ES2692809T3 - Nueva cepa del PRRSV europea - Google Patents

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ES2692809T3 ES15174330.9T ES15174330T ES2692809T3 ES 2692809 T3 ES2692809 T3 ES 2692809T3 ES 15174330 T ES15174330 T ES 15174330T ES 2692809 T3 ES2692809 T3 ES 2692809T3
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Jeremy Kroll
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Michael B. Roof
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Abstract

Una composición que comprende virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV) de un tipo europeo, que es de la cepa depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) con el número de acceso ECACC 11012502.

Description

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DESCRIPCION
Nueva cepa del PRRSV europea Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una cepa atenuada viva de un virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV) europeo, a metodos para la produccion de tales cepas, a vacunas basadas en ellas y a metodos para la produccion de tales vacunas y el uso de las mismas en el tratamiento de cerdos.
Antecedentes de la invencion
El smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS) es considerado por muchos como la enfermedad mas importante que actualmente afecta la industria del cerdo mundialmente. El smdrome se describio por primera vez en 1987 en los Estados Unidos como la “enfermedad misteriosa del cerdo” y rapidamente se propago a lo largo del globo. Produce graves perdidas de reproduccion, esta asociado al aumento de la mortalidad debido a infecciones secundarias y esta ligada a una conversion de alimentos reducida y a un aumento de peso diario promedio. Desafortunadamente, ha demostrado ser dificil el control del virus que produce el PRRS.
El virus PRRS (PRRSV) es un virus de ARN monocatenario envuelto clasificado en la familia Arteriviridae (Cavanaugh, 1997). Produce una extendida enfermedad en el cerdo que se describio por primera vez como 'enfermedad misteriosa del cerdo' en EE.UU. en 1987 (Hill, 1990). La enfermedad se manifiesta como enfermedad respiratoria en todos los grupos de edad de cerdos que conduce a muerte en algunos cerdos jovenes y a problemas reproductivos graves en hembras en edad de reproduccion.
La transmision del PRRSV puede producirse, y frecuentemente se produce, por contacto directo entre cerdos infectados y susceptibles. La transmision tambien puede producirse a distancias muy cortas por aire o por semen. Una vez infectado, el virus puede permanecer en la sangre de adultos durante aproximadamente dos semanas, y en cerdos infectados durante uno a dos meses o mas. Los verracos infectados puede emitir el virus en el semen durante mas de 100 dfas. Este largo periodo de viremia aumenta significativamente la posibilidad de transmision. Ademas, el virus PRRS puede atravesar la placenta durante el ultimo tercio del periodo de gestacion para infectar lechones en el utero y causar lechones nacidos muertos o nacidos debiles.
Todos los tipos y tamanos de piaras, que incluyen aquellas con alto estado de salud o estado de salud ordinario o de unidades tanto interiores como exteriores, pueden infectarse por el virus PRRS. Las piaras infectadas pueden experimentar grandes perdidas de reproductividad, ademas de niveles elevados de neumoma despues del destetamiento con escaso crecimiento. La fase reproductiva normalmente dura dos a tres meses; sin embargo, los problemas despues del destetamiento frecuentemente se vuelven endemicos. La enfermedad reproductiva se caracteriza por un brote de abortos que afecta tanto a cerdas como a cerdas jovenes en el ultimo termino de gestacion. Los partos prematuros se producen aproximadamente a los 109 y 112 dfas de gestacion. El numero de lechones nacidos muertos y nacidos debiles aumenta y se produce un aumento considerable en la mortalidad antes del destetamiento.
La fase respiratoria tradicionalmente se ha observado en el criadero, especialmente en criaderos de flujo continuo. Sin embargo, los problemas respiratorios producidos por el virus PRRS tambien pueden verse en el cebador como parte del complejo respiratorio de enfermedad porcina (PRDC). Puede producirse una reduccion en la velocidad de crecimiento, un aumento en el porcentaje de cerdos invendibles y un aumento de la mortalidad despues del destetamiento. Los hallazgos de diagnostico indican altos niveles de neumoma que se asocian al virus PRRS junto con una amplia variedad de otros agentes microbianos comunmente considerados agentes infecciosos secundarios. Las cepas aisladas bacterianas pueden incluir Streptococcus suis, Haemophilus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Pasteurella multocida, entre otros. Los agentes vmcos comunmente implicados incluyen virus de la gripe porcina y coronavirus respiratorio porcino. Los cerdos afectados raramente responden a altos niveles de medicacion, y los sistemas todo dentro/todo fuera han fracasado en controlar la enfermedad.
El virus PRRSV existe como dos genotipos denominados en lo sucesivo tipo “US” y “EU” que comparten aproximadamente 50% de homologfa de secuencias (Dea S y col. (2000). Arch Virol 145:659-88). Estos dos genotipos tambien pueden distinguirse por sus propiedades inmunologicas. La mayona de la informacion de la secuenciacion de diversas cepas aisladas se basa en las protemas estructurales, concretamente la protema de la envuelta GP5 que explica solo aproximadamente 4% del genoma vmco, aunque se sabe poco de las protemas no estructurales (nsp). Se han descrito el aislamiento del PRRSV y la preparacion de vacunas en varias publicaciones (documentos WO 92/21375, WO 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930).
La vacunacion es el metodo clave para aliviar la carga de PRRS ya que los cerdos que se recuperan de una infeccion del PRRS desarrollaran una respuesta inmunitaria que bajo circunstancias normales los protegera de ser infectados de nuevo por la misma cepa del virus. Sin embargo, el virus PRRS tiene la capacidad de cambiar (por mutacion o recombinacion); y, por tanto, pueden producirse nuevas cepas vmcas. En tales casos, la proteccion
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cruzada entre cepas puede no existir, y pueden observarse nuevos brotes en granjas que habfan sido infectadas previamente. Por tanto, existe una necesidad continua de vacunas adicionales.
Breve sumario de la invencion
La presente invencion se refiere a composiciones de vacunas contra el PRRS vivas modificadas mejoradas de genotipo europeo y a composiciones que comprenden nuevas cepas del PRRSV que puedan usarse para la preparacion de tales vacunas. En particular, la invencion proporciona cepas del virus PRRS mejoradas que se han depositado en la Coleccion europea de cultivos celulares (ECACC) con los numeros de acceso ECACC 11012501 y ECACC 11012502, cada una depositada el 25 de enero de 2011 segun las disposiciones del Tratado de Budapest, o cualquier descendente o progenie de una de las cepas anteriormente mencionadas.
En realizaciones particulares, la presente invencion describe una composicion que comprende un virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV) de un tipo europeo, que es de la cepa depositada en la Coleccion europea de cultivos celulares (ECACC) con el numero de acceso ECACC 11012501 o el numero de acceso ECACC 11012502.
El PRRSV se caracteriza porque el virus se atenua pasandolo al menos 36 veces por cultivo celular de forma que cuando el virus modificado se administre a un cerdo u otro mairnfero propenso al PRRSV fracase en producir signos clmicos de enfermedad por PRRSV, pero pueda inducir una respuesta inmunitaria que inmunice al mamffero contra formas patogenas del PRRSV.
Tambien se contempla, en un aspecto de referencia, un metodo para la preparacion del PRRSV atenuado vivo depositado en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC) con el numero de acceso ECACC 11012502 o una forma atenuada de una cepa parental depositada con el numero de acceso ECACC 11012501 que comprende adaptar un PRRSV cultivado con MA 104 de un tipo europeo a celulas de mam^era no MA 104.
Otro aspecto de la invencion contempla una composicion de vacuna para la proteccion de cerdos contra la infeccion por PRRSV que comprende el PRRSV atenuado vivo depositado en la Coleccion europea de cultivos celulares (ECACC) con el numero de acceso ECACC 11012502 y un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Una vacuna tal puede comprender ventajosamente ademas uno o mas patogenos atenuados o inactivados no PRRSV o material antigenico del mismo. Por ejemplo, los patogenos no PRRSV pueden seleccionarse de virus de la seudorrabia, virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible, Escherichia coli, Erysipelas rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.virus PRRS
Se contempla que la composicion de vacuna pueda comprender un vehmulo que es adecuado para administracion intradermica o intramuscular. En algunas realizaciones, la vacuna esta en forma liofilizada. En realizaciones espedficas, la vacuna comprende al menos aproximadamente 107 partmulas vmcas.
Tambien se contempla un metodo de inmunizacion de cerdos contra el smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS), metodo que comprende la etapa de administrar a un cerdo una composicion de vacuna que incluye un virus vivo del smdrome reproductor y respiratorio porcino mezclado con un agente de vehmulo farmacologicamente compatible, comprendiendo el virus el virus PRRSV 94881 pasado al menos 36 veces por cultivo celular para modificar el virus de forma que cuando el virus modificado se administre a un cerdo u otro marnffero propenso al PRRS fracase en producir signos clmicos de enfermedad de PRRS, pero pueda inducir una respuesta inmunitaria que inmunice al mamffero contra formas patogenas del PRRS.
En algunas realizaciones, el metodo se realiza, no presentando el cerdo lesiones pulmonares despues de la vacunacion. En otras realizaciones, el cerdo presenta menos lesiones pulmonares despues de la vacunacion con respecto a la vacunacion con la vacuna Porcilis.virus PRRS
Tambien se contempla virus PRRSuna composicion que comprende una protema que tiene la secuencia de SEQ ID NO:7 o las protemas que tienen las secuenciasvirus PRRS SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9.
Tambien se contempla un acido nucleico aislado que comprende la secuencia de SEQ ID NO:24 o las secuencias de SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; y SEQ ID NO:26.
La invencion se refiere ademas a un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica el ORF de PRRSV de SEQ ID NO:7 operativamente unida a un promotor o los ORF de PRRSV de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, y SEQ ID NO:9operativamente unida a un promotor. En algunas realizaciones, la secuencia de acido nucleico que codifica dicho ORF es SEQ ID NO:24 o dicha secuencia de acido nucleico que codifica dichos ORF comprende SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22; SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; y SEQ ID NO:26.
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Breve descripcion de varias vistas de los dibujos
Figura 1A: Observacion clmica de la puntuacion de tos en el modelo de exposicion respiratoria usando la cepa de exposicion europea.
Figura 1B: Observacion clmica de la puntuacion clmica total en el modelo de exposicion respiratoria usando una cepa de exposicion europea.
Figura 2: Mediciones de temperatura rectal en el modelo de exposicion respiratoria usando una cepa de exposicion europea.
Figura 3: Mediciones del aumento de peso diario promedio en el modelo de exposicion respiratoria usando una cepa de exposicion europea.
Figura 4: Viremia del PRRS como se indica por PCR cuantitativa en el modelo de exposicion respiratoria usando una cepa de exposicion europea.
Figura 5: Serologfa del PRRS como se indica por ELISA en el modelo de exposicion respiratoria usando una cepa de exposicion europea.
Figura 6: Examen macroscopico de lesiones pulmonares en el modelo de exposicion respiratoria usando una cepa de exposicion europea.
Figura 7A-C: Mediciones de histopatologfa. La Figura 7A muestra lesiones pulmonares macroscopicas medias; la Figura 7B muestra la histopatologfa de animal de control; la Figura 7B muestra la histopatologfa de animales infectados por PRRS.
Figura 8: Muestra los resultados de PCR-RT en tiempo real que representan el % de viremia en animales vacunados con PRRSV 94881 EU PRRS 94881.
Figura 9: Proceso simultaneo para la produccion a gran escala de PRRSV 94881 EU PRRS 94881.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion proporciona metodos para tratar o reducir la gravedad de la infeccion por el virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV), ademas de metodos para prevenir la infeccion por PRRSV. Generalmente, el metodo es para tratar o reducir la gravedad de o la incidencia de la infeccion por el virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV). “Tratar o reducir la gravedad de o la incidencia de” se refiere a una reduccion en la gravedad de los signos clmicos, smtomas y/o signos patologicos normalmente asociados a la infeccion, hasta e incluyendo la prevencion de cualquier signo o smtoma tal. “Signos patologicos” se refiere a la prueba de infeccion que se encuentra microscopicamente o durante autopsia (por ejemplo, lesiones pulmonares).
El metodo generalmente incluye la etapa de administrar una cantidad terapeutica de un antfgeno del PRRSV a un cerdo de una edad definida o intervalo de edad. Por ejemplo, en un aspecto de la invencion, una cantidad terapeutica de un antfgeno del PRRSV puede administrarse a un lechon de aproximadamente tres semanas de edad o mas joven, y diferentes cantidades terapeuticas del antfgeno pueden administrarse a un cerdo entre aproximadamente 3 semanas de edad y 4 semanas de edad. Similarmente, una cantidad terapeutica incluso diferente podna administrarse a un cerdo entre aproximadamente cuatro semanas y dieciseis semanas de edad (o cualquier edad dentro de este intervalo, por ejemplo, cinco semanas a seis semanas de edad, nueve semanas a quince semanas de edad, siete semanas a diez semanas de edad, etc.), o a cerdos de mas de dieciseis semanas, tales como una cerda adulta.
En realizaciones espedficas, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende una cepa del PRRSV atfpica atenuada y a vacunas vivas modificadas mejoradas correspondientes que confieren inmunidad eficaz a esta cepa del PRRSV tfpica recientemente descubierta. “Inmunidad eficaz” se refiere a la capacidad de una vacuna para prevenir infecciones por PRRSV en cerdos, que incluye infecciones por PRRSV atfpicas, que producen signos clmicos sustanciales de la enfermedad. Debe entenderse que los cerdos inmunizados pueden o pueden no ser serologicamente positivos para PRRSV, pero los cerdos no presentan ningun smtoma clmico sustancial.
En formas preferidas, la composicion de vacuna de la invencion incluye un virus vivo del PRRS de tipo europeo vivo que se ha atenuado en virulencia. Se ha mostrado que el virus atenuado resultante es avirulento en estudios en animales huesped controlados expuestos y confiere inmunidad eficaz. Esta cepa particular de PRRS EU no es tan virulenta como otras y de ah que sea una opcion atractiva como candidato a vacuna. La cepa parental PRRSV 94881 no produce enfermedad de PRRS atfpica grave en la cerda prenada ni lesiones pulmonares graves en cerdos jovenes. Esta cepa se aislo inicialmente en Renania del Norte-Westfalia, Alemania, de un lechon de 3 semanas de edad con trastorno respiratorio grave. La cepa se atenuo posteriormente mediante pase continuo por celulas MA 104. La cepa atenuada fue depositada por Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, Alemania en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretana, el 25 de enero de 2011 y se le concedio el n° de acceso 11012502. Este virus atenuado es un virus de siembra maestro
(MSV) preferido que posteriormente se ha sometido a pases y se ha desarrollado como una vacuna eficaz contra el PRRSV. La cepa parental virulenta denominada 94881 tambien fue depositada segun el Tratado de Budapest por Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, Alemania en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Gran Bretana, el 25 de enero de 2011 y se le concedio el n° 5 de acceso 11012501.
En ciertas realizaciones a modo de ejemplo, la composicion de vacuna contra el virus vivo modificado se probo a una dosificacion de 1 ml para cerdos y 2 ml para cerdas por inyeccion intramuscular y se mostro que era eficaz en la produccion de inmunidad protectora.
El pase del virus hasta la atenuacion se llevo a cabo usando metodos de virologfa clasica. Espedficamente, la cepa 10 aislada parental PRRSV 94881 se atenuo in vitro mediante pases continuos por celulas MA 104 para lograr un pase maximo de 108 pases despues del aislamiento inicial. Brevemente, el material se paso aproximadamente 1 a 2 pases por semana durante un total de 108 pases en matraces T de 25 cm2 o T de 75 cm2. Los cultivos de celulas MA 104 confluentes con aproximadamente 12 - 30 ml de medio esencial mmimo (MEM) complementado con 6% de suero bovino fetal (SBF) se inocularon con 100 a 300 |jl del virus. Los cultivos se incubaron durante 3 - 7 dfas en una 15 estufa de incubacion de camara humidificada a 37°C con 4 - 6% de CO2. Una vez los cultivos alcanzaron > 25% del efecto citopatico (CPE), el matraz se recogio extrayendo el sobrenadante. Una parte del sobrenadante se paso a un nuevo matraz y 2 ml de la cosecha se tomaron en almuotas para el almacenamiento a -60°C a -80°C.
El experto usando tecnicas convencionales en la materia podra determinar la secuencia de acidos nucleicos subyacentes del virus atenuado que se deposito en ECACC con el n° de acceso 11012502. virus PRRSLa secuencia 20 mostrada en SEQ ID NO:1 es la secuencia de longitud completa del MSV PRRSV 94881 atenuado y tiene una secuencia de longitud completa de 14843 pb. Los ORF 1 a 7 se han anotado para esta secuencia del siguiente modo:
Numero de ORF
CDS en SEQ ID NO:1 Protema codificada
ORF1a
178 a 7227 SEQ ID NO:2
ORF1b
7209 a 11600 SEQ ID NO:3
ORF2
11611 a 12360 SEQ ID NO:4
ORF3
12219 a 13016 SEQ ID NO:5
ORF4
12761 a 13312 SEQ ID NO:6
ORF5
13309 a 13914 SEQ ID NO:7
ORF6
13902 a 14423 SEQ ID NO:8
ORF7
14413 a 14799 SEQ ID NO:9
La secuencia mostrada en SEQ ID NO:10 es la secuencia de longitud completa de la cepa PRRSV 94881 parental, 25 pase 5, y tiene una secuencia de longitud completa de 14843 pb. Los ORF 1 a 7 se han anotado para esta secuencia del siguiente modo:
Numero de ORF
CDS en SEQ ID NO:10 Protema codificada
ORF1a
178 a 7227 SEQ ID NO:11
ORF1b
7209 a 11600 SEQ ID NO:12
ORF2
11611 a 12360 SEQ ID NO:13
ORF3
12219 a 13016 SEQ ID NO:14
ORF4
12761 a 13312 SEQ ID NO:15
ORF5
13309 a 13914 SEQ ID NO:16
ORF6
13902 a 14423 SEQ ID NO:17
ORF7
14413 a 14799 SEQ ID NO:18
Con el aislamiento de esta nueva cepa del virus PRRS europeo atenuado es posible producir vacunas contra el PRRS mejoradas que contienen una cepa del PRRS mas reciente que refleja cepas del PRRS virulentas 30 actualmente encontradas en el campo. En particular, el nuevo virus PRRS europeo atenuado puede usarse para preparar vacunas vivas modificadas (MLV). Una vacuna viva modificada se caracteriza porque contiene virus vivos que pueden replicarse en cerdos, pero no ejercen la enfermedad del PRRS clinica. Ademas, tras la administracion induce una respuesta inmunologica en cerdos que generalmente conduce a un grado significativo de proteccion contra la posterior infeccion por el virus PRRS patogeno. El virus que muestra tales caractensticas se llama 35 normalmente virus atenuado. Ademas, la presente invencion proporciona detalles de las secuencias de los ORF de tanto las cepas parentales como las atenuadas del PRRSV 94881. Por tanto, se contempla que el experto pueda emplear las secuencias de uno cualquiera o mas de los ORF mostrados en la presente memoria en una vacuna de subunidad.
Como se ha observado anteriormente, en general, la atenuacion del virus puede generarse a partir de cepas 40 aisladas de virus patogenos por pases repetidos por celulas huesped adecuadas que son permisibles al virus hasta
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que el virus muestra las propiedades deseadas (documentos WO 92/21375, WO 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930). Alternativamente, puede generarse por remanipulacion genetica mediante el uso de un clon infeccioso, normalmente un transcrito de ADN complementario de longitud completa del genoma vmco (documentos WO 98/18933, EP 1 018 557, WO 03/062407, Nielsen y col., J Virol 2003, 77:3702-371 1). En una realizacion preferida, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende virus PRRS atenuado del genotipo europeo 94481 que se atenua a partir de un virus parental que se deposito en ECACC con el n° de acceso 11012501. Una composicion preferida comprende el virus atenuado de la presente invencion que se deposito en ECACC con el n° de acceso 11012502. virus PRRSLas cepas de la invencion tambien pueden modificarse adicionalmente para conferir adicionalmente propiedades deseables a las mismas. Esto puede lograrse por propagacion clasica y tecnicas de seleccion como la propagacion continuada en celulas huesped adecuadas para extender el fenotipo atenuado. Alternativamente, las cepas pueden modificarse geneticamente por mutacion dirigida de la secuencia de acidos nucleicos del genoma de estas cepas por tecnicas de ingeniena genetica adecuadas. El genoma del PRRSV se secuencio completamente o parcialmente (Conzelmann y col., 1993; Meulenberg y col., 1993a, Murtaugh y col., 1995) y codifica, ademas de la ARN polimerasa dependiente de ARN (ORF 1a y 1b), seis protemas estructurales de las que cuatro glucoprotemas de la envuelta se llamaron GP2 (ORF2), GP3 (ORF3), GP4 (ORF4) y GP5 (ORF5), una protema M de la membrana no glicosilada (ORF6) y la protema N de la nucleocapside (ORF7) (Meulenberg y col. 1995, 1996; van Nieuwstadt y col., 1996). La caracterizacion inmunologica y la secuenciacion de nucleotidos de las cepas del PRRSV europeo y US han identificado diferencias antigenicas menores dentro de las cepas del PRRSV localizadas en las protemas vmcas estructurales (Nelson y col., 1993; Wensvoort y col., 1992; Murtaugh y col., 1995). El MSV PRRSV 94881 de la presente invencion se ha comparado con la cepa del virus de referencia europeo el virus de Lelystad (LV), que revelo homologfas de nucleotidos que oscilan de 85,40 a 95,09 por ciento en los 8 genes vmcos diferentes e identidades de aminoacidos de 86,39 a 97,27 por ciento entre ambas cepas de virus. Pudieron identificarse dos deleciones en el ORF 1a del MSV 94881 en comparacion con LV. Por ejemplo, ORF1a del MSV 94881 tiene 85,40% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce una identidad de aminoacidos de 86,39%; ORF1b del MSV 94881 tiene 92,12% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce un identidad de aminoacidos de 97,27%; ORF2 del MSV 94881 tiene 91,07% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce un identidad de aminoacidos de 90,76%; ORF3 del MSV 94881 tiene 90,98% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce un identidad de aminoacidos de 89,43%; ORF4 del MSV 94881 tiene 90,58% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce un identidad de aminoacidos de 87,43%; ORF5 del MSV 94881 tiene 90,43% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce un identidad de aminoacidos de 88,56%; ORF6 del MSV 94881 tiene 95,02% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce un identidad de aminoacidos de 97,11%; ORF7 del MSV 94881 tiene 95,09% de homologfa de nucleotidos con el virus de Lelystad que produce un identidad de aminoacidos de 92,97%.virus PRRSvirus PRRSvirus PRRSvirus PRRS
Las tecnicas recombinantes para preparar secuencias modificadas son muy conocidas para aquellos expertos en la materia y normalmente emplean la construccion de copias de ADN complementario de longitud completa (clones infecciosos) del genoma vmco que luego pueden modificarse por recombinacion de ADN y metodos de manipulacion (como mutagenesis dirigida a sitio, etc.). De esta forma puede modificarse, por ejemplo, sitios antigenicos o propiedades enzimaticas de protemas vmcas. En la bibliograffa se ha informado de clones infecciosos de cepas del virus PRRS de genotipo europeo y norteamericano.
Las cepas del virus PRRS de la presente invencion son adecuadas para vacunas de la invencion, pueden cultivarse y recogerse por metodos conocidos en la tecnica, por ejemplo, propagandose en celulas huesped adecuadas como la lmea celular simia MA-104, celulas Vero o macrofagos alveolares porcinos. El PRRSV crece preferencialmente en macrofagos alveolares de los pulmones (Wensvoort y col., 1991). Tambien son susceptibles al virus algunas lmeas celulares tales como CL2621 y otras lmeas celulares clonadas de la lmea celular de rinon de mono MA-104 (Benfield y col., 1992; Collins y col., 1992; Kim y col., 1993).
Preferentemente, las composiciones de vacunas segun la presente invencion comprenden una o mas de estas cepas vivas en un vehmulo adecuado, pero los virus inactivados tambien pueden usarse para preparar vacuna elaborada con microbios muertos (KV). Las composiciones MLV se formulan normalmente para permitir la administracion de 101 a 107 partmulas vmcas por dosis, preferentemente 103 a 105 partmulas por dosis, mas preferentemente 104 a 105 partmulas por dosis (4,0-5,0 log-10 TCID50). Las composiciones KV puede formularse basandose en un tttulo de pre-inactivacion de 103 a 1010 partmulas vmcas por dosis. Las composiciones puede comprender un vehmulo farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, una disolucion salina fisiologica.
Los cerdos pueden infectarse por el PRRSV por una via buconasal. El virus en los pulmones se recoge por macrofagos alveolares de los pulmones y en estas celulas la replicacion del PRRSV se completa en el plazo de 9 horas. El PRRSV se desplaza de los pulmones a los ganglios linfaticos de los pulmones en el plazo de 12 horas y a los ganglios linfaticos perifericos, la medula osea y el bazo en el plazo de 3 dfas. En estos sitios, solo algunas celulas se tinen positivamente para el antfgeno vmco. El virus esta presente en la sangre durante al menos 21 dfas y frecuentemente mucho mas. Despues de 7 dfas, los anticuerpos para PRRSV se encuentran en la sangre. La presencia combinada de virus y anticuerpo en cerdos infectados con PRRS muestra que la infeccion por el virus puede persistir durante un largo tiempo, aunque a un bajo nivel, a pesar de la presencia del anticuerpo. Durante al menos 7 semanas, la poblacion de celulas alveolares en los pulmones es diferente de pulmones de SPF normales.
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Una composicion de vacuna segun la presente invencion puede presentarse en forma de una preparacion liofilizada del virus vivo, para reconstituirse con un disolvente, para producir una disolucion para inyeccion. El disolvente puede ser, por ejemplo, agua, solucion salina fisiologica o tampon, o un disolvente con adyuvante. El disolvente puede contener adyuvantes. La composicion de vacuna reconstituida puede entonces inyectarse a un cerdo, por ejemplo, como una inyeccion intramuscular o intradermica en el cuello. Para inyeccion intramuscular puede aplicarse un volumen de 2 ml, para una inyeccion intradermica es normalmente 0,2 ml. Por tanto, en otro aspecto, la presente invencion es un producto de vacuna que comprende en recipientes separados una composicion liofilizada del virus y un disolvente para reconstitucion y que opcionalmente contiene adicionalmente un prospecto o etiqueta que comprende instrucciones de uso.
Una composicion de vacuna segun la presente invencion puede no solo comprender la cepa anteriormente mencionada, sino que puede incluir adicionalmente componentes activos contra el PRRS u otras enfermedades vmcas o bacterianas porcinas como el circovirus porcino o el virus de la fiebre porcina clasica. Por tanto, la invencion se refiere ademas a una composicion de vacuna como se ha descrito, caracterizada porque contiene al menos otro antigeno activo contra una enfermedad porcina que no es PRRS. Por ejemplo, tales otros antigenos pueden incluir Mycoplasma hyopneumoniae, PCV2, SIV, H. parasuis, E. rhusiopathiae, S. suis, A. suis, Leptospira sp. Parvovirus y similares. Ademas, la vacuna puede comprender ciertos adyuvantes farmaceuticamente o veterinariamente aceptables. La invencion proporciona nuevas composiciones de vacuna, en particular vacunas contra el virus PRRS que comprenden el PRRSV 94881 que comprenden ademas adyuvantes que potencian la eficacia de la vacuna de forma que se observe una mejor respuesta clmica/resultado con la administracion de la combinacion del adyuvante y la vacuna con respecto a la administracion de la vacuna sola. Por ejemplo, las composiciones de vacuna de la invencion pueden comprender una vacuna contra el virus PRRSV 94881 y un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en MCP-1, a-tocoferol (por ejemplo, acetato de a-tocoferol, una version a modo de ejemplo que se comercializa como Diluvac Forte®), fracciones de Haemophilus somnus, carbopol y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la vacuna contra el virus que comprende la vacuna contra el virus PRRSV 94881 puede ser una vacuna de subunidad recombinante o alternativamente puede ser una vacuna contra el virus vivo atenuado. Una vacuna viva a modo de ejemplo que existe es la MLV del PRRS Ingelvac® y el PRRSV 94881 puede formularse de un modo similar a la MLV del PRRS Ingelvac®.
Ademas de lo anterior, las composiciones de la invencion pueden contener otros componentes, en tanto que los otros componentes no interfieran con los adyuvantes o la vacuna contra el virus subyacente. Tales otros componentes incluyen, por ejemplo, aglutinantes, colorantes, desecantes, antisepticos, agentes humectantes, estabilizadores, excipientes, adhesivos, plastificantes, agentes de pegajosidad, espesantes, materiales de parche, bases para pomada, eliminadores de queratina, sustancias basicas, promotores de la absorcion, acidos grasos, ester de acido graso, alcoholes superiores, tensioactivos, agua y agentes de tampon. Otros componentes preferidos incluyen agentes de tampon, bases para pomada, acidos grasos, antisepticos, sustancias basicas o tensioactivos.
El contenido o la cantidad de los adyuvantes usados en la invencion puede variar y puede determinarse considerando, por ejemplo, las propiedades de la vacuna contra el virus PRRS que se usa, y la forma de dosificacion. El adyuvante puede comprender, por ejemplo, 1 al 100% en peso. Las composiciones basadas en el PRRSV 94881 de la invencion se producen mezclando juntos el componente de adyuvante y el componente de la vacuna contra el virus, tanto solos como con diversos otros componentes. Las composiciones pueden ser de forma que la vacuna contra el virus y el adyuvante se presenten como una formulacion o, alternativamente, el adyuvante y la vacuna se presenten en formulaciones distintas que pueden administrarse simultaneamente o secuencialmente.
Por tanto, el componente de adyuvante de las composiciones de la invencion puede administrarse por separado de la vacuna contra el virus en la administracion a organismos. Alternativamente, el adyuvante segun la presente invencion, junto con la vacuna contra el virus, pueden administrarse como una unica composicion de vacuna. La vacuna contra el virus puede ser cualquier vacuna contra el virus. Mas realizaciones espedficas contemplan el uso de una vacuna contra el virus PRRS que comprende el PRRSV 94881. Ademas, una vacuna tal puede combinarse con otras vacunas tales como la MLV del PRRS Ingelvac® y/o Porcilis®. Esto es simplemente una vacuna de combinacion del virus PRRS a modo de ejemplo y facilmente pueden prepararse otras combinaciones de vacuna tales.
Las composiciones descritas en la presente memoria son particularmente ventajosas en la induccion de la produccion de una respuesta de anticuerpo al virus PRRS. La administracion de las vacunas producira preferentemente una reduccion de la gravedad de uno o mas smtomas clmicos, tales como lesiones pulmonares, anorexia, decoloraciones de la piel, letargo, signos respiratorios, lechones momificados, tos, diarrea y combinaciones de los mismos, que estan asociados a infeccion por PRRSV.
Por tanto, las composiciones potencian particularmente el resultado clinico en un animal enfermo con respecto al resultado de la administracion de la vacuna contra el virus PRRS sola. En realizaciones espedficas, el resultado clinico potenciado es una reduccion del porcentaje de lesiones pulmonares de al menos 50% cuando se compara con animales que no reciben la composicion inmunogenica en combinacion con dicho adyuvante. En otras realizaciones, el resultado clinico potenciado es una reduccion de la viremia en animales de al menos 45% cuando se compara con animales que no reciben la composicion inmunogenica en combinacion con dicho adyuvante.
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Por tanto, en un aspecto, la invencion se refiere a una composicion de vacuna mejorada, mas particularmente a una composicion de vacuna contra el virus PRRS mejorada, en el que la mejora comprende mezclar con la vacuna contra el virus un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en MCP-1, fracciones de Haemophilus somnus, carbopol y combinaciones de los mismos. La composicion de vacuna de la invencion puede comprender adicionalmente un vetuculo farmaceuticamente aceptable.
Las composiciones de vacuna de la invencion pueden formularse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica de la formulacion, por ejemplo, en preparaciones lfquidas, suspensiones, pomadas, polvos, lociones, emulsiones W/O, emulsiones O/W, emulsiones, cremas, cataplasmas, parches y geles y se usa preferentemente como medicamentos. Por tanto, segun otro aspecto de la presente invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende la composicion de vacuna anterior. La composicion de vacuna segun la presente invencion, cuando se administra dermicamente, puede inducir significativamente la produccion de anticuerpos. Por consiguiente, en otra realizacion preferida de la presente invencion, la composicion de vacuna puede proporcionarse como una preparacion transdermica.
Ademas, como se ha descrito anteriormente, el virus y el adyuvante en la presente invencion pueden administrarse a un organismo juntos como una unica composicion de vacuna, o como una preparacion de adyuvante separada y distinta del componente del virus PRRS antigenico de la vacuna, por lo que el adyuvante actua de tal forma que la cantidad de un anticuerpo producida en el organismo en respuesta a la vacuna contra el virus PRRS puede disminuirse significativamente con respecto a la administracion de la vacuna contra el virus PRRS sola.
Cuando se administran el adyuvante y la composicion de vacuna contra el virus PRRS a un organismo, el resultado clmico del animal se potencia. La cantidad eficaz del adyuvante y la cantidad inmunologicamente eficaz de la composicion de vacuna contra el virus PRRS pueden determinarse facilmente por un experto en la materia considerando, por ejemplo, el tipo y las propiedades de la sustancia antigenica, las especies de organismos, edad, peso corporal, gravedad de las enfermedades, el tipo de enfermedades, el tiempo de administracion y el metodo de administracion, y adicionalmente usando la cantidad de un anticuerpo producido contra la sustancia antigenica en el organismo como mdice.
La composicion de vacuna contra el virus PRRS, el adyuvante, o combinaciones de los mismos, pueden administrarse a organismos por cualquier metodo adecuado seleccionado dependiendo, por ejemplo, de la afeccion de los animales y las propiedades de las enfermedades. Ejemplos de tales metodos incluyen administracion intraperitoneal, administracion dermica, por ejemplo, inyeccion subcutanea, inyeccion intramuscular, inyeccion intradermica y parches, administracion nasal, administracion por via oral, administracion mucosa (por ejemplo, administracion rectal, administracion vaginal y administracion corneal). Entre ellas se prefiere la administracion intramuscular.
Una dosis terapeutica a modo de ejemplo de la MLV contra el PRRSV es aproximadamente dos mililitros (2 ml). Los expertos reconoceran que la cantidad de dosificacion puede variarse basandose en la variedad, tamano y otros factores ffsicos del sujeto individual, ademas de la formulacion espedfica de la MLV contra el PRRSV y la via de administracion. Preferentemente, la MLV contra el PRRSV se administra en una dosis unica; sin embargo, pueden ser utiles dosis adicionales. De nuevo, el experto reconocera mediante la presente invencion que la dosificacion y el numero de dosis esta influido por la edad y la condicion ffsica del cerdo objetivo, ademas de otras consideraciones comunes a la industria y las condiciones espedficas bajo las que se administra la MLV contra el PRRSV.
Las composiciones de vacunas basadas en los virus PRRS pueden usarse para vacunar tanto lechones como cerdas. En un aspecto de la invencion, una pauta de dosis particular se selecciona basandose en la edad del cerdo y el antfgeno seleccionado para administracion. Esto permitira que los cerdos de cualquier edad reciban la dosis mas eficaz. En un metodo preferido, una cantidad terapeutica de la MLV del PRRSV 94881 se administra a un cerdo o lechon que tiene aproximadamente dos semanas de edad + 5 dfas de edad. La cantidad seleccionada variara dependiendo de la edad del cerdo. Alternativamente, una cantidad terapeutica diferente de una MLV tal se administra a un cerdo o lechon que tiene mas de aproximadamente 3 semanas, y esta cantidad tambien se cambiara a medida que el cerdo que recibe una administracion tal envejece o se hace mayor. Por consiguiente, cerdos de aproximadamente cuatro semanas de edad, seis semanas de edad, ocho semanas de edad, diez semanas de edad, doce semanas de edad, catorce semanas de edad, dieciseis semanas de edad, una cerda joven, o una cerda recibiran todos diferentes cantidades. La dosis terapeutica que va a usarse se optimizara en el campo y normalmente se determina en estudios clmicos en los que se define una dosis de inmunizacion minima basandose en la proteccion contra una exposicion al PRRSV heterologo virulento en cerdos susceptibles. Preferentemente, la MLV contra el PRRSV producida segun los metodos descritos en la presente memoria se administra por administracion intramuscular; sin embargo, pueden usarse otros metodos de administracion tales como intradermica, intranasal, intrarretiniana, oral, subcutanea y similares que son muy conocidos y usados en la tecnica.
El experto reconocera que los metodos de vacunacion pueden implicar determinar el momento y la dosificacion apropiada para la vacunacion de un cerdo contra el PRRSV. Tales metodos comprenden generalmente las etapas de determinar al menos una variable seleccionada del grupo que consiste en edad, estado de salud, nivel de inmunidad innata y nivel de inmunidad activa, del cerdo y ajustar un nivel de dosificacion estandar para explicar estas variables. Generalmente, el nivel de inmunidad innata y el nivel de inmunidad activa se determinaran con
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referencia a un patron que comprende los niveles promedio de una poblacion de cerdos de edad y estado de salud similar. En un metodo particularmente preferido, todas las variables se consideran antes de determinar el nivel de dosificacion optimo y el momento de la administracion.
En realizaciones preferidas, la presente invencion tambien se refiere a acidos nucleicos aislados que codifican marcos de lectura abiertos espedficos del virus 94881 atenuado depositado con el n° de acceso de ECACC 11012502 y el virus 94881 virulento parental depositado con el n° de acceso de ECACC 11012501. Por ejemplo, la secuencia de nucleotidos completa del virus 94881 atenuado depositado con el n° de acceso de ECACC 11012502 tiene una secuencia de SEQ ID NO:1 que codifica las secuencias de protemas de ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 y SEQ ID NO:9, respectivamente. La secuencia de nucleotidos completa del virus 94881 virulento parental depositado con el n° de acceso de ECACC 11012501 tiene una secuencia de SEQ ID NO:10 que codifica las secuencias de protemas de ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 de SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 y SEQ ID NO:18, respectivamente.
La composicion de vacuna contra el PRRSV 94881 puede administrarse de cualquier forma convencional y en algunos metodos preferidos la administracion es intramuscularmente. Se prefiere que la composicion de vacuna contra el PRRSV administrada proporcione sus beneficios de tratamiento o reduccion de la gravedad de o incidencia de la infeccion por el PRRSV despues de una dosis unica, como con Ingelvac®; sin embargo, si se seleccionan otros antigenos o vacunas de combinacion o multivalentes, debe entenderse que pueden administrarse en su modo convencional, que puede incluir una o mas dosis de refuerzo despues de la administracion inicial. Aquellos expertos en la materia podran determinar niveles de dosificacion apropiados basandose en la vacuna contra el PRRSV seleccionada y el intervalo de edad del animal al que se administrara el antigeno.
En ejemplos espedficos presentados en la presente memoria mas adelante, los cerdos y cerdas se expusieron a una nueva cepa derivada de europea del PRRSV que pudo producir reproduciblemente enfermedad respiratoria en lechones. Historicamente, las cepas del PRRSV derivadas de europea no hadan podido reproducir enfermedad respiratoria en el modelo de lechon y de aid que los modelos de exposicion respiratoria se basaran en la infeccion por cepas no europeas. Debido a la alta diversidad genetica hay una demanda en Europa de una nueva vacuna basada en una cepa europea. En ejemplos adicionales, los animales se expusieron a una cepa que produjo fracaso reproductivo en modelos de exposicion de cerdas jovenes/cerdas. Se ha encontrado que la eficacia de las vacunas MLV basadas en el virus 94881 atenuado depositado con el n° de acceso de ECACC 11012502 o cualquier virus preparado a partir de esta cepa o de la cepa parental depositada con el n° de acceso de ECACC 11012501 puede mostrarse usando una variedad de modelos de exposicion debido a que esta cepa tambien es eficaz en otros modelos de insuficiencia respiratoria o fracaso reproductivo inducido por el virus PRRS.
Ejemplos
Ejemplo 1: Descripcion del modelo de exposicion respiratoria al PRRSV
Como se ha observado anteriormente, historicamente, las cepas del PRRSV derivadas de EU no podfan reproducir enfermedad respiratoria en el modelo de lechon. Debido a la alta diversidad genetica, en Europa existe una demanda de una nueva vacuna basada en una cepa europea y es necesario un buen modelo de exposicion respiratoria reproducible utilizando una cepa del PRRSV derivada de europea virulenta para la conduccion de los estudios. En el siguiente ejemplo, los inventores muestran que la exposicion de cerdos a la cepa de exposicion europea de pase bajo (pase 4) produjo fidedignamente smtomas respiratorios.
En este estudio se usaron 3 grupos con 12 animales, 3 semanas de edad en la asignacion y aprox. 10 semanas de edad en la exposicion:
Grupo 1: Grupo de control
Grupo 2: Grupo de exposicion (SD 35)
Grupo 3: Vacunado con el PRRSV Porcilis® (SD 0) y luego expuesto (SD 35).
El estudio se realizo durante un periodo de 56 dfas. La autopsia de 6 animales de cada grupo se midio 10 dfas despues de la exposicion; la autopsia de los animales restantes 21 dfas despues de la exposicion. Los parametros investigados diariamente incluyeron: temperatura rectal, signos respiratorios y otros signos clmicos. Otros parametros investigados incluyeron: peso corporal, mortalidad, viremia, seroconversion, examen patologico e histologico de los pulmones.
En el dfa de estudio -7, los grupos de cerdos se asignaron a cada grupo. En el dfa de estudio 0, el Grupo 3 se vacuno con el PRRSV Porcilis®. En el dfa de estudio 35, el Grupo 2 y el Grupo 3 se expusieron a una cepa de exposicion europea. En el dfa 45, 6 animales de cada grupo se sacrificaron. El resto de los animales se sacrifico el dfa 56.
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La Figura 1A muestra las mediciones de tos como una puntuacion media por animal y semana. Se observo que hubo un aumento en la tos despues de la exposicion en tanto el grupo de exposicion sola (Grupo 2) como el grupo de Porcilis (Grupo 3). La Figura 1B muestra la puntuacion clmica total que se tomo de disnea, tos, rinorrea o legana y comportamiento. Estos datos mostraron que hubo un aumento global en la puntuacion clmica total despues de la exposicion en el grupo de exposicion y de Porcilis. La temperatura rectal de los animales se monitorizo antes y despues de la exposicion y muestra que hubo un aumento de la temperatura rectal en el grupo de exposicion y de Porcilis despues de la exposicion (SD > 35, grupo 1-2 p< 0,001; grupo 1-3 p< 0,001) (Figura 2).
La medicion del peso diario promedio (Figura 3) mostro que despues de la exposicion hasta la primera y hasta la segunda autopsia el ADW fue significativamente menos en el grupo de exposicion (SD 35-44 p< 0,001 y SD 35-56 p< 0,01) y en el grupo vacunado con Porcilis (SD 35-44 p< 0,05 y Sd 35-56 p< 0,05).
La viremia se monitorizo usando PCR (Figura 4) y ensayos de ELISA (Figura 5). La PCR mostro que en el Grupo 1: todos los animales del grupo de control siguieron siendo negativos. En el Grupo 2: todos los animales fueron positivos para PRRSV despues de la exposicion; en el Grupo 3: todos los animales fueron positivos para PRRSV despues de la vacunacion. Los ELISA revelaron: que en el Grupo 1: todos los animales siguieron siendo negativos; en el Grupo 2: todos los animales fueron positivos para PRRSV AB despues de la exposicion; en el grupo 3: todos los animales fueron positivos para PRRSV AB despues de la vacunacion.
Tambien se realizo el examen macroscopico de los pulmones (Figura 6) en el que los pulmones se evaluaron para areas manchadas de color tostado y areas de consolidacion: en comparacion con el grupo de control pudieron observarse cambios macroscopicos significativos en el grupo de exposicion y de Porcilis (Grupo 1-2 p<0,001; Grupo 1-3 p < 0,05). En el examen histopatologico, los datos tambien mostraron la eficacia de la vacunacion (Figura 7A a 7C). La puntuacion de lesion pulmonar media fue significativamente mayor en el grupo de exposicion y de Porcilis en comparacion con el grupo de control (Grupo 1-2 p< 0,001; Grupo 1-3 p < 0,001). Las lesiones microscopicas fueron mas fuertes 10 dfas despues de la infeccion.
En resumen, la tos, las puntuaciones clmicas totales y las temperaturas rectales aumentaron despues de la exposicion en los controles de exposicion y los grupos vacunados con Porcilis. El peso corporal fue significativamente (p<0,05) menos en los controles de exposicion y el grupo de Porcilis en comparacion con el grupo de control negativo. Todos los animales del grupo de Porcilis fueron positivos para el virus PRRS y los anticuerpos despues de la vacunacion. Todos los animales de los controles de exposicion fueron positivos para el virus PRRS y los anticuerpos despues de la exposicion. Los analisis macroscopicos e histologicos de los pulmones mostraron graves lesiones pulmonares macroscopicas y microscopicas en los controles de exposicion y el grupo de Porcilis en comparacion con el grupo de control negativo.
Por tanto, este estudio confirmo que la cepa de exposicion europea usada no induce enfermedad significativa (p<0,05) cuando se compara con el grupo de control negativo: fiebre, tos, disminucion del peso y lesiones pulmonares macroscopicas y microscopicas graves.
Ademas, la cepa de exposicion europea ha demostrado satisfactoriamente enfermedad respiratoria espedfica para el PRRSV consistente y reproducible en el modelo de exposicion de cerdo y, por tanto, es adecuada para su uso como un virus de exposicion en futuros estudios de eficacia. Porcilis PRRS muestra una falta de eficiencia contra la cepa de exposicion europea dentro de los parametros de este estudio.
Ejemplo 2: Evaluacion de la dosis de inmunizacion minima del virus PRRS atenuado 94881 en lechones de 2 semanas de edad susceptibles tras la exposicion a la cepa aislada del PRRS europea heterologa.
Se realizo un estudio de exposicion a vacunacion para evaluar la dosis de inmunizacion minima (MID) de la cepa aislada 94881 derivada de europea de la vacuna del smdrome reproductor y respiratorio porcino, virus vivo modificado (MLV contra el 94881 del PRRS), a tres niveles de tftulos diferentes, administrada a lechones susceptibles a smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRS), que teman aproximadamente 14 dfas de edad, para proporcionar una reduccion relevante en lesiones pulmonares tras la exposicion a una cepa aislada europea heterologa del PRRS. Quince lechones se incluyeron en cada grupo vacunado (Grupos 1-3), ademas de en el grupo de control de exposicion (Grupo 4). Diez lechones se incluyeron en el grupo de control negativo (Grupo 5).
Los grupos de vacunas y los grupos de control de exposicion se monitorizaron para varios parametros que inclrnan: viremia despues de la exposicion, evaluaciones clmicas despues de la vacunacion, seroiogfa del PRRS, viremia despues de la vacunacion, observaciones clmicas despues de la exposicion, aumento de peso diario promedio (ADWG), temperaturas rectales y deteccion del virus PRRS en los pulmones. Un grupo de control negativo (Grupo 5), que no se expuso, tambien se incluyo en el estudio para fines de validacion del estudio demostrando que la bioseguridad no se infringio durante la duracion del estudio.
Los grupos de control de exposicion y de control negativo fueron negativos para PRRS hasta el dfa de exposicion (D28) y el grupo de control negativo siguio siendo negativo para PRRS para el resto del estudio (D38), validandose asf el estudio.
La exposicion fue 4 semanas despues de la vacunacion. En este momento, solo 2 animales en el grupo de vacunas
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de t^tulo bajo, 1 animal en el grupo de vacunas de titulo medio y 3 animales en el grupo de vacunas de titulo alto fueron positivos por qPCR para PRRS en suero.
El grupo de control de exposicion presento lesiones pulmonares significativas tipicas del PRRS despues de la exposicion. Despues de la exposicion, los grupos de vacunas de titulos bajo, medio y alto tuvieron medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar totales de 0,13%, 0,55% y 0,40%, respectivamente; mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar total de 33,40%. Las medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar totales para los tres grupos de titulos de vacunas fueron significativamente inferiores a las del grupo de control de exposicion (p<0,0001). No hubo diferencias estadfsticas entre los grupos de titulos de vacunas (p>0,1484) para las puntuaciones de lesion pulmonar total. El grupo de control negativo tuvo una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar total de 0,00%.
En los dfas de estudio 31, 35 y 38 del periodo despues de la exposicion, los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron significativamente menos viremia que el grupo de control de exposicion (p<0,0093). No hubo diferencias estadfsticas entre los grupos de tftulos de vacunas para viremia despues de la exposicion, excepto en D35, cuando el grupo de vacunas de titulo alto presento significativamente menos viremia que el grupo de vacunas de titulo medio (p=0,0442). Los lechones de control negativo fueron negativos para viremia en D31, D35 y D38.
Clrnicamente, la gravedad (p<0,0082) y la frecuencia (p<0,0268) de la tos fue menos grave en los tres grupos de titulos de vacunas que en el grupo de control de exposicion durante el periodo despues de la exposicion; Dfa 29 - Dfa 38. La fiebre fue mas importante en el grupo de control de exposicion que en los tres grupos de titulos de vacunas despues de la exposicion. El ADWG fue significativamente mayor para los tres grupos de titulos de vacunas en comparacion con el grupo de control de exposicion (p<0,0027).
La MID de la MLV contra el PRRSV 94881 como se determina en este estudio esta asociada al nivel de vacunas de titulo bajo de 1 x 10277 TCID50/ml basandose en una reduccion relevante en lesiones pulmonares macroscopicas para los tres niveles de titulos en comparacion con los controles de exposicion despues de recibir una exposicion del PRRS derivado europeo heterologo virulento. Cuando se examinaron parametros secundarios, los tres niveles de titulos de vacuna se asociaron a eficacia y no fueron evidentes claras distinciones entre los grupos de titulos.
Diseno general del estudio:
Fue un estudio de diseno aleatorizado ciego realizado en 70 lechones destetados susceptibles al PRRS, 14-16 dfas de edad en Dfa 0 (D0). En la siguiente Tabla 2.1 se muestra una descripcion de los grupos de tratamiento:
Tabla 2.1 Grupos de tratamiento
Grupo
N° de animales en D0 Tratamiento en Dia 0
1
15 IVP n° 1 (titulo medio de 1 x 102 77 de MLV contra el 94881 del PRRS)
2
15 IVP n° 2 (titulo medio de 1 x 10442 de MLV contra el 94881 del PRRS)
3
15 IVP n° 3 (titulo medio de 1 x 105 84 de MLV contra el 94881 del PRRS)
4
15 CP (placebo del mismo producto sin MLV contra el 94881 del PRRS)
5
10 CP (placebo del mismo producto sin MLV contra el 94881 del PRRS)
Ochenta y tres lechones cumplieron los criterios de inclusion del estudio, de los que los 70 primeros numeros numericos fueron asignados aleatoriamente a uno de cinco grupos en D-3 por un bioestadfstico. Los lechones se asignaron 15 por grupo a los Grupos 1-4 y diez lechones al Grupo 5. Los 83 lechones fueron seronegativos para PRRS.
Los lechones se observaron de D-1 a D26 para evaluaciones clmicas despues de la vacunacion y las observaciones se registraran en el cuaderno de recogida de datos de las evaluaciones clmicas.
Serologfa: Se recogio sangre venosa completa de lechones en D0, D7, D14, D21, D28. Se registraron las recogidas de muestras. Las muestras de sangre se centrifugaron y el suero se recogio de cada tubo, se fracciono y se transfirio a tubos apropiadamente etiquetados. Un conjunto de muestras de suero se mantuvo a 2-8°C y el otro conjunto de muestras de suero se mantuvo a -70 ± 10°C. El conjunto de muestras de suero recogido en los dfas 0, 7, 14, 21, 28 y 38 y mantenido a 2-8°C se probo para anticuerpos del PRRS. Los resultados se informaron como negativos (relacion S/P de ELISA de < 0,4) o positivos (relacion S/P de ELISA de > 0,4).
Viremia del PRRS: El conjunto de muestras de suero recogido en los dfas 0, 7, 14, 21, 28, 31, 35 y 38 y mantenido a -70 ± 10°C se probo para ARN del PRRSv por qPCR (Apendice 1, Anexo 7). Los resultados se informaron como n.d. (no detectado), positivo (detectado el PRRSv EU, pero no cuantificable, GE/ml (equivalente de genoma) = < 3,3 log) o un valor informado (log GE/ml). Para fines estadfsticos, a “no detectado” se le asigno un valor de 0 log GE/ml y a un valor “positivo” se le asigno un valor de 3,0 log GE/ml.
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Aumento de peso diario promedio (ADWG): Cada cerdo se peso en una bascula calibrada y se registraron los pesos corporales individuales. El aumento diario promedio se determino de D0 a D28 y de D28 a D38.
Observaciones clmicas despues de la exposicion: Los lechones fueron observados por el investigador del estudio o representantes para signos clmicos de enfermedad de D27 a D38 y se registraron en el cuaderno de recogida de datos de las observaciones clmicas. Las observaciones incluyeron respiracion, comportamiento y tos basandose en el sistema de puntuacion de observaciones clmicas que se muestra a continuacion en la Tabla 2.2.
Tabla 2.2 Sistema de puntuacion de observaciones clmicas
Puntuacion de respiracion
Puntuacion de comportamiento Puntuacion de tos
0 = respiracion normal 1 = respiracion jadeante/rapida 2 = disnea 3 = muerto
0 = normal 1 = letargo de leve a moderado 2 = gravemente letargico o recostado 3 = muerto 0 = sin tos 1 = tos suave o intermitente 2 = tos aspera o grave, repetitiva 3 = muerto
Una puntuacion de observacion clmica total diaria para cada lechon se determino por la suma de sus puntuaciones de respiracion diaria, comportamiento y tos.
Las temperaturas rectales se recogieron de D27 a D38.
Puntuacion de lesion pulmonar total: Se les hizo la autopsia a todos los lechones que murieron antes de D38 y los lechones restantes que se sacrificaron en D38. Cada conjunto de pulmones se examino para cualquier patologfa pulmonar macroscopica y la determinacion del % de patologfa para cada lobulo del pulmon. Si se observara patologfa de otros organos, estas tambien se describinan y se anotanan.
qPCR de pulmon para PRRSV: Para cada conjunto de pulmones se retuvieron dos muestras de los lobulos apicales izquierdo y derecho, los lobulos cardfacos izquierdo y derecho, los lobulos diafragmaticos izquierdo y derecho y el lobulo intermedio. Para un conjunto de muestras de pulmon, las tres muestras del lado izquierdo se combinaron en un recipiente; mientras que las tres muestras del lado derecho y la muestra del lobulo intermedio del pulmon se combinaron en otro recipiente. Cada recipiente se lleno con una cantidad suficiente de 10% de disolucion de formalina. Para el otro conjunto de muestras de pulmon, las tres muestras de pulmon del lado izquierdo se combinaron en un Whirlpak®; mientras que las tres muestras del lado derecho y la muestra del lobulo intermedio del pulmon se combinaron en otro Whirlpak®.
Las muestras de tejido de pulmon congeladas se mantuvieron a -70 ± 10°C hasta el posterior analisis. Para cada lechon, todas las muestras del pulmon izquierdo se homogeneizaron y se probaron como una unica muestra combinada; y todos los tejidos del pulmon derecho y la muestra del lobulo intermedio del pulmon se homogeneizaron y se probaron como una unica muestra combinada. Los resultados se informaron como n.d. (no detectado), positivo (detectado PRRSv EU, pero no cuantificable, GE/ml (equivalente de genoma) = < 3,3 log) o un valor de prueba (log GE/ml) para muestras del pulmon izquierdo y derecho. Para fines de analisis para cada lechon se anotaron la media de los resultados de qPCR de las muestras del pulmon izquierdo y derecho. Para fines estadfsticos, a “no detectado” se le asigno un valor de 0 log GE/ml y a un valor “positivo” se le asigno un valor de 3,0 log GE/ml.
Resultados
Puntuacion de lesion pulmonar total despues de la exposicion: Un resumen de grupo mmimo, maximo, mediana, intervalo de confianza de 95%, rango de Q y media para las puntuaciones de lesion pulmonar totales mostro que los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto tuvieron medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar totales de 0,13%, 0,55% y 0,40%, respectivamente; mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar total de 33,40%. Las medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar totales para los tres grupos de tftulos de vacunas fueron significativamente inferiores a las del grupo de control de exposicion (p<0,0001). No hubo diferencias estadfsticas entre los grupos de tftulos de vacunas (p>0,1484) para las puntuaciones de lesion pulmonar total. El grupo de control negativo tuvo una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar total de 0,00%.
Para uno de los animales (grupo de vacunas de tttulo alto) se observo neumoma intersticial supurativa histologicamente leve con pleuritis fibrinopurulenta copiosa. Las vfas respiratorias y los alveolos fueron relativamente comunes, excepto los neutrofilos dispersos. El tejido de pulmon fue negativo por IHC para antfgenos de M. hyo, PCV2, PRRSv y VIS. Las lesiones pulmonares estuvieron de acuerdo con serositis generalmente asociada a agentes bacterianos (Apendice 12; acceso 2009030254). Se aislaron varios cultivos bacterianos puros del tejido de pulmon y se identificaron como Bordetella bronchiseptica y un Staphylococcus negativo para coagulasa. Aunque se aislaron dos tipos de bacteria de tejidos de pulmon, este lechon no se elimino de los analisis de puntuacion de lesion pulmonar total del Grupo 3.
Dos de 10 lechones de control negativo presentaron lesiones pulmonares de muy poca importancia (n° 1767, 0,55%;
n° 1789, 0,61%). Estas lesiones se consideraron insignificativas y no indicativas de PRRS. Dos de 10 lechones de control negativo presentaron lesiones pulmonares de muy poca importancia (n° 1767, 0,55%; n° 1789, 0,61%). Estas lesiones se consideraron insignificativas y no indicativas de PRRS.
Viremia del PRRS despues de la exposicion: Los resultados individuales de viremia del PRRS despues de la 5 exposicion (D31-D38) se tabularon y se encontro que todos los lechones fueron viremicos despues de la exposicion en los tres grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion. En los tres momentos de tiempo despues de la exposicion, los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron significativamente menos viremia que el grupo de control de exposicion (p<0,0093). No hubo diferencias entre los grupos de tftulos de vacunas para viremia despues de la exposicion, excepto en D35, cuando el grupo de vacunas de tftulo alto presento una viremia media 10 inferior a la del grupo de vacunas de titulo medio (p=0,0442). Los lechones de control negativo fueron negativos para viremia en D31, D35 y D38. El area bajo la curva (ABC) representa tanto la cantidad como la duracion de la carga vftica y es una buena herramienta de evaluacion para examinar la viremia. Tambien se detectaron diferencias significativas entre los tres grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion con respecto al ABC en tanto D28 como en D38 (p<0,0162) y D31 a D38 (p<0,0001). No se detectaron diferencias entre los grupos de tftulos 15 de vacunas con respecto al ABC (p>0,3669) en ambos intervalos de tiempo.
La frecuencia por grupo de lechones positivos viremicos tambien se resumio para D31 a D28 y se muestra en la Tabla 2.3. Como todos los lechones de control de vacuna y de exposicion fueron positivos para viremia despues de la exposicion, la frecuencia de lechones positivos para viremia fue de 100% para cada grupo en cada momento de tiempo. De ah que no se realizan analisis de la frecuencia despues de la exposicion para viremia.
20 Tabla 2.3 Resumen de la frecuencia por grupo de lechones positivos viremicos - D31 a D38
Dia de estudio
Grupo* N° de positivos % de positivos IC de 95% N° total
31
1 14 100 76,8 100,0 14
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0 0 0,0 30,8 10
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1 14 100 76,8 100,0 14
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15 100 78,2 100,0 15
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14 100 76,8 100,0 14
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0 0 0,0 30,8 10
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1 14 100 76,8 100,0 14
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15 100 78,2 100,0 15
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15 100 78,2 100,0 15
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14 100 76,8 100,0 14
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* Grupo 1 = MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo bajo; Grupo 2 = MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo medio; Grupo 3 = MLV del PRRS de tftulo alto; Grupo 4 = grupo de control de exposicion; Grupo 5 = grupo de control negativo
Resultados de qPCR de pulmon: Los resultados individuales del aislamiento del virus de los pulmones despues de la 25 exposicion se resumieron como la frecuencia de los resultados de la prueba de muestras de pulmon positivas para qPCR (valores de p) para diferencias entre grupos. Tejidos de pulmon de lechones en los tres grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion fueron positivos por qPCR para PRRSv despues de la exposicion. No hubo diferencias significativas detectadas entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion (p=1,0000). Como todos los lechones de tftulos de vacunas fueron positivos por qPCR para PRRSv, no se realizaron 30 pruebas entre los grupos de tftulos de vacunas.
Aunque no se detectaron diferencias entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion para la frecuencia de tejidos de pulmon positivos por qPCR, las diferencias fueron evidentes para la carga vftica en tejidos de pulmon. De hecho, los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto tuvieron una mediana de los valores de qPCR de pulmon de 6,88, 6,80 y 6,81 log-10 GE/ml, respectivamente; mientras que el grupo de control de 35 exposicion tuvo una mediana del valor de qPCR de pulmon de 8,13 log-10 GE/ml. Las diferencias entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion fueron significativas (p<0,0001). En cambio, no se detectaron diferencias entre los grupos de tftulos de vacunas para las medianas de valores de qPCR de pulmon (p>0,7379).
Puntuaciones de observaciones clrnicas despues de la exposicion: La respiracion y el comportamiento anormal no fueron graves despues de la exposicion, como se demuestra por las medianas de puntuaciones clrnicas maximas de
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0 (una puntuacion de 0 represento respiracion normal o comportamiento normal) para los cinco grupos. Ademas, no se detectaron diferencias significativas entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion para tanto la respiracion como el comportamiento anormal (p>0,0996).
Se observo tos en los tres grupos de tftulos de vacunas y el control de exposicion, pero fue mas grave en el grupo de control de exposicion. Para los tres grupos de tftulos de vacunas, cada grupo tuvo una puntuacion de tos maxima de 1, que represento tos suave o intermitente y la mediana de la puntuacion de tos maxima de 0. En cambio, el grupo de control de exposicion tuvo una puntuacion de tos maxima de 2, que represento tos aspera o grave, repetitiva, y una mediana de la puntuacion de tos maxima de 1. Los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron significativamente menos tos grave que el grupo de control de exposicion (p<0,0082). No se observo tos en el grupo de control negativo.
Los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron puntuaciones totales maximas de 1 y medianas de puntuaciones maximas de cero. En cambio, el grupo de control de exposicion tuvo una puntuacion total maxima de 4 y una mediana de la puntuacion maxima de 1. Los tres grupos de vacunas tuvieron significativamente menores puntuaciones clrnicas totales maximas que el grupo de control de exposicion (p<0,0047). De nuevo, el grupo de control negativo tuvo una puntuacion clinica total maxima de cero y una mediana de la puntuacion clinica total maxima de cero.
La frecuencia de la respiracion o el comportamiento anormal durante al menos un dfa de D29 a D38 fue baja para todos los grupos. De hecho, no se observo respiracion anormal en grupos de vacunas de tftulos bajo y medio de D29 a D38. El grupo de vacunas de tftulo alto tuvo uno de 15 (7%) lechones y el grupo de control de exposicion tuvo 3 de 14 (21%) lechones con respiracion anormal. No se observo comportamiento anormal en ningun grupo de tftulos de vacunas; mientras que 2 de 14 (14%) lechones del control de exposicion mostraron comportamiento anormal durante al menos un dfa despues de la exposicion. No se detectaron diferencias significativas entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion para la frecuencia de respiracion o comportamiento anormal durante al menos un dfa despues de la exposicion (p>0,0996). No se observo respiracion o comportamiento anormal en el grupo de control negativo.
La frecuencia de tos fue mucho mayor en el control de exposicion que en los tres grupos de tftulos de vacunas. De hecho, la frecuencia de tos durante al menos un dfa despues de la exposicion fue de 14%, 13% y 27% para los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto, respectivamente. En cambio, la frecuencia de tos durante al menos un dfa despues de la exposicion para el grupo de control de exposicion fue de 71%. Los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron significativamente menos frecuencia de tos que el grupo de control de exposicion (p<0,0268).
La frecuencia de cualquier signo clrnico despues de la exposicion, como se representa por una puntuacion clinica total > 0, fue superior en el grupo de control de exposicion que en los tres grupos de tftulos de vacunas. Similar a la frecuencia de tos, la frecuencia de cualquier signo clrnico durante al menos un dfa despues de la exposicion fue de 14%, 13% y 33% para los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto, respectivamente; mientras que 79% de los lechones en el grupo de control de exposicion tuvo al menos un signo clrnico despues de la exposicion. Los tres grupos de vacunas tuvieron significativamente menor frecuencia de cualquier signo clrnico despues de la exposicion que el grupo de control de exposicion (p<0,0253). No se observaron signos clrnicos en el grupo de control negativo durante este mismo periodo de tiempo.
Las puntuaciones medias para la respiracion o el comportamiento anormal de D29 a D38 fueron bajas para todos los grupos. De hecho, las puntuaciones de respiracion medias para los grupos de vacunas de tftulos bajo y medio fueron 0,00 (normal), la vacuna de tftulo alto tuvo una puntuacion de respiracion media de 0,01 y el control de exposicion tuvo una puntuacion de respiracion media de 0,03. La puntuacion media para el comportamiento fue 0,00 para los tres grupos de tftulos de vacunas; mientras que el control de exposicion tuvo una puntuacion de comportamiento media de 0,01. No se detectaron diferencias significativas entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion para las puntuaciones de respiracion y comportamiento medias (p>0,0996). Las puntuaciones de respiracion y comportamiento medias para el grupo de control negativo fueron 0,00.
El grupo de control de exposicion tuvo una mayor puntuacion de tos media que los tres grupos de tftulos de vacunas. De hecho, las puntuaciones de tos medias fueron 0,01, 0,01 y 0,04 para los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto, respectivamente. En cambio, la puntuacion de tos media para el grupo de control de exposicion fue 0,28. Los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron significativamente menores puntuaciones de tos medias que el grupo de control de exposicion (p<0,0077).
La puntuacion total media fue superior en el grupo de control de exposicion que en los tres grupos de tftulos de vacunas. Similar a las puntuaciones de tos medias, las puntuaciones totales medias despues de la exposicion fueron 0,01, 0,01 y 0,04 para los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto, respectivamente; mientras que la puntuacion total media para el grupo de control de exposicion fue 0,32. Los tres grupos de vacunas tuvieron significativamente menores puntuaciones totales medias que el grupo de control de exposicion (p<0,0025).
Temperaturas rectales despues de la exposicion: Las temperaturas rectales medias por grupo maximas para grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto entre D29 y D38 fueron 40,20°C (D33), 40,33°C (D35) y 40,20°C (d37),
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respectivamente. La temperatura rectal media por grupo maxima para el grupo de control de exposicion y el grupo de control negativo entre D29 y D38 fueron 40,51°C (D33) y 39,95°C (D33), respectivamente.
El grupo de vacunas de tftulo bajo tuvo significativamente menores temperaturas rectales que el grupo de control de exposicion en D29 (39,47 frente a 39,90°C), D31 (39,85 frente a 40,20°C), D35 (39,80 frente a 40,22°C) y D38 (39,86 frente a 40,32°C) (p<0,0317); mientras que la vacuna de titulo bajo tuvo una temperatura rectal significativamente mayor que el grupo de control de exposicion en D30 (40,08 frente a 39,58°C; p=0,0003). No se detectaron diferencias significativas entre el grupo de vacunas de tftulo bajo y el grupo de control de exposicion en D32-D34 y D36-D37 (p>0,0545).
El grupo de vacunas de titulo medio tuvo significativamente menores temperaturas rectales que el grupo de control de exposicion en D31 (39,62 frente a 40,20°C), D33 (40,15 frente a 40,51°C) y D38 (39,58 frente a 40,32°C) (p<0,0227). No se detectaron diferencias significativas entre el grupo de vacunas de tftulo medio y el grupo de control de exposicion en D29-D30, D32 y D34-D37 (p>0,0580).
El grupo de vacunas de tftulo alto tuvo una temperatura rectal significativamente menor que el grupo de control de exposicion en D33 (40,12 frente a 40,51°C), D35 (39,79 frente a 40,22°C) y D38 (39,55 frente a 40,32°C) (p<0,0147); mientras que el grupo de vacunas de titulo alto tuvo una temperatura rectal significativamente mayor que el grupo de control de exposicion en D32 (40,31 frente a 39,90°C; p=0,0063). No se detectaron diferencias significativas entre el grupo de vacunas de tftulo alto y el grupo de control de exposicion en D29-D31, D34 y D36-37 (p>0,0708).
Hubo menos frecuencia de fiebre en los tres grupos de tftulos de vacunas despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion. La frecuencia de fiebre fue en general baja y similar entre los grupos de tftulos de vacunas.
Aumento de peso diario promedio (ADWG): El ADWG medio por mmimos cuadrados de D0 a D28 para los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto fueron 0,4, 0,3 y 0,4 kg/dfa, respectivamente. El ADWG medio por mmimos cuadrados durante este mismo periodo de tiempo para el grupo de control de exposicion fue 0,3 kg/dfa. El grupo de vacunas de tftulo bajo tuvo un ADWG medio por mmimos cuadrados significativamente mayor que el grupo de control de exposicion de D0 a D28 (p=0,0292); mientras que no se detectaron otras diferencias significativas entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion (p>0,1262), o entre los grupos de tftulos de vacunas (p>0,1293), para el ADWG medio por mmimos cuadrados. Durante este mismo periodo de tiempo, el grupo de control negativo tuvo ADWG medio de 0,5 kg/dfa.
El ADWG medio por mmimos cuadrados de D28 a D38 para los grupos de vacunas de tftulos bajo, medio y alto fueron 0,5, 0,5 y 0,4 kg/dfa, respectivamente. El ADWG medio por mmimos cuadrados durante este mismo periodo de tiempo para el grupo de control de exposicion fue 0,3 kg/dfa. Los tres grupos de tftulos de vacunas vencieron significativamente al grupo de control de exposicion despues de la exposicion (p<0,0027). Durante este mismo periodo de tiempo, el grupo de control negativo tuvo un ADWG medio de 0,6 kg/dfa.
Evaluaciones clmicas despues de la vacunacion: En el grupo de vacunas de bajo tftulo, un lechon (1735) se anoto como delgado de D0 a D10. Ademas, un lechon que empezo en D6 se anoto como delgado durante 16 dfas, presento tos durante 2 dfas y depresion durante 9 dfas, y se sacrifico en D21 por motivos de proteccion animal debido a una mala salud. El lechon 1727 tuvo una puntuacion de lesion pulmonar total de 10,8%. Como este valor se determino antes de la exposicion, no se incluyo en el analisis de lesion pulmonar total despues de la exposicion. Ademas, se observaron areas de consolidacion rojas/purpuras en las areas craneoventrales de los pulmones, el hngado estaba palido y los rinones teman multiples areas rojas/purpuras en la pelvis renal. El patologo observo infiltracion grasa en los lobulos centrales en el hfgado, comunmente observada en casos de equilibrio energetico negativo y consiguiente lipolisis. No se observaron otras lesiones en las secciones de hugado, rinon y pulmon. El tejido de pulmon fue positivo para PRRS EU por PCR. No se detecto crecimiento para el cultivo bacteriano rutinario.
En el grupo de vacunas de tftulo medio, un lechon se excluyo del estudio en D0 antes del tratamiento debido a una mala salud y se sustituyo por otro lechon. Dos lechones presentaron tos durante uno y tres dfas, respectivamente, empezando en D12. Cuatro lechones se anotaron como delgados en D2, D3 o ambos D2 y D3.
En el grupo de vacunas de tftulo alto, un lechon (1728) presento cojera o cojera e hinchazon en una pata de D7 a D26. Empezando 18 dfas despues de la vacunacion, un lechon se anoto como delgado durante 6 dfas y presento tos durante un dfa y recubrimiento de pelo despeinado durante 4 dfas. Otro lechon se anoto como delgado en D2. Dos lechones presentaron tos durante dos dfas y un dfa, respectivamente, empezando en D9. Un lechon presento diarrea durante un dfa (D14).
En el grupo de control de exposicion, seis lechones presentaron tos periodica durante un acumulado de uno a seis dfas, empezando con un primer lechon en D7 y terminando con tres lechones en D21. Dos lechones se anotaron como delgados durante dos y 11 dfas, respectivamente, empezando en D1 para uno de estos lechones. El segundo de estos dos lechones tambien presento depresion y recubrimiento de pelo despeinado durante 4 dfas, debilidad en las patas durante un dfa y se encontro muerto en D15. En la autopsia de este lechon no se anotaron lesiones pulmonares (puntuacion de lesion pulmonar de 0%), sin alimento en el estomago y sin grasa abdominal, y se diagnostico muerte por inanicion como la causa de muerte. Como esta puntuacion de lesion pulmonar se determino
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antes de la exposicion, no se incluyo en el analisis de la lesion pulmonar despues de la exposicion.
Los resultados de las pruebas por grupo (valores de p) se resumieron para cualquier evaluacion cftnica anormal durante al menos un d^a de D1 a D26. No se detectaron diferencias significativas entre los grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion (p>0,0502); ni entre los grupos de tftulos de vacunas (p>0,3898). Ningun lechon en el grupo de control negativo presento una evaluacion clmica anormal de D-1 a D26.
Serologfa del PRRS: Se resumieron los resultados individuales de serologfa por ELISA del PRRS de lechones. Los lechones en el grupo de control negativo siguieron siendo seronegativos para PRRS durante el estudio. La seroconversion pudo observarse en los 3 grupos de tftulos de vacunas 14 dfas despues de la vacunacion; mientras que el grupo de control de exposicion siguio siendo seronegativo para PRRS hasta despues de la exposicion. Diez dfas despues de la exposicion (D38), todos los lechones en los grupos de vacunas de tftulos bajo y alto y el grupo de control de exposicion fueron seropositivos para PRRS; mientras que 14 de 15 lechones en los grupos de vacunas de tftulo medio fueron seropositivos para PRRS.
Se determinaron resultados de las pruebas de serologfa positiva por ELISA para PRRS (valores de p) para diferencias entre grupos. Los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron significativamente mayores frecuencias de lechones positivos por ELISA para PRRS que el grupo de control de exposicion en D14, D21 y D28 (p<0,0001). No se detectaron diferencias significativas entre los tres grupos de tftulos de vacunas y control de exposicion en D38 (p=1,0000 o no se realizo la prueba) ni entre los tres grupos de tftulos de vacunas en ningun momento de tiempo (p=1,0000 o no se realizo la prueba).
Viremia del PRRS despues de la vacunacion: Se determinaron resultados individuales de la viremia del PRRS despues de la vacunacion. Para fines estadfsticos, a un resultado “no detectado” se le asigno un valor de 0 log GE/ml y a un valor “positivo” se le asigno un valor de 3,0 log GE/ml. Todos los grupos fueron negativos para viremia del PRRS en D0. Se evaluaron los datos de los tftulos de viremia por grupo (qPCR) - D7 a D28 despues de la vacunacion (log GE/ml). Los lechones en los tres grupos de tftulos de vacunas alcanzaron viremia media pico en D7, despues de lo cual los niveles de los tftulos para los tres grupos cayeron lentamente antes de exposicion (SD 28). En cambio, el grupo de control de exposicion y el grupo de control negativo siguieron siendo negativos para viremia durante la fase del estudio antes de la exposicion. De los resultados de las pruebas por grupo (valores de p) para los resultados de qPCR en D7, D14, D21 y D28 se observo que los tres grupos de tftulos de vacunas tuvieron significativamente mayores medianas de valores de qPCR que el grupo de control de exposicion para D7-D28 (p<0,0159). El grupo de vacunas de tftulo medio tuvo un valor medio de qPCR significativamente mayor que el grupo de vacunas de tftulo bajo (p=0,0193); por lo demas no se detectaron diferencias para los valores medios de qPCR entre grupos de vacunas antes de la exposicion (p>0,0594).
Cuatro semanas despues de la vacunacion, la frecuencia de viremia fue baja en los tres grupos de tftulos de vacunas.
Pueden sacarse las siguientes conclusiones basandose en estos resultados del estudio:
• La ausencia de cualquier brote de bioseguridad durante el estudio y la confirmacion de la susceptibilidad de los lechones al PRRS confirmo la validacion del estudio y su idoneidad para la interpretacion
• La enfermedad clmica del PRRS sustancial fue evidente en el grupo de control de exposicion, validandose asf este modelo de exposicion como una herramienta de laboratorio adecuada para evaluar la eficacia de la vacuna contra el PRRS y mas espedficamente la MID de MLV contra el 94881 del PRRS
• Los tres niveles de dosis de MLV contra el PRRSV 94881 se asociaron a una reduccion significativa en lesiones pulmonares, ademas de a una reduccion significativa en viremia despues de la exposicion, la carga vftica en tejidos de pulmon, tos, puntuaciones de observaciones clmicas totales, fiebre y ADWG
• La MID de MLV contra el PRRSV 94881 como se determina en este estudio esta asociada al nivel de vacuna de tftulo bajo de 1 x 10277 TCID50/ml basandose en una reduccion relevante en lesiones pulmonares macroscopicas para los tres niveles de tftulos en comparacion con los controles de exposicion despues de recibir una exposicion del PRRS derivado de europeo heterologo virulento.
Otra descripcion de los resultados
Las observaciones clmicas fueron tomadas cada dfa. La RT-PCR cuantitativa se realizo usando cebadores espedficos para PRRSV europeo para muestras de sangre, hisopo oral, fecal y nasal, ademas de lavados de pulmon.
De estos estudios, los datos mostraron que los lechones mostraron salud normal, excepto algunos cerdos que fueron cojos. Despues de la muerte no hubo anomaftas en la autopsia, excepto que 1-2 animales mostraron signos de ganglios linfaticos inguinales levemente alargados. Y, lo que es mas importante, se observo que no hubo lesiones pulmonares observadas con el grupo vacunado.
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La Figura 8 muestra el porcentaje de animales viremicos en el grupo centinela con respecto al grupo vacunado con una composicion que contiene la cepa del virus PRRS atenuado depositada con el n° de acceso de ECACC 11012502. Esta figura muestra la propagacion de la cepa de vacuna de animales vacunados a centinelas. En el pico de viremia del PRRS (SD 21) como se ha detectado por RT-PCR cuantitativa, la carga vmca fue un 78,47% inferior en cerdos infectados con centinela (carga vmca media de 3,347 GE/ml) que en animales vacunados (carga vmca media de 4,014 GE/ml). En la habitacion en la que se mezclaron las cerdas sin tratamiento previo para PRRS con sus cnas vacunadas, solo 3 cerdas de 8 dieron positivo para PRRSv en sangre por RT-PCR, confirmandose asf la exposicion de la vacuna MLV del PRRS limitada e ineficaz a animales adultos sin tratamiento previo. La vacuna MLV del virus 94881 se elimino principalmente en las heces en este estudio. De hecho, en las heces, el virus podna detectarse de un dfa a 21 dfas despues de la vacunacion. Cinco dfas despues de la vacunacion, casi 30% de los animales vacunados eliminaron el virus en las heces. El virus PRRS no se detecto en secreciones nasales y en solo algunos animales por secreciones orales (2 de los 56 animales muestreados 5 dfas despues de la vacunacion).
Ejemplo 3: Materiales y metodos a modo de ejemplo para su uso en probar la eficacia de la vacuna usando Porcilis® PRRS como ejemplo.
En este estudio se uso un numero seleccionado, por ejemplo, catorce cerdas prenadas sanas de una piara negativa para el PRRSV confirmada (probada virologicamente y serologicamente). Las cerdas afrontaron un primer o segundo parto y se confirmo que estaban prenadas en el momento de la vacunacion/infeccion por exposicion en el dfa 94 de gestacion. Las cerdas se dividieron en tres grupos de tratamiento. El primer grupo se trato con una dosis comercial de Porcilis™ PRRS de 2 ml que contema al menos 1040 TCID50 por administracion intramuscular en el dfa 94 de gestacion. El grupo de control de exposicion (Grupo 2) recibio una dosis de 10472 TCID50 en 2 ml de medio de cultivo celular de la cepa aislada en campo europea patogena (pase 4) intranasalmente. El Grupo 3 se vacuno con una dosis de 2 ml que contema 1076 TCID50 i.m. de la MLV del PRRS que contema la cepa del PRRS atenuada depositada con el n° de acceso de ECACC 11012502 el 25 de enero de 2011 siete dfas antes de la inseminacion y se expuso a la cepa aislada en campo europea (pase 4) (10472 TCID50 en 2 ml de medio de cultivo celular i.n.) en el dfa 94 de gestacion.
Los animales del Grupo 1 se monitorizaron hasta el dfa 5 despues del parto. Los animales del Grupo 2 y 3 se monitorizaron hasta el dfa 28 despues del parto.
Fase del animal: Todas las cerdas se acostumbraron a las instalaciones del animal 1 semana antes de la vacunacion. El investigador observo diariamente las cerdas y los lechones para su estado de salud general. Cada animal que murio o se sacrifico se sometio a autopsia y a posteriores analisis de laboratorio.
El embarazo se confirmo con examen por ultrasonidos. Se obtuvo suero de las cerdas en los dfas de estudio 0, 7, 14 y en el parto para investigaciones por PCR y ELISA. Cualquier material que se asocio a aborto se sometio a investigaciones de laboratorio.
La patologfa macroscopica rutinaria se realizo en todos los lechones nacidos muertos. Se recogieron muestras de tejido de pulmon de todos los lobulos de los pulmones de lechones nacidos muertos y de sus madres. Las muestras para probar por PCR se almacenaron a -70°C. Se recogieron 2 ml de sangre precolostral de cada lechon en el dfa del nacimiento. Se preparo el suero y las alfcuotas se almacenaron a -70°C. El suero se uso para probar para viremia para evaluar la infeccion transplacentaria. Todos los lechones del Grupo 1 que sobrevivieron hasta el dfa 5 se sacrificaron a los 5 dfas de edad.
Parametros de rendimiento clmico y reproductivo: Los siguientes criterios son criterios a modo de ejemplo que pueden investigarse (orden de prioridad): numero de lechones nacidos vivos por camada, numero de lechones nacidos muertos por camada, numero de fetos momificados por camada y numero de lechones que sobreviven del dfa 5 o 28 de edad, respectivamente. El numero de lechones nacidos viremicos se determino usando suero precolostral. La frecuencia de muestras de sangre y tejido positivas por PCR de cerdas y/o lechones se investigo para evaluar la epidemiologfa y el curso de la infeccion.
Muestras de campo: Las muestras de campo investigadas en este estudio se tomaron de diagnosticos de PRRSV rutinarios y consistieron en sangre, suero y diversos materiales de organos, principalmente pulmones y ganglios linfaticos, de diferentes pafses europeos. Las muestras se almacenaron a -20°C durante un maximo de 3 dfas antes de la preparacion del ARN y el material residual se transfirio posteriormente a -70°C para el almacenamiento a largo plazo. El ARN y los productos de RT-PCR se almacenaron a -20°C.
Cultivo de celulas: Se cultivaron celulas MA104 (clon CL2621) en MEM (Dulbecco, Alemania) complementado con 10% de SBF y antibioticos.
Se recogieron macrofagos alveolares porcinos usando un metodo descrito por Wensvoort y col. (Wensvoort, G. y col. Vet. Quat. 1991, 13:121-130) y se modifico del siguiente modo: cada lobulo del pulmon se infundio con 50-100 ml de PBS y posteriormente se masajeo durante 3 a 5 min. Entonces, el lfquido se rescato del lobulo y se paso por un filtro de gasa. Este metodo se repitio hasta que el lfquido de lavado fue claro. El lfquido de lavado recogido se centrifugo a 500 g durante 15 min a temperatura ambiente. El sedimento se lavo en PBS y las alfcuotas de 1x107 celulas en 50% de RPMI 1640 (Biochrom), 40% de SBF y 10% de DMSO se congelaron a -196°C. Para el uso
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posterior, los PAM se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con 10% de SBF y antibioticos.
Preparacion de material de organos para el aislamiento del virus en cultivo celular: Aproximadamente 0,5 cm3 de material de tejido se transfirieron a un tubo que contema una bala de homogeneizador de acero en 1,8 ml de PBS esteril. Los tubos se agitaron durante 10 min hasta que se homogeneizo el material de organos. Los residuos de celulas se sedimentaron por centrifugacion durante 2 min a 450 g y temperatura ambiente. El sobrenadante se paso a traves de un filtro esteril de 0,45 |im de poro y se guardo a -70°C. Se usaron alfcuotas de 30 ml para inocular una monocapa de cultivo celular semiconfluente usando placas de microtitulacion de 24 pocillos.
Aislamiento del ARN: El ARN del material de organos se extrajo con el kit RNeasy Mini y de suero, plasma, sobrenadante de cultivo celular y disolucion de vacuna con el kit QTAamp Viral RNA Mini (ambos de Qiagen) segun las recomendaciones del fabricante usando aproximadamente 100 mg de material de organos y 140 ml de material de lfquido, respectivamente, para cada preparacion. El ARN se eluyo finalmente en 65 ml de tampon como recomienda el fabricante.
Purificacion en placa del virus: Las monocapas confluentes de celulas MA 104 en placas de cultivo celular de 10 cm se sembraron 48 horas antes de infectarse con el virus respectivo a diluciones de diez veces de 10-1 a 10-4. Las celulas se incubaron durante 1 hora con las diluciones de virus que luego se eliminaron, y las celulas se recubrieron con 30 ml de medio de MA 104 que contema 5% de metilcelulosa (Sigma). Las placas se recogieron despues de cinco a siete dfas y se transfirieron a monocapas de MA 104 en placas de 24 pocillos. Los virus de estas placas se recogieron a aproximadamente 50% de CPE y se sometieron a posteriores analisis.
Ensayo de inmunofluorescencia: Las celulas se fijaron a -20°C durante 15 min usando acetona:metanol (1:1) frio en hielo y despues se secaron al aire. Despues de la rehidratacion en PBS, las celulas se incubaron con el anticuerpo monoclonal espedfico del PRRSV SDOW17 (Rural Technologies Inc., EE.UU.) diluido 1:1000 en PBS durante 1 hora. Despues de 3 lavados con PBS, las celulas se incubaron con anticuerpo secundario de cabra conjugado con anti-FITC de raton (Dianova, Hamburgo, Alemania) (1:150 en PBS) durante otra hora. Despues de 3 lavados finales con PBS, las celulas se recubrieron con disolucion de glicerina:PBS (1:1) y se sometieron a microscopfa de inmunofluorescencia.
nRT-PCR de diagnostico: Puede llevarse a cabo un diagnostico de RT-nPCR para comprobar las muestras para la presencia del virus PRRSV-EU.
Una RT-nPCR de diagnostico a modo de ejemplo puede llevarse a cabo con el kit Titan One Tube (Roche Molecular Biochemicals) del siguiente modo: [5 ml de preparacion de ARN total, 1* tampon de RT-PCR, dNTPs 0,4 mM, 20 pmoles de cebadores PLS y PLR, ditiotreitol 5 mM, MgCh 1 mM, 2,5-5 U de RNasin (Promega Ltd), 1-2,5 U de mezcla de enzimas, ajustada a un volumen final de 25 ml con agua destilada tratada con DEPC]. Las condiciones de ciclado rutinarias usadas pueden ser: 45°C durante 1 hora, 94°C durante 2 min y 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 58°C durante 45 s y 68°C durante 45 s, etapa de extension final a 68°C durante 5 min. La reaccion de PCR anidada se llevo a cabo con Qiagen Taq (Qiagen AG) del siguiente modo: [1 ml de producto de RT-PCR, 1*tampon de PCR, 10 ml de disolucion Q, MgCh 3,5 mM, dNTPs 0,3 mM, 20 pmoles de cada uno de los cebadores EU-7-n-s y EU-7-n- as, 2,5 U de Taq polimerasa, ajustada a un volumen final de 50 ml con agua destilada]. Las condiciones de ciclado fueron del siguiente modo: 7 ciclos a 94°C durante 1 min, 58°C durante 1 min y 72°C durante 1 min, seguido de 30 ciclos a 94°C durante 1 min y 70°C durante 1,5 min (sin etapa de hibridacion), etapa de extension final a 70°C durante 5 min.
Secuenciacion de nucleotidos: La secuenciacion de nucleotidos puede realizarse en los productos de PCR anidada que se habfan generado con cebadores que conteman una marca M13, tanto directamente a partir de la reaccion de PCR como a partir de productos de PCR que se habfan escindido de geles de agarosa y purificado con el kit de extraccion en gel JETsorb (Genomed). La secuenciacion se hizo usando el secuenciador automatico LI-COR DNA Analyzer GENE READIR 4200® (LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., EE.UU.). Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos deducidas pueden analizarse con AlignIR®, vs1.1 (LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., EE.UU.) y el paquete de software DNASIS.RTM. 2.6 (Hitachi Software Genetic Systems Inc., San Francisco, EE.UU.).
Ejemplo 4: Determinacion de la secuencia del genoma de longitud completa del PRRSV 94881
El presente ejemplo muestra la determinacion de las secuencias de nucleotidos del genoma de longitud completa de la cepa 94881 atenuada y su cepa parental 94881, pase 5. Estas secuencias no mostraron ninguna posicion de nucleotidos confusa que indicara la presencia de un contenido vmco homogeneo. La comparacion del virus de siembra maestro 94881 con el virus de Lelystad (LV) de la cepa del virus de referencia europea revelo homologfas de nucleotidos que oscilaban de 85,40 a 95,09 por ciento en los 8 genes vmcos diferentes e identidades de aminoacidos de 86,39 a 97,27 por ciento entre ambas cepas de virus. Pudieron identificarse dos deleciones en el ORF 1a del MSV 94881 en comparacion con LV. La comparacion entre el virus de siembra maestro 94881 y su cepa parental, pase 5, mostro 26 intercambios de nucleotidos entre ambos, produciendo un numero total de 14 intercambios de aminoacidos.
Para la determinacion de secuencias del genoma de longitud completa del virus de siembra maestro 94881 se realizo un numero total de 1 transcripcion inversa, 17 PCR externas y 58 PCR internas, resultando 40 productos de
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PCR que se usaron para la secuenciacion. En el caso de 94881, pase 5, se realizaron 1 transcripcion inversa, 17 PCR externas y 67 PCR internas, resultando 40 productos de PCR, por tanto, se uso para la secuenciacion.
Los analisis del alineamiento de secuencias de solapamiento produjeron una secuencia de longitud completa de 14843 nucleotidos para ambas cepas aisladas de virus que comprendfan los marcos de lectura abiertos completes (ORF) 1a a 7, cada una. Adicionalmente pudieron determinarse los 177 nucleotidos de la region sin traducir en 5' (5'- NTR) y 43 nucleotidos de la region sin traducir en 3' (3'-NTR), cada una. En comparacion con la cepa aislada del virus de referencia del PRRSV europea Lelystad (LV) (n° de acceso de GenBank M96262), 44 nucleotidos de 5'-NTR y 83 nucleotidos de 3'-NTR no pudieron determinarse ya que aquellas regiones se usaron para cebar las regiones de hibridacion.
Las reacciones de secuenciacion produjeron para ambas cepas de virus una clara secuencia de nucleotidos sin ninguna oscilacion o cualquier otra indicacion de una secuencia mixta. Despues de la traduccion en aminoacidos, las secuencias de aminoacidos claras sin ningun aminoacido cuestionable estuvieron disponibles para la comparacion de secuencias del MSV 94881 con el LV y con la cepa parental 94881, pase 5. Se realizaron los alineamientos y las comparaciones de las secuencias de nucleotidos entre el MSV 94881 y el virus de Lelystad y se mostro que habfa diferencias sustanciales al nivel de nucleotidos y aminoacidos. Tambien se realizaron alineamientos entre MSV 94881 y su cepa parental, pase 5.
Las comparaciones de secuencias con LV produjeron homologfas de nucleotidos de 85,40 a 95,09 por ciento en los 8 genes vmcos diferentes e identidades de aminoacidos de 86,39 a 97,27 por ciento entre ambas cepas de virus. Pueden identificarse dos deleciones en el ORF 1a de MSV 94881 en comparacion con LV. Una delecion de 138 nucleotidos se localiza en la posicion 2154 a 2292 del LV y hace que falten 46 aminoacidos. En la posicion 2686 a 2688 otro triplete esta delecionado, haciendo que falte el aminoacido fenilalanina. Una disposicion de todas las homologfas de nucleotidos e identidades de aminoacido entre LV y ambas cepas de 94881 se muestra en la Tabla 4.1.
Tabla 4.1: Disposicion de comparaciones de secuencias de nucleotidos y de aminoacidos del virus de siembra maestro 94881 con el virus de referencia europeo el virus de Lelystad
ORF
Longitud del gen virico/protema vmca nn/aa N° de desviaciones de nucleotidos con respecto al virus de Lelystad Homologia genetica con respecto al virus de Lelystad en porcentaje N° de desviaciones de aminoacidos con respecto al virus de Lelystad Identidad de aminoacidos con respecto al virus de Lelystad en
5'-NTR
177*/ --- 9 94,92 — —
1a
7050** / 2349 1050 85,40 326 86,39
1b
4392/1463 346 92,12 40 97,27
2
750 / 249 67 91,07 23 90,76
3
798 / 265 72 90,98 28 89,43
4
552/ 183 52 90,58 23 87,43
5
606 / 201 58 90,43 23 88,56
6
522/ 173 26 95,02 5 97,11
7
387/ 128 19 95,09 9 92,97
3'-NTR
44***/_ 2 95,45 --- ---
NTR: region sin traducir
* = Solo se compararon 177 nucleotidos entre el virus de Lelystad y MSV 94881. Los 44 nucleotidos restantes, localizados en la direccion 5', no se habfan determinado.
** = La cepa aislada del MSV 94881 muestra dos deleciones en ORF 1a, una con 138 nucleotidos y una con 3 nucleotidos, respectivamente. Las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos completas del virus de referencia LV se usaron para la homologfa y los calculos de identidad, las deleciones se evaluan como desviaciones. La longitud del gen vmco correspondiente de LV es 7191 nucleotidos y la poliprotema correspondiente de 2396 aminoacidos, los calculos de homologfa genetica y la identidad de aminoacidos se refieren a los numeros de 7191 nucleotidos y 2396 aminoacidos, respectivamente.
*** = Solo se compararon 44 nucleotidos entre el virus de Lelystad y el MSV 94881. Los 83 nucleotidos restantes, localizados en la direccion 3', no se habfan determinado.
La comparacion de secuencias de las secuencias de nucleotidos de longitud completa del 94881 virus de siembra maestro y la cepa parental 94881, pase 5, revelaron un numero total de 26 intercambios de nucleotidos entre ambos. Los intercambios de nucleotidos se distribuyeron del siguiente modo: 15 en ORF 1a, 4 en ORF 1b, 2 en ORF 2, ninguno en ORF 3, 1 en ORF 4, 3 en ORF 5, 1 en ORF 6 y ninguno en ORF 7. Estos intercambios de nucleotidos produjeron un numero total de 14 intercambios de aminoacidos que se distribuyeron del siguiente modo: 8 en la
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poliprotema 1a, 1 en la poliprotema 1b, 1 en la glicoprotema 2, ninguno en la glicoprotema 3, 1 en la glicoprotema 4, 2 en la glicoprotema 5 y 1 en la protema de la matriz. Ambas cepas mostraron las mismas deleciones en comparacion con el virus de Lelystad en ORF 1a. Una disposicion de todos los intercambios de nucleotidos e intercambios de aminoacidos resultantes que incluyen las posiciones en los genes vmcos y las protemas correspondientes se muestra en detalle en la Tabla 4.2.
Ejemplo 5 - Cultivo del virus depositado y MSV
Como se ha observado anteriormente, 94881 parental (pase bajo) se deposito en la Coleccion europea de cultivos celulares (ECACC) con el numero de acceso ECACC 11012501, el virus de siembra maestro 94881 (MSV) se deposito en la Coleccion europea de cultivos celulares (ECACC) con el numero de acceso ECACC 11012502. Las condiciones de crecimiento y cultivo para el virus parental y el MSV se proporcionan en el presente ejemplo.
94881 parental: Es un virus de un genotipo que es PRRSV tipo 1, ya que tal es un PRRSV de genotipo europeo. El virus tiene un huesped porcino. El virus parental depositado en 11012501 se deposito a un titulo de 5,81 log10 TCID50/ml. Las celulas huesped para la propagacion de virus son celulas MA 104. Estas celulas se cultivan en medio esencial mmimo (MEM) con 3,7 g/l de bicarbonato sodico que contiene 6% de suero bovino fetal irradiado a 37 ± 1°C. Las celulas se siembran en placa en matraces T (75 cm2) con una densidad de siembra de 2 x 104 a 2 x 105 celulas/cm2 y se cultivan durante 3 a 7 dfas hasta 100% de confluencia antes del pase. Para el crecimiento del virus, el virus se anade a las celulas a una MOI de 0,001-0,01 en matraces T. Las celulas infectadas estan a una confluencia de aproximadamente 80-100% normalmente 1-3 dfas despues de la siembra de las celulas. Las celulas infectadas se cultivan a 37 ± 1°C durante 3-10 dfas despues de la infeccion y luego se recoge el virus. La cosecha se realiza cuando las celulas de la monocapa presentan aproximadamente 80-100% de efecto citopatico (CPE) 3-10 dfas despues de la infeccion. El sobrenadante de cultivos de tejido de MA104 infectado (medio gastado + PRRSV de un cultivo con 80-100% de CPE) se recoge y contiene el virus que se ha propagado. Este sobrenadante puede almacenarse a -70°C/-80°C durante varios meses hasta su uso. El virus se evalua para TCID50 con el calculo de Spearman y Kaerber para determinar log10 TCID50/ml de muestra.
Virus de siembra maestro (MSV) 94881 para vacuna (pase alto): Es un virus de un genotipo que es PRRSV tipo 1, ya que tal es un PRRSV de genotipo europeo. El virus tiene un huesped porcino. El MSV depositado en 11012502 se deposito a un titulo de 6,43 log10 TCID50/ml. Las celulas huesped usadas para la propagacion del MSV son celulas MA 104. Estas celulas se cultivan en medio esencial mmimo (MEM) con 1,4 g/l de bicarbonato sodico y que contiene 10% de suero bovino fetal irradiado a 36 ± 2°C. Las celulas se siembran en placa en matraces T (75-150 cm2) o botellas rotatorias de 850 cm2 con una densidad de siembra de 1 x 104 a 1 x 105 celulas / cm2 y se cultivan durante 3 a 7 dfas hasta 100% de confluencia antes del pase. Para el crecimiento del virus, el virus se anade a las celulas a una MOI de 0,001-0,01 en matraces T o botellas rotatorias. Las celulas infectadas estan a una confluencia de aproximadamente 80-100% normalmente 1-3 dfas despues de la siembra de las celulas. Las celulas infectadas se cultivan a 36 ± 2°C durante 3-14 dfas despues de la infeccion y luego se recoge el virus. La cosecha se realiza cuando las celulas de la monocapa presentan aproximadamente 80-100% de efecto citopatico (CPE) 3-14 dfas despues de la infeccion. El sobrenadante de cultivos de tejido de MA104 infectado (medio gastado + PRRS de un cultivo con 80-100% de CPE) se recoge y contiene el virus que se ha propagado. Este sobrenadante puede almacenarse a 2-8°C durante 5-10 dfas, -70°C durante varios meses hasta su uso. El MSV se evalua para TCID50 con el calculo de Reed y Muench para determinar log10 TCID50/ml de muestra.
Tabla 4.2: Disposicion de comparaciones de secuencias de nucleotidos y de aminoacidos del virus de siembra maestro 94881 con respecto a la cepa parental 94881
ORF
N° de nucleotidos que se desvian Posicion en el gen vmco Intercambio (nn) de la cepa parental a MSV Sinonimo / no sinonimo N° de aminoacidos que se desvian Posicion en la protema vmica Intercambio (aa) de la cepa parental a MSV
1a
15 309 C a T sinonimo 8 — ---
753 G a T no sinonimo 251 E a D
1474 G a A no sinonimo 492 V a I
1789 G a A no sinonimo 597 V a I
2094 C a T sinonimo --- —
2987 T a C no sinonimo 996 L a S
3034 A a G no sinonimo 1012 T a A
3065 A a G no sinonimo 1022 E a G
3736 A a G no sinonimo 1246 T a A
3966 C a T sinonimo --- —
4101 T a C sinonimo --- —
5
10
15
20
25
30
35
5803 C a T no sinonimo 1935 L a F
6354 T a G sinonimo --- —
6519 C a T sinonimo --- —
6588 T a C sinonimo --- —
1b
4 591 T a C sinonimo 1 --- —
1833 C a T sinonimo --- —
1932 C a T sinonimo --- —
3682 G a A no sinonimo 1228 V a I
2
2
13 C a T no sinonimo 1 5 H toY
195 C a T sinonimo --- —
3
0 --- — — 0 --- —
4
1 529 T a C no sinonimo 1 177 F a L
5
3 109 A a G no sinonimo 2 37 N a D
364 C a T no sinonimo 122 L a F
570 C a T sinonimo --- —
6
1 214 C a T no sinonimo 1 72 L a F
7
0 --- — — 0 --- —
Ejemplo 6: Estudio de MID en cerdas jovenes de la MLV contra el 94881 del PRRS Sumario
El objetivo de este estudio de exposicion a vacunacion fue evaluar la dosis de inmunizacion mmima (MID) de la cepa aislada 94881 derivada de europea de la vacuna del smdrome reproductor y respiratorio porcino, virus vivo modificado, codigo 19T1.U_ (MLV contra el 94881 del PRRS) en cerdas jovenes. Se administraron dos niveles de tttulos diferentes a cerdas jovenes seronegativas para PRRS aproximadamente 28 dfas antes del celo (Dfa 0; D0), las cerdas jovenes se expusieron a una cepa aislada europea heterologa del PRRSv a aproximadamente 90 dfas de gestacion (D118) y las cerdas jovenes se evaluaron para el numero total de lechones nacidos vivos o porcentajes de lechones nacidos vivos y lechones destetados a los 20 dfas de edad para determinar la MID. En el tiempo de exposicion en el Dfa 118 (D118), el grupo de control de exposicion consistio en 8 cerdas jovenes prenadas (Grupo 1, placebo), el grupo de tttulo bajo consistio en 8 cerdas jovenes prenadas (Grupo 2, 1 x 10243 TCID50/dosis), el grupo de tttulo alto consistio en 8 cerdas jovenes prenadas (Grupo 3, 1 x 10390 TCID50/dosis) y el grupo de control negativo consistio en 5 cerdas jovenes prenadas (Grupo 4, placebo, no expuesto).
Tanto los grupos de tttulo bajo como de tttulo alto se asociaron a mayores porcentajes de lechones vivos por camada en el parto (P<0,0455) y mayores porcentajes y numeros de lechones vivos por camada en el destetamiento (P<0,0203) en comparacion con el grupo de control de exposicion.
Con respecto a los parametros de eficacia de apoyo, el grupo de dosis alta se asocio a un mayor porcentaje y numero de lechones sanos por cerda joven en el parto (P<0,0211), un menor porcentaje y numero de fetos debiles y momificados (P<0,0090), un menor porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR y menor carga vmca en cerdas jovenes despues de la exposicion en D125, DOF 0 y DOF+13 (P<0,0155), un menor porcentaje de lechones por cerda joven positiva por qPCR y menor carga vmca en lechones en DOF 0 (P<0,0030), un menor porcentaje de lechones por cerda joven con enfermedad clinica (P<0,0001) y mayores pesos corporales de los lechones en DOF+20 y ADWG (P<0,0013) en comparacion con el grupo de control de exposicion.
El grupo de dosis baja se asocio a un mayor porcentaje de lechones sanos por cerda joven en el parto (P=0,0138), un menor porcentaje y numero de fetos momificados (P<0,0190), un menor porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR y menor carga vmca en cerdas jovenes despues de la exposicion en D125, D132, DOF 0 y DOF+13 (P<0,0290), un menor porcentaje de lechones por cerda joven positiva por qPCR en DOF 0 (P=0,0381), un menor porcentaje de lechones por cerda joven con enfermedad clinica (P<0,0001) y mayor peso corporal de los lechones en DOF+20 y ADWG (P<0,0028) en comparacion con el grupo de control de exposicion.
En conclusion, el objetivo del estudio se cumplio y los datos de este estudio establecen la MID de MLV contra el PRRSV 94881 en cerdas jovenes como 1 x 10243 TCID50/2 ml. Ademas, este estudio establece la duracion de la inmunidad (DOI) en cerdas jovenes en aproximadamente 4 meses.
Objetivo(s)/fin del estudio
El objetivo de este estudio de exposicion a vacunacion era evaluar la dosis de inmunizacion minima (MID) de la cepa
aislada 94881 derivada de europea de la vacuna del smdrome reproductor y respiratorio porcino, virus vivo modificado, codigo 19T1.U_ (MLV contra el 94881 del PRRS), a dos niveles de tttulos diferentes (Grupo 2, tttulo bajo; Grupo 3, tttulo alto), administrada a cerdas jovenes seronegativas para PRRS antes del celo para proporcionar mayores porcentajes de lechones nacidos vivos y lechones destetados a los 21 dfas de edad, tras la exposicion de 5 cerdas jovenes a una cepa aislada europea heterologa del virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSv) a aproximadamente 90 dfas de gestacion. El criterio primario para satisfacer este objetivo fue que uno o ambos grupos de vacunas debfan demostrar porcentaje o numero relevantemente mayor de lechones nacidos vivos y lechones destetados a los 20 dfas de edad (DOF +20) en comparacion con el grupo de control de exposicion (Grupo 1).
10 Otros parametros analizados entre los grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion incluyeron evaluaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la vacunacion, serologfa del PRRS de cerdas jovenes, viremia de cerdas jovenes, observaciones clmicas de cerdas jovenes, viremia de lechones, lechones totales por camada, lechones sanos vivos por camada, lechones vivos debiles por camada, momias por camada, lechones nacidos muertos por camada, lechones aplastados/mortalidad por camada, observaciones clmicas de lechones y aumento
15 de peso diario promedio (ADWG) de lechones. Estos parametros se analizaron como parametros de apoyo y no sirvieron de parametros primarios para satisfacer el objetivo del estudio.
Programa de acontecimientos
Tabla 6.1 Programa de acontecimientos de cerdas jovenes
Dia(s) de estudio
Fechas Acontecimiento clave del estudio
-2 o -1
20-Jul-2010 a 21 -Jul-2010 Examen de salud
-1 a 21
21-Jul- 2010 a 12-Ago-2010 Grupos 1-4: Evaluaciones clmicas diarias
0
22-Jul-2010 Grupos 1-4: Recogida de sangre; vacunacion de grupos 1 y 4 con producto de control (CP); vacunacion del grupo 2 con producto veterinario en investigacion (IVP) n° 1 (grupo de vacunas de tttulo bajo); y vacunacion del grupo 3 con IVP n° 2 (grupo de vacunas de tttulo alto)
8 a 21
30-Jul-2010 a 12-Ago-2010 Grupos 1-4: Tratamiento de cerdas jovenes una vez al dfa con Matrix™ para sincronizar los ciclos de celo
7, 14, 21, 56 y 84
29-Jul-2010, 05-Ago-2010, 12-Ago-2010, 16-Sep-2010, 14-Oct-2010 Grupos 1-4: Recogida de sangre
22 a 113
13-Ago-2010 a 12-Nov-2010 Grupos 1-4: Evaluaciones clmicas al menos tres veces a la semana
26 a 32
17-Ago-2010 a 23-Ago-2010 Grupos 1-4: Observacion para la deteccion de calor y cerdas jovenes en celo por inseminacion artificial (AI)
84
14-Oct-2010 Grupos 1-4: Embarazo comprobado por ultrasonidos
116 a 20 dfas despues del parto
15-Nov-2010 a 05-Ene-2011 Grupos 1-4: Observaciones clmicas, registro de abortos, lechones nacidos muertos, momias, lechones vivos, lechones nacidos debiles
118 (aprox. 90 dfas de gestacion)
17-Nov-2010 Grupos 1-4: Recogida de sangre Grupos 1-3: Exposicion a la cepa aislada del PRRSv 190136
125, 132, parto/ aborto (DOF*), DOF +7, DOF +13
24-Nov-2010, 01-Dic-2010, 03-Dic-2010 a 16-Dic-2010, 10-Dic-2010 a 23-Dic-2010, 16-Dic-2010 a 29-Dic-2010 Grupos 1-4: Recogida de sangre
DOF+20
23-Dic-2010 a 05-Ene-2011 Grupos 1-4: Recogida de sangre de las cerdas jovenes restantes; sacrificio de las cerdas jovenes restantes; eliminacion
DOF+20 o despues
25-Dic-2010 a 05-Ene-2011 Grupos 1-4: Sacrificio de las cerdas jovenes restantes; eliminacion
*DOF = Dfa del parto
Dia(s) de estudio
Fechas Acontecimiento clave del estudio
DOF
03-Dic-2010 a 16-Dic- 2010 Todos los lechones muertos: Se pesan; se les hace la autopsia; recogida de sangre/fluido corporal si es posible; recogida de muestras de pulmon Todos los lechones vivos: Se pesan; recogida de sangre (pre- colostral o peri-natal (en el plazo de 12 horas desde el nacimiento))
DOF +1 a DOF +20
04-Dic-2010 a 05-Ene- 2011 Todos los lechones vivos: Observaciones clmicas Lechones muertos: Se pesan; se les hace la autopsia; recogida de sangre/fluido corporal si es posible; recogida de muestras de pulmon
DOF +7
10-Dic-2010 a 23-Dic- 2010 Todos los lechones vivos: Recogida de sangre
DOF +13
16-Dic-2010 a 29-Dic- 2010 Todos los lechones vivos: Recogida de sangre
DOF +20
23-Dic-2010 a 05-Ene- 2011 Todos los lechones vivos: Se pesan; recogida de sangre;
DOF+20 o despues
25-Dic-2010 a 05-Ene- 2011 Lechones del Grupo 1-3: Sacrificio de los lechones restantes, eliminacion; Lechones del Grupo 4: Se asignan a otro proyecto de BIVI
Diseno del estudio Tabla 6.3 Diseno del estudio
Grupo
Numero de cerdas jovenes en D0 Tratamiento en D0 (aproximadamente 28 dias antes del celo) Numero de cerdas jovenes en D118 Exposicion en D118 a 6,0 ml (2 ml/orificio nasal; 2 ml IM) de 1 x 105 6 * * * 10,30 TCID50 de PRRSv 190136
1 (grupo de control de exposicion)
28 2,0 ml IM de producto de control (placebo del mismo producto sin MLV contra el 94881 del PRRS) 16 Si
2 (grupo de tttulo bajo)
28 2,0 ml IM de IVP n° 1 (1 x 10243 TCID50 de MLV contra el 94881 del PRRS) 16 Si
3 (grupo de tttulo alto)
28 2,0 ml IM de IVP n° 2 (1 x 10390 TCID50 de MLV contra el 94881 del PRRS) 16 Si
4 (grupo de control negativo)
10 2,0 ml IM de producto de control 5 No
5
Criterios de cegado
El investigador del estudio y los representantes fueron cegados con respecto a las cerdas jovenes asignadas a los
Grupos 1-4. Para mantener el cegado del investigador del estudio y los representantes, una persona que no recogfa
los datos administro los IVP y el CP a las cerdas jovenes asignadas en D0. El personal del laboratorio se cego al
10 tratamiento de recibfa cada cerda joven mientras que realizaban sus tareas respectivas.
Materiales
Producto veterinario en investigacion (ivp) y producto de control (cp)
Nombre del producto generico:
Smdrome reproductor y respiratorio porcino, virus vivo modificado
Cepa aislada:
Cepa aislada 94881
Formulacion:
El protocolo de lotes del fabricante (MBP) para la vacuna MLV contra el 94881 del PRRS, lote 390-005 (torta), se presenta en el Apendice 1. El MBP para el diluyente con adyuvante de carbopol esteril, lote 808-002 (diluyente), se presenta en la Seccion 15.1, Apendice 1. D0 justo antes de la vacunacion, BIVI-Ames reconstituyo/diluyo la vacuna MLV contra el 94881 del PRRS, lote 390-005, con diluyente con adyuvante de carbopol esteril, lote 808-002, para formular los dos IVP. IVP n° 1 se formulo a un nivel de titulo elegido como diana de aproximadamente 1 x 1030 TCID50/2 ml y IVP n° 2 se formulo a un nivel de tttulo elegido como diana de aproximadamente 1 x 1045 TCID50/2 ml. Un volumen adecuado de cada IVP se formulo para la vacunacion y pruebas.
Lote de IVP / n° de serie:
IVP n° 1: N270-142 IVP n° 2: N270-143
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. 2621 North Belt Highway St. Joseph, MO 64506
Fecha de caducidad:
Se asigno una fecha de caducidad del 22 de julio de 2010 a cada IVP solo para fines de estudio.
Requisitos de almacenamiento:
IVP rehidratado/diluido se almaceno a 2-8°C o sobre hielo
Pruebas:
La MLV contra el 94881 del PRRS, serie 390-005, y el diluyente con adyuvante de carbopol esteril, lote 808-002, fueron probados por BIVI-QC. Al principio y al final del metodo de vacunacion se contacto con BIVI-Ames. BIVI-Ames probo antes y despues de la vacunacion alfcuotas de cada IVP para el tttulo de virus segun el Metodo de tttulos de PRRSv (Seccion 15.1).
Resultados de las pruebas:
Los resultados de las pruebas para la MLV contra el 94881 del PRRS, serie 390-005, y para el diluyente con adyuvante de carbopol esteril, lote 808-002, fueron satisfactorios. IVP n° 1 tuvo un tttulo promedio de 1 x 10243 TCID50/2 ml y IVP n° 2 tuvo un tttulo promedio de 1 x 103 90 TCID50/2 ml
Transferencia de IVP:
Dos viales que conteman 35 ml de cada IVP se transfirieron al sitio de estudio en D0 justo antes de la vacunacion.
Retencion de IVP:
Una muestra de retencion de cada IVP se guarda actualmente a -70 ± 10°C en BIVI-Ames hasta que se haya firmado el informe final.
Tabla 6.6 Producto de control (CP)
Nombre del producto
Formulacion:
La produccion de BIVI produjo producto de placebo liofilizado que contema material inerte que consistfa en la serie de vacuna sin MLV contra el PRRSV 94881 (lote N240-191-062409) En D0, BIVI-Ames reconstituyo el lote N240-191-062409 con diluyente con adyuvante de carbopol esteril, lote 808-002, para formular el CP, lote n° 270-141.
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. 2621 North Belt Highway St. Joseph, MO 64506, EE.UU.
Numero de lote:
N270-141
Fecha de caducidad:
Se asigno una fecha de caducidad del 22 de julio de 2010 al CP solo para fines de estudio.
Condiciones de almacenamiento:
Vacuna liofilizada: 2-8°C CP rehidratado: 2-8°C o sobre hielo
Pruebas:
CP se probo por BIVI-QC para la esterilidad segun EP segun Resumen especial n° 96
Resultados de las pruebas:
Se determino que CP era esteril
Transferencia de CP:
Dos viales que conteman 50 ml cada uno de CP se transfirieron al sitio de estudio en D0 justo antes de la vacunacion.
Retencion de CP:
CP solo se formulo para el estudio y no se retuvo.
Material de exposicion Tabla 6.7 Material de exposicion
Nombre/numero de la cepa aislada
Virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino
Localizacion y fecha del aislamiento, incluidos smtomas clmicos
Cepa aislada 190136, pase 2. La cepa aislada n° 190136 se obtuvo del tejido de pulmon de un lechon recien nacido de una granja que mostraba signos reproductivos tfpicos de PRRS (abortos en cerdas jovenes y debilidad en lechones recien nacidos) durante un brote en baja Sajonia, Alemania, en abril de 2004. Los veterinarios enviaron las muestras a BioScreen (la muestra llego el 21 de abril de 2004). La cepa aislada n° 90136 podna propagarse directamente en celulas AK-MA104.
Formulacion:
El virus de exposicion se descongelo y se diluyo con MEM (medio esencial mmimo) a un titulo elegido como diana de aproximadamente 1 x 106 TCID50/3 ml en D118. Se preparo un volumen adecuado de material de exposicion. Se tomaron dos alfcuotas del material de exposicion.
Numero de lote:
N289-034
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. - EE.UU.
Condiciones de almacenamiento
Se almaceno material de exposicion a granel a -70 ± 10°C. Una vez preparado, el material de exposicion diluido se mantuvo sobre hielo hasta que se administro.
Pruebas:
Al principio y al final del metodo de exposicion se contacto con BIVI-Ames. El personal del laboratorio de BIVI-Ames probo antes y despues de la exposicion alfcuotas para el tttulo de virus segun el Metodo de tttulos de PRRSv
Resultados de las pruebas:
El material de exposicion tuvo un tftulo medio de 1 x 10630 TCID50/6 ml de dosis
Transferencia del material de exposicion:
Tres viales que conteman 101 ml cada uno de material de exposicion se transfirieron al sitio de estudio en D118 justo antes de la administracion.
Via de administracion
2,0 ml/orificio nasal y 2,0 ml IM en el cuello izquierdo (administrado a todas las cerdas jovenes en los Grupos 1,2 y 3 en D118).
Retencion del material de exposicion:
El material de exposicion solo se formulo para este estudio y no se retuvo.
5 Tratamientos adicionales
Matrix™ (6,8 ml; Alternogest; Intervet/Schering Plough Animal Health) se administro a cada pienso para cerdas jovenes de D8 a D21 para sincronizar los ciclos de celo.
Se administro oxitocina (VetTek) en el parto para ayudar a las cerdas jovenes con el parto, pero no para iniciar el parto. En el parto, todos los lechones vivos recibieron 1,0 ml de inyeccion de hierro (Phoenix o Durvet), IM, en el 10 jamon derecho para prevenir anemia por deficiencia de hierro poco despues del nacimiento. Adicionalmente, todos los lechones vivos recibieron gentamicina (SparHawk Laboratories Inc) como un frotamiento preventivo poco despues del nacimiento. Todos los tratamientos se registraron en el cuaderno de recogida de datos del tratamiento biologico y farmaceutico.
Tratamientos
15 Justificacion de la dosificacion
Cada IVP se administro como una dosis de 2,0 ml a cerdas jovenes asignadas para evaluar la MID de MLV contra el 94881 del PRRS. Una dosis de 2,0 ml del CP se administro a cerdas jovenes asignadas a los Grupos 1 y 4.
Pauta de dosificacion
En D0, una persona que no recogfa los datos del estudio administro cada IVP o CP a cada cerda joven respectiva IM
en la region derecha del cuello usando una jeringuilla Luer-lock de 3,0 ml esteril y una aguja de 18g x 1 pulgada (2,54 cm) esteril. La pauta de dosificacion se muestra a continuacion en la Tabla 6.8.
Tabla 6.8 Pauta de dosificacion
Grupo
Numero Tratamiento DosisMa Dia de estudio
1
28 CP 2,0 ml IM D0
2
28 IVP n° 1 (dosis de titulo bajo) 2,0 ml IM D0
3
28 IVP n° 2 (dosis de tttulo alto) 2,0 ml IM D0
4
10 CP 2,0 ml IM D0
5 Metodos y precauciones para el personal del estudio
El personal que administra los IVP, el CP y el material de exposicion se adhirio a precauciones de seguridad y vistio equipo de proteccion personal como se explica resumidamente para el sitio del estudio espedfico.
Informacion sobre los animales
Detalles de los animales del estudio
10 Tabla 6.9 Informacion sobre los animales
Fuente:
Wilson Prairie View Farms N5627 Highway DD Burlington, WI 53105
Numero de cerdas jovenes:
94
Fecha de llegada:
Las cerdas jovenes llegaron a las instalaciones de Veterinary Resources, Inc. en dos envfos el 15 de julio de 2010 (D-7) y el 20 de junio de 2011 (D-2).
Identificacion:
Oreja etiquetada individualmente con un unico numero
Especie:
Porcina
Raza:
Cruzada comercial
Sexo:
Hembras
Intervalo de edad:
Aproximadamente 8 meses de edad en D0
Propietario de los animales de prueba:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.
Estado fisiologico:
Todas las cerdas jovenes fueron seronegativas por ELISA para PRRS en D0. Las cerdas jovenes seleccionadas para la asignacion al estudio fueron observadas por el investigador del estudio en D-2 o D-1 y determino que estaban en buen estado de salud y nutricional.
Resultados del embarazo:
Las cerdas jovenes se comprobaron para el embarazo en D84.
Asignaciones de cerdas jovenes a grupos en D0
Grupo 1 (n=28): 1, 3, 5, 6, 8, 11, 15, 18, 19, 34, 35, 39, 40, 52, 54, 68, 79, 82, 88, 90, 95, 96, 98, 101, 102, 107, 109 y 110 Grupo 2 (n=28): 12, 26, 31, 32, 41, 47, 49, 56, 58, 59, 60, 64, 67, 69, 70, 72, 73, 75, 76, 77, 78, 85, 89, 93, 94, 100, 103 y 104
Grupo 3 (n=28): 2, 7, 14, 22, 23, 25, 27, 28, 30, 33, 36, 42, 46, 48, 51, 53, 57, 61, 62, 65, 66, 80, 84, 86, 91, 92, 105 y 106
Grupo 4 (n=10): 4, 10, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 29 y 108
N° de cerdas jovenes a grupos restantes en el estudio en D118
Grupo 1 (n=16): 1, 6, 11, 18, 19, 40, 54, 68, 79, 82, 88, 95, 96, 98, 102 y 107 Grupo 2 (n=16): 12, 26, 31, 32, 41, 47, 49, 58, 64, 67, 72, 85, 89, 93, 100 y 104
Grupo 3 (n=16): 7, 14, 23, 27, 33, 36, 46, 48, 57, 61, 62, 65, 66, 84, 92 y 106
Grupo 4 (n=5): 4, 13, 16, 17 y 108
Criterios de inclusion/exclusion
Todas las cerdas jovenes enroladas en este estudio fueron negativas por ELISA para PRRS, sin reproducir y estuvieron sanas en el momento de la vacunacion como se ha determinado por observacion.
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Descarte despues de la inclusion de cerdas jovenes
Cinco (5) cerdas jovenes del Grupo 1 (n° 5, 15, 34, 35 y 52), dos (2) cerdas jovenes del Grupo 2 (n° 77 y 94), tres (3) cerdas jovenes del Grupo 3 (n° 2, 25 y 30) y una (1) cerda joven del Grupo 4 (n° 20) no mostraron celo y posteriormente no se reprodujeron. Estas cerdas jovenes se sacaron del estudio en D47.
Dos (2) cerdas jovenes del Grupo 1 (n° 109 y 110), nueve (9) cerdas jovenes del Grupo 2 (n° 56, 59, 60, 69, 73, 75, 76, 78 y 103), cuatro (4) cerdas jovenes del Grupo 3 (n° 22, 28, 51 y 53) y una (1) cerda joven del Grupo 4 (n° 21) se sacaron del estudio en D89 debido a cojera, no estaban prenadas o reproduccion tardfa.
El protocolo del estudio establecio que si > 16 cerdas jovenes prenadas por grupo para los Grupos 1-3 estaban todavfa en el estudio antes de la exposicion, se seleccionanan aleatoriamente cerdas jovenes para ser sacadas del estudio; quedando asf 16 cerdas jovenes prenadas por grupo para los Grupos 1-3. Cinco (5) cerdas jovenes del Grupo 1 (n° 3, 8, 39, 90 y 101), una (1) cerda joven del Grupo 2 (n° 70) y cinco (5) cerdas jovenes del Grupo 3 (n° 42, 80, 86, 91 y 105) se sacaron del estudio en D104 basandose en las aleatorizaciones por el estadfstico o seleccion por personal que no es del estudio, reduciendose el tamano del grupo a 16 cerdas jovenes para los Grupos 1-3.
Debido a limitaciones de espacio, el investigador del estudio solicito que el tamano del Grupo 4 se redujera de ocho (8) a cinco (5). El estadfstico selecciono aleatoriamente tres (3) cerdas jovenes (n° 10, 24 y 29) para ser sacadas del estudio, que se sacaron en D109.
Manipulacion y alojamiento de los animales
Alojamiento de los animales
Cerdas jovenes con tttulo bajo de IVP se alojaron en las Habitaciones 1 y 2, y cerdas jovenes con tttulo alto de IVP se alojaron en las Habitaciones 3 y 4, en el Edificio CB en VRI-Cambridge a partir de D-1 para completar el estudio. Las cerdas jovenes asignadas a los grupos de control de exposicion y de control negativo se alojaron en una unica habitacion en VRI-Risdal de D-1 a D85. En D85, el resto de las cerdas jovenes en los grupos de control de exposicion y de control negativo se movieron a VRI-Cambridge. Dieciseis (16) cerdas jovenes de control de exposicion se alojaron en el Edificio CB, Habitaciones 5-8, y ocho (8) cerdas jovenes de control negativo se alojaron en el Edificio CA, Habitacion 12, para el resto del estudio. De D85 en adelante, cada habitacion fue identica en distribucion con dos filas de 4 cajones de parto por fila. Cada cajon contuvo una cerda joven y su progenie. Cada cajon tema aproximadamente 5 pies x 7 pies (1,5 m x 2,1 m) de tamano, estaba elevada por encima del suelo, paneles de barras metalicas para los lados y malla de plastico para el revestimiento del suelo. No hubo contacto hocico con hocico entre cajones adyacentes. El suelo de cada cajon se lavo al menos una vez al dfa para eliminar excrementos y residuos. Cada habitacion tema calefaccion y ventilacion separadas, previniendose la contaminacion cruzada de aire entre habitaciones. Cada habitacion se limpio y se desinfecto antes de uso para este estudio. El personal de los servicios de animales se ducho y se puso ropas limpias antes de entrar en cada habitacion.
El aislamiento del grupo de tratamiento fue necesario en este estudio ya que es muy conocido dentro de la comunidad cientifica que el PRRSv se propaga facilmente de cerdo a cerdo por diversos mecanismos que incluyen la aerosolizacion. Esto incluye vacunas contra el PRRS vivas avirulentas ya que estos productos biologicos incluyen partfculas vmcas atenuadas que imitan las caractensticas del PRRS natural virulento sin la capacidad para producir enfermedad. Los metodos apropiados fueron in situ para garantizar que se mantema la bioseguridad y que los animales vacunados no se contaminaban accidentalmente de forma cruzada con animales de control negativo sin tratamiento previo contra el PRRSv no vacunados.
Cada habitacion en la instalacion tiene ventiladores y calefactores para ayudar en la suficiente circulacion y el calentamiento del aire. El sistema de ventilacion es separado aunque identico para cada habitacion, por lo que el aire no es compartido entre habitaciones. El pienso solido se almaceno en bolsas, libres de bichos. El agua estaba a voluntad de un pozo localizado en la instalacion para animales. Las cerdas jovenes se alimentaron con una racion de gestacion o lactacion sin medicar comercialmente preparada (Heart of Iowa Cooperative, Roland, IA) apropiada para su tamano, edad y condicion.
Las cerdas jovenes teman buen estado de salud y nutricional antes de iniciarse el estudio como se ha determinado por el investigador del estudio. Durante el estudio se observaron dos cerdas jovenes con una leve cojera y se observo una cerda joven con una hinchazon en la region izquierda del cuello. El investigador del estudio considero que todo esto eran condiciones no espedficas que comunmente se produdan en grupos de cerdas jovenes alojadas en confinamiento. El investigador del estudio determino que no se requenan tratamientos concomitantes para ningun animal durante este estudio.
Todas las cerdas jovenes y sus cerdos asignados a los Grupos 1-3 fueron desechadas por incineracion comercial despues de la eutanasia. Las cerdas jovenes asignadas al Grupo 4 fueron desechadas procesandolas despues de la eutanasia. Los lechones del Grupo 4 no se sacrificaron y se desecharon, sino que se asignaron a otro proyecto de BIVI. Ningun producto alimenticio de los animales enrolados en este estudio entro en la cadena alimentaria humana.
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Evaluacion de la eficacia
Para evaluar la MID de MLV contra el 94881 del PRRS, el grupo de tttulo bajo (Grupo 2) y el grupo de tttulo alto (Grupo 3) se expusieron en D118 y se evaluaron el rendimiento reproductivo y los lechones destetados despues de la exposicion. Los criterios primarios para satisfacer este objetivo fueron que uno o ambos grupos de vacunas debfan demostrar porcentaje o numero estadfsticamente mayor de lechones nacidos vivos y lechones destetados a los 20 dfas de edad (DOF +20) en comparacion con el grupo de control de exposicion (Grupo 1).
Otros parametros analizados para soportar la eficacia entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion incluyeron evaluaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la vacunacion, serologfa del PRRS de cerdas jovenes, viremia de cerdas jovenes, observaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la exposicion, viremia de lechones en el parto, numero total de lechones por camada, lechones sanos vivos por camada, lechones vivos debiles por camada, momias por camada, lechones nacidos muertos por camada, lechones aplastados/mortalidades por camada, observaciones clmicas de lechones y ADWG de lechones.
Criterios para una prueba valida
El grupo de control negativo (Grupo 4) no se incluyo en ningun analisis. El grupo de control negativo se incluyo en el estudio para demostrar que las cerdas jovenes fuente fueron negativas para PRRS en el momento en el que los otros tres grupos se expusieron. Ademas, el grupo de control negativo tuvo que seguir siendo negativo para PRRS hasta que se completara el estudio para excluir una posible introduccion de un PRRSv del campo o contaminacion cruzada accidental de grupos expuestos.
Se requirio que todas las muestras de suero antes de la compra y en D0 fueran negativas para anticuerpos del PRRS. Las muestras de suero recogidas de los Grupos 1 y 4 hasta el dfa de la exposicion y del Grupo 4 hasta que se completara el estudio tuvieron que estar libres de anticuerpos del PRRS para que el estudio fuera valido.
Parametros de resultados primarios
Las variables de eficacia primaria para la evaluacion estadfstica fueron lechones vivos por cerda joven en el nacimiento (numero medio o porcentaje) y lechones vivos por camada en DOF +20 (numero medio y porcentaje).
9.2.1 Porcentaje de lechones vivos en el nacimiento por cerda joven
Los datos del parto se registraron para cada cerda joven durante el estudio. El dfa del parto (DOF) para cada cerda joven se definio como el dfa en el que nacio el primer lechon. En el momento del parto, cada lechon se clasifico en una de cinco categonas enumeradas a continuacion en la Tabla 6.10. Un lechon vivo en el nacimiento se definio como cualquier lechon que recibio una escala de observacion en el nacimiento como lechon vivo sano, lechon vivo debil o lecho aplastado/mortalidad (la muerte debida a aplastamiento se confirmo en la autopsia como se ha descrito mas adelante). Las observaciones se realizaron por el investigador del estudio o un representante y se registraron en el cuaderno de recogida de datos del parto/procesamiento de la camada.
Tabla 6.10 Categonas del resultado del parto
Termino
Definicion
Momia
Un feto momificado que no se ha desarrollado completamente y que presenta una grave autolisis o un feto completamente desarrollado que presenta un aspecto verde plomizo brillante y sin pelo o con muy poco pelo
Lechon nacido muerto
Un lechon muerto completamente desarrollado con pelo
Lechon vivo debil
Un lechon delicado que no puede mamar ni caminar
Lechon vivo sano
Un lechon lactante sano que puede caminar
Aplastado/mortalidad
Un lechon completamente desarrollado que parece haber muerto poco despues del parto debido a que ha sido aplastado por la cerda joven
Lechones vivos por camada en DOF +20
Los lechones se observaron para signos clmicos de enfermedad como se explica mas adelante en la Tabla 6.11 de DOF+1 a DOF+20. Las observaciones se realizaron por el investigador del estudio o representantes y se registraron en el cuaderno de recogida de datos de observaciones clmicas.
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Respiracion
Comportamiento Tos
0 = respiracion normal
0 = normal 0 = ninguna
1 = respiracion jadeante/rapida
1 = letargo de leve a moderado 1 = tos suave o intermitente
2 = disnea
2 = gravemente letargico o recostado 2 = tos aspera o grave, repetitiva
3 = muerto
3 = muerto
3 = muerto
Una puntuacion de observacion clmica total diaria se determino como una suma de las puntuaciones de respiracion, comportamiento y tos por el estadfstico usando el programa SAS. Cualquier lechon que recibio una puntuacion clmica de cero a ocho en DOF+20 se evaluo como vivo en DOF+20.
Parametros de apoyo
Otros parametros analizados entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion incluyeron evaluaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la vacunacion, serolog^a del PRRS de cerdas jovenes, viremia de cerdas jovenes, observaciones clmicas de cerdas jovenes, viremia de lechones, lechones totales por camada, lechones sanos vivos por camada, lechones vivos debiles por camada, momias por camada, lechones nacidos muertos por camada, lechones aplastados/mortalidades por camada, observaciones clmicas de lechones y aumento de peso diario promedio (ADWG) de lechones.
Evaluaciones diarias de las cerdas jovenes
Todas las cerdas jovenes se observaron una vez al dfa de D-1 a D21 y de D22 a 115 al menos tres veces a la semana para evaluaciones diarias despues de la vacunacion por el investigador del estudio o representantes. Las observaciones se registraron en el cuaderno de recogida de datos de la evaluacion diaria.
Serologfa del PRRS en cerdas jovenes
Se recogio sangre venosa completa de cerdas jovenes antes de la compra y en D0, D7, D14, D21, D56, D84, D118, D125, D132, DOF 0, DOF+7, DoF+13 y DOF+20. Las recogidas de sangre de cerdas jovenes en el momento del parto/abortos (DOF 0) se realizaron inmediatamente despues de completarse el parto/abortos o hasta 8 horas despues del parto/aborto.
Brevemente, se recogieron aproximadamente 10 ml de sangre de cada cerda joven en un tubo(s) separador(es) de suero (SST) de tamano apropiado. Se registraron las recogidas de muestras en el cuaderno de recogida de datos de la recogida de muestras. Se dejo que la sangre coagulara a temperatura ambiente en los SST. Las muestras de sangre recogidas los dfas de diario se llevaron a BIVI-Ames el dfa de la recogida. Las muestras de sangre recogidas los fines de semanas fueron procesadas por el personal de VRI el dfa de la recogida. Las muestras de suero en VRI se mantuvieron a 2-8°C. En tanto BIVI-Ames como VRI, las muestras de sangre se centrifugaron y el suero se recogio, se fracciono y se transfirio a tubos apropiados. Cada tubo se etiqueto con el numero de ID de la cerda joven, el numero de estudio, la fecha de recogida, el dfa de estudio y el tipo de muestra. Las muestras de suero en VRI fueron llevadas a BIVI-Ames lo antes posible. Un cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes completo se incluyo con cada envfo. En BIVI-Ames, un conjunto de muestras de suero se mantuvo a 2-8°C y el otro conjunto de muestras de suero se mantuvo a -70 ± 10°C.
El conjunto de muestras de suero de cerdas jovenes mantenido a 2-8°C se probo por BIVI-Ames para anticuerpos del PRRS. Los resultados se informaron como negativos (relacion S/P de ELISA de < 0,4) o positivos (relacion S/P de ELISA de > 0,4).
Observaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la exposicion
Se observaron cerdas jovenes para signos clmicos de enfermedad de D116 a DOF+20. Las observaciones se realizaron por el investigador del estudio o representantes. Se observaron cerdas jovenes cada dfa para respiracion, comportamiento y tos basandose en el sistema de puntuacion de observaciones clmicas explicado anteriormente en la Tabla 6.11.
Viremia del PRRS en lechones
Se recogio sangre venosa completa de lechones en DOF 0, DOF+7, DOF+13 y DOF+20, o cuando un lechon se encontro muerto. Se prefirio la recogida de sangre pre-colostral de lechones reden nacidos, pero no fue obligatorio. Si no pudo cogerse la sangre pre-colostral, fue permisible la sangre peri-natal en el plazo de 12 horas desde el parto. Las muestras no recogidas antes de la primera lactancia se marcaron como “peri-natales” y se guardaron
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separadas de las muestras pre-colostrales.
Brevemente, se recogieron aproximadamente 2,0 a 2,5 ml de sangre de cada lechon vivo en un tubo(s) separador(es) de suero (SST) de tamano apropiado. Se recogieron un mmimo de 5,0 ml de sangre de cada lechon en DOF +20 justo antes de la eutanasia. Se recogio sangre de cada momia o lechon nacido muerto, o si la sangre no pudo recogerse de un feto muerto se recogio lfquido toracico o abdominal. Se registraron las recogidas de muestras en el cuaderno de recogida de datos de la recogida de muestras.
Aumento de peso diario promedio del lechon
Los lechones individuales se pesaron en DOF 0 y DOF+20, o en el dfa en el que un lechon se encontro muerto, por el investigador del estudio o representantes. Los pesos corporales individuales en DOF 0 se registraron en el cuaderno de recogida de datos del parto/procesamiento de la camada y los pesos corporales despues de DOF 0 se registraron en el cuaderno de recogida de datos del peso corporal.
Cuantificacion del virus PRRS en tejido de pulmon
El investigador del estudio hizo la autopsia de todos los lechones muertos en el parto o que murieron antes de DOF+20. Los resultados de la autopsia y un diagnostico se registraron en el cuaderno de recogida de datos de la autopsia. Se recogieron dos muestras de pulmon de cada lechon al que se le hizo la autopsia. Una muestra se coloco en un recipiente Whirlpak® separado y la otra muestra se coloco en un recipiente apropiado lleno de un volumen suficiente de 10% de formalina. Se registraron las recogidas de muestras en el cuaderno de recogida de datos de la autopsia.
Los recipientes Whirlpak® y con formalina se etiquetaron apropiadamente con el numero de animal, numero de estudio, fecha de muestreo, dfa de estudio, tipo de muestra y si las muestras fueron del lado izquierdo, lado derecho o ambos. Las muestras en Whirlpak® se almacenaron a -70 ± 10°C y las muestras en 10% de formalina se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se llevaron a BIVI-Ames. Un cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes completo se incluyo con cada envfo de muestras. En BIVI-Ames, las muestras en Whirlpak® se almacenaron a -70 ± 10°C hasta que se enviaron de BIVI-Ames a Alemania, y las muestras fijadas en formalina se almacenaron en BIVI-Ames a temperatura ambiente.
Despues de completarse el estudio, las muestras de tejido congeladas en Whirlpak® se enviaron y se probaron como se ha descrito anteriormente.
Las muestras de tejido fijadas en formalina se enviaron a ISU VDL en el plazo de una semana desde la recogida para incorporarlas en bloques de parafina. Los tejidos en bloques de parafina se devolvieron a BIVI y actualmente son guardados por BIVI-Ames a temperatura ambiente para posibles pruebas futuras. El patrocinador y el monitor del estudio tomaran la decision de si retener estas muestras o desecharlas despues de que se haya completado el informe del estudio.
Acontecimientos adversos
No se informo de acontecimientos adversos atribuidos a los IVP durante este estudio. Para mas informacion sobre los acontecimientos adversos vease la Seccion 12.6 Evaluaciones de cerdas jovenes despues de la vacunacion.
Metodos estadfsticos
Unidad experimental
Los grupos de tratamiento tuvieron que alojarse en habitaciones separadas en este estudio para evitar la transmision de la vacuna contra el PRRSv viva a grupos no vacunados. Por tanto, la habitacion fue la unidad experimental. Sin embargo, para los fines de este analisis se ignoro un posible sesgo debido a confundir los efectos de “habitacion” y “tratamiento”, y la cerda joven y su camada correspondiente se analizaron como unidad experimental.
Aleatorizacion
Noventa y cuatro (94) cerdas jovenes seronegativas para PRRS de un conjunto de 107 cerdas jovenes elegibles para la prueba se asignaron aleatoriamente a uno de los 4 grupos antes de D0. Los Grupos 1-3 estuvieron cada uno constituido por 28 cerdas jovenes. El Grupo 4 estuvo constituido por 10 cerdas jovenes. Para el Grupo 1, el n° 45 y 55 fueron excluidos por el gerente de la granja antes del envfo debido a motivos de salud y se sustituyeron por dos cerdas jovenes adicionales, el n° 15 y 18, respectivamente. Para el Grupo 3, la cerda joven n° 44 fue excluida por el gerente de la granja antes del envfo debido a motivos de salud y se sustituyo por la cerda joven adicional n° 25.
Debido a limitaciones de espacio en el momento de la exposicion, los Grupos 1-3 se limitaron a 16 cerdas jovenes por grupo y el Grupo 5 se limito a 5-8 cerdas jovenes. En D85, 16 cerdas jovenes por grupo se seleccionaron aleatoriamente para seguir en el estudio para los Grupos 1-3. Como el Grupo 4 estaba constituido por 8 cerdas jovenes en D85, este grupo no se redujo mas por la aleatorizacion. Despues, el investigador del estudio pidio que se redujera el Grupo 4 de 8 cerdas jovenes a 5 cerdas jovenes. En D109, 5 cerdas jovenes fueron seleccionadas
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aleatoriamente para seguir en el estudio para el Grupo 4.
Todos los metodos de aleatorizacion fueron realizados por un bioestadfstico.
Analisis
Los analisis estad^sticos y los resumenes de datos se realizaron por Dr. rer. hort. Martin Vanselow, Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Alemania, +49(0) 511 606 777 650,
m.vanselow@t-online.de.
El objetivo principal del analisis estadfstico fue la comparacion de dos grupos de vacunas MLV contra el PRRSV 94881 (Grupos 2 y 3) con un grupo de control expuesto sin vacunar (Grupo 1). Todos los datos fueron importados a SAS para la gestion y la evaluacion. Los datos fueron recibidos del patrocinador del estudio en forma de conjuntos de datos de SAS verificados. Los casos que se habfan extrafdo del estudio se consideraron para el parametro de analisis respectivo hasta la fecha de exclusion. Todos los datos se resumieron descriptivamente (n, mmimo, maximo, media, mediana, desviacion estandar, rango de intercuartiles, o distribuciones de frecuencia, intervalo de confianza) basandose en el tipo de variable. Los analisis estadfsticos se realizaron usando la version del software SAS 8.2 (SAS, 2001, Cary, Carolina del Norte, EE.UU.: SAS Institute Inc.).
Variables para la evaluacion estadfstica del estudio:
Variables primarias
Proporciones de lechones vivos en el parto/aborto (DOF+0)
Proporciones de lechones vivos a los 20 dfas de edad (DOF+20)
Variables de apoyo
Evaluaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la vacunacion
Serologfa del PRRS en cerdas jovenes
Viremia de cerdas jovenes
Observaciones clmicas de cerdas jovenes
Viremia de lechones
Rendimiento reproductivo
Observaciones clmicas de lechones
Aumento de peso diario promedio (ADWG) de lechones
Hipotesis que van a probarse y suposiciones hechas:
El grupo de control negativo sin exponer (Grupo 4) se excluyo de las pruebas estadfsticas. Los grupos de tttulo bajo y tttulo alto (Grupos 2 y 3, respectivamente) se compararon con el grupo de control de exposicion (Grupo 1). Todas las pruebas entre los grupos se disenaron como pruebas bilaterales en las diferencias. En el caso de todas las pruebas, las diferencias se consideraron estadfsticamente significativas solo si P < 0,05. La eficacia se demostro si el porcentaje o numero de lechones nacidos vivos y el porcentaje o numero de lechones destetados en DOF+20 era significativamente mayor para uno o ambos grupos de vacunas en comparacion con el grupo de control expuesto.
Detalles sobre las manipulaciones y evaluacion de datos:
Evaluaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la vacunacion
Se generaron tablas de frecuencias de animales con al menos un hallazgo positivo entre los dfas de estudio 1 y 21 y entre los dfas de estudio 1 y 113. Las diferencias entre los grupos de control de exposicion y los grupos de vacunas se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Observaciones clmicas de cerdas jovenes despues de la exposicion
Se generaron tablas de frecuencias de animales con al menos un hallazgo positivo entre dfa de estudio 116 y DOF+20. Las diferencias entre el grupo de control de exposicion y los grupos de vacunas se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Serologfa de cerdas jovenes
Se generaron tablas de frecuencias de resultados “positivos” por ELISA en los dfas de estudio 7, 14, 21, 56, 84, 118, 125, 132 (antes del parto) y DOF+0, DOF+7, DOF+13 y dOf+20. Las diferencias entre los grupos de control de
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exposicion y los grupos de vacunas se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Viremia en cerdas jovenes
Los datos de viremia se evaluaron para cada d^a de investigacion por separado ^as del estudio antes del parto 7, 14, 21, 56, 84, 118, 125, 132 y DoF+0, DOF+7, DOF+13 y DOF+20). Para la evaluacion cualitativa de los datos por qPCR, los resultados analfticos 'no detectado' ('n.d.') y 'negativo' se clasificaron como 'negativos' y los resultados analfticos 'positivo' y un valor medido se clasificaron como 'positivos'. Para la evaluacion cuantitativa, 'no detectado' ('n.d.') y 'negativo' se sustituyeron por un valor de log-io GE/ml de 0,0 y 'positivo' se sustituyo por 3,0. Los datos de PCR cuantitativa (carga vftica del PRRS [log-io GE/ml]) se usaron para comparaciones entre los grupos de control de exposicion (Grupo 1) y de tratamiento 2 y 3 usando la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. Se generaron tablas de frecuencias de resultados 'positivos' por qPCR. Las diferencias entre el grupo de control de exposicion y los grupos de vacunas se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Rendimiento reproductivo
Se determinaron las frecuencias absolutas por cerda joven de numero total, lechones vivos, sanos, debiles, nacidos muertos, muertos y vivos en DOF+20 y se usaron como valores individuales para las comparaciones entre grupos. Las frecuencias relativas por cerda joven de lechones vivos, sanos, debiles, nacidos muertos y muertos se calcularon en relacion con el numero total de lechones en el parto y se usaron como valores individuales para las comparaciones entre grupos. El porcentaje de lechones vivos por camada en DOF+20 se calculo en relacion con el numero de lechones vivos en el parto menos el numero de mortalidades y lechones aplastados. Las diferencias entre el grupo de control de exposicion y los grupos de vacunas se probaron por la prueba de Wilcoxon Mann- Whitney.
Viremia en lechones
Los datos de viremia se evaluaron para cada dfa de investigacion por separado (DOF+0, DOF+7, DOF+13 y DOF+20). Para la evaluacion cualitativa de los datos por qPCR, los resultados analfticos 'no detectado' ('n.d.') y 'negativo' se clasificaron como 'negativos' y los resultados analfticos 'positivo' y un valor medido se clasificaron como 'positivos'. Se calcularon los porcentajes de lechones 'positivos' por camada y se usaron como valores individuales para las comparaciones entre grupos por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. Para la evaluacion cuantitativa, 'no detectado' ('n.d.') y 'negativo' se sustituyeron por un valor de log-10 GE/ml de 0,0 y 'positivo' se sustituyo por 3,0. Se calcularon las medianas de valores de qPCR por camada y se usaron como valores individuales para las comparaciones entre grupos por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. Para las estadfsticas resumidas se usaron los datos de qPCR individuales. Las cargas vfticas en muestras de pulmon solo se evaluaron descriptivamente.
Peso corporal y aumento de peso diario promedio de lechones
Los aumentos de peso diarios promedio (ADWG) individuales se calcularon para los periodos de tiempo entre DOF+0 y DOF+20. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por analisis de la varianza (ANOVA) y posteriores pruebas de la t. Las medias por mmimos cuadrados de los grupos y las diferencias entre las medias por mmimos cuadrados con intervalos de confianza de 95% se derivaron de ANOVA. El analisis para DOF+20 y ADWG se repitio con peso en DOF+0 como una covariable. Los datos de peso de lechones por cerda joven se resumieron descriptivamente.
Observaciones clmicas de lechones
Se calculo el porcentaje de lechones por camada con al menos un hallazgo positivo entre los dfas de estudio DOF+1 y DOF+20 y se uso como valores individuales para las comparaciones entre grupos por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. Los datos se analizaron suponiendo una estructura de diseno completamente aleatoria.
Resultados
Rendimiento reproductivo de cerdas jovenes
Los porcentajes medios de lechones vivos por camada en el parto (sanos + debiles + aplastados/mortalidad) fueron 54,4%, 75,1%, 72,3% y 93,0% para los grupos de control de exposicion, de tftulo bajo, de tftulo alto y de control negativo, respectivamente. Los grupos de tftulo bajo y de tftulo alto tuvieron significativamente mayor porcentaje de lechones vivos por camada en el parto en comparacion con el grupo de control de exposicion (P<0,0455). El numero medio de lechones vivos por camada en el parto fueron 6,5, 8,3, 8,6 y 10,8 para los grupos de control de exposicion, de tftulo bajo, de tftulo alto y de control negativo, respectivamente. No se detectaron diferencias significativas entre los grupos para el numero de lechones vivos por camada en el parto (P>0,1039).
Los porcentajes medios de lechones sanos vivos por camada fueron 41,4%, 65,8%, 67,9% y 93,0% para los grupos de control de exposicion, de tftulo bajo, de tftulo alto y de control negativo, respectivamente. Los grupos de tftulo bajo y de tftulo alto tuvieron significativamente mayores porcentajes de lechones sanos vivos por camada en el parto en comparacion con el grupo de control de exposicion (P<0,0138). El numero medio de lechones sanos vivos por
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25
camada en el parto fueron 4,9, 7,2, 8,1 y 10,8 para los grupos de control de exposicion, de t^tulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente. El grupo de tftulo alto tuvo un numero significativamente mayor de lechones sanos vivos por camada en el parto (P=0,0211), mientras que no se detecto diferencia para el grupo de tftulo bajo en comparacion con el grupo de control de exposicion (P=0,0640).
Los porcentajes medios de lechones vivos debiles por camada en el parto fueron 7,4%, 7,1%, 0,4% y 0,0% para los grupos de control de exposicion, de tftulo bajo, de tftulo alto y de control negativo, respectivamente. El numero medio de lechones vivos debiles por camada en el parto fue 0,9, 0,8, 0,1 y 0,0 para los grupos de control de exposicion, de tftulo bajo, de tftulo alto y de control negativo, respectivamente. El grupo de tftulo alto tuvo significativamente menor porcentaje y numero de lechones vivos debiles por camada en el parto en comparacion con el grupo de control de exposicion (P<0,0090). En cambio, no se detectaron diferencias entre el grupo de tftulo bajo y el grupo de control de exposicion para el porcentaje o numero de lechones vivos debiles en el parto (P>0,8569).
Los porcentajes medios de momias por camada en el parto fueron 28,1%, 14,1%, 8,7%, y 0,0% para los grupos de control de exposicion, de titulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente. El numero medio de momias por camada en el parto fue 3,1, 1,6, 0,9 y 0,0 para los grupos de control de exposicion, de titulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente. Tanto los grupos de tftulo bajo como de titulo alto tuvieron porcentajes y numeros de momias significativamente menores por camada en el parto en comparacion con el grupo de control de exposicion (P<0,0190).
No se detectaron diferencias significativas entre los dos grupos de tftulos de vacunas y el grupo de control de exposicion para el porcentaje o numero de lechones nacidos muertos o mortalidades/aplastados por camada en el parto (P>0,1681).
Un resumen de los resultados del rendimiento reproductivo por grupo (% de lechones por camada y numero de lechones por camada) en el DOF se muestra a continuacion en las Tablas 6.12 y 6.13.
Tabla 6.12 Resumen de los resultados del rendimiento reproductivo por grupo (% de lechones por camada) en el DOF
Lechones
Grupo* N Mm. Max. Mediana Media IC de 95% DE P
1 16 0 92 57,3 54,4 41,1 67,7 24,91
Vivos
2 16 33 100 81,9 75,1 64,5 85,7 19,88 0,0184
3
16 17 100 75,6 72,3 59,5 85,1 24,01 0,0455
4 5 83 100 91,7 93,0 84,2 101,8 7,11
1 16 0 92 48,1 41,4 27,5 55,3 26,13
Sanos
2 16 8 92 71,4 65,8 52,2 79,5 25,57 0,0138
3
16 17 100 71,8 67,9 54,4 81,3 25,25 0,0082
4 5 83 100 91,7 93,0 84,2 101,8 7,11
1 16 0 25 3,6 7,4 2,6 12,2 9,04
Debiles
2 16 0 25 0,0 7,1 2,1 12,2 9,43 0,9441
3
16 0 7 0,0 0,4 -0,5 1,3 1,67 0,0024
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
1 16 0 50 9,5 17,5 8,5 26,4 16,83
Nacidos
2 16 0 42 3,8 10,7 3,3 18,2 13,94 0,1965
muertos
3 16 0 83 10,6 19,0 7,0 31,0 22,54 0,9033
4 5 0 17 8,3 7,0 -1,8 15,8 7,11
1 16 0 63 25,8 28,1 18,8 37,4 17,50
Momias
2 16 0 55 9,1 14,1 6,0 22,3 15,25 0,0190
3
16 0 50 3,3 8,7 1,2 16,3 14,14 0,0006
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
1 16 0 27 0,0 5,6 1,1 10,2 8,55
Mortalidades / Aplastados
2 16 0 18 0,0 2,1 -0,6 4,8 5,07 0,2276
3
16 0 25 0,0 4,0 0,1 7,8 7,25 0,6108
4
5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
1 15 0 100 33,3 43,6 23,0 64,3 37,28
Vivos en
2 16 13 100 84,5 73,8 58,5 89,2 28,80 0,0203
DOF+20
3 16 44 100 86,6 83,8 75,1 92,5 16,37 0,0022
4 5 100 100 100,0 100,0 100,0 100,0 0,00
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Tabla 6.13: Resumen de los resultados del rendimiento reproductivo por grupo (n° de lechones por camada) en el DOF
Lechones
Grupo* N Mm. Max. Mediana Media IC de 95% DE P
Total
1 16 6 15 12,0 11,6 10,4 12,9 2,31
2 16 9 13 11,0 11,1 10,4 11,7 1,24 0,1857
3 16 7 15 12,0 11,6 10,3 12,9 2,42 0,9623
4 5 10 14 12,0 11,6 9,5 13,7 1,67
Vivos
1 16 0 11 6,0 6,5 4,7 8,3 3,35
2 16 4 12 8,0 8,3 7,0 9,5 2,27 0,1543
3 16 2 13 9,0 8,6 6,6 10,6 3,77 0,1039
4 5 9 14 10,0 10,8 8,4 13,2 1,92
Sanos
1 16 0 11 5,5 4,9 3,1 6,7 3,36
2 16 1 12 7,0 7,2 5,7 8,7 2,83 0,0640
3 16 2 13 8,5 8,1 6,1 10,1 3,76 0,0211
4 5 9 14 10,0 10,8 8,4 13,2 1,92
Debiles
1 16 0 3 0,5 0,9 0,3 1,5 1,09
2 16 0 3 0,0 0,8 0,2 1,4 1,11 0,8569
3 16 0 1 0,0 0,1 -0,1 0,2 0,25 0,0090
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
Nacidos
1 16 0 6 1,0 2,0 0,9 3,1 2,03
muertos
2 16 0 5 0,5 1,3 0,4 2,1 1,65 0,1681
3 16 0 10 1,0 2,1 0,8 3,5 2,58 0,9478
4 5 0 2 1,0 0,8 -0,2 1,8 0,84
Momias
1 16 0 7 3,0 3,1 2,1 4,1 1,89
2 16 0 6 1,0 1,6 0,7 2,5 1,67 0,0125
3 16 0 4 0,5 0,9 0,2 1,5 1,20 0,0003
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
Mortalidades
1 16 0 3 0,0 0,7 0,1 1,2 1,01
/
2 16 0 2 0,0 0,3 -0,1 0,6 0,58 0,2200
Aplastados
3 16 0 2 0,0 0,4 0,0 0,8 0,73 0,6115
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
Vivos en
1 16 0 10 2,0 2,9 1,2 4,7 3,21
DOF+20
2 16 1 10 6,5 6,2 4,5 7,9 3,19 0,0063
3 16 2 12 7,5 6,9 5,0 8,9 3,71 0,0026
4 5 9 14 10,0 10,8 8,4 13,2 1,92
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
5 Lechones vivos en dof+20
Estas puntuaciones ponen de relieve el numero de lechones vivos en el destetamiento (20 dfas de edad). Un resumen del porcentaje por grupo y numero de lechones vivos por camada en DOF+20 se muestra anteriormente en la Tablas 6.12 y 6.13.
Los porcentajes medios de lechones vivos por camada en el destetamiento (DOF+20) fueron 43,6%, 73,8%, 83,8% y 10 100,0% para los grupos de control de exposicion, de tftulo bajo, de tftulo alto y de control negativo, respectivamente.
El numero medio de lechones vivos por camada en el destetamiento fue 2,9, 6,2, 6,9 y 10,8 para los grupos de control de exposicion, de tftulo bajo, de tftulo alto y de control negativo, respectivamente. Tanto los grupos de tftulo bajo como de tftulo alto tuvieron porcentajes y numeros significativamente mayores de lechones vivos por camada en el destetamiento (DOF+20) en comparacion con el grupo de control de exposicion (P<0,0203).
15 Viremia por qPCR en cerdas jovenes
Todas las cerdas jovenes fueron negativas por qPCR para ARN del PRRSv en D0. Todas las cerdas jovenes del
control de exposicion y del control negativo siguieron siendo negativas por qPCR para ARN del PRRSv hasta e incluyendo el dfa de exposicion (D118). El grupo de control negativo siguio siendo negativo por qPCR para el resto del estudio, con excepcion de la cerda joven n° 108, que fue “positiva” en DOF+7. La cerda joven n° 108 fue negativa en otros momentos de tiempo para ARN del PRRSv por pruebas de qPCR.
5 Despues de la vacunacion, 50% y 36% de las cerdas jovenes de tftulo bajo y de tftulo alto, respectivamente, fueron
positivas por qPCR para ARN del PRRSv (P<0,0007) en D7. De D14 a D56, solo 4% de las cerdas jovenes de tftulo
bajo siguio siendo positivas por qPCR, mientras que hasta 4% de las cerdas jovenes de tftulo alto fueron positivas por qPCR intermitentemente durante este periodo de observacion. No se detectaron diferencias entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion de D14 a D56 para el porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR 10 para ARN del PRRSv (P=1,0000 o no se realizo la prueba). Todas las cerdas jovenes vacunadas fueron negativas
por qPCR para ARN del PRRSv en D84 y D118 (dfa de exposicion).
Despues de la exposicion, los grupos de tftulo bajo y alto tuvieron porcentajes estadfsticamente menores de cerdas jovenes positivas por qPCR para ARN del PRRSv en comparacion con el grupo de control de exposicion en los dfas 125, DOF 0 y DOF+13 (P<0,0155). En D132, el grupo de tftulo bajo tuvo un porcentaje significativamente menor de 15 cerdas jovenes positivas por qPCR para ARN del PRRSv (P=0,0290); mientras que no se detecto diferencia estadfstica entre el grupo de tftulo alto y el grupo de control de exposicion (P=0,1556). No se detectaron diferencias significativas entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion en DOF+7 y DOF+20 para el porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR para ARN del PRRSv (P>0,1719).
Un resumen del porcentaje por grupo de cerdas jovenes positivas por qPCR para ARN del PRRSv de D7 a DOF +20 20 se muestra a continuacion en las Tablas 6.14 y 6.15.
Tabla 6.14 Resumen del porcentaje por grupo de cerdas jovenes positivas por qPCR para ARN del PRRSv de D7 a D132
Dia de estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
7
1 0 0 0,0 12,3 28
2 14 50 30,6 69,4 28 <0,0001
3 10 36 18,6 55,9 28 0,0007
4 0 0 0,0 30,8 10
14
1 0 0 0,0 12,3 28
2 1 4 0,1 18,3 28 1,0000
3 0 0 0,0 12,3 28 n.a.
4 0 0 0,0 30,8 10
21
1 0 0 0,0 12,3 28
2 1 4 0,1 18,3 28 1,0000
3 1 4 0,1 18,3 28 1,0000
4 0 0 0,0 30,8 10
56
1 0 0 0,0 14,8 23
2 1 4 0,1 19,6 26 1,0000
3 1 4 0,1 20,4 25 1,0000
4 0 0 0,0 33,6 9
84
1 0 0 0,0 14,8 23
2 0 0 0,0 13,2 26 n.a.
3 0 0 0,0 13,7 25 n.a.
4 0 0 0,0 33,6 9
118 (dia de
1 0 0 0,0 20,6 16
exposicion)
2 0 0 0,0 20,6 16 n.a.
3 0 0 0,0 20,6 16 n.a.
4 0 0 0,0 52,2 5
125
1 16 100 79,4 100,0 16
2 5 31 11,0 58,7 16 0,0001
3 4 25 7,3 52,4 16 <0,0001
4 0 0 0,0 52,2 5
Dia de estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
132
1 10 63 35,4 84,8 16
2 3 19 4,0 45,6 16 0,0290
3 5 31 11,0 58,7 16 0,1556
4 0 0 0,0 52,2 5
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV del PRRS 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo; n.a. = no aplicable, no se realizo la prueba
Tabla 6.15: Resumen del porcentaje por grupo de cerdas jovenes positivas por qPCR para ARN del PRRSv de DOF 5 0 a DOF+20
Dia de estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
DOF+0
1 15 94 69,8 99,8 16
2 4 25 7,3 52,4 16 0,0002
3 1 6 0,2 30,2 16 <0,0001
4 0 0 0,0 52,2 5
DOF+7
1 5 31 11,0 58,7 16
2 2 13 1,6 38,3 16 0,3944
3 1 6 0,2 30,2 16 0,1719
4 1 20 0,5 71,6 5
DOF+13
1 7 47 21,3 73,4 15
2 0 0 0,0 20,6 16 0,0024
3 1 6 0,2 30,2 16 0,0155
4 0 0 0,0 52,2 5
DOF+20
1 3 19 4,0 45,6 16
2 3 19 4,0 45,6 16 1,0000
3 0 0 0,0 20,6 16 0,2258
4 0 0 0,0 52,2 5
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Ambos grupos de vacunas tuvieron significativamente mayor mediana de las cargas vmcas en comparacion con el grupo de control de exposicion en D7 (P<0,0007). No se detectaron diferencias entre grupos de vacunas y el grupo 10 de control de exposicion de D14 a D56 para la carga vmca (P=1,0000). Todas las cerdas jovenes vacunadas tuvieron carga vmca cero en D84 y D118 (dfa de exposicion).
Despues de la exposicion, los grupos de titulo bajo y alto tuvieron medianas estadfsticamente menores de las cargas vmcas en comparacion con el grupo de control de exposicion en D125, DOF 0 y DOF+13 (P<0,0155). En D132, el grupo de titulo bajo tuvo una mediana significativamente menor de la carga vmca (P=0,0230); mientras que no se 15 detecto diferencia estadfstica entre el grupo de titulo alto y el grupo de control de exposicion (0,94 y 1,97 log-io GE/ml respectivamente; P=0,1144). No se detectaron diferencias significativas para la carga vmca entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion en DOF+7 y DOF+20 (P>0,1719).
Un resumen de los resultados de qPCR en GE/ml de cerdas jovenes medios por grupo de D7 a DOF +20 se muestra a continuacion en las Tablas 6.16 y 6.17.
20 Tabla 6.16: Resumen de los resultados de qPCR de cerdas jovenes por grupo (log™ GE/ml) de D7 a D132
Dia de estudio Grupo*
N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media P
7
1 28 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 28 0,00 3,00 1,500 0,000 3,000 3,000 1,500 <0,0001
3 28 0,00 3,00 0,000 0,000 3,000 3,000 1,071 0,0007
4 10 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
14
1 28 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 28 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,107 1,0000
Dia de estudio Grupo*
N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media P
3 28 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1,0000
4 10 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
21
1 28 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 28 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,107 1,0000
3 28 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,107 1,0000
4 10 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
56
1 23 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 26 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,115 1,0000
3 25 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,120 1,0000
4 9 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
84
1 23 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
2 26 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1,0000
3 25 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1,0000
4 9 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
1 16 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
118 (Dia de
2 16 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1,0000
exposicion)
3 16 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1,0000
4 5 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
125
1 16 3,00 5,38 4,495 4,130 4,880 0,765 4,419
2 16 0,00 6,46 0,000 0,000 3,000 3,000 1,293 0,0001
3 16 0,00 3,00 0,000 0,000 3,000 1,500 0,750 <0,0001
4 5 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
132
1 16 0,00 4,47 3,000 0,000 3,000 3,000 1,967
2 16 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,563 0,0230
3 16 0,00 3,00 0,000 0,000 3,000 3,000 0,938 0,1144
4 5 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Tabla 6.17: Resumen de los resultados de qPCR de cerdas jovenes por grupo (log-io GE/ml) de DOF 0 a DOF+20
Dia de estudio
Grupo* N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media P
DOF+0
1 16 0,00 3,00 3,000 3,000 3,000 0,000 2,813
2 16 0,00 3,00 0,000 0,000 3,000 1,500 0,750 0,0002
3 16 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,188 <0,0001
4 5 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
DOF+7
1 16 0,00 3,00 0,000 0,000 3,000 3,000 0,938
2 16 0,00 5,55 0,000 0,000 0,000 0,000 0,534 0,3944
3 16 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,188 0,1719
4 5 0,00 3,00 0,000 0,000 3,000 0,000 0,600
DOF+13
1 15 0,00 3,00 0,000 0,000 3,000 3,000 1,400
2 16 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,0024
3 16 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,188 0,0155
4 5 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
DOF+20
1 16 0,00 3,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,563
2 16 0,00 6,45 0,000 0,000 0,000 0,000 0,903 0,7924
3 16 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,2258
4 5 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo bajo; Grupo 3 5 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
5
10
15
20
25
30
PUNTUACIONES DE OBSERVACIONES CLINICAS DE CERDAS JOVENES DESPUES DE LA EXPOSICION
De D116 a DOF+20, 25%, 25%, 38% y 60% de cerdas jovenes de control de exposicion, de t^tulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente, presentaron enfermedad clmica durante al menos un dia de D116 a DOF+20. No se detectaron diferencias significativas entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion para la frecuencia de cerdas jovenes positivas para enfermedad clmica de D116 a DOF+20 (P>0,7043).
Un resumen del porcentaje por grupo de cerdas jovenes positivas para enfermedad clmica (una puntuacion de observacion clmica de > 0) durante al menos un dfa de D116 a DOF +20 se muestra a continuacion en la Tabla 6.18.
Tabla 6.18: Resumen del porcentaje por grupo de cerdas jovenes positivas para enfermedad clmica (una puntuacion de observacion clmica de > 0) durante al menos un dfa de D116 a DOF +20
Dias del estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
1 4 25 7,3 52,4 16
2 4 25 7,3 52,4 16 o o o o
116 - DOF+20
3 6 38 15,2 64,6 16 0,7043
4 3 60 14,7 94,7 5
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tftulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Serologfa por elisa del prrs en cerdas jovenes
Todas las cerdas jovenes fueron seronegativas para PRRS en D0 y D7. Todas las cerdas jovenes del control de exposicion y del control negativo siguieron siendo seronegativas para PRRS hasta e incluyendo el dfa de exposicion (D118); mientras que el grupo de control negativo siguio siendo seronegativo para PRRS para el resto del estudio (DOF+20).
En D14, 18% y 21% de las cerdas jovenes de tftulo bajo y tftulo alto, respectivamente, fueron seropositivas para PRRS. El grupo de tftulo alto tuvo un porcentaje significativamente mayor de cerdas jovenes seropositivas para PRRS en D14 (P=0,0232), mientras que no se detecto diferencia para el grupo de tftulo bajo en comparacion con el grupo de control de exposicion (p=0,0515). Estos porcentajes alcanzaron altos niveles por grupo de 65% y de 60% para los grupos de tftulo bajo y de tftulo alto, respectivamente en D56 (P<0,0001). En el dfa de la exposicion (D118), 56% y 50% de las cerdas jovenes de tftulo bajo y de tftulo alto fueron seropositivas para PRRS (P<0,0024). En D125, 6%, 88% y 100% de las cerdas jovenes de control de exposicion, de titulo bajo y de titulo alto, respectivamente, fueron seropositivas para PRRS; y la diferencia entre los grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion fueron significativas (P<0,0001). Despues de D125, todas las cerdas jovenes de control de exposicion, de tftulo bajo y de titulo alto restantes fueron seropositivas PRRS para el resto del estudio (no se realizo la prueba).
Un resumen de los resultados de serologfa por ELISA del PRRS por grupo de D14 a DOF+20 se muestra a continuacion en las Tablas 6.19 y 6.20.
Tabla 6.19: Resumen de los resultados de serologfa por ELISA del PRRS de cerdas jovenes por grupo de D14 a Dfa 132
Dia de estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
7
1 0 0 0,0 12,3 28
2 0 0 0,0 12,3 28 n.a.
3 0 0 0,0 12,3 28 n.a.
4 0 0 0,0 30,8 10
14
1 0 0 0,0 12,3 28
2 5 18 6,1 36,9 28 0,0515
3 6 21 8,3 41,0 28 0,0232
4 0 0 0,0 30,8 10
21
1 0 0 0,0 12,3 28
2 13 46 27,5 66,1 28 <0,0001
3 11 39 21,5 59,4 28 0,0003
4 0 0 0,0 30,8 10
56
1 0 0 0,0 14,8 23
2 17 65 44,3 82,8 26 <0,0001
Dia de estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
3 15 60 38,7 78,9 25 <0,0001
4 0 0 0,0 33,6 9
84
1 0 0 0,0 14,8 23
2 15 58 36,9 76,6 26 <0,0001
3 14 56 34,9 75,6 25 <0,0001
4 0 0 0,0 33,6 9
118
1 0 0 0,0 20,6 16
2 9 56 29,9 80,2 16 0,0008
3 8 50 24,7 75,3 16 0,0024
4 0 0 0,0 52,2 5
125
1 1 6 0,2 30,2 16
2 14 88 61,7 98,4 16 <0,0001
3 16 100 79,4 100,0 16 <0,0001
4 0 0 0,0 52,2 5
132
1 16 100 79,4 100,0 16
2 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
3 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
4 0 0 0,0 52,2 5
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo. n.a. = no aplicable, no se realizo la prueba
Tabla 6.20 Resumen de los resultados de serologfa por ELISA del PRRS de cerdas jovenes por grupo de DOF 0 a 5 DOF+20
Dia de estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
DOF+0
1 16 100 79,4 100,0 16
2 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
3 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
4 0 0 0,0 52,2 5
DOF+7
1 15 100 78,2 100,0 15
2 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
3 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
4 0 0 0,0 52,2 5
DOF+13
1 16 100 79,4 100,0 16
2 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
3 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
4 0 0 0,0 52,2 5
DOF+20
1 16 100 79,4 100,0 16
2 16 100 79,4 100,0 16 n.a.
3 15 100 78,2 100,0 15 n.a.
4 0 0 0,0 52,2 5
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo. **No se realizo la prueba en la muestra de la cerda joven n° 106. n.a. = no aplicable, no se realizo la prueba
Evaluaciones de cerdas jovenes despues de la vacunacion
10 No se detectaron evaluaciones anormales de D1 a 21 en ningun grupo y no se realizo la prueba. De D1 a D113, 4%, 4%, 0% y 10% de las cerdas jovenes de control de exposicion, de tttulo bajo, de tttulo alto y de control negativo, respectivamente, presentaron una evaluacion anormal durante al menos un dfa de D1 a D113. No se detectaron diferencias significativas entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion para evaluaciones anormales de D1 a D113 (P=1,0000).
Individualmente, el n° 109 (grupo de control de exposicion) presento cojera de la pata trasera derecha en D85, el n° 12 (grupo de titulo bajo) presento una hinchazon en la region izquierda del cuello de D78 a D89 y el n° 21 (grupo de control negativo) presento cojera de D81 a D83. Un resumen del porcentaje por grupo de cerdas jovenes que presento una evaluacion anormal durante al menos un dfa de D1 a D21 y de D1 a D113 se muestra a continuacion 5 en la Tabla 6.21.
Tabla 6.21 Resumen de las evaluaciones anormales por grupo durante al menos un dfa de D1 a D113
Dias del estudio
Grupo* N % IC de 95% Total P
1 -21
1 -4 Sin hallazgos 'positivos'
1 -113
1 1 4 0,1 18,3 28
2 1 4 0,1 18,3 28 1,0000
3 0 0 0,0 12,3 28 1,0000
4 1 10 0,3 44,5 10
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Puntuaciones de observaciones clmicas de lechones
10 Los porcentajes medios de lechones por camada positivos para enfermedad clmica (una puntuacion de observacion clmica de > 0) durante al menos un dia de DOF+1 a DOF+20 fueron 91,6%, 32,5%, 33,4% y 3,2% para los grupos de control de exposicion, de titulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente. Los grupos de titulo bajo y alto tuvieron porcentajes significativamente menores de lechones por camada positivos para enfermedad clmica durante al menos un dfa de DOF+1 a DOF+20 en comparacion con el grupo de control de exposicion 15 (p<0,0001).
Un resumen del porcentaje por grupo de lechones por camada que fueron positivos para enfermedad clmica (una puntuacion de observacion clmica de > 0) durante al menos un dfa de DOF+1 a DOF+20 se muestra a continuacion en la Tabla 6.22.
Tabla 6.22: Resumen del porcentaje por grupo de lechones por camada positivos para enfermedad clmica (una 20 puntuacion de observacion clmica de > 0) durante al menos un dfa de DOF+1 a DOF+20
Dias del estudio Grupo*
N Mm. Max. Mediana Media IC de 95% DE P
DOF+1
1 15 56 100 100,0 91,6 82,9 100,4 15,78
a
2 16 0 100 25,0 32,5 15,6 49,4 31,64 <0,0001
DOF+20
3 16 0 100 25,0 33,4 19,0 47,9 27,16 <0,0001
4 5 0 9 0,0 3,2 -2,3 8,8 4,50
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Resultados de qPCR de suero/fluidos corporales de lechon
Una media de 86,3%, 58,1%, 55,0% y 0% de lechones por camada para los grupos de control de exposicion, de 25 titulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente, fueron positivos por qPCR para ARN del PRRSv en
DOF 0. Los grupos de titulo bajo y alto tuvieron porcentajes estadfsticamente menores de lechones por camada positivos por qPCR para ARN del PRRSv en comparacion con el grupo de control de exposicion en DOF 0 (P<0,0381). En DOF+7, de nuevo los grupos de titulo bajo y de titulo alto tuvieron porcentajes significativamente menores de lechones por camada positivos por qPCR para ARN del PRRSv en comparacion con el grupo de control 30 de exposicion (P<0,0293). En DOF+13, solo el grupo de titulo bajo tuvo un porcentaje significativamente menor de lechones por camada positivos por qPCR (P=0,0216); mientras que no se detectaron diferencias significativas para el grupo de titulo alto y el control de exposicion para el porcentaje de lechones por camada positivos por qPCR (P=0,0860). No se detectaron diferencias significativas entre los grupos en DOF+20 (P>0,0614).
Un resumen del porcentaje por grupo de lechones positivos para PRRSv por qPCR de suero/fluido corporal por 35 cerda joven se muestra a continuacion en la Tabla 6.23.
Tabla 6.23: Un resumen del porcentaje por grupo de lechones positivos para PRRSv por qPCR de suero/fluido corporal por cerda joven
Dia de estudio Grupo*
N Mm. Max. Mediana Media IC de 95% DE P
DOF+0
1 16 50 100 96,4 86,3 76,8 95,8 17,87
2 16 0 100 68,3 58,1 37,3 78,9 39,07 0,0381
3 16 0 100 60,0 55,0 37,0 73,0 33,77 0,0018
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
DOF+7
1 12 100 100 100,0 100,0 100,0 100,0 0,00
2 16 10 100 100,0 76,6 57,1 96,0 36,51 0,0293
3 16 0 100 100,0 78,6 60,6 96,6 33,83 0,0175
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
DOF+13
1 11 100 100 100,0 100,0 100,0 100,0 0,00
2 16 0 100 100,0 75,4 55,0 95,8 38,31 0,0216
3 16 0 100 100,0 84,0 68,2 99,9 29,75 0,0860
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
DOF+20
1 11 0 100 100,0 90,9 70,7 111,2 30,15
2 16 0 100 93,8 75,3 55,6 95,0 36,97 0,0614
3 16 0 100 100,0 81,6 65,0 98,1 31,06 0,1832
4 5 0 0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,00
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
5 El grupo de titulo alto tuvo una mediana significativamente menor de resultado de qPCR en comparacion con el grupo de control de exposicion en DOF 0 (P=0,0030); mientras que no se detecto diferencia entre el grupo de titulo bajo y el grupo de control de exposicion (P=0,0620). En DOF+7, DOF+13 y DOF+20, ambos grupos de vacunas tuvieron medianas significativamente menores de valores de qPCR en comparacion con el grupo de control de exposicion (p<0,0122).
10 Un resumen de los resultados de qPCR en GE/ml de suero/fluido corporal de lechones por grupo por cerda joven se muestra a continuacion en la Tabla 6.24.
Tabla 6.24: Resumen de resultados de qPCR de suero/fluido corporal de lechones por grupo (log™ GE/ml) por cerda joven (valores de P para diferencias entre grupos basados en las medianas de valores de qPCR)
Dia de estudio
Grupo* N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media P
DOF+0
1 180 0,00 8,69 6,400 6,080 6,790 3,195 5,556
2 176 0,00 8,47 3,000 3,000 4,420 6,945 3,560 0,0620
3 183 0,00 8,76 3,000 0,000 3,000 6,580 3,049 0,0030
4 58 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
DOF+7
1 58 4,47 8,76 6,950 6,610 7,370 1,300 6,914
2 103 0,00 8,12 3,000 3,000 4,930 5,640 3,337 <0,0001
3 115 0,00 6,91 4,280 3,000 4,630 2,120 3,642 <0,0001
4 54 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
DOF+13
1 52 4,19 8,62 6,835 6,430 6,970 0,995 6,549
2 100 0,00 8,22 3,000 3,000 3,000 4,530 2,678 <0,0001
3 113 0,00 6,54 3,000 3,000 3,000 1,580 3,413 <0,0001
4 54 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
DOF+20
1 46 0,00 6,94 5,595 5,270 6,520 1,770 5,554
2 98 0,00 6,59 3,000 3,000 3,000 4,000 2,502 0,0122
3 111 0,00 6,28 3,000 3,000 3,000 1,160 3,218 0,0005
4 54 0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 15 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
ADWG de lechones
No se detectaron diferencias entre grupos para pesos corporales medios por LS en DOF 0 (P>0,2972). Ambos grupos de vacunas tuvieron mayores pesos corporales medios por mmimos cuadrados en comparacion con el grupo de control de exposicion en DOF+20 (P<0,0028), teniendo o sin tener en cuanta pesos corporales en DOF 0 como 5 covariable en los analisis.
El ADWG medio de DOF 0 a DOF+20 fue 0,1 kg/dfa, 0,2 kg/dfa, 0,2 kg/dfa y 0,2 kg/dfa para los grupos de control de exposicion, de tttulo bajo, de tttulo alto y de control negativo, respectivamente. Ambos grupos de vacunas tuvieron significativamente mayor ADWG en comparacion con el grupo de control de exposicion (P<0,0028), teniendo o sin tener en cuanta pesos corporales en DOF 0 como covariable en los analisis.
10 Un resumen de los pesos corporales de lechones en DOF 0 y DOF+20 por grupo y ADWG de DOF 0 a DOF+20 (kg/dfa) se muestra a continuacion en las Tablas 6.25 y 6.26.
Tabla 6.25: Resumen de pesos corporales de lechones en DOF 0 y DOF+20 (kg/dfa)
DOF+20 por grupo y ADWG de DOF 0 a
Dia(s) de estudio Grupo*
N Mm. Max. Mediana Media IC de 95% DE
1 47 0,9 2,0 1,40 1,34 1,274 1,411 0,234
Pesos corporales
2 99 0,9 2,1 1,40 1,43 1,388 1,479 0,227
en DOF+0
3 111 0,9 2,0 1,40 1,40 1,360 1,448 0,234
4 54 0,9 1,9 1,40 1,39 1,335 1,454 0,218
1 47 1,5 6,1 3,70 3,80 3,462 4,146 1,164
Pesos corporales
2 99 2,4 8,3 5,50 5,42 5,168 5,673 1,266
en DOF+20
3 111 2,1 8,2 5,30 5,19 5,000 5,388 1,032
4 54 2,4 6,9 5,20 5,26 5,008 5,511 0,922
1 47 0,015 0,235 0,1150 0,1231 0,10649 0,13968 0,05653
ADWG (DOF+0 a
2 99 0,065 0,340 0,2000 0,1993 0,18770 0,21099 0,05837
DOF+20)
3 111 0,055 0,330 0,1950 0,1895 0,18078 0,19823 0,04638
4 54 0,060 0,260 0,1925 0,1932 0,18305 0,20343 0,03733
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo bajo; Grupo 3 15 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de tttulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Tabla 6.26: Resumen de pesos corporales medios por LS por grupo y ADWG en DOF 0 a DOF+20 (kg/dfa) - Resultados de las pruebas (valor de P) en diferencias entre grupos
Dia(s) de estudio
Grupo* Media por LS Intervalo de confianza de 95% P
1 1,32 1,169 1,477
2 1,42 1,318 1,522
Pesos corporales
3 1,41 1,317 1,497
en DOF+0
Dif. 1-2 -0,10 -0,281 0,088 0,2972
Dif. 1-3 -0,08 -0,262 0,094 0,3467
1 3,82 3,072 4,567
2 5,32 4,827 5,819
Pesos corporales
3 5,35 4,910 5,785
en DoF+20
Dif. 1-2 -1,50 -2,401 -0,606 0,0016
Dif. 1-3 -1,53 -2,394 -0,662 0,0010
1 4,01 3,341 4,685
2 5,28 4,843 5,727
Pesos corporales en DOF+20**
3 5,34 4,950 5,728
Dif. 1-2 -1,27 -2,078 -0,466 0,0028
Dif. 1-3 -1,33 -2,103 -0,550 0,0013
ADWG
1 0,125 0,0903 0,1594
(DOF+0 a
2 0,195 0,1722 0,2181
DOF+20)
3 0,197 0,1768 0,2172
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Dif. 1-2 -0,070 -0,1118 -0,0289 0,0014
Dif. 1-3 -0,072 -0,1122 -0,0322 0,0008
1 0,130 0,0969 0,1640
2 0,194 0,1720 0,2161
ADWG (DOF+0 a DOF+20**)
3 0,197 0,1773 0,2162
Dif. 1-2 -0,064 -0,1039 -0,0233 0,0028
Dif. 1-3 -0,066 -0,1052 -0,0275 0,0013
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo. ** el peso en DOF+0 se uso como covariable
Observaciones y diagnosticos de autopsias de lechones
Los fetos anotados como nacidos muertos, momias o aplastados en el parto se confirmaron en la autopsia como clasificados correctamente, con excepcion de 8 fetos. Dos fetos de control de exposicion se anotaron como nacidos muertos (40-S1, 66-S1), pero los resultados de la autopsia revelaron pulmones hinchados que indica que estuvieron vivos en el momento del nacimiento. Dos fetos de control de exposicion se anotaron como aplastados (1-C1, 79-C2), pero los resultados de la autopsia revelaron pulmones no hinchados para ambos fetos, que indica que no respiraron. Un feto de titulo bajo se anoto como nacido muerto (85-S2), pero los resultados de la autopsia revelaron pulmones hinchados que indica que el lechon estaba vivo en el momento del nacimiento. Tres lechones de titulo alto se anotaron como aplastados (36-C1, 36-C2, 65-C1), pero los resultados de la autopsia revelaron pulmones no hinchados para ambos fetos, que indica que no respiraron. Debido al bajo numero de fetos incorrectamente anotados en el momento del parto, no se hicieron cambios en los analisis de rendimiento de las cerdas jovenes.
Un lechon del control de exposicion 102-428 murio posteriormente a la recogida de sangre, que se confirmo por autopsia.
Resultados de qPCR de pulmones de lechones
De los fetos y lechones muertos a los que se les practico la autopsia, los resultados de qPCR de pulmones medios fueron 4,68, 4,09, 3,55 y 0,0 log-io GE/ml para los grupos de control de exposicion, de titulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente. No se realizaron analisis estadfsticos en estos datos.
Un resumen de los resultados de qPCR del PRRSv en los pulmones por grupo (log™ GE/ml) se muestra a continuacion en la Tabla 6.27.
Tabla 6.27: Resumen de los resultados de qPCR del PRRSv en los pulmones de lechones por grupo (log10 GE/ml)
Grupo
N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media
1
141 0,00 7,95 5,140 4,810 5,390 2,990 4,676
2
79 0,00 7,45 4,780 3,000 5,260 2,620 4,092
3
75 0,00 6,84 4,220 3,000 5,100 5,620 3,547
4
4
0,00 0,00 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000
*Grupo 1 = grupo de control de exposicion; Grupo 2 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo bajo; Grupo 3 = grupo de MLV contra el PRRSV 94881 de titulo alto; Grupo 4 = grupo de control negativo
Discusion/conclusion
Para lograr el objetivo del estudio, cuatro grupos de cerdas jovenes susceptibles a PRRS se incluyeron en el diseno del estudio en d0: un grupo de control de exposicion que recibio producto de control (Grupo 1); un grupo de vacunas de titulo bajo que recibio 1 x 10243 TCID50 de MLV contra el PRRSV 94881 (IVP n° 1, Grupo 2); un grupo de vacunas de titulo alto que recibio 1 x 10390 TCID50 de MLV contra el PRRSV 94881 (IVP n° 2, Grupo 3); y un grupo de control negativo (Grupo 4) que tambien recibio producto de control. Cada tratamiento se administro como una dosis de 2,0 ml IM aproximadamente 28 dfas antes del celo (D0).
Para determinar la dosis de inmunizacion minima de MLV contra el 94881 del PRRS, los dos grupos de titulos de vacunas y el grupo de control de exposicion se expusieron en D118 (aproximadamente 90 dfas de gestacion) a una cepa aislada europea heterologa del PRRSv (cepa aislada 190136) y se evaluaron despues de la exposicion para el porcentaje y numero de lechones vivos por camada en el nacimiento (dfa de parto, DOF) y el porcentaje y numero de lechones vivos por camada a los 21 dfas de edad (DOF +21).
Validacion del estudio (Grupo de control negativo 4)
Para garantizar que las cerdas jovenes fuente estuvieron libres del PRRSv y que no se produjo exposicion externa al
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PRRSv o contaminacion cruzada entre los grupos de tratamiento y de control durante el estudio, un grupo de control negativo (Grupo 4) se incluyo en el diseno del estudio. Las cerdas jovenes de control negativo fueron negativas para anticuerpos del PRRS durante todo el estudio. Ademas, este grupo de cerdas jovenes y su progenie tambien fueron negativos para viremia del PRRSv (qPCR) en todos los momentos de tiempo probados, con excepcion del n° 108 en DOF+7. La cerda joven n° 108 fue “positiva” en DOF+7, mientras que negativa por qPCR en todos los otros momentos de tiempo y sus lechones tambien fueron negativos para ARN del PRRSv. Este resultado se considero un error debido a una contaminacion de muestras y no debido a infeccion por PRRSv. Estos resultados soportan que el grupo de control negativo siguio estando libre de infeccion por PRRS durante el estudio y valido los resultados de este ensayo.
Validacion del modelo de exposicion reproductiva del PRRSv (Grupo de control de exposicion 1)
Es necesario un modelo de exposicion que implique una cepa derivada de EU virulenta del PRRSv que induzca enfermedad clinica del PRRS suficiente y reproducible para evaluar adecuadamente la eficacia de la vacuna contra el PRRS en un entorno de laboratorio. Tras la inoculacion con la cepa aislada del PRRS europea 190136 (1 x 10630 TCID50/6 ml), el grupo de control de exposicion solo presento 54,4% de lechones vivos por camada en el nacimiento (93,0% para el grupo de control negativo), 17,5% y 28,1% por camada de nacidos muertos y momias, respectivamente (7,0% y 0,0%, respectivamente, para el grupo de control negativo), 91,6% de los lechones por camada presento enfermedad clinica durante al menos un dfa de DOF+1 a DOF+20 (3,2% lechones por camada para el grupo de control negativo), una media de 2,9 lechones vivos por camada a los 20 dfas de edad (una media de 10,8 para el grupo de control negativo) y 86,3% de los lechones por camada viremicos en el nacimiento (0% para el grupo de control negativo). Estos resultados ponen de relieve que se indujo enfermedad clinica espedfica del PRRS grave en el grupo de control de exposicion sin vacunar de cerdas jovenes y su progenie, validandose asf este modelo de exposicion como una herramienta de laboratorio clmico adecuada para evaluar la eficacia de la vacuna contra el PRRS y mas espedficamente la MID de MLV contra el PRRSV 94881 en cerdas jovenes.
Determinacion de la dosis de inmunizacion minima de MLV contra el PRRSV 94881 en cerdas jovenes (dosis de vacunas de titulos bajo y alto; Grupos 2-3)
La determinacion de la MID de MLV contra el PRRSV 94881 en cerdas jovenes se baso en el grupo de vacunas que recibio el menor titulo de vacuna que produjo mayores porcentajes o numero de lechones vivos por camada en el nacimiento y mayores porcentajes o numero de lechones vivos por camada a los 20 dfas de edad despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion.
Los lechones vivos por camada (tanto porcentaje como numero) en el parto se seleccionaron como uno de los dos criterios clave para determinar la MID de MLV contra el 94881 del PRRS. El primer criterio clave se baso en el hecho de que la infeccion por PRRSv en cerdas jovenes prenadas y cerdas produce normalmente lechones nacidos muertos y momias, con bajos numeros de lechones vivos en el parto. Los lechones vivos por camada en el nacimiento se definieron como la suma de lechones vivos sanos, vivos debiles y aplastados-mortalidad en el parto. Los lechones anotados como aplastados o mortalidad se incluyeron en la categona de “vivos” porque los hallazgos de la autopsia confirmaron que estos lechones estuvieron vivos en el nacimiento y murieron poco despues debido a traumatismo. Tanto los grupos de titulo bajo como de titulo alto presentaron porcentajes significativamente mayores de lechones vivos por camada en el parto en comparacion con el control de exposicion (P<0,0455), por tanto, se cumplio este criterio para la eficacia de la vacuna. Aunque no se detectaron diferencias significativas entre los grupos de vacunas de titulo bajo y alto y el grupo de control de exposicion con respecto al numero medio de lechones vivos por camada en el parto (P>0,1857), los grupos de titulo bajo y de titulo alto presentaron numeros medios considerablemente mayores de lechones vivos por camada en el parto (media 8,3 y 8,6 lechones por camada, respectivamente) en relacion con el grupo de control de exposicion (media 6,5 lechones por camada), proporcionandose asf mas pruebas y apoyo de que se observo un efecto de tratamiento con la vacuna beneficioso en estos animales despues de la exposicion.
Los lechones vivos por camada (tanto porcentaje como numero) a los 20 dfas de edad fue el segundo criterio para determinar la MID de MLV contra el PRRSV 94881 debido a que la inmunidad del PRRS en cerdas jovenes influira intrauterinamente infeccion de lechones y la propagacion del virus de cerdas jovenes a lechones vivos. Los lechones infectados con PRRS intrauterinamente y los nacidos vivos o infectados con PRRS virulento despues del parto por propagacion de la cerda joven normalmente mueren antes del destetamiento secundario al PRRS. En este estudio, el grupo de control de exposicion, de titulo bajo, de titulo alto y de control negativo presento 43,6%, 73,8%, 83,8% y 100% de lechones vivos por camada, respectivamente, a los 20 dfas de edad (P<0,0203). Asimismo, los grupos de control de exposicion, de titulo bajo, de titulo alto y de control negativo tuvieron un numero medio de 2,9, 6,2, 6,9 y 10,8 lechones por camada, respectivamente, a los 20 dfas de edad (P<0,0063). Ambos grupos de vacunas tuvieron significativamente mayor porcentaje y numero de lechones vivos en el destetamiento (P<0,0203), por tanto, se cumplio este criterio del objetivo del estudio.
Otros analisis de los datos del parto revelaron mas informacion que soporta la eficacia de la vacuna tras la exposicion al PRRSv, especialmente con respecto al grupo de titulo alto. El grupo de titulo alto presento estadfsticamente un mayor porcentaje y un mayor numero medio de lechones sanos en el nacimiento (P<0,0211); mientras que presento porcentajes significativamente menores y numeros medios de fetos debiles y momificados
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(P<0,0090) en comparacion con el grupo de control de exposicion. Estos datos soportan que la dosis de vacuna alta induce inmunidad protectora contra una cepa de exposicion del PRRSv virulenta y heterologa. El grupo de titulo bajo tambien presento eficacia de la vacuna en el parto, como es evidente por un mayor porcentaje de lechones sanos vivos por camada (P=0,0138) y porcentajes y numero medios significativamente menores de fetos momificados (P<0,0190). En cambio, no se detectaron diferencias entre grupos para el porcentaje o numero de fetos nacidos muertos o aplastados/mortalidades en el parto (P>0,1681).
Siete dfas despues de la exposicion (D125), los grupos de titulo bajo y de titulo alto tuvieron porcentajes significativamente menores de cerdas jovenes positivas para ARN del pRrSv por pruebas de qPCR, ademas de carga vmca significativamente menor para ambos grupos en comparacion con el grupo de control de exposicion (P<0,0001). Estos datos soportan adicionalmente que ambos niveles de dosis de vacuna indujeron inmunidad adecuada en cerdas jovenes para reducir significativamente la replicacion vmca tras la exposicion. Asimismo, los grupos de titulo bajo y alto tuvieron porcentajes significativamente menores de cerdas jovenes positivas por qPCR en DOF 0 y DOF+13, ademas de menor carga vmca para ambos grupos en estos dfas del estudio (P<0,0155). El grupo de titulo bajo tuvo significativamente menor porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR y menor carga vmca en D132 (P<0,0290); mientras que no se detectaron diferencias estadfsticas entre el grupo de titulo alto y de control de exposicion para el mismo conjunto de parametros (P>0,1144). No se detectaron diferencias estadfsticas entre grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion para el porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR o la carga vmca en DoF+7 y DOF+20 (P>0,1719).
Normalmente, el PRRSv no induce enfermedad clinica en cerdas jovenes y cerdas, distinta de aborto. En este estudio, el 25%, 25%, 38% y 60% de las cerdas jovenes de control de exposicion, de titulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente, presentaron enfermedad clinica (recibieron una puntuacion de observacion clinica > 0) durante al menos un dfa despues de la exposicion. No se detectaron diferencias significativas entre los grupos de vacunas y el grupo de control de exposicion con respecto al porcentaje de cerdas jovenes con enfermedad clinica durante al menos un dfa de D116 a DOF +20 (P>0,7043). Las cerdas jovenes que presentaron alguna forma de enfermedad clinica lo hicieron en el peri-parto y no inmediatamente despues de la exposicion. El alto porcentaje de cerdas jovenes de control negativo (60%) que presento enfermedad clinica y el hecho de que la enfermedad clinica no fuera principalmente aproximadamente en el momento del parto para todos los grupos en este estudio soporta que la enfermedad clinica no se atribuyo a enfermedad del PRRS, sino a cambios fisiologicos asociados al parto.
Todas las cerdas jovenes en el estudio fueron seronegativas por ELISA para PRRS en D0, proporcionandose asf la confirmacion de los criterios de inclusion para los animales de prueba que entraron en el estudio. Asimismo, todas las cerdas jovenes fueron seronegativas por ELISA para PRRS en D7. Las cerdas jovenes vacunadas empezaron a presentar resultados seropositivos por ELISA para PRRS en D14 y los grupos de dosis baja y alta presentaron su mayor tasa de seroconversion de 65% y 60%, respectivamente, en D56 (P<0,0001). En cambio, el grupo de control de exposicion siguio siendo seronegativo por ELISA para PRRS hasta 7 dfas despues de la exposicion (D125). Desde D132 hasta la conclusion del estudio, todas las cerdas jovenes de titulo bajo, de titulo alto y de control de exposicion fueron seropositivas por ELISA para PRRS. El porcentaje de cerdas jovenes positivas para viremia despues de la vacunacion alcanzo su maximo en D7 para ambos grupos de vacunas como se demuestra por 50% y 36% para los grupos de titulo bajo y alto, respectivamente (P<0,0007). La viremia cayo rapidamente al 4% (1 de 28, el n° 64) y al 0% (0 de 28) para los grupos de titulo bajo y de titulo alto, respectivamente en D14 (P=1,0000 o no se realizo la prueba). La viremia siguio siendo 4% para los grupos de titulo bajo (1 de 28, el n° 56) y de titulo alto (1 de 28, el n° 91) en D21. En D56, una de 26 (4%, el n° 89) cerdas jovenes de titulo bajo y una de 25 (4%, el n° 66) cerdas jovenes de titulo alto fueron positivas para viremia. Todas las cerdas jovenes fueron negativas para viremia en D84 y D118.
No se detectaron diferencias significativas entre ambos grupos de titulos de vacunas y el grupo de control de exposicion con respecto al porcentaje de cerdas jovenes por grupo despues de la vacunacion con una evaluacion clinica anormal durante al menos un dfa de D1 a D113 (P=1,0000). Individualmente, solo tres cerdas jovenes presentaron alguna evaluacion anormal durante este periodo de tiempo. Dos cerdas jovenes presentaron cojera (una cerda joven de control de exposicion y una cerda joven de control negativo) y una cerda joven de titulo bajo presento hinchazon en la region izquierda del cuello. Como la vacuna se administro en la region derecha del cuello, no se observaron acontecimientos adversos asociados a esta vacuna.
Los resultados de viremia del PRRS en lechones sobre el DOF dieron adicionalmente la oportunidad de ver el nivel de proteccion en cerdas jovenes en la prevencion de infeccion placentaria cruzada de lechones. En el DOF, una media de 58,1% y 55,0% de los lechones por cerda joven en los grupos de titulo bajo y de titulo alto, respectivamente, fueron positivos por qPCR. En cambio, una media de 86,3% de los lechones por cerda joven en el grupo de control de exposicion fueron positivos por qPCR en suero/fluidos corporales, que fue significativamente superior a ambos grupos de vacunas (P<0,0381). Cuando se examino la carga vmca de los lechones en DOF 0, los lechones de titulo alto tuvieron significativamente menor carga vmca en comparacion con los lechones del control de exposicion (P=0,0030); mientras que no se detecto diferencia para la carga vmca entre lechones de titulo bajo y de control de exposicion (P=0,0620). Reducciones significativas (P<0,05) en el porcentaje de lechones por cerda joven positivos para viremia indican una reduccion de la transmision vertical del PRRSv virulento de cerda joven vacunada a cna cuando se inmuniza con cualquier dosis de MLV contra el PRRSV 94881 EU PRRS 94881. Ademas, el grupo de titulo alto tuvo una mediana del valor de lechon por qPCR por cerda joven de 3,00 log-iQ GE/ml en el DOF;
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mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana del valor de lechon por qPCR por cerda joven de 6,40 logio GE/ml en suero/fluidos corporales (P=0,0030). No se detecto diferencia significativa entre el grupo de dosis baja y el grupo de control de exposicion para la carga vmca de los lechones en DOF (P=0,0620). Los datos soportan adicionalmente la eficacia de la dosis alta de MLV contra el PRRSV 94881 cuando se administra a cerdas jovenes y cerdas.
Los grupos de tttulo bajo y de tttulo alto presentaron medias de 32,5% y 33,4%, respectivamente, para lechones por camada con enfermedad clmica (una puntuacion de observacion clmica de > 0) durante al menos un dfa de DOF+1 a DOF +20. Estos resultados fueron significativamente inferiores para el grupo de control de exposicion, que presento una media de 91,6% de lechones por camada para el mismo parametro (P<0,0001), soportando adicionalmente la eficacia de la vacuna para ambos niveles de dosis.
No se detecto diferencia significativa entre grupos para pesos corporales medios de lechones en DOF 0 (P>0,2972); mientras que ambos grupos de vacunas tuvieron pesos corporales significativamente mayores en DOF+20 y ADWG de DOF 0 a DOF+20 (P<0,0028). De nuevo, estos resultados soportan la eficacia de ambas dosis de MLV contra el 94881 del PRRS.
Los resultados de la autopsia confirmaron la correcta clasificacion de casi todos los fetos en el parto. Debido al numero muy pequeno de fetos que se anotaron como aplastados que fueron en realidad nacidos muertos y nacidos muertos que fueron en realidad aplastados en el parto, en comparacion con el numero total de fetos correctamente clasificados en el parto, no se hicieron cambios en los datos de rendimiento de las cerdas jovenes antes de analizarse. Un lechon de control de exposicion murio posteriormente a la recogida de sangre. Como esta situacion solo implico a un lechon en comparacion con el gran numero total de lechones en el grupo de control de exposicion, este lechon no se elimino de los analisis.
Las muestras de pulmon se recogieron de 141, 79, 75 y 4 fetos/lechones muertos de los grupos de control de exposicion, de tttulo bajo, de titulo alto y de control negativo, respectivamente. Se determino un valor de pulmon por qPCR medio de 4,68, 4,10, 3,55 y 0,00 log10 GE/ml para los grupos de control de exposicion, de tttulo bajo, de tttulo alto y de control negativo, respectivamente. No se realizaron analisis en estos datos ya que a los lechones vivos a los 20 dfas de edad no se les hizo la autopsia, pero estos resultados ponen de relieve que las cerdas jovenes vacunadas con MLV contra el PRRSV 94881 produjeron menor carga vmca en los pulmones de lechones cuando las cerdas jovenes se expusieron a un PRRSv virulento.
En conclusion, los resultados de este estudio demostraron porcentajes significativamente mayores de lechones vivos por camada en el parto (P<0,0455) y mayores porcentajes y numeros de lechones por camada en el destetamiento (P<0,0203) para ambos grupos de vacunas en comparacion con el grupo de control de exposicion. Por tanto, se cumplio el objetivo del estudio y los datos de este estudio establecen la MID de MLV contra el PRRSV 94881 en cerdas jovenes como 1 x 10243 TCID50/2 ml. Estos resultados se alcanzaron 118 dfas despues de la vacunacion, que ademas establece la duracion de la inmunidad (DOI) en cerdas jovenes en aproximadamente 4 meses.
Cuando se examinaron los datos de apoyo, la dosis alta de MLV contra el PRRSV 94881 (1 x 10390 TCID50/2 ml) se asocio a un mayor porcentaje y numero de lechones sanos por cerda joven en el parto (P<0,0211), un menor porcentaje y numero de fetos debiles y momificados (P<0,0090), un menor porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR y menor carga vmca en cerdas jovenes despues de la exposicion en D125, DOF 0 y DOF+13 (P<0,0155), un menor porcentaje de lechones por cerda joven positiva por qPCR y menor carga vmca en lechones en DOF 0 (P<0,0030), un menor porcentaje de lechones por cerda joven con enfermedad clmica (P<0,0001) y mayores pesos corporales de los lechones en DOF+20 y ADwG (P<0,0013).
El grupo de dosis baja se asocio a un mayor porcentaje de lechones sanos por cerda joven en el parto (P=0,0138), un menor porcentaje y numero de fetos momificados (P<0,0190), un menor porcentaje de cerdas jovenes positivas por qPCR y menor carga vmca en cerdas jovenes despues de la exposicion en D125, D132, DOF 0 y DOF+13 (P<0,0290), un menor porcentaje de lechones por cerda joven positiva por qPCR en DOF 0 (P=0,0381), un menor porcentaje de lechones por cerda joven con enfermedad clmica (P<0,0001) y mayor peso corporal de los lechones en DOF+20 y ADWG (P<0,0028).
Ejemplo 7 Evaluacion de la aparicion de inmunidad de MLV contra el PRRSV 94881 en lechones susceptibles tras la exposicion a una cepa aislada europea heterologa del PRRS dos semanas despues de la vacunacion
El objetivo de este estudio de exposicion a vacunacion fue evaluar la aparicion de inmunidad (OOI) dos semanas despues de la administracion del candidato a vacuna contra el smdrome reproductor y respiratorio porcino, la cepa aislada derivada de europea 94881, virus vivo modificado (MLV contra el 94881 del PRRS), en lechones susceptibles de 14 ± 3 dfas de edad. El criterio de eficacia primaria para satisfacer una OOI de 2 semanas despues de la vacunacion fue si el grupo vacunado (Grupo 1) demostro una diferencia significativa (p<0,05) para lesiones pulmonares despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion sin vacunar (Grupo 2). Los parametros secundarios incluyeron evaluaciones clmicas despues de la vacunacion, observaciones clmicas despues de la exposicion, temperaturas rectales, aumento de peso diario promedio, evaluacion de anticuerpos del PRRS y viremia en muestras de suero y cuantificacion del virus PRRS en muestras de pulmon recogidas en la
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autopsia.
Los lechones se asignaron aleatoriamente a cualquier Grupo 1 (vacuna MLV contra el PRRSV 94881 que contiene 1 x 10382 TCID50/ml y expuesto; n=20), Grupo 2 (vacuna de placebo y expuesto; n=20) o Grupo 3 (vacuna de placebo y no expuesto; n=10). Los lechones se alojaron en corrales de plastico con suelos elevados (n=5/corral). Cada grupo de tratamiento se alojo en una habitacion diferente para evitar la transmision del PRRSv por v^as mecanicas, que incluyen aerosolizacion.
Todos los animales asignados a este estudio completaron el estudio. No se informaron acontecimientos adversos durante este estudio. Las puntuaciones de lesion pulmonar medias en D24 fueron 27,4% y 54,8% para los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y los controles de exposicion, respectivamente. La puntuacion de lesion pulmonar media para los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 fue significativamente menor que la de los controles de exposicion (p=0,0002) y, por tanto, se cumplio la variable de eficacia primaria y la OOI se establecio en 2 semanas tras una unica vacunacion. Una proporcion significativamente mayor de cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron tttulos de anticuerpos del PRRS positivos en D14, D17 y D21 en comparacion con los controles de exposicion (p<0,0012). El ABC media para viremia fue significativamente menor para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 en comparacion con los controles de exposicion para D17- D24 (50,72 y 54,61 log-io GE/ml, respectivamente; p=0,0039) despues de la exposicion. Los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 no presentaron signos de letargo (0%) despues de la exposicion en comparacion con 45% de los cerdos del control de exposicion (p=0,0012). Los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron mayores aumentos de peso durante la fase despues de la exposicion (SD 14-SD 24) del estudio en comparacion con los controles de exposicion (0,3 y 0,1 kg, respectivamente; p=0,0003).
La significativa reduccion (p<0,05) de las lesiones pulmonares, signos clmicos, replicacion del virus en la sangre y los pulmones despues de la exposicion, ademas de la mejora de los rendimientos de crecimiento en animales vacunados, demuestra la eficacia de la vacuna contra el PRRSv virulento cuando la exposicion se realiza 2 semanas despues de la vacunacion. Por tanto, soporta la demostracion de una aparicion de inmunidad al menos 2 semanas despues de la vacunacion con MLV contra el 94881 del PRRS.
Objetivos/fin del estudio
El objetivo de este estudio de exposicion a vacunacion fue evaluar la aparicion de inmunidad (OOI) dos semanas despues de la administracion del candidato a vacuna contra el smdrome reproductor y respiratorio porcino, cepa aislada derivada de europea 94881, virus vivo modificado (MLV contra el 94881 del PRRS), en lechones susceptibles de 14 ± 3 dfas de edad. El criterio de eficacia primaria para satisfacer una OOI de 2 semanas despues de la vacunacion fue si el grupo vacunado (Grupo 1) demostro una diferencia significativa (p<0,05) para lesiones pulmonares disminuidas despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion sin vacunar (Grupo 2).
Los parametros de eficacia secundarios analizados entre el grupo de vacunas y el grupo de control de exposicion incluyeron evaluaciones clmicas despues de la vacunacion, serologfa del PRRS, viremia del PRRS despues de la exposicion, observaciones clmicas despues de la exposicion, aumento de peso diario promedio (ADWG), temperaturas rectales y cuantificacion del PRRSv en los pulmones.
Un grupo de control negativo (Grupo 3), que no se vacuno ni se expuso, se incluyo en el estudio para demostrar que la piara fuente estuvo libre de infeccion por PRRSv durante el periodo de ensayo y que la bioseguridad no se infringio durante este ensayo.
Programa de acontecimientos
Tabla 7.1 Programa de acontecimientos
Dia de estudio
Fechas Acontecimiento clave del estudio
-8
14-Dic-09 Cribado para estado por ELISA del PRRS negativo
-1
21-Dic-09 Llegada a VRI; examen de salud
-1 a 12
21-Dic-09 a 03- Ene-10 Evaluaciones clmicas
0
22-Dic-09 Recogida de pesos corporales Vacunacion del Grupo 1 con IVP, vacunacion de los Grupos 2 y 3 con CP
7
29-Dic-09 Muestra de sangre
13 a 24
04-Ene-10 a 15-Ene-10 Observaciones clmicas y temperaturas rectales
14
05-Ene-10 Recogida de pesos corporales y muestra de sangre; Grupos de exposicion 1 y 2 con cepa aislada del PRRS europea heterologa
17 y 21
08-Ene-10 y Muestra de sangre
Dia de estudio
Fechas Acontecimiento clave del estudio
12-Ene-10
24
15-Ene-10 Sacrificio y autopsia de cerdos despues de la recogida de datos y muestras; puntuacion de pulmones para patolog^a; recogida de tejidos de pulmon
Diseno del estudio Tabla 7.2 Diseno del estudio
Grupo
Numero de lechones en D0 Tratamiento en D0 (14 ± 3 dias de edad) Exposicion en D14 con 1 ml/orificio nasal y 1 ml IM de PRRSv 205817 Sacrifico y autopsia en D24
1
20 1,0 ml IM de IVP (1 x 10382 TCID50/ml) Sf Sf
2
20 1,0 ml IM de producto de control (CP; placebo del mismo producto sin MLV contra el 94881 del PRRS) Sf Sf
3
10 1,0 ml IM de CP No Sf
5 Criterios de cegado
El investigador del estudio y los representantes fueron cegados a los grupos de tratamiento asignados durante la fase en vida del estudio. Para mantener este cegado, un individuo que no participo en las evaluaciones de los cerdos (es decir, evaluaciones clmicas, observaciones clmicas o autopsias) realizo la aleatorizacion y administro los tratamientos de IVP y CP asignados en D0. El personal del laboratorio de BIVI se cego al tratamiento que recibfa 10 cada cerdo mientras que realizaban sus tareas respectivas.
Materiales
Producto veterinario en investigacion (IVP) y producto de control (CP)
Tabla 7.3 IVP
Nombre del producto generico:
Smdrome reproductor y respiratorio porcino, virus vivo modificado
Cepa:
94881
Produccion y formulacion:
La produccion de BIVI produjo MLV contra el 94881 del PRRS, lote 390-005 (Apendice 4), segun el Resumen de produccion, codigo 19S1.U_ y el Dosier EU parte 2b. En D0, BIVI-Ames reconstituyo/diluyo la vacuna MLV contra el 94881 del PRRS, lote 390-005 (Apendice 4), con solucion salina tamponada con fosfato (PBS; lote 809003, Apendice 5) para formular el IVP, lote n° 257-086. Los registros de la formulacion transcrita para el IVP se presentan en el Apendice 7 (registros originales disponibles a peticion).
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. 2621 North Belt Highway St. Joseph, MO 64506, EE.UU.
Lote n°:
N257-086
Fecha de caducidad:
Se asigno una fecha de caducidad del 22-Dic-09 al IVP solo para fines de estudio.
Condiciones de almacenamiento:
Vacuna liofilizada: 2-8°C IVP rehidratado/diluido: 2-8°C o sobre hielo
Pruebas:
El lote 390-005 se probo por BIVI-QC segun el borrador del Resumen de produccion y el Dosier de EU parte 2F. Al principio y al final del metodo de la vacunacion se contacto con personal de BIVI- Ames. El personal de laboratorio de BIVI-Ames probo antes de y despues de la vacunacion almuotas para el IVP para el tttulo de virus segun el Metodo de tttulos de PRRSv (Apendice 1, Anexo 6).
Resultados de las pruebas:
Serie 390-005: Los resultados fueron satisfactorios (Apendice 4). Lote de IVP N257-086: Tftulo medio de 1 x 10382 TCID50/ml (Apendice 7).
Retencion de IVP:
IVP se formulo solo para este estudio y no se retuvo.
Tabla 7.4 CP
Nombre del producto generico:
Placebo
Formulacion:
La produccion de BIVI produjo producto de placebo liofilizado que contema material inerte comprendido en la serie de vacuna sin MLV contra el PRRSV 94881 (lote N240-191-062409, Apendice 6). En D0, BIVI-Ames reconstituyo el lote N240-191-062409 con solucion salina tamponada con fosfato (PBS; lote 809-003, Apendice 5) para formular el CP, lote n° 257-085. Los registros de la formulacion transcrita para el CP se presentan en el Apendice 7 (registros originales disponibles a peticion).
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. 2621 North Belt Highway St. Joseph, MO 64506, EE.UU.
Numero de lote:
N257-085
Fecha de caducidad:
Se asigno una fecha de caducidad del 22-Dec-09 al CP solo para fines de estudio.
Condiciones de almacenamiento:
Vacuna liofilizada: 2-8°C CP rehidratado: 2-8°C o sobre hielo
Pruebas:
CP se probo por BIVI-QC para esterilidad segun EP segun el Resumen especial n° 96 (Apendice 1, Anexo 5).
Resultados de las pruebas:
Se determino que CP era esteril (Apendice 7).
Retencion de CP:
CP se formulo solo para este estudio y no se retuvo.
Material de exposicion 5 Tabla 7.5 Material de exposicion
Nombre/numero de cepa aislada
Cepa aislada del PRRS 205817
Localizacion y fecha de aislamiento, incluidos smtomas clmicos
La cepa aislada del virus PRRS europeo 205817 se derivo de la cepa aislada 190136 originariamente obtenida de tejido de pulmon de un lechon recien nacido de una granja que mostraba signos reproductivos tfpicos de PRRS (abortos en cerdas y debilidad en lechones recien nacidos) durante un brote en baja Sajonia, Alemania, en abril de 2004. Los veterinarios enviaron las muestras de pulmon a BioScreen (la muestra llego el 21 de abril de 2004) para pruebas de diagnostico. La cepa aislada n° 190136 se propago directamente en celulas MA 104 y para su uso en futuros ensayos clmicos en BIVI se preparo una disolucion madre de exposicion de cultivo puro. Un cultivo puro de la cepa aislada 190136 se uso para inocular cerdos para la evaluacion de su capacidad para reproducir la enfermedad respiratoria espedfica para PRRS en un ensayo de laboratorio controlado. Los animales expuestos presentaron dificultades respiratorias y revelaron pruebas de neumoma intersticial tras el examen histopatologico. Al virus PRRS que se volvio a aislar satisfactoriamente de lesiones pulmonares se le dio la designacion de cepa aislada 205817. La cepa aislada 205817 se propago directamente en celulas MA104 y para su uso en futuros ensayos clmicos de BIVI se preparo una disolucion madre de exposicion de cultivo puro.
Formulacion:
El virus de exposicion se descongelo y se diluyo con MEM (medio esencial mmimo) a un tttulo elegido como diana de aproximadamente 1 x 106 TCID50/3 ml en D14. Se preparo un volumen adecuado de material de exposicion. Se tomaron dos almuotas del material de exposicion.
Numero de lote:
N257-093
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. - EE.UU.
Condiciones de almacenamiento
Se almaceno material de exposicion a granel a -70 ± 10°C. Una vez preparado, el material de exposicion diluido se mantuvo sobre hielo hasta que se administro.
Pruebas:
Al principio y al final del metodo de exposicion se contacto con BIVI-Ames. El personal del laboratorio de BIVI-Ames probo antes y despues de la exposicion almuotas para el tttulo de virus segun el Metodo de tttulos de PRRSv
Resultados de las pruebas:
El material de exposicion tuvo un tftulo medio de 1 x 10471 TCID50/3 ml de dosis
Via de administracion
1,0 ml/orificio nasal y 1,0 ml IM en el cuello izquierdo (administrado a todos los cerdos en los Grupos 1 y 2 en D14).
Retencion del material de exposicion:
El material de exposicion solo se formulo para este estudio y no se retuvo.
Tratamientos
Justificacion de la dosificacion
El IVP se administro como una dosis de 1,0 ml a cerdos asignados para evaluar la OOI de MLV contra el PRRSV 5 94881 2 semanas despues de la vacunacion. El CP se administro como una dosis de 1,0 ml a los Grupos 2 y 3 como
una vacuna de placebo.
Pauta de dosificacion
IVP o CP se administro a un cerdo asignado en la region derecha del cuello IM en D0 usando una jeringuilla Luer- lock esteril de 3,0 ml y una aguja esteril 20g x 1 pulgada (2,54 cm) o 18g x % pulgada (1,91 cm) por una persona que 10 no recogfa datos del estudio. La pauta de dosificacion se muestra a continuacion en la Tabla 7.6.
Tabla 7.6 Pauta de dosificacion
Grupo
Numero Tratamiento DosisMa Dia de estudio
1
20 IVP 1,0 ml IM D0
2
20 CP 1,0 ml IM D0
3
10 CP 1,0 ml IM D0
Informacion sobre los animales Detalles de los animales del estudio Tabla 7.7 Informacion sobre los animales
Fuente:
Wilson Prairie View Farm N5627 Highway DD Burlington, WI 53105 EE.UU.
Numero de lechones:
50
Fecha de llegada:
Los cerdos llegaron a las instalaciones de Veterinary Resources, Inc. (VRI) Cambridge el 21 de diciembre de 2009 (D-1).
Tratamiento a la llegada:
A los 50 cerdos asignados al estudio se les administro EXCEDE® a la dosis de etiqueta IM en el jamon derecho despues de la llegada.
Identificacion:
Oreja etiquetada individualmente con un unico numero
Especie:
Porcina
Raza:
Cruzada comercial
Sexo:
Mezclado (hembras y machos castrados)
Intervalo de edad:
11 a 17 dfas de edad en D0
Intervalo de peso:
3,2 a 5,5 kg en D0
Propietario de los animales de prueba:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.
Estado fisiologico:
En D-1, los cerdos seleccionados para la asignacion al estudio fueron observados por el investigador del estudio y determino que estaban en buen estado de salud y nutricional. Las observaciones se registraron en el cuaderno de recogida de datos del examen de salud del animal.
Asignaciones de cerdos a grupos
Grupo 1 (n=20): 55, 56, 60, 72, 75, 76, 77, 83, 87, 91, 99, 102, 116, 117, 124, 141, 142, 144, 156y162 Grupo 2 (n=20): 57, 61, 62, 68, 78, 81, 86, 89, 97, 110, 129, 132, 135, 150, 152, 154, 160, 165, 167 y 168 Grupo 3 (n=10): 51, 69, 80, 85, 104, 105, 128, 131,133y155
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Criterios de inclusion/exclusion
Todos los lechones enrolados en este estudio fueron negativos por ELISA para PRRS y estaban sanos en el momento de la vacunacion como se ha determinado por observacion.
Criterios de eliminacion despues de la inclusion
No se eliminaron cerdos del estudio.
Manipulacion y alojamiento de los animales
Alojamiento de los animales
Los lechones se alojaron en Veterinary Resources, Inc. (VRI) en Cambridge, IA, durante la duracion del estudio. Los grupos 1, 2 y 3 se alojaron en habitaciones uniformes pero separadas para garantizar la bioseguridad. Los lechones se alojaron en multiples corrales (5 lechones/corral) dentro de cada habitacion. El Grupo 1 se alojo en 4 corrales en la Habitacion 5, el Grupo 2 se alojo en 4 corrales en la Habitacion 6 y el Grupo 3 se alojo en 2 corrales en la Habitacion 4. Los corrales estaban constituidos por cubas de plastico sobre bases elevadas con revestimiento del suelo de pizarra de plastico. Cada corral contuvo un comedero de 6 orificios de plastico y un bebedero de boquilla. Cada habitacion de aislamiento se construyo identica a las otras y todas cumplen el nivel de biorriesgo 2 (BL2), se filtran con Hepa, se ventilan mecanicamente con control de temperatura regulado por termostato.
El aislamiento del grupo de tratamiento fue necesario en este estudio ya que es muy conocido dentro de la comunidad cientifica que el PRRSv se propaga facilmente de cerdo a cerdo por diversos mecanismos que incluyen la aerosolizacion. Esto incluye vacunas contra el PRRS vivas avirulentas ya que estos productos biologicos incluyen partfculas vmcas atenuadas que imitan las caractensticas del PRRS natural virulento sin la capacidad para producir enfermedad. Los metodos apropiados fueron in situ para garantizar que se mantema la bioseguridad y que los animales vacunados no se contaminaban accidentalmente de forma cruzada con animales de control negativo sin tratamiento previo contra el PRRSv no vacunados. El personal de la instalacion de prueba tomo medidas apropiadas para limpiar y desinfectar adecuadamente cada habitacion antes de su uso para este estudio.
Cada habitacion en la instalacion tiene ventiladores y calefactores para ayudar en la suficiente circulacion y el calentamiento del aire. El sistema de ventilacion es separado aunque identico para cada habitacion, por lo que el aire no es compartido entre habitaciones.
El pienso solido se almaceno en bolsas, libres de bichos. El agua estaba a voluntad. Los lechones se alimentaron con una racion comercial (Lean Metrics Infant, Purina Mills, St. Louis, MO) medicada con tiamulina (35 g/ton) y clortetraciclina (400 g/ton) a voluntad apropiada para su tamano, edad y condicion; segun practicas de cna de animales aceptables para la region. Los cerdos teman buen estado de salud y nutricional antes de iniciarse el estudio como se ha determinado por el investigador del estudio.
Durante el estudio se observaron animales seleccionados con una leve perdida de condicion corporal, aspecto despeinado del pelo, articulaciones hinchadas y grados variables de cojera. El investigador del estudio considero que todo esto eran condiciones no espedficas que comunmente se produdan en grupos de cerdos alojados en confinamiento. Tambien se anotaron tos, estornudos, respiracion rapida, disnea y letargo de leve a moderado en cerdos seleccionados despues de la exposicion y se consideraron signos clmicos tfpicos asociados a neumoma, aunque no espedficos para etiologfa. El investigador del estudio determino que no se requenan tratamientos concomitantes para ningun animal durante este estudio.
Todos los cerdos asignados a este estudio fueron desechados por incineracion comercial despues de la eutanasia y autopsia en D24. Ningun producto alimenticio de los animales enrolados en este estudio entro en la cadena alimentaria humana.
Evaluacion de la eficacia
Para evaluar la OOI de MLV contra el PRRSV 94881 2 semanas despues de la vacunacion, los Grupos 1 y 2 se expusieron en D14 y se evaluaron las lesiones pulmonares despues de la exposicion. Se logro una OOI de 2 semanas despues de la vacunacion cuando el Grupo 1 (dosis de inmunizacion minima de MLV contra el 94881 del PRRS) demostro una patologfa pulmonar significativamente disminuida (p<0,05) despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion (Grupo 2).
Los parametros de eficacia secundaria analizados entre el grupo de vacunas y el grupo de control de exposicion incluyeron evaluaciones clmicas despues de la vacunacion, observaciones clmicas despues de la exposicion, temperaturas rectales, peso corporal y aumento de peso diario promedio (ADWG), evaluacion de anticuerpos del PRRS y viremia en muestras de suero y cuantificacion del virus PRRS en muestras de pulmon recogidas en la autopsia.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Un grupo de control negativo (Grupo 3), que no se expuso, se incluyo en el estudio para demostrar que la piara fuente estaba libre de infeccion por PRRS y que la bioseguridad se mantema durante el estudio.
Criterios para una prueba valida
Se requirio que todas las muestras de suero antes de la compra y en D0 fueran negativas para anticuerpos del PRRS.
Las muestras de suero recogidas de los Grupos 2 y 3 hasta el dfa de la exposicion y del Grupo 3 hasta que se completara el estudio tuvieron que estar libres de anticuerpos del PRRS para que el estudio fuera valido.
Parametros de resultados primarios
La variable de eficacia primaria para la evaluacion estadfstica fue puntuaciones de lesion pulmonar totales en D24 del estudio.
Puntuaciones de lesion pulmonar total
En el Dfa 24, despues de recogerse y registrarse los datos y las muestras, todos los cerdos del estudio se sacrificaron siguiendo VRI SOP PRC1027 (Apendice 1, Anexo 8). A cada cerdo se le practico la autopsia segun VRI SOP PRC 1028. La cavidad toracica se expuso por un representante y se extrajeron el corazon y los pulmones. El investigador del estudio examino cada conjunto de pulmones, describio cualquier patologfa macroscopica observada y determino el % de patologfa para cada lobulo del pulmon. Las observaciones y los datos se registraron en el cuaderno de recogida de datos del informe de la autopsia. Para cada cerdo se determino una puntuacion de lesion pulmonar total usando la formula de EP.
Parametros de apoyo
Otros parametros que iban a analizarse entre el Grupo 1 y el Grupo 2 incluyeron evaluaciones clmicas despues de la vacunacion, serologfa del PRRS, viremia despues de la vacunacion, observaciones clmicas despues de la exposicion, ADWG, temperaturas rectales y cuantificacion del virus en los pulmones despues de la exposicion. Estos parametros se analizaron como parametros de apoyo y no sirvieron de parametros primarios para satisfacer el objetivo del estudio.
Evaluacion clmica
Todos los cerdos se observaron en los dfas expuestos en la Tabla 7.1 para evaluaciones clmicas despues de la vacunacion por el investigador del estudio o representantes. Las observaciones se registraron en el cuaderno de recogida de datos de las evaluaciones clmicas.
Serologfa del PRRS
Se recogio sangre venosa completa en los dfas expuestos en la Tabla 3. Brevemente, se recogieron aproximadamente 2-5 ml de sangre de cada lechon en un tubo(s) separador(es) de suero (SST) de tamano apropiado. Se registraron las recogidas de muestras Se registraron las recogidas de muestras en el cuaderno de recogida de datos de la recogida de muestras. Se dejo que la sangre coagulara a temperatura ambiente en los SST. Las muestras de sangre fueron llevadas a BIVI-Ames en el dfa de recogida y se completo el cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes. Las muestras de sangre se centrifugaron por BIVI-Ames y el suero se recogio, se fracciono y se transfirio a tubos apropiados. Cada tubo se etiqueto con el numero de ID del lechon, el numero de estudio, la fecha de recogida, el dfa de estudio y el tipo de muestra. En BIVI-Ames, un conjunto de muestras de suero se mantuvo a 2-8°C y el otro conjunto de muestras de suero se mantuvo a -70 ± 10°C.
Las muestras de suero recogidas los dfas 0, 7, 14, 17, 21 y 24 y mantenidas a 2-8°C se probaron por BIVI-Ames para anticuerpos del PRRS. Los resultados se informaron como negativos (relacion S/P de ELISA de < 0,4) o positivos (relacion S/P de ELISA de > 0,4).
Viremia del PRRS
El otro conjunto de muestras de suero recogido en los dfas 0, 7, 14, 17, 21 y 24 y mantenido a -70 ± 10°C en BIVI- Ames hasta que se completo la fase en vida del estudio.
Un cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes completo se incluyo con el envm. BioScreen probo las muestras de suero para ARN del PRRSv por qPCR. Los resultados se informaron como equivalente de genoma/ml (log GE/ml).
Observaciones clmicas despues de la exposicion
Los lechones se observaron para signos clmicos de enfermedad en los dfas expuestos en la Tabla 7.1. Las observaciones se realizaron por el investigador del estudio o representantes y se registraron en el cuaderno de
recogida de datos de las observaciones clmicas. Los lechones se observaron cada d^a para respiracion, comportamiento y tos basandose en el sistema de puntuacion de observaciones clmicas explicado a continuacion en la Tabla 7.8.
Tabla 7.8 Sistema de puntuacion de observaciones clmicas
Respiracion
Comportamiento Tos
0 = respiracion normal 1 = respiracion jadeante/rapida 2 = disnea 3 = muerto
0 = normal 1 = letargo de leve a moderado 2 = gravemente letargico o recostado 3 = muerto 0 = ninguna 1 = tos suave o intermitente 2 = tos aspera o grave, repetitiva 3 = muerto
5
Aumento de peso diario promedio (ADWG)
Los pesos corporales individuales se recogieron en los dfas expuestos en la Tabla 3. Cada cerdo se peso en una bascula calibrada por el investigador del estudio o representantes. Los resultados se informaron en kg en el cuaderno de recogida de datos del peso corporal. El aumento de peso diario promedio se determino de D0 a D14 y 10 de D14 a D24.
Temperaturas rectales
Las temperaturas rectales se recogieron por el investigador del estudio o representantes en los dfas expuestos en la Tabla 6.1. Las temperaturas rectales se registraron en °C en el cuaderno de recogida de datos de las observaciones clmicas.
15 Cuantificacion del virus PRRS en tejido de pulmon
Para cada conjunto de pulmones se retuvieron dos muestras de los lobulos apicales izquierdo y derecho, los lobulos cardfacos izquierdo y derecho, los lobulos diafragmaticos izquierdo y derecho y el lobulo intermedio. Cada muestra de pulmon tema aproximadamente 1 pulgada (2,54 cm) x 1 pulgada (2,54 cm). Para un conjunto de muestras de pulmon, las tres muestras del lado izquierdo se combinaron en un recipiente; mientras que las tres muestras del lado 20 derecho y la muestra del lobulo intermedio del pulmon se combinaron en otro recipiente. Cada recipiente se lleno con una cantidad suficiente de 10% de disolucion de formalina. Para el otro conjunto de muestras de pulmon, las tres muestras de pulmon del lado izquierdo se combinaron en un Whirlpak®; mientras que las tres muestras del lado derecho y la muestra del lobulo intermedio del pulmon se combinaron en otro Whirlpak®. Todos los recipientes y Whirlpak® se etiquetaron apropiadamente con el numero de animal, numero de estudio, fecha de recogida, dfa de 25 estudio, tipo de muestra y si las muestras son del lado izquierdo o derecho. Las muestras de pulmon en Whirlpak® se almacenaron sobre nieve carbonica hasta que se transportaron a BIVI-Ames, mientras que las muestras en formalina se almacenaron a temperatura ambiente. Las recogidas de muestras se registraron en el cuaderno de recogida de datos del informe de la autopsia. Las muestras de tejido de pulmon fijadas en formalina y las muestras de pulmon en Whirlpak® se transfirieron a BIVI-Ames. Un cuaderno de recogida de datos de la entrega de 30 espedmenes completo se incluyo con cada envfo.
Un cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes completo se incluyo con el envfo. BioScreen probo las muestras de pulmon para ARN del PRRSv por qPCR (Apendice 1, Anexo 7). Los tejidos de pulmon izquierdo se homogeneizaron y probaron. Los tejidos del pulmon derecho y las muestras del lobulo intermedio del pulmon se homogeneizaron y se probaron. Los resultados se informaron como equivalente de genoma (log GE/ml) para 35 muestras del pulmon izquierdo y derecho.
Acontecimientos adversos
No se informo de acontecimientos adversos durante este estudio.
Metodos estadfsticos Unidad experimental
40 Los grupos de tratamiento tuvieron que alojarse en habitaciones separadas en este estudio para evitar la transmision del PRRSv a grupos no vacunados. Por tanto, la habitacion fue la unidad experimental. Sin embargo, para los fines de este analisis se ignoro un posible debido a confundir los efectos de “habitacion” y “tratamiento”, y el lechon se uso como unidad experimental.
Aleatorizacion
45 Cincuenta (50) lechones se asignaron a bloques por peso (n=5 lechones/bloque). A cada cerdo se le asigno un numero aleatorio usando la funcion de numeros aleatorios en Excel. Dentro de cada bloque de peso, los cerdos se clasificaron en orden numerico ascendente del numero aleatorio asignado. Entonces, los grupos de tratamiento se
5
10
15
20
25
30
35
40
asignaron a cerdos en este orden numerico: los 2 numeros aleatorios mas bajos se asignaron al grupo 1, los 2 siguientes numeros se asignaron al grupo 2 y el numero mas alto se asigno al Grupo 3. Los Grupos 1 y 2 contuvieron cada uno 20 cerdos y el Grupo 3 contuvo 10 cerdos.
Analisis
Los analisis estadfsticos y los resumenes de datos se realizaron por Dr. rer. hort. Martin Vanselow, Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Alemania, +49(0) 511 606 777 650,
m.vanselow@t-online.de.
Los datos se analizaron suponiendo una estructura de diseno completamente aleatoria. Los analisis estadfsticos se realizaron usando la version del software SAS 8.2 (SAS, Cary, EE.UU./Carolina del Norte, SAS Institute Inc). Todas las pruebas en diferencias se disenaron como pruebas bilaterales a a = 5%.
Puntuaciones de lesion pulmonar total
La puntuacion de lesion pulmonar total en el dfa de la autopsia (D24) se midio como el porcentaje de implicacion pulmonar calculado segun la formula de ponderacion recomendada en el borrador de la monograffa Vacuna contra la neumoma enzootica porcina (inactivada). Esta formula tiene en cuenta el peso relativo de cada uno de los siete lobulos del pulmon. El porcentaje evaluado del area del lobulo del pulmon con lesiones tfpicas se multiplico por el factor respectivo por lobulo del pulmon dando la puntuacion de lesion pulmonar ponderada total. Los factores para los lobulos de pulmon respectivos se presentan en la Tabla 7.9.
Tabla 7.9 Factores para calcular las puntuaciones de lesion pulmonar
Lobulo del pulmon
Factor
Apical izquierdo
0,05
Cardfaco izquierdo
0,06
Diafragmatico izquierdo
0,29
Apical derecho
0,11
Cardfaco
0,10
Diafragmatico derecho
0,34
Accesorio/intermedio derecho
0,05
Los grupos de tratamiento se compararon en diferencias usando la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
Evaluacion clinica despues de la vacunacion
Se generaron tablas de frecuencias de animales con al menos un hallazgo positivo entre D1 y D12. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Serologfa del PRRS
Se generaron tablas de frecuencias de resultados positivos por ELISA. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Viremia del PRRS
Los datos de viremia se evaluaron por separado para cada dfa de investigacion. Adicionalmente, para la carga vmca se analizaron las areas bajo las curvas de respuesta individuales entre D14 y D24 (ABC D14-D24) y entre D17 y D24 (ABC D17-D24).
Los datos de PCR cuantitativa (carga vmca del PRRS [log-10 GE/ml]) se usaron para comparaciones entre los grupos de tratamiento por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. Antes de los calculos, el resultado analftico 'no detectado' se sustituyo por un valor de log-10 GE/ml de 0,0 y 'positivo' se sustituyo por 3,0. Los grupos de tratamiento se probaron en diferencias usando la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
Observaciones clmicas despues de la exposicion
Se generaron tablas de frecuencias de animales con al menos un hallazgo positivo entre D15 y D24. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Las puntuaciones maximas y las puntuaciones medias por animal de D15 a D24 para respiracion, comportamiento, tos y para los tres sumados juntos (total) se usaron para la evaluacion estadfstica. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
5
10
15
20
25
30
Peso corporal y aumento de peso diario promedio
Los aumentos de peso diarios individuals se calcularon para los periodos de tiempo entre D0 y D14 y entre D14 y D24. Para cada dfa de investigacion y para cada periodo de tiempo se calcularon las estadfsticas descriptivas. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron usando analisis de la varianza y posteriores pruebas de la t. Las medias por mmimos cuadrados de los grupos y las diferencias entre las medias por mmimos cuadrados con intervalos de confianza de 95% se calcularon a partir del analisis de la varianza.
Temperaturas rectales
Las diferencias entre los grupos de tratamiento con respecto a los datos de temperatura originales se probaron usando analisis de la varianza y posteriores pruebas de la t. Las medias por mmimos cuadrados de los grupos y las diferencias entre las medias por mmimos cuadrados con intervalos de confianza de 95% se calcularon a partir del analisis de la varianza.
Cuantificacion del virus PRRS en tejidos de pulmon
Los datos de PCR cuantitativa (carga vmca del PRRS [logio GE/ml]) de pulmones recogidos en D24 se usaron para comparaciones entre los grupos de tratamiento por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. Para la evaluacion se uso el promedio (logio GE/ml) de los resultados de qPCR del pulmon izquierdo y derecho. Antes de los calculos, el resultado analftico 'no detectado' se sustituyo por logio GE/ml de 0,0 y 'positivo' se sustituyo por 3,0.
Se generaron tablas de frecuencias de resultados por qPCR positivos. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Resultados
Puntuaciones de lesion pulmonar total
Un resumen de las puntuaciones de lesion pulmonar totales por grupo y del valor de p asociado se muestra a continuacion en la Tabla 7.10.
Tabla 7.10 Puntuaciones de lesion pulmonar totales (%)
Grupo1
N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
1
20 0,06 59,30 27,550 12,270 40,600 29,515 27,368 0,0002
2
20 13,86 91,60 55,200 47,300 66,500 21,850 54,841
3
10 0,00 0,06 0,000 0,000 0,000 0,000 0,006 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
Las puntuaciones de lesion pulmonar totales medias de lechones de D24 fueron 27,368% y 54,841% para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion, respectivamente. La puntuacion de lesion para los cerdos vacunados contra el PRRS fue significativamente menor que la puntuacion de lesion media para los controles de exposicion (p=0,0002).
Viremia del PRRS
Un resumen del ARN del PRRSv detectado en suero por datos de qPCR se muestra a continuacion en la Tabla 7.11.
Tabla 7.11 ARN del PRRSv detectado por qPCR en suero (log10 GE/ml) por dfa
Dia
Grupo1 N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
7
1 20 0,00 5,34 3,00 3,00 3,79 0,82 3,17 <0,0001
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
14
1 20 0,00 4,29 3,32 3,00 3,77 0,84 3,30 <0,0001
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
17
1 20 5,54 8,07 6,72 6,47 7,08 0,80 6,78 <0,0001
2
20 6,44 9,02 8,18 7,47 8,47 1,09 8,00
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
21
1 20 6,18 8,73 7,38 7,13 8,08 0,98 7,51 0,0565
5
10
15
20
25
30
2 20 7,22 8,86 7,87 7,62 8,11 0,57 7,88
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
24
1 20 5,82 8,54 7,15 6,73 7,84 1,16 7,26 0,6251
2
20 6,53 8,29 7,27 6,97 7,60 0,67 7,34
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
ABC 14-24
1 20 56,95 78,02 65,10 60,39 70,05 9,76 65,84 0,4945
2
20 58,74 74,30 67,02 64,38 68,24 4,83 66,61
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
ABC17-24
1 20 42,98 59,51 49,52 47,46 54,30 7,14 50,72 0,0039
2
20 49,08 60,99 54,35 52,93 55,38 3,63 54,61
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NI = no incluido en el analisis estadfstico. ABC = area bajo la curva; GE/ml por dfa
El ARN del PRRSv no se detecto en el suero de ningun lechon en D0. Los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron valores medios de 3,17 y 3,30 logio GE/ml en D7 y D14, respectivamente. Los valores fueron significativamente superiores a los controles de exposicion en ambos dfas (p<0,0001), ya que los controles de exposicion no tuvieron ARN del PRRSv detectado hasta D17. En ese dfa, los valores medios fueron 6,78 y 8,00 log1o GE/ml para lechones vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion, respectivamente. El valor de D17 para controles de exposicion fue significativamente mayor que para los lechones vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 (p<0,000l). Los valores medios para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 en D21 y D24 fueron 7,51 y 7,26 log1o GE/ml en D21 y D24 respectivamente, en comparacion con 7,88 y 7,34 log1o GE/ml para controles de exposicion en los mismos dfas. No hubo diferencias significativas entre cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 en D21 o 24 (p>0,0565). No se detecto ARN del PRRSv en suero de ningun cerdo de control negativo durante este estudio.
No hubo diferencias entre el ABC 14-24 para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y cerdos del control de exposicion (65,84 y 66,61, respectivamente; p=0,4945). Los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron un ABC significativamente menor para D17-D24 en comparacion con los controles de exposicion (50,72 y 54,61, respectivamente; p=0,0039).
Cuantificacion del virus PRRS en tejidos de pulmon
Los resultados individuales de qPCR del PRRSv de tejidos de pulmon recogidos en la autopsia en D24 se presentan en el Apendice 1, Tabla 30. Un resumen del ARN del PRRSv detectado en tejidos de pulmon por datos de qPCR se muestra a continuacion presentado en la Tabla 7.12 y un resumen de la frecuencia de animales con qPCR positiva en la autopsia se muestra a continuacion en la Tabla 7.13.
Tabla 7.12 Aislamiento del virus de los pulmones, qPCR (log10 GE/ml medio) en la autopsia (D24)
Grupo1
N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
1
20 6,63 8,26 7,46 7,07 7,86 0,84 7,47 0,0101
2
20 6,55 8,67 7,99 7,69 8,14 0,54 7,88
3
10 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NA = no aplicable debido a la falta de variabilidad. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
Tabla 7.13 Frecuencia de animales con posible ARN del PRRSv, PCR de tejidos de pulmon recogidos en la autopsia (D24)
Dia
Grupo N % IC de 95% Total P
24
1 20 100 83,2 100,0 20 NA
2
20 100 83,2 100,0 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NA = no aplicable debido a la falta de variabilidad. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
Se detecto ARN del PRRSv en los tejidos de pulmon de todos los lechones en tanto el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 como en todos los lechones en el grupo de control de exposicion. No hubo diferencia entre estos grupos. No se detecto ARN del PRRSv en las muestras de pulmon de ningun lechon de control negativo.
Observaciones clmicas despues de la exposicion
5 La frecuencia de lechones con al menos una puntuacion de evaluacion clinica positiva en el periodo despues de la exposicion (D15-D24) se muestra a continuacion en la Tabla 7.14.
Tabla 7.14 Frecuencia de lechones con una observacion clinica positiva despues de la exposicion (D15-D24)
Parametro
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Total Valor de p
Respiracion
1 2 10 1,2 31,7 20 0,2351
2
6 30 11,9 54,3 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
Comportamiento
1 0 0 0,0 16,8 20 0,0012
2
9 45 23,1 68,5 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
Tos
1 6 30 11,9 54,3 20 0,2003
2
11 55 31,5 76,9 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
Total
1 6 30 11,9 54,3 20 0,0562
2
13 65 40,8 84,6 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
10 La respiracion anormal se observo en tanto el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 (10%) como en el grupo de control de exposicion (30%), sin embargo, estos valores no fueron significativamente diferentes (p=0,2351).
El comportamiento anormal solo se observo en el grupo de control de exposicion (45%), y no en el grupo vacunado con mLv contra el PRRSV 94881 (0%). El grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvo una incidencia significativamente menor del comportamiento anormal que los controles de exposicion (p=0,0012).
15 La tos se observo en tanto el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 (30%) como en el grupo de control de exposicion (55%). Estos valores no fueron significativamente diferentes (p=0,2003).
Los porcentajes de lechones con puntuaciones clmicas totales > 0 fueron de 30% y 65% para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Estos valores no fueron significativamente diferentes (p=0,0562).
20 No se observaron signos clmicos en el grupo de control negativo en ningun momento despues de la exposicion.
Un resumen de las puntuaciones de observaciones clmicas maximas por grupo para el periodo despues de la exposicion (D15 a D24) se muestra a continuacion en la Tabla 7.15.
Tabla 7.15 Puntuaciones clmicas maximas despues de la exposicion, D15 a D24
Parametro
Grupo1 N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
Respiracion
1 20 0 1 0 0 0 0 0,1 0,1872
2
20 0 2 0 0 1 1 0,4
3
10 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
Comportamiento
1 20 0 0 0 0 0 0 0,0 0,0012
2
20 0 1 0 0 1 1 0,5
3
10 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
Tos
1 20 0 1 0 0 1 1 0,3 0,1129
2
20 0 2 1 0 1 1 0,7
3
10 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
Total
1 20 0 1 0 0 1 1 0,3 0,0072
5
10
15
20
25
30
35
2 20 0 4 1 0 2 2 1,2
3
10 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
La respiracion anormal se observo en tanto el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 como en los controles de exposicion despues de la administracion de exposicion, con puntuaciones maximas de 1 (respiracion jadeante/rapida) y 2 (disnea), respectivamente. No hubo diferencia significativa entre estas puntuaciones de respiracion (p=0,1872). La mediana de la puntuacion de respiracion maxima fue 0 para ambos grupos.
No se observo comportamiento anormal en el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 en el periodo despues de la exposicion (puntuacion maxima = 0). A diferencia, el grupo de control de exposicion tuvo una puntuacion de comportamiento maxima de 1 (letargo de leve a moderado; p=0,0012), aunque la mediana de la puntuacion para este grupo fue 0. La puntuacion maxima para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 fue significativamente menor que la puntuacion para el grupo de control de exposicion (p=0,0012). Las medianas de las puntuaciones de comportamiento maximas fue 0 para ambos grupos.
Se observo tos en tanto el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 como en el grupo de control de exposicion despues de la exposicion. Las puntuaciones maximas fueron 1 (tos suave o intermitente) y 2 (tos aspera
0 grave, repetitiva), y las medianas de las puntuaciones fueron 0 y 1 para vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion, respectivamente. No hubo diferencias significativas entre estos grupos (p=0,1129). Las medianas de las puntuaciones de tos maximas fueron 0 y 1 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente.
Las puntuaciones totales maximas fueron 1 y 4 y las medianas de las puntuaciones totales fueron 0 y 1 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. La puntuacion maxima para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 fue significativamente menor que la puntuacion para el grupo de control de exposicion (p=0,0072). Las medianas de las puntuaciones totales fueron 0 y
1 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente.
No se observaron signos clmicos de D15 a D24 en el grupo de control negativo no expuesto durante este estudio. Este grupo tuvo una puntuacion maxima de 0 para cada parametro.
Un resumen de las puntuaciones de observaciones clmicas medias por grupo para el periodo despues de la exposicion (D15 a D24) se muestra a continuacion en la Tabla 7.16.
Tabla 7.16 Puntuaciones clmicas medias despues de la exposicion, D15 a D24
Parametro
Grupo1 N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
Respiracion
1 20 0,0 0,2 0,00 0,00 0,00 0,00 0,02 0,1394
2
20 0,0 0,6 0,00 0,00 0,10 0,10 0,07
3
10 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
Comportamiento
1 20 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,0012
2
20 0,0 0,8 0,00 0,00 0,10 0,10 0,12
3
10 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
Tos
1 20 0,0 0,4 0,00 0,00 0,10 0,10 0,07 0,0835
2
20 0,0 0,7 0,10 0,00 0,30 0,35 0,17
3
10 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
Total
1 20 0,0 0,4 0,00 0,00 0,10 0,15 0,08 0,0103
2
20 0,0 1,4 0,25 0,00 0,40 0,50 0,35
3
10 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NI = no incluido en el analisis estadfstico
Las puntuaciones de observaciones clmicas medias siguieron un patron similar a las puntuaciones clmicas maximas con diferencias significativas solo observadas entre el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion para la puntuacion de comportamiento media (p=0,0012) y la puntuacion total media (p=0,0103).
Las puntuaciones de respiracion medias fueron 0,02 y 0,07 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Las puntuaciones de comportamiento medias fueron 0,00 y 0,12 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion,
5
10
15
20
25
respectivamente. Las puntuaciones de tos medias fueron 0,07 y 0,17 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Las puntuaciones totales medias fueron 0,08 y 0,35 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y grupo de control de exposicion, respectivamente.
No se observaron signos clmicos de D15 a D24 en los controles negativos no expuestos durante este estudio. Este grupo tuvo una puntuacion media de 0 para cada parametro.
Peso corporal y aumento de peso diario promedio
Un resumen de los pesos corporales en D0, D14 y D24 y ADWG para D0 a D14 y D14 a D24 se muestra a continuacion en la Tabla 7.17.
Tabla 7.17 Peso corporal y aumento de peso diario promedio (kg y kg/d)
Dia(s)
Grupo1 N Mm. Max. Mediana Media DE
0
1 20 3,3 5,5 3,95 4,14 0,589
2
20 3,2 5,2 4,05 4,17 0,603
3
10 3,4 5,1 4,00 4,07 0,556
14
1 20 5,6 9,4 7,60 7,64 1,029
2
20 6,0 8,9 7,30 7,39 0,909
3
10 5,5 9,3 6,95 7,22 1,187
24
1 20 7,0 13,9 10,40 10,26 1,693
2
20 6,4 10,9 8,80 8,87 1,328
3
10 6,8 12,9 10,90 10,64 1,807
ADWG 0 -14
1 20 0,164 0,343 0,2571 0,2500 0,05254
2
20 0,179 0,307 0,2357 0,2304 0,03939
3
10 0,150 0,307 0,2071 0,2250 0,04906
ADWG 14 -24
1 20 0,090 0,460 0,2600 0,2620 0,08907
2
20 -0,060 0,290 0,1600 0,1475 0,09060
3
10 0,130 0,440 0,3700 0,3420 0,10130
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto.
Los pesos corporales medios en D0 fueron 4,1 y 4,2 kg para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. En D14, los pesos corporales medios fueron 7,6 y 7,4 kg para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. En D24, los pesos corporales medios fueron 10,3 y 8,9 kg para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Los aumentos de peso diario promedio (ADWG) durante el periodo de vacunacion (D0 a D14) fueron 0,25 y 0,23 kg/d para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Los ADWG durante el periodo de exposicion (D14 a D24) fueron 0,26 y 0,15 kg/d para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Los ADWG para los controles negativos fueron 0,23 y 0,34 kg/d para D0-D14 y D14-D24, respectivamente.
Los lechones de control negativo tuvieron pesos corporales medios de 4,1, 7,2 y 10,6 kg en D0, D14 y D28, respectivamente.
Un resumen de la media por LS y el analisis estadfstico de pesos corporales y ADWG para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion se muestra a continuacion en la Tabla 7.18.
Tabla 7.18 Peso corporal medio de LS y aumento diario (kg)
Dia(s)
Grupo1 Media por LS Intervalo de confianza de 95% Valor de p
0
1 4,14 3,865 4,405 0,8743
2
4,17 3,895 4,435
Dif. 1-2
-0,03 -0,411 0,351
1 7,64 7,196 8,074
14
2 7,39 6,951 7,829 0,4297
Dif. 1-2 0,25 -0,376 0,866
24
1 10,26 9,566 10,944 0,0063
2
8,87 8,176 9,554
Dif. 1-2
1,39 0,416 2,364
ADWG 0 -14
1 0,2500 0,22898 0,27102 0,1889
2
0,2304 0,20934 0,25138
Dif. 1-2
0,0196 -0,01008 0,04937
ADWG 14 -24
1 0,2620 0,22133 0,30267 0,0003
2
0,1475 0,10683 0,18817
Dif. 1-2
0,1145 0,05699 0,17201
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto.
Los pesos corporales medios por LS en Dfa 0 fueron 4,14 y 4,17 kg para los lechones vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. La diferencia fue -0,03 kg, que no fue significativamente diferente (p=0,8743). En D14, los pesos corporales medios por LS fueron 7,64 y 7,39 kg para el 5 grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. La diferencia fue 0,25 kg, que tampoco fue significativamente diferente (p=0,4297). En D24, los pesos corporales medios por LS fueron 10,26 y 8,87 para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. La diferencia en este dfa fue 1,39 kg, y el peso del grupo vacunado fue significativamente superior al del grupo de control de exposicion (p=0,0063).
10 Los ADWG medios por LS durante el periodo de vacunacion (D0-D14) fueron 0,25 y 0,23 kg/d para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Estos valores no fueron significativamente diferentes (p=0,1889). Los ADWG medios por LS durante el periodo despues de la exposicion (D14-D24) fueron 0,26 y 0,15 para el grupo vacunado con MLV contra el PRrSv 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. El ADWG para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 fue
15 significativamente superior al ADWG para el grupo de control de exposicion (p=0,0003).
Temperaturas rectales
Un resumen de temperaturas rectales se muestra a continuacion en las Tablas 7.19 y 7.20. Un resumen de la media por LS y el analisis estadfstico de la temperatura rectal para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion se muestra a continuacion en las Tablas 7.21 y 7.22.
20 Tabla 7.19 Temperatura rectal (°C) Dfa 13-22
Dia
Grupo1 N Mm. Max. Mediana Media DE
13
1 20 39,3 40,3 39,80 39,77 0,247
2
20 38,9 40,0 39,35 39,39 0,292
3
10 39,0 39,7 39,15 39,26 0,267
14
1 20 39,4 40,2 39,75 39,76 0,226
2
20 39,0 39,8 39,40 39,37 0,220
3
10 39,1 40,3 39,40 39,51 0,375
15
1 20 39,3 40,4 39,65 39,69 0,258
2
20 39,4 41,1 39,70 39,90 0,538
3
10 39,1 40,3 39,40 39,52 0,371
16
1 20 39,9 41,3 40,80 40,68 0,417
2
20 39,3 40,3 39,75 39,77 0,279
3
10 39,1 39,9 39,45 39,46 0,263
17
1 20 39,2 40,6 39,80 39,89 0,363
2
20 39,4 40,6 39,85 39,90 0,285
3
10 39,2 40,0 39,50 39,53 0,226
18
1 20 39,3 41,0 39,95 39,99 0,492
2
20 39,5 41,2 40,20 40,29 0,472
3
10 38,9 39,7 39,30 39,30 0,211
19
1 20 39,7 41,6 40,35 40,40 0,464
2 20 39,5 41,1 40,65 40,55 0,451
3
10 39,0 39,6 39,20 39,22 0,199
20
1 20 39,7 41,5 40,50 40,52 0,449
2
20 39,5 41,5 40,65 40,61 0,531
3
10 39,1 40,1 39,40 39,49 0,281
21
1 20 39,6 41,1 40,30 40,22 0,413
2
20 39,4 41,0 40,10 40,12 0,371
3
10 39,2 40,2 39,45 39,59 0,351
22
1 20 39,8 41,0 40,20 40,34 0,391
2
20 39,6 41,2 40,30 40,41 0,437
3
10 39,0 40,0 39,40 39,45 0,276
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto.
Tabla 7.20 Temperatura rectal (°C) Dfa 23-24
Dia
Grupo1 N Mm. Max. Mediana Media DE
23
1 20 39,6 41,2 40,25 40,36 0,454
2
20 39,5 41,6 40,60 40,60 0,482
3
10 39,3 40,1 39,70 39,68 0,290
24
1 20 39,8 41,3 40,30 40,39 0,421
2
20 39,7 41,6 40,30 40,50 0,531
3
10 39,1 40,2 39,60 39,66 0,389
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo
5 3 = tratado con placebo, no expuesto
Tabla 7.21 Temperatura rectal media por LS (°C) Dfa 13 -20
Dia
Grupo1 Media por LS Intervalo de confianza de 95% Valor de p
13
1 39,77 39,648 39,892 <0,0001
2
39,39 39,268 39,512
Dif. 1-2
0,38 0,207 0,553
14
1 39,76 39,654 39,856 <0,0001
2
39,37 39,269 39,471
Dif. 1-2
0,39 0,242 0,528
15
1 39,69 39,494 39,876 0,1241
2
39,90 39,704 40,086
Dif. 1-2
-0,21 -0,480 0,060
16
1 40,68 40,514 40,836 <0,0001
2
39,77 39,609 39,931
Dif. 1-2
0,91 0,678 1,132
17
1 39,89 39,737 40,033 0,8852
2
39,90 39,752 40,048
Dif. 1-2
-0,02 -0,224 0,194
18
1 39,99 39,767 40,203 0,0528
2
40,29 40,072 40,508
Dif. 1-2
-0,31 -0,614 0,004
19
1 40,40 40,188 40,602 0,3065
2
40,55 40,338 40,752
Dif. 1-2
-0,15 -0,443 0,143
20
1 40,52 40,293 40,737 0,5659
2
40,61 40,383 40,827
Dif. 1-2
-0,09 -0,405 0,225
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto
Tabla 7.22 Temperature rectal media por LS (°C) Dfa 21 - 24
Dia
Grupo1 Media por LS Intervalo de confianza de 95% Valor de p
21
1 40,22 40,037 40,393 0,4489
2
40,12 39,942 40,298
Dif. 1-2
0,10 -0,156 0,346
22
1 40,34 40,152 40,528 0,6231
2
40,41 40,217 40,593
Dif. 1-2
-0,07 -0,331 0,201
23
1 40,36 40,143 40,567 0,1062
2
40,60 40,388 40,812
Dif. 1-2
-0,25 -0,545 0,055
24
1 40,39 40,168 40,602 0,4526
2
40,50 40,283 40,717
Dif. 1-2
-0,12 -0,422 0,192
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2= tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 5 = tratado con placebo, no expuesto
La temperature rectal media y media por LS para los lechones vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 fue 39,77°C en el dfa antes de la exposicion y oscilo de 39,69°C (D15) a 40,68°C (D16) despues de la exposicion. La temperature rectal media y media por LS para los controles de exposicion fue 39,39°C en el dfa antes de la exposicion y oscilo de 39,77°C (D16) a 40,61°C (D20) despues de la exposicion. Las temperatures rectales medias 10 por mmimos cuadrados fueron significativamente inferiores para controles de exposicion en comparacion con lechones vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 antes de la administracion de exposicion (D13 y D14) y en D16 despues de la exposicion (p<0,0001). No hubo otras diferencias significativas en temperaturas rectales entre cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion en este estudio (p>0,0528). Las temperaturas rectales medias y medias por LS para los controles negativos siguieron siendo < 39,68°C durante el 15 estudio.
Evaluacion clinica despues de la vacunacion
Un resumen del porcentaje de lechones con al menos una evaluacion positiva de D1 a D12 se muestra a continuacion en la Tabla 7.23.
Tabla 7.23 Porcentaje de lechones con al menos una evaluacion clinica positiva de D1-D12
Grupo1
N° de positivos % de positivos IC de 95% Total Valor de p
1
0 0 0,0 16,8 20 1,0000
2
1 5 0,1 24,9 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
20 1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo
3 = tratado con placebo, no expuesto. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
Ningun lechon en ningun grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 o controles negativos tuvo hallazgos de evaluacion clinica durante el periodo de vacunacion D-1 a D12. El lechon 110 en el grupo de control de exposicion se observo con una llaga detras de la pata delantera derecha empezando en D9. No hubo diferencia significativa 25 entre lechones vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion para este parametro
(p=1,0000).
Serologfa del PRRS
Un resumen de la frecuencia de lechones con tftulos de anticuerpos del PRRS positivos se muestra a continuacion en la Tabla 7.24.
5
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20
25
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Tabla 7.24 Frecuencia de lechones con tftulo de anticuerpos del PRRS positivos por dfa
Dia
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Total Valor de p
7
1 0 0 0,0 16,8 20 NA
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
14
1 17 85 62,1 96,8 20 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
17
1 19 95 75,1 99,9 20 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
21
1 20 100 83,2 100,0 20 0,0012
2
11 55 31,5 76,9 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
24
1 20 100 83,2 100,0 20 1,0000
2
19 95 75,1 99,9 20
3
0 0 0,0 30,8 10 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el PRRSV 94881 a MID, expuesto; Grupo 2 = tratado con placebo, expuesto; Grupo 3 = tratado con placebo, no expuesto. NA = no aplicable, no expuesto. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
Todos los lechones en todos los grupos de tratamiento fueron negativos para anticuerpos del PRRS en DO y D7. En D14, 85% de los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron tftulos para anticuerpos del PRRS positivos. Este numero aumento al 95% en D17 y fue 100% en tanto D21 como D24. Ningun cerdo en el grupo de control de exposicion desarrollo tftulos de anticuerpos del PRRS positivos hasta D21 (7 dfas despues de la administracion de exposicion) cuando 55% de los cerdos tema tftulos positivos. Este valor aumento al 95% en D24. En D14, D17 y D21, los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron una proporcion significativamente mayor de cerdos con tftulos de anticuerpos del PRRS positivos en comparacion con el grupo de control de exposicion (p<0,0012). Ningun cerdo en el grupo de control negativo desarrollo tftulos de anticuerpos del PRRS durante este estudio.
Discusion/conclusion
Para lograr el objetivo del estudio, tres grupos se incluyeron en el diseno del estudio en DO: un grupo de vacunas que recibio 1 x 10382 TCID50 de MLV contra el PRRSV 94881 (Grupo 1); un grupo de control de exposicion que recibio producto de control (Grupo 2) y un grupo de control negativo (Grupo 3) que tambien recibio producto de control.
Veinte (20) lechones sanos susceptibles y seronegativos para PRRS se inocularon IM con 1 ml de MLV contra el PRRSV 94881 a aproximadamente 14 dfas de edad. Treinta (20 lechones del grupo de control de exposicion y 10 lechones del grupo de control negativo) lechones susceptibles y seronegativos para PRRS se inocularon IM con 1 ml de producto de control a aproximadamente 14 dfas de edad.
Para determinar si se logro una aparicion de inmunidad de 2 semanas para MLV contra el 94881 del PRRS, el grupo de vacunas y el grupo de control de exposicion se expusieron 14 dfas despues de la vacunacion a una cepa aislada europea heterologa del PRRSv (cepa aislada 205817) y se evaluaron despues de la exposicion para la reduccion relevante en lesiones pulmonares.
Validacion del estudio (Grupo de control negativo 3)
Para garantizar que los lechones fuente estuvieran libres de PRRSv y que no se produjera exposicion externa al PRRSv o contaminacion cruzada entre los grupos de tratamiento y de control durante el estudio, un grupo de control negativo (Grupo 3) se incluyo en el diseno del estudio. Los lechones en el grupo de control negativo fueron negativos para PRRSv (viremia; qPCR), ademas de para anticuerpos del PRRS durante el estudio, validandose asf este ensayo.
Validacion del modelo de exposicion (Grupo de control de exposicion 2)
Es necesario un modelo de exposicion que induzca suficiente enfermedad clinica de PRRS para evaluar adecuadamente la aparicion de inmunidad a la vacuna contra el PRRS en un entorno de laboratorio. Tras la inoculacion con la cepa aislada del PRRS europea 205817 mediante el metodo descrito anteriormente, el grupo de
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control de exposicion presento una temperature rectal media de > 40,50°C en D19, D20 D23 y D24 (< 39,68°C en los mismos d^as, grupo de control negativo), un ADWG medio de 0,15 kg/dfa en comparacion con un ADWG medio de 0,34 kg/dfa para el grupo de control negativo de D14 a D24, comportamiento anormal, tos y una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar de 55,2% (0,00%; grupo de control negativo). Estos resultados ponen de relieve que la enfermedad clinica espedfica para PRRS grave se indujo en el grupo de control de exposicion aun cuando el tttulo de virus de exposicion era ligeramente menor que la dosis elegida como diana, validandose asf este modelo de exposicion como una herramienta de laboratorio clinico adecuada para evaluar la eficacia de la vacuna contra el pRrS y mas espedficamente la OOI de MLV contra el 94881 del PRRS.
Determinacion de la aparicion en dos semanas de inmunidad de MLV contra el PRRSV 94881 (Grupo 1
La determinacion de una aparicion de inmunidad (OOI) para MLV contra el PRRSV 94881 2 semanas despues de la vacunacion se baso en el grupo de vacunas que presento una reduccion significativa (p < 0,05) en lesiones pulmonares despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion.
Las lesiones pulmonares se seleccionaron como el parametro primario para la determinacion de la OOI de 2 semanas debido a que este parametro proporciona las pruebas de eficacia mas clmicamente relevantes y convincentes cuando se evalua una nueva vacuna dentro del modelo de exposicion respiratoria del PRRS en cerdos. El desarrollo de lesiones pulmonares es uno de los distintivos de la enfermedad de PRRS respiratoria en cerdos. Las lesiones pulmonares frecuentemente van acompanadas de posteriores manifestaciones de caractensticas de la enfermedad por el PRRSv secundarias tales como signos clmicos, fiebre, disminucion del ADWG, etc.
El grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 presento una reduccion significativa en la patologfa pulmonar macroscopica despues de la exposicion, como se demuestra por la mediana de la puntuacion de lesion pulmonar total de 27,6% en comparacion con el grupo de control de exposicion, que presento una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar total de 55,2% (p=0,0002). Por tanto, se establecio una OOI de 2 semanas para MLV contra el PRRSV 94881 a la dosificacion de 1 x 10382 TCID50 basandose en el parametro primario de una reduccion significativa para lesiones pulmonares despues de la exposicion. Este resultado se logro con una dosis de vacuna ligeramente menor que la dosis de inmunizacion minima de 1 x 1045 TCID50/dosis.
La viremia despues de la exposicion se selecciono como el parametro secundario mas importante debido a que representa el nivel de replicacion y persistencia vmca que se produce dentro del animal huesped tras la exposicion. Una reduccion significativa (p<0,05) en la viremia se corresponded con una vacuna contra el PRRS que induce inmunidad adecuada para limitar la patogenesis del PRRS dentro del huesped. 3 dfas despues de la exposicion (D17), el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 se asocio a una reduccion significativa en la mediana de viremia (qPCR) en comparacion con el grupo de control de exposicion (6,72 GE/ml frente a 8,18 GE/ml; p<0,0001). Para evaluar adicionalmente la viremia despues de la exposicion entre grupos se calculo la cantidad de la carga vmca durante una duracion espedfica de tiempo despues de la exposicion, como se representa como “area bajo la curva” o ABC. El grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvo una mediana del valor de ABC de D17 a D24 de 49,52 GE/mlMa; mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana del valor de ABC de 54,35 GE/ml/dfa. La mediana del valor de ABC fue significativamente menor para el grupo de vacunas en comparacion con el grupo de control de exposicion de D17 a D24 (p=0,0039). Si la viremia se examino 3 dfas despues de la exposicion o durante el transcurso del periodo despues de la exposicion, la MLV contra el PRRSV 94881 administrada 2 semanas antes de exposicion a una cepa europea heterologa virulenta del PRRS redujo significativamente (p<0,05) la viremia despues de la inoculacion de la exposicion. En asociacion con una reduccion de viremia del PRRS despues de la exposicion, una reduccion significativa (p<0,05) en la carga vmca en el tejido de pulmon tambien sena de gran importancia desde el punto de vista de la inmunidad de la vacuna contra el PRRS. Una reduccion de la carga vmca en el tejido de pulmon puede asociarse a una estabilidad vmca reducida, replicacion y persistencia dentro del huesped y puede conducir secundariamente a una reduccion de la propagacion del PRRSv a otros cerdos. En este estudio, los tejidos de pulmon del grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron una mediana del resultado de qPCR de pulmon de 7,46 log-10 GE/ml 10 dfas despues de la exposicion (D24), mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana del resultado de qPCR de pulmon de 7,88 log-10 GE/ml. La diferencia entre el grupo de vacunas y el grupo de control de exposicion fue significativa (p=0,0101), soportandose asf adicionalmente una OOI de 2 semanas.
Una reduccion marcada en la gravedad y frecuencia de signos clmicos despues de la exposicion en lechones tambien soportana la eficacia de la vacuna contra el PRRS y el establecimiento de una OOI de 2 semanas para MLV contra el 94881 del PRRS. No se observo respiracion anormal de suficiente gravedad y frecuencia en ningun grupo despues de la exposicion y no se detectaron diferencias (p>0,1394). En cambio, la gravedad y la frecuencia de la tos fueron aproximadamente iguales entre grupos y no se detectaron diferencias (p>0,0835). Se detectaron diferencias entre los grupos para gravedad y frecuencia del comportamiento anormal (letargo) despues de la exposicion. Cero de 20 (0%) y 9 de 20 (45%) lechones vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y del control de exposicion, respectivamente, presentaron comportamiento anormal durante al menos un dfa despues de la exposicion (p=0,0012). Asimismo, el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 presento menores puntuaciones clmicas anormales maximas y clmicas anormales medias despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion (p=0,0012). Las puntuaciones clmicas totales (suma de puntuaciones de respiracion, comportamiento
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y tos) fueron significativamente diferentes entre grupos cuando se analizaron las puntuaciones maximas y las puntuaciones medias de D15 a D24. Debido a la influencia de las puntuaciones de comportamientos anormales sobre las puntuaciones totales, el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvo una puntuacion total maxima significativamente menor y puntuacion total media menor en comparacion con el grupo de control de exposicion (p<0,0103). Las diferencias entre los grupos para gravedad y frecuencia de comportamiento anormal soportan adicionalmente una OOI de 2 semanas despues de la vacunacion.
Antes de la exposicion, el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvo ligeramente mayores temperaturas rectales medias en comparacion con el grupo de control de exposicion en D13 (39,77°C frente a 39,39°C, respectivamente; p<0,0001) y en D14 (39,76°C frente a 39,37°C, respectivamente; p<0,0001). Aunque se detectaron diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos antes de la exposicion, estas diferencias no fueron biologicamente relevantes. Despues de la exposicion, el unico dfa en el que se detecto una diferencia significativa (p<0,05) entre los grupos para la temperatura rectal media fue en D16 (2 dfas despues de la exposicion). En D16, los grupos vacunados y de control de exposicion tuvieron temperaturas rectales medias de 40,68°C y 39,77°C, respectivamente, y la diferencia entre grupos fue significativa (p<0,0001). La media temperatura rectal 4-5 dfas despues de la exposicion se elevo por encima de 40°C y siguio estando por encima de 40°C hasta el fin del estudio para ambos grupos.
La presencia de comportamiento anormal significativo, viremia, patologfa pulmonar y carga vmca en tejidos de pulmon debido a PRRS en el grupo de control de exposicion produjo diferencias significativas (p<0,05) entre los grupos para ADWG despues de la exposicion. En este estudio, los grupos vacunados y de control de exposicion tuvieron ADWG medios de D14 a D24 de 0,3 kg/dfa y 0,1 kg/dfa, respectivamente, y la diferencia entre grupos fue significativa (p=0,0003). Una diferencia significativa (p<0,05) entre los grupos para ADWG despues de la exposicion soporta adicionalmente el establecimiento de una OOI de 2 semanas despues de la vacunacion.
Parametros examinados despues de la vacunacion en este estudio
No se observaron evaluaciones clmicas anormales relacionadas con la vacunacion con MLV contra el 94881 PRRS
0 producto de control en lechones tras la inoculacion en D0. Un lechon de control de exposicion presento una llaga detras de la pata delantera derecha empezando en D9 que parecio que no se asociaba a la administracion del producto de control.
Todos los lechones fueron negativos en serologfa por ELISA para PRRS en D0, confirmandose asf que todos los lechones cumplieron los criterios de inclusion de ser negativos para PRRS tras la entrada en el estudio. La mayona de los lechones que recibieron MLV contra el PRRSV 94881 se seroconvirtieron para PRRS en D14 y todos los lechones vacunados contra el PRRS fueron seropositivos 7 dfas despues de la exposicion (D21). En cambio, el control de exposicion siguio siendo seronegativo hasta 7 dfas despues de la exposicion, cuando este grupo empezo a demostrar seroconversion del PRRS. El grupo de control negativo siguio siendo seronegativo para PRRS durante todo el estudio.
7 y 14 dfas despues de la vacunacion, el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 presento resultados de qPCR medios de 3,17 y 3,30, log-io GE/ml, respectivamente. Estos resultados ponen de relieve que en el plazo de 2 semanas desde la vacunacion, una dosificacion de 1 x 10382 TCID50 de MLV contra el PRRSV 94881 indujo suficiente replicacion de la MLV que es frecuentemente requerida para construir la inmunidad protectora ya a las 2 semanas despues de la vacunacion. En cambio, el grupo de control de exposicion y el grupo de control negativo fueron negativos para viremia del PRRSv de D0 a D14.
Conclusion
La reduccion significativa (p<0,05) de las lesiones pulmonares, signos clmicos, replicacion del virus en la sangre y los pulmones despues de la exposicion, ademas de la mejora de los rendimientos de crecimiento, soportan el establecimiento de una OOI de 2 semanas tras la vacunacion con una dosis unica de MLV contra el PRRSV 94881 a
1 x 10382 TCID50/ml en lechones de aproximadamente 14 dfas de edad.
Ejemplo 8 Evaluacion de la duracion de la inmunidad de la MLV contra el PRRSV 94881 en cerdos de dos semanas de edad susceptibles tras la exposicion a una cepa aislada europea heterologa de PRRS 26 semanas despues de la vacunacion
El objetivo de este estudio de exposicion a vacunacion era evaluar la duracion de la inmunidad (DOI) 26 semanas despues de la administracion del candidato a vacuna contra el smdrome reproductor y respiratorio porcino, cepa aislada derivada de europea 94881, virus vivo modificado (MLV contra el 94881 del PRRS), en cerdos seronegativos para PRRS de 14 ± 3 dfas de edad. El criterio de eficacia primaria para satisfacer una DOI de 26 semanas despues de la vacunacion fue una reduccion significativa (p <0,05) en las puntuaciones de lesion pulmonar (macroscopica o histologica) despues de la exposicion en el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 (Grupo 1) en comparacion con el grupo de control de exposicion (Grupo 2).
En el Dfa 0 (D0), 22 cerdos asignados al grupo vacunado recibieron 1,0 ml IM de MLV contra el PRRSV 94881 (1 x 10427 TCID50) IM (Grupo 1), 22 cerdos asignados al grupo de control de exposicion recibieron 1,0 ml IM de producto
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40
45
de control (placebo del mismo producto sin MLV contra el 94881 del PRRS, Grupo 2) y 12 cerdos asignados al grupo de control negativo tambien recibieron 1,0 ml IM de producto de control (Grupo 3). Los Grupos 1 y 2 se expusieron en D179 (dfa despues de la exposicion {DPC} 0) a una cepa virulenta del PRRSv europeo y los cerdos se monitorizaron 10 dfas despues de la exposicion para signos clmicos, aumento de peso diario promedio y viremia. A los cerdos se les hizo la autopsia en D189 (DPC 10) y se determinaron las lesiones pulmonares macroscopicas e histologicas, y la carga vmca del pulmon.
Las medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica en D189 (DPC 10) fueron 0,1% y 13,8% para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion, respectivamente (p<0,0001). Las medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar histologica en DPC 10 fueron 6,0 y 19,5 para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion, respectivamente (p<0,0001). Los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron significativamente menos carga vmca en suero 3, 7 y 10 dfas despues de la exposicion en comparacion con los controles de exposicion (p<0,0001). El analisis del area bajo la curva (ABC) despues de la exposicion para viremia de DPC 0 a DPC 10 y dPc 3 a DPC 10 tambien fue significativamente inferior para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 (15,54 y 8,88 log-10 GE/ml por dfa, respectivamente) en comparacion con el grupo de control de exposicion (44,77 y 36,43 log-10 GE/ml por dfa, respectivamente, p<0,0001). La mediana de valores de qPCR para tejidos de pulmon recogidos en la autopsia fue 3,69 y 6,25 log-10 GE/ml para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion, respectivamente (p<0,0001). No hubo diferencias significativas en signos clmicos despues de la exposicion (p>0,4878).
Una reduccion significativa (p<0,05) de lesiones pulmonares macroscopicas e histologicas, la carga vmca en tejidos de pulmon recogidos en la autopsia y la viremia despues de la exposicion para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 en comparacion con los controles de exposicion soportaron la eficacia de la vacuna contra el PRRSv virulento cuando se expuso 26 semanas despues de la vacunacion. Los resultados de este estudio establecen una duracion de la inmunidad de 26 semanas despues de la vacunacion en cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 a las 2 semanas de edad. Estos resultados se alcanzaron con una dosis de vacuna de 1 x 10427 TCID50/ml, que fue ligeramente inferior a la dosis de inmunizacion minima (1 x 1045 TCID50/ml) para este producto veterinario en investigacion.
Objetivo(s)/Fin del estudio
El objetivo de este estudio de exposicion a vacunacion era evaluar la duracion de la inmunidad (DOI) de la cepa aislada derivada de europea contra el smdrome reproductor y respiratorio porcino 94881, virus vivo modificado, codigo 19S1.U (MLV contra el 94881 del PRRS), administrada a cerdos seronegativos para PRRS, 14 ± 3 dfas de edad, contra una exposicion virulenta a una cepa aislada europea heterologa de PRRS 26 semanas despues de la vacunacion. El criterio de eficacia primaria para satisfacer una DOI de 26 semanas despues de la vacunacion fue una reduccion significativa (p <0,05) en las puntuaciones de lesion pulmonar (macroscopica o histologica) despues de la exposicion en el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 (Grupo 1) en comparacion con el grupo de control de exposicion (Grupo 2).
Los parametros de eficacia secundaria incluyeron viremia despues de la vacunacion y despues de la exposicion, evaluaciones clmicas despues de la vacunacion, serologfa del PRRS, observaciones clmicas despues de la exposicion, aumento de peso diario promedio (ADWG), temperaturas rectales y cuantificacion del PRRSv en pulmon. La viremia despues de la exposicion se considero que era el parametro secundario mas importante ya que es un parametro objetivo y cuantificable. La temperatura rectal y las observaciones clmicas se consideraron entonces de apoyo en el metodo de definicion de DOI. Por ultimo lugar, el rendimiento del crecimiento, la serologfa y la deteccion del virus en pulmones se usaron como parametros de apoyo hacia los parametros primarios en satisfacer el objetivo del estudio.
Programa de acontecimientos
Tabla 8.1 Programa de acontecimientos
Dia de estudio
Fechas Acontecimiento clave del estudio
-7
04-Feb-10 Recogida de muestras de sangre para cribar para estado por ELISA del PRRS negativo
-2
09-Feb-10 Realizacion del examen de salud
-1 a 21
10-Feb-10- 04-Mar-10 Realizacion diaria de evaluaciones clmicas
0
11-Feb-10 Registro de pesos corporales; recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia; vacunacion del Grupo 1 con IVP, vacunacion de los Grupos 2 y 3 con CP
7
18-Feb-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
13
24-Feb-10 Vacunacion de cerdos con 1,0 ml de la vacuna CircoFlex® Insercion SC de microchip en el cuello izquierdo de cada cerdo en estudio
Dia de estudio
Fechas Acontecimiento clave del estudio
14
25-Feb-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
21
04-Mar-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
22 a 177
05-Mar-1007 -Ago-10 Evaluaciones clmicas al menos 3 veces/semana
28
11-Mar-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
56
08 -Abr-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
84
06-May-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
112
03-Jun-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
140
01-Jul-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
168
29-Jul-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
D178 (DPC-1) a D189 (DPC 10)
08-Ago-10- 19-Ago-10 Observaciones clmicas y temperaturas rectales diarias
D179 (DPC 0)
09-Ago-10 Recogida de pesos corporales; recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia; exposicion de Grupos 1 y 2 a la cepa aislada del PRRS europea heterologa
D182 (DPC 3)
12-Ago-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
D186 (DPC 7)
16-Ago-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia
D188 (DPC 9)
18-Ago-10 Recogida de pesos corporales
D189 (DPC 10)
19-Ago-10 Recogida de muestras de sangre para serologfa y viremia Sacrificio y autopsia de cerdos Puntuacion de lesiones pulmonares para patologfa Recogida de tejidos de pulmon para el aislamiento del virus e histopatologfa
Diseno del estudio
Fue un estudio de eficacia de la exposicion a vacunacion ciego realizado en 56 cerdos seronegativos para PRRS destetados, 14 ± 3 dfas de edad en el dfa 0 (D0). Un resumen del estudio se proporciona en la Tabla 8.2.
5 Tabla 8.2 Diseno del estudio
Grupo
Numero de cerdos en D0 Tratamiento en D0 (14 ± 3 dias de edad) Exposicion en D179 (DPC 0) a 1,0 ml/orificio nasal y 1,0 ml IM del PRRSv 205817 (media 1 x 10627 TCID50/3 ml) Sacrificio y autopsia en D189 (DPC 10)
1
22 1,0 ml IM de IVP (MLV contra el 94881 del PRRS) Sf Sf
2
22 1,0 ml IM de producto de control (CP; placebo del mismo producto sin MLV contra el 94881 del PRRS) Sf Sf
3
12 1,0 ml IM de CP No Sf
Criterios de cegado
El investigador del estudio y los representantes fueron cegados a los grupos de tratamiento asignados durante la fase en vida del estudio. Para mantener este cegado, el monitor del BIVI realizo la aleatorizacion y un individuo que no participo en las evaluaciones de los cerdos (es decir, evaluaciones clmicas, observaciones clmicas o autopsias) 10 administro los tratamientos de IVP y CP asignados en D0. El personal del laboratorio de BIVI se cego al tratamiento que recibfa cada cerdo mientras que realizaban sus tareas respectivas.
Materiales
Producto veterinario en investigacion (IVP) y producto de control Tabla 8.3 IVP
Nombre del producto generico:
Smdrome reproductor y respiratorio porcino, virus vivo modificado
Cepa:
94881
Produccion y formulacion:
La produccion de BIVI-St. Joseph produjo MLV contra el 94881 del PRRS, lote 390-
005 (Seccion 15.4), segun el Resumen de produccion, codigo 19S1.U_ y el Dosier EU parte 2b. En D0, BIVI-Ames reconstituyo/diluyo la vacuna MLV contra el 94881 del PRRS, lote 390-005, con solucion salina tamponada con fosfato (PBS; lote 809-002, Seccion 15.5) para formular el IVP, lote n° N257-137, a una dosificacion diana de aproximadamente 1 x 1045 TCID50/ml.
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. 2621 North Belt Highway St. Joseph, MO 64506, EE.UU.
Lote n°:
390-005, reconstituido al lote N257-137
Fecha de caducidad:
Se asigno una fecha de caducidad del 11-Feb-10 al IVP solo para fines de estudio.
Condiciones de almacenamiento:
Vacuna liofilizada: 2-8°C IVP rehidratado/diluido: sobre hielo
Pruebas:
MLV contra el 94881 del PRRS, lote 390-005, y PBS, lote 809-002, se probaron por BIVI-QC segun el borrador del Resumen de produccion (Seccion 15.1) y como se ha especificado adicionalmente en el Dosier de EU parte 2.F. El personal de laboratorio de BIVI-Ames probo antes de y despues de la vacunacion alfcuotas del IVP para el tttulo de virus segun el Metodo de tttulos de PRRSv (Seccion 15.1).
Resultados de las pruebas:
Lote 390-005: Los resultados fueron satisfactorios (Seccion 15.4). Lote 809-002: Los resultados fueron satisfactorios (Seccion 15.5). Lote de IVP N257-137: Tftulo medio de 1 x 10427 TCID50/ml (Seccion 15.7).
Retencion de IVP:
El IVP solo se reconstituyo / diluyo para uso inmediato en este estudio y no se retuvo mas alla del acontecimiento de vacunacion.
Tabla 8.4 CP
Nombre del producto generico:
Placebo
Formulacion:
La produccion de BIVI produjo producto de placebo liofilizado que contema material inerte comprendido en la serie sin MLV contra el PRRSV 94881 (lote N240-191- 062409, Seccion 15.6). En D0, BIVI-Ames reconstituyo el lote N240-191-062409 con solucion salina tamponada con fosfato (PBS; lote 809-002, Seccion 15.5) para formular el CP, lote n° N257-134
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. 2621 North Belt Highway St. Joseph, MO 64506, EE.UU.
Numero de lote:
Lote N240-191-062409, reconstituido al lote N257-134
Fecha de caducidad:
Se asigno una fecha de caducidad del 11-Feb-10 al CP solo para fines de estudio.
Condiciones de almacenamiento:
Vacuna liofilizada: 2-8°C CP rehidratado: 2-8°C o sobre hielo
Pruebas:
El lote N240-191-062409 y el lote N257-134 se probaron por BIVI-QC para la esterilidad segun EP
Resultados de las pruebas:
Lote N240-191-062409: Los resultados fueron satisfactorios para esterilidad (Seccion 15.6). Lote 809-002: Los resultados fueron satisfactorios para esterilidad. Se determino que CP era esteril (Seccion 15.7).
Retencion de CP:
CP solo se reconstituyo para su uso en este estudio y no se retuvo mas alla del acontecimiento de vacunacion.
Material de exposicion 5 Tabla 8.5 Material de exposicion
Nombre/numero de cepa aislada
Cepa aislada del PRRS 205817
Localizacion y fecha de aislamiento, incluidos
La cepa aislada del virus PRRS europeo 205817 se derivo de cepa aislada 190136 originariamente obtenida de tejido de pulmon de un cerdo recien nacido de una granja con signos reproductivos tfpicos de PRRS (abortos en cerdas y debilidad en cerdos recien
smtomas clmicos
nacidos) durante un brote en baja Sajonia, Alemania, en abril de 2004. Los veterinarios enviaron las muestras de pulmon a BioScreen (la muestra llego el 21 de abril de 2004) para pruebas de diagnostico. La cepa aislada 190136 se propago directamente en celulas MA 104 y se preparo una disolucion madre de exposicion de cultivo puro. Un cultivo puro de la cepa aislada 190136 se uso para inocular cerdos para la evaluacion de su capacidad para reproducir la enfermedad respiratoria espedfica para PRRS en un ensayo de laboratorio controlado. Los animales expuestos presentaron dificultades respiratorias y revelaron pruebas de neumoma intersticial tras el examen histopatologico. Al virus PRRS que se volvio a aislar satisfactoriamente de lesiones pulmonares se le dio la designacion de cepa aislada 205817. La cepa aislada 205817 se propago directamente en celulas MA104 y para su uso en futuros ensayos clmicos de BIVI se preparo una disolucion madre de exposicion de cultivo puro.
Formulacion:
El virus de exposicion se propago en celulas AK-MA104 y se formulo a un tttulo elegido como diana de aproximadamente 1 x 106 TCID50/3 ml de dosis en D179. Se preparo un volumen adecuado de material de exposicion. Se tomaron dos almuotas x 5 ml del material de exposicion para fines de ensayo antes de que el material de exposicion se transportara a VRI.
Numero de lote:
N270-179
Fabricante:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. - EE.UU.
Condiciones de almacenamiento
Se almaceno material de exposicion a granel a -70 ± 10°C. Una vez preparado, el material de exposicion diluido se mantuvo sobre hielo hasta que se administro.
Pruebas:
El personal del laboratorio de BIVI-Ames probo antes y despues de la exposicion almuotas para el titulo de virus segun el Metodo de tttulos de PRRSv
Resultados de las pruebas:
El material de exposicion tuvo un tftulo medio de 1 x 10627 TCID50/3 ml de dosis
Via de administracion
1,0 ml/orificio nasal y 1,0 ml IM en el cuello derecho
Retencion del material de exposicion:
El material de exposicion solo se descongelo / diluyo para este estudio y no se retuvo mas alia del acontecimiento de exposicion.
Tratamientos
Justificacion de la dosificacion
El IVP se administro como una dosis de 1,0 ml a cerdos asignados para evaluar la DOI de MLV contra el PRRSV 5 94881 26 semanas despues de la vacunacion. El CP se administro como una dosis de 1,0 ml a los Grupos 2 y 3
como una vacuna de placebo.
Pauta de dosificacion
IVP o CP se administro a un cerdo asignado en la region derecha del cuello IM en D0 usando una jeringuilla Luer- lock esteril de 3,0 ml y una aguja esteril 20g x 1 pulgada (2,54 cm) por una persona que no recogfa datos del 10 estudio. La pauta de dosificacion se muestra a continuacion en la Tabla 8.6.
Tabla 8.6 Pauta de dosificacion
Grupo
Numero Tratamiento DosisMa Dia de estudio
1
22 IVP 1,0 ml IM D0
2
22 CP 1,0 ml IM D0
3
12 CP 1,0 ml IM D0
Tratamientos concomitantes
Debido al hecho de que varios cerdos se encontraron muertos pronto en el estudio posteriormente a las infecciones bacterianas, el investigador y el monitor del estudio estuvieron de acuerdo con la administracion de los siguientes 15 tratamientos concomitantes adicionales a todos los animales del estudio (Seccion 15.10):
Dfa 20: Mu-Se® (vitamina E/Selenio, Intervet/Schering Plough Animal Health, EE.UU.), 0,1 ml IM en el jamon derecho
Dfa 21: EXCEDE® (ceftiofur, Pfizer Animal Health, EE.UU.), 0,5 ml en el jamon izquierdo Dfa 35: EXCEDE® (ceftiofur, Pfizer Animal Health, EE.UU.), 1,0 ml en el jamon derecho.
20 Dfa 42: EXCEDE® (ceftiofur, Pfizer Animal Health, EE.UU.), 1,0 ml en el jamon izquierdo.
5
10
15
20
25
Dfa 47: BAYTRIL 100® (enrofloxacina, Bayer Animal Health, EE.UU.), 1,5 ml SC en el cuello izquierdo
La vitamina E/selenio se administro para la prevencion de enfermedad cardiaca de Mulberry y los tratamientos con antibiotico se administraron para el tratamiento/prevencion de infecciones bacterianas.
Informacion sobre los animales
Detalles de los animales del estudio
Tabla 8.7 Informacion sobre los animales
Fuente:
Prairie View Farms, N5627 Hwy DD, Burlington, WI 53105
Numero de cerdos:
56
Dfa de llegada:
Los cerdos llegaron a las instalaciones de Veterinary Resources, Inc. (VRI) Cambridge el D-2 (09-Feb-10).
Identificacion:
Cada animal se identifico con etiquetas para las orejas dobles individuales en la llegada en D-2. Cada animal tambien tuvo un microchip electronico insertado SC en el cuello izquierdo en D13.
Especie:
Porcina
Raza:
Cruzada comercial
Sexo:
Hembras o machos castrados.
Intervalo de edad:
13 a 17 dfas de edad en D0
Intervalo de peso:
2,4 a 5,4 kg en D0
Propietario de los animales de prueba:
Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.
Estado fisiologico:
En D-2, los cerdos seleccionados para la asignacion al estudio fueron observados por el investigador del estudio y determino que estaban en buen estado de salud y nutricional. Las observaciones se registraron en el cuaderno de recogida de datos del examen de salud del animal.
Asignaciones de cerdos a grupos
Grupo 1 (n=22): 117, 118, 119, 121, 127, 128, 129, 131, 133, 136, 139, 141, 142, 144, 146, 147, 153, 154, 162, 163, 164 y 179 Grupo 2 (n=22): 123, 124, 125, 130, 134, 137, 138, 148, 149, 150, 156, 157, 158, 160, 161, 165, 167, 169, 170, 172, 177 y 178 Grupo 3 (n=12): 116, 120, 126, 132, 135, 145, 151, 152, 155, 159, 166y 171
Criterios de inclusion/exclusion
Todos los cerdos enrolados en este estudio fueron negativos por ELISA para PRRS (relacion S/P de ELISA de <0,4) y fueron sanos en el momento de la vacunacion (D0) como se ha determinado por observacion.
Criterios de descarte despues de la inclusion
No se descarto ningun cerdo del estudio. Se encontraron muertos tres cerdos antes de la administracion de exposicion. Mas resultados sobre estos tres cerdos se presentan en la Seccion 12.8.
Manipulacion y alojamiento de los animales
Los cerdos se alojaron en Veterinary Resources, Inc. (VRI) en Cambridge, IA, durante la duracion del estudio. Los cerdos se alojaron en multiples corrales (11 o 12 cerdos/corral) dentro de cada habitacion, con animales vacunados (Grupo 1) y de control (Grupos 2 y 3) alojados en habitaciones uniformes pero separadas para garantizar la bioseguridad. Los cerdos con MLV contra el PRRSV 94881 se alojaron en la Habitacion CB8 hasta D78, luego en CC1 hasta D105 y luego CC3 para el resto del estudio. Los cerdos del control de exposicion se alojaron en la Habitacion CC2 durante todo el estudio. Los cerdos del control negativo se alojaron en la Habitacion CB6 hasta D73 y luego en CB7 para el resto del estudio. Los corrales para los animales eran elevados con revestimiento del suelo de pizarra de plastico, con comederos apropiados para la edad y bebedores de boquilla y taza. Cada habitacion de aislamiento se construyo identica a las otras y todas cumplieron el nivel de biorriesgo 2 (BL2), se filtraron con Hepa, se ventilaron mecanicamente con control de temperatura regulado por termostato.
El aislamiento del grupo de tratamiento fue necesario en este estudio ya que es muy conocido dentro de la comunidad cientifica que el PRRSv se propaga facilmente de cerdo a cerdo por diversos mecanismos que incluyen la aerosolizacion. Esto incluye vacunas contra el PRRS vivas avirulentas ya que estos productos biologicos incluyen
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
partmulas vmcas atenuadas que imitan las caractensticas del PRRS natural virulento sin la capacidad para producir enfermedad. Los metodos apropiados fueron in situ para garantizar que se mantema la bioseguridad y que los animales vacunados no se contaminaban accidentalmente de forma cruzada con animales de control negativo sin tratamiento previo contra el PRRSv no vacunados.
El personal de la instalacion de prueba tomo medidas apropiadas para limpiar y desinfectar adecuadamente cada habitacion antes de su uso para este estudio.
Cada habitacion en la instalacion tema ventiladores y calefactores para ayudar en la suficiente circulacion y el calentamiento del aire. El sistema de ventilacion era separado aunque identico para cada habitacion, por lo que el aire no era compartido entre habitaciones.
El pienso solido se almaceno en bolsas, libres de bichos. El pienso y el agua estaban disponibles a voluntad. Los cerdos se alimentaron con pienso medicado para lactantes Lean Metrics (Purina Mills LLC, St. Louis, MO) desde la llegada hasta D5, cuando se cambiaron a pienso medicado senior Lean Metrics (Purina Mills LLC, St. Louis, MO). En D64 los cerdos se cambiaron a pienso Lean Metrics Complete 85 (Purina Mills LLC, St. Louis, MO) y en D82 se cambiaron a pienso Lean Metrics Complete CE85, T40 (Purina Mills LLC, St. Louis, MO), con el que se alimentaron para el resto del estudio. Durante el estudio, los piensos proporcionados fueron apropiados para el tamano, edad y condicion de los cerdos segun practicas de cna de animales aceptables para la region.
Los cerdos teman buen estado de salud y nutricional antes de iniciarse el estudio como se ha determinado por el investigador del estudio. Durante el estudio se observaron animales seleccionados con otras afecciones que inclrnan delgadez, tos, hinchazones, recubrimiento de pelo despeinado, depresion, abscesos y escasa condicion corporal. El investigador del estudio considero que todo esto eran condiciones que eran tfpicas de cerdos en crecimiento/maduracion alojados en grupo. Estas condiciones se consideraron transitorias o sin importancia y no se trataron.
Evaluacion de la eficacia
Para evaluar la DOI de MLV contra el PRRSV 94881 26 semanas despues de la vacunacion, los grupos de MLV contra el PRRSV 94881 y de control de exposicion se expusieron en D179 (DPC 0) y las lesiones pulmonares despues de la exposicion se evaluaron 10 dfas despues (DPC 10). Una DOI de 26 semanas despues de la vacunacion se logro cuando el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 tuvo patologfa pulmonar significativamente disminuida (p<0,05) (macroscopica o histologica) despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion.
Los parametros de eficacia secundaria analizados entre el grupo de vacunas y el grupo de control de exposicion incluyeron viremia despues de la vacunacion y despues de la exposicion, observaciones clmicas despues de la exposicion, temperaturas rectales despues de la exposicion, evaluaciones clmicas despues de la vacunacion, aumento de peso diario promedio (ADWG) y serologfa del PRRS. La viremia despues de la exposicion se considero que era el parametro secundario mas importante ya que es un parametro objetivo y cuantificable. La temperatura rectal y las observaciones clmicas se consideraron entonces de apoyo en el metodo de definicion de DOI. Por ultimo lugar, el rendimiento del crecimiento, la serologfa y la deteccion del virus en los pulmones se usaron como parametros de apoyo hacia los parametros primarios en satisfacer el objetivo del estudio.
Criterios para una prueba valida
Se requirio que todos los cerdos fueran negativos por ELISA para PRRS (relacion S/P de ELISA de <0,4) en el cribado antes de la compra y en D0. Se requirio que todos los cerdos del control de exposicion fueran negativos para anticuerpos del PRRS hasta la exposicion y se requirio que el grupo de control negativo fuera negativo para anticuerpos del PRRS durante el estudio.
Parametro de resultados primarios
La variable de resultados para eficacia primaria fue la patologfa pulmonar (lesiones macroscopicas e histologicas) en D189 (DPC 10) del estudio.
Puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica
En D189, despues de recogerse y registrarse los datos y las muestras, todos los cerdos restantes del estudio se sacrificaron siguiendo VRI SOP PRC1027 (Seccion 15.1). A cada cerdo se le practico la autopsia segun VRI SOP PRC 1028 (Seccion 15.1). La cavidad toracica de cada cerdo se expuso por un representante y se extrajeron el corazon y los pulmones. El investigador del estudio examino cada conjunto de pulmones, describio cualquier patologfa macroscopica y determino el porcentaje de patologfa para cada lobulo del pulmon. Las observaciones y los datos se registraron en el cuaderno de recogida de datos del informe de la autopsia.
Puntuaciones de lesion pulmonar histologica
Para cada conjunto de pulmones se retuvieron dos muestras de los lobulos apicales izquierdo y derecho, los lobulos
5
10
15
20
25
30
cardfacos izquierdo y derecho, los lobulos diafragmaticos izquierdo y derecho y el lobulo intermedio. Cada muestra de pulmon tema aproximadamente 1 pulgada (2,54 cm) x 1 pulgada (2,54 cm). Para un conjunto de muestras de pulmon, las tres muestras del lado izquierdo se combinaron en un recipiente; mientras que las tres muestras del lado derecho y la muestra del lobulo intermedio del pulmon se combinaron en otro recipiente. Cada recipiente se lleno con una cantidad suficiente de 10% de disolucion de formalina. Para el otro conjunto de muestras de pulmon, las tres muestras de pulmon del lado izquierdo se combinaron en un Whirlpak®; mientras que las tres muestras del lado derecho y la muestra del lobulo intermedio del pulmon se combinaron en otro Whirlpak®. Todos los recipientes y Whirlpak® se etiquetaron apropiadamente con el numero de animal, numero de estudio, fecha de recogida, dfa de estudio, tipo de muestra y si las muestras fueron del lado izquierdo o derecho. Las muestras de pulmon en formalina se almacenaron a temperatura ambiente mientras que las muestras de pulmon en Whirlpak® se almacenaron sobre nieve carbonica hasta que se transportaron a BIVI-Ames. Las recogidas de muestras se registraron en el cuaderno de recogida de datos del informe de la autopsia. Las muestras de tejido de pulmon fijadas en formalina y las muestras de pulmon en Whirlpak® se transfirieron a BIVI-Ames. Un cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes completo se incluyo con cada envfo.
Las muestras de tejido de pulmon fijadas en formalina fueron mantenidas por BIVI-Ames a temperatura ambiente hasta que fueron enviadas por BIVI-Ames al Laboratorio de diagnostico veterinario de la Universidad del Estado de Iowa (ISU VDL). Las muestras de pulmon fueron manipuladas y procesadas por personal de ISU VDL segun metodos de ISU VDL en el plazo de una semana desde la autopsia. Para cada cerdo se genero un unico portaobjetos que contema siete secciones (cada uno de los sietes lobulos del pulmon). Cada portaobjetos de H & E se identifico con un unico codigo identificador. El ISU VDL proporciono un registro informatico que contema el numero de estudio, codigos identificadores y tejidos de cerdo asociados.
Una vez al dfa, en los dfas en los que los portaobjetos del estudio se leyeron para histopatologfa, un patologo del ISU VDL (K. Schwartz) leyo primero los portaobjetos positivos y de control negativo del PRRS EU. Despues, el patologo leyo los portaobjetos de pulmon tenidos con H & E para hipertrofia e hiperplasia neumodtica, infiltracion septal con celulas mononucleares, residuos necroticos, acumulacion intraalveolar de celulas inflamatorias y acumulacion perivascular de celulas inflamatorias. Los resultados se registraron en una hoja de calculo de Excel. El sistema de puntuacion de histopatologfa pulmonar se muestra a continuacion en la Tabla 8.8.
Tabla 8.8 Sistema de puntuacion de histopatologfa pulmonar
Hipertrofia e hiperplasia neumocftica
Acumulacion intraalveolar de celulas inflamatorias
0 = no presente
0 = no presente
1 = leve
1 = leve
2 = moderada
2 = moderada
3 = grave
3 = grave
Infiltracion septal con celulas mononucleares
Acumulacion perivascular de celulas inflamatorias
0 = no presente
0 = no presente
1 = leve
1 = leve
2 = moderada
2 = moderada
3 = grave
3 = grave
Residuos necroticos
Definiciones del sistema de puntuacion aplicado a parametros histologicos (excepto residuos necroticos):
0 = no presentes
0 = no presente: lesiones no detectables presentes dentro
3 = sf presentes
de un area de vision 1 = lesiones leves: pocas celulas positivas (1-5 celulas/area) presentes dentro de un area de vision 2 = lesiones moderadas: multiples celulas positivas (>5 celulas/area) en una unica localizacion o pocas celulas (15 celulas/area) en multiples localizaciones dentro de un area de vision
3 = lesiones graves: multiples celulas positivas (>5 celulas/area) en multiples localizaciones dentro de un area de vision.
Tras completarse la lectura de todos los portaobjetos, los portaobjetos se devolvieron al representante del patrocinador y se archivaran en Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., St. Joseph, MO, hasta que se complete el informe final.
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Parametros secundarios
Las variables secundarias incluyeron viremia despues de la vacunacion y despues de la exposicion, observaciones clmicas despues de la exposicion, temperaturas rectales despues de la exposicion, aumento de peso diario promedio (ADWG), cuantificacion del PRRSv en los pulmones, evaluaciones clmicas despues de la vacunacion y serologfa del PRRS.
qPCR del PRRS en suero
Se recogio sangre venosa completa antes de la compra y en los dfas 0, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 168, 179 (DPC 0), 182 (DPC 3), 186 (DpC 7) y 189 (DPC 10). Brevemente, se recogieron aproximadamente 2-5 ml de sangre de cada cerdo en un tubo(s) separador(es) de suero (SST) de tamano apropiado. Se registraron las recogidas de muestras en el cuaderno de recogida de datos de la recogida de muestras. Se dejo que la sangre coagulara a temperatura ambiente en los SST. Las muestras de sangre fueron llevadas a BIVI-Ames el dfa de recogida y se completo el cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes. Las muestras de sangre se centrifugaron por BIVI-Ames y el suero se recogio, se fracciono y se transfirio a tubos apropiados. Cada tubo se etiqueto con el numero de ID del cerdo, el numero de estudio, la fecha de recogida, el dfa de estudio y el tipo de muestra. En BIVI- Ames, un conjunto de muestras de suero se mantuvo a 2-8°C y el otro conjunto de muestras de suero se mantuvo a -70 ± 10°C.
Observaciones clmicas despues de la exposicion
Los cerdos se observaron para signos clmicos de enfermedad de D178 (DPC -1) a D189 (DPC 10). Las observaciones se realizaron por el investigador del estudio o representantes y se registraron en el cuaderno de recogida de datos de las observaciones clmicas. Los cerdos se observaron cada dfa para respiracion, comportamiento y tos basandose en el sistema de puntuacion de observaciones clmicas explicado a continuacion en la Tabla 8.9.
Tabla 8.9 Sistema de puntuacion de observaciones clmicas
Respiracion
Comportamiento Tos
0 = respiracion normal 1 = respiracion jadeante/rapida 2 = disnea 3 = muerto
0 = normal 1 = letargo de leve a moderado 2 = gravemente letargico o recostado 3 = muerto 0 = sin tos 1 = tos suave o intermitente 2 = tos aspera o grave, repetitiva 3 = muerto
Temperaturas rectales
Las temperaturas rectales se recogieron por el investigador del estudio o representantes de D178 (DPC -1) a D189 (DPC 10). Las temperaturas rectales se registraron en unidades de °C en el cuaderno de recogida de datos de las observaciones clmicas.
Peso corporal y aumento de peso diario promedio
Los pesos corporales individuales se recogieron en D0, D179 (DPC 0) y D188 (DPC 9). Cada cerdo se peso en una bascula calibrada por el investigador del estudio o representantes. Los resultados se registraron en unidades de kg en el cuaderno de recogida de datos del peso corporal. El aumento de peso diario promedio se determino a partir de D179 (DPC 0) a D188 (DPC 9).
qPCR del PRRS en los pulmones
Las muestras de tejido de pulmon en Whirlpak® se mantuvieron a -70 ± 10°C en BIVI-Ames hasta que se enviaron a la direccion incluida en la Seccion 9.3.1. Un cuaderno de recogida de datos de la entrega de espedmenes completo se incluyo con el envm. BioScreen probo las muestras de pulmon para ARN del PRRSv por qPCR (Seccion 15.1). Los tejidos del pulmon izquierdo se homogeneizaron y se probaron. Los tejidos del pulmon derecho y las muestras del lobulo intermedio del pulmon se homogeneizaron y se probaron. Los resultados se informaron como equivalente de genoma (log-10 GE/ml) para muestras del pulmon izquierdo y derecho. Para cada cerdo, el estadfstico calculara un tttulo medio geometrico de valores de GE/ml derechos e izquierdos usando el programa SAS.
Evaluacion clmica despues de la vacunacion
Todos los cerdos se observaron para evaluaciones clmicas despues de la vacunacion por el investigador del estudio o representantes. Las observaciones se realizaren diariamente de D-1 a D21 y luego al menos tres veces a la semana de D22 a D177. Las observaciones se registraron en el cuaderno de recogida de datos de las evaluaciones clmicas.
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Serologfa del PRRS
Las muestras de suero recogidas antes de la compra y en los dfas 0, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 168, 179 (DPC 0), 182 (DPC 3), 186 (DPC 7) y 189 (DPC 10) y mantenidas a 2-8°C se probaron por BIVI-Ames para anticuerpos del PRRS (Seccion 15.1). Los resultados se informaron como negativos (relacion S/P de ELISA de < 0,4) o positivos (relacion S/P de ELISA de > 0,4).
Acontecimientos adversos
No se observaron acontecimientos adversos atribuidos a la MLV contra el PRRSV 94881 en este estudio.
Metodos estadfsticos Unidad experimental
Los grupos de tratamiento se alojaron en habitaciones separadas en este estudio para evitar la transmision del PRRSv a grupos no vacunados. Por tanto, la habitacion fue la unidad experimental. Sin embargo, para los fines de este analisis se ignoro un posible debido a confundir los efectos de “habitacion” y “tratamiento”, y el cerdo se uso como unidad estadfstica.
Aleatorizacion
Cincuenta y seis (56) cerdos se asignaron aleatoriamente a uno de los tres grupos. La aleatorizacion se realizo por BIVI. En el momento del envfo, el n° 140 y 143 (grupo de control de exposicion), ademas del n° 168 (grupo de MLV contra el 94881 del PRRS) se eliminaron. El numero 178 se selecciono aleatoriamente para sustituir al n° 140, el n° 177 se selecciono aleatoriamente para sustituir al 143 y el n° 179 se selecciono aleatoriamente para sustituir al n° 168 de un conjunto de cinco cerdos adicionales que cumplieron los criterios de inclusion. ANALISIS
Los analisis estadfsticos y los resumenes de datos se realizaron por Dr. rer. hort. Martin Vanselow, Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Alemania, +49(0) 511 606 777 650,
m.vanselow@t-online.de. Los datos se analizaron suponiendo una estructura de diseno completamente aleatoria. Los analisis estadfsticos se realizaron usando la version del software SAS 8.2 o superior (SAS, 2001, Cary, EE.UU./Carolina del Norte, SAS Institute Inc.). El cerdo 179 de MLV contra el PRRSV 94881 y los cerdos del control de exposicion 124 y 161 murieron antes de la exposicion y se excluyeron de los analisis despues de la exposicion. Todas las pruebas en diferencias se disenaron como pruebas bilaterales a a = 5%. El informe estadfstico se presenta en la Seccion 15.9.
Puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica
La puntuacion de lesion pulmonar macroscopica para cada cerdo se calculo usando los factores mostrados a continuacion en la Tabla 8.10 multiplicados por el % de patologfa para un lobulo del pulmon espedfico. Los calculos se realizaron usando el programa SAS.
Tabla 8.10 Factores para calcular las puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica
Lobulo del pulmon
Factor
Apical izquierdo
0,05
Cardfaco izquierdo
0,06
Diafragmatico izquierdo
0,29
Apical derecho
0,11
Cardfaco
0,10
Diafragmatico derecho
0,34
Accesorio/intermedio derecho
0,05
Los grupos de tratamiento se compararon en diferencias usando la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
Puntuaciones de lesion pulmonar histologica
Las puntuaciones histologicas individuales de las muestras de pulmon se acumularon por lobulo y animal. Esta puntuacion suma se dividio entre el numero de lobulos examinados por animal. Los resultados se usaron como valores individuales para la comparacion entre los grupos de tratamiento. Los grupos de tratamiento se probaron en diferencias usando la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
qPCR del PRRS en los pulmones
Los datos de PCR cuantitativa (carga vmca del PRRS [log-10 GE/ml]) de pulmones recogidos en D189 se usaron para comparaciones entre los grupos de tratamiento por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. El promedio (log-iQ GE/ml)
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de los resultados de qPCR del pulmon izquierdo y derecho se usaron para la evaluacion. Antes de los calculos, el resultado analftico 'no detectado' se sustituyo por log10 GE/ml de 0,0 y 'positivo' se sustituyo por 3,0.
Se generaron tablas de frecuencias de resultados de qPCR positivos. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
qPCR del PRRS en suero
Los datos de viremia se evaluaron por separado para cada dfa de investigacion. Adicionalmente, para la carga vmca se analizaron las areas bajo las curvas de respuesta individuales entre D179 y D189 (ABC 0-10) y entre D182 y D189 (ABC 3-10).
Los datos de PCR cuantitativa (carga vmca del PRRS [logi0 GE/ml]) se usaron para comparaciones entre los grupos de tratamiento por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. Antes de los calculos, el resultado analftico 'no detectado' se sustituyo por un valor de logi0 GE/ml de 0,0 y 'positivo' se sustituyo por 3,0. Los grupos de tratamiento se probaron en diferencias usando la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
Se generaron tablas de frecuencias de resultados de qPCR positivos. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Observaciones clmicas despues de la exposicion
Se generaron tablas de frecuencias de animales con al menos un hallazgo positivo entre D180 y D189. Las puntuaciones totales fueron la suma de la puntuacion de respiracion + la puntuacion de comportamiento + la puntuacion de tos. Los calculos se realizaron usando el programa SAS. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Las puntuaciones maximas y las puntuaciones medias por animal de D180 a D189 para respiracion, comportamiento, tos y para los tres sumados juntos (total) se usaron para la evaluacion estadfstica. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney.
Peso corporal y aumento de peso diario promedio
Los aumentos de peso diarios individuales se calcularon para el periodo de tiempo entre D179 a D188. Para cada dfa de investigacion y para el periodo de tiempo se calcularon las estadfsticas descriptivas. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron usando analisis de la varianza y posteriores pruebas de la t. Las medias por mmimos cuadrados de los grupos y las diferencias entre las medias por mmimos cuadrados con intervalos de confianza de 95% se calcularon a partir del analisis de la varianza.
Temperaturas rectales
Las diferencias entre los grupos de tratamiento con respecto a los datos de temperatura originales se probaron usando analisis de la varianza y posteriores pruebas de la t. Las medias por mmimos cuadrados de los grupos y las diferencias entre las medias por mmimos cuadrados con intervalos de confianza de 95% se calcularon a partir del analisis de la varianza.
Evaluacion clinica despues de la vacunacion
Se generaron tablas de frecuencias de animales con al menos un hallazgo positivo entre D1 y D21. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Serologfa del PRRS
Se generaron tablas de frecuencias de resultados positivos por ELISA para cada momento de tiempo. Las diferencias entre los grupos de tratamiento se probaron por la prueba exacta de Fisher.
Resultados
Puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica
Las medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica en D189 (DPC 10) fueron 0,1% y 13,8% para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y los controles de exposicion, respectivamente. La mediana de la puntuacion de lesion pulmonar macroscopica para cerdos vacunados contra el PRRS fue significativamente menor que la mediana de la puntuacion de lesion pulmonar macroscopica para los controles de exposicion (p<0,0001). La mediana de la puntuacion de lesion pulmonar macroscopica para el grupo de control negativo fue 0,0%.
El numero 123 (grupo de control de exposicion) no pudo puntuarse para lesiones pulmonares en D189 debido a pleuritis difusa y adhesiones. De los tejidos de pulmon de este cerdo se aislaron Moraxella osloensis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus hyicus y especies de Pseudomonas despues de la autopsia.
Un resumen de las puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica por grupo y el valor de p asociado se muestra a continuacion en la Tabla 8.11.
Tabla 8.11 Resumen de puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica por grupo (%) en D189
Grupo1
N3 Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
1
21 0,00 12,40 0,060 0,050 0,550 0,400 1,099 <0,0001
2
192 0,06 69,20 13,800 2,690 22,650 20,850 15,842
3
12 0,00 0,59 0,000 0,000 0,110 0,085 0,093 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de 5 control negativo. 2 El n° 123 no se puntuo debido a pleuritis difusa y adhesiones debido a infecciones bacterianas. 3 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico
Puntuaciones de lesion pulmonar histologica
Las medianas de las puntuaciones de lesion pulmonar histologica fueron 6,0 y 19,5 para el grupo vacunado con MLV 10 contra el PRRSV 94881 y los controles de exposicion, respectivamente. La mediana de la puntuacion de lesion pulmonar histologica para el grupo vacunado contra PRRS fue significativamente menor que la mediana de la puntuacion de lesion pulmonar histologica para controles de exposicion (p<0,0001). La mediana de la puntuacion de lesion pulmonar histologica para el grupo de control negativo fue 9,0.
Un resumen de las puntuaciones de lesion pulmonar histologica por grupo y el valor de p asociado se muestra a 15 continuacion en la Tabla 8.12.
Tabla 8.12 Resumen de puntuaciones de lesion pulmonar histologica por grupo
Grupo1
N2 Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
1
21 2 20 6,0 3,0 8,0 5,0 6,6 <0,0001
2
20 8 47 19,5 15,0 23,0 10,0 20,2
3
12 0 15 9,0 7,0 14,0 6,5 9,1 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. 2 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico
20 qPCR del PRRS en los pulmones
Las medianas de los valores de pulmon por qPCR de tejidos de pulmon fueron 3,69 y 6,25 log-10 GE/ml para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y controles de exposicion, respectivamente. La mediana del valor de qPCR para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 fue significativamente menor que la mediana del valor de qPCR para controles de exposicion (p<0,0001). No se detecto ARN del PRRSv en muestras de pulmon de 25 ningun cerdo de control negativo.
Un resumen de valores de qPCR de pulmon por grupo y el resultado de la prueba (valor de p) esta continuacion en la Tabla 8.13.
Tabla 8.13 Resumen de los valores de qPCR de pulmon por grupo (media log-ig GE/ml)
Grupo1
N2 Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
1
21 0,00 6,83 3,69 1,50 5,21 3,18 3,36 <0,0001
2
20 4,80 7,40 6,25 5,62 6,68 1,26 6,22
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de 30 control negativo. 2 Un cerdo con MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico
Se detecto ARN del PRRSv en tejidos de pulmon de 90% y 100% de cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y cerdos del control de exposicion, respectivamente. No hubo diferencia estadfstica entre el grupo vacunado y los controles de exposicion (p=0,4878).
35 Un resumen de frecuencia por grupo de tejidos de pulmon positivos por qPCR para PRRS de cerdos en la autopsia se muestra a continuacion en la Tabla 8.14.
Grupo1
N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total2 Valor de p
1
19 90 69,6 98,8 21 0,4878
2
20 100 83,2 100,0 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. 2 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico
5 qPCR del PRRS en suero
No se detecto ARN del PRRSv en el suero de ningun cerdo en D0. Despues de la vacunacion, los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron valores medios de 3,00, 0, 0, 3,00, 0, 0, 0, 0 y 0 log-io GE/ml en D7, D14, D21, D28, D56, D84, D112, D140 y D168, respectivamente. Los valores fueron significativamente superiores a los de los controles de exposicion en D7, D14, D21 y D28 (p<0,0013), ya que los controles de exposicion no detectaron 10 ARN del PRRSv hasta D182 (DPC 3).
No se detecto ARN del PRRSv en el suero de ningun cerdo en D179 (DPC 0). Despues de la exposicion, los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron valores medios de 4,44, 0 y 0 log-10 GE/ml en D182 (DPC 3), D186 (DPC 7) y D189 (DPC 10), respectivamente, en comparacion con 5,88, 5,30 y 4,24 log-10 GE/ml para controles de exposicion en los mismos dfas. Los valores medios para los controles de exposicion fueron superiores a los del 15 grupo de MLV contra el PRRSV 94881 en todos los dfas despues de la exposicion (p<0,0001).
No se detecto ARN del PRRSv en suero de ningun cerdo de control negativo durante este estudio.
Las medianas de los valores del ABC para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 fueron 15,54 y 8,88 log-10 GE/ml por dfa de DPC 0 a DPC 10 y de DPC 3 a DPC 10, respectivamente. A diferencia, las medianas de los valores del ABC para controles de exposicion fueron 44,77 y 36,43 log-10 GE/ml por dfa de DPC 0 a DPC 10 y de 20 DPC 3 a DPC 10, respectivamente. Los valores medios para el grupo de MLV contra PRRS MLV fueron significativamente inferiores a los valores medios para los controles de exposicion para ambos periodos (p<0,0001).
Los resumenes de los datos de qPCR para PRRS en suero se muestran a continuacion en las Tablas 8.15 y 8.16.
Tabla 8.15 Resumen de resultados por qPCR para PRRS en suero (log-10 GE/ml) de D0 a D168
Dia
Grupo1 N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
0
1 22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
7
1 21 3,00 4,63 3,00 3,00 3,00 0,00 3,23 <0,0001
2
22 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
14
1 21 0,00 3,00 0,00 0,00 3,00 3,00 1,43 0,0005
2
21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
21
1 21 0,00 3,00 0,00 0,00 3,00 3,00 1,29 0,0013
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
28
1 21 0,00 3,88 3,00 0,00 3,00 3,00 1,93 <0,0001
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
56
1 21 0,00 3,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,57 0,1069
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
84
1 21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3 12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
112
1 21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
140
1 21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
168
1 21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. NI = no incluido en el analisis estadfstico
Tabla 8.16 Resumen de resultados por qPCR para PRRS en suero (logio GE/ml) de D179 a D189
Dia
Grupo1 N Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
179 (DPC 0)
1 21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
182 (DPC 3)
1 21 3,00 5,58 4,44 3,93 5,28 1,51 4,42 <0,0001
2
20 5,09 6,33 5,88 5,75 6,00 0,32 5,81
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
186 (DPC 7)
1 21 0,00 3,74 0,00 0,00 0,00 0,00 0,61 <0,0001
2
20 3,66 6,57 5,30 4,86 5,69 1,08 5,30
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
189 (DPC 10)
1 21 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 <0,0001
2
20 0,00 5,88 4,24 3,71 4,42 1,18 3,97
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
ABC DPC 010
1 21 10,50 31,22 15,54 13,76 19,53 5,95 17,61 <0,0001
2
20 36,86 52,16 44,77 43,23 48,03 6,24 44,84
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
ABC DPC 3- DPC 10
1 21 6,00 23,45 8,88 7,86 11,16 3,40 10,97 <0,0001
2
20 27,77 43,02 36,43 34,60 38,53 5,23 36,12
3
12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de 5 control negativo. NI = no incluido en el analisis estadfstico. ABC = area bajo la curva; log1o GE/ml por dfa
Despues de la vacunacion, el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 tuvo proporciones de cerdos positivos por qPCR significativamente mayores en D7, D14, D21 y D28 en comparacion con el grupo de control de exposicion. (p<0,0013). No se detecto diferencia significativa entre grupos en D56 para la proporcion de cerdos positivos por qPCR (p=0,1069).
10 En D182 (DPC 3), 100% de los cerdos en los grupos de MLV contra el PRRSV 94881 y de control de exposicion fueron positivos por qPCR (no se realizo la prueba). En D186 (DPC 7) y D189 (DPC 10), el grupo de MlV contra PRRS tuvo una proporcion de cerdos positivos por qPCR significativamente menor en comparacion con el grupo de control de exposicion (<0,0001).
Los resumenes de las proporciones por grupo de datos positivos por qPCR se muestran a continuacion en las 15 Tablas 8.17 y 8,18.
Dia
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total Valor de p
0
1 0 0 0,0 15,4 22 n.a.
2
0 0 0,0 15,4 22
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
7
1 21 100 83,9 100,0 21 <0,0001
2
0 0 0,0 15,4 22
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
14
1 10 48 25,7 70,2 21 0,0005
2
0 0 0,0 16,1 21
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
21
1 9 43 21,8 66,0 21 0,0013
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
28
1 13 62 38,4 81,9 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
56
1 4 19 5,4 41,9 21 0,1069
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
84
1 0 0 0,0 16,1 21 n.a.
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
112
1 0 0 0,0 16,1 21 n.a.
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
140
1 0 0 0,0 16,1 21 n.a.
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
168
1 0 0 0,0 16,1 21 n.a.
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. n.a. = no se realizo la prueba; NI = no incluido en el analisis estadfstico
Tabla 8.18 Resumen de la proporcion por grupo de resultados positivos por qPCR en suero despues de la 5 exposicion
Dia
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total Valor de p
179 (DPC 0)
1 0 0 0,0 16,1 21 n.a.
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
182 (DPC 3)
1 21 100 83,9 100,0 21 n.a.
2
20 100 83,2 100,0 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
186 (DPC 7)
1 4 19 5,4 41,9 21 <0,0001
2
20 100 83,2 100,0 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
189 (DPC 10)
1 0 0 0,0 16,1 21 <0,0001
2
19 95 75,1 99,9 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
5
10
15
20
25
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. n.a. = no se realizo la prueba; NI = no incluido en el analisis estadfstico
Observaciones clmicas despues de la exposicion
No se observo respiracion anormal en ningun cerdo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 despues de la exposicion en comparacion con un cerdo del control de exposicion (n° 149) que demostro una puntuacion de “1” en D185 (DPC 6). No se detecto diferencia entre grupos para el porcentaje de cerdos que demostro la respiracion anormal durante al menos un dfa despues de la exposicion (p=0,4878).
No se observaron comportamiento y tos anormal despues de la exposicion en ningun cerdo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 o en cerdos del control de exposicion.
Los porcentajes de cerdos con las puntuaciones clmicas totales > 0 durante al menos un dfa despues de la exposicion fueron 0% y 5% para el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Estos valores no fueron significativamente diferentes (p=0,4878).
No se observaron signos clmicos en el grupo de control negativo de D179 a D189.
Un resumen de las frecuencias por grupo de cerdos con al menos una puntuacion de observacion clinica positiva durante el periodo despues de la exposicion se muestra a continuacion en la Tabla 8.19.
Tabla 8.19 Resumen de las frecuencias por grupo de cerdos con al menos una puntuacion de observacion clinica positiva despues de la exposicion
Parametro
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total2 Valor de p
Respiracion
1 0 0 0,0 16,1 21 0,4878
2
1 5 0,1 24,9 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
Comportamiento
1 0 0 0,0 16,1 21 NA
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
Tos
1 0 0 0,0 16,1 21 NA
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
Total
1 0 0 0,0 16,1 21 0,4878
2
1 5 0,1 24,9 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. 2 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico; NA = prueba no aplicable debido a la falta de variabilidad
No hubo diferencia entre grupos para puntuaciones de respiracion maximas o puntuaciones totales maximas despues de la exposicion (p=0,4878).
Un resumen de las puntuaciones de observaciones clmicas maximas por grupo para el periodo despues de la exposicion (DPC 1 a DPC 10) se muestra a continuacion en la Tabla 8.20.
Tabla 8.20 Resumen de puntuaciones clmicas maximas despues de la exposicion por grupo
Parametro
Grupo1 N2 Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
Respiracion
1 21 0 0 0 0 0 0 0,0 0,4878
2
20 0 1 0 0 0 0 0,1
3
12 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
Comportamiento
1 21 0 0 0 0 0 0 0,0 1,0000
2
20 0 0 0 0 0 0 0,0
3
12 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
Tos
1 21 0 0 0 0 0 0 0,0 1,0000
5
10
15
20
25
2 20 0 0 0 0 0 0 0,0
3
12 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
Total
1 21 0 0 0 0 0 0 0,0 0,4878
2
20 0 1 0 0 0 0 0,1
3
12 0 0 0 0 0 0 0,0 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. 2 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico
Las puntuaciones de observaciones clmicas medias siguieron un patron similar al porcentaje de cerdos con puntuaciones clmicas positivas. No hubo diferencias significativas entre el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion (p>0,4878). Un resumen de las puntuaciones de observaciones clmicas medias por grupo para el periodo despues de la exposicion (DPC 1 a DPC 10) se muestra a continuacion en la Tabla 8.21.
Tabla 8.21 Resumen de puntuaciones clmicas medias despues de la exposicion por grupo
Parametro
Grupo1 N2 Mm. Max. Mediana IC de 95% Rango de Q Media Valor de p
Respiracion
1 21 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,4878
2
20 0,0 0,1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01
3
12 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
Comportamiento
1 21 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
20 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
Tos
1 21 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0000
2
20 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
3
12 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
Total
1 21 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,4878
2
20 0,0 0,1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01
3
12 0,0 0,0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. 2 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico
Peso corporal y aumento de peso diario promedio
La diferencia entre grupos no fue significativa (p=0,2389). En D179 (DPC 0), los pesos corporales medios y medios por LS fueron 134,6 y 128,2 kg para el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. La diferencia no fue significativamente diferente (p=0,1090). En D188 (DPC 9), los pesos corporales medios y medios por LS fueron 138,3 y 130,3 kg para el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. El peso corporal para el grupo vacunado fue significativamente superior al del grupo de control de exposicion en D188 (p=0,0455).
Los ADWG medios por LS durante el periodo de exposicion (DPC 0 a DPC 9) fueron 0,4 y 0,2 kg/d para el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion, respectivamente. Estos valores no fueron significativamente diferentes (p=0,1041).
Los cerdos del control negativo tuvieron pesos corporales medios de 2,7, 117,2 y 120,0 kg en D0, D179 y D188, respectivamente. El ADWG para el grupo de control negativo de D179 a D188 fue 0,5 kg/d.
Un resumen del pesos corporales medios por grupo en D0, D179 (DPC 0) y D188 (DPC 9) y ADWG de DPC 0 a DPC 9 se muestra a continuacion en la Tabla 8.22. Un resumen de media por LS y analisis estadfstico de pesos corporales y ADWG para el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 y el grupo de control de exposicion se muestra a continuacion en la Tabla 8.23.
Dia(s)
Grupo1 N Mm. Max. Mediana Media DE
Pesos corporales en 0
1 22 2,8 5,4 4,00 3,96 0,730
2
22 2,4 4,8 3,75 3,72 0,547
3
12 2,7 4,5 3,60 3,71 0,552
Pesos corporales en D179 (DPC 0)
1 21 108,5 155,0 136,60 134,57 12,737
2
20 103,3 152,6 130,10 128,15 12,288
3
12 117,2 156,5 133,05 134,61 10,900
Pesos corporales en D188 (DPC 9)
1 21 112,2 157,8 141,50 138,28 12,879
2
20 109,4 150,9 131,90 130,27 11,896
3
12 120,0 162,5 136,60 139,11 11,922
ADWG DPC 0 a DPC 9
1 21 -0,422 0,956 0,4111 0,4124 0,31653
2
20 -0,589 0,844 0,2889 0,2350 0,36530
3
12 -1,600 2,656 0,5111 0,5000 0,92391
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo
Tabla 8.23 Resumen del peso corporal medio por LS por grupo y aumento diario (kg y kg/d)
Dia(s)
Grupo1 Media por LS Intervalo de confianza de 95% Valor de p
Pesos corporales en 0
1 3,96 3,674 4,241 0,2389
2
3,72 3,446 4,000
Dif. 1-2
0,23 -0,162 0,631
Pesos corporales en D179 (DPC 0)
1 134,57 129,040 140,093 0,1090
2
128,15 122,487 133,813
Dif. 1-2
6,42 -1,496 14,329
Pesos corporales en D188 (DPC 9)
1 138,28 132,800 143,756 0,0455
2
130,27 124,652 135,878
Dif. 1-2
8,01 0,170 15,856
ADWG DPC 0 a DPC 9
1 0,4124 0,26180 0,56297 0,1041
2
0,2350 0,08070 0,38930
Dif. 1-2
0,1774 -0,03822 0,39299
5 1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de
control negativo
Temperatures rectales
La temperature rectal media para el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 fue 39,3°C en el dfa de exposicion (D179) y las medias oscilaron de 39,1°C (D189, DPC 10) a 39,8°C (D181, DPC 2) despues de la exposicion. La 10 temperatura rectal media para el grupo de control de exposicion fue 39,1°C en el dfa de exposicion y las medias oscilaron de 39,1°C (D183, DPC 4) a 39,9°C (D182, DpC 3) despues de la exposicion. Las temperaturas rectales medias para el grupo de control negativo siguieron siendo < 39,3°C durante el mismo periodo de tiempo.
Un resumen de las temperaturas rectales por grupo se muestra a continuacion en la Tabla 8.24. Tabla 8.24 Resumen de temperatura rectal por grupo (°C) Dfas D179 (DPC 0) a D189 (DPC 10)
Dia
Grupo1 N2 Mm. Max. Mediana Media DE
D179 (DPC 0)
1 21 38,5 40,0 39,40 39,33 0,360
2
20 38,6 40,0 39,00 39,07 0,380
3
12 38,8 39,7 39,30 39,27 0,257
D180 (DPC 1)
1 21 38,7 40,4 39,40 39,46 0,370
2
20 38,9 40,9 39,60 39,61 0,527
Dia
Grupo1 N2 Mm. Max. Mediana Media DE
3 12 38,8 39,5 39,00 39,09 0,227
D181 (DPC 2)
1 21 39,0 41,0 39,80 39,82 0,473
2
20 38,6 40,5 39,35 39,42 0,487
3
12 38,8 39,2 38,80 38,90 0,141
D182 (DPC 3)
1 21 38,5 40,6 39,50 39,52 0,542
2
20 39,0 41,1 40,05 39,86 0,588
3
12 38,7 39,4 39,00 39,05 0,254
D183 (DPC 4)
1 21 38,9 40,8 39,50 39,52 0,411
2
20 38,4 40,3 39,00 39,08 0,508
3
11 38,8 39,4 39,10 39,08 0,209
D184 (DPC 5)
1 21 39,0 40,3 39,70 39,72 0,360
2
20 38,7 39,7 39,10 39,15 0,302
3
12 38,8 39,5 39,10 39,10 0,191
D185 (DPC 6)
1 21 39,1 40,5 39,60 39,66 0,376
2
20 38,9 40,9 39,25 39,48 0,546
3
12 38,4 39,4 38,85 38,88 0,313
D186 (DPC 7)
1 21 38,1 40,4 39,20 39,22 0,413
2
20 38,6 40,4 39,35 39,39 0,479
3
12 38,5 39,6 38,90 38,98 0,328
D187 (DPC 8)
1 21 38,8 39,9 39,20 39,23 0,290
2
20 38,8 40,8 39,45 39,58 0,573
3
12 38,5 39,5 38,85 38,93 0,296
D188 (DPC 9)
1 21 38,8 39,9 39,10 39,17 0,288
2
20 38,3 40,5 39,00 39,20 0,598
3
12 38,4 39,1 38,85 38,85 0,173
D189 (DPC 10)
1 21 38,7 39,7 39,00 39,06 0,256
2
20 39,0 40,8 39,50 39,51 0,408
3
12 38,6 39,3 39,05 39,00 0,226
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. 2 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis
Las temperaturas rectales medias por mmimos cuadrados fueron significativamente mayores para cerdos vacunados 5 con MLV contra el PRRSV 94881 en comparacion con los controles de exposicion en DpC 0 (p=0,0281), DPC 2 (p=0,0095), DPC 4 (p=0,0034) y DPC 5 (p<0,0001). Las temperaturas rectales medias por mmimos cuadrados fueron significativamente inferiores para cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 en comparacion con los controles de exposicion en DPC 8 (p=0,0183) y en DPC 10 (p=0,0001). No se detectaron diferencias significativas entre grupos para los restantes dfas despues de la exposicion (p>0,0642). Un resumen de la media por 10 LS por grupo y el analisis estadfstico de la temperatura rectal se muestra a continuacion en la Tabla 8.25.
Tabla 8.25 Resumen de la temperatura rectal media por LS por grupo (°C) D179 (DPC 0) a D189 (DPC 10)
Dia
Grupo1 Media por LS Intervalo de confianza de 95% Valor de p
D179 (DPC 0)
1 39,33 39,170 39,496 0,0281
2
39,07 38,903 39,237
Dif. 1-2
0,26 0,030 0,497
D180 (DPC 1)
1 39,46 39,257 39,657 0,3025
2
39,61 39,400 39,810
Dif. 1-2
-0,15 -0,434 0,138
D181 (DPC 2)
1 39,82 39,612 40,036 0,0095
2
39,42 39,198 39,632
Dia
Grupo1 Media por LS Intervalo de confianza de 95% Valor de p
Dif. 1-2 0,41 0,105 0,712
D182 (DPC 3)
1 39,52 39,274 39,773 0,0642
2
39,86 39,604 40,116
Dif. 1-2
-0,34 -0,693 0,021
D183 (DPC 4)
1 39,52 39,320 39,727 0,0034
2
39,08 38,867 39,283
Dif. 1-2
0,45 0,158 0,740
D184 (DPC 5)
1 39,72 39,572 39,866 <0,0001
2
39,15 38,999 39,301
Dif. 1-2
0,57 0,359 0,779
D185 (DPC 6)
1 39,66 39,457 39,869 0,2164
2
39,48 39,269 39,691
Dif. 1-2
0,18 -0,112 0,478
D186 (DPC 7)
1 39,22 39,027 39,421 0,2408
2
39,39 39,188 39,592
Dif. 1-2
-0,17 -0,448 0,116
D187 (DPC 8)
1 39,23 39,034 39,432 0,0183
2
39,58 39,376 39,784
Dif. 1-2
-0,35 -0,631 -0,062
D188 (DPC 9)
1 39,17 38,966 39,377 0,8454
2
39,20 38,989 39,411
Dif. 1-2
-0,03 -0,323 0,266
D189 (DPC 10)
1 39,06 38,908 39,207 0,0001
2
39,51 39,352 39,658
Dif. 1-2
-0,45 -0,662 -0,234
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo
Tres de 21 (14%) cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 y 5 de 20 (25%) controles de exposicion tuvieron una temperature rectal > 40,5°C durante al menos un dfa despues de la exposicion. No se detecto diferencia 5 entre grupos para la proporcion de cerdos que presento a temperature rectal > 40,5°C durante al menos un dfa despues de la exposicion (p=0,4537). Un resumen de la proporcion por grupo de cerdos con fiebre (> 40,5°C) durante al menos un dfa despues de la exposicion se muestra a continuacion en la Tabla 8.26.
Tabla 8.26 Resumen de la proporcion por grupo de fiebre (> 40,5°C) durante al menos un dfa despues de la exposicion
Dia
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total2 Valor de p
D180(DPC 1) a D189 (DPC 10)
1 3 14 3,0 36,3 21 0,4537
2
5 25 8,7 49,1 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
10 1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de
control negativo. 2 Un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion murieron antes de la exposicion y no se incluyeron en el analisis. NI = no incluido en el analisis estadfstico
Evaluacion clinica despues de la vacunacion
Cuatro de 22 (18%) cerdos de MLV contra el 94881 del PRRS, 8 de 22 (36%) cerdos del control de exposicion y 2 15 de 12 (17%) cerdos del control negativo presentaron una evaluacion clinica anormal durante al menos un dfa de D1 a D21. No hubo diferencia significativa entre grupos para este parametro (p=0,3102).
Un resumen del porcentaje por grupo de cerdos con al menos un evaluacion clinica anormal de D1 a D21 se muestra a continuacion en la Tabla 8.27.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Grupo1
N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total Valor de p
1
4 18 5,2 40,3 22 0,3102
2
8 36 17,2 59,3 22
3
2 17 2,1 48,4 12 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. NI = no incluido en el analisis estadfstico
En conjunto, 7 cerdos de MLV contra el PRRSV 94881 presentaron una evaluacion clmica anormal durante al menos un dfa entre D1 y D177:
El cerdo 121 presento hinchazon de la barriga de D61 a D146, una vaina hinchada de D147 a D167, hinchazon de la barriga en D168, una vaina hinchada de D169-172 e hinchazon de la barriga de 173 a 177. El cerdo 141 estuvo delgado de D4-D10, estuvo deprimido de D4-D6 y con recubrimiento de pelo despeinado en D5. El cerdo 144 presento tos en D26. El cerdo 146 presento hinchazon en el esternon en D82. El cerdo 147 tuvo debilidad en las patas de D84-D86 y tuvo sacudidas en D84. El cerdo 154 estuvo delgado de D4-D6. El cerdo 179 estuvo delgado de D2-D5, presento recubrimiento de pelo despeinado en D5 y se encontro muerto en D6. Trece cerdos en el grupo de control de exposicion presentaron una evaluacion clmica anormal durante al menos un dfa de D1 a D177: el cerdo 124 presento sacudidas y temblores en D20 y se encontro muerto en D21. El cerdo 134 presento una vaina hinchada de D46-D68, hinchazon de la barriga de D69-D143, una hernia umbilical en D144 e hinchazon de la barriga de D145 a D177. El cerdo 137 presento una vaina hinchada de D108-D143. El cerdo 138 presento una vaina hinchada de D115-D143. El cerdo 148 presento cojera o una pata hinchada de D16-20 y tos en D35. El cerdo 149 estuvo delgado de D5-D9 y en D12 y presento recubrimiento de pelo despeinado de D12-D15. El cerdo 150 estuvo delgado de D4-D9 y en D13, presento mala condicion corporal de D10-D12 y estuvo deprimido en D11. El cerdo 161 estuvo delgado de D4-D9, presento recubrimiento de pelo despeinado y signos del sistema nervioso central en D9 y se encontro muerto en D10. El cerdo 167 presento una vaina hinchada de D117-D143. El cerdo 170 estuvo delgado de D4-D7 y presento depresion en D7. El cerdo 172 presento una llaga o una garra hinchada de D120-D143. El cerdo 177 presento depresion en D19 e hinchazon en el cuello de D156-D159. El cerdo 178 presento depresion en D5, de D17-20 y de D28-D36, estuvo cojo y/o pata hinchada de D15-D47, estuvo delgado de D16-D18 y tuvo entumecimiento de las patas de D39-D47. Seis cerdos en el control negativo presentaron una evaluacion clmica anormal durante al menos un dfa de D1 a D177. El cerdo 120 presento tos de D5-7 y en D12. El cerdo 126 estuvo delgado de D2-18, presento depresion de D4-D5, en D10 y de D17-D19, recubrimiento de pelo despeinado en D5 y respiracion fatigosa de D18-D22. El cerdo 132 presento un absceso de D49-D56. El cerdo 145 presento una vaina hinchada de D37-D43 y de D46 a D74, y una llaga en la vaina de D75-D83 y de D85 a D87. El cerdo 151 presento cojera y/o una pata hinchada de D78-D83 y en D85. El cerdo 155 presento un absceso en D69-D77.
Se produjeron tres mortalidades antes de la exposicion. Cerdo 179 (MLV contra el 94881 del PRRS, D6): la autopsia revelo lesiones mmimas (delgado, mala condicion corporal). Las pruebas de laboratorio mostraron una leve neumoma intersticial macrofagica. La inmunohistoqmmica fue negativa para PRRS. Las muestras intestinales se autolisaron, pero no mostraron pruebas de necrosis grave o inflamacion grave. Se aislaron sin complicaciones Escherichia coli y Enterococcus spp (Seccion 15.9). Cerdo 124 (control de exposicion, D21): no se identificaron lesiones macroscopicas en la autopsia. Las pruebas de laboratorio revelaron meningoencefalitis supurativa a piogranulomatosa grave con perivasculitis supurativa. Tambien fue evidente la marcada congestion pulmonar y hepatica. El diagnostico fue meningoencefalitis asociada a Streptococcus suis. Cerdo 161 (control de exposicion, D10): la autopsia revelo lesiones mmimas (delgado, mala condicion corporal). De tejidos de pulmon se aislaron Bordetella bronchiseptica, Streptococcus alfa hemolftico y Staphylococcus auricularis.
Serologfa del PRRS
Todos los cerdos fueron negativos por ELISA para PRRS en D0 y D7. En D14, 90% de los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron tftulos de ELISA positivos para PRRS. Este numero aumento al 95% en D21 y fue 100%, 100%, 100%, 90%, 100% y 95% en D28, D56, D84, D112, D140 y D168, respectivamente. Ninguno de los cerdos del control de exposicion desarrollo tftulos de anticuerpos del PRRS durante la fase de vacunacion de este estudio, y de D14 a D168, un porcentaje significativamente mayor de cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron tftulos de anticuerpos del PRRS positivos en comparacion con los controles de exposicion
(p<0,0001).
Durante la fase de exposicion del estudio, los porcentajes de cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 con tftulos de ELISA positivos para PRRS fueron 95%, 95%, 100% y 100% en DPC 0, DPC 3, DPC 7 y DPC10, respectivamente. A diferencia, los cerdos del control de exposicion no desarrollaron tftulos de anticuerpos del PRRS hasta DPC 7, cuando 30% tuvo tftulos. Este aumento al 80% en DPC 10. Los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron mayores porcentajes de animales con tftulos de anticuerpos del PRRS positivos durante la fase de exposicion del estudio (p<0,0478).
Los cerdos en el grupo de control negativo fueron seronegativos por ELISA para PRRS durante el estudio, con la
excepcion de dos cerdos en D112. Los numeros 116 y 120 fueron seropositivos por ELISA para PRRS en D112.
Un resumen de porcentajes por grupo de cerdos con tttulos de anticuerpos del PRRS positivos antes de la exposicion se muestra a continuacion en la Tabla 8.28. Los datos de la porcion de exposicion del estudio se muestran a continuacion en la Tabla 8.29.
5 Tabla 8.27 Resumen de la frecuencia por grupo de cerdos con titulo de anticuerpos del PRRS positivos por dfa, Dfas 0-168
Dia
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total Valor de p
0
1 0 0 0,0 15,4 22 NA
2
0 0 0,0 15,4 22
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
7
1 0 0 0,0 16,1 21 NA
2
0 0 0,0 15,4 22
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
14
1 19 90 69,6 98,8 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,1 21
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
21
1 20 95 76,2 99,9 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
28
1 21 100 83,9 100,0 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
56
1 21 100 83,9 100,0 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
84
1 21 100 83,9 100,0 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
112
1 19 90 69,6 98,8 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
2 17 2,1 48,4 12 NI
140
1 21 100 83,9 100,0 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
168
1 20 95 76,2 99,9 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de
control negativo. NI = no incluido en el analisis estadfstico. NA = no aplicable, no expuesto
Tabla 8.29 Resumen de frecuencia por grupo de cerdos con tftulo de anticuerpos del PRRS positivos por dfa, DPC 0 10 aDPC 10
Dia
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total Valor de p
D179 (DPC 0)
1 20 95 76,2 99,9 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
D182 (DPC 3)
1 20 95 76,2 99,9 21 <0,0001
2
0 0 0,0 16,8 20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Dia
Grupo1 N° de positivos % de positivos IC de 95% Numero total Valor de p
3 0 0 0,0 26,5 12 NI
D186 (DPC 7)
1 21 100 83,9 100,0 21 <0,0001
2
6 30 11,9 54,3 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
D189 (DPC 10)
1 21 100 83,9 100,0 21 0,0478
2
16 80 56,3 94,3 20
3
0 0 0,0 26,5 12 NI
1 Grupo 1 = vacuna MLV contra el 94881 del PRRS; Grupo 2 = grupo de control de exposicion; Grupo 3 = grupo de control negativo. NI = no incluido en el analisis estadfstico.
Discusion/Conclusion
Para lograr el objetivo del estudio, veintidos (22) cerdos sanos, susceptibles y seronegativos para PRRS se inocularon IM con 1 ml de MLV contra el PRRSV 94881 a aproximadamente 14 dfas de edad. Treinta y cuatro (22 cerdos del grupo de control de exposicion y 12 cerdos del grupo de control negativo) cerdos susceptibles y seronegativos para PRRS se inocularon IM con 1 ml de producto de control a aproximadamente 14 dfas de edad.
Validacion del estudio y modelo de exposicion
Los cerdos en el grupo de control negativo siguieron siendo negativos para PRRSv (viremia; qPCR) durante el estudio. Dos cerdos (n° 116 y 120) en el grupo de control negativo tuvieron tttulos positivos por ELISA en D112, mientras que todos los otros resultados de ELISA para este grupo fueron negativos. Considerando que no se detecto viremia en estos cerdos o en el grupo como conjunto; asimismo, todas las muestras de suero fueron negativas por ELISA, los resultados para estos dos cerdos en D112 se consideraron falsos positivos posiblemente debido a un error de laboratorio inasignable. Por tanto, este fue un estudio valido. Sin guardar relacion con el establecimiento de un estudio valido, el grupo de control negativo tuvo una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar histologica de 9,0 en D189 a diferencia de una mediana de la puntuacion de lesion macroscopica de 0,0%. Estos datos ponen de relieve que los cerdos alojados bajo condiciones de cna de cerdos normales durante un periodo de tiempo prolongado desarrollan lesiones pulmonares menores que son sin importancia y no estan relacionadas con patogenos espedficos.
Tras la inoculacion con la cepa aislada del PRRS europea 205817 mediante el metodo descrito anteriormente, el grupo de control de exposicion presento un ADWG medio de DPC 0 a DPC 9 de 0,2 kgMa (un ADWG medio de 0,5 kg/dfa para el grupo de control negativo), una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar macroscopica de 13,8% (0,0% para el grupo de control negativo), una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar histologica de 19,5 (9,0 para el grupo de control negativo) y un valor medio de 6,25 log-10 GE/ml para la deteccion de ARN del PRRSv en el tejido de pulmon (mediana de 0,0 log-10 GE/ml para el grupo de control negativo). Estos resultados ponen de relieve que la enfermedad clinica espedfica para PRRS se indujo en el grupo de control de exposicion, validandose asf este modelo de exposicion como una herramienta de laboratorio clmico adecuada para evaluar la eficacia de la vacuna contra el PRRS y mas espedficamente una duracion de26 semanas de inmunidad de MLV contra el 94881 del PRRS.
Determinacion de la duracion de 26 semanas de la inmunidad de MLV contra el PRRSV 94881
La determinacion de la DOI para MLV contra el PRRSV 94881 de 26 semanas despues de la vacunacion se baso en el grupo de vacunas que presentaba una reduccion significativa (p<0,05) en lesiones pulmonares (macroscopicas o histologicas) despues de la exposicion en comparacion con el grupo de control de exposicion.
Las lesiones pulmonares macroscopicas e histologicas se seleccionaron como el parametro primario para la determinacion de la DOI de 26 semanas debido a que este parametro proporciona las pruebas de eficacia mas clmicamente relevantes y convincentes cuando se evalua una nueva vacuna dentro del modelo de exposicion respiratoria del PRRS en cerdos. El desarrollo de lesiones pulmonares es uno de los distintivos de la enfermedad de PRRS respiratoria en cerdos y puede considerarse la fuente para todas las posteriores manifestaciones de caractensticas de la enfermedad por el PRRSv secundarias tales como signos clmicos, fiebre, disminucion del ADWG, etc.
El grupo de MLV contra el PRRSV 94881 presento una reduccion significativa en la patologfa pulmonar macroscopica despues de la exposicion, como se demuestra por una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar macroscopica de 0,1% en comparacion con el grupo de control de exposicion, que presento una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar macroscopica de 13,8% (p<0,0001). Ademas, el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 presento una reduccion significativa en las puntuaciones de lesion pulmonar histologica, como se demuestra por una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar de histologfa de 6,0 para el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 en comparacion con una mediana de la puntuacion de lesion pulmonar de histologia de 19,5 para el grupo de
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control de exposicion (p<0,0001). Por tanto, la DOI de 26 semanas para MLV contra el PRRSV 94881 a la dosificacion de 1 x 10427 TCID50 se establecio basandose en el parametro primario de una reduccion significativa para lesiones pulmonares despues de la exposicion. Este resultado se logro con una dosis de vacuna ligeramente menor que la dosis de inmunizacion mmima elegida como diana de 1 x 1045 TCID5o/ml. Un cerdo del control de exposicion (n° 123) no pudo puntuarse para lesiones pulmonares macroscopicas debido a pleuritis y adhesiones debido a infecciones bacterianas, pero se puntuo para lesiones pulmonares histologicas. La omision de este cerdo del grupo de control del analisis de la puntuacion de lesion pulmonar macroscopica de la exposicion no afecto el resultado de este estudio.
La viremia despues de la exposicion se selecciono como el parametro secundario mas importante debido a que representa el nivel de replicacion y persistencia vmca que se produce dentro del animal huesped tras la exposicion. Una reduccion significativa (p<0,05) en la viremia se corresponded con una vacuna contra el PRRS que induce inmunidad adecuada para limitar la patogenesis del PRRS dentro del huesped. 3, 7 y 10 dfas despues de la exposicion, el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 demostro una reduccion significativa en la viremia (qPCR) en comparacion con el grupo de control de exposicion (p<0,0001). Para evaluar adicionalmente la viremia despues de la exposicion entre grupos se calculo la cantidad de carga vmca durante una duracion espedfica de tiempo despues de la exposicion, como se representa como “area bajo la curva” o ABC. El grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvo una mediana del valor de ABC de DPC 0 a DPC 10 de 15,54 log-10 GE/ml/dfa; mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana del valor de ABC de 44,77 log-10 GE/ml/dfa (p<0,0001). Ademas, el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvo una mediana del valor de ABC de DPC 3 a DPC 10 de 8,88 log-10 GE/ml/dfa; mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana del valor de ABC para este periodo de 36,43 log-10 GE/ml/dfa (p<0,0001). Si la viremia se examino en momentos de tiempo espedficos despues de la exposicion o durante el transcurso del periodo despues de la exposicion, la MLV contra el PRRSV 94881 administrada 26 semanas antes de exposicion a una cepa europea heterologa virulenta del PRRS redujo significativamente (p<0,05) la viremia despues de la inoculacion de la exposicion.
En asociacion con una reduccion de viremia del PRRS despues de la exposicion, una reduccion significativa (p<0,05) en la carga vmca en el tejido de pulmon tambien sena de gran importancia desde el punto de vista de la inmunidad de la vacuna contra el PRRS. Una reduccion de la carga vmca en el tejido de pulmon puede asociarse a estabilidad vmca reducida, replicacion y persistencia dentro del huesped y puede conducir secundariamente a una reduccion de la propagacion del PRRSv a otros cerdos. En este estudio, los tejidos de pulmon del grupo de MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron una mediana del resultado de qPCR de pulmon de 3,69 log-10 GE/ml 10 dfas despues de la exposicion (DPC 10) mientras que el grupo de control de exposicion tuvo una mediana del resultado de qPCR de pulmon de 6,25 log-10 GE/ml. La diferencia entre el grupo de vacunas y el grupo de control de exposicion fue significativa (p<0,0001), soportandose asf adicionalmente la duracion de la inmunidad de 26 semanas.
Una reduccion marcada en la gravedad y la frecuencia de signos clmicos despues de la exposicion en cerdos tambien soportana la eficacia de la vacuna contra el PRRS y el establecimiento de DOI de 26 semanas para MLV contra el 94881 del PRRS. Solo un cerdo presento signos clmicos tras la exposicion: el cerdo 149 (control de exposicion) tuvo una puntuacion respiratoria de “1” (respiracion jadeante/rapida) en D185. Ningun cerdo en el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 presento signos clmicos durante la fase despues de la exposicion de este estudio y no hubo diferencias estadfsticas entre los grupos vacunados y de control de exposicion (p=0,4878 o no se realizo la prueba). Los signos clmicos despues de la exposicion no fueron suficientemente fuertes en este estudio para evaluar la DOI.
La fiebre entre grupos vario despues de la exposicion. Los cerdos vacunados con MLV contra el PRRSV 94881 presentaron significativamente menores temperaturas rectales medias por LS en dos dfas (DPC 8 y DPC 10; (p<0,0183) y mayores temperaturas rectales medias por LS en cuatro dfas (DPC 0, DPC 2, DPC 4 y DPC 5; p<0,0281) en comparacion con los cerdos del control de exposicion. De otro modo, no se detectaron diferencias significativas entre grupos despues de la exposicion (p>0,0642). Aunque se detectaron diferencias estadfsticas entre grupos despues de la exposicion, estas diferencias no fueron biologicamente significativas, considerando que las temperaturas rectales medias siguieron siendo < 39,9°C (grupo de control de exposicion, D182) para todos los grupos. No se detecto diferencia entre grupos con respecto a la proporcion de cerdos con fiebre durante al menos un dfa despues de la exposicion (p=0,4537).
La presencia de viremia significativa, patologfa del pulmon y carga vmca en tejidos de pulmon debido a PRRS en el grupo de control de exposicion produjo una diferencia significativa (p<0,05) entre grupos para peso corporal en DPC 9. En este estudio, los grupos vacunados y de control de exposicion tuvieron pesos corporales medios por LS en DPC 9 de 138,3 kg y 130,3 kg, respectivamente (p=0,0455). Los ADWG medios por LS de DPC 0 a DpC 9 fueron 0,4 kg/dfa y 0,2 kg/dfa para grupos vacunados y de exposicion, respectivamente. Este diferencia no fue estadfsticamente significativa (p=0,1041).
Parametros examinados despues de la vacunacion en este estudio
Se encontraron muertos tres cerdos durante la fase de vacunacion de este estudio. El cerdo 179 (vacunado con MLV contra el 94881 del PRRS) se encontro muerto en D6 asociado a infecciones por Escherichia coli y Enterococcus spp. sin complicaciones. El cerdo 161 (grupo de control de exposicion) se encontro muerto en D10
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50
asociado a infecciones por Bordetella bronchiseptica, Streptococcus alfa hemolftico y Staphylococcus auricularis. El cerdo 124 (grupo de control de exposicion) se encontro muerto en D21 asociado a una infeccion por Streptococcus suis que condujo a meningoencefalitis. Para controlar y prevenir cualquier muerte mas, los cerdos se trataron en masa con vitaminas y antibioticos inyectables. Tras los tratamientos no se produjeron mas muertes. Como las muertes se produjeron en ambos grupos de tratamiento puede asumirse que el propio IVP no se asocio a las infecciones. Mas probablemente, los cerdos llegaron a la instalacion de investigacion alojando estas infecciones. Los datos para estos cerdos se incluyeron cuando estuvieron disponibles. Las puntuaciones de lesion pulmonar macroscopica e histologica de estos cerdos se omitieron de los analisis de lesion pulmonar ya que estos cerdos murieron antes de la administracion de exposicion. La perdida de un cerdo de MLV contra el PRRSV 94881 y dos cerdos del control de exposicion durante el prolongado periodo de tiempo desde la vacunacion hasta la exposicion no afecto el resultado del estudio.
No se observaron evaluaciones clmicas anormales relacionadas con la vacunacion con MLV contra el PRRSV 94881 o producto de control en cerdos tras la inoculacion en D0. Siete cerdos en el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 tuvieron evaluaciones anormales despues de la vacunacion; mientras que trece cerdos del control de exposicion tuvieron evaluaciones anormales. Excluyendo los tres cerdos que murieron debido a infecciones bacterianas, estas evaluaciones anormales incluyeron delgadez, tos, hinchazones, recubrimiento de pelo despeinado, depresion, abscesos y mala condicion corporal en diversos momentos de tiempo, ninguno de los cuales duro un periodo de tiempo prologado. En opinion del autor, estos hallazgos no estuvieron relacionados con la administracion de ningun producto experimental, sino que son hallazgos tfpicos en cerdos en crecimiento/maduracion bajo situaciones de alojamiento en grupo durante un periodo de tiempo prologado.
Todos los cerdos fueron negativos en serologfa por ELISA para PRRS en D0, confirmandose asf que todos los cerdos cumplieron los criterios de inclusion de ser seronegativos para PRRS tras la entrada en el estudio. La mayona de los cerdos (90%) que recibieron MLV contra el PRRSV 94881 se seroconvirtieron para PRRS en D14 y todos los cerdos vacunados contra el PRRS fueron seropositivos en D28. En cambio, los cerdos del control de exposicion siguieron siendo seronegativos hasta 7 dfas despues de la exposicion, cuando este grupo empezo a demostrar seroconversion para PRRS. Como se ha contemplado anteriormente, dos cerdos del control negativo fueron seropositivos por ELISA para PRRS en D112, que se considero un hallazgo secundario, posiblemente debido a un error de laboratorio inasignable. g
7, 14, 21 y 28 dfas despues de la vacunacion, el grupo vacunado con MLV contra el PRRSV 94881 presento las medianas de resultados de qPCR de 3,00, 0, 0 y 3,00 log-10 GE/ml, respectivamente. Estos resultados ponen de relieve que en el plazo de 4 semanas desde la vacunacion, una dosificacion de 1 x 10427 TCID50 de MLV contra el PRRSV 94881 indujo suficiente replicacion de la MLV que frecuentemente se requiere para construir la inmunidad protectora ya a las 4 semanas despues de la vacunacion. En cambio, el grupo de control de exposicion fue negativo para viremia del PRRS hasta tres dfas despues de la exposicion.
Conclusion
Una reduccion significativa (p<0,05) de lesiones pulmonares macroscopicas e histologicas en la autopsia, la carga vmca en tejidos de pulmon en la autopsia y la viremia despues de la exposicion para el grupo de MLV contra el PRRSV 94881 en comparacion con el grupo de control de exposicion demostro la eficacia de la vacuna contra el PRRSv virulento cuando se vacuno a las 2 semanas de edad y se expuso a las 26 semanas despues de la vacunacion. Por tanto, los resultados de este estudio soportan la demostracion de la duracion de la inmunidad de 26 semanas despues de la vacunacion con MLV contra el 94881 del PRRS. Estos resultados se alcanzaron con una dosis de vacuna de 1 x 10427 TCID50/ml, que fue ligeramente menor que la dosis de inmunizacion minima (1 x 1045 TCID50/ml).
Las secuencias de la cepa atenuada y la cepa parental PRRSV 94881 son como las siguientes:
SEQ ID NO:1: SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE LONGITUD COMPLETA del virus de siembra maestro del PRRS de 94881
1
TTTGTGTACC TTGGAGGCGT GGGTACAGCC CTGCCCCACC CTTTGGTCCC TGTTCTAGCC
61
CGACAAGTAC CCTTCTCTCT CGGGGCGAGC GCGCCGCCTG CTGCTCCCTT GCGGCGGGAA
121
GGACCTCCCG AGTATTTCCG GAGAGCACCT GCTTTACGGG ATCTCCGCCC TTTAACCATG
181
TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGGTATTTTG GAACGCCGGC
241
CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC
301
ACGGACCTCG GTGCAGTTGG CTTGTTTCAC AAGCCTAAAG ACAAGCTCCA TTGGAAAGTT
361
CCCATTGGTA TCCCCCAGGT GGAATGTTCT CCATCTGGGT GTTGCTGGCT GTCAACCATT
421
TTTCCTTTAG CGCGCATGAC CTCCGGCAAT CACAACTTCC TTCAACGACT CGTGAAGGTT
5
10
15
20
25
30
35
481
GCTGATGTAT TGTACCGTGA CGGTTGCTTA ACCCCTAGAC ACCTCCGTGA ACTCCAAGTT
541
TACGAGCGTG GTTGCAATTG GTATCCGATT ACGGGGCCTG TGCCTGGGAT GGCTGTGTAC
601
GCGAACTCCA TGCACGTGTC CGACCAACCG TTCCCTGGTG CCACTCATGT GTTAACAAAT
661
TCCCCTTTGC CTCAACGGGC TTGTCGGCAG CCGTTCTGTC CGTTCGAAGA GGCCCATTCT
721
AGCATATACA GGTGGGAAAA ATTTGTAATT TTTATGGATT CCTCCTCCGA CGGTCGATCT
781
CGCATGATGT GGACTCCGGA ATCCGATGAC TCCACGGCTT TGGAAGTTCT GCCGCCCGAG
841
CTAGAACACC AGGTCAAGGT CCTTGTTCGG AGCTTTCCCG CCCATCACCT TGTCGACCTT
901
GCCGATTGGG AGCTCACTGA GTCCCCTGAT AACGGTTTTT CCTTCAGCAC GTCACATCCT
961
TGCGGCTACC TTGTTCGGGA CCCGGCTGTA TCCGAAGGCA AGTGTTGGCT TTCCTGCTTT
1021
TTGAGCCAGT CAGCCGAAGT GCTCAGTCGC GAGGCGCATC TGGCTACCGC CTATGGTTAC
1081
CAAACCAAGT GGGGTGTGCC TGGCAAGTAC ATCCAGCGCA GACTTCAAGT TCACGGTCTC
1141
CGTGCTGTGG TCGACCCTGA TGGTCCCATT CACGTTGAAG CATTGTCTTG CCCCCAGTCT
1201
TGGATCAGGC ACTTGACCCT GAATGATGAT GTCACCCCGG GATTCGTTCG CCTAATGTCT
1261
CTTCGCATTG TGCCGAACAC AGAGCCTACC ACACACCGGA TCTTTCGTTT TGGAGTGCAC
1321
AAGTGGTATG GTGCCGCCGG CAAACGGGCC CGTGGCAAGC GTGCCGCCAA AAGTGAGAAA
1381
GACTCGGCTT CCACCCTCAA GGTTGCCCGA CCGACTTCCA CCAGTGGAAT CGTCACCTAC
1441
TCCCCACCTG CGGACGGGTC TTGTGGTTGG CATGCCCTTG CCGCCATACT GAACCGGATG
1501
ATTAATAATG ACTTCACGTC CCCTCTGCCT CGGTACAACA GGCCGGAGGA CGATTGGGCT
1561
TCTGATGGTG ACCTTGCTCA GGCCATTCAA TGTTTGCAAC TACCTGCCGC CATAGCTCGG
1621
AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC ATAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA
1681
GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AGTGCGTTGT TGGCGTCTGC
1741
TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG
1801
GCCCTGGCGT CTGCTTATAG ACTGCCTTCA GACTGTGTTT GTGATGGTAT TATTGACTTC
1861
CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AAATGTTGAC TTCCCCGTCA
1921
CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGTCTGTAT AAATTGTTGT TAGAGATCTT GCCGCAGAAA
1981
TGCGGATCCA CAGAAGGGGA ATTCATCTAT ACTGTTGAGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG
2041
AGCTCCAAAC AGGCCATGGC CCTCCTTGCA AAAATTAAGG TCCCATCCTC AAAGGCCCCA
2101
TCCGTGACTC TGAACGAGTG CTTCCCCACG GATGTTCCAG TCAACTCTGA GTTAATATCT
2161
TGGGAAGAGC CCAAAGACCC TGGCGCTGCT GTTGTCCTAT GTCCATCGGA TGCAAAAGAA
2221
TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA AGAAGCTCAA GCGAGAAACC GTAAGGTCCT TCACCCTGTG
2281
GTCCTTACCG AGGAACTTAG CGAGCAACAG GTGCAGGTGG TTGAGGGTGA TCAGGATATG
2341
CCACTGGATT TGACTTGGCC AACCTTAACC GCTACGGCGA CCCCTGTTAG AGGGCCGGTA
2401
CCGGACAATT TGAGCTCTGG CATTGGTGCC CAGCCCGCTA CCGTTCAAGA ACTCATTCTG
2461
GCGAGGCCTG CACCCCGTCT TGTTGAGCGC TGTGGCACGG AGTCGAACGG CAGCAGTTCA
2521
TTTCTGGATT TGCCTGACGT GCAGACCTCG GACCAGCCTT TAGACCTGTC CCTGGCCGCG
2581
TGGCCTGTAA GGGCTACCGC GTCTGACCCC GGTTGGATCC ACGGTAGGCG TGAGCCTGTC
2641
TTTGTGAAGC CTCGAGGTGT TTTCTCTGAT GGCGAGTCGG CCCTTCAGTT CGGAGAGCTT
5
10
15
20
25
30
35
2701
TCCGAAGCCA GTTCTGTCGT CGATGACCGG ACAAAAGAAG CTCCGGTGGT TGACGCCCCC
2761
ATCGATTTGA CAACTTCGAA CGAGACGCTC TCTGGGTCTG ACCCCTTTGA ATTCGCCAAA
2821
TTCAGGCGCC CGCGTTTCTC CGCGCAAGCT TTAATCGACC GAGGTGGTCC GCTTGCCGAT
2881
GTTCATGCAA AGATAAAGAG TCGGGTATAT GAACAATGCC TTCAAGCTTG TGAACCTGGT
2941
AGTCGTGCGA CCCCAGCCAC CAAGAAGTGG CTCGACAAAA TGTGGGACAG GGTGGACATG
3001
AAAACTTGGC GCTGCACCTC GCAGTTCCAA GCTGGTCACA TTCTTGAGTC CCTCAAATTC
3061
CTCCCTGACA TGATTCAAGA CACACCGCCT CCTGTTCCCA GGAAGAACCG AGCTGGTGAC
3121
AGTGCCGGCC TGAAGCAACT GGTGGCGCAG TGGGATAGGA AATCGAGTGT GACACCCCCC
3181
ACAAAACCGG TTGGACCGGT GCTTGACCAG GCCGTCCCTC TGCCTATGGA CATCCAGCAA
3241
GGAGATGCCA TCTCCGCTGA CAAGCCACCC CATTCGCAAA ACCCTTCTAG TCAAGTAGAT
3301
GTGGGTGGAG GTTGGAAAAG TTTTATGCTC TCCGGCACCC GTTTCGCGGG GTCCGTTAGT
3361
CAGCGCCTTA CGACATGGGT TTTTGAGGTT CTCTCCCATC TCCCAGCTTT TATGCTCACA
3421
CTTTTCTCGC CACGGGGCTC TATGGCTCCA GGTGATTGGC TGTTTGCAGG TGCTGTTCTA
3481
CTTGCTCTCC TGCTCTGCCG TTCTTACCCA ATACTCGGAT GCCTTCCCTT ATTGGGTGTC
3541
TTTTCTGGTT CTGTGCGGTG TGTTCGTTTG GGTGTTTTTG GTTCTTGGAT GGCTTTTGCT
3601
GTATTTTTAT TCTCGACTCC ACCCGACCCA GTCGGTTCTT CTTGTGACCA CGATTCGCCG
3661
GAGTGTCATG CTGAGCTTTT GGCTCTTGAG CAGCGCCAAC TTTGGGAACC TGTGCGCAGC
3721
CTTGTGGTCG GGCCATCGGG CCTCTTATGC GTCATTCTTG GCAAGTTACT CGGTGGGTCA
3781
CGTTGTCTCT GGTTTGTTCT CCTACGTATA TGCATGCTCG CAGATTTGGC AATTTCTCTT
3841
ATTTATGTGG TGTCCCAAGG GCGTTGTCAC AAGTGTTGGG GAAAGTGTAT AAGGACGGCT
3901
CCTGCAGAAG TGGCCCTTAA TGTGTTTCCT TTTTCGCGCG CCACCCGCTC ATCTCTTGTG
3961
TCCTTGTGTG ATCGGTTCCA AGCGCCAAAA GGAGTTGACC CCGTGCACTT GGCGACAGGC
4021
TGGCGCGGGT GCTGGTGTGG TGAGAGCCCT ATTCATCAAT CACACCAAAA ACCGATAGCT
4081
TATGCCAACT TGGATGAAAA GAAGATATCC GCCCAGACGG TGATTGCTGT CCCGTATGAT
4141
CCTAGTCAGG CCATTAAATG CCTGAAAGTT TTGCAGGCAG GAGGGGCTAT TGTGGACCAG
4201
CCTACGCCCG AGGTCGTCCG TGTGTCTGAG ATTCCCTTCT CGGCCCCATT TTTTCCGAAG
4261
GTCCCAGTCA ACCCAGACTG CAGGGTTGTG GTAGATTCGG ACACTTTTGT GGCTGCGGTC
4321
CGCTGCGGTT ATTCGACAGC ACAACTGGTC CTTGGTCGGG GCAACTTTGC CAAGCTAAAT
4381
CAGACCCCCC TCAGGAACTC TGTCCCCACC AAAACAACTG GTGGGGCCTC ATACACCCTT
4441
GCCGTGGCCC AGGTATCTGT GTGGACTCTT GTTCATTTCA TCCTCGGCCT TTGGTTAACG
4501
TCACCTCAAG TGTGTGGTCG AGGGACCTCT GACCCGTGGT GTTCGAACCC TTTTTCGTAT
4561
CCTACTTATG GCCCCGGAGT TGTGTGTTCC TCTCGACTCT GCGTGTCTGC CGACGGAGTT
4621
ACCCTGCCAT TGTTCTCAGC CGTTGCCCAT CTTTCCGGTA GAGAGGTGGG GATTTTTATT
4681
TTGGTGCTTG CCTCCTTGGG CGCTTTAGCC CACCGCTTGG CTCTTAAGGC AGACATGTCA
4741
ATGGTCTTTT TGGCGTTTTG TGCTTACGCC TGGCCCATGA GCTCCTGGTT AATTTGCTTC
4801
TTTCCTATGC TCTTGAGGTG GGTAACCCTT CATCCTCTCA CTATGCTTTG GGTGCACTCA
4861
TTTTTGGTGT TTTGCCTACC AGCTGCCGGC GTTCTCTCGC TGGGAATAAC CGGTCTTCTT
5
10
15
20
25
30
35
4921
TGGGCAGTTG GCCGTTTCAC CCAGGTTGCC GGAATTATCA CACCTTATGA CATCCACCAG
4981
TATACCTCCG GACCACGTGG TGCAGCTGCT GTAGCAACGG CTCCAGAAGG TACTTACATG
5041
GCGGCCGTTC GGAGAGCCGC TTTGACTGGA CGGACTTTGA TCTTCACACC ATCTGCAGTC
5101
GGATCCCTTC TTGAAGGTGC TTTCAGAACT CAAAAGCCCT GCCTTAACAC CGTGAATGTC
5161
GTAGGCTCTT CCCTTGGTTC TGGAGGAGTT TTCACCATTG ATGGCAGAAG AGTCATCGTC
5221
ACTGCCACCC ATGTGTTGAA TGGTAACACA GCCAGGGTCA CTGGTGATTC CTACAACCGC
5281
ATGCACACGT TCAATACTAA TGGTGATTAT GCCTGGTCCC ATGCTGATGA CTGGCAAGGC
5341
GTTGCCCCTA TGGTTAAGAT CGCTAAGGGG TATCGCGGTC GTGCCTACTG GCAAACGTCA
5401
ACCGGAGTCG AACCTGGCAT CATGGGGGAA GGATTCGCCT TCTGTTTCAC TAACTGTGGC
5461
GACTCAGGGT CACCTGTCAT TTCAGAAGCT GGTGACCTTA TTGGAGTCCA TACCGGTTCA
5521
AACAAACTCG GTTCTGGTCT TGTGACAACC CCTGAAGGGG AGACCTGCTC CATCAAGGAA
5581
ACTAGGCTCT CTGACCTTTC TAGACATTTT GCAGGTCCAA GCGTCCCTCT TGGGGACATT
5641
AAGTTGAGCC CAGCCATCAT CCCTGATGTG ACAACTATTC CGAGTGACTT GGCATCGCTC
5701
CTTGCTTCTG TCCCCGTGAT GGAAGGTGGC CTCTCAACTG TCCAGCTTTT GTGCGTCTTT
5761
TTCCTTCTCT GGCGCATGAT GGGCCATGCC TGGACACCCA TTGTTGCCGT AGGCTTCTTT
5821
TTGCTGAATG AAATTCTCCC AGCAGTCTTG GTCCGAGCTG TGTTCTCTTT TGCACTCTTT
5881
GTACTTGCAT GGGCCACCCC CTGGTCGGCA CAAGTGTTGA TGATTAGACT CCTCACGGCG
5941
GCTCTCAACC GCAACAGGTT GTCCCTGGCG TTCTACGCAT TCGGAGGTGT CGTTGGCCTG
6001
GCCACAGAAA TCGGGACTTT TGCTGGTGGA TGGCCTGAAC TGTCCCAAGC CCTCTCGACA
6061
TACTGCTTCC TGCCCAGGTT CCTTGCTGTG ACTAGTTATG TCCCCACCAT CATCATCGGT
6121
GGGCTCCATG CCCTCGGCGT AATTTTGTGG TTATTCAAAT ACCGATGCCT CCACAACATG
6181
CTGGTTGGTG ATGGGAGTTT CTCAAGCGCT TTCTTCCTAC GGTATTTTGC TGAGGGTAAT
6241
CTTAGGAAAG GCGTGTCGCA GTCCTGTGGC ATGAATAACG AATCCCTGAC AGCTGCTTTG
6301
GCTTGCAAGT TGTCGCAAGC TGACCTTGAT TTTTTGTCCA GTTTAACGAA CTTCAAGTGC
6361
TTTGTGTCCG CTTCAAACAT GAAAAATGCA GCTGGCCAAT ACATCGAGGC GGCGTATGCT
6421
AGAGCTCTGC GTCAGGAGCT GGCCTCCTTG GTTCAGGTTG ACAAGATGAA AGGAGTATTG
6481
GCCAAGCTCG AGGCTTTCGC TGAGACGGCC ACTCCGTCAC TTGACACAGG GGACGTGATT
6541
GTTCTGCTTG GGCAACACCC CCATGGATCC ATCCTCGACA TTAATGTGGG GGGTGAAAGG
6601
AAAACTGTGT CTGTGCAAGA AACACGATGC CTGGGTGGTT CCAAATTCAG TGTCTGCACT
6661
GTCGTGTCCA ACACGCCCGT GGATACCTTG ACCGGTATCC CACTTCAGAC GCCAACCCCA
6721
CTTTTTGAAA ATGGCCCGCG CCATCGCAGC GAGGACGACG ACCTCAAAGT TGAGAGAATG
6781
AAAAAACACT GTGTATCCCT CGGCTTCCAC AAAATCAATG GTAAAGTTTA CTGCAAAATT
6841
TGGGACAAGT CTAACGGCGA CACCTTTTAC ACGGATGATT CCCGATACAC TCAAGACCAT
6901
GCTTTTCAGG ACAGGTCAAC CGACTATAGA GACAGGGATT ATGAAGGTGT ACAGACCGCC
6961
CCCCAACAGG GATTCGATCC AAAGTCCGAA GCCCCTGTTG GCACTGTTGT AATCGGTGGC
7021
ATTACGTATA ACAGGCATCT GGTCAAAGGT AAGGAGGTCC TAGTTCCCAA ACCTGACAAC
7081
TGCCTTGAAG CTGCCAGACT GTCCCTTGAG CAAGCTCTTG CTGGGATGGG CCAAACTTGT
5
10
15
20
25
30
35
7141
GACCTTACAG CTACCGAAGT GGAGAAACTA AAGCGCATCA TTAGTCAACT CCAAGGTCTG
7201
ACCACTGAAC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GACCCGCTGT GGCCGCGGCG
7261
GCCTAGTTGT AACTGAAACG GCGGTAAAAA TCGTAAAATA CCACAGCAGA ACTTTCACCT
7321
TAGGCTCTTT AGACCTAAAA GTCACCTCCG AGGTGGAGGT GAAGAAATCA ACTGAGCAGG
7381
GGCACGCTGT CGTGGCGAAC TTATGTTCCG GTGTCGTCTT GATGAGGCCT CACCCACCGT
7441
CCCTTGTTGA CGTTCTCCTC AAACCCGGAC TTGACACAAC ACCCGGCATT CAACCAGGGC
7501
ATGGGGCCGG GAATATGGGC GTGAACGGTT CTATTTGGGA TTTTGAAACT GCACCCACAA
7561
AGGTAGAACT AGAGTTGTCC AAGCAAATAA TCCAAGCATG TGAAGTCAGG CGCGGGGACG
7621
CCCCTAACCT CCAACTCCCC TACAAGCTTT ATCCTGTCAG GGGGGACCCC GAGCGGCGTA
7681
AAGGTCGCCT TGTCAACACT AGGTTTGGAG ATTTACCTTA CAAAACTCCC CAAGACACCA
7741
AGTCCGCAAT TCATGCGGCT TGTTGCCTGC ATCCCAATGG GGTCCTCGTG TCTGATGGCA
7801
AATCCACGCT GGGTACCACT CTTCAACATG GTTTCGAGCT TTATGTCCCC ACTGTACCTT
7861
ATAGTGTCAT GGAATACCTT GATTCACGCC CTGACACCCC TTTTATGTGT ACTAAACATG
7921
GCACTTCCAA GGCTGCTGCA GAGGACCTCC AAAAATATGA CCTATCCACT CAAGGGTTTG
7981
TCTTGCCTGG GGTCCTACGC CTAGTGCGCA GGTTCATCTT TAGCCATGTT GGTAAGGCGC
8041
CACCACTGTT CCTTCCATCA ACCTACCCTG CCAAGAACTC CATGGCAGGG GTCAATGGCC
8101
AGAGGTTCCC AACAAAGGAT GTCCAGAGCA TACCTGAAAT TGATGAAATG TGCGCCCGTG
8161
CCGTCAAGGA AAATTGGCAG ACTGTGACAC CTTGCACCCT CAAAAAACAG TACTGTTCCA
8221
AACCTAAAAC TAGAACCATC CTAGGTACCA ACAACTTCAT AGCCTTGGCT CACAGGTCAG
8281
CACTCAGTGG TGTCACCCAG GCGTTCATGA AGAAGGCCTG GAAGTCCCCA ATTGCCTTGG
8341
GGAAAAACAA GTTTAAGGAA TTGCATTGCA CTGTCGCCGG CAGATGCCTT GAGGCTGACC
8401
TGGCTTCCTG CGATCGCAGC ACCCCCGCCA TTGTGAGGTG GTTTGTTGCC AACCTCCTGT
8461
ATGAACTTGC AGGATGTGAA GAGTACTTGC CTAGCTACGT GCTCAACTGT TGCCATGACC
8521
TTGTGGCAAC GCAGGATGGC GCTTTCACAA AACGCGGTGG CCTGTCGTCC GGGGACCCCG
8581
TCACCAGTGT GTCCAACACC GTCTACTCAC TGATAATTTA CGCCCAGCAC ATGGTGCTTT
8641
CGGCCTTGAA GATGGGTCAT GAAATTGGTC TCAAGTTCCT TGAGGAACAG CTCAAATTTG
8701
AGGACCTTCT TGAAATCCAG CCCATGTTAG TGTATTCTGA TGACCTCGTC TTGTATGCGG
8761
AAAGACCCAC TTTTCCCAAC TACCATTGGT GGGTCGAGCA TCTTGACCTG ATGTTGGGCT
8821
TTAAAACGGA CCCAAAGAAA ACTGTCATAA CTGATAAACC CAGTTTTCTC GGCTGCAGAA
8881
TTGAAGCAGG ACGGCAGTTA GTCCCCAATC GCGACCGTAT TCTGGCTGCT CTTGCATATC
8941
ATATGAAGGC GCAGAACGCC TCAGAGTATT ATGCGTCCGC TGCCGCAATT CTGATGGATT
9001
CGTGTGCTTG CATTGACCAT GACCCCGAGT GGTATGAGGA TCTTATCTGC GGCATCGCCC
9061
GGTGTGCTCG CCAGGACGGT TACCGTTTTC CAGGCCCGGC ATTTTTCATG TCCATGTGGG
9121
AGAAGCTGAA AAGTCATAAT GAAGGGAAGA AATGCCGTCA CTGCGGCATC TGCGACGCCA
9181
AAGCCGACTA TGCGTCCGCC TGTGGACTTG ATTTGTGTTT GTTCCATTCA CACTTTCATC
9241
AACACTGCCC AGTCACTCTG AGCTGTGGCC ACCATGCCGG TTCAAAGGAA TGTTCGCAGT
9301
GTCAGTCACC TGTCGGGGCT GGCAAATCCC CCCTTGACGC TGTGCTGAAA CAAATCCCGT
5
10
15
20
25
30
35
9361
ACAAACCTCC TCGTACCATT ATCATGAAGG TGGACAACAA AACAACGACC CTTGACCCGG
9421
GAAGATATCA GTCCCGTCGA GGTCTTGTTG CAGTCAAAAG AGGTATTGCA GGTAATGAGG
9481
TTGATCTTTC TGATGGAGAC TACCAAGTGG TGCCTCTTTT GCCGACTTGC AAAGACATAA
9541
ACATGGTGAA GGTGGCTTGC AACGTACTAC TCAGCAAGTT TATAGTAGGG CCGCCAGGTT
9601
CCGGAAAAAC CACCTGGCTA CTGAACCAAG TCCAGGACGA TGATGTCATT TACACACCTA
9661
CTCATCAGAC AATGTTTGAC ATAGTCAGTG CTCTTAAAGT TTGCAGGTAT TCCATCCCAG
9721
GAGCCTCAGG ACTCCCTTTT CCACCACCTG CCAGGTCCGG GCCGTGGGTT AGGCTCATCG
9781
CCAGCGGACA TGTCCCTGGC CGAGTGTCAT ATCTCGATGA GGCAGGATAT TGCAATCATC
9841
TAGACATTCT AAGGCTGCTT TCCAAAACAC CCCTTGTGTG TTTGGGTGAC CTTCAGCAAC
9901
TTCACCCGGT CGGCTTTGAT TCCTATTGTT ATGTGTTCGA TCAGATGCCT CAGAAGCAGC
9961
TGACCACCAT TTATAGATTT GGCCCTAACA TCTGTGCAGC CATCCAGCCT TGTTACAGGG
10021
AGAAACTTGA ATCCAAGGCC AGGAACACCA GAGTGGTTTT CACCACCCGG CCTGTGGCCT
10081
TTGGTCAGGT CCTGACACCG TACCACAAAG ATCGTACCGG CTCTGCAATA ACTATAGATT
10141
CATCCCAGGG GGCGACCTTC GACATTGTGA CATTGCATCT ACCATCGCCA AAGTCCCTAA
10201
ACAAATCCCG AGCACTTGTA GCCATCACTC GGGCAAGACA TGGGTTGTTC ATTTATGACC
10261
CTCATGACCA ACTCCAGGAG TTTTTCAACT TAACCCCCGA GCGCACTGAT TGTAACCTTG
10321
CGTTCAGCCG TGGGGATGAG CTGGTTGTTT TGAATGTGGA TAATGCGGTC ACAACTGTAG
10381
CGAAGGCCCT AGAGACAGGT TCACCCCGAT TTCGAGTATC GGACCCGAGG TGCAAGTCTC
10441
TCTTAGCCGC TTGTTCGGCC AGTCTAGAAG GGAGCTGCAT GCCACTACCA CAAGTAGCAC
10501
ATAACCTGGG GTTTTACTTT TCCCCGGACA GCCCAGCTTT TGCACCCCTG CCAAAAGAGC
10561
TGGCGCCACA TTGGCCAGTG GTCACCCACC AGAATAATCG AGCGTGGCCT GATCGACTTG
10621
TCGCTAGTAT GCGCCCAATT GATGCCCGCT ACAGCAAGCC AATGGTCGGT GCAGGGTATG
10681
TGGTCGGGCC ATCCATTTTT CTTGGCACTC CTGGTGTGGT GTCATACTAT CTCACATTAT
10741
ACATCGGGGG CGAGCCTCAG GCCCTGCCAG AAACACTCGT TTCAACAGGA CGTATAGCCA
10801
CAGATTGTCG GGAATATCTC GACGCGGCTG AGGAAGAGGC AGCGAGAGAA CTTCCCCACG
10861
CATTTATTGG CGATGTCAAA GGCACTACGA TCGGGGGGTG TCACCACATT ACATC GAAAT
10921
ACCTACCTAG GTCCCTGCCT AAAGACTCTG TTGCTGTGGT TGGGGTGAGT TCGCCCGGTA
10981
GGGCTGCTAA AGCCGTGTGC ACTCTCACCG ATGTGTACCT CCCCGAACTC CGACCATATT
11041
TGCAACCGGA GACGGCATCA AAATGCTGGA AACTTAAACT GGATTTCAGG GATGTTCGAC
11101
TGATGGTCTG GAAAGGCGCC ACAGCCTATT TCCAGTTGGA AGGGCTGACA TGGTCAGCGC
11161
TGCCCGATTA TGCTAGGTTC ATTCAGCTAC CCAAGGATGC CGTTGTGTAC ATCGATCCGT
11221
GTATAGGGCC GGCAACAGCC AATCGCAAGG TTGTGCGAAC CACAGACTGG CGGGCCGACC
11281
TGGCAGTGAC ACCGTATGAT TACGGTGCTC AGGTCATTTT GACAACAGCC TGGTTCGAGG
11341
ACCTTGGGCC GCAGTGGAAG ATTTTGGGGT TGCAGCCTTT CAGACGAACA TTTGGCTTTG
11401
AGAACACTGA AGATTGGGCA ATTCTCGCAC GCCGTATGAA TGACGGCAAA GATTACACTG
11461
ACTATAATTG GCATTGTGTA CGAGAACGCC CACACGCAAT TTACGGGCGC GCCCGTGACC
11521
ATACGTATCA TTTTGCCCTT GGCACTGAAC TGCAAGTAGA GCTGGGCAGA CCCCGGCTGC
5
10
15
20
25
30
35
11581
CTCCTGAGCA AGTGCCGTGA ACGCGGAGTG ATGCAATGGG TTTACTGTGG AGTAAAATCA
11641
GTCAGTTGTT CGTGGATGCC TTCACTGAGT TCCTTGTTAG TGTGGTTGAC ATTGTCATCT
11701
TTCTCGCCAT ATTGTTTGGG TTCACTGTTG CAGGCTGGTT ATTGGTCTTC CTTCTCAGAG
11761
TGGTTTGCTC CGCGTTTCTC CGTTCGCGCT CTGCCATTCA CTCTTCCGAA CTATCGAAGG
11821
TCCTATGAGG GCTTGCTACC CAACTGCAGA CCGGATGTCC CACAATTCGC AGTTAAGCAC
11881
CCGTTGGGTA TACTTTGGCA TATGCGAGTC TCCCACCTAA TTGACGAAAT GGTCTCTCGC
11941
CGCATTTACC GGACCATGGA ACATTCGGGT CAAGCGGCCT GGAAGCAGGT TGTTAGTGAA
12001
GCCACTCTCA CAAAACTGTC AAGGCTTGAC GTAGTCACTC ATTTCCAACA CCTGGCCGCA
12061
GTGGAGGCTG ATTCTTGCCG CTTCCTTAGC TCACGACTCG CGATGCTGAA AAACCTTGCC
12121
GTTGGCAATG TGAGCCTGGA GTACAACACT ACTTTGGACC GCGTTGAGCT CATCTTTCCC
12181
ACACCAGGTA C GAGGCCCAA GTTGACCGAT TTTAGGCAAT GGCTTATCAG CGTGCACGCT
12241
TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT
12301
CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA
12361
CTATCAATTA CACTATATGT AAGCCATGCC CTACCAGTCA AGCTGCCCAA CAAAGACTCG
12421
AGCCTGGCCG TAACGTGTGG TGCAAAATAG GGCACGACAG GTGTGAGGAA CGTGACCATG
12481
ATGAGTTGTC AATGTCCATT CCGTCCGGGT ACGACAACCT CAAACTTGAG GGTTATTATG
12541
CTTGGCTGGC TTTTTTGTCC TTTTCCTACG CGGCCCAATT CCATCCGGAG CTGTTCGGAA
12601
TAGGAAACGT GTCGCGCGTC TTTGTGGATA AGCGACACCA GTTCATTTGC GCCGAGCATG
12661
ATGGACAAAA TTCAACCATA TCTGCCAGAC ACAACATCTC CGCGTCGTAT GCGGTGTATT
12721
ACCATCATCA AATAGACGGG GGCAATTGGT TTCATTTGGA ATGGCTGCGA CCATTCTTTT
12781
CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT
12841
CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT
12901
TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT
12961
CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAACGGC
13021
TAATGTGACC GATGAATCGT ATTTGTACAA CGCGGACTTG CTGATGCTTT CCGCGTGCCT
13081
TTTCTACGCC TCGGAAATGA GCGAGAAAGG CTTCAAAGTC ATCTTTGGGA ATATTTCTGG
13141
CGTTGTTTCC GCTTGTGTTA ATTTCACAGA TTATGTGGCC CATGTGACCC AACACACTCA
13201
GCAGCACCAT TTGGTAATTG ATCACATTCG GTTACTACAC TTCTTGACAC CGTCTACGAT
13261
GAGGTGGGCT ACAACCATTG CTTGTTTGCT TGCCATTCTT TTGGCGGTAT GAAATGTTCT
13321
TGCAAGTTGG GGCATTTCTT GACTCCTCAC TCTTGCTTCT GGTGGCTTTT TTTGCTGTGT
13381
ACCGGCTTGT CTTGGTCCTT TGTCGATGGC AACGACGACA GCTCGACATC CCAATACATA
13441
TATAATTTGA CGATATGCGA GCTGAATGGG ACC GAATGGT TGTCCGGTCA TTTTGATTGG
13501
GCAGTCGAAA CCTTTGTGCT TTACCCAGTT GCCACTCATA TCATTTCACT GGGTTTTCTC
13561
ACAACAAGCC ATTTCCTTGA TGCGCTCGGT CTCGGCGCTG TGTCCGCCAC AGGATTCATT
13621
GGCGAGCGGT ATGTACTTAG CAGCATGTAC GGCGTTTGCG CCTTCGCGGC GTTCGTATGT
13681
TTTGTCATCC GTGCTGCTAA AAATTGCATG GCTTGCCGCT ATGCCCGCAC CCGGTTTACC
13741
AACTTCATCG TGGACGACCG GGGAAGAATC CATCGATGGA AGTCTTCAAT AGTGGTGGAG
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
13801
AAATTGGGCA AAGCTGAAGT CGGTGGTGAC CTTGTCAACA TTAAGCATGT TGTCCTCGAA
13861
GGGGTTAAAG CTCAACCTTT GACGAGGACT TCGGCTGAGC AATGGGAAGC CTAGACGACT
13921
TTTGCAACGA TCCCACCGCC GCACAAAAAC TCGTGCTGGC CTTTAGCATC ACATATACAC
13981
CCATAATGAT ATACGCCCTT AAGGTGTCAC GCGGCCGACT CCTGGGGCTG TTGCACATCT
14041
TGATATTTCT GAATTGTTCC TTTACTTTTG GGTACATGAC ATATGTGCAT TTTCAATCCA
14101
CCAACCGTGT CGCATTCACT CTGGGGGCTG TAGTCGCCCT TTTGTGGGGT GTTTACAGCC
14161
TCACAGAGTC ATGGAAGTTC ATCACTTCCA GATGCAGATT GTGTTGCCTA GGCCGGCGAT
14221
ACATTCTGGC CCCTGCCCAT CACGTAGAAA GTGCTGCAGG CCTCCATTCA ATCCCAGCGT
14281
CTGGTAACCG AGCATACGCT GTGAGAAAGC CCGGACTAAC ATCAGTGAAC GGCACTCTAG
14341
TACCTGGGCT TCGGAGCCTC GTGCTGGGCG GCAAACGAGC TGTTAAACGA GGAGTGGTTA
14401
ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAAGAACCAG AGCCAGAAGA AAAGAAGAAA TGCAGCTCCG
14461
ATGGGGAAAG GCCAGCCAGT CAATCAACTG TGCCAGTTGC TGGGTACAAT GATAAAGTCC
14521
CAGCGCCAGC AATCTAGGGG AGGACAGGCC AAAAAGAAGA AGCCTGAGAA GCCACATTTT
14581
CCCCTAGCTG CTGAAGATGA CATTCGGCAC CATCTCACCC AGGCCGAACG TTCCCTCTGC
14641
TTGCAATCGA TCCAGACGGC TTTCAATCAA GGCGCAGGAA CTGCGTCGCT TTCATCCAGC
14701
GGGAAGGTCA GTTTCCAGGT TGAGTTCATG CTGCCGGTTG CTCATACAGT GCGCCTGATT
14761
CGCGTGACTT CTACATCCGC CAGTCAGGGT GCAAATTAAT TTGACAGTCA GGTGAATGGC
14821
CGCGATTGAC GTGTGGCCTC TAA
SEQ ID NO: 2: ORF 1a DEL MSV 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 178...7227
MSGMFSRCMCTPAARVFWNAGQVYCTRCLSARSLLSPELQDTDLGAVGLFHKPKDKLHWKVPIGIPQVECSPSGCC
WLSTIFPLARMTSGNHNFLQRLVKVADVLYRDGCLTPRHLRELQVYERGCNWYPITGPVPGMAVYANSMHVSDQPF
PGATHVLTNSPLPQRACRQPFCPFEEAHSSIYRWEKFVIFMDSSSDGRSRMMWTPESDDSTALEVLPPELEHQVKVL
VRSFPAHHLVDLADWELTESPDNGFSFSTSHPCGYLVRDPAVSEGKCWLSCFLSQSAEVLSREAHLATAYGYQTKW
GVPGKYIQRRLQVHGLRAVVDPDGPIHVEALSCPQSWIRHLTLNDDVTPGFVRLMSLRIVPNTEPTTHRIFRFGVHKW
YGAAGKRARGKRAAKSEKDSASTLKVARPTSTSGIVTYSPPADGSCGWHALAAILNRMINNDFTSPLPRYNRPEDDW
ASDGDLAQAIQCLQLPAAIARNRACPNAKYLIKLNGVHWEVEVRPGMAPRSLSRECVVGVCSEGCVASPYPEDGLPK
RALEALASAYRLPSDCVCDGIIDFLANPPPQEFWTLDKMLTSPSPEQSGFSSLYKLLLEILPQKCGSTEGEFIYTVERM
LKDCPSSKQAMALLAKIKVPSSKAPSVTLNECFPTDVPVNSELISWEEPKDPGAAVVLCPSDAKESKETAPEEAQARN
RKVLHPVVLTEELSEQQVQVVEGDQDMPLDLTWPTLTATATPVRGPVPDNLSSGIGAQPATVQELILARPAPRLVERC
GTESNGSSSFLDLPDVQTSDQPLDLSLAAWPVRATASDPGWIHGRREPVFVKPRGVFSDGESALQFGELSEASSVV
DDRTKEAPVVDAPIDLTTSNETLSGSDPFEFAKFRRPRFSAQALIDRGGPLADVHAKIKSRVYEQCLQACEPGSRATP
ATKKWLDKMWDRVDMKTWRCTSQFQAGHILESLKFLPDMIQDTPPPVPRKNRAGDSAGLKQLVAQWDRKSSVTPP
TKPVGPVLDQAVPLPMDIQQGDAISADKPPHSQNPSSQVDVGGGWKSFMLSGTRFAGSVSQRLTTWVFEVLSHLPA
FMLTLFSPRGSMAPGDWLFAGAVLLALLLCRSYPILGCLPLLGVFSGSVRCVRLGVFGSWMAFAVFLFSTPPDPVGS
SCDHDSPECHAELLALEQRQLWEPVRSLVVGPSGLLCVILGKLLGGSRCLWFVLLRICMLADLAISLIYVVSQGRCHK
CWGKCIRTAPAEVALNVFPFSRATRSSLVSLCDRFQAPKGVDPVHLATGWRGCWCGESPIHQSHQKPIAYANLDEK
KISAQTVIAVPYDPSQAIKCLKVLQAGGAIVDQPTPEVVRVSEIPFSAPFFPKVPVNPDCRVVVDSDTFVAAVRCGYST
AQLVLGRGNFAKLNQTPLRNSVPTKTTGGASYTLAVAQVSVWTLVHFILGLWLTSPQVCGRGTSDPWCSNPFSYPTY
GPGVVCSSRLCVSADGVTLPLFSAVAHLSGREVGIFILVLASLGALAHRLALKADMSMVFLAFCAYAWPMSSWLICFF
PMLLRWVTLHPLTMLWVHSFLVFCLPAAGVLSLGITGLLWAVGRFTQVAGIITPYDIHQYTSGPRGAAAVATAPEGTY
MAAVRRAALTGRTLIFTPSAVGSLLEGAFRTQKPCLNTVNVVGSSLGSGGVFTIDGRRVIVTATHVLNGNTARVTGDS
YNRMHTFNTNGDYAWSHADDWQGVAPMVKIAKGYRGRAYWQTSTGVEPGIMGEGFAFCFTNCGDSGSPVISEAG
DLIGVHTGSNKLGSGLVTTPEGETCSIKETRLSDLSRHFAGPSVPLGDIKLSPAIIPDVTTIPSDLASLLASVPVMEGGLS
TVQLLCVFFLLWRMMGHAWTPIVAVGFFLLNEILPAVLVRAVFSFALFVLAWATPWSAQVLMIRLLTAALNRNRLSLAF
YAFGGVVGLATEIGTFAGGWPELSQALSTYCFLPRFLAVTSYVPTIIIGGLHALGVILWLFKYRCLHNMLVGDGSFSSA
FFLRYFAEGNLRKGVSQSCGMNNESLTAALACKLSQADLDFLSSLTNFKCFVSASNMKNAAGQYIEAAYARALRQEL
ASLVQVDKMKGVLAKLEAFAETATPSLDTGDVIVLLGQHPHGSILDINVGGERKTVSVQETRCLGGSKFSVCTVVSNT
PVDTLTGIPLQTPTPLFENGPRHRSEDDDLKVERMKKHCVSLGFHKINGKVYCKIWDKSNGDTFYTDDSRYTQDHAF
QDRSTDYRDRDYEGVQTAPQQGFDPKSEAPVGTVVIGGITYNRHLVKGKEVLVPKPDNCLEAARLSLEQALAGMGQ
TCDLTATEVEKLKRIISQLQGLTTEQALNC
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
SEQ ID NO:3 ORF 1B DEL MSV 94881 CODIFICADO POR SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 7209...11600
TGFKLLAASGLTRCGRGGLVVTETAVKIVKYHSRTFTLGSLDLKVTSEVEVKKSTEQGHAVVANLCSGVVLMRPHPPS
LVDVLLKPGLDTTPGIQPGHGAGNMGVNGSIWDFETAPTKVELELSKQIIQACEVRRGDAPNLQLPYKLYPVRGDPER
RKGRLVNTRFGDLPYKTPQDTKSAIHAACCLHPNGVLVSDGKSTLGTTLQHGFELYVPTVPYSVMEYLDSRPDTPFM
CTKHGTSKAAAEDLQKYDLSTQGFVLPGVLRLVRRFIFSHVGKAPPLFLPSTYPAKNSMAGVNGQRFPTKDVQSIPEI
DEMCARAVKENWQTVTPCTLKKQYCSKPKTRTILGTNNFIALAHRSALSGVTQAFMKKAWKSPIALGKNKFKELHCTV
AGRCLEADLASCDRSTPAIVRWFVANLLYELAGCEEYLPSYVLNCCHDLVATQDGAFTKRGGLSSGDPVTSVSNTVY
SLIIYAQHMVLSALKMGHEIGLKFLEEQLKFEDLLEIQPMLVYSDDLVLYAERPTFPNYHWWVEHLDLMLGFKTDPKKT
VITDKPSFLGCRIEAGRQLVPNRDRILAALAYHMKAQNASEYYASAAAILMDSCACIDHDPEWYEDLICGIARCARQDG
YRFPGPAFFMSMWEKLKSHNEGKKCRHCGICDAKADYASACGLDLCLFHSHFHQHCPVTLSCGHHAGSKECSQCQ
SPVGAGKSPLDAVLKQIPYKPPRTIIMKVDNKTTTLDPGRYQSRRGLVAVKRGIAGNEVDLSDGDYQVVPLLPTCKDIN
MVKVACNVLLSKFIVGPPGSGKTTWLLNQVQDDDVIYTPTHQTMFDIVSALKVCRYSIPGASGLPFPPPARSGPWVRL
IASGHVPGRVSYLDEAGYCNHLDILRLLSKTPLVCLGDLQQLHPVGFDSYCYVFDQMPQKQLTTIYRFGPNICAAIQPC
YREKLESKARNTRVVFTTRPVAFGQVLTPYHKDRTGSAITIDSSQGATFDIVTLHLPSPKSLNKSRALVAITRARHGLFI
YDPHDQLQEFFNLTPERTDCNLAFSRGDELVVLNVDNAVTTVAKALETGSPRFRVSDPRCKSLLAACSASLEGSCMP
LPQVAHNLGFYFSPDSPAFAPLPKELAPHWPVVTHQNNRAWPDRLVASMRPIDARYSKPMVGAGYVVGPSIFLGTP
GVVSYYLTLYIGGEPQALPETLVSTGRIATDCREYLDAAEEEAARELPHAFIGDVKGTTIGGCHHITSKYLPRSLPKDSV
AVVGVSSPGRAAKAVCTLTDVYLPELRPYLQPETASKCWKLKLDFRDVRLMVWKGATAYFQLEGLTWSALPDYARFI
QLPKDAVVYIDPCIGPATANRKVVRTTDWRADLAVTPYDYGAQVILTTAWFEDLGPQWKILGLQPFRRTFGFENTED
WAILARRMNDGKDYTDYNWHCVRERPHAIYGRARDHTYHFALGTELQVELGRPRLPPEQVP
SEQ ID NO:4 ORF 2 DEL MSV 94881 CODIFICADO POR SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 11611...12360
MQWVYCGVKSVSCSWMPSLSSLLVWLTLSSFSPYCLGSLLQAGYWSSFSEWFAPRFSVRALPFTLPNYRRSYEGLL
PNCRPDVPQFAVKHPLGILWHMRVSHLIDEMVSRRIYRTMEHSGQAAWKQVVSEATLTKLSRLDVVTHFQHLAAVEA
DSCRFLSSRLAMLKNLAVGNVSLEYNTTLDRVELIFPTPGTRPKLTDFRQWLISVHASIFSSVASSVTLFTVLWLRIPAL
RYVFGFHWPTATHHSN
SEQ ID NO:5 ORF 3 DEL MSV 94881 CODIFICADO POR SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 12219...13016
MAYQRARFHLLLCGFVCYLVHSALASNSSSTLCFWFPLAHGNTSFELTINYTICKPCPTSQAAQQRLEPGRNVWCKIG
HDRCEERDHDELSMSIPSGYDNLKLEGYYAWLAFLSFSYAAQFHPELFGIGNVSRVFVDKRHQFICAEHDGQNSTISA
RHNISASYAVYYHHQIDGGNWFHLEWLRPFFSSWLVLNISWFLRRSPASPASRRIYQILRPTRPRLPVSWSFRTSIVS
NLTGPQQRKVPLPSGGRPNVVKPSAFPSTSR
SEQ ID NO:6 ORF 4 DEL MSV 94881 CODIFICADO POR SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 12761...13312
MAATILFLLAGAQHLMVSEAFACKPCFSTHLSDIKTNTTAAAGFMVLQNINCFQSHRASTAQGTTPLRRSSQCREAVGI
PQYITITANVTDESYLYNADLLMLSACLFYASEMSEKGFKVIFGNISGVVSACVNFTDYVAHVTQHTQQHHLVIDHIRLL
HFLTPSTMRWATTIACLLAILLAV
SEQ ID NO:7 ORF 5 DEL MSV 94881 CODIFICADO POR SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 13309.13914
MKCSCKLGHFLTPHSCFWWLFLLCTGLSWSFVDGNDDSSTSQYIYNLTICELNGTEWLSGHFDWAVETFVLYPVATH
IISLGFLTTSHFLDALGLGAVSATGFIGERYVLSSMYGVCAFAAFVCFVIRAAKNCMACRYARTRFTNFIVDDRGRIHR
WKSSIVVEKLGKAEVGGDLVNIKHVVLEGVKAQPLTRTSAEQWEA
SEQ ID NO:8 ORF 6 DEL MSV 94881 CODIFICADO POR SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 13902...14423
MGSLDDFCNDPTAAQKLVLAFSITYTPIMIYALKVSRGRLLGLLHILIFLNCSFTFGYMTYVHFQSTNRVAFTLGAVVALL
WGVYSLTESWKFITSRCRLCCLGRRYILAPAHHVESAAGLHSIPASGNRAYAVRKPGLTSVNGTLVPGLRSLVLGGKR
AVKRGVVNLVKYGR
SEQ ID NO:9 ORF 7 DEL MSV 94881 CODIFICADO POR SECUENCIA DE SEQ ID NO:1 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 14413...14799
MAGKNQSQKKRRNAAPMGKGQPVNQLCQLLGTMIKSQRQQSRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQAERSL
CLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGKVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAN
SEQ ID NO:10 SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS DE LONGITUD COMPLETA DE LA CEPA DEL PRRS PARENTAL 94881
5
10
15
20
25
30
35
1
TTTGTGTACC TTGGAGGCGT GGGTACAGCC CTGCCCCACC CCTTGGCCCC TGTTCTAGCC
61
CGACAGGTAC CCTTCTCTCT CGGGGCGAGC GCGCCGCCTG CTGCTCCCTT GCGGCGGGAA
121
GGACCTCCCG AGTATTTCCG GAGAGCACCT GCTTTACGGG ATCTCCGCCC TTTAACCATG
181
TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGGTATTTTG GAACGCCGGC
241
CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC
301
ACGGACCTCG GTGCAGTTGG CTTGTTTCAC AAGCCTAAAG ACAAGCTCCA TTGGAAAGTT
361
CCCATTGGTA TCCCCCAGGT GGAATGTTCT CCATCTGGGT GTTGCTGGCT GTCAACCATT
421
TTTCCTTTAG CGCGCATGAC CTCCGGCAAT CACAACTTCC TTCAACGACT CGTGAAGGTT
481
GCTGACGTAT TGTACCGTGA CGGTTGCTTA ACCCCTAGAC ACCTCCGTGA ACTCCAAGTT
541
TACGAGCGTG GTTGCAATTG GTATCCGATT ACGGGGCCTG TGCCTGGGAT GGCTGTGTAC
601
GCGAACTCCA TGCACGTGTC CGACCAACCG TTCCCTGGTG CCACTCATGT GTTAACAAAT
661
TCCCCTTTGC CTCAACGGGC TTGTCGGCAG CCGTTCTGTC CGTTCGAAGA GGCCCATTCT
721
AGCATATACA GGTGGGAAAA ATTTGTAATT TTTATGGATT CCTCCTCCGA CGGTCGATCT
781
CGCATGATGT GGACTCCGGA ATCCGATGAC TCCACGGCTT TGGAAGTTCT GCCGCCCGAG
841
CTAGAACACC AGGTCAAGGT CCTTGTTCGG AGCTTTCCCG CCCATCACCT TGTCGACCTT
901
GCCGATTGGG AGCTCACTGA GTCCCCTGAG AACGGTTTTT CCTTCAGCAC GTCACATCCT
961
TGCGGCTACC TTGTTCGGGA CCCGGCTGTA TCCGAAGGCA AGTGTTGGCT TTCCTGCTTT
1021
TTGAGCCAGT CAGCCGAAGT GCTCAGTCGC GAGGCGCATC TGGCTACCGC CTATGGTTAC
1081
CAAACCAAGT GGGGTGTGCC TGGCAAGTAC ATCCAGCGCA GACTTCAAGT TCACGGTCTC
1141
CGTGCTGTGG TCGACCCTGA TGGTCCCATT CACGTTGAAG CATTGTCTTG CCCCCAGTCT
1201
TGGATCAGGC ACTTGACCCT GAATGATGAT GTCACCCCGG GATTCGTTCG CCTAATGTCT
1261
CTTCGCATTG TGCCGAACAC AGAGCCTACC ACACACCGGA TCTTTCGTTT TGGAGTGCAC
1321
AAGT GGTATG GTGCCGCCGG CAAACGGGCC CGTGGCAAGC GTGCCGCCAA AAGTGAGAAA
1381
GACTCGGCTT CCACCCTCAA GGTTGCCCGA CCGACTTCCA CCAGTGGAAT CGTCACCTAC
1441
TCCCCACCTG CGGACGGGTC TTGTGGTTGG CATGCCCTTG CCGCCATACT GAACCGGATG
1501
ATTAATAATG ACTTCACGTC CCCTCTGCCT CGGTACAACA GGCCGGAGGA CGATTGGGCT
1561
TCTGATGGTG ACCTTGCTCA GGCCATTCAA TGTTTGCAAC TACCTGCCGC CATAGCTCGG
1621
AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC GTAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA
1681
GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AGTGCGTTGT TGGCGTCTGC
1741
TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG
1801
GCCCTGGCGT CTGCTTATAG ACTGCCTTCA GACTGTGTTT GTGATGGTAT TATTGACTTC
1861
CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AAATGTTGAC TTCCCCGTCA
1921
CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGTCTGTAT AAATTGTTGT TAGAGGTCTT GCCGCAGAAA
1981
TGCGGATCCA CAGAAGGGGA ATTCATCTAT ACTGTTGAGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG
2041
AGCTCCAAAC AGGCCATGGC CCTCCTTGCA AAAATTAAGG TCCCATCCTC AAAGGCCCCA
2101
TCCGTGACTC TGAACGAGTG CTTCCCCACG GATGTTCCAG TCAACTCTGA GTTAATATCT
2161
TGGGAAGAGC CCAAAGACCC TGGCGCTGCT GTTGTCCTAT GTCCATCGGA TGCAAAAGAA
5
10
15
20
25
30
35
2221
TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA AGAAGCTCAA GCGAGAAACC GTAAGGTCCT CCACCCTGTG
2281
GTCCTTACCG AGGAACTTAG CGAGCAACAG GTGCAGGTGG TTGAGGGTGA TCAGGATATG
2341
CCACTGGATT TGACTTGGCC AACCTTAACC GCTACGGCGA CCCCTGTTAG AGGGCCGGTA
2401
CCGGACAATT TGAGCTCTGG CATTGGTGCC CAGCCCGCTA CCGTTCAAGA ACTCATTCTG
2461
GCGAGGCCTG CACCCCGTCT TGTTGAGCGC TGTGGCACGG AGTCGAACGG CAGCAGTTCA
2521
TTTCTGGATT TGCCTGACGT GCAGACCTCG GACCAGCCTT TAGACCTGTC CCTGGCCGCG
2581
TGGCCTGTAA GGGCTACCGC GTCTGACCCC GGTTGGATCC ACGGTAGGCG TGAGCCTGTC
2641
TTTGTGAAGC CTCGAGGTGT TTTCTCTGAT GGCGAGTCGG CCCTTCAGTT CGGAGAGCTT
2701
TCCGAAGCCA GTTCTGTCGT CGATGACCGG ACAAAAGAAG CTCCGGTGGT TGACGCCCCC
2761
ATCGATTTGA CAACTTCGAA CGAGACGCTC TCTGGGTCTG ACCCCTTTGA ATTCGCCAAA
2821
TTCAGGCGCC CGCGTTTCTC CGCGCAAGCT TTAATCGACC GAGGTGGTCC GCTTGCCGAT
2881
GTTCATGCAA AGATAAAGAG TCGGGTATAT GAACAATGCC TTCAAGCTTG TGAACCTGGT
2941
AGTCGTGCGA CCCCAGCCAC CAAGAAGTGG CTCGACAAAA TGTGGGACAG GGTGGACATG
3001
AAAACTTGGC GCTGCACCTC GCAGTTCCAA GCTGGTCACA TTCTTGAGTC CCTCAAATTC
3061
CTCCCTGACA TGATTCAAGA CACACCGCCT CCTGTTCCCA GGAAGAACCG AGCTGGTGAC
3121
AGTGCCGGCC TGAAGCAACT GGTGGCGCAG TGGGATAGGA AATTGAGTGT GACACCCCCC
3181
ACAAAACCGG TTGGACCGGT GCTTGACCAG ACCGTCCCTC TGCCTATGGA CATCCAGCAA
3241
GAAGATGCCA TCTCCGCTGA CAAGCCACCC CATTCGCAAA ACCCTTCTAG TCAAGTAGAT
3301
GTGGGTGGAG GTTGGAAAAG TTTTATGCTC TCCGGCACCC GTTTCGCGGG GTCCGTTAGT
3361
CAGCGCCTTA CGACATGGGT TTTTGAGGTT CTCTCCCATC TCCCAGCTTT TATGCTCACA
3421
CTTTTCTCGC CACGGGGCTC TATGGCTCCA GGTGATTGGC TGTTTGCAGG TGCTGTTCTA
3481
CTTGCTCTCC TGCTCTGCCG TTCTTACCCA ATACTCGGAT GCCTTCCCTT ATTGGGTGTC
3541
TTTTCTGGTT CTGTGCGGTG TGTTCGTTTG GGTGTTTTTG GTTCTTGGAT GGCTTTTGCT
3601
GTATTTTTAT TCTCGACTCC ACCCGACCCA GTCGGTTCTT CTTGTGACCA CGATTCGCCG
3661
GAGTGTCATG CTGAGCTTTT GGCTCTTGAG CAGCGCCAAC TTTGGGAACC TGTGCGCAGC
3721
CTTGTGGTCG GGCCATCGGG CCTCTTATGC GTCATTCTTG GCAAGTTACT CGGTGGGTCA
3781
CGTTGTCTCT GGTTTGTTCT CCTACGTATA TGCATGCTCG CAGATTTGGC AATTTCTCTT
3841
ATTTATGTGG TGTCCCAAGG GCGTTGTCAC AAGTGTTGGG GAAAGTGTAT AAGGACGGCT
3901
CCTGCAGAAG TGACCCTTAA TGTGTTTCCT TTTTCGCGCG CCACCCGCTC ATCTCTTGTG
3961
TCCTTGTGTG ATCGGTTCCA AGCGCCAAAA GGAGTTGACC CCGTGCACTT GGCGACAGGC
4021
TGGCGCGGGT GCTGGTGTGG TGAGAGCCCT ATTCATCAAT CACACCAAAA ACCGATAGCT
4081
TATGCCAACT TGGATGAAAA GAAGATATCC GCCCAGACGG TGATTGCTGT CCCGTATGAT
4141
CCCAGTCAGG CCATTAAATG CCTGAAAGTT TTGCAGGCAG GAGGGGCTAT TGTGGACCAG
4201
CCTACGCCCG AGGTCGTCCG TGTGTCTGAG ATTCCCTTCT CGGCCCCATT TTTTCCGAAG
4261
GTCCCAGTCA ACCCAGATTG CAGGGTTGTG GTAGATTCGG ACACTTTTGT GGCTGCGGTC
4321
CGCTGCGGTT ATTCGACAGC ACAACTGGTC CTTGGTCGGG GCAACTTTGC CAAGCTAAAT
4381
CAGACCCCCC TCAGGAACTC TGTCCCCACC AAAACAACTG GTGGGGCCTC ATACACCCTT
5
10
15
20
25
30
35
4441
GCCGTGGCCC AGGTATCTGT GTGGACTCTT GTTCATTTCA TCCTCGGCCT TTGGTTAACG
4501
TCACCTCAAG TGTGTGGTCG AGGGACCTCT GACCCGTGGT GTTCGAACCC TTTTTCGTAT
4561
CCTACTTATG GCCCCGGAGT TGTGTGTTCC TCTCGACTCT GCGTGTCTGC CGACGGAGTT
4621
ACCCTGCCAT TGTTCTCAGC CGTTGCCCAT CTTTCCGGTA GAGAGGTGGG GATTTTTATT
4681
TTGGTGCTTG CCTCCTTGGG CGCTTTAGCC CACCGCTTGG CTCTTAAGGC AGACATGTCA
4741
ATGGTCTTTT TGGCGTTTTG TGCTTACGCC TGGCCCATGA GCTCCTGGTT AATTTGCTTC
4801
TTTCCTATGC TCTTGAGGTG GGTAACCCTT CATCCTCTCA CTATGCTTTG GGTGCACTCA
4861
TTTTTGGTGT TTTGCCTACC AGCTGCCGGC GTTCTCTCGC TGGGAATAAC CGGTCTTCTT
4921
TGGGCAGTTG GCCGTTTCAC CCAGGTTGCC GGAATTATCA CACCTTATGA CATCCACCAG
4981
TATACCTCCG GACCACGTGG TGCAGCTGCT GTAGCAACGG CTCCAGAAGG TACTTACATG
5041
GCGGCCGTTC GGAGAGCCGC TTTGACTGGA CGGACTTTGA TCTTCACACC ATCTGCAGTC
5101
GGATCCCTTC TTGAAGGTGC TTTCAGAACT CAAAAGCCCT GCCTTAACAC CGTGAATGTC
5161
GTAGGCTCTT CCCTTGGTTC TGGAGGAGTT TTCACCATTG ATGGCAGAAG AGTCATCGTC
5221
ACTGCCACCC ATGTGTTGAA TGGTAACACA GCCAGGGTCA CTGGTGATTC CTACAACCGC
5281
ATGCACACGT TCAATACTAA TGGTGATTAT GCCTGGTCCC ATGCTGATGA CTGGCAAGGC
5341
GTTGCCCCTA TGGTTAAGAT CGCTAAGGGG TATCGCGGTC GTGCCTACTG GCAAACGTCA
5401
ACCGGAGTCG AACCTGGCAT CATGGGGGAA GGATTCGCCT TCTGTTTCAC TAACTGTGGC
5461
GACTCAGGGT CACCTGTCAT TTCAGAAGCT GGTGACCTTA TTGGAGTCCA TACCGGTTCA
5521
AACAAACTCG GTTCTGGTCT TGTGACAACC CCTGAAGGGG AGACCTGCTC CATCAAGGAA
5581
ACTAGGCTCT CTGACCTTTC TAGACATTTT GCAGGTCCAA GCGTCCCTCT TGGGGACATT
5641
AAGTTGAGCC CAGCCATCAT CCCTGATGTG ACAACTATTC CGAGTGACTT GGCATCGCTC
5701
CTTGCTTCTG TCCCCGTGAT GGAAGGTGGC CTCTCAACTG TCCAGCTTTT GTGCGTCTTT
5761
TTCCTTCTCT GGCGCATGAT GGGCCATGCC TGGACACCCA TTGTTGCCGT AGGCTTCTTT
5821
TTGCTGAATG AAATTCTCCC AGCAGTCTTG GTCCGAGCTG TGTTCTCTTT TGCACTCTTT
5881
GTACTTGCAT GGGCCACCCC CTGGTCGGCA CAAGTGTTGA TGATTAGACT CCTCACGGCG
5941
GCTCTCAACC GCAACAGGTT GTCCCTGGCG TTCTACGCAC TCGGAGGTGT CGTTGGCCTG
6001
GCCACAGAAA TCGGGACTTT TGCTGGTGGA TGGCCTGAAC TGTCCCAAGC CCTCTCGACA
6061
TACTGCTTCC TGCCCAGGTT CCTTGCTGTG ACTAGTTATG TCCCCACCAT CATCATCGGT
6121
GGGCTCCATG CCCTCGGCGT AATTTTGTGG TTATTCAAAT ACCGATGCCT CCACAACATG
6181
CTGGTTGGTG ATGGGAGTTT CTCAAGCGCT TTCTTCCTAC GGTATTTTGC TGAGGGTAAT
6241
CTTAGGAAAG GCGTGTCGCA GTCCTGTGGC ATGAATAACG AATCCCTGAC AGCTGCTTTG
6301
GCTTGCAAGT TGTCGCAAGC TGACCTTGAT TTTTTGTCCA GTTTAACGAA CTTCAAGTGC
6361
TTTGTGTCCG CTTCAAACAT GAAAAATGCA GCTGGCCAAT ACATCGAGGC GGCGTATGCT
6421
AGAGCTCTGC GTCAGGAGCT GGCCTCCTTG GTTCAGGTTG ACAAGATGAA AGGAGTATTG
6481
GCCAAGCTCG AGGCTTTCGC TGAGACGGCC ACTCCGTCAC TTGACACAGG TGACGTGATT
6541
GTTCTGCTTG GGCAACACCC CCATGGATCC ATCCTCGACA TTAATGTGGG GGGTGAAAGG
6601
AAAACTGTGT CTGTGCAAGA AACACGATGC CTGGGTGGTT CCAAATTCAG TGTCTGCACT
5
10
15
20
25
30
35
6661
GTCGTGTCCA ACACGCCCGT GGATACCTTG ACCGGCATCC CACTTCAGAC GCCAACCCCA
6721
CTTTTTGAAA ATGGCCCGCG CCATCGCAGC GAGGACGACG ACCTTAAAGT TGAGAGAATG
6781
AAAAAACACT GTGTATCCCT CGGCTTCCAC AAAATCAATG GTAAAGTTTA CTGCAAAATT
6841
TGGGACAAGT CTAACGGCGA CACCTTTTAC ACGGATGATT CCCGATACAC TCAAGACCAT
6901
GCTTTTCAGG ACAGGTCAAC CGACTATAGA GACAGGGATT ATGAAGGTGT ACAGACCGCC
6961
CCCCAACAGG GATTCGATCC AAAGTCCGAA GCCCCTGTTG GCACTGTTGT AATCGGTGGC
7021
ATTACGTATA ACAGGCATCT GGTCAAAGGT AAGGAGGTCC TAGTTCCCAA ACCTGACAAC
7081
TGCCTTGAAG CTGCCAGACT GTCCCTTGAG CAAGCTCTTG CTGGGATGGG CCAAACTTGT
7141
GACCTTACAG CTACCGAAGT GGAGAAACTA AAGCGCATCA TTAGTCAACT CCAAGGTCTG
7201
ACCACTGAAC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GACCCGCTGT GGCCGCGGCG
7261
GCCTAGTTGT AACTGAAACG GCGGTAAAAA TCGTAAAATA CCACAGCAGA ACTTTCACCT
7321
TAGGCTCTTT AGACCTAAAA GTCACCTCCG AGGTGGAGGT GAAGAAATCA ACTGAGCAGG
7381
GGCACGCTGT CGTGGCGAAC TTATGTTCCG GTGTCGTCTT GATGAGGCCT CACCCACCGT
7441
CCCTTGTTGA CGTTCTCCTC AAACCCGGAC TTGACACAAC ACCCGGCATT CAACCAGGGC
7501
ATGGGGCCGG GAATATGGGC GTGAACGGTT CTATTTGGGA TTTTGAAACT GCACCCACAA
7561
AGGTAGAACT AGAGTTGTCC AAGCAAATAA TCCAAGCATG TGAAGTCAGG CGCGGGGACG
7621
CCCCTAACCT CCAACTCCCC TACAAGCTTT ATCCTGTCAG GGGGGACCCC GAGCGGCGTA
7681
AAGGTCGCCT TGTCAACACT AGGTTTGGAG ATTTACCTTA CAAAACTCCC CAAGACACCA
7741
AGTCCGCAAT TCATGCGGCT TGTTGCCTGC ATCCCAATGG GGTCCTCGTG TCTGATGGTA
7801
AATCCACGCT GGGTACCACT CTTCAACATG GTTTCGAGCT TTATGTCCCC ACTGTACCTT
7861
ATAGTGTCAT GGAATACCTT GATTCACGCC CTGACACCCC TTTTATGTGT ACTAAACATG
7921
GCACTTCCAA GGCTGCTGCA GAGGACCTCC AAAAATATGA CCTATCCACT CAAGGGTTTG
7981
TCTTGCCTGG GGTCCTACGC CTAGTGCGCA GGTTCATCTT TAGCCATGTT GGTAAGGCGC
8041
CACCACTGTT CCTTCCATCA ACCTACCCTG CCAAGAACTC CATGGCAGGG GTCAATGGCC
8101
AGAGGTTCCC AACAAAGGAT GTCCAGAGCA TACCTGAAAT TGATGAAATG TGCGCCCGTG
8161
CCGTCAAGGA AAATTGGCAG ACTGTGACAC CTTGCACCCT CAAAAAACAG TACTGTTCCA
8221
AACCTAAAAC TAGAACCATC CTAGGTACCA ACAACTTCAT AGCCTTGGCT CACAGGTCAG
8281
CACTCAGTGG TGTCACCCAG GCGTTCATGA AGAAGGCCTG GAAGTCCCCA ATTGCCTTGG
8341
GGAAAAACAA GTTTAAGGAA TTGCATTGCA CTGTCGCCGG CAGATGCCTT GAGGCTGACC
8401
TGGCTTCCTG CGATCGCAGC ACCCCCGCCA TTGTGAGGTG GTTTGTTGCC AACCTCCTGT
8461
ATGAACTTGC AGGATGTGAA GAGTACTTGC CTAGCTACGT GCTCAACTGT TGCCATGACC
8521
TTGTGGCAAC GCAGGATGGC GCTTTCACAA AACGCGGTGG CCTGTCGTCC GGGGACCCCG
8581
TCACCAGTGT GTCCAACACC GTCTACTCAC TGATAATTTA CGCCCAGCAC ATGGTGCTTT
8641
CGGCCTTGAA GATGGGTCAT GAAATTGGTC TCAAGTTCCT TGAGGAACAG CTCAAATTTG
8701
AGGACCTTCT TGAAATCCAG CCCATGTTAG TGTATTCTGA TGACCTCGTC TTGTATGCGG
8761
AAAGACCCAC TTTTCCCAAC TACCATTGGT GGGTCGAGCA TCTTGACCTG ATGTTGGGCT
8821
TTAAAACGGA CCCAAAGAAA ACTGTCATAA CTGATAAACC CAGTTTTCTC GGCTGCAGAA
5
10
15
20
25
30
35
8881
TTGAAGCAGG ACGGCAGTTA GTCCCCAATC GCGACCGTAT TCTGGCTGCT CTTGCATATC
8941
ATATGAAGGC GCAGAACGCC TCAGAGTATT ATGCGTCCGC TGCCGCAATT CTGATGGATT
9001
CGTGTGCTTG CATTGACCAT GACCCCGAGT GGTATGAGGA CCTTATCTGC GGCATCGCCC
9061
GGTGTGCTCG CCAGGACGGT TACCGTTTTC CAGGCCCGGC ATTTTTCATG TCCATGTGGG
9121
AGAAGCTGAA AAGTCATAAC GAAGGGAAGA AATGCCGTCA CTGCGGCATC TGCGACGCCA
9181
AAGCCGACTA TGCGTCCGCC TGTGGACTTG ATTTGTGTTT GTTCCATTCA CACTTTCATC
9241
AACACTGCCC AGTCACTCTG AGCTGTGGCC ACCATGCCGG TTCAAAGGAA TGTTCGCAGT
9301
GTCAGTCACC TGTCGGGGCT GGCAAATCCC CCCTTGACGC TGTGCTGAAA CAAATCCCGT
9361
ACAAACCTCC TCGTACCATT ATCATGAAGG TGGACAACAA AACAACGACC CTTGACCCGG
9421
GAAGATATCA GTCCCGTCGA GGTCTTGTTG CAGTCAAAAG AGGTATTGCA GGTAATGAGG
9481
TTGATCTTTC TGATGGAGAC TACCAAGTGG TGCCTCTTTT GCCGACTTGC AAAGACATAA
9541
ACATGGTGAA GGTGGCTTGC AACGTACTAC TCAGCAAGTT TATAGTAGGG CCGCCAGGTT
9601
CCGGAAAAAC CACCTGGCTA CTGAACCAAG TCCAGGACGA TGATGTCATT TACACACCTA
9661
CTCATCAGAC AATGTTTGAC ATAGTCAGTG CTCTTAAAGT TTGCAGGTAT TCCATCCCAG
9721
GAGCCTCAGG ACTCCCTTTT CCACCACCTG CCAGGTCCGG GCCGTGGGTT AGGCTCATCG
9781
CCAGCGGACA TGTCCCTGGC CGAGTGTCAT ATCTCGATGA GGCAGGATAT TGCAATCATC
9841
TAGACATTCT AAGGCTGCTT TCCAAAACAC CCCTTGTGTG TTTGGGTGAC CTTCAGCAAC
9901
TTCACCCGGT CGGCTTTGAT TCCTATTGTT ATGTGTTCGA TCAGATGCCT CAGAAGCAGC
9961
TGACCACCAT TTATAGATTT GGCCCTAACA TCTGTGCAGC CATCCAGCCT TGTTACAGGG
10021
AGAAACTTGA ATCCAAGGCC AGGAACACCA GAGTGGTTTT CACCACCCGG CCTGTGGCCT
10081
TTGGTCAGGT CCTGACACCG TACCACAAAG ATCGTACCGG CTCTGCAATA ACTATAGATT
10141
CATCCCAGGG GGCGACCTTC GACATTGTGA CATTGCATCT ACCATCGCCA AAGTCCCTAA
10201
ACAAATCCCG AGCACTTGTA GCCATCACTC GGGCAAGACA TGGGTTGTTC ATTTATGACC
10261
CTCATGACCA ACTCCAGGAG TTTTTCAACT TAACCCCCGA GCGCACTGAT TGTAACCTTG
10321
CGTTCAGCCG TGGGGATGAG CTGGTTGTTT TGAATGTGGA TAATGCGGTC ACAACTGTAG
10381
CGAAGGCCCT AGAGACAGGT TCACCCCGAT TTCGAGTATC GGACCCGAGG TGCAAGTCTC
10441
TCTTAGCCGC TTGTTCGGCC AGTCTAGAAG GGAGCTGCAT GCCACTACCA CAAGTAGCAC
10501
ATAACCTGGG GTTTTACTTT TCCCCGGACA GCCCAGCTTT TGCACCCCTG CCAAAAGAGC
10561
TGGCGCCACA TTGGCCAGTG GTCACCCACC AGAATAATCG AGCGTGGCCT GATCGACTTG
10621
TCGCTAGTAT GCGCCCAATT GATGCCCGCT ACAGCAAGCC AATGGTCGGT GCAGGGTATG
10681
TGGTCGGGCC ATCCATTTTT CTTGGCACTC CTGGTGTGGT GTCATACTAT CTCACATTAT
10741
ACATCGGGGG CGAGCCTCAG GCCCTGCCAG AAACACTCGT TTCAACAGGA CGTATAGCCA
10801
CAGATTGTCG GGAATATCTC GACGCGGCTG AGGAAGAGGC AGCGAGAGAA CTTCCCCACG
10861
CATTTATTGG CGATGTCAAA GGCACTACGG TCGGGGGGTG TCACCACATT ACATCGAAAT
10921
ACCTACCTAG GTCCCTGCCT AAAGACTCTG TTGCTGTGGT TGGGGTGAGT TCGCCCGGTA
10981
GGGCTGCTAA AGCCGTGTGC ACTCTCACCG ATGTGTACCT CCCCGAACTC CGACCATATT
11041
TGCAACCGGA GACGGCATCA AAATGCTGGA AACTTAAACT GGATTTCAGG GATGTTCGAC
5
10
15
20
25
30
35
11101
TGATGGTCTG GAAAGGCGCC ACAGCCTATT TCCAGTTGGA AGGGCTGACA TGGTCAGCGC
11161
TGCCCGATTA TGCTAGGTTC ATTCAGCTAC CCAAGGATGC CGTTGTGTAC ATCGATCCGT
11221
GTATAGGGCC GGCAACAGCC AATCGCAAGG TTGTGCGAAC CACAGACTGG CGGGCCGACC
11281
TGGCAGTGAC ACCGTATGAT TACGGTGCTC AGGTCATTTT GACAACAGCC TGGTTCGAGG
11341
ACCTTGGGCC GCAGTGGAAG ATTTTGGGGT TGCAGCCTTT CAGACGAACA TTTGGCTTTG
11401
AGAACACTGA AGATTGGGCA ATTCTCGCAC GCCGTATGAA TGACGGCAAA GATTACACTG
11461
ACTATAATTG GCATTGTGTA CGAGAACGCC CACACGCAAT TTACGGGCGC GCCCGTGACC
11521
ATACGTATCA TTTTGCCCTT GGCACTGAAC TGCAAGTAGA GCTGGGCAGA CCCCGGCTGC
11581
CTCCTGAGCA AGTGCCGTGA ACGCGGAGTG ATGCAATGGG TTCACTGTGG AGTAAAATCA
11641
GTCAGTTGTT CGTGGATGCC TTCACTGAGT TCCTTGTTAG TGTGGTTGAC ATTGTCATCT
11701
TTCTCGCCAT ATTGTTTGGG TTCACTGTTG CAGGCTGGTT ATTGGTCTTC CTTCTCAGAG
11761
TGGTTTGCTC CGCGTTTCTC CGTTCGCGCT CTGCCATTCA CTCTCCCGAA CTATCGAAGG
11821
TCCTATGAGG GCTTGCTACC CAACTGCAGA CCGGATGTCC CACAATTCGC AGTTAAGCAC
11881
CCGTTGGGTA TACTTTGGCA TATGCGAGTC TCCCACCTAA TTGACGAAAT GGTCTCTCGC
11941
CGCATTTACC GGACCATGGA ACATTCGGGT CAAGCGGCCT GGAAGCAGGT TGTTAGTGAA
12001
GCCACTCTCA CAAAACTGTC AAGGCTTGAC GTAGTCACTC ATTTCCAACA CCTGGCCGCA
12061
GTGGAGGCTG ATTCTTGCCG CTTCCTTAGC TCACGACTCG CGATGCTGAA AAACCTTGCC
12121
GTTGGCAATG TGAGCCTGGA GTACAACACT ACTTTGGACC GCGTTGAGCT CATCTTTCCC
12181
ACACCAGGTA CGAGGCCCAA GTTGACCGAT TTTAGGCAAT GGCTTATCAG CGTGCACGCT
12241
TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT
12301
CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA
12361
CTATCAATTA CACTATATGT AAGCCATGCC CTACCAGTCA AGCTGCCCAA CAAAGACTCG
12421
AGCCTGGCCG TAACGTGTGG TGCAAAATAG GGCACGACAG GTGTGAGGAA CGTGACCATG
12481
ATGAGTTGTC AATGTCCATT CCGTCCGGGT ACGACAACCT CAAACTTGAG GGTTATTATG
12541
CTTGGCTGGC TTTTTTGTCC TTTTCCTACG CGGCCCAATT CCATCCGGAG CTGTTCGGAA
12601
TAGGAAACGT GTCGCGCGTC TTTGTGGATA AGCGACACCA GTTCATTTGC GCCGAGCATG
12661
ATGGACAAAA TTCAACCATA TCTGCCAGAC ACAACATCTC CGCGTCGTAT GCGGTGTATT
12721
ACCATCATCA AATAGACGGG GGCAATTGGT TTCATTTGGA ATGGCTGCGA CCATTCTTTT
12781
CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT
12841
CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT
12901
TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT
12961
CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAACGGC
13021
TAATGTGACC GATGAATCGT ATTTGTACAA CGCGGACTTG CTGATGCTTT CCGCGTGCCT
13081
TTTCTACGCC TCGGAAATGA GCGAGAAAGG CTTCAAAGTC ATCTTTGGGA ATATTTCTGG
13141
CGTTGTTTCC GCTTGTGTTA ATTTCACAGA TTATGTGGCC CATGTGACCC AACACACTCA
13201
GCAGCACCAT TTGGTAATTG ATCACATTCG GTTACTACAC TTCTTGACAC CGTCTACGAT
13261
GAGGTGGGCT ACAACCATTG CTTGTTTGTT TGCCATTCTT TTGGCGGTAT GAAATGTTCT
5
10
15
20
25
30
35
40
13321
TGCAAGTTGG GGCATTTCTT GACTCCTCAC TCTTGCTTCT GGTGGCTTTT TTTGCTGTGT
13381
ACCGGCTTGT CTTGGTCCTT TGTCGATGGC AACGACAACA GCTCGACATC CCAATACATA
13441
TATAATTTGA CGATATGCGA GCTGAATGGG ACCGAATGGT TGTCCGGTCA TTTTGATTGG
13501
GCAGTCGAAA CCTTTGTGCT TTACCCAGTT GCCACTCATA TCATTTCACT GGGTTTTCTC
13561
ACAACAAGCC ATTTCCTTGA TGCGCTCGGT CTCGGCGCTG TGTCCGCCAC AGGATTCATT
13621
GGCGAGCGGT ATGTACTTAG CAGCATGTAC GGCGTTTGCG CCTTCGCGGC GCTCGTATGT
13681
TTTGTCATCC GTGCTGCTAA AAATTGCATG GCTTGCCGCT ATGCCCGCAC CCGGTTTACC
13741
AACTTCATCG TGGACGACCG GGGAAGAATC CATCGATGGA AGTCTTCAAT AGTGGTGGAG
13801
AAATTGGGCA AAGCTGAAGT CGGTGGTGAC CTTGTCAACA TTAAGCATGT TGTCCTCGAA
13861
GGGGTTAAAG CTCAACCCTT GACGAGGACT TCGGCTGAGC AATGGGAAGC CTAGACGACT
13921
TTTGCAACGA TCCCACCGCC GCACAAAAAC TCGTGCTGGC CTTTAGCATC ACATATACAC
13981
CCATAATGAT ATACGCCCTT AAGGTGTCAC GCGGCCGACT CCTGGGGCTG TTGCACATCT
14041
TGATATTTCT GAATTGTTCC TTTACTTTTG GGTACATGAC ATATGTGCAT TTTCAATCCA
14101
CCAACCGTGT CGCACTCACT CTGGGGGCTG TAGTCGCCCT TTTGTGGGGT GTTTACAGCC
14161
TCACAGAGTC ATGGAAGTTC ATCACTTCCA GATGCAGATT GTGTTGCCTA GGCCGGCGAT
14221
ACATTCTGGC CCCTGCCCAT CACGTAGAAA GTGCTGCAGG CCTCCATTCA ATCCCAGCGT
14281
CTGGTAACCG AGCATACGCT GTGAGAAAGC CCGGACTAAC ATCAGTGAAC GGCACTCTAG
14341
TACCTGGGCT TCGGAGCCTC GTGCTGGGCG GCAAACGAGC TGTTAAACGA GGAGTGGTTA
14401
ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAAGAACCAG AGCCAGAAGA AAAGAAGAAA TGCAGCTCCG
14461
ATGGGGAAAG GCCAGCCAGT CAATCAACTG TGCCAGTTGC TGGGTACAAT GATAAAGTCC
14521
CAGCGCCAGC AATCTAGGGG AGGACAGGCC AAAAAGAAGA AGCCTGAGAA GCCACATTTT
14581
CCCCTAGCTG CTGAAGATGA CATTCGGCAC CATCTCACCC AGGCCGAACG TTCCCTCTGC
14641
TTGCAATCGA TCCAGACGGC TTTCAATCAA GGCGCAGGAA CTGCGTCGCT TTCATCCAGC
14701
GGGAAGGTCA GTTTCCAGGT TGAGTTCATG CTGCCGGTTG CTCATACAGT GCGCCTGATT
14761
CGCGTGACTT CTACATCCGC CAGTCAGGGT GCAAATTAAT TTGACAGTCA GGTGAATGGC
14821
CGCGATTGAC GTGTGGCCTC TAA
SEQ ID NO:11 ORF 1a DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 178...7227
MSGMFSRCMCTPAARVFWNAGQVYCTRCLSARSLLSPELQDTDLGAVGLFHKPKDKLHWKVPIGIPQVECSPSGCC
WLSTIFPLARMTSGNHNFLQRLVKVADVLYRDGCLTPRHLRELQVYERGCNWYPITGPVPGMAVYANSMHVSDQPF
PGATHVLTNSPLPQRACRQPFCPFEEAHSSIYRWEKFVIFMDSSSDGRSRMMWTPESDDSTALEVLPPELEHQVKVL
VRSFPAHHLVDLADWELTESPENGFSFSTSHPCGYLVRDPAVSEGKCWLSCFLSQSAEVLSREAHLATAYGYQTKW
GVPGKYIQRRLQVHGLRAVVDPDGPIHVEALSCPQSWIRHLTLNDDVTPGFVRLMSLRIVPNTEPTTHRIFRFGVHKW
YGAAGKRARGKRAAKSEKDSASTLKVARPTSTSGIVTYSPPADGSCGWHALAAILNRMINNDFTSPLPRYNRPEDDW
ASDGDLAQAIQCLQLPAAIARNRACPNAKYLVKLNGVHWEVEVRPGMAPRSLSRECVVGVCSEGCVASPYPEDGLP
KRALEALASAYRLPSDCVCDGIIDFLANPPPQEFWTLDKMLTSPSPEQSGFSSLYKLLLEVLPQKCGSTEGEFIYTVER
MLKDCPSSKQAMALLAKIKVPSSKAPSVTLNECFPTDVPVNSELISWEEPKDPGAAVVLCPSDAKESKETAPEEAQAR
NRKVLHPVVLTEELSEQQVQVVEGDQDMPLDLTWPTLTATATPVRGPVPDNLSSGIGAQPATVQELILARPAPRLVER
CGTESNGSSSFLDLPDVQTSDQPLDLSLAAWPVRATASDPGWIHGRREPVFVKPRGVFSDGESALQFGELSEASSV
VDDRTKEAPVVDAPIDLTTSNETLSGSDPFEFAKFRRPRFSAQALIDRGGPLADVHAKIKSRVYEQCLQACEPGSRAT
PATKKWLDKMWDRVDMKTWRCTSQFQAGHILESLKFLPDMIQDTPPPVPRKNRAGDSAGLKQLVAQWDRKLSVTP
PTKPVGPVLDQTVPLPMDIQQEDAISADKPPHSQNPSSQVDVGGGWKSFMLSGTRFAGSVSQRLTTWVFEVLSHLP
AFMLTLFSPRGSMAPGDWLFAGAVLLALLLCRSYPILGCLPLLGVFSGSVRCVRLGVFGSWMAFAVFLFSTPPDPVG
SSCDHDSPECHAELLALEQRQLWEPVRSLVVGPSGLLCVILGKLLGGSRCLWFVLLRICMLADLAISLIYVVSQGRCHK
CWGKCIRTAPAEVTLNVFPFSRATRSSLVSLCDRFQAPKGVDPVHLATGWRGCWCGESPIHQSHQKPIAYANLDEKK ISAQTVIAVPYDPSQAIKCLKVLQAGGAIVDQPTPEVVRVSEIPFSAPFFPKVPVNPDCRVVVDSDTFVAAVRCGYSTA QLVLGRGNFAKLNQTPLRNSVPTKTTGGASYTLAVAQVSVWTLVHFILGLWLTSPQVCGRGTSDPWCSNPFSYPTY GPGVVCSSRLCVSADGVTLPLFSAVAHLSGREVGIFILVLASLGALAHRLALKADMSMVFLAFCAYAWPMSSWLICFF 5 PMLLRWVTLHPLTMLWVHSFLVFCLPAAGVLSLGITGLLWAVGRFTQVAGIITPYDIHQYTSGPRGAAAVATAPEGTY MAAVRRAALTGRTLIFTPSAVGSLLEGAFRTQKPCLNTVNVVGSSLGSGGVFTIDGRRVIVTATHVLNGNTARVTGDS YNRMHTFNTNGDYAWSHADDWQGVAPMVKIAKGYRGRAYWQTSTGVEPGIMGEGFAFCFTNCGDSGSPVISEAG DLIGVHTGSNKLGSGLVTTPEGETCSIKETRLSDLSRHFAGPSVPLGDIKLSPAIIPDVTTIPSDLASLLASVPVMEGGLS TVQLLCVFFLLWRMMGHAWTPIVAVGFFLLNEILPAVLVRAVFSFALFVLAWATPWSAQVLMIRLLTAALNRNRLSLAF 10 YALGGWGLATEIGTFAGGWPELSQALSTYCFLPRFLAVTSYVPTMIGGLHALGVILWLFKYRCLHNMLVGDGSFSSAF
FLRYFAEGNLRKGVSQSCGMNNESLTAALACKLSQADLDFLSSLTNFKCFVSASNMKNAAGQYIEAAYARALRQELA SLVQVDKMKGVLAKLEAFAETATPSLDTGDVIVLLGQHPHGSILDINVGGERKTVSVQETRCLGGSKFSVCTVVSNTP VDTLTGIPLQTPTPLFENGPRHRSEDDDLKVERMKKHCVSLGFHKINGKVYCKIWDKSNGDTFYTDDSRYTQDHAFQ DRSTDYRDRDYEGVQTAPQQGFDPKSEAPVGTVVIGGITYNRHLVKGKEVLVPKPDNCLEAARLSLEQALAGMGQT 15 CDLTATEVEKLKRIISQLQGLTTEQALNC
SEQ ID NO:12 ORF 1B DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 7209...11600
TGFKLLAASGLTRCGRGGLVVTETAVKIVKYHSRTFTLGSLDLKVTSEVEVKKSTEQGHAVVANLCSGVVLMRPHPPS LVDVLLKPGLDTTPGIQPGHGAGNMGVNGSIWDFETAPTKVELELSKQIIQACEVRRGDAPNLQLPYKLYPVRGDPER 20 RKGRLVNTRFGDLPYKTPQDTKSAIHAACCLHPNGVLVSDGKSTLGTTLQHGFELYVPTVPYSVMEYLDSRPDTPFM CTKHGTSKAAAEDLQKYDLSTQGFVLPGVLRLVRRFIFSHVGKAPPLFLPSTYPAKNSMAGVNGQRFPTKDVQSIPEI DEMCARAVKENWQTVTPCTLKKQYCSKPKTRTILGTNNFIALAHRSALSGVTQAFMKKAWKSPIALGKNKFKELHCTV AGRCLEADLASCDRSTPAIVRWFVANLLYELAGCEEYLPSYVLNCCHDLVATQDGAFTKRGGLSSGDPVTSVSNTVY SLIIYAQHMVLSALKMGHEIGLKFLEEQLKFEDLLEIQPMLVYSDDLVLYAERPTFPNYHWWVEHLDLMLGFKTDPKKT 25 VITDKPSFLGCRIEAGRQLVPNRDRILAALAYHMKAQNASEYYASAAAILMDSCACIDHDPEWYEDLICGIARCARQDG YRFPGPAFFMSMWEKLKSHNEGKKCRHCGICDAKADYASACGLDLCLFHSHFHQHCPVTLSCGHHAGSKECSQCQ SPVGAGKSPLDAVLKQIPYKPPRTIIMKVDNKTTTLDPGRYQSRRGLVAVKRGIAGNEVDLSDGDYQVVPLLPTCKDIN MVKVACNVLLSKFIVGPPGSGKTTWLLNQVQDDDVIYTPTHQTMFDIVSALKVCRYSIPGASGLPFPPPARSGPWVRL IASGHVPGRVSYLDEAGYCNHLDILRLLSKTPLVCLGDLQQLHPVGFDSYCYVFDQMPQKQLTTIYRFGPNICAAIQPC 30 YREKLESKARNTRVVFTTRPVAFGQVLTPYHKDRTGSAITIDSSQGATFDIVTLHLPSPKSLNKSRALVAITRARHGLFI YDPHDQLQEFFNLTPERTDCNLAFSRGDELVVLNVDNAVTTVAKALETGSPRFRVSDPRCKSLLAACSASLEGSCMP LPQVAHNLGFYFSPDSPAFAPLPKELAPHWPVVTHQNNRAWPDRLVASMRPIDARYSKPMVGAGYVVGPSIFLGTP GVVSYYLTLYIGGEPQALPETLVSTGRIATDCREYLDAAEEEAARELPHAFIGDVKGTTVGGCHHITSKYLPRSLPKDS VAVVGVSSPGRAAKAVCTLTDVYLPELRPYLQPETASKCWKLKLDFRDVRLMVWKGATAYFQLEGLTWSALPDYAR 35 FIQLPKDAVVYIDPCIGPATANRKVVRTTDWRADLAVTPYDYGAQVILTTAWFEDLGPQWKILGLQPFRRTFGFENTE DWAILARRMNDGKDYTDYNWHCVRERPHAIYGRARDHTYHFALGTELQVELGRPRLPPEQVP
SEQ ID NO:13 ORF 2 DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 11611...12360
MQWVHCGVKSVSCSWMPSLSSLLVWLTLSSFSPYCLGSLLQAGYWSSFSEWFAPRFSVRALPFTLPNYRRSYEGLL 40 PNCRPDVPQFAVKHPLGILWHMRVSHLIDEMVSRRIYRTMEHSGQAAWKQVVSEATLTKLSRLDVVTHFQHLAAVEA DSCRFLSSRLAMLKNLAVGNVSLEYNTTLDRVELIFPTPGTRPKLTDFRQWLISVHASIFSSVASSVTLFTVLWLRIPAL RYVFGFHWPTATHHSN
SEQ ID NO:14 ORF 3 DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 12219...13016
45 MAYQRARFHLLLCGFVCYLVHSALASNSSSTLCFWFPLAHGNTSFELTINYTICKPCPTSQAAQQRLEPGRNVWCKIG HDRCEERDHDELSMSIPSGYDNLKLEGYYAWLAFLSFSYAAQFHPELFGIGNVSRVFVDKRHQFICAEHDGQNSTISA RHNISASYAVYYHHQIDGGNWFHLEWLRPFFSSWLVLNISWFLRRSPASPASRRIYQILRPTRPRLPVSWSFRTSIVS NLTGPQQRKVPLPSGGRPNVVKPSAFPSTSR
SEQ ID NO:15 ORF 4 DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ 50 ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 12761...13312
MAATILFLLAGAQHLMVSEAFACKPCFSTHLSDIKTNTTAAAGFMVLQNINCFQSHRASTAQGTTPLRRSSQCREAVGI
PQYITITANVTDESYLYNADLLMLSACLFYASEMSEKGFKVIFGNISGVVSACVNFTDYVAHVTQHTQQHHLVIDHIRLL
HFLTPSTMRWATTIACLFAILLAV
SEQ ID NO:16 ORF 5 DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ 55 ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 13309...13914
MKCSCKLGHFLTPHSCFWWLFLLCTGLSWSFVDGNDNSSTSQYIYNLTICELNGTEWLSGHFDWAVETFVLYPVATH
IISLGFLTTSHFLDALGLGAVSATGFIGERYVLSSMYGVCAFAALVCFVIRAAKNCMACRYARTRFTNFIVDDRGRIHR
WKSSIVVEKLGKAEVGGDLVNIKHVVLEGVKAQPLTRTSAEQWEA
5
10
15
20
25
30
35
SEQ ID NO:17 ORF 6 DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 13902...14423
MGSLDDFCNDPTAAQKLVLAFSITYTPIMIYALKVSRGRLLGLLHILIFLNCSFTFGYMTYVHFQSTNRVALTLGAVVALL
WGVYSLTESWKFITSRCRLCCLGRRYILAPAHHVESAAGLHSIPASGNRAYAVRKPGLTSVNGTLVPGLRSLVLGGKR
AVKRGVVNLVKYGR
SEQ ID NO:18 ORF 7 DE LA CEPA DEL PRRSV PARENTAL 94881 CODIFICADO POR LA SECUENCIA DE SEQ ID NO:10 ENTRE LOS NUCLEOTIDOS 14413...14799
MAGKNQSQKKRRNAAPMGKGQPVNQLCQLLGTMIKSQRQQSRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQAERSL
CLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGKVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAN
SEQ ID NO:19 Nucleotido que codifica ORF1A del PRRSV atenuado 94881
178
ATG
181
TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGGTATTTTG GAACGCCGGC
241
CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC
301
ACGGACCTCG GTGCAGTTGG CTTGTTTCAC AAGCCTAAAG ACAAGCTCCA TTGGAAAGTT
361
CCCATTGGTA TCCCCCAGGT GGAATGTTCT CCATCTGGGT GTTGCTGGCT GTCAACCATT
421
TTTCCTTTAG CGCGCATGAC CTCCGGCAAT CACAACTTCC TTCAACGACT CGTGAAGGTT
481
GCTGATGTAT TGTACCGTGA CGGTTGCTTA ACCCCTAGAC ACCTCCGTGA ACTCCAAGTT
541
TACGAGCGTG GTTGCAATTG GTATCCGATT ACGGGGCCTG TGCCTGGGAT GGCTGTGTAC
601
GCGAACTCCA TGCACGTGTC CGACCAACCG TTCCCTGGTG CCACTCATGT GTTAACAAAT
661
TCCCCTTTGC CTCAACGGGC TTGTCGGCAG CCGTTCTGTC CGTTCGAAGA GGCCCATTCT
721
AGCATATACA GGTGGGAAAA ATTTGTAATT TTTATGGATT CCTCCTCCGA CGGTCGATCT
781
CGCATGATGT GGACTCCGGA ATCCGATGAC TCCACGGCTT TGGAAGTTCT GCCGCCCGAG
841
CTAGAACACC AGGTCAAGGT CCTTGTTCGG AGCTTTCCCG CCCATCACCT TGTCGACCTT
901
GCCGATTGGG AGCTCACTGA GTCCCCTGAT AACGGTTTTT CCTTCAGCAC GTCACATCCT
961
TGCGGCTACC TTGTTCGGGA CCCGGCTGTA TCCGAAGGCA AGTGTTGGCT TTCCTGCTTT
1021
TTGAGCCAGT CAGCCGAAGT GCTCAGTCGC GAGGCGCATC TGGCTACCGC CTATGGTTAC
1081
CAAACCAAGT GGGGTGTGCC TGGCAAGTAC ATCCAGCGCA GACTTCAAGT TCACGGTCTC
1141
CGTGCTGTGG TCGACCCTGA TGGTCCCATT CACGTTGAAG CATTGTCTTG CCCCCAGTCT
1201
TGGATCAGGC ACTTGACCCT GAATGATGAT GTCACCCCGG GATTCGTTCG CCTAATGTCT
1261
CTTCGCATTG TGCCGAACAC AGAGCCTACC ACACACCGGA TCTTTCGTTT TGGAGTGCAC
1321
AAGTGGTATG GTGCCGCCGG CAAACGGGCC CGTGGCAAGC GTGCCGCCAA AAGTGAGAAA
1381
GACTCGGCTT CCACCCTCAA GGTTGCCCGA CCGACTTCCA CCAGTGGAAT CGTCACCTAC
1441
TCCCCACCTG CGGACGGGTC TTGTGGTTGG CATGCCCTTG CCGCCATACT GAACCGGATG
1501
ATTAATAATG ACTTCACGTC CCCTCTGCCT CGGTACAACA GGCCGGAGGA CGATTGGGCT
1561
TCTGATGGTG ACCTTGCTCA GGCCATTCAA TGTTTGCAAC TACCTGCCGC CATAGCTCGG
1621
AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC ATAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA
1681
GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AGTGCGTTGT TGGCGTCTGC
1741
TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG
1801
GCCCTGGCGT CTGCTTATAG ACTGCCTTCA GACTGTGTTT GTGATGGTAT TATTGACTTC
5
10
15
20
25
30
35
1861
CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AAATGTTGAC TTCCCCGTCA
1921
CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGTCTGTAT AAATTGTTGT TAGAGATCTT GCCGCAGAAA
1981
TGCGGATCCA CAGAAGGGGA ATTCATCTAT ACTGTTGAGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG
2041
AGCTCCAAAC AGGCCATGGC CCTCCTTGCA AAAATTAAGG TCCCATCCTC AAAGGCCCCA
2101
TCCGTGACTC TGAACGAGTG CTTCCCCACG GATGTTCCAG TCAACTCTGA GTTAATATCT
2161
TGGGAAGAGC CCAAAGACCC TGGCGCTGCT GTTGTCCTAT GTCCATCGGA TGCAAAAGAA
2221
TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA AGAAGCTCAA GCGAGAAACC GTAAGGTCCT TCACCCTGTG
2281
GTCCTTACCG AGGAACTTAG CGAGCAACAG GTGCAGGTGG TTGAGGGTGA TCAGGATATG
2341
CCACTGGATT TGACTTGGCC AACCTTAACC GCTACGGCGA CCCCTGTTAG AGGGCCGGTA
2401
CCGGACAATT TGAGCTCTGG CATTGGTGCC CAGCCCGCTA CCGTTCAAGA ACTCATTCTG
2461
GCGAGGCCTG CACCCCGTCT TGTTGAGCGC TGTGGCACGG AGTCGAACGG CAGCAGTTCA
2521
TTTCTGGATT TGCCTGACGT GCAGACCTCG GACCAGCCTT TAGACCTGTC CCTGGCCGCG
2581
TGGCCTGTAA GGGCTACCGC GTCTGACCCC GGTTGGATCC ACGGTAGGCG TGAGCCTGTC
2641
TTTGTGAAGC CTCGAGGTGT TTTCTCTGAT GGCGAGTCGG CCCTTCAGTT CGGAGAGCTT
2701
TCCGAAGCCA GTTCTGTCGT CGATGACCGG ACAAAAGAAG CTCCGGTGGT TGACGCCCCC
2761
ATCGATTTGA CAACTTCGAA CGAGACGCTC TCTGGGTCTG ACCCCTTTGA ATTCGCCAAA
2821
TTCAGGCGCC CGCGTTTCTC CGCGCAAGCT TTAATCGACC GAGGTGGTCC GCTTGCCGAT
2881
GTTCATGCAA AGATAAAGAG TCGGGTATAT GAACAATGCC TTCAAGCTTG TGAACCTGGT
2941
AGTCGTGCGA CCCCAGCCAC CAAGAAGTGG CTCGACAAAA TGTGGGACAG GGTGGACATG
3001
AAAACTTGGC GCTGCACCTC GCAGTTCCAA GCTGGTCACA TTCTTGAGTC CCTCAAATTC
3061
CTCCCTGACA TGATTCAAGA CACACCGCCT CCTGTTCCCA GGAAGAACCG AGCTGGTGAC
3121
AGTGCCGGCC TGAAGCAACT GGTGGCGCAG TGGGATAGGA AATCGAGTGT GACACCCCCC
3181
ACAAAACCGG TTGGACCGGT GCTTGACCAG GCCGTCCCTC TGCCTATGGA CATCCAGCAA
3241
GGAGATGCCA TCTCCGCTGA CAAGCCACCC CATTCGCAAA ACCCTTCTAG TCAAGTAGAT
3301
GTGGGTGGAG GTTGGAAAAG TTTTATGCTC TCCGGCACCC GTTTCGCGGG GTCCGTTAGT
3361
CAGCGCCTTA CGACATGGGT TTTTGAGGTT CTCTCCCATC TCCCAGCTTT TATGCTCACA
3421
CTTTTCTCGC CACGGGGCTC TATGGCTCCA GGTGATTGGC TGTTTGCAGG TGCTGTTCTA
3481
CTTGCTCTCC TGCTCTGCCG TTCTTACCCA ATACTCGGAT GCCTTCCCTT ATTGGGTGTC
3541
TTTTCTGGTT CTGTGCGGTG TGTTCGTTTG GGTGTTTTTG GTTCTTGGAT GGCTTTTGCT
3601
GTATTTTTAT TCTCGACTCC ACCCGACCCA GTCGGTTCTT CTTGTGACCA CGATTCGCCG
3661
GAGTGTCATG CTGAGCTTTT GGCTCTTGAG CAGCGCCAAC TTTGGGAACC TGTGCGCAGC
3721
CTTGTGGTCG GGCCATCGGG CCTCTTATGC GTCATTCTTG GCAAGTTACT CGGTGGGTCA
3781
CGTTGTCTCT GGTTTGTTCT CCTACGTATA TGCATGCTCG CAGATTTGGC AATTTCTCTT
3841
ATTTATGTGG TGTCCCAAGG GCGTTGTCAC AAGTGTTGGG GAAAGTGTAT AAGGACGGCT
3901
CCTGCAGAAG TGGCCCTTAA TGTGTTTCCT TTTTCGCGCG CCACCCGCTC ATCTCTTGTG
3961
TCCTTGTGTG ATCGGTTCCA AGCGCCAAAA GGAGTTGACC CCGTGCACTT GGCGACAGGC
4021
TGGCGCGGGT GCTGGTGTGG TGAGAGCCCT ATTCATCAAT CACACCAAAA ACCGATAGCT
5
10
15
20
25
30
35
4081
TATGCCAACT TGGATGAAAA GAAGATATCC GCCCAGACGG TGATTGCTGT CCCGTATGAT
4141
CCTAGTCAGG CCATTAAATG CCTGAAAGTT TTGCAGGCAG GAGGGGCTAT TGTGGACCAG
4201
CCTACGCCCG AGGTCGTCCG TGTGTCTGAG ATTCCCTTCT CGGCCCCATT TTTTCCGAAG
4261
GTCCCAGTCA ACCCAGACTG CAGGGTTGTG GTAGATTCGG ACACTTTTGT GGCTGCGGTC
4321
CGCTGCGGTT ATTCGACAGC ACAACTGGTC CTTGGTCGGG GCAACTTTGC CAAGCTAAAT
4381
CAGACCCCCC TCAGGAACTC TGTCCCCACC AAAACAACTG GTGGGGCCTC ATACACCCTT
4441
GCCGTGGCCC AGGTATCTGT GTGGACTCTT GTTCATTTCA TCCTCGGCCT TTGGTTAACG
4501
TCACCTCAAG TGTGTGGTCG AGGGACCTCT GACCCGTGGT GTTCGAACCC TTTTTCGTAT
4561
CCTACTTATG GCCCCGGAGT TGTGTGTTCC TCTCGACTCT GCGTGTCTGC CGACGGAGTT
4621
ACCCTGCCAT TGTTCTCAGC CGTTGCCCAT CTTTCCGGTA GAGAGGTGGG GATTTTTATT
4681
TTGGTGCTTG CCTCCTTGGG CGCTTTAGCC CACCGCTTGG CTCTTAAGGC AGACATGTCA
4741
ATGGTCTTTT TGGCGTTTTG TGCTTACGCC TGGCCCATGA GCTCCTGGTT AATTTGCTTC
4801
TTTCCTATGC TCTTGAGGTG GGTAACCCTT CATCCTCTCA CTATGCTTTG GGTGCACTCA
4861
TTTTTGGTGT TTTGCCTACC AGCTGCCGGC GTTCTCTCGC TGGGAATAAC CGGTCTTCTT
4921
TGGGCAGTTG GCCGTTTCAC CCAGGTTGCC GGAATTATCA CACCTTATGA CATCCACCAG
4981
TATACCTCCG GACCACGTGG TGCAGCTGCT GTAGCAACGG CTCCAGAAGG TACTTACATG
5041
GCGGCCGTTC GGAGAGCCGC TTTGACTGGA CGGACTTTGA TCTTCACACC ATCTGCAGTC
5101
GGATCCCTTC TTGAAGGTGC TTTCAGAACT CAAAAGCCCT GCCTTAACAC CGTGAATGTC
5161
GTAGGCTCTT CCCTTGGTTC TGGAGGAGTT TTCACCATTG ATGGCAGAAG AGTCATCGTC
5221
ACTGCCACCC ATGTGTTGAA TGGTAACACA GCCAGGGTCA CTGGTGATTC CTACAACCGC
5281
ATGCACACGT TCAATACTAA TGGTGATTAT GCCTGGTCCC ATGCTGATGA CTGGCAAGGC
5341
GTTGCCCCTA TGGTTAAGAT CGCTAAGGGG TATCGCGGTC GTGCCTACTG GCAAACGTCA
5401
ACCGGAGTCG AACCTGGCAT CATGGGGGAA GGATTCGCCT TCTGTTTCAC TAACTGTGGC
5461
GACTCAGGGT CACCTGTCAT TTCAGAAGCT GGTGACCTTA TTGGAGTCCA TACCGGTTCA
5521
AACAAACTCG GTTCTGGTCT TGTGACAACC CCTGAAGGGG AGACCTGCTC CATCAAGGAA
5581
ACTAGGCTCT CTGACCTTTC TAGACATTTT GCAGGTCCAA GCGTCCCTCT TGGGGACATT
5641
AAGTTGAGCC CAGCCATCAT CCCTGATGTG ACAACTATTC CGAGTGACTT GGCATCGCTC
5701
CTTGCTTCTG TCCCCGTGAT GGAAGGTGGC CTCTCAACTG TCCAGCTTTT GTGCGTCTTT
5761
TTCCTTCTCT GGCGCATGAT GGGCCATGCC TGGACACCCA TTGTTGCCGT AGGCTTCTTT
5821
TTGCTGAATG AAATTCTCCC AGCAGTCTTG GTCCGAGCTG TGTTCTCTTT TGCACTCTTT
5881
GTACTTGCAT GGGCCACCCC CTGGTCGGCA CAAGTGTTGA TGATTAGACT CCTCACGGCG
5941
GCTCTCAACC GCAACAGGTT GTCCCTGGCG TTCTACGCAT TCGGAGGTGT CGTTGGCCTG
6001
GCCACAGAAA TCGGGACTTT TGCTGGTGGA TGGCCTGAAC TGTCCCAAGC CCTCTCGACA
6061
TACTGCTTCC TGCCCAGGTT CCTTGCTGTG ACTAGTTATG TCCCCACCAT CATCATCGGT
6121
GGGCTCCATG CCCTCGGCGT AATTTTGTGG TTATTCAAAT ACCGATGCCT CCACAACATG
6181
CTGGTTGGTG ATGGGAGTTT CTCAAGCGCT TTCTTCCTAC GGTATTTTGC TGAGGGTAAT
6241
CTTAGGAAAG GCGTGTCGCA GTCCTGTGGC ATGAATAACG AATCCCTGAC AGCTGCTTTG
5
10
15
20
25
30
35
6301
GCTTGCAAGT TGTCGCAAGC TGACCTTGAT TTTTTGTCCA GTTTAACGAA CTTCAAGTGC
6361
TTTGTGTCCG CTTCAAACAT GAAAAATGCA GCTGGCCAAT ACATCGAGGC GGCGTATGCT
6421
AGAGCTCTGC GTCAGGAGCT GGCCTCCTTG GTTCAGGTTG ACAAGATGAA AGGAGTATTG
6481
GCCAAGCTCG AGGCTTTCGC TGAGACGGCC ACTCCGTCAC TTGACACAGG GGACGTGATT
6541
GTTCTGCTTG GGCAACACCC CCATGGATCC ATCCTCGACA TTAATGTGGG GGGTGAAAGG
6601
AAAACTGTGT CTGTGCAAGA AACACGATGC CTGGGTGGTT CCAAATTCAG TGTCTGCACT
6661
GTCGTGTCCA ACACGCCCGT GGATACCTTG ACCGGTATCC CACTTCAGAC GCCAACCCCA
6721
CTTTTTGAAA ATGGCCCGCG CCATCGCAGC GAGGACGACG ACCTCAAAGT TGAGAGAATG
6781
AAAAAACACT GTGTATCCCT CGGCTTCCAC AAAATCAATG GTAAAGTTTA CTGCAAAATT
6841
TGGGACAAGT CTAACGGCGA CACCTTTTAC ACGGATGATT CCCGATACAC TCAAGACCAT
6901
GCTTTTCAGG ACAGGTCAAC CGACTATAGA GACAGGGATT ATGAAGGTGT ACAGACCGCC
6961
CCCCAACAGG GATTCGATCC AAAGTCCGAA GCCCCTGTTG GCACTGTTGT AATCGGTGGC
7021
ATTACGTATA ACAGGCATCT GGTCAAAGGT AAGGAGGTCC TAGTTCCCAA ACCTGACAAC
7081
TGCCTTGAAG CTGCCAGACT GTCCCTTGAG CAAGCTCTTG CTGGGATGGG CCAAACTTGT
7141
GACCTTACAG CTACCGAAGT GGAGAAACTA AAGCGCATCA TTAGTCAACT CCAAGGTCTG
7201
ACCACTGAAC AGGCTTTAAA CTGCTAG
SEQ ID NO:20 Nucleotido que codifica ORF1B del PRRSV atenuado 94881
7209 AC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GACCCGCTGT GGCCGCGGCG
7261
GCCTAGTTGT AACTGAAACG GCGGTAAAAA TCGTAAAATA CCACAGCAGA ACTTTCACCT
7321
TAGGCTCTTT AGACCTAAAA GTCACCTCCG AGGTGGAGGT GAAGAAATCA ACTGAGCAGG
7381
GGCACGCTGT CGTGGCGAAC TTATGTTCCG GTGTCGTCTT GATGAGGCCT CACCCACCGT
7441
CCCTTGTTGA CGTTCTCCTC AAACCCGGAC TTGACACAAC ACCCGGCATT CAACCAGGGC
7501
ATGGGGCCGG GAATATGGGC GTGAACGGTT CTATTTGGGA TTTTGAAACT GCACCCACAA
7561
AGGTAGAACT AGAGTTGTCC AAGCAAATAA TCCAAGCATG TGAAGTCAGG CGCGGGGACG
7621
CCCCTAACCT CCAACTCCCC TACAAGCTTT ATCCTGTCAG GGGGGACCCC GAGCGGCGTA
7681
AAGGTCGCCT TGTCAACACT AGGTTTGGAG ATTTACCTTA CAAAACTCCC CAAGACACCA
7741
AGTCCGCAAT TCATGCGGCT TGTTGCCTGC ATCCCAATGG GGTCCTCGTG TCTGATGGCA
7801
AATCCACGCT GGGTACCACT CTTCAACATG GTTTCGAGCT TTATGTCCCC ACTGTACCTT
7861
ATAGTGTCAT GGAATACCTT GATTCACGCC CTGACACCCC TTTTATGTGT ACTAAACATG
7921
GCACTTCCAA GGCTGCTGCA GAGGACCTCC AAAAATATGA CCTATCCACT CAAGGGTTTG
7981
TCTTGCCTGG GGTCCTACGC CTAGTGCGCA GGTTCATCTT TAGCCATGTT GGTAAGGCGC
8041
CACCACTGTT CCTTCCATCA ACCTACCCTG CCAAGAACTC CATGGCAGGG GTCAATGGCC
8101
AGAGGTTCCC AACAAAGGAT GTCCAGAGCA TACCTGAAAT TGATGAAATG TGCGCCCGTG
8161
CCGTCAAGGA AAATTGGCAG ACTGTGACAC CTTGCACCCT CAAAAAACAG TACTGTTCCA
8221
AACCTAAAAC TAGAACCATC CTAGGTACCA ACAACTTCAT AGCCTTGGCT CACAGGTCAG
8281
CACTCAGTGG TGTCACCCAG GCGTTCATGA AGAAGGCCTG GAAGTCCCCA ATTGCCTTGG
8341
GGAAAAACAA GTTTAAGGAA TTGCATTGCA CTGTCGCCGG CAGATGCCTT GAGGCTGACC
5
10
15
20
25
30
35
8401
TGGCTTCCTG CGATCGCAGC ACCCCCGCCA TTGTGAGGTG GTTTGTTGCC AACCTCCTGT
8461
ATGAACTTGC AGGATGTGAA GAGTACTTGC CTAGCTACGT GCTCAACTGT TGCCATGACC
8521
TTGTGGCAAC GCAGGATGGC GCTTTCACAA AACGCGGTGG CCTGTCGTCC GGGGACCCCG
8581
TCACCAGTGT GTCCAACACC GTCTACTCAC TGATAATTTA CGCCCAGCAC ATGGTGCTTT
8641
CGGCCTTGAA GATGGGTCAT GAAATTGGTC TCAAGTTCCT TGAGGAACAG CTCAAATTTG
8701
AGGACCTTCT TGAAATCCAG CCCATGTTAG TGTATTCTGA TGACCTCGTC TTGTATGCGG
8761
AAAGACCCAC TTTTCCCAAC TACCATTGGT GGGTCGAGCA TCTTGACCTG ATGTTGGGCT
8821
TTAAAACGGA CCCAAAGAAA ACTGTCATAA CTGATAAACC CAGTTTTCTC GGCTGCAGAA
8881
TTGAAGCAGG ACGGCAGTTA GTCCCCAATC GCGACCGTAT TCTGGCTGCT CTTGCATATC
8941
ATATGAAGGC GCAGAACGCC TCAGAGTATT ATGCGTCCGC TGCCGCAATT CTGATGGATT
9001
CGTGTGCTTG CATTGACCAT GACCCCGAGT GGTATGAGGA TCTTATCTGC GGCATCGCCC
9061
GGTGTGCTCG CCAGGACGGT TACCGTTTTC CAGGCCCGGC ATTTTTCATG TCCATGTGGG
9121
AGAAGCTGAA AAGTCATAAT GAAGGGAAGA AATGCCGTCA CTGCGGCATC TGCGACGCCA
9181
AAGCCGACTA TGCGTCCGCC TGTGGACTTG ATTTGTGTTT GTTCCATTCA CACTTTCATC
9241
AACACTGCCC AGTCACTCTG AGCTGTGGCC ACCATGCCGG TTCAAAGGAA TGTTCGCAGT
9301
GTCAGTCACC TGTCGGGGCT GGCAAATCCC CCCTTGACGC TGTGCTGAAA CAAATCCCGT
9361
ACAAACCTCC TCGTACCATT ATCATGAAGG TGGACAACAA AACAACGACC CTTGACCCGG
9421
GAAGATATCA GTCCCGTCGA GGTCTTGTTG CAGTCAAAAG AGGTATTGCA GGTAATGAGG
9481
TTGATCTTTC TGATGGAGAC TACCAAGTGG TGCCTCTTTT GCCGACTTGC AAAGACATAA
9541
ACATGGTGAA GGTGGCTTGC AACGTACTAC TCAGCAAGTT TATAGTAGGG CCGCCAGGTT
9601
CCGGAAAAAC CACCTGGCTA CTGAACCAAG TCCAGGACGA TGATGTCATT TACACACCTA
9661
CTCATCAGAC AATGTTTGAC ATAGTCAGTG CTCTTAAAGT TTGCAGGTAT TCCATCCCAG
9721
GAGCCTCAGG ACTCCCTTTT CCACCACCTG CCAGGTCCGG GCCGTGGGTT AGGCTCATCG
9781
CCAGCGGACA TGTCCCTGGC CGAGTGTCAT ATCTCGATGA GGCAGGATAT TGCAATCATC
9841
TAGACATTCT AAGGCTGCTT TCCAAAACAC CCCTTGTGTG TTTGGGTGAC CTTCAGCAAC
9901
TTCACCCGGT CGGCTTTGAT TCCTATTGTT ATGTGTTCGA TCAGATGCCT CAGAAGCAGC
9961
TGACCACCAT TTATAGATTT GGCCCTAACA TCTGTGCAGC CATCCAGCCT TGTTACAGGG
10021
AGAAACTTGA ATCCAAGGCC AGGAACACCA GAGTGGTTTT CACCACCCGG CCTGTGGCCT
10081
TTGGTCAGGT CCTGACACCG TACCACAAAG ATCGTACCGG CTCTGCAATA ACTATAGATT
10141
CATCCCAGGG GGCGACCTTC GACATTGTGA CATTGCATCT ACCATCGCCA AAGTCCCTAA
10201
ACAAATCCCG AGCACTTGTA GCCATCACTC GGGCAAGACA TGGGTTGTTC ATTTATGACC
10261
CTCATGACCA ACTCCAGGAG TTTTTCAACT TAACCCCCGA GCGCACTGAT TGTAACCTTG
10321
CGTTCAGCCG TGGGGATGAG CTGGTTGTTT TGAATGTGGA TAATGCGGTC ACAACTGTAG
10381
CGAAGGCCCT AGAGACAGGT TCACCCCGAT TTCGAGTATC GGACCCGAGG TGCAAGTCTC
10441
TCTTAGCCGC TTGTTCGGCC AGTCTAGAAG GGAGCTGCAT GCCACTACCA CAAGTAGCAC
10501
ATAACCTGGG GTTTTACTTT TCCCCGGACA GCCCAGCTTT TGCACCCCTG CCAAAAGAGC
10561
TGGCGCCACA TTGGCCAGTG GTCACCCACC AGAATAATCG AGCGTGGCCT GATCGACTTG
5
10
15
20
25
30
35
10621
TCGCTAGTAT GCGCCCAATT GATGCCCGCT ACAGCAAGCC AATGGTCGGT GCAGGGTATG
10681
TGGTCGGGCC ATCCATTTTT CTTGGCACTC CTGGTGTGGT GTCATACTAT CTCACATTAT
10741
ACATCGGGGG CGAGCCTCAG GCCCTGCCAG AAACACTCGT TTCAACAGGA CGTATAGCCA
10801
CAGATTGTCG GGAATATCTC GACGCGGCTG AGGAAGAGGC AGCGAGAGAA CTTCCCCACG
10861
CATTTATTGG CGATGTCAAA GGCACTACGA TCGGGGGGTG TCACCACATT ACATCGAAAT
10921
ACCTACCTAG GTCCCTGCCT AAAGACTCTG TTGCTGTGGT TGGGGTGAGT TCGCCCGGTA
10981
GGGCTGCTAA AGCCGTGTGC ACTCTCACCG ATGTGTACCT CCCCGAACTC CGACCATATT
11041
TGCAACCGGA GACGGCATCA AAATGCTGGA AACTTAAACT GGATTTCAGG GATGTTCGAC
11101
TGATGGTCTG GAAAGGCGCC ACAGCCTATT TCCAGTTGGA AGGGCTGACA TGGTCAGCGC
11161
TGCCCGATTA TGCTAGGTTC ATTCAGCTAC CCAAGGATGC CGTTGTGTAC ATCGATCCGT
11221
GTATAGGGCC GGCAACAGCC AATCGCAAGG TTGTGCGAAC CACAGACTGG CGGGCCGACC
11281
TGGCAGTGAC ACCGTATGAT TACGGTGCTC AGGTCATTTT GACAACAGCC TGGTTCGAGG
11341
ACCTTGGGCC GCAGTGGAAG ATTTTGGGGT TGCAGCCTTT CAGACGAACA TTTGGCTTTG
11401
AGAACACTGA AGATTGGGCA ATTCTCGCAC GCCGTATGAA TGACGGCAAA GATTACACTG
11461
ACTATAATTG GCATTGTGTA CGAGAACGCC CACACGCAAT TTACGGGCGC GCCCGTGACC
11521
ATACGTATCA TTTTGCCCTT GGCACTGAAC TGCAAGTAGA GCTGGGCAGA CCCCGGCTGC
11581
CTCCTGAGCA AGTGCCGTGA
SEQ ID NO:21 Nucleotido que codifica ORF2 del PRRSV atenuado 94881
11611
ATGCAATGGG TTTACTGTGG AGTAAAATCA
11641
GTCAGTTGTT CGTGGATGCC TTCACTGAGT TCCTTGTTAG TGTGGTTGAC ATTGTCATCT
11701
TTCTCGCCAT ATTGTTTGGG TTCACTGTTG CAGGCTGGTT ATTGGTCTTC CTTCTCAGAG
11761
TGGTTTGCTC CGCGTTTCTC CGTTCGCGCT CTGCCATTCA CTCTTCCGAA CTATCGAAGG
11821
TCCTATGAGG GCTTGCTACC CAACTGCAGA CCGGATGTCC CACAATTCGC AGTTAAGCAC
11881
CCGTTGGGTA TACTTTGGCA TATGCGAGTC TCCCACCTAA TTGACGAAAT GGTCTCTCGC
11941
CGCATTTACC GGACCATGGA ACATTCGGGT CAAGCGGCCT GGAAGCAGGT TGTTAGTGAA
12001
GCCACTCTCA CAAAACTGTC AAGGCTTGAC GTAGTCACTC ATTTCCAACA CCTGGCCGCA
12061
GTGGAGGCTG ATTCTTGCCG CTTCCTTAGC TCACGACTCG CGATGCTGAA AAACCTTGCC
12121
GTTGGCAATG TGAGCCTGGA GTACAACACT ACTTTGGACC GCGTTGAGCT CATCTTTCCC
12181
ACACCAGGTA CGAGGCCCAA GTTGACCGAT TTTAGGCAAT GGCTTATCAG CGTGCACGCT
12241
TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT
12301
CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA
SEQ ID NO:22 Nucleotido que codifica ORF3 del PRRSV atenuado 94881
12219 AT GGCTTATCAG CGTGCACGCT
12241 TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT 12301 CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA 12361 CTATCAATTA CACTATATGT AAGCCATGCC CTACCAGTCA AGCTGCCCAA CAAAGACTCG 12421 AGCCTGGCCG TAACGTGTGG TGCAAAATAG GGCACGACAG GTGTGAGGAA CGTGACCATG
5
10
15
20
25
30
35
12481
ATGAGTTGTC AATGTCCATT CCGTCCGGGT ACGACAACCT CAAACTTGAG GGTTATTATG
12541
CTTGGCTGGC TTTTTTGTCC TTTTCCTACG CGGCCCAATT CCATCCGGAG CTGTTCGGAA
12601
TAGGAAACGT GTCGCGCGTC TTTGTGGATA AGCGACACCA GTTCATTTGC GCCGAGCATG
12661
ATGGACAAAA TTCAACCATA TCTGCCAGAC ACAACATCTC CGCGTCGTAT GCGGTGTATT
12721
ACCATCATCA AATAGACGGG GGCAATTGGT TTCATTTGGA ATGGCTGCGA CCATTCTTTT
12781
CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT
12841
CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT
12901
TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT
12961
CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAA
SEQ ID NO:23 Nucleotido que codifica ORF4 del PRRSV atenuado 94881
12761
ATGGCTGCGA CCATTCTTTT
12781
CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT
12841
CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT
12901
TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT
12961
CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAACGGC
13021
TAATGTGACC GATGAATCGT ATTTGTACAA CGCGGACTTG CTGATGCTTT CCGCGTGCCT
13081
TTTCTACGCC TCGGAAATGA GCGAGAAAGG CTTCAAAGTC ATCTTTGGGA ATATTTCTGG
13141
CGTTGTTTCC GCTTGTGTTA ATTTCACAGA TTATGTGGCC CATGTGACCC AACACACTCA
13201
GCAGCACCAT TTGGTAATTG ATCACATTCG GTTACTACAC TTCTTGACAC CGTCTACGAT
13261
GAGGTGGGCT ACAACCATTG CTTGTTTGCT TGCCATTCTT TTGGCGGTAT GA
SEQ ID NO:24 Nucleotido que codifica ORF5 del PRRSV atenuado 94881
13309 AT GAAATGTTCT
13321
TGCAAGTTGG GGCATTTCTT GACTCCTCAC TCTTGCTTCT GGTGGCTTTT TTTGCTGTGT
13381
ACCGGCTTGT CTTGGTCCTT TGTCGATGGC AACGACGACA GCTCGACATC CCAATACATA
13441
TATAATTTGA CGATATGCGA GCTGAATGGG ACCGAATGGT TGTCCGGTCA TTTTGATTGG
13501
GCAGTCGAAA CCTTTGTGCT TTACCCAGTT GCCACTCATA TCATTTCACT GGGTTTTCTC
13561
ACAACAAGCC ATTTCCTTGA TGCGCTCGGT CTCGGCGCTG TGTCCGCCAC AGGATTCATT
13621
GGCGAGCGGT ATGTACTTAG CAGCATGTAC GGCGTTTGCG CCTTCGCGGC GTTCGTATGT
13681
TTTGTCATCC GTGCTGCTAA AAATTGCATG GCTTGCCGCT ATGCCCGCAC CCGGTTTACC
13741
AACTTCATCG TGGACGACCG GGGAAGAATC CATCGATGGA AGTCTTCAAT AGTGGTGGAG
13801
AAATTGGGCA AAGCTGAAGT CGGTGGTGAC CTTGTCAACA TTAAGCATGT TGTCCTCGAA
13861
GGGGTTAAAG CTCAACCTTT GACGAGGACT TCGGCTGAGC AATGGGAAGC CTAG
SEQ ID NO:25 Nucleotido que codifica ORF6 del PRRSV atenuado 94881
13902
ATGGGAAGC CTAGACGACT
13921
TTTGCAACGA TCCCACCGCC GCACAAAAAC TCGTGCTGGC CTTTAGCATC ACATATACAC
13981
CCATAATGAT ATACGCCCTT AAGGTGTCAC GCGGCCGACT CCTGGGGCTG TTGCACATCT
14041
TGATATTTCT GAATTGTTCC TTTACTTTTG GGTACATGAC ATATGTGCAT TTTCAATCCA
5
10
15
20
25
30
35
14101
CCAACCGTGT CGCATTCACT CTGGGGGCTG TAGTCGCCCT TTTGTGGGGT GTTTACAGCC
14161
TCACAGAGTC ATGGAAGTTC ATCACTTCCA GATGCAGATT GTGTTGCCTA GGCCGGCGAT
14221
ACATTCTGGC CCCTGCCCAT CACGTAGAAA GTGCTGCAGG CCTCCATTCA ATCCCAGCGT
14281
CTGGTAACCG AGCATACGCT GTGAGAAAGC CCGGACTAAC ATCAGTGAAC GGCACTCTAG
14341
TACCTGGGCT TCGGAGCCTC GTGCTGGGCG GCAAACGAGC TGTTAAACGA GGAGTGGTTA
14401
ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAA
SEQ ID NO:26 Nucleotido que codifica ORF7 del PRRSV atenuado 94881
14413
ATGGCCGG TAAGAACCAG AGCCAGAAGA AAAGAAGAAA TGCAGCTCCG
14461
ATGGGGAAAG GCCAGCCAGT CAATCAACTG TGCCAGTTGC TGGGTACAAT GATAAAGTCC
14521
CAGCGCCAGC AATCTAGGGG AGGACAGGCC AAAAAGAAGA AGCCTGAGAA GCCACATTTT
14581
CCCCTAGCTG CTGAAGATGA CATTCGGCAC CATCTCACCC AGGCCGAACG TTCCCTCTGC
14641
TTGCAATCGA TCCAGACGGC TTTCAATCAA GGCGCAGGAA CTGCGTCGCT TTCATCCAGC
14701
GGGAAGGTCA GTTTCCAGGT TGAGTTCATG CTGCCGGTTG CTCATACAGT GCGCCTGATT
14761
CGCGTGACTT CTACATCCGC CAGTCAGGGT GCAAATTAAT TTGACAGTCA GGTGAATGGC
14821
CGCGATTGAC GTGTGGCCTC TAA
SEQ ID NO:27 Nucleotido que codifica ORF1a del PRRSV atenuado 94881
178
ATG
181
TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGGTATTTTG GAACGCCGGC
241
CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC
301
ACGGACCTCG GTGCAGTTGG CTTGTTTCAC AAGCCTAAAG ACAAGCTCCA TTGGAAAGTT
361
CCCATTGGTA TCCCCCAGGT GGAATGTTCT CCATCTGGGT GTTGCTGGCT GTCAACCATT
421
TTTCCTTTAG CGCGCATGAC CTCCGGCAAT CACAACTTCC TTCAACGACT CGTGAAGGTT
481
GCTGACGTAT TGTACCGTGA CGGTTGCTTA ACCCCTAGAC ACCTCCGTGA ACTCCAAGTT
541
TACGAGCGTG GTTGCAATTG GTATCCGATT ACGGGGCCTG TGCCTGGGAT GGCTGTGTAC
601
GCGAACTCCA TGCACGTGTC CGACCAACCG TTCCCTGGTG CCACTCATGT GTTAACAAAT
661
TCCCCTTTGC CTCAACGGGC TTGTCGGCAG CCGTTCTGTC CGTTCGAAGA GGCCCATTCT
721
AGCATATACA GGTGGGAAAA ATTTGTAATT TTTATGGATT CCTCCTCCGA CGGTCGATCT
781
CGCATGATGT GGACTCCGGA ATCCGATGAC TCCACGGCTT TGGAAGTTCT GCCGCCCGAG
841
CTAGAACACC AGGTCAAGGT CCTTGTTCGG AGCTTTCCCG CCCATCACCT TGTCGACCTT
901
GCCGATTGGG AGCTCACTGA GTCCCCTGAG AACGGTTTTT CCTTCAGCAC GTCACATCCT
961
TGCGGCTACC TTGTTCGGGA CCCGGCTGTA TCCGAAGGCA AGTGTTGGCT TTCCTGCTTT
1021
TTGAGCCAGT CAGCCGAAGT GCTCAGTCGC GAGGCGCATC TGGCTACCGC CTATGGTTAC
1081
CAAACCAAGT GGGGTGTGCC TGGCAAGTAC ATCCAGCGCA GACTTCAAGT TCACGGTCTC
1141
CGTGCTGTGG TCGACCCTGA TGGTCCCATT CACGTTGAAG CATTGTCTTG CCCCCAGTCT
1201
TGGATCAGGC ACTTGACCCT GAATGATGAT GTCACCCCGG GATTCGTTCG CCTAATGTCT
1261
CTTCGCATTG TGCCGAACAC AGAGCCTACC ACACACCGGA TCTTTCGTTT TGGAGTGCAC
1321
AAGTGGTATG GTGCCGCCGG CAAACGGGCC CGTGGCAAGC GTGCCGCCAA AAGTGAGAAA
5
10
15
20
25
30
35
1381
GACTCGGCTT CCACCCTCAA GGTTGCCCGA CCGACTTCCA CCAGTGGAAT CGTCACCTAC
1441
TCCCCACCTG CGGACGGGTC TTGTGGTTGG CATGCCCTTG CCGCCATACT GAACCGGATG
1501
ATTAATAATG ACTTCACGTC CCCTCTGCCT CGGTACAACA GGCCGGAGGA CGATTGGGCT
1561
TCTGATGGTG ACCTTGCTCA GGCCATTCAA TGTTTGCAAC TACCTGCCGC CATAGCTCGG
1621
AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC GTAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA
1681
GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AGTGCGTTGT TGGCGTCTGC
1741
TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG
1801
GCCCTGGCGT CTGCTTATAG ACTGCCTTCA GACTGTGTTT GTGATGGTAT TATTGACTTC
1861
CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AAATGTTGAC TTCCCCGTCA
1921
CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGTCTGTAT AAATTGTTGT TAGAGGTCTT GCCGCAGAAA
1981
TGCGGATCCA CAGAAGGGGA ATTCATCTAT ACTGTTGAGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG
2041
AGCTCCAAAC AGGCCATGGC CCTCCTTGCA AAAATTAAGG TCCCATCCTC AAAGGCCCCA
2101
TCCGTGACTC TGAACGAGTG CTTCCCCACG GATGTTCCAG TCAACTCTGA GTTAATATCT
2161
TGGGAAGAGC CCAAAGACCC TGGCGCTGCT GTTGTCCTAT GTCCATCGGA TGCAAAAGAA
2221
TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA AGAAGCTCAA GCGAGAAACC GTAAGGTCCT CCACCCTGTG
2281
GTCCTTACCG AGGAACTTAG CGAGCAACAG GTGCAGGTGG TTGAGGGTGA TCAGGATATG
2341
CCACTGGATT TGACTTGGCC AACCTTAACC GCTACGGCGA CCCCTGTTAG AGGGCCGGTA
2401
CCGGACAATT TGAGCTCTGG CATTGGTGCC CAGCCCGCTA CCGTTCAAGA ACTCATTCTG
2461
GCGAGGCCTG CACCCCGTCT TGTTGAGCGC TGTGGCACGG AGTCGAACGG CAGCAGTTCA
2521
TTTCTGGATT TGCCTGACGT GCAGACCTCG GACCAGCCTT TAGACCTGTC CCTGGCCGCG
2581
TGGCCTGTAA GGGCTACCGC GTCTGACCCC GGTTGGATCC ACGGTAGGCG TGAGCCTGTC
2641
TTTGTGAAGC CTCGAGGTGT TTTCTCTGAT GGCGAGTCGG CCCTTCAGTT CGGAGAGCTT
2701
TCCGAAGCCA GTTCTGTCGT CGATGACCGG ACAAAAGAAG CTCCGGTGGT TGACGCCCCC
2761
ATCGATTTGA CAACTTCGAA CGAGACGCTC TCTGGGTCTG ACCCCTTTGA ATTCGCCAAA
2821
TTCAGGCGCC CGCGTTTCTC CGCGCAAGCT TTAATCGACC GAGGTGGTCC GCTTGCCGAT
2881
GTTCATGCAA AGATAAAGAG TCGGGTATAT GAACAATGCC TTCAAGCTTG TGAACCTGGT
2941
AGTCGTGCGA CCCCAGCCAC CAAGAAGTGG CTCGACAAAA TGTGGGACAG GGTGGACATG
3001
AAAACTTGGC GCTGCACCTC GCAGTTCCAA GCTGGTCACA TTCTTGAGTC CCTCAAATTC
3061
CTCCCTGACA TGATTCAAGA CACACCGCCT CCTGTTCCCA GGAAGAACCG AGCTGGTGAC
3121
AGTGCCGGCC TGAAGCAACT GGTGGCGCAG TGGGATAGGA AATTGAGTGT GACACCCCCC
3181
ACAAAACCGG TTGGACCGGT GCTTGACCAG ACCGTCCCTC TGCCTATGGA CATCCAGCAA
3241
GAAGATGCCA TCTCCGCTGA CAAGCCACCC CATTCGCAAA ACCCTTCTAG TCAAGTAGAT
3301
GTGGGTGGAG GTTGGAAAAG TTTTATGCTC TCCGGCACCC GTTTCGCGGG GTCCGTTAGT
3361
CAGCGCCTTA CGACATGGGT TTTTGAGGTT CTCTCCCATC TCCCAGCTTT TATGCTCACA
3421
CTTTTCTCGC CACGGGGCTC TATGGCTCCA GGTGATTGGC TGTTTGCAGG TGCTGTTCTA
3481
CTTGCTCTCC TGCTCTGCCG TTCTTACCCA ATACTCGGAT GCCTTCCCTT ATTGGGTGTC
3541
TTTTCTGGTT CTGTGCGGTG TGTTCGTTTG GGTGTTTTTG GTTCTTGGAT GGCTTTTGCT
5
10
15
20
25
30
35
3601
GTATTTTTAT TCTCGACTCC ACCCGACCCA GTCGGTTCTT CTTGTGACCA CGATTCGCCG
3661
GAGTGTCATG CTGAGCTTTT GGCTCTTGAG CAGCGCCAAC TTTGGGAACC TGTGCGCAGC
3721
CTTGTGGTCG GGCCATCGGG CCTCTTATGC GTCATTCTTG GCAAGTTACT CGGTGGGTCA
3781
CGTTGTCTCT GGTTTGTTCT CCTACGTATA TGCATGCTCG CAGATTTGGC AATTTCTCTT
3841
ATTTATGTGG TGTCCCAAGG GCGTTGTCAC AAGTGTTGGG GAAAGTGTAT AAGGACGGCT
3901
CCTGCAGAAG TGACCCTTAA TGTGTTTCCT TTTTCGCGCG CCACCCGCTC ATCTCTTGTG
3961
TCCTTGTGTG ATCGGTTCCA AGCGCCAAAA GGAGTTGACC CCGTGCACTT GGCGACAGGC
4021
TGGCGCGGGT GCTGGTGTGG TGAGAGCCCT ATTCATCAAT CACACCAAAA ACCGATAGCT
4081
TATGCCAACT TGGATGAAAA GAAGATATCC GCCCAGACGG TGATTGCTGT CCCGTATGAT
4141
CCCAGTCAGG CCATTAAATG CCTGAAAGTT TTGCAGGCAG GAGGGGCTAT TGTGGACCAG
4201
CCTACGCCCG AGGTCGTCCG TGTGTCTGAG ATTCCCTTCT CGGCCCCATT TTTTCCGAAG
4261
GTCCCAGTCA ACCCAGATTG CAGGGTTGTG GTAGATTCGG ACACTTTTGT GGCTGCGGTC
4321
CGCTGCGGTT ATTCGACAGC ACAACTGGTC CTTGGTCGGG GCAACTTTGC CAAGCTAAAT
4381
CAGACCCCCC TCAGGAACTC TGTCCCCACC AAAACAACTG GTGGGGCCTC ATACACCCTT
4441
GCCGTGGCCC AGGTATCTGT GTGGACTCTT GTTCATTTCA TCCTCGGCCT TTGGTTAACG
4501
TCACCTCAAG TGTGTGGTCG AGGGACCTCT GACCCGTGGT GTTCGAACCC TTTTTCGTAT
4561
CCTACTTATG GCCCCGGAGT TGTGTGTTCC TCTCGACTCT GCGTGTCTGC CGACGGAGTT
4621
ACCCTGCCAT TGTTCTCAGC CGTTGCCCAT CTTTCCGGTA GAGAGGTGGG GATTTTTATT
4681
TTGGTGCTTG CCTCCTTGGG CGCTTTAGCC CACCGCTTGG CTCTTAAGGC AGACATGTCA
4741
ATGGTCTTTT TGGCGTTTTG TGCTTACGCC TGGCCCATGA GCTCCTGGTT AATTTGCTTC
4801
TTTCCTATGC TCTTGAGGTG GGTAACCCTT CATCCTCTCA CTATGCTTTG GGTGCACTCA
4861
TTTTTGGTGT TTTGCCTACC AGCTGCCGGC GTTCTCTCGC TGGGAATAAC CGGTCTTCTT
4921
TGGGCAGTTG GCCGTTTCAC CCAGGTTGCC GGAATTATCA CACCTTATGA CATCCACCAG
4981
TATACCTCCG GACCACGTGG TGCAGCTGCT GTAGCAACGG CTCCAGAAGG TACTTACATG
5041
GCGGCCGTTC GGAGAGCCGC TTTGACTGGA CGGACTTTGA TCTTCACACC ATCTGCAGTC
5101
GGATCCCTTC TTGAAGGTGC TTTCAGAACT CAAAAGCCCT GCCTTAACAC CGTGAATGTC
5161
GTAGGCTCTT CCCTTGGTTC TGGAGGAGTT TTCACCATTG ATGGCAGAAG AGTCATCGTC
5221
ACTGCCACCC ATGTGTTGAA TGGTAACACA GCCAGGGTCA CTGGTGATTC CTACAACCGC
5281
ATGCACACGT TCAATACTAA TGGTGATTAT GCCTGGTCCC ATGCTGATGA CTGGCAAGGC
5341
GTTGCCCCTA TGGTTAAGAT CGCTAAGGGG TATCGCGGTC GTGCCTACTG GCAAACGTCA
5401
ACCGGAGTCG AACCTGGCAT CATGGGGGAA GGATTCGCCT TCTGTTTCAC TAACTGTGGC
5461
GACTCAGGGT CACCTGTCAT TTCAGAAGCT GGTGACCTTA TTGGAGTCCA TACCGGTTCA
5521
AACAAACTCG GTTCTGGTCT TGTGACAACC CCTGAAGGGG AGACCTGCTC CATCAAGGAA
5581
ACTAGGCTCT CTGACCTTTC TAGACATTTT GCAGGTCCAA GCGTCCCTCT TGGGGACATT
5641
AAGTTGAGCC CAGCCATCAT CCCTGATGTG ACAACTATTC CGAGTGACTT GGCATCGCTC
5701
CTTGCTTCTG TCCCCGTGAT GGAAGGTGGC CTCTCAACTG TCCAGCTTTT GTGCGTCTTT
5761
TTCCTTCTCT GGCGCATGAT GGGCCATGCC TGGACACCCA TTGTTGCCGT AGGCTTCTTT
5
10
15
20
25
30
35
5821
TTGCTGAATG AAATTCTCCC AGCAGTCTTG GTCCGAGCTG TGTTCTCTTT TGCACTCTTT
5881
GTACTTGCAT GGGCCACCCC CTGGTCGGCA CAAGTGTTGA TGATTAGACT CCTCACGGCG
5941
GCTCTCAACC GCAACAGGTT GTCCCTGGCG TTCTACGCAC TCGGAGGTGT CGTTGGCCTG
6001
GCCACAGAAA TCGGGACTTT TGCTGGTGGA TGGCCTGAAC TGTCCCAAGC CCTCTCGACA
6061
TACTGCTTCC TGCCCAGGTT CCTTGCTGTG ACTAGTTATG TCCCCACCAT CATCATCGGT
6121
GGGCTCCATG CCCTCGGCGT AATTTTGTGG TTATTCAAAT ACCGATGCCT CCACAACATG
6181
CTGGTTGGTG ATGGGAGTTT CTCAAGCGCT TTCTTCCTAC GGTATTTTGC TGAGGGTAAT
6241
CTTAGGAAAG GCGTGTCGCA GTCCTGTGGC ATGAATAACG AATCCCTGAC AGCTGCTTTG
6301
GCTTGCAAGT TGTCGCAAGC TGACCTTGAT TTTTTGTCCA GTTTAACGAA CTTCAAGTGC
6361
TTTGTGTCCG CTTCAAACAT GAAAAATGCA GCTGGCCAAT ACATCGAGGC GGCGTATGCT
6421
AGAGCTCTGC GTCAGGAGCT GGCCTCCTTG GTTCAGGTTG ACAAGATGAA AGGAGTATTG
6481
GCCAAGCTCG AGGCTTTCGC TGAGACGGCC ACTCCGTCAC TTGACACAGG TGACGTGATT
6541
GTTCTGCTTG GGCAACACCC CCATGGATCC ATCCTCGACA TTAATGTGGG GGGTGAAAGG
6601
AAAACTGTGT CTGTGCAAGA AACACGATGC CTGGGTGGTT CCAAATTCAG TGTCTGCACT
6661
GTCGTGTCCA ACACGCCCGT GGATACCTTG ACCGGCATCC CACTTCAGAC GCCAACCCCA
6721
CTTTTTGAAA ATGGCCCGCG CCATCGCAGC GAGGACGACG ACCTTAAAGT TGAGAGAATG
6781
AAAAAACACT GTGTATCCCT CGGCTTCCAC AAAATCAATG GTAAAGTTTA CTGCAAAATT
6841
TGGGACAAGT CTAACGGCGA CACCTTTTAC ACGGATGATT CCCGATACAC TCAAGACCAT
6901
GCTTTTCAGG ACAGGTCAAC CGACTATAGA GACAGGGATT ATGAAGGTGT ACAGACCGCC
6961
CCCCAACAGG GATTCGATCC AAAGTCCGAA GCCCCTGTTG GCACTGTTGT AATCGGTGGC
7021
ATTACGTATA ACAGGCATCT GGTCAAAGGT AAGGAGGTCC TAGTTCCCAA ACC TGACAAC
7081
TGCCTTGAAG CTGCCAGACT GTCCCTTGAG CAAGCTCTTG CTGGGATGGG CCAAACTTGT
7141
GACCTTACAG CTACCGAAGT GGAGAAACTA AAGCGCATCA TTAGTCAACT CCAAGGTCTG
7201
ACCACTGAAC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GACCCGCTGT GGCCGCGGCG
5EQ ID NO:28 Nucleotido que codifica ORF1b del PRRSV atenuado 94881
7209
AC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GACCCGCTGT GGCCGCGGCG
7261
GCCTAGTTGT AACTGAAACG GCGGTAAAAA TCGTAAAATA CCACAGCAGA ACTTTCACCT
7321
TAGGCTCTTT AGACCTAAAA GTCACCTCCG AGGTGGAGGT GAAGAAATCA ACTGAGCAGG
7381
GGCACGCTGT CGTGGCGAAC TTATGTTCCG GTGTCGTCTT GATGAGGCCT CACCCACCGT
7441
CCCTTGTTGA CGTTCTCCTC AAACCCGGAC TTGACACAAC ACCCGGCATT CAACCAGGGC
7501
ATGGGGCCGG GAATATGGGC GTGAACGGTT CTATTTGGGA TTTTGAAACT GCACCCACAA
7561
AGGTAGAACT AGAGTTGTCC AAGCAAATAA TCCAAGCATG TGAAGTCAGG CGCGGGGACG
7621
CCCCTAACCT CCAACTCCCC TACAAGCTTT ATCCTGTCAG GGGGGACCCC GAGCGGCGTA
7681
AAGGTCGCCT TGTCAACACT AGGTTTGGAG ATTTACCTTA CAAAACTCCC CAAGACACCA
7741
AGTCCGCAAT TCATGCGGCT TGTTGCCTGC ATCCCAATGG GGTCCTCGTG TCTGATGGTA
7801
AATCCACGCT GGGTACCACT CTTCAACATG GTTTCGAGCT TTATGTCCCC ACTGTACCTT
7861
ATAGTGTCAT GGAATACCTT GATTCACGCC CTGACACCCC TTTTATGTGT ACTAAACATG
5
10
15
20
25
30
35
7921
GCACTTCCAA GGCTGCTGCA GAGGACCTCC AAAAATATGA CCTATCCACT CAAGGGTTTG
7981
TCTTGCCTGG GGTCCTACGC CTAGTGCGCA GGTTCATCTT TAGCCATGTT GGTAAGGCGC
8041
CACCACTGTT CCTTCCATCA ACCTACCCTG CCAAGAACTC CATGGCAGGG GTCAATGGCC
8101
AGAGGTTCCC AACAAAGGAT GTCCAGAGCA TACCTGAAAT TGATGAAATG TGCGCCCGTG
8161
CCGTCAAGGA AAATTGGCAG ACTGTGACAC CTTGCACCCT CAAAAAACAG TACTGTTCCA
8221
AACCTAAAAC TAGAACCATC CTAGGTACCA ACAACTTCAT AGCCTTGGCT CACAGGTCAG
8281
CACTCAGTGG TGTCACCCAG GCGTTCATGA AGAAGGCCTG GAAGTCCCCA ATTGCCTTGG
8341
GGAAAAACAA GTTTAAGGAA TTGCATTGCA CTGTCGCCGG CAGATGCCTT GAGGCTGACC
8401
TGGCTTCCTG CGATCGCAGC ACCCCCGCCA TTGTGAGGTG GTTTGTTGCC AACCTCCTGT
8461
ATGAACTTGC AGGATGTGAA GAGTACTTGC CTAGCTACGT GCTCAACTGT TGCCATGACC
8521
TTGTGGCAAC GCAGGATGGC GCTTTCACAA AACGCGGTGG CCTGTCGTCC GGGGACCCCG
8581
TCACCAGTGT GTCCAACACC GTCTACTCAC TGATAATTTA CGCCCAGCAC ATGGTGCTTT
8641
CGGCCTTGAA GATGGGTCAT GAAATTGGTC TCAAGTTCCT TGAGGAACAG CTCAAATTTG
8701
AGGACCTTCT TGAAATCCAG CCCATGTTAG TGTATTCTGA TGACCTCGTC TTGTATGCGG
8761
AAAGACCCAC TTTTCCCAAC TACCATTGGT GGGTCGAGCA TCTTGACCTG ATGTTGGGCT
8821
TTAAAACGGA CCCAAAGAAA ACTGTCATAA CTGATAAACC CAGTTTTCTC GGCTGCAGAA
8881
TTGAAGCAGG ACGGCAGTTA GTCCCCAATC GCGACCGTAT TCTGGCTGCT CTTGCATATC
8941
ATATGAAGGC GCAGAACGCC TCAGAGTATT ATGCGTCCGC TGCCGCAATT CTGATGGATT
9001
CGTGTGCTTG CATTGACCAT GACCCCGAGT GGTATGAGGA CCTTATCTGC GGCATCGCCC
9061
GGTGTGCTCG CCAGGACGGT TACCGTTTTC CAGGCCCGGC ATTTTTCATG TCCATGTGGG
9121
AGAAGCTGAA AAGTCATAAC GAAGGGAAGA AATGCCGTCA CTGCGGCATC TGCGACGCCA
9181
AAGCCGACTA TGCGTCCGCC TGTGGACTTG ATTTGTGTTT GTTCCATTCA CACTTTCATC
9241
AACACTGCCC AGTCACTCTG AGCTGTGGCC ACCATGCCGG TTCAAAGGAA TGTTCGCAGT
9301
GTCAGTCACC TGTCGGGGCT GGCAAATCCC CCCTTGACGC TGTGCTGAAA CAAATCCCGT
9361
ACAAACCTCC TCGTACCATT ATCATGAAGG TGGACAACAA AACAACGACC CTTGACCCGG
9421
GAAGATATCA GTCCCGTCGA GGTCTTGTTG CAGTCAAAAG AGGTATTGCA GGTAATGAGG
9481
TTGATCTTTC TGATGGAGAC TACCAAGTGG TGCCTCTTTT GCCGACTTGC AAAGACATAA
9541
ACATGGTGAA GGTGGCTTGC AACGTACTAC TCAGCAAGTT TATAGTAGGG CCGCCAGGTT
9601
CCGGAAAAAC CACCTGGCTA CTGAACCAAG TCCAGGACGA TGATGTCATT TACACACCTA
9661
CTCATCAGAC AATGTTTGAC ATAGTCAGTG CTCTTAAAGT TTGCAGGTAT TCCATCCCAG
9721
GAGCCTCAGG ACTCCCTTTT CCACCACCTG CCAGGTCCGG GCCGTGGGTT AGGCTCATCG
9781
CCAGCGGACA TGTCCCTGGC CGAGTGTCAT ATCTCGATGA GGCAGGATAT TGCAATCATC
9841
TAGACATTCT AAGGCTGCTT TCCAAAACAC CCCTTGTGTG TTTGGGTGAC CTTCAGCAAC
9901
TTCACCCGGT CGGCTTTGAT TCCTATTGTT ATGTGTTCGA TCAGATGCCT CAGAAGCAGC
9961
TGACCACCAT TTATAGATTT GGCCCTAACA TCTGTGCAGC CATCCAGCCT TGTTACAGGG
10021
AGAAACTTGA ATCCAAGGCC AGGAACACCA GAGTGGTTTT CACCACCCGG CCTGTGGCCT
10081
TTGGTCAGGT CCTGACACCG TACCACAAAG ATCGTACCGG CTCTGCAATA ACTATAGATT
5
10
15
20
25
30
35
10141
CATCCCAGGG GGCGACCTTC GACATTGTGA CATTGCATCT ACCATCGCCA AAGTCCCTAA
10201
ACAAATCCCG AGCACTTGTA GCCATCACTC GGGCAAGACA TGGGTTGTTC ATTTATGACC
10261
CTCATGACCA ACTCCAGGAG TTTTTCAACT TAACCCCCGA GCGCACTGAT TGTAACCTTG
10321
CGTTCAGCCG TGGGGATGAG CTGGTTGTTT TGAATGTGGA TAATGCGGTC ACAACTGTAG
10381
CGAAGGCCCT AGAGACAGGT TCACCCCGAT TTCGAGTATC GGACCCGAGG TGCAAGTCTC
10441
TCTTAGCCGC TTGTTCGGCC AGTCTAGAAG GGAGCTGCAT GCCACTACCA CAAGTAGCAC
10501
ATAACCTGGG GTTTTACTTT TCCCCGGACA GCCCAGCTTT TGCACCCCTG CCAAAAGAGC
10561
TGGCGCCACA TTGGCCAGTG GTCACCCACC AGAATAATCG AGCGTGGCCT GATCGACTTG
10621
TCGCTAGTAT GCGCCCAATT GATGCCCGCT ACAGCAAGCC AATGGTCGGT GCAGGGTATG
10681
TGGTCGGGCC ATCCATTTTT CTTGGCACTC CTGGTGTGGT GTCATACTAT CTCACATTAT
10741
ACATCGGGGG CGAGCCTCAG GCCCTGCCAG AAACACTCGT TTCAACAGGA CGTATAGCCA
10801
CAGATTGTCG GGAATATCTC GACGCGGCTG AGGAAGAGGC AGCGAGAGAA CTTCCCCACG
10861
CATTTATTGG CGATGTCAAA GGCACTACGG TCGGGGGGTG TCACCACATT ACATCGAAAT
10921
ACCTACCTAG GTCCCTGCCT AAAGACTCTG TTGCTGTGGT TGGGGTGAGT TCGCCCGGTA
10981
GGGCTGCTAA AGCCGTGTGC ACTCTCACCG ATGTGTACCT CCCCGAACTC CGACCATATT
11041
TGCAACCGGA GACGGCATCA AAATGCTGGA AACTTAAACT GGATTTCAGG GATGTTCGAC
11101
TGATGGTCTG GAAAGGCGCC ACAGCCTATT TCCAGTTGGA AGGGCTGACA TGGTCAGCGC
11161
TGCCCGATTA TGCTAGGTTC ATTCAGCTAC CCAAGGATGC CGTTGTGTAC ATCGATCCGT
11221
GTATAGGGCC GGCAACAGCC AATCGCAAGG TTGTGCGAAC CACAGACTGG CGGGCCGACC
11281
TGGCAGTGAC ACCGTATGAT TACGGTGCTC AGGTCATTTT GACAACAGCC TGGTTCGAGG
11341
ACCTTGGGCC GCAGTGGAAG ATTTTGGGGT TGCAGCCTTT CAGACGAACA TTTGGCTTTG
11401
AGAACACTGA AGATTGGGCA ATTCTCGCAC GCCGTATGAA TGACGGCAAA GATTACACTG
11461
ACTATAATTG GCATTGTGTA CGAGAACGCC CACACGCAAT TTACGGGCGC GCCCGTGACC
11521
ATACGTATCA TTTTGCCCTT GGCACTGAAC TGCAAGTAGA GCTGGGCAGA CCCCGGCTGC
11581
CTCCTGAGCA AGTGCCGTGA
SEQ ID NO:29 Nucleotido que codifica ORF2 del PRRSV atenuado 94881
11611
ATGCAATGGG TTCACTGTGG AGTAAAATCA
11641
GTCAGTTGTT CGTGGATGCC TTCACTGAGT TCCTTGTTAG TGTGGTTGAC ATTGTCATCT
11701
TTCTCGCCAT ATTGTTTGGG TTCACTGTTG CAGGCTGGTT ATTGGTCTTC CTTCTCAGAG
11761
TGGTTTGCTC CGCGTTTCTC CGTTCGCGCT CTGCCATTCA CTCTCCCGAA CTATCGAAGG
11821
TCCTATGAGG GCTTGCTACC CAACTGCAGA CCGGATGTCC CACAATTCGC AGTTAAGCAC
11881
CCGTTGGGTA TACTTTGGCA TATGCGAGTC TCCCACCTAA TTGACGAAAT GGTCTCTCGC
11941
CGCATTTACC GGACCATGGA ACATTCGGGT CAAGCGGCCT GGAAGCAGGT TGTTAGTGAA
12001
GCCACTCTCA CAAAACTGTC AAGGCTTGAC GTAGTCACTC ATTTCCAACA CCTGGCCGCA
12061
GTGGAGGCTG ATTCTTGCCG CTTCCTTAGC TCACGACTCG CGATGCTGAA AAACCTTGCC
12121
GTTGGCAATG TGAGCCTGGA GTACAACACT ACTTTGGACC GCGTTGAGCT CATCTTTCCC
12181
ACACCAGGTA CGAGGCCCAA GTTGACCGAT TTTAGGCAAT GGCTTATCAG CGTGCACGCT
5
10
15
20
25
30
35
12241
TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT
12301
CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA
SEQ ID NO:30 Nucleotido que codifica ORF3 del PRRSV atenuado 94881
12219
AT GGCTTATCAG CGTGCACGCT
12241
TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT
12301
CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA
12361
CTATCAATTA CACTATATGT AAGCCATGCC CTACCAGTCA AGCTGCCCAA CAAAGACTCG
12421
AGCCTGGCCG TAACGTGTGG TGCAAAATAG GGCACGACAG GTGTGAGGAA CGTGACCATG
12481
ATGAGTTGTC AATGTCCATT CCGTCCGGGT ACGACAACCT CAAACTTGAG GGTTATTATG
12541
CTTGGCTGGC TTTTTTGTCC TTTTCCTACG CGGCCCAATT CCATCCGGAG CTGTTCGGAA
12601
TAGGAAACGT GTCGCGCGTC TTTGTGGATA AGCGACACCA GTTCATTTGC GCCGAGCATG
12661
AT GGACAAAA TTCAACCATA TCTGCCAGAC ACAACATCTC CGCGTCGTAT GCGGTGTATT
12721
ACCATCATCA AATAGACGGG GGCAATTGGT TTCATTTGGA ATGGCTGCGA CCATTCTTTT
12781
CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT
12841
CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT
12901
TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT
12961
CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAA
SEQ ID NO:31 Nucleotido que codifica ORF4 del PRRSV atenuado 94881
12761
ATGGCTGCGA CCATTCTTTT
12781
CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT
12841
CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT
12901
TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT
12961
CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAACGGC
13021
TAATGTGACC GATGAATCGT ATTTGTACAA CGCGGACTTG CTGATGCTTT CCGCGTGCCT
13081
TTTCTACGCC TCGGAAATGA GCGAGAAAGG CTTCAAAGTC ATCTTTGGGA ATATTTCTGG
13141
CGTTGTTTCC GCTTGTGTTA ATTTCACAGA TTATGTGGCC CATGTGACCC AACACACTCA
13201
GCAGCACCAT TTGGTAATTG ATCACATTCG GTTACTACAC TTCTTGACAC CGTCTACGAT
13261
GAGGTGGGCT ACAACCATTG CTTGTTTGTT TGCCATTCTT TTGGCGGTAT GA
SEQ ID NO:32 Nucleotido que codifica ORF5 del PRRSV atenuado 94881
13309
AT GAAATGTTCT
13321
TGCAAGTTGG GGCATTTCTT GACTCCTCAC TCTTGCTTCT GGTGGCTTTT TTTGCTGTGT
13381
ACCGGCTTGT CTTGGTCCTT TGTCGATGGC AACGACAACA GCTCGACATC CCAATACATA
13441
TATAATTTGA CGATATGCGA GCTGAATGGG ACCGAATGGT TGTCCGGTCA TTTTGATTGG
13501
GCAGTCGAAA CCTTTGTGCT TTACCCAGTT GCCACTCATA TCATTTCACT GGGTTTTCTC
13561
ACAACAAGCC ATTTCCTTGA TGCGCTCGGT CTCGGCGCTG TGTCCGCCAC AGGATTCATT
13621
GGCGAGCGGT ATGTACTTAG CAGCATGTAC GGCGTTTGCG CCTTCGCGGC GCTCGTATGT
13681
TTTGTCATCC GTGCTGCTAA AAATTGCATG GCTTGCCGCT ATGCCCGCAC CCGGTTTACC
13741 AACTTCATCG TGGACGACCG GGGAAGAATC CATCGATGGA AGTCTTCAAT AGTGGTGGAG
13801 AAATTGGGCA AAGCTGAAGT CGGTGGTGAC CTTGTCAACA TTAAGCATGT TGTCCTCGAA
13861 GGGGTTAAAG CTCAACCCTT GACGAGGACT TCGGCTGAGC AATGGGAAGC CTAG
SEQ ID NO:33 Nucleotido que codifica ORF6 del PRRSV atenuado 94881
5
13902 ATGGGAAGC CTAGACGACT
13921 TTTGCAACGA TCCCACCGCC GCACAAAAAC TCGTGCTGGC CTTTAGCATC ACATATACAC
13981 CCATAATGAT ATACGCCCTT AAGGTGTCAC GCGGCCGACT CCTGGGGCTG TTGCACATCT
14041 TGATATTTCT GAATTGTTCC TTTACTTTTG GGTACATGAC ATATGTGCAT TTTCAATCCA
14101 CCAACCGTGT CGCACTCACT CTGGGGGCTG TAGTCGCCCT TTTGTGGGGT GTTTACAGCC
10
14161 TCACAGAGTC ATGGAAGTTC ATCACTTCCA GATGCAGATT GTGTTGCCTA GGCCGGCGAT
14221 ACATTCTGGC CCCTGCCCAT CACGTAGAAA GTGCTGCAGG CCTCCATTCA ATCCCAGCGT
14281 CTGGTAACCG AGCATACGCT GTGAGAAAGC CCGGACTAAC ATCAGTGAAC GGCACTCTAG
14341 TACCTGGGCT TCGGAGCCTC GTGCTGGGCG GCAAACGAGC TGTTAAACGA GGAGTGGTTA
14401 ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAA
15
SEQ ID NO:34 Nucleotido que codifica ORF7 del PRRSV atenuado 94881
14413 ATGGCCGG TAAGAACCAG AGCCAGAAGA AAAGAAGAAA TGCAGCTCCG
14461 ATGGGGAAAG GCCAGCCAGT CAATCAACTG TGCCAGTTGC TGGGTACAAT GATAAAGTCC
14521 CAGCGCCAGC AATCTAGGGG AGGACAGGCC AAAAAGAAGA AGCCTGAGAA GCCACATTTT
14581 CCCCTAGCTG CTGAAGATGA CATTCGGCAC CATCTCACCC AGGCCGAACG TTCCCTCTGC
20
14641 TTGCAATCGA TCCAGACGGC TTTCAATCAA GGCGCAGGAA CTGCGTCGCT TTCATCCAGC
14701 GGGAAGGTCA GTTTCCAGGT TGAGTTCATG CTGCCGGTTG CTCATACAGT GCGCCTGATT
14761 CGCGTGACTT CTACATCCGC CAGTCAGGGT GCAAATTAA
Listado de secuencias
25 <110> KROLL, Jeremy
VAUGHN, Eric BURGARD, Kim ORVEILLON, Francois-Xavier LAYTON, Sarah 30 UTLEY, Phil
PESCH, Stefan OHLINGER, Volker ROOF, Mike PIONTKOWSKI, Mike 35
<120> NUEVA CEPA DE PRRSV EUROPEA <130> 10-0137 40 <160> 34
<170> PatentIn version 3.5 <210> 1
45 <211> 14843
<212> DNA
<213> Virus del smdrome respiratorio reproductivo porcino

Claims (22)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    1. Una composicion que comprende virus del smdrome reproductor y respiratorio porcino (PRRSV) de un tipo europeo, que es de la cepa depositada en la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC) con el numero de acceso ECACC 11012502.
  2. 2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde dicho PRRSV se atenua pasandolo al menos 36 veces por cultivo celular de forma que cuando el virus modificado se administre a un cerdo u otro mairnfero propenso al PRRSV fracase en producir signos clmicos de enfermedad por PRRSV, pero pueda inducir una respuesta inmunitaria que inmunice al mamnfero contra formas patogenas de PRRSV.
  3. 3. La composicion segun la reivindicacion 1 o 2, que esta en forma liofilizada.
  4. 4. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha composicion se formula para permitir la administracion de 101 a 107 partmulas virales por dosis, o en donde dicha composicion comprende al menos aproximadamente 107 partmulas virales.
  5. 5. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende, ademas, uno o mas patogenos atenuados o inactivados no PRRSV o material antigenico de los mismos.
  6. 6. La composicion segun la reivindicacion 5, en la que dichos patogenos no PRRSV se seleccionan del virus de la seudorrabia, virus de la gripe porcina, parvovirus porcino, virus de la gastroenteritis transmisible, Escherichia coli, Erysipelas rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae y Actinobacillus pleuropneumoniae.
  7. 7. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas un adyuvante, opcionalmente seleccionado del grupo que consiste en MCP-1, a-tocoferol (por ejemplo, acetato de a-tocoferol), fracciones de Haemophilus sonmus, carbopol y combinaciones de los mismos.
  8. 8. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso como una vacuna.
  9. 9. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en un metodo de
    - tratamiento o reduccion de la gravedad de la infeccion por virus del smdrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV),
    - prevencion de la infeccion por PRRSV,
    - induccion de la produccion de una respuesta de anticuerpos al virus PRRS, y / o
    - disminucion de la gravedad de uno o mas smtomas clmicos asociados con la infeccion por PRRSV, en donde dichos uno o mas smtomas clmicos se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en lesiones pulmonares, anorexia, decoloracion de la piel, letargo, signos respiratorios, lechones momificados, tos, diarrea, y combinaciones de los mismos.
  10. 10. La composicion segun la reivindicacion 7 para uso en un metodo de
    - reduccion del porcentaje de lesiones pulmonares en al menos 50% en comparacion con los animales que no reciben la composicion inmunogenica en combinacion con dicho adyuvante,
    - reduccion de la viremia en animales en al menos 45% en comparacion con los animales que no reciben la composicion inmunogenica en combinacion con dicho adyuvante.
  11. 11. La composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en la que dicho metodo incluye la etapa de administrar una cantidad terapeutica de un antfgeno de PRRSV a
    - un lechon de tres semanas de vida o menos,
    - un cerdo de entre aproximadamente 3 semanas y 4 semanas de vida.
    - un cerdo de entre aproximadamente cuatro semanas y dieciseis semanas de vida, en el que dicho cerdo tiene opcionalmente de cinco semanas a seis semanas de vida o de nueve semanas a quince semanas de vida o de siete semanas a diez semanas de vida, o
    - un cerdo de mas de dieciseis semanas, en el que dicho cerdo de mas de dieciseis semanas es opcionalmente una cerda joven o una cerda adulta.
  12. 12. La composicion para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que la composicion debe administrarse
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    - en dosis de 1 ml para cerdos y 2 ml para cerdas mediante inyeccion intramuscular, y / o
    - en una sola dosis.
  13. 13. Un producto de vacuna, que comprende en recipientes separados una composicion liofilizada segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un disolvente para reconstitucion, y opcionalmente que contiene ademas un prospecto o etiqueta que comprende instrucciones de uso.
  14. 14. El producto de vacuna de la reivindicacion 13, en el que
    - el disolvente se selecciona del grupo que consiste en agua, solucion salina fisiologica, o tampon, o un disolvente adyuvante, y/o
    - en el que el disolvente contiene un adyuvante.
  15. 15. Una composicion proteica que comprende
    - una protema que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 7, o
    - las protemas que tienen las secuencias de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 9.
  16. 16. Un acido nucleico aislado que comprende
    - la secuencia de SEQ ID NO: 24, o
    - las secuencias de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; y SEQ ID NO: 26.
  17. 17. Un vector de expresion recombinante que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica
    (i) el ORF de PRRSV de la SEQ ID NO: 7 operativamente unido a un promotor, o
    (ii) los ORF PRRSV de la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 9 operativamente unido a un promotor.
  18. 18. El vector de expresion recombinante de la reivindicacion 17, en el que
    (i) dicha secuencia de acido nucleico que codifica dicho ORF es la SEQ ID NO: 24, o
    (ii) dicha secuencia de acido nucleico que codifica dichos ORF comprende la SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; y SEQ ID NO: 26.
    imagen1
    Tos
  19. 0.25-
    Contro
    Exposition
    Porci is
  20. 0.05-
    Periodo de estudio
    FIG 1B
    Puntuacion clinica total
    Control
    •— Exposition A— Porcilis
    0,2
    7-0 1-7 8-14 15-2122-28 29-35 36-42 43-49 50-57
    Periodo del estudio
    imagen2
    Temperatura Rectal
    40,8
    40,6-
    40,4-
    r 40,2-
    Control
    40
    Exposicior
    S. 39,8-
    Porcilis
  21. 39.6
  22. 39.4-
    39,2-
    Dia del estudio
    Aumento de peso diario promedio
    Antes de la Exposition hasta Exposition hasta
    imagen3
    1-35 35-44 35-56
    Dia de estudio
    imagen4
    Viremia de PRRS
    03
    Control
    Exposicion
    PonCihs
    DRV i dias despues
    DPC (dias despues
    de la vacunacion i
    de la exposicion)
    FIG 5
    Serologia
    o
    00
    Control
    Exposicion
    Poncilis
    DPV (dias despues
    DPC (dias despues
    de la vacunacion)
    de la exposicion)
    imagen5
    imagen6
    imagen7
    imagen8
    imagen9
    reparation del virus durante 1 -4 dias.
    luego wcoqer (3a eosacha) (inodo de
    mtorizacion DO]
    Renofer oe h.tes .AK-M A1C4 dc las totSIlM r^siOTas
    _____
    -----------*---------------
    Transfers 7,00 * 10E09 celulas K-MAHJ4 a una bolella da adictijr
    ____ A
    et^|
    Trsnsferir 27Q-2SQ I de medio
    at biorreadgr
    Fijar biorreaetor de 3001 segun SOP 29-069
    Transfenr e virus
    al biorreactor
    Ca cu ar el voiumen
    de virus- basandose
    en la MU I diang
    2
    Ai'iad ■ a la bolella
    Propagar el wits durante
    de adic 6n
    i* dlas. luego recoger
    coseoha)
    Rc-almocntacion
    Transfenr 27G-2B0
    de
    me d o a l biorreactor
    Transfenr IFBS ai bionedetor
    (5% de volgmen de medhoj
    ropaqacion del virus durante 1 4 duas:
    luego recoger (2s cosecha) (modo de
    mtorizacion DO
    Repel ir la re^allmentaddn
    Trafisterir 270-2&0 I de medio m£s
    5% de FQb a bionreactor
    T ransierir I FES a I biorreactor
    (5% de voiumen de medio]
    Paramelros de bid reactor
    A
    pH: 7,25 +r- 0,1
    Temp.: 36.0 +/ 1C
    T
    -lujo de gas: 2,0 3,0 SLPM
    1^
    Transfenr c&lulas AK-MA104
    Agrtacidn 25 rpm
    al biorreactor
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UA (2) UA117272C2 (es)
WO (1) WO2012110489A2 (es)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PH12013501708B1 (en) 2011-02-17 2018-08-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Commercial scale process for production of prrsv
HRP20151031T1 (hr) 2011-02-17 2015-11-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novi europski soj prrsv
US8906385B2 (en) 2011-12-01 2014-12-09 University Of Maryland, College Park Interferon-inducing porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolate
KR102012109B1 (ko) 2012-05-17 2019-08-19 조에티스 엘엘씨 이유 전 돼지 생식기 호흡기 증후군(prrs) 바이러스에 대한 효과적인 백신접종
US9314519B2 (en) 2012-08-21 2016-04-19 Intervet Inc. Liquid stable virus vaccines
US9457073B2 (en) * 2012-09-26 2016-10-04 University Of Manitoba Live attenuated replication-competent arteriviruses having decreased dub/deisgylating activity
CA2892948C (en) * 2012-12-07 2022-09-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Porcine reproductive and respiratory syndrome virus compositions and uses thereof
US9393298B2 (en) 2013-03-15 2016-07-19 Intervet Inc. Liquid stable bovine virus vaccines
US9480739B2 (en) 2013-03-15 2016-11-01 Intervet Inc. Bovine virus vaccines that are liquid stable
AR097762A1 (es) 2013-09-27 2016-04-13 Intervet Int Bv Formulaciones secas de vacunas que son estables a temperatura ambiente
ES2729838T3 (es) * 2013-12-20 2019-11-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Variante del virus del PRRS, clon de ADNc del virus del PRRS europeo y usos del mismo
US10280199B2 (en) 2014-02-07 2019-05-07 Phibro Animal Health Corporation Coronavirus proteins and antigens
AR099470A1 (es) 2014-02-17 2016-07-27 Intervet Int Bv Vacunas de virus de aves de corral líquidas
TWI670085B (zh) * 2014-02-19 2019-09-01 荷蘭商英特威國際公司 液體穩定之豬病毒疫苗
EP3603632A1 (en) 2014-10-27 2020-02-05 Pharmacosmos Holding A/s Treatment or prevention of anaemia in offspring of non-human mammals
CN106924726B (zh) * 2015-12-29 2021-02-09 普莱柯生物工程股份有限公司 一种用于预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗组合物及其制备方法和应用
CA3022006A1 (en) * 2016-05-11 2017-11-16 Phibro Animal Health Corporation A composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using
US10279031B2 (en) 2016-05-11 2019-05-07 Phibro Animal Health Corporation Composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using
AU2017353380B2 (en) 2016-11-03 2024-08-22 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof
MX2019006992A (es) * 2016-12-14 2019-08-29 Zoetis Services Llc Vacunacion eficaz contra cepas europeas del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (prrs) previo al destete.
US11013796B2 (en) 2018-08-30 2021-05-25 Iowa State University Research Foundation, Inc. Porcine parainfluenza virus type 1 isolates and immunogenic compositions therefrom
BR112021019859A2 (pt) 2019-04-04 2022-02-15 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Vacinas de circovírus suíno tipo 3 (pcv3) e produção e seus usos
CN110735005B (zh) * 2019-11-26 2023-01-10 广西大学 Siv和prrsv多重rt-pcr快速检测试剂盒及引物
CN111676247A (zh) * 2020-06-30 2020-09-18 扬州大学 一株猪繁殖与呼吸综合征病毒1型分离株感染性克隆构建、拯救与应用
EP4185321A2 (en) 2020-07-24 2023-05-31 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Combination porcine vaccine
CN113862230B (zh) * 2021-09-30 2023-08-08 中牧实业股份有限公司 一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE148705C (es)
US3137631A (en) 1959-12-01 1964-06-16 Faberge Inc Encapsulation in natural products
US3080291A (en) 1960-06-10 1963-03-05 Jensen Salsberg Lab Inc Serial passage of distemper virus in tissue cultures of chick embryo and canine tissue and vaccine therefrom
US3959457A (en) 1970-06-05 1976-05-25 Temple University Microparticulate material and method of making such material
US4015100A (en) 1974-01-07 1977-03-29 Avco Everett Research Laboratory, Inc. Surface modification
US4122167A (en) 1977-02-09 1978-10-24 Merck & Co., Inc. Respiratory synctial vaccine
US4205060A (en) 1978-12-20 1980-05-27 Pennwalt Corporation Microcapsules containing medicament-polymer salt having a water-insoluble polymer sheath, their production and their use
US4224412A (en) 1979-05-01 1980-09-23 Dorofeev Viktor M Living virus culture vaccine against canine distemper and method of preparing same
US4554159A (en) 1981-11-12 1985-11-19 Institute Merieux Vaccine and method of immunizing against herpes simplex virus (types 1 and 2)
US4452747A (en) 1982-03-22 1984-06-05 Klaus Gersonde Method of and arrangement for producing lipid vesicles
GB8319302D0 (en) 1983-07-16 1983-08-17 Tpt Ltd Container
US4468346A (en) 1983-10-27 1984-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins
DE3405100A1 (de) 1984-02-14 1985-08-14 Drägerwerk AG, 2400 Lübeck Pt-katalysator auf einem traeger als luftreinigungsmittel
US4744933A (en) 1984-02-15 1988-05-17 Massachusetts Institute Of Technology Process for encapsulation and encapsulated active material system
US5008050A (en) 1984-06-20 1991-04-16 The Liposome Company, Inc. Extrusion technique for producing unilamellar vesicles
US4921706A (en) 1984-11-20 1990-05-01 Massachusetts Institute Of Technology Unilamellar lipid vesicles and method for their formation
US4606940A (en) 1984-12-21 1986-08-19 The Ohio State University Research Foundation Small particle formation and encapsulation
DE3687769T2 (de) 1985-07-08 1993-09-02 Chiron Corp Vakzine und diagnostika, die vom bovine-diarrhea-virus stammen.
US5206163A (en) 1985-07-08 1993-04-27 Chiron Corporation DNA encoding bovine diarrhea virus protein
US4753884A (en) 1986-01-28 1988-06-28 Novagene, Inc. Pseudorabies virus mutants, vaccines containing same, methods for the production of same and methods for the use of same
JPS62198626A (ja) 1986-02-26 1987-09-02 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 血球凝集性脳脊髄炎ウイルス感染症予防ワクチン
FR2602791B1 (fr) 1986-08-18 1988-11-10 Ministere Agri Direction Quali Procede de culture du virus de la rhinotracheite infectieuse de la dinde, et vaccin prepare a partir du virus ainsi obtenu
NZ222465A (en) 1986-11-07 1992-11-25 Pasteur Institut Nanb (non a, non b hepatitis viral) antigen
US5009956A (en) 1987-02-24 1991-04-23 Univ Minnesota Phospholipase A2-resistant liposomes
DE3833925A1 (de) 1988-03-11 1989-09-21 Inst Angewandte Biotechnologie Verfahren und herstellung von virus und viralem antigen und vorrichtung hierzu
US5213759A (en) 1988-05-05 1993-05-25 Elopak Systems A.G. Sterilization
US4927637A (en) 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US4944948A (en) 1989-02-24 1990-07-31 Liposome Technology, Inc. EGF/Liposome gel composition and method
US5132117A (en) 1990-01-11 1992-07-21 Temple University Aqueous core microcapsules and method for their preparation
AU7007491A (en) 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
JP3128133B2 (ja) 1991-06-06 2001-01-29 スティッチティング セントラール ディールゲネースクンディグ インスティトゥート 豚の奇病の原因体であるレリスタドエイジェント、それを含むワクチン組成物、豚の奇病の診断キット及び診断方法
US6080570A (en) 1991-08-26 2000-06-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome
DK0601062T4 (da) 1991-08-26 2001-03-14 Univ Minnesota SIRS-vaccine og diagnosefremgangsmåde
US6982160B2 (en) 1991-08-26 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions that include SIRS virus
US6042830A (en) 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
KR0138092B1 (ko) 1991-08-26 1998-04-30 제임스 씨. 데세사레 미확인(Mystery) 돼지 질병 관련 바이러스제
US5846805A (en) 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
AU2696792A (en) 1991-09-16 1993-04-27 David A Benfield Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
AU2684792A (en) 1991-10-14 1993-05-21 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
FR2686097B1 (fr) 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
US5338543A (en) 1992-02-27 1994-08-16 Ambico, Inc. Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine
TW289731B (es) 1992-07-09 1996-11-01 Akzo Nv
US6380376B1 (en) 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6773908B1 (en) 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6251397B1 (en) 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US5695766A (en) 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US5419907A (en) 1992-11-10 1995-05-30 Iowa State University Research Foundation, Inc. Pathogenic porcine respiratory coronavirus
HU218430B (hu) 1993-02-08 2000-08-28 Bayer Corp. Eljárás sertés reproduktív és légzési szindróma vírus (PRRSV) tenyésztésére és annak alkalmazása vakcinában
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
EP0659885A1 (en) 1993-12-21 1995-06-28 Akzo Nobel N.V. Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity
DE4407489A1 (de) 1994-03-07 1995-09-14 Bayer Ag Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines
DE69522984T2 (de) 1994-04-11 2002-04-25 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
JPH10500889A (ja) 1994-04-15 1998-01-27 テンプル・ユニバーシティ 水性溶媒封入法、装置およびマイクロカプセル
GB2289279B (en) 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
WO1996004010A1 (en) 1994-08-05 1996-02-15 Regents Of The University Of Minnesota Vr-2332 viral nucleotide sequence and methods of use
EP0732340B1 (en) 1995-03-14 2004-06-09 Akzo Nobel N.V. Expression of porcine reproductive respiratory syndrome virus polypeptides in the same cell
US5690940A (en) 1995-06-21 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof
ES2102971B1 (es) 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
EP0894007A1 (en) 1996-03-01 1999-02-03 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
US5866401A (en) 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
US6015663A (en) 1996-03-01 2000-01-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains
US5976537A (en) 1996-07-02 1999-11-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
EP0835930B1 (en) 1996-10-09 2001-01-31 Akzo Nobel N.V. European vaccine strains of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US20040224327A1 (en) 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
WO1998035023A1 (en) * 1997-02-07 1998-08-13 Origen, Inc. Method for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus for use as vaccines and diagnostic assays
KR100388257B1 (ko) 1997-05-06 2003-06-19 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 백신 또는 진단방법에서 사용하기 위한 피알알에스 바이러스의 피알알에스브이 항원부위 인식성 펩타이드 서열
CA2283422A1 (en) 1997-06-04 1998-12-10 Calgene, Llc Production of polyunsaturated fatty acids by expression of polyketide-like synthesis genes in plants
WO1998055626A2 (en) 1997-06-05 1998-12-10 Origen, Inc. Recombinant porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) for use as a vaccine
US7211379B2 (en) 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
CA2290220C (en) 1998-12-22 2013-11-19 Pfizer Products Inc. An infectious cdna clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus and uses thereof
US7132106B2 (en) 1998-12-22 2006-11-07 Pfizer Inc. Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7691389B2 (en) 1998-12-22 2010-04-06 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7618797B2 (en) 1998-12-22 2009-11-17 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
FR2789695B1 (fr) 1999-02-11 2003-03-07 Merial Sas Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs
EP1157121B1 (en) 1999-03-08 2013-04-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Prrsv replicon
DK2251419T3 (da) 1999-04-22 2012-07-02 Us Agriculture Porcint reproduktions- og respirations-syndrom-vaccine baseret på isolat JA-142
WO2002095040A1 (en) 2001-05-21 2002-11-28 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Delections in arterivirus replicons
US20040213805A1 (en) 1999-10-12 2004-10-28 Verheije Monique Helene Deletions in arterivirus replicons
US20020012670A1 (en) 2000-01-26 2002-01-31 Knut Elbers Recombinant attenuation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV)
WO2001059077A1 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Regents Of The University Of Minnesota Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use
EP1156111A1 (en) 2000-05-19 2001-11-21 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Chimeric arterivirus-like particles
US7018638B2 (en) 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
RU2003129068A (ru) * 2001-03-09 2005-04-10 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх (De) Штаммы вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (prrs) с ослабленной жизнеспособностью
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US6841364B2 (en) 2002-01-22 2005-01-11 Protatek International, Inc. Infectious cDNA clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and expression vectors thereof
ATE557082T1 (de) 2002-04-05 2012-05-15 Boehringer Ingelheim Vetmed Sequenz positionen zur anpassung bei prrsv
US7335361B2 (en) 2003-06-09 2008-02-26 Animal Technology Institute Taiwan Fusion antigen used as vaccine
US7722878B2 (en) 2004-06-17 2010-05-25 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PRRSV subunit vaccines
CN101039693A (zh) * 2004-06-18 2007-09-19 明尼苏达大学董事会 鉴定病毒感染和疫苗接种的生物
AU2005265142A1 (en) 2004-06-18 2006-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US20060063151A1 (en) 2004-09-21 2006-03-23 Michael Roof Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US7879337B2 (en) * 2004-11-11 2011-02-01 Pfizer Inc. Mutant porcine reproductive and respiratory syndrome virus
US8178103B2 (en) * 2004-11-19 2012-05-15 Intervet International B.V. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains and compositions
RU2007130801A (ru) 2005-01-13 2009-02-20 Берингер Ингельхайм Ветмедика Гмбх (De) Улучшенные вакцины против репродуктивно-респираторного синдрома свиней (prrs)
PL2369001T3 (pl) 2005-06-24 2017-06-30 Regents Of The University Of Minnesota Wirusy PRRS, ich klony zakaźne, mutanty i sposoby stosowania
CA2630648C (en) * 2005-11-29 2016-01-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) and uses thereof
US8563313B2 (en) 2007-02-13 2013-10-22 Washington State University Research Foundation Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus
WO2008121958A1 (en) 2007-04-02 2008-10-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Use of prrsv vaccines to reduce pcv2 viremia
US20100003278A1 (en) 2008-07-03 2010-01-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunological Compositions Effective for Lessening the Severity or Incidence of PRRSV Signs and Methods of Use Thereof
EP2328612A4 (en) 2008-08-25 2012-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmed VACCINE AGAINST HIGH PATHOGENIC DISEASED LATE LIVESTOCK (PRRS)
US20100129398A1 (en) 2008-11-26 2010-05-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Materials and Methods for Control of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
ES2742262T3 (es) 2010-04-16 2020-02-13 Univ Gent Vacuna con protección cruzada para el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino
CN101920010A (zh) * 2010-06-29 2010-12-22 西北农林科技大学 表达prrsv免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法
US8728487B2 (en) 2011-01-20 2014-05-20 Hua Wu Attenuated live vaccine for prevention of porcine reproductive and respiratory syndrome
PH12013501708B1 (en) * 2011-02-17 2018-08-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Commercial scale process for production of prrsv
HRP20151031T1 (hr) 2011-02-17 2015-11-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novi europski soj prrsv
WO2013017568A1 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh INFECTIOUS cDNA CLONE OF EUROPEAN PRRS VIRUS AND USES THEREOF
CN105073130A (zh) 2013-03-15 2015-11-18 勃林格殷格翰动物保健公司 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
ES2729838T3 (es) 2013-12-20 2019-11-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Variante del virus del PRRS, clon de ADNc del virus del PRRS europeo y usos del mismo

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