ES2692522T3

ES2692522T3 - Anticuerpo anti-cMet y su utilización para la detección y el diagnóstico del cáncer

Info

Publication number: ES2692522T3
Application number: ES10744608.0T
Authority: ES
Inventors: Liliane Goetsch; Alexandra Jouhanneaud
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2010-08-23
Publication date: 2018-12-04
Anticipated expiration: 2030-08-23
Also published as: TW201111781A; NZ598194A; MX2012002139A; NZ700437A; SG178339A1; BR112012003759A2; US20120149031A1; ZA201202076B; JP5951486B2; JP2013502213A; IL218202A; EP2467402B1; CN102639564A; EP2287197A1; IL218202A0; CA2769427A1; EP2467402A1; WO2011020925A1; KR20120051734A; RU2012109004A

Abstract

Anticuerpo, o fragmento funcional o derivado del mismo, apto para unirse a c-Met, estando dicho anticuerpo caracterizado por que se selecciona de entre el grupo que consiste en: a) un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, que comprende: - una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes como se define según IMGT, respectivamente CDR-H1 que presenta la secuencia SEC ID nº 7, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID nº 2 y CDR-H3 que presenta la secuencia SEC ID nº 8, y - una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes como se define según IMGT, respectivamente CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID nº 4, CDR-L2 que presenta la secuencia SEC ID nº 5 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID nº 6; y b) un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, que comprende: - una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes como se define según IMGT, respectivamente CDR-H1 que presenta la secuencia SEC ID nº 29, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID nº 30 y CDR-H3 que presenta la secuencia SEC ID nº 31; y - una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes como se define según IMGT, respectivamente CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID nº 32, CDR-L2 que presenta la secuencia SEC ID nº 33 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID nº 34.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpo anti-cMet y su utilizacion para la deteccion y el diagnostico del cancer.

La presente invencion se refiere al campo del pronostico y/o diagnostico de una enfermedad proliferativa en un paciente. Mas particularmente, la invencion se refiere a un nuevo anticuerpo apto para unirse espedficamente al receptor cMet humano, asf como las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos que codifican este anticuerpo. La invencion comprende asimismo la utilizacion de dicho anticuerpo y los procedimientos correspondientes para la deteccion y diagnostico de trastornos oncogenos patologicos hiperproliferativos asociados a la expresion de cMet. En ciertas formas de realizacion, los trastornos son trastornos oncogenos con expresion incrementada del polipeptido cMet con respecto a la normal, o cualquier otra patologfa asociada a la sobreexpresion de cMet. La invencion comprende, por ultimo, los productos y/o composiciones o kits que comprenden por lo menos un anticuerpo de ese tipo para el pronostico o diagnostico de ciertos canceres.

Los agentes dirigidos al receptor de tirosina cinasa (RTK) tales los inhibidores trastuzumab, cetuximab, bevacizumab, imatinib y gefitinib han ilustrado el interes de adoptar como diana esta protema para el tratamiento de canceres seleccionados.

cMet, es el miembro prototfpico de una subfamilia de RTKs que tambien incluye RON y SEA. La familia de RTK cMet es estructuralmente diferente de otras familias de RTK y es el unico receptor conocido con alta afinidad por el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), tambien denominado factor disperso (SF) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10:2867-2878]. cMet y HGF se expresan ampliamente en una variedad de tejidos y su expresion se limita normalmente a las celulas de origen epitelial y mesenquimatico, respectivamente [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991,6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123:223-235]. Ambos son necesarios para el desarrollo normal de los mairnferos y se ha demostrado que son particularmente importantes en la migracion celular, la diferenciacion morfogena y la organizacion de las estructuras tubulares tridimensionales, asf como en su crecimiento y angiogenesis [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. Si bien se ha demostrado que la regulacion controlada de cMet y HGF es importante para el desarrollo de los mamfferos, el mantenimiento y reparacion de tejidos [Nagayama T, Nagayama M, Kohara S, Kamiguchi H, Shibuya M, Katoh Y, Itoh J, Shinohara Y., Brain Res. 2004, 5;999(2):155-66; Tahara Y, Ido A, Yamamoto S, Miyata Y, Uto H, Hori T, Hayashi K, Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1):146-51], su desregulacion esta implicada en el progreso de los canceres.

La senalizacion aberrante desencadenada por la activacion incorrecta de cMet es una de las aberraciones mas frecuentes observadas en los canceres humanos y desempena una funcion crucial en la tumorigenesis y metastasis [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino y Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2(4):289-300].

La activacion incorrecta de cMet se puede suscitar mediante mecanismos dependientes de ligandos e independientes, que incluyen la sobreexpresion de cMet, y/o la activacion paracrina o autocrina, o por una ganancia de mutacion de funciones [J.G. Christensen, Burrows J. y Salgia R., cancer Latters. 2005, 226:1-26]. Sin embargo, es necesaria la oligomerizacion del receptor cMet, en presencia o ausencia del ligando, para regular la afinidad de union y la cinetica de union de la cinasa hacia sustratos peptfdicos con contenido de aTp y tirosina [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Ago. 17, 43:10570-8]. El cMet activado recluta efectores de la senalizacion hacia su sitio de multianclaje situado en el dominio del citoplasma, para dar lugar a la activacion de varias vfas de senalizacion clave, que incluyen Ras-MAPK, PI3K, Src y Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Estas vfas son esenciales para la proliferacion de celulas tumorales, invasion y angiogenesis y para eludir la apoptosis [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H, Neel BG, Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3):122-30; Fan S, Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q, Cao Y, Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Abr 27, 19(18):2212-23]. Ademas, una faceta singular de la senalizacion de cMet con respecto a los otros RTK es su interaccion informada con los complejos de adhesion focal y asociados que no se unen a cinasas tales como las integrinas a6p4 [Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R, Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M, Prevo R, Smit L, David G, Hartmann G, Gherardi E, Pals ST, J Biol Chem. 1999, 274(10):6499-506], Plexina B1 o semaforinas [Giordano S, Corso S, Conrotto P, Artigiani S, Gilestro G, Barberis D, Tamagnone L, Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P, Valdembri D, Corso S, Serini G, Tamagnone L, Comoglio PM, Bussolino F, Giordano S, Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23:5131-7] que pueden agregar aun mas a la complejidad de regulacion de la funcion celular por su receptor. Por ultimo, los datos recientes demuestran que cMet puede estar implicado en la resistencia de los tumores al gefitinib o erlotinib, lo que sugiere que la combinacion de compuestos que se dirigen tanto al EGFR como a cMet podnan ser de considerable interes [Engelman JA at al., Science, 2007, 316:1039-43].

En los ultimos anos, se han desarrollado numerosas estrategias para atenuar la senalizacion de cMET en estirpes de celulas cancerosas. Estas estrategias incluyen i) anticuerpos neutralizantes contra cMet o HGF/SF

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[Cao B, Su Y, Oskarsson M, Zhao P, Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98(13):7443-8; Martens T, Schmidt NO, Eckerich C, Fillbrandt R, Merchant M, Schwall R, Westphal M, Lamszus K, Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] o el uso del antagonista de HGF/SF NK4 para prevenir la union del ligando a cMet [Kuba K, Matsumoto K, Date K, Shimura H, Tanaka M, Nakamura T, Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) pequenos inhibidores del sitio de union de ATP a cMet que bloquean la actividad de cinasa [Christensen JG, Schreck R, Burrows J, Kuruganti P, Chan E, Le P, Chen J, Wang X, Ruslim L, Blake R, Lipson KE, Ramphal J, Do S, Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) polipeptido de dominio SH2 de diseno que interfiere con el acceso al sitio de multianclaje y ARNi o ribozima que reduce la expresion del receptor o ligando. La mayona de estas estrategias exhiben una inhibicion selectiva de cMet, que da lugar a la inhibicion de los tumores y demuestra que cMet podna ser de interes para la intervencion terapeutica en el cancer.

El objetivo de la presente invencion consiste en producir por lo menos un reactivo que se puede utilizar como biomarcador de diagnostico o pronostico para detectar y/o monitorear trastornos oncogenos, especialmente los que se caracterizan por la expresion de cMet o los que son mediados por la expresion aberrante de cMet. Por lo tanto, la invencion es como se reivindica.

No se han dado a conocer intentos anteriores por desarrollar un anticuerpo valioso que se pueda utilizar como herramienta de diagnostico o pronostico. En la presente memoria se describen nuevos anticuerpos que satisfacen estos criterios.

En un primer aspecto, un asunto de la invencion es un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, que se une al receptor cMET (cMet) preferentemente cMet humano, con alta afinidad y, por lo tanto, puede ser de utilidad en procedimientos para diagnosticar trastornos oncogenos hiperproliferativos mediados por la expresion de cMet.

Las expresiones “fragmento(s) funcional(es) y/o derivado(s)” se definen en detalle a continuacion en la presente memoria descriptiva.

Debe apreciarse en la presente memoria que la divulgacion no se refiere a los anticuerpos en su forma natural; es decir, que no estan en su ambiente natural sino que han podido ser aislados u obtenidos mediante purificacion de fuentes naturales o de lo contrario obtenidos por recombinacion genetica o por smtesis qmmica, y que entonces pueden contener aminoacidos no naturales, como se describe a continuacion con mayor detalle.

Mas particularmente, de acuerdo con otro aspecto de la invencion, se reivindica un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, con capacidad para unirse espedficamente a cMet, caracterizandose dicho anticuerpo por que comprende por lo menos una region determinante de complementariedad (CDR) seleccionada de entre las CDR que comprenden las secuencias de aminoacidos SEC ID n° 1 a 12 o 29 a 39 o por lo menos una CDR cuya secuencia presenta por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad despues del alineamiento optimo con las secuencias 1 a 12 o 29 a 39.

Un “fragmento funcional” de un anticuerpo se refiere espedficamente a un fragmento de anticuerpo, como por ejemplo los fragmentos Fv, scFv (sc= cadena simple), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se haya incrementado. Dichos fragmentos funcionales se describen con mayor detalle a continuacion en la presente descripcion.

Un “compuesto derivado” o “derivado” de un anticuerpo se refiere, en particular, a una protema de union compuesta por un andamiaje peptfdico y por lo menos una de las CDR del anticuerpo original para conservar su capacidad para ser reconocido. Dichos compuestos derivados, muy conocidos por un experto en la materia, se describen a continuacion en la presente descripcion.

Mas preferentemente, la invencion comprende los anticuerpos, sus compuestos derivados o sus fragmentos funcionales de acuerdo con la presente invencion, obtenidos por recombinacion genetica o smtesis qmmica.

De acuerdo con una forma de realizacion preferida, el anticuerpo de acuerdo con la invencion, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracteriza por consistir en un anticuerpo monoclonal.

Debe apreciarse que la expresion “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo que surge de una poblacion casi homogenea. Mas espedficamente, los anticuerpos individuales de una poblacion son identicos, excepto por unas pocas mutaciones de origen natural posibles que se pueden encontrar en proporciones irnnimas. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal consiste en un anticuerpo homogeneo que surge del cultivo de un unico clon celular (por ejemplo, un hibridoma, una celula hospedadora eucariota transfectada con una molecula de ADN que codifica el anticuerpo homogeneo, una celula hospedadora procariota transfectada con una molecula de ADN que codifica el anticuerpo homogeneo, etc.) y generalmente se caracteriza por cadenas pesadas una, y solo una clase y subclase, y cadenas ligeras unicamente de un tipo. Los anticuerpos monoclonales son altamente espedficos y se dirigen contra un unico antfgeno. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos

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policlonales que incluyen, por lo general, diversos anticuerpos dirigidos contra diversos determinates, o epttopos, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo epttopo del antigeno.

Preferentemente, las CDR del anticuerpo se definen de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT.

Se ha definido la numeracion caractenstica de IMGT para comparar los dominios variables sin importar el receptor del antfgeno, el tipo de cadena o la especie [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. y Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. En la numeracion caractenstica IMGT, los aminoacidos conservados tienen siempre la misma posicion, por ejemplo cistema 23 (1a-CYS), triptofano 41 (TRP-CONSERVADO), aminoacido hidrofobo 89, cistema 104 (2a-CYS), fenilalanina o triptofano 118 (J-PHE o J-TRP). La singular numeracion IMGT ofrece una delimitacion normalizada de las regiones de marco (FR1-IMGT: posiciones 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 y FR4-IMGT: 118 a 128) y de las regiones determinantes de la complementariedad: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 y CDR3-IMGT: 105 a 117. Como los huecos representan posiciones no ocupadas, los tramos de CDR-IMGT (expuestos entre parentesis y separados por puntos, por ej. [8.8.13]) se convierten en informacion crucial. La singular numeracion de IMGT se utiliza en representaciones graficas 2D, designadas IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. y Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. y Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], y en estructuras 3D en IMGT/estructura3D-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. y Lefranc, M.- P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Existen tres CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El termino CDR o CDRs se utiliza en la presente memoria para indicar, segun el caso, una o varias de estar regiones o incluso la totalidad de estas regiones que contienen la mayor parte de los residuos aminoacidos responsables de la union por afinidad del anticuerpo por el antfgeno y el epttopo que reconoce.

Mas particularmente, de acuerdo con un primer aspecto, la invencion se refiere a un anticuerpo aislado, o un fragmento o derivado funcional del mismo, con capacidad para unirse espedficamente a la protema c-Met, que comprende i) una cadena pesada que comprende por lo menos una de las siguientes CDR-H1, CDR-H2 y CDR- H3, segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, donde CDR-H1 comprende la secuencia SEC ID n° 55, CDR-H2 comprende la secuencia SEC ID n° 56 y CDR-H3 comprende la secuencia SEC ID n° 57; y/o ii) una cadena ligera que comprende por lo menos una de las siguientes CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, donde CDR-L1 comprende la secuencia SEC ID n° 58, CDR-L2 comprende la secuencia SEC ID n° 59 y CDR-L3 comprende la secuencia SEC ID n° 60.

Una forma de realizacion preferida proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional o derivado del mismo, con capacidad para unirse espedficamente a la protema c-Met, que se caracteriza por que comprende i) una cadena pesada que comprende por lo menos las siguientes tres CDR CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, donde CDR-H1 comprende la secuencia SEC ID n° 55, CDR-H2 comprende la secuencia SEC ID n° 56 y CDR-H3 comprende la secuencia SEC ID n° 57; y/o ii) una cadena ligera que comprende por lo menos las siguientes tres CDR: CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, donde CDR-L1 comprende la secuencia SEC ID n° 58, CDR-L2 comprende la secuencia SEC ID n° 59 y CDR-L3 comprende la secuencia SEC ID n° 60.

Para ponerse mas claramente de manifiesto, las secuencias consenso SEC ID n° 55 a 60 de la invencion estan resumidas en la siguiente tabla 1.

Tabla 1

: SEC ID n° Secuencia (IMGT)

CDR-H1: 55 GYX1X2TSX3YX4

CDR-H2: 56 INX5X6X7GX8X9

CDR-H3: 57 X10RX11 X12X13X14X15X16X1yY

CDR-L1: 58 X18X19X20X21X22Y

CDR-L2: 59 X23X24S

CDR-L3: 60 QQX25NSX26PX27T

Donde:

X1: S o T: X2: I o F X3: A o - X4: F o W

X5: Y o P: X6: D o S X7: - o N X8: T o R

X9: N o T: X10: T o A X11: D o R X12: R o V

X13: T o G: X14: F o Y X15: A o L X16: - o M

X17: - o D: X18: Q o - X19: R o S X20: I o S

X21: Y o V: X22: N o S X23: Y o D X24: A o T

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X25: S o W____________X2S: W o N_____________X27: L o P___________________________________

“-“ corresponde a “ausente (eliminacion del residuo aminoacido en esta posicion)_____________________

De acuerdo con una forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes definidas segun el IMGT, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde CDR-H1 comprende la secuencia SEC ID n° 7, CDR-H2 comprende la secuencia SEC ID n° 2 and CDR-H3 comprende la secuencia SEC ID n° 8.

De acuerdo con una forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes definidas segun el IMGT, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde CDR-L1 comprende la secuencia SEC ID n° 4, CDR-L2 comprende la secuencia SEC ID n° 5 and CDR-L3 comprende la secuencia SEC ID n° 6.

De acuerdo con una forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, respectivamente CDR- H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde CDR-H1 comprende la secuencia SEC ID n° 29, CDR-H2 comprende la secuencia SEC ID n° 30 y CDR-H3 comprende la secuencia SEC ID n° 31.

De acuerdo con una forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, respectivamente CDR- L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde CDR-L1 comprende la secuencia SEC ID n° 32, CDR-L2 comprende la secuencia SEC ID n° 33 y CDR-L3 comprende la secuencia SEC ID n° 34.

Es decir, se proporciona en la presente memoria un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena pesada seleccionada de entre el grupo que consiste en:

a) una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, CDR-H1 que presenta la secuencia SEC ID n° 7, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID n° 2 y CDR-H3 que presenta la secuencia SEC ID n° 8 respectivamente y

b) una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, CDR-H1 que presenta la secuencia SEC ID n° 29, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID n° 30 y CDR-H3 que presenta la secuencia SEC ID n° 31 respectivamente.

Se proporciona asimismo en la presente memoria un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que se caracteriza por comprender una cadena ligera seleccionada de entre el grupo que consiste en:

a) una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID n° 4, CDR-L2 que presenta la secuencia SEC ID n° 5 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID n° 6, respectivamente y

b) una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes segun lo definido de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT, CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID n° 32, CDR-L2 que presenta la secuencia SEC ID n° 33 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID n° 34 respectivamente.

En otra forma de realizacion, region determinante de la complementariedad, o CDR, se refiere a regiones hipervariables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas segun lo definido por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 y ediciones posteriores). Existen tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera. En este contexto, los terminos “CDR” y “CDR” se utilizan para indicar, dependiendo del caso, una o mas, o incluso todas, las regiones que contienen la mayona de los residuos aminoacidos responsables de la afinidad de union del anticuerpo por el antfgeno o el epttopo que reconoce.

De acuerdo con otra forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes definidas de acuerdo con Kabat, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde CDR-H1 comprende la secuencia SEC ID n° 9, CDR-H2 comprende la secuencia SEC ID n° 10 y CDR-H3 comprende la secuencia SEC ID n° 3.

De acuerdo con otra forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena ligera que comprende las

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tres CDR siguientes definidas de acuerdo con Kabat, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde CDR- L1 comprende la secuencia 11, CDR-L2 comprende la secuencia 12 y CDR-L3 comprende la secuencia 6.

De acuerdo con otra forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmented funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes definidas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, respectivamente: CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3, donde CDR-H1 comprende la secuencia SEC ID n° 35, CDR-H2 comprende la secuencia SEC ID n° 36 y CDR-H3 comprende la secuencia SEC ID n° 37.

De acuerdo con otra forma de realizacion particular, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes definidas de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde CDR-L1 comprende la secuencia SEC ID n° 38, CDR-L2 comprende la secuencia SEC ID n° 39 y CDR-L3 comprende la secuencia SEC ID n° 34.

Otra manera de definir las CDR de los anticuerpos de acuerdo con la presente invencion puede consistir en determinar los residuos comunes correspondientes a cada CDR de acuerdo con IMGT y a continuacion Kabat.

De acuerdo con otra forma de realizacion, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena pesada que comprende por lo menos una de las tres CDR de las secuencias SEC ID Nos. 1, 2 o 3, o por lo menos una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad despues del alineamiento optimo, con las secuencias SEC ID Nos. 1,2 o 3.

Mas particularmente, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena ligera que comprende por lo menos una de las tres CDR de las secuencias SEC ID Nos. 4, 5 o 6, o por lo menos una secuencia con al menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad, despues del alineamiento optimo, con las secuencias SEC ID Nos. 4, 5 o 6.

De una manera preferida, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes, respectivamente CDR-H1, CDR-H2 y cDr-H3, donde:

- CDR-H1 comprende la secuencia SEC ID n° 1, 7, 9, 29 o 35, o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 1, 7, 9, 29 o 35;

- CDR-H2 comprende las secuencias SEC ID n° 2, 10, 30 o 36, o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 2, 10, 30 o 36 y

- CDR-H3 comprende la secuencia SEC ID n° 3, 8, 31 o 37, o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 3, 8, 31 o 37.

Aun mas preferentemente, el anticuerpo de la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, se caracteriza por el hecho de que comprende una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes, respectivamente CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3, donde:

- CDR-L1 comprende la secuencia SEC ID n° 4, 11, 32 o 38, o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 4, 11, 32 o 38;

- CDR-L2 comprende las secuencias SEC ID n° 5, 12, 33 o 39, o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 5, 12, 33 o 39 y

- CDR-L3 comprende la secuencia SEC ID n° 6 o 34, o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 6 o 34.

La invencion se refiere a un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que se caracteriza por ser seleccionado de entre el grupo que consiste en:

a) un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que comprende:

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- una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes definidas segun el IMGT,

respectivamente CDR-H1 que presenta la secuencia SEC ID n° 7, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID n° 2 y CDR-H3 que presenta la secuencia SEC ID n° 8 y

- una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes definidas segun el IMGT, respectivamente CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID n° 4, CDR-L2 que presenta la secuencia SEC ID n° 5 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID n° 6 y

b) un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que comprende:

respectivamente CDR-H1 que presenta la secuencia SEC ID n° 29, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID n° 30 y CDR-H3 que presenta la secuencia SEC ID n° 31 y

- una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes definidas segun el IMGT, respectivamente CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID n° 32, CDR-L2 que presenta la secuencia sEc ID n° 33 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID n°34.

En la presente descripcion, los terminos “polipeptidos” “secuencias de polipeptidos” “peptidos” y “protemas” unidos a compuestos del anticuerpo o sus secuencias” son intercambiables.

Para mayor claridad, debe apreciarse que, en la siguiente descripcion, y mas espedficamente en las tablas 3a y 4a, las CDR del anticuerpo denominado 224D10, se definen por la numeracion IMGT, la numeracion de Kabat y por la numeracion comun.

La numeracion comun reagrupa los residuos que forman parte de cada CDR, que son comunes a las CDR definidas por los sistemas de numeracion IMGT y de Kabat.

El sistema de numeracion IMGT define las CDR de acuerdo con el sistema IMGT definido, en tanto que el sistema de numeracion de Kabat define las CDR de acuerdo con el sistema de Kabat definido anteriormente.

Mas particularmente, la CDR-H1 consiste en la SEC ID n° 1 (TSAYF) en el sistema de numeracion comun, en la SEC ID n° 7 (GYSITSAYF) en el sistema de numeracion ImGt en la SEC ID n° 9 (TSAYFWS) en el sistema de numeracion de Kabat.

La CDR-H2 consiste en la SEC ID n° 2 (INYDGTN) en los sistemas comun y IMGT y en SEC ID n° 10 (FINYDGTNNYNPSLKN) en el sistema de numeracion de Kabat.

La CDR-H3 consiste en la SEC ID n° 3 (DRTFAY) en los sistemas de numeracion comun y de kabat, en tanto que consiste en SEC ID n° 8 (TRDRTFAY) en el sistema de numeracion IMGT.

En el caso de la cadena ligera, CDR-L1 consiste en SEC ID n° 4 (QRIYNY) en el sistema de numeracion comun y de IMGT y en SEC ID n° 11 (RASQRIYNYLH) en el sistema de numeracion de Kabat.

Con respecto a CDR-L2, esta consiste en SEC ID n° 5 (YAS) en los sistemas de numeracion comun e IMGT y en SEC ID n° 12 (YASQSIS) en el sistema de numeracion de Kabat.

Por ultimo, la CDR-L3 consiste en SEC ID n° 6 (QQSNSWPLT) segun cada uno de los tres sistemas de numeracion.

Un experto en la materia puede hacer lo mismo con respecto al anticuerpo 221C9.

Paralelamente, para mayor claridad, debe apreciarse en la siguiente descripcion, y mas espedficamente en las tablas 3b y 4b, se definen las CDR del anticuerpo denominado 221C9, segun la numeracion IMGT y la numeracion de kabat.

Como se utiliza en la presente memoria, el “porcentaje de identidad” entre dos secuencias de aminoacidos se refiere al porcentaje de nucleotidos o residuos aminoacidos identicos entre las dos secuencias que se deben comparar, obtenido tras el alineamiento optimo, porcentaje este que es puramente estadfstico y donde las diferencias entre las dos secuencias se distribuyen de manera aleatoria en toda su longitud. La comparacion de dos secuencias de acido nucleico o aminoacidos se lleva a cabo tradicionalmente comparando las secuencias despues de haberlas alineadas de manera optima, comparacion que se puede realizar por segmentos o utilizando una “ventana de alineamiento”. El alineamiento optimo de las secuencias para su comparacion se puede llevar a cabo, ademas de por comparacion manual, por medio de un algoritmo de homologfa local de Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], por medio del algoritmo de homologfa local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], por medio del procedimiento de busqueda de similitud de Pearson y Lipman

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(1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] o por medio de software de computacion que utiliza estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o mediante el software de comparacion BLAST NR o BLAST P).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de acido nucleico o aminoacidos se determina comparando las dos secuencias alineadas de manera optima en las cuales la secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos que se deben comparar pueden tener adiciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia para la alineacion optima entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad se calcula determinando el numero de posiciones en las cuales el residuo aminoacido o nucleotido es identico entre las dos secuencias, dividiendo el numero de posiciones identicas por el numero total de posiciones en la ventana de alineamiento y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre las dos secuencias.

Por ejemplo, el programa BLAST, “BLAST 2 secuencias” (Tatusova et al., “Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences”, FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250) que se puede obtener en el sitio web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, se puede utilizar con los parametros por defecto (notablemente para los parametros “penalizacion por abertura de hueco” 5 y “penalizacion por extension de hueco”: 2; donde la matriz seleccionada es, por ejemplo, la matriz “BLOSUM 62” propuesta por el programa) el porcentaje de identidad entre las dos secuencias que se deben comparar es calculado directamente por el programa.

En el caso de la secuencia de aminoacidos que presenta por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad con una secuencia de aminoacidos de aminoacidos, los ejemplos preferidos incluyen los que contienen la secuencia de referencia, ciertas modificaciones, particularmente una eliminacion, adicion o sustitucion de por lo menos un aminoacido, truncamiento o extension. En el caso de la sustitucion de uno o mas aminoacidos consecutivos o no consecutivos, se prefieren las sustituciones en las cuales se reemplazan los aminoacidos sustituidos por aminoacidos “equivalentes”. En este caso, se utiliza la expresion “aminoacidos equivalentes” para indicar cualquier aminoacido con probabilidad de ser sustituido por uno de los aminoacidos estructurales sin modificar, sin embargo, las actividades biologicas de los anticuerpos correspondientes y las de los ejemplos espedficos definidos a continuacion.

Se pueden determinar los aminoacidos equivalentes por su homologfa estructural con los aminoacidos por los cuales son sustituidos o basandose en los resultados de las pruebas comparativas de actividad biologica entre los diversos anticuerpos que probablemente se generen.

A tftulo de ejemplo no limitativo, la siguiente tabla 2 resume las posibles sustituciones que probablemente se lleven a cabo sin dar lugar a una modificacion significativa de la actividad biologica del correspondiente anticuerpo modificado; naturalmente son posibles sustituciones inversas en las mismas condiciones.

Tabla 2

Residuo original: Sustitucion (sustituciones)

Ala (A): Val, Gly, Pro

Arg (R): Lys, His

Asn(N): Gln

Asp(D): Glu

Cys(C): Ser

Gln (Q): Asn

Glu (G): Asp

Gly (G): Ala

His (H): Arg

Ile (I): Leu

Leu (L): Ile, Val, Met

Lys (K): Arg

Met (M): Leu

Phe (F): Tyr

Pro (P): Ala

Ser (S): Thr, Cys

Thr (T): Ser

Trp (W): Tyr

Tyr (Y): Phe, Trp

Val (V): Leu, Ala

Un experto en la materia sabe que en el estado actual de la tecnica, se encuentra la mayor variabilidad (longitud y composicion) entre las seis cDr en las tres CDR de cadena pesada y, mas espedficamente, en la CDR-H3 de esta cadena pesada.

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En una forma de realizacion espedfica, la presente invencion se refiere a un anticuerpo murino o compuestos derivados o fragmented funcionales del mismo.

Otra forma de realizacion de la invencion divulga el anticuerpo 224D10, o uno de sus fragmented funcionales o derivados, que comprende:

una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes, sobre la base de la definicion “comun” de las

CDR:

- CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 1 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 1;

- CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 2 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 2 y

- CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 3 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 3 y

una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes:

- CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 4 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 4;

- CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 5 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 5; y

- CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 6 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 6.

Todavfa otra forma de realizacion de la invencion divulga el anticuerpo 224D10, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, que comprende:

una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes, basandose en el sistema de numeracion IMGT:

- CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 7 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 7;

- CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 2 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad despues del alineamiento optimo con la secuencia sEc ID n° 2 y

- CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 8 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad despues del alineamiento optimo con la secuencia sEc ID n° 8 y

una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes:

- CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 5 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad despues del alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 5; y

Todavfa otra forma de realizacion divulga el anticuerpo 224D10, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, que comprende:

una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes, sobre la base del sistema de numeracion de

Kabat:

- CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 9 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 9;

- CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 10 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 10 y

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- CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 3 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 3, y

una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes:

- CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 11 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 11;

- CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 12 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 12; y

El anticuerpo 224D10, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, de acuerdo con la invencion se caracteriza por el hecho de que comprende, de acuerdo con el sistema de numeracion “comun”:

- una cadena pesada que comprende la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 1, la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 2 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 3; y

- una cadena ligera que comprende la CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 4, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 5 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 6.

En otra forma de realizacion, el anticuerpo 224D10, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, de

acuerdo con la invencion se caracteriza por el hecho de que comprende, de acuerdo con el sistema de

numeracion IMGT:

- una cadena pesada que comprende la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 7, la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 2 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 8; y

numeracion de Kabat:

- una cadena pesada que comprende la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 9, la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 10 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 3; y

- una cadena ligera que comprende la CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 11, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 12 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 6.

De acuerdo con una forma de realizacion adicional, el anticuerpo 224D10 de la invencion, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracteriza por el hecho de que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 13 o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 13; y/o por el hecho de que comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 14 o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 14.

Mas particularmente, el anticuerpo de la invencion, sus compuestos derivados y sus fragmentos funcionales, comprenden:

a) un dominio de secuencia variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 13 y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera que presenta por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 14; y

b) se caracterizan por el hecho de que dicho anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo,

- tiene la capacidad de unirse espedficamente a la protema c-Met y, preferentemente

- no bloquea la union del ligando HGF a la protema c-Met.

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Otra forma de realizacion divulga el anticuerpo 221C9, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, que comprende:

una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes:

- CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 29 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 29;

- CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 30 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 30; y

- CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 31 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 31, y

una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes:

- CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 32 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 32;

- CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 33 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 33; y

- CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 34 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 34.

Otra de las formas de realizacion divulga el anticuerpo 221C9, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, que comprende;

una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes:

- CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 35 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 35;

- CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 36 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 36; y

- CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 37 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 37, y

una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes:

- CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 38 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 38;

- CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 39 o de una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 39; y

Es decir, el anticuerpo aislado 221C9, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, de acuerdo con la invencion se caracteriza por el hecho de que comprende, de acuerdo con el sistema de numeracion IMGT:

- una cadena pesada que comprende la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 29, la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 30 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 31; y

- una cadena ligera que comprende a CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 32, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 33 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 34.

En otra forma de realizacion, el anticuerpo aislado 221C9, o uno de sus fragmentos funcionales o derivados, de acuerdo con la invencion se caracteriza por el hecho de que comprende, de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat:

- una cadena pesada que comprende la CDR-H1 de la secuencia SEC ID n° 35, la CDR-H2 de la secuencia SEC ID n° 36 y la CDR-H3 de la secuencia SEC ID n° 37; y

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- una cadena ligera que comprende la CDR-L1 de la secuencia SEC ID n° 38, la CDR-L2 de la secuencia SEC ID n° 39 y la CDR-L3 de la secuencia SEC ID n° 34.

De acuerdo con otra forma de realizacion adicional, el anticuerpo 221C9 de la invencion, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan por el hecho de que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 40 o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 40; y/o por que comprenden una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 41 o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 41.

a) una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 40 y/o una secuencia de dominio variable de cadena ligera con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con la secuencia SEC ID n° 41; y

- tiene capacidad para unirse espedficamente a la protema c-Met y, preferentemente

- no bloque la union del ligando HGF a la protema c-Met.

Es decir, la invencion se puede describir asimismo como un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que se caracteriza por ser seleccionado de entre el grupo que consiste en:

a) un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 13 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 14; y

b) un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, que comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 40 y una secuencia de dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 41.

Como se expone anteriormente, la invencion se refiere asimismo a cualquier compuesto derivado de un anticuerpo como se describe en la invencion.

Mas particularmente, el anticuerpo de la invencion, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracterizan por el hecho de que dicho compuesto derivado consiste en una protema de union que comprende un andamiaje peptfdico sobre el cual se inserta por lo menos una CDR de tal manera que conserve la totalidad o parte de las propiedades de reconocimiento de paratopos del anticuerpo inicial.

Tambien pueden estar presente una o mas secuencias entre las seis secuencias CDR descritas en la presente invencion en los diversos andamiajes de protema inmunoglobulina. En este caso, la secuencia proteica posibilita la recreacion de un esqueleto peptidico favorable para el plegamiento de las CDR injertadas, lo que les permite conservar sus propiedades de reconocimiento de antfgeno del paratopo.

Por lo general, un experto en la materia sabe determinar el tipo de andamiaje proteico en el cual injertar por lo menos una de las CDR que surgen del anticuerpo original. Mas espedficamente, es conocido que para seleccionar dichos andamiajes, es necesario que satisfagan el mayor numero posible de los siguientes criterios (Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167-187):

- buena conservacion filogenetica;

- estructura tridimensional conocida (como, por ejemplo, por cristalograffa, espectroscopfa de RMN o cualquier otra tecnica conocida por un experto en la materia);

- tamano pequeno;

- pocas o ninguna modificacion postranscripcion y/o

- facilidad de produccion, expresion y purificacion.

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El origen de dichos andamiajes proteicos puede ser, aunque no de manera limitativa, una de las estructuras seleccionadas entre: fibronectina, y preferentemente el dominio 10 de la fibronectina tipo III, lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), protema Z que se origina en el dominio B de la protema A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A o protemas con un motivo repetido tal como la “repeticion de ankirina” (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), la “repeticion de armadillo”, la repeticion “rica en leucina” y la “repeticion de tetratricopeptido”.

Tambien se deben mencionar los andamiajes derivados de toxinas tales como, por ejemplo, toxinas de escorpiones, insectos, plantas, moluscos, etc., y los inhibidores proteicos de la sintasa NO neuronal (PIN).

Un ejemplo, no limitativo en absoluto, de dichas construcciones hforidas, es la insercion de la CDR-H1 (cadena pesada) de un anticuerpo anti-CD4, es decir 13B8.2, en uno de los bucles de la PIN, de la nueva protema de union asf obtenida conservando las mismas propiedades de union del anticuerpo original (Bes et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2006, 343(1), 334-344). A tttulo unicamente ilustrativo, tambien se puede mencionar el injerto de la CDR-H3 (cadena pesada) de un anticuerpo VHH antilisozima en uno de los bucles de neocarzinostatina (Nicaise et al., Protein Science, 2004, 13(7):1882-1891).

Por ultimo, como se describe anteriormente, dichos andamiajes peptfdicos pueden comprender de una a seis CDR derivadas del anticuerpo original. Preferentemente, aunque no es indispensable, un experto en la materia selecciona por lo menos una CDR de la cadena pesada, la que se considera principalmente responsable por la especificidad del anticuerpo. La seleccion de una o mas CDR relevantes es evidente para un experto en la materia, que a continuacion debe seleccionar las tecnicas conocidas adecuadas (Bes et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74).

La presente divulgacion se refiere asimismo a un anticuerpo, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, que se caracteriza por el hecho de que el andamiaje peptfdico es seleccionado entre protemas que son a) filogeneticamente bien conservadas, b) de arquitectura robusta, c) de organizacion molecular 3-D muy conocida, d) de pequeno tamano y/o e) comprenden regiones que se pueden modificar mediante eliminacion y/o insercion sin modificar las propiedades de estabilidad.

De acuerdo con una forma de realizacion preferida, el anticuerpo de la invencion, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, se caracteriza por el hecho de que dicho andamiaje peptfdico es seleccionado entre i) andamiajes que surgen de la fibronectina, preferentemente el dominio 10 de la fibronectina tipo 3, lipocalina, anticalina, protema Z producida por el dominio B de la protema A de Staphylococcus aureus, tioredoxina A o protemas con un motivo repetido tal como la “repeticion de ankirina” (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705), la “repeticion de armadillo”, la repeticion “rica en leucina” y la “repeticion de tetratricopeptido” o iii) inhibidores proteicos de la sintasa NO neuronal (PIN).

Otro aspecto de la invencion se refiere a los fragmentos funcionales del anticuerpo descrito anteriormente.

Mas particularmente, la invencion se refiere a un anticuerpo, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, que se caracteriza por el hecho de que dicho fragmento funcional es seleccionado entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab')2, Fab', scFv, scFv-Fc y diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se haya incrementado tales como fragmentos PEGilados.

Dichos fragmentos funcionales del anticuerpo de acuerdo con la invencion consisten, por ejemplo, en los fragmentos Fv, scFv (sc=cadena simple), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc o diacuerpos, o cualquier fragmento cuya vida media se haya incrementado mediante modificacion qmmica, como por ejemplo la adicion de polialquilen glicol tal como polietilenglicol (PEGilacion) (se hace referencia a fragmentos PEGilados como Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG y Fab'-PEG), o mediante la incorporacion a un liposoma, microesferas o PLGA, donde dichos fragmentos poseen por lo menos una de las CDR caractensticas de la invencion con la notable capacidad de ejercer una actividad de manera general, o incluso parcial, del anticuerpo del cual se obtiene.

Preferentemente, dichos fragmentos funcionales comprenden o incluyen una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual se los obtiene, donde dicha secuencia parcial es suficiente para retener la misma especificidad de union que el anticuerpo del cual se lo obtiene y suficiente actividad, preferentemente por lo menos igual a 1/100, mas preferentemente por lo menos 1/10 de la del anticuerpo del cual se la obtiene.

Dicho fragmento funcional ha de contener por lo menos cinco aminoacidos preferentemente 6, 7, 8, 10, 15, 25, 50 o 100 aminoacidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual se origina.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales son de los tipos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o diacuerpos, que generalmente tienen la misma especificidad de union que el anticuerpo del cual se originan. De acuerdo con la presente invencion, se pueden obtener fragmentos del anticuerpo de la invencion de los

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anticuerpos descritos anteriormente por procedimiento tales como digestion con enzimas, incluyendo pepsina o papama, y/o mediante escision de los puentes de disulfuro por reduccion qmmica. Los fragmentos de anticuerpo tambien se pueden obtener por tecnicas geneticas recombinantes tambien conocidas por un experto en la materia o por smtesis de peptidos por medio, por ejemplo, de sintetizadores peptidicos tales como los comercializados por Applied BioSystems, etc.

Para mayor claridad, la siguiente tabla 3a resume las diversas secuencias de aminoacidos correspondientes al anticuerpo 224D10 de la invencion.

Tabla 3a (donde Mu. = murino)

Anticuerpo: Numeracion de las CDR Cadena pesada Cadena ligera SEC ID n°


: CDR-H1 1


: CDR-H2 2

: Comun CDR-H3 3


: CDR-L1 4



: CDR-L2 5



: CDR-L3 6


: CDR-H1 7


: CDR-H2 2

: IMGT CDR-H3 8

224D10: CDR-L1 4


: CDR-L2 5



: CDR-L3 6


: CDR-H1 9


: CDR-H2 10


: CDR-H3 3

: Kabat CDR-L1 11


: CDR-L2 12



: CDR-L3 6


: Dominio variable Mu. 13



: Dominio variable Mu. 14

Para mayor claridad, la siguiente tabla 3b resume las diversas secuencias de aminoacidos correspondientes al anticuerpo 221C9 de la invencion.

Tabla 3b (donde Mu. = murino)

Anticuerpo: Numeracion de las CDR Cadena pesada Cadena ligera SEC ID n°


: CDR-H1 29


: CDR-H2 30

: IMGT CDR-H3 31


: CDR-L1 32



: CDR-L2 33



: CDR-L3 34

221C9: CDR-H1 35

: CDR-H2 36

: Kabat CDR-H3 37



: CDR-L1 38



: CDR-L2 39



: CDR-L3 34


: Dominio variable Mu. 40



: Dominio variable Mu. 41

De acuerdo con otro aspecto, la invencion se refiere a un hibridoma murino con capacidad de secretar un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invencion, particularmente el hibridoma de origen murino depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Paris, Francia, el 12 de marzo de 2008, bajo el numero I-3949. Dicho hibridoma fue obtenido por la fusion de esplenocitos de ratones inmunizados Balb/C y celulas de las estirpes de mieloma Sp 2/O-Ag 14.

El anticuerpo monoclonal, al que en la presente memoria se denomina 224D10, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, que se caracteriza por el hecho de que dicho anticuerpo es secretado por el hibridoma depositado en la CNCM el 12 de marzo de 2008, bajo el numero I-3949 forma parte, como es evidente, de la presente invencion.

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De acuerdo con otro aspecto, la invencion se refiere a un hibridoma murino con capacidad para secretar un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invencion, particularmente el hibridoma de origen murino depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Paris, Francia, el 14 de enero de 2010, bajo el numero I-4273. Dicho hibridoma fue obtenido mediante la fusion de esplenocitos de ratones inmunizados Balb/C y estirpes de celulas de mieloma Sp 2/O-Ag 14.

El anticuerpo monoclonal, al que en la presente memoria se denomina 221C9, o sus compuestos derivados o fragmentos funcionales, que se caracteriza por el hecho de que dicho anticuerpo es secretado por el hibridoma depositado en la CNCM el 14 de enero de 2010, bajo el numero I-4273 evidentemente forma parte de la presente invencion.

Un nuevo aspecto de la presente invencion se refiere a un acido nucleico aislado que se caracteriza por el hecho de que es seleccionado de entre los siguientes acidos nucleicos:

a) un acido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo o un compuesto derivado o fragmento funcional del mismo, de acuerdo con la invencion;

b) un acido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias SEC ID n°15 a 26 y 42 a 52, o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad tras el alineamiento optimo con las secuencias sEc ID 15 a 26 y 42 a 52;

c) un acido nucleico que comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID n° 27, 28, 53 y/o 54 o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad despues del alineamiento optimo con las secuencias SEC ID 27, 28, 53 y/o 54;

d) los correspondientes acidos nucleicos ARN de los acidos nucleicos definidos en a), b) o c);

e) los acidos nucleicos complementarios de los acidos nucleicos definidos en a), b) y c) y

f) un acido nucleico de por lo menos 18 nucleotidos con capacidad para hibridarse en condiciones de alta rigurosidad con por lo menos una de las CDR de las secuencias SEC ID n° 15 a 28 y 42 a 54 o una secuencia con por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98% de identidad despues del alineamiento optimo con las secuencias SEC ID 15 a 28 y 42 a 54, o una secuencia complementaria de las mismas.

La siguiente tabla 4a resume las diversas secuencias de nucleotidos relacionadas con el anticuerpo 224D10 de la invencion.

Tabla 4a

Anticuerpo: Numeracion de las CDR Cadena pesada Cadena ligera SEC ID n°


: CDR-H1 15


: CDR-H2 16

: Comun CDR-H3 17


: CDR-L1 18



: CDR-L2 19



: CDR-L3 20


: CDR-H1 21

: IMGT CDR-H2 16


: CDR-H3 22

224D10: CDR-L1 18


: CDR-L2 19



: CDR-L3 20


: CDR-H1 23


: CDR-H2 24

: Kabat CDR-H3 17


: CDR-L1 25



: CDR-L2 26



: CDR-L3 20


: Dominio variable Mu. 27



: Dominio variable Mu. 28

La siguiente tabla 4b resume las diversas secuencias de nucleotidos relativas al anticuerpo 221C9 de la

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invencion.

Tabla 4b

Anticuerpo: Numeracion de las CDR Cadena pesada Cadena ligera SEC ID n°


: CDR-H1 42


: CDR-H2 43

: IMGT CDR-H3 44


: CDR-L1 45



: CDR-L2 46



: CDR-L3 47

221C9: CDR-H1 48

: CDR-H2 49

: Kabat CDR-H3 50


: CDR-L1 51



: CDR-L2 52



: CDR-L3 47


: Dominio variable Mu. 53



: Dominio variable Mu. 54

Los terminos “acido nucleico”, “secuencia nucleica”, “secuencia de acido nucleico” “polinudeOtido”, “oligonucleOtido”, “secuencia de polinucleOtidos” y “secuencia de nucleOtidos”, que se utilizan de manera intercambiable en la presente descripciOn, se refieren a una secuencia de nucleOtidos precisa, modificada o no, que define un fragmento o una regiOn de un acido nucleico, que contiene nucleOtidos naturales o no, que es un ADN bicatenario, un ADN de cadena simple o productos de la transcripciOn de dichos ADN.

Se debe hacer constar asimismo que la presente invenciOn no se refiere a las secuencias de nucleOtidos en su ambiente cromosOmico natural, es decir en estado natural. Las secuencias de la presente invenciOn han sido aisladas y/o purificadas, es decir, que han sido muestreadas directa o indirectamente, por ejemplo mediante una copia, donde su ambiente ha sido por lo menos parcialmente modificado. Tambien se deben mencionar en la presente memoria los acidos nucleicos aislados obtenidos por genetica recombinante, por ejemplo por medio de celulas hospedadoras u obtenidos por smtesis qmmica.

“Secuencias nucleicas que exhiben un porcentaje de identidad de por lo menos 80%, preferentemente 85%, 90%, 95% y 98%, despues del alineamiento Optimo con una secuencia preferida” se refiere a secuencias nucleicas que exhiben, con respecto a la secuencia nucleica de referencia, ciertas modificaciones tales como, espedficamente, una eliminaciOn, un truncamiento, una prolongaciOn, una fusiOn y/o sustituciOn quimerica, notablemente puntual. Preferentemente, estas son secuencias que codifican las mismas secuencias de aminoacidos la secuencia de referencia, lo que se relaciona con la degeneraciOn del cOdigo genetico, o secuencias de complementariedad con probabilidad de hibridarse espedficamente a las secuencias de referencia, preferentemente en condiciones altamente rigurosas, principalmente las definidas a continuaciOn.

HibridaciOn en condiciones de alta rigurosidad se refiere a que las condiciones relacionadas con la temperatura y la potencia iOnica son seleccionadas de tal manera que permitan que se mantenga la hibridaciOn entre dos fragmentos de ADN complementarios. A tftulo unicamente ilustrativo, las condiciones de alta rigurosidad de la etapa de hibridaciOn para definir los fragmentos de polinucleOtidos descrita anteriormente son las siguientes.

La hibridaciOn ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridaciOn a 42°C por espacio de tres horas en amortiguador de fosfato (20 mM, pH 7,5) con contenido de 5X SSC (1X SSC corresponde a una soluciOn de NaCl 0,15 M + citrato de sodio 0,015 M), formamida al 50%, dodecil sulfato de sodio al 7% (SDS), 10X soluciOn de Denhardt, sulfato de dextrano al 5% y 1% de ADN de esperma de salmOn; (2) hibridaciOn primaria por espacio de 20 horas a una temperatura que depende de la longitud de la sonda (es decir,: 42°C en el caso de una sonda >100 nucleOtidos de longitud) seguida por dos lavados de 20 minutos a 20°C en 2X SSC + 2% de SDS, un lavado de 20 minutos a 20°C en 0.1X SSC + 0,1% de SDS. El ultimo lavado de lleva a cabo en 0.1X SSC + 0.1% de SDS por espacio de 30 minutos a 60°C en el caso de una sonda >100 nucleOtidos de longitud. Las condiciones de hibridaciOn de alta rigurosidad descritas anteriormente para un polinucleOtido de un tamano definido pueden ser adaptadas por un experto en la materia a oligonucleOtidos de mayor o menor longitud, de acuerdo con los procedimientos descritos por Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory; 3a ediciOn, 2001).

Ademas, se proporciona en la presente memoria un vector que comprende un acido nucleico de acuerdo con lo descrito en la presente memoria.

La divulgaciOn se refiere espedficamente a vectores de clonaciOn y/o expresiOn que contienen dicha secuencia de nucleOtidos.

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Dichos vectores contienen preferentemente elementos que dan lugar a la expresion y/o secrecion de las secuencias de nucleotidos en una celula hospedadora dada. El vector debe contener, por consiguiente, un promotor, senales de iniciacion y terminacion de la traduccion, as^ como regiones de regulacion de la transcripcion adecuadas. Se debe poder mantener de manera estable en la celula hospedadora y puede tener, opcionalmente, senales espedficas que especifican la secrecion de la protema traducida. Estos diversos elementos son seleccionados y optimizados por un experto en la materia de acuerdo con la celula hospedadora utilizada. Para este fin, se pueden insertar las secuencias de nucleotidos en vectores de autorreplicacion dentro del hospedador elegido o pueden ser vectores integrativos del hospedador seleccionado.

Dichos vectores se preparan por procedimientos utilizados generalmente por un experto en la materia y se pueden introducir los clones asf obtenidos en un hospedador adecuado por procedimientos estandares tales como lipofeccion, electroporacion, choque termino o procedimientos qmmicos.

Los vectores son, por ejemplo, vectores de origen plasmfdico o viral. Son utilizados para transformar celulas hospedadoras para clonar o expresar las secuencias de nucleotidos de la invencion.

Se proporcionan asimismo en la presente memoria unas celulas hospedadoras transformadas o que comprenden un vector como se describe en la presente memoria.

La celula hospedadora puede ser seleccionada de entre sistemas procariotas o eucariotas tales como celulas bacterianas, por ejemplo, aunque tambien celulas de levadura o celulas animales, especialmente celulas de mamffero o tambien se pueden utilizar celulas vegetales.

La divulgacion se refiere asimismo a animales, ademas del hombre, que contienen una celula transformada como se describe en la presente memoria.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un procedimiento para la produccion de un anticuerpo de acuerdo con la invencion, o uno de sus fragmentos funcionales, que se caracteriza por el hecho de que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes:

a) el cultivo en un medio de cultivo y las condiciones de cultivo adecuadas para una celula hospedadora de acuerdo con la invencion; y

b) la recuperacion de dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, asf producidos del medio de cultivo o de dichas celulas cultivadas.

Dichas celulas transformadas son de utilizacion los procedimientos de preparacion de los polipeptidos recombinantes de acuerdo con la invencion. Los procedimientos para la preparacion del polipeptido de acuerdo con la invencion en forma recombinante, que se caracterizan por el hecho de que dichos procedimientos utilizan un vector y/o una celula transformada por un vector de acuerdo con la invencion, tambien estan comprendidos en la presente invencion. Preferentemente, se cultiva una celula transformada por un vector de acuerdo con la invencion en condiciones que permiten la expresion del mencionado polipeptido y la recuperacion de dicho peptido recombinante.

Como se ha expuesto anteriormente, la celula hospedadora puede ser seleccionada de entre sistemas procariotas y eucariotas. En particular, es posible identificar las secuencias de nucleotidos de la invencion que facilitan la secrecion en dicho sistema procariota o eucariota. Por lo tanto, se puede utilizar ventajosamente un vector de acuerdo con la invencion que presenta dicha secuencia para la produccion de protemas recombinantes que se deben secretar. En efecto, la purificacion de estas protemas recombinantes de interes es facilitada por el hecho de que estan presentes en el sobrenadante del cultivo celular en lugar de estar en el interior de las celulas hospedadoras.

Los presentes polipeptidos tambien se pueden preparar mediante smtesis qrnmica. Uno de dichos procedimientos de preparacion tambien es un objetivo de la presente invencion. Un experto en la materia conoce los procedimientos de smtesis qrnmica, como por ejemplo las tecnicas en fase solida (ver, especialmente, Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2a ed.) o tecnicas en fase solida parcial, mediante la condensacion de fragmentos o mediante smtesis convencional en solucion.

Los polipeptidos obtenidos por smtesis qrnmica que son aptos para contener los correspondientes aminoacidos no naturales tambien estan comprendidos en la presente invencion. Los anticuerpos, o los compuestos derivados o fragmentos funcionales de los mismos, que se pueden obtener probablemente por el procedimiento de la invencion tambien estan comprendidos en la presente invencion.

Tambien se divulga la utilizacion del anticuerpo de la invencion como biomarcador. Los procedimientos se pueden utilizar para detectar o diagnosticar diversos trastornos oncogenos hiperproliferativos asociados con la

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expresion de cMet a tttulo de ejemplo no limitativo los siguientes: cancer de prostata, osteosarcomas, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de endometrio, glioblastoma, cancer de colon, cancer gastrico, cancer renal o cualquier otro cancer asociado a la expresion de cMet. Como apreciara un experto en la materia, el nivel de expresion del anticuerpo asociado a un trastorno espedfico vana dependiendo de la naturaleza y/o la gravedad de la afeccion preexistente.

La administracion de los presentes anticuerpos en cualquiera de las maneras convencionales conocidas por un experto en la materia (por ejemplo, topica, parenteral, intramuscular, etc.), ofrece un procedimiento de suma utilidad para detectar celulas displasicas en una muestra, ademas de permitir al medico monitorizar el regimen terapeutico de un paciente sometido a tratamiento por un trastorno hiperproliferativo asociado o mediado por la expresion de cMet.

En otra forma de realizacion, la divulgacion se refiere a una composicion farmaceutica para la captacion de imagenes in vivo de un trastorno oncogeno asociado a la expresion de cMet y que comprende dicho anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo que esta marcado y que se une a cMet in vivo, y un vehmulo farmaceuticamente aceptable.

El anticuerpo de la invencion, o un fragmento funcional o derivado del mismo, es de utilidad para diversos fines medicos y de investigacion, incluyendo la deteccion, diagnostico y determinacion de etapa de diversas patologfas asociadas a la expresion de cMet.

La determinacion de etapas tiene valor pronostico potencial y ofrece criterios para disenar una terapia optima. Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000). En general, la determinacion patologica de etapas, por ejemplo del cancer, es preferible a la determinacion clmica puesto que aquella aporta un pronostico mas preciso. Sin embargo, podna ser preferible la determinacion clmica de la etapa si hubiera una determinacion patologica tan precisa, ya que no depende de un procedimiento invasivo para obtener tejido para la evaluacion patologica.

Cuando se utiliza con marcadores adecuados u otras biomoleculas o sustancias qrnmicas detectables apropiadas, el anticuerpo de la invencion es de particular utilidad para aplicaciones de diagnostico y pronostico in vitro e in vivo.

Los marcadores para la utilizacion en inmunoensayos son conocidos generalmente por un experto en la materia e incluyen enzimas, radioisotopos y sustancias fluorescentes, luminescentes y sustancias cromogenas, incluyendo partmulas coloreadas tales como oro coloidal o perlas de latex. Los inmunoensayos adecuados incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Existen diversos tipos de marcadores y procedimientos para conjugar los marcadores a los anticuerpos de la invencion muy conocidos por un experto en la materia, tales como los expuestos a continuacion.

Como se utiliza en la presente memoria, se pretende que el termino "un trastorno oncogeno asociado a la expresion de cMet” incluya enfermedades y otros trastornos en los cuales se ha demostrado o se sospecha que la presencia de altos niveles o niveles anormalmente bajos (aberrantes) de cMet en un sujeto que padece un trastorno es responsable de la fisiopatologfa del trastorno o es un factor que contribuye al empeoramiento del trastorno. Por otro lado, dichos trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, por un aumento de los niveles de cMet en la superficie celular o en la autofosforilacion de tirosina incrementada en cMet en las celulas o tejidos afectados de un sujeto que padece el trastorno. El aumento de los niveles de cMet puede ser detectado, por ejemplo, usando el anticuerpo 224D10 de la invencion. Ademas, se refiere a las celulas que exhiben un desarrollo relativamente autonomo, por lo que exhiben un fenotipo de crecimiento aberrante que se caracteriza por una perdida significativa de control de la proliferacion celular. Por otro lado, las celulas pueden expresar niveles normales de cMet pero estar marcados por una proliferacion anormal.

En ciertas formas de realizacion, “expresion incrementada” en lo que respecta a cMet, se refiere a los niveles de protema o expresion genica que demuestran un aumento estadfsticamente significativo de la expresion (medida por expresion de ARN o expresion de protemas) con respecto a un control.

Mas particularmente, se considera que la utilizacion de un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, de acuerdo con la invencion descrita, para diagnosticar in vitro un trastorno oncogeno asociado con la expresion de cMET o para determinar in vitro el pronostico para desarrollar un trastorno oncogeno asociado a la expresion de cMet, por ejemplo un cancer asociado a la expresion de cMet.

Otro amplio aspecto de acuerdo con la presente invencion se refiere a un procedimiento para diagnosticar un trastorno oncogeno hiperproliferativo o una susceptibilidad a un estado patologico asociado a la expresion de cMet en un sujeto que comprende determinar la presencia o ausencia de celulas que presentan cMet en una muestra y diagnosticar un estado patologico o la susceptibilidad a un estado patologico basandose en la presencia o ausencia de dichas celulas portadoras de cMet. Las utilizaciones diagnosticas del anticuerpo de la invencion comprenden tumores primarios, metastasis cancerosas. El anticuerpo puede estar presente en forma de inmunoconjugado o de un anticuerpo marcado para obtener una senal detectable y/o cuantificable.

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Mas particularmente, un objeto preferido de acuerdo con la presente invencion es un procedimiento para la deteccion in vitro de la presencia y/o ubicacion de un tumor con expresion de cMet en un sujeto, donde dicho procedimiento comprende las etapas siguientes (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, de acuerdo con la invencion y (b) detectar la union de dicho anticuerpo a la muestra. Otro aspecto de la presente invencion es el seguimiento de la expresion de c-Met en respuesta a una terapia dirigida a c-Met durante los ensayos clmicos y, mas espedficamente cuando la regulacion a menos y o la degradacion del receptor c-Met es uno de los componentes del mecanismo de accion del compuesto analizado.

Como resulta evidente para un experto en la materia, la deteccion de la union del anticuerpo de la invencion puede ser revelada por diversos ensayos. Si bien cualesquier medios para poner en practica los ensayos es compatible con la invencion, se pueden mencionar como ejemplos, FACS, ELlSA o IHC.

En el contexto de la presente memoria, el termino “muestra” indica cualquier lfquido biologico, celula, tejido, organo o porcion del mismo que incluye o incluye potencialmente una celula neoplasica tal como una celula, como por ejemplo una celula de colon, estomago, recto, mama, ovario, prostata, rinon, pulmon, sangre, cerebro u otro organo o tejido que contenga o se sospecha que contiene una celula neoplasica. El termino incluye muestras presentes en un individuo, asf como muestras obtenidas o derivadas del individuo. Por ejemplo, una muestra puede ser una seccion histologica de un especimen obtenido por biopsia, o celulas que se colocan o se adaptan a un cultivo celular. Una muestra puede ser asimismo una fraccion subcelular o extracto, o una molecula de acido nucleico en bruto o sustancialmente pura o una preparacion proteica.

Se pretende que la expresion muestra clmica comprenda una variedad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto y utiles en el procedimiento de la invencion, como por ejemplo, una prueba de diagnostico o monitorizacion para determinar o detectar los niveles de expresion de cMet. La definicion comprende muestras de tejidos solidos obtenidas mediante extirpacion quirurgica, un especimen de patologfa, una muestra archivada o un especimen para biopsia, cultivos tisulares o celulas derivadas de los mismos y la progenie de las mismas y secciones o frotis preparados de cualquiera de estas fuentes. Los ejemplos no limitativos son muestras obtenidas de tejido mamario, ganglios linfaticos, colon, pancreas, prostata, etc. La definicion comprende ademas muestras lfquidas de origen biologico y se puede referir a las celulas o fragmentos celulares suspendidos en las mismas o al medio lfquido y sus solutos.

Otro aspecto de acuerdo con la presente invencion se relaciona con un procedimiento para determinar in vitro el nivel de expresion de cMet en un tumor con expresion de cMet de un sujeto, donde dicho procedimiento comprende las etapas siguientes (a') poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento o derivado funcional del mismo, de acuerdo con la invencion y (b') cuantificar el nivel de union del anticuerpo a cMet en dicha muestra.

Como resulta evidente para el experto en la materia, el nivel de union del anticuerpo a cMet se puede cuantificar de una variedad de maneras, como por ejemplo mediante diversos ensayos. Si bien cualesquier medios para poner en practica los ensayos son compatibles con la invencion, un procedimiento preferido conlleva procedimientos inmunoenzimaticos de acuerdo con la tecnica de ELISA, por inmunofluorescencia, por inmunohistoqdmica o una tecnica de radio-inmunoensayo (RIA) o equivalente.

Preferentemente, la muestra biologica esta constituida por un lfquido biologico tal como suero, sangre entera, celulas, una muestra de tejidos o biopsia de origen humano. La muestra puede incluir, por ejemplo, tejido obtenido por biopsia, que puede ser convenientemente analizado para determinar la presencia de un trastorno oncogeno hiperproliferativo asociado a la expresion de cMet.

Una vez realizada una determinacion de la cantidad de cMet presente en la muestra de ensayo, se pueden comparar los resultados con los de las muestras de control, que se obtienen de manera similar a las muestras de ensayo pero de individuos que no tienen o presentan un trastorno oncogeno hiperproliferativo asociado a la expresion de cMet. Si el nivel del cMet es significativamente elevado en la muestra de ensayo, se puede concluir que existe una probabilidad incrementada de que el sujeto del cual se la obtuviera tenga o en el futuro desarrolle dicho trastorno.

La invencion se refiere, mas particularmente, a un procedimiento para diagnosticar in vitro un tumor con expresion de cMet o para determinar in vitro el pronostico de la posibilidad de desarrollar un tumor con expresion de cMet en un sujeto, donde dicho procedimiento comprende las etapas siguientes (i) determinar el nivel de expresion de cMet de acuerdo con lo descrito anteriormente y (ii) comparar el nivel de expresion de la etapa (i) con un nivel de expresion de cMet de referencia de un tejido normal o de un tejido sin expresion de cMet.

“Diagnosticar” una enfermedad ha de incluir, en el contexto de la presente memoria, por ejemplo el diagnostico o la deteccion de la presencia de un trastorno oncogeno hiperproliferativo patologico asociado a la expresion de cMet o mediado por la misma, monitorizar el progreso de la enfermedad e identificar o detectar celulas o

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muestras que sean indicativas de un trastorno asociado a la expresion de cMet.

“Pronostico” se refiere, en el contexto la presente memoria, a la probabilidad de recuperacion de una enfermedad o a la prediccion del probable desarrollo o desenlace de una enfermedad. Por ejemplo, si una muestra de un sujeto es positiva para la tincion con el anticuerpo de la invencion, entonces el “pronostico” correspondiente a ese sujeto es mejor que si la muestra fuera negativa para la tincion de cMet. Se puede puntuar a las muestras con respecto a los niveles de expresion de cMet en una escala apropiada, como se expone con mayor detalle a continuacion.

Sin embargo, otro aspecto de la invencion se refiere asimismo a la monitorizacion de la expresion de c-Met de compuestos terapeuticos que inducen una degradacion de c-Met como uno de sus mecanismos de accion. En ese caso, el seguimiento de la expresion de c-Met en la membrana celular podna ser una herramienta crucial para evaluar la eficacia del tratamiento durante las pruebas clmicas y las terapias “personalizadas”.

El nivel de expresion de cMet se compara o se mide ventajosamente en relacion con los niveles de una celula o muestra de control, a los que se hace referencia como “nivel de referenda” o “nivel de expresion de referenda”. “nivel de referencia” o “nivel de expresion de referencia”. “Nivel de referencia” o “nivel de expresion de referencia”, nivel control y “control” se utilizan en forma intercambiable en la presente memoria. En terminos generales, un “nivel de dcontrol” se refiere a un nivel de referencia separado medido en una celula control comparable, que esta generalmente libre de enfermedad o de cancer. Puede ser del mismo individuo o de otro individuo que es normal o que no presenta la misma enfermedad de la cual se obtiene la muestra enferma o de ensayo. En el contexto de la presente invencion, el termino “nivel de referencia” se refiere a un “nivel de control” de expresion de cMet usado para evaluar un nivel de ensayo de expresion de cMet en una muestra de un paciente que contiene celulas cancerosas. Por ejemplo, cuando el nivel de cMet en la muestra biologica de un paciente es superior al nivel de referencia de cMet, se considera que las celulas tienen un alto nivel de expresion, o sobreexpresion, de cMet. El nivel de referencia se puede determinar mediante una pluralidad de procedimientos. Los niveles de expresion pueden definir entonces las celulas que presentan cMet o, por otro lado, el nivel de expresion de expresion de cMet independiente del numero de celulas con expresion de cMet. Por lo tanto, el nivel de referencia correspondiente a cada paciente se puede calcular mediante una relacion de cMet de referencia, donde la relacion de referencia se puede determinar por cualquiera de los procedimientos para determinar el nivel de referencias descrito en la presente memoria.

Por ejemplo, el control puede ser un valor predeterminado, que puede asumir una variedad de formas. Puede ser un valor de corte unico tal como una mediana o media. El “nivel de referencia” puede ser un solo numero, igualmente aplicable a cada paciente en forma individual, o el nivel de referencia puede variar de acuerdo con subpoblaciones espedficas de pacientes. Asf, por ejemplo, los hombres de mayor edad pueden tener un nivel de referencia diferente de los hombres de menos edad para el mismo cancer y las mujeres pueden tener un nivel de referencia diferente al de los hombres con respecto al mismo cancer. Por otro lado, se puede determinar el “nivel de referencia” midiendo el nivel de expresion de cMet en celulas cancerosas no oncogenas del mismo tejido que el tejido de las celulas neoplasicas que se debe analizar. Ademas, el “nivel de referencia” podna ser una determinada relacion de cMet en las celulas neoplasicas de un paciente con respecto a los niveles de cMet en las celulas no tumorales dentro del mismo paciente. El “nivel de referencia” tambien puede ser un nivel de cMet de celulas cultivadas in vitro, que puede ser manipulado para simular celulas cancerosas, o se puede manipular de cualquier otra manera que de origen a niveles de expresion que determinan con precision el nivel de referencia. Por otro lado, el “nivel de referencia” se puede establecer sobre la base de grupos comparativos, como por ejemplo en grupos que no tienen niveles elevados de cMet y grupos que tienen niveles de cMet elevados. Otro ejemplo de grupos comparativos sena el de grupos que presentan una enfermedad, afeccion o smtomas espedficos y grupos sin la enfermedad.

El valor predeterminado se puede disponer, por ejemplo, donde una poblacion analizada se divide en grupos iguales (o desiguales), como por ejemplo un grupo de bajo riesgo, un grupo de medio riesgo y un grupo de alto riesgo o en cuadrantes o quintiles, donde el cuadrante o quintil mas bajo es el de los individuos con el mayor riesgo o la menor cantidad de cMet.

Tambien se puede determinar el nivel de referencia comparando el nivel de cMet en poblaciones de pacientes que tienen el mismo cancer. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante analisis histografico, en el cual se representa graficamente toda una multitud de pacientes, donde un primer eje representa el nivel de cMet y un segundo eje representa el numero de pacientes en el grupo cuyas celulas tumorales expresan cMet en un nivel dado. Se pueden determinar dos o mas grupos separados de pacientes mediante la identificacion de subseries de poblaciones de la multitud que tienen el mismo nivel de cMet o niveles similares. La determinacion del nivel de referencia se puede realizar sobre la base de un nivel que mejor distingue estos grupos separados. Un nivel de referencia tambien puede representar los niveles de dos o mas marcadores, uno de los cuales es cMet. Dos o mas marcadores pueden estar representados, por ejemplo, por una relacion de valores correspondiente a los niveles de cada marcador.

Del mismo modo, una poblacion aparentemente sana presenta un intervalo “normal” diferente del de una

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poblacion que presenta una afeccion asociada a la expresion de cMet conocida. En consecuencia, el valor predeterminado seleccionado puede considerar la categona en la cual se encuentra el individuo. Los intervalos y las categonas apropiados pueden ser seleccionados sin mas experimentacion de rutina por un experto en la materia. La expresion “elevado” o “incrementado” se refiere a alto con respecto a un control seleccionado. Por lo general, el control se basa en individuos aparentemente normales dentro de un intervalo de edad apropiado.

Tambien se debe tener en cuenta que los controles de acuerdo con la invencion pueden ser, ademas de valores predeterminados, muestras de materiales analizados de manera paralela con los materiales experimentados. Los ejemplos incluyen tejido o celulas obtenidas al mismo tiempo del mismo sujeto, por ejemplo partes de una unica biopsia o partes de una unica muestra de celulas del sujeto.

En el diagnostico o la monitorizacion clmicos de pacientes con enfermedades mediadas por cMet, la deteccion de celulas con expresion de cMet o un aumento de los niveles de cMet, en comparacion con los niveles en una muestra biologica correspondiente de un sujeto normal o de tejido no canceroso por lo general es indicativo de un paciente que presenta o se sospecha que presenta un trastorno mediado por cMet.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la invencion da a conocer un procedimiento para predecir la susceptibilidad al cancer que comprende detectar el nivel de expresion de cMet en una muestra de tejido, donde su presenta indica la susceptibilidad al cancer, donde el grado de expresion de cMet correlaciona con el grado de susceptibilidad. Por lo tanto, en formas de realizacion espedficas, se examina la expresion de cMet, por ejemplo en tejidos prostaticos, tejido de osteosarcoma, tejido pulmonar, tejido pancreatico, tejido de colon, tejido mamario, tejido de gioblastoma, tejidos ovaricos o cualquier otro tejido que se sospeche que puede presentar celulas con expresion de cMet, donde la presencia de cMet en la muestra ofrece una indicacion de susceptibilidad al cancer o la emergencia o existencia de un tumor de tejidos espedficos.

Tambien se presenta un procedimiento para evaluar la agresividad de los tumores. En una forma de realizacion, un procedimiento para observar el progreso de una malignidad en un individuo en el tiempo comprende determinar el nivel de cMet expresado por las celulas en una muestra del tumor, comparar el nivel asf determinado con el nivel de cMet expresado en una muestra de tejidos equivalente tomada del mismo individuo en un momento diferente, donde el grado de expresion de cMet en la muestra tumoral con el tiempo proporciona informacion del progreso del cancer.

En otra de las formas de realizacion, la solicitud presenta procedimientos para determinar el protocolo terapeutico apropiado para un sujeto. Espedficamente, los anticuerpos de la presente invencion son de gran utilidad para monitorizar el curso de la mejora de una enfermedad maligna en un individuo, especialmente en circunstancias en que el sujeto esta recibiendo tratamiento con un anticuerpo para cMet que no compite con los anticuerpos de la presente invencion por la union a cMet. La presencia o ausencia o un cambio de nivel de cMet de acuerdo con la presente invencion puede ser indicativa de que es probable que el sujeto sufra una recafda o de un cancer progresivo o persistente asociado a cMet. Por consiguiente, midiendo el aumento del numero de celulas que expresan cMet o los cambios de concentracion de cMet presente en diversos tejidos o celulas, es posible determinar si un regimen terapeutico espedfico destinado a mejorar una malignidad asociada a cMet es eficaz.

Otro aspecto de la invencion es un procedimiento in vivo para obtener imagenes de un trastorno oncogeno asociado a la expresion de cMet. Por ejemplo, dicho procedimiento se puede utilizar en un paciente que presenta smtomas de un trastorno oncogeno. Si el paciente tiene, por ejemplo, niveles de expresion de cMet incrementados, entonces es probable que el paciente sufra un trastorno canceroso. Ademas, el procedimiento puede ser de utilidad para monitorizar el progreso y/o la respuesta al tratamiento en pacientes a quienes ya se habfa diagnosticado un cancer mediado por cMet. De acuerdo con el objetivo expuesto, la invencion presenta un reactivo para imagenes in vivo que comprende un anticuerpo de acuerdo con la invencion, o un fragmento funcional o derivado del mismo, preferentemente marcado, especialmente radiomarcado, y su uso en la obtencion de imagenes medicas. Por consiguiente, un procedimiento general de acuerdo con la presente invencion funciona administrando a un paciente una cantidad efectiva para la obtencion de imagenes de un reactivo de obtencion de imagenes tal como el anticuerpo monoclonal descrito anteriormente que ha sido marcado y un vehuculo farmaceuticamente efectivo y a continuacion detectando el agente una vez unido al cMet presente en la muestra. En deltas formas de realizacion, el procedimiento consiste en administrar una cantidad efectiva para la captacion de imagenes de un agente de captacion de imagenes que comprende una porcion de direccionamiento y una porcion activa. El agente de captacion de imagenes es administrado en una cantidad efectiva para una utilizacion de diagnostico en un mairnfero tal como un humano y a continuacion se detecta la localizacion y acumulacion del agente de captacion de imagenes. La localizacion y acumulacion del agente de captacion de imagenes se puede detectar mediante captacion de imagenes por radionuclidos, radiocentellograffa, imagenes de resonancia magnetica nuclear, tomograffa computada, tomograffa de emision de positrones, tomograffa axial computada, procedimiento de imagenes de rayos X o resonancia magnetica, deteccion de fluorescencia y deteccion quimioluminiscente.

En lo que respecta al desarrollo de la terapia antitumoral dirigida, el diagnostico con tecnicas immunohistologicas

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proporciona, in situ, informacion sobre el nivel de expresion del receptor y, por lo tanto permite seleccionar pacientes susceptibles de ser tratados siguiendo el nivel de expresion de receptores necesarios para dicho tratamiento.

Para la inmunoterapia que utiliza anticuerpos monoclonales, la respuesta al tratamiento dependiendo del nivel de expresion dirigida al receptor como el tratamiento con trastuzumab en que la determinacion de la sobreexpresion de Her2 en el carcinoma mamario es ahora de gran importancia clmica con la llegada del anticuerpo monoclonal anti-Her2 humanizado trastuzumab. La demostracion de la sobreexpresion de Her2 es un prerrequisito para el tratamiento con trastuzumab, ya que actua dirigiendose a las celulas de carcinoma con sobreexpresion de Her2. Las pruebas precisas de Her2 apuntan a garantizar que no se administre el tratamiento con trastuzumab, costoso y potencialmente toxico, a pacientes con tumores sin sobreexpresion y que cada paciente que se pueda beneficiar con el trastuzumab reciba tratamiento apropiado.

La ensenanza con trastuzumab con respecto a la seleccion de pacientes con sobreexpresion de Her2 presenta el beneficio de determinar el nivel de expresion del receptor cuando se utiliza una terapia con un anticuerpo monoclonal y de desarrollar, al mismo tiempo que un anticuerpo monoclonal terapeutico, un anticuerpo monoclonal que se puede utilizar para la seleccion del paciente.

En consecuencia, la invencion se refiere a un procedimiento para determinar el estado de cMet in vitro de un tumor de un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes (1) determinar el nivel de expresion de cMet de acuerdo con lo descrito anteriormente, (2) puntuar dicho tumor con respecto al nivel de expresion de cMet y (3) comparar dicha puntuacion con la obtenida de una muestra de control.

La expresion “estado de cMet”, en el contexto de la presente invencion, se relaciona con la clasificacion de un tumor respecto de una clase cMet positivo [cMet(+)] o cMet negativo [cMet(-)] basandose en la determinacion del nivel de expresion del gen cMet medida por cualquiera de procedimientos tales como inmunohistoqmmica (IHC), hibridacion in situ por fluorescencia (FISH), hibridacion colorimetrica in situ (CISH), chip genico u otros procedimientos conocidos por un experto en la materia.

En una forma de realizacion preferida, el anticuerpo para diagnostico debe poder unirse al receptor considerado diana cuando las muestras de tejidos estan fijadas con formalina e incluidas en parafina.

Mas particularmente, el nivel de expresion de cMet se mide por inmunohistoqmmica (IHC).

Por ejemplo, se pueden puntuar las muestras con respecto a los niveles de expresion de cMet en una escala de 0-3+ correspondiente a los niveles de tincion del anticuerpo, donde 0 es negativo y 1+-3+ representan la tincion positiva en cuatro etapas semicuantitativas de intensidad creciente. Se pueden registrar las puntuaciones de 1+3+ como positivos, puesto que cada puntuacion positiva puede estar asociado a un riesgo significativamente reducido de recafdas y enfermedad letal en comparacion con una puntuacion de 0 (negativa), pero la intensidad creciente entre las puntuaciones positivas puede aportar una mayor reduccion del riesgo. Se puede utilizar cualquier procedimiento de analisis de riesgo convencional para estimar el valor pronostico de cMet. Los procedimientos de analisis representativos incluyen el analisis de regresion de Cox, que es un procedimiento semiparametrico para modelar datos de supervivencia o tiempo transcurrido hasta un evento en presencia de casos censados (Hosmer y Lemeshow, 1999; Cox, 1972). A diferencia de otros analisis de supervivencia, por ejemplo las tablas de Vida o Kaplan-Meyer, Cox permite la inclusion de variables de prediccion (covariables) en los modelos. Utilizando un procedimiento de analisis convencional, por ejemplo Cox, se pueden analizar hipotesis con respecto a la correlacion del estado de expresion de cMet de un tumor primario al momento del inicio de la recafda de la enfermedad (tiempo de sobrevida sin enfermedad, o tiempo hasta la enfermedad metastasica), o tiempo hasta la muerte por la enfermedad (tiempo de supervivencia total). El analisis de regresion de Cox tambien se conoce como analisis de riesgo proporcional. Este procedimiento es estandar para analizar el valor de pronostico de un marcador tumoral con respecto al tiempo de supervivencia de un paciente. Cuando se utiliza en el modo multivariable, se analiza el efecto de varias covariables en forma paralela de manera que se puedan identificar las covariables individuales que tienen valor de pronostico independiente, es decir, los marcadores mas utiles. El termino “estado de cMet” positivo o negativo [al que tambien se hace referencia como cMet(+) o cMet (-)] de tumores se refiere a puntuaciones de 0 a puntuaciones de 1+-3+, respectivamente.

Una muestra puede ser “puntuada” durante el diagnostico o la monitorizacion del cancer, como por ejemplo el cancer de mama. En su forma mas sencilla, la puntuacion puede ser categoricamente negativa o positiva a juzgar por el examen visual de las muestras por inmunohistoqmmica. La puntuacion mas cuantitativa conlleva juzgar la intensidad de tincion de los dos parametros y la proporcion de celulas tenidas (“positivas”) que se muestrean. Basandose en estos dos parametros se pueden asignar numeros que reflejan niveles crecientes de tincion positiva. Allred et al. (Allred, Harvey et al. 1998) han descrito una manera de obtener esto, que implicaba la puntuacion de ambos parametros en una escala de 0 (negativo) a 3+ y resumiendo las puntuaciones de los parametros individuales en una puntuacion general. Esto da lugar a una escala con posibles puntuaciones de 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. (Debe apreciarse que una puntuacion de 1 no es posible en la escala de Allred). Un

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procedimiento de puntuacion algo mas sencillo integra la intensidad de la tincion nuclear y la proporcion de celulas que exhiben nucleos coloreados en una escala combinada de 0 a 3+. Se puede aplicar cualquiera de estos procedimientos de puntuacion para puntuar la intensidad y proporcion de tincion de Stat5 activado en los nucleos de las celulas. Los terminos “estado de cMet” positivo o negativo de los tumores, utilizados en la presente memoria, se refieren a niveles de expresion de cMet que corresponden a las puntuaciones de 0 o 1+-3+ en la escala simplificada, respectivamente.

En general, los resultados de una prueba o ensayo de acuerdo con la invencion se pueden presentar en cualquiera de entre una variedad de formatos. Los resultados se pueden presentar de manera cualitativa. Por ejemplo, el resultado de la prueba puede indicar solo si se ha detectado un determinado polipeptido, tal vez tambien con una indicacion de los lfmites de deteccion. Los resultados se pueden presentar de forma semicuantitativa. Por ejemplo, se pueden definir diversos intervalos, y se puede asignar una puntuacion a los intervalos, (por ejemplo, 1+ a 3+) que proporciona un cierto grado de informacion cuantitativa. Ese tipo de puntuacion puede reflejar diversos factores, por ejemplo, el numero de celulas en las cuales se detecta cMet, la intensidad de la senal (que puede indicar el nivel de expresion de cMet o las celulas portadoras de cMet), etc. Los resultados se pueden presentar en forma cuantitativa, por ejemplo, en terminos de porcentaje de celulas en las cuales se detecta el polipeptido (cMet), como concentracion de la protema, etc. Como apreciara un experto en la materia, el tipo de salida proporcionada por un analisis vana dependiendo de las limitaciones tecnicas del analisis y de la significacion biologica asociada a la deteccion del polipeptido. Por ejemplo, en el caso de ciertos polipeptidos, la deteccion de una salida puramente cualitativa (por ejemplo, si se detecta o no el polipeptido en un determinado nivel de deteccion) aporta informacion significativa. En otros casos es necesaria una salida mas cuantitativa (por ejemplo, una relacion del nivel de expresion del polipeptido en la muestra que se esta analizando contra el nivel normal).

En una forma de realizacion mas preferida, se gradua la puntuacion del nivel de expresion de cMet de 0 a 3+, basandose en la evaluacion de la intensidad del producto de la reaccion y el porcentaje de celulas positivas. Para mayor claridad, la tabla 5 expuesta a continuation resume estos parametros. Solo se considera la reactividad de la membrana circunferencial completa del tumor invasivo y con frecuencia se asemeja a un aspecto de “alambre de gallinero”. En lmeas generales, las muestras puntuadas como lfmite (puntuacion de 2+ o mas) correspondientes a IHC de cMet se deben considerar cMet(+) y se requiere someterlas a una evaluacion adicional. El analisis de IHC debe ser desechado y repetido o confirmado por FISH o cualquier otro procedimiento si, a tttulo de ejemplo no limitativo, los controles no son los esperados, existen distorsiones que comprenden la mayor parte de la muestra y la muestra tiene una fuerte positividad membranosa de los conductos mamarios normales (controles internos), lo que sugiere una recuperation excesiva del antfgeno.

Tabla 5

Estado de c-Met: Descripcion IHC

0: Sin reactividad o reactividad membranosa en menos de 10% de las celulas tumorales

1 +: Se detecta reactividad membranosa debil/escasamente perceptible en mas de 10% de las celulas tumorales. Las celulas solo son inmunorreactivas en parte de la membrana.

2+: Se observa reactividad membranosa debil a moderada en mas de 10% de las celulas tumorales.

3+: Se observa reactividad membranosa fuerte y completa en mas de 10% de las celulas tumorales.

En una forma de realizacion mas preferida del procedimiento de acuerdo con la invencion, dicha puntuacion comprende el uso de una escala apropiada basandose en dos parametros que son la intensidad de la tincion y el porcentaje de celulas positivas.

En una forma de realizacion preferida, el procedimiento de acuerdo con la invencion, una escala apropiada es una escala de 0 a 3+ en la cual a la falta de reactividad membranosa de las celulas tumorales se asigna una puntuacion de 0 y a la reactividad fuerte completa en mas de 10% de las celulas tumorales se le asigna una puntuacion de 3+.

Con mayor detalle, de acuerdo con lo descrito anteriormente, dicha escala apropiada es una escala de 0 a 3 en la cual se asigna 0 a la falta de reactividad membranosa de las celulas tumorales, se da una puntuacion de 1+ a la reactividad membranosa tenuemente perceptible en mas de 10% de las celulas tumorales; se da una puntuacion de 2+ a la reactividad membranosa debil a moderada completa en mas de 10% de las celulas tumorales y se da una puntuacion de 3+ a la reactividad membranosa completa fuerte en mas de 10% de las celulas tumorales.

En un aspecto espedfico de la invencion, un tumor es cMet(+) con una puntuacion de 2+.

En un aspecto espedfico de la invencion, un tumor es cMet(+) con una puntuacion de 3+.

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En otro aspecto espedfico de la invencion, un tumor es cMet(+) con una puntuacion de 2+ o 3+.

La presente divulgacion proporciona asimismo un procedimiento para determinar si un trastorno oncogeno es susceptible al tratamiento con un anticuerpo anti-cMet, o un fragmento o derivado del mismo, donde dicho procedimiento comprende las etapas siguientes (a) determinar in vitro el estado de cMet de un tumor de un sujeto de acuerdo con lo descrito anteriormente y (b) determinar que, si el estado es cMet(+), el trastorno oncogeno es susceptible al tratamiento con un anticuerpo anti-cMet o un fragmento o derivado del mismo.

En otro aspecto de la invencion, se considera un kit util para dicho procedimiento de diagnostico o pronostico, donde dicho kit comprende el anticuerpo de la invencion.

Por conveniencia, una combinacion envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para la ejecucion del ensayo de diagnostico, por ejemplo kits, tambien estan dentro del alcance de la invencion. El kit contiene los anticuerpos para la deteccion y cuantificacion de cMet in vitro, por ejemplo en un ELISA o una transferencia Western. El anticuerpo de la presente invencion se puede presentar en un kit para la deteccion y cuantificacion de cMet in vitro, por ejemplo en un ELISA o una transferencia Western. En los casos en que el anticuerpo esta conjugado a una enzima (por ejemplo, un sustrato precursor que aporta el cromoforo o fluoroforo detectable). Ademas, se pueden incluir otros aditivos tales como estabilizadores, amortiguadores (por ejemplo, un amortiguador de bloqueo o un amortiguador de lisis) y demas. Ese tipo de kit puede comprender un receptaculo que esta compartimentado para recibir uno o mas recipientes tales como frascos ampolla, tubos y demas, donde dichos recipientes contienen elementos separados de la invencion. Por ejemplo, un recipiente puede contener un primer anticuerpo unido a un veldculo insoluble o parcialmente soluble. Un segundo recipiente puede contener un segundo anticuerpo soluble, marcado de manera detectable, en forma de liofilizado o en solucion. El receptaculo puede contener ademas un tercer recipiente que contiene un tercer anticuerpo marcado de manera detectable en forma liofilizada o en solucion. Un kit de esta naturaleza se puede utilizar en el ensayo sandwich de la invencion. La etiqueta o prospecto puede ofrecer una descripcion de la composicion, como asf tambien instrucciones para el uso pretendido in vitro o de diagnostico.

Las cantidades relativas de los diversos reactivos se pueden variar ampliamente para producir concentraciones en solucion de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Espedficamente, los reactivos se pueden presentar en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, e incluir excipientes que al disolverse producen una solucion de los reactivos de la concentracion apropiada.

En otro de los aspectos de la invencion, se presentan anticuerpos monoclonales o fragmentos de union de los mismos de acuerdo con lo detallado en la presente memoria con una porcion detectable, de tal manera que puedan ser envasados y utilizados, por ejemplo, en kits, para diagnosticar o identificar celulas con el antfgeno mencionado anteriormente. Entre los ejemplos no limitativos de dichos marcadores se incluyen fluoroforos tales como isotiocianato de fluorescema, cromoforos, radionuclidos o enzimas. Dichos anticuerpos marcados o fragmentos de union se pueden utilizar para la localizacion histologica del antfgeno, ELISA, clasificacion celular, como asf tambien en otras tecnicas inmunologicas para detectar o cuantificar cMet y las celulas que presentan este antfgeno, por ejemplo.

Tambien se presentan kits que son utiles como control positivo para ensayos de apoptosis, para la purificacion o inmunoprecipitacion de cMet de las celulas. Para el aislamiento y la purificacion de cMet, el kit puede contener los anticuerpos descritos en la presente memoria o antfgenos de union al antfgeno de los mismos acoplados a perlas (por ejemplo, perlas de sefarosa). Se pueden producir kits que contienen los anticuerpos para la deteccion y cuantificacion de cMet in vitro, por ejemplo en un ELISA o una transferencia Western. Como en el caso del artfculo de fabricacion, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en el recipiente o asociado al mismo. El recipiente contiene una composicion que comprende por lo menos un anticuerpo anti-cMet o fragmento de union del mismo de acuerdo con la presente invencion. Se pueden incluir otros recipientes que contienen, por ejemplo, diluyentes y amortiguadores, anticuerpos de control. La etiqueta o prospecto puede ofrecer una descripcion de la composicion, asf como instrucciones para el uso pretendido in vitro o de diagnostico.

Mas particularmente, la invencion se refiere a un kit para la determinacion del estado de cMet de un tumor por cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia. En una forma de realizacion preferida, como se describe en el ejemplo, la invencion se refiere a un kit para la determinacion del estado de cMet de un tumor por procedimientos de IHC.

En una forma de realizacion espedfica, la invencion consiste en un kit que comprende por lo menos un anticuerpo anti-c-Met, o un fragmento funcional o derivado del mismo, segun lo descrito anteriormente, donde dicho anticuerpo esta preferentemente marcado.

Debe apreciarse que un experto en la materia puede utilizar cualquier procedimiento de marcado tal como, por ejemplo, el uso de los marcadores mencionados anteriormente.

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En una forma de realizacion preferida, el kit de acuerdo con la invencion, util para detectar in vitro la presencia y/o la ubicacion de un tumor con expresion de c-Met en un sujeto, comprende ademas un reactivo util para detectar el grado de union entre dicho anticuerpo anti-c-Met y c-Met.

En otra forma de realizacion preferida, el kit de la invencion util para determinar in vitro el nivel de expresion de c- Met en un tumor con expresion de c-Met, comprende ademas un reactivo provechoso para cuantificar el nivel de union entre dicho anticuerpo marcado y c-Met.

En otra forma de realizacion adicional, el kit de acuerdo con la invencion util para determinar in vitro el estado de c-Met de un tumor, comprende ademas:

i) un reactivo util para detectar el grado de union entre dicho anticuerpo marcado y c-Met; y

ii) unas muestras de control positivas y negativas que sirven para la puntuacion del nivel de expresion de c- Met.

Dicho kit para determinar in vitro el estado de c-Met de un tumor puede comprender ademas un anticuerpo policlonal espedfico para los anticuerpos murinos, preferentemente dicho anticuerpo policlonal espedfico para anticuerpos murinos esta marcado.

Otras caractensticas y ventajas descritas en la presente memoria se ponen de manifiesto a continuacion en la descripcion mediante los ejemplos y las figuras cuyas leyendas estan explicadas a continuacion.

Figuras 1A y 1B:

Reconocimiento de c-Met segun ELISA (figura A) y FACS (figura B) por el Mab m224D10.

Figura 2:

Experimentos de inhibicion de la union a [125I]-HGF. Se represento la union espedfica total de [125I]-HGF (en %) en funcion de la concentracion del ligando en un grafico semilogantmico. Los valores de union espedficos son el medio de los experimentos realizados por triplicado.

Figuras 3A y 3B:

Analisis IHC de secciones incluidas en parafina de tumores xenoinjertados U87-MG coloreados con un isotipo control (figura 3A) y el Mab m224D10 (figura 3B).

Figura 4:

Reconocimiento segun FACS de c-Met por el Mab m221C9 Figuras 5A y 5B:

Curvas de titulacion del Mab 221C9 Mab en la protema c-Met dimerica (A) y monomerica (B) inmovilizada. Figura 6:

Tincion por IHC de secciones incluidas en parafina de tejidos de tumores mamarios (A) y gastricos (B) que expresaban diversos niveles de c-Met con m224D10.

Figura 7:

Tincion por IHC de secciones incluidas en parafina de tejidos de tumores mamarios (A) y gastricos (B) que expresaban diversos niveles de c-Met con m221C9.

Figura 8:

Sensograma de inyecciones sucesivas de los Mabs 11E1 y 224D10 en 201,7 UR de c-Met-Fc capturado en la celda flujometrica 2 de un chip sensor CM5 activado por un anticuerpo anti-tag-His.

Figura 9:

Sensograma de inyecciones sucesivas de los Mabs 224G11 y 224D10 en 203,4 UR de c-Met-Fc capturado en la celda flujometrica 2 de un chip sensor CM5 activado por un anticuerpo anti-tag-His.

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Sensograma de inyecciones sucesivas de los Mabs 5D5 y 224D10 en 203,6 UR de c-Met-Fc capturado en la celda flujometrica 2 de un chip sensor CM5 activado por un anticuerpo anti-tag-His.

Figura 11:

Esquema de mapeo de epttopos de los 7 anticuerpos anti-cMet. Las flechas indican los tres experimented realizados para este estudio. Los cuadrados grises indican que los anticuerpos no han sido analizados con 224D10.

Figura 12:

Ensayo de competencia de HGF con m221C9 Mab.

Ejemplo 1: Generacion y seleccion de anticuerpos contra cMet que se podrian utilizar para fines de diagnostico

- Etapa de inmunizacion

Para generar anticuerpos anti-cMet se inmunizaron ratones BALB/c de 8 semanas de edad 3 a 5 veces, por via subcutanea, con una estirpe de celulas CHO transfectadas que expresaban cMet en su membrana plasmatica (20x106 celulas/dosis/raton) o 2 a 3 veces con una protema de fusion del dominio extracelular cMet (10-15 pg/dosis/raton) (R&D Systems, # Catalogo 358MT) o fragmentos de esta protema recombinante mezclados con adyuvante completo de Freund para la primera inmunizacion y adyuvante incompleto de Freund para los siguientes. Tambien se ejecutaron protocolos mixtos en los cuales los ratones recibieron tanto celulas cHO-cMet como protemas recombinantes. Tres dfas antes de la fusion de las celulas, se dio un refuerzo a los ratones por via i.p. o i.v. con la protema recombinante o fragmentos. A continuacion se recogieron bazos de ratones y fueron fusionados a celulas de mieloma SP2/0-Ag14 (ATCC) y sometidos a seleccion por HAT. En general, para la preparacion de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente de origen murino, es posible referirse a las tecnicas que se describen en particular en el manual “Antibodies” (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) o a la tecnica de preparacion de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).

- Etapa de cribado de 224D10

En un principio se clasificaron los hibridomas obtenidos por ELISA en la protema recombinante cMet. Es decir, se revistio la protema c-Met-Fc recombinante humana (R&D systems) de un dfa para otro a 4°C sobre placas Immulon II de 96 pocillos y, despues de una etapa de bloqueo con una solucion de gelatina al 0,5%, se agrego un intervalo de dosis del anticuerpo m224G10 durante 1 h mas a 37°C. A continuacion se lavaron las placas y se agrego IgG HRP espedfica de cabra antirraton (Jackson) durante 1 h a 37°C. Se realizo el desarrollo de la reaccion empleando una solucion sustrato de TMB. A continuacion se realizo un segundo analisis de deteccion por analisis FACS en las estirpes celulares A459 y NCI-H441 que expresan niveles moderados a elevados de c- Met, a fin de garantizar que los anticuerpos producidos pudieran reconocer asimismo el receptor nativo en las celulas tumorales. Para ese fin se incubaron 2x105 celulas con un intervalo de concentraciones de 224D10 Mab no conjugado o el isotipo control 9G4 (Mab isotipo control de IgG1) por espacio de 20 min a 4°C. Despues de 3 lavados en salina con amortiguador de fosfato (PBS) suplementado con BSA al 1% y 0,01% de NaN3, se incubaron las celulas con el anticuerpo secundario de cabra antirraton Alexa 488 (dilucion 1/500) por espacio de 20 minutos a 4°C. Despues de 3 adicionales en PBS suplementado con BSA al 1% y 0,1% de NaN3, se analizaron las celulas por FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Se evaluaron por lo menos 5000 celulas para calcular el valor medio de intensidad de fluorescencia.

Se amplificaron los reactores positivos de estos 2 ensayos, fueron clonados y se recupero una serie de hibridomas, fueron purificados y analizados para detectar su falta de competencia con HGF radiomarcado. En efecto, habitualmente se necesita un anticuerpo de diagnostico tanto para la seleccion de pacientes como a tftulo de biomarcador para seguir el comportamiento del receptor tomado como objetivo en pacientes tratados con un anticuerpo terapeutico. Con respecto a este ultimo punto, el criterio principal que se debe considerar es que el anticuerpo de diagnostico se debe unir a un epftopo diferente del reconocido por el anticuerpo terapeutico. Una de las metas para un anticuerpo terapeutico neutralizante dirigido contra un receptor de factor de crecimiento es inhibir la union al ligando. En ese aspecto, durante la seleccion del anticuerpo de diagnostico, se podnan seleccionar los que no interfieran con la union al ligando. Para comprobar esa propiedad, se establecio un ensayo de competencia de los anticuerpos con HGF radiomarcado. En smtesis, se bloquearon microplacas de 96 pocillos FlashPlate (Perkin Elmer) con gelatina al 0,5% en PBS (2 h a temperatura ambiente) antes de revestirlas de un dfa para otro a 4°C con la protema recombinante c-Met-Fc protein (R&D). Se saturaron ademas los sitios de protema A con una hIgG pertinente durante 2 h a temperatura ambiente. Se lavaron las placas con PBS

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despues de cada etapa. En el caso de los ensayos de competencia, se midio la union de [125I]-HGF (actividad espedfica ~ 2,000 Ci/mmol) a 200 pM a c-Met inmovilizado en presencia de diversas concentraciones del anticuerpo monoclonal anti-c-Met que se va a analizar o HGF (R&D Systems) en el intervalo de 0,1 pM a1 pM en PBS pH 7,4. Se introdujeron anticuerpos conocidos por su capacidad para desplazar HGF (224G11, 11E1 y 5D5) como controles positivos del experimento. El Mab 5D5 Mab es un anticuerpo generado por Genentech y disponible como hibridoma en la ATCC. Se utilizo una IgG1 murina, descrita como 9G4, como isotipo control. A continuacion se incubaron las placas a temperatura ambiente por espacio de 6 h y se las sometio a recuento en un contador de centelleo en microplacas Packard Top Count. Se determino la union no espedfica en presencia de HGF1 pM.

Por ultimo, se seleccionaron los Mabs que cumplfan con los 3 criterios descritos anteriormente [i) reconocimiento de c-Met en un analisis ELISA, ii) union al c-Met nativo y iii) ausencia de competencia con el ligando radiomarcado] para la prueba final de reconocimiento de c-Met en secciones incluidas en parafina de xenoinjertos de U87-MG, se desparafino, rehidrato y coloco en amortiguador de recuperacion Target Retrieval Buffer 1X (Dako S1699) en un bano hirviendo precalentado a 98°C para la recuperacion de epttopos termoinducida a 98°C por espacio de 30 minutos y luego durante 30 minutos mas en el amortiguador Target Retrieval Buffer. Despues de 3 lavados en Salina con amortiguador de Tris-0,05% de tween 20 (TBS-T) (Dako S3006), se bloqueo la actividad endogena de peroxidasa utilizando reactivo de bloqueo de peroxidasa (Dako K4007) durante cinco minutos. Se lavaron las secciones con TBS-T y fueron incubadas con reactivo de bloqueo (UltraV block-TA-125UB- LabVision) durante 5 minutos antes de la adicion del anticuerpo monoclonal de raton c- Met que se debe analizar (5 pg/ml). Se utiliza una IgG1/kappa (5 pg/ml, X0931, Dako) de raton como control negativo. A continuacion se incubaron las secciones de un dfa para otro a 4°C, fueron lavadas con TBS-T e incubadas con ligante biotinilado universal (LSAB+, Dako K0679) por espacio de 15 minutos a temperatura ambiente. Despues del lavado con TBS-T, se incubaron las secciones durante 15 minutos mas con el complejo universal de estreptavidina-peroxidasa (LSAB+, Dako K0679). Se utilizo diaminobenzidina para la revelacion de un producto de reaccion marron.

Despues de una serie de fusiones, se identifico el anticuerpo murino 224D10 (m224D10) como candidato para el diagnostico de tumores c-Met positivos. Como se ejemplifica en la figura 1, el m224D10 puede reconocer c-Met tanto en un ensayo ELISA (Figura 1A) como en la superficie de las estirpes celulares A549 y NCI-H441 conocidas por su expresion de c-Met (Figura 1B).

A continuacion se analizo el m224D10 en un ensayo de desplazamiento de HGF radiomarcado. En la figura 2, se represento el porcentaje de union espedfica total de [125I]-HGF en funcion de concentraciones de ligandos en graficos semilogantmicos y se determinaron graficamente las concentraciones de los diversos inhibidores necesarias para inhibir la union al radioligando en 50% (CI50) a partir de las curvas sigmoidales de competencia. Como se estimaba, el HFG no marcado pudo desplazar por completo la union de [125I]-HGF a c-Met inmovilizado, en tanto que el anticuerpo control 9G4 no exhibio actividad de bloqueo de HGF. Los Mabs anti-c-Met 224G11, 11E1 y 5D5, utilizados como controles positivos, pudieron inhibir la union de [125I]-HGF a c-Met inmovilizado, con valores CI50 de 3,6 nM, 42 nM y 4,4 nM, respectivamente. Mab m224D10 no pudo desplazar [125I]-HGF y fue seleccionado para estudios de inmunohistoqmmica (IHC).

Los resultados expuestos en la figura 3B demostraron que m224G10 puede reconocer c-Met en tumores U87- MG xenoinjertados conocidos por ser particularmente sensibles a una terapia dirigida a c-Met. Como se esperaba, no se observo tincion alguna con un isotipo control de IgG1 (Figura 3A). Basandose en estos resultados, se realizaron experimentos para determinar si se podfa utilizar el Mab 224D10 para puntuar c-Met en tumores.

- Etapa de cribado de 221C9

Inicialmente se analizaron los hibridomas obtenidos por ELISA en la protema recombinante cMet dimerica o monomerica. En pocas palabras, se aplicaron las protemas recombinantes humanas c-Met (dimerica o monomerica) de un dfa para otro a 4°C en placas Immulon II de 96 pocillos y, al cabo de 1 h de una etapa de bloqueo con una solucion de gelatina al 0,5%, se agrego el sobrenadante de hibridoma puro durante 1 h mas a 37°C. A continuacion se lavaron las placas y se agrego una IgG HRP espedfica de cabra antirraton (Jackson) durante 1 h a 37°C. Se realizo la revelacion de la reaccion utilizando la solucion sustrato de TMB. A continuacion se realizo un segundo analisis de deteccion por FACS en la estirpe celular A549 que expresa niveles moderados a altos de c-Met, para asegurarse de que los anticuerpos producidos pudieran reconocer tambien el receptor nativo en las celulas tumorales. Para ese fin se incubaron 2x105 celulas con 10 pg/ml de m221C9 o m10D9 (Mab isotipo control de IgG1) por espacio de 20 min a 4°C. Despues de 3 lavados en salina con amortiguador de fosfato (PBS) suplementada con BSA al 1% y 0,01% de NaN3, se incubaron las celulas con el anticuerpo secundario de cabra antirraton Alexa 488 (dilucion 1/500) durante 20 minutos a 4°C. Despues de 3 lavados adicionales en PBS suplementado con BSA al 1% y 0,1% de NaN3, se analizaron las celulas por FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson). Se evaluaron por lo menos 5000 celulas para calcular el valor medio de la intensidad de fluorescencia.

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Se amplificaron los hibridomas positivos en estos dos ensayos, fueron clonados, determinaron los isotipos y fueron expandidos. Se recogieron los nuevos sobrenadantes de hibridomas, se determino su contenido de IgG. Se realizo un analisis de citometna complementary en un panel de 5 estirpes celulares tumorales humanas (A549, BXPC3, MCF7, U87MG y HepG2). Todas estas estirpes celulares fueron provistas por la ATCC. Los datos obtenidos se presentan en la figura 4 y los valores de MFI fueron presentados en la siguiente tabla 6.

Tabla 6

Datos del analisis de citometna (MFI) ejecutado con el Mab 221C9 en 5 estirpes de celulas tumorales (ATCC)

: A549 BXPC-3 MCF7 U87MG HepG2

Celulas solamente: 13,98 11,87 9,87 9,10 10,52

Anticuerpo secundario: 11,98 13,23 11,10 11,20 15,85

Isotipo control: 11,83 14,77 12,06 11,56 18,12

221C9: 243,59 375,57 31,95 71 233,58

Se realizaron unos experimented complementarios con anticuerpo 221C9 purificado. Se llevo a cabo la titulacion del primer anticuerpo tanto en la protema c-Met monomerica como en la protema c-Met dimerica.

Las curvas de titulacion se presentan en la figura 5. Se observo una afinidad similar por ambas formas del receptor c-Met. Para realizar este ELISA se aplico la protema c-Met dimerica humana (R&D sytems, cat# 358MT) en una concentracion de 0,25 pg/ml en PBS de un dfa para otro a 4°C. Despues de la saturacion de las placas (Costar #3690) con una solucion de gelatina a 0,5 % durante 2 horas a 37°C, se incubaron los sobrenadantes de hibridoma durante 1 hora a 37°C. Una vez enjuagado con PBS, se agrega el anticuerpo anti-raton HRP (Jackson ImmunoResearch, # catalogo 115-035-164) a cada pocillo en una dilucion de 1/5000 en amortiguador ELISA (0,1 % de gelatina/0,05 % de Tween 20 en PBS) y se incubaron las placas durante 1 hora a 37°C. Despues de 3 lavados en PBS, se revela la actividad de la peroxidasa mediante la adicion de 50 pl del sustrato TMB (Uptima). Se deja que la reaccion se produzca durante 5 min a temperatura ambiente. Se detiene la reaccion mediante la adicion de 50 pl/pocillo de una solucion de H2SO4 1 M y se lee en un lector de placas a 450 nm. Se realizo el mismo tipo de protocolo en c-Met monomerico, aunque, en ese caso, la protema fue aplicada a razon de 5 pg/ml.

Por ultimo, 221C9 Mab habfa cumplido los 2 criterios descritos anteriormente (i) reconocimiento de c-Met en un ensayo ELISA, (ii) union al c-Met nativo expresado en la superficie de las estirpes celulares tumorales humanas.

Ejemplo 2: Puntuacion de tejidos con respecto a la expresion de c-Met con los Mabs m224D10 ay m221C9

Usando el protocolo descrito anteriormente, se coloreo una serie de tejidos tumorales humanos incluidos en parafina, que expresaban niveles variables de c-Met con los Mabs m224D10 y m221C9, respectivamente.

Los resultados expuestos en la figura 6 correspondiente al m224D10 y la figura 7 correspondiente al Mab m221C9 Mab demostraron, en los dos tipos de tumores, que tanto m224D10 como m221C9 pueden discriminar tumores humanos con niveles variables de c-Met. Usando estos anticuerpos, se pudieron puntuar los tumores de la siguiente manera:

- 0 o neg: tumores negativos en los cuales no se observo tincion alguna de las membranas o celulas con membrana menos de 10% positiva,

- 1+: tincion apenas perceptible en mas de 10% de las celulas tumorales,

- 2+: Se observo una tincion moderada completa de las membranas en mas de 10% de las celulas tumorales,

- 3+: Una potente tincion completa de mas de 10% de las celulas tumorales.

Ejemplo 3: 224D10 Experimentos de competencia

Como se expone anteriormente, tambien se podna utilizar un Mab de diagnostico como “marcador de respuesta” para anticuerpos terapeuticos que induzcan la regulacion a menos del receptor objetivo. Con respecto a ese punto, se podnan realizar biopsias de sangre en pacientes tratados y analizarlas para determinar el estado de c- Met. Para ese fin, el anticuerpo de diagnostico que se debe utilizar debe reconocer un epftopo diferente del tomado como diana por el anticuerpo terapeutico. Como los anticuerpos terapeuticos habitualmente pueden desplazar HGF, la seleccion del anticuerpo de diagnostico que no compite por el desplazamiento del ligando podna ser de utilidad como marcador de respuesta para todos los Mabs terapeuticos.

En este ejemplo se realizaron experimentos de competencia entre 224D10 y muchos Mabs terapeuticos para

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demostrar que se podna utilizar 224D10 como marcador de respuesta.

Se estudiaron los Mabs anti-c-Met 11E1,227H1, 224G11 y el Mab 5D5, que es una forma murina del 5D5 de un brazo, existente en el comercio como hibridoma en la ATCC, en un experimento de biacore. En pocas palabras, se activa un chip sensor CM5 en una celda flujometrica 1 y 2 mediante el acoplamiento covalente del Mab antipolihistidina utilizando el kit de acoplamiento de aminas siguiendo las instrucciones del proveedor. El amortiguador de funcionamiento es el amortiguador HBS-EP. Los experimentos se llevan a cabo a 25°C a una velocidad de flujo de 30 pl/min. Se utiliza la protema quimerica HGF-R/Fc en una concentracion de10 pg/ml en el amortiguador de funcionamiento y se inyecta durante 1 minuto en la celda flujometrica 2. Por lo general, se capturaron aproximadamente 190 UR de c-Met-Fc. La celda flujometrica 1 sirvio como referencia para el calculo de la union no espedfica de los Mabs. Se inyecta el primer Mab (20 pg/ml) durante 2 minutos en ambas celulas de flujo. A continuacion se inyecto el segundo anticuerpo (20 pg/ml) en ambas celdas flujometricas. Se registra la senal de resonancia diferencial Fc2-Fc1. Al final de cada ciclo, se regenero el chip sensor descartando las protemas c-Met y los Mabs con una inyeccion del amortiguador de regeneracion de Glicina, pH 1,5 en ambas celdas flujometricas durante medio minuto.

El primer experimento se lleva a cabo con 11E1 como primer anticuerpo y 224D10 como segundo anticuerpo (ver la figura 8). Este experimento demuestra que 11E1 y 224D10 se unen a dos regiones de epttopos distantes en la superficie de la molecula de c-Met-Fc. El experimento se lleva a cabo con 224G11 como primer anticuerpo y 224D10 como segundo anticuerpo (ver la figura 9). Este experimento demuestra que 224G11 y 224D10 se unen tambien a dos regiones distantes. El tercer experimento se lleva a cabo con 5D5 como primer anticuerpo y 224D10 como segundo anticuerpo (ver la figura 10). Una vez mas, este experimento demuestra que 5D5 y 224D10 se unen a dos regiones distantes. En conclusion 224D10 se une a una region distante, en la molecula de c-Met, de los sitios de union de 11E1, 224G11 y 5D5. Dado que los datos preliminares obtenidos con el mismo tipo de protocolo El protocolo Biacore demostro que el anticuerpo 13.3.2 anti-c-Met de Pfizer pertenece al mismo grupo de mapeo de epttopos que 11E1 (Figura 11), se puede sospechar que 224D10 y 13.3.2 se pueden unir simultaneamente a la misma molecula de c-Met incluso si esta combinacion no ha sido estudiada. Del mismo modo con respecto a 227H1 que pertenece al mismo grupo de epttopos que 224G11 (Figura 11), es probable que tanto el anticuerpo 227H1 como el 224D10 se unan simultaneamente a c-Met. Por ultimo, 223C4, que pertenece al mismo grupo de mapeo de epttopos que 5D5 (Figura 11) podna unirse probablemente a c-Met simultaneamente con 224D10.

Ejemplo 4: Experimentos de competencia de HGF realizados en presencia del anticuerpo 221C9

Para caracterizar adicionalmente los Mabs de diagnostico, se llevan a cabo ensayos de competencia de HGF. Se preparan primeras mezclas de reaccion que comprenden la protema c-Met en presencia, o no, de los Mabs que se deben analizar en una placa saturada separada (0,5% de gelatina en PBS 1X). Se efectuan diluciones en serie 1: 2 (comenzando con 40 pg/ml en 12 columnas) de anticuerpos murinos (los referencia y Mabs que se deben estudiar). A continuacion se agregan 0,8 pg/ml de la protema rh c-Met-Fc (RD Systems, ref. 358-MT/CF), excepto por la estirpe control negativo que contiene solo el diluyente de ELISA (0,1% de gelatina, 0,05% de Tween 20 en PBS 1X). Despues de la homogeneizacion, se cargan las muestras de competencia en placas revestidas con HGF con una solucion de 0,3 pg/ml de rhHGF en PBS (RDSystems, ref. 294-HGN/CF). Despues de una incubacion y varios lavados, se detectan las protemas c-Met unidas utilizando una IgG-HRP de cabra antihumana (Jackson, ref. 109-035-098). Una vez unido, se agrega el sustrato de TMB a las placas. Se detiene la reaccion mediante la adicion de una solucion acida de H2SO4 se leen las densidades opticas obtenidas a 450 nm utilizando un instrumento lector de microplacas.

El experimento se lleva a cabo con 221C9 en presencia o ausencia de la protema recombinante c-Met-Fc (ver la figura 12). Este experimento demuestra que 221C9 puede competir por la union a c-Met en su receptor ligando inmovilizado. Sin embargo, en presencia de 20 pg/ml de 221C9, solo se observa una union parcial de c-Met.

Listado de secuencias

<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT

<120> NUEVO ANTICUERPO ANTI-cMET Y SU UTILIZACION PARA LA DETECCION Y EL DIAGNOSTICO DEL CANCER

<130> D27752

<150> EP 09305777.6 <151> 2009-08-21

<150> US 61/235.864 <151> 2009-08-21

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<150> US 61/348.005 <151> 2010-05-25

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211>5 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 1

Thr Ser Ala Tyr Phe 1 5

<210> 2 <211>7 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 2

lie Asn Tyr Asp Gly Thr Asn 1 5

<210> 3 <211>6 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 3

Asp Arg Thr Phe Ala Tyr 1 5

<210> 4 <211>6 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 4

Gin Arg lie Tyr Asn Tyr

1 5

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<400> 5

Tyr Ala Ser 1

<210> 6 <211>9 <212> PRT <213> mus musculus

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Gin Gin Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr 1 5

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Thr Arg Asp Arg Thr Phe Ala Tyr 1 5

<210>9 <211>7 <212> PRT <213> mus musculus

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Thr Ser Ala Tyr Phe Trp Ser 1 5

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Phe lie Asn Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 15 10 15

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<400> 11

Arg Ala Ser Gin Arg lie Tyr Asn Tyr Leu His 15 10

<210> 12 <211>7 <212> PRT <213> mus musculus

<400> 12

Tyr Ala Ser Gin Ser lie Ser 1 5

<210> 13 <211> 115 <212> PRT <213> mus musculus

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imagen1

<210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> mus musculus

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accagtgctt atttc 15

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ataaactacg acggtaccaa t 21

<210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 17

gatcggacct ttgcttat 18

<210> 18 <211> 18 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 18

caaagaattt acaactac 18

<210> 19 <211>9 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 19

tatgcttcc 9

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<400> 20

caacagagta acagctggcc tctcacg 27

<210> 21 <211> 27 <212> ADN <213> mus musculus

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ggctactcca tcaccagtgc ttatttc 27

<210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> mus musculus

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acaagagatc ggacctttgc ttat 24

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<400> 23

accagtgctt atttctggag c 21

<210> 24 <211> 48 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 24

ttcataaact acgacggtac caataactac aacccatctc tcaaaaat 48

<210> 25 <211> 33 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 25

agggccagtc aaagaattta caactaccta cac 33

<210> 26 <211> 21 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 26

tatgcttccc agtccatctc t 21

<210> 27 <211> 345 <212> ADN <213> mus musculus

<400> 27

gatctacagc: ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60

acctgctctg: tcactggcta ctccatcacc agtgcttatt tctggagctg gatccggcag 120

tttccaggaa: acaaactgga atggatgggc ttcataaact acgacggtac caataactac 180

aacccatctc: tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgata catctaagaa ccagtttttc 240

ctgaggttga: attctgtgac tactgacgac acagctacgt attactgtac aagagatcgg 300

acctttgctt: attggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345

<210> 28 <211> 321 <212> ADN <213> mus musculus

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gatattgtgt

ctttcctgca

catgagtctc

aggttcagtg

gaagattttg

gggaccaagc

taactcagtc: tccagccacc ctgtctgtga ctccaggaga tagagtcagt 60

gggccagtca: aagaatttac aactacctac actggtatca acaaaaatca 120

caaggcttct: catcaagtat gcttcccagt ccatctctgg gatcccctcc 180

gcagtggctc: agggacagat ttcattctca ctatcaacag tgtggagact 240

gaatgtattt: ctgtcaacag agtaacagct ggcctctcac gttcggtgct 300

tggagctgag: a 321

<210> 29 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 29

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 30 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 30

lie Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr 1 5

<210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 31

Ala Arg Arg Val Gly Tyr Leu Met Asp Tyr 15 10

<210> 32 <211>5 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 32

Ser Ser Val Ser Tyr 1 5

<210> 33 <211>3 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 33

Asp Thr Ser 1

<210> 34 <211>9 <212> PRT <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 34

Gin Gin Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr 1 5

<210> 35 <211>5 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 35

Ser Tyr Trp Met His 1 5

<210> 36 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 36

Glu lie Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Arg 15 10 15

Thr

<210> 37 <211>8 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 37

Arg Val Gly Tyr Leu Met Asp Tyr 1 5

<210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 38

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 15 10

<210> 39 <211>7 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 39

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5

<210> 40 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 40

Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Glu lie Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Arg Thr Lys Ala Thr Leu Thr Val Ala Lys Ser Ser lie Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Val Gly Tyr Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110

Val Thr Ala Pro Gin 115

5 <210> 41

<211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus

10 <400> 41

Gin lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Leu lie Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

<210> 42 15 <211> 24

<212>ADN <213> Mus musculus

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

ggctacacct tcaccagcta ctgg

24

<210> 43 <211> 24 <212>ADN <213> Mus musculus

<400> 43

attaatccta gcaacggtcg tact 24

<210> 44 <211> 30 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 44

gcaagaaggg ttggttacct catggactac 30

<210> 45 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 45

tcaagtgtaa gttac 15

<210> 46 <211>9 <212> ADN <213> Mus musculus

<210> 47 <211> 27 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 47

cagcagtgga atagtaaccc acccacg 27

<210> 48 <211> 15 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 48

agctactgga tgcac 15

<210> 49 <211> 51 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 46

gacacatcc

9

<400> 49

gagattaatc ctagcaacgg tcgtactcac tacaatgaga agttcaggac c

51

5

10

15

20

25

30

35

40

45

<211> 24

<212>ADN

<213> Mus musculus

<400> 50

agggttggtt acctcatgga ctac 24

<210> 51 <211> 30 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 51

agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac 30

<210> 52 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 52

gacacatcca aactggcttc t 21

<210> 53 <211> 351 <212> ADN <213> Mus musculus

<400> 53

caggtccaac

tcctgcaagg

cctggacaag

aatgagaagt

atgcaactca

ggttacctca

<210> 54 <211> 318 <212>ADN <213> Mus musculus

tgcagcagcc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60 cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaacggtcg tactcactac 180 tcaggaccaa ggccacactg actgttgcca aatcctccat cacagcctac 240 gcaccctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaagggtt 300 tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgctcctca g 351

<400> 54

caaattgttc

atgacctgca

acctccccca

ttcagtggca

gatgctgcca

accaagctgg

tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc aaagattgat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa cttattactg ccagcagtgg aatagtaacc eacccacgtt cggtgctggg agctgaaa

<210> 55 <211>9 <212> PRT <213> artificial

60

120

180

240

300

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

<220>

<223> Secuencia de CDR-H1 <220>

<221> misc_feature <222> (3)..(3)

<223> Xaa es S o T

<220>

<221> misc_feature <222> (4)..(4)

<223> Xaa es I o F

<220>

<221> misc_feature <222> (7)..(7)

<223> Xaa es A o esta ausente <220>

<221> misc_feature <222> (9)..(9)

<223> Xaa es F o W

<400> 55

Gly Tyr Xaa Xaa Thr Ser Xaa Tyr Xaa

1 5

<210> 56 <211>8 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Secuencia de CDR-H2 <220>

<221> misc_feature <222> (3)..(3)

<223> Xaa es Y o P

<220>

<221> misc_feature <222> (4)..(4)

<223> Xaa es D o S

<220>

<221> misc_feature <222> (5)..(5)

<223> Xaa es N o esta ausente <220>

<221> misc_feature <222> (7)..(7)

<223> Xaa es T o R

<220>

<221> misc_feature <222> (8)..(8)

<223> Xaa es N o T

<400> 56

lie Asn Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 1 5

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Secuencia de CDR-H3 <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(1)

<223> Xaa es T o A

<220>

<221> misc_feature <222> (3)..(3)

<223> Xaa es D o R

<220>

<221> misc_feature <222> (4)..(4)

<223> Xaa es R o V

<220>

<221> misc_feature <222> (5)..(5)

<223> Xaa es T o G

<220>

<221> misc_feature <222> (6)..(6)

<223> Xaa es F o Y

<220>

<221> misc_feature <222> (7)..(7)

<223> Xaa es A o L

<220>

<221> misc_feature <222> (8)..(8)

<223> Xaa es M o esta ausente <220>

<221> misc_feature <222> (9)..(9)

<223> Xaa es D o esta ausente <400> 57

Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr 15 10

<210> 58 <211>6 <212> PRT <213> artificial

<220>

<223> Secuencia de CDR-L1 <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(1)

<223> Xaa es Q o esta ausente

: CO 2 to 0 > 0 CO

: o O ZS O -i—< 3 +-* o

: C£ 0 _ 0 0 z

: co ^ -— CO <£■ • (/) & 0

ICN: 0 |CO 0 o '-r « | ^ 0 P — m o1^ 0 m

' 0 X

co ■ JJj

E Sx

' 0 ^X

oo

LO

u

>1

H

id

X m

td

X

id

td

X

td

<j>

Q1

lo co Q_

0

o

A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A: X
A
A
A
A

O: — CM CO O — CM CO O ^— CM CO O ^— CM CO O irt O t— CM CO

CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM: O <U ni t— t— t— t—

CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM: "d- IU V __i
CM
CM
CM
CM

V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V: ?S
V
V
V
V



: lO O LO O LO

o

co

<220>

<223> Secuencia de CDR-L2

<220>

<221 > misc_feature <222> (1)..(1)

<223> Xaa es Y o D

CM

"3-

CO

01

Q

O

: 0 H 0 ■Q 0 § 0

: 3 o 0 3 o 3

: 0 < ^1 O 0 CO 0

: a ,_v CO 0) 0 c £ ,_v </) a

: i |CM 0 w ■q 0 I ICO, 0 i

: o CO 'E S 0 0 X G) LO (0 0 o CD 03 1— 01 CL 03 3 O 0 CO O </) E CO 0 0 X o (/) 'E

A
A
A
A
A: ?s
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A

O: ^— CM CO O nj O CM CO O CO O ^— CM CO O ^—

CM
CM
CM
CM: O <rt ^— ^— ^— ^—
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM

CM
CM
CM
CM: "3- sh . CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM

V
V
V
V
V: * " V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V
V

LO O LO

CO "3- "3-

O LO o

LO lo CD

<222> (6)..(6)

<223> Xaa es W o N

<220>

<221> misc_feature <222> (8)..(8)

<223> Xaa es L o P 5

<400> 60

Gin Gin Xaa Asn Ser Xaa Pro Xaa Thr 1 5

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo, o fragmento funcional o derivado del mismo, apto para unirse a c-Met, estando dicho anticuerpo caracterizado por que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

a) un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, que comprende:

- una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes como se define segun IMGT, respectivamente CDR-H1 que presenta la secuencia SEC ID n° 7, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID n° 2 y CDR-H3 que presenta la secuencia SEC ID n° 8, y

- una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes como se define segun IMGT,

respectivamente CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID n° 4, CDR-L2 que presenta la secuencia SEC ID n° 5 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID n° 6; y

b) un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, que comprende:

- una cadena pesada que comprende las tres CDR siguientes como se define segun IMGT, respectivamente CDR-Hl que presenta la secuencia SEC ID n° 29, CDR-H2 que presenta la secuencia SEC ID n° 30 y cDr-H3 que presenta la secuencia SEC ID n° 31; y

- una cadena ligera que comprende las tres CDR siguientes como se define segun IMGT,

respectivamente CDR-L1 que presenta la secuencia SEC ID n° 32, CDR-L2 que presenta la secuencia SEC ID n° 33 y CDR-L3 que presenta la secuencia SEC ID n° 34.
2. Anticuerpo, o fragmento funcional o derivado del mismo, segun la reivindicacion 1, caracterizado por que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

a) un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 13 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 14; y

b) un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 40 y un dominio variable de cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoacidos SEC ID n° 41.
3. Anticuerpo, o fragmento funcional o derivado del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que es un anticuerpo murino.
4. Anticuerpo, o fragmento funcional o derivado del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que no bloquea la union del ligando HGF a la protema c-Met.
5. Hibridoma murino apto para secretar un anticuerpo segun una de las reivindicaciones 1 a 4, siendo dicho hibridoma murino seleccionado de entre el hibridoma depositados en la CNCM, Institut Pasteur, Paris, Francia el 12 de marzo de 2008 con el numero I-3949 y el hibridoma depositado en la CNCM, Institut Pasteur, Pans, Francia el 14 de enero de 2010 con el numero I-4273.
6. Acido nucleico aislado, caracterizado por que codifica un anticuerpo segun una de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Acido nucleico segun la reivindicacion 6, caracterizado por que comprende una secuencia de ADN que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias SEC ID n° 15 a 26 o 42 a 52, o comprende una secuencia de ADN que comprende las secuencias SEC ID n° 27, 28, 53 o 54.
8. Procedimiento de deteccion in vitro de la presencia y/o la ubicacion de un tumor que expresa c-Met en un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 4 y (b) detectar la union de dicho anticuerpo con la muestra.
9. Procedimiento de determinacion in vitro del nivel de expresion de c-Met en un tumor que expresa c-Met de un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de (a') poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo, o un fragmento funcional o derivado del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 4 y (b') cuantificar el nivel de union de anticuerpo a c-Met en dicha muestra.
10. Procedimiento segun la reivindicacion 8, en el que se mide el nivel de expresion de c-Met por inmunohistoqmmica (IHC).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50
11. Procedimiento de diagnostico in vitro de un tumor que expresa c-Met o determinacion in vitro del pronostico para desarrollar un tumor que expresa c-Met en un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de (i) determinar el nivel de expresion de c-Met segun la reivindicacion 9 y (ii) comparar el nivel de expresion de la etapa (i) con un nivel de expresion de referencia de c-Met del tejido normal.
12. Procedimiento de determinacion in vitro del estado de c-Met de un tumor de un sujeto, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de (1) determinar el nivel de expresion de c-Met segun la reivindicacion 9, (2) puntuar dicho tumor para el nivel de expresion de c-Met y (3) comparar dicha puntuacion con la obtenida de una muestra de control.
13. Procedimiento segun la reivindicacion 12, en el que dicha puntuacion comprende utilizar una escala apropiada basada en dos parametros que son la intensidad de la tincion y el porcentaje de celulas positivas.
14. Procedimiento segun la reivindicacion 13, en el que dicha escala apropiada es una escala de 0 a 3+ en la que sin reactividad membranosa de las celulas tumorales puntua 0 y una reactividad completa fuerte en mas de 10% de las celulas tumorales puntua 3+.
15. Procedimiento segun la reivindicacion 14, en el que dicha escala apropiada es una escala de 0 a 3 en la que sin reactividad membranosa de las celulas tumorales puntua 0; puntua 1+ una reactividad membranosa perceptible debil en mas de 10% de las celulas tumorales; la reactividad membranosa completa leve a moderada en mas de 10% de las celulas tumorales puntua 2+; y la reactividad completa fuerte en mas de 10% de las celulas tumorales puntua 3+.
16. Procedimiento segun la reivindicacion 14 o 15, en el que un tumor es c-Met(+) con una puntuacion de 2+ o 3+.
17. Procedimiento para determinar si un trastorno oncogeno es susceptible de tratamiento con un anticuerpo antic-Met, o un fragmento o derivado del mismo, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de (a) determinar in vitro el estado de c-Met de un tumor de un sujeto segun la reivindicacion 16 y (b) determinar que, si el estado es c-Met(+), el trastorno oncogeno es susceptible de tratamiento con un anticuerpo anti-c-Met, o un fragmento o derivado del mismo.
18. Kit que comprende por lo menos un anticuerpo anti-c-Met, o un fragmento funcional o derivado del mismo, segun una de las reivindicaciones 1 a 4, estando dicho anticuerpo preferentemente marcado.
19. Kit segun la reivindicacion 18 para detectar in vitro la presencia y/o la ubicacion de un tumor que expresa c-Met en un sujeto, comprendiendo ademas dicho kit un reactivo util para detectar el grado de union entre dicho anticuerpo anti-c-Met y c-Met.
20. Kit segun la reivindicacion 18 para determinar in vitro el nivel de expresion de c-Met en un tumor que expresa c-Met, comprendiendo ademas dicho kit un reactivo util para cuantificar el nivel de union entre dicho anticuerpo anti-c-Met y c-Met.
21. Kit segun la reivindicacion 18 o 19 para determinar in vitro el estado de c-Met de un tumor, comprendiendo ademas dicho kit:

i) un reactivo util para detectar el grado de union entre dicho anticuerpo anti-c-Met y c-Met; y

ii) unas muestras de control positivas y negativas utiles para la puntuacion del nivel de expresion de c-Met.
22. Kit segun la reivindicacion 21 para determinar in vitro el estado de c-Met de un tumor, comprendiendo ademas dicho kit un anticuerpo policlonal espedfico para anticuerpos murinos, estando preferentemente dicho anticuerpo policlonal espedfico para anticuerpos murinos marcado.