilidad aumentada. La solubilidad aumentada permite la producción de una alta concentración de reserva de globina mutante para la infusión de una dosis suficiente para el tratamiento de carboxihemoglobinemia.
También se proporciona un método de retiración de monóxido de carbono de hemoglobina en sangre o tejido poniendo en contacto la sangre o el tejido con una molécula de globina recombinante que un monóxido de carbono con alta afinidad. En algunas realizaciones, la molécula de globina recombinante es una neuroglobina humana recombinante con una mutación en el resto 64, tal como una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W o una citoglobina recombinante humana con una mutación en el resto 81, tal como una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W. En algunos ejemplos, el método de retiración de monóxido de carbono de hemoglobina es un método in vitro. En otros ejemplos, el método es un método in vivo que incluye la administración de la molécula de globina recombinante a un sujeto que necesita tratamiento.
Se proporciona adicionalmente proteínas de neuroglobina recombinantes humanas que comprenden una mutación en el resto 64 y que comprenden adicionalmente una mutación C46G, una mutación C55S y una mutación C120S. En algunas realizaciones, la mutación en el resto 64 es una mutación H64Q, H64A, H64L o H64W. De manera
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similar, la presente divulgación proporciona proteínas de citoglobina recombinantes humanas que comprenden una mutación en el resto 81 y que comprenden adicionalmente una mutación C38S y una mutación C83S. En algunas realizaciones, la mutación en el resto 81 es una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W. También se proporcionan mediante la presente divulgación composiciones que comprenden la neuroglobina recombinante o proteínas de citoglobina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los anteriores y otros objetivos, características, y ventajas de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Las FIG. 1A-1B son gráficos que muestran la reacción de los glóbulos rojos (RBC) carboxilados con tampón o desoxi neuroglobina (desoxiNgb) H64Q. Los experimentos se realizaron a 21 °C en tampón de PBS en condiciones anaeróbicas. (FIG. 1 A) Se muestran especies desoxi o carboxiladas para la fracción de RBC: desoxiHb durante el experimento de RBC + Ngb (rombos); HbCO durante el experimento de RBC + Ngb (cuadrados); HbCo durante el experimento de RBC + tampón (X); y desoxiHb durante el experimento de RBC + tampón (triángulos). (FIG. 1B) Se muestran especies desoxi o carboxiladas para la fracción de sobrenadante (neuroglobina): desoxiNgb durante el experimento de RBC + Ngb (rombos); y NgbCO durante el experimento de RBC + Ngb (cuadrados).
La FIG. 2 es un gráfico que muestra la reacción de los glóbulos rojos con desoxiNgb H64Q. El experimento se realizó a 21 °C en tampón de PBS en condiciones anaeróbicas. Se muestran especies desoxi o carboxiladas para la fracción de RBC: desoxiHb (rombos); HbCO (cuadrados); desoxiNgb (triángulos); y NgbCO (X).
La FIG. 3 es un gráfico que muestra la reacción de los glóbulos rojos carboxilados con oxiNgb H64Q. El experimento se realizó a 21 °C en tampón de PBS en condiciones aeróbicas. Se muestran especies desoxi o carboxiladas para la fracción de RBC: oxiHb (cuadrados); HbCO (triángulos); oxiNgb (X); NgbCO (asteriscos).
La FIG. 4 es un gráfico que muestra la concentración de HbCO en la sangre de ratones expuestos a CO. Los ratones se expusieron a 1500 ppm de CO durante 60 minutos, a continuación se detuvo el CO y se infundió PBS (200 pl) durante 5 minutos. Se extrajeron muestras de sangre (aproximadamente 10 pl) cada 5-10 minutos, se redujeron químicamente con ditionito y se controlaron para su HbCO. Otras especies de Hb en sangre (oxiHb/metHb/desoxiHb) se representan como desoxi Hb.
La FIG. 5 es un gráfico que muestra la concentración de HbCO en la sangre de ratones expuestos a CO. Los ratones se expusieron a 1500 ppm de CO durante 70 minutos, después de los cuales se detuvo el CO y se infundió H64Q Ngb concentrado (200 pl) durante 10 minutos. Se extrajeron muestras de sangre (aproximadamente 10 pl) cada 5-10 minutos, se redujeron químicamente con ditionito y se controlaron para su HbCO y NgbCO. Otras especies de Hb en la sangre (oxiHb/metHb/desoxiHb) se representan como desoxi Hb y especies de Ngb (oxiNgb/metNgb/desoxiNgb) se representan como desoxi Ngb.
La FIG. 6 es un gráfico que muestra la concentración de HbCO en la sangre de ratones expuestos a CO. Los ratones se expusieron a 1500 ppm de CO durante 70 minutos, después de los cuales se detuvo el CO y se infundió H64Q Ngb concentrado (200 pl) durante 5 minutos. Se extrajeron muestras de sangre (aproximadamente 10 pl) cada 5-10 o 20 minutos, se redujeron químicamente con ditionito y se controlaron para su HbCO y NgbCO. Otras especies de Hb en la sangre (oxiHb/metHb/desoxiHb) se representan como desoxi Hb. Las FIG. 7A-7B son un par de gráficos que muestran la caída en concentración de HbCO en la sangre de ratones expuestos a CO después de la infusión de PBS o H64Q. La FIG. 7A muestra los niveles de HbCO absolutos; La FIG. 7B muestra el cambio relativo en el nivel de HbCO. Los ratones se expusieron a 1500 ppm de CO durante 60-70 minutos, después de los cuales se detuvo el CO y se infundió H64Q Ngb concentrado (200 pl) durante 5 minutos. El tiempo de infusión se marcó como t=0. Se extrajeron muestras de sangre (aproximadamente 10 pl) cada 5-10 minutos, se redujeron químicamente con ditionito y se controlaron para su HbCO y NgbCO. Otras especies de Hb en la sangre (oxiHb/metHb/desoxiHb) se representan como desoxi Hb. Los puntos representar el error estándar promedio de tres o más experimentos.
La FIG. 8 es un gráfico que muestra la caída en porcentaje de concentración de HbCO en la sangre de ratones expuestos a CO 5 y 10 minutos después de la infusión de PBS o H64Q. Las barras representan, de izquierda a derecha: infusión de PBS durante 5 minutos; infusión de PBS durante 10 minutos; infusión de Ngb H64Q durante 5 minutos; e infusión de H64Q Ngb durante 10 minutos.
La FIG. 9A es un gráfico que demuestra que la neuroglobina H64Q se limpia como NgbCO en la orina de ratones infundidos. Se muestra la absorbancia de orina a partir de las vejigas de ratones sacrificados aproximadamente 75 minutos después de la finalización de la exposición a CO. Las tres trazas superiores muestran la absorbancia debido a la neuroglobina, que incluye del 82 al 91 % de NgbCO. Las trazas inferiores indican la absorbancia que no es atribuible a Ngb. La FIG. 9B es una fotografía de los órganos internos de un ratón no tratado con Ngb H64Q y una jeringa con orina coloreada de rojo que contiene NgbCO.
LISTADO DE SECUENCIAS
Las secuencias de aminoácidos que se enumeran en el listado de secuencias adjunto se muestran usando el código estándar de tres letras para aminoácidos, tal como se define en 37 C.F.R. 1.822. El listado de secuencias se envía como un archivo de texto ASCII, creado el 20 de febrero de 2014, 9.98 KB, que se incorpora por referencia en el presente documento. en el listado de secuencias adjunto:
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La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoácidos de neuroglobina humana.
La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de neuroglobina humana recombinante que comprende una o más mutaciones.
La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de neuroglobina humana recombinante que comprende mutaciones en los restos 46, 55, 64 y 120.
La SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos de citoglobina humana.
La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de una citoglobina humana recombinante que comprende una o más mutaciones.
La SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de citoglobina humana recombinante que comprende mutaciones en los restos 38, 81 y 83.
Descripción detallada
I. Abreviaturas
Cgb citoglobina
CO monóxido de carbono Hb hemoglobina
HbCO carboxihemoglobina
Ngb neuroglobina
NgbCO carboxineuroglobina
RBC glóbulos rojos
II. Términos y métodos
A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se usan según su uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes sobre biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:
Administración: Proporcionar o dar a un sujeto un agente, tal como un agente terapéutico (por ejemplo, un polipéptido recombinante), mediante cualquier vía eficaz. Las vías de administración a modo de ejemplo incluyen, pero sin limitación, inyección o infusión (tal como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, inyección intratecal, intravenosa, intracerebroventricular, intraestriatal, intracraneal o en la médula espinal), oral, intraductal, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal y vías de inhalación.
Antídoto: Un agente que neutraliza o contrarresta los efectos de una intoxicación.
Monóxido de carbono (CO): Un gas incoloro, inodoro e insípido que es tóxico para los humanos y animales cuando se encuentra a concentraciones suficientemente altas. El CO también se produce durante el metabolismo animal normal a bajos niveles.
Carboxihemoglobina (HbCO): Un complejo estable de monóxido de carbono (CO) y hemoglobina (Hb) que se forma en los glóbulos rojos cuando se inhala o produce CO durante el metabolismo normal.
Carboxihemoglobinemia o intoxicación por monóxido de carbono: Una afección que resulta de la presencia de cantidades excesivas de monóxido de carbono en la sangre. Por lo general, la exposición de CO de 100 partes por millón (ppm) o superior es suficiente para causar carboxihemoglobinemia. Los síntomas de intoxicación por CO agudo leve incluyen mareos, confusión, dolores de cabeza, vértigo y efectos similares a la gripe; exposiciones más grandes puede llevar a una toxicidad significante del sistema nervioso central e incluso la muerte. Después de una intoxicación aguda, a menudo se produces secuelas a largo plazo. El monóxido de carbono también puede tener efectos graves sobre el feto de una mujer embarazada. La exposición crónica a bajos niveles de monóxido de carbono pueden llevar a la depresión, confusión y pérdida de memoria. El monóxido de carbono principalmente causa efectos adversos en humanos mediante la combinación con hemoglobina para formar una carboxihemoglobina (HbCO) en la sangre. Esto evita que el oxígeno se una a la hemoglobina, reduciendo la capacidad portadora de oxígeno de la sangre, llevando a la hipoxia. Además, se piensa que la mioglobina y citocromo oxidasa mitocondrial se ven perjudicialmente afectadas. La carboxihemoglobina puede volverse en hemoglobina, pero la recuperación lleva tiempo porque el complejo de HbCO se relativamente estable. Los métodos actuales de tratamiento para la intoxicación de Co incluyen la administración de oxígeno al 100 % o proporcionando terapia de oxígeno hiperbárico.
Poner en contacto: Colocación en asociación física directa; incluye tanto en forma sólida como líquida. Cuando se
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usa en el contexto de un método in vivo, "poner en contacto" también incluye la administración.
Citoglobina: Una molécula de globina que se expresa de forma ubicua en todos los tejidos. La citoglobina es una hemoglobina hexacoordinada que se ha presentado para facilitar la difusión de oxígeno a través de tejidos, reducir nitrito en óxido nítrico y juega un papel citoprotector en condiciones hipóxicas y bajo estrés oxidativo. La citoglobina humana tiene 190 aminoácidos de longitud. Una secuencia de aminoácidos de citoglobina humana ilustrativa se indica a continuación en el presente documento como SEQ ID NO: 4. Los mutantes de citoglobina recombinante que se desvela en el presente documento, que muestran una muy alta afinidad para CO, comprende una mutación en el resto 81 (histidina a glutamina, alanina, triptófano o leucina) y comprende opcionalmente una sustitución de cisteína a serina en la posición 38 y/o una sustitución de cisteína a serina en la posición 83 (véase SEQ ID NO: 5). En un ejemplo no limitante, el mutante de citoglobina con alta afinidad de CO comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
Globina: Una proteína que contiene hemo en la unión y/o transporte de oxígeno. Las globinas incluyen, por ejemplo, hemoglobina, mioglobina, neuroglobina y citoglobina.
Hemoglobina (Hb): La metaloproteína de transporte de oxígeno y que contiene hierro en los glóbulos rojos de la sangre en vertebrados y otros animales. En los seres humanos, la molécula de hemoglobina es un conjunto de cuatro subunidades de proteínas globulares. Cada subunidad está compuesta de una cadena de proteínas estrechamente asociada con un grupo hemo no proteico. Cada cadena de proteínas se dispone en un conjunto de segmentos estructurales de hélice alfa conectados juntos en una disposición plegadas de globinas, denominadas así porque esta disposición es el mismo motivo de plegado que se usa en otras proteínas hemo/globina. Este patrón de plegado contiene un bolsillo que une fuertemente el grupo hemo.
Neuroglobina (Ngb): Un miembro de la familia globina de proteínas. La función fisiológica de la neuroglobina es actualmente desconocida, pero se piensa que proporciona protección en condiciones hipóxicas o isquémicas. La neuroglobina se expresa en el sistema nervioso central y periférico, líquido cefalorraquídeo, tejidos retinales y endocrinos. La neuroglobina humana tiene 151 aminoácidos de longitud. Una secuencia de neuroglobina humana ilustrativa se proporciona en el presente documento como SEQ ID NO: 1. Los mutantes de neuroglobina recombinante que se desvela en el presente documento, que muestran una muy alta afinidad para CO, comprende una mutación en el resto 64 (histidina a glutamina, alanina, triptófano o leucina) y comprende opcionalmente una sustitución de cisteína a glicina en el resto 46, y/o una sustitución de cisteína a serina en la posición 55 y/o una sustitución de cisteína a serina en la posición 120 (véase SEQ ID NO: 2). En un ejemplo no limitante, el mutante de neuroglobina con alta afinidad de CO comprende la secuencia de aminoácidos de la sEq ID NO: 3.
Péptido o polipéptido: Un polímero en el que los monómeros son restos de aminoácidos que se unen juntos mediante enlaces amida. Cuando los aminoácidos son aminoácidos alfa, puede usarse o bien el isómero óptico L o bien el isómero óptico D, siendo preferentes los isómeros L. Los términos "péptido", "polipéptido" o "proteína" tal como usan en el presente documento están destinados para abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluye secuencias modificadas, que incluye proteínas de globina modificadas. Los términos "péptido" y "polipéptido" están destinados específicamente a cubrir proteínas de origen natural, así como las que se producen de forma recombinante o sintética.
Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas que, cuando se producen, interfieren menos con las propiedades de la proteína original, es decir, la estructura y especialmente la función de la proteína se conserva y no cambia significativamente por tales sustituciones. A continuación se muestran ejemplos de sustituciones conservadoras.
Resto original
Sustituciones conservadoras
Ala
Ser
Arg
Lys
Asn
Gln, His
Asp
Glu
Cys
Ser
Gln
Asn
Glu
Asp
His
Asn; Gln
lie
Leu, Yal
Leu
Ile; Val
Lys
Arg; Gln; Glu
Met
Leu; Ile
Phe
Met; Leu; Tyr
Ser
Thr
Thr
Ser
Trp
Tyr
Tyr
Trp; Phe
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Val Ile; Leu
Las sustituciones conservadoras mantienen generalmente (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélice, (b) la carga de hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.
Las sustituciones que en general se espera que produzcan las mayores cambios en las propiedades proteínicas serán no conservadoras, por ejemplo, cambios en los que (a) un resto hidrófilo, por ejemplo, serina o treonina, se sustituye por (o mediante) un resto hidrófobo, por ejemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina, valina o alanina; (b) una cisteína o prolina se sustituye por (o mediante) cualquier otro resto; (c) un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisina, arginina o histidina, se sustituye por (o mediante) un resto electronegativo, por ejemplo, glutamina o ácido aspártico; o (d) un resto que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por (o mediante) una que no tiene una cadena lateral, por ejemplo, glicina.
Vehículos farmacéuticamente aceptables: Los vehículos farmacéuticamente aceptables para su uso son convencionales. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición, 1975, describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de composiciones que se desvelan en el presente documento.
En general, la naturaleza del vehículo dependerá del modo particular de administración que se emplee. Además de vehículos bilógicamente neutrales, composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener menores cantidades de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponadores del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.
Recombinante: Un ácido nucleico o proteína recombinante es uno que tiene una secuencia que no es de origen natural o tiene una secuencia que se produce mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial se consigue a menudo mediante síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. El término recombinante incluye ácidos nucleicos y proteínas que se han alterado por la adición, sustitución o eliminación de una parte de una molécula o proteína de ácido nucleico natural.
Identidad/similitud de secuencia: La identidad entre dos o más secuencias de ácidos nucleicos o dos o más secuencias de aminoácidos, se expresa en términos de identidad o similitud entre las secuencias. La identidad de secuencia puede medirse en términos de porcentaje de identidad; cuanto mayor sea el porcentaje, más idénticas son las secuencias. La similitud de secuencia puede medirse en términos de porcentaje de similitud (que tiene en cuenta sustituciones de aminoácidos conservadoras); cuanto mayor sea el porcentaje, más similares son las secuencias. Los homólogos y ortólogos de ácido nucleico o secuencias de aminoácidos poseen un grado relativamente alto de identidad/similitud de secuencia cuando se alinean usando métodos estándar. Esta homología es más significante cuando las proteínas de ortólogos o ADNc derivan de especias que están más estrechamente relacionadas (tales como secuencias humanas y de ratones), en comparación con especímenes más remotamente relacionados (tales como secuencias humanas y C. elegans).
Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica. Se describen diversos programas y algoritmos de alineación en: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet y col., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang y col. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; y Pearson y col., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, presenta una consideración detallada de métodos de alineación de secuencia y cálculos de homología.
La Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del NCBI (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990) está disponible a partir de varias fuentes, entre los que se incluye el centro nacional de información biotecnológica (NCBI) y en internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencias de blastp, blastn, blastx, blastn y tblastx. Puede encontrarse información adicional en la página web del NCBI.
Sujeto: Organismos multicelulares vivos, entre los que se incluyen organismos vertebrados, una categoría que incluye mamíferos tanto humanos como no humanos.
Cantidad terapéuticamente eficaz: Una cantidad de un compuesto o composición, por ejemplo, una molécula de globina recombinante, suficiente para conseguir un efecto deseado en un sujeto que está siendo tratado. Por ejemplo, esta puede ser la cantidad necesaria para limpiar monóxido de carbono en la sangre o tejidos, reducir el nivel de HbCO en la sangre y/o reducir uno o más signos o síntomas asociados con la intoxicación por monóxido de carbono.
A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica a la
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cual pertenece la presente divulgación. Los términos en singular "un", "una", "uno", y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. "Que comprende A o B" significa que incluye A, o B, o A y B. Se entiende además que todos los tamaños de bases o los tamaños de aminoácidos, y todos los valores de pesos moleculares o masas moleculares, proporcionados para los ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionas para la descripción. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o ensayo de la presente descripción, se describen a continuación los métodos y materiales adecuados.
En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, que incluye las explicaciones de términos, prevalecerá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
III. Descripción detallada
Existe la necesidad de una terapia eficaz, rápida y fácilmente disponible para tratar carboxihemoglobinemia (que incluye intoxicación por monóxido de carbono). En el presente documento se desvela un nuevo antídoto que proporciona una rápida eliminación de monóxido de carbono de la hemoglobina. La terapia desvelada implica el uso de globinas humanas modificadas, particularmente neuroglobinas modificadas en el resto 64 (respecto a la SEQ ID NO: 1) y/o citoglobinas modificadas en el resto 81 /respecto a la SEQ ID NO: 4) que unen monóxido de carbono con una afinidad extremadamente alta. Los datos que se desvelan en el presente documento demuestran, por primera vez, que las globinas mutantes con alta afinidad par CO pueden retirar de una forma muy eficaz CO de los glóbulos rojos; entonces, el CO se limpia del sistema a través de la secreción en la orina. Por tanto, las moléculas de globina mutantes descritas en el presente documento proporcionan un tratamiento sorprendentemente eficaz para la carboxihemoglobinemia. Las globinas mutantes monoméricas, por ejemplo, se infunden en la sangre de un sujeto, en la que rápida e irreversiblemente secuestran el monóxido de carbono y, por lo tanto, limitan los efectos tóxicos del monóxido de carbono sobre la respiración celular y el trasporte y utilización de oxígeno.
A. Métodos de tratamiento de carboxihemoglobinemia o intoxicación por CO
En el presente documento se proporciona un método de tratamiento de carboxihemoglobinemia en un sujeto seleccionando un sujeto con carboxihemoglobinemia y administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad. En algunas realizaciones, la molécula de globina recombinante es una neuroglobina humana recombinante con una mutación (una sustitución de aminoácido) en el resto 64, tal como una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W o una citoglobina recombinante humana con una mutación en el resto 81, tal como una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W. A lo largo de esta descripción, las posiciones de aminoácidos de la neuroglobina recombinante humana y la citoglobina recombinante humana se basan en la neuroglobina humana de tipo silvestre y las secuencias de citoglobina humana de tipo silvestre que se indican a continuación en el presente documento como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.
Las moléculas de globina recombinantes pueden incluir adicionalmente una o más sustituciones de aminoácidos de cisteína para conferir una solubilidad aumentada. La solubilidad aumentada permite la producción de una alta concentración de reserva de globina mutante para la infusión de una dosis suficiente para el tratamiento de carboxihemoglobinemia. En algunas realizaciones, la neuroglobina recombinante humana comprende adicionalmente una mutación C46G, una mutación C55S, una mutación C120S o cualquier combinación de las mismas. En ejemplos concretos, la neuroglobina recombinante comprende todas las tres sustituciones de cisteína. En un ejemplo no limitante, la neuroglobina recombinante humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la citoglobina recombinante humana comprende adicionalmente una mutación C83S, o una mutación C38S, o ambas mutaciones C38S y C83S. En un ejemplo no limitante, la citoglobina recombinante humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
En realizaciones alternativas, la neuroglobina recombinante humana comprende una mutación en el resto 64 y, opcionalmente una, dos o tres sustituciones de cisteína (es decir, uno, dos o las tres de las mutaciones C46G, C55S y C120S) puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en otros restos. De manera similar, la citoglobina recombinante humana que comprende una mutación en el resto 81 y,
opcionalmente, una o ambas de las sustituciones de cisteína (es decir, una o ambas de las mutaciones C38S y C83S) puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en otros restos. En algunos ejemplos, la neuroglobina o citoglobina recombinante humana comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos conservadoras o una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueva o diez sustituciones de aminoácidos no conservadoras o cualquier combinación de sustituciones
conservadoras y no conservadoras, siempre y cuando la globina recombinante retenga la capacidad de unir monóxido de carbono con alta afinidad. En algunos ejemplos, la neuroglobina o citoglobina humana recombinante incluye una eliminación, tal como una eliminación de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos, mientras que aún mantiene la capacidad de unir monóxido de carbono con alta afinidad.
En algunos ejemplos, la neuroglobina recombinante humana comprende una mutación en el resto 64 y,
opcionalmente una, dos o tres sustituciones de cisteína (es decir, uno, dos o las tres de las mutaciones C46G, C55S
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y C120S), es de al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
En algunos ejemplos, la citoglobina recombinante humana que comprende una mutación en el resto 81 y, opcionalmente, una o ambas de las sustituciones de cisteína (es decir, una o ambas de las mutaciones C38S y C83S) es de al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene al menos el 3 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 % o al menos el 20 % de carboxihemoglobina (HbCo) en su sangre.
En algunas realizaciones, la molécula de globina recombinante se administra por vía intravenosa, tal como por infusión intravenosa.
Puede determinarse una dosis adecuada de neuroglobina o citoglobina recombinante por un médico practicante. En algunas realizaciones, la dosis es la cantidad de globina recombinante requerida para disminuir la HbCO al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 %. En general, una dosis de aproximadamente 136 gramos de neuroglobina o aproximadamente 184 gramos de citoglobina es suficiente para conseguir un 20 % de reducción en HbCO.
Por tanto, en algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz de neuroglobina recombinante humana es de aproximadamente 25 a 1000 gramos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 gramos, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 gramos o aproximadamente 60 a aproximadamente 140 gramos. En ejemplos concretos, la dosis terapéuticamente eficaz de neuroglobina recombinante humana es de
aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450 o aproximadamente 500 gramos. En algunas realizaciones, la dosis terapéuticamente eficaz de citoglobina recombinante humana es de aproximadamente 25 a aproximadamente 1000 gramos o de aproximadamente 50 a aproximadamente 800 gramos. En ejemplos concretos, la dosis terapéuticamente eficaz de citoglobina recombinante humana es de aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600,
aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750 o aproximadamente 800 gramos.
En algunas realizaciones, la concentración de neuroglobina o citoglobina administrada al sujeto es de aproximadamente 70 a aproximadamente 200 gramos por litro, que equivale aproximadamente a 35-200 gramos para 500 mililitros o 1 litro de tratamiento.
La globina modificada con alta afinidad para monóxido de carbono puede administrarse a un sujeto en una dosis única o en múltiples dosis según se necesite, para reducir la HbCO a un nivel no tóxico.
En algunas realizaciones, la dosis administrada al sujeto es la cantidad de globina recombinante requerida para disminuir la HbCO por al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % (en comparación con el nivel de HbCO antes del tratamiento) en sangre y/o tejido del sujeto.
B. Métodos de retiración de monóxido de carbono de la hemoglobina
También se proporciona en el presente documento un método de retiración de monóxido de carbono de hemoglobina en sangre o tejido poniendo en contacto la sangre o el tejido con una molécula de globina recombinante que un monóxido de carbono con alta afinidad. En el contexto de la presente divulgación, "retirar" no requiere la completa eliminación de monóxido de carbono de la sangre o del tejido, sino que más bien significa la retiración de CO de las moléculas de hemoglobina en la sangre o en el tejido de modo que el nivel completo de HbCO se ve reducido en la sangre o el tejido de una muestra o un sujeto. Por ejemplo, la HbCO puede reducirse por al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 4 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 % o al menos el 25 % (en comparación con el nivel de HbCO antes del tratamiento) en la sangre y/o el tejido.
En algunas realizaciones del método, la molécula de globina recombinante es una neuroglobina humana recombinante con una mutación en el resto 64, tal como una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W o una citoglobina recombinante humana con una mutación en el resto 81, tal como una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W.
Las moléculas de globina recombinantes pueden incluir adicionalmente una o más sustituciones de aminoácidos de
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cisteína para conferir una solubilidad aumentada. La solubilidad aumentada permite la producción de una alta concentración de reserva de globina mutante para la infusión de una dosis suficiente para la retiración eficaz de CO de la sangre. En algunas realizaciones, la neuroglobina recombinante humana comprende adicionalmente una mutación C46G, una mutación C55S, una mutación C120S o cualquier combinación de las mismas. En ejemplos concretos, la neuroglobina recombinante comprende todas las tres sustituciones de cisteína. En un ejemplo no limitante, la neuroglobina recombinante humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, la citoglobina recombinante humana comprende adicionalmente una mutación C83S, o una mutación C38S, o ambas mutaciones C38S y C83S. En un ejemplo no limitante, la citoglobina recombinante humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
En realizaciones alternativas, la neuroglobina recombinante humana comprende una mutación en el resto 64 y, opcionalmente una, dos o tres sustituciones de cisteína (es decir, una, dos o las tres de las mutaciones C46G, C55S y C120S) puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en otros restos. De manera similar, la citoglobina recombinante humana que comprende una mutación en el resto 81 y, opcionalmente, una o ambas de las sustituciones de cisteína (es decir, una o ambas de las mutaciones C38S y C83S) puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en otros restos. En algunos ejemplos, la neuroglobina o citoglobina recombinante humana comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos conservadoras o una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueva o diez sustituciones de aminoácidos no conservadoras o cualquier combinación de sustituciones conservadoras y no conservadoras, siempre y cuando la globina recombinante retenga la capacidad de unir monóxido de carbono con alta afinidad. En algunos ejemplos, la neuroglobina o citoglobina humana recombinante incluye una eliminación, tal como una eliminación de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos, mientras que aún mantiene la capacidad de unir monóxido de carbono con alta afinidad.
En algunos ejemplos, la neuroglobina recombinante humana comprende una mutación en el resto 64 y, opcionalmente una, dos o tres sustituciones de cisteína (es decir, una, dos o las tres de las mutaciones C46G, C55S y C120S), es de al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.
En algunos ejemplos, la citoglobina recombinante humana que comprende una mutación en el resto 81 y, opcionalmente, una o ambas de las sustituciones de cisteína (es decir, una o ambas de las mutaciones C38S y C83S) es de al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
En algunos ejemplos, el método de retiración de monóxido de carbono de hemoglobina es un método in vitro. Por ejemplo, el método puede incluir poner en contacto una muestre de sangre o de tejido con la molécula de globina recombinante. En algunos ejemplos, se pone en contacto una cantidad suficiente de globina recombinante con la muestra de sangre o de tejido de modo que la HbCO se reduce en la muestra por al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 %.
En otros ejemplos, el método es un método in vivo que incluye la administración de la molécula de globina recombinante a un sujeto que necesita tratamiento. En algunos casos, el sujeto (antes de la administración) tiene al menos el 3 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 % o al menos el 20 % de HbCo en su sangre. La molécula de globina recombinante puede administrarse usando cualquier via de administración adecuada, tal como administración intravenosa, por ejemplo, infusión intravenosa.
Se describen anteriormente en el aparato A dosis terapéuticamente eficaces adecuadas de neuroglobina y citoglobina recombinante. En algunos ejemplos, la dosis terapéuticamente eficaz de neuroglobina recombinante humana es de aproximadamente 25 a 1000 gramos o de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 gramos. En algunos ejemplos, la dosis terapéuticamente eficaz de citoglobina recombinante humana es de aproximadamente 25 a aproximadamente 1000 gramos o de aproximadamente 50 a aproximadamente 800 gramos. La globina modificada con alta afinidad para monóxido de carbono puede administrarse a un sujeto en una dosis única o en múltiples dosis según se necesite, para reducir la HbCO a un nivel no tóxico.
En algunas realizaciones del método in vivo, la dosis administrada al sujeto es la cantidad de globina recombinante requerida para disminuir la HbCO al menos el 1 %, al menos el 2 %, al menos el 3 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % en sangre y/o tejido del sujeto.
C. Mutantes de neuroglobina y citoglobina recombinantes
Se proporcionan en el presente documento proteínas de neuroglobina recombinantes humanas que comprenden una mutación en el resto 64 (respecto a la SEQ ID NO: 1) y que comprenden adicionalmente una mutación C46G ), una mutación C55S y una mutación C120S. En algunas realizaciones, la mutación en el resto 64 es una mutación
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H64Q, H64A, H64L o H64W. De manera similar, la presente divulgación proporciona proteínas de citoglobina recombinantes humanas que comprenden una mutación en el resto 81 (respecto a la SEQ ID NO: 4) y que comprenden adicionalmente una mutación C38S y una mutación C83S. En algunas realizaciones, la mutación en el resto 81 es una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W. Se proporciona adicionalmente composiciones que comprenden las proteínas de neuroglobina o citoglobina recombinante que se desvelan en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los datos que se desvelan en el presente documento (véase Ejemplo 2) demuestran, por primera vez, que las moléculas de neuroglobina que comprenden la mutación H64L o H64Q tiene índices de autooxidación 23 veces más lentos que la proteína de tipo silvestre. Un índice de autooxidación inferior es una propiedad deseable puesto que reduce las reacciones secundarias que resultan perjudiciales para la capacidad de la globina mutante en unir CO y suministrar oxígeno a los tejidos.
Las secuencias de aminoácidos de neuroglobina humana de tipo silvestre y citoglobina humana de tipo silvestre se muestran a continuación, junto con mutantes de neuroglobina y citoglobina recombinantes ilustrativos que se proporcionan mediante la presente divulgación. La citoglobina recombinante humana de la reivindicación 13 es la única citoglobina recombinante humana reivindicada como tal.
Neuroglobina humana (SEQ ID NO: 1; N.° de acceso en Genbank™ NP_067080.1)
MERPEPELIRQSWRAVSRSPLEHGTVLFARLFALEPDLLPLFQYNCRQFSSPEDCLSSPEFLD HIRKVMI ,VIDA A VTN VFDLSSLEEYI .ASI XiRKI IR A VGVKI .SSI'STVGESLI YMLFKCLGPA FTPATRAAWSQLYGAVVQAMSRGWDGE Neuroglobina recombinante con alta afinidad para CO (SEQ ID NO: 2)
MERPEPELIRQSWRAVSRSPLEHGTVLFARLFALEPDLLPLFQYNX1RQFSSPEDX2LSSPEFL DXjIRKVMLVÍDAAVTNVEDIJSSLEEYLASLGRKHRAVGVKLSSFSTVGESLLYMLFKXjL GP AFTPATRA A W SQL Y G A V V Q AMSRGWDGE
X1 = C o G X2 = C o S X3 = Q, L, A o W
Neuroglobina recombinante con cuatro sustituciones de aminoácidos (SEQ ID NO: 3)
MERPEPELIRQSWRAVSRSPLEHGTVLFARLFALEPDLLPLFQYNGRQFSSPEDSLSSPEFLD
QIRKVMLVIDAAVTNVEDLSSLEEYLASLGRKHRAVGVKLSSFSTVGESLLYMLEKSLGPA
FTPATRAAWSQLYGAVVQAMSRGWDGE
Citoglobina humana (SEQ ID NO: 4; N.° de acceso en Genbank™ NP_599030)
MEKVPGEMEIERRERSEELSEAERKAVQAMWARLYANCEDVGVAILVRFFVNFPSAKQYF
SQFKHMEDPLEMERSPQLRKHACRVMGALNTVVENLHDPDKVSSVLALVGKAHALKHK
VEPVYFKILSGVILEVVAEEFASDFPPETQRAWAKLRGLIYSHVTAAYKEVGWVQQVPNA
TTPPATLPSSGP
Citoglobina recombinante con alta afinidad de CO (SEQ ID NO: 5)
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FSQFKHMEDPLEMERSPQLRKX2AX1RVMGAENTVVENEHDPDKVSSVEAEVGKAHAEK
FIKVEPVYFKILSGVILEVVAEEFASDFPPETQRAWAKLRGLIYSHVTAAYKEVGWVQQVP
NATTPPATLPSSGP
Xi = C o S X2 = Q, L, A o W
Citoglobina recombinante con tres sustituciones de aminoácidos (SEQ ID NO: 6)
MEKVPGEMEIERRERSEELSEAERKAVQAMWAREYANSEDVGVAIEVRFFVNFPSAKQYI
SQFKHMEDPLEMERSPQLRKQASRVMGALNTVVENLHDPDKVSSVLALVGKAHALKHK
VEPVYFKlISGVILEVVAEEFASDFPPETQRAWAKERGEIYSnVTAAYKEVGWVQQVPNA
TTPPATLPSSGP
Las proteínas de neuroglobina y citoglobina recombinante humanas proporcionadas en el presente documento pueden comprender una de las secuencias que se han mostrado anteriormente (y se indican en el presente documento como SEQ ID NO: 2, 3, 5 y 6), o las globinas recombinantas pueden incluir adicionalmente una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Por ejemplo, la neuroglobina recombinante humana con mutaciones en los restos 46, 55, 64 y 120 puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en otros restos. De manera similar, la citoglobina recombinante humana que comprende mutaciones en los restos 38, 81 y 83 puede incluir una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras en otros restos. En algunos ejemplos, la neuroglobina o citoglobina recombinante humana comprende una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sustituciones de aminoácidos conservadoras o una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueva o diez sustituciones de aminoácidos no conservadoras o cualquier combinación de sustituciones conservadoras y no conservadoras, siempre y cuando la globina recombinante retenga la capacidad de unir monóxido de carbono con alta afinidad. En algunos ejemplos, la neuroglobina o citoglobina humana recombinante incluye una eliminación, tal como una eliminación de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aminoácidos, mientras que aún mantiene la capacidad de unir monóxido de carbono con alta afinidad.
En algunos ejemplos, la neuroglobina recombinante humana es de al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 y retiene la modificación en el resto 64 (H64Q, H64A, H64W o H64L) y las mutaciones C46G, C55S y C120S.
En algunos ejemplos, la citoglobina recombinante humana es de al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % idéntica a SEQ ID NO: 6 y retiene la modificación en el resto 81 (H81Q, H81 A, H81W o H81L) y las mutaciones C38S y C83S.
Composiciones que comprenden cualquiera de las moléculas de globina recombinantes que se desvelan en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable, también se proporcionan mediante la presente divulgación.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas características particulares y/o realizaciones. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la divulgación a las características particulares o realizaciones descritas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Limpieza de monóxido de carbono (CO) de hemoglobina mediante el mutante H64Q de neuroglobina
Este ejemplo demuestra que el mutante H64Q de neuroglobina retira rápidamente CO de hemoglobina carboxilada ubicada dentro de los glóbulos rojos.
Antecedentes
La neuroglobina (Ngb) es una proteína hemo, descubierta recientemente en mamíferos y otras especies (Burmester y col., Nature 407(6803):520-523, 2000). La Nhb es muy similar en secuencia y estructura a la mioglobina y
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hemoglobina, pero a diferencia de estas proteínas contiene un hemo coordinado por seis con dos grupos de histidina que se unen al hemo, mientras que la mioglobina y hemoglobina están coordinadas por cinco y solo tienen una histidina enlazada permanentemente al hemo. La función de esta proteína hemo se desconoce. La reacción del átomo de hierro a partir de un grupo hemo puede representarse del siguiente modo:
imagen1
donde kon y koff son los índices de unión y disociación del CO, respectivamente. La Ngb muestra una alta afinidad de ligandos tales como oxígeno o monóxido de carbono y esta afinidad es incluso superior cuando la histidina distal (His64) se reemplaza por otras cadenas laterales (Tabla 1).
Tabla 1. Constantes de unión y disociación de neuroglobina y hemoglobina
kon (M-1s-1) koff (s-1)
m RCu ""I fl6 H M ■1/1
Ngb humana de tipo silvestre
65 x 106 0,014
Ngb de ratón de tipo silvestre
72 x 106 0,013
H64L de Ngb de ratón
200 x106 ND (demasiado lento)
Hb humana (subunidad a, estado R)
6 x 106 0,012
Hb humana (subunidad a, estado T)
0,12 x 106 0,21
Hb humana (subunidad 3, estado R)
7,4x106 0,007
Hb humana (subunidad 3, estado T)
0,05 x 106 0,19
Valores determinados a 25 °C.
Datos de neuroglobina de Dewilde y col., J Biol Chem 276(42):38949-38955, 1998. Hemoglobin data from Unzai y col., J Biol Chem 273(36):23150-23159, 1998._____
Basándose en caracterización previa (Tiso y col., J Biol Chem 286(20):18277-18289, 2011) y estudios posteriores, se cree que las propiedades de unión de Co de los mutantes H64Q y H64L son muy similares, por lo tanto, los valores informados de H64L son una estimación razonable para H64Q. Los datos en la Tabla 1 indican que en presencia de un limpiador adecuado, la disociación de CO de la hemoglobina conducirá a una semivida del complejo de HbCO de aproximadamente 3,5 segundos (estado T) o 70 segundos (estado R) a 25 °C. Tasas superiores pueden conducir incluso a tiempos más cortos a 37 °C. Estos tiempos cortos proporcionan una oportunidad para un enfoque terapéutico. Sin embargo, en ausencia de limpiadores de Co, el CO disociado se unirá finalmente de nuevo a la hemoglobina, llevando a una persistencia de la HbCO mucho superior que la sugerida por los índices de disociación.
Los índices de unión y disociación para la neuroglobina (Tabla 1) indican una afinidad mucho superior hacia CO que para la de la hemoglobina. Por lo tanto, se formuló la hipótesis de que la neuroglobina sería un limpiador adecuado de CO de HbCO u otros compuestos carboxilados. Los resultados descritos a continuación confirman esta hipótesis.
Materiales y métodos
Reactivos
Se uso sangre fresca o de hasta 2 semanas después de su recogida de voluntarios sanos. Los glóbulos rojos (RBC) y la hemoglobina se preparó como se ha descrito previamente (Huang y col., J Clin Invest 115(8):2099-2107, 2005). Todos los productos químicos se adquirieron en Sigma (St. Louis, mO), a menos que se indique lo contrario. Se recogieron los datos de espectros de absorbancia visible y datos cinéticos sobre espectrofotómetros de UV visible Cary 50 y HP8453 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) con un espectrómetro de flujo detenido SX20 (Applied Photophysics Limited, Leatherhead, Reino Unido). Todos los experimentos se realizaron en tampón fosfato salino (Sigma). Se preparó tampón saturado con monóxido de carbono (CO) burbujeando 20 ml de PBS con gas de CO durante al menos 15 minutos. Se preparó solución de ditionito de sodio de reserva añadiendo PBS desgasificado mediante pase de flujo de Argon a un vial desgasificado de ditionito de sodio seco.
Expresión y purificación de neuroglobina recombinante
Se purificó proteína H64Q de neuroglobina (Ngb) recombinante a partir de cultivos de E. coli a partir de un método modificado basado en trabajo previo (Tiso y col., J Biol Chem 286(20): 18277-18289, 2011). se cultivaron células de E. coli SoluBL21 (Genlantis) que contenían plásmido de pET28-NgbH64Q en caldo de TB complementado con 30 pg/ml de Kanamicina. Se indujo la expresión a DO600nm= 0,8 añadiendo 1 mM de isopropil-1-tio-p-D- galactopiranosida y se llevó a cabo durante 24 horas a 37 °C. Se añadió ácido 5-aminolevulinico (0,4 mM) en inducción para aumentar la producción del cofactor de hemo. Se recogieron y resuspendieron las células en tampón de lisis (50 mM de MOPS, pH 7,0, EDTA 1 mM, 1mg/ml de lisozima, PMSF 1 mM, DTT 0,5 mM) y se sometieron a lisis mediante sonicación. Se cargó sobrenadante en una columna de DEAE-sefarosa equilibrada con tampón A (MOPS 50 mM pH 7,0, NaCI 10 mM). Las muestras se lavaron con 3 volúmenes de columna de tampón A y se
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eluyeron con un gradiente lineal al 100 % de tampón B (MOPS 50 mM pH 7,0, NaCI 100 mM). Las fracciones de Ngb se agruparon y concentraron. Para una purificación adicional, las muestras concentradas se sometieron en una columna de filtración de gel (Sephacryl S-200 HR, GE Healthcare). La pureza se evaluó mediante SDS-PAGE y espectroscopia de UV-Vis.
Cinética de Hb carboxilada mezclada con neuroglobina
Se preparó Hb carboxilada (HbCO) añadiendo un exceso de ditionito de sodio a Hb descongelada y mezclándolo con tampón saturado con CO en una relación de al menos 4:1. Se retiró el exceso de CO pasándolo a través de una columna de desalación dentro de una caja de guantes. Para experimentos anaeróbicos, se añadió, a continuación, un exceso de ditionito de sodio a la HbCO. La Ngb-H64Q descongelada se mezcló con un exceso de ferricianida de potasio y se pasó a través de una columna de desalación para obtener la forma oxidada. En algunos casos, ya se almacenó Ngb-H64Q en forma oxidada a -80 °C. Se obtuvo Ngb-H64Q desoxigenada añadiendo un exceso de ditionito de sodio a la forma oxidada. Para experimentos aeróbicos, se obtuvo la forma oxigenada pasando la forma desoxigenada a través de una columna de desalación en condiciones aeróbicas inmediatamente antes de mezclarla con HbCO.
Para la cinética medida con el espectrofotómetro Cary 50 o HP8453, se colocó HbCO dentro de una cubeta de 1 cm de longitud de trayectoria en el vehículo de células y se llevó a 25 °C o 37 °C. La Ngb-H64Q desoxigenada u oxigenada se equilibró rápidamente a la misma temperatura usando un baño de agua al lado del espectrofotómetro. Se inició la reacción inyectando Ngb-H64Q en la solución de HbCO para una concentración final de 40 pM de ambas proteínas. Se inició la recogida de absorbancia con un retraso de 1 a 10 segundos y se continuó hasta 20 minutos según la mezcla se agitaba continuamente. Hubo presente una concentración final de 1 -5 mM de ditionito de sodio en condiciones anaeróbicas. Para la cinética medida con el espectrómetro de flujo detenido SX20, las lineas de muestra del instrumento se lavaron en primer lugar con PBS puro para experimentos aeróbicos y con PBS que contenía 5 mM de ditionito de sodio para experimentos anaeróbicos. Las lineas de muestra y jeringas del aparato se equilibraron a 25 °C o 37 °C. A continuación se cargaron HbCO y Ngb-H6Q en jeringas de 2,5 ml del aparato que contenía 5 mM de ditionito de sodio para experimentos anaeróbicos. Se mezclaron HbCO y Ngb-H64Q 1:1 con un tiempo muerto de menos de 2 mseg para una concentración final de 25-30 pM de ambas proteínas. La absorbancia de la mezcla de reacción se siguió durante no más de 200 segundos.
Cinética de RBC carboxilados mezclados con neuroglobina
Se obtuvieron glóbulos rojos lavando 50-100 pL de sangre con PBS de 5 a 7 veces mediante centrifugación a 1000 x g durante 5-10 minutos. Los glóbulos rojos lavados se diluyeron en 1 a 2 ml de PBS y se desoxigenaron mientras sobre hielo y con agitación lenta mediante un flujo de pasaje de gas de argón durante hasta 1 hora. Para experimentos anaeróbicos, se pasó argón brevemente y se añadió un exceso de ditionito de sodio a Hb a los glóbulos rojos. Se obtuvo Hb encapsulado por glóbulos rojos carboxilados diluyendo la solución de glóbulos rojos desoxigenados con una relación de al menos 4:1. Se retiró el exceso de CO lavando los glóbulos rojos 2 veces con PBS desgasificado (que contenía 5-10 mM de ditionito para experimentos anaeróbicos) mediante centrifugación durante 5 minutos a 1000 x g en tubos de centrifugación de 15 ml desgasificados y tapados con tabique. Tras el lavado, los glóbulos rojos se resuspendieron a una concentración final de 100-200 pM, con un exceso de ditionito de sodio para experimentos anaeróbicos.
Se preparó Ngb-H64Q oxigenado y desoxigenado siguiendo el mismo procedimiento que el descrito para los experimentos con Hb pura. En algunos experimentos, después de iniciar la reacción, se separaron los glóbulos rojos de Ngb-H64Q para medir los espectros de absorbancia. En este caso, la temperatura de reacción se reguló con una combinación de placa caliente de agitación ISOTEMP™ y baño de agua (Fisher Scientific). La HbCO encapsulada por glóbulos rojos y Ngb-H64Q oxigenada o desoxigenada se equilibraron a 25 °C o 37 °C en viales de vidrio separados. Se inició la reacción inyectando Ngb-H64Q en la solución de glóbulos rojos para una concentración final de 40 pM de ambas proteínas. Se inyectó un volumen equivalente de PBS (con o sin ditionito) en una muestra de control de glóbulos rojos carboxilados. Periódicamente, se recogieron y centrifugaron 0,5 ml de la reacción y de la muestra de control durante 30-60 segundos a 5000 x g en tubos de microcentrifugación de 1,5 ml. Se retiró el sobrenadante que contenía Ngb-H64Q (se añadieron 5 mM de ditionito de sodio en experimentos aeróbicos para evitar la autooxidación de la proteína) y se almacenó sobre hielo.
Se añadió una solución de NP40 al 0,5 % en PBS (siempre que contenía 5 mM de ditionito de sodio para experimentos anaeróbicos y a veces aeróbicos) a los sedimentos de glóbulos rojos para someter a lisis las células. Se midió la absorbancia de Hb en la solución de glóbulos rojos sometida a lisis con el espectrofotómetro Cary 50 en una cubeta de 1 cm de longitud de trayectoria. Este ciclo se repitió cada 1,5-5 minutos durante un total de seis veces, proporcionando seis mediciones de absorbancia de la Hb. Las muestras de control y reacción se agitaron continuamente. El tiempo en que se midió la absorbancia de hemoglobina en la reacción se asumió que era el tiempo trascurrido después de la inyección de Ngb-H64Q a los 15 o 30 segundos después del inicio de la centrifugación (durante duraciones de centrifugación de 30 o 60 segundos, respectivamente). Después de medir el último (6°) punto de tiempo, también se registró la absorbancia de las muestras de sobrenadante almacenado de las mezclas de reacción y control. En algunos experimentos, los glóbulos rojos no se separaron de la Ngb-H64Q; en su
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lugar, se registró la absorbancia de la mezcla completa con la unión de esfera integrante de un espectrómetro de Cary 100. Esta configuración recoge luz dispersa por los glóbulos rojos, proporcionando, de este modo, espectros suficientemente precisos para la desconvolución espectral. El procedimiento para estos experimentos fue el mismo que para la mezcla de Ngb-H64Q con HbCO pura en el Cary 50, después de la preparación de glóbulos rojos carbxilados.
Desconvolución de los mínimos cuadrados
Se obtuvo los espectros de referencia estándar de las formas oxidadas (met), desoxigenadas (desoxi), oxigenadas (O2) y carboxiladas (CO) de hemoglobina (Hb) y neuroglobina H64Q (Ngb-H64Q). Después de descongelar la proteína sobre hielo, se obtuvieron los espectros de la forma oxidada mezclándola con un exceso de ferricianida de potasio y pasándola a través de una columna de desalación ECONO-PAC™ 10DG (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Se registraron los espectros de las especies desoxigenadas después de añadir un exceso de ditionito de sodio a la forma oxidada. Se registraron los espectros de la forma oxigenada inmediatamente después de pasar las especies desoxigenadas a traves de la columna de desalación en condiciones aeróbicas. Los espectros de la forma carboxilada se midieron después de mezclas las especies oxigenadas con tampón saturado con CO en una relación de 1:4. Se recogieron todos los espectros estándar a 20 °C, 25 °C y 37 °C en el espectrofotómetro Cary 50.
Se realizó la desconvolución de los espectros experimentales con una rutina de ajuste de mínimos cuadrados en una Excel de Microsoft. Puesto que el cambio en absorbancia de los experimentos cinéticos no es bueno, todos los espectros compuestos de tanto Hb como Ngb-H64Q se ajustaron siempre entre 450 y 700 nm, 490 y 650 nm y 510 y 600 nm, con y sin restringir la Hb y Ngb-H64Q a concentraciones que fueran iguales entre sí, para confirmar la precisión de la desconvolución. Se desconvolucionaron los espectros de absorbancia a partir de experimentos anaeróbicos usando estándares carboxilados y desoxigenados de Hb y Ngb-H64Q. Se desconvolucionaron los espectros de absorbancia a partir de experimentos aeróbicos usando los estándares de las fomas oxidadas, carboxiladas y oxigenadas de Hb y Ngb-H64Q. Para los experimentos de glóbulos rojos en los que la Hb se separó de la Ngb-H64Q y el ditionito de añadió a continuación a los glóbulos rojos en experimentos aeróbicos o al sobrenadante en experimentos anaeróbicos, se usaron estándares desoxigenados en la desconvolución en lugar de las formas oxigenadas y oxidadas. Antes de desconvolucionar los espectros recogidos con el espectrómetro de flujo detenido y a veces aquellos con el HP8453, los valores de absorbancia se remapearon a las mismas longitudes de onda que los usados por el espectrofotómetro Cary 50 usando la función interp1 de MATLAB™, empleando interpolación de hermite cúbica por piezas.
Resultados
Se estudió la reacción de los glóbulos rojos (RBC) carboxilados con tampón o una solución de desoxi H64Q neuroglobina (FIG. 1). Cuando se mezclaron los RBC con tampón, no se apreció la aparición de ningún cambio en la relación de la HbCO (FIG. 1, panel izquierdo). Cuando se mezclaron las células con el mutante desoxiNgb, se retiró todo el CO de los RBC a los aproximadamente 15 minutos. Los cambios en la fracción de neuroglobina son coherentes con una transferencia de CO de Hb a Ngb.
Se muestra otro experimento con condiciones similares en la FIG. 2. La reacción se completó en justo a los 10 minutos, coherente con los resultados previos mostrados en la FIG. 1.
Además, Se evaluó la reacción de los glóbulos rojos carboxilados con oxi H64Q neuroglobina (FIG. 3). Tal como se observó en la desoxiNgb, la forma oxigenada también es capaz de limpiar CO de los glóbulos rojos a una velocidad incluso más rápida que la observada en el experimento previo. El proceso se completa en menos de 5 segundos. Los cambios en la fracción de neuroglobina son coherentes con una transferencia de CO de Hb a Ngb.
En conjunto, estos resultados indican que la neuroglobina es capaz de retirar CO de hemoglobina carboxilada que está ubicada dentro de glóbulos rojos (por todo el compartimento) a los 5-10 minutos, una escala de tiempo adecuada para el tratamiento clínico.
Ejemplo 2: Índices de autooxidación para neuroglobinas de TS y mutantes
Los complejos de dioxígeno férreo en las proteínas hemo tienen índices intrínsecos de autooxidación, en los que la molécula de oxígeno puede tomar un electrón del hierro hemo para formar hemo oxidado y un radical de superóxido:
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La autooxidación es una reacción secundaria que puede ser perjudicial para las aplicaciones de neuroglobina previstas (por ejemplo, unión y retiración de CO de la hemoglobina). A efectos del tratamiento de la
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carboxihemoglobinemia, se infunde neuroglobina como un complejo de dioxígeno férreo (forma oxi, Fe2+-O2) que es capaz de: i) unir CO y ii) suministrar oxígeno a los tejidos. La oxidación de la oxineuroglobina lleva a la formación de la forma férrea (forma met, Fe3+) que no puede cumplir ninguna de las dos funciones mencionadas anteriormente. La reacción también forma la especie de superóxido de radical (O2^) que causaría un estrés oxidativo aumentado.
Se determinaron los índices de autooxidación para varios mutantes His64 de neuroglobina de tipo silvestre y se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2. Índices de autooxidación para neuroglobina de tipo silvestre y mutantes
Kox (min-1) t% (min)
Neuroglobina humana, tipo silvestre
0,230 % 0,030 3,0
Neuroglobina humana, H64W
0,076 ± 0,006 9,1
Neuroglobina humana, H64A
0,066 ± 0,005 10,5
Neuroglobina humana, H64L
0,010 ± 0,004 69,3
Neuroglobina humana, H64Q
0,010 ± 0,002 69,3
Los valores se determinaron a 37 °C en 100 mM de fosfato de sodio, pH 7,4. ty2; semivida calculada del complejo de dioxígeno férreo.
La neuroglobina de tipo silvestre tiene un rápido índice de autooxidación; la mitad de cualquier complejo de dioxígeno férreo existente se oxida cada 3 minutos. Sin embargo, los mutantes de neuroglobina h64L y H64Q tienen índices de autooxidación 23 veces más lentos que la proteína de tipo silvestre. Basándose en estos hallazgos, se seleccionó el mutante H64Q para los estudios in vivo descritos en el Ejemplo 3.
Ejemplo 3: La neuroglobina H64Q recombinante es un antídoto para la carboxihemoglobinemia in vivo
Este ejemplo demuestra que la administración de una molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad limpia de forma eficaz HbCO de la sangre de ratones expuestos a CO y, por lo tanto, representa un antídoto para la carboxihemoglobinemia y/o intoxicación por monóxido de carbono. En los experimentos descritos a continuación, se retira CO de los glóbulos rojos después de una infusión de cinco minutos de neuroglobina H64Q mutante recombinante. La neuroglobina mutante H64Q que se usa en los estudios a continuación también contiene mutaciones en tres restos de cisteína (C46G/C55S/C120S).
En los siguientes experimentos, se administró neuroglobina H64Q en una dosificación que variaba entre 13,6 y 27,2 mg (4-8 mM). El volumen en sangre en humanos es aproximadamente 5000 veces superior, por lo tanto, este intervalo de dosificación es equivalente al intervalo de dosificación humana de 68-136 gramos.
La capacidad de la neuroglobina H64Q recombinante de retirar HbCO de la sangre in vivo se evaluó en ratones expuestos a CO. Los ratones se expusieron a 1500 ppm de CO durante 60-70 minutos, El Co se detuvo a continuación y se infundió o bien PBS (200 pl) o neuroglobina H64Q concentrada (200 pl) durante 5 minutos (PBS - FIG. 4; neuroglobina H64Q - FIG. 6) o 10 minutos (neuroglobina H64Q - FIG. 5). Se extrajeron muestras de sangre (aproximadamente 10 pl) cada 5-10 minutos, los glóbulos rojos se lavaron, se sometieron a lisis y se redujeron químicamente con ditionito y se controlaron para su HbCO y NgbCO. Este ensayo muestra la cantidad de CO que hay en el glóbulo rojo antes y después de la infusión de H64Q NgB in vivo. Como se muestra en las Figuras 5 y 6, la infusión de neuroglobina h64Q retira rápidamente HbCO de la sangre dentro del período de infusión de 5 o 10 minutos.
La caída en concentración de HbCO en sangre de ratones expuestos a CO después de una infusión de cinco minutos de PBS o neuroglobina H64Q se muestra en las FIG. 7A y 7B. La FIG. 7A muestra los niveles de HbCO absolutos durante el tiempo y la FIG. 7B muestra el cambio relativo en el nivel de HbCO durante el tiempo. Los resultados que se muestran en estas figuras demuestran claramente que la infusión de neuroglobina H64Q lleva a una limpieza más rápida de HbCO en la sangre y un cambio relativo superior de HbCO con el tiempo, que la infusión con PBS. De manera similar, La FIG. 8 muestra que la infusión de H64Q durante 5 o 10 minutos lleva a un porcentaje superior de caída de HbCO en comparación con la infusión de pBS para el mismo período de tiempo.
Para confirmar que la neuroglobina se limpia como NgbCO en la orina de ratones infundidos, se determinó la absorbancia de orina a partir de las vejigas de ratones sacrificados aproximadamente 75 minutos después de la finalización de la exposición a CO. Los resultados se presentan en la FIG. 9A. Las tres trazas superiores muestran la absorbancia debido a la neuroglobina, que incluye del 82 al 91 % de NgbCO. Las trazas inferiores indican la absorbancia que no es atribuible a Ngb. Además, se confirmó la presencia de NgbCO en la orina de ratones expuestos a CO mediante la presencia de orina con color rojo en estos ratones (véase jeringa en la FIG. 9B).
En vista de las muchas realizaciones posibles a las que pueden aplicarse los principios de la invención desvelada, debe reconocerse que las realizaciones ilustradas son únicamente ejemplos preferentes de la invención y no deben entenderse como que limitan el alcance de la invención. En su lugar, el alcance de la invención se define por las siguientes reivindicaciones.
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> UNIVERSIDAD DE PITTSBURGH - DEL SISTEMA DE LA COMMONWEALTH DE EDUCACIÓN SUPERIOR
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE CARBOXIHEMOGLOBINEMIA
<130> SMW/FP7148364
<140> 14769521,7 <141 > 11/03/2014
<150> PCT/US2014/023180 <151 > 11/03/2014
<150> US 61/799,155 <151 > 15/03/2013
<150> US 61/834,035 <151 > 12/06/2013
<160> 6
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens
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Met Glu Arg Pro Glu Pro Glu Leu lie Arg Gln Ser Trp Arg Ala Val 15 10 15

Ser Arg Ser Pro Leu Glu His Gly Thr Val Leu Phe Ala Arg Leu Phe 20 25 30

Ala Leu Glu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Phe Gln Tyr Asn Cys Arg Gln 35 40 45

Phe Ser Ser Pro Glu Asp Cys Leu Ser Ser Pro Glu Phe Leu Asp His 50 55 60

lie Arg Lys Val Met Leu Val lie Asp Ala Ala Val Thr Asn Val Glu 65 70 75 80

Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Gly Arg Lys His 85 90 95

Arg Ala Val Gly Val Lys Leu Ser Ser Phe Ser Thr Val Gly Glu Ser 100 105 110

Leu Leu Tyr Met Leu Glu Lys Cys Leu Gly Pro Ala Phe Thr Pro Ala 115 120 125

Thr Arg Ala Ala Trp Ser Gln Leu Tyr Gly Ala Val Val Gln Ala Met 130 135 140

Ser Arg Gly Trp Asp Gly Glu 145 150
<210>2 <211 > 151 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Polipéptido recombinante <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46)
<223> Xaa = Cys o Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55)
<223> Xaa = Cys o Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64)
<223> Xaa = Gln, Leu, Ala, Trp
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<221 > MISC_FEATURE <222> (120)..(120) <223> Xaa = Cys o Ser
<400>2
imagen3
Ala Val 15
Leu Phe Arg Gln Asp Xaa
Val Glu 80
Lys His 95
Glu Ser
Pro Ala
Ala Met
<210>3 <211 > 151 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Polipéptido recombinante <400> 3
imagen4
<210>4 <211 > 190 5 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4

Met Glu Lys Val Pro Gly Glu Met Glu lie Glu Arg Arg Glu Arg Ser 15 10 15
Glu Glu Leu Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Val Gln Ala Met Trp Ala

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Arg Leu Tyr Ala Asn Cys Glu Asp Val Gly Val Ala lie Leu Val Arg 35 40 45

Phe Phe Val Asn Phe Pro Ser Ala Lys Gln Tyr Phe Ser Gln Phe Lys 50 55 60

His Met Glu Asp Pro Leu Glu Met Glu Arg Ser Pro Gln Leu Arg Lys 65 70 75 80

His Ala Cys Arg Val Met Gly Ala Leu Asn Thr Val Val Glu Asn Leu 85 90 95

His Asp Pro Asp Lys Val Ser Ser Val Leu Ala Leu Val Gly Lys Ala 100 105 110

His Ala Leu Lys His Lys Val Glu Pro Val Tyr Phe Lys lie Leu Ser 115 120 125

Gly Val lie Leu Glu Val Val Ala Glu Glu Phe Ala Ser Asp Phe Pro 130 135 140

Pro Glu Thr Gln Arg Ala Trp Ala Lys Leu Arg Gly Leu lie Tyr Ser 145 150 155 160

His Val Thr Ala Ala Tyr Lys Glu Val Gly Trp Val Gln Gln Val Pro 165 170 175

Asn Ala Thr Thr Pro Pro Ala Thr Leu Pro Ser Ser Gly Pro 180 185 190
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Polipéptido recombinante
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<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38)
<223> Xaa = Cys o Ser 15
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<221 > MISC_FEATURE <222> (81)..(81)
<223> Xaa = Gln, Leu, Ala o Trp <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (83)..(83)
<223> Xaa = Cys o Ser
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5 <223> Polipéptido recombinante
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Claims (14)

  1. 5
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    REIVINDICACIONES
    1. Una molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad, para su uso en un método de tratamiento de carboxihemoglobinemia en un sujeto, comprendiendo el método:
    la selección de un sujeto con carboxihemoglobinemia; y
    la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad, en donde la molécula de globina recombinante comprende:
    una neuroglobina recombinante humana con una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W, la numeración correspondiéndose a la SEQ ID NO: 1; o
    una citoglobina recombinante humana con una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W, correspondiendo la numeración a la SEQ ID NO: 4,
    tratando, de este modo, la carboxihemoglobinemia en el sujeto.
  2. 2. Un método in vitro de eliminación de monóxido de carbono de la hemoglobina en sangre o en tejido, que comprende poner en contacto la sangre o el tejido con una molécula de globina recombinante que une monóxido de carbono con alta afinidad, en donde la molécula de globina recombinante comprende:
    una neuroglobina recombinante humana con una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W, correspondiendo la numeración a la SEQ ID NO: 1; o
    una citoglobina recombinante humana con una mutación H81Q, H81A, H81L o H81W, correspondiendo la numeración a la SEQ ID NO: 4,
    eliminando, de este modo, monóxido de carbono de la hemoglobina en sangre o el tejido.
  3. 3. La molécula para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o el método de la reivindicación 2, en donde la neuroglobina recombinante humana comprende adicionalmente una mutación C46G, una mutación C55S, una mutación C120S o cualquier combinación de las mismas.
  4. 4. La molécula para su uso o el método de la reivindicación 3, en donde la neuroglobina recombinante humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
  5. 5. La molécula para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o el método de la reivindicación 2, en donde la citoglobina recombinante humana comprende adicionalmente una mutación C83S, o una mutación C38S, o ambas mutaciones C38S y C83S.
  6. 6. La molécula para su uso o el método de la reivindicación 5, en donde la citoglobina recombinante humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
  7. 7. La molécula para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-6, en donde el sujeto tiene al menos el 3 %, al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 % o al menos el 20 % de carboxihemoglobina en su sangre.
  8. 8. La molécula para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7, en donde el método de molécula de globina recombinante se administra mediante infusión intravenosa.
  9. 9. La molécula para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-8, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de globina recombinante es de aproximadamente 50 a 800 gramos.
  10. 10. Una neuroglobina recombinante humana que comprende una mutación en el resto 64 y que comprende adicionalmente una mutación C46G, una mutación C55S y una mutación C120S, correspondiendo la numeración a la SEQ ID NO: 1.
  11. 11. La neuroglobina recombinante humana de la reivindicación 10, en la que la mutación en el resto 64 es una mutación H64Q, H64L, H64A o H64W.
  12. 12. La neuroglobina recombinante humana de la reivindicación 11, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
  13. 13. Una citoglobina recombinante humana que comprende una mutación H81A o H81L y que comprende adicionalmente una mutación C38S y una mutación C83S, la numeración correspondiéndose a la SEQ ID NO: 4.
  14. 14. Una composición que comprende la neuroglobina o la citoglobina recombinantes humanas de una cualquiera de las reivindicaciones 10-13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
    Porcentaje Porcentaje
    100 % 90% 80% 70% 60% 50% 40 % 30%
    20% 10 % 0%
    0
    FIG. 1A
    imagen1
    rhc CO ' •• •• ctí roe dxi
    •• rhrCO ■
    imagen2
    % Fracciones de glóbulos rojos (Hemoglobina)
    10 20 Tiempo (min)
    30
    FIG. 1B
    imagen3
    Tiempo (min)
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