ES2693518T3 - Composiciones y procedimientos de transfección de polinucleótidos - Google Patents

Composiciones y procedimientos de transfección de polinucleótidos Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un complejo péptido-polinucleótido, comprendiendo el complejo péptido-polinucleótido una relación molar de péptido:polinucleótido que es más de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1, en el que el péptido es (a) no citotóxico y capaz de afectar a la liberación de un polinucleótido desde un endosoma de una célula, y (b) comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y procedimientos de transfeccion de polinucleotidos Campo de la invencion
La invencion proporciona un complejo peptido-polinucleotido que comprende una relacion seleccionada de peptido a polinucleotido, cuyo complejo se puede formular para una composicion farmaceutica, y procedimientos para usarlo.
Antecedentes de la invencion
Se ha propuesto el ARN de interferencia (ARNi) con la utilizacion del ARN de interferencia pequeno (ARNip) como una terapia altamente eficaz para innumerables enfermedades que incluyen cancer y enfermedades inflamatorias. Sin embargo, a pesar de casi dos decadas de intensa investigacion, la terapeutica con ARNip ha demostrado un exito limitado en la traduccion a aplicaciones clmicas debido a la escasa absorcion celular y la inestabilidad del ARNip libre en suero. Se han utilizado con exito lfpidos y polfmeros cationicos para la transfeccion de ARNip, pero pueden exhibir una citotoxicidad inaceptable y causar la generacion de especies reactivas de oxfgeno (ROS, de sus siglas en ingles) y la fuga de Ca+2. Ademas, los agentes de transfeccion de ARNip basados en peptido de penetracion celular (CPP, de sus siglas en ingles), que se ha demostrado que reducen la citotoxicidad, no han logrado la alta eficacia de los agentes de transfeccion lipfdica tradicionales debido a la captura lisosomica.
Por lo tanto, existe una necesidad en la materia de nuevas clases de composiciones de ARNip terapeuticas y agentes de transfeccion de ARNip capaces de una absorcion celular eficaz y el suministro al citoplasma para tratar enfermedades. El documento de Hou K. y Wickline S. (2012), FASEB J., vol.26, relacionado con la Reunion de Biologfa Experimental; San Diego, CA, USA; 21-25 de abril, 2012, describe "un nuevo sistema de suministro de nanopartfculas de peptidos procedentes de melitina para la muerte mediada por ARNip de STAT3 de celulas de melanoma B16".
Sumario de la invencion
La invencion es como se define en las reivindicaciones.
La presente invencion abarca una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido. El complejo peptido-polinucleotido comprende una relacion molar de peptido:polinucleotido que es mas de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1. El peptido es (a) no citotoxico y capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma de una celula, y (b) comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. El polinucleotido es una secuencia de ARN o una secuencia de ADN. En un aspecto, el peptido comprende al menos una region cationica y al menos un resto de histidina localizado adyacente a al menos una region cationica del peptido. En otro aspecto, el polinucleotido es un ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico.
La presente invencion tambien abarca un procedimiento para suministrar un polinucleotido al citoplasma de una celula. El procedimiento comprende poner en contacto una celula con un complejo peptido-polinucleotido, comprendiendo el complejo peptido-polinucleotido una relacion molar de peptido:polinucleotido que es mas de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1, en el que el peptido es (a) no citotoxico y capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma de una celula, y (b) comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. En un aspecto, el peptido comprende al menos una region cationica y al menos un resto de histidina localizado adyacente a o dentro de al menos una region cationica del peptido. En otro aspecto, el polinucleotido es un ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico.
La presente invencion tambien abarca un procedimiento para suministrar un polinucleotido al citoplasma de una celula en un sujeto que lo necesita. El procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido, comprendiendo el complejo peptido-polinucleotido una relacion molar de peptido:polinucleotido que es mas de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1, en el que el peptido es (a) no citotoxico y capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma de una celula, y (b) comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. En un aspecto, el peptido comprende al menos una region cationica y al menos un resto de histidina localizado adyacente a o dentro de al menos una region cationica del peptido. En otro aspecto, el polinucleotido es un ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico.
Otros aspectos de la invencion se describen mas a fondo a continuacion.
REFERENCIA A LAS FIGURAS DE COLOR
El archivo de la aplicacion contiene al menos una fotograffa ejecutada en color.
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Breve descripcion de las figuras
La FIG. 1 representa dos graficas que muestran (A) la optimizacion de las relaciones p5RHH/ARNip revela una mayor eficacia de transfeccion con cantidades aumentadas de p5RHH hasta un maximo de 150:1 p5RHH:ARNip, y (B) ensayos de Alamar blue indican que no hay citotoxicidad en las relaciones p5RHH:ARNip hasta 200:1 cuando se transfecta ARNip 50 nM.
La FIG. 2 representa un gel de electroforesis y una micrograffa MEB que muestra (A) un ensayo de retardo de gel que muestra que se requiere una relacion p5RHH:ARNip de 50:1 para formar completamente ARNip, y (B) el analisis MEB de tamano de partmula confirma los datos dinamicos de dispersion de luz revelando pequenos complejos de 100-200 nm de diametro. (Barra de escala 100 nm)
La FIG. 3 representa graficas e imagenes de transferencia de Western (A) la respuesta a la dosis por citometna de flujo muestra que la transfeccion mediada por p5RHH es menos eficaz que por Lipofectamine2000, pero tambien muestra una alta eficacia de transfeccion de ARNip con una atenuacion visible a concentraciones tan bajas como 5 nM. (B) Los ensayos con Alamar blue indican que p5RHH muestra una toxicidad minima a concentraciones de ARNip de hasta 200 nM. El analisis de transferencia Western (C) y RT-PCR (D) del ARNm de GFP confirma la capacidad de p5RHH para disminuir los niveles de ARNm de una manera espedfica de secuencia con una CI50 de ~ 50 nM. Lipofectamine 2000 tiene una eficacia de transfeccion mas alta con una CI50 de entre 10-25 nM determinada por transferencia de western (E) y RT-PCR (F).
La FIG. 4 representa (A) El derivado de melitina no funcional, p5RWR, no exhibe capacidad de transfeccion de ARNip cuando se criba para la atenuacion de GFP en celulas B16GFP mediante citometna de flujo. El ARNip se suministra, pero no alcanza el citoplasma hasta que se incuba con cloroquina 50 pM. (B, C) La microscopia confocal confirma los datos de la citometna de flujo, lo que indica que p5RWR no manifiesta una liberacion apreciable de oligonucleotidos en el citoplasma a menos que se incube con cloroquina 50 pM. (D, E) En comparacion, p5RHH muestra una liberacion eficaz de oligo en el citoplasma similar al suministro de oligonucleotidos a traves de Lipofectamine 2000.
La FIG. 5 representa que los datos de transferencia Western indican que p5RHH (A) es aproximadamente 5 veces menos eficaz que Lipofectamine 2000 (B) al iniciar una disminucion en los niveles de la protema STAT3 en celulas B16. Los datos de RT-PCR muestran que p5RHH (C) pierde actividad a concentraciones por debajo de 50 nM mientras que Lipofectamine 2000 (D) exhibe actividad a dosis tan bajas como 10 nM. El analisis de viabilidad de B16 a traves de Alamar Blue demuestra que la transfeccion de p5RHH (E) conduce a una disminucion de la viabilidad de B16 mediante el silenciamiento de la expresion de oncogenes de una manera espedfica de secuencia, mientras que Lipofectamine2000 (F) causa citotoxicidad dependiente de dosis inespedfica.
La FIG. 6 representa la cuantificacion de los niveles de protema STAT3 en celulas B16 cuando se suministra ARNip aleatorio o espedfico de STAT3 mediante p5RHH (A) o Lipofectamine 2000 (B). Los datos se presentan como el promedio de 3 experimentos independientes.
La FIG. 7 representa (A) la transferencia de Western representa una disminucion dependiente de la dosis en los niveles de protema STAT3 en HUVEC tratadas con ARNip espedfico de STAT3. (B) Los datos de la RT-PCR ilustran una atenuacion del 60 % dependiente de p5RHH en el ARNm de STAT3 a concentraciones tan altas como 200 nM. (C) p5RHH no tiene citotoxicidad hacia las celulas HUVEC cuando transfectan ARNip. (D) Las HUVEC tratadas con ARNip de STAT3 muestran disminucion de una formacion de tubo de 60 % en matrigel en comparacion con los controles (E, F) como se cuantifico en (G). Una disminucion en la formacion de tubo se acompana de una disminucion del 40 % en la migracion de HUVEC en respuesta a bFGF en ensayos de migracion transwell como se determina por microscopia (H) y ensayos Alamar Blue (I).
La FIG. 8 representa la cuantificacion de los niveles de protema STAT3 a partir de HUVEC transfectadas con p5RHH que demuestra una CI50 de ~ 50 nM. Media de 3 experimentos independientes.
La FIG. 9 representa la transferencia de Western representativa (A) que muestra la atenuacion de STAT3 utilizando Lipofectamine 2000 que muestra una CI50 menor que 10 nM con cuantificacion (B). La RT-PCR verifica una fuerte atenuacion a 10 nM (C). A pesar de la alta eficacia de suministro de ARNip, Lipofectamine 2000 causa una citotoxicidad extensa, con una disminucion > 50 % en la viabilidad celular a solo ARNip 50 nM.
La FIG. 10 representa la cuantificacion de la transmigracion de HUVEC en respuesta a un gradiente de bFGF mediante microscopia de fluorescencia que muestra que el ARNip de STAT3 disminuye la transmigracion de HUVEC en > 50 % en comparacion con las muestras tratadas con ARNip aleatorio.
La FIG. 11 representa (A) el analisis de transferencia de Western ilustra la atenuacion de JNK2 en celulas RAW264.7 mediante p5RHH con CI50 < 25 nM. (B) Cabe destacar que, p5RHH causa solo un ~ 5 % de disminucion en la viabilidad celular cuando se transfecta el ARNip aleatorio a 100 nM. (C-E) La atenuacion de JNK2 en ARNip 50nM muestra una fuerte disminucion en la acumulacion de gotitas de lfpidos en celulas RAW264.7 cuando se incubaron con Ac-LDL 50 pg/ml durante la noche cuando se compara con celulas tratadas con ARNip aleatorio y controles no tratados.
La FIG. 12 representa que Lipofectamine 2000 atenua JNK2 en celulas RAW264.7 con una CI50 < 25 nM (A), pero induce una citotoxicidad extensa a concentraciones tan bajas como 10 nM (B).
La FIG. 13 representa (A) La incubacion de nanopartfculas de p5RHH:ARNip con HSA 50 pg/ml durante 30 minutos o toda la noche se caracteriza por una atenuacion de GFP mejorada cuando se compara con las nanopartmulas de p5RHH:ARNip recien preparadas. (B) La microscopia confocal de celulas B16 transfectadas en medio de cultivo celular normal complementado con FBS al 10 % muestra una liberacion de oligonucleotidos eficaz en el citoplasma.
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La FIG. 14 representa un esquema y una imagen de microscopfa de fuerza atomica que muestra el ensamblaje de nanopartfculas de p5RHH/ARNip. (A) Esquema para la formulacion de nanopartfculas de p5RHH/ARNip estabilizadas con albumina. (B) Las imagenes de AFM en modo humedo de nanopartfculas de p5RHH/ARNip revelan un tamano medio de partfcula de ~ 55 nM ± 18.
La FIG. 15 representa una grafica y una micrograffa electronica que muestran las partfculas de ARNip y la eficacia de transfeccion de las partfculas. (A) La eficiencia de transfeccion de los complejos incubados durante la duracion indicada, medida por el porcentaje de celulas que exhiben la atenuacion de GFP a concentracion final de ARNip de GFP 50 nM cuando se empaquetan con p5RHH. Estos datos indican que la incubacion de p5RHH/ARNip de 40 minutos proporciona la duracion optima de incubacion para una transfeccion maxima. (B) Las partfculas incubadas durante el tiempo indicado muestran que las partfculas de p5RHH/ARNip tienen un tamano de < 100 nm.
La FIG. 16 representa graficas que muestran que la absorcion de nanopartfculas de p5RHH/Alexa488-ARNip a 4 °C (C) se reduce drasticamente en comparacion con la absorcion a 37 °C (B). Las celulas no tratadas se muestran para comparacion (A).
La FIG. 17 representa graficas e imagenes de microscopfa que muestran absorcion y colocalizacion de nanopartfculas de p5RHH/ARNip. (A-D) La absorcion de 40 minutos de nanopartfculas de p5RHH/Alexa488- ARNip muestra que el 60 % de las celulas tratadas toman (A) nanopartfculas de p5RHH/ARNip. La presencia de inhibidores de endocitosis indica que (B) filipina 100 pg/ml (inhibidor de caveolae) y (C) PAO 10 pM (inhibidor de endocitosis mediado por clatrina) no inhiben la absorcion de nanopartfculas de p5RHH/ARNip. Como alternativa, el tratamiento con inhibidor de macropinocitosis (EIPA, 80 pM) (D) casi anula la absorcion de nanopartfculas. (E- J) La colocalizacion segun se determina mediante microscopfa confocal muestra que las nanopartfculas de p5RHH/Cy-3 ARNip se toman con FITC-dextrano de 70 kDa (J) pero no con FITC-transferrina (I). Barra de escala 10 pm.
La FIG. 18 representa graficas que muestran que los inhibidores de endocitosis solo inhiben la absorcion de marcadores espedficos para la ruta indicada.
La FIG. 19 representa una imagen microscopica que muestra la liberacion citoplasmica de Cy-3-ARNip en 1 hora.
La FIG. 20 representa graficas que muestran que (A-C) la bafilomicina A1 no inhibe la absorcion de nanopartfculas de p5RHH/Alexa488-ARNip (C) en comparacion con la transfeccion en ausencia de bafilomicina A1 (B). (D-F) Por otra parte, la bafilomicina A1 bloquea la atenuacion de GFP (F) en comparacion con la transfeccion en ausencia de bafilomicina A1 (E) lo que indica que la acidificacion endosomica es crucial para la transfeccion de ARNip mediada por p5RHH.
La FIG. 21 representa graficas e imagenes de microscopfa que muestran que (A) la fluorescencia de la union de TOPRO3 a ARNip aumenta drasticamente a pH < 5,5 cuando se empaqueta a traves de p5RHH (■), pero no el peptido no funcional p5RWR (♦). (B) La electroforesis en gel de poliacrilamida confirma que p5RHH libera ARNip a pH 4,5 pero p5RWR no muestra una liberacion dependiente de pH. (C) p5RHH tambien se libera a pH bajo con un aumento en la liberacion de p5RHH a pH < 5,5. (D) el p5RHH liberado es capaz de hemolisis, lo que lleva a un aumento de la liberacion de hemoglobina a pH < 5,5. (E-H) Los ensayos de liberacion de naranja acridina muestran que las nanopartfculas de p5RHH/ARNip son capaces de alterar los endosomas (H) cuando se prueban en cultivo tisular, como se exhibe por la liberacion de colorante similar a la cloroquina 100 pM (F), mientras que p5RWR no puede (G). (I-K) Esquema que muestra el desensamblaje del complejo peptido- polinucleotido a diversos valores de pH. Barra de escala 50 pm.
La FIG. 22 representa dos graficas que muestran que (A) la hemolisis normalizada muestra una disminucion dependiente del pH en la capacidad del p5RHH libre para alterar el RBC. En cambio, las nanopartfculas de p5RHH/ARNip muestran un aumento en la alteracion de RBC con pH disminuido, recuperando la misma capacidad lttica de p5RHH libre a pH 5,5. Los resultados se informaron como hemolisis fraccional normalizada a la lisis maxima por p5RHH 100 pM a pH 7,5 registrada en experimentos separados. (B) La hemolisis de RBC normalizada a hemolisis maxima en Triton-X al 0,1 % indica que p5RHH lisa RBC con una CI50 entre 200-400 pM.
La FIG. 23 representa graficas e imagenes de microscopfa que muestran que (A) la atenuacion de GFP en celulas B16 gFp revela que solo p5RHH puede suministrar con exito ARNip de GFP al citoplasma, mientras que p5RWR no puede, incluso con escape endosomal inducido por cloroquina. (B) FACS revela que tanto p5RWR como p5RHH suministran cantidades similares de ARNip marcado con Alexa 488. Control no tratado (cuadrado rojo); a488 ARNip/p5RWR 50 nM(cuadrado beige); a88 ARNip/p5RWR 50 nM + cloroquina (cuadrado azul); a488 ARNip/p5RHH 50 nM (cuadrado verde); a88 ARNip/p5RHH 50 nM + cloroquina (cuadrado turquesa). La microscopfa confocal (barra de escala 10 pm) revela que p5RWR (C) suministra ARNip mediante restos en vesfculas puntiformes mientras que p5RHH logra distribucion citoplasmica (D). Se requiere la incubacion simultanea con cloroquina para liberar ARNip al citoplasma cuando se transfecta con p5RWR (E) pero no tiene efecto sobre la transfeccion mediada por p5RHH (F).
La FIG. 24 representa transferencias de Western, un grafico e imagenes de microscopfa que muestran que (A, B) la transferencia Western demuestra una disminucion dependiente de la dosis en la expresion de p100/p52 o p65 que no se observa cuando se tratan celulas F8 con ARNip aleatorio. (C) Los ensayos con Alamar blue 48 horas despues de la transfeccion revelan que el ARNip aleatorio (■) no afecta la viabilidad de las celulas F8. La atenuacion de la ruta de NFkB canonica con ARNip de p65 (A) tiene una CI50 de casi 200 nM. Dirigiendose a la ruta de NFkB no canonica con ARNip de p100/p52 (•) produce una CI50 de 100 nM. Sin embargo, el bloqueo simultaneo de las rutas de NFkB canonica y no canonica (♦) mejora la CI50 a 50 nM. Las imagenes de IVIS (barra
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de escala de 5 mm) revelan la localizacion del tumor de ARNip marcado con Cy5.5 en el tumor de los ratones tratados (E), y se confirma mediante microscop^a confocal (G) (barra de escala de 50 pm). Los controles no tratados se muestran para comparacion (D, F).
La FIG. 25 representa imagenes de microscopfa confocal que muestran que los tumores de ratones inyectados con nanopartfculas de ARNip p5RHH/Cy5.5 exhiben acumulacion de ARNip de Cy5.5 en la periferia, mientras que el ARNip de Cy5.5 limitado se encuentra en el centro del tumor. (Barra de escala 50 pm ).
La FIG. 26 representa un esquema del suministro de ARNip en el citoplasma utilizando partfculas de p5RHH/ARNip, que muestra la entrada en una celula y la liberacion de ARNip de la partfcula de peptido/ARNip y de endosoma en el citoplasma.
La FIG. 27 representa imagenes IVIS de organos y tumores de un animal a quien se le administro un control salino (A) y a un animal a quien se le administro p5RHH/ARNip con un ARNip de NFkB marcado con Cy5.5 (B). La FIG. 28 representa transferencias Northern y graficas que muestran la citotoxicidad de p5RHH/ARNip (A, C) en comparacion con Lipofectamine 2000 (B, D).
La FIG. 29 representa un esquema del modelo murino inducido por anticuerpos de colageno y la administracion de ARNip.
La FIG. 30 muestra graficas y una imagen IVIS que muestra (A) el grosor del tobillo (B) y la puntuacion artntica de los animales a los que se administro solucion salina, y los animales transfectados con p5RHH/ARNip con ARNip aleatorio o ARNip dirigido a la subunidad p65 de la ruta canonica. (C) Imagen IVIS de animales a los que se administro solucion salina o p5RHH/ARNip con ARNip que se dirige a la subunidad p65 de la ruta canonica.
La FIG. 31 representa una imagen que muestra la eficacia de la terapia de artritis que utiliza p5RHH/ARNip que se dirige a la subunidad p65 de la ruta canonica utilizando imagenes de entropfa con ultrasonido.
La FIG. 32 muestra imagenes y graficas que muestran que la nanoterapia con p65-ARNip en artritis inducida por anticuerpos de colageno (CAIA, de sus siglas en ingles) es eficaz. La artritis se indujo con inyeccion i.p. de 1,5 mg de coctel de anticuerpos de 5 clones en el dfa 0 seguido de la inyeccion de 50 ug de LPS en el dfa 3. En el dfa 4, cuando se establecio la artritis temprana, los ratones se dividieron aleatoriamente en 3 grupos para el tratamiento (Tx) con solucion salina, nanopartfculas de secuencia aleatoria y nanopartfculas de p65-ARNip administradas i.v. en los dfas 4, 5 y 6. Las patas fueron fotografiadas el dfa 10 (A-C). El cambio en el grosor del tobillo (D), la puntuacion de artritis (E) y el % de perdida de peso (F) se registraron diariamente. Los valores se presentan como media ± EEM, n = 6-8 ratones por grupo de tratamiento. *P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 La FIG. 33 representa inmunotransferencias y graficas que muestran que la nanoterapia con p65-ARNip suprime la expresion de p65 y la inflamacion en CAIA. El dfa 10, se sacrificaron los ratones y se recogieron las patas, se homogeneizaron y los lisados aclarados se transfirieron para la expresion de p65 (A). Los lisados tambien se analizaron para citoquinas inflamatorias [TNFa (B), IL-1p (C), IL-6 (D), MCP-1 (E)] mediante matrices de perlas citometricas y ELISA. ** P < 0,01, *** P < 0,001
La FIG. 34 representa graficas que muestran parametros hematologicos despues de la administracion de nanopartfculas. El dfa 10, se sacrificaron los ratones y se obtuvo sangre para WBC y diferenciales. N = 6-8 ratones por grupo de tratamiento. (A) Hemoglobina; (B) HCT; (C) plaqueta; (D) WBC; y (E) WBC, neutrofilos segmentados y linfocitos.
La FIG. 35 representa graficas que muestran la funcion renal despues de la administracion de nanopartfculas. El dfa 10, se sacrificaron los ratones y se obtuvo sangre para el analisis de electrolitos y funcion renal. (A) Sodio en suero; (B) cloruro en suero; (C) potasio en suero; (D) BUN; (E) creatinina.
La FIG. 36 representa graficas que muestran la funcion hepatica despues de la administracion de nanopartfculas. El dfa 10, se sacrificaron los ratones y se obtuvo sangre para la pruebas de funcion hepatica. (A) AST; (B) ALT; (C) bilirrubina total.
La FIG. 37 representa una grafica que muestra la activacion del complemento despues de la administracion de nanopartfculas. Los ratones se inyectaron i.v. con el control indicado (HBSS) o nanopartfculas y plasma recogidos a los 30 minutos para la generacion de C3a, una indicacion de la activacion del complemento. Las nanopartfculas de DOTAP PFOB al 50 % en moles, que se ha demostrado que tienen un complemento fuertemente activado in vivo, sirvieron como control positivo. No existe una diferencia estadfstica significativa entre HBSS y el grupo de nanopartfculas p65-ARNip o aleatorias.
La FIG. 38 representa los efectos fuera de la diana de las nanopartfculas. Se recogio el bazo el dfa 10 y los esplenocitos se enumeraron y se representaron graficamente en (A). Las subpoblaciones de esplenocitos se analizaron por citometna de flujo y se representan en (B).
La FIG. 39 representa los efectos fuera de la diana de las nanopartfculas. Se seleccionaron positivamente linfocitos T cD4+ de esplenocitos y se estimularon con anticuerpo monoclonal anti-CD3 unido a la placa (5 ug/ml). A las 72 h, se analizo el sobrenadante del cultivo para determinar la secrecion de citocinas mediante una matriz de perlas citometricas. (A) TNF-a; (B) IFN-gamma; (C) IL-6; (D) IL-10.
La FIG. 40 muestra graficas que muestran la respuesta humoral a las nanopartfculas de ARNip. El dfa 10 se sacrificaron los ratones y se recogio el suero. Se midieron los niveles totales de IgG (A) e IgM (B) mediante ELISA tipo sandwich.
La FIG. 41 muestra graficas que muestran la respuesta humoral a las nanopartfculas. El dfa 10 se sacrificaron los ratones y se recogio el suero. Se evaluaron las respuestas espedficas de IgM (A, C) e IgG (B, D) a las nanopartfculas peptfdicas (p5RHH, A-B) y las nanopartfculas de ARNip (ARNip de p5RHH:p65, C-D) utilizando un ensayo ELISA de tipo sandwich modificado.
La FIG. 42 representa la absorcion de nanopartfculas fuera de la diana en celulas de sangre periferica. Se inyectaron los ratones con HBSS (B, D) o nanopartfculas que conteman la secuencia aleatoria marcada con Cy3
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(A, C). Despues de 30 minutes, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron celulas blancas de sangre periferica y se analizaron para determinar las nanopartteulas asociadas a celulas (celulas Cy3+) mediante citometna de flujo. Las celulas se tineron conjuntamente con Ly6G (neutrofilos; A-B) y Ly6C (monocitos; C-D).
La FIG. 43 representa la absorcion de nanopartteulas fuera de la diana en esplenocitos. Se inyectaron los ratones con HBSS (B, D) o nanopartteulas que conternan la secuencia aleatoria marcada con Cy3 (A, C). Despues de 30 minutos, se sacrificaron los ratones y se obtuvieron esplenocitos y se analizaron para determinar las nanopartteulas asociadas a celulas (celulas Cy3+; y-axis) mediante citometna de flujo. Las celulas se tineron conjuntamente con Ly6G (neutrofilos; A, B) y Ly6C (monocitos; C, D).
Descripcion detallada de la invencion
La invencion es como se define en las reivindicaciones. La presente invencion proporciona un complejo peptido- polinucleotido capaz de la transfeccion eficaz del polinucleotido en el citoplasma de una celula con citotoxicidad reducida, en comparacion con otros procedimientos de transfeccion de polinucleotidos conocidos en la materia. Ventajosamente, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion es estable en presencia de suero y, por lo tanto, es capaz de suministrar de manera eficaz un polinucleotido al citoplasma de una celula in vivo. Por consiguiente, la presente invencion abarca, una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion, y un procedimiento para utilizar un complejo peptido-polinucleotido de la invencion para transfectar el polinucleotido en el citoplasma de una celula.
I. COMPLEJO PEPTIDO-POLINUCLEOTIDO
Un aspecto de la presente invencion abarca un complejo peptido-polinucleotido como se refiere en las reivindicaciones. Un complejo peptido-polinucleotido de la invencion es capaz de la transfeccion eficaz de un polinucleotido asociado con el peptido en el citoplasma de una celula. El peptido, el polinucleotido, el complejo peptido-polinucleotido y la celula se describen a continuacion.
(a) Peptido
En un aspecto, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion comprende un peptido. En general, y como se describe en los ejemplos, un peptido de la invencion procede de la melitina y se modifica para atenuar su citotoxicidad mientras mantiene su propension a interactuar con bicapas de membrana. Ademas, el peptido es sustancialmente no lftico y no citotoxico para las celulas. Un complejo peptido-polinucleotido de la invencion comprende un peptido que (1) es capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma de una celula, y (2) comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1.
Como se utiliza en el presente documento, la frase "funciona sustancialmente similar a un peptido que comprende la SEQ ID NO: 1" se refiere a un peptido sustancialmente no lftico y/o no citotoxico que es capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido de un endosoma. En algunas realizaciones, un peptido de la invencion es no lftico. La expresion "no lftico" significa que la bicapa liptelica de una celula normalmente no esta comprometida en contacto con el peptido. La integridad de la bicapa liptelica puede evaluarse mediante la entrada o salida inadecuada de componentes celulares o extracelulares en una celula. Por ejemplo, las proternas celulares y/u organulos pueden escaparse de una celula con una bicapa liptelica comprometida. Como alternativa, los componentes extracelulares (es decir, aquellos que normalmente no entran a traves de uniones comunicantes, por ejemplo) pueden entrar en una celula con una bicapa liptelica comprometida. Se debe tener en cuenta, sin embargo, que el peptido puede penetrar la bicapa liptelica de una celula y entrar al interior de la celula, pero al hacerlo, la integridad de la bicapa iiptelica no se ve afectada. En otras realizaciones, un peptido de la invencion es sustancialmente no citotoxico. La expresion "no citotoxico" indica que la celula normalmente no se destruye en contacto con el peptido. Normalmente, un peptido de la invencion disminuye la viabilidad celular en no mas de aproximadamente el 10 %, mas preferentemente no mas de aproximadamente el 7 %, mas preferentemente no mas de aproximadamente el 5 %, o mas preferentemente no mas de aproximadamente el 3 %. En determinadas realizaciones, un peptido de la invencion es no lftico y no citotoxico.
Como se describe en la Seccion I (b) y (c) a continuacion, un peptido de un complejo de la invencion es capaz de asociarse con un polinucleotido. Por lo tanto, en un aspecto, un peptido de un complejo de la invencion comprende al menos una region cationica que interactua con un polinucleotido. Normalmente, una region cationica tiene 2 o mas aminoacidos basicos contiguos. Cabe destacar que, un peptido de un complejo de la invencion tambien posee una capacidad endosomolftica, que le permite afectar la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma y hacia el citoplasma de una celula. El termino "endosomolftico" se puede utilizar para describir sustancias que inician o facilitan la lisis de los endosomas. Como se describe en los ejemplos, la protonacion de restos de histidina de un peptido de un complejo de la invencion promueve el desensamblaje del complejo peptido-polinucleotido, que libera el peptido para permeabilizar la membrana endosomal para la liberacion de polinucleotidos. Por lo tanto, en otro aspecto, un peptido de un complejo de la invencion comprende uno o mas restos de histidina localizados adyacentes a o dentro de al menos una region cationica del peptido. A modo de ejemplo no limitativo, si un peptido de un complejo de la invencion comprende tres regiones cationicas, el peptido puede tener al menos una histidina adyacente a o dentro de la primera region cationica del peptido, al menos una histidina adyacente a o dentro de la
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segunda region cationica del peptido, al menos una histidina adyacente a o dentro de la tercera region cationica del peptido, al menos una histidina adyacente a o dentro de cada una de la primera y segunda region cationica del
peptido, al menos una histidina adyacente a o dentro de cada una de la primera y tercera region cationica del
peptido, al menos una histidina adyacente a o dentro de cada una de la segunda y tercera region cationica del
peptido, o al menos una histidina adyacente a o dentro de cada una de la primera, segunda y tercera region
cationica del peptido. Un resto de histidina adyacente a una region cationica puede colocarse antes o despues de la region cationica. En algunas realizaciones, un resto de histidina adyacente a una region cationica esta inmediatamente adyacente a la region. En otras realizaciones, un resto de histidina adyacente a una region cationica no esta inmediatamente adyacente a la region. Por ejemplo, el resto de histidina puede estar en aproximadamente 2, 3, 4 o 5 posiciones de la region cationica. En otras realizaciones, un resto de histidina esta dentro de una region cationica. La capacidad endosomolttica de un peptido de un complejo de la invencion evita la necesidad de agentes endosomoltticos adicionales, tales como cloroquina, peptidos fusogenicos, adenovirus inactivados y polietilenimina, para liberar polinucleotidos transfectados de endosomas para el suministro en el citoplasma de una celula. Dichos agentes endosomoltticos conocidos tienen efectos negativos sobre las celulas y pueden aumentar la citotoxicidad durante la transfeccion.
En algunas realizaciones, un peptido de un complejo de la invencion comprende la SEQ ID NO: 1. En otras
realizaciones, un peptido de un complejo de la invencion consiste en la SEQ ID NO: 1. En determinadas
realizaciones, un peptido de un complejo de la invencion es una variante de la SEQ ID NO: 1, en el que la variante comprende al menos 10 aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 y funciona sustancialmente similar a un peptido que comprende la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, un peptido de un complejo de la invencion puede abarcar al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoacidos contiguos de la SEC ID NO: 1. En algunas realizaciones, un
peptido de un complejo de la invencion puede seleccionarse de la Tabla A.
Tabla A
SEQ ID NO.
Secuencia SEQ ID NO. Secuencia
1
VLTTGLPALISWIRRRHRRHC 26 LPALISWIRRRH
2
VLTTGLPALISWIRRRH 27 LPALISWIRRRHR
3
VLTTGLPALISWIRRRHR 28 LPALISWIRRRHRR
4
VLTTGLPALISWIRRRHRR 29 LPALISWIRRRHRRH
5
VLTTGLPALISWIRRRHRRH 30 LPALISWIRRRHRRHC
6
LTTGLPALISWIRRRH 31 PALISWIRRRH
7
LTTGLPALISWIRRRHR 32 PALISWIRRRHR
8
LTTGLPALISWIRRRHRR 33 PALISWIRRRHRR
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LTTGLPALISWIRRRHRRH 34 PALISWIRRRHRRH
10
LTTGLPALISWIRRRHRRHC 35 PALISWIRRRHRRHC
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TTGLPALISWIRRRH 36 ALISWIRRRH
12
TTGLPALISWIRRRHR 37 ALISWIRRRHR
13
TTGLPALISWIRRRHRR 38 ALISWIRRRHRR
14
TTGLPALISWIRRRHRRH 39 ALISWIRRRHRRH
15
TTGLPALISWIRRRHRRHC 40 ALISWIRRRHRRHC
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TGLPALISWIRRRH 41 LISWIRRRHR
17
TGLPALISWIRRRHR 42 LISWIRRRHRR
18
TGLPALISWIRRRHRR 43 LISWIRRRHRRH
19
TGLPALISWIRRRHRRH 44 LISWIRRRHRRHC
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TG LPALISWIRRRHRRHC 45 ISWIRRRHRR
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GLPALISWIRRRH 46 ISWIRRRHRRH
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GLPALISWIRRRHR 47 ISWIRRRHRRHC
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GLPALISWIRRRHRR 48 SWIRRRHRRH
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GLPALISWIRRRHRRH 49 SWIRRRHRRHC
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G LPALISWIRRRHRRHC 50 WIRRRHRRHC
En una realizacion preferente, un peptido de un complejo de la invencion comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, en la que el peptido es no lftico y es capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido de un endosoma de una celula. El peptido comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1, puede tener aproximadamente el 80 %, preferentemente aproximadamente el 85 %, mas preferentemente aproximadamente el 90 %, mas preferentemente
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aproximadamente el 95 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1. Un peptido de un complejo de la invencion que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 puede comprender uno o mas aminoacidos que se han sustituido de forma conservadora. Por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o mas de nueve aminoacidos pueden estar sustituidos de forma conservadora, siempre y cuando el peptido resultante funcione sustancialmente similar a un peptido que comprende la SEQ ID NO: 1.
En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una secuencia de aminoacidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 y codifica un peptido que es no fftico y es capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido de un endosoma de una celula. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos tiene al menos el 80 % de identidad, al menos el 85 % de identidad, al menos el 90 % de identidad o al menos el 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la secuencia de aminoacidos es la SEQ ID NO: 1.
Un peptido de la divulgacion puede producirse utilizando una variedad de tecnicas conocidas en la materia. Los peptidos pueden aislarse utilizando tecnicas estandar, pueden sintetizarse utilizando tecnicas estandar, o pueden comprarse u obtenerse de un deposito.
Un peptido de la divulgacion puede estar marcado. Los ejemplos no limitantes de marcadores adecuados incluyen marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores radiactivos, marcadores colorimetricos y marcadores de resonancia. Los procedimientos para marcar peptidos son bien conocidos en la materia.
Un peptido puede estar unido a un complejo de carga. Como se utiliza en el presente documento, la expresion "complejo de carga" puede referirse a cualquier molecula o agente que pueda ser transportado por o unido al peptido distinto de un polinucleotido de la invencion. Dicho de otra manera, un peptido de la divulgacion puede unirse a un complejo de carga ademas de a un polinucleotido de un complejo de la invencion. Por ejemplo, un complejo de carga puede ser una carga de imagenes, una carga terapeutica, una carga citotoxica o una carga diana.
Los ejemplos no limitativos de moleculas y agentes de carga de imagenes pueden incluir cualquier molecula, agente o material que tenga una propiedad ffsica o qrnmica detectable. Dichas cargas de imagenes han sido bien desarrollados en el campo de imagenes fluorescentes, imagenes de resonancia magnetica, tomograffa por emision de positrones, imagenes Raman, tomograffa de coherencia optica, imagenes fotoacusticas, imagenes infrarrojas transformadas de Fourier o inmunoensayos y, en general, casi cualquier marcador util en tales procedimientos pueden aplicarse a la presente invencion. Para una revision de varios sistemas de marcaje o de produccion de senales que se pueden utilizar, vease la patente de Estados Unidos n.° 4391904.
Los ejemplos no limitantes de carga terapeutica pueden incluir cualquier sustancia que tenga una actividad biologica, tales como agentes farmacologicos. Dicha carga terapeutica puede incluir analgesicos, antipireticos, antiasmaticos, antibioticos, antidepresivos, antidiabeticos, agentes antifungicos, agentes antihipertensivos, antiinflamatorios incluidos los no esteroides y los esteroides, antineoplasticos, agentes contra la ansiedad, agentes inmunosupresores, agentes antimigranosos, sedantes, hipnoticos, agentes antianginosos, agentes antipsicoticos, agentes antimamacos, antiarntmicos, agentes antiartnticos, agentes antigota, anticoagulantes, agentes tromboffticos, agentes antifibrinoffticos, agentes hemorreologicos, agentes antiplaquetarios, anticonvulsivos, agentes antiparkinsonianos, antihistammicos, agentes antirrestenosis, antiprunticos, agentes utiles para la regulacion del calcio, agentes antibacterianos, agentes antivirales, antimicrobianos, antiinfecciosos, broncodilatadores, compuestos esteroideos y hormonas, y combinaciones de los mismos. Como alternativa, un complejo de carga puede estar en forma de componentes de complejos moleculares o sales farmacologicamente aceptables.
La carga citotoxica se refiere a una molecula o agente que es perjudicial para (por ejemplo, mata o dana) una celula. Los ejemplos pueden incluir medicamentos antimicrotubulos como los taxoles (paclitaxel, docetaxel) y alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina). Por ejemplo, los ejemplos pueden incluir taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracenodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procama, tetracama, lidocama, propranolol, y puromicina y analogos u homologos de los mismos.
Una carga diana puede ser cualquier molecula o agente que dirija un complejo peptido-polinucleotido de la invencion a una celula. Una carga diana puede dirigirse a una celula diana eucariota o una celula diana procariota. Los ejemplos no limitantes de agentes diana pueden incluir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, un ligando receptor, una molecula pequena, un peptido, un polipeptido, un ffpido, un carbohidrato, un acido nucleico, un ARNip, un ARNhc, un ARN antisentido, un dendnmero, una microburbuja o un aptamero.
Los medios por los cuales un complejo de carga esta unido a un peptido de un complejo de la invencion pueden variar y variaran dependiendo de la realizacion. Un complejo de carga puede estar unido a un peptido de un complejo de la invencion mediante cualquier medio conocido en la materia, que incluye covalentemente o no covalentemente.
(b) Polinucleotido
En otro aspecto, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion comprende un polinucleotido. Un polinucleotido
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puede ser monocatenario, bicatenario o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, un polinucleotido es bicatenario. En otras realizaciones, un polinucleotido es monocatenario. En algunas otras realizaciones, un polinucleotido es una combinacion de monocatenario y bicatenario.
Un polinucleotido de un complejo de la invencion puede comprender un acido ribonucleico (ARN), un acido desoxirribonucleico (ADN) o una combinacion de ARN y ADN. De manera adicional, un polinucleotido puede comprender bases de acido nucleico modificadas, tales como bases de ADN modificadas o bases de ARN modificadas. Las modificaciones pueden ocurrir en, pero no estan restringidas a, la posicion 2' del azucar, la posicion C-5 de las pirimidinas y la posicion 8 de las purinas. Los ejemplos de bases de ADN o ARN modificadas adecuadas incluyen nucleotidos 2'-fluoro, nucleotidos 2'-amino, nucleotidos 5'-aminoalil-2'-fluoro y nucleotidos fosforotioato (monotiofosfato y ditiofosfato). Como alternativa, un polinucleotido puede ser un imitador de nucleotido. Los ejemplos de imitadores de nucleotidos incluyen acidos nucleicos bloqueados (LNA, de sus siglas en ingles), acidos nucleicos peptfdicos (PNA, de sus siglas en ingles) y oligomeros de morfolino fosforodiamidato (PMO, de sus siglas en ingles).
En algunas realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion es una combinacion de ARN y ADN. En otras realizaciones, un polinucleotido comprende ADN. Cuando un polinucleotido es ADN, el polinucleotido puede comprender un casete de expresion. Como se utiliza en el presente documento, un "casete de expresion" es una construccion de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una protema o peptido unido de forma operativa a un promotor. En determinadas realizaciones, una construccion de acido nucleico comprende ademas secuencias reguladoras adicionales. Un ejemplo no limitativo de una secuencia reguladora adicional incluye una secuencia de terminacion de la transcripcion. Otras secuencias reguladoras adicionales son conocidas en la materia. Como se utiliza en el presente documento, el termino promotor puede significar una molecula sintetica o de origen natural capaz de conferir o activar la expresion de una secuencia de acido nucleico diana en una celula. Un promotor puede ser el promotor normalmente asociado con un polinucleotido de ADN de un complejo de la invencion, o puede ser un promotor heterologo. Un promotor heterologo puede proceder de fuentes tales como virus, bacterias, hongos, plantas, insectos y animales. Un promotor puede regular la expresion de una secuencia de ADN de forma constitutiva o diferencial con respecto a la celula, el tejido u organo en el que se produce la expresion. O, un promotor puede regular la expresion con respecto a la etapa de desarrollo, o en respuesta a estfmulos externos tales como tensiones fisiologicas, patogenos, iones metalicos o agentes inductores o activadores (es decir, un promotor inducible). Los ejemplos representativos no limitantes de promotores pueden incluir el promotor T7 de bacteriofago, promotor T3 de bacteriofago, promotor SP6, promotor basal HSP70, operador-promotor lac, promotor tac, promotor tardm SV40, promotor temprano SV40, promotor RSV-LTR, promotor lE de CMV, un promotor que comprende la secuencia de acido nucleico del elemento de respuesta de tetraciclina (TRE, de sus siglas en ingles) y el promotor IE de CMV. En algunas alternativas de estas realizaciones, un polinucleotido de ADN de un complejo de la invencion se incorpora a un vector. Un experto en la materia sena capaz de construir un vector mediante tecnicas recombinantes estandar (vease, por ejemplo, Sambrook y col., 2001 y Ausubel y col., 1996). Los vectores incluyen pero no se limitan a plasmidos, cosmidos, elementos transponibles, virus ( bacteriofagos, virus animales y virus de plantas) y cromosomas artificiales (por ejemplo, YAC), tales como vectores retrovirales (por ejemplo, procedentes de vectores de virus de leucemia murina Moloney (MoMLV, de sus siglas en ingles), MsCv, SFFV, MpSV, SNV etc.), vectores lentivirales (por ejemplo, procedentes de VIH-1, VIH-2, VIS, VIB, VIF etc.), vectores adenovirales (Ad) que incluyen replicacion competente, replicacion deficiente y formas debiles de los mismos, vectores virales adenoasociados (AAV, de sus siglas en ingles), vectores de virus de simio 40 (SV-40), vectores de virus del papiloma bovino, virus de Epstein Barr, vectores de virus del Herpes, vectores de virus vaccinia, vectores de virus de tumor mamario bovino, vectores de virus de tumor mamario murino y vectores de virus del sarcoma de Rous.
En algunas otras realizaciones, un polinucleotido comprende ARN. Los ejemplos no limitantes de secuencias de ARN pueden incluir ARNm capaz de codificar una protema y ARN no codificante como el ARNt, ARNr, ARNpn, microARN, ARNip, ARNpi y el ARN no codificante largo (ARNncl). Por ejemplo, un acido nucleico puede comprender ARNm. En realizaciones preferidas, cuando un acido nucleico comprende ARNm, la molecula de ARNm puede estar cubierta en 5', poliadenilada o cubierta y poliadenilada. Como alternativa, una molecula de ARNm puede comprender un sitio de entrada ribosomal interno (IRES, de sus siglas en ingles) para la traduccion de un marco de lectura abierto interno del ARNm.
En determinadas realizaciones, un polinucleotido comprende un ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico expresada en una celula. Los ejemplos no limitantes de ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico expresada en una celula incluyen microARN (tambien conocidos como miARN), ARNip, ARNpi y ARNncl. En general, la transfeccion de una celula con un ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico puede conducir a la escision de la secuencia de acido nucleico, puede mejorar, prevenir o alterar la traduccion de la secuencia de acido nucleico en una protema, o puede regular la transcripcion de una secuencia de acido nucleico.
En realizaciones preferidas, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico expresada en una celula. Como se utiliza en el presente documento, "que altera la expresion de una secuencia de acido nucleico" puede utilizarse para describir cualquier disminucion en el nivel de expresion de una secuencia de acido nucleico, o una protema traducida de la secuencia de acido nucleico, cuando se compara con un nivel de expresion de la secuencia de acido nucleico en
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una celula que no se trato con un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En algunas alternativas de las realizaciones, un polinucleotido comprende un ARN de interferencia pequeno (ARNip).
En una realizacion preferente, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3. En otra realizacion preferida, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica JNK2. En determinadas realizaciones preferidas, el ARN no codificante es un ARNip. En otras realizaciones preferidas, el ARN no codificante es un miARN. En aun otras realizaciones preferidas, el ARN no codificante es un ARNhc.
En todavfa otra realizacion preferente, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con una ruta de senalizacion de NFkB. Los ejemplos no limitantes de una ruta de NFkB pueden incluir la ruta de NFkB canonica y la ruta de NFkB no canonica. En determinadas realizaciones preferidas, el ARN no codificante es un ARNip. En otras realizaciones preferidas, el ARN no codificante es un miARN. En aun otras realizaciones preferidas, el ARN no codificante es un ARNhc.
Los ejemplos no limitantes de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB canonica pueden incluir un acido nucleico que codifica la subunidad p65 del factor de transcripcion de la ruta de senalizacion de NFkB canonica y un acido nucleico que codifica la subunidad p105/p50 del factor de transcripcion de la ruta de senalizacion de NFkB canonica. En una alternativa de las realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p105/p50 de la ruta de senalizacion de NFkB canonica. En otra alternativa de las realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p65 de la ruta de senalizacion de NFkB canonica. En una realizacion de ejemplo, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARNip con una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 51 (GGAGUACCCUGAAGCUAUA).
Los ejemplos no limitantes de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB canonica pueden incluir un acido nucleico que codifica la subunidad p100/p52 de la ruta de senalizacion de NFkB no canonica y un acido nucleico que codifica la subunidad RelB de la ruta de senalizacion de NFkB no canonica. En una alternativa de las realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad RelB de la ruta de senalizacion de NFkB no canonica. En otra alternativa de las realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p100/p52 de la ruta de senalizacion de NFkB no canonica. En una realizacion de ejemplo, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARNip con una secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 52 (GAAAGAAGACAGAGCCUAU).
En algunas realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende mas de un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con una ruta de senalizacion de NFkB. En realizaciones preferidas, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB canonica, y un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB no canonica. En una realizacion de ejemplo, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p65 de la ruta de senalizacion de NFkB canonica, y un ARN no codificante capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p100/p52 de la ruta de senalizacion de NFkB canonica.
En general, un ARNip comprende una molecula de ARN de doble cadena que vana de aproximadamente 15 a aproximadamente 29 nucleotidos de longitud. En algunas realizaciones, el ARNip puede tener 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 nucleotidos de longitud. En otras realizaciones, el ARNip puede ser de aproximadamente 16 a aproximadamente 18, de aproximadamente 17 a aproximadamente 19, de aproximadamente 21 a aproximadamente 23, de aproximadamente 24 a aproximadamente 27 o de aproximadamente 27 a aproximadamente 29 nucleotidos de longitud. En una realizacion preferente, el ARNip puede ser de aproximadamente 21 nucleotidos de longitud. Un ARNip puede opcionalmente comprender ademas uno o dos salientes monocatenarios, por ejemplo, un saliente de 5' en uno o ambos extremos, un saliente de 3' en uno o ambos extremos, o una combinacion de los mismos. El ARNip puede formarse a partir de dos moleculas de ARN que se hibridan entre sf o, como alternativa, puede generarse a partir de un ARN de horquilla corta (ARNhc) (vease mas abajo). En algunas realizaciones, las dos cadenas del ARNip pueden ser completamente complementarias, de modo que no existan desajustes o protuberancias en el duplex formado entre las dos secuencias. En otras realizaciones, las dos cadenas del ARNip pueden ser sustancialmente complementarias, de modo que pueden existir uno o mas desajustes y/o protuberancias en el duplex formado entre las dos secuencias. En determinadas realizaciones, uno o ambos de los extremos 5' del ARNip pueden tener un grupo fosfato, mientras que en otras realizaciones uno o ambos de los extremos 5' carecen de un grupo fosfato. En otras realizaciones, uno o ambos de los extremos 3' del ARNip pueden tener un grupo hidroxilo, mientras que en otras realizaciones uno o ambos de los
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extremos 5' carecen de un grupo hidroxilo.
Una cadena del ARNip, que se conoce como la "cadena antisentido" o "cadena gma", incluye una parte que se hibrida con un transcrito diana. Un transcrito diana se refiere a una secuencia de acido nucleico expresada por una celula para la cual se desea alterar la expresion. En el contexto de una composicion terapeutica de la invencion, la alteracion de la expresion de un transcrito diana puede producir un efecto beneficioso. En realizaciones preferidas, la cadena antisentido del ARNip puede ser completamente complementaria con una region del transcrito diana, es decir, se hibrida con el transcrito diana sin una sola falta de coincidencia o protuberancia sobre una region diana entre aproximadamente 15 y aproximadamente 29 nucleotidos de longitud, preferentemente al menos 16 nucleotidos de longitud, y mas preferentemente aproximadamente de 18-20 nucleotidos de longitud. En otras realizaciones, la cadena antisentido puede ser sustancialmente complementaria a la region diana, es decir, pueden existir uno o mas desajustes y/o protuberancias en el duplex formado por la cadena antisentido y el transcrito diana. Normalmente, los ARNip estan dirigidos a secuencias exonicas del transcrito diana. Los expertos en la materia estan familiarizados con programas, algoritmos y/o servicios comerciales que disenan los ARNip para transcritos diana. Un ejemplo ejemplar es el algoritmo de diseno de ARNip de Rosetta (Rosetta Inpharmatics, North Seattle, WA), de ARNip de MISSION® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y de ARNip de siGENoME (Thermo Scientific). El ARNip puede sintetizarse enzimaticamente in vitro utilizando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Como alternativa, el ARNip puede sintetizarse qmmicamente utilizando tecnicas de smtesis de oligonucleotidos que son bien conocidas en la materia.
En otras realizaciones, el ARN no codificante puede ser un ARN de horquilla corta (ARNhc). En general, un ARNhc es una molecula de ARN que comprende al menos dos porciones complementarias que estan hibridadas o que son capaces de hibridarse para formar una estructura de doble cadena suficientemente larga para mediar la interferencia del ARN (como se describio anteriormente), y al menos una porcion de cadena unica que forma un bucle que conecta las regiones del ARNhc que forman el duplex. La estructura tambien puede llamarse estructura de tallo- bucle, siendo el tallo la parte duplex. En algunas realizaciones, la parte duplex de la estructura puede ser completamente complementaria, de modo que no existan desajustes o protuberancias en la region duplex del ARNhc. En otras realizaciones, la parte duplex de la estructura puede ser sustancialmente complementaria, de modo que pueden existir uno o mas desajustes y/o protuberancias en la parte duplex del ARNhc. El bucle de la estructura puede tener una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 nucleotidos, preferentemente de aproximadamente 4 a aproximadamente 10 nucleotidos de longitud, y mas preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 9 nucleotidos de longitud. El bucle puede ubicarse en el extremo 5' o 3' de la region que es complementaria al transcrito diana (es decir, la porcion antisentido del ARNhc).
El ARNhc puede comprender ademas un saliente en el extremo 5' o 3'. El saliente opcional puede tener una longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 nucleotidos, y mas preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 nucleotidos. En algunas realizaciones, el saliente puede comprender uno o mas restos de U, por ejemplo, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 restos de U. En algunas realizaciones, el extremo 5' del ARNhc pueden tener un grupo fosfato, mientras que en otras realizaciones puede no tenerlo. En otras realizaciones, el extremo 3' del ARNhc pueden tener un grupo hidroxilo, mientras que en otras realizaciones puede no tenerlo. En general, los ARNhc se procesan en los ARNip mediante la maquinaria de ARNi celular conservada. Por lo tanto, los ARNhc son precursores de los ARNip y son igualmente capaces de inhibir la expresion de un transcrito diana que es complementario de una porcion del ARNhc (es decir, la porcion antisentido del ARNhc). Los expertos en la materia estan familiarizados con los recursos disponibles (como se detalla anteriormente) para el diseno y smtesis de ARNhc. Un ejemplo de ello son los ARNhc de MISSION® (Sigma-Aldrich).
En aun otras realizaciones, el ARN no codificante puede ser un vector de expresion de ARNi de interferencia de ARN (ARNi). Normalmente, un vector de expresion de ARNi puede utilizarse para la smtesis intracelular (in vivo) de agentes de ARNi, tales como miARN, ARNip o ARNhc. En una realizacion, pueden transcribirse dos hebras de ARNip complementarias separadas utilizando un solo vector que contiene dos promotores, cada uno de los cuales dirige la transcripcion de una unica cadena de ARNip (es decir, cada promotor esta unido de manera operativa a una plantilla para el ARNip para que pueda ocurrir la transcripcion). Los dos promotores pueden estar en la misma orientacion, en cuyo caso cada uno esta unido operativamente a una plantilla para una de las cadenas de ARNip complementarias. Como alternativa, los dos promotores pueden estar en orientaciones opuestas, flanqueando una sola plantilla de modo que la transcripcion para los promotores de lugar a la smtesis de dos cadenas de ARNip complementarias. En otra realizacion, el vector de expresion de ARNi puede contener un promotor que impulsa la transcripcion de una unica molecula de ARN que comprende dos regiones complementarias, de modo que la transcripcion forma un ARNhc.
En terminos generales, los promotores utilizados para dirigir in vivo la expresion de una o mas unidades de transcripcion de ARNip o ARNhc pueden ser promotores de la ARN polimerasa III (Pol III). Ciertos promotores de Pol III, tales como los promotores U6 o H1, no requieren elementos reguladores que actuen en cis dentro de la region transcrita, y por lo tanto, se prefieren en ciertas realizaciones. En otras realizaciones, los promotores para Pol II pueden utilizarse para dirigir la expresion de una o mas unidades de transcripcion de ARNip o ARNhc. En algunas realizaciones, pueden utilizarse promotores Pol II espedficos de tejido, espedficos de celula o inducibles.
Un constructo que proporciona una plantilla para la smtesis de ARNip o ARNhc puede producirse utilizando
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procedimientos estandar de ADN recombinante e insertarse en cualquiera de una amplia variedad de vectores diferentes adecuados para la expresion en celulas eucariotas. Se pueden encontrar directrices en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y col., John Wiley & Sons, New York, 2003) o Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3a edicion, 2001). Los expertos en la materia tambien aprecian que los vectores pueden comprender secuencias reguladoras adicionales (por ejemplo, secuencia de terminacion, secuencia de control de traduccion, etc.), asf como secuencias de marcadores seleccionables. Los plasmidos de ADN son conocidos en la materia, incluidos los basados en pBR322, PUC y otros. Dado que muchos vectores de expresion ya contienen un promotor o promotores adecuados, puede que solo sea necesario insertar la secuencia de acido nucleico que codifica el agente de ARNi de interes en una ubicacion apropiada con respecto al promotor o promotores. Los vectores virales tambien pueden utilizarse para proporcionar la expresion intracelular de agentes de ARNi. Los vectores virales adecuados incluyen vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores de virus de herpes, y otros. En realizaciones preferidas, el vector de expresion de ARNi es un vector basado en lentiviral o partfcula lentiviral de ARNhc, como el proporcionado en los productos de ARNhc de MISSION® TRC (Sigma-Aldrich).
Las secuencias de acido nucleico de la divulgacion pueden obtenerse utilizando una variedad de diferentes tecnicas conocidas en la materia. Las secuencias de nucleotidos, asf como las secuencias homologas, pueden aislarse utilizando tecnicas estandar, compradas u obtenidas de un deposito. Una vez que se obtiene la secuencia de nucleotidos, puede amplificarse para su uso en una variedad de aplicaciones, utilizando procedimientos conocidos en la materia.
(c) Complejo Dolipeptido-polinucledtido
En otro aspecto de la invencion, un polipeptido y un polinucleotido de la invencion se asocian para formar un complejo. Como se utiliza en el presente documento, el termino "asociado" puede referirse a la interaccion de un peptido y un polinucleotido a traves de enlaces no covalentes, o al enlace covalente de un peptido y un polinucleotido. En realizaciones preferidas, un polipeptido y un polinucleotido de un complejo de la invencion se asocian a traves de enlaces no covalentes tales como un enlace de hidrogeno, un enlace ionico, un enlace basado en Van der Waals, un enlace hidrofobo o interacciones electrostaticas. Por ejemplo, un peptido de un complejo de la invencion puede tener una carga neta positiva global, que puede permitir que el peptido se asocie con un polinucleotido de un complejo de la invencion a traves de interacciones electrostaticas para formar un complejo de la invencion. Los procedimientos para formar un complejo polipeptido-polinucleotido de la invencion se conocen en la materia y se describen adicionalmente en la Seccion V y en los Ejemplos.
La relacion molar de peptido a polinucleotido a la que un peptido se asocia con un polinucleotido para formar un complejo de la invencion puede variar y variara dentro de la relacion molar definida en las reivindicaciones dependiendo del peptido, la composicion del polinucleotido o el tamano del polinucleotido y puede determinarse experimentalmente. En esencia, una relacion molar adecuada de un peptido a un polinucleotido puede ser una relacion molar en la que el peptido forma un complejo completamente con el polinucleotido, mientras minimiza la exposicion de un sujeto al peptido.
De acuerdo con la invencion, un peptido se asocia con un polinucleotido para formar un complejo de la invencion en una relacion molar de peptido a polinucleotido que es mas de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1.
En algunas realizaciones, un peptido y un polinucleotido de la invencion se asocian en una relacion molar de peptido a polinucleotido de al menos aproximadamente 50:1. En realizaciones adicionales, un peptido y un polinucleotido de la invencion se asocian en una relacion molar de peptido a polinucleotido de al menos aproximadamente 75:1. En otras realizaciones adicionales, un peptido y un polinucleotido de la invencion se asocian en una relacion molar de peptido a polinucleotido de al menos aproximadamente 100:1.
Cuando un polinucleotido es ARNip, una relacion molar adecuada de un peptido a un polinucleotido capaz de formar complejo completamente con el polinucleotido de ARNip puede ser mas de aproximadamente 50:1, pero menos de aproximadamente 200:1 para minimizar la exposicion de un sujeto al peptido. Dicho de otra manera, en algunas realizaciones, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede estar entre aproximadamente 50:1 y aproximadamente 200:1. En otras realizaciones, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 50:1, aproximadamente 51:1, aproximadamente 52:1, aproximadamente 53:1, aproximadamente 54:1 o aproximadamente 55:1. En otras realizaciones, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 70:1, aproximadamente 71:1, aproximadamente 72:1, aproximadamente 73:1, aproximadamente 74:1, aproximadamente 75:1, aproximadamente 76:1, aproximadamente 77:1, aproximadamente 78:1, aproximadamente 79:1 o aproximadamente 80:1. En algunas otras realizaciones, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 95:1, aproximadamente 96:1, aproximadamente 97:1, aproximadamente 98:1, aproximadamente 99:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 101:1, aproximadamente 102:1, aproximadamente 103:1, aproximadamente 104:1 o aproximadamente 105:1. En aun otras realizaciones, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 145:1, aproximadamente 146:1, aproximadamente 147:1, aproximadamente 148:1,
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aproximadamente 149:1, aproximadamente 150:1, 151:1, aproximadamente 152:1, aproximadamente 153:1, aproximadamente 154:1 o aproximadamente 155:1. En otras realizaciones, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 195:1, aproximadamente 196:1, aproximadamente 197:1, aproximadamente 198:1, aproximadamente 199:1, aproximadamente 200:1. En una realizacion preferente, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 150:1. En otra realizacion preferida, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 100:1. En otra realizacion preferida, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede ser de aproximadamente 50:1. En otra realizacion preferida, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede estar entre aproximadamente 50:1 y aproximadamente 100:1. En otra realizacion preferida, una relacion molar de un peptido y un polinucleotido de ARNip de la invencion puede estar entre aproximadamente 75:1 y aproximadamente 150:1.
Los procedimientos para determinar una relacion molar en la que el peptido es capaz de formar complejo completamente con el polinucleotido son conocidos en la materia, y pueden incluir ensayos de retardo de gel como se describe en los ejemplos. Los procedimientos para determinar una relacion molar en la que la exposicion de un sujeto al peptido se minimiza son conocidos en la materia, y pueden incluir mediciones de citotoxicidad utilizando dosis crecientes del polipeptido.
Un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede tener de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 999 nm de diametro, mas preferentemente de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 500 nm de diametro, mas preferentemente de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 250 nm de diametro. Como tal, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede denominarse "nanopartfcula". En algunas realizaciones, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, o aproximadamente 120 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, o 220 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, o 270 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente 280, 285, 290, 295, 300, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, o 345 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente 350, 355, 360, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, o 415 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, o 500 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, o 630 nm de diametro.
En una realizacion preferente, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 50 a aproximadamente 250 nm de diametro. Por ejemplo, una nanopartfcula de la invencion puede tener aproximadamente 50, aproximadamente 51, aproximadamente 52, aproximadamente 53, aproximadamente 54, aproximadamente 55,

aproximadamente 56, aproximadamente 57, aproximadamente 58, aproximadamente 59, aproximadamente 60,

aproximadamente 61, aproximadamente 62, aproximadamente 63, aproximadamente 64, aproximadamente 65,

aproximadamente 66, aproximadamente 67, aproximadamente 68, aproximadamente 69, aproximadamente 70,

aproximadamente 71, aproximadamente 72, aproximadamente 73, aproximadamente 74, aproximadamente 75,

aproximadamente 76, aproximadamente 77, aproximadamente 78, aproximadamente 79, aproximadamente 80,

aproximadamente 81, aproximadamente 82, aproximadamente 83, aproximadamente 84, aproximadamente 85,

aproximadamente 86, aproximadamente 87, aproximadamente 88, aproximadamente 89, aproximadamente 90,

aproximadamente 91, aproximadamente 92, aproximadamente 93, aproximadamente 94, aproximadamente 95,
aproximadamente 96, aproximadamente 97, aproximadamente 98, aproximadamente 99, aproximadamente 100, aproximadamente 101, aproximadamente 102, aproximadamente 103, aproximadamente 104, aproximadamente 105, aproximadamente 106, aproximadamente 107, aproximadamente 108, aproximadamente 109,

aproximadamente 110, aproximadamente 111, aproximadamente 112, aproximadamente 113, aproximadamente 114, aproximadamente 115, aproximadamente 116, aproximadamente 117, aproximadamente 118,

aproximadamente 119, aproximadamente 120, aproximadamente 121, aproximadamente 122, aproximadamente 123, aproximadamente 124, aproximadamente 125, aproximadamente 126, aproximadamente 127,

aproximadamente 128, aproximadamente 129, aproximadamente 130, aproximadamente 131, aproximadamente 132, aproximadamente 133, aproximadamente 134, aproximadamente 135, aproximadamente 136,

aproximadamente 137, aproximadamente 138, aproximadamente 139, aproximadamente 140, aproximadamente 141, aproximadamente 142, aproximadamente 143, aproximadamente 144, aproximadamente 145,

aproximadamente 146, aproximadamente 147, aproximadamente 148, aproximadamente 149, aproximadamente 150, aproximadamente 151, aproximadamente 152, aproximadamente 153, aproximadamente 154,

aproximadamente 155, aproximadamente 156, aproximadamente 157, aproximadamente 158, aproximadamente 159, aproximadamente 160, aproximadamente 161, aproximadamente 162, aproximadamente 163,

aproximadamente 164, aproximadamente 165, aproximadamente 166, aproximadamente 167, aproximadamente 168, aproximadamente 169, aproximadamente 170, aproximadamente 171, aproximadamente 172,

aproximadamente 173, aproximadamente 174, aproximadamente 175, aproximadamente 176, aproximadamente 177, aproximadamente 178, aproximadamente 179, aproximadamente 180, aproximadamente 181,

aproximadamente 182, aproximadamente 183, aproximadamente 184, aproximadamente 185, aproximadamente 186, aproximadamente 187, aproximadamente 188, aproximadamente 189, aproximadamente 190,
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aproximadamente 191, aproximadamente 192, aproximadamente 193, aproximadamente 194, aproximadamente 195, aproximadamente 196, aproximadamente 197, aproximadamente 198, aproximadamente 199,

aproximadamente 200, aproximadamente 201, aproximadamente 202, aproximadamente 203, aproximadamente 204, aproximadamente 205, aproximadamente 206, aproximadamente 207, aproximadamente 208,

aproximadamente 209, aproximadamente 210, aproximadamente 211, aproximadamente 212, aproximadamente 213, aproximadamente 214, aproximadamente 215, aproximadamente 216, aproximadamente 217,

aproximadamente 218, aproximadamente 219, aproximadamente 220, aproximadamente 221, aproximadamente 222, aproximadamente 223, aproximadamente 224, aproximadamente 225, aproximadamente 226,

aproximadamente 227, aproximadamente 228, aproximadamente 229, aproximadamente 230, aproximadamente 231, aproximadamente 232, aproximadamente 233, aproximadamente 234, aproximadamente 235,

aproximadamente 236, aproximadamente 237, aproximadamente 238, aproximadamente 239, aproximadamente 240, aproximadamente 241, aproximadamente 242, aproximadamente 243, aproximadamente 244,
aproximadamente 245, aproximadamente 246, aproximadamente 247, aproximadamente 248, aproximadamente 249 o aproximadamente 250 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 50 a aproximadamente 200 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 50 a aproximadamente 150 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 50 a aproximadamente 100 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 75 a aproximadamente 125 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 100 a aproximadamente 150 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 125 a aproximadamente 175 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 150 a aproximadamente 200 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 175 a aproximadamente 225 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 200 a aproximadamente 250 nm de diametro. En otra realizacion preferida, una nanopartfcula de la invencion tiene aproximadamente de 180 a aproximadamente 200 nm de diametro.
En determinadas realizaciones, una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede comprender un agregado de partfculas mas pequenas de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nm de diametro. Como tal, una nanopartfcula de la invencion puede comprender un agregado de partfculas mas pequenas de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o aproximadamente 30 nm de diametro. En algunas realizaciones, una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion comprende un agregado de partfculas mas pequenas de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o aproximadamente 15 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion comprende un agregado de partfculas mas pequenas de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o aproximadamente 20 nm de diametro. En algunas otras realizaciones, una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion comprende un agregado de partfculas mas pequenas de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o aproximadamente 25 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion comprende un agregado de partfculas mas pequenas de aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o aproximadamente 30 nm de diametro.
Una nanopartfcula de la invencion puede modificarse adicionalmente para mejorar la estabilidad de la nanopartfcula. Por ejemplo, una nanopartfcula de la invencion puede recubrirse con albumina para mejorar la estabilidad. Una nanopartfcula de la invencion recubierta con albumina puede tener aproximadamente de 5 a aproximadamente 90 nm o mas de diametro. Como tal, una nanopartfcula de la invencion puede comprender partfculas de aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, o aproximadamente 90 nm de diametro. En algunas realizaciones, una nanopartfcula de la invencion comprende partfculas de aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25 o aproximadamente 30 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion comprende partfculas de aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50 o aproximadamente 55 nm de diametro. En algunas otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion comprende partfculas de aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75 o aproximadamente 80 nm de diametro. En otras realizaciones, una nanopartfcula de la invencion comprende partfculas de aproximadamente 80, aproximadamente 85 o aproximadamente 90 nm o mas de diametro. En realizaciones preferidas, una nanopartfcula de la invencion comprende partfculas de aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70 o aproximadamente 75 nm de diametro.
El tamano de partfcula puede evaluarse utilizando procedimientos conocidos en la materia. Los ejemplos no limitantes de procedimientos para medir el tamano de una partfcula pueden incluir dispersion dinamica de la luz, difraccion laser, electrozona (zona de deteccion electrica), oscurecimiento de la luz - tambien conocido como fotozona y deteccion optica de partfculas individuales (SPOS, de sus siglas en ingles), analisis granulometrico,
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medidas aerodinamicas, diametro de permeabilidad al aire, sedimentacion, medicion del potencial zeta de la partfcula, o combinaciones de los mismas. En una realizacion preferente, el tamano de partfcula se evalua mediante dispersion dinamica de la luz. En otra realizacion preferida, el tamano de partfcula se evalua midiendo el potencial zeta de la partfcula. En todavfa otra realizacion preferente, el tamano de partfcula se evalua mediante dispersion dinamica de la luz o midiendo el potencial zeta de la partfcula.
Una nanopartfcula de la invencion puede tener un potencial zeta de aproximadamente -15 a aproximadamente 20 mV, preferentemente de aproximadamente 0 mV o mas. Por ejemplo, una nanopartfcula puede tener un potencial zeta de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19 o aproximadamente 20 mV o mas. En algunas realizaciones, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o aproximadamente 5 mV. En otras realizaciones, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 10, 11, 12, 13, o aproximadamente 14 mV. En algunas otras realizaciones, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14 o aproximadamente 15 mV. En una realizacion de ejemplo, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 o aproximadamente 5 mV. En otras realizaciones, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 10, aproximadamente 11, 12, aproximadamente 13 o aproximadamente 14 mV. En una realizacion de ejemplo, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 3,72 mV. En otra realizacion ejemplar, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 12 mV. En todavfa otra realizacion ejemplar, una nanopartfcula tiene un potencial zeta de aproximadamente 13,1 mV.
Una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede tener una relacion de carga positiva a negativa de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 30:1, preferentemente de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 25:1. En algunas realizaciones, una nanopartfcula tiene una relacion de carga positiva a negativa de aproximadamente 4:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 6:1, aproximadamente 7:1 o aproximadamente 8:1. En otras realizaciones, una nanopartfcula tiene una relacion de carga positiva a negativa de aproximadamente 10:1, aproximadamente 11:1, aproximadamente 12:1, aproximadamente 13:1 o aproximadamente 14:1. En algunas otras realizaciones, una nanopartfcula tiene una relacion de carga positiva a negativa de aproximadamente 22:1, aproximadamente 23:1, aproximadamente 24:1, aproximadamente 25:1 o aproximadamente 26:1.
Como se describe en la Seccion I(a), un complejo peptido-polinucleotido es capaz de liberar eficazmente el polinucleotido en el citoplasma de una celula. Un complejo peptido-polinucleotido tambien puede ser capaz de proteger al polinucleotido de la degradacion tras la administracion en un sujeto. Como tal, una nanopartfcula peptido- polinucleotido de la invencion puede permanecer estable en presencia de suero. Una nanopartfcula puede permanecer estable en presencia de suero durante aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60 minutos, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 horas, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dfas o mas. Una nanopartfcula puede permanecer estable en presencia de aproximadamente 50, 100, 150, 200, o aproximadamente 300 pg/ml o mas de albumina de suero humano. La estabilidad de una nanopartfcula puede determinarse midiendo la capacidad de una nanopartfcula para mantener la actividad de un polinucleotido del complejo peptido-polinucleotido de la nanopartfcula, o midiendo los cambios en el tamano de una nanopartfcula a lo largo del tiempo. Los procedimientos para medir el tamano de una nanopartfcula pueden ser los descritos en esta Seccion.
Los procedimientos para preparar un complejo peptido-polinucleotido de la invencion generalmente comprenden poner en contacto un peptido con un polinucleotido para formar un complejo peptido-polinucleotido. Normalmente, un peptido y un polinucleotido se ponen en contacto mediante la incubacion en condiciones adecuadas para que se forme un complejo peptido-polinucleotido. Las condiciones adecuadas para que se forme un complejo peptido- polinucleotido pueden ser las descritas en los ejemplos. Normalmente, dichas condiciones pueden comprender una temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 40 °C, y tiempos de incubacion de entre aproximadamente 20 segundos a aproximadamente 60 minutos o mas. Las temperaturas adecuadas tambien pueden ser inferiores a aproximadamente 30 °C. Por ejemplo, la incubacion puede ocurrir en el hielo. Un experto en la materia apreciara que la duracion y la temperatura de la incubacion pueden variar y variaran dependiendo del peptido y el polinucleotido, y pueden determinarse experimentalmente.
Una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede modificarse adicionalmente para mejorar la estabilidad de la nanopartfcula. Por ejemplo, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede entrecruzarse para mejorar la estabilidad de las nanopartfculas. Un experto en la materia reconocera que un reticulante adecuado puede variar y variara dependiendo de la composicion de la nanopartfcula y el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede entrecruzarse qmmicamente utilizando reticulantes qmmicos tales como glutaraldetudo, espaciadores de acido bis-carboxflico, esteres activos de acido biscarboxflico, utilizando un protocolo de acoplamiento de amina/acido bis-enlazador por carbodiimida, o utilizando un protocolo de qrnmica de clic, qrnmica del acoplamiento carbodiimida, acilacion, acoplamiento ester activo, o alquilacion.
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Como alternativa, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede estar cubierto con un componente capaz de mejorar la estabilidad de las nanopartfculas. Los procedimientos para modificar una nanopartfcula para mejorar la estabilidad son conocidos en la materia, y pueden ser como se describe en Nicolas y col., 2013 Acta Biomater. 9:4754-4762.
Como se utiliza en el presente documento, el termino "recubrimiento" puede referirse a la interaccion de un complejo peptido-polinucleotido con un compuesto a traves de enlaces no covalentes, o al enlace covalente de un complejo peptido-polinucleotido y un compuesto. En realizaciones preferidas, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion y un compuesto de recubrimiento se asocian a traves de enlaces no covalentes tales como un enlace de hidrogeno, un enlace ionico, un enlace basado en Van der Waals, un enlace hidrofobo o interacciones electrostaticas. Por ejemplo, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede tener una carga positiva neta global, y un compuesto de recubrimiento puede tener una carga negativa global que puede permitir que el complejo peptido-polinucleotido y el compuesto se asocien a traves de interacciones electrostaticas para formar un complejo de la invencion.
Los ejemplos no limitantes de compuestos que pueden utilizarse para recubrir una nanopartfcula para mejorar la estabilidad de la nanopartfcula incluyen albumina, acidos grasos tales como acido oleico, polietilenglicol, polisacaridos tales como quitosan, heparina o heparanos y otros glicosaminoglicanos u otros materiales de recubrimiento publicados conocidos por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, la estabilidad de un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede mejorarse mediante el recubrimiento de nanopartfculas con un acido graso. En otras realizaciones, la estabilidad de un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede mejorarse mediante el recubrimiento de nanopartfculas con polisacarido.
En realizaciones preferidas, la estabilidad de una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede mejorarse mediante el recubrimiento de nanopartfculas con albumina. Las albuminas son protemas globulares cargadas negativamente que se encuentran comunmente en el suero sangumeo. Aunque sin desear quedar ligados a teona alguna, se cree que recubrir las nanopartfculas de la invencion con albumina puede mejorar la estabilidad de las nanopartfculas al prevenir la floculacion. Preferentemente, las albuminas que se pueden utilizar para recubrir una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion son albuminas de suero y pueden incluir albumina de suero bovino y albumina de suero humano. En una realizacion ejemplar, la estabilidad de una nanopartfcula que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede mejorarse mediante el recubrimiento de nanopartfculas con albumina de suero humano.
En esencia, una nanopartfcula se recubre con albumina mediante la incubacion de la nanopartfcula con una solucion que comprende albumina. Las nanopartfculas pueden incubarse en una solucion que comprende aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, o aproximadamente 1 mg/ml o mas de albumina. En algunas realizaciones, las nanopartfculas que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion pueden incubarse en una solucion que comprende aproximadamente 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 o aproximadamente 0,3 mg/ml de albumina. En otras realizaciones, las nanopartfculas que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion pueden incubarse en una solucion que comprende aproximadamente 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 o aproximadamente 0,5 mg/ml de albumina. En algunas otras realizaciones, las nanopartfculas que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion pueden incubarse en una solucion que comprende aproximadamente 0,5, 0,55, 0,6, 0,65 o aproximadamente 0,7 mg/ml de albumina. En otras realizaciones, las nanopartfculas que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion pueden incubarse en una solucion que comprende aproximadamente 0,7, 0,75, 0,8, 0,85 o aproximadamente 0,9 mg/ml de albumina. En realizaciones adicionales, las nanopartfculas que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion pueden incubarse en una solucion que comprende aproximadamente 0,9, 0,95, 1 o aproximadamente 1,5 mg/ml de albumina. En realizaciones preferidas, las nanopartfculas que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion pueden incubarse en una solucion que comprende aproximadamente 0,4, 0,45, 0,5, 0,55 o aproximadamente 0,6 mg/ml de albumina.
Un complejo peptido-polinucleotido puede incubarse con albumina durante aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, o aproximadamente 60 minutos o mas para recubrir el complejo peptido-polinucleotido. En algunas realizaciones, una partfcula que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion se incuba con albumina durante aproximadamente 5, 10, 15 o aproximadamente 20 minutos. En otras realizaciones, una partfcula que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion se incuba con albumina durante aproximadamente 20, 25, 30 o aproximadamente 35 minutos. En algunas otras realizaciones, una partfcula que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion se incuba con albumina durante aproximadamente 35, 40, 45 o aproximadamente 50 minutos. En otras realizaciones, una partfcula que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion se incuba con albumina durante aproximadamente 50, 55 o aproximadamente 60 minutos o mas. En realizaciones preferidas, una partfcula que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion se incuba con albumina durante aproximadamente 25, 30 o aproximadamente 35 minutos.
(d) celula
En otro aspecto de la invencion, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion es capaz de transfectar el polinucleotido en el citoplasma de una celula. En algunas realizaciones, una celula es una celula procariota. En realizaciones preferidas, una celula es una celula eucariota. Una celula puede estar in vitro, in vivo, in situ, o ex vivo.
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Una celula puede ser una celula unica o puede comprender un tejido o un organo. El termino "celula" tambien se refiere a una celula en un sujeto.
Un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede administrate a una celula in vitro mediante la incubacion de una celula en presencia de un complejo peptido-polinucleotido de la invencion en condiciones adecuadas para la transfeccion de un polinucleotido de un complejo peptido-polinucleotido. Las condiciones adecuadas para la transfeccion de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido pueden ser como se describen en los ejemplos. Un experto en la materia apreciara que la duracion de la incubacion puede variar y variara dependiendo del complejo peptido-polinucleotidos y de las celulas. Normalmente, tales condiciones pueden comprender tiempos de incubacion de entre aproximadamente diez minutos y 24 horas. Mas preferentemente, las condiciones de transfeccion pueden comprender tiempos de incubacion de entre aproximadamente 15 minutos y 3 horas.
Un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede administrarse a una celula in vivo (es decir, en un sujeto) mediante la administracion a un sujeto de una composicion que comprende un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. Las composiciones adecuadas se describen con mas detalle en la Seccion II a continuacion.
II. COMPOSICION FARMACEUTICA
En otro aspecto de la invencion, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede incorporarse en composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion. Una composicion farmaceutica de la invencion puede utilizarse para alterar la expresion de una o mas de una secuencia de acido nucleico normalmente expresada en una celula. Por ejemplo, una composicion farmaceutica de la invencion puede utilizarse para alterar la expresion de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas secuencias de acido nucleico normalmente expresadas en una celula. Un experto en la materia apreciara que las composiciones farmaceuticas pueden administrarse para tratar una enfermedad, para prevenir una enfermedad o para promover una buena salud. Como tal, una composicion farmaceutica de la invencion puede utilizarse para alterar la expresion de cualquier secuencia de acido nucleico normalmente expresada en una celula, de tal manera que la expresion alterada conduce a efectos medibles y beneficiosos para el sujeto al que se administra la composicion (es decir, eficacia significativa)
En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente expresada en una celula. En una realizacion preferente, una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3. En otra realizacion preferida, una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica JNK2. En todavfa otra realizacion preferente, una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p65 de la ruta de senalizacion canonica de NFkB. En otra realizacion preferida, una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p100/p52 de la ruta de senalizacion canonica de NFkB.
En otras realizaciones, una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de dos secuencias de acido nucleico normalmente expresadas en una celula. En una realizacion preferente, una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p65 de la ruta de senalizacion canonica de NFkB, y una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p100/p52 de la ruta de senalizacion canonica de NFkB.
Cuando una composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para alterar la expresion de mas de una secuencia de acido nucleico normalmente expresada en una celula, puede formularse una composicion farmaceutica utilizando una mezcla de mas de un complejo peptido-polinucleotido, en la que cada complejo comprende un polinucleotido capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico diferente normalmente expresada en una celula. Como alternativa, puede utilizarse mas de un polinucleotido para generar una mezcla de complejos peptido- polinucleotido, en los que cada polinucleotido es capaz de alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico diferente normalmente expresada en una celula.
Una composicion farmaceutica de la invencion tambien puede comprender uno o mas portadores, adyuvantes, excipientes y vehfculos no toxicos farmaceuticamente aceptables, segun se desee. Como se utiliza en el presente documento, el lenguaje "vetnculo farmaceuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares, compatibles con la administracion farmaceutica. La utilizacion de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las nanopartfculas de la invencion, se contempla su uso en las composiciones. Los compuestos activos complementarios tambien pueden incorporarse en las composiciones.
Una composicion farmaceutica de la invencion puede formularse para que sea compatible con su ruta de administracion prevista. Las vfas de administracion adecuadas incluyen administracion parenteral, oral, pulmonar, transdermica, transmucosa y rectal. El termino parenteral, tal como se usa en el presente documento, incluye inyeccion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intratecal o intraesternal, o tecnicas de infusion.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir los
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siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bendlico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminotetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clortndrico o hidroxido de sodio. La preparacion parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis multiples hechos de vidrio o plastico.
Las composiciones orales generalmente pueden incluir un diluyente inerte o un vehfculo comestible. Las composiciones orales pueden incluirse en capsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el fin de la administracion terapeutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trociscos o capsulas. Las composiciones orales tambien pueden prepararse utilizando un vehfculo fluido para su uso como un enjuague bucal, en el que el compuesto en el vehfculo fluido se aplica oralmente y se agita y expectora o se traga. Pueden incluirse agentes de union farmaceuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composicion. Los comprimidos, pfldoras, capsulas, trociscos y similares, pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa; un agente desintegrante tal como acido algmico, Primogel, o almidon de mafz; un lubricante como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante como la menta, salicilato de metilo, o sabor a naranja. Para la administracion por inhalacion, los compuestos se suministran en forma de un aerosol desde un recipiente o dispensador a presion que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas como el dioxido de carbono, o un nebulizador.
En realizaciones preferidas, una composicion farmaceutica de la invencion se formula para ser compatible con la administracion parenteral. Por ejemplo, las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir soluciones acuosas esteriles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones esteriles inyectables. Para la administracion intravenosa, los vetnculos adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL (BASF; Parsippany, N.J.) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS, de sus siglas en ingles). En una realizacion ejemplar, una composicion farmaceutica de la invencion se formula con solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
En todos los casos, una composicion puede ser esteril y puede ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyeccion. Una composicion puede ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento, y puede conservarse contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vetnculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante la utilizacion de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante la utilizacion de surfactantes. La prevencion de la accion de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes como el manitol, sorbitol, o cloruro de sodio, en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles pueden prepararse mediante la incorporacion del compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de los ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporacion del compuesto activo en un vetnculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos preferidos de preparacion son secado al vacfo y secado por congelacion, que produce un polvo del principio activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de una solucion previamente esterilizada y filtrada del mismo.
La administracion sistemica tambien puede ser por medios transmucosos o transdermicos. Para la administracion transmucosa o transdermica, en la formulacion se utilizan penetrantes apropiados para la barrera a permear. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la materia y pueden incluir, por ejemplo, para administracion transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusfdico. La administracion transmucosa puede lograrse mediante la utilizacion de aerosoles nasales o supositorios. Para la administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en unguentos, pomadas, geles o cremas como se conoce generalmente en la materia. Los compuestos tambien pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retencion para administracion rectal.
En una realizacion, los compuestos activos se preparan con vetnculos que protegeran el compuesto contra la eliminacion rapida del cuerpo, como una formulacion de liberacion controlada, que incluye implantes y sistemas de
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suministro microencapsulados. Se pueden utilizar poUmeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno vinil acetato, poliantndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Los procedimientos para la preparacion de tales formulaciones seran evidentes para los expertos en la materia. Estos pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N.° 4.522.811.
Formulaciones adicionales de composiciones farmaceuticas pueden estar en, por ejemplo, Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1975) y Liberman, H. A. y Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Nueva York, N.Y. (1980). Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 16Ed ISBN: 0-912734-04-3, ultima edicion, proporciona un compendio de tecnicas de formulacion como son generalmente conocidas por los practicantes.
Un experto en la materia reconocera que la concentracion de un complejo de peptido-polinucleotido de la invencion en una composicion farmaceutica puede variar y variara dependiendo en parte de la via de administracion, el sujeto y el motivo de la administracion, y puede determinarse experimentalmente. Los procedimientos para determinar experimentalmente la concentracion de un agente activo tal como las nanopartfculas de la invencion en una composicion farmaceutica son conocidos en la materia. En general, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 50 |jM de un polinucleotido en un complejo peptido- polinucleotido de la invencion. Por ejemplo, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 0,1 nM, 0,2 nM, 0,3 nM, 0,4 nM, 0,5 nM, 0,6 nM, 0,7 nM, 0,8 nM, 0,9 nM, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 11 nM, 12 nM, 13 nM, 14 nM, 15 nM, 16 nM, 17 nM, 18 nM, 19 nM, 20 nM, 21 nM, 22 nM, 23 nM, 24 nM, 25 nM, 26 nM, 27 nM, 28 nM, 29 nM, 30 nM, 31 nM, 32 nM, 33 nM, 34 nM, 35 nM, 36 nM,
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nM,
990 nM, CD CD nM, CD CD K) CD CD CO 994 nM, 995 nM, 996 nM, 997 nM, 998 nM, 999 nM, 1 pM, 2 pM 3 pM, 4 pM,
5 |JM, 6 |JM, 7 |JM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 11 pM, 12 pM, 13 pM, 14 pM, 15 pM, 16 pM, 17 pM, 18 pM, 19 pM, 20 pM, 21 pM, 22 pM, 23 pM, 24 pM, 25 pM, 26 pM, 27 pM, 28 pM, 29 pM, 30 pM, 31 pM, 32 pM, 33 pM, 34 pM, 35 pM, 36 pM, 37 pM, 38 pM, 39 pM, 40 pM, 41 pM, 42 pM, 43 pM, 44 pM, 45 pM, 46 pM, 47 pM, 48 pM, 49 pM, o aproximadamente 50 pM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 0,1 nM a aproximadamente 1,0 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 1 nM a aproximadamente 200 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 1 nM a aproximadamente 50 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 10 nM a aproximadamente 200 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 50 nM a aproximadamente 100 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 50 nM a aproximadamente 200 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 100 nM a aproximadamente 200 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 150 nM a aproximadamente 200 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 200 nM a aproximadamente 100 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 500 nM a aproximadamente 1000 nM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica puede formularse para comprender aproximadamente 1 pM a aproximadamente 50 pM de un polinucleotido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion. Una concentracion de peptido en un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede calcularse basandose en la concentracion deseada de polinucleotido y la relacion de peptido a polinucleotido en el complejo peptido- polinucleotido de la invencion.
Una composicion farmaceutica tambien puede formularse para comprender aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80,
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III. PROCEDIMIENTO DE USO
En otro aspecto, la invencion abarca un procedimiento para utilizar un complejo peptido-polinucleotido de la invencion para transfectar el polinucleotido en el citoplasma de una celula. En algunas realizaciones, la celula esta in vitro. En otras realizaciones, la celula esta in vivo. Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona un procedimiento para utilizar un complejo peptido-polinucleotido de la invencion para transfectar el polinucleotido en el citoplasma de una celula en un sujeto que lo necesite. En terminos generales, un procedimiento de la invencion comprende poner en contacto una celula con un complejo peptido-polinucleotido de la invencion en condiciones adecuadas para la transfeccion de un polinucleotido. Las celulas y condiciones adecuadas se describen anteriormente en la Seccion I. En realizaciones en las que la celula esta in vivo, un procedimiento de la invencion comprende normalmente administrar una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido- polinucleotido de la invencion a un sujeto que lo necesite. Las composiciones farmaceuticas adecuadas se describen en la Seccion II.
En otro aspecto, la invencion abarca un procedimiento para tratar una afeccion en un sujeto. El procedimiento comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido. Un complejo peptido-polinucleotido de la invencion es capaz de transfectar eficazmente, o suministrar, el polinucleotido del complejo de peptido-polinucleotido en una celula del sujeto.
En algunas realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico expresada en una celula. Mediante la transfeccion eficaz de un polinucleotido capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico expresada en una celula, se puede utilizar un procedimiento de la invencion para tratar cualquier afeccion que pueda tratarse regulando o inhibiendo la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente expresada en una celda. En algunas realizaciones preferidas, la invencion abarca un procedimiento para administrar un complejo peptido- polinucleotido de la invencion a un sujeto para tratar una afeccion mediada por NFkB seleccionada de un tumor y artritis en el sujeto. En otras realizaciones preferidas, la invencion abarca un procedimiento para administrar a un sujeto un complejo peptido-polinucleotido de la invencion para tratar la angiogenesis asociada con la expresion de STAT3 en el sujeto. En otras realizaciones preferidas, la invencion abarca un procedimiento para administrar a un sujeto un complejo peptido-polinucleotido de la invencion para inhibir la formacion de celulas espumosas asociada con la desregulacion de JNK2 en el sujeto.
En otras realizaciones, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende ADN que codifica una protema que es deficiente o esta ausente en el sujeto. Los ejemplos no limitantes de enfermedades caracterizadas por una protema deficiente o ausente en un sujeto incluyen enfermedades de las neuronas motoras inferiores, enfermedad de Pompe, trastornos de almacenamiento lisosomal y glioblastoma multiforme. En una realizacion preferente, un polinucleotido de un complejo de la invencion comprende ADN que codifica una protema que es deficiente o esta ausente en un sujeto con una enfermedad de almacenamiento lisosomal. La terapia de reemplazo enzimatico es particularmente adecuada para enfermedades de almacenamiento lisosomal, y un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede utilizarse para transfectar un casete o vector de expresion que codifica una protema que es deficiente o esta ausente en un sujeto con una enfermedad de almacenamiento lisosomal en el citoplasma del sujeto. Los trastornos de almacenamiento lisosomal incluyen, pero no se limitan a, Deficiencia del activador/Gangliosidosis GM2, Alfa-manidosidosis, Aspartilglucosaminuria, enfermedad de almacenamiento de ester de colesterilo, deficiencia cronica de hexosaminidasa A, cistinosis, enfermedad de Danon, enfermedad de Fabry, enfermedad de Farber, Fucosidosis, Galactosialidosis, enfermedad de Gaucher (Tipo I, tipo ll, tipo lll), Gangliosidosis GM1 (Infantil, Infantil Tardm/Juvenil, Adulto/ cronico), enfermedad de celulas I/Mucolipidosis II, Enfermedad de almacenamiento de acido sialico libre infantil/ISSD, deficiencia de hexosaminidasa A juvenil, enfermedad de Krabbe (aparicion infantil, aparicion tardfa), Leucodistrofia metacromatica, trastornos de las mucopolisacaridosis (polidistrofia seudohurler/mucolipidosis IIIA, Smdrome de MPSI Hurler, Smdrome de MPSI Scheie, Smdrome de MPS I Hurler- Scheie, Smdrome de MPS I Hurler, Smdrome de Sanfilippo Tipo A/MPS III A, Smdrome de Sanfilippo Tipo B/MPS III B, Smdrome de Sanfilippo Tipo C/MPS III C, Smdrome de Sanfilippo Tipo D/MPS III D, Morquio Tipo A/MPS IVA, Morquio Tipo B/MPS IVB, Deficiencia de Hialuronidasa MPS IX, mPS VI Maroteaux-Lamy, Smdrome de MPS VII Sly, Mucolipidosis I/Sialidosis, Mucolipidosis IIIC, Mucolipidosis tipo IV), Deficiencia multiple de sulfatasa, Enfermedad de Niemann-Pick (tipo A, tipo B, tipo C), Lipofuscinosis Ceroides Neuronales (enfermedad CLN6 (infantil tardfa atfpica,
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variante de inicio tardfo, juvenil temprano), enfermedad Batten-Spielmeyer-Vogt/juvenil NCL/CLN3, variante finlandesa infantil ta^a CLN5, enfermedad de Jansky-Bielschowsky/Enfermedad de CLN2/TPP1 infantil tardfa, enfermedad de NCL/CLN4 de inicio en Kufs/adulto, epilepsia del Norte/variante infantil tardfa CLN8, enfermedad de Santavuori-Haltia/CLN1/PPT infantil, Beta-manidosidosis, Enfermedad de Pompe/enfermedad por almacenamiento de glucogeno tipo II, Picnodisostosis, Enfermedad de Sandhoff/aparicion en adulto/Gangliosidosis GM2, enfermedad de Sandhoff/gangliosidosis GM2-Infantil, enfermedad de Sandhoff/gangliosidosis GM2-juvenil, enfermedad de Schindler, enfermedad de Salla/Enfermedad por almacenamiento de acido sialico, Gangliosidosis Tay-Sachs/GM2, enfermedad de Wolman. En una realizacion ejemplar, el sujeto requiere tratamiento para una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en la enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, MPS I, MPS II] MPS VI y enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo II.
El peptido, el polinucleotido y el complejo peptido-polinucleotido pueden ser como se describe en la Seccion I. Las composiciones farmaceuticas que comprenden un complejo peptido-polinucleotido de la invencion pueden ser como se describe en la Seccion II. Los procedimientos para administrar un complejo peptido-polinucleotido de la invencion y los procedimientos para tratar una afeccion se describen a continuacion.
(a) Administracion a un sujeto que lo necesite
En un aspecto, la presente invencion abarca la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion farmaceutica a un sujeto que la necesite. Como se utiliza en el presente documento, la frase "un sujeto que lo necesite" se refiere a un sujeto que necesita tratamiento preventivo o terapeutico. Un sujeto puede ser un roedor, un ser humano, un animal de ganado, un animal de comparMa o un animal de zoologico. En una realizacion, un sujeto puede ser un roedor, por ejemplo, un raton, una rata, un conejillo de indias, etc. En otra realizacion, un sujeto puede ser un animal de ganado. Los ejemplos no limitantes de animales de ganado adecuados pueden incluir cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, llamas y alpacas. En aun otra realizacion, un sujeto puede ser un animal de comparMa. Los ejemplos no limitantes de animales de comparMa pueden incluir mascotas como perros, gatos, conejos y pajaros. En aun otra realizacion, un sujeto puede ser un animal de zoologico. Como se utiliza en el presente documento, un "animal de zoologico" se refiere a un animal que se puede encontrar en un zoologico. Tales animales pueden incluir primates no humanos, gatos grandes, lobos y osos. En una realizacion preferente, un sujeto es un raton. En otra realizacion preferida, un sujeto es un ser humano.
Como se describe en la Seccion II, una composicion farmaceutica de la invencion se formula para que sea compatible con su ruta de administracion prevista. Las rutas de administracion adecuadas incluyen administracion parenteral, oral, pulmonar, transdermica, transmucosa y rectal. En realizaciones preferidas, una composicion farmaceutica de la invencion se administra mediante inyeccion.
Un experto en la materia reconocera que la cantidad y la concentracion de la composicion administrada a un sujeto dependeran en parte del sujeto y del motivo de la administracion. Los procedimientos para determinar las cantidades optimas son conocidos en la materia. En general, la concentracion de un complejo peptido-polinucleotido de la invencion en una composicion farmaceutica puede ser como se describe en la Seccion ll.
Las composiciones de la invencion se administran normalmente a un sujeto que lo necesita en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio al sujeto. Esta cantidad se define como una "cantidad terapeuticamente eficaz". Una cantidad terapeuticamente eficaz puede determinarse por la eficacia o potencia de la composicion particular, el trastorno que se esta tratando, la duracion o frecuencia de la administracion, el procedimiento de administracion y el tamano y condicion del sujeto, incluida la respuesta al tratamiento particular de ese sujeto. Una cantidad terapeuticamente eficaz puede determinarse utilizando procedimientos conocidos en la materia, y puede determinarse experimentalmente, derivandose de cantidades terapeuticamente eficaces determinadas en animales modelo tales como el raton, o una combinacion de los mismos. De manera adicional, la ruta de administracion puede considerarse cuando se determina la cantidad terapeuticamente eficaz. Al determinar las cantidades terapeuticamente eficaces, un experto en la materia tambien puede considerar la existencia, naturaleza y alcance de cualquier efecto adverso que acompane la administracion de un compuesto particular en un sujeto particular.
Cuando una composicion farmaceutica de la invencion se administra a un sujeto por inyeccion, puede administrarse una composicion al sujeto en un bolo en una cantidad de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3,
3.5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, o aproximadamente 100 mg/kg o mas. En algunas realizaciones, una composicion farmaceutica de la invencion se administra a un sujeto en una cantidad de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, o aproximadamente 5 mg/kg. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica de la invencion se administra a un sujeto en una cantidad de aproximadamente 5, 5,5, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12,
12.5, 13, 13,5, 14, 14,5, o aproximadamente 15 mg/kg. En algunas otras realizaciones, una composicion farmaceutica de la invencion se administra a un sujeto en una cantidad de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o aproximadamente 30 mg/kg. En otras realizaciones, una composicion farmaceutica de la invencion se administra a un sujeto en una cantidad de aproximadamente 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o aproximadamente 45 mg/kg. En realizaciones adicionales, una composicion farmaceutica de la invencion se administra a un sujeto en una cantidad de aproximadamente 45, 46, 47, 48, 49, 50,
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60, 70, 80, 90, o aproximadamente 100 mg/kg o mas. En realizaciones preferidas, una composicion se administra al sujeto en un bolo en una cantidad de aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 o aproximadamente 1,5 mg/kg.
Tambien puede administrate una composicion mediante inyeccion de mas de un bolo en el sujeto durante un penodo de tiempo. Por ejemplo, una composicion puede administrarse mediante inyeccion de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas bolos en el sujeto. En algunas realizaciones, una composicion se administra mediante inyeccion de 1, 2, 3, 4 o 5 bolos en el sujeto. En otras realizaciones, una composicion se administra mediante inyeccion de 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas bolos en el sujeto. En realizaciones preferidas, una composicion se administra mediante inyeccion de 2, 3 o 4 bolos en el sujeto. Los bolos pueden inyectarse aproximadamente cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o aproximadamente cada 12 horas, o pueden inyectarse aproximadamente cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, o aproximadamente cada 7 dfas. En realizaciones preferidas, los bolos pueden inyectarse aproximadamente cada dfa.
(b) Tratamiento de una afeccion mediada por NFkB
Como se ha descrito anteriormente, un procedimiento de la invencion puede utilizarse para tratar una afeccion mediada por NFkB en un sujeto. Un procedimiento de la invencion puede utilizarse para tratar una afeccion mediada por NFkB en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con una ruta de senalizacion de NFkB. Un procedimiento de la invencion puede utilizarse para tratar una afeccion mediada por NFkB en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB canonica, la ruta de senalizacion de NFkB no canonica, o tanto la ruta de senalizacion de NFkB canonica como no canonica. Como se describe en los ejemplos, los solicitantes sorprendentemente descubrieron que la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB canonica y la ruta de senalizacion de NFkB no canonica es sinergica. El termino "sinergico" se refiere a un efecto en el que dos o mas agentes trabajan en sinergia para producir un efecto que es mas aditivo que los efectos de cada agente de forma independiente. Una medida del sinergismo puede mostrarse mediante el procedimiento de mdice de combinacion de Chou-Talalay. El procedimiento de mdice de Chou-Talalay se basa en la ecuacion del efecto de la mediana y procede del principio de la ley de accion en masa, que es la teona que vincula entidades unicas y multiples, y dinamicas de primer orden y de orden superior, que abarcan las ecuaciones de Michaelis-Menten, Hill, Henderson-Hasselbalch y Scatchard. El procedimiento de mdice de combinacion de Chou-Talalay proporciona un mdice de combinacion (IC) en el que un efecto aditivo da un IC = 1, el sinergismo da un IC < 1 y el antagonismo da un IC > 1. Vease Ting-Chao Chou, 2008, Preclinical versus clinical drug combination studies, Leukemia & Lymphoma, 49:2059-2080.
En algunas realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar una afeccion mediada por NFkB en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB canonica. En una alternativa ejemplar de las realizaciones, una afeccion mediada por NFkB en un sujeto se trata mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p65 del factor de transcripcion de la ruta de senalizacion de NFkB canonica.
En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar una afeccion mediada por NFkB en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB no canonica. En una alternativa ejemplar de las realizaciones, una afeccion mediada por NFkB en un sujeto se trata mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p100/p52 de la ruta de senalizacion de NFkB canonica.
En realizaciones preferidas, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar una afeccion mediada por NFkB en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB canonica, y una secuencia de acido nucleico normalmente asociada con la ruta de senalizacion de NFkB no canonica. En una alternativa ejemplar de las realizaciones, una afeccion mediada por NFkB en un sujeto se trata mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p65 del factor de transcripcion de la ruta de senalizacion de NFkB canonica y la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica la subunidad p100/p52 de la ruta de senalizacion de NFkB canonica.
La expresion "afeccion mediada por NFkB" puede utilizarse para describir cualquier afeccion que pueda ser causada por la desregulacion de la senalizacion en una ruta de senalizacion de NFkB. Los ejemplos no limitantes de afecciones mediadas por NFkB pueden incluir un trastorno de inflamacion, una enfermedad autoinmune, rechazo de trasplantes, osteoporosis, cancer, artritis, enfermedad del Alzheimer, artritis, aterosclerosis, una infeccion viral o ataxia telangiectasia. En algunas realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar un trastorno de inflamacion. En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar una enfermedad autoinmune. En algunas otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar rechazo de trasplantes. En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar osteoporosis. En realizaciones adicionales, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar la enfermedad del Alzheimer. En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar aterosclerosis. En algunas otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar una infeccion viral. En aun otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar ataxia telangiectasia.
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i. Tratamiento del cancer
En realizaciones preferidas, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar una neoplasia o cancer. La neoplasia puede ser maligna o benigna, el cancer puede ser primario o metastasico; la neoplasia o el cancer pueden estar en etapa temprana o en etapa tardfa. Un cancer o una neoplasia pueden tratarse mediante el suministro de una secuencia de acido nucleico a un tumor de cancer en un sujeto. El cancer o la neoplasia pueden tratarse mediante la reduccion del crecimiento de las celulas cancerosas o matando las celulas cancerosas.
En algunas realizaciones, un polinucleotido de un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede tratar un cancer o una neoplasia mediante el suministro de un polinucleotido de la nanopartmula a una celula cancerosa en un sujeto in vivo. Los ejemplos no limitantes de neoplasias o canceres que pueden tratarse con un procedimiento de la invencion pueden incluir leucemia linfoblastica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, canceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cancer anal, cancer de apendice, astrocitomas (cerebelosos o cerebrales infantiles), carcinoma de celulas basales, cancer de las vfas biliares, cancer de vejiga, cancer de hueso, glioma del tronco encefalico, tumores cerebrales (astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales, ruta visual y gliomas hipotalamicos), cancer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, Linfoma de Burkitt, tumores carcinoides (infantiles, gastrointestinales), carcinoma de origen primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central (primario), astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, cancer de cuello de utero, canceres infantiles, leucemia linfodtica cronica, leucemia mielogena cronica, trastornos mieloproliferativos cronicos, cancer de colon, linfomas cutaneos de linfocitos T, tumor desmoplasico de celulas redondas pequenas, cancer endometrial, ependimoma, cancer de esofago, sarcoma de Ewing en la familia de tumores de Ewing, tumor extracraneal de celulas germinales (infantil), tumor extragonadal de celulas germinales, cancer de conducto biliar extrahepatico, canceres de ojo (melanoma intraocular, retinoblastoma), cancer de vesmula biliar, cancer gastrico (estomago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumores de celulas germinales (extracraneales, extragonadal, ovarico infantiles), tumor trofoblastico gestacional, gliomas (adultos, tronco cerebral infantil, astrocitoma cerebral infantil, ruta visual infantil e hipotalamico), carcinoide gastrico, leucemia de celulas pilosas, cancer de cabeza y cuello, cancer hepatocelular (hngado), linfoma de Hodgkin, cancer hipofarmgeo, glioma de la ruta hipotalamica y visual (infantil), melanoma intraocular, carcinoma de celulas de los islotes, sarcoma de Kaposi, cancer de rinon (cancer de celulas renales), cancer de laringe, leucemias (linfoblasticas agudas, mieloide aguda, linfodtica cronica, mielogena cronica, celulas pilosas), cancer de labio y cavidad oral, cancer de tngado (primario), canceres de pulmon (celulas no pequenas, celulas pequenas), linfomas (relacionados con el SIDA, Burkitt, cutaneos de linfocitos T, Hodgkin, non Hodgkin, sistema nervioso central primario), macroglobulinemia (Waldenstrom), histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma (infantil), melanoma, melanoma intraocular, carcinoma de celulas de Merkel, mesoteliomas (adultos malignos, infantil), cancer escamoso metastasico de cuello con origen primario oculto, cancer de boca, smdrome de neoplasia endocrina multiple (infantil), mieloma multiple/neoplasia de celulas plasmaticas, micosis fungoide, smdromes mielodisplasicos, enfermedades mielodisplasicas/mieloproliferativas, leucemia mielogena (cronica), leucemias mieloides (agudas en adultos, agudas en la infancia), mieloma multiple, trastornos mieloproliferativos (cronicos), cavidad nasal y cancer de seno paranasal, carcinoma nasofarmgeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer oral, cancer de orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cancer de ovario, cancer epitelial de ovario (tumor de superficie epitelial-estromal), tumor de celulas germinales de ovario, tumor de ovario bajo de potencial maligno, cancer de pancreas, cancer de pancreas (celula de islote), cancer de seno paranasal y cavidad nasal, cancer paratiroideo, cancer de pene, cancer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodermicos primitivos supratentoriales (infantiles), adenoma pituitario, neoplasia de celulas plasmaticas, blastoma pleuropulmonar, linfoma del sistema nervioso central primario, cancer de prostata, cancer rectal, carcinoma de celulas renales (cancer de rinon), cancer de celulas transicionales de pelvis renal y ureter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma (infantil), cancer de glandula salival, sarcoma (familia de tumores de Ewing, Kaposi, tejido blando, uterino), smdrome de Sezary, canceres de piel (no melanoma, melanoma), carcinoma de piel (celulas de Merkel), cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de celulas escamosas, cancer de cuello escamoso con origen primario oculto (metastasico), cancer de estomago, tumor neuroectodermico primitivo supratentorial (infantil), linfoma de linfocitos T (cutaneo), leucemia y linfoma de linfocitos T, cancer testicular, cancer de garganta, timoma (infantil), timoma y carcinoma tfmico, cancer de tiroides, cancer de tiroides (infantil), cancer de celulas de transicion de la pelvis renal y el ureter, tumor trofoblastico (gestacional), sitio primario desconocido (adulto, infantil), cancer de celulas transicionales ureter y pelvis renal, cancer de uretra, cancer uterino (endometrial), sarcoma uterino, cancer vaginal, ruta visual y glioma hipotalamico (infantil), cancer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms (infantil). En una realizacion preferente, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar linfoma y leucemia de linfocitos T. En una realizacion de ejemplo, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar la leucemia/linfoma de linfocitos T adultas (ATLL, de sus siglas en ingles) inducida por el Virus-1 Linfotropico T humano (HTLV-1, de sus siglas en ingles).
En otras realizaciones, un polinucleotido de un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede suministrarse a una celula cancerosa in vitro. Por ejemplo, un polinucleotido de un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede suministrarse a una lmea celular de cancer in vitro. Una celula cancerosa puede ser una lmea celular de cancer cultivada in vitro. En algunas alternativas de las realizaciones, una lmea celular de cancer puede ser una lmea celular primaria que aun no esta descrita. Los procedimientos para preparar una lmea celular de cancer
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primaria utilizan tecnicas estandar conocidas por los expertos en la materia. En otras alternativas, una lmea celular de cancer puede ser una lmea celular de cancer establecida. Una lmea celular de cancer puede ser adherente o no adherente, o una lmea celular puede crecer en condiciones que estimulen el crecimiento adherente, no adherente u organortpico utilizando tecnicas estandar conocidas por los expertos en la materia. Una lmea celular de cancer puede estar inhibida por contacto o no inhibida por contacto.
En algunas realizaciones, la lmea celular de cancer puede ser una lmea celular humana establecida procedente de un tumor. Los ejemplos no limitantes de lmeas celulares de cancer procedentes de un tumor pueden incluir las lmeas celulares de osteosarcoma 143B, CAL-72, G-292, HOS, KHOS, Mg-63, Saos-2 y U-2 OS; las lmeas celulares de cancer de prostata DU145, PC3 y Lncap; las lmeas celulares de cancer de mama MCF-7, MDA-MB-438 y T47D; la lmea celular de leucemia mieloide THP-1, la lmea celular de glioblastoma U87; la lmea celular de neuroblastoma SHSY5Y; la lmea celular de cancer de hueso Saos-2; las lmeas celulares de cancer de colon WiDr, COLO 320DM, HT29, DLD-1, COLO 205, COLO 201, HCT-15, SW620, LoVo, SW403, SW403, SW1116, SW1463, SW837, SW948, SW1417, GPC-16, HCT-8HCT 116, NCI-H716, NCI-H747, NCI-H508, NCI-H498, COLO 320HSR, SNU-C2A, LS 180, LS 174T, MOLT-4, LS513, LS1034, LS411N, Hs 675.T, CO 88BV59-1, Co88BV59H21-2, Co88BV59H21-2V67-66, 1116-NS-19-9, TA 99, AS 33, TS 106, Caco-2, HT-29, SK-CO-1, SNU-C2B y SW480; B16-F10, RAW264.7, la lmea celular F8 y la lmea celular de carcinoma pancreatico Panc1. En una realizacion de ejemplo, un complejo peptido- polinucleotido de la invencion puede administrarse a una lmea celular F8. En otra realizacion ejemplar, un complejo peptido-polinucleotido de la invencion puede administrarse a una lmea celular B16-F10.
ii. Tratamiento de una afeccion artntica
En otras realizaciones preferidas, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar una afeccion artntica. Los ejemplos no limitantes de afecciones artnticas incluyen osteoartritis, artritis reumatoide, gota y pseudogota, artritis septica, espondilitis anquilosante, artritis idiopatica juvenil, enfermedad de Still, lupus o artritis causada por una infeccion o tratamiento. En algunas realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar osteoartritis. En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar artritis reumatoide. En aun otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar gota. En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar pseudogota. En realizaciones adicionales, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar artritis septica. En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar espondilitis anquilosante. En aun otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar artritis idiopatica juvenil. En otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar la enfermedad de Still. En realizaciones adicionales, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar lupus. En aun otras realizaciones, un procedimiento de la invencion se utiliza para tratar artritis causada por una infeccion o tratamiento. Por ejemplo, un procedimiento de la invencion puede utilizarse para tratar artritis causada por artritis inducida por anticuerpos de colageno.
Como se utiliza en el presente documento, la expresion "tratar una afeccion artntica" puede utilizarse para describir el alivio de los smtomas artnticos. Los ejemplos no limitantes de smtomas artnticos, independientemente del tipo de artritis, incluyen varios niveles de dolor, hinchazon, rigidez de la articulacion, incapacidad para utilizar la mano o caminar, malestar y sensacion de cansancio, perdida de peso, dormir mal, molestias y dolores musculares, sensibilidad y dificultad para mover la articulacion. Los procedimientos para medir los smtomas artnticos son bien conocidos en la materia y pueden incluir medir el grosor de una articulacion artntica como el tobillo, utilizando una puntuacion artntica o utilizando mediciones basadas en imagenes.
En algunas realizaciones, los smtomas artnticos se miden mediante el grosor del tobillo. Como tal, tratar una afeccion artntica que utiliza un procedimiento de la invencion puede prevenir un aumento en el grosor del tobillo en un sujeto tratado con una composicion farmaceutica de la invencion cuando se compara con un sujeto que no fue tratado con la composicion farmaceutica.
En otras realizaciones, los smtomas artnticos se miden utilizando una puntuacion artntica. Los procedimientos para medir una puntuacion artntica son conocidos en la materia y pueden incluir la puntuacion del Colegio Americano de Reumatologfa (ACR, de sus siglas en ingles), la escala de gravedad de la artritis reumatoide (RASS, de sus siglas en ingles), o los criterios de clasificacion de la artritis reumatoide ACR/EULAR. Como tal, tratar una afeccion artntica que utiliza un procedimiento de la invencion puede prevenir un aumento en la puntuacion artntica en un sujeto tratado con una composicion farmaceutica de la invencion cuando se compara con un sujeto que no fue tratado con la composicion farmaceutica. Por ejemplo, tratar una afeccion artntica que utiliza un procedimiento de la invencion puede prevenir un aumento en la puntuacion artntica por encima de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 utilizando los criterios de clasificacion de artritis reumatoide ACR/EULAr. En realizaciones preferidas, tratar una afeccion artntica que utiliza un procedimiento de la invencion puede prevenir un aumento en la puntuacion artntica por encima de aproximadamente 1, 2 o aproximadamente 3.
En aun otras realizaciones, los smtomas artnticos se miden utilizando mediciones basadas en imagenes. Los procedimientos para medir smtomas artnticos utilizando mediciones basadas en imagenes son conocidos en la materia y pueden incluir la utilizacion de imagenes moleculares ultrasonicas como se describe en Hughes y col., 2011 J Acoust Soc Am. 129:3756; Hughes 2011 IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 58:2361-2369; Hughes y col., 2007 Ultrasound Med Biol. 33:1236-1243; Hughes y col., 2007 Journal of the Acoustical Society of
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America. 121:3542-3557; Hughes y col., 2013 J Acoust Soc Am. 133:283-300; Hughes y col., 2009 Journal of the Acoustical Society of America. 126:2350-2358, cuyas divulgaciones se incorporan en el presente documento en su totalidad.
(c) Tratamiento de afecciones asociadas con la desregulacion de STAT3
En algunas realizaciones, la invencion abarca un procedimiento para administrar a un sujeto un complejo peptido- polinucleotido de la invencion para tratar una afeccion asociada con la desregulacion de STAT3 en el sujeto. En algunas realizaciones preferidas, la invencion se utiliza para tratar una afeccion asociada con la desregulacion de STAT3 en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 en el sujeto. Por ejemplo, un procedimiento de la invencion puede utilizarse para tratar el cancer mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3. Un cancer o una neoplasia pueden ser como se describe en la Seccion MI(c)i. El cancer o la neoplasia pueden tratarse mediante la reduccion del crecimiento de las celulas cancerosas o mediante la prevencion de la angiogenesis. En algunas realizaciones, el cancer o la neoplasia se tratan mediante la reduccion del crecimiento de las celulas cancerosas. En otras realizaciones, el cancer o la neoplasia se tratan mediante la prevencion de la angiogenesis. El termino "angiogenesis" significa la formacion de nuevos vasos sangumeos en un tejido, la estimulacion de la proliferacion de celulas endoteliales o la promocion de la supervivencia de las celulas endoteliales en proliferacion. En una realizacion preferente, la invencion se utiliza para tratar cancer en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 en el sujeto. En una realizacion de ejemplo, la invencion se utiliza para tratar cancer en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 en el sujeto mediante la reduccion del crecimiento de celulas cancerosas. En otra realizacion ejemplar, la invencion se utiliza para tratar cancer en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 en el sujeto mediante la prevencion de la angiogenesis.
La alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 puede reducir el nivel de expresion de la protema STAT3. La alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 tambien puede reducir el nivel de un ARNm que codifica STAT3. Por ejemplo, la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 puede reducir el nivel de un ARNm que codifica STAT3 en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o aproximadamente 10 veces o mas. En algunas realizaciones, la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 reduce el nivel de un ARNm que codifica STAT3 en aproximadamente 1, 2, 3, 4 o aproximadamente 5 veces. En otras realizaciones, la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 reduce el nivel de un ARNm que codifica STAT3 en aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, o aproximadamente 10 veces o mas.
En general, las curvas de titulacion que miden la capacidad de una composicion farmaceutica de la invencion para alterar la expresion de una secuencia de acido nucleico normalmente expresada en una celula pueden realizarse para determinar la CI50. Por ejemplo, la CI50 de una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido- polinucleotido capaz de alterar la expresion de STAT3 en una celula puede ser de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 9, o aproximadamente 100 nM o mas. En algunas realizaciones, la CI 50 de una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido capaz de alterar la expresion de STAT3 en una celula es de aproximadamente 10, 15, 20, 25, o aproximadamente 30 nM. En otras realizaciones, la CI50 de una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido capaz de alterar la expresion de STAT3 en una celula es de aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, o aproximadamente 60 nM. En aun otras realizaciones, la CI50 de una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido- polinucleotido capaz de alterar la expresion de STAT3 en una celula es de aproximadamente 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 9, o aproximadamente 100 nM o mas. En realizaciones preferidas, la CI50 de una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido capaz de alterar la expresion de STAT3 en una celula es de aproximadamente 40, 45, 50, 55, o aproximadamente 70 nM.
La alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 puede prevenir la angiogenesis. Los procedimientos para medir la angiogenesis son conocidos en la materia y pueden ser como se describen en los ejemplos y pueden incluir ensayos de formacion de tubos de matrigel y ensayos de migracion de celulas transwell. La alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 puede reducir la formacion de tubos de matrigel en aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o aproximadamente 95 % o mas. En algunas realizaciones, la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 reduce la formacion de tubos de matrigel en aproximadamente 30, 35, 40, 45, o aproximadamente 50 %. En otras realizaciones, la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 reduce la formacion de tubos matrigel en aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o aproximadamente el 95 % o mas. En realizaciones preferidas, la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica STAT3 reduce la formacion de tubos de matrigel en aproximadamente 50, 55, 60, 65, o aproximadamente 70 %.
(d) Tratamiento de afecciones asociadas con la desregulacion de JNK2
En otras realizaciones, la invencion abarca un procedimiento para administrar a un sujeto un complejo peptido- polinucleotido de la invencion para tratar una afeccion asociada con la desregulacion de JNK2 en el sujeto. En una
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realizacion de ejemplo, la invencion se utiliza para tratar una afeccion asociada con la desregulacion de JNK2 en un sujeto mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica JNK2 en el sujeto. Por ejemplo, un procedimiento de la invencion puede utilizarse para tratar aterosclerosis mediante la alteracion de la expresion de una secuencia de acido nucleico que codifica JNK2. En algunas realizaciones preferidas, la aterosclerosis se trata mediante el bloqueo de la formacion de celulas espumosas. La formacion de celulas espumosas es el sello distintivo de las placas ateroscleroticas, y puede convertirse en un problema cuando se acumulan en focos particulares, que crean asf un centro necrotico de aterosclerosis. En una realizacion de ejemplo, un complejo peptido-polinucleotido, en el que el polinucleotido del complejo es un ARNip anti-JNK2, se utiliza para bloquear la formacion de celulas espumosas.
IV. KU
Otro aspecto de la divulgacion abarca un kit. El kit comprende una primera composicion que comprende un peptido y opcionalmente una segunda composicion que comprende un polinucleotido. Como alternativa, un usuario del kit puede proporcionar un polinucleotido de interes. Siguiendo las indicaciones proporcionadas por el kit, un usuario del kit puede mezclar la composicion que comprende un peptido y una composicion que comprende un polinucleotido para formar un complejo peptido-polinucleotido. Las indicaciones del kit pueden incluir instrucciones para mezclar el peptido y el polinucleotido en una proporcion adecuada. Las relaciones adecuadas se describen anteriormente en la Seccion I. El kit tambien puede incluir tampones adecuados, agua, reactivos de reticulacion o albumina.
Definiciones
Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protema" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polfmero de restos de aminoacidos. Los terminos se aplican a los polfmeros de aminoacidos en los que uno o mas restos de aminoacidos son un mimetico qmmico artificial de un aminoacido de origen natural correspondiente, asf como a los polfmeros de aminoacidos de origen natural, aquellos que contienen restos modificados, y polfmero de aminoacidos de origen no natural.
Los terminos "homologo", "identico" o porcentaje de "identidad" en relacion con dos o mas peptidos, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje espedfico de restos de aminoacidos que son iguales (es decir, aproximadamente un 60 % de identidad, preferentemente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o una identidad superior en una region espedfica, cuando se compara y se alinea para obtener una correspondencia maxima sobre una ventana de comparacion o una region designada) segun lo medido utilizando un algoritmo de comparacion de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parametros predeterminados que se describen a continuacion, o mediante alineacion manual e inspeccion visual (vease, por ejemplo, el sitio web de NCBI
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ o similar). La definicion tambien incluye secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, asf como aquellas que tienen sustituciones, asf como las de origen natural, por ejemplo, variantes polimorficas o alelicas, y variantes creadas por el hombre. Como se describe a continuacion, los algoritmos preferidos pueden dar cuenta de vacios y similares.
Los terminos "aislado", "purificado" o "biologicamente puro" se refieren al material que esta sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompanan tal como se encuentra en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan normalmente mediante tecnicas de qrnmica analttica, como la electroforesis en gel de poliacrilamida o la cromatograffa lfquida de alto rendimiento. Una protema o acido nucleico que es la especie predominante presente en una preparacion se purifica sustancialmente. El termino "purificado" en algunas realizaciones denota que un acido nucleico o protema da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforetico. Preferentemente, significa que el acido nucleico o la protema tiene una pureza de al menos el 85 %, mas preferentemente una pureza de al menos el 95 %, y lo mas preferentemente una pureza de al menos el 99 %. "Purificar" o "purificacion" en otras realizaciones significa eliminar al menos un contaminante de la composicion a purificar. En este sentido, la purificacion no requiere que el compuesto purificado sea homogeneo, por ejemplo, 100 % puro.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la divulgacion. Los expertos en la materia debenan apreciar que las tecnicas desveladas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas por los inventores para que funcionen bien en la practica de la divulgacion y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la materia debenan, a la luz de la presente divulgacion, apreciar que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones espedficas que se desvelan y seguir obteniendo un resultado sin apartarse de la invencion que es como se define en las reivindicaciones.
Introduccion para los ejemplos 1-8
Se ha propuesto el ARN de interferencia (ARNi) con la utilizacion del ARN de interferencia pequeno (ARNip) como una terapia altamente eficaz para innumerables enfermedades que incluyen cancer y aterosclerosis. Sin embargo, a pesar de casi dos decadas de intensa investigacion, la terapeutica de ARNip ha demostrado un exito limitado en la traduccion a aplicaciones clmicas. Las principales barreras que impiden el exito de las terapias basadas en ARNip
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comprenden una pobre absorcion celular e inestabilidad del ARNip libre en suero. Su gran peso molecular (~ 14 kDa) y su alta carga superficial impiden que el ARNip pase a traves de la membrana celular para alcanzar el compartimento citoplasmico donde el ARNip esta activo, bloqueando as^ la induccion exitosa de ARNi. Estas caractensticas, combinados con una semivida serica de solo -10 minutos, requieren el empaquetamiento del ARNip en agentes de transfeccion. Estos agentes pueden proteger el ARNip de las endonucleasas sericas y promover la absorcion del ARNip a traves de la endocitosis. Desafortunadamente, estas rutas endocfticas presentan otra barrera, ya que el ARNip debe evitar permanecer atrapado en el compartimento endosomal/lisosomal donde se degrada por un entorno cada vez mas acido.
A pesar de estos desaffos, se han utilizado con exito lfpidos y polfmeros cationicos para la transfeccion de ARNip. Desafortunadamente, estos tipos de agentes de transfeccion pueden exhibir una citotoxicidad inaceptable. La incorporacion de lfpidos cationicos en las bicapas de membrana dentro de las celulas promueve la liberacion de ARNip en el citoplasma, pero tambien causa la generacion de especies reactivas de oxfgeno (ROS) y la fuga de Ca +2, un efecto secundario compartido por los polfmeros cationicos de polietilenoilina de alto peso molecular. A pesar del desarrollo continuo de estos vehnculos de ARNip para reducir la citotoxicidad, estos agentes han experimentado dificultades cuando se administran sistemicamente in vivo debido a la agregacion con protemas sericas y la activacion del complemento. Si el problema del suministro sistemico de ARNip se debe resolver, se deberan desarrollar nuevas clases de agentes de transfeccion de ARNip.
Los agentes de transfeccion de ARNip basados en peptidos que penetran las celulas (CPP, de sus siglas en ingles) se han mostrado prometedores con respecto a la reduccion de la citotoxicidad. Aunque la transfeccion de ARNip basada en CPP parece casi libre de citotoxicidad, los agentes de transfeccion basados en peptidos no han logrado la alta eficacia de los agentes de transfeccion lipfdicos tradicionales. Los estudios de Veldhoen y col. (2006, Nucleic Acids Res. 34: 6561-73) han proporcionado informacion que sugiere que la transfeccion basada en peptidos esta limitada por el atrapamiento lisosomal. A pesar de que los primeros trabajos sugieren que los CpP median la absorcion de ARNip de una manera independiente de la energfa, parece que las nanopartfculas producidas por el ensamblaje de CPP y ARNip son endocitosas y deben escapar de la ruta endosomal-lisosomal para acceder al compartimento citosolico. Con esta barrera en mente, la tecnologfa de CPP existente ha logrado un nuevo nivel de sofisticacion a traves de la conjugacion qmmica de los CPP a los lfpidos activos de membrana o agentes endosomolfticos, aunque estos aun requieren mas procesamiento y purificacion de peptidos.
Los ejemplos que se presentan a continuacion proponen una estrategia alternativa para la transfeccion de ARNip basada en peptidos eficaz basada en modificaciones del peptido citolttico, la melitina, que es el componente formador de poros del veneno de abeja. La capacidad de la melitina para formar poros en las bicapas de membrana sugiere que puede servir como base para el desarrollo de peptidos simples que pueden mejorar el escape endosomal, estableciendo asf el escenario para un suministro de ARNip mas eficaz en el compartimento citosolico para un ARNi mejorado y superar la menor eficacia asociada con estrategias tradicionales basadas en CPP. El trabajo previo realizado por los inventores ha demostrado que la melitina puede modificarse para atenuar su citotoxicidad mientras mantiene su propension a interactuar con las bicapas de membrana. Como se demuestra en los presentes ejemplos, mediante la incorporacion de estos cambios junto con las modificaciones para mejorar las interacciones peptido/ARNip, los peptidos procedentes de la melitina pueden suministrar de forma segura el ARNip al compartimento citoplasmico debido a sus propiedades inherentes activas de membrana.
Ejemplo 1. Deteccion de la atenuacion de ARNip.
La atenuacion de las celulas B16 que expresan de forma estable GFP-PEST permitio una rapida deteccion de la atenuacion eficaz del ARNip de la expresion de GFP debido a que la secuencia PEST acorta la semivida de GFP de 26 a 10 horas. Los derivados de la melitina se seleccionaron segun las modificaciones disenadas para disminuir la citotoxicidad asf como mejorar las interacciones con oligonucleotidos. Estos peptidos se cribaron por su capacidad para suministrar ARNip de GFP para la atenuacion de GFP en celulas B16 GfP (Tabla 1, FIG. l). P5RHH exhibio una transfeccion de ARNip especialmente eficaz y se eligio para una caracterizacion y optimizacion adicionales de la formulacion.
Tabla 1: La melitina junto con tres derivados se probaron para la atenuacion de GFP a 50 nM. Solo p5RHH mostro
un suministro significativo de ARNip.
Composicion de particulas (peptido/ARNip) Relacion de carga (+/-) ^Capaz de transfectar?
Melitina (SEQ ID NO: 53) GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ
62:1 6:1 No
124:1
12:1 Toxico
248:1
24:1 Toxico
Peptido 5C (SEQ ID NO: 54) VLTTGLPALISWIKRKRQQC
62:1 6:1 No
124:1
12:1 No
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248:1 24:1 No
Peptido 5RWR (SEQ ID NO: 55) VLTTGLPALISWIKRKRQQRWRRRR
28:1 6:1 No
56:1
12:1 No
112:1
24:1 No
Peptido 5RHH (SEQ ID NO: 1) VLTTGLPALISWIRRRHRRHC
50:1 6:1 Si
100:1
12:1 Si
200:1
24:1 Si
La citometna de flujo se realizo para determinar la relacion optima p5RHH:ARNip para la transfeccion, en la que la eficacia de la transfeccion mejoro con el aumento del contenido de p5RHH hasta el maximo en una relacion p5RHH:ARNip de 150:1 (FIG. 1A). En cambio, el ARNip aleatorio no tuvo efecto en los niveles de expresion de GFP en las mismas condiciones. Aunque no hubo signos de citotoxicidad asociada con el peptido en relaciones de hasta 200:1 (FIG. 1B), se selecciono una relacion p5RHH:ARNip de 100:1 para los experimentos restantes para minimizar la exposicion al p5RHH.
Ejemplo 2. Formacion y caracterizacion de nanoparticulas.
Sobre la base de la carga positiva neta global del derivado de melitina, p5RHH, se anticipo que interactuana electrostaticamente con el ARNip cargado negativamente. Estas interacciones se monitorizaron en diferentes relaciones peptido:ARNip utilizando ensayos de retardo de gel, en los que solo el ARNip libre unido podna migrar al gel de poliacrilamida en presencia de un campo electrico. En estos ensayos, se mezclo una cantidad fija de ARNip con cantidades crecientes de p5RHH en PBS durante 40 minutos antes de cargar en el gel (FIG. 2A). Es evidente que se requiere una relacion peptido:ARNip de al menos 50:1 para compactar completamente el ARNip, lo que confirmo la falta de transfeccion de ARNip observada por FACS en relaciones de p5RHH:ARNip por debajo de 50:1 (FIG. 1A).
La dispersion dinamica de la luz (DLS, de sus siglas en ingles) y las mediciones del potencial zeta (Tabla 2) revelaron que el tamano de partfcula esta estrechamente relacionado con la carga superficial eficaz. Las partfculas que tienen una carga superficial cercana a 0 mV exhiben el mayor diametro, mientras que las partfculas con un potencial zeta de mayor magnitud tienen diametros mas pequenos. Se encontro que el tamano de partfcula mas pequeno de 190 nm se produda con una relacion molar peptido:ARNip de 100:1 o una relacion de carga de alrededor de 12:1 (+/-). Es importante tener en cuenta que aumentar la relacion p5RHH:ARNip a 200:1 (duplicando la relacion +/- a 24:1) no aumenta el potencial zeta, pero da como resultado un aumento del tamano de partfcula. Este fenomeno se ha informado previamente con otros agentes de transfeccion de peptidos, aunque la causa aun no se ha establecido. La fractura por congelacion SEM (FIG. 2B) muestra la presencia de distintas nanoparticulas con un diametro total cercano a 150 nm. De forma interesante, estas partfculas parecen consistir en agregados de partfculas mas pequenas, de 10-20 nm, que se han unido para formar una partfcula estable de mayor diametro. Cuando se evalua el tamano mediante microscopfa de fuerza atomica (AFM, de sus siglas en ingles), el tamano de partfcula despues de 72 horas es < 100 nm, normalmente alrededor de 50-100 nm. En general, parece que cuando el tamano de partfcula se evalua mediante DLS, el tamano de partfcula puede parecer mayor porque los agregados estan incluidos en la respuesta. El tamano de las partfculas activas, medido con mayor precision mediante SEM o AFM, es alrededor de 50 a 100 nm.
Tabla 2: Caractensticas de las nanoparticulas (NP) en varias relaciones peptido:ARNip. El analisis de las nanoparticulas de p5RHH:ARNip mediante dispersion dinamica de la luz y el analisis del potencial zeta sugieren que la carga superficial eficaz determina el tamano de partfcula. Las nanoparticulas con una carga superficial de mayor magnitud exhiben diametros mas pequenos, lo que sugiere la importancia de las interacciones electrostaticas en la estabilizacion de las nanoparticulas de p5RHH:ARNip. Una relacion p5RHH:ARNip de 100:1 genera el tamano de partfcula mas pequeno de 190 nm.
Composicion de particulas (ARNip/peptido)
Relacion de carga (+/-) Tamano de partfcula (nm) Potencial zeta (mV)
10:1
1,2:1 299,6 -13
25:1
3:1 830,6 -2,28
50:1
6:1 603,6 3,72
100:1
12:1 187,9 12
200:1
24:1 315,5 13,1
Ejemplo 3. Comparacion con LF2000.
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El analisis de la respuesta a la dosis mediante citometna de flujo revelo que la atenuacion de GFP por el ARNip de GFP transfectado con p5RHH es altamente eficaz, con una capacidad para disminuir la expresion de GFP en ~ 15 % de las celulas en concentraciones tan bajas como 5 nM (FIG. 3A). El ARNip aleatorio no tuvo ningun efecto sobre los niveles de protema GFP cuando se transfecto en las mismas condiciones (FIG. 3C, D). Sin embargo, en comparacion con Lipofectamine 2000, p5RHH es menos eficaz en la transfeccion de ARNip, con una CI50 de 50 nM basada en RT-PCR en comparacion con la CI50 reportada de Lipofectamine 2000 de 10 nM (FIG. 3E, F). De manera adicional, la capacidad de p5RHH para transfectar ARNip a bajas concentraciones, como se observa en la citometna de flujo, no es evidente a traves de transferencia de Western o RT-PCR, probablemente debido al bajo porcentaje de celulas (~ 15 %) que muestran una atenuacion de FACS. Sin embargo, es evidente que p5RHH mejora drasticamente el perfil de citotoxicidad sobre lipofectamine 2000, que es evidente a partir de la disminucion minima (~ 3 %) en la viabilidad celular, incluso en las concentraciones mas altas probadas (FIG. 3B).
Ejemplo 4. Liberacion eficaz de ARNip en el citoplasma.
El analisis de un derivado de melitina que se sabe que esta inactivo para la transfeccion de ARNip (p5RWR: VLTTGLPALISWIKRKRQQRWRRRR (SEQ ID NO: 83), Tabla 1, FIG. 1) por microscopfa confocal revela que los oligonucleotidos empaquetados con p5RWR no llegan al citoplasma sin incubacion en presencia de cloroquina 50 |jM, que es un agente endosomolttico conocido (FIG. 4B, C). El analisis de FACS para la atenuacion de GFP confirma que el ARNip transfectado por p5RWR no es capaz de iniciar la atenuacion de GFP sin la ayuda de la cloroquina (FIG. 4A). Estos datos sugieren que las nanopartfculas de p5RWR/ARNip permanecen atrapadas en el compartimento endosomal y no pueden iniciar ARNi. En comparacion, p5RHH solo es capaz de suministrar oligonucleotidos al citoplasma cuando se analiza 24 horas despues de la transfeccion (FIG. 4D, E), lo que sugiere que p5RHH posee una capacidad endosomolftica innata.
Ejemplo 5. Suministro de ARNip para retardar el crecimiento del cancer.
El transductor de senal y el activador de la transcripcion 3 (STAT3, de sus siglas en ingles) es un oncogen bien conocido que se considera que desempena un papel fundamental en una amplia variedad de malignidades humanas. Para probar la capacidad de p5RHH para regular negativamente los oncogenes activados de forma constitutiva, la expresion de STAT3 se dirigio a las celulas B16-F10 que se sabe que son dependientes de STAT3. El suministro de un ARNip espedfico de STAT3 condujo a la degradacion del ARNm de STAT3 con una disminucion subsiguiente en la expresion de la protema STAT3 (p5RHH CI50: ~ 50 nM, Lipofectamine 2000 IC50: ~ 10 nM) (FIG. 5A-D, FIG. 6). La transfeccion de ARNip de STAT3 mediada por P5RHH condujo a una disminucion de la viabilidad de B16-F10 (60 % a 200 nM) 72 horas despues de la transfeccion, segun se determino mediante los ensayos de Alamar Blue (FIG. 5E). Cabe destacar que, el ARNip aleatorio no mostro ningun efecto sobre la viabilidad de B16, lo que ilustra la seguridad de p5RHH en comparacion con Lipofectamine 2000 (FIG. 5F), que produjo una disminucion equivalente en la viabilidad celular (hasta un 60 % a 200 nM) cuando se administro ARNip espedfico de STAT3 o aleatorio.
Ejemplo 6. Suministro de ARNip para prevenir la angiogenesis.
La angiogenesis patologica es un sello distintivo de muchos estados patologicos, incluido el cancer, la aterosclerosis y la inflamacion. El STAT3 ha demostrado previamente ser un mediador clave en la migracion y la maduracion de las celulas endoteliales durante la angiogenesis. Por lo tanto, la capacidad de p5RHH para suministrar ARNip de STAT3 a celulas HUVEC para el bloqueo de la angiogenesis se delimito con la utilizacion de ensayos de formacion de tubos de matrigel y ensayos de migracion de celulas transwell. Las HUVEC transfectadas con nanopartfculas de ARNip p5RHH/STAT3 mostraron una disminucion en los niveles de ARNm y protemas de STAT3 con un CI50 de ~ 50 nM (FIG. 7A, B, FIG. 8) sin ningun tipo de disminucion en la viabilidad de HUVEC (FIG. 7C). Al igual que con la transfeccion de celulas B16-F10, la transfeccion mediada por Lipofectamine 2000 exhibe una CI50 de ~ 10 nM, pero fuerte citotoxicidad, con una disminucion del 40 % en la viabilidad celular en dosis de ARNip tan bajas como 25 nM (FIG. 9).
Aunque la transfeccion de ARNip de STAT3 mediada por p5RHH no afecto la viabilidad celular, las nanopartfculas de ARNip p5RHH/STAT3 utilizadas para tratar HUVEC manifestaron una disminucion de ~ 60 % en la formacion de tubos en comparacion con el ARNip aleatorio para el tratamiento de HUVEC (FIG. 7D-F). Ademas, la migracion de HUVEC transfectadas por p5RHH se redujo en un 50 % segun lo cuantificado por Alamar Blue (FIG. 7I) y microscopfa de fluorescencia (FIG. 7H, Fig. 10). Estos datos demuestran la alta eficacia con la que p5RHH es capaz de transfectar de manera segura las celulas endoteliales humanas primarias para la prevencion de la angiogenesis patologica.
Ejemplo 7. Suministro de ARNip para disminuir la formacion de celulas espumosas.
Las barreras endoteliales rotas que caracterizan las placas ateroscleroticas hacen de la aterosclerosis un objetivo primordial para las terapias basadas en nanopartmulas. Para asegurar que la formacion de celulas espumosas, el sello distintivo de las placas ateroscleroticas, podna bloquearse con las nanopartmulas de p5RHH/ARNip, el ARNip de JNK2 se administro a RAW264.7 (lmea celular de monocitos/macrofagos de raton). JNK2 es un conocido mediador de la formacion de celulas espumosas y se ha implicado en la absorcion de Ac-LDL por parte del receptor
eliminador A, asf como de oxLDL por CD36. p5RHH fue capaz de suministrar ARNip de JNK2 a celulas RAW264.6 sin citotoxicidad (FIG. 11A, B), lo que llevo a una fuerte disminucion en los niveles de protema JNK2 en concentraciones tan bajas como 25 nM. En comparacion, Lipofectamine 2000 tiene una CI50 similar a la determinada por transferencia de Western, pero tambien exhibe una extensa citotoxicidad (FIG. 12). La disminucion de los niveles 5 de protema JNK2 suprimio la formacion de celulas espumosas en las celulas RAW264.7 que se han incubado en presencia de 50 pg/ml de Ac-LDL durante 12 horas segun lo determinado por microscopfa de luz despues de la tincion con Oil-Red O (FIG. 11C-E). Estas imagenes muestran una extensa acumulacion de gotas de lfpidos en controles no tratados y celulas tratadas con ARNip aleatorio, pero no acumulacion de gotas de lfpidos en celulas RAW264.7 tratadas con un ARNip espedfico de JNK2.
10 Ejemplo 8. Rendimiento de p5RHH en presencia de suero.
Para garantizar que las partmulas utilizadas en los experimentos sean estables en presencia de suero, se incubaron nanopartmulas de p5RHH/ARNip en albumina de suero humano (HSA, de sus siglas en ingles) 150 pg/ml durante 12 horas o toda la noche. La dispersion dinamica de la luz revelo que el tamano no cambio cuando se comparo con las partmulas recien preparadas (Tabla 3). Ademas, el potencial zeta de las nanopartmulas incubadas con HSA se 15 volvio menos positivo, lo que podna deberse al recubrimiento de las nanopartmulas con albumina cargada negativamente. Cuando se probo la actividad de estas partmulas, su capacidad para atenuar la expresion de GFP se mejoro de manera fortuita en comparacion con las nanopartmulas frescas (FIG. 13A, B). Estos experimentos demuestran la estabilidad del suero de las nanopartmulas de p5RHH/ARNip, su maduracion a agentes de transfeccion aun mas potentes a lo largo del tiempo en ciertas condiciones, lo que sugiere una aplicabilidad potencial 20 en entornos in vivo.
Tabla 3. Analisis del tamano de partfcula de p5RHH:ARNip incubado en presencia de albumina serica (poblacion promedio de una formulacion).
Tamano de partfcula (nm) fndice de polidispersidad Potencial zeta (mV)
Peptido 5RHH/ARNip - HSA (30 min)
190 0,120 12,0±0,7
Peptido 5RHH/ARNip - HSA (12 horas)
> 5.000 -- --
Peptido 5RHH/ARNip + HSA (30 min)
190 0,194 -7,0±1,0
Peptido 5RHH/ARNip + HSA (12 horas)
220 0,191 -5,5±1,5
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Discusion para los ejemplos 1-8
Los solicitantes han explorado previamente procedimientos de suministro de ARNip altamente eficaces basados en Ifpidos cationicos en una nueva formulacion de nanoemulsion de perfluorocarbono. A pesar de la alta eficacia de la transfeccion lograda in vitro, las dificultades con la transfeccion a altas concentraciones de nanopartfculas reflejaron los desaffos que acompanan a los agentes de transfeccion de lfpidos cationicos tradicionales. En los presentes ejemplos, los peptidos de melitina se modificaron para realizar un agente de transfeccion de ARNip de alta eficacia basado en la hipotesis de que la insercion de la membrana de melitina y la capacidad de formacion de poros proporcionanan un medio novedoso de escape endosomal, que es un inconveniente clave para los agentes de transfeccion de ARNip basados en CPP informado anteriormente.
De hecho, los experimentos presentados en el presente documento demuestran que p5RHH es capaz de facilitar la liberacion de ARNip en el citoplasma. El analisis de un derivado de melitina inactivo (p5RWR) sugiere que, al igual que con el suministro tradicional de ARNip basado en CPP, las partfculas de p5RWR/ARNip tambien se incorporan a los endosomas y requieren agentes endosomoltticos para acceder al citoplasma. Las nanopartfculas de P5RHH/ARNip tienen una carga superficial positiva determinada por las mediciones del potencial zeta, que es una caractenstica que se ha demostrado que desempena un papel importante en la asociacion de nanopartfculas con las membranas celulares y la posterior endocitosis. Sobre la base de la similitud de la carga superficial, es probable que las nanopartfculas de p5RHH/ARNip se manejen a traves de la misma maquinaria endocftica que los complejos inactivos p5RWR/ARNip, lo que sugiere que p5RHH puede promover la liberacion de ARNip de la ruta endosomal/lisosomal de manera eficaz. Aunque la ruta de absorcion exacta responsable de la internalizacion de la nanopartfcula de p5RHH/ARNip queda por determinar, el analisis de los complejos inactivos p5RWR proporciona informacion sobre los mecanismos potenciales del procesamiento de nanopartfculas de p5RHH/ARNip por la celula.
Si bien las propiedades exactas responsables del escape endosomal eficaz aun no se han aclarado, el trabajo sobre los peptidos histidilados utilizados para la transfeccion de oligonucleotidos proporciona cierta intuicion con respecto a la funcion de p5RHH. Los peptidos y polfmeros histidilados se disenaron originalmente para ayudar a la liberacion de plasmidos en funcion de la protonacion del grupo imidazol de histidina (pKa ~ 6,0) durante la acidificacion lisosomal (pH ~ 4,5). Estos polfmeros incorporan un alto contenido de histidina (80-90 % de histidina) para conducir la lisis endosomal a traves del efecto de esponja de protones. p5RHH posee solo dos restos de histidina y, por lo tanto, es poco probable que sea capaz de tamponar suficientes protones para lisar endosomas. Sin embargo, la protonacion de los restos de histidina probablemente promueve el desensamblaje de nanopartfculas de p5RHH/ARNip y la liberacion de p5RHH para permeabilizar la membrana endosomal para la liberacion de ARNip. Actualmente se estan llevando a cabo estudios detallados sobre el desensamblaje de p5RHH/ARNip y la capacidad lttica a pH bajo.
La capacidad de p5RHH para suministrar ARNip al citoplasma produce una disminucion cuantificable en la expresion de GFP en concentraciones tan bajas como 5 nM. Sin embargo, p5RHH aun no es capaz de alcanzar el nivel de eficacia de transfeccion proporcionado por Lipofectamine 2000 en celulas B16-F10 o HUVEC. p5RHH parece exhibir una eficacia mejorada cuando se transfectan celulas RAW264.7, con una CI50 que es aproximadamente igual a la de Lipofectamine 2000. No es sorprendente que, los diferentes tipos de celulas favorezcan los diferentes mecanismos endocfticos que podnan explicar las diferencias entre las eficacias de transfeccion en diferentes tipos de celulas. Sin embargo, p5RHH exhibe una mejora sustancial sobre la transfeccion basada en lfpidos cationicos tradicional con respecto a la citotoxicidad, que muestra una disminucion minima en la viabilidad celular frente a una variedad de lmeas celulares de raton y humanas en todas las concentraciones probadas. Ademas, parece que la eficacia de la transfeccion mediada por p5RHH puede optimizarse aun mas como lo sugiere la observacion de un aumento de la eficacia de transfeccion cuando las partfculas se incuban primero con albumina serica que se utiliza para probar la estabilidad serica. Las mediciones del potencial zeta sugieren que la albumina recubre las nanopartfculas de p5RHH/ARNip, pero no esta claro como esto mejora la transfeccion. Los estudios existentes han demostrado que la albumina puede ayudar a la fusion de bicapas lipfdicas a un pH bajo y esta actividad puede desempenar un papel en el escape endosomal. La mejora observada en la eficacia de la transfeccion de ARNip debena establecer una via interesante para mejorar los procedimientos de formulacion para maximizar la eficacia de la transfeccion mediada por p5RHH.
La capacidad de p5RHH para transfectar ARNip en celulas cancerosas, celulas endoteliales e incluso macrofagos apunta a un amplio espectro de actividad de transfeccion mientras se mantienen las caractensticas de citotoxicidad favorables. Dado el tamano de las nanopartfculas (~ 190 nm), se abordaron los procesos de enfermedad que no requieren extravasacion vascular a traves de barreras endoteliales intactas. El cancer, la angiogenesis y la aterosclerosis se caracterizan por una barrera endotelial discontinua con una perdida de nanopartfculas mejorada en los tejidos circundantes. En el cancer, este efecto es ampliamente conocido como "permeabilidad y retencion mejorada", y se han informado previamente de efectos similares para estados de aterosclerosis severa. Ademas, el tamano de las nanopartfculas en los ejemplos inmediatos debena proporcionar farmacocineticas favorables y una semivida en suero al evitar tanto la filtracion renal como la absorcion por el sistema reticulendotelial. Las nanopartfculas de p5RHH/ARNip tambien exhiben estabilidad de tamano y retienen la capacidad de transfeccion del ARNip cuando se incuban en presencia de albumina de suero humano durante 24 horas antes de la transfeccion, un problema que se ha reconocido que disminuye la actividad de algunos agentes de transfeccion de CPP. Aunque la proteccion detallada de ARNip y el analisis de estabilidad a largo plazo aun no se han realizado, estos datos sugieren que las nanopartfculas de p5RHH/ARNip podnan proporcionar beneficios terapeuticos cuando se utilizan
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para la transfeccion en entornos in vivo.
Como tal, el nuevo derivado de melitina, p5RHH, muestra la capacidad de interactuar con el ARNip de forma electrostatica y formar nanopartteulas estables que muestran un suministro eficaz en el citoplasma con la posterior degradacion espedfica de secuencia del ARNm y la disminucion de la expresion de protemas en una variedad de tipos de celulas. Los estudios no revelaron ningun signo de citotoxicidad, lo que sugiere la utilidad potencial de las nanopartteulas de p5RHH/ARNip en entornos clmicos. La estabilidad de estas partteulas en presencia de protemas sericas sugiere que las nanopartteulas de p5RHH/ARNip senan buenos candidates de pruebas para suministrar ARNip in vivo en dianas intravasculares o en tejido enfermo caracterizado por disfuncion de la barrera endotelial.
Procedimientos para los ejemplos 1-4.
Preparacion de nanoensamblajes de peptido/ARNip y analisis
Se formularon los derivados de melitina por Genscript (Piscataway, NJ), se disolvieron a 10 mM en agua libre de RNAsa/DNAsa (Sigma, St. Louis, MO) y se almacenaron en alteuotas de 4 pl a -80 °C antes de su uso. Se prepararon los complejos de transfeccion P5RHH/ARNip mediante la dilucion de p5RHH 1:200 en solucion salina tamponada con fosfato (PBS, Sigma), se agitaron en vortex durante 30 segundos, seguido de la adicion de la cantidad apropiada de ARNip (concentracion de reserva de 10 pM en tampon ARNip 1x (Thermo) ) y se incubaron durante 40 minutos a 37 °C con agitacion en un Eppendorf Thermomixer R. Se analizaron las nanopartteulas resultantes para determinar la incorporacion de ARNip por resolucion en un gel de poliacrilamida al 12 % seguido de tincion con bromuro de etidio. Se realizaron la dispersion dinamica de la luz (DLS) y las mediciones del potencial zeta en un medidor de partteulas Zeta Plus (Brookhaven Instruments, Newton, MA). Se realizo el analisis de la estabilidad del suero mediante la incubacion de nanopartteulas de peptido/ARNip recien formadas en albumina de suero humano (HSA, Sigma) 10mg/ml durante la noche seguido de DLS y mediciones de potencial zeta.
Cultivo celular
Se mantuvieron las lmeas celulares B16F10 y RAW264.7 (ATCC, Manassas, VA) en condiciones estandar de cultivo celular (37 °C y CO2 al 5 % en una incubadora humidificada) en DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) complementado con suero fetal bovino al 10 % (Gibco). Las celulas B16F10 que expresan establemente GFP se produjeron de la siguiente manera. Se transfectaron B16F10 (Lipofectamine 2000, Invitrogen) con una fusion de eGfP (pEGFP-N1, Clontech) y la secuencia PEST de la ornitina descarboxilasa de raton (S421-V461) en pEF6V5HisTOPO (Invitrogen). Se seleccionaron celulas para cuatro rondas con clasificacion de celulas por citometna de flujo sin seleccion de antibioticos. Una alteuota de celulas se mantuvo en cultivo continuo durante un mes sin un cambio notable en el nivel de expresion de EGFP. Se adquirieron celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, de sus siglas en ingles) de Lifeline Technologies (Frederick, MD) y se cultivaron en medio basal VascuLife (Lifeline Technologies) complementado con EGF 5 ng/ml, bFGF 5 ng/ml, IGF-1 15 ng/ml, acido ascorbico 50 pg/ml, hidrocortisona hemisuccinato 1 pg/ml, sulfato de heparina 0,75 U/ml, L-glutamina 10 mM, suero bovino fetal al 2 % de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para todos los experimentos, se utilizaron HUVEC en el paso 3.
Transfeccion de ARNip
Las celulas se colocaron en placas de 6 pocillos 12 horas antes de la transfeccion y se cultivaron en condiciones estandar de cultivo celular. Se prepararon nanopartteulas de P5RHH/ARNip y se incubaron con celulas durante 4 horas en un volumen final de 1 ml de Optimeml (Gibco) o medios apropiados complementados con FBS al 10 %. Las transfecciones se escalaron en consecuencia para las celulas colocadas en placas de 12 pocillos segun el area de superficie del cultivo celular. Despues de la transfeccion, se lavaron las celulas dos veces con PBS y se incubaron con medio de cultivo celular estandar durante otras 24-72 horas antes del analisis. Se utilizo Lipofectamine 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, se diluyo Lipofectamine 2000 en Optimeml hasta una concentracion final de 8,4 pg/ml y se incubo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se anadio ARNip al lfpido diluido y se incubo durante otros 40 minutos antes de la dilucion hasta un volumen total de 1 ml con Optimeml para la transfeccion. El ARNip de eGFP (en sentido: 5'-GACGUAAACGGCCACAAGUUC-3'; SEQ ID NO: 56) se adquirio de Sigma. Se compraron ARNip espedficos de los genes ARNip1 de MAPK9 de raton de siGENOME, ARNip2 de STAT3 de raton de siGENOME y ARNip2 de STAT3 humano de siGENOME en Dharmacon (Lafayette, CO). El ARNip aleatorio se compro a Qiagen (Valencia, CA).
Transferencia de Western
24 o 48 horas despues de la transfeccion, se anadio 100-200 pl de tampon RIPA (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, IgepaICA-630 al 1,0 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, dodecil sulfato de sodio al 0,1 %, EDTA 1 mM, glicerol al 5 %) con PMSF 1 mM y coctel inhibidor de proteasa completa (Roche) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se incubo en hielo durante 1 hora. Luego, se centrifugaron los lisados celulares a 4 °C durante 5 minutos y se almacenaron los sobrenadantes a -20 °C. Se resolvieron los lisados en geles Nupage Bis-Tris (Life Technologies) y se transfirieron a 0,22 pm de nitrocelulosa antes del bloqueo en albumina de suero bovino al 5 % (Sigma) en TBS- T. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-GAPDH de conejo (1:1500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p-actina de raton (1:1000, Sigma), anti-STAT3 de raton (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), anti- JNK2 de conejo (1:1000, Cell Signaling). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron: anti-HRP de conejo (1:5000,
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Santa Cruz Biotechnology) and anti-HRP de raton (1:5000, Santa Cruz Biotechnology). Las transferencias se desarrollaron utilizando el sustrato de transferencia Western ECL (Pierce, Rockford, IL). Se cuantifico la atenuacion utilizando densitometna en ImageJ (NIH, Bethesda, MD) y se normalizo a un control no tratado. Todos los datos se presentan como promedio de 3 experimentos separados.
PCR en tiempo real
24 horas despues de la transfeccion, se produjo ADNc utilizando el kit de ADNc FastLane Cell (Qiagen). Se almaceno el ADNc a -20 °C hasta su uso. Se cuantificaron los niveles de ARNm utilizando la deteccion de SYBR green en un sistema Applied Biosystems 7300 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) utilizando iTaq SYBR green con ROX (Bio-Rad, Hercules, CA). Quantitect Primer Assay (Qiagen) proporciono cebadores espedficos de genes para cada gen. Se normalizaron los genes de interes a la B-actina apropiada para la especie. Los resultados se informan como "factor de cambio" promedio en relacion con los controles no tratados para 3 experimentos separados.
Microscopia confocal
Se cultivaron celulas B16F10 en cubreobjetos de vidrio y se transfectaron con ARNip anti-GFP marcado con Cy5.5 (Sigma) de acuerdo con el procedimiento de transfeccion estandar. 12 horas despues de la transfeccion, se lavaron las celulas 3x en PBS y se fijaron en PFA al 4 % antes de montarlas en portaobjetos de vidrio (Vectashield Mounting Medium con DAPI, Vector Labs, Burlingame, CA). Se tomaron imagenes de las celulas mediante microscopia confocal en un Zeiss Meta 510 (Thornwood, NY).
Citometna de flujo
24 horas despues de que se transfectaran las celulas B16-GFP con nanopartfculas de p5RHH/ARNip que conteman ARNip espedfico de GFP o aleatorio, se tripsinizaron y se resuspendieron las celulas en tampon FACS (FBS al 0,2 % y EDTA 0,5 mM) para el analisis de fluorescencia de GFP.
Ensayos de viabilidad celular
Se determino la viabilidad celular 72 horas despues de la transfeccion utilizando Alamar Blue (Life technologies). En resumen, se diluyo Alamar Blue 1:10 en medio libre de rojo fenol y se incubo con celulas durante 2-4 horas. Se midio la fluorescencia en un lector de placas fluorescente con excitacion a 570 nm y emision a 585 nm (Varian Cary Eclipse, Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
Ensayos de formacion de tubos
Se descongelo Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) durante la noche a 4 °C en un bano de hielo y posteriormente se dejo gelificar en placas de 24 pocillos durante 1 hora a 37 °C. 24 horas despues de la transfeccion con ARNip espedfico de STAT3 o de control, se tripsinizaron y se sembraron las HUVEC en matrigel a una densidad celular de 30.000 celulas/pocillo. La formacion de tubos se dejo avanzar durante 24 horas antes de la visualizacion en un microscopio invertido. Se determino una puntuacion de formacion de tubos en funcion de la longitud total de tubos por campo de vision normalizada a los controles no tratados segun lo medido en ImageJ (NIH).
Ensayos de migracion de HUVEC
Los fondos de las inserciones Transwell de 12 pocillos con un tamano de poro de 1,0 pm (Corning, Tewksbury, MA) se recubrieron con gelatina porcina al 0,1 % (Sigma) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las HUVEC transfectadas con ARNip espedfico de STAT3 o de control con 24 horas de anticipacion fueron luego tripsinizadas y resuspendidas en medios libres de factor de crecimiento y se agregaron a la camara transwell apical a una densidad de 30.000-50.000 celulas/pocillo. La camara inferior contema factor de crecimiento libre de medio basal VascuLife ± bFGF 5 ng/ml. Se dejaron migrar las celulas a traves del inserto de polfmero durante 12 horas. Se retiraron las celulas no migradas de la camara apical con un hisopo de algodon esteril y se determinaron los numeros de celulas migradas a traves de Alamar Blue. Los datos se presentan como la migracion normalizada promedio de 3 experimentos separados. Para la visualizacion, se cortaron los insertos y se montaron en portaobjetos de vidrio. Se visualizaron los nucleos celulares con tincion DAPI en una Olympus BX610 (Tokio, Japon) y se informaron como el numero promedio de celulas por campo de vision.
Ensayo de formacion de celulas espumosas/tincion con Oil Red O
48 horas despues de la transfeccion con ARNip espedfico de JNK2 o de control, se incubaron celulas RAW264.7 ± Ac-LDL 50 ug/ml (Intracel, Frederick, MD) durante 24 horas adicionales. Luego se tineron las celulas con Oil-Red O para visualizar la formacion de celulas espumosas. En resumen, se disolvio Oil-Red O en metanol puro a (0,5 g/100 ml) durante la noche antes de la filtracion a traves de un filtro de 0,22 pm. Luego se diluyo la reserva de Oil-Red O 3:5 en agua destilada para preparar la solucion de trabajo Oil-Red O y se filtro por segunda vez a traves de un filtro de 0,22 pm. Se fijaron las celulas en PFA al 4 % durante 10 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con metanol al 60 % antes de tenir en la solucion de trabajo Oil-Red O durante 15 minutos. Despues de la tincion, se lavaron las celulas una vez con metanol al 60 % y una vez con agua destilada antes de montar en portaobjetos de
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vidrio.
Introduccion para los ejemplos 9-14.
La degradacion post-transcripcional del ARNm a traves de ARN de interferencia (ARNi) proporciona un enfoque dirigido para silenciar la expresion genica que puede resultar beneficioso en el tratamiento de muchas enfermedades clmicamente relevantes. El ARNi se puede inducir mediante el suministro de ARN de interferencia pequeno (ARNip) en el citoplasma de una celula de mairnfero, despues de lo cual la incorporacion del ARNip en los complejos de silenciamiento inducidos por ARN (RISC, de sus siglas en ingles) conduce a una escision espedfica de la secuencia del ARNm complementary. Dada la actividad del ARNip en el citoplasma, el ARNip debe pasar por alto las membranas celulares impermeables para alcanzar el compartimento citoplasmatico. Desafortunadamente, debido al gran peso molecular del ARNip (~ 21 kDa) y la carga negativa, el ARNip desnudo no puede difundirse libremente a traves de las membranas celulares, lo que requiere un sistema de suministro eficaz para ayudar a la absorcion celular y el posterior escape endosomal.
Los sistemas de suministro de ARNip comunes incluyen lfpidos y polfmeros cationicos, que son eficaces, pero estan obstaculizados por una posible toxicidad. Trabajos recientes se han centrado en peptidos poli-basicos o dominios de transduccion de peptidos (PTD, de sus siglas en ingles) para la transfeccion de ARNip debido a su falta de efectos secundarios toxicos. Desafortunadamente, muchos estudios han informado de solo un exito modesto en el logro de un suministro de ARNip altamente eficaz cuando se forman complejos con peptidos como consecuencia de un atrapamiento endosomal excesivo. Reconocer el atrapamiento endosomal como la barrera primaria que obstaculiza el progreso de los vectores de ARNip basados en peptidos hace hincapie en que deben desarrollarse nuevas estrategias para mejorar la transfeccion mediada por peptidos. Por consiguiente, los inventores proponen que los peptidos que alteran la membrana que llevan una carga neta positiva pueden proporcionar una alternativa inexplorada para la transfeccion eficaz de ARNip debido a su doble funcionalidad tanto para el ARNip complejo como para alterar los compartimentos endosomicos.
Desafortunadamente, es diffcil predecir la utilidad de derivados de melitina en la transfeccion de ARNip debido a que los mecanismos que permiten el exito de la transfeccion mediada por peptido aun no han sido completamente aclarados. Por ejemplo, el trabajo reciente de van Asbeck y col. (2013; ACS Nano 7: 3797-3807) concluye que la sensibilidad a la descomplejacion mediante macromoleculas polianionicas contribuye a mejorar la transfeccion, pero no se establecio el papel que desempena la descomplejacion en el suministro de ARNip al citoplasma. Ademas, los peptidos fusogenicos del virus de la gripe sensibles al pH se han aprovechado previamente para aumentar la transfeccion mediada por peptidos, pero su capacidad para mejorar la transfeccion de ARNip puede atribuirse al aumento del empaquetamiento o la absorcion de ARNip, y no al escape endosomal. Si bien las nanopartfculas de CPP/ARNip se han caracterizado bien desde una perspectiva ffsico-qmmica, los mecanismos implicados en la transfeccion de nanocomplejos de peptido/ARNip que contribuyen a una derivacion exitosa del atrapamiento endosomal y la posterior induccion de ARNi aun no se han dilucidado. Se requieren estudios adicionales con respecto al procesamiento intracelular de nanocomplejos de peptido/ARNip y el mecanismo de liberacion del ARNip en el citoplasma para desarrollar mas los peptidos para la transfeccion de ARNip.
Los inventores han informado previamente que el derivado de melitina, p5RHH, es capaz de la transfeccion de ARNip con una CI50 tan baja como 25 nM sin citotoxicidad significativa en todas las dosis probadas (Hou y col., 2013; 34:3110-3119). En los ejemplos en el presente documento, este peptido se emplea para el suministro de ARNip de p65 y p100/52 para la atenuacion simultanea de rutas de senalizacion de NFkB tanto canonicas como no canonicas en un modelo murino de Virus-1 T-Linfotropico humano (HTLV-1) inducido por leucemia/linfoma de linfocitos T en adultos (ATLL). Para mejorar la estabilidad, se muestra en el presente documento que una formulacion de p5RHH recubierta de albumina exhibe una notable eficacia de transfeccion atribuible al desensamblaje de nanopartfculas desencadenado por pH. Estudios detallados sobre el mecanismo de accion revelan que la exposicion al pH endosomal desencadena tanto el desensamblaje de nanopartfculas como el escape endosomal. Ademas, se desprende de las comparaciones con los derivados de melitina que no funcionan que la alteracion endosomal sola no da como resultado una induccion exitosa de ARNi, pero requiere la liberacion simultanea de ARNip del vector.
Los resultados presentados en el presente documento ofrecen parametros generales que producen un suministro eficaz de ARNip en el citoplasma mediante vectores peptfdicos, que pueden ayudar en el desarrollo de nanocomplejos de peptido/ARNip no covalentes para las terapias de ARNip.
Ejemplo 9: Formulacion de nanoparticulas de p5RHH/ARNip estabilizadas con albumina.
Para formular las nanoparticulas de p5RHH/ARNip, se disuelve p5RHH (reserva 10 mM en DI H2O) 1:200 en solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco, se agita en vortex durante 30 segundos, seguido de la adicion de la cantidad apropiada de ARNip (reserva 100 |jM en 1x ARNip) y se incuba a 37 °C durante 40 minutos (FIG. 14A). Se eligieron incubaciones de 40 minutos en funcion del tamano de partfcula segun se rastrearon mediante microscopfa electronica Deep-Etch. Las micrograffas electronicas (FIG. 15A) indican que las partfculas formadas en este punto de tiempo no han comenzado a mostrar una agregacion adicional, lo que permite una plataforma para la estabilizacion cinetica a traves del recubrimiento de superficie con albumina. Notablemente, las incubaciones de 40
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Se sabe que la albumina proporciona una estabilidad mejorada de las nanopartteulas mediante el recubrimiento de las nanopartteulas para prevenir la floculacion. Las formulaciones estabilizadas con albumina incluyen una incubacion posterior de 30 minutos en presencia de albumina de suero humano 0,5 mg/ml (reserva 50 mg/ml en DI H2O) antes de su uso. Se midio el tamano de las nanopartteulas de p5RHH/ARNip estabilizadas con albumina 72 horas despues de la formulacion en ~ 55 nm ± 18 mediante microscopfa de fuerza atomica en modo humedo (FIG. 14B), lo que indica que la albumina evita la floculacion de las nanopartteulas de p5RHH/ARNip.
Ejemplo 10. Mecanismo de entrada celular de nanopartteulas de peptido/ARNip.
Teniendo en cuenta la incertidumbre que rodea la entrada celular de las nanopartteulas de peptido/ARNip, se realizaron ensayos de absorcion para proporcionar informacion sobre el mecanismo mediante el cual p5RHH logra el suministro citoplasmico de ARNip. Los ensayos de citometna de flujo que representan la absorcion de ARNip aleatorio marcado con Alexa488 empaquetado con p5RHH proporcionan una herramienta experimental conveniente para determinar el papel de rutas endodticas selectas en la absorcion de nanopartteulas de p5RHH/ARNip. La incubacion de celulas a 4 °C provoca una inhibicion casi completa de la absorcion de p5RHH/ARNip, que rechaza asf la hipotesis de que p5RHH media la translocacion directa de la membrana para la liberacion citoplasmica de ARNip (FIG. 16). En cambio, los estudios sobre la absorcion de p5RHH/ARNip en presencia de inhibidores de la endocitosis indican que la macropinocitosis es la ruta principal responsable de la absorcion de p5RHH/ARNip (FIG. 17A-D). El inhibidor de la macropinocitosis EIPA reduce drasticamente la absorcion de p5RHH/ARNip, mientras que el inhibidor de las caveolas, la filipina y el inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina (CME, de sus siglas en ingles), PAO, no tienen efecto sobre la absorcion de p5RHH/ARNip.
Se ha demostrado que la utilizacion de inhibidores endosomicos para evaluar los mecanismos de absorcion no es espedfico y tambien es dependiente del tipo celular. En consecuencia, los ensayos de inhibicion de la absorcion se realizaron durante solo 40 minutos a concentraciones de inhibidor que se determinaron que eran espedficas de la ruta esperada (FIG. 18), como se demostro mediante la inhibicion de marcadores de transferrina endosomal estandar (CME) y dextrano de 70 kDa (macropinocitosis). Se sabe que las celulas B16 no expresan caveolina-1 y, como es logico, la absorcion del marcador de caveolas Toxina B del colera no se puede medir en este tipo de celulas (observacion no publicada).
La microscopia confocal confirma los datos de la citometna de flujo, que ilustran la colocalizacion fuerte de p5RHH/Cy3-ARNip con FITC-dextrano de 70 kDa (FIG. 17J), pero no con FITC-Transferrina (FIG. 17I). Se incubaron las celulas con marcadores de absorcion durante solo 40 minutos para minimizar la liberacion de ARNip marcado con Cy-3 en el citoplasma, lo que podna producir una fluorescencia citoplasmica o nuclear que, de lo contrario, podna confundir el analisis y, por lo tanto, no se tomaron imagenes de las celulas que exhiben liberacion citoplasmica para evitar estos problemas. De forma interesante, el ARNip rapido (< 1 hora de absorcion y liberacion) marcado con Cy-3 confirma el rapido escape endosomal inducido por las nanopartteulas de p5RHH/ARNip (FIG. 19).
Estos resultados estan de acuerdo con las reglas generales que regulan la absorcion celular de muchos peptidos cargados positivamente que contienen restos basicos. Espedficamente, los restos de arginina pueden formar interacciones ionicas bidentadas con los proteoglicanos de la superficie celular, lo que da como resultado una asociacion cercana con la membrana plasmatica. Ademas, estas interacciones de union no espedfica pueden estimular los reordenamientos de actina que se requieren para la absorcion de la fase fluida por la macropinocitosis. La fuerte absorcion de peptidos cargados positivamente indica que la asociacion electrostatica con la membrana plasmatica y la posterior absorcion en fase lfquida es suficiente para lograr una absorcion sustancial de peptido/ARNip.
Ejemplo 11. Trafico de ARNip posterior a la endocitosis.
El trafico adecuado de ARNip posterior al evento endodtico inicial tambien es de vital importancia para una transfeccion exitosa del ARNip. En particular, el pH de los endosomas y los lisosomas se controla estrictamente mediante la acidificacion a traves de ATPasas vacuolares unidas a la membrana y puede proporcionar un desencadenante para la liberacion de ARNip ambientalmente sensible de las nanopartteulas de p5RHH/ARNip. Para determinar si el bajo pH generado por estas ATPasas vacuolares esta involucrado en la liberacion de ARNip de los endosomas, se incubaron las celulas en presencia de bafilomicina A1 durante la transfeccion. En comparacion con las celulas de control transfectadas sin bafilomicina A1 (FIG. 20E), las celulas tratadas con bafilomicina A1 (FIG. 20F) condujeron a una perdida casi completa de la atenuacion de GFP segun se determino mediante citometna de flujo. Debido a que la bafilomicina A1 podna estar disminuyendo la absorcion de p5RHH/ARNip, se utilizo la evaluacion por citometna de flujo de la absorcion de ARNip marcado con fluorescencia en celulas Bl6 para asegurar que la concentracion de bafilomicina A1 utilizada en estos ensayos no afectara la absorcion de p5RHH/ARNip (FIG. 20A-C). Estos datos confirman la importancia de la acidificacion endosomal en la liberacion citoplasmica de ARNip cuando se suministra a las celulas a traves de p5RHH.
Ejemplo 12: Integridad de las nanopartteulas a pH acido.
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Debido a que la acidificacion endosomal es crucial para la capacidad de p5RHH para suministrar ARNip al citoplasma, se incubaron nanopartfculas de p5RHH/ARNip a pH bajo para determinar como un ambiente cada vez mas acido afecta la integridad de las nanopartfculas. Los ensayos de union al colorante que utilizan la tincion de acido nucleico TOPRO3 revelan que el ARNip se hace cada vez mas accesible a un pH < 5,5, como se manifiesta por el aumento de la intensidad de la fluorescencia de TOPRO3 (FIG. 21A). Para determinar si el aumento de la accesibilidad del tinte se correlacionaba con una mayor liberacion de ARNip, se analizaron muestras adicionales en un gel de poliacrilamida al 20 % para resolver el ARNip libre (FIG. 21B). Segun estos datos, es evidente que el ARNip no se vuelve libre para migrar al gel hasta que se alcanza un pH de 4,5. En conjunto, estos ensayos implican un mecanismo dependiente del pH para el desensamblaje de partfculas y la liberacion de ARNip, con un pH mas bajo (4,5) requerido para que el ARNip se libere completamente que el requerido para iniciar el desensamblaje de partfculas (pH 5,5). En contraste con p5RHH, p5RWR no puede responder al pH como se demuestra por una falta de fluorescencia de TOPRO3 a pH < 5,5 (FIG. 21A), y una falta de liberacion de ARNip medida por la movilidad del gel (FIG. 21B).
Para corroborar el desensamblaje de partfculas, se cuantifico la liberacion de p5RHH dependiente del pH de las nanopartfculas de p5RHH/ARNip despues de la dialisis a traves de una membrana de dialisis 10 K. Estos ensayos revelan que aproximadamente el 40 % de p5RHH permanecio libre despues del ensamblaje de la partfcula, y se produjo una fuerte liberacion de p5RHH a pH < 5,5 (FIG. 21C). Esta dependencia del pH coincide con la dependencia del pH observada para la union del tinte de ARNip, lo que confirma que el pH, de hecho, desencadena el desensamblaje de las nanopartfculas y la posterior liberacion de p5RHH y de ARNip.
La capacidad lttica de p5RHH liberada se puede cuantificar in vitro con ensayos de hemolisis de globulos rojos (RBC, de sus siglas en ingles). Cuando se incuba a un pH decreciente, la capacidad de las nanopartfculas de p5RHH/ARNip para lisar RBC aumenta, debido a la liberacion de p5RHH libre a pH < 5,5 (FIG. 21D). Estos ensayos se realizaron a 4 °C para disminuir la tasa de autohemolisis observada a temperaturas mas altas. La hemolisis de los RBC indica que p5RHH libre es capaz de lisar estructuras unidas a la membrana y podna, posiblemente, alterar las membranas endosomicas en celulas intactas (FIG. 22).
Se observo alteracion endosomal en celulas vivas mediante tincion con naranja de acridina. Las celulas se cargaron primero con naranja de acridina (10 pM, 15 minutos), que emiten fluorescencia roja a pH bajo en el endosoma pero verde a pH citoplasmico. La alteracion endosomica se puede visualizar mediante un aumento de la fluorescencia verde citoplasmica en presencia de cloroquina 100 pM (FIG. 21F). De forma similar, las celulas transfectadas con p5RHH/ARNip tambien liberaron naranja de acridina de las vesfculas endosomicas citoplasmicas, lo que confirma la eficaz alteracion del endosoma, mientras que las celulas transfectadas con nanopartfculas del p5RWR/ARNip no mostraron alteracion endosomal (FIG. 21H, G). Estos resultados resaltan la importancia del desensamblaje de nanopartfculas y la liberacion de peptidos activos en la membrana medidos in vitro para la alteracion del endosoma en un contexto celular (FIG. 21I-K). Mientras las nanopartfculas de p5RHH/ARNip son sensibles al pH y liberan p5RHH para la alteracion endosomica, las nanopartfculas de p5RWR/ARNip no se desensamblan y no alteran la integridad endosomal.
Un mecanismo potencial para las propiedades sensibles al pH de las nanopartfculas de p5RHH/ARNip parece ser la protonacion de restos de histidina. Con un pKa de 6, la histidina probablemente proporciona el desencadenante cntico para el desensamblaje de partfculas debido a que el aumento de la union del tinte al ARNip y la liberacion de p5RHH se registran a pH < pKa de la histidina. Tradicionalmente, la protonacion de histidina a menudo se ha utilizado como un desencadenante para el suministro de ARNip en el contexto del efecto de esponja de protones, en el que la capacidad tamponante de los polfmeros que contienen histidina conduce a la acumulacion de contraiones de Cl- y, en ultima instancia, a la ruptura osmotica del endosoma. En comparacion con los procedimientos que dependen del tamponamiento endosomal para la ruptura osmotica, la presencia de solo dos restos de histidina en el presente peptido sugiere que estas modificaciones propuestas a la melitina probablemente no produzcan una capacidad de tamponamiento adecuada para lograr el efecto de esponja de protones para el escape endosomal. Como ejemplo, se ha demostrado que el TAT debe aumentarse con al menos diez restos de histidina para la liberacion exitosa de acido nucleico en el citoplasma. Si bien no se puede descartar por completo que exista alguna contribucion del efecto de esponja de protones a la endosomolisis mediante p5RHH observada para la liberacion de naranja de acridina, la necesidad de solo dos restos de histidina es una indicacion de que el pH desencadena el desensamblaje de partfculas y la posterior liberacion del peptido lttico de membrana. Es probable que la ruptura osmotica juegue solo un papel menor, si lo hay.
Ejemplo 13. Atenuacion exitosa de GFP en celulas B16 GFP mediante nanopartfculas de ARNip.
Cuando se examina la capacidad de p5RHH para suministrar ARNip de GFP a celulas B16-GFP, se observa una fuerte disminucion en la expresion de GFP a ARNip 50 nM mediante transferencia de Western 24 horas despues de la transfeccion (FIG. 23A). Ademas, la transfeccion de celulas en presencia de cloroquina 50 pM, un conocido agente endosomolftico, no mejora la atenuacion. La falta de atenuacion adicional por la cloroquina verifica que la propia p5RHH sea capaz de liberar completa y eficazmente el ARNip del compartimento endosomico, un hallazgo que se visualiza mediante microscopfa confocal (FIG. 23D, F).
A pesar de la absorcion casi igual de las nanopartfculas de p5RWR/ARNip (FIG. 23B), p5RWR es incapaz de inducir
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la atenuacion de GFP incluso en presencia de cloroquina (FIG. 23A). La microscopfa confocal revela un alto grado de atrapamiento endosomal, lo que sugiere que las nanopartmulas de p5RWR/ARNip no alcanzan el citoplasma (FIG. 23C), a menos que se traten con cloroquina (FIG. 23E). El hecho de que la atenuacion de GFP permanezca danada a pesar de la liberacion endosomal por la cloroquina (FIG. 23A) indica que la accesibilidad del ARNip al complejo silenciador inducido por el ARN esta deteriorada, lo que refleja la escasa liberacion de ARNip de las nanopartmulas basadas en p5RWR observada por la union de TOPRO3 y los ensayos de cambio de movilidad de gel in vitro (FIG. 21A, B).
Estos datos resaltan que la capacidad de las nanopartmulas de p5RHH/ARNip para desensamblarse en respuesta a un pH bajo es crucial para el suministro de ARNip al citoplasma. Espedficamente, el desensamblaje de nanopartmulas con la liberacion de ARNip del vector y la endosomolisis concurrente por p5RHH es un evento coordinado que produce el acceso del ARNip libre al compartimiento citoplasmico. El papel esencial de la liberacion coordinada de ARNip y el escape endosomal en la transfeccion exitosa de ARNip es bien conocido. Por ejemplo, la liberacion prematura de ARNip en el endosoma permite la degradacion del ARNip por hidrolasas endosomicas. Por otra parte, los peptidos que se unen demasiado fuerte al ARNip tambien tienen la hipotesis de prevenir el exito del ARNi. En consecuencia, la liberacion de ARNip de las nanopartmulas de p5RHH/ARNip debe ser concurrente con el escape endosomal para la degradacion maxima del ARNm.
Ejemplo 14. Transfeccion in vivo altamente eficaz de ARNip dirigidos a las rutas de NFkB en el modelo de leucemia/linfoma de linfocitos T adultos (ATLL).
El potencial terapeutico de las nanopartmulas de p5RHH/ARNip recubiertas con albumina se demostro mediante la transfeccion altamente eficaz de los ARNip que se dirigen a las rutas de NFkB canonicas y no canonicas en las celulas F8, un modelo murino de ATLL inducido por HTLV-1. El factor de transcripcion NFkB fue elegido como una diana terapeutica debido a su papel central en la ATLL, donde promueve la resistencia a la quimioterapia mediante el impulso de la expresion de protemas antiapoptoticas. Mientras que los inhibidores del proteasoma de molecula pequena y los inhibidores del complejo IKK pueden disminuir la activacion de NFkB en algunos modelos de enfermedad ATLL, las preguntas sobre su especificidad y capacidad para inactivar NFkB in vivo resaltan la necesidad de terapias mas espedficas. La sinergia potencial proporcionada por la inhibicion directa de las rutas de NFkB tanto canonicas como no canonicas a traves de ARNip puede ser la clave para el bloqueo exitoso de la senalizacion de NFkB requerida para el exito terapeutico.
Se eligieron ARNip para dirigirse a la subunidad p65 de la ruta canonica y a la subunidad p100/p52 de la ruta no canonica. La transferencia de Western realizada 24 horas despues de la transfeccion revelo una disminucion dependiente de la dosis en la expresion de ambas protemas que no se observo cuando se transfectaron las celulas con un control de ARNip aleatorio (FIG. 24A, B). Los ensayos con Alamar blue (FIG. 24C) 48 horas despues de la transfeccion demuestran que la atenuacion de estas rutas in vitro es terapeuticamente relevante, ya que se registra una fuerte disminucion de la viabilidad celular con los ARNip de p65 y pl0o/p52. Ademas, esta claro que el bloqueo de la ruta de NFkB no canonica con el ARNip de p100/p52 (CI50 ~ 100 nM) es superior al bloqueo de la ruta canonica (CI50 ~ 200 nM) en esta lmea celular. Se supone que la ruta no canonica desempena un papel mas importante en la promocion de la expresion de protemas antiapoptoticas que la ruta canonica, al marcarla como la diana mas deseable para modular la proliferacion de celulas ATLL. Los datos presentados en el presente documento, que utilizan el suministro de ARNip mediado por p5RHH, no solo confirman esta hipotesis, sino que tambien revelan una respuesta sinergica cuando se dirigen a las rutas de NFkB canonicas y no canonicas con una unica formulacion p5RHH/ARNip que empaqueta simultaneamente ambos ARNip de p65 y p100/p52. La utilizacion de esta formulacion de p5RHH/ARNip de doble diana mejora la muerte celular mediada por el bloqueo de NFkB, con una CI50~ 50 nM. Es importante tener en cuenta que a pesar de la capacidad de lisar RBC in vitro y las membranas endosomicas in vivo, la transfeccion con ARNip aleatorio no produce ninguna toxicidad de las celulas F8. El trabajo realizado por los inventores ha demostrado que el truncamiento N-terminal de la melitina disminuye su capacidad lftica en 2 ordenes de magnitud (observacion no publicada), y aunque parece que p5RHH es capaz de lisar endosomas a alta concentracion, p5RHH es seguro despues de la liberacion y dilucion endosomal en el citoplasma. Dada la seguridad de p5RHH en el cultivo de tejidos, se realizaron experimentos piloto para examinar la localizacion tumoral de las nanopartmulas de p5RHH/ARNip cuando se suministraron in vivo. Las imagenes de IVIS y la microscopfa confocal revelan el suministro de tumores de ARNip aleatorios marcados con Cy5.5 (FIG. 24D-G y FIG. 27) cuando se introducen por inyeccion en la vena de la cola en ratones portadores de tumores de ATLL espontaneos en una dosis de 1 mg/kg. Los tumores de ratones inyectados con nanopartmulas de p5RHH/Cy5.5-ARNip exhiben acumulacion de ARNip de Cy5.5 en la periferia, mientras que el ARNip de Cy5.5 limitado se encuentra en el centro del tumor (FIG. 25).
Los intentos anteriores de dirigirse a la expresion de NFkB en sf se han centrado en la utilizacion de oligonucleotidos de ADN antisentido desnudos o la expresion de ARNhc lentiviral, que tienen un potencial terapeutico limitado. La utilizacion de oligonucleotidos antisentido es ineficiente, ya que requiere un orden de magnitud mas de oligonucleotidos in vitro que la formulacion de ARNip presentada en el presente documento. Por otra parte, los vectores virales para la expresion de ARNhc presentan innumerables desafms para los ensayos en humanos que van desde la induccion de cancer hasta la toxicidad asociada con los efectos de saturacion. Debido a la capacidad de dirigir simultaneamente ambas rutas de NFkB, se cree que el enfoque actual de ARNip muestra que la utilizacion de p5RHH para la transfeccion altamente eficaz y de baja toxicidad de ARNip dirigido a NFkB refleja una estrategia
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sinergica para el tratamiento de ATLL u otros procesos de enfermedad que son conducidos por la induccion de NFkB.
Conclusion para los ejemplos 1-14.
En resumen, los peptidos ltticos de membrana pueden reclutarse como agentes de escape endosomicos para promover el suministro citoplasmico de ARNip evitando el atrapamiento de ARNip asociado con la transfeccion mediada por PTD alternativa. Se presenta una formulacion de p5RHH/ARNip estabilizado con albumina con un tamano final de ~ 55 nm. Estas nanopartfculas son endocitadas por la absorcion de la fase fluida mediante macropinocitosis. La posterior acidificacion endosomal proporciona un desencadenante para el desensamblaje de partfculas mediadas por pH con liberacion simultanea de ARNip y escape endosomal provocado por la liberacion de p5RHH libre (FIG. 26). Cuando se utiliza para la transfeccion simultanea de los ARNip de p65 y p100/p52 en un modelo de ATLL, p5RHH media una disminucion sinergica en la viabilidad celular, lo que sugiere el potencial de mas estudios in vivo. La capacidad unica de las nanopartfculas de p5RHH/ARNip para coordinar eficazmente la liberacion de peptidos y ARNip con endosomal augura un potencial para la utilizacion de la transfeccion mediada por p5RHH en una variedad de sustratos de enfermedades. Ademas, el analisis del mecanismo de accion de p5RHH proporciona una perspectiva que puede guiar el desarrollo adicional de futuros vectores peptfdicos para la transfeccion de ARNip.
Materiales y procedimientos para los ejemplos 9-14.
Preparacion de nanopartculas de peptido/ARNip y analisis
Los derivados de melitina p5RHH (VLTTGLPALISWIRRRHRRHC; SEQ ID NO: 1) y p5RWR (VLTTGLPALISWIKRKRQQRWRRRR; SEQ ID NO: 55) se sintetizaron por Genscript (Piscataway, NJ), se disolvieron a 10 mM en agua libre de RNAsa/DNAsa (Sigma, St. Louis, MO) y se almacenaron en alfcuotas de 4 pl a -80 °C antes de su uso. Se prepararon los complejos de transfeccion p5RHH/ARNip mediante la dilucion de p5RHH 1:200 en solucion salina tamponada con fosfato (PBS, Gibco), se agitaron en vortex durante 30 segundos, seguido de la adicion de ARNip (concentracion de reserva de 10 pM en tampon ARNip 1x (Thermo Scientific, Waltham, MA)) para lograr una relacion peptido a ARNip de 100 a 1, y se incubaron durante 40 minutos a 37 °C con agitacion en un Eppendorf Thermomixer R. Para experimentos con animales, se incubaron el peptido y el ARNip a una concentracion 10 veces mayor durante 10 minutos en hielo. Se realizo microscopfa de fuerza atomica en modo humedo por ARC Technologies (White Bear Lake, MN).
Cultivo celular
Las lmeas celulares B16-F10 (ATCC, Manassas, VA) se mantuvieron en condiciones de cultivo celular estandar (37 °C y CO2 al 5 % en una incubadora humidificada) en DMEM (Gibco, Carlsbad, CA) complementado con suero fetal bovino al 10 % (Gibco). Las celulas F8 se cultivaron en RPMI (Gibco) complementado con suero fetal bovino al 10% de acuerdo con publicaciones anteriores.
Inhibicidn de la absorcion por citometna de flujo
Se incubaron las celulas B16-F10 con ARNip marcado con alexa 488 envasado con p5RHH (25 nM), FITC- Transferrina (5 pg/ml, Life Technologies) o FITC-Dextran de 70 kDa (100 pg/ml, Sigma) en presencia o ausencia de inhibidores de la endocitosis durante 40 minutos. Despues de la incubacion, se lavaron las celulas 3x en PBS, se tripsinizaron y se resuspendieron en tampon FACS (HBSS con FBS al 0,2 % y EDTA 0,5 mM) para el analisis de citometna de flujo. Los inhibidores se utilizaron de la siguiente manera: EIPA (80 pM, Sigma), filipina (100 pg/ml, Sigma), y PAO (10 pM Sigma).
Microscopia confocal
Se cultivaron las celulas B16-F10 en cubreobjetos de vidrio durante la noche antes de la incubacion con nanopartfculas p5RHH y marcadores de absorcion apropiados durante 40 minutos o 24 horas. Se agregaron nanopartfculas de ARNip p5RHH/Cy-3 a una concentracion final de ARNip de 200 nM en presencia de FITC- Dextrano de 70 kDa (10 mg/ml) o FITC-Transferrina (25 pg/ml). Despues de la incubacion, se lavaron las celulas en hielo 3x en PBS durante 10 minutos y se fijaron en paraformaldetndo al 4 % antes de montarlas en portaobjetos de vidrio (medio de montaje Vectashield con DAPI, Vector Labs, Burlingame, CA). Se tomaron imagenes de las celulas en un Zeiss Meta 510 (Thornwood, NY).
Analisis de la atenuacion de GFP
Las celulas B16 GFP se colocaron en placas a 150.000 celulas/pocillo en placas de 6 pocillos y se transfectaron 12 horas mas tarde a una concentracion final de ARNip 50 nM en 1 ml de DMEM al 10% en presencia o ausencia de bafilomicina A1 1 pM (reserva 1 mM en DMSO, Sigma). 24 horas despues de que se transfectaron las celulas B16- GFP con nanopartfculas de p5RHH/ARNip que conteman ARNip espedfico de GFP o aleatorio, Se tripsinizaron y se resuspendieron las celulas en tampon FACS (FBS al 0,2 % y EDTa 0,5 mM) para el analisis de fluorescencia de GFP. El ARNip de eGFP (en sentido: 5'-GACGUAAACGGCCACAAGUUC-3; SEQ ID NO: 84 ') se compro a Sigma.
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El ARNip aleatorio se compro a Qiagen (Valencia, CA).
Accesibilidad del tinte de ARNip a pH bajo
Las nanopartteulas de p5RHH/ARNip preformadas se incubaron en solucion salina equilibrada de Hank (HBSS, Gibco) al pH indicado durante 30 minutes en presencia de TOPRO3 (Life Technologies) diluida de 1 a 1000. La fluorescencia de TOPRO3 se mide en una placa de 96 pocillos con excitacion a 642 nm y emision a 661 nm. Los valores de fluorescencia se normalizan luego a los controles de ARNip solo y se presentan como el promedio de 3 experimentos separados.
Ensayos de movilidad en gel dependientes de pH
Las nanopartteulas de p5RHH/ARNip se incuban en HBSS al pH indicado durante 30 minutes antes de la resolucion en un gel de TBE-PAGE al 20 %. El ARNip se visualiza mediante tincion con SYBR GOLD en 1x TBE (IBIScientific) diluido de 1 a 10000 durante 15 minutos.
Tincion de naranja de acridina para la alteracion lisosomal
Las celulas B16F10 colocadas en cubreobjetos se cargan con naranja de acridina a 10 pM durante 15 minutos y se lavan 3x en PBS antes de la incubacion en presencia de nanopartteulas de p5RHH/ARNip en DMEM al 10 % a una concentracion final de ARNip de 100 nM durante 12 horas. Como alternativa, se expusieron las celulas a cloroquina (Sigma) a 100 pM durante 15 minutos antes de la obtencion de imagenes. Se visualizaron las celulas vivas mediante microscopfa de fluorescencia en una Olympus BX610 (Tokio, Japon).
Hemolisis de RBC
Se aislaron globulos rojos de conejo (RBC) de la sangre completa mediante centrifugacion y se lavaron en PBS 3x antes de su almacenamiento a 4 °C. Antes de los estudios de hemolisis, se lavaron los rBc 3x en HBSS con pH apropiado y se diluyeron de 1 a 5000. Luego se incubaron los RBC en el tampon espedfico de pH con nanopartteulas de p5RHH/ARNip durante 12 horas. Los restos de RBC se sedimentaron mediante centrifugacion y el contenido de hemoglobina del sobrenadante se midio por absorbancia UV a 550 nm. Los valores de absorbancia se normalizaron luego contra la lisis maxima con los controles de p5RHH solo y se presentaron como el promedio de 3 experimentos separados.
Analisis de la atenuacion de NFkB en celulas F8
Las celulas F8 se colocaron en placas de 6 pocillos a 200.000 celulas/pocillo y se transfectaron a concentraciones variables de ARNip en un volumen final de 1 ml con el ARNip designado. El ARNip 5 (p65) de NFkB de raton siGENOME y el ARNip 1 (p100/p50) de NFkB 2 de raton siGENOME se compraron a Dharmacon (Lafayette, CO). El ARNip aleatorio se compro a Qiagen (Valencia, CA). 24 horas despues de la transfeccion, se sedimentaron las celulas F8 a 1000 rpm en un Precision AKR-1000. Se resuspendieron luego los sedimentos celulares en 100 pl de tampon RIPA (Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, IgepaICA-630 al 1,0 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, dodecilsulfato de sodio al 0,1 %, EDTA 1 mM, glicerol al 5 %) con PMSF 1 mM y coctel inhibidor de proteasa completo (Roche) e incubados en hielo durante 1 hora. Luego, se centrifugaron los lisados celulares a 4 °C durante 5 minutos y se almacenaron los sobrenadantes a -20 °C. Se resolvieron los lisados en geles NupageBis-Tris (Life Technologies) y se transfirieron a 0,22 pm de nitrocelulosa antes del bloqueo en albumina de suero bovino al 5 % (Sigma) en TBS-T. Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anti-p65 de conejo (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA), anti-p100/p50 de conejo (1:1000, Cell Signaling). Los anticuerpos secundarios: anti-HRP de conejo (1:5000, Santa Cruz Biotechnology). Las transferencias se desarrollaron utilizando el sustrato de transferencia Western ECL (Pierce, Rockford, IL).
Mediciones de viabilidad de celulas F8
Las celulas F8 se colocaron en placas de 24 pocillos 12 horas antes de la transfeccion a 20.000 celulas/pocillo en 400 pl y se cultivaron en condiciones estandar de cultivo celular. Las nanopartteulas de p5RHH/ARNip se prepararon e incubaron con celulas durante 48 horas en un volumen final de 600 pl antes de las mediciones de viabilidad utilizando Alamar Blue (Life Technologies). En resumen, se diluyo Alamar Blue de 1 a 10 en medio de cultivo celular y se incubo con celulas durante 2-4 horas. Se midio la fluorescencia en un lector de placas fluorescente con excitacion a 570 nm y emision a 585 nm (Varian Cary Eclipse, Agilent Technologies, Santa Clara, CA).
Experimentos con animales
Los protocolos de animales experimentales fueron aprobados por el Comite de Cuidado de Animales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington. Los ratones transgenicos con tumores espontaneos fueron un regalo del laboratorio de Ratner. Los ratones con tumores avanzados se seleccionaron para experimentos piloto y se inyectaron con una dosis unica a 1 mg/kg 24 horas antes del sacrificio. Se perfundieron los animales con solucion salina y se extirparon los tumores para obtener imagenes de IVIS y seccionamiento congelado.
Ejemplo 15. Citotoxicidad de p5RHH.
Se transfectaron las celulas B16 GFP con concentraciones crecientes de nanopartfculas de p5RHH/ARNip que conteman ARNip espedfico de GFP o aleatorio. Para comparacion, las celulas B16 GFP tambien se transfectaron con concentraciones crecientes de ARNip espedfico de GFP o aleatorio utilizando lipofectamine 2000. El ARN extrafdo de las celulas transfectadas se analizo mediante analisis de transferencia de Northern y se determino la 5 viabilidad normalizada de las celulas B16 transfectadas (FIG. 28). A diferencia de las transfecciones que utilizan Lipofectamine 2000 (FIG. 28B, D), se determino que p5RHH/ARNip es seguro en todas las dosis analizadas (FIG. 28A, C).
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Ejemplo 16. El bloqueo de NFkB alivia los sintomas artriticos en la artritis inducida por anticuerpos de colageno.
El potencial terapeutico de las nanopartfculas de p5RHH/ARNip recubiertas con albumina se demostro en un modelo murino de artritis inducido por anticuerpos de colageno. En resumen, el modelo comprende la inyeccion de un anticuerpo monoclonal contra el colageno II, seguido unos dfas mas tarde por la inyeccion de lipopolisacarido para mejorar los sintomas artnticos. El modelo murino inducido por anticuerpos de colageno y la administracion de ARNip es como se describe en la FIG. 29.
Se utilizo ARNip dirigido a la subunidad p65 de la ruta canonica. Se utilizo ARNip aleatorio como control. El ARNip se marco con Cy5.5. La concentracion de ARNip en cada administracion fue de 1 mg/kg de ARNip. A tres ratones se les administro solucion salina, a tres ratones se les administro ARNip aleatorio, y a 4 ratones se les administro ARNip de p65. La gravedad de la artritis se determino mediante la evaluacion del grosor del tobillo, la puntuacion artntica y el peso corporal en los dfas 0, 3, 4, 6, 8 y 10.
Como se muestra en la FIG. 30, el bloqueo de NFkB que utiliza partfculas de p5RHH/ARNip con ARNip dirigidas a la subunidad p65 de la ruta canonica disminuye la artritis inducida por anticuerpos de colageno medida por el grosor del tobillo (FIG. 30A), y la puntuacion artntica (FIG. 30B). Las imagenes de IVIS muestran que el ARNip se acumula en las patas artnticas de los animales (FIG. 30C).
Ademas, se utilizaron imagenes moleculares por ultrasonidos para visualizar la eficacia del tratamiento de la artritis utilizando p5RHH/ARNip con ARNip dirigido a la subunidad p65. La imagen ultrasonica mide los cambios en la composicion ffsica (fibrosis, edema, celulas inflamatorias, etc.) y la organizacion de los tejidos a una resolucion de subvoxel para tejidos similares que se someten a tratamiento (Hughes y col., 2011 J Acoust Soc Am. 129: 3756; Hughes 2011 IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 58:2361-2369; Hughes y col., 2007 Ultrasound Med Biol. 33:1236-1243; Hughes y col., 2007 Journal of the Acoustical Society of America. 121:3542-3557; Hughes y col., 2013 J Acoust Soc Am. 133:283-300; Hughes y col., 2009 Journal of the Acoustical Society of America. 126:23502358)
Las imagenes de la entropfa muestran que tres huesos de la pata son visibles (azul a rojo) 4 dfas despues del tratamiento con solucion salina (placebo). Mientras que tres de los huesos de la pata son visibles en animales 4 dfas despues del tratamiento con p5RHH/ARNip con ARNip dirigido a la subunidad p65, sus valores de pfxeles estan mucho mas cerca del fondo normal (FIG. 31).
Ejemplo 17. Nanoparticulas de ARNip para suprimir la respuesta inflamatoria en artritis inducida por anticuerpos de colageno.
El objetivo de este estudio es demostrar la capacidad de las nanoparticulas de ARNip para suprimir la respuesta inflamatoria en la artritis inducida por anticuerpos de colageno en ratones. La ruta NFkB se selecciono como un punto de control central en la inflamacion mediante la incorporacion de ARNip contra las subunidades p65, que son los principales reguladores transcripcionales de la ruta de NFkB canonica. Las nanoparticulas se prepararon de la forma habitual y se inyectaron por via intravenosa en tres dosis diarias consecutivas despues del establecimiento de la inflamacion articular. Las respuestas conjuntas se midieron a lo largo del tiempo y se realizaron un numero de otras pruebas para definir la seguridad del material.
Induccion y tratamiento de la artritis: La artritis se indujo utilizando el modelo de artritis inducida por anticuerpos de colageno (CAIA) con el coctel de 5 clones del anticuerpo monoclonal artrogenico Artrogeno-CIA (Chondrex, Inc.). Se inyectaron i.p. ratones DBA/1J macho de seis a ocho semanas de edad (Taconic) con 1,5 mg del coctel de anticuerpos de 5 clones en el dfa 0 y 50 ug de LPS en el dfa 3. A partir del dfa 4, cuando se establecio la artritis temprana en todos los ratones, los animales recibieron diariamente una serie de inyecciones i.v. de solucion salina, nanoparticulas con secuencia de ARN aleatorio o ARNip de p-65 (i.v. 1mg/kg por la vena de la cola). La manifestacion clmica de la artritis se evaluo diariamente en una escala de 0-3 (0 = sin hinchazon o eritema, 1 = leve hinchazon o eritema, 2 = eritema moderado e hinchazon en multiples dedos o pata completa, 3 = eritema pronunciado e hinchazon de la totalidad pata, puntuacion maxima de 3 x 4 patas = 12 por raton). El cambio de la imea base en el grosor de la pata se determino diariamente mediante calibradores de cuadrante y se determino un cambio promedio en el grosor del tobillo para cada raton a partir de las dos mediciones de la pata trasera. Los ratones tambien se pesaron cada dos dfas y se calculo el porcentaje de perdida de peso desde el inicio. El dfa 9, se sacrificaron los ratones y su sangre, patas y organos se recogieron para su analisis.
Analisis de citoquinas: Se homogeneizaron las patas en 1 ml de PBS y se eliminaron los lisados mediante centrifugacion. Las concentraciones de TNF-a, IL-6 y MCP-1 en los lisados de las patas se midieron mediante una matriz de perlas citometricas utilizando el kit inflamatorio de raton (BD Bioscience) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Se midio la IL-1p mediante ELISA (R&D Systems) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes.
Parametros hematologicos y quimicas del suero: El dfa 10 se extrajo sangre de la vena cava inferior y se envio para WBC/diferenciales y qmmicas del suero (funciones hepaticas y renales). El analisis se realizo por el Departamento de Medicina Comparada de la Universidad de Washington.
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Respuestas inmunes a las nanoparticulas: Se midieron la IgG y la IgM total utilizando un ensayo ELISA estandar. En resumen, la placa de 96 pocillos se recubrio con anticuerpo de captura de cabra anti-IgG de raton (Southern Biotechnology Associates, Inc.) o anti-IgM de raton (Southern Biotechnology Associates, Inc.) (1 ug/ml en PBS) y se incubo a 4 °C durante la noche. Despues de lavar y bloquear con BSA al 1 % en PBS, se anadieron a pocillos sueros de raton diluidos (diluciones 1:40,00-1:400,00) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Despues del lavado, se agregaron a la placa 100 ul de anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (Southern Biotechnology Associates, Inc.) o anti-IgM de raton (Southern Biotechnology Associates, Inc.) conjugado con HRP (dilucion 1:3.000 en BSA al 1 % en PBS) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Despues de lavar, se agregaron a cada pocillo 100 |jl de solucion de peroxido-cromogeno (R&D Systems) y se leyo el desarrollo del color a 450 nm con un lector SpectraMax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos). Se utilizaron IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) e IgM (Rockland Immunochemicals) de raton purificadas para establecer las curvas estandar.
Para medir la respuesta espedfica de IgM o IgG al peptido p5RHH o a las nanoparticulas de peptido:ARNip, las placas Immunlon 4 HBX (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) se incubaron con 100 jl/pocillo de peptido P5RHH o nanoparticulas de ARNip-P5PHR en concentracion de peptidos P5RHH de 2 jM a 4 °C durante la noche. Para determinar la cantidad de materiales recubiertos en la superficie de los pocillos de la placa, se midieron el peptido P5RHH no unido o las nanoparticulas de ARNip-P5RHH utilizando un espectrofluorometro fluorescente (Varian Inc, Palo Alto, CA), ya que P5RHH tiene un resto de triptofano. Los espectros de emision de fluorescencia de triptofano (300 nm a 500 nm) se midieron despues de la excitacion a 280 nm. Se han generado curvas estandar y las cantidades de materiales no unidos se calcularon frente a curvas estandar. Para la placa recubierta con peptido, el peptido recubierto tiene una concentracion de 2,21 jg/ml; Para la placa recubierta de nanoparticulas (NP) de ARNip- P5RHH, la concentracion de peptido fue de 3,58 jg/ml. Despues de lavar y bloquear con BSA al 1 % en PBS, se anadieron sueros de raton diluidos (dilucion 1:10-1:100) a los pocillos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (Southern Biotechnology Associates, Inc.) o anti-IgM de raton (Southern Biotechnology Associates, Inc.) conjugado con HRP como anteriormente. El desarrollo del color se realizo utilizando una solucion de peroxido-cromogeno (R&D Systems) como anteriormente. Los datos se presentan como absorbancia directa (DO a 450 nm).
Absorcion de nanoparticulas fuera del objetivo: Se inyectaron los ratones i.v. con 200 ul de HBSS o nanoparticulas de peptido:ARN aleatorio marcadas con Cy3. Despues se sacrificaron 30 ratones y se obtuvieron globulos blancos y esplenocitos de sangre periferica para el analisis de partfculas marcadas con Cy3 asociadas a celulas mediante citometna de flujo. Las celulas tambien se tineron con Ly6G (neutrofilos) y Ly6C (monocitos) para buscar la colocalizacion espedfica.
Activacion del complemento: Se inyectaron los ratones i.v. con 200 ul de nanoparticulas de peptido:ARNip. La sangre se extrajo de la vena cava inferior a los 30 minutos despues de la inyeccion de NP directamente en tubos de EDTA 10 mM para evitar una activacion adicional del complemento ex vivo. Se preparo plasma fresco a partir de sangre recogida para ELISA C3a. En resumen, se recubrieron las placas durante la noche a 4 °C con anticuerpo monoclonal de rata anti-C3a de raton (4 jg/ml) (BD Pharmingen). Despues de bloquearse con diluyente reactivo (BSA al 1 % en PBS) durante 1 hora a TA, se lavaron las placas 3X con tampon de lavado ELISA (Tween 20 al 0,05 % (v/v) en PBS) y se incubaron con muestras (100 jl de plasma recien obtenido del mismo dfa diluido 1:100 en diluyente reactivo) durante 1 hora a TA. Se lavaron las placas (3X), seguido de incubacion con anti-C3a de raton biotinilado (250 ng/ml) durante 1 hora a TA. Despues del lavado, se incubaron las placas con estreptavidina- peroxidasa (400 ng/ml; Sigma) durante 30 minutos, se lavaron y se agregaron 100 jl de solucion de peroxido- cromogeno (R&D Systems) a cada pocillo y se leyo el desarrollo de color a 450 nm con un lector SpectraMax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Estados Unidos). Se utilizo un raton recombinante C3a (BD Pharmingen) para establecer la curva estandar.
Resultados: Tanto el grosor del tobillo como la puntuacion de la artritis se reducen al principio del procedimiento de la enfermedad por el ARNip activo pero no el aleatorio (FIG. 32). El peso corporal no difirio entre los grupos. p65, la diana molecular obtenida a partir de lisados de pata, se redujo mediante el ARNip activo (FIG. 33). Se observo una amplia supresion de citoquinas en las patas, lo que concuerda con la inhibicion del punto de control de NFkB corriente arriba.
Los analisis de sangre realizados en el ultimo dfa del experimento no revelaron cambios en los RBC, WBC (incluido el diferencial) o plaquetas (FIG. 34). Las pruebas de funcion renal no revelaron cambios en las qmmicas sericas relevantes ni en las medidas de la funcion renal (FIG. 35) y las pruebas de funcion hepatica tampoco cambiaron (FIG. 36). Los estudios de activacion del complemento no revelaron aumentos significativos asociados con la terapia con nanoparticulas, lo que indica la evitacion de la activacion inmune innata (FIG. 37). Se observo muy ligera elevacion en el recuento de esplenocitos con ninguna alteracion en los tipos de celulas que estaban presentes, lo que indica efectos mmimos sobre la capacidad de respuesta inmune a las nanoparticulas (FIG. 38).
La capacidad de respuesta inmune nativa al desaffo con el anticuerpo anti-CD3 en los linfocitos T CD4+ de los bazos se conservo bien para los efectores inmunes importantes, lo que indica que la capacidad de respuesta inmune sistemica se mantendna, a pesar de la inhibicion local amplia de la inflamacion en las articulaciones afectadas (FIG. 39). No se observo una induccion a corto plazo de anticuerpos contra las nanoparticulas de ARNip, lo que indica una
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falta de estimulacion de la inmunidad adaptativa y un potencial para evitar la resistencia al agente despues de las inyecciones en serie (FIG. 40). No se observaron respuestas inmunitarias para el ARNip desnudo o las partfculas de ARNip completamente formadas, lo que confirma la falta de estimulacion de la inmunidad adaptativa (FIG. 41).
Para descartar el suministro de complejos de nanopartfculas a las articulaciones por parte de los globulos blancos, la citometna de flujo confirmo la falta de absorcion de partfculas en la circulacion periferica por los neutrofilos y los monocitos, que muestran solo senales mmimas de las nanopartfculas asociadas con estos tipos de celulas, que de otro modo son componentes prominentes del proceso inflamatorio. Esto sugiere que el tipo probable de celula diana ya reside en las articulaciones y no se inhibe en la circulacion periferica antes de llegar a las articulaciones (FIG. 42). En el bazo, tambien es evidente que los neutrofilos y los monocitos no absorben las partfculas de manera significativa, lo que confirma que las nanopartfculas evitan el bazo y no estimularan una respuesta inmune, ni seran transportados a los tejidos inflamados por los esplenocitos activados (FIG. 43).
LISTADO DE SECUENCIAS
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Thr Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg 15 10 15
His
<210> 20 <211> 18 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 20
5
10
15
20
25
30
35
40
His Cys
<210> 21 <211> 13 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 21
Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His 15 10
<210> 22 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 22
Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg 15 10
<210> 23 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 23
Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg 15 10 15
<210> 24 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 24
Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His 15 10 15
<210> 25 <211> 17 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 25
5
10
15
20
25
30
35
40
Cys
<210> 26 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 26
Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His 15 10
<210> 27 <211> 13 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 27
Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg 15 10
<210> 28 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SINTETIZADO <400> 28
Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg 15 10
<210> 29 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 29
Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His 15 10 15
<210> 30 <211> 16 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 30
5
10
15
20
25
30
35
40
<210>31 <211> 11 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 31
Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His 15 10
<210> 32 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 32
Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg 15 10
<210> 33 <211> 13 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 33
Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg 15 10
<210> 34 <211> 14 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SINTETIZADO
<400> 34
Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His 15 10
<210> 35 <211> 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SINTETIZADO <400> 35
Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His Cys 15 10 15
5
10
15
20
25
30
35
40
<210> 36 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 36
Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His 15 10
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 37
Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg 15 10
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SINTETIZADO <400> 38
Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg 15 10
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 39
Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His 15 10
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 40
Ala Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His Cys 15 10
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5
10
15
20
25
30
35
40
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 41
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 42
Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg 15 10
Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg 15 10
<210> 43 <211> 12 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 43
Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His 15 10
<210> 44 <211> 13 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 44
Leu lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His Cys 15 10
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 45
lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg 15 10
<210> 46 <211> 11 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
5
10
15
20
25
30
35
40
<223> SINTETIZADO
<400> 46
lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His 15 10
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 47
lie Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His Cys 15 10
<210> 48 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SINTETIZADO
<400> 48
Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His 15 10
<210> 49 <211> 11 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SINTETIZADO <400> 49
Ser Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His Cys 15 10
<210> 50 <211> 10 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO
<400> 50
Trp lie Arg Arg Arg His Arg Arg His Cys 15 10
<210> 51 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 51
ggaguacccugaagcuaua 19
5
10
15
20
25
30
35
<210> 52 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 52
gaaagaagac agagccuau 19
<210> 53 <211> 26 <212> PRT <213> Apis cerana
<400> 53
Gly lie Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 15 10 15
lie Ser Trp lie Lys Arg Lys Arg Gin Gin
20 25
<210> 54 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 54
Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Lys Arg Lys 15 10 15
Arg Gin Gin Cys 20
<210> 55 <211> 25 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 55
Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu lie Ser Trp lie Lys Arg Lys 15 10 15
Arg Gin Gin Arg Trp Arg Arg Arg Arg 20 25
<210> 56 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> SINTETIZADO <400> 56
gacguaaacg gccacaaguu c

Claims (12)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion farmaceutica que comprende un complejo peptido-polinucleotido, comprendiendo el complejo peptido-polinucleotido una relacion molar de peptido:polinucleotido que es mas de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1, en el que el peptido es (a) no citotoxico y capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma de una celula, y (b) comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
  2. 2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que la relacion molar de peptido a oligonucleotido es de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 100:1.
  3. 3. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el complejo es una nanopartfcula con un diametro de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 200 nm.
  4. 4. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el peptido comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.
  5. 5. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el peptido comprende al menos una region cationica y al menos un resto de histidina localizado adyacente a o dentro de al menos una region cationica del peptido.
  6. 6. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polinucleotido es un ARN no codificante capaz de regular o inhibir la expresion de una secuencia de acido nucleico.
  7. 7. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polinucleotido es un ARN de interferencia pequeno (ARNip) o un microARN (miARN).
  8. 8. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el complejo esta recubierto con albumina.
  9. 9. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polinucleotido del complejo altera al menos una secuencia de acido nucleico que codifica una protema seleccionada del grupo que consiste en STAT3, JNK2, p65 y p100/52.
  10. 10. Un procedimiento in vitro de suministro de un polinucleotido al citoplasma de una celula, comprendiendo el procedimiento poner en contacto una celula con un complejo peptido-polinucleotido, comprendiendo el complejo peptido-polinucleotido una relacion molar de peptido:polinucleotido que es mas de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1, en el que el peptido es (a) no citotoxico y capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma de una celula, y (b) comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.
  11. 11. Un complejo peptido-polinucleotido, comprendiendo el complejo peptido-polinucleotido una relacion molar de peptido:polinucleotido que es mas de aproximadamente 50:1 y menos de aproximadamente 200:1, en el que el peptido es (a) no citotoxico y capaz de afectar a la liberacion de un polinucleotido desde un endosoma de una celula, y (b) comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, para su uso en
    (i) la alteracion de un nucleotido normalmente asociado con la ruta de senalizacion de NFkB, por lo tanto, tratar un tumor;
    (ii) la alteracion de un nucleotido normalmente asociado con la ruta de senalizacion de NFkB y, por lo tanto, tratar la artritis;.
    (iii) la alteracion de la expresion de STAT3 en una celula y, por lo tanto, inhibir la angiogenesis;
    (iv) la alteracion de la expresion de JNK2 en una celula y, por lo tanto, inhibir la formacion de celulas espumosas; o
    (v) la alteracion de la expresion de p65 en una celula y, por lo tanto, tratar la artritis,
    en el que el polinucleotido se suministra al citoplasma de una celula en un sujeto que lo necesite.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que:
    (a) el polinucleotido altera un nucleotido normalmente asociado con la ruta de senalizacion de NFkB;
    (b) el polinucleotido altera un nucleotido normalmente asociado con la ruta de senalizacion de NFkB;
    (c) el polinucleotido altera la expresion de STAT3 en una celula;
    (d) el polinucleotido altera la expresion de JNK2 en una celula; o
    (e) el polinucleotido altera la expresion de p65 en una celula.
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