ES2693687T3 - Compuestos y composiciones para uso en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Una cantidad terapéuticamente efectiva de metilsulfona para uso en el tratamiento de cáncer metastásico, donde la cantidad terapéuticamente efectiva se administra como una solución de metilsulfona en el intervalo de 0,2 a 0,6 mg de metilsulfona/ml de disolvente para administración por pulverización, tópica, transdérmica u oral, o de 1,0 a 5,0 mg de metilsulfona/ml de disolvente para infusión IV o infusión intratecal.

Description

DESCRIPCION

Compuestos y composiciones para uso en el tratamiento del cancer 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Segun la Organizacion Mundial de la Salud (OMS), mas de 11 millones de personas se diagnostican con cancer cada ano en el mundo y mas de 7 millones de personas mueren de cancer cada ano. Las terapias convencionales para el cancer implican la administracion de farmacos antitumorales tales como inhibidores de timidilato sintasa (p. 10 ej., 5-fluorouracilo), analogos de nucleosido, inhibidores de aromatasa no esteroideos y esteroideos, taxanos e inhibidores de topoisomerasa 1. El mejor resultado clinico esperado de la quimioterapia actual es matar las celulas malignas. Es un problema clinicamente significativo con este enfoque que las dosis de farmacos quimioterapeuticos actuales requeridas para este resultado clinico son a menudo toxicas para celulas no cancerosas. Seria beneficioso identificar un farmaco quimioterapeutico que volviera las celulas cancerosas o malignas inocuas para los sujetos, 15 disminuyendo significativamente los efectos secundarios asociados a los farmacos quimioterapeuticos actuales.

Se divulgan compuestos que contienen azufre o selenio, y formas polimericas de los mismos, que pueden usarse solos o en combination con terapias estandares para inhibir trastornos mediados por la angiogenesis, en el documento W02007/005670 A2.

20

Por consiguiente, existe la necesidad de identificar o sintetizar nuevos agentes quimioterapeuticos que traten efectivamente trastornos proliferativos celulares disminuyendo los efectos secundarios asociados a los farmacos quimioterapeuticos actuales.

25 RESUMEN DE LA INVENCION

El inventor de la presente solicitud ha descubierto que la metilsulfona induce un fenotipo no maligno irreversible en melanoma metastasico agresivo y celulas de cancer de mama que vuelve estas celulas inocuas para los sujetos. Ademas, los inventores demuestran que, en presencia de metilsulfona, las celulas de melanoma evolucionaban a 30 melanocitos funcionales. Por consiguiente, la presente solicitud proporciona compuestos y composiciones para uso en el tratamiento de trastornos proliferativos celulares, p. ej. cancer.

Por consiguiente, en un aspecto la presente invencion proporciona una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona para uso en el tratamiento de cancer metastasico, donde la cantidad terapeuticamente efectiva 35 comprende una solution de metilsulfona en el intervalo de 0,2 a 0,6 mg de metilsulfona/ml de disolvente para administracion por pulverizacion, topica, transdermica u oral, o de 1,0 a 5,0 mg de metilsulfona/ml de disolvente para infusion IV o infusion intratecal.

En otra realization, el cancer es un cancer de tumor solido.

40

En una realizacion especifica, el cancer de tumor solido se selecciona del grupo consistente en cancer de ovario, cerebro, colon, pulmon, melanoma, vejiga, mama o prostata.

En una realizacion adicional, el cancer es un cancer hematologico 45

En aun otra realizacion, el cancer hematologico es leucemia o linfoma.

En una realizacion, la metilsulfona para uso en el tratamiento de cancer metastasico se administra por via sistemica o local.

50

En otra realizacion, la metilsulfona para uso en el tratamiento de cancer metastasico se orienta a la localization del cancer, por ejemplo, mediante una microparticula o nanoparticula.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de 55 cancer metastasico que comprende: a) de 0,2 a 0,6 mg de metilsulfona/ml, donde la composicion se formula para administracion por pulverizacion, topica, transdermica u oral, o de 1,0 a 5,0 mg de metilsulfona/ml, donde la composicion se formula para infusion IV o infusion intratecal; y b) un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.

60 En una realizacion, la composicion se formula para aerosolizacion.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una metilsulfona para uso en el tratamiento de melanoma.

En una realizacion, la metilsulfona para uso en el tratamiento de melanoma se administra por via sistemica o local.

5

En otra realizacion, la metilsulfona para uso en el tratamiento de melanoma se orienta a la localizacion del cancer, por ejemplo, mediante una micropartfcula o nanoparticula.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de 10 melanoma que comprende metilsulfona y un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion, la composicion se formula para aerosolizacion.

En otro aspecto, la presente invencion proporciona un parche transdermico para uso en el tratamiento de melanoma 15 que comprende metilsulfona.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es un unico fotograma de una pelfcula que demuestra el cambio en la morfologfa de celulas de 20 melanoma despues de la adicion de metilsulfona al 2 %. Las celulas se volvfan apoptoticas a concentraciones de metilsulfona de mas del 2 %.

La Figura 2 representa una grafica que demuestra la apoptosis en celulas de melanoma con metilsulfona al 0-6,0 %.

25 Las Figuras 3A-D representan celulas de melanoma con y sin metilsulfona al 2%.

La Figura 4 es una grafica que representa la slntesis de ADN en celulas de melanoma con y sin metilsulfona al 2 % a las 48 y 72 horas.

30 Las Figuras 5A-B representan un experimento en agar blando que demuestra el crecimiento de colonias celulares en ausencia de metilsulfona y la ausencia de colonias cuando se trata con metilsulfona al 2 %.

La Figura 6 representa la migracion de celulas de melanoma a traves de una membrana de matriz despues de tratarse con metilsulfona al 2 % durante 48 horas. Los puntos oscuros son poros de membrana. Las celulas de 35 melanoma son ligeramente coloreadas y triangulares. En presencia de metilsulfona al 2 %, las celulas de melanoma son incapaces de pasar a traves de la membrana.

Las Figuras 7A-D representan la curacion de heridas en celulas de melanoma en presencia y ausencia de metilsulfona al 2 %.

40

Las Figuras 8A-B representan la senescencia inducida por metilsulfona al 2 % en celulas de melanoma. Practicamente ninguna celula de control era senescente.

Las Figuras 9A-B representan la arborization de celulas de melanoma que se han tratado con metilsulfona al 2 % 45 durante 4 semanas. Las Figuras 9A-D representan cuatro campos diferentes de las celulas arborizadas. Las arborescencias oscuras indican la presencia de melanosomas.

Las Figuras 10A-H representan microscopfa de inmunofluorescencia de protefnas implicadas en la transition de ETM. Se muestran celulas de melanoma con y sin metilsulfona al 2 % despues de 7 dfas.

50

Las Figuras 11A-B representan microscopfa de inmunofluorescencia de filamentos de actina en celulas de melanoma con y sin metilsulfona al 2 % despues de 72 horas.

Las Figuras 12A-D representan microscopfa de inmunofluorescencia de microtubulos en celulas de melanoma en 55 presencia de metilsulfona al 2 % con el tiempo.

Las Figuras 13A-C representan microscopfa de inmunofluorescencia de microtubulos en celulas de melanoma con y sin metilsulfona al 2 % en presencia de vinblastina (VNB) 107 M. Se procesaron las celulas para inmunofluorescencia dos horas despues de anadir VNB.

La Figura 14 es una grafica que compara el efecto de diferentes dosis de metilsulfona y VNB sobre la induccion de apoptosis en linfocitos leucemicos. CH46 es un nombre cli'nico para metilsulfona.

La Figura 15 representa linfocitos normales de un voluntario sano que se trataron con dos diferentes dosis de 5 metilsulfona y se determinaron los porcentajes de celulas apoptoticas por citometria de flujo. CH46 es un nombre clinico para metilsulfona.

La Figura 16 representa una comparacion del metilmetilsulfona (MMS y metiletilsulfona (MES).

10

La Figura 17 representa una comparacion del metilmetilsulfona (MMS) y etiletilsulfona (EES).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Los inventores han descubierto que la metilsulfona es capaz de detener la progresion de celulas cancerosas en un sujeto y puede inducir la apoptosis a concentraciones mayores. Especificamente, los inventores demuestran que el tratamiento de celulas cancerosas con metilsulfona induce varios fenotipos no malignos incluyendo inhibition por contacto, senescencia y diferenciacion en celulas arborizadas que contienen melanosomas. Como se describe en los Ejemplos, una comparacion de la induccion de la apoptosis en linfocitos leucemicos con linfocitos aislados de un voluntario sano mostro que la metilsulfona inducia apoptosis en mas del 90 % de las celulas leucemicas e inducia apoptosis en menos del 10 % de las celulas T del voluntario sano.

Metilsulfona

25

La metilsulfona es tambien conocida en la bibliografia como dimetilsulfona, MSM y metilsulfonilmetano. La metilsulfona tiene la formula molecular C2H6O2S y la estructura quimica:

h3c------S-------CH*

o

30

La metilsulfona no es toxica. Los estudios de toxicidad muestran que la metilsulfona es tan toxica como el agua. Por lo tanto, los efectos secundarios asociados al tratamiento quimioterapeutico actual no son un problema con la metilsulfona. La metilsulfona tiene un peso molecular de 94,13 y un numero de registro CAS de 67-71-0. La solubilidad en agua aproximada de la metilsulfona es de 150 g/l a 20 °C. La metilsulfona es estable y no 35 higroscopica.

Se ha mostrado que la metilsulfona cruza facilmente las membranas plasmaticas para entrar en celulas.

Trastornos proliferativos celulares

40

Los compuestos y composiciones para uso de la presente invencion son utiles en el tratamiento de cancer metastasico y melanoma.

El termino “cancer” incluye malignidades caracterizadas por un crecimiento celular desregulado 0 incontrolado, por 45 ejemplo carcinomas, sarcomas, leucemias y linfomas. El termino “cancer” incluye tumores malignos primarios, p. ej. aquellos cuyas celulas no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto distintos del sitio del tumor original, y tumores malignos secundarios, p. ej. aquellos que surgen de metastasis, la migration de celulas tumorales a sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original.

50 "Neoplasia" 0 "transformation neoplasica” es el proceso patologico que da como resultado la formation y crecimiento de un neoplasma, masa de tejido 0 tumor. Tal proceso incluye crecimiento celular incontrolado, incluyendo tumores benignos 0 malignos. Los neoplasmas incluyen masas anormales de tejido cuyo crecimiento supera y no esta coordinado con el de tejidos normales y persiste de la misma manera excesiva despues de la termination de los estimuios que provocaron el cambio. Los neoplasmas pueden mostrar una falta parcial 0

15

20

efecto sobre la apoptosis de celulas de melanoma por efecto sobre la apoptosis de celulas de melanoma por

completa de organization estructural y coordination funcional con el tejido normal, y habitualmente forman una masa de tejido distinta. Es una causa de neoplasia la desregulacion de la maquinaria del ciclo celular.

Los neoplasmas tienden a crecer y funcionar algo independientemente de los mecanismos homeostaticos que 5 controlan el crecimiento y funcion de tejido normales. Sin embargo, algunos neoplasmas permanecen bajo el control de los mecanismos homeostaticos que controlan el crecimiento y funcion de tejido normales. Por ejemplo, algunos neoplasmas son sensibles a estrogeno y pueden detenerse por terapia antiestrogenica. Los neoplasmas pueden oscilar en tamaho de menos de 1 cm a mas de 15 cm de diametro.

10 Los neoplasmas tienden a parecerse morfologica y funcionalmente al tejido del que se originan. Por ejemplo, los neoplasmas que surgen en el tejido de islote del pancreas se parecen a tejido de islote, contienen granulos secretores y secretan insulina. Los rasgos clmicos de un neoplasma pueden ser el resultado de la funcion del tejido del que se originan. Por ejemplo, pueden producirse cantidades excesivas de insulina por neoplasmas de celula de islote, dando como resultado hipoglucemia que, a su vez, da como resultado cefaleas y mareos. Sin embargo, 15 algunos neoplasmas muestran poco parecido morfologico o funcional con el tejido del que se originaron. Algunos neoplasmas dan como resultado efectos sistemicos no especificos tales como caquexia, propension aumentada a la infection y fiebre.

Al vaiorar la histologia y otros rasgos de un neoplasma, puede determinarse si el neoplasma es benigno o maligno. 20 La invasion y metastasis (la difusion del neoplasma a sitios distantes) son atributos definitivos de malignidad. A pesar del hecho de que los neoplasmas benignos pueden alcanzar un tamaho enorme, permanecen separados y distintos del tejido no neoplasico adyacente. Los tumores benignos son generalmente bien delimitados y redondos, tienen una capsula y tienen color gris o bianco y una textura uniforme. En contraposition, los tumores malignos tienen generalmente proyecciones similares a dedos, margenes irregulares, no estan delimitados y tienen un color y 25 textura variables. Los tumores benignos crecen empujando el tejido adyacente a medida que crecen. A medida que se agranda el tumor benigno, comprime el tejido adyacente causando a veces atrofia. La union entre el tumor benigno y el tejido circundante puede convertirse en una capsula de tejido conectivo que permite una retirada quirurgica sencilla del tumor benigno.

30 A la inversa, los tumores malignos son localmente invasivos y crecen en los tejidos adyacentes, dando iugar habitualmente a margenes irregulares que no estan encapsulados, haciendo necesario retirar un amplio margen de tejido normal para la retirada quirurgica de tumores malignos. Los neoplasmas benignos tienden a crecer mas lentamente y tienden a ser menos autonomos que los tumores malignos. Los neoplasmas benignos tienden a parecerse histologicamente mucho al tejido del que se originan. Los canceres mas altamente diferenciados, es decir 35 canceres que se parecen al tejido del que se originaron, tienden a tener un mejor pronostico que los canceres poco diferenciados, mientras que es mas probable que los tumores malignos tengan una funcion aberrante que los tumores benignos, p. ej. la secretion de cantidades anormales o excesivas de hormonas.

Los rasgos histologicos del cancer se resumen por el termino “anaplasia”. Los neoplasmas malignos contienen a 40 menudo numerosas celulas mitoticas. Estas celulas son tipicamente anormales. Tales aberraciones mitoticas dan cuenta de algunas de las anormalidades cariotfpicas encontradas en la mayon'a de canceres. Se ven tambien celulas muitinucleadas extrarias en algunos canceres, especialmente aquellos que son altamente anaplasicos.

El termino “anaplasia” incluye los rasgos histologicos del cancer. Estos rasgos incluyen desequilibrio de la 45 arquitectura del tejido normal, amontonamiento de celulas, falta de orientation celular llamada dispolaridad y heterogeneidad celular en tamaho y forma llamada “pleomorfismo”. Los rasgos citologicos de la anaplasia incluyen una relation nuclear-citoplasmica aumentada (la relation nuclear-citoplasmica puede ser de mas del 50 % para celulas malignas), pleomorfismo nuclear, aglutinacion de la cromatina nuclear a lo largo de la membrana celular, tincion aumentada de la cromatina nuclear, retfculo endoplasmico simplificado, ribosomas libres aumentados, 50 pleomorfismo de mitocondrias, tamaho y numero disminuido de organulos, numeros elevados y aumentados de nueleolos y a veces la presencia de filamentos intermedios.

El termino “displasia” incluye estados premalignos en que un tejido demuestra rasgos histologicos y citologicos intermedios entre normales y anaplasicos. La displasia es a menudo reversible.

55

El termino "carcinoma" incluye malignidades de tejidos epiteliales o endocrinos, incluyendo carcinomas del sistema respiratorio, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinomas del sistema genitourinario, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas de prostata, carcinomas del sistema endocrino, melanomas, coriocarcinoma y carcinomas de cuello uterino, pulmon, cabeza y cuello, colon y ovario. El termino “carcinoma” incluye tambien 60 carcinosarcomas, que incluyen tumores malignos compuestos por tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. El

termino "adenocarcinoma" incluye carcinomas derivados de tejido glandular o un tumor en que las celulas tumorales forman estructuras glandulares reconocibles.

El termino "sarcoma" incluye tumores malignos de tejido conectivo mesodermico, p. ej. tumores de hueso, grasa y 5 cartilago.

Los terminos “leucemia” y “linfoma” incluyen malignidades de celulas hematopoyeticas de la medula osea. Las leucemias tienden a proliferar como celulas unicas, mientras que los linfomas tienden a proliferar como masas tumorales solidas. Los ejemplos de leucemias incluyen leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia promielocftica 10 aguda, leucemia mielogenosa cronica, leucemia de linaje mixto, leucemia monoblastica aguda, leucemia linfoblastica aguda, leucemia no linfoblastica aguda, leucemia blastica de celulas del manto, sindrome mielodisplasico, leucemia de celulas T, leucemia de celulas B y leucemia linfocitica cronica. Los ejemplos de linfomas incluyen enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de celulas B, linfoma epiteliotropico, linfoma compuesto, linfoma anaplasico de celulas grandes, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa gastrica y no gastrica, enfermedad linfoproliferativa, 15 linfoma de celulas T, linfoma de Burkitt, linfoma de celulas del manto, linfoma difuso de celulas grandes, linfoma linfoplasmacitoide y mieloma multiple.

Por ejemplo, los compuestos y composiciones farmaceuticas para uso de la presente invencion pueden aplicarse a celulas cancerosas de origen mesenquimatico, tales como aquellas que producen sarcomas (p. ej., fibrosarcoma, 20 mixosarcoma, liosarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico o cordosarcoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcorna, sinoviosarcoma o mesoteliosarcoma); leucemias y linfomas tales como leucemia granulocitica, leucemia monocitica, leucemia linfocitica, linfoma maligno, plasmocitoma, sarcoma de celulas de reticulo o enfermedad de Hodgkin; sarcomas tales leiomiosarcoma o rabdomiosarcoma, tumores de origen epitelial tales como carcinoma escamoso, carcinoma basocelular, carcinoma de glandula sudoripara, carcinoma de glandula sebacea, 25 adenocarcinoma, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma indiferenciado, carcinoma broncogenico, melanoma, carcinoma de celulas renales, hepatoma-carcinoma de celulas hepaticas, carcinoma de conducto biliar, colangiocarcinoma, carcinoma papilar, carcinoma de celulas transicionales, coriocarcinoma, seminoma o carcinoma embrionario y tumores del sistema nervioso incluyendo glioma, meningioma, meduloblastoma, schwannoma o epidimoma. Los tipos celulares adicionales susceptibles de tratamiento incluyen 30 aquelios que dan lugar a carcinomas mamarios, carcinoma gastrointestinal tal como carcinomas colonicos, carcinoma de vejiga, carcinoma de prostata y carcinoma escamoso de la region de cabeza y cuello. Los ejemplos de canceres susceptibles de tratamiento incluyen canceres vaginal, cervicouterino y de mama.

La frase “inhibir el crecimiento celular indeseable” pretende incluir la inhibicion del crecimiento celular indeseable o 35 inapropiado. La inhibicion pretende incluir inhibicion de la proliferacion incluyendo proliferacion rapida. Por ejemplo, el crecimiento celular puede dar como resultado masas benignas o la inhibicion del crecimiento celular dar como resultado tumores malignos. Son ejemplos de afecciones benignas que son el resultado de crecimiento celular inapropiado o angiogenesis la retinopatia diabetica, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, psoriasis, angiofibromas, artritis reumatoide, hemangiomas, sarcoma de Kaposi y otras afecciones o disfunciones 40 caracterizadas por una division celular endotelial desregulada.

La frase “inhibir el crecimiento celular” o “inhibir la neoplasia” incluye la prevencion del crecimiento de un tumor en un sujeto o una reduccion del crecimiento de un tumor preexistente en un sujeto. La inhibicion puede ser tambien la inhibicion de la metastasis de un tumor de un sitio a otro. En particular, la frase “tumor” pretende englobar tumores 45 tanto in vitro como in vivo que se forman en cualquier organo o parte del cuerpo del sujeto. Los ejemplos de los tipos de tumores que se pretende englobar por la presente invencion incluyen aquelios tumores asociados con cancer de mama, cancer de piel, cancer oseo, cancer de prostata, cancer de higado, cancer de pulmon, cancer de cerebro, cancer de laringe, vesfcula, esofago, pancreas, recto, paratiroideo, tiroideo, suprarrenal, de tejido neural, cabeza y cuello, colon, estomago, bronquios y rihones. Especificamente, los tumores cuya tasa de crecimiento se inhibe por la 50 presente invencion incluyen carcinoma basocelular, carcinoma escamoso de tipo tanto ulceroso como papilar, carcinoma cutaneo metastasico, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, sarcoma de celulas de reticulo, mieloma, tumor de celulas gigantes, tumor pulmonar microcitico, calculos biliares, tumor de celulas de islote, tumor cerebral primario, tumores linfociticos y granulociticos agudos y cronicos, tricoleucemia, adenoma, hiperplasia, carcinoma medular, feocromocitoma, neuromas mucosos, ganglioneuromas intestinales, tumor hiperplasico del nervio corneal, tumor del 55 habito marfanoide, tumor de Wilm, seminoma, tumor de ovario, tumor leiomiomatoso, displasia cervicouterina y carcinoma sin situ, neuroblastoma, retinoblastoma, sarcoma de tejido blando, carcinoide maligno, lesion cutanea topica, micosis fungoide, rabdomiosarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma osteogenico y otros sarcomas, hipercalcemia maligna, tumor de celulas renales, policitemia vera, adenocarcinoma, glioblastoma multiforme, leucemias, linfomas (es decir, linfomas malignos, linfoma de celulas del manto), melanomas malignos, mieloma 60 multiple, carcinomas epidermoides y otros carcinomas y sarcomas.

Composiciones farmaceuticas y sistemas de suministro

La composicion activa de la invention, metilsulfona, puede incorporarse a composiciones farmaceuticas adecuadas 5 para administration a un sujeto, p. ej. un ser humano. Tales composiciones comprenden tipicamente metilsulfona y un portador farmaceuticamente aceptable.

Como se usa en la presente memoria, la frase “portador farmaceuticamente aceptable” pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes 10 isotonicos y retardantes de la absorcion y similares, compatibles con la administration farmaceutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente conventional sea incompatible con el compuesto activo, tales medios pueden usarse en las composiciones de la invention. Pueden incorporarse tambien compuestos activos suplementarios a las composiciones. Una composicion farmaceutica de la invention se formula para ser compatible con su via de 15 administration pretendida. Los ejemplos de vias de administration incluyen administration parenteral, p. ej., intravenosa, intradermica, subcutanea, oral (p. ej. por inhalation), transdermica (topica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente esteril tal como agua para inyecciones, solution salina, aceites no volatiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol 20 bentilico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminotetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clorhidrico o hidroxido de sodio. La preparation parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plastico.

25

Las composiciones farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles (cuando sean hidrosolubles) y polvos esteriles para la preparation extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para administration intravenosa, los portadores adecuados incluyen solution salina fisiologica, agua bacteriostatics, Cremophor (BASF, Parsippany, N.J.) o solucidn salina tamponada con fosfato 30 (PBS). En todos los casos, la composicion debe ser esteril y deberla ser fluida en la medida en que exista una facil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabrication y almacenamiento y debe conservarse frente a la action contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Puede mantenerse la fluidez apropiada, por 35 ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaho de particula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. Puede conseguirse la prevention de la action de microorganismos mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composicion. Puede causarse la 40 absorcion prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables esteriles incorporando metilsulfona en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combination de los ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, 45 seguido de esterilizacion por filtration. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparation de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos de preparation preferidos son secado a vatio y liofilizacion que procuran un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solution esterilizada por filtration 50 anteriormente del mismo.

Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en capsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para administration oral, el agente puede estar contenido en formas entericas para sobrevivir en el estomago o recubrirse o mezclarse adicionalmente para liberarse en una 55 region particular del tracto Gl por procedimientos conocidos. Con el fin de administration terapeutica oral, puede incorporarse el compuesto activo con excipientes y usarse en forma de comprimidos, pastillas para chupar o capsulas. Las composiciones orales pueden prepararse tambien usando un portador fluido para uso como colutorio, donde el compuesto en el portador fluido se aplica por via oral y se gargariza y expectora o traga. Los agentes de union y/o materiales coadyuvantes farmaceuticamente compatibles pueden incluirse como parte de la composicion. 60 Los comprimidos, pildoras, capsulas, pastillas para chupar y similares pueden contener cualquiera de los siguientes

ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristaiina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente disgregante tal como acido alginico, Primogel o almidon de maiz; un lubricants tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina o un agente aromatizante tal como 5 menta piperita, salicilato de metilo o aroma de naranja.

Para administracion por inhalacion, los compuestos se suministran en forma de un pulverizador de aerosol a partir de un recipiente o dispensador a presion que contiene un propelente adecuado, p. ej., un gas tal como dioxido de carbono o un nebulizador.

10

La administracion sistemica tambien puede ser por medios transmucosos o transdermicos. Para administracion transmucosa o transdermica, se usan en la formulacion penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo para administracion transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de acido fusidico. La administracion transmucosa puede 15 lograrse mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para administracion transdermica, los compuestos activos se formulan en pomadas, unguentos, geles o cremas como es generalmente conocido en la tecnica.

Los compuestos pueden prepararse tambien en forma de supositorios (p. ej., con bases de supositorio 20 convencionales tales como manteca de cacao y otros gliceridos) o enemas de retention para suministro rectal.

En una realization, se prepara metilsulfona con portadores que protegeran al compuesto frente a una elimination rapida del cuerpo, tales como una formulacion de liberation controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polimeros biocompatible biodegradables, tales como acetato de 25 etilenvinilo, polianhidridos, poli(acido glicolico), colageno, poliortoesteres y poli(acido lactico). Los procedimientos para la preparation de tales formulaciones resultaran evidentes para los especialistas en la tecnica. Los materiales pueden obtenerse tambien comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Pueden usarse tambien suspensiones liposomicas (incluyendo liposomas orientados a celulas infectadas con anticuerpos monoclonales de antigenos viricos) como portadores farmaceuticamente aceptables. Estos pueden prepararse 30 segun procedimientos conocidos por los especialistas en la tecnica, por ejemplo como se describe en la patente de EE. UU. n° 4.522.811.

La metilsulfona puede formularse tambien en nanoparticulas para suministro a un sujeto. Las nanoparticulas tienen la capacidad de suministrar altas concentraciones de un agente quimioterapeutico directamente a celulas 35 cancerosas, evitando asi el suministro a celulas sanas. Especificamente, las nanoparticulas de metilsulfona pueden usarse para suministrar metilsulfona directamente a un tejido u organo especifico para tratar un trastorno proliferativo celular tal como cancer.

Se divulgan en la presente memoria dos sistemas de orientacion ejemplares especificos para nanoparticulas. En 40 primer lugar, un sistema usara anticuerpos contra proteinas de superficie celular especificas expresadas en celulas madre de cancer de adulto. Por ejemplo, se orientara a CD44 en celulas madre de cancer de mama con nanoparticulas que tengan anticuerpos especificos de CD44. El segundo sistema de orientacion usara anticuerpos especificos de tejido contra celulas cancerosas que no son celulas madre. Estas celulas cancerosas constituyen la gran mayoria de las celulas malignas. Como alternativa, pueden orientarse a tumores solidos nanoparticulas 45 cargadas con metilsulfona a traves del sistema vascular permeable del tumor. Los tipos ejemplares de nanoparticulas contempladas para uso con la invencion incluyen liposomas y nanoesferas.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificacion unitaria por la facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. Forma de dosificacion unitaria como se usa en la presente 50 memoria hace referenda a unidades fisicamente separadas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido. La especificacion de las formas de dosificacion unitaria de la invencion esta dictada por y es directamente dependiente de las caracteristicas unicas del compuesto activo y del efecto terapeutico particular para conseguir y de las limitaciones 55 inherentes a la tecnica de combination de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.

La presente invencion engloba formulaciones topicas farmaceuticamente aceptables de metilsulfona. Estas formulaciones topicas son utiles para el tratamiento, por ejemplo, de melanoma. El termino “formulacion topica farmaceuticamente aceptable”, como se usa en la presente memoria, significa cualquier formulacion que sea 60 farmaceuticamente aceptable para la administracion intradermica de un compuesto de la invencion por aplicacion de

la formulacion a la epidermis.

En ciertas realizaciones, las formulaciones topicas farmaceuticamente aceptables de la invencion comprenden al menos metilsulfona y un agente potenciador de la penetracion. La eleccion de la formulacion topica dependera de 5 varios factores, incluyendo la afeccion para tratar, las caracteristicas fisicoquimicas del compuesto de la invencion y los demas excipientes presentes, su estabilidad en la formulacion, el equipo de fabrication disponible y las limitaciones de costes. Como se usa en la presente memoria, el termino “agente potenciador de la penetracion” significa un agente capaz de transportar metilsulfona a traves del estrato corneo y a la epidermis o dermis. Se han evaluado una amplia variedad de compuestos en cuanto a su efectividad en la potentiation de la tasa de 10 penetracion de farmacos a traves de la piel. Veanse, por ejemplo, Percutaneous Penetration Enhancers, Maibach H. I. y Smith H. E. (eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. (1995), que estudia el uso y ensayo de diversos potenciadores de penetracion cutanea, y Buyuktimkin et al., Chemical Means of Transdermal Drug Permeation Enhancement in Transdermal and Topical Drug Delivery Systems, Gosh T. K., Pfister W. R., Yum S. I. (Eds.), Interpharm Press Inc., Buffalo Grove, III. (1997). En ciertas realizaciones ejemplares, los agentes de penetracion 15 para uso con la invencion incluyen, pero sin limitacion, trigliceridos (p. ej., aceite de soja), composiciones de aloe (p. ej., gel de aloe vera), alcohol etilico, alcohol isopropilico, octilfenilpolietilenglicol, acido oleico, polietilenglicol 400, propilenglicol, sulfoxido de N-decilmetilo, esteres de acido graso (p. ej., miristato de isopropilo, laurato de metilo, monooleato de glicerol y monooleato de propilenglicol) y N-metilpirrolidona.

20 Se divulgan adicionalmente composiciones farmaceuticas que pueden incluirse en un kit, envase, paquete o dispensador junto con instrucciones para administracion.

Como se define en la presente memoria, una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona es una cantidad que reduce el numero o elimina las celulas cancerosas o reduce el tamafio de un tumor en un sujeto. Como se 25 entiende por los especialistas en la tecnica, las dosificaciones difieren dependiendo de la via de administracion. En realizaciones ejemplares, se usan 0,2-0,6 mg de metilsulfona/ml de disolvente para administracion por pulverizacion, topica, transdermica u oral. En otras realizaciones ejemplares, tales como infusion IV o infusion intratecal, podria usarse una concentration mayor de metilsulfona, p. ej., 1,0-5,0 mg/ml.

30 El especialista en la tecnica apreciara que ciertos factores pueden influir en la dosificacion requerida para tratar efectivamente un sujeto incluyendo, pero sin limitacion, la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos anteriores, la salud general y/o la edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Ademas, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona puede incluir un unico tratamiento o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, se trata un sujeto con una solution 35 de metilsulfona en el intervalo de 0,2 a 0,6 mg de metilsulfona/ml de disolvente una vez por semana durante entre aproximadamente 1 y 40 semanas, preferiblemente entre 5 y 20 semanas, mas preferiblemente entre aproximadamente 10 y 15 semanas. Se apreciara tambien que la dosificacion efectiva de metilsulfona usada para tratamiento puede aumentar o disminuir durante el transcurso de un tratamiento particular. Los cambios en dosificacion pueden ser el resultado y resultar evidentes a partir de los resultados de diagnosticos de ensayo que 40 son conocidos en la tecnica para para diagnosticar o monitorizar la progresion de diversos tipos de cancer.

Se entiende que las dosis apropiadas de agentes de molecula pequena tales como metilsulfona dependen de una serie de factores dentro del conocimiento del medico, veterinario o investigador especialista. La dosis o las dosis de molecula pequena variaran, por ejemplo, dependiendo de la identidad, tamano y condition del sujeto o muestra que 45 se este tratando, dependiendo adicionalmente de la via por la que se vaya a administrar la composition, si es aplicable, y del efecto que desee el facultativo que tenga la molecula.

Ademas, un especialista en la tecnica comprendera que pueden tratarse efectivamente tipos especificos de cancer usando modos de administracion especificos. Los modos de administracion ejemplares para tipos especificos de 50 cancer se exponen en la tabla siguiente:

Sistemas de suministro

Tipos de cancer

Bomba intratecal

Cerebro, medula espinal

Pulverizacion directa

Ovario, trompa de Falopio

Aerosolizacion para inhalar

Pulmon

Instilacion intravejiga

Vejiga

Parches transdermicos

Melanoma

Liberation oral retardada

Colon

Inyeccion IV de nanoparticulas

Canceres hematologicos tales como leucemia, linfoma, mieloma multiple, cancer oseo y metastasis de cualquier cancer

Cateterizacion uretral o pulverization directa

Prostata

Inyeccidn IV en el suministro primario sanguineo

Mama

Compuestos y composiciones para uso en el tratamiento del cancer

En aun otro aspecto, la presente invencion proporciona una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona para 5 uso en el tratamiento de cancer metastasico incluyendo, por ejemplo, canceres de mama, ovario, pulmon, piel y hematologicos, p. ej. leucemia. En ciertas realizaciones, segun los compuestos y composiciones para uso de la presente invencion, se inhibe el crecimiento de celulas tumorales poniendo en contacto las celulas con una metilsulfona como se describe en la presente memoria.

10 Los compuestos y composiciones para uso de la presente invencion son efectivos para el tratamiento del cancer mientras que disminuyen (o eliminan) significativamente muchos de los efectos adversos asociados al tratamiento quimioterapeutico actual. Como se indica anteriormente, la metilsulfona no es toxica, y por lo tanto no causa los efectos secundarios asociados a la mayoria de tratamientos quimioterapeuticos. Esto permite administrar dosificaciones aumentadas a un sujeto necesitado de tratamiento.

15

Como se usa en la presente memoria, “sujeto” incluye organismos que son capaces de padecer un trastorno proliferativo celular, p. ej. cancer, tales como animales humanos y no humanos. Los animales humanos preferidos incluyen sujetos humanos. El termino “animales no humanos” de la invencion incluye todos los vertebrados, p. ej. mamiferos, p. ej. roedores, p. ej. ratones y no mamiferos tales como primates no humanos, p. ej. ovejas, perros, 20 vacas, polios, anfibios, reptiles, etc. Susceptible de un trastorno proliferativo celular pretende incluir sujetos con riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo celular. En una realizacion, el sujeto tiene mayor riesgo que un miembro medio de la poblacion.

La frase “una cantidad profilacticamente efectiva” hace referencia a una cantidad de un metilsulfona o una 25 preparacion farmaceutica de la misma que es efectiva, tras administration de dosis unica o multiple al sujeto, para prevenir o tratar un trastorno proliferativo celular.

La frase “cantidad terapeuticamente efectiva” de metilsulfona hace referencia a una cantidad de metilsulfona o una preparacion farmaceutica de la misma que, tras administracion de dosis unica o multiple al sujeto, proporciona un 30 beneficio terapeutico al sujeto. En una realizacion, el beneficio terapeutico es reducir o eliminar celulas cancerosas o tumores, o prolongar la supervivencia de un sujeto con un trastorno proliferativo celular.

Por consiguiente, en otro aspecto de la invencion, se proporcionan metilsulfona y composiciones farmaceuticas para uso en el tratamiento de cancer metastasico que comprenden administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de 35 metilsulfona a un sujeto necesitado de ello. En ciertas realizaciones, se proporciona metilsulfona y composiciones farmaceuticas para uso en el tratamiento de cancer metastasico que comprenden administrar una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona, o una composition farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion, a un sujeto necesitado de ello, en cantidades tales y durante un tiempo tal como sea necesario para conseguir el resultado deseado.

40

En ciertas realizaciones, los compuestos y composiciones para uso se administran de tal modo que se proporcione una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona o un derivado farmaceuticamente aceptable de la misma a un sujeto (incluyendo, pero sin limitacion un ser humano o animal) necesitado de ello. En ciertas realizaciones, la metilsulfona es util para el tratamiento de cancer metastasico (incluyendo, pero sin limitacion, glioblastoma, 45 retinoblastoma, cancer de mama, cancer cervicouterino, cancer de colon y rectal, leucemia, linfoma, cancer de pulmon (incluyendo, pero sin limitacion, carcinoma pulmonar microcltico), melanoma o cancer de piel, mieloma multiple, linfoma no de Hodgkin, cancer de ovario, cancer pancreatico, cancer de prostata y cancer gastrico, cancer de vejiga, cancer de utero, cancer de ririon, cancer testicular, cancer de estomago, cancer cerebral, cancer de higado o cancer esofagico).

50

En ciertas realizaciones, la presente invencion proporciona metilsulfona para uso en el tratamiento de cancer metastasico o melanoma en un sujeto que comprende administrar a un sujeto necesitado de ello una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona, opcionalmente con un portador, coadyuvante o vehiculo farmaceuticamente aceptable. La metilsulfona puede administrate de cualquier manera conocida en la tecnica tal 55 como aquellas divulgadas en la presente memoria. Un medico clinico entrenado sera capaz de elegir la mejor via de administracion basandose en el tipo y localization del trastorno proliferativo celular.

En otra realization, la divulgacion se refiere a una metilsulfona para uso profilactico en la prevention de un trastorno proliferativo celular, o la prevention de la recurrencia de un trastorno proliferativo celular.

5 Se divulga adicionalmente un sujeto con riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo celular, o con riesgo de tener una recurrencia de un trastorno proliferativo celular, al que se administra profilacticamente metilsulfona o una composicion farmaceutica que comprende metilsulfona para prevenir la aparicion o reaparicion del trastorno proliferativo celular.

10 La divulgacion se refiere a tratamientos de combinacion. El tratamiento con metilsulfona o una composicion farmaceutica de la misma puede combinarse con tratamiento quimioterapeutico, por radiacion o quirurgico.

Se divulga que se administra a un sujeto uno o mas agentes anticancerosos en combinacion con metilsulfona para tratar un trastorno proliferativo celular. El agente anticanceroso puede ser un agente quimioterapeutico o un agente 15 biologico, p. ej. un anticuerpo anticanceroso.

Se divulga que se administra metilsulfona en combinacion con una intervention quirurgica para tratar el cancer. Se divulga que los sujetos que experimentan cirugia para retirar uno o mas tumores se tratan con una solucion de metilsulfona para asegurar un tratamiento exitoso. Cuando un sujeto experimenta cirugia para retirar uno o mas 20 tumores del abdomen, la cavidad abdominal puede lavarse con una solucion de metilsulfona.

EJEMPLOS

Deberia apreciarse que la invencion no deberia considerarse limitada por los ejemplos que se describen ahora; en 25 lugar de ello, deberia considerarse que la invencion incluye todas y cada una de las aplicaciones proporcionadas en la presente memoria y todas las variaciones equivalentes dentro de las habilidades del especialista.

Ejemplo 1: Efecto de metilsulfona sobre celulas cancerosas

30 El siguiente experimento demuestra que la metilsulfona es capaz de inducir apoptosis o senescencia en celulas cancerosas.

Se usaron los siguientes procedimientos en el Ejemplo 1:

35 Cultivo celular

Se dejaron crecer celulas de melanoma de raton Cloudman S-91 (subclon M-3, CCL 53.1; American Type Culture Collection, Rockville, MD) en medio RPMI suplementado con 10 % de suero fetal bovino (Invitrogen, Inc) y 5 % de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Inc). Se dejaron crecer celulas de cancer de mama de raton (66CI-1; American 40 Type Culture, Collection, Rockville, MD) que son negativas de receptor de estrogeno en medio DMEM suplementado con 10 % de suero fetal bovino (Invitrogen, Inc) y 5 % de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Inc). Se dejaron crecer linfocitos leucemicos de celulas T humanas (CEM; American Type Culture Collection, Rockville, MD) en medio MEM suplementado con 7 % de suero fetal bovino. Se sometieron a pase los cultivos dos veces por semana.

45 Se obtuvieron linfocitos de celulas T normales de una muestra de sangre de un voluntario sano. Se obtuvieron las muestras de sangre con aprobacion del IRB y con la firma voluntaria del formulario de consentimiento informado. Se separaron los globulos blancos de los globulos rojos usando un gradiente de Ficoll. Se uso citometria de flujo con anticuerpos contra CD3 y CD4 para identificar los linfocitos de celulas T (Flow Cytometry Facility, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT).

50

Ensayo de apoptosis de anexina

Se valoro la apoptosis temprana y tardia con el kit de detection de apoptosis Annexin V-FITC de PharMingen (Becton-Dickinson, San Diego, CA). Se obtuvieron imagenes en el Center for Cell Analysis and Modeling, University 55 of Connecticut Health Center, Farmington, CT. con un microscopio Axioplan CCD equipado con una lente de objetivo FL de NA 1,3 de 40x y camara CCD enfriada digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37 mediante el software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal Imaging Corp., Downington, PA).

Microscopia de celulas vivas

Se sembraron cdlulas en platos de cultivo de tejido de 35 mm a una concentration de 105 celulas/placa, a menos que se afirme otra cosa, y se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2. Despues de 24 horas, se anadio metilsulfona (0-10 % en medio) a las placas apropiadas y se videograbaron inmediatamente con un microscopio invertido Nikon TE300 equipado con una lente de objetivo 0.25 NA Plan Achromat de 10x. Se videograbaron celulas de control (sin 5 farmaco) como se describe anteriormente. Se adquirieron series temporales (10 min) de imagenes de contraste de fases a una tasa de video de 1 fotograma/5 s con una videocamara CCD Watec-902B (Watec Corp., Japon) a traves de la option de adquisicion continua del software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal Imaging Corp., Downington, PA). Durante los registros, se mantuvieron las celulas a 37 °C con Hepes 10 mM, pH 7,4. Se obtuvieron series temporales de celulas ± metilsulfona al 2 % cada 24-48 horas durante hasta 6 semanas.

10

Proliferation celular

Se sembraron celulas en cubreobjetos esteriles de 12 mm en placas de cultivo de tejido de 35 mm y se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2. Despues de 24 horas, se anadio metilsulfona al 2 % en medio o medio solo a las placas y se 15 incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 48 y 72 horas. Se afiadio BrdU (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.; diluido 1/3 en medio RPMI) a cada placa durante 60 minutos a 37 °C, 5 % de CO2. Se transfirieron los cubreobjetos a soportes de porcelana, se lavaron con PBS, se fijaron con metanol/acetona (1:1), se lavaron con PBS y se incubaron en BSA al 5 %/PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para desnaturalizar el ADN, se colocaron los cubreobjetos en HCI 0,1 N/Triton X-100 al 1 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. Despues 20 de lavar con PBS, se incubaron las celulas con anticuerpo anti-BrdU Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR; diluido 1/20 en BSA al 5 %/PBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las celulas con PBS y se incubaron con Hoechst (diluido 1/1000 en PBS) en la oscuridad a temperatura ambiente. Despues de lavar con PBS, se sumergieron las celulas en H20d y se drenaron sobre toallitas Kim. Se anadio medio de montaje SlowFade (Molecular Probes, Eugene, OR) a un portaobjetos de vidrio y se colocaron cubreobjetos boca abajo sobre los 25 portaobjetos y se sellaron con esmalte de unas transparente. Se visualizaron las celulas en el Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT. con un microscopio Axioplan CCD equipado con una lente de objetivo FL de NA 1,3 de 40x, equipada con una camara CCD enfriada digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37. Se uso Metamorph de Molecular Devices para adquisicion de imagenes.

30 Inmunofluorescencia de filamentos de actina

Se sembraron celulas sobre portaobjetos de 10 pocillos que se habian pretratado con acido sulfurico Despues de 24 horas, se retiro el medio y se anadio metilsulfona al 2 % en medio a la mitad de los portaobjetos; las celulas de control recibieron medio solo. A las 72 y 144 horas, se lavaron las celulas a 37 °C con PBS, pH 7,4, y se fijaron con 35 formaldehido al 3,7 % en PBS durante 10 minutos. Se uso PBS para lavar las celulas tres veces seguido de lavado con Triton X-100 al 0,1 %/PBS durante 5 minutos. Se lavaron de nuevo las celulas tres veces con PBS y entonces con BSA al 1 %/PBS durante 20 minutos. Se incubaron las celulas con faloidina marcada con rodamina (Molecular Probes, Eugene, OR; diluida 1/40 con BSA al 1 %/PBS) durante 20 minutos. Despues de lavar 3 veces con PBS, se anadio SlowFade a cada pocillo. Se colocaron los cubreobjetos de vidrio sobre cada portaobjetos y se sellaron con 40 esmalte de unas. Se visualizaron las imagenes usando 568 nm de excitation en un sistema de cribado confocal de disco giratorio Perkin Elmer Ultraview RS5 montado en un microscopio invertido Nikon TE2000 con un objetivo de inmersion en aceite Plan Apo de NA 1,4 de 100x (William A. Mohler, Ph.D., Director, Spinning Disk Microscope Facility, University of Connecticut Health Center).

45 Inmunofluorescencia de E-caderina; p-catenina y N-caderina

Se sembraron celulas sobre cubreobjetos de 12 mm. Cuando las celulas crecieron a 60 a 70 % de confluencia, se anadio metilsulfona al 2 % a la mitad de los cubreobjetos y medio normal a la otra mitad. Despues de 24 horas, se sumergieron los cubreobjetos en PBS a 37 °C durante 30 segundos y se fijaron en paraformaldehido al 4 % a 37 °C 50 durante 10 minutos. Se lavaron las celulas con PBS durante 5 minutos y se incubaron con Triton X-100 al 1 %/PBS durante 5 minutos. Para bloquear los sitios no especificos, se diluyo suero de polio 1/20 en PBS y se anadio a las celulas durante 30 minutos. Se lavaron las celulas 3 veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS 3 minutos cada vez.

Se diluyo anticuerpo de conejo anti-E-caderina (Santa Cruz Biotech, CA) 1/100 en BSA al 5 %/PBS y se anadio a las 55 celulas sobre cubreobjetos durante 2 horas. Se lavaron las celulas 5 veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS durante 3 minutos cada vez. Se diluyo el anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 de polio anti-conejo 1/200 en BSA al 5 %/PBS y se anadio a cubreobjetos durante una hora en la oscuridad. Se lavaron las celulas cinco veces en Triton X-100 al 0,1 %/PBS, tres minutos cada vez. Se lavaron las celulas con PBS durante 1 minuto y se colocaron en Hoechst (1 mg/ml), diluido 1/1000 durante 5 minutos. Se lavaron las celulas con PBS durante 1 minuto. Se anadio SlowFade a 60 portaobjetos, se colocaron boca abajo cubreobjetos y se sellaron con esmalte de unas. Se observaron las celulas en

el Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, con el microscopio Axioplan CCD equipado con una lente de objetivo FL de NA 1,3 de 40x y camara CCD enfriada digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37 a traves de software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal Imaging Corp., Downington, PA).

5

Se efectuo la inmunofluorescencia de p-catenina como se describe para E-caderina. Se bloquearon los sitios no especlficos con suero de burro. Se diluyo el anticuerpo primario, anticuerpo de cabra anti-p-catenina (Santa Cruz Biotech, CA) 1/100 en BSA al 5 %/PBS. Se diluyo el anticuerpo secundario, anticuerpo Alexa Fluor 568 de burro anti-cabra, 1/200 en BSA al 5 %/PBS.

10

Se efectuo la inmunofluorescencia de N-caderina como se describe para E-caderina. Se bloquearon los sitios no especlficos con suero de polio. Se diluyo el anticuerpo primario, anti-N-caderina de conejo (Santa Cruz Biotech, CA) 1/100 en BSA al 5 %/PBS. Se diluyo el anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488 de polio anti-conejo, 1/200 en BSA al 5 %/PBS.

15

Inmunofluorescencia de p27

Se dejaron crecer celulas sobre cubreobjetos de 12 mm hasta 60 a 70 % de confluencia. Se ariadio metilsulfona al 2 % a la mitad de los cubreobjetos y medio normal a la otra mitad. Despues de 24, 48 y 96 horas, se colocaron los 20 cubreobjetos en soportes de porcelana y se incubaron en PBS a 37 °C durante 30 segundos, seguido de incubacion en paraformaldehido al 4 % a 37 °C durante 10 minutos. Se lavaron las celulas con PBS durante 5 minutos seguido de incubacion en Triton X-1000 al 0,2 %/PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se ariadio suero de polio (50 pi en 1 ml de PBS) a las celulas durante 30 minutos. Se lavaron las celulas con Triton X-100 al 0,2 %/PBS, 3 minutos cada vez. Se diluyo anticuerpo policlonal de conejo anti-p27 (Santa Cruz Biotech, CA) 1/250 en BSA al 1 25 %/PBS y se ariadio a cubreobjetos durante 1,5 horas. Se lavaron las celulas 5 veces en Triton X-100 al 0,2 %/PBS 3 minutos cada vez. Se diluyo el anticuerpo secundario, anticuerpo Alexa Fluor 488 de polio anti-conejo, 1/1000 en BSA al 1 %/PBS y se ariadio a cubreobjetos durante 30 minutos en la oscuridad. Se lavaron las celulas 5 veces con Triton X-100 al 0,2 %/PBS 3 minutos cada vez. Se lavaron las celulas dos veces con PBS durante 2 minutos cada vez y se colocaron en DAPI, diluido 1/1000 en PBS durante 5 minutos. Se lavaron las celulas con PBS durante 1 30 minuto. Se ariadid SlowFade a portaobjetos, se colocaron cubreobjetos boca abajo y se sellaron con esmalte de urias. Se observaron las celulas en el Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, con un microscopio Axioplan CCD equipado con una lente de objetivo de 100x y camara CCD enfriada digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37 a traves del software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal Imaging Corp., Downington, PA).

35

Inmunofluorescencia de vimentina

Se dejaron crecer celulas en cubreobjetos de 12 mm. Despues de 24 horas, se ariadio metilsulfona al 2 % a la mitad de los cubreobjetos y medio normal a la otra mitad. Despues de 120 horas, se colocaron los cubreobjetos en 40 soportes de porcelana y se fijaron las celulas en metanol a -20 °C durante 10 minutos. Se lavaron las celulas dos veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS y se incubaron en BSA al 1 %/PBS en un plato Petri grande de vidrio recubierto con toallita Kim empapada en agua y un fondo de Parafilm durante 30 minutos. Se incubaron las celulas en anticuerpo policlonal de cabra anti-vimentina (Santa Cruz Biotech, CA), diluido 1/50 en BSA al 1 %/PBS, durante 1 hora. Se lavaron las celulas 5 veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS 3 minutos cada vez. Se diluyo el anticuerpo 45 secundario, Alexa Fluor 488 de conejo anti-cabra, 1/100 en BSA al 1 %/PBS y se ariadio a cubreobjetos durante 30 minutos en la oscuridad. Se lavaron las celulas 5 veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS 3 minutos cada vez. Se lavaron las celulas dos veces con PBS durante 2 minutos cada vez y se colocaron en DAPI (1 mg/ml) diluido 1/1000 en PBS durante 5 minutos en la oscuridad. Se lavaron las celulas con PBS durante 1 minuto. Se ariadio SlowFade a un portaobjetos, se colocaron cubreobjetos boca abajo y se sellaron con esmalte de urias. Se observaron las celulas 50 en el Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, con un microscopio Axioplan CCD equipado con una lente de objetivo de 100x y camara CCD enfriada digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37 a traves del software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal Imaging Corp., Downington, PA).

55 Inmunofluorescencia de microtubulos

Se sembraron celulas en placas de cultivo de tejido de 6-100 mm que conteman cada una 1 portaobjetos de 10 pocillos recubierto con polilisina, o se sembraron en cubreobjetos recubiertos con polilisina. Una vez las celulas estaban aproximadamente un 50 % confluentes, se ariadio metilsulfona al 2 % a las celulas durante 10, 30, 60, 90 y 60 120 minutos. En cada punto temporal, se colocaron las celulas en tampon estabilizante de microtubulos durante 10

minutos seguido de incubacion en metanol a -20 °C durante 5 minutos. Se lavaron las celulas dos veces con Triton X-100 al 0,1 % en PBS a temperatura ambiente y se incubaron entonces con anticuerpo monoclonal de raton anti- alfa-tubulina (Santa Cruz Biotech, CA; diluido 1/200 en BSA al 1 %/ PBS) durante 1,5 boras. Se lavaron las celulas 5 veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS 3 minutos cada vez. Se incubaron las celulas con anticuerpo secundario 5 (anticuerpo Alexa Fluor 568 de conejo anti-raton; diluido 1/100 en 1 %/PBS) durante 30 minutos en la oscuridad. Se lavaron las celulas 5 veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS 3 minutos cada vez. Se lavaron las celulas dos veces con PBS a intervalos de 2 minutos y se incubaron con DAPI (1 pg/ml en PBS) durante 5 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Se lavaron las celulas con PBS durante 1 minuto. Se ahadio SlowFade a portaobjetos, se colocaron cubreobjetos boca abajo por el lado de las celulas y se sellaron con esmalte de unas. Se observaron los 10 microtubulos en el Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, con un microscopio Axioplan CCD equipado con lente de objetivo FL de NA 1,3 de 40x y camara CCD enfriada digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37 a traves del software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal imaging Corp., Downington, PA).

15 Ensayo de agar blando para formation de colonias

Se sembraron celulas en placas de 8-35 mm que contenian agar basico con y sin metilsulfona al 2 %. Para elaborar agar basico, se mezclo agar al 1 % (pureza de ADN; agar Difco Bacto; Becton Dickenson and Company, Sparks, MD) en agua a temperatura ambiente, se fundio en un microondas y se enfrio a 40 °C antes de usar. Para placas de 20 farmaco, se combino agar al 1 % (1:1) con metilsulfona al 4 % en medio 2x RPMI con bicarbonato de sodio suplementado con 10 % de FBS y 5 % de penicilina/estreptomicina. Para las placas de control, se combino agar al 1 % (1:1) con medio 2X RMPI. Se ahadio agar ± metilsulfona al 2 % a placas de cultivo de tejido de 35 mm adecuadas y se almacenaron durante una noche a 4 °C. El dia siguiente, se dispusieron agar superior y celulas sobre el agar basico. Se elaboro el agar superior con agar al 0,66 % en agua. Se fundio el agar en un microondas, se enfrio y se 25 almaceno a 40 °C. Se almaceno tambien medio 2x RPMI y metilsulfona al 4 % a 40 °C. Se tripsinizaron las celulas y se contaron para una concentration final de 5x103 celulas/placa. Se ajustaron los recuentos celulares a 2x105 celulas/ml y se anadieron 0,05 ml de suspension celular a tubos de centrifuga de 15 ml (2 cada vez). Se retiraron las placas de agar basico de los 4 °C y se permitieron calentar a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos antes de sembrar. Para sembrar celulas de control, se anadieron medio 2x RPMI y agar al 0,66 % al tubo de 30 suspension celular, se agito suavemente y se coloco sobre las placas de agar basico de control. Para sembrar celulas en metilsulfona al 2 %, se ahadio metilsulfona al 4 % (en medio 2X RMPI) y agar al 0,66 % al tubo de suspension celular, se agito suavemente y se coloco sobre las placas de agar basico con farmaco. Se incubaron las celulas en incubadora a 37 °C, 5 % de CO2 durante 10-14 dfas. Se tiheron las placas con violeta cristal al 0,005 % durante 1 hora. Se fotografiaron las colonias y se contaron con un microscopio de diseccion.

35

Ensayo de invasion celular

Se efectuaron los ensayos de invasion en camaras Transwell (Coming). Se recubrieron las membranas de poro de 8 pm de las camaras superiores con gel ECM de sarcoma de murino de Engelbreth-Holm-Swarm (Sigma), se 40 diluyeron 1:6 con medio RPMI ± metilsulfona al 2 % y se colocaron en un pocillo con medio RPMI ± metilsulfona al 2 %. Se sembraron celulas (1x105 celulas/200 pi) en las camaras superiores apropiadas en medio RPMI ± metilsulfona al 2 %. Despues de 20 horas de incubacion a 37 °C, se retiraron las celulas de la superficie superior de la camara y se fijaron los filtros con glutaraldehido al 5 %. Se tiheron las celulas sobre la superficie inferior del filtro con una solution de azul de toluidina al 0,5 %. Se retiraron las membranas de insertos con una cuchilla, se montaron entre 45 un portaobjetos de vidrio y un cubreobjetos y se mantuvieron en el sitio con cinta adhesiva. Se fotografiaron las celulas y se contaron en el Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, con un microscopio Axioplan CCD equipado con una lente objetivo FL de NA 1,3 de 40x y camara CCD enfriada digital de alta velocidad a traves del software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal Imaging Corp., Downington, PA). Todos los ensayos se efectuaron por triplicado.

50

Laceration celular

Se cultivaron las celulas a aproximadamente 90 % de confluencia en placas de cultivo de tejido de 35 mm. Se ahadio metilsulfona (al 2 %) a la mitad de placas y 48 horas despues se laceraron las celulas con una punta de 55 pipeta de plastico esteril de 1000 pi. Se lavaron las celulas dos veces con medio para retirar el desecho celular y se incubaron a 37 °C durante una noche en medio RPMI ± metilsulfona al 2 %. Despues de 72 horas, se fotografiaron los bordes de la laceration y se registraron con un microscopio invertido Nikon TE300 (Nikon) equipado con una lente de objetivo Plan Achromat de NA 0,25 de 10x. Se adquirieron imagenes de contraste de fase de serie temporal (de 5 min de largo) a una tasa de video (1 fotograma/3 s) con una videocamara Watec-902B CCD (Watec Corp., 60 Japon) a traves de la option de adquisicion continua del software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph

(Universal Imaging Corp., Downington, PA). Durante los registros, se mantuvieron las celulas a 37 °C y Hepes 10 mM. Se obtuvieron las series temporales y fotografias de celulas ± metilsulfona al 2 % cada 24 horas hasta 120 horas.

5 Tincion mitocondrial: celulas vivas y fijas

Se dejaron crecer las celulas en cubreobjetos redondos de 12 mm tratados con polilisina al 60-90 % de confluencia. Despues de 24 horas, se ahadio metilsulfona al 2 % a la mitad de los cubreobjetos. A las 48 y 72 horas, se ahadio MitoTracker Red CM-H2XR0S 500 nM (Molecular Probes, Eugene, OR), diluido en medio ± metilsulfona al 2 % a las 10 celulas y se incubaron las celulas durante 45 minutos a 37 °C. Se ahadio medio reciente ± metilsulfona al 2 % a las celulas y se fotografiaron las celulas usando un microscopio invertido Nikon TE300 (Nikon) equipado con una lente de objetivo NA Plan Achromat de 20x. Se adquirieron imagenes de contraste de fase con una videocamara Watec- 902B CCD (Watec Corp., Japon). Se obtuvieron imagenes de fluorescencia de mitocondrias marcadas con rodamina con Andor iXon EM-CCD (Andor Technology, Windsor, CT). Se manejaron ambas camaras con el software de 15 adquisicion y analisis de imagenes Metamorph (Universal Imaging, Downington, PA).

Para celulas fijas, se lavaron las celulas con medio despues de incubacion en MitoTracker Red y se colocaron entonces en formaldehido al 3,7 % en medio a 37 °C ± metilsulfona al 2 % durante 15 minutos a 37 °C. Se lavaron las celulas con PBS varias veces, 3 minutos cada vez, y se ahadieron entonces a acetona enfriada con hielo usando 20 un soporte de porcelana. Despues de un lavado con PBS durante 1 minuto, se ahadio SlowFade a un portaobjetos, se colocaron cubreobjetos boca abajo y se seilaron con esmalte de uhas. Se obtuvieron las imagenes en el Center for Cell Analysis and Modeling, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT, EE. UU., con un microscopio Axioplan CCD equipado con una lente de objetivo de 63x y camara CCD enfriada digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37 a traves del software de adquisicion y analisis de imagenes Metamorph 25 (Universal Imaging Corp., Downington, PA).

Ensayo de senescencia

Se valoro la senescencia con el kit de tincion histoquimica en celulas de senescencia (Sigma).

30

RESULTADOS

Respuesta a la dosis de celulas de melanoma ante metilsulfona

35 Se sembraron celulas de melanoma M3 Cloudman en platos de cultivo que contenian medio RPMI. Despues de 24 horas, se cambio el medio a medio de control (sin farmaco) 0 a medios que contenian diferentes concentraciones de metilsulfona (metilsulfona al 1-10 % en medio RPMI). Se examinaron las celulas por microscopia de video de celulas vivas inmediatamente despues de ahadir el farmaco y cada 24 horas hasta las 144 horas.

40 Inmediatamente despues de ahadir el farmaco a todas las concentraciones, las celulas se volvieron redondas, deprendiendose algunas celulas de las placas de cultivo (Figura 1). Cuando se incubaron las celulas de melanoma con metilsulfona al 2-6 % durante 24 horas, se indujo la apoptosis de las celulas tratadas con la mayor concentracion (6 %) (Figura 2). Sin embargo, con metilsulfona al 2 %, las celulas se volvian a adherir al plato de cultivo durante las siguientes pocas horas y asumian una morfologia distinta que las celulas de control: las celulas en metilsulfona al 2 45 % exhibian una morfologia aplanada en comparacion con la forma de gusano amorfa de las celulas no tratadas.

Se considero la posibilidad de que los datos generados por tratar celulas con metilsulfona fueran un efecto no especifico debido a cambios en la osmolaridad extracelular. Para ensayar esta posibilidad, se sustituyo por una concentracion equimolar de urea la metilsulfona al 2 %; la urea tiene una estructura quimica y momento dipolar que 50 son similares a la metilsulfona. La urea no imitaba los efectos de la metilsulfona. En lugar de ello, la urea inducia la muerte necrotica. Se reemplazo a continuation metilsulfona al 2 % por una concentracion equimolar de dimetilsulfoxido (DMSO). El analisis microscopico demostro que el DMSO no tenia efecto sobre las celulas de melanoma y no inducia ninguno de los efectos observados con metilsulfona.

55 Inhibition por contacto inducida por metilsulfona en celulas de melanoma

A las 24 horas despues de ahadir metilsulfona al 2 %, las celulas crecieron hasta entrar en contacto con celulas vecinas. En este punto, las celulas parecian inhibirse por contacto (Figura 3). El video de celulas vivas demostro que, aunque las celulas de control retenian sus formas redondeadas amorfas y seguian migrando sobre celulas 60 vecinas, las celulas de melanoma con metilsulfona al 2 % detenian la migration y el crecimiento y formaban una

monocapa confluente de celulas quiescentes detenidas en G1, una marca distintiva de la inhibition por contacto.

La metilsulfona inhibia la smtesis de ADN en celulas de melanoma

5 Cuando las celulas se vuelven quiescentes, disminuye entonces la smtesis de ADN significativamente en comparacion con las celulas que permanecen en el ciclo celular. Para comparar la smtesis de ADN en celulas de control y celulas tratadas con metilsulfona al 2 %, se determinaron los porcentajes de incorporation de BrdU a ADN. La Figura 4 demuestra los datos de celulas a las 48 y 72 horas en presencia o ausencia de metilsulfona al 2 %. A las 48 horas, un 14 % de las celulas de control sintetizaban ADN, mientras que solo un 0,03 % de las celulas en 10 metilsulfona al 2 % sintetizaban ADN. A las 72 horas, un 21 % de las celulas de control y un 0 % de las celulas tratadas con farmaco sintetizaban ADN.

Las celulas de melanoma se volvlan dependientes del anclaje en presencia de metilsulfona al 2 %.

15 Las celulas malignas no requieren adhesion o anclaje a un sustrato duro para el crecimiento. Esta independencia del anclaje es una caracterlstica clasica de las celulas metastasicas. La formacion de colonias por proliferation celular aparece cuando las celulas cancerosas crecen en agar blando, mientras que las celulas normales no proliferaran ni por lo tanto formaran colonias en agar blando. Se ensayo metilsulfona para determinar si afectaba al crecimiento independiente de anclaje de las celulas de melanoma usando el ensayo de agar blando. Como se muestra en la 20 Figura 5, el tratamiento de celulas de melanoma con metilsulfona al 2 % no daba como resultado la formacion de colonias, mientras que se formaban cientos de colonias con celulas de control.

La metilsulfona inhibia la migracion de celulas de melanoma a traves de una matriz extracelular

25 Una segunda caracteristica clasica de las celulas metastasicas es su capacidad de migrar a traves de una matriz extracelular. Se determino si la metilsulfona alteraba esta capacidad en celulas de melanoma. En ausencia de metilsulfona, un alto porcentaje de celulas migraban a traves de la matriz. En contraposicion, ninguna de las celulas tratadas con metilsulfona al 2 % migraba a traves de la matriz (Figura 6).

30 La curacion de heridas proseguia normalmente en presencia de metilsulfona

La curacion de heridas es un proceso complicado en el que las celulas yuxtapuestas a un sitio de herida deben desprenderse de las celulas vecinas y de un sustrato (o membrana basal), migrar a la herida e inhibirse entonces por contacto una vez se cubre la herida. Se ensayo si las celulas de melanoma tratadas con metilsulfona al 2 % 35 funcionarian apropiadamente en el proceso de curacion de heridas. Como se describe en la presente memoria, se dejaron crecer celulas de melanoma de control y celulas tratadas con metilsulfona al 2 % hasta confluencia. El rascado de una capa de celulas confluentes con una punta de pipeta de plastico formaba heridas. Se uso microscopia de video de celulas vivas para monitorizar la migracion de celulas a la herida. En las muestras de control, las celulas migraban al area herida, pero no dejaban de moverse una vez se cubria el sitio de herida, 40 formando una masa de tipo tumoral en el sitio de herida. En contraposicion, las celulas de melanoma tratadas con metilsulfona al 2 % se desprendian de las celulas vecinas y de la superficie de la placa de tejido y migraban al area herida, aunque a una tasa menor que las celulas de control. Sin embargo, en contraposicion con las celulas de control, cuando se cubria la herida, las celulas tratadas con metilsulfona al 2 % detenian la migracion y se inhibian por contacto de nuevo (Figura 7).

45

La metilsulfona inducia senescencia en celulas de melanoma

Durante las primeras 2-3 semanas de incubation de celulas de melanoma en metilsulfona al 2 %, el reemplazo de medio de metilsulfona al 2 % por medio sin farmaco revertia los fenotipos descritos anteriormente. Volver a anadir 50 metilsulfona al 2 % a las celulas volvia a inducir los fenotipos no malignos. Este ciclo de reversion aparecia hasta que las celulas se incubaban con metilsulfona al 2 % durante mas de 3 semanas. En este punto, mas del 95 % de las celulas de melanoma se volvian senescentes a juzgar por la activation de la actividad p-galactosidasa que volvia azules las celulas senescentes (Figura 8). La senescencia indica que las celulas no pueden volver a entrar nunca en el ciclo celular. Para determinar si el aumento en la actividad p-galactosidasa indicaba verdaderamente senescencia, 55 se reemplazo medio que contiene metilsulfona al 2 % por medio de control en celulas en que el ensayo de p- galactosidasa indicaba que eran senescentes, y se encontro que las celulas permanecian senescentes. Como prueba adicional, se desprendieron celulas senescentes del plato de cultivo por tripsinacion y se volvieron a sembrar las celulas en medio sin metilsulfona. Las celulas readheridas al plato de cultivo se inhibian por contacto y permanecian senescentes a juzgar por la actividad p-galactosidasa.

La metilsulfona inducia la arborization de celulas de melanoma senescentes.

Los melanocitos maduros adoptan una morfologia que es similar a las celulas neuronales al tener un area pequena de citoplasma rodeando al nucleo y largas extensiones llamadas arborescencias. La funcion primaria de los 5 melanocitos es producir melanina y empaquetar la melanina en veslculas llamadas melanosomas. Los melanosomas se transportan entonces a las puntas de las arborescencias de melanocitos. Estas puntas se fagocitan por queratinocitos, celulas que se asientan cerca de la superficie de la piel, y los melanosomas recien adquiridos forman un escudo en forma de paraguas alrededor de los nucleos de los queratinocitos para proteger el ADN de estas celulas de UV inductores de mutaciones.

10

Las celulas de melanoma que se han vuelto senescentes en presencia de metilsulfona al 2 % asumi'an la morfologia de melanocitos maduros completada con arborescencias extensas que se rellenaban con melanosomas (Figura 9). Estas celulas sobrevivian en cultivo durante al menos 2 meses.

15 Se localizo p27 en los nucleos de celulas de melanoma tratadas con metilsulfona

La p27 es una proteina asociada con la detention del ciclo celular y la senescencia. Su forma activa se encuentra dentro del nucleo. Usando microscopia inmunofluorescente, se mostro que p27 esta localizada en los nucleos de celulas tratadas con metilsulfona.

20

La metilsulfona no alteraba las proteinas implicadas en la transition de epiteiial a mesenquimatico (ETM)

La transition ETM puede estar implicada en el desarrollo de metastasis de algunos tumores. Las proteinas asociadas a celulas epiteliales incluyen E-caderina y p-catenina, mientras que las proteinas asociadas con celulas 25 mesenquimaticas incluyen N-caderina y vimentina. Se uso microscopia de inmunofluorescencia para comparar la distribution de E-caderina, p-catenina, N-caderina y vimentina en celulas de melanoma con y sin tratamiento con metilsulfona. Como se muestra en la Figura 10, no habia diferencias significativas en la distribution de estas proteinas en celulas de melanoma en presencia o ausencia de metilsulfona al 2 % despues de tratamiento con farmaco durante 1 semana. Se encontraron resultados similares despues de incubation de celulas de melanoma 30 con metilsulfona al 2 % durante 5 semanas.

Efecto de la metilsulfona sobre filamentos de actina y microtubules

La inmunofluorescencia de los filamentos de actina mostraba diferencias entre las celulas incubadas con y sin 35 farmaco. En celulas de control, los filamentos de actina se encontraban principalmente en las extensiones de borde destacadas. En celulas tratadas con metilsulfona al 2 %, los filamentos de actina eran claramente visibles en la superficie celular en pequenas prominentias que entraban en contacto con celulas vecinas (Figura 11).

La inmunofluorescencia de microtubulos demostro, que al cabo de 10 minutos de adicion de metilsulfona al 2 % a 40 celulas de melanoma, los microtubulos se desensamblaban rapidamente. Durante las siguientes 2 horas, los microtubulos empezaban a reensamblarse, pero con un patron distinto que las celulas no tratadas. En las celulas de control, se encontraban microtubulos principalmente en extensiones “de tipo cono de crecimiento”, con la aparicion de desorden en el citoplasma. En celulas tratadas con metilsulfona al 2 %, los microtubulos reaparecian en un patron ordenado, que proviene de centros organizadores de microtubulos y que irradian hacia fuera a la periferia 45 celular (Figura 12).

Un ensayo para ensayar la estabilidad de los microtubulos es dar a las celulas concentraciones crecientes de un farmaco desensamblador de microtubulos y usar la microscopia de inmunofluorescencia para valorar las longitudes de microtubulos (Caron et al.). Se requerira una mayor concentration de farmaco para desensamblar los 50 microtubulos mas estabilizados. Se usaron diferentes concentraciones de farmaco antimicrotubulos, vinblastina, para valorar la estabilidad de microtubulos en celulas de control y celulas incubadas con metilsulfona al 2 %. A una concentration de vinblastina 10'7 M, los microtubulos en las celulas de control estaban en gran parte desaparecidos, mientras que los microtubulos en celulas tratadas con metilsulfona al 2 % eran claramente visibles (Figura 13). Estos datos sugieren que la metilsulfona estabiliza los microtubulos.

55

Se encontraron tambien efectos de la metilsulfona sobre celulas de melanoma en celulas de cancer de mama negativas de receptor de estrogenos agresivas y metastasicas

Se encontro que las concentraciones de metilsulfona mayores del 2 % inducian la apoptosis en celulas de cancer de 60 mama. Cuando se trataban celulas de cancer de mama con metilsulfona al 2 %, las celulas se inhibfan por contacto,

se reducia notablemente la smtesis de ADN, disminufa la actividad mitocondrial, el crecimiento celular se volvfa dependiente de anclaje, se inhibia la migracion de las celulas a traves de una matriz extracelular, la curacion de heridas prosegufa normalmente y las celulas se volvi'an senescentes.

5 La metilsulfona inducia la apoptosis en linfocitos de celulas T leucemicos, pero no en linfocitos de celulas T normales

Linfocitos leucemicos

10 Se mantuvieron celulas CEM, linfocitos de celulas T leucemicos obtenidos de una niria de 6 anos con leucemia linfocftica aguda, en platos Petri en MEM (medio esencial minirno) con 7 % de suero fetal de temero en una incubadora a 5 % de CO2 a 37 °C. Para los experimentos, se anadio metilsulfona al medio a concentraciones de 0,60 %, En las celulas de control, no se anadio metilsulfona. Se incubaron las celulas (2x106 por ml) durante 20 horas en presencia o ausencia de metilsulfona, y se ensayo entonces la apoptosis usando microscopia de FITC-anexina 15 V/yoduro de propidio. Se compare tambien la metilsulfona con el farmaco antimicrotubulos, vinblastina. La vinblastina (VNB) y su derivado, vincristina, son tratamientos estandares para leucemia linfocftica aguda, asi como otros canceres. Se uso la concentration de VNB que se encuentra en la sangre de sujetos que se estan tratando con este farmaco (10-7 M) (6,7).

20 Despues de 20 horas, un 74 % de los linfocitos leucemicos en metilsulfona al 4 % eran apoptoticos. En metilsulfona al 6 %, un 88 % de las celulas eran apoptoticas.

Despues de 20 horas en VNB 10-7 M, un 48 % de las celulas leucemicas eran apoptoticas (Figura 14).

25 Linfocitos normales

Se extrajo sangre de voluntaries sanos y se enriquecio en globulos blancos (p. ej., linfocitos, neutrofilos) usando Ficoll-Plaque. Se incubaron las celulas en platos Petri que contenian MEM con 7 % de suero fetal bovino en una incubadora de CO2 (5 %) a 37 °C. La metilsulfona estaba presente a concentraciones de 0, 3, 6 o 10 %. Despues de 30 20 horas, se incubaron las celulas con anticuerpos especificos de linfocitos T (celulas T CD3 y CD4), linfocitos B (celulas B) y neutrofilos, y se determino el porcentaje de celulas apoptoticas por citometria de flujo. Esta es una tecnica que identifica tipos celulares especificos (p. ej., celulas T CD3, celula T CD4, celulas B y neutrofilos) en una poblacion mixta de celulas sanguineas, y determina entonces si las celulas estan vivas o apoptoticas.

35 Se incubaron tambien linfocitos leucemicos CEM en presencia o ausencia de metilsulfona al 10 %. El objetivo aqui era determinar si el ensayo de microscopio de FITC-anexina V/yoduro de propidio descrito anteriormente producia resultados similares al ensayo de citometria de flujo usado en estos experimentos.

Despues de 20 horas, se incubaron las celulas con anticuerpos fluorescentes para identificar celulas T, celulas B y 40 neutrofilos y procesar entonces por citometria de flujo (Figura 15).

Incluso a metilsulfona al 10 %, los linfocitos normales (celulas T) permanecian viables. Las celulas B y neutrofilos estaban tambien ilesos por metilsulfona al 10 %. En contraposition, un 92 % de los linfocitos leucemicos CEM morian por metilsulfona al 10 %. Estos datos indican, en primer lugar, que la metilsulfona era dahina para linfocitos 45 leucemicos, pero no para linfocitos normales. En segundo lugar, los dos ensayos apoptoticos (microscopio y citometria de flujo) producian resultados similares. En tercer lugar, la metilsulfona era mas efectiva que la vinblastina, el farmaco quimioterapeutico usado hoy en dia contra leucemia y otros canceres.

Metilsulfona y falta de toxicidad

50

Para ensayar la toxicidad de la MMS y compuestos estructuralmente relacionados, se analizo la capacidad de inducir apoptosis en celulas de melanoma.

Brevemente, se sembraron celulas de melanoma (linea celular Cloudman M3) a 105 celulas/ml en medio RPMI. 55 Despues de 24 horas, se reemplazo el medio por RPMI que contenfa concentraciones diferentes (gramos/volumen) de MMS, MES y EES. Despues de 24 horas, se ensayo la apoptosis usando el kit de anexina V-FITC/yoduro de propidio Becton-Dickinson y un microscopio fluorescente como se describe por el fabricante. Se exponen los resultados en las Figuras 16 y 17.

60 Estos experimentos demuestran que la MMS induce significativamente menos apoptosis de celulas M3 que MES o

EES. Esto es especialmente cierto a las concentraciones menores, por ejemplo, menores de MES, EES y MMS al 5

%.

Como la mayoria de los demas farmacos quimioterapeuticos, parece que EES/MES tienen un diferencial estrecho 5 (ventana muy pequena) entre matar las celulas cancerosas pero tambien danar las celulas normales. En contraposicion, la MMS tiene una amplia ventana de concentraciones que matan celulas cancerosas sin danar celulas normales.

Ejemplo 2: Inmunofluorescencia de SKP2 y p27 en celulas cancerosas

10

La SKP2 es una ubiquitina ligasa que es activa en nucleos celulares y se expresa en muchos tipos de celulas malignas. La SKP2 promueve el ciclo celular y la proliferacion celular y promueve la degradation de la proteina supresora tumoral p27. La p27 es un supresor tumoral que es activo cuando se localiza en nucleos celulares y en forma no fosforilada. La p27 promueve la detention del ciclo celular y la senescencia.

15

En celulas diferenciadas normales, la p27 (forma activa no fosforilada) se localiza en el nucleo. En celulas 66 y M3 usadas en este experimento, la p27 esta en los nucleos y la SKP2 esta en el citoplasma en su forma inactiva. Las celulas normales tienen altos niveles de p27 en nucleo y bajos niveles de SKP2 en citoplasma. Esto se confirmo en los experimentos descritos a continuation. Los nucleos se tineron con DAPI (azul) y correspondientemente p27 (rojo) 20 o SKP2 (rojo), y se fusionaron entonces las fotos p27/DAPI y SKP2/DAPI. En celulas malignas, es cierto lo contrario: la p27 (fosforilada e inactiva) esta a bajos niveles en el citoplasma; la SKP2 (activa) esta a altos niveles en los nucleos.

Se sembraron las celulas a 1 x 105 celulas/ml en cubreobjetos redondos de 12 mm en placas de cultivo de tejido de 25 35 mm (el volumen final de medio era de 1,5 ml/placa de 35 mm). A las 24 horas despues de la siembra, se reemplazaron los medios por medios recientes que conteman metilsulfona al 2 % y se incubaron las celulas en medio/metilsulfona al 2 % durante 4 semanas. Se cambio medio/metilsulfona al 2 % cada lunes, miercoles y viernes. Se efectuo la inmunofluorescencia a las 4 semanas despues de la siembra para buscar la presencia de las siguientes protelnas: SKP2 y p27 (Santa Cruz Biotechnology). Para empezar la tincion inmunofluorescente, se 30 transfirieron las celulas de cubreobjetos desde las placas de cultivo celular a soportes de porcelana; los soportes de porcelana se colocaron suavemente en un vaso de precipitados con PBS (37 °C) durante 30 segundos para lavar las celulas. Se fijaron las celulas con solution de paraformaldehido al 4 % (37 °C) durante 10 minutos y se lavaron entonces con PBS durante 5 minutos. Se uso suero de cabra (Santa Cruz Biotechnology) en la etapa de bloqueo. Se recubrio un gran plato Petri de vidrio con Parafilm. Se colocaron entonces los cubreobjetos boca abajo por el lado de 35 las celulas sobre una gota (35 pi por cubreobjetos) de suero de cabra y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se transfirieron las celulas de los soportes de porcelana y se lavaron con Triton X-100 al 0,1 %/PBS 3 veces a 3 minutos por lavado. Se diluyeron los anticuerpos primarios 1:100 en BSA al 5 %/PBS y se centrifugaron durante 1 minuto para retirar cualquier particula. Se colocaron los cubreobjetos boca abajo por el lado de las celulas sobre 35 pi de anticuerpo primario/cubreobjetos en el plato Petri de vidrio cubierto con Parafilm y se 40 incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Todos los anticuerpos primarios eran policlonales de conejo. Se transfirieron las celulas a soportes de porcelana y se lavaron tres veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS durante 3 minutos cada vez. Se diluyo e! anticuerpo secundario, Alexa Fluor 546 de cabra anti-conejo (Molecular Probes),

1:200 en BSA al 5%/PBS. Se colocaron los cubreobjetos boca abajo por el lado de las celulas sobre 35 pi de anticuerpo secundario/cubreobjetos en el plato Petri de vidrio recubierto de Parafilm y se incubaron durante 1 hora 45 en la oscuridad a temperatura ambiente. Se transfirieron las celulas a soportes de porcelana y se lavaron 5 veces con Triton X-100 al 0,1 %/PBS durante 3 minutos cada vez, seguido de PBS durante 1 minuto. Para tenir los nucleos, se diluyo DAPI 1:1000 en PBS. Se colocaron los cubreobjetos boca abajo por el lado de las celulas sobre 35 pi de DAPI/cubreobjetos en el plato Petri de vidrio recubierto con Parafilm y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad. Se lavaron los cubreobjetos con PBS durante 1 minuto y se colocaron entonces 50 boca abajo por el lado de las celulas sobre 2,5 pl/cubreobjetos de Slow Fade (Molecular Probes) sobre portaobjetos de vidrio. Se aplico esmalte de unas transparente alrededor del cubreobjetos y se dejo secar al aire en la oscuridad durante 30 minutos. Se almacenaron las celulas durante una noche a 4 °C. Se observaron los portaobjetos en un microscopio de campo amplio equipado con una camara digital de alta velocidad Photometries PXL-EEV37. Se adquirieron las imagenes con un objetivo de 40x usando el software MetaMorph de Molecular Devices.

Los resultados de los experimentos de inmunofluorescencia descritos en la presente memoria demuestran que, en presencia de metilsulfona, hay una alta expresion de p27 en el nucleo y bajos niveles de SKP2 en el citoplasma, demostrando que la metilsulfona induce un fenotipo normal en celulas metastasicas malignas.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una cantidad terapeuticamente efectiva de metilsulfona para uso en el tratamiento de cancer metastasico, donde la cantidad terapeuticamente efectiva se administra como una solucion de metilsulfona en el

   5 intervalo de 0,2 a 0,6 mg de metilsulfona/ml de disolvente para administracion por pulverizacion, topica, transdermica u oral, o de 1,0 a 5,0 mg de metilsulfona/ml de disolvente para infusion IV o infusion intratecal.
2. 2. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el cancer es un cancer de tumor solido.

   10
3. 3. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, donde el cancer de tumor solido se selecciona de entre el grupo consistente en cancer de ovario, cerebro, colon, pulmon, melanoma, de vejiga, mama o prostata.

   15 4. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el cancer es un cancer hematologico.
4. 5. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, donde el cancer hematologico es leucemia o

   linfoma.

   20 6. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la metilsulfona se administra por via

   sistemica o local.
5. 7. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la metilsulfona se orienta a la localizacion del cancer, por ejemplo, por una microparticula o nanoparticula.

   25
6. 8. Una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de cancer metastasico que comprende:

   a) de 0,2 a 0,6 mg de metilsulfona/ml, donde la composicion se formula para administracion por pulverizacion, topica, transdermica u oral, o de 1,0 a 5,0 mg de metilsulfona/ml, donde la composicion se formula para infusion IV o

   30 infusion intratecal; y

   b) un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.
7. 9. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 8, donde la composicion se formula para aerosolizacion.

   35
8. 10. Metilsulfona para uso en el tratamiento de melanoma.
9. 11. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, donde la metilsulfona se administra por via sistemica o local.

   40
10. 12. Metilsulfona para uso de acuerdo con la reivindicacion 10, donde la metilsulfona se orienta a la localizacion del cancer, por ejemplo, por una microparticula o nanoparticula.
11. 13. Una composicion farmaceutica para uso en el tratamiento de melanoma que comprende metilsulfona y 45 un diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.
12. 14. La composicion farmaceutica para uso de acuerdo con la reivindicacion 13, donde la composicion se formula para aerosolizacion.

    50 15. Un parche transdermico para uso en el tratamiento de melanoma que comprende metilsulfona.