ES2691723T3 - Formulaciones de quitosán fisiológicas solubles combinadas con plasma rico en plaquetas (PRP) para reparación de tejidos - Google Patents
Formulaciones de quitosán fisiológicas solubles combinadas con plasma rico en plaquetas (PRP) para reparación de tejidos Download PDFInfo
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Abstract
Una composición polimérica activada por coagulación que comprende una mezcla de plasma rico en plaquetas (PRP), un quitosán, un ácido mineral u orgánico, la sal inorgánica NaCl y un activador de la coagulación; en la que dicho PRP es el único producto derivado de sangre en la composición polimérica activada por coagulación; y en la que el activador de la coagulación es una solución de CaCl2, en la que la concentración de CaCl2 es entre 1,3% en p/p a 3% en p/p; en la que el quitosán, el ácido y la sal permiten que el PRP sea activado por el activador de la coagulación para formar un gel de plaquetas o un coágulo de plaquetas; en la que la composición polimérica tiene un pH entre 6,2 y 6,8 y se prepara con una solución de quitosán que tiene una osmolalidad entre 250 mOsm/kg y 600 mOsm/kg; y en la que la composición polimérica activada por coagulación no contiene fosfato de glicerol.
Description
DESCRIPCION
Formulaciones de quitosan fisiologicas solubles combinadas con plasma rico en plaquetas (PRP) para reparation de tejidos 5
[0001] La presente description se refiere a formulaciones de quitosan fisiologicas solubles combinadas con
plasma rico en plaquetas (PRP) para la reparacion de tejidos, que incluye tanto trombina como/o CaCl2 como activador de la coagulation y diferentes procedimientos de mezcla.
10 [0002] El quitosan es un polisacarido lineal compuesto de D-glucosamina (unidad desacetilada) y N-acetil-D-
glucosamina (unidad acetilada) unidas en p-(1-4), que se produce principalmente por la desacetilacion alcalina de la quitina. El quitosan puede existir en muchas conformaciones estructurales, dependiendo de una variedad de factores que incluyen el grado de hidratacion, el entorno de electrolitos y la complejidad de la mezcla original de quitina. El quitosan y sus derivados con amino sustituido son pollmeros cationicos bioerosionables, biocompatibles y 15 biodegradables que se han propuesto para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo ingenierla tisular, suministro de farmacos y genes, formulation farmaceutica, armazones para el crecimiento celular y encapsulation de celulas, cicatrization de heridas y hemostasia superficial.
[0003] Una propiedad bien conocida del quitosan es su solubilidad a pH acido (<6) e insolubilidad a pH 20 neutro, lo que hace que su uso en solution con celulas vivas y tejidos sea problematico. Varias publicaciones
(Chenite, publication de solicitud de patente internacional N° WO 99/07416; Chenite y col., 2000, Biomater., 21: 2155 - 2161; Chenite y col., 2001, Carbohyd. Polym., 46: 39 - 47) describen que mezclar una sal dibasica de poliol- fosfato, es decir, fosfato de glicerol (GP), con una solucion acuosa de quitosan puede aumentar el pH de la solucion mientras se evita la precipitation del pollmero. En presencia de estas sales particulares, las soluciones de quitosan 25 de concentration sustancial (0,5-3%) y alto peso molecular (> varios cientos de kDa) permanecen llquidas, a temperatura ambiente o baja, durante un largo perlodo de tiempo con una region de pH neutro fisiologicamente aceptable entre 6,8 y 7,2. Estas soluciones de quitosan-fosfato de glicerol que pueden gelificar con calentamiento suave (por ejemplo de 4 a 37°C) son biocompatibles, biodegradables y adhesivas para tejidos humanos, proporcionan nuevas oportunidades en el suministro de productos terapeuticos sensibles.
30
[0004] Las propiedades del quitosan le permiten coagular rapidamente la sangre y recientemente han obtenido la aprobacion en EE. UU. para usar en vendajes y otros agentes hemostaticos. El primer paso en el proceso temprano de cicatrizacion de heridas es la hemostasia debida a la coagulacion de la sangre. Un procedimiento para mejorar la cicatrizacion es estabilizar el coagulo de sangre dispersando un pollmero
35 biocompatible soluble por la sangre fresca no coagulada, actuando el pollmero como un armazon en todo el coagulo para mantener su volumen y aumentar la adhesion del coagulo a los tejidos en el sitio de la lesion (Iliescu y col., 2007, Microsc. Res. Tech., 71: 236 - 247). Las soluciones de quitosan-GP son no toxicas y bioreabsorbibles, ademas de permitir la coagulacion e impedir la retraction del coagulo. Se mezclan con sangre autologa para formar mezclas viscosas de quitosan-GP/sangre que solidifican en aproximadamente 10 minutos, en parte debido a la 40 trombogenicidad del quitosan (Hoemann y col., 2007, Osteoarthritis & Cartilage, 15: 78-89).
[0005] El plasma rico en plaquetas (PRP) es un producto derivado de la sangre que concentra un alto numero de plaquetas en un volumen pequeno de plasma. Tiene una funcion sustancial en la regeneration de tejidos y la cicatrizacion de heridas. En algunas aplicaciones, las plaquetas se han usado directamente sin ser formuladas. En
45 otras aplicaciones, se ha usado un gel de plaquetas (tambien conocido como coagulo de plaquetas) que se preparo a partir de PRP. El termino "gel de plaquetas" se introdujo para describir el producto maleable similar a la gelatina que se produce cuando se anaden trombina y calcio al PRP. La adicion de trombina y calcio induce la escision del fibrinogeno para formar fibrina que polimeriza, produciendo un gel similar al pegamento. Las plaquetas atrapadas en el gel se activan y liberan moleculas bioactivas. En la mayorla de los estudios y aplicaciones cllnicas para la 50 reparacion de tejidos, se uso una solucion de trombina/cloruro de calcio para activar plaquetas para hacer que el PRP forme un gel de plaquetas. Por ejemplo: el PRP se coagulo por adicion de una solucion de trombina al 10% (v/v, 1000 U/ml en CaCl2 100 mM) para dar una concentracion final de trombina de 100 U/ml (Akeda y col., 2006, Osteoarthritis and Cartilage, 14: 1272-1280); 200 pl de PRP se trataron con 20 pl de trombina bovina esteril preparada mezclando 25 pl de la enzima (1000 U/ml) en 10 ml de CaCl2 en condiciones esteriles para obtener un 55 coagulo (Ranly y col., 2007, J. Bone Joint Surg. Am., 89: 139 - 147). El PRP tambien se ha activado justo antes de la aplicacion con una solucion de cloruro de calcio al 10% y 5000 unidades de trombina bovina para formar un gel (You y col., 2007, Oral Surg. Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endo., 103: e8-e12).
[0006] En algunos estudios y aplicaciones cllnicas, se uso solo calcio para activar las plaquetas para hacer
que el PRP forme un gel de plaquetas (coagulo). Por ejemplo: se anadio solucion de CaCl2 al 10% en PRP para activar las plaquetas y se formo el gel de plaquetas despues de 10 a 15 minutos (Casati y col, 2007, Int J. Oral Maxillofac. Surg., 36:132-136). Tambien se han usado soluciones de cloruro de calcio solas con diferente concentracion (5%, 10%, 25% y 50%) para inducir la activacion plaquetaria, poniendo de manifiesto que el CaCl2 5 solo era adecuado para producir la activacion del PRP, y que la solucion de cloruro calcico al 5% era la concentracion mas eficaz para activar el PRP para coagular (Fedrico Luengo Gimeno y col., 2006, Thrombosis Journal, 4: 18-25). Los coagulos de PRP tambien se prepararon anadiendo 0,5 ml de cloruro de calcio al 10% a tubos y mezclandolos con PRP. Despues la mezcla se coagulo con injerto de material de injerto oseo (hueso cortical desmineralizado liofilizado humano) (Mendonca y col., 2006, Int. J. Oral Maxillofac. Surg., 35: 88-91). La publication 10 de solicitud de patente internacional N° WO 96/23039 describe un nuevo tipo de agentes adhesivos hemostaticos. Estos agentes se prepararon a partir de concentrado de PRP en combination con pollmeros biocompatibles fisiologicamente aceptables, que inclulan alginatos, poli-L-aminoacidos (poli-L lisina, poli-L-histidina y poli-a-D-acido glutamico), quitosan y quitina. En presencia de iones calcio, la combinacion de concentrado de plasma con pollmeros formaba adhesivos que tenlan propiedades adhesivas fuertes e inicio muy rapido de estas propiedades 15 adhesivas.
[0007] Todavla es necesaria una formulation de pollmero mejorada con una solubilidad mejorada a pH y fuerza ionica fisiologicos que se pueda mezclar con PRP para formar un implante hlbrido de pollmero/PRP. Existe una necesidad especlfica de un implante hlbrido de pollmero/PRP con buenas propiedades mecanicas que se
20 pueda obtener mediante un procedimiento de preparation simple.
[0008] El documento WO 2006/015178 describe un sistema de encapsulation de factor de crecimiento para la potenciacion de la formacion de hueso.
25 [0009] El documento WO 2008/064487 describe un procedimiento para la solidification in situ de
composiciones de sangre-pollmero para aplicaciones de medicina regenerativa y reparation de cartllagos.
[0010] Chang y col., BioMedical Engineering, Vol. 21(2), Abril 2009, paginas 15-122, describen la evaluation de materiales compuestos de microesferas de quitosan/CaSO4/plasma rico en plaquetas como material de
30 osteogenesis alveolar.
[0011] Hoemann y col., J. Bone and Joint Surgery, Vol. 87, Diciembre 2005, paginas 2671-2686, describen que los implantes de quitosan-fosfato de glicerol/sangre mejoran la reparacion de cartllago hialino en defectos de microfracturas ovinas.
35
[0012] Qin y col., Carbohydrate Polymers, Vol. 63(3), 3 de Marzo 2006, paginas 367-374, describen la solubilidad en agua del quitosan y su actividad antimicrobiana.
RESUMEN
40
[0013] De acuerdo con la presente description, ahora se proporciona una composition polimerica que activa la coagulation para usar en la reparacion de tejido de un paciente, que comprende plasma rico en plaquetas (PRP), un quitosan, una sal y un activador de la coagulacion.
45 [0014] De acuerdo con un primer aspecto, la presente solicitud proporciona una composicion polimerica
activada por coagulacion que comprende plasma rico en plaquetas (PRP), un quitosan, una sal y un activador de la coagulacion. En una realizacion, la sal puede ser una sal organica o inorganica. En una realizacion, la sal inorganica es sal de sodio, sal de cloruro, sal de potasio, sal de calcio, sal de magnesio, sal de fosfato, sal de sulfato y/o sal de carboxilato. En otra realization, la sal inorganica es al menos una de NaCl, KCl, CsCl, CaCl2, CsF, KClO4 NaNO3 y/o 50 CaSO4. En otra realizacion, la sal organica es fosfato de glicerol (tal como pGP). En una realizacion adicional, el activador de la coagulacion es una solucion de CaCl2 (que tiene, por ejemplo, una concentracion igual o mayor que aproximadamente 1,0% en p/p e igual o menor que aproximadamente 25% en p/p o igual o mayor que aproximadamente 1,3% en p/p e igual o menor que aproximadamente el 3%) que se puede combinar opcionalmente con trombina. En otra realizacion mas, el pollmero se puede preparar combinando dicho PRP con una solucion de 55 quitosan que comprende dicho quitosan y dicha sal en una relation en volumen igual o menor que aproximadamente 3:1 o aproximadamente 2:1 en v/v. En otra realizacion mas, el pollmero se puede preparar combinando dicho PRP con una solucion de quitosan que comprende dicho quitosan y dicha sal en una relacion en volumen igual o menor que 4:1 e igual o menor que 1:1. En una realizacion, la composicion polimerica tiene un pH igual o mayor que aproximadamente 6,2 e igual o menor que aproximadamente 6,8. En otra realizacion mas, el pollmero se prepara
con una solucion de dicho quitosan que tiene una osmolalidad igual o mayor que aproximadamente 250 mOsm/kg e igual o menor que aproximadamente 600 mOsm/kg o una osmolalidad igual o mayor que aproximadamente 342 mOsm/kg e igual a o menor que aproximadamente 361 mOsm/kg. En una realizacion, el pollmero se prepara con una solucion de dicho quitosan que tiene una concentracion de quitosan igual o mayor que aproximadamente 1,0% 5 en p/p e igual o menor que aproximadamente 10% en p/p o una concentracion de quitosan es igual o mayor que aproximadamente 1,62% en p/p e igual o menor que aproximadamente 2% en p/p. En otra realizacion, el quitosan tiene un grado de desacetilacion (DDA) igual o mayor que aproximadamente 20% e igual o menor que aproximadamente 100% (tal como, por ejemplo, aproximadamente 76% o aproximadamente 81%). En otra realizacion, el quitosan tiene un peso molecular medio en numero (Mn) igual o mayor que aproximadamente 1 kDa e 10 igual o menor que aproximadamente 10 MDa (tal como, por ejemplo, aproximadamente 232 kDa o aproximadamente 298 kDa). En otra realizacion mas, el pollmero comprende ademas un acido mineral o un acido organico, que incluye, pero no se limita a acido clorhldrico, acido acetico, acido nltrico, acido fosforico, acido sulfurico, acido borico, acido fluorhldrico, acido fluorhldrico y/o acido bromhldrico.
15 [0015] De acuerdo con un segundo aspecto, la presente solicitud proporciona una composition polimerica
activada por coagulation preparada combinando plasma rico en plaquetas (PRP), una solucion de quitosan, una solucion de sal y una solucion de activador de la coagulacion. En esta composicion polimerica, la concentracion de quitosan en dicha solucion de quitosan es igual o mayor que aproximadamente 1,0% en p/p e igual o menor que aproximadamente 10% en p/p, y la relation en volumen entre el PRP y la solucion de quitosan es entre 20 aproximadamente 4:1 a aproximadamente 1:1. En una realizacion, la composicion polimerica tambien se puede obtener combinando un acido mineral o un acido organico (tal como, por ejemplo, el acido mineral es acido clorhldrico, acido acetico, acido nltrico, acido fosforico, acido sulfurico, acido borico, acido fluorhldrico y/o acido bromhldrico). En una realizacion adicional, la solucion de sal comprende una sal inorganica, que incluye, pero no se limita a sal de sodio, sal de cloro, sal de potasio, sal de calcio, sal de magnesio, sal de fosfato, sal de sulfato y/o sal 25 de carboxilato (tal como, por ejemplo, NaCl, KCl, CsCl, CaCh, CsF, KClO4, NaNO3 y/o CaSO4). En otra realizacion, la solucion de sal comprende una sal organica, tal como, por ejemplo, fosfato de glicerol (o pGP). En otra realizacion mas, la solucion de activador de la coagulacion comprende trombina en una concentracion de aproximadamente 100 U/ml a aproximadamente 1000 U/ml diluido en un 10% en p/p de una solucion de CaCl2. En otra realizacion, el activador de la coagulacion es una solucion de CaCl2 opcionalmente combinada con trombina. En otra realizacion, la 30 relacion en volumen entre una primera solucion que comprende el PRP, la solucion de quitosan y la sal y una segunda solucion que comprende el activador de la coagulacion es igual o menor que aproximadamente 10:1, o aproximadamente 9:1. En otra realizacion, la concentracion de CaCl2 en la solucion de CaCh es igual o mayor que aproximadamente 1,0% en p/p e igual o menor que aproximadamente 25% en p/p o igual o mayor que aproximadamente 1,3% en p/p e igual o menor que aproximadamente 3% en p/p. En otra realizacion mas, la relacion 35 en volumen entre el PRP y la solucion de quitosan es igual o menor que aproximadamente 3:1, aproximadamente 2:1. En otra realizacion mas, la composicion polimerica tiene un pH igual o mayor que aproximadamente 6,2 y es igual o menor que aproximadamente 6,8. En una realizacion adicional, la solucion de quitosan tiene una osmolalidad igual o mayor que aproximadamente 250 mOsm/kg e igual o menor que aproximadamente 600 mOsm/kg o igual o mayor que aproximadamente 342 mOsm/kg e igual o menor que aproximadamente 361 mOsm/kg. En otra 40 realizacion mas, la concentracion de quitosan en dicha solucion de quitosan es igual o mayor que aproximadamente 1,62% en p/p e igual o menor que aproximadamente 2% en p/p. En otra realizacion mas, el quitosan de dicha solucion de quitosan tiene un grado de desacetilacion (DDA) igual o mayor que aproximadamente 20% e igual o menor que aproximadamente 100% (tal como, por ejemplo, aproximadamente 76% o aproximadamente 81%). En otra realizacion mas, el quitosan de la solucion de quitosan tiene un peso molecular medio en numero (Mn) igual o 45 mayor que aproximadamente 1 kDa e igual o menor que aproximadamente 10 MDa (tal como, por ejemplo, aproximadamente 232 kDa o aproximadamente 298 kDa).
[0016] En un tercer aspecto, la presente solicitud proporciona un procedimiento para reparar un tejido de un
paciente, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de introducir en dicho tejido una composicion polimerica 50 activada por coagulacion tal como se define en este documento de modo que la composicion se adhiere al tejido y promueve la proliferation celular para reparar el tejido. En una realizacion, el tejido es cartllago, menisco, ligamento, tendon, hueso, piel, cornea, tejidos periodontales, tejidos maxilofaciales, tejidos temporomandibulares, abscesos, tumores resecados y/o ulceras.
55 [0017] En un cuarto aspecto, la presente solicitud proporciona el uso de una composicion polimerica activada
por coagulacion como se define en este documento, para reparar un tejido de un sujeto, en el que la composicion polimerica se adhiere al tejido y promueve la proliferacion celular, as! como el uso de una composicion polimerica activada por coagulacion como se define en este documento en la fabrication de un medicamento para reparar un tejido de un sujeto, en el que la composicion polimerica se adhiere al tejido y promueve la proliferacion celular. En
una realizacion, el tejido es cartliago, menisco, ligamento, tendon, hueso, piel, cornea, tejidos periodontales, tejidos maxilofaciales, tejidos temporomandibulares, abscesos, tumores resecados y/o ulceras.
[0018] En un quinto aspecto, la presente solicitud proporciona un procedimiento para preparar una 5 composicion polimerica activada por coagulacion para reparar tejido en un sujeto. En terminos generales, el
procedimiento comprende disolver de 1,0% en p/p a 10,0% en p/p de quitosan en HCl para proporcionar una mezcla de quitosan-HCl, anadiendo una solucion de NaCl o fosfato de glicerol a la mezcla de quitosan-HCl para proporcionar una mezcla de quitosan-HCl-sal, mezclar plasma rico en plaquetas (PRP) con la mezcla de quitosan- HCl-sal en una relacion de volumen entre aproximadamente 4:1 y aproximadamente 1:1 para proporcionar una 10 mezcla de PRP/quitosan-HCl-sal; y anadir un activador de la coagulacion a la mezcla de PRP/quitosan-HCl-sal en una relacion en volumen de entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 10:1. En una realizacion, el activador de la coagulacion es una solucion de CaCh opcionalmente combinada con trombina. En otra realizacion, en la etapa a), en la que el quitosan se disuelve en HCl calentando a una temperatura de aproximadamente 60°C durante aproximadamente 2 horas. En otra realizacion mas, el quitosan se proporciona en una solucion de aproximadamente 15 1,62% en p/p. En otra realizacion mas, el quitosan tiene un grado de desacetilacion (DDA) de aproximadamente 76% o de aproximadamente 81%. En otra realizacion mas, el quitosan tiene un peso molecular medio en numero (Mn) de aproximadamente 232 kDa o de aproximadamente 298 kDa. En otra realizacion mas, el acido clorhldrico se proporciona como una solucion 38 mM o como una solucion 71 mM. En una realizacion, el NaCl se proporciona como una solucion 150 mM o como una solucion 160 mM. En una realizacion, el (3-fosfato de glicerol se proporciona 20 como una solucion al 2,15% en p/p. En otra realizacion, la concentracion de CaCh en la solucion de CaCh es igual o mayor que aproximadamente 1,0 en p/p e igual o menor que aproximadamente 25% en p/p. En otra realizacion mas, la trombina se proporciona como una solucion de aproximadamente 100 U/ml a aproximadamente 1000 U/ml diluida con 10% en p/p de la solucion de CaCl2. En otra realizacion mas, el activador de la coagulacion se pone en una capa sobre la mezcla de PRP/quitosan-HCl-sal. En otra realizacion mas, el activador de la coagulacion se mezcla 25 suavemente por inversion con la mezcla de PRP/quitosan-HCl-sal.
[0019] Por consiguiente, se proporciona una composicion polimerica activada por coagulacion que comprende plasma rico en plaquetas (PRP), una solucion de quitosan, una sal y un activador de la coagulacion.
30 [0020] En una realizacion, la sal es una sal organica o inorganica. La sal inorganica puede ser sal de sodio,
sal de cloruro, sal de potasio, sal de calcio, sal de magnesio, sal de fosfato, sal de sulfato o sal de carboxilato. Alternativamente, la sal es al menos una de NaCl, KCl, CsCl, CaCl2, CsF, KClO4 NaNO3 o CaSO4. Ademas, la sal organica puede ser fosfato de glicerol.
35 [0021] En otra realizacion, el activador es al menos uno de una solucion de CaCl2 o una mezcla de
trombina/CaCl2.
[0022] En una realizacion adicional, la relacion de mezcla de PRP/quitosan-sal y activador es como maximo 10:1, o como maximo 9:1 de una relacion en volumen.
40
[0023] En una realizacion adicional, la concentracion del activador CaCl2 es entre 1,0% en p/p y 25% en p/p, alternativamente entre 1,3% en p/p y 3% en p/p.
[0024] En otra realizacion, la relacion de mezcla de PRP:quitosan es de 4:1 a 1:1 en v/v, alternativamente 45 3:1, o 2:1 en v/v.
[0025] En una realizacion adicional, la composicion tiene un pH entre 6,2 y 6,8.
[0026] En otra realizacion, la solucion de quitosan tiene una osmolalidad entre 250 mOsm/kg y 600 mOsm/kg, 50 alternativamente entre 342 mOsm/kg y 361 mOsm/kg.
[0027] En una realizacion adicional, la concentracion de quitosan en la solucion de quitosan esta entre aproximadamente 1,0% en p/p a 10% en p/p, mas particularmente entre aproximadamente 1,62% en p/p a 2% en
p/p.
55
[0028] En otra realizacion, el quitosan de dicha solucion de quitosan tiene un grado de desacetilacion (DDA) entre 20% y 100%, mas particularmente de 76% u 81%.
[0029] En otra realizacion, el quitosan de la solucion de quitosan tiene un peso molecular medio en numero
(Mn) en el intervalo de 1 kDa a 10 MDa, mas particularmente de 232 kDa o 298 kDa.
[0030] En una realizacion adicional, la composicion descrita en este documento comprende ademas un acido mineral o un acido organico, tal como, por ejemplo, acido clorhldrico, acido acetico, acido nltrico, acido fosforico,
5 acido sulfurico, acido borico, acido fluorhldrico o acido bromhldrico.
[0031] Tambien se proporciona en este documento una composicion polimerica activada por coagulacion preparada combinando plasma rico en plaquetas (PRP), una solucion de quitosan, una sal y un activador; en la que la concentracion de quitosan en la solucion de quitosan es entre aproximadamente 1,0% en p/p y 10% en p/p; y la
10 relacion PRP:quitosan es de 4:1 a 1:1 en v/v.
[0032] En una realizacion, el activador es trombina de 100 U/ml a 1000 U/ml diluido con 10% en p/p de CaCl2.
15 [0033] Tambien se proporciona un procedimiento para reparar un tejido de un paciente, comprendiendo el
procedimiento la etapa de introducir en el tejido una composicion polimerica como se define en este documento de modo que la composicion se adhiere al tejido y promueve la proliferacion celular para reparar el tejido.
[0034] En una realizacion, el tejido puede ser cartllago, menisco, ligamento, tendon, hueso, piel, cornea, 20 tejidos periodontales, tejidos maxilofaciales, tejidos temporomandibulares, abscesos, tumores resecados y/o ulceras.
[0035] Tambien se proporciona en este documento el uso de una composicion polimerica como se define en este documento para reparar un tejido de un sujeto, y/o en la fabricacion de un medicamento para reparar un tejido de un sujeto, en la que la composicion polimerica se adhiere al tejido y promueve la proliferacion celular.
25
[0036] Se proporciona ademas en este documento un procedimiento para preparar una composicion polimerica para reparar tejido en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa de disolver de 1,0% en p/p a 10,0% en p/p de quitosan en HCl; anadir una solucion de NaCl o fosfato de glicerol a la mezcla de quitosan-HCl; mezclar plasma rico en plaquetas (PRP) con la mezcla de quitosan-HCl-NaCl o quitosan-HCl-pGP en una relacion
30 entre 4:1 y 1:1 en v/v; y anadir un activador a la mezcla de PRP/quitosan-HCl-NaCl o fosfato de glicerol en una relacion como maximo de 5:1 a 10:1 en v/v.
[0037] En una realizacion, el quitosan se disuelve en HCl calentando a 60°C durante aproximadamente 2 horas.
35
[0038] En otra realizacion, la composicion comprende 1,62% en p/p de quitosan con un grado de desacetilacion (DDA) de 76% u 81% con un peso molecular medio numerico (Mn) de 232 kDa o 298 kDa, acido clorhldrico 38 mM o 71 mM, y NaCl 150 mM o 160 mM, o 2,15% en p/p de fosfato de p-glicerol.
40 [0039] En una realizacion adicional, el activador se pone en una capa en la parte superior de la mezcla de
PRP/quitosan-HCl-NaCl o quitosan-HCl-pGP.
[0040] En otra realizacion, el activador se mezcla suavemente por inversion con la mezcla de PRP/quitosan- HCl-NaCl o quitosan-HCl-pGP.
45
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0041] Ahora se hara referencia a los dibujos que acompanan.
50 La figura 1 es un histograma que refleja el tiempo de coagulacion de coagulos-1 de PRP/quitosan (PRP/quitosan- HCl-NaCl pH 6,6) preparados con trombina/activador CaCl2 por diferentes procedimientos de mezcla. El procedimiento de mezcla 1 era la inversion suave, el procedimiento de mezcla 2 era extraccion en una jeringa sin inversion y el procedimiento de mezcla 3 era poner en una capa.
55 La figura 2 es un histograma que refleja el tiempo de coagulacion de coagulos-2 de PRP/quitosan (PRP/quitosan- HCl-pGP pH 6,6) preparado con trombina/activador CaCl2 por diferentes procedimientos de mezcla. El procedimiento de mezcla 1 era la inversion suave, el procedimiento de mezcla 2 era extraccion en una jeringa sin inversion y el procedimiento de mezcla 3 era poner en una capa.
La figura 3 es un histograma que refleja la resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan (PRP/quitosan-HCl- NaCI pH 6,6 o PRP/quitosan-HCl-pGP pH 6,6) preparados con trombina/activador CaCh por diferentes procedimientos de mezcla. El procedimiento de mezcla 1 era la inversion suave, el procedimiento de mezcla 2 era extraccion en una jeringa sin inversion y el procedimiento de mezcla 3 era poner en una capa.
5
La figura 4 corresponde a representaciones fotograficas de coagulos de PRP/quitosan en los tubos de vidrio (A, C, E, G, I, K) y despues de sacarlos de los tubos (B, D, F, H, J, L) en la que los numeros de muestra son: 1-1 (con NaCl, procedimiento de mezcla 1); 1-2 (con NaCl, procedimiento de mezcla 2); 1-3 (con NaCl, procedimiento de mezcla 3); 2-1 (con pGP, procedimiento de mezcla 1); 2-2 (con pGP, procedimiento de mezcla 2); 2-3 (con pGP, 10 procedimiento de mezcla 3).
La figura 5 corresponde a representaciones fotograficas de pruebas de fluidez de mezclas de PRP/quitosan no activadas para evaluar las propiedades de manipulacion en diferentes momentos despues de la mezcla (A: 30 segundos; B: 1 min; C: 2 min; D: 3 min; E: 5 minutos, y F: 10 minutos); en la que los numeros de muestra son de 15 izquierda a derecha: 1-1 (con NaCl, relacion de mezcla: 3:1); 1-2 (con NaCl, relacion de mezcla: 2:1); 2-1 (con pGP, relacion de mezcla: 3:1); 2-2 (con pGP, relacion de mezcla: 2:1); Control (PRP puro).
La figura 6 es un histograma que refleja el tiempo de coagulacion de mezclas de PRP/quitosan no activadas (PRP/quitosan-HCl-NaCl pH 6,6 o PRP/quitosan-HCl-pGP pH 6,6) con diferentes relaciones de mezcla.
20
La figura 7 corresponde a representaciones fotograficas de coagulos de PRP/quitosan no activados con diferentes relaciones de mezcla en los tubos de vidrio (A, D, G, J), despues de sacarlos de los tubos (B, E, H, K) y despues de prueba de resistencia mecanica ( C, F, I, L) en la que los numeros de muestra son: 1-1 (con NaCl, relacion de mezcla 3:1); 1-2 (con NaCl, relacion de mezcla 2:1); 2-1 (con pGP, relacion de mezcla 3:1); 2-2 (con pGP, relacion 25 de mezcla 2:1).
La figura 8 es un histograma que refleja la resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan no activados en la que los numeros de muestra son: 1-1 (con NaCl, relacion de mezcla: 3:1); 1-2 (con NaCl, relacion de mezcla: 2:1); 21 (con pGP, relacion de mezcla: 3:1); 2-2 (con pGP, relacion de mezcla: 2:1).
30
La figura 9 es un histograma que refleja el tiempo de coagulacion de mezclas de PRP/quitosan-HCl-NaCl a pH 6,6 con diferentes concentraciones de quitosan y CaCl2 y con diferentes relaciones de mezcla donde los numeros de muestra son: 1-1 (CaCl2 al 1,3%, relacion de mezcla 3:1, quitosan al 1,62%); 1-2 (CaCl2 al 1,3%, relacion de mezcla 3:1, 2% de quitosan); 1-3 (CaCl2 al 1,3%, relacion de mezcla 2:1, 1,62% de quitosan); 1-4 (CaCl2 al 1,3%, relacion 35 de mezcla 2:1, quitosan al 2%); 2-1 (CaCl2 al 3%, relacion de mezcla 3:1, quitosan al 1,62%); 2-2 (CaCl2 al 3%, relacion de mezcla 3:1, quitosan al 2%); 2-3 (CaCl2 al 3%, relacion de mezcla 2:1, quitosan al 1,62%); 2-4 (CaCl2 al 3%, relacion de mezcla 2:1, quitosan al 2%).
La figura 10 es un histograma que refleja la resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl a pH 6,6 40 con diferentes concentraciones de quitosan y CaCl2 y en diferentes relaciones de mezcla en la que los numeros de muestra son: 1-1 (CaCl2 al 1,3%, relacion de mezcla 3:1, quitosan al 1,62%); 1-2 (CaCl2 al 1,3%, relacion de mezcla 3:1, quitosan al 2%); 1-3 (CaCl2 al 1,3%, relacion de mezcla 2:1, quitosan al 1,62%); 1-4 (CaCl2 al 1,3%, relacion de mezcla 2:1, quitosan al 2%); 2-1 (CaCh al 3%, relacion de mezcla 3:1, quitosan al 1,62%); 2-2 (CaCh al 3%, relacion de mezcla 3:1, quitosan al 2%); 2-3 (CaCl2 al 3%, relacion de mezcla 2:1, quitosan al 1,62%); 2-4 (CaCl2 al 3%, 45 relacion de mezcla 2:1, quitosan al 2%).
La figura 11 es un histograma que refleja el tiempo de coagulacion de coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl a pH 6,6 o PRP/quitosan-HCl-pGP a pH 6,6 activados por inversion suave con CaCl2 (todos los coagulos son con quitosan al 1,62%, relacion de mezcla 3:1) en la que los numeros de las muestras son: coagulo-1 (CH0100702B: Mn 232 kDa, 50 DDA 81%); coagulo-2 (CH0050602A: Mn 298 kDa, DDA 76%); control (PRP puro).
La figura 12 es un histograma que refleja la resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl a pH 6,6 o PRP/quitosan-HCl-pGP a pH 6,6 activados por inversion suave con CaCl2 (todos los coagulos son con quitosan al 1,62%, relacion de mezcla 3:1) en la que los numeros de muestra son: coagulo-1 (CH0100702B: Mn 232 kDa, DDA 55 81%); coagulo-2 (CH0050602A: Mn 298 kDa, DDA 76%); control (PRP puro).
La figura 13 corresponde a representaciones fotograficas de coagulos de PRP/quitosan activados por inversion suave con CaCl2 (todos los coagulos son con quitosan al 1,62%, relacion de mezcla 3:1) en los tubos de vidrio (A, D, G, J, M), despues de sacarlos de los tubos (B, E, H, K, N) y despues de la prueba de resistencia mecanica (C, F, I, L,
O) en la que los numeros de muestras son: 1-1 (con NaCI; Mn 232 kDa, DDA 81%); 1-2 (con pGP; Mn 232 kDa, DDA 81%); 2-1 (con NaCl; Mn 298 kDa, DDA 76%); 2-2 (con pGP; Mn 298 kDa, DDA 76%); control (PRP puro).
La figura 14 es un histograma que refleja llquido que expulsan los coagulos de PRP/quitosan activados por inversion 5 suave con CaCl2 (todos los coagulos son con quitosan al 1,62%, la relacion de la mezcla 3:1) en la que los numeros de muestra son: coagulo-1 (CH0100702B: Mn 232 kDa, DDA 81%); coagulo-2 (CH0050602A: Mn 298 kDa, DDA 76%); control (PRP puro).
DESCRIPCION DETALLADA
10
[0042] Ahora se proporciona y se describe en esta invencion una nueva formulacion de mezclas de
PRP/quitosan activadas por un activador de la coagulacion (tal como CaCl2 y/o trombina). Dichas formulaciones son utiles para facilitar la reparacion de tejido.
15 [0043] Las composiciones polimericas activadas por coagulacion descritas en este documento pueden de
permitir la formacion de un gel o coagulo de plaquetas. Los otros componentes de la composicion polimerica (tales como quitosan, la sal y, opcionalmente, el acido) permiten que el PRP sea activado con los procedimientos convencionales usando un activador de la coagulacion (tal como CaCl2 y/o la trombina) para formar un gel de plaquetas (o coagulo de plaquetas). Las composiciones polimericas activadas por coagulacion descritas en este 20 documento pueden permitir la formacion de un gel o tipo pasta. Por ejemplo, y como se muestra a continuation, el PRP incluido en la composicion permite la formacion de un gel basado en quitosan.
[0044] Las composiciones polimericas activadas por coagulacion descritas en este documento comprenden un PRP, un quitosan, una sal y un activador de la coagulacion. En una realization, las composiciones activadas por
25 coagulacion descritas en este documento unicamente contienen plasma rico en plaquetas como productos derivados de sangre. En otra realizacion, el PRP es autologo con respecto al receptor de las composiciones, es decir, el PRP se obtiene del mismo individuo que va a recibir la composicion polimerica activada por coagulacion. Sin embargo, el PRP tambien puede ser alogenico para el receptor, es decir, se puede obtener de un individuo que es inmunologicamente distinto del receptor de la composicion polimerica activada por coagulacion, pero donde el 30 individuo y el receptor son de la misma especie. En esta realizacion, el PRP deberla corresponderse preferiblemente (en parte o en total) con al menos uno o varios antlgenos plaquetarios. En otra realizacion, el PRP tambien puede ser xenogenico para el receptor, es decir, obtenido de un individuo que es inmunologicamente distinto del receptor de la composicion polimerica activada por coagulacion y donde el individuo y el receptor no son de la misma especie. En otra realizacion mas, el PRP puede derivar de una fuente humana.
35
[0045] Como se usa en este documento, el activador de la coagulacion es un agente capaz de inducir la coagulacion del PRP y la formacion de un gel de plaquetas a partir de un PRP natural. Dichos activadores de la coagulacion incluyen, pero no se limitan a una solution de CaCl2 y una combination de CaCl2 y trombina.
40 [0046] En una realizacion, el pollmero activado por coagulacion consiste esencialmente en un PRP, un
quitosan, una sal y un activador de la coagulacion. En esta realizacion especlfica, no estan incluidos otros agentes activos que participen en la formacion del gel o coagulo. Sin embargo, se pueden incluir otros componentes como un acido (para facilitar la disolucion del quitosan), conservantes o medicamentos.
45 [0047] Como se define en este documento como procedimiento 1, se uso trombina con la concentration de
1000 U/ml (la trombina se disolvio en solucion de CaCl2 al 10% en p/p) para activar las mezclas de PRP/quitosan, y la relacion de mezcla de mezcla de PRP/quitosan a trombina/solucion de CaCl2 es 9:1 en una relacion en volumen.
[0048] Otro aspecto identificado como procedimiento de mezcla 1, es la formacion de mezclas de 50 PRP/quitosan, donde la trombina/CaCl2 se mezclaba en PRP/quitosan por inversion suave 5 veces del tubo de
mezcla que contiene perlas de acero inoxidable y despues se extrala en una jeringa para ponerlas en tubos de vidrio para preparar el coagulo (implante).
[0049] Otro aspecto mas es proporcionar un nuevo procedimiento identificado como procedimiento de mezcla 55 2 de formacion de mezclas de PRP/quitosan, donde se anadla CaCL/trombina al PRP/quitosan sin inversion y
directamente se extrala en una jeringa para ponerlas en tubos de vidrio para preparar el coagulo (implante).
[0050] Otro aspecto mas de la invencion es proporcionar una nueva formacion de mezclas PRP/quitosan, que se preparan por el procedimiento de mezcla 3, donde la mezcla de PRP/quitosan se ponla en tubos de vidrio y
despues se ponla trombina/solucion de CaCl2, en una capa en la parte superior del PRP/quitosan en el tubo para preparar el coagulo (implante).
[0051] El procedimiento de mezcla 3 era el mejor procedimiento de mezcla para el activador trombina/CaCh, 5 que da como resultado las mejores propiedades de coagulacion, coagulando en un tiempo adecuado, sin retraccion
del coagulo, buenas propiedades mecanicas y buena homogeneidad.
[0052] Otro aspecto mas es proporcionar una nueva formacion de mezclas de PRP/quitosan, que se preparan por el procedimiento de mezcla con jeringa donde mezclas de PRP/quitosan se mezclaban con el activador
10 (trombina/solucion de CaCL: 1.000 U/ml en CaCl2 al 10% (p/p) inicial) usando un sistema de doble jeringa, y despues se transferlan a tubos de vidrio para preparar el coagulo (implante).
[0053] Otro aspecto mas es proporcionar una nueva formacion de mezclas de PRP/quitosan exentas de trombina, que se preparan usando solo solucion de CaCl2 con diferentes concentraciones (de 1,0% en p/p a 25% en
15 p/p) como activador y el procedimiento de mezcla 3, donde la mezcla de PRP/quitosan se ponla en tubos de vidrio y despues solamente solucion de CaCh en una capa en la parte superior del PRP/quitosan para preparar el coagulo (implante).
[0054] Otro aspecto mas de la invention es proporcionar una nueva formulation de mezclas de PRP/quitosan 20 exentas de trombina, que se prepara usando solo la solucion de CaCh con diferentes concentraciones (de 1,0% en
p/p a 25% en p/p) como activador, donde el CaCh se mezclaba en PRP/quitosan por inversion suave 5 veces del tubo de mezcla que contiene perlas de acero inoxidable y despues se extrala en una jeringa para ponerlas en tubos de vidrio para preparar el coagulo (implante).
25 [0055] Otro aspecto mas es proporcionar una nueva formacion de mezclas de PRP/quitosan exentas de
trombina, que se preparan usando solo solucion de CaCl2 con concentration mas baja (de 1,0% en p/p a 5% en p/p) como activador, y usando solucion de quitosan con diferentes concentraciones (de 1,0% en p/p a 10,0% en p/p) mezclada con PRP en diferentes relaciones de mezcla (PRP:quitosan es de 4:1 a 1:1 en relation en volumen).
30 [0056] Por lo tanto, se describe en este documento una nueva formulacion y/o procedimiento para preparar
mezclas de PRP/quitosan con trombina, donde la mezcla de PRP/quitosan se ponla en tubos de vidrio y despues la trombina/solucion de CaCl2 se ponla en una capa en la parte superior del PRP/quitosan en el tubo para preparar el implante (mostrado en el ejemplo 1 a partir de sangre humana). El plasma rico en plaquetas (PRP) se aislo de sangre entera anticoagulada con citrato recien extralda con centrifugation en dos etapas (1300 rpm durante 10 35 minutos y luego 2000 rpm durante 10 minutos). Se mezclaron solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (38 mM)- NaCl (160 mM) a pH de 6,54 y osmolalidad de 361 mOsm/kg, y solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (71 mM)- pGP (2,15% en p/p) a pH 6,65 y osmolalidad de 342 mOsm/kg con PRP. Se pipetearon 900 pl de plasma rico en plaquetas (PRP) en criotubos que contenlan 300 pl de una solucion de quitosan y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 segundos (agitados e invertidos aproximadamente 50 veces 40 energicamente). La relacion de mezcla de PRP a quitosan era 3:1 en relacion en volumen.
[0057] Se transfirieron 300 pl a 3 tubos de vidrio a 37°C usando una jeringa de 1 ml. Inmediatamente, se
anadieron 30 pl de solucion de trombina (1000 U/ml) diluida con solucion esteril de cloruro de calcio al 10% (p/p) (la relacion de mezcla de PRP/quitosan a trombina/CaCl2 es de 10 a 1) sobre la superficie de la mezcla de 45 PRP/quitosan de cada tubo de vidrio para preparar 3 coagulos (implantes). Los resultados de la prueba de tiempos de coagulacion mostraron que las mezclas de PRP/quitosan-HCl-NaCl coagulaban en 6 minutos y la mezcla de PRP/quitosan-HCl-pGP formaba coagulo en 8 minutos en el tubo de vidrio (vease la tabla 2, Figs. 1 y 2) Para ambos, casi no hubo expulsion de llquido y el coagulo no se retrajo.
50 [0058] Los coagulos de PRP/quitosan hechos por esta combination de procedimiento de mezcla/activador
eran firmes y elasticos, la resistencia mecanica de los coagulos era ++++ (Tabla 3, Figs. 3 y 4) La homogeneidad de los coagulos (Tabla 4) era mejor que la homogeneidad de los coagulos hechos por el procedimiento de mezcla 2 (1 muestra era "±", 1 era "-") y mejor que la homogeneidad de los coagulos hechos por el procedimiento de mezcla 1 (ambos era "-"). El procedimiento de mezcla 3 dio como resultado las mejores propiedades de coagulacion, 55 coagulada en un tiempo adecuado, sin retraccion del coagulo, buenas propiedades mecanicas y buena homogeneidad. Tambien se obtuvieron resultados similares a partir de sangre de conejo.
[0059] La description actual tambien proporciona una nueva formacion de mezclas de PRP/quitosan exentas
de trombina (mostradas en el Ejemplo 3), preparadas usando solo solucion de CaCl2 con concentraciones mas bajas
(1,3% en p/p y 3% en p/p) como activador, y usando solucion de quitosan con diferentes concentraciones (1,62% en p/p y 2% en p/p) mezclado con PRP en diferentes relaciones de mezcla (la relacion de PRP:quitosan es 3:1 o 2:1). El plasma rico en plaquetas (PRP) se aislo de sangre entera anticoagulada con citrato recien extralda con centrifugacion en dos etapas (1300 rpm durante 10 minutos y luego 2000 rpm durante 10 minutos). Se usaron 5 solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (38 mM)-NaCl (160 mM) a pH de 6,56 y osmolalidad de 344 mOsm/kg, y solucion de quitosan (2,0% en p/p)-HCl (50 mM)-NaCl (150 mM) a pH de 6,49 y osmolalidad de 324 mOsm/kg para mezclar con PRP. Para preparar la mezcla de PRP/quitosan en una relacion de mezcla de 3:1 (v/v), se pipetearon 0,9 ml de plasma rico en plaquetas (PRP) en los criotubos que contenlan 300 pl de solucion de quitosan al 1,62% en p/p (o quitosan al 2,0% en p/p) y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 10 segundos (agitados e invertidos aproximadamente 50 veces energicamente). Se transfirieron 300 pl a 3 tubos de vidrio a 37°C usando una jeringa de 1 ml. Inmediatamente se instilaron 60 pl de solucion de cloruro de calcio al 1,3% (p/p) (o solucion de CaCl2 al 3% en p/p) con mucho cuidado y lentamente sobre la superficie de la mezcla de PRP/quitosan de cada tubo de vidrio para la preparacion de 3 coagulos (la relacion de mezcla de PRP/quitosan a solucion de CaCl2 era de 5 a 1 en relacion en volumen).
15
[0060] Para preparar la mezcla de PRP/quitosan en una relacion de mezcla de 2:1 (v/v), se repitieron todos los procedimientos descritos antes pipeteando 0,8 ml de PRP en 400 pl de solucion de quitosan. Los resultados de las pruebas de tiempo de coagulacion (Tabla 10 y FIG. 9) mostraban que todas las mezclas coagulaban en 8 minutos. Para la misma relacion de mezcla, las soluciones de quitosan mas concentradas necesitaban menos
20 tiempo para coagular (2,0% frente a 1,62%). Para la misma concentracion de quitosan, el PRP mezclado con mas solucion de quitosan necesitaba menos tiempo para coagular (relacion de mezcla 2:1 < relacion de mezcla 3:1). Con la misma concentracion de quitosan y relacion de mezcla, las mezclas activadas con solucion de CaCl2 al 3% coagulaban ligeramente mas rapido que las mezclas activadas con solucion de CaCl2 al 1,3% (el tiempo de coagulacion era mas corto para 3 de 4 muestras). Los resultados de resistencia mecanica mostraron (vease la Tabla 25 11, FIG. 10) que los ocho coagulos no se retralan significativamente, pero los coagulos preparados con quitosan al 2% parecla que expulsaban menos llquido que los coagulos preparados con quitosan al 1,62%. Aunque las puntuaciones de resistencia mecanica eran identicas para todas las muestras, la resistencia mecanica de los coagulos preparados con quitosan al 2% parecla ligeramente mejor (despues de trituracion, 2 de 4 muestras mostraron solo un agujero en el centro de los coagulos, 1 de 4 muestras se rompio en dos fragmentos conectados y 30 1 de 4 muestras se rompio en dos fragmentos) que los coagulos preparados con quitosan al 1,62% (despues de la trituracion, 4 de 4 muestras se rompieron en dos fragmentos conectados).
[0061] Los resultados de la evaluacion de homogeneidad (Tabla 12) demostraron que la homogeneidad de los ocho coagulos era satisfactoria (todos eran superiores a ±). La homogeneidad de coagulos preparados con
35 solucion de CaCl2 al 1,3% (3 de 4 muestras eran +, 1 de 4 era entre ± y +) era mejor que la homogeneidad de los coagulos preparados con solucion de CaCl2 al 3% (1 de 4 muestras era +, 3 de 4 muestras estaban entre ± y +).
[0062] En resumen, se pueden preparar coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl con buenas propiedades mezclando PRP con soluciones de quitosan al 2,0% o al 1,62% en p/p en relaciones de mezcla tanto 2:1 como 3:1
40 en v/v, y activando con soluciones de CaCl2 al 1,3% o 3% en p/p. Las mezclas de PRP/quitosan-HCl-NaCl preparadas con solucion de quitosan al 2,0% con una relacion de mezcla de 2:1 (v/v), usando solucion de CaCl2 al 3% en p/p como activador, daban como resultado las mejores propiedades de coagulacion, coagulando en un tiempo adecuado, sin retraccion del coagulo, buenas propiedades mecanicas y buena homogeneidad. El uso de una concentracion mas alta (2%) y una mayor relacion de mezcla de solucion de quitosan a PRP daba como resultado 45 propiedades de manipulation mas atractivas ya que estas mezclas eran mas de tipo pasta y mas viscosas y por lo tanto mas faciles de aplicar en defectos de cartllago y en otros sitios que son un desaflo para el suministro.
[0063] La presente description tambien proporciona otra nueva formation de mezclas de PRP/quitosan exentas de trombina (mostrada en el Ejemplo 4), preparadas por la adicion de solucion de CaCl2 al 3% en p/p a
50 mezcla de PRP/quitosan y mezcla de las mismas suavemente invirtiendo el tubo 5 veces en 5 segundos, y despues transfiriendo a tubos de vidrio con una jeringa para preparar el coagulo (implante). El plasma rico en plaquetas (PRP) se aislo de sangre entera anticoagulada con citrato recien extralda, con centrifugacion en dos etapas (1300 rpm durante 10 minutos y despues 2000 rpm durante 10 minutos). El PRP se mezclo con una solucion de quitosan con diferentes pesos moleculares (CH0100702B- Mn 232 kDa, DDA 81% y CH0050602A- Mn 298 kDa, DDA 76%) y 55 pH fisiologico y osmolalidad similares con una relacion de mezcla de 3:1. Para preparar la mezcla de PRP/quitosan: se pipetearon 0,9 ml de plasma rico en plaquetas (PRP) en los criotubos que contenlan 300 pl de solucion de quitosan al 1,62% en p/p y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 segundos (agitados e invertidos aproximadamente 50 veces energicamente). Se anadieron 240 pl de solucion de CaCl2 al 3% en p/p a la mezcla de PRP/quitosan y se mezclaron suavemente invirtiendo el tubo 5 veces en 5
segundos. Se transfirieron aproximadamente 300 pi de mezcla a tres tubos de vidrio para preparar 3 coagulos.
[0064] Los resultados mostraron que todas las mezclas preparadas con quitosan CH0100702B (Mn 232 kDa, DDA 81%) coagulaban en 8 minutos. El tiempo de coagulacion de los coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl era casi
5 igual al tiempo de coagulacion de los coagulos de PRP/quitosan-HCl-pGP (el promedio era 7,3 minutos frente a 7 minutos, respectivamente) (Tabla 15 y FIG. 11). Todas las mezclas preparadas con quitosan CH0050602A (Mn 298 kDa, DDA 76%) coagulaban en 8 minutos. El tiempo de coagulacion de los coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl era casi igual al tiempo de coagulacion de los coagulos de PRP/quitosan-HCl-pGP (el promedio era 7 minutos frente a 8 minutos, respectivamente) (Tabla 16 y FIG. 11).
10
[0065] Los resultados de la prueba de resistencia mecanica mostraron que todos los coagulos preparados por inversion suave despues de la activacion con CaCl2 eran firmes y elasticos, la resistencia mecanica de todos los coagulos era "++++". No habla diferencias significativas en la resistencia mecanica entre los coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl y los coagulos de PRP/quitosan-HCl-pGP. No habla diferencias significativas en la
15 resistencia mecanica entre los coagulos preparados con los diferentes quitosanos tampoco (Tabla 17 y FIG. 12) Despues de 60 minutos, ninguno de los coagulos expulsaba ningun llquido ni se retrala, los coagulos estaban perfectamente intactos. Mientras tanto, el coagulo de PRP sin quitosan expulsaba una gran cantidad de llquido (82,9%) y se retrala significativamente (Tabla 17, FIG. 13 y FIG. 14).
20 [0066] En conclusion, la inversion suave del criotubo despues de la adicion del activador CaCl2 no parece
interrumpir el proceso de coagulacion y afectar al tiempo de coagulacion. Los coagulos de PRP/quitosan preparados por el procedimiento de mezcla de inversion suave no expulsan llquido, no se retraen, tienen buena resistencia mecanica y coagulan en tiempo adecuado. El procedimiento de inversion suave es mas facil de trasladar a la aplicacion cllnica.
25
[0067] Las composiciones descritas en este documento se pueden usar para mejorar la reparacion y
regenerar tejidos cartilaginosos y otros tejidos incluyendo, sin limitacion, menisco, ligamento, tendon, hueso, piel, cornea, tejidos periodontales, abscesos, tumores resecados y ulceras.
30 [0068] Tambien se contempla en este documento el uso de las composiciones polimericas descritas en este
documento que se pueden poner o inyectar en un sitio del cuerpo donde la mezcla ayuda a la reparacion, regeneration, reconstruction o acumulacion de tejidos. Los tejidos reparados incluyen, por ejemplo, sin limitacion, cartllago, menisco, ligamento, tendon, hueso, piel, cornea, tejidos periodontales, abscesos, tumores resecados y ulceras. El tejido que se puede reparar o regenerar es, por ejemplo, sin limitacion cartllago, menisco, ligamento,
35 tendon, hueso, piel, cornea, tejido periodontal, abscesos, tumores resecados o ulceras. En algunos casos, el sitio de introduction en el cuerpo se puede preparar quirurgicamente para eliminar los tejidos anormales. Dicho procedimiento se puede hacer perforando, raspando o taladrando regiones de tejido adyacentes o regiones vascularizadas para crear canales para que la composition polimerica migre al sitio que requiere reparacion.
40 [0069] La presente description se entendera mas facilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos
que se proporcionan para ilustrar realizaciones en lugar de limitar su alcance.
EJEMPLO 1
45 Formulacion y caracterizacion de coagulos de PRP/quitosan activados por trombina y preparados con diferentes procedimientos de mezcla (sangre humana) 1
1- Preparation de solution de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (38 mM)-NaCl (160 mM); sin NaOH, pH: 6,6; Volumen total:10,0 ml
50
[0070] Se pesaron 0,180 g de quitosan (Mn 232 kDa, DDA 81%) en un vaso de precipitados de 20 ml, se
anadio H2O dd al vaso de precipitados, hasta que el peso de quitosan + H2O = 9,34 g. Se introdujo una barra de agitation magnetica en el vaso de precipitados; la solution se agito durante aproximadamente 10 minutos con el fin de hidratar el polvo de quitosan tanto como fuera posible. Se anadieron 0,38 ml de HCl 1 N (Sigma, Producto N°
55 318949) a la solucion con agitacion moderada. El vaso de precipitados se cubrio con Parafilm™, y la solucion se calento a aproximadamente 60°C durante 2 horas, se agito durante la noche hasta que se disolvio por completo. Se anadieron 0,32 ml de solucion de NaCl 5 N (Sigma, Producto N° S-9888) al vaso de precipitados y se mezclaron bien. El pH de la solucion de quitosan era fisiologico a 6,5 y la osmolalidad tambien era fisiologica de 361 mOsm/kg (Tabla 1).
2- Preparation de solution de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (71 mM) -fiGP (2,15% en p/p), pH: 6,6, volumen total: 9,0 ml
5 [0071] Se pesaron 0,162 g de quitosan (Mn 232 kDa, DDA 81%) en un vaso de precipitados de 20 ml, se
anadio H2O dd al vaso de precipitados, hasta que el peso del quitosan + H2O = 6,65 g. Se anadio una barra de agitacion magnetica en el vaso de precipitados; la solucion se agito durante aproximadamente 10 minutos con el fin de hidratar el polvo de quitosan tanto como fuera posible. Se anadieron 0,55 ml de HCl 1 N (Sigma, Producto N° 318949) a la solucion con agitacion moderada. El vaso de precipitados se cubrio con Parafilm™ y se agito durante la 10 noche hasta que se disolvio por completo. Se anadieron 1,8 ml de pGP al 10,75% en p/p (Sigma, producto n° G9891) en HCl 50 mM al vaso de precipitados y se mezclaron bien (la relacion de mezcla de solucion de quitosan/solucion de (3GP es de 4:1). El pH de la solucion de quitosan era fisiologico a 6,7 y la osmolalidad tambien era fisiologica, de 342 mOsm/kg (Tabla 1).
15 Tabla 1
Composicion y propiedades de soluciones de quitosan
- Solucion
- Cquitosan (%p/p) Chci (mM) CNaCI (mM) CpGP (%p/p) Precipitacion pH (Medido) Osmolalidad (mOsm/kg)
- 1. Quitosan-HCl-NaCI pH 6,6
- 1,62 38 160 no no 6,54 361
- 2. Quitosan-HCl-3GP pH 6,6
- 1,62 71 no 2,5 no 6,65 342
3- Extraction de sangre
[0072] Se extrajeron aproximadamente 40 cc de sangre completa de un donante con consentimiento 20 informado, usando un protocolo IRB de toma de sangre. Primero, se recogieron ~2 ml de sangre en un tubo
Vacutainer® que contenla EDTA (Fisher, BD, Producto N° 02-683-99A) para obtener el CBC (hemograma completo) y recuentos de plaquetas. Segundo, se recogieron ~35 ml de sangre en 4 tubos Vacutainer® que contenlan ACD (VWR, BD, Producto N° VT4606) para preparar el plasma rico en plaquetas (PRP). Cada tubo Vacutainer® puede contener hasta 8,5 ml de sangre.
25
4- Aislamiento de PRP de sangre entera anticoagulada
[0073] Los tubos de ACD-Vacutainer® que contenlan sangre completa se centrifugaron en la centrlfuga ACE EZ PRP™ a 1300 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente con el fin de separar los eritrocitos del plasma y
30 la capa leucocitaria que contiene leucocitos y plaquetas. Las fracciones de llquidos sobrenadantes que contienen plasma y la capa leucocitaria se eliminaron usando una aguja roma de 63,5 mm (21^ pulgadas) (calibre 18) (ACE, Producto N° 09-002-69) unida a una jeringa de 10 ml (Fisher, BD, Producto N° 309604). El llquido de color pajizo se extrajo con la jeringa hasta que la aguja alcanzo los primeros 1-2 mm de la capa de globulos rojos. Se tomaron los primeros 1-2 mm de eritrocitos para asegurar que se recogla la capa leucocitaria entera (es decir, la fraccion de 35 globulos blancos). Las fracciones de plasma y capa leucocitaria se pasaron de la jeringa a tubos nuevos de Vacutainer® (lavados y despirogenizados) que no contenlan anticoagulante. El plasma y la capa leucocitaria se centrifugaron adicionalmente a 2000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente con el fin separar el plasma rico en plaquetas (PRP) del plasma pobre en plaquetas (PPP). Los tubos Vacutainer® se transfirieron a un soporte Vacutainer® y se retiraron las tapas. Las fracciones de llquido sobrenadante amarillo (PPP) se separaron usando la 40 misma aguja roma de 63,5 mm (2^ pulgadas) (calibre 18) y una nueva jeringa de 10 ml. Se dejo un pequeno volumen de llquido sobrenadante amarillo (PPP) en los tubos Vacutainer®, dejando aproximadamente 1,5 ml de PRP que contenla algo de PPP en la fraccion inferior de los tubos Vacutainer®. Las fracciones de PPP superiores se sacaron de la jeringa a un tubo Falcon esteril. Los 1,5 ml de PRP en la fraccion inferior de los tubos Vacutainer® se mezclaron suavemente extrayendo y sacando el llquido 3 veces con la aguja roma de 76,2 mm (3 pulgadas) (calibre 45 18, ACE, Producto N° 09-002-70) unida a una jeringa de 10 ml. La fraccion de PRP se almaceno a temperatura ambiente hasta su uso posterior. Se recogieron aproximadamente 6,0 ml de PRP de aproximadamente 35 ml de sangre ACD recogida del donante.
5- Preparation de soluciones de coagulation de trombina 50
[0074] Para preparar la solucion de cloruro calcico al 10% (p/p), se pesaron 1,99 g de CaCl2.2H2O (Sigma, Producto N° C7902-500G) en un vaso de precipitados de 50 ml, se anadio H2O dd al vaso de precipitados, hasta que la peso de CaCl2.2H2O + H2O = 15 g. Se introdujo una barra de agitacion magnetica en el vaso de precipitados, y la
solucion se agito hasta que se disolvio por completo. La solucion de trombina (1000 U/ml) se prepare diluyendo el polvo de trombina con la solucion de cloruro de calcio al 10% (p/p). Para este experimento particular, se diluyo un vial completo (1000 U, Sigma, Producto N° T7009-1KU) de trombina con 1,0 ml de solucion de cloruro calcico al 10% (p/p). La solucion de trombina se almaceno en hielo hasta su uso.
5
6- Preparation de los coagulos de quitosan/PRP y medicion del tiempo de coagulation y resistencia mecanica de los coagulos
[0075] Para preparar los coagulos de quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6)/PRP coagulados con trombina/cloruro de
10 calcio (1000 U/ml), se pipetearon 900 pl de plasma rico en plaquetas (PRP) en criotubos que contenlan 300 pl de solucion de quitosan y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 segundos (agitados e invertidos aproximadamente 50 veces energicamente). A continuacion, se uso uno de los siguientes 3 procedimientos de mezcla.
15 [0076] Procedimiento de mezcla n° 1: inversion 5 veces y despues extraccion con la jeringa: se anadieron
inmediatamente 133 pl de solucion de trombina (1000 U/ml) diluida con solucion de cloruro de calcio esteril al 10% (p/p) a la mezcla de PRP/quitosan y se mezclo bien mediante inversion durante 5 segundos (invirtiendo el tubo 5 veces suavemente). Para preparar los coagulos, se transfirieron 300 pl a 3 tubos de vidrio a 37°C con una jeringa de 1 ml. Se prepararon tres coagulos: 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo 20 inmediatamente despues de coagulado, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo despues de 60 minutos y 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y la resistencia mecanica.
[0077] Procedimiento de mezcla n° 2: sin inversion, simplemente extraldo con jeringa: se anadieron 133 pl de
solucion de trombina (1000 U/ml) diluida con solucion de cloruro de calcio esteril al 10% (p/p) sobre la superficie de 25 la mezcla de PRP/quitosan. La mezcla se extrajo inmediatamente con una jeringa de 1 ml y se transfirieron 300 pl a 3 tubos de vidrio a 37°C. Se prepararon 3 coagulos:1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo inmediatamente despues de coagulado; 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo coagulacion y se fijo despues de 60 minutos, y 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y la resistencia mecanica.
30 [0078] Procedimiento de mezcla n° 3 - en una capa en la parte superior: se transfirieron 300 pl de mezcla de
PRP/quitosan a 3 tubos de vidrio a 37°C con una jeringa de 1 ml. Se anadieron 33 pl de solucion de trombina (1000 U/ml) diluida con solucion de cloruro de calcio esteril al 10% (p/p) sobre la superficie de la mezcla de PRP/quitosan de cada tubo de vidrio para preparar 3 coagulos: 1 coagulo se uso para el ensayo del coagulacion tiempo y se fijo inmediatamente despues de coagulado, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo 35 despues de 60 minutos, y 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y la resistencia mecanica.
[0079] Para preparar los coagulos PRP/quitosan-HCl-pGP (pH 6,6) coagulados con trombina/cloruro de calcio (1000 U/ml), se pipetearon 900 pl de plasma rico en plaquetas (PRP) en criotubos que contenlan 300 pl de solucion de quitosan y tres bolas de acero inoxidable 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 segundos (sacudidos e
40 invertidos aproximadamente 50 veces energicamente). Despues se repitieron los 3 procedimientos de mezcla anteriores.
[0080] La coagulacion se determino por visualizacion del coagulo a 37°C. Los tubos de vidrio se sacaron de la placa caliente verticalmente cada minuto, el tubo se inclino lentamente y se visualizo la mezcla de sangre en el
45 fondo del tubo. Si la mezcla estaba inmovil y formaba un coagulo, entonces habla coagulado; si la mezcla todavla era movil en el fondo del tubo, aun no habla coagulado. La resistencia mecanica se ensayo poniendo el coagulo en el centro de la palma, presionando el coagulo con un dedo hasta que se aplastara; se vigilaron la resistencia observada a la compresion, expulsion de llquido y el aspecto aplastado. La resistencia mecanica se puntuo con el sistema de 4 "+": "+" representa que el coagulo se rompla facilmente y el aspecto aplastado era de fragmentos 50 multiples (mas de 5 fragmentos); "++" representa que el coagulo era relativamente firme y el aspecto aplastado era de fragmentos multiples (3-5 fragmentos); "+++" representa que el coagulo era firme y elastico, el aspecto aplastado era de 2-3 fragmentos; "++++" representa que el coagulo era firme y elastico, el aspecto aplastado era de 2 fragmentos (a veces todavla conectados) o simplemente habla un orificio en el centro del coagulo.
55 [0081] Los resultados de los tiempos de coagulacion (Tabla 2, Figs. 1 y 2) mostraban que todas las mezclas
de PRP/quitosan coagularon en el espacio de 10 minutos (de un par de segundos a 10 minutos). Para el procedimiento de mezcla 1 donde la trombina se mezclo en PRP/quitosan mediante inversion suave 5 veces del tubo de mezcla que contenla perlas de acero inoxidable y despues se tomo mediante una jeringa para ponerlo en tubos de vidrio: la coagulacion se producla cuando la mezcla se transferla con jeringa y era diflcil transferir la mezcla
de PRP/quitosan a tubos de vidrio (Tabla 2, Figs. 1 y 2). Expulsaban una gran cantidad de llquido (++++, los coagulos comenzaron a expulsar llquido a los 4 minutos despues de la coagulacion). Los coagulos se retrajeron significativamente dando como resultado un coagulo encogido sumergido en suero. Los coagulos de PRP/quitosan hechos por este procedimiento eran firmes y elasticos, la resistencia mecanica era +++ (Tabla 3, Figs. 3 y 4) Estos 5 resultados sugieren que la mezcla con perlas despues de la activacion con trombina/CaCh da como resultado la retraccion del coagulo y un coagulo relativamente debil en comparacion con los otros dos procedimientos de mezcla.
[0082] Para el procedimiento de mezcla 2, donde se anadio trombina al PRP/quitosan sin inversion y se
extrajo directamente con la jeringa para ponerlo en tubos de vidrio, la coagulacion se produjo inmediatamente 10 despues de ponerlos en tubos de vidrio (menos de 10 segundos; vease la Tabla 2, Figs. 1 y 2). Expulsaban algo de llquido (++, los coagulos comenzaron a expulsar llquido a los 30 minutos para el coagulo 1 y a los 35 minutos para el coagulo 2 despues de preparar los coagulos). Los coagulos se retrajeron significativamente. Los coagulos de PRP/quitosan hechos por este procedimiento eran firmes y elasticos, la resistencia mecanica era ++++ (Tabla 3, Figs. 3 y 4). Estos resultados sugieren que los coagulos hechos por este procedimiento de mezcla tienen 15 propiedades mecanicas mejoradas (++++) pero todavla se retraen.
[0083] Para el procedimiento de mezcla 3 donde la mezcla de PRP/quitosan se puso en tubos de vidrio y
despues se dispuso la trombina en una capa en la parte superior del PRP-quitosan en el tubo, la coagulacion se produjo a los 6-8 minutos en el tubo de vidrio. La mezcla de PRP/quitosan-HCl-NaCl coagulo despues de 6 minutos
20 y la mezcla de PRP/quitosan-HCl-pGP formo coagulo despues de 8 minutos en el tubo de vidrio (Tabla 2, Figs. 1 y 2). Casi no hubo expulsion de llquido y los coagulos no se retrajeron. Los coagulos de PRP/quitosan hechos por este procedimiento de mezcla eran firmes y elasticos, la resistencia mecanica era ++++ (Tabla 3, Figs. 3 y 4). Estos resultados confirman que el procedimiento de mezcla 3 da como resultado las mejores propiedades de coagulo, sin retraccion despues de la activacion por trombina/CaCl2.
25
Tabla 2
- Tiempo de coagulacion de mezclas de PRP/quitosan
- Mezcla
- Numero de muestra Tiempo de coagulacion (min) Valor medio (min) Cometarios
- PRP/quitosan- n-HCl-NaCl pH 6,6 (coagulo)
- Procedimiento de mezcla 1 (Despues de anadir trombina, invertir el criotubo 5 veces en 5 segundos, despues transferir a tubos de vidrio) 1 -- Todas las muestras coagulan en el espacio de 10 minutos. La transferencia a tubos de vidrio era diflcil despues del procedimiento de mezcla 1 ya que la mezcla coagulaba instantaneamente; los coagulos tambien coagulaban demasiado rapido con el procedimiento de mezcla 2. El coagulo se retrala mucho y expulsaba mucho llquido (++++)despues de coagulacion con el procedimiento de mezcla 1; se expulsaba algo de llquido (++) y los coagulos se retralan un poco con el procedimiento de mezcla 2; los coagulos no se retralan y expulsaban poco llquido (+) con el procedimiento de mezcla 3. Los resultados mostraban que el procedimiento de mezcla 3 era la mejor eleccion para preparar coagulos de PRP/quitosan despues de activacion con trombina/CaCl2
- 2
- --
- 3
- Procedimiento de mezcla 2 (Anadir solucion de trombina sobre la superficie de mezcla de PRP/quitosan y despues transferir directamente a tubos de vidrio)
- 1 <10 segundos
- 2
- <10 segundos
- 3
- <10 segundos
- Procedimiento de mezcla 3 (Transferir mezcla de PRP/quitosan a tubos de vidrio, despues anadir solucion de trombina sobre la superficie de la mezcla)
- 1 6
- 2
- 6
- 3
- 6
- PRP/quitosan- n-HCl-pGP pH 6,6 (coagulo2)
- Procedimiento de mezcla 1 (Despues de anadir trombina, invertir el criotubo 5 veces en 5 segundos, despues transferir a tubos de vidrio) 1 --
- 2
- --
- 3
- Procedimiento de mezcla 2 (Anadir solucion de trombina sobre la superficie de mezcla de PRP/quitosan, despues
- 1 <10 segundos
- 2
- <10 segundos
- transferir directamente a tubos de vidrio) 3 <10 segundos (tiempo de coagulacion adecuado, buena forma del coagulo y buena resistencia mecanica)
- Procedimiento de mezcla 3 (Transferir mezcla de PRP/quitosan a tubos de vidrio, despues anadir solucion de trombina sobre la superficie de la mezcla)
- 1 8 8
- 2
- 8
- 3
- 8
- "-" significa que la mezcla coagulaba durante la transferencia y se puede calcular como "0"
Tabla 3
- Ensayo de resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan
- Muestra
- Resistencia a la compresion Liquido expulsado Aspecto aplastado
- Quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6)/PRP coagulo1-1 (1000 U/ml)
- Firme y elastico +++ Una gran cantidad de hquido expulsado ++++ 2-3 fragmentos)
- Quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6)/PRP coagulo1-2 (1000 U/ml)
- Firme y elastico ++++ Algo de Kquido expulsado ++ Se rompe en 2 fragmentos pero todavia conectados
- Quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6)/PRP coagulo1-3 (1000 U/ml)
- Firme y elastico ++++ Poco lfquido expulsado + Se rompe en 2 fragmentos
- Quitosan-HCl-pGP (pH 6,6)/PRP coagulo2-1 (1000 U/ml)
- Firme y elastico +++ Una gran cantidad de hquido expulsado ++++ 2-3 fragmentos)
- Quitosan-HCl-pGP (pH 6,6)/PRP coagulo 2-2 (1000 U/ml)
- Firme y elastico ++++ Algo de Kquido expulsado ++ Se rompe en 2-3 fragmentos pero todavia conectado
- Quitosan-HCl-pGP (pH 6,6)/PRP coagulo 2-3 (1000 U/ml)
- Firme y elastico ++++ Casi sin lfquido expulsado + Se rompe en 2 fragmentos pero todavia conectados
7- Tratamiento histologico y evaluation de homogeneidad de coagulos de PRP/quitosan 5
[0084] Los coagulos fijados se seccionaron en 2 partes. Una parte se inserto en parafina, se tino con
Safranina O/Verde rapido y se observo por microscopia optica. Todas las fotos se tomaron de las muestras de coagulos de PRP/quitosan fijadas 60 minutos despues de que se prepararan los coagulos, se usaron dos fotos tomadas con los objetivos 5x y 40x de diferentes regiones de cada muestra para la evaluacion de la homogeneidad.
10 Cada muestra se observo con microscopio con especial enfasis en: presencia de burbujas o grietas; presencia y distribucion de precipitados de quitosan descritos como: agregados grandes o agregados pequenos; distribucion de quitosan y si estan distribuidos homogeneamente o no en toda la seccion; morfologia eritrocitica en terminos de discoide, encogido, hinchado o encadenado.
15 [0085] La homogeneidad (valor medio) del coagulo 2 (2 de 3 muestras eran "±") hecho mezclando PRP con
quitosan-HCl-pGP (pH 6,6) era ligeramente mejor que el coagulo 1 hecho mezclando PRP con quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) (1 de 3 muestras era "±"). La homogeneidad de los coagulos preparados con el procedimiento de mezcla 3 era mejor (2 de 2 muestras eran "±") que la homogeneidad de los coagulos preparados con el procedimiento de mezcla 2 (1 muestra era "±", 1 muestra era "-") o el procedimiento de mezcla 1 (ambas muestras eran "-"). Habia
20 muchas burbujas en los coagulos preparados con el procedimiento de mezcla 1 y menos burbujas en los coagulos preparados con el procedimiento de mezcla 2 y el procedimiento de mezcla 3. Estos resultados mostraron que el procedimiento de mezcla 1 no es ideal para preparar coagulos de PRP/quitosan homogeneos con activacion con trombina/CaCl2, el mejor procedimiento de mezcla era el procedimiento de mezcla 3 (Tabla 4).
Tabla 4
- Homogeneidad de coag
- ulos de PRP/quitosan
- Muestra de coagulo-1 (con NaCl)
- Homogeneidad del coagulo-1 Muestra de coagulo-2 (con pGP) Homogeneidad del coagulo-2
- PRP1-1 mezcla 1)
- (procedimiento de - PRP2-1 (procedimiento mezcla 1) de -
- PRP1-2 mezcla 2)
- (procedimiento de - PRP2-2 (procedimiento mezcla 2) de ±
- PRP1-3 mezcla 3)
- (procedimiento de ± PRP2-3 (procedimiento mezcla 3) de ±
EJEMPLO 2
Ensayo de fluidez y ensayo de tiempo de coagulacion para mezclas de PRP/quitosan sin ningun activador (sin trombina o calcio) usando diferentes proporciones de mezcla
1- Preparacion de solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (38 mM)-NaCl (160 mM); sin NaOH, pH: 6,6; Volumen total:10,0 ml
[0086] La solucion de quitosan-HCl-NaCl se preparo con quitosan Mn 232 kDa, DDA 81% como se describe en lo que antecede. El pH de la solucion de quitosan era fisiologico a 6,6 y la osmolalidad tambien era fisiologica (359 mOsm/kg; Tabla 5).
2- Preparacion de solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (71 mM) -pGP (2,15%), pH: 6,6, Volumen total: 9,0 ml
[0087] La solucion de quitosan-HCl-pGP se preparo con quitosan Mn 232 kDa, DDA 81% como se describe en lo que antecede. El pH de la solucion de quitosan era fisiologico a 6,6 y la osmolalidad tambien era fisiologica (352 mOsm/kg; Tabla 5).
Tabla 5
- Composicion y propiedades de soluciones de quitosan
- Solucion N° y tipo.
- Cquitosan (%p/p) Chci (mM) CNaCI (mM) CpGP (%p/p) Precipitacion pH (Medido) Osmolalidad (mOsm/kg)
- 1. Quitosan-HCl NaCl pH 6,6
- 1,62 38 160 no no 6,57 359
- 2. Quitosan-HCl-pGP pH 6,6
- 1,62 71 no 2,15 no 6,63 352
3- Extraction de sangre
[0088] Se extrajo sangre de conejos usando una tecnica esteril, iniciada inyectando 0,3 cc/kg de Hypnorm®
IM a los conejos (por ejemplo, 0,9 cc para un conejo de 3 kg). Primero, para cada conejo, se recogieron ~2 ml de sangre en un tubo Vacutainer® que contenla EDTA (Fisher, BD, Producto N° 02-683-99A) para obtener el CBC (hemograma completo) y el recuento de plaquetas. En segundo lugar, para cada conejo, se recogieron ~26 ml de sangre en 3 tubos Vacutainer® que contenlan ACD (VWR, BD, Producto N° VT4606) para preparar sangre entera anticoagulada y PRP. Cada tubo Vacutainer® puede contener hasta 8,5 ml de sangre. Se usaron dos conejos en este experimento.
4- Aislamiento de PRP de sangre completa anticoagulada
35 [0089] El PRP se aislo de sangre completa de conejo mediante centrifugacion diferencial como se ha descrito
en lo que antecede. Se pueden recoger aproximadamente 4,5 ml de PRP de la sangre de ACD recogida de cada conejo.
5- Parte 1 del experimento: Prueba de fluidez de la mezcla de PRP/quitosan 40
[0090] Para preparar el PRP/quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) (relaciones de mezcla 3:1 en v/v), se pipetearon 0,9
ml de plasma rico en plaquetas (PRP) en criotubos que contenlan 300 pl de solucion de quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6)
25
30
5
10
15
20
y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 segundos (el tubo se sacudio e invirtio aproximadamente 50 veces energicamente). Para preparar la mezcla de PRP/quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) (relacion de mezcla 2:1 en v/v), se pipetearon 0,8 ml de plasma rico en plaquetas (PRP) en criotubos que contenlan 400 |jl de solucion de quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron 5 manualmente durante 10 segundos (el tubo se sacudio e invirtio aproximadamente 50 veces energicamente). Para preparar la mezcla de PRP/quitosan-HCl-pGP (pH 6,6) (relacion de mezcla: 3:1 y 2:1 en v/v), se repitieron todos los procedimientos descritos en lo que antecede mezclando el PRP con solucion de quitosan-HCl-pGP (pH 6,6).
[0091] Para el ensayo de fluidez, se analizaron un total de 5 muestras: las muestras 1 y 2 eran mezclas de
10 PRP/quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) en una relacion de mezcla 3:1 y 2:1 en v/v; las muestras 3 y 4 eran mezclas de
PRP/quitosan-HCl-pGP (pH 6,6) en una relacion de mezcla de 3:1 y 2:1 en v/v, la muestra 5 era PRP sin quitosan como control. Una placa de plastico limpia se inclino sobre la mesa de trabajo en un angulo de aproximadamente 45°. Se pipetearon aproximadamente 0,5 ml de mezcla de cada muestra, despues se pusieron tres gotas de cada muestra con cuidado sobre la superficie de la placa (la distancia entre cada muestra era de aproximadamente 2 cm),
15 se observo la fluidez de las mezclas y se tomaron fotos a los 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 5 minutos y 10 minutos.
[0092] Los resultados de la prueba de fluidez (FIG. 5) mostraron que el PRP puro demostraba propiedades muy llquidas al fluir por casi toda la placa de plastico en 1 minuto, la distancia del recorrido de las diferentes
20 muestras era diferente y la distancia del recorrido no cambio significativamente de 30 segundos a 10 minutos. Para la misma relacion de mezcla, la distancia del recorrido de PRP/quitosan-NaCl era mucho mas corta que la de PRP/quitosan-pGP, posiblemente porque la solucion de quitosan con NaCl era mas viscosa que la solucion de quitosan con pGP y la solucion de quitosan con NaCl coagula mas rapido que la solucion de quitosan con pGP. Para la misma solucion de quitosan, la distancia del recorrido de la relacion de mezcla 3:1 en v/v era mucho mas larga
25 que la relacion de mezcla 2:1 en v/v. Estos resultados sugieren que el uso de concentraciones de quitosan mayores (2%) y relacion mayor de la solucion de quitosan a PRP daban como resultado propiedades de manipulacion mas atractivas puesto que estas mezclas eran mas de tipo pasta y mas viscosas, y por lo tanto mas faciles de aplicar en defectos de cartllago y en otros sitios que son un reto para el suministro.
30 6- Parte 2 del experimento: Preparacion de coagulos de PRP/quitosan y medicion del tiempo de coagulacion y la resistencia mecanica de los coagulos
[0093] Para preparar las mezclas de PRP/quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) y PRP/quitosan-HCl-pGP (pH 6,6) (relaciones de mezcla 3:1 y 2:1 en v/v), se siguieron los mismos procedimientos de preparacion descritos en lo que
35 antecede. Para cada mezcla, se transfirieron 300 jl a 3 tubos de vidrio a 37°C con una jeringa de 1 ml para preparar tres coagulos: 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo inmediatamente despues de coagulado, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo despues de 60 minutos, 1 coagulo se uso para el ensayo de tiempo de coagulacion y resistencia mecanica despues de 60 minutos. La coagulacion del coagulo se determino por visualization del coagulo a 37°C como se ha descrito en lo que antecede. La resistencia
40 mecanica se ensayo como se ha descrito en lo que antecede.
[0094] Los resultados del ensayo de coagulacion (Tabla 6 y FIG. 6) mostraron que las mezclas de PRP/quitosan con NaCl coagulaban en 5 minutos (5 minutos para la relacion de mezcla 3:1 frente a 3 minutos para la relacion de mezcla 2:1). Las mezclas de PRP/quitosan con pGP coagulaban despues de 45 minutos (51 minutos
45 para la relacion de mezcla 3:1 frente a 45 minutos para la relacion de mezcla 2:1). Para ambas relaciones de mezcla (3:1 y 2:1), las mezclas con NaCl (coagulo 1) coagulaban mucho mas rapido que la mezcla con pGP (coagulo 2). Los coagulos preparados con una relacion de mezcla 2:1 coagulaban ligeramente mas rapido que los coagulos preparados con una relacion de mezcla 3:1, lo que sugiere que el aumento de la concentration de quitosan aceleraba la coagulacion o creaba una solucion mas viscosa.
50
[0095] Con respecto a la resistencia mecanica de los coagulos (Tabla 7, Figs. 7 y 8), los dos coagulos con NaCl no eran firmes y se romplan facilmente. Despues de aplastados, los coagulos estaban aplanados, la resistencia mecanica de los coagulos estaba cerca de "+" (entre 0 y +). Los dos coagulos con pGP) eran mezclas de tipo gel. Despues de que se vertieran fuera de los tubos, pareclan barro viscoso (muy fragil) y la resistencia
55 mecanica de los coagulos era "0". Las resistencias mecanicas de coagulos de PRP preparados sin activation por la trombina y CaCl2 (solo mezcla de PRP con quitosan) eran mucho mas debiles que los coagulos de PRP con trombina y CaCl2 in vitro (vease la Tabla 3 para las propiedades mecanicas con la trombina y la Tabla 11 para las propiedades mecanicas con CaCL).
Tabla 6
- Tiempo de coagulacion de mezclas de PRP/quitosan
- Mezcla
- Relacion de mezcla y numero de muestra Tiempo de coagulacion (min) Valor medio (min) Cometarios
- PRP/quitosan- -HCl-NaCl pH 6,6 (coagulo1)
- 3:1 1 5 5 Para el coagulo 1 (con NaCl), ambas relaciones de mezcla (3:1 y 2:1) coagulaban en 5 minutos (5 min para 3:1 y 3 min para 2:1); despues de 60 min, el coagulo no se retrala y no expulsaba suero. Para el coagulo 2 (con pGP) ambas relaciones de mezcla (3:1 y 2:1) coagulaban despues de 45 minutos (51 min para 3:1 y 45 min para 2:1), y formaban coagulos de tipo gel (fragiles); despues de 60 minutos, el coagulo no se retrala y no expulsaba suero. Los tiempos de coagulacion de la relacion de mezcla 2:1 eran menores que los tiempos de coagulacion de la relacion de mezcla 3:1 en mezclas con NaCl y pGP.
- 2
- 5
- 3
- 5
- 2:1
- 1 3 3
- 2
- 3
- 3
- 3
- PRP/quitosan- HCl-pGP pH 6,6 (coagulo2)
- 3:1 1 51 51
- 2
- 51
- 3
- 51
- 2:1
- 1 45 45
- 2
- 45
- 3
- 45
Tabla 7
- Ensayo de resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan preparados sin ningun activador (sin trombina, sin calcio)
- Muestra
- Resistencia a la compresion Llquido expulsado Aspecto aplastado
- PRP/quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) coagulo1-1 (3:1)
- Se rompe facilmente Cercano a "+" Casi sin llquido expulsado + Aplanado
- PRP/quitosan-HCl-NaCl (pH 6,6) coagulo1-2 (2:1)
- Se rompe facilmente Cercano a "+" Casi sin llquido expulsado + Aplanado
- PRP/quitosan-HCl-pGP (pH 6,6) coagulo2-1 (3:1)
- Barro viscoso Cercano a "0" Casi sin llquido expulsado + Aplanado
- PRP/quitosan-HCl-pGP (pH 6,6) coagulo2-1 (2:1)
- Barro viscoso Cercano a "0" Casi sin llquido expulsado + Aplanado
5
7- Tratamiento histologico y evaluation de la homogeneidad de los coagulos de PRP/quitosan
[0096] El tratamiento histologico y la evaluacion de la homogeneidad se llevaron a cabo como se ha descrito en lo que antecede.
10
[0097] Los resultados de histologla (Tabla 8) mostraban que los coagulos de PRP/quitosan preparados con NaCl eran homogeneos, ambas relaciones de mezcla eran "+". La homogeneidad de los coagulos PRP/quitosan preparados con pGP era mala, ambas relaciones de mezcla eran "-". Se observo mas quitosan en los coagulos preparados con una relacion de mezcla de 2:1 en v/v que los coagulos preparados con una relacion de mezcla de
15 3:1 en v/v.
Tabla 8
- Homogeneidad de coagulos de PRP/quitosan preparados con NaCl o pGP con relaciones de mezcla 3:1 o 2:1
- Muestras de coagulo-1 (con NaCl)
- Homogeneidad del coagulo-1 Muestra de coagulo-2 (con pGP) Homogeneidad del coagulo-2
- PRP 1-1-2-60 (3:1)
- + PRP 2-1-2-60 (3:1) -
- PRP 1-2-2-60 (2:1)
- + PRP 2-2-2-60 (2:1) -
EJEMPLO 3
Preparacion de coagulos de PRP/quitosan usando soluciones de quitosan al 1,62% y 2,0% en relaciones de 5 mezcla de 2:1 y 3:1 y con un pequeno volumen de solucion de CaCl2 como activador
1- Preparacion de solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (38 mM)-NaCl (160 mM); sin NaOH, pH: 6,6; Volumen total: 10,0 ml
10 [0098] La solucion de quitosan-HCl-NaCl se preparo con quitosan Mn 232 kDa, DDA 81% como se describe
en lo que antecede. El pH de la solucion de quitosan era fisiologico a 6,6 y la osmolalidad tambien era fisiologica (344 mOsm/kg; Tabla 9).
2- Preparacion de solucion de quitosan (2,0% en p/p)-HCl (50 mM)-NaCl (150 mM); pH: 6,5; Volumen total: 10,0 ml 15
[0099] Se pesaron 0,222 g de quitosan (Mn 232 kDa, DDA 81%) en un vaso de precipitados de 20 ml, se
anadio H2O dd al vaso de precipitados, hasta que el peso del quitosan + H2O = 9,20 g. Se introdujo una barra de agitacion magnetica en el vaso de precipitados; la solucion se agito durante aproximadamente 10 minutos con el fin de hidratar el polvo de quitosan tanto como fuera posible. Se anadieron 0,50 ml de HCl 1 N (Sigma, Producto N° 20 318949) a la solucion con agitacion moderada. El vaso de precipitados se cubrio con Parafilm™ y la solucion se calento a aproximadamente 60°C durante 4 horas, se agito durante la noche hasta que se disolvio por completo. Se anadieron 0,30 ml de solucion de NaCl 5 N (Sigma, producto n° S-9888) en el vaso de precipitados y se mezclo bien. El pH de la solucion de quitosan era fisiologico a 6,5 y la osmolalidad tambien era fisiologica (342 mOsm/kg; Tabla 9).
25
Tabla 9
- Composicion >
- y propiedades de soluciones de quitosan
- Solucion N° y tipo
- Cquitosan (% p/p) Chci (mM) CNaCI (mM) CpGP (% p/p) Precipitacion pH (Medido) Osmolalidad (mOsm/kg)
- 1. Quitosan-HCl-NaCl pH 6,6
- 1,62 38 160 no no 6,56 344
- 2. Quitosan-HCl-NaCl pH 6,5
- 2,0 50 150 no no 6,49 324
[0100] Se prepararon con exito dos soluciones de quitosan diferentes (con NaCl, al 1,62% y 2,0%) con
osmolalidad fisiologica similar. La solucion de quitosan 1 con una concentracion mas alta (2,0%) era mucho mas 30 viscosa que la solucion de quitosan 2 con una concentracion mas baja (1,62%) mediante visualizacion.
3- Extraccion de sangre
[0101] La sangre se extrajo de conejos utilizando una tecnica esteril como se ha descrito previamente. Se
35 usaron dos conejos en este experimento.
4- Aislamiento de PRP de sangre completa anticoagulada
[0102] El PRP se aislo de sangre completa de conejo por centrifugacion diferencial como se ha descrito
40 previamente. Se pueden recoger aproximadamente 4,5 ml de PRP de la sangre de ACD recogida de cada conejo y se recogieron aproximadamente 9,0 ml de PRP en este experimento.
5- Preparacion de las soluciones del activador CaCl2
45 [0103] Para preparar la solucion de CaCl2 al 1,3% (p/p) y al 3% (p/p), respectivamente, se pesaron 0,26 g y
0,60 g de CaCl2.2H2O (Sigma, Producto N° C7902-500G) y se depositaron en dos vasos de precipitados diferentes de 50 ml, se anadio H2O dd en estos vasos de precipitados, hasta que el peso de CaCl2.2H2O + H2O = 15 g. Se introdujo una barra de agitacion magnetica en los vasos de precipitados y se agito hasta que se disolvio por completo.
50
6- Preparacion de coagulos de PRP/quitosan y medicion del tiempo de coagulacion y la resistencia mecanica de los coagulos
[0104] Se prepararon mezclas de PRP/quitosan-HCl-NaCl en una relacion de mezcla 3:1 en v/v: se pipetearon 0,9 ml de plasma rico en plaquetas (PRP) en criotubos que contenian 300 pl de solucion de quitosan- HCl-NaCl al 1,62% (pH 6,6) y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 segundos (el tubo se agito e invirtio aproximadamente 50 veces energicamente). Se transfirieron 300 pl a 3 tubos de
5 vidrio a 37°C con una jeringa de 1 ml. Inmediatamente se instilaron 60 pl de solucion de cloruro de calcio al 1,3% (p/p) con mucho cuidado y lentamente en la superficie de la mezcla de PRP/quitosan de cada tubo de vidrio para preparar 3 coagulos: 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo inmediatamente despues de coagulado, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo despues de 60 minutos, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y la resistencia mecanica despues de 60 minutos. Se 10 repitieron todos los procedimientos que se han descrito en lo que antecede con solucion de quitosan-HCl-NaCl al 2,0% (pH 6,5) en lugar de usar solucion de quitosan al 1,62%.
[0105] Se prepararon mezclas de PRP/quitosan-HCl-NaCl en una relacion de mezcla 2:1 en v/v: se pipetearon 0,8 ml de plasma rico en plaquetas (PRP) en los criotubos que contenian 400 pl de solucion de quitosan-
15 HCl-NaCl al 1,62% (pH 6,6) y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10 segundos (el tubo se agito e invirtio aproximadamente 50 veces energicamente). Se transfirieron 300 pl a 3 tubos de vidrio a 37°C con una jeringa de 1 ml. Inmediatamente se instilaron 60 pl de solucion de cloruro de calcio al 1,3% (p/p) con mucho cuidado y lentamente en la superficie de la mezcla PRP/quitosan de cada tubo de vidrio para preparar 3 coagulos: 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo inmediatamente despues 20 de coagulado, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo despues de 60 minutos, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y la resistencia mecanica despues de 60 minutos. Se repitieron todos los procedimientos que se han descrito en lo que antecede con una solucion de quitosan-HCl-NaCl al 2,0% (pH 6,5).
25 [0106] Las mezclas de PRP/quitosan tambien se activaron con una solucion de CaCl2 al 3% en p/p. Se
repitieron todos los procedimientos descritos en lo que antecede con una solucion de CaCl2 al 3% en p/p en lugar de una solucion de CaCh al 1,3% en p/p.
[0107] La coagulacion del coagulo se determino por visualizacion del coagulo a 37°C como se ha descrito en
30 lo que antecede. La resistencia mecanica se probo como se ha descrito antes. Los resultados del ensayo de coagulacion (vease la Tabla 10 y FIG. 9) mostraban que todas las mezclas coagulaban en el espacio de 8 minutos. Para las mezclas activadas por CaCl2 al 1,3%, el PRP mezclado con quitosan al 1,62% con relacion de mezcla 3:1 coagulaba a los 8 minutos, el PRP mezclado con quitosan al 2,0% con relacion de mezcla 3:1 coagulaba a los 6 minutos, el PRP mezclado con quitosan al 1,62% con una relacion de mezcla 2:1 coagulaba a los 7 minutos, el PRP 35 mezclado con quitosan al 2,0% con relacion de mezcla 2:1 coagulaba a los 5 minutos. Para las mezclas activadas con CaCl2 al 3%, el PRP mezclado con quitosan al 1,62% con relacion de mezcla 3:1 coagulaba a los 8 minutos, el PRP mezclado con quitosan al 2,0% con relacion de mezcla 3:1 coagulaba a los 5 minutos, el PRP mezclado con quitosan al 1,62% con relacion de mezcla 2:1 coagulaba a los 5 minutos, el PRP mezclado con quitosan al 2,0% con relacion de mezcla de 2:1 coagulaba a los 3 minutos. Para la misma relacion de mezcla, una solucion de quitosan 40 mas concentrada necesitaba menos tiempo para coagular (2,0% en p/p < 1,62% en p/p). Para la misma concentracion de quitosan, el PRP mezclado con mas solucion de quitosan necesitaba menos tiempo para coagular (relacion de mezcla de 2:1 en v/v < relacion de mezcla de 3:1 en v/v). Las mezclas de PRP/quitosan activadas con solucion de CaCh al 3% coagulaban ligeramente mas rapido que las mezclas activadas con solucion de CaCh al 1,3% en p/p (3 de 4 muestras coagulaban mas rapido con CaCh al 3% en p/p).
45
Tabla 10
- Tiempo de coagulacion de mezclas de PRP/quitosan
- Mezcla
- Concentracion de quitosan y relaciones de mezcla de PRP a quitosan Tiempo de coagulacion (min) Valor medio (min) Cometarios
- PRP/quitosan- HCl-NaCl (coagulo1: adicion de solucion de CaCh al 1,3% como
- 1,62% y 3:1 (coagulo1-1) 1 8 8 Todas las mezclas activadas por CaCh al 1,3% coagulaban en el espacio de 8 minutos; para la misma relacion de mezcla, la solucion de quitosan mas concentrada necesitaba un tiempo mas corto para formar un coagulo (2,0%<1,62%). Para la misma solucion de quitosan, el PRP mezclado con mas solucion
- 2
- 8
- 3
- 8
- 2,0% y 3:1 (coagulo1-2)
- 1 6 6
- 2
- 6
- 3
- 6
- 1,62% y 2:1
- 1 7 7
- activador)
- (coagulo1-3) 2 7 de quitosan necesitaba un tiempo mas corto para formar un coagulo (relacion de mezcla de 2:1 < relacion de mezcla de 3:1)
- 3
- 7
- 2,0% y 2:1 (coagulo1-4)
- 1 5 5
- 2
- 5
- 3
- 5
- PRP/quitosan- HCl-NaCl (coagulo2: adicion de solucion de CaCl2 al 3% como activador)
- 1,62% y 3:1 (coagulo2-1) 1 8 8 Todas las mezclas activadas por CaCl2 al 3% coagulaban en el espacio de 8 minutos; para la misma relacion de mezcla, la solucion de quitosan mas concentrada necesitaba un tiempo mas corto para formar un coagulo (2,0%<1,62%). Para la misma solucion de quitosan, el PRP mezclado con mas solucion de quitosan necesitaba un tiempo mas corto para formar un coagulo (relacion de mezcla de 2:1 < relacion de mezcla de 3:1)
- 2
- 8
- 3
- 8
- 2,0% y 3:1 (coagulo2-2)
- 1 5 5
- 2
- 5
- 3
- 5
- 1,62% y 2:1 (coagulo2-3)
- 1 5 5
- 2
- 5
- 3
- 5
- 2,0% y 2:1 (coagulo2-4)
- 1 3 3
- 2
- 3
- 3
- 3
Tabla 11
- Ensayo de resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan
- Muestra
- Resistancia a la compresion Liquido expulsado Aspecto aplastado
- Quitosan-HCl-NaCl/PRP coagulo1-1 (1,62%, 3:1, CaCl2 al 1,3%)
- Firme y elastico ++++ + + 2 fragmentos pero todavia conectados
- Quitosan-HCI-NaCI/PRP coagulo1-2 2,0%, 3:1, CaCl2 al 1,3%)
- Firme y elastico ++++ + 2 fragmentos
- Quitosan-HCl-NaCl/PRP coagulo1-3 (1,62%, 2:1, CaCl2 al 1,3%)
- Firme y elastico ++++ + + 2 fragmentos pero todavia conectados
- Quitosan-HCI-NaCI/PRP coagulo1-4 (2,0%, 2:1, CaCl2 al 1,3%)
- Firme y elastico ++++ + + 2 fragmentos pero todavia conectados
- Quitosan-HCI-NaCI/PRP coagulo2-1 (1,62%, 3:1, CaCl2 al 3%)
- Firme y elastico ++++ + + 2 fragmentos pero todavia conectados
- Quitosan-HCI-NaCI/PRP coagulo2-2 (2,0%, 3:1, CaCl2 al 3%)
- Firme y elastico ++++ + Agujero en el centro
- Quitosan-HCl-NaCl/PRP coagulo2-3 (1,62%, 2:1, CaCl2 al 3%)
- Firme y elastico ++++ + + 2 fragmentos pero todavia conectados
- Quitosan-HCl-NaCl/PRP coagulo2-4 (2,0%, 2:1, CaCl2 al 3%)
- Firme y elastico ++++ + Agujero en el centro
[0108] Cuando se ensayo la resistencia mecanica de los coagulos despues de 60 minutos, se encontro que
5 los ocho coagulos eran firmes y elasticos. Para el coagulo1-1 (1,62%, 3:1 y solucion de CaCl2 al 1,3%), exudaba algo de llquido (puntuado como ++), el coagulo no se retrala de manera significativa, la resistencia mecanica era “++++”, despues de aplastamiento, el coagulo se rompla en dos fragmentos conectados. Para el coagulo1-2 (2,0%, 3:1 y solucion de CaCh al 1,3%), casi no exudaba llquido (puntuado como +), el coagulo no se retrala, la resistencia mecanica era "++++", despues de aplastado, el coagulo se rompla en dos fragmentos. Para el coagulo1-3 (1,62%, 10 2:1 y solucion de CaCl2 al 1,3%), exudaba algo de llquido (puntuado como ++), el coagulo no se retrala significativamente, la resistencia mecanica era "++++", despues de aplastado, el coagulo se rompla en dos fragmentos conectados. Para el coagulo1-4 (2,0%, 2:1 y solucion de CaCl2 al 1,3%), exudaba algo de llquido (puntuado como ++), el coagulo no se retrala significativamente, la resistencia mecanica era "++++", despues del aplastamiento, el coagulo se rompla en dos fragmentos conectados. Para el coagulo2-1 (1,62%, 3:1 y solucion de 15 CaCl2 al 3%), exudaba algo de llquido (puntuado como ++), el coagulo no se retrala significativamente, la resistencia mecanica era "++++", despues del aplastamiento, el coagulo se rompla en dos fragmentos conectados. Para el coagulo 2-2 (2,0%, 3:1 y solucion de CaCl2 al 3%), exudaba un poco de llquido (marcado como +), el coagulo no se retrala significativamente, la resistencia mecanica era "++++", despues de aplastamiento, el coagulo tenia solo un agujero en el centro. Para el coagulo2-3 (1,62%, 2:1 y solucion de CaCh al 3%), exudaba algo de llquido (puntuado 20 como ++), el coagulo no se retraia de manera significativa, la resistencia mecanica era “++++”, despues del aplastamiento, el coagulo se rompia en dos fragmentos conectados. Para el coagulo2-4 (2,0%, 2:1 y solucion de
CaCl2 al 3%), casi no exudaba llquido (puntuado como +), el coagulo no se retrala, la resistencia mecanica era "++++", despues del aplastamiento, el coagulo tenia solo un agujero en el centro (Tabla 11, FIG. 10).
[0109] En este experimento (Tabla 11 y FIG. 10), los ocho coagulos no se retralan significativamente, pero a
5 partir de la cantidad de llquido expulsado y las fotos de los coagulos antes del aplastamiento, la retraccion de los coagulos con quitosan al 2% en p/p era menor que los coagulos con quitosan al 1,62% en p/p. Aunque el ensayo de resistencia mecanica mostraba puntuacion identica para todos los coagulos, parecla que la resistencia mecanica de los coagulos preparados con quitosan al 2% en p/p era ligeramente mejor (despues de aplastamiento, 2 de 4 muestras tenlan solo un agujero en el centro de los coagulos, 1 de 4 muestras se rompla en dos fragmentos 10 conectados y 1 de 4 muestras se rompla en dos fragmentos) que los coagulos preparados con 1,62% en p/p de quitosan (despues de aplastamiento, 4 de 4 muestras se rompian en dos fragmentos conectados).
7- Tratamiento histologico y evaluacion de la homogeneidad de coagulos de PRP/quitosan
15 [0110] El tratamiento histologico y la evaluacion de la homogeneidad se realizaron como se describe en lo
que antecede.
[0111] Los resultados de la evaluacion histologica (Tabla 12) mostraban que la homogeneidad de los ocho
coagulos era satisfactoria (ninguno de ellos era -, todos estaban por encima de ±). Para el coagulo1-1 (1,62%, 3:1, 20 CaCl2 al 1,3%), la homogeneidad era +; para el coagulo1-2 (2,0%, 3:1, CaCl2 al 1,3%), la homogeneidad era +; para el coagulo1-3 (1,62%, 2:1, CaCh al 1,3%), la homogeneidad era +; para el coagulo1-4 (2,0%, 2:1, CaCh al 1,3%), la homogeneidad era + (entre ± y +); para el coagulo2-1 (1,62%, 3:1, CaCl2 al 3%), la homogeneidad de coagulo + (entre ± y +); para el coagulo2-2 (2,0%, 3:1, CaCl2 al 3%), la homogeneidad era + (entre ± y +); para el coagulo2-3 (1,62%, 2:1, CaCl2 al 3%), la homogeneidad de coagulo + (entre ± y +); para el coagulo2-4 (2,0%, 2:1, CaCl2 al 3%), 25 la homogeneidad era +.
30
[0112] La homogeneidad de los coagulos preparados con solucion de CaCh al 1,3% en p/p (3 de 4 muestras
eran +, 1 de 4 muestras era entre ± y +) era mejor que los coagulos de preparados con solucion de CaCl2 al 3% en p/p (1 de 4 era muestras +, 3 de 4 muestras era entre ± y +).
Tabla 12
- Homogeneidad del coagulo
- PRP 1-1-60 (1,62%, 3:1, CaCl2 al 1,3%)
- +
- PRP 1-2-60 (2,0%, 3:1, CaCl2 al 1,3%)
- +
- PRP 3-1-60 (1,62%, 2:1, CaCl2 al 1,3%)
- +
- PRP 1-4-60 (2,0%, 2:1, CaCh al 1,3%)
- + (entre ± y +)
- PRP 2-1-60 (1,62%, 3:1, CaCh al 3%)
- + (entre ± y +)
- PRP 2-2-60 (2,0%, 3:1, CaCh al 3%)
- + (entre ± y +)
- PRP 2-3-60 (1,62%, 2:1, CaCh al 3%)
- + (entre ± y +)
- PRP 2-4-60 (2,0%, 2:1, CaCh al 3%)
- +
EJEMPLO 4
35 Formulacion y caracterizacion de coagulos de PRP/quitosan preparados con soluciones de quitosan de diferentes pesos moleculares (sangre de conejo) y un procedimiento de mezcla de inversion
1- Preparacion de solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (38 mM)-NaCl (160 mM); sin NaOH, pH: 6,6; Volumen total: 10,0 ml 40
[0113] Las soluciones de quitosan-HCl-NaCl se prepararon con quitosan de Mn 232 kDa, DDA 81% o con quitosan de Mn 298 kDa, DDA 76% como se describe en lo que antecede. El pH de las soluciones de quitosan era fisiologico a 6,6 y 6,5 y la osmolalidad tambien era fisiologica (332 y 330 mOsm/kg; Tabla 13).
45 2- Preparacion de solucion de quitosan (1,62% en p/p)-HCl (71 mM)-pGP (2,15%), pH: 6,6, Volumen total: 9,0 ml (usando respectivamente quitosan CH1007028, CH0050602A)
[0114] Las soluciones de quitosan-HCl-pGP se prepararon con quitosan de Mn 232 kDa, DDA 81% o con quitosan de Mn 298 kDa, DDA 76% como se describe en lo que antecede. El pH de las soluciones de quitosan era
fisiologico a 6,7 y la osmolalidad tambien era fisiologica (341 y 339 mOsm/kg; Tabla 13).
Tabla 13
- Composicion y propiedades de soluciones de quitosan
- Solucion N° y tipo
- Cquitosan (% p/p) Chci (mM) CNaCI (mM) CpGP (% p/p) Precipitacion pH (Medido) Osomolaridad (mOsm)
- 1-1. Quitosan-HCI NaCl pH6,6 (CH0100702B)
- 1,62 38 160 no no 6,61 332
- 1-2. Quitosan-HCl-pGP pH6,6 (CH0100702B)
- 1,62 71 No 2,15 no 6,67 341
- 2-1. Quitosan-HCl-NaCI pH6,6 (CH0050602A)
- 1,62 38 160 no no 6,52 330
- 2-2. Quitosan-HCl-pGP pH6,6 (CH0050602A)
- 1,62 71 No 2,15 no 6,65 339
5 3- Extraction de sangre
[0115] La sangre se extrajo de conejos usando una tecnica esteril, como se describe en lo que antecede. Se uso un conejo en este experimento.
10 4- Aislamiento de PRP de sangre completa anticoagulada
[0116] El PRP se aislo a partir de sangre completa de conejo por centrifugacion diferencial como se describe en lo que antecede. Se recogieron aproximadamente 4,5 ml de PRP de la sangre ACD recogida del conejo.
15 5- Parte 1 del experimento: Formulation y caracterizacion de coagulos de PRP/quitosan al 1,62% (con NaCI y (3GP)
[0117] Se prepararon mezclas de PRP/quitosan-HCl-NaCl con una relacion de mezcla de 3:1 en v/v: se pipetearon 0,9 ml de plasma rico en plaquetas (PRP) en criotubos que contenlan 300 pl de solucion quitosan al 1,62% en p/p-HCl-NaCl (pH 6,6), y tres bolas de acero inoxidable de 0,39 g, se mezclaron manualmente durante 10
20 segundos (el tubo se agito e invirtio aproximadamente 50 veces energicamente). Se anadieron 240 pl de solucion de CaCl2 al 3% en p/p a la mezcla de PRP/quitosan y se mezclo suavemente invirtiendo el tubo 5 veces en 5 segundos. Se transfirieron 300 pl de cada mezcla a tres tubos de vidrio para preparar 3 coagulos: 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo inmediatamente despues de coagulado, 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de coagulacion y se fijo despues de 60 minutos y 1 coagulo se uso para el ensayo del tiempo de 25 coagulacion y la resistencia mecanica despues de 60 minutos. Se repitieron todos los procedimientos que se han descruti en lo que antecede mezclando PRP con solucion de quitosan al 1,62% en p/p-HCl-pGP (pH 6,6) en lugar de solucion de quitosan al 1,62% en p/p-HCl-NaCl (pH 6,6). Todos los procedimientos que se describen en lo que antecede se realizaron con 2 quitosanes diferentes: quitosan CH0100702B (Mn 232 kDa, DDA 81%) y quitosan CH0050602A (Mn 298 kDa, DDA 76%).
30
[0118] La coagulacion del coagulo se determino por visualizacion del coagulo a 37°C como se describe en lo que antecede. La resistencia mecanica se ensayo como se describe en lo que antecede.
[0119] Los resultados mostraron que todas las mezclas preparadas con quitosan CH0100702B (Mn 232 kDa, 35 DDA 81%) coagulaban en el espacio de 8 minutos. El tiempo de coagulacion de los coagulos de PRP/quitosan-HCl-
NaCl era casi igual al tiempo de coagulacion de los coagulos de PRP/quitosan-HCl-pGP (la media era de 7,3 minutos frente a 7 minutos, respectivamente) (Tabla 14 y FIG. 11). Los resultados mostraron que todas las mezclas preparadas con quitosan CH0050602A (Mn 298 kDa, dDa 76%) coagulaban en el espacio de 8 minutos. El tiempo de coagulacion de los coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl era casi igual al tiempo de coagulacion de los coagulos 40 de PRP/quitosan-HCl-pGP (la media era de 7 minutos frente a 8 minutos, respectivamente) (Tabla 14 y FIG. 11).
Tabla 14
Tiempo de coagulacion de coagulos de PRP/quitosan preparados por inversion con los quitosanes ___________________________CH0100702B y CH0050602A _________________________
- Mezcla
- Concentracion de solucion Tiempo de Valor Cometarios
- de quitosan y relacion de coagulacion medio
- mezcla (min) (min)
- PRP/quitosan-HCl-NaCl CH0100702B
- 1,62% y 3:1 (coagulo1-1) 1 8 7,3 Todas las mezclas coagulaban en el espacio de 8 minutos (de 7 minutos a 8 minutos)
- 2
- 7
- 3
- 7
- PRP/quitosan-HCl-pGP CH0100702B
- 2,0% y 3:1 (coagulo1-2) 1 7 7 Todas las mezclas coagulaban a los 7 minutos).
- 2
- 7
- 3
- 7
- PRP/quitosan-HCl-NaCl CH0050602A
- 1,62% y 2:1 (coagulo1-3) 1 7 7 Todas las mezclas coagulaban a los 7 minutos.
- 2
- 7
- 3
- 7
- PRP/quitosan-HCl-pGP CH0050602A
- 2,0% y 2:1 (coagulo1-4) 1 8 8 Todas las mezclas coagulaban a los 8 minutos.
- 2
- 8
- 3
- 8
- PRP sin quitosan
- Sin quitosan (Coagulo-C) 1 16 15,3 Todas las mezclas coagulaban en el espacio de 16 minutos (de 15 minutos a 16 minutos).
- 2
- 15
- 3
- 15
6- Ensayo de resistencia mecanica y expulsion de liquido
[0120] Todos los coagulos preparados por inversion eran firmes y elasticos, la resistencia mecanica de todos
5 los coagulos era "++++". No habia diferencias significativas en la resistencia mecanica entre los coagulos de PRP/quitosan-HCl-NaCl y los coagulos de PRP/quitosan-HCl. No habia diferencias significativas tampoco en la resistencia mecanica entre los coagulos preparados con los diferentes quitosanes (Tabla 15 y FIG. 12). Despues de 60 minutos, los coagulos de PRP/quitosan preparados por inversion con CH0100702B y CH0050602A, ambos con NaCl o pGP, no expulsaban ningun liquido ni se retraian (Tabla 15, Figs. 13 y 14), los coagulos estaban 10 perfectamente intactos. Mientras tanto, el coagulo de PRP sin quitosan expulsaba una gran cantidad de Kquido (82,9%) y se retraia significativamente (Tabla 15, Figs. 13 y 14).
Tabla 15
- Ensayo de resistencia mecanica de coagulos de PRP/quitosan preparados por inversion
- Muestra
- Resistencia a la compresion Peso del tubo (A) Peso del tubo + coagulo + suero (B) Peso del tubo + coagulo (C) Liquido expulsado = (B-C)/(B A) X 100 Aspecto aplastado Nivel de hemolisis
- PRP/quitosan al 1,62%-HCl-NaCl (pH6,6) coagulo1-1 (3:1, CH0100702B)
- + + + + 7,47 g 7,86 g 7,86 g 0 2 fragmentos pero todavia conectados -
- PRP/quitosan al 1,62%-HCl-pGP (pH6,6) coagulo1-2 (3:1, CH0100702B)
- + + + + 7,46 g 7,84 g 7,84 g 0 2 fragmentos pero todavia conectados -
- PRP/quitosan al 1,62%-HCl-NaCl (pH6,6) coagulo2-1 (3:1, CH0050602A)
- + + + + 7,53 g 7,92 g 7,92 g 0 Agujero en el centro -
- PRP/quitosan al 1,62-HCl-pGP (pH6,6) coagulo2-2 (3:1, CH0050602A)
- + + + + 7,48 g 7,86 g 7,86 g 0 2 fragmentos pero todavia conectados -
- PRP puro coagulo- C (sin quitosan)
- + + + + 7,38 g 7,73 g 7,44 g 82,9 2 fragmentos pero todavia conectados +
15 8- Tratamiento histologico y evaluacion de la homogeneidad de coagulos de PRP/quitosan
[0121] El tratamiento histologico y la evaluation de la homogeneidad se llevaron a cabo como se describe en lo que antecede.
[0122] Los coagulos PRP/quitosan preparados por inversion con pGP eran mas homogeneos (1 de 2 5 muestras era "+" y uno era "± entre ± y +) que los coagulos de PRP/quitosan preparados por inversion con NaCl
(ambas muestras eran " - ") (Tabla 16).
Tabla 16
- Homogeneidad de coagulos de PRP/quitosan preparados por inversion
- Muestras de coagulo (con NaCl)
- Homogeneidad de los coagulos (con NaCl) Muestras de coagulo (con PGP) Homogeneidad de los coagulos (con PGP)
- PRP 1-1 (CH0100702B)
- - PRP 1-2 (CH0100702B) +
- PRP 2-1 (CH0050602A)
- - PRP 2-2 (CH0050602A) ± (entre ± y +)
- PRP-C (sin quitosan)
- + N/A N/A
10 [0123] La invention es como se define en las reivindicaciones adjuntas. Aunque la invention se ha descrito
en conexion con realizaciones especlficas de la misma, se entendera que puede tener modificaciones adicionales y esta previsto que esta solicitud cubra cualquier variation, uso o adaptation de la invencion siguiendo, en general, los principios de la invencion e incluyendo dichas desviaciones de la presente description como parte de la practica conocida o habitual en la tecnica a la que pertenece la invencion y que se puede aplicar a las caracterlsticas 15 esenciales expuestas en lo que antecede, y como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Una composicion polimerica activada por coagulacion que comprende una mezcla de plasma rico en plaquetas (PRP), un quitosan, un acido mineral u organico, la sal inorganica NaCl y un activador de la coagulacion;5 en la que dicho PRP es el unico producto derivado de sangre en la composicion polimerica activada por coagulacion; y en la que el activador de la coagulacion es una solucion de CaCl2, en la que la concentracion de CaCl2 es entre 1,3% en p/p a 3% en p/p;en la que el quitosan, el acido y la sal permiten que el PRP sea activado por el activador de la coagulacion para 10 formar un gel de plaquetas o un coagulo de plaquetas;en la que la composicion polimerica tiene un pH entre 6,2 y 6,8 y se prepara con una solucion de quitosan que tiene una osmolalidad entre 250 mOsm/kg y 600 mOsm/kg; y15 en la que la composicion polimerica activada por coagulacion no contiene fosfato de glicerol.
- 2. La composicion polimerica activada por coagulacion de la reivindicacion 1, preparada combinando dicho PRP con una solucion de quitosan que comprende dicho quitosan, dicho acido mineral u organico y dicha sal en una relacion en volumen de 4:1, preferiblemente 3:1, mas preferiblemente 2:1 e incluso mas preferiblemente 1:1.20
- 3. La composicion polimerica activada por coagulacion de la reivindicacion 1 o 2, preparada con una solucion que tiene una concentracion de quitosan entre 1,0% en p/p a 10% en p/p, preferiblemente entre 1,62% en p/p y 2% en p/p.25 4. La composicion polimerica activada por coagulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,en la que el quitosan tiene un grado de desacetilacion (DDA) entre 20% y 100%, preferiblemente 76% u 81%.
- 5. La composicion polimerica activada por coagulacion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el quitosan tiene un peso molecular medio en numero (Mn) en el intervalo de 1 kDa a 10 MDa,30 preferiblemente 232 kDa o 298 kDa.
- 6. La composicion polimerica activada por coagulacion como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para usar en la reparacion de un tejido en un sujeto, en la que la composicion polimerica activada por coagulacion se adhiere al tejido y promueve la proliferacion celular.35
- 7. Un procedimiento de preparacion de una composicion polimerica activada por coagulacion para reparar tejido en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:(a) disolver de 1,0% en p/p a 10,0% en p/p de quitosan en HCl para proporcionar una mezcla de quitosan-HCl;40 (b) anadir una solucion de NaCl a la mezcla de quitosan-HCl para proporcionar una mezcla de quitosan-HCl-sal;(c) mezclar plasma rico en plaquetas (PRP) con la mezcla de quitosan-HCl-sal en una relacion en volumen entre 4:1 y 1:1 para proporcionar una mezcla de PRP/quitosan-HCl-sal; y(d) anadir un activador de la coagulacion a la mezcla de PRP/quitosan-HCl-sal en una relacion en volumen entre 5:1 y 10:1, en el que el activador de la coagulacion es una solucion de CaCl2, en el que la concentracion de CaCl2 es45 entre 1,3% en p/p y 3% en p/p;en el que dicho PRP es el unico producto derivado de la sangre en la composicion polimerica activada por coagulacion; y en el que la composicion polimerica activada por coagulacion no comprende fosfato de glicerol.
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