ES2693035T3 - SSEA4 y ST3GAL2 como biomarcadores de respuesta a fármacos quimioterapéuticos - Google Patents

Abstract

El uso de los biomarcadores SSEA4 y/o ST3GAL2 para evaluar el resultado del tratamiento quimioterapéutico de un cáncer en un individuo, en donde dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama humano, carcinoma de células renales (RCC) y cáncer de ovario humano si el biomarcador es SSEA4 y en donde dicho cáncer es cáncer de mama humano si el biomarcador es ST3GAL2 y en donde los fármacos quimioterapéuticos usados en dicho tratamiento quimioterapéutico son inhibidores de la síntesis y transcripción del ADN.

Description

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DESCRIPCION

SSEA4 y ST3GAL2 como biomarcadores de respuesta a farmacos quimioterapeuticos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a metodos para predecir el resultado del tratamiento quimioterapeutico del cancer en un individuo y biomarcadores para el mismo.

Antecedentes de la invencion

En el campo de la oncologfa, los biomarcadores se usan para calcular el pronostico de una malignidad, predecir tratamientos adecuados, monitorear la progresion de la enfermedad y evaluar el impacto del tratamiento. La gama de biomarcadores usados es extremadamente amplia. Se usan con frecuencia las caractensticas morfologicas o histologicas, pero ademas los marcadores moleculares al nivel de protema y de acido nucleico (ADN/ARN).

Mientras que existen marcadores buenos para la mayona de las terapias dirigidas, para la mayona de las entidades tumorales existe una ausencia de marcadores que puedan usarse para predecir la respuesta para terapias sistemicas como la quimioterapia. En el cancer de mama, la quimioterapia se usa predominantemente para la enfermedad en estadio 2-4, y es beneficiosa particularmente en la enfermedad con receptor de estrogeno negativo (ER-, por sus siglas en ingles). Usualmente, se administran en combinaciones varios farmacos, y uno de los tratamientos mas comunes es la ciclofosfamida mas doxorrubicina (Adriamicina®), conocida como A/C. En general, la quimioterapia funciona mediante la destruccion inespedfica de las celulas de crecimiento rapido/replicacion rapida. En el caso de la A/C, la muerte celular se induce al causar dano al ADN durante la replicacion. Debido al mecanismo de accion general para la mayona de los agentes quimioterapeuticos, estos farmacos junto a las celulas tumorales objetivo danan, ademas, a las celulas normales de crecimiento rapido donde ellos causan efectos secundarios graves como perdida de cabello o complicaciones hepaticas y gastrointestinales.

El documento WO2013/152301A1 describe el uso de los genes de la via de biosmtesis de O-glicano (OGBP, por sus siglas en ingles), lo que incluye el ST3GAL2, para determinar el pronostico de un paciente con cancer de ovario, en donde un pronostico favorable comprende una probabilidad aumentada de supervivencia despues del tratamiento con quimioterapia primaria.

El documento EP2036988A1 describe biomarcadores para el riesgo de desarrollar cancer ginecologico recurrente hacia un agente quimioterapeutico. Los genes descritos son AKR1C1, MLPH, ESR1, PGR, COMP, DCN, IGKC, CCL5, FBN1 y/o UBE2C.

Gottschling y otros (2012, European Respiratory Journal 41:656-663) describen niveles altos de SSEA4 en el cancer de pulmon con recafda y describen el antfgeno de superficie como un marcador de mal pronostico.

Aunque menos del 25 % de los pacientes con cancer de mama se benefician del tratamiento quimioterapeutico (CLIFFORD A. HUDIS y LUCA GIANNI, The Oncologist 2011;16(suppl 1):1-11), este abordaje sistemico se usa todavfa como el tratamiento convencional. Debido a los efectos secundarios graves, sena beneficioso altamente identificar marcadores que puedan usarse para predecir la respuesta a la quimioterapia lo que evitana el tratamiento de los tumores con resistencia intnnseca.

Breve descripcion de la invencion

Sorprendentemente, se encontro que el SSEA4 (antfgeno embrionario 4 espedfico de estadio), un sialilglicolfpido, y ST3GAL2, la enzima sintetizadora del SSEA4, son biomarcadores para el diagnostico y pronostico de respuesta farmacologica en el cancer.

La expresion de SSEA4 y/o ST3GAL2 en/dentro de las celulas cancerosas predice el resultado del tratamiento quimioterapeutico de estas celulas. SSEA4 y/o ST3GAL2 pueden usarse como biomarcadores en un metodo para predecir la resistencia a la quimioterapia en un individuo con cancer en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales humano (RCC, por sus siglas en ingles) y cancer de ovario humano si el biomarcador es SSEA4 y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano y si el biomarcador es ST3GAL2 y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicho tratamiento quimioterapeutico son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Diseno del estudio para el tratamiento quimioterapeutico de xenoinjertos de tumores

Tras el injerto estable de los tumores humanos (etapa de pretratamiento, A), los ratones se trataron mediante el uso de un tratamiento convencional de combinacion doxorrubicina/ciclofosfamida (A/C). Despues de la reduccion del tumor, se

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extrajeron los nodulos residuales (etapa de tumor residual, C). El mismo d^a, se extrajeron los tumores de ratones no tratados (etapa sin tratamiento, B), los cuales sirvieron como controles directos. Ademas, se mantuvo un grupo de animales con tumores residuales hasta la reca^da de la enfermedad (etapa de rebrote, D).

Figura 2: Estrategia de seleccion de poblaciones representativas para el analisis de marcadores por citometna de flujo de tejido de xenoinjerto tumoral disociado

El tejido tumoral se disocio para obtener una suspension de celulas individuales a la vez que se preservaron los epftopos de la superficie celular. La muestra se tino para marcadores espedficos de raton para excluir las celulas de origen murino del analisis, asf como tambien para los candidatos de cribado y se analizo mediante citometna de flujo multiparametrica. Los dobletes se excluyeron mediante seleccion de subpoblaciones por FSC-A/FSC-H (A), los restos se excluyeron mediante seleccion de poblaciones por FSC/SSC (B), las celulas muertas se excluyeron mediante la exclusion de subpoblaciones con eventos PI+ (C), y las celulas de raton se excluyeron mediante la seleccion de subpoblaciones con eventos a-raton-FITC negativos (D). Cuando se cribaron dos muestras en paralelo, una de las muestras se marco mediante el uso de un colorante UV, lo que permite la separacion posterior de los eventos de cada muestra mediante la seleccion de subpoblaciones con intensidad de fluorescencia en el canal VioBlue (E-H).

Figura 3: Identificacion de marcadores de superficie celular regulados diferencialmente durante el tratamiento quimioterapeutico

Los patrones de expresion de marcadores de superficie celular en xenoinjertos de tumores de cuatro pacientes con cancer de mama independientes, HBCx-6 (A, B), HBCx-10 (C, D), HBCx-14 (E, F) y HBCx-17 (G, H), se analizaron mediante citometna de flujo multiparametrica en tres puntos temporales, la etapa de tumor residual, la etapa sin tratamiento y la etapa de rebrote. En total, la expresion de 13 marcadores (2 a 9 por modelo de tumor) aumento (B, D, F, H) y la expresion de 10 marcadores (1 a 5 por modelo de tumor) disminuyo (A, C, E, G) durante la quimioterapia.

Figura 4: Expresion de SSEA4 durante el tratamiento quimioterapeutico de xenoinjertos de tumores

La expresion de SSEA4 durante el tratamiento quimioterapeutico de xenoinjertos de tumores de cuatro pacientes independientes con cancer de mama, HBCx-6, HBCx-10, HBCx-14 y HBCx-17, se analizo mediante citometna de flujo multiparametrica en cuatro puntos temporales, la etapa de pretratamiento, la etapa de celulas tumorales residuales y la etapa sin tratamiento paralela, y la etapa de rebrote. El numero de celulas positivas para SSEA4 se enriquecio significativamente (p < 0,001, n = 8) tras el tratamiento con A/C en todos los tumores analizados. Ademas, en tres de cada cuatro modelos tumorales, HBCx-10, HBCx-14 y HBCx-17, la fraccion de celulas positivas se redujo a los niveles basales cuando los tumores recayeron.

***p< 0,001

Figura 5: Expresion de SSEA4 en tumores sensibles o resistentes al tratamiento quimioterapeutico

Los tumores que son sensibles (n = 6) o resistentes (n = 4) al tratamiento con A/C se analizaron para determinar la expresion de SSEA4. Tres de cada cuatro de los modelos tumorales resistentes mostraron porcentajes mas altos de celulas positivas para SSEA4 que todos los seis tumores sensibles. En dos de los modelos tumorales resistentes, casi todas las celulas expresaron SSEA4.

Figura 6: Expresion de SSEA4 en RCC y tejido renal sano

El carcinoma de celulas renales de celulas claras (RCC, por sus siglas en ingles), que se mostro resistente intnnsecamente a la quimioterapia en mas del 95 % de los pacientes, se investigo para determinar la expresion de SSEA4. El RCC primario asf como tambien el tejido renal sano del mismo paciente se disociaron y analizaron mediante citometna de flujo multiparametrica. Los dobletes se excluyeron mediante seleccion de subpoblaciones por FSC-A/FSC- H (A), los restos se excluyeron mediante seleccion de poblaciones por FSC/SSC (B), las celulas muertas se excluyeron mediante la exclusion de subpoblaciones con eventos Pl+ (C), y las celulas de raton se excluyeron mediante la seleccion de subpoblaciones con eventos a-LIn-FITC negativos (D). En cada paciente, se analizo en paralelo el tejido sano y tumoral. Por lo tanto, una de las muestras se marco mediante el uso de un colorante UV lo que permite la separacion posterior de los eventos de cada muestra mediante la seleccion de subpoblaciones con intensidad de fluorescencia en el canal VioBlue (E-H). En todos los pacientes analizados (n = 3), la expresion de SSEA4 aumento fuertemente en el tejido tumoral y casi todas las celulas tumorales expresaron este marcador (F-H).

*a-Lin-FITC = CD45-FITC, CD31-FITC, CD235a (Glicoforina A)-FITC

Figura 7: Expresion de SSEA4 durante el tratamiento quimioterapeutico de celulas de cancer de mama in vitro

Lmeas celulares que conteman cantidades diferentes de celulas positivas para SSEA4 se trataron con farmacos quimioterapeuticos in vitro. Una lmea celular de tumor primario derivada del modelo HBCx-17 mostro un crecimiento reproducible parcialmente en un fenotipo adherente y en uno en suspension. Las celulas cultivadas en suspension

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mostraron una expresion de SSEA4 mayor significativamente (p = 0,029) en comparacion con las celulas adherentes

(A) . Para evaluar la sensibilidad de ambas subpoblaciones al tratamiento quimioterapeutico, se midieron los valores de CI50 (n = 3) para farmacos usados comunmente. Para Cisplatino, Mafosfamida, 5-Fluorouracilo y Adriamicina®, las celulas en suspension mostraron valores mas altos de CI50, lo que indica un aumento de la resistencia a esos farmacos

(B) . Para examinar directamente el fenotipo de las celulas que sobrevivieron al tratamiento, se trato otra lmea celular adherente puramente derivada del modelo HBCx-17 con concentraciones crecientes de Mafosfamida (C), 4- Hidroxiciclofosfamida (D) o Adriamicina® (E) (n = 4). En todos los casos, la poblacion sobreviviente mostro una fraccion mayor significativamente de celulas positivas para SSEA4.

** p < 0,01, ***p< 0,001

Figura 8: La expresion de SSEA4 indica un fenotipo mas mesenquimatico

La expresion de SSEA4 se evaluo tras la induccion de EMT. Para inducir una transicion mesenquimatica, la lmea celular epitelial de mama MCF10A se trato con TGFp1 a concentraciones de 10 y 20 ng/ml. Tras el tratamiento, casi todas las celulas cambiaron su morfologfa de un tipo de colonia compactada a una forma fibroblastica alargada (A). La F-actina se tino con faloidina para visualizar la arquitectura del citoesqueleto. Los marcadores epiteliales E-cadherina (B) y EpCAM

(C) se regularon negativamente, mientras que el marcador mesenquimatico Fibronectina (D) se regulo positivamente tras el tratamiento. La fraccion de celulas positivas para SSEA4 se incremento tras la induccion de EMT (E), lo que verifica que la expresion de SSEA4 indica un fenotipo mas mesenquimatico.

Figura 9: La expresion de ST3GAL2 se correlaciona con el pronostico del resultado clmico de las pacientes con cancer de mama

Debido a la naturaleza del epttopo SSEA4, su expresion no puede controlarse directamente mediante el perfilado de transcriptoma. Por lo tanto, el valor pronostico de su enzima sintetizadora ST3GAL2 se evaluo mediante el uso de una gran base de datos publica de micromatrices clmicas de tumores de mama de 2.977 pacientes (Gyorffy B y otros, Breast Cancer Res Treatment, 2010 Oct;123(3):725-31.). Cuando se uso el conjunto de datos completo, no se observaron diferencias en el resultado clmico, mientras que se encontraron diferencias significativas altamente (p < 0,01) hacia un pronostico peor para los pacientes que expresaban niveles altos de ST3GAL2 en los pacientes ER-, los pacientes PR- y los pacientes doble negativos con independencia del tratamiento (A). Cuando se centro en pacientes tratados con quimioterapia, se observo una reduccion significativa altamente de la supervivencia libre de recafda con independencia del subtipo de tumor (p < 0,01, HR 1,91), en pacientes ER- (p < 0,01, HR 2,97) y en pacientes doble negativos (p < 0,01, HR 3,08) en pacientes que expresaban niveles altos de ST3GAL2 (B). Ademas, mediante la aplicacion de la supervivencia libre de metastasis a distancia como punto final principal, los pacientes tratados con quimioterapia tuvieron un pronostico peor cuando expresaron niveles altos de ST3GAL2 (C).

Figura 10: La expresion de ST3GAL2 se correlaciona con el pronostico del resultado clmico de los pacientes con cancer de ovario

Para evaluar el valor pronostico de la expresion de ST3GAL2 en una entidad tumoral independiente, se analizo una base de datos de micromatrices clmicas de tumores de ovario publica de 1.464 pacientes (Gyorffy B y otros, Endocrine- Related Cancer. 2012 Abr 10;19(2):197-208.). Cuando se uso el conjunto de datos completo, se observo una diferencia significativa hacia un resultado clmico peor con respecto a la supervivencia libre de progresion (p < 0,05), asf como tambien a la supervivencia posterior a la progresion (p < 0,05, A). Cuando se centro en los pacientes tratados con quimioterapia, el nivel de significacion se incremento aun mas para ambos puntos finales (p < 0,01, Figura B).

Descripcion detallada de la invencion

Inesperadamente, identificamos que SSEA4 y ST3GAL2, la enzima sintetizadora de SSEA4, son biomarcadores para la resistencia a la quimioterapia al cancer en un individuo. La expresion de SSEA4 y/o ST3GAL2 en/dentro de las celulas cancerosas puede usarse para la prediccion o estimacion de la respuesta al tratamiento quimioterapeutico de dichas celulas en un individuo en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales (RCC) humano y cancer de ovario humano si el biomarcador es SSEA4 y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano si el biomarcador es ST3GAL2 y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicho tratamiento quimioterapeutico son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la invencion proporciona el uso de SSEA4 y/o ST3GAL2 como biomarcadores para evaluar el resultado del tratamiento quimioterapeutico de un cancer en un individuo en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales (RCC) humano y cancer de ovario humano si el biomarcador es SSEA4 y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano si el biomarcador es ST3GAL2 y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicho tratamiento quimioterapeutico son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

La evaluacion puede ser de valor diagnostico.

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En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para la evaluacion del pronostico asociado a la resistencia a la quimioterapia en un individuo con cancer, el metodo comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra a analizar

b) detectar la expresion de SSEA4 en dicha muestra

En donde la expresion de SSEA4 en dicha muestra es indicativa de un mal pronostico y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales (RCC) humano y cancer de ovario humano y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicha quimioterapia son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Preferentemente, la expresion de SSEA4 en mas del 50 % de las celulas cancerosas de dicha muestra a analizar es indicativa de un mal pronostico.

Comprensiblemente, el metodo de la presente descripcion permite el pronostico asociado a la sensibilidad a la quimioterapia (buen pronostico) en un individuo con cancer en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales (RCC) humano y cancer de ovario humano si el biomarcador es SSEA4 y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicho tratamiento quimioterapeutico son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Este es el caso si solo muy pocas celulas, preferentemente ninguna celula, de la muestra a analizar presenta el biomarcador SSEA4.

La presencia o expresion de SSEA4 en las celulas cancerosas puede determinarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica adecuado para determinar la presencia o detectar la expresion de un biomarcador en celulas, tales como la tincion con un anticuerpo o un fragmento de este. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los metodos para la tincion de celulas con anticuerpos o fragmentos de estos se conocen bien en la tecnica, tales como citometna de flujo, inmunohistoqmmica o inmunocitoqmmica.

En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para la evaluacion del pronostico asociado a la resistencia a la quimioterapia en un individuo con cancer, el metodo comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra a analizar

b) detectar el nivel de expresion de ST3GAL2 en dicha muestra

c) comparar el nivel de expresion detectado con respecto a un nivel control

d) determinar dicho pronostico en base a la comparacion de c)

En donde el nivel control es un nivel control de buen pronostico y un aumento del nivel de expresion en comparacion con el nivel control se determina como un mal pronostico, y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano y cancer de ovario humano, y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicha quimioterapia son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Preferentemente, se determina un aumento del nivel de expresion de al menos el 50 % en comparacion con el nivel control como indicador de mal pronostico.

La expresion de ST3GAL2 se determina a nivel de ARNm o nivel de protema.

Comprensiblemente, se determina un aumento del nivel de expresion de menos de 50 % en comparacion con el nivel control como indicador de buen pronostico. El metodo de la presente descripcion permite el pronostico asociado a la sensibilidad a la quimioterapia (buen pronostico) en un individuo que tiene un cancer, en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano y cancer de ovario humano, y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicha quimioterapia son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Este es el caso si no es detectable un aumento del nivel de expresion de ST3GAL2 entre las celulas de la muestra a analizar y el nivel control.

En otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para la evaluacion del pronostico asociado a la resistencia a la quimioterapia en un individuo con cancer, el metodo comprende las etapas de

a) proporcionar una muestra a analizar

b) detectar el nivel de actividad de la protema ST3GAL2 en dicha muestra

c) comparar el nivel de actividad detectado con un nivel control

d) determinar dicho pronostico en base a la comparacion de c)

En donde el nivel control es un nivel control de buen pronostico y un aumento del nivel de actividad en comparacion con el nivel control se determina como un mal pronostico, y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano y cancer de ovario humano y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicha quimioterapia son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

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Preferentemente, se determina un aumento del nivel de actividad de al menos el 50 % en comparacion con el nivel control como indicador de mal pronostico.

La actividad de la protema ST3GAL2 se determina en el nivel de protema.

Comprensiblemente, se determina un aumento del nivel de actividad de menos del 50 % en comparacion con el nivel control como indicador de buen pronostico. El metodo de la presente descripcion permite el pronostico asociado a la sensibilidad a la quimioterapia (buen pronostico) en un individuo con cancer, en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano y cancer de ovario humano, y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicha quimioterapia son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Este es el caso si no es detectable un aumento del nivel de actividad de ST3GAL2 entre las celulas de la muestra a analizary el nivel control.

El tratamiento quimioterapeutico comprende la aplicacion de farmacos quimioterapeuticos que son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN. Con mayor preferencia, dicho tratamiento quimioterapeutico comprende la aplicacion de farmacos quimioterapeuticos seleccionados del grupo que consiste en cisplatino, mafosfamida, fluorouracilo/5-FU, doxorrubicina y docetaxel. Con la maxima preferencia, dicho tratamiento quimioterapeutico comprende la aplicacion de la combinacion de los farmacos quimioterapeuticos doxorrubicina/ciclofosfamida (A/C).

SSEA4 y/o ST3GAL2 son biomarcadores de pronostico significativos que indican la resistencia de las celulas cancerosas a la quimioterapia en un individuo, en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales humano (RCC) y cancer de ovario humano si el biomarcador es SSEA4 y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano y cancer de ovario humano si el biomarcador es ST3GAL2 y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicho tratamiento quimioterapeutico son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

Preferentemente, SSEA4 y/o ST3GAL2 son biomarcadores de pronostico significativos asociados a la resistencia a la quimioterapia en un individuo que tiene cancer de mama humano. Con mayor preferencia, SSEA4 y/o ST3GAL2 son biomarcadores de pronostico significativos que indican resistencia a la quimioterapia en un individuo con cancer de mama humano del subtipo "cancer de mama triple negativo".

La expresion del gen ST3GAL2 puede determinarse a nivel de acido nucleico, mediante el uso de metodos conocidos en la tecnica, tales como el analisis de hibridacion de transferencia de Northern, los ensayos de PCR basados en la transcripcion inversa, las micromatrices de ARN o las micromatrices de ADN. Ademas, la expresion puede determinarse a nivel de protema, es decir, mediante la medicion del nivel del polipeptido codificado por el gen ST3GAL2, o la actividad biologica de este (la smtesis de SSEA4). Dichos metodos se conocen bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, inmunoensayos tales como ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), transferencia de Western, inmunohistoqmmica, inmunocitoqmmica, ensayos basados en el recambio de sustrato o micromatrices de protemas.

Dado que SSEA4 es un sialilglicolfpido, la presencia de SSEA4 no puede medirse directamente al nivel de acido nucleico.

Definiciones

A menos que se especifique de cualquier otra manera, los terminos tecnicos y cientfficos usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que el conocido comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion.

En la presente descripcion, el termino "pronostico" se refiere a un pronostico del posible resultado asociado al exito de un tratamiento quimioterapeutico de un cancer en un individuo. En consecuencia, un pronostico menos favorable, negativo y malo se define por una resistencia de las celulas cancerosas al tratamiento quimioterapeutico, lo que da como resultado un termino de supervivencia o una tasa de supervivencia mas baja despues del tratamiento del individuo. A la inversa, un pronostico positivo, favorable o bueno se define por la sensibilidad de las celulas cancerosas al tratamiento quimioterapeutico, lo resulta en un termino de supervivencia o tasa de supervivencia despues del tratamiento elevada. Por lo tanto, un predictor de "mal pronostico" se asocia con un riesgo mayor de que un individuo que padece un cancer es o sera resistente a la quimioterapia aplicada para el tratamiento de dicho cancer. Por lo tanto, "buen pronostico" predice una probabilidad buena de que un paciente que padece un cancer es o sera sensible a la quimioterapia aplicada para el tratamiento de dicho cancer.

Los terminos "evaluar el pronostico" o "evaluar el resultado" se refieren a la capacidad de predecir, pronosticar o correlacionar una deteccion o medicion dada con un resultado futuro asociado con la respuesta al tratamiento quimioterapeutico del cancer del paciente.

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El presente metodo para la evaluacion del pronostico asociado a la resistencia a la quimioterapia de un cancer en un individuo se destina, entre otros, a usarse clmicamente para tomar decisiones concernientes a las modalidades de tratamiento, lo que incluye la intervencion quimioterapeutica, y los criterios de diagnostico, tales como la estadificacion de la enfermedad.

El termino "resistencia a la quimioterapia" significa que algunas de las celulas cancerosas de la muestra a analizar (al menos una celula) se resiste al efecto deseado del tratamiento quimioterapeutico.

El termino "sensibilidad al tratamiento quimioterapeutico" significa que las celulas cancerosas de la muestra a analizar son sensibles al efecto deseado del tratamiento quimioterapeutico.

La muestra usada para el presente metodo es una muestra biologica, preferentemente es una muestra derivada de un individuo que comprende tejido tumoral o celulas cancerosas. La muestra puede obtenerse de un individuo (paciente) en diversos puntos temporales, lo que incluye antes, durante y/o despues del tratamiento quimioterapeutico. Preferentemente, la muestra a analizar en el presente metodo se obtiene antes del tratamiento quimioterapeutico. Preferentemente, la muestra a analizar comprende una suspension de celulas individuales que comprende al menos 1 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % de celulas cancerosas. El tejido tumoral para la muestra a analizar puede generarse invasivamente a partir de un individuo que padece cancer y el tejido tumoral puede disociarse en una suspension celular mediante el uso de metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el tejido tumoral se disocia con el Kit de Disociacion de Tumor humano en combinacion con el disociador gentleMACS (ambos de Miltenyi Biotec GmbH). Despues de la disociacion, las celulas se resuspenden en un tampon para la citometna de flujo. Otros metodos para la generacion de la muestra estan disponibles en la tecnica y mas abajo se proporcionan ejemplos adicionales. Como alternativa al analisis de citometna de flujo, puede usarse inmunohistoqmmica o inmunocitoqmmica para la deteccion de la expresion de SSEA4 y/o ST3GAL2 con o sin disociacion previa del tejido.

Preferentemente, estas celulas son viables. Pero, estas celulas pueden ser tambien celulas fijadas que pueden usarse para la extraccion posterior de acidos nucleicos o protemas. La invencion se ilustra principalmente mediante el aislamiento de tejido tumoral humano que se ha implantado en ratones. Sin embargo, abarca el aislamiento del tejido tumoral en general, por ejemplo, directamente de pacientes humanos que padecen de un cancer.

Todos los metodos disponibles en la tecnica para "detectar la expresion", "detectar el nivel de expresion" o "detectar el nivel de actividad" de biomarcadores se abarcan en la presente descripcion. La expresion de un biomarcador de la invencion puede detectarse a nivel de acido nucleico o a nivel de protema (ambos para ST3GAL2) o a nivel de glicolfpidos (SSEA4). Por "deteccion de expresion", "deteccion del nivel de expresion" o "deteccion del nivel de actividad" se pretende determinar la cantidad o la presencia de un biomarcador. Por lo tanto, "deteccion de expresion", "deteccion del nivel de expresion" o "deteccion del nivel de actividad" abarca los casos donde se determina que un biomarcador no se expresa, no se expresa detectablemente, se expresa a un nivel bajo, se expresa a un nivel normal, o se sobreexpresa. Para determinar la sobreexpresion, la muestra a analizar puede compararse con una muestra correspondiente que se origina a partir de una persona sana o de un tejido sano del mismo paciente. Es decir, el nivel "normal" de expresion es el nivel de expresion del biomarcador en, por ejemplo, una muestra de tejido mamario de un individuo no afectado por cancer de mama o region no infiltrada por el tejido tumoral (nivel control). Dicha muestra puede presentarse en una forma estandarizada. En algunas modalidades, la determinacion de la (sobre)expresion de biomarcadores no requiere comparacion entre la muestra a analizar y una muestra correspondiente (nivel control). Por ejemplo, la deteccion de la expresion de un biomarcador tal como el SSEA4, indicativo de un pronostico de resistencia al tratamiento quimioterapeutico de un cancer en un individuo, puede precluir la necesidad de comparacion con una muestra correspondiente (nivel control) que, por ejemplo, se origina de una persona sana o tejido sano de un paciente. Los metodos para la "deteccion de expresion", "deteccion del nivel de expresion" o "deteccion del nivel de actividad" de los biomarcadores de la invencion comprenden cualesquiera metodos que determinen la cantidad o la presencia de los biomarcadores ya sea a nivel de acido nucleico o a nivel de protema o a nivel de glicolfpidos. Dichos metodos se conocen bien en la tecnica e incluyen, pero no se limitan a, transferencias de Western, transferencias de Northern, transferencias de Southern, ELISA, inmunoprecipitacion, inmunofluorescencia, citometna de flujo, inmunohistoqmmica, tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos, metodos de transcripcion inversa de acidos nucleicos y metodos de amplificacion de acidos nucleicos. Los metodos para detectar el nivel de actividad de las protemas tambien se conocen bien en la tecnica, tales como ELISA o ensayos basados en el recambio de sustrato.

Un "nivel control" normal es un perfil de expresion de biomarcadores tal como el gen ST3GAL2, que se encuentra tfpicamente en una poblacion celular de un individuo que se sabe que no padece cancer o en tejido sano de un paciente. Un aumento en el nivel de expresion del biomarcador, tal como el gen ST3GAL2, en una muestra a analizar de un individuo que padece un cancer (paciente) en comparacion con la expresion de una muestra control normal, indica una probabilidad elevada de resistencia a la quimioterapia (mal pronostico) para el cancer.

Por ejemplo, un aumento en los niveles de expresion de ST3GAL2 de al menos 10 %, al menos 25 %, al menos 50 %, al menos 75 %, al menos 100 % o mas indica el mal pronostico.

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La diferencia entre los niveles de expresion de la muestra a analizar de un paciente y el nivel control puede normalizarse al nivel de expresion de los acidos nucleicos controles, por ejemplo, los genes de mantenimiento, cuyos niveles de expresion se sabe que no difieren en dependencia del estado canceroso o no canceroso de la celula. Los genes control ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, beta-actina, gliceraldehndo 3 fosfato deshidrogenasa y protema ribosomal P1.

Para el metodo de evaluacion del pronostico asociado a la resistencia o sensibilidad a la quimioterapia en un individuo que tiene un cancer mediante el uso del biomarcador SSEA4, en general, la presencia de SSEA4 en las celulas cancerosas en la muestra a analizar indica la resistencia de estas celulas a la quimioterapia. A un umbral de 50 % o mas de celulas entre la fraccion de celulas cancerosas en la muestra que porta el SSEA4 en la superficie celular, la prediccion de resistencia contra la quimioterapia para la malignidad espedfica en investigacion es extremadamente mala (ver ejemplo 2).

El termino "tumor" se conoce medicamente como neoplasia. No todos los tumores son cancerosos: los tumores benignos no invaden los tejidos vecinos y no se diseminan por todo el cuerpo.

El termino "cancer" se conoce medicamente como neoplasia maligna. El cancer es un grupo amplio de enfermedades que involucran el crecimiento celular no regulado. En el cancer, las celulas se dividen y crecen descontroladamente, forman tumores malignos e invaden las partes cercanas del cuerpo. Ademas, el cancer puede diseminarse a partes mas distantes del cuerpo a traves del sistema linfatico o del torrente sangumeo. Existen mas de 200 canceres conocidos diferentes que afectan a los humanos.

Los terminos "quimioterapia" o "tratamiento quimioterapeutico" se refieren al tratamiento del cancer (celulas cancerosas) con uno o mas farmacos antineoplasicos citotoxicos ("agentes quimioterapeuticos" o "farmacos quimioterapeuticos") como parte de un regimen estandarizado. La quimioterapia puede administrarse con una intencion curativa o puede tener como objetivo prolongar la vida o aliviar los smtomas. A menudo se usa junto con otros tratamientos para el cancer, tales como radioterapia, cirugfa y/o terapia de hipertermia. Los agentes quimioterapeuticos tradicionales actuan mediante la destruccion de las celulas que se dividen rapidamente, una de las propiedades principales de la mayona de las celulas cancerosas. Esto significa que la quimioterapia dana ademas las celulas que se dividen rapidamente en circunstancias normales: celulas en la medula osea, tracto digestivo y folmulos pilosos. Esto resulta en los efectos secundarios mas comunes de la quimioterapia: mielosupresion (disminucion de la produccion de celulas sangumeas, por lo tanto tambien inmunosupresion), mucositis (inflamacion del revestimiento del tracto digestivo) y alopecia (perdida del cabello).

Algunos farmacos contra el cancer mas nuevos (por ejemplo, diversos anticuerpos monoclonales) no son citotoxicos indiscriminadamente, sino que mas bien se dirigen a protemas que se expresan anormalmente en las celulas cancerosas y que son esenciales para su crecimiento. Dichos tratamientos con frecuencia se denominan "terapia dirigida" (a diferencia de la quimioterapia clasica) y con frecuencia se usan conjuntamente con los agentes quimioterapeuticos tradicionales en los regfmenes de tratamiento antineoplasico.

Los tipos de farmacos quimioterapeuticos clasicos a los que se refieren los terminos "farmacos quimioterapeuticos" y "quimioterapia", como se usa en la presente, son:

Agentes alquilantes: Los agentes alquilantes son el grupo mas antiguo de quimioterapeuticos en uso hoy en dfa. Se llaman asf debido a su capacidad para alquilar muchas moleculas, lo que incluye las protemas, el ARN y el ADN. Esta capacidad para unirse covalentemente al ADN o ARN a traves de su grupo alquilo es la causa principal de sus efectos contra el cancer. Esto conduce a una forma de muerte celular programada llamada apoptosis. Los agentes alquilantes funcionaran en cualquier punto del ciclo celular y, por lo tanto, se conocen como farmacos independientes del ciclo celular. Por esta razon, el efecto sobre la celula depende de la dosis; la fraccion de celulas que mueren es proporcional directamente a la dosis de farmaco. Los subtipos de agentes alquilantes son las mostazas nitrogenadas, nitrosoureas, tetrazinas, aziridinas, cisplatinos y derivados, y agentes alquilantes no clasicos. Las mostazas nitrogenadas incluyen mecloretamina, ciclofosfamida, melfalan, clorambucilo, ifosfamida y busulfan. Las nitrosoureas incluyen N-nitroso-N- metilurea (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) y semustina (MeCCNU), fotemustina y estreptozotocina. Las tetrazinas incluyen dacarbazina, mitozolomida y temozolomida. Las aziridinas incluyen tiotepa, micomicina y diaziquona (AZQ). El cisplatino y sus derivados incluyen cisplatino, carboplatino y oxaliplatino. Ellos deterioran la funcion celular mediante la formacion de enlaces covalentes con los grupos amino, carboxilo, sulfhidrilo y fosfato en moleculas importantes biologicamente. Los agentes alquilantes no clasicos incluyen procarbazina y hexametilmelamina. La mafosfamida es un agente alquilante oxazafosforina (similar a la ciclofosfamida) que se investiga como farmaco quimioterapeutico.

Antimetabolitos: Los terminos "antimetabolitos" e "inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN", como se usan en la presente descripcion, tienen un significado intercambiable y se definen como un grupo de moleculas que impiden la smtesis de ADN y ARN. Muchos de ellos tienen una estructura similar a las unidades estructurales de ADN y ARN. Los antimetabolitos se parecen a nucleobases o nucleosidos, pero tienen grupos qrnmicos alterados. Estos farmacos ejercen su efecto ya sea mediante el bloqueo de las enzimas requeridas para la smtesis de ADN o mediante su incorporacion al ADN o ARN. Mediante la inhibicion de las enzimas involucradas en la smtesis de ADN, estos impiden la mitosis porque el ADN no puede duplicarse a sf mismo. Ademas, despues de la incorporacion erronea de las moleculas

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en el ADN, puede producirse dano en el ADN y se induce la muerte celular programada (apoptosis). A diferencia de los agentes alquilantes, los antimetabolitos son dependientes del ciclo celular. Esto significa que solo funcionan durante una parte espedfica del ciclo celular, en este caso la fase S (la fase de smtesis del ADN). Por esta razon, a una determinada dosis, se produce el efecto meseta y proporcionalmente no se produce mas muerte celular con el aumento de las dosis. Los subtipos de los antimetabolitos son los antifolatos, fluoropirimidinas, analogos de desoxinucleosidos y tiopurinas. Los antifolatos incluyen metotrexato y pemetrexed. Las fluoropirimidinas incluyen fluorouracilo y capecitabina. El fluorouracilo es un analogo de nucleobases que se metaboliza en las celulas para formar al menos dos productos activos: 5-fluourouridina monofosfato (FUMP) y 5-fluoro-2'-deoxiuridina 5'-fosfato (fdUMP). La FUMP se incorpora al ARN y la fdUMP inhibe la enzima timidilato sintasa; ambas conducen a la muerte celular. La capecitabina es un profarmaco de 5-fluorouracilo que se descompone en las celulas para producir el farmaco activo. Los analogos de desoxinucleosidos incluyen citarabina, gemcitabina, decitabina, vidaza, fludarabina, nelarabina, cladribina, clofarabina y pentostatina. Las tiopurinas incluyen tioguanina y mercaptopurina.

Agentes antimicrotubulos: Los agentes antimicrotubulos son productos qmmicos derivados de plantas que bloquean la division celular al impedir la funcion de los microtubulos. Los alcaloides de la vinca y los taxanos son los dos grupos principales de agentes antimicrotubulos. Los alcaloides de la vinca impiden la formacion de los microtubulos, mientras que los taxanos impiden el desmontaje de los microtubulos. Al hacer esto, impiden que las celulas cancerosas completen la mitosis. Despues de esto, se produce la detencion del ciclo celular, lo cual induce la muerte celular programada (apoptosis). Los alcaloides de la vinca se derivan del bfgaro de Madagascar, Catharanthus roseus. Los taxanos son farmacos naturales y semisinteticos. El primer farmaco de su clase, paclitaxel, se extrajo originalmente del arbol de tejo del Padfico, Taxus brevifolia. Ahora, este farmaco y otro de esta clase, docetaxel, se producen semisinteticamente a partir de un qmmico que se encuentra en la corteza de otro arbol de tejo: Taxus baccata. Estos farmacos promueven la estabilidad de los microtubulos, lo que impide su desmontaje. Docetaxel ejerce su efecto durante la fase S.

Inhibidores de la topoisomerasa: Los inhibidores de la topoisomerasa son farmacos que afectan la actividad de dos enzimas: topoisomerasa I y topoisomerasa II. Cuando la helice bicatenaria del ADN se desenrolla, por ejemplo, durante la replicacion o traslacion del ADN, el ADN adyacente sin abrir se tensa (superenrolla), como cuando se abre la mitad de una cuerda torcida. El estres causado por este efecto se ayuda en parte por las enzimas topoisomerasas. Estas producen roturas monocatenarias o bicatenarias en el ADN, lo que reduce la tension en la cadena de ADN. Esto permite que se produzca el desenrollamiento normal del ADN durante la replicacion o la traduccion. La inhibicion de la topoisomerasa I o II interfiere con ambos procesos. Dos inhibidores de la topoisomerasa I, el irinotecan y el topotecan, se derivan semisinteticamente de la camptotecina, la cual se obtiene del arbol ornamental chino Camptotheca acuminata. Los farmacos que tienen como objetivo a la topoisomerasa II pueden dividirse en dos grupos. Los venenos de la topoisomerasa II causan niveles elevados de enzimas unidas al ADN. Esto impide la replicacion y traduccion del ADN, causa roturas de la cadena de ADN y conduce a la muerte celular programada (apoptosis). Estos agentes incluyen etoposido, doxorrubicina, mitoxantrona y teniposido. El segundo grupo, los inhibidores cataltticos, son farmacos que bloquean la actividad de la topoisomerasa II y, por lo tanto, impiden la smtesis y traduccion del ADN porque el ADN no puede desenrollarse correctamente. Este grupo incluye novobiocina, merbarona y aclarrubicina.

Antibioticos citotoxicos: Los antibioticos citotoxicos son un grupo variado de farmacos que tienen diversos mecanismos de accion. El grupo incluye las antraciclinas y otros farmacos, lo que incluye actinomicina, bleomicina, plicamicina y mitomicina. La doxorrubicina y la daunorrubicina fueron las dos primeras antraciclinas, y se obtuvieron a partir de la bacteria Streptomyces peucetius. Los derivados de estos compuestos incluyen epirrubicina e idarrubicina. Otros farmacos usados clmicamente en el grupo de la antraciclina son pirarrubicina, aclarrubicina y mitoxantrona. Los mecanismos de las antraciclinas incluyen el intercalamiento del ADN (insercion de moleculas entre las dos cadenas de ADN), la generacion de radicales libres altamente reactivos que danan las moleculas intercelulares, y la inhibicion de la topoisomerasa. La actinomicina es una molecula compleja que intercala el ADN e impide la smtesis de ARN. La bleomicina, un glucopeptido aislado de Streptomyces verticillus, tambien intercala el ADN, pero produce radicales libres que danan el ADN. Esto se produce cuando la bleomicina se une a un ion metalico, se reduce qmmicamente y reacciona con el oxfgeno. La mitomicina es un antibiotico citotoxico con la capacidad de alquilar el ADN.

La quimioterapia combinada implica tratar a un paciente con varios farmacos diferentes simultaneamente. Las farmacos difieren en su mecanismo y efectos secundarios. La mayor ventaja es minimizar las posibilidades de que se desarrolle resistencia a cualquier agente. Ademas, los farmacos a menudo pueden usarse en dosis mas bajas, lo que reduce la toxicidad. Un ejemplo prominente es la combinacion de doxorrubicina y ciclofosfamida (A/C).

La "resistencia a la quimioterapia" se produce cuando el tratamiento no inhibe o destruye las celulas cancerosas, al menos a la concentracion aplicada. En otras palabras, las celulas cancerosas resisten los efectos de la quimioterapia. El termino "sensibilidad a la quimioterapia" tiene un significado correspondiente.

El termino "biomarcador" o "marcador" se difunde mucho en la tecnica y puede denotar ampliamente una molecula biologica y/o una porcion detectable de esta (por ejemplo, un acido nucleico, un peptido o un lfpido tal como un glicolfpido) cuya evaluacion cualitativa y/o cuantitativa en un individuo es predictiva o informativa (por ejemplo, predictiva, diagnostica y/o pronostica) con respecto a uno o mas aspectos del fenotipo y/o genotipo del individuo, tal como, por ejemplo, con respecto al estado del individuo. Por ejemplo, el biomarcador es predictivo o informativo con

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respecto al resultado del tratamiento quimioterapeutico de un cancer en un individuo. Se expresa un biomarcador ("expresion del biomarcador") si el biomarcador es detectable con metodos conocidos en la tecnica. Por lo tanto, la expresion de biomarcadores abarca no solo la expresion a nivel de acido nucleico (ADN y/o ARN) y a nivel de protema, sino tambien la expresion (presencia) de otras estructuras biologicas en o dentro de las celulas, tales como los glicolfpidos o la actividad de una protema.

Como se usa en la presente descripcion, los terminos "paciente" e "individuo" se usan de manera intercambiable para referirse a un animal. Preferentemente, el individuo es un mairnfero tal como raton, rata, vaca, cerdo, cabra, gallina, perro, mono o humano. Con mayor preferencia, el individuo es un ser humano.

El termino "etiqueta" como se usa en la presente descripcion se refiere al acoplamiento del fragmento de union a antigeno, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de este, a otras moleculas, por ejemplo, partmulas, enzimas o fragmentos de enzimas (para la deteccion basada en enzimas de la union a anticuerpos), fluoroforos, haptenos como la biotina, o superficies mas grandes, tales como placas de cultivo y placas de microtitulacion. En algunos casos, el acoplamiento resulta en la inmovilizacion directa del fragmento de union a antfgeno, por ejemplo, si el fragmento de union a antfgeno se acopla a una superficie mas grande de una placa de cultivo. En otros casos este acoplamiento

resulta en la inmovilizacion indirecta, por ejemplo, un fragmento de union a antfgeno acoplado directa o indirectamente (a traves de, por ejemplo, biotina) a una perla magnetica se inmoviliza si dicha perla se retiene en un campo magnetico. En otros casos, el acoplamiento del fragmento de union a antfgeno a otras moleculas no resulta en una inmovilizacion directa o indirecta, pero permite el enriquecimiento, la separacion, el aislamiento y la deteccion de celulas de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, si el fragmento de union a antfgeno se acopla a un fluoroforo, lo cual permite despues discriminar entre celulas marcadas y celulas no marcadas, por ejemplo, a traves de metodos de citometna de flujo, como FACSorting, o microscopfa de fluorescencia.

El termino "fragmento de union a antfgeno" como se usa en la presente descripcion se refiere a cualquier resto que se une preferentemente a la molecula objetivo deseada de la celula, es decir, el antfgeno.

El termino "resto" comprende, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

El termino "anticuerpo", como se usa en la presente descripcion, se refiere a anticuerpos policlonales o monoclonales, los cuales pueden generarse mediante metodos que se conocen bien por los expertos en la tecnica. El anticuerpo puede ser de cualquier especie, por ejemplo, murino, de rata, oveja y humano. Para fines terapeuticos, si van a usarse fragmentos de union a antfgeno no humanos, estos pueden humanizarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Ademas, los anticuerpos pueden ser anticuerpos modificados (por ejemplo, oligomeros, anticuerpos reducidos, oxidados y marcados).

El termino "anticuerpo" comprende tanto moleculas intactas como fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Adicionalmente, el termino "fragmento de union al antfgeno" incluye cualquier resto diferente de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen preferentemente a la molecula objetivo deseada de la celula. Los restos adecuados incluyen, sin limitacion, oligonucleotidos conocidos como aptameros que se unen a moleculas objetivo deseadas, carbohidratos, lectinas o cualquier otra protema de union a antfgeno (por ejemplo, interaccion receptor-ligando). El enlace (acoplamiento) entre el anticuerpo y la etiqueta o partmula puede ser covalente o no covalente. Un enlace covalente puede ser, por ejemplo, el enlace a grupos carboxilo en perlas de poliestireno, o a grupos NH2 o SH2 en perlas modificadas. Un enlace no covalente es, por ejemplo, a traves de biotina-avidina o una partmula acoplada a fluoroforo unida al anticuerpo antifluoroforo. Los metodos para acoplar anticuerpos a partmulas, fluoroforos, haptenos como la biotina o superficies mas grandes, tales como placas de cultivo, se conocen bien por los expertos en la tecnica.

Modalidades

En una modalidad de la presente descripcion, se logra una muestra a analizar mediante una biopsia, por ejemplo, una biopsia por puncion, un aspirado con aguja fina, o una extirpacion quirurgica del tumor o partes del tumor. Despues, la muestra se procesa por disociacion a una suspension de celulas individuales para medir la expresion de SSEA4 o ST3GAL2 o la actividad de ST3GAL2. Como una alternativa, la muestra se fija y puede o no usarse para preparar secciones, por ejemplo, secciones fijadas en formalina, embebidas en parafina (FFPE, por sus siglas en ingles), antes de medir la expresion de SSEA4 o ST3GAL2. Como una alternativa, la muestra se lisa directamente para aislar acidos nucleicos o protemas a partir de la muestra para medir la expresion de SSEA4 o ST3GAL2. En todos los casos, el procesamiento de la muestra puede o no puede contener una etapa de separacion de celulas, por ejemplo, por citometna de flujo de clasificacion magnetica. La separacion celular o el enriquecimiento celular de celulas cancerosas puede realizarse mediante el uso de fragmentos de union a antfgeno (anticuerpos) contra marcadores tumorales tales como EPCAM, CD34, CD99, CD117, CA15-3, MUC16, MUC1, ErbB2/HER2, PSMA o MCSP.

En una modalidad de la presente descripcion, se proporciona una muestra a analizar de un paciente que padece un cancer, es decir, cancer de mama humano. La determinacion de la presencia (expresion) de SSEA4 en la muestra de prueba se realiza mediante el uso de un fragmento de union a antigeno, tal como un anticuerpo monoclonal contra

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SSEA4, el cual se marca con una etiqueta tal como un fluoroforo. La presencia (deteccion) de SSEA4 en las celulas de la muestra a analizar, determinada, por ejemplo, por citometna de flujo o microscop^a de fluorescencia, es indicativa de un mal pronostico asociado con la resistencia a la quimioterapia, es decir, el cancer de mama del paciente es resistente al tratamiento quimioterapeutico, tal como A/C.

En una modalidad, la muestra de prueba indica que mas del 50 % de las celulas cancerosas expresan SSEA4. En tal caso, el paciente tiene un riesgo alto de que el tumor sea resistente a la quimioterapia.

En una modalidad de la presente descripcion, se proporciona una muestra a analizar de un paciente que padece un cancer, es decir, RCC. La deteccion del nivel de expresion (a nivel de protema) de ST3GAL2 en la muestra de prueba se realiza mediante el uso de un fragmento de union a antigeno tal como un anticuerpo monoclonal contra ST3GAL2, el cual se marca con una etiqueta tal como un fluoroforo. Las celulas de la muestra se permeabilizan y se marcan con el anticuerpo anti-ST3GAL2. Las celulas de un individuo que no padece ningun cancer se usan como celulas de referencia. Como una alternativa, el tejido sano del paciente se usa como referencia. Ademas, estas celulas son permeabilizadas y marcadas con el anticuerpo anti-ST3GAL2. El nivel de expresion de ST3GAL2 en estas celulas de referencia se usa como nivel control. Un aumento del nivel de expresion (nivel de protema) de ST3GAL2 en las celulas de la muestra a analizar en comparacion con el nivel de expresion (nivel de protema) de ST3GAL2 de las celulas de referencia (nivel control), determinado, por ejemplo, por citometna de flujo, es indicativo de un mal pronostico, es decir, el RCC del paciente es resistente al tratamiento quimioterapeutico, tal como A/C.

En una modalidad, la muestra de prueba indica un aumento del nivel de expresion (nivel de protema) de ST3GAL2 de las celulas cancerosas en mas del 50 % en comparacion con el nivel control (celulas de referencia). En tal caso, el paciente tiene un riesgo alto de que el tumor sea resistente a la quimioterapia.

En una modalidad de la presente descripcion, se proporciona una muestra a analizar de un paciente que padece un cancer, es decir, cancer de ovario. La deteccion del nivel de expresion (en el nivel de acido nucleico) de ST3GAL2 en la muestra de prueba se realiza, por ejemplo, mediante el uso de analisis de hibridacion de transferencia de Northern, ensayos de PCR basados en transcripcion inversa, micromatrices de ARN o micromatrices de ADN. Las celulas de la muestra se lisan y los acidos nucleicos, por ejemplo, ARNm o ARN total, se afslan. En algunos ensayos, esta etapa de aislamiento puede no ser necesaria, por ejemplo, PCR directa sobre las celulas lisadas. Las celulas de un individuo que no padece ningun cancer se usan como celulas de referencia. Como una alternativa, el tejido sano del paciente se usa como referencia y los acidos nucleicos, por ejemplo, ARNm o ARN total, se afslan. En algunos ensayos, esta etapa de aislamiento puede no ser necesaria, por ejemplo, PCR directa sobre las celulas lisadas. El nivel de expresion de ST3GAL2 en estas celulas de referencia se usa como nivel control. Un aumento del nivel de expresion (nivel de acido nucleico) de ST3GAL2 en las celulas de la muestra a analizar en comparacion con el nivel de expresion (nivel de acido nucleico) de ST3GAL2 de las celulas de referencia (nivel control), determinado, por ejemplo, por PCR, es indicativo de un mal pronostico, es decir, el cancer de ovario del paciente es resistente al tratamiento quimioterapeutico, tal como A/C.

En una modalidad, la muestra de prueba indica un aumento del nivel de expresion (nivel de acido nucleico) de ST3GAL2 de las celulas cancerosas en mas del 50 % en comparacion con el nivel control (celulas de referencia). En tal caso, el paciente tiene un riesgo alto de que el tumor sea resistente a la quimioterapia.

En una modalidad de la presente descripcion, se proporciona una muestra a analizar de un paciente que padece un cancer, es decir, cancer de mama. La deteccion del nivel de expresion (en el nivel de lfpidos o protemas) de SSEA4 o ST3GAL2 en la muestra de prueba se realiza, por ejemplo, mediante el uso de analisis de hibridacion de transferencia de Western, ELISA, o micromatrices de protemas. Las celulas de la muestra se lisan y las protemas se afslan. En algunos ensayos, esta etapa de aislamiento puede no ser necesaria, por ejemplo, analisis directo de las celulas lisadas. Las celulas de un individuo que no padece ningun cancer se usan como celulas de referencia. Como una alternativa, el tejido sano del paciente se usa como referencia y las protemas se afslan. En algunos ensayos, esta etapa de aislamiento puede no ser necesaria, por ejemplo, analisis directo de las celulas lisadas. El nivel de expresion de SSEA4 o ST3GAL2 en estas celulas de referencia se usa como nivel control. Un aumento del nivel de expresion de SSEA4 o ST3GAL2 en las celulas de la muestra a analizar en comparacion con el nivel de expresion de SSEA4 o ST3GAL2 de las celulas de referencia (nivel control), determinado por ejemplo, por ELISA, es indicativo de un mal pronostico, es decir, el cancer de mama del paciente es resistente al tratamiento quimioterapeutico tal como A/C.

En una modalidad, la muestra de prueba indica un aumento del nivel de expresion de SSEA4 o ST3GAL2 de las celulas cancerosas de mas del 50 % en comparacion con el nivel control (celulas de referencia). En tal caso, el paciente tiene un riesgo alto de que el tumor sea resistente a la quimioterapia.

En una modalidad de la presente descripcion, se proporciona una muestra a analizar de un paciente que padece un cancer, es decir, cancer de mama. La deteccion del nivel de actividad de ST3GAL2 en la muestra de prueba se realiza, por ejemplo, por ELISA o ensayos de recambio de sustrato. Las celulas de la muestra se lisan y las protemas se afslan. En algunos ensayos, esta etapa de aislamiento puede no ser necesaria, por ejemplo, analisis directo de las celulas lisadas. Las celulas de un individuo que no padece ningun cancer se usan como celulas de referencia. Como una alternativa, el tejido sano del paciente se usa como referencia y las protemas se afslan. En algunos ensayos, esta etapa

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En una modalidad, la muestra de prueba indica un aumento del nivel de actividad de ST3GAL2 de las celulas cancerosas de mas del 50 % en comparacion con el nivel control (celulas de referencia). En tal caso, el paciente tiene un riesgo alto de que el tumor sea resistente a la quimioterapia.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se destinan a una explicacion mas detallada de la invencion pero sin restringir la invencion a estos ejemplos.

Ejemplo 1: La expresion de 23 marcadores de superficie celular en xenoinjertos de cancer de mama derivados de pacientes se afecta por el tratamiento quimioterapeutico

Se realizo un cribado de anticuerpos para identificar nuevos biomarcadores de superficie celular para subpoblaciones de cancer de mama que muestran un aumento de la resistencia al tratamiento quimioterapeutico. El cribado se baso en una biblioteca de 45 anticuerpos dirigidos contra protemas de superficie humanas (Tabla 1).

Estos candidatos a anticuerpos se han seleccionado en base a nuestra experiencia para expresarse en subpoblaciones de celulas tumorales. Se injertaron piezas de tejido de tumor de mama derivado del paciente en una cohorte de ratones (50 a 100 animales por modelo de tumor). Se demostro que estos modelos tumorales conservan la morfologfa, las caractensticas moleculares y el perfil de respuesta farmacologica de los tumores originales del paciente (Marangoni y otros, Clin Cancer Res 13, 3989 - 3998 (2007)). Tras el establecimiento estable de los tumores (etapa de pretratamiento), indicado por volumenes de tumor de 150-350 mm3, comenzamos el tratamiento mediante el uso de una combinacion de doxorrubicina/ciclofosfamida (A/C) de cuidado estandar. Despues de que el tumor se redujo a volumenes de 14 - 63 mm3, se extirparon los nodulos (etapa de tumores residuales). El mismo dfa, se extirparon los tumores de los ratones no tratados (etapa sin tratamiento) para servir como controles directos. Ademas, se mantuvo un grupo de animales con tumores residuales hasta que la enfermedad recayo a volumenes similares a los de la etapa de pretratamiento (etapa de rebrote, Figura 1). Despues de extirpar los tumores en los puntos temporales espedficos, el tejido se disocio suavemente para obtener una suspension de celulas individuales mientras se preservaban los epftopos de la superficie celular para excluir un sesgo inducido por el protocolo. Subsecuentemente, la muestra se tino para los marcadores espedficos de raton para excluir las celulas de origen murino del analisis, asf como tambien para los candidatos de cribado y se analizo mediante citometna de flujo multiparametrica (Figura 2). Los tumores de cuatro pacientes con cancer de mama diferentes se analizaron independientemente. En total, la expresion de 13 marcadores (2 a 9 por modelo de tumor) se enriquecio y la expresion de 10 marcadores (1 a 5 por modelo de tumor) disminuyo durante la quimioterapia (Figura 3). Interesantemente, el 87 % (20 de 23) de estos marcadores regreso a su nivel de expresion basal como se observo en la etapa sin tratamiento tras la regresion de la enfermedad (etapa de rebrote, Figura 3).

Tabla 1: Anticuerpos usados para el abordaje del cribado

Antigeno

Clon Vendedor Tftulo

AN2/MCSP

1E6.4 Miltenyi Biotec 1:11

ABCB5

IgG de conejo policlonal Bioss 1:50

CaSR

IgG de conejo policlonal Enzo Life Science 1:50

CD9

M-L13 BD Biosciences 1:11

CD10

97C5 Miltenyi Biotec 1:11

CD15/SSEA1

VIMC6 Miltenyi Biotec 1:11

CD20

LT20 Miltenyi Biotec 1:11

CD24

32D12 Miltenyi Biotec 1:11

CD26

FR 10-11G9 Miltenyi Biotec 1:11

CD34

AC136 Miltenyi Biotec 1:11

CD38

IB6 Miltenyi Biotec 1:11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CD44

DB105 Miltenyi Biotec 1:11

CD49a

TS/27 BioLegend 1:20

CD49b

Y418 eBioscience 1:20

CD49c

ASC-1 BioLegend 1:20

CD49d

MZ18-24A9 Miltenyi Biotec 1:11

CD49e

NKI-SAM1 Miltenyi Biotec 1:11

CD49f

GoH3 Miltenyi Biotec 1:11

CD61

Y2/51 Miltenyi Biotec 1:11

CD66 (a,c,d,e)

TET2 Miltenyi Biotec 1:11

CD71

AC102 Miltenyi Biotec 1:11

CD90

DG3 Miltenyi Biotec 1:11

CD105 (Endoglina)

43A4E1 Miltenyi Biotec 1:11

CD117

AC126 Miltenyi Biotec 1:11

CD122

Tu27 BioLegend 1:11

CD133/1

W6B3C1 Miltenyi Biotec 1:11

CD133/2

293C3 Miltenyi Biotec 1:11

CD138

B-B4 Miltenyi Biotec 1:11

CD146

541-10B2 Miltenyi Biotec 1:11

CD166

3A6 BioLegend 1:6

CD271 (Receptor NGF)

ME20.4-1.H4 Miltenyi Biotec 1:11

CD309 (KDR/VEGF-R2)

ES8-20E6 Miltenyi Biotec 1:11

CD324 (Ecad)

67A4 Miltenyi Biotec 1:11

CD325 (Ncad)

8C11 eBioscience 1:11

CD326 (EpCAM)

HEA-125 Miltenyi Biotec 1:11

CD338 (ABCG2)

5D3 BD Biosciences 1:20

CD340 (Her2/neu)

24D2 BioLegend 1:20

DRD5

IgG de conejo policlonal Bioss 1:100

Lgr5 DA03

DA03 Miltenyi Biotec 1:11

ROR1

2A2 Miltenyi Biotec 1:11

Sca1

D7 Miltenyi Biotec 1:11

SSEA4

REA101 Miltenyi Biotec 1:11

TGFbetaR

IgG de cabra policlonal BD Biosciences 1:11

TRA-1-60

REA157 Miltenyi Biotec 1:11

TRA-1-81

REA246 Miltenyi Biotec 1:11

El porcentaje de celulas que expresan CD146 se redujo en tres de cada cuatro modelos tumorales, lo que indica que es la subpoblacion mas sensible atacada durante el tratamiento de A/C. Sorprendentemente, identificamos una subpoblacion de celulas tumorales que expresan el antigeno embrionario 4 espedfico de estadio (SSEA4) que se enriquecio fuertemente durante el tratamiento quimioterapeutico en todos los modelos tumorales analizados. Tanto CD44 como CD133, para los cuales ya se ha descrito una correlacion con un fenotipo de celulas madre cancerosas y resistencia a farmacos, solo mostraron enriquecimiento en uno de los cuatro modelos.

Ejemplo 2: SSEA4 es un marcador para celulas resistentes al tratamiento quimioterapeutico

Para investigar mas a fondo la importancia de la expresion de SSEA4 durante el tratamiento del cancer de mama, repetimos el analisis de este marcador en tres de los modelos tumorales. Ademas, incluimos la etapa de pretratamiento

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

en el analisis para excluir cualquier cambio que pudiera inducirse por el punto temporal o el tamano global del tumor. El numero de celulas positivas para SSEA4 se enriquecio significativamente (p < 0,001, n = 8) tras el tratamiento con A/C en todos los tumores analizados (Figura 4). Ademas, en tres de cada cuatro modelos tumorales, la fraccion de celulas positivas se redujo a los niveles basales despues de que el tratamiento se detuvo y los tumores recayeron. En el modelo de tumor HBCx-17 observamos una sensibilidad reducida intrmseca para el tratamiento con A/C en 19 animales y un tumor que no respondio en absoluto al tratamiento. Interesantemente, la cantidad de celulas positivas para SSEA4 aumento en estos tumores mas resistentes (42,2 %) y totalmente resistentes (98,5 %) en comparacion con los tumores sensibles (36,8 %) en la etapa de rebrote (datos no mostrados). Para evaluar si la resistencia intrmseca conocida de otros modelos tumorales se correlaciona tambien con la frecuencia de la poblacion de celulas tumorales positivas para SSEA4, comparamos tumores de pacientes que son sensibles (n = 6) o resistentes (n = 4) al tratamiento con A/C. Sorprendentemente, tres de los cuatro modelos tumorales resistentes mostraron porcentajes mas altos de celulas positivas para SSEA4 que todos los seis tumores sensibles (Figura 5). En dos de los modelos tumorales resistentes, casi todas las celulas expresaron SSEA4. Para evaluar si esta observacion se limita al cancer de mama o puede ser mas general, analizamos el carcinoma de celulas renales de celulas claras (RCC), una entidad tumoral independiente que se muestra resistente intrmsecamente a la quimioterapia en mas del 95 % de los pacientes (Cohen, Herbert T.; McGovern, Francis J. (2005), New England Journal of Medicine 353 (23): 2477-90). El rCc primario asf como tambien el tejido renal sano del mismo paciente se disocio y se analizo para determinar la expresion de SSEA4. Sorprendentemente, en todos los pacientes analizados (n = 3), la expresion de SSEA4 aumento fuertemente en el tejido tumoral, casi todas las celulas tumorales expresaron este marcador (Figura 6).

Para investigar mas a fondo si las celulas que sobreviven a la quimioterapia regulan negativamente el SSEA4 durante el tratamiento o si las celulas ya positivas muestran un aumento de la resistencia intrmseca, tratamos lmeas celulares que muestran fracciones variables de celulas positivas para SSEA4 con farmacos quimioterapeuticos in vitro. Una lmea de celulas tumorales primarias derivada del modelo HBCx-17 mostro un crecimiento reproducible parcialmente en un fenotipo adherente y en uno en suspension. Interesantemente, las celulas que crecieron en suspension mostraron una expresion mayor de SSEA4 en comparacion con las celulas adherentes (Figura 7). Para evaluar la sensibilidad de ambas subpoblaciones al tratamiento quimioterapeutico, determinamos los valores de CI50 (n = 3) para ocho farmacos usados comunmente (Figura 7 y datos no mostrados). Para cinco de estos, cisplatino, mafosfamida, 5-fluorouracilo, doxorrubicina y docetaxel, las celulas de la suspension mostraron valores mas altos de CI50, lo que indica un aumento de la resistencia a esos farmacos. Uno de los farmacos, etoposido, no mostro diferencias, y para dos moleculas, topotecan e irinotecan, se observaron valores de CI50 disminuidos de las celulas en suspension. Etoposido, topotecan e irinotecan inhiben las enzimas topoisomerasa I y II, lo que causa por lo tanto roturas de ADN bicatenario. Por lo tanto, las celulas positivas para SSEA4 parecen ser mas resistentes a los inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN, pero igual o menos resistentes a los inhibidores de la topoisomerasa.

Para examinar directamente el fenotipo de las celulas que sobrevivieron al tratamiento, otra lmea celular adherente derivada puramente del modelo HBCx-17 se trato con concentraciones crecientes de mafosfamida, 4- hidroxiciclofosfamida o adriamicina® (n = 4). En todos los casos, la poblacion sobreviviente mostro una fraccion mayor significativamente de celulas positivas para SSEA4 (Figura 7).

Ejemplo 3: La expresion de SSEA4 indica un fenotipo mesenquimatico

Los resultados del analisis de ARNm y de miARN indican claramente que la expresion de SSEA4 se correlaciona con un fenotipo mas mesenquimatico. Como se demostro que la EMT se correlaciona con la resistencia al farmaco (Ganapati V. Hegde y otros, PLOS ONE 2012, 7(10):e45647), quisimos examinar si aumenta ademas la expresion de SSEA4 tras la induccion de EMT. Para inducir una transicion mesenquimatica, la lmea celular epitelial de mama MCF10A se trato con TGFp1 a concentraciones de 10 y 20 ng/ml. Tras el tratamiento, casi todas las celulas cambiaron su morfologfa de un tipo de colonia compactada a una forma fibroblastica alargada (Figura 8). Marcadores clave de EMT conocidos anteriormente, como EpCAM, E-cadherina, vimentina y fibronectina, se regularon como se esperaba, lo que demuestra la eficiencia de la induccion de EMT mediante el uso de nuestro metodo (Figura 8 y datos no mostrados). Ademas, tambien se incremento fuertemente el potencial invasivo de las celulas tratadas (datos no mostrados). Sorprendentemente, la fraccion de celulas positivas para SSEA4 aumento tras la induccion de EMT, lo que verifica la correlacion entre la expresion de SSEA4 y un fenotipo mas mesenquimatico (Figura 8).

Ejemplo 4: SSEA4 y/o ST3GAL2 son marcadores de pronostico significativos altamente en pacientes con cancer de mama

Ya estan disponibles enormes colecciones de datos de expresion genica con resultados clmicos emparejados de pacientes con cancer de mama. Sin embargo, debido a la naturaleza del epttopo SSEA4, su expresion no puede controlarse directamente mediante el perfilado del transcriptoma. Por lo tanto, evaluamos el valor pronostico de su enzima sintetizadora ST3GAL2 en una gran base de datos publica de micromatrices clmicas de tumores de ovario de 2,977 pacientes (Gyorffy B y otros, Breast Cancer Res Treatment, 2010 Oct;123(3):725-31.). Cuando se uso el conjunto de datos completo, no se observaron diferencias en el resultado clmico, mientras que se encontraron diferencias significativas altamente (p < 0,01) hacia un pronostico peor para los pacientes que expresan niveles altos de ST3GAL2 en los pacientes ER-, los pacientes PR- y los pacientes doble negativos con independencia del tratamiento (Figura 9). Cuando se centro en pacientes tratados con quimioterapia, se observo una reduccion significativa altamente de la

supervivencia libre de recafda con independencia del subtipo de tumor (p < 0,01, HR 1,91), en pacientes RE- (p < 0,01, HR 2,97) y en pacientes doble negativos (p < 0,01, HR 3,08) (Figura 9). Esto apoya firmemente la importancia de SSEA4 y ST3GAL2 como marcadores de diagnostico para predecir la resistencia a la quimioterapia y el resultado en todos los subtipos principales de cancer de mama. No solo cuando se aplica la supervivencia libre de recafda como un 5 punto final, sino tambien para la supervivencia libre de metastasis a distancia, los pacientes que expresan niveles altos de ST3GAL2 tuvieron un peor pronostico, lo que indica un papel de la subpoblacion positiva para SSEA4 tambien durante la metastasis (Figura 9).

Ejemplo 5: SSEA4/ST3GAL2 es un marcador de pronostico significativo e indica resistencia a la quimioterapia en otras 10 entidades tumorales

Para evaluar si esta observacion se limita al cancer de mama o puede ser mas general, analizamos ademas el valor pronostico de ST3GAL2 en una gran base de datos publica de micromatrices clmicas de tumores de ovario de 1,464 pacientes (Gyorffy B y otros, Endocrine-Related Cancer. 2012 Abr 10;19(2):197-208.). Ya al usar el conjunto de datos 15 completo, se observo una diferencia significativa hacia un resultado clmico peor con respecto a la supervivencia libre de progresion (p < 0,05), asf como tambien a la supervivencia posterior a la progresion (p < 0,05, Figura 10). Cuando se centro en pacientes tratados con quimioterapia, de nuevo el nivel de significacion se aumento fuertemente para ambos puntos finales (p < 0,01, Figura 10), lo que indica que el uso de SSEA4 y ST3GAL2 como marcadores de diagnostico puede no limitarse al cancer de mama.

20

Claims (1)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   Reivindicaciones

   1 El uso de los biomarcadores SSEA4 y/o ST3GAL2 para evaluar el resultado del tratamiento quimioterapeutico de un cancer en un individuo, en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales (RCC) y cancer de ovario humano si el biomarcador es SSEA4 y en donde dicho cancer es cancer de mama humano si el biomarcador es ST3GAL2 y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicho tratamiento quimioterapeutico son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

   2 Un metodo para evaluar el pronostico asociado a la resistencia a la quimioterapia en un individuo que tiene un cancer, el metodo comprende detectar la expresion de SSEA4 en una muestra de prueba del individuo en donde la expresion de SSEA4 en la muestra de prueba es indicativa de un mal pronostico, y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano, carcinoma de celulas renales (RCC) y cancer de ovario humano, y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicha quimioterapia son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

   3 El metodo de conformidad con la reivindicacion 2, en donde la expresion de SSEA4 en mas del 50 % de las celulas cancerosas de dicha muestra es indicativa de un mal pronostico.

   4 El metodo de conformidad con la reivindicacion 2 o 3, en donde la expresion de SSEA4 se determina mediante la tincion con un anticuerpo o fragmento de este.

   5 Un metodo para evaluar el pronostico asociado a la resistencia a la quimioterapia en un individuo que tiene un cancer, el metodo comprende a) detectar la expresion o el nivel de actividad de ST3GAL2 en una muestra del individuo b) comparar la expresion o el nivel de actividad detectada con un nivel control c) determinar dicho pronostico en base a la comparacion de b) en donde el nivel control es un nivel control de buen pronostico y un aumento de la expresion o nivel de actividad en comparacion con el nivel control se determina como mal pronostico y en donde dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama humano y cancer de ovario humano, y en donde los farmacos quimioterapeuticos usados en dicha quimioterapia son inhibidores de la smtesis y transcripcion del ADN.

   6 El metodo de conformidad con la reivindicacion 5, en donde dicho aumento es al menos del 50 % en comparacion con dicho nivel control.

   7 El metodo de conformidad con la reivindicacion 5 o 6, en donde dicha expresion de ST3Gal2 se determina a nivel de ARNm o nivel de protema.

   8 El metodo de conformidad con la reivindicacion 5 o 6, en donde dicha actividad de la protema ST3Gal2 se determina a nivel de protema.