ES2693761T3 - Composiciones de péptidos - Google Patents

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ES2693761T3 ES14719988.9T ES14719988T ES2693761T3 ES 2693761 T3 ES2693761 T3 ES 2693761T3 ES 14719988 T ES14719988 T ES 14719988T ES 2693761 T3 ES2693761 T3 ES 2693761T3
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Shubh Sharma
Leonardus H.T. Van Der Ploeg
Bart Henderson
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Rhythm Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un polipéptido aislado seleccionado de: Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 8); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 2); Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 51); Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 52); Ac-Arg-ciclo[Cys-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 57); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 11); Ac-TzAla-ciclo[Cys-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 59); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 9); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 39); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 4); Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 15); Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 14); o Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 45), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones de peptidos Antecedentes de la invencion
Los trastornos tales como la obesidad, el sfndrome metabolico, la resistencia a la insulina y la diabetes aumentan enormemente los costes nacionales de sanidad, y pueden tener un grave impacto en la calidad de vida de los individuos afectados, de sus familias y de sus cuidadores. La incidencia de estos trastornos esta aumentando, acercandose a proporciones epidemicas. Por consiguiente, existe la necesidad de composiciones y metodos para tratar estos trastornos.
El documento WO 2005/000339 (D8) describe agonistas peptfdicos del receptor de la melanocortina-4 (MC4R), tales como ciertos hexapeptidos cfclicos que comprenden un resto de histidina, y sus usos.
El documento WO 2009/151383 (D12) describe peptidos cfclicos especfficos del receptor de melanocortina usados para el tratamiento de la obesidad y otras enfermedades asociadas con la funcion del receptor de melanocortina.
El documento WO 2011/060355 (D15) describe un proceso para la sfntesis de un analogo de melanocortina que es un heptapeptido cfclico.
Yan et al (D17) describen la identificacion de nuevos analogos de hexapeptidos limitados por el disulfuro selectivos de MC4R.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un polipeptido aislado seleccionado de: Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg- Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 8); Ac-Arg- ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (sEq ID NO: 2); Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 51); Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 52); Ac-Arg-ciclo[Cys-Val-Gln-D-Phe- Arg-T rp-Cys] -NH2 (SEQ ID NO: 57); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 11); Ac-TzAla- ciclo[Cys-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SeQ ID NO: 59); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SeQ ID NO: 9); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 39); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro- D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 4); Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 15); Ac- Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 14); o Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 45),
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
La presente invencion tambien proporciona un polipeptido de la invencion para su uso en un metodo para tratar un trastorno que es sensible a la modulacion de MC4R. Se describe la administracion al sujeto de una cantidad eficaz de un modulador de MC4R descrito en el presente documento. En un ejemplo particular, el trastorno sensible a la modulacion de MC4R incluye diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, obesidad, resistencia a la insulina, sfndrome metabolico, disfuncion erectil masculina, trastorno sexual femenino, enfermedad del hfgado graso no alcoholico, esteatohepatitis no alcoholica, trastornos de abuso de sustancias, incluyendo trastornos por alcoholismo, caquexia, inflamacion y ansiedad.
Se divulgan compuestos y composiciones que poseen mayor selectividad y potencia hacia el MC4R y el receptor de la melanocortina-3 (MC3R) en comparacion con el receptor de la melanocortina-1 (MC1R). Los compuestos y las composiciones que se describen en el presente documento pueden reducir o eliminar efectos secundarios no deseados tales como el aumento de los efectos en la presion arterial, el aumento de la frecuencia cardfaca, los efectos no deseados sobre la excitacion sexual y el aumento de la pigmentacion cutanea.
La presente invencion tambien proporciona una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido de la invencion.
Descripcion detallada de la invencion
A continuacion, se presenta una descripcion de las realizaciones ilustrativas de la invencion.
Glosario
La nomenclatura usada para definir los peptidos es la que se usa normalmente en la tecnica, en la que el grupo amino del extremo N aparece a la izquierda y el grupo carboxilo del extremo C aparece a la derecha.
Como se usa en el presente documento, el termino "aminoacido" incluye tanto un aminoacido natural como un aminoacido no natural. A menos que se indique otra cosa, todos los aminoacidos y sus restos encontrados en los
compuestos descritos en el presente documento pueden estar en la configuracion D o L.
Los compuestos de la invencion utiles para poner en practica los metodos descritos en el presente documento pueden poseer uno o mas centros quirales y, por lo tanto, existen en una serie de formas estereoisomericas. Todos los 5 estereoisomeros y las mezclas de los mismos estan incluidos en el alcance de la presente invencion. Los compuestos racemicos pueden separarse usando HPLC preparativa y una columna con una fase estacionaria quiral o resolverse para producir enantiomeros individuales usando metodos conocidos por los expertos en la materia. Ademas, los compuestos intermedios quirales pueden resolverse y usarse para preparar compuestos quirales de la invencion.
10 Los compuestos descritos en el presente documento pueden existir en una o mas formas tautomericas. Todos los tautomeros y las mezclas de los mismos estan incluidos dentro del alcance de la presente invencion.
Salvo que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente 15 invencion.
Sfmbolo Significado
Abu acido a-aminobutfrico
Ac grupo acilo
Aib acido a-aminoisobutfrico
Ala o A alanina
Arg o R arginina
Asn o N asparagina
Asp o D acido aspartico
Ate
—nh2 co2h
Cha
sChp
Cys o C hCys Dbu Dpr
Gln o Q Glu o E Gly o G His o H Hyp Ile o I Leu o L Lys o K Met o M
1- Nal
2- Nal Nle Orn Pen
Phe o F Pro o P
acido 2-aminotetralin-2-carboxflico p-ciclohexilalanina
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acido 1-amino-4-fenilciclohexan-1-carboxflico
cistefna
homocistefna
acido 2,4-diaminobutfrico
acido 2,3-diaminopropionico
glutamina
acido glutamico
glicina
histidina
hidroxiprolina
isoleucina
leucina
lisina
metionina
(1-naftil)-alanina
(2-naftil)-alanina
norleucina
ornitina
penicilamina
fenilalanina
prolina
Sfmbolo Significado QAIa
acido quinolinilalanina o acido 2-amino-3-(quinolin-3-il)propanoico Sar sarcosina (N-metilglicina)
Ser o S Serina
Tle ferc-leucina (ferc-butilglicina)
TzAla
Thr o T
3-(1,2,4-triazol-1-il)-L-Ala treonina
Trp o W
triptofano
Tyr o Y
tirosina
Val o V
valina
BHA
benzhidrilamina
Boc
ferc-butiloxicarbonilo
But
butilo terciario
DIPEA
W,W-diisopropiletilamina
DTT
ditiotreitol
Fmoc
fluorenilmetiloxicarbonilo
HBTU
hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
MCR4
receptor de la melanocortina-4
Mtt
4-metiltritilo
NMP
N-metilpirrolidona
OBut
butoxi terciario
OPip
2-fenilisopropilo
Pbf
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
Trt
tritilo
TIS
triisopropilsilano
TFA
acido trifluoroacetico
A menos que se indique otra cosa, todas las abreviaturas (por ejemplo, Ala) de aminoacidos de la presente divulgacion se refieren a restos de aminoacidos, es decir, cadena de estructura de -NH-C(R)(R')-CO-, en la que cada R y R' es, independientemente, hidrogeno o la cadena lateral de un aminoacido (por ejemplo, R=CH3 y R'=H para Ala, o R y R' 5 pueden unirse para formar un sistema anular).
La designacion "Ac" o "NH2" del extremo de un polipeptido indica que el extremo correspondiente esta acilado o amidado, respectivamente.
10 La expresion "un enlace covalente entre cadenas laterales de aminoacidos" significa que las cadenas laterales de los dos restos de aminoacidos en cuestion incluyen cada una un grupo funcional capaz de formar un enlace covalente entre si. Los ejemplos de dichos enlaces incluyen puentes disulfuro formados por cadenas laterales Cys, hCys o Pen, y enlaces amida formados por un grupo amino de una cadena lateral de aminoacidos y un grupo carboxi de otra cadena lateral de aminoacidos, tales como, por ejemplo, Asp, Glu, Lys, Orn, Dbu o Dpr. En realizaciones ilustrativas, 15 los aminoacidos pueden seleccionarse por pares para poder formar un enlace covalente entre sus respectivas cadenas laterales. Cuando se forma un enlace covalente entre las cadenas laterales de aminoacidos, el polipeptido se puede ciclar. Dicho polipeptido cfclico puede indicarse mediante una formula estructural o usando la notacion corta "c()" o "ciclo()". Por ejemplo, "-c(Cys-Cys)-" o "-ciclo(Cys-Cys)-" denota la estructura:
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mientras que "-c(Asp-Lys)-" o "-ciclo(Asp-Lys)-" denota la estructura:
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"Alquilo", usado solo o como parte de un resto mayor tal como "hidroxialquilo", “alcoxialquilo”, "alquilamina" se refiere a un grupo alifatico saturado, lineal o ramificado, que tiene el numero especificado de atomos de carbono, normalmente, que tiene de 1 a 12 atomos de carbono. Mas concretamente, el grupo alifatico puede tener de 1 a 8, de 1 a 6 o de 1 a 4 atomos de carbono. Este termino se ilustra mediante grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, ferc-butilo, n-hexilo, y similares.
“Haloalquilo” se refiere a un grupo alquilo sustituido con uno o mas atomos de halogeno.
"Halogeno" o "halo" se refieren a fluor, cloro, bromo o yodo.
"Ciano" se refiere al grupo -CN.
"Ph" se refiere a un grupo fenilo.
"Carbonilo" se refiere a un grupo -C(O)- divalente.
"Arilo" usado solo o como parte de un resto mayor como en "aralquilo" se refiere a un grupo carbocfclico aromatico de 6 a 18 atomos de carbono que tiene un solo anillo o multiples anillos condensados. El termino "arilo" tambien incluye carbociclo/s aromatico/s condensado/s a grupos cicloalquilo o heterocicloalquilo. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, benzo[tf][1,3]dioxol, naftilo, fenantrenilo y similares.
"Ariloxi" se refiere a un grupo -OAr, en el que O es un atomo de oxfgeno y Ar es un grupo arilo como se ha definido anteriormente.
"Aralquilo" se refiere a un alquilo que tiene al menos un atomo de hidrogeno del alquilo reemplazado por un resto arilo, tal como bencilo, -(CH2)2fenilo, -(CH2)3fenilo, -CH(fenil)2, y similares.
"Heteroarilo" usado solo o como una parte de un resto mayor como en "heteroaralquilo" se refiere a un sistema anular heteroaromatico monocfclico, bicfclico o tricfclico de 5 a 18 miembros, que contiene de uno a cuatro heteroatomos del anillo seleccionados independientemente de nitrogeno, oxfgeno y azufre. El termino "heteroarilo" tambien incluye uno o varios anillos heteroaromaticos condensados a grupos cicloalquilo o heterocicloalquilo. Los ejemplos concretos de grupos heteroarilo incluyen opcionalmente piridilo sustituido, pirrolilo, pirimidinilo, furilo, tienilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, pirazolilo, 1,2,3-triazolilo, 1,2,4-triazolilo, 1,2,3-oxadiazolilo, 1,2,4-oxadiazolilo, 1,2,5- oxadiazolilo, 1,3,4-oxadiazolil, 1,3,4-triazinilo, 1,2,3-triazinilo, benzofurilo, [2,3-dihidro]-benzofuranilo, isobenzofurilo, benzotienilo, benzotriazolilo, isobenzotienilo, indolilo, isoindolilo, 3H-indolilo, benzoimidazolilo, imidazo[1,2-a]piridilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinolizinilo, quinazolinilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, cinolinilo, naftiridinilo, pirido[3,4- b]piridilo, pirido[3,2-b]piridilo, pirido[4,3-b]piridilo, quinolilo, isoquinolilo, tetrazolilo, 1,2,3,4-tetrahidroquinolilo, 1,2,3,4- tetrahidroisoquinolilo, purinilo, pteridinilo, carbazolilo, xantenilo, benzoquinolilo y similares.
"Heteroaralquilo" se refiere a un alquilo que tiene al menos un atomo de hidrogeno en el alquilo reemplazado por un resto heteroarilo, tal como -CH2-piridinilo, -CH2-pirimidinilo, y similares.
"Alcoxi" se refiere al grupo -O-R, en el que R es "alquilo", "cicloalquilo", “alquenilo” o “alquinilo”. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, etenoxi y similares.
"Hidroxialquilo" y "alcoxialquilo" son grupos alquilo sustituidos con hidroxilo y alcoxi, respectivamente.
"Amino" significa -NH2; "alquilamina" y "dialquilamina" significan -NHR y -NR2, respectivamente, en los que R es un
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grupo alquilo. "Cicloalquilamina" y "dicicloalquilamina" significan -NHR y -NR2, respectivamente, en los que R es un grupo cicloalquilo. "Cicloalquilalquilamina" significa -NHR, en el que R es un grupo cicloalquilalquilo. "[Cicloalquilalquil][alquil]amina" significa -N(R)2, en el que un R es cicloalquilalquilo y el otro R es alquilo.
"Acilo" se refiere a R"-C(O)-, en el que R" es H, alquilo, alquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, arilo, alquilarilo o alquilarilo sustituido, y se indica en la formula general de una realizacion particular como "Ac".
Los sustituyentes adecuados para "alquilo", “arilo” o “heteroarilo”, etc., son aquellos que formaran un compuesto estable de la invencion. Los ejemplos de sustituyentes adecuados son aquellos seleccionados del grupo que consiste en halogeno, -CN, -OH, -NH2, alquilo (C1-C4), haloalquilo (C1-C4), arilo, heteroarilo, cicloalquilo (C3-C7), heterocicloalquilo (de 5 a 7 miembros), -NH-alquilo (C1-C6), -N(alquilo (C1-C6))2, alcoxi (C1-C6), alcoxicarbonilo (C1-C6), -CONH2, -OCONH2, -NHCONH2, -N-alquil (C1-C6)CONH2, -N-alquil (C1-C6)CONH-alquilo (C1-C6), -NHCONH-alquilo (C1-C6), -NHCON(alquilo (C1-C6))2, -N-alquil (C1-C6)CON(alquilo (C1-C6))2, -NHC(S)NH2, -N-alquil (C1-C6)C(S)NH2, -N- alquil (C1-C6)C(S)NH-alquilo (C1-C6), -NHC(S)NH-alquilo (C1-C6), -NHC(S)N(alquilo (C1-C6))2, -N-alquil (C1- C6)C(S)N(alquilo (C1-C6))2, -CONH-alquilo (C1-C6), -OCONH-alquil (C1-C6)-CON(alquilo (C1-C6))2, -C(S)-alquilo (C1- C6), -S(O)p-alquilo (C1-C6), -S(O)pNH2, -S(O)pNH-alquilo (C1-C6), -S(O)pN(alquilo (C1-C6))2, -CO-alquilo (C1-C6), -OCO- alquilo (C1-C6), -C(O)O-alquilo (C1-C6), -OC(O)O-alquilo (C1-C6), -C(O)H o -CO2H. Mas concretamente, los sustituyentes se seleccionan entre halogeno, -CN, -OH, -NH2, alquilo (C1-C4), haloalquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), fenilo y cicloalquilo (C3-C7). Dentro del marco de la presente invencion, dicha "sustitucion" tambien pretende englobar situaciones en las que un atomo de hidrogeno se reemplaza por un atomo de deuterio. p es un numero entero con un valor de 1 o 2.
Los sustituyentes adecuados de un Phe sustituido incluyen de uno a cinco sustituyentes en cualquier atomo de carbono aromatico, seleccionandose los sustituyentes entre F, Cl, Br, I, -CH3, -OH, -CN, amina, -NO2, u -OCH3. Los ejemplos incluyen Phe(2'-F), Phe(2'-Cl), Phe(2'-Br), Phe(2'-I), Phe(2'-CN), Phe(2'-CH3), Phe(2'-OCH3), Phe(2'-CF3), Phe(2'- NO2), Phe(3'-F), Phe(3'-Cl), Phe(3'-Br), Phe(3'-I), Phe(3'-CN), Phe(3'-CH3), Phe(3'-OCH3), Phe(3'-CF3), Phe(3'-NO2), Phe(4'-F), Phe(4'-Cl), Phe(4'-Br), Phe(4'-I), Phe(4'-CN), Phe(4'-CHa), Phe(4'-OCHa), Phe(4'-CFa), Phe(4'-NO2), Phe(4'- t-Bu), Phe(2',4'-diF), Phe(2',4'-diCl), Phe(2',4'-diBr), Phe(2',4'-diI), Phe(2',4'-di-CN), Phe(2',4'-di-CH3), Phe(2',4'-di- OCH3), Phe(3',4'-diF), Phe(3',4'-diCl), Phe(3',4'-diBr), Phe(3’,4’-diI), Phe(3',4'-di-CN), Phe(3',4'-di-CH3), Phe(3',4'-di- OCH3), Phe(3',5'-diF), Phe(3',5'-diCl), Phe(3',5'-diBr), Phe(3',5'-diI), Phe(3',5'-di-CN), Phe(3',5'-diCH3), Phe(3',5'-di- OCH3) o Phe(3',4',5'-triF).
Los sustituyentes adecuados en una His sustituida incluyen de uno a tres sustituyentes en cualquier atomo sustituible del anillo, seleccionandose los sustituyentes entre F, Cl, Br, I, -CH3, -OH, -CN, amina, -NO2, bencilo o -OCH3. Los ejemplos incluyen 1-metil-histidina y 3-metil-histidina.
La designacion "(aminoacido)n" significa que un aminoacido se repite n veces. Por ejemplo, la designacion "(Pro)2" o "(Arg)3" significa que los restos de prolina o arginina se repiten, respectivamente, dos o tres veces.
En la presente invencion, se incluyen las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos polipeptfdicos desvelados en el presente documento. Por ejemplo, una sal de acido de un compuesto que contiene una amina u otro grupo basico puede obtenerse haciendo reaccionar el compuesto con un acido organico o inorganico adecuado, dando como resultado formas de sal anionicas farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de sales anionicas incluyen las sales de acetato, bencenosulfonato, benzoato, bicarbonato, bitartrato, bromuro, edetato de calcio, camsilato, carbonato, cloruro, citrato, diclorhidrato, edetato, edisilato, estolato, esilato, fumarato, gliceptato, gluconato, glutamato, glicolilarsanilato, hexilresorcinato, bromhidrato, clorhidrato, hidroxinaftoato, yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, malato, maleato, mandelato, mesilato, metilsulfato, mucato, napsilato, nitrato, pamoato, pantotenato, fosfato/difosfato, poligalacturonato, salicilato, estearato, subacetato, succinato, sulfato, tanato, tartrato, teoclato, tosilato, trietiyoduro y trifluoroacetato.
Las sales de los compuestos que contienen un grupo funcional acido se pueden preparar mediante la reaccion con una base adecuada. Dicha sal farmaceuticamente aceptable puede prepararse con una base que proporcione un cation farmaceuticamente aceptable, que incluye sales de metal alcalino (especialmente sodio y potasio), sales de metal alcalinoterreo (especialmente calcio y magnesio), sales de aluminio y sales de amonio, asf como sales preparadas a partir de bases organicas fisiologicamente aceptables, tales como trimetilamina, trietilamina, morfolina, piridina, piperidina, picolina, diciclohexilamina, N,N-dibenciletilendiamina, 2-hidroxietilamina, bis-(2-hidroxietil)amina, tri-(2-hidroxietil)amina, procafna, dibencilpiperidina, deshidroabietilamina, N,N-bisdeshidroabietilamina, glucamina, N- metilglucamina, colidina, quinina, quinolina, y aminoacidos basicos, tales como lisina y arginina.
Los compuestos desvelados pueden administrarse al sujeto junto con un vehfculo farmaceutico aceptable como parte de una composicion farmaceutica. La formulacion del compuesto que se va a administrar variara de acuerdo con la via de administracion seleccionada (por ejemplo, solucion, emulsion, capsula). Los vehfculos farmaceuticos adecuados pueden contener ingredientes inertes que no interactuan con el compuesto. Pueden emplearse tecnicas de formulacion farmaceutica convencionales, tales como las descritas en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, PA. Los vehfculos farmaceuticos adecuados para la administracion parenteral
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incluyen, por ejemplo, agua esteril, solucion salina fisiologica, solucion salina bacteriostatica (solucion salina que contiene aproximadamente el 0,9 % mg/ml de alcohol bendlico), solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Hank, lactato de Ringer y similares. Los metodos para encapsular composiciones (tales como en el recubrimiento de gelatina dura o ciclodextrano) se conocen en la tecnica (Baker, et a/.,"Controlled Release of Biological Active Agents", John Wiley and Sons, 1986).
Como se usa en el presente documento, la expresion "un trastorno sensible a la modulacion del receptor de la melanocortina-4" se refiere a cualquier trastorno que pueda tratarse mediante la activacion (agonizacion) o inhibicion de MC4R. A continuacion, se describiran en detalle ejemplos de dichos trastornos.
Como se usa en el presente documento, el termino "modulador" se refiere a compuestos que interaction con el receptor diana y afectan a su funcion biologica. Los ejemplos de moduladores incluyen agonistas completos, agonistas parciales, antagonistas neutros y agonistas inversos.
Como se usa en el presente documento, el termino "agonista" se refiere a cualquier compuesto qmmico, ya sea natural o sintetico, que, al interaccionar con (por ejemplo, unirse a) su diana, en el presente documento, MC4R, eleva la actividad de senalizacion de MC4R por encima de su nivel basal. Un agonista puede ser un superagonista (es decir, un compuesto que es capaz de producir una respuesta maxima superior a la del agonista endogeno hacia el receptor diana, y por lo tanto, tiene una eficacia superior al 100 %), un agonista completo (es decir, un compuesto que genera una respuesta maxima tras la ocupacion y activacion del receptor) o un agonista parcial (es decir, un compuesto que puede activar los receptores, pero que no puede generar la respuesta maxima del sistema receptor). A continuacion, se describiran en detalle ejemplos de agonistas de MC4R.
Como se usa en el presente documento, el termino "antagonista" se refiere a cualquier compuesto qmmico que, al interaccionar con (por ejemplo, unirse a) su diana, en el presente documento, MC4R, bloquea, de una manera dependiente de la dosis, la actividad de senalizacion de un compuesto agonista con el MC4R.
Como se usa en el presente documento, el termino "agonista inverso" se refiere a cualquier compuesto qmmico que, al interaccionar con (por ejemplo, unirse a) su diana, en el presente documento, MC4R, disminuye, de una manera dependiente de la dosis, el nivel basal de la actividad de senalizacion del MC4R.
Como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un agente terapeutico o una combinacion de agentes terapeuticos que es terapeutica o profilacticamente suficiente para tratar el trastorno diana. Los ejemplos de cantidades eficaces normalmente vanan entre aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal. Un intervalo ilustrativo es de aproximadamente 0,0001 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg. Por ejemplo, la cantidad eficaz puede variar de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg. En otros ejemplos, el intervalo puede ser de aproximadamente 0,0001 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. En otros ejemplos mas, las cantidades eficaces vanan de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal a 50 mg/kg de peso corporal, o de 0,01 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal.
Como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" se refiere a un mairnfero, preferentemente, un ser humano, pero tambien puede significar un animal que necesite tratamiento veterinario, por ejemplo, animales de compafna (por ejemplo, perros, gatos, y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).
Como se usa en el presente documento, la expresion "segundo agente" incluye cualquier principio farmaceutico activo (API) que, en combinacion con un peptido descrito en el presente documento, potencia el efecto terapeutico producido por un peptido descrito en el presente documento solo o muestra sinergia con un peptido descrito en el presente documento (es decir, muestra un efecto combinado que es superior al efecto aditivo). Como se usa en el presente documento, "un efecto terapeutico potenciado" incluye un perfil terapeutico mejorado distinto de la sinergia. Los ejemplos de efectos terapeuticos mejorados incluyen una dosis eficaz reducida de un peptido descrito en el presente documento, una ventana terapeutica prolongada de un peptido descrito en el presente documento, etc. Se pueden administrar uno o mas segundos agentes. A continuacion, se describiran detalladamente los ejemplos de segundos agentes.
Un segundo agente puede administrarse antes, simultaneamente con o despues de la administracion de un peptido descrito en el presente documento. Por consiguiente, un peptido descrito en el presente documento y un segundo agente pueden administrarse juntos en una sola formulacion o pueden administrarse en formulaciones separadas, por ejemplo, de forma simultanea o secuencial. Por ejemplo, si un peptido descrito en el presente documento y un segundo agente se administran secuencialmente en composiciones separadas, un peptido descrito en el presente documento puede administrarse antes o despues de un segundo agente terapeutico. Ademas, un peptido descrito en el presente documento y un segundo agente pueden o no administrarse en pautas posologicas similares. Por ejemplo, un peptido descrito en el presente documento y un segundo agente terapeutico pueden tener semividas diferentes y/o actuar en diferentes escalas de tiempo, de manera que un peptido descrito en el presente documento se administre con mayor frecuencia que el segundo agente terapeutico o viceversa. Finalmente, un peptido descrito en el presente documento
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puede ir seguido de un segundo agente, que mejore aun mas la eficacia terapeutica, como resultado de la aplicacion consecutiva de ambos agentes terapeuticos. Un peptido descrito en el presente documento o un segundo agente pueden administrarse de forma aguda o cronica.
Se puede lograr una cantidad eficaz en los metodos o las composiciones administrando conjuntamente una primera cantidad de un compuesto que tenga una actividad moduladora de MC4R o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo y una segunda cantidad de al menos un segundo agente. En un caso, un peptido descrito en el presente documento y un segundo agente se administran cada uno en una cantidad eficaz respectiva (es decir, cada uno en una cantidad que serfa terapeuticamente eficaz si se administrara sola). En otro caso, un peptido descrito en el presente documento y un segundo agente se administran cada uno en una cantidad que por si sola no proporciona un efecto terapeutico (una dosis subterapeutica). En otro caso mas, un peptido descrito en el presente documento puede administrarse en una cantidad eficaz, mientras que el segundo agente se administra en una dosis subterapeutica. En otro caso mas, un peptido descrito en el presente documento puede administrarse a una dosis subterapeutica, mientras que el segundo agente se administra en una cantidad eficaz. Una combinacion de un peptido descrito en el presente documento y un segundo agente presenta un efecto terapeutico potenciado o una sinergia en comparacion con un peptido descrito en el presente documento o un segundo agente solo.
La presencia de un efecto sinergico se puede determinar usando metodos adecuados para evaluar la interaccion del farmaco. Los metodos adecuados incluyen, por ejemplo, la ecuacion de Sigmoid-Emax (Holford, N. H. G. y Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)), la ecuacion de aditividad de Loewe (Loewe, S. y Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol. Pharmacol. 114: 313-326 (1926)) y la ecuacion de efecto de la mediana (Chou, T. C. y Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)). Cada ecuacion referida anteriormente se puede aplicar con los datos experimentales para generar el grafico correspondiente para contribuir a la evaluacion de los efectos de la combinacion de farmacos. Los correspondientes graficos asociados a las ecuaciones referidas anteriormente son la curva de concentracion- efecto, curva de isobolograma y la curva de fndice de combinacion, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, "tratar" incluye lograr, retrasar, parcial o sustancialmente, inhibir o prevenir la progresion de las indicaciones clfnicas relacionadas con el trastorno diana. Por ejemplo, “tratar” incluye lograr, parcial o sustancialmente, uno o mas de los siguientes resultados: la reduccion parcial o total del peso corporal (medido, por ejemplo, segun el fndice de masa corporal, IMC); la mejora de un sfntoma o indicador clfnico asociado con la obesidad, tal como la diabetes de tipo II, afeccion prediabetica, nivel de hemoglobina en sangre A1C (Hb1Ac) superior al 6 %, hiperinsulimenia, hiperlipidemia, insensibilidad a la insulina, intolerancia a la glucosa, etc.; retraso, Inhibicion o prevencion de la progresion de la obesidad y de la indicacion relacionada con la obesidad; retraso parcial o total, inhibicion o prevencion de la aparicion o del desarrollo de la obesidad o de la indicacion relacionada con la obesidad. El retraso, la inhibicion o la prevencion de la progresion de la obesidad incluyen, por ejemplo, el retraso, la inhibicion o la prevencion de la progresion de un sujeto que tiene un peso normal a la obesidad. El termino "tratar" incluye ademas reducir parcial o totalmente el riesgo de enfermedad arterial coronaria, apoplejfa y diabetes (por ejemplo, de tipo 2) asociadas con el sfndrome metabolico, asf como mejorar un sfntoma clfnico o signos clfnicos del sfndrome metabolico asociados con el sfndrome metabolico, tales como uno cualquiera o mas de los cinco indicadores mencionados anteriormente. Por ejemplo, el termino "tratar" incluye retrasar, inhibir o prevenir la progresion de los parametros asociados con el sfndrome metabolico, incluyendo la resistencia a la insulina, el aclaramiento de la glucosa y los parametros de la enfermedad cardiovascular, incluyendo la frecuencia cardfaca y la presion arterial, enfermedad de las articulaciones, inflamacion, apnea del sueno, atracones y otros trastornos de la alimentacion como la bulimia, la terapia de apoyo para la cirugfa de perdida de peso y la terapia de apoyo para perder peso antes de la cirugfa ortopedica. "Tratamiento profilactico" se refiere al tratamiento antes de la aparicion de los sfntomas clfnicos de un trastorno diana para prevenir, inhibir o reducir su aparicion.
Trastorno sensible a la modulacion del MC4R
Los ejemplos de trastornos sensibles a la modulacion de MC4R incluyen enfermedades inflamatorias agudas y cronicas tales como inflamacion general, enfermedad inflamatoria del intestino, inflamacion cerebral, sepsis y choque septico; enfermedades con un componente autoinmunitario tales como la artritis reumatoide, la artritis gotosa y la esclerosis multiple; enfermedades metabolicas y afecciones medicas acompanadas del aumento de peso, tales como obesidad, trastornos de la alimentacion y sfndrome de Prader-Willi; enfermedades metabolicas y afecciones medicas acompanadas de perdida de peso, tales como anorexia, bulimia, desgaste por SIDA, caquexia, caquexia por cancer y desgaste en ancianos debiles; diabetes, y afecciones relacionadas con la diabetes y complicaciones de la diabetes, tales como retinopatfa; proliferacion neoplasica tal como cancer de piel y cancer de prostata; afecciones medicas reproductivas o sexuales tales como endometriosis y hemorragia uterina en la mujer, disfuncion sexual, disfuncion erectil y disminucion de la respuesta sexual en la mujer; enfermedades o afecciones debidas al tratamiento del o acceso al organismo, tales como el rechazo del trasplante de organo, lesion por isquemia y reperfusion, tratamiento de la lesion de la medula espinal y la aceleracion de la curacion de las heridas, asf como la perdida de peso causada por la quimioterapia, radioterapia, inmovilizacion temporal o permanente, o dialisis; enfermedades o afecciones cardiovasculares tales como choque hemorragico, choque cardiogenico, choque hipovolemico, trastornos cardiovasculares y caquexia cardfaca; enfermedades o afecciones pulmonares tales como sfndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, asma y fibrosis pulmonar; para potenciar la tolerancia inmunitaria y combatir los ataques al sistema inmunitario, tales como los relacionados con ciertas alergias o el rechazo
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de trasplante de organo; tratamiento de enfermedades y afecciones dermatologicas tales como psoriasis, agotamiento de la pigmentacion de la piel, acne, formacion de queloides y cancer de piel; afecciones y trastornos del comportamiento, del sistema nervioso central o neuronales, tales como ansiedad, depresion, memoria y disfuncion de la memoria, modulacion de la percepcion del dolor y tratamiento del dolor neuropatico; afecciones y enfermedades asociadas con el consumo de alcohol, abuso del alcohol y/o alcoholismo; y afecciones o enfermedades renales, tales como el tratamiento de la caquexia renal o la natriuresis. Otros ejemplos adicionales incluyen actividades normalizadoras u homeostaticas en un sujeto, incluyendo la liberacion de tiroxina, la sfntesis y liberacion de aldosterona, la temperatura corporal, la presion arterial, la frecuencia cardfaca, el tono vascular, el flujo arterial cerebral, los niveles de glucosa en sangre, el metabolismo oseo, la formacion o el desarrollo oseo, el peso de los ovarios, el desarrollo de la placenta, la secrecion de prolactina y FSH, el crecimiento fetal intrauterino, el parto, la espermatogenesis, la secrecion de sebo y feromonas, la neuroproteccion y el crecimiento nervioso, asf como modulacion de la motivacion, del aprendizaje y de otras conductas. Otros ejemplos incluyen atracones, bulimia u otros trastornos de la alimentacion.
Los trastornos sensibles a la modulacion del receptor MC4R pueden ser diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, obesidad, resistencia a la insulina, sfndrome metabolico, enfermedad cardiovascular o desequilibrio de lipoprotefna de baja densidad/lipoprotefna de alta densidad/trigliceridos, enfermedad del hfgado graso no alcoholico y trastornos de abuso de sustancias.
Los trastornos sensibles a la modulacion del receptor MC4R pueden ser diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, obesidad, resistencia a la insulina y sfndrome metabolico.
Obesidad
Como se usa en el presente documento, el termino "obeso" se refiere a un sujeto que tiene un fndice de masa corporal (IMC) de aproximadamente 30 kg/m2 o superior, por ejemplo, un IMC de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 kg/m2 o superior. En realizaciones particulares, un sujeto obeso tiene un IMC dentro de los intervalos definidos como "obeso" por el Centro para el Control de Enfermedades. Vease, URL
http://www.cdc.gov/obesity/defining.html, ultima consulta el 28 de octubre de 2011. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un adulto que tiene un IMC >= 30,0 kg/m2 es obeso.
Diabetes y trastornos relacionados
Los sujetos que se van a tratar mediante los metodos descritos pueden tener o tienen un mayor riesgo de desarrollar trastornos relacionados con la diabetes. "Trastornos relacionados con la diabetes" se refiere a la diabetes (que incluye el tipo 1 (OMIM 222100) y el tipo 2 (OMIM 125853)), la resistencia a la insulina y el sfndrome metabolico.
El sujeto que se va a tratar puede tener diabetes (tipo 1 o tipo 2), resistencia a la insulina o sfndrome metabolico. El trastorno puede ser diabetes, por ejemplo, diabetes de tipo 2. El sujeto puede tener o esta en mayor riesgo de desarrollar, diabetes de tipo 2 segun lo definido por la Organizacion Mundial de la Salud y la Federacion Internacional de la Diabetes en "Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycaemia", publicado en 2006. Un sujeto diabetico puede presentar una glucosa plasmatica en ayunas de >= 126 mg/dl o una glucosa plasmatica a las 2 horas (2 horas despues de la administracion oral de 75 glucosa) >= 200 mg/dl. Un sujeto diabetico o prediabetico puede presentar niveles elevados de hemoglobina glucosilada, por ejemplo, superiores al 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6 %, o mas de hemoglobina total. Un sujeto diabetico o prediabetico puede ser identificado o caracterizado ademas por polimorfismos geneticos (incluyendo, por ejemplo, polimorfismos que conducen a niveles de expresion alterados, por ejemplo, niveles de expresion elevados o reducidos y/o variaciones en secuencias codificantes) en o cerca de uno o mas de los genes de la siguiente T abla 1:
Tabla 1
Localizacion
Gen/locus N.° de OMIM Localizacion Gen/locus N.° de OMIM
2q24.1
GPD2 138430 11 p15.1 ABCC8 600509
2q31.3
NEUROD1 601724 11p11.2 MAPK8IP1 604641
2q36.3
IRS1 147545 12q24.31 HNF1A 142410
3p25.2
PPARG 601487 13q 12.2 IPF1 600733
3q27.2
IGF2BP2 608289 13q34 IRS2 600797
4p16.1
WFS1 606201 15q21.3 LIPC 151670
5q34-q35.2
NIDDM4 608036 17p13.1 SLC2A4 138190
6p22.3
CDKAL1 611259 17q 12 HNF1B 189907
6p21.31
HMGA1 600701 17q25.3 GCGR 138033
6q23.2
ENPP1 173335 19p13.2 RETN 605565
7p13
GCK 138079 19p13.2 RETN 605565
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Localizacion
Gen/locus N.° de OMIM Localizacion Gen/locus N.° de OMIM
7q32.1
PAX4 167413 19q 13.2 AKT2 164731
8q24.11
SLC30A8 611145 20q 12-q 13.1 NIDDM3 603694
10q25.2-q25.3
TCF7L2 602228 20q13.12 HNF4A 600281
11 p15.1
KCNJ11 600937 20q13.13 PTPN1 176885
Los genes adicionales que se pueden usar para identificar o caracterizar mejor a los sujetos que se van a tratar mediante los metodos descritos incluyen FTO (OMIM 610966), JAZF1 (OMIM 606246) y HHEX (OMIM 604420).
Un sujeto que se va a tratar mediante los metodos descritos puede tener diabetes de tipo I. Un sujeto con diabetes de tipo I se caracteriza en virtud de un ensayo del peptido C, por ejemplo, niveles de peptido C en ayunas inferiores a aproximadamente 1,0 nmol/l, por ejemplo, inferiores a 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4 nmol/l, o inferiores, por ejemplo, inferiores a 0,33, 0,25, 0,2 o 0,1 nmol/l. Los niveles de peptido C se miden tras la exposicion oral a la glucosa (2 horas despues de la administracion oral de 75 g de glucosa) y se detecta un aumento inferior a 0,54 nmol/l, por ejemplo, inferior a 0,50, 0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,25, 0,20, 0,15 o 0,10 nmol/l. La glucosa en ayunas alterada (110125 mg/dl) o la tolerancia a la glucosa alterada (glucosa a las 2 h tras la exposicion de 75 g: 140-199 mg/dl) pueden usarse para identificar o caracterizar mejor la funcion reducida de las celulas beta en los sujetos con diabetes de tipo 1. Los diabeticos de tipo 1 pueden identificarse o caracterizarse mejor por la presencia de autoanticuerpos contra antfgenos de celulas de los islotes y/o insulina, por ejemplo, autoanticuerpos dirigidos a 65 kDa de gAd (OMIM 138275) y/o molecula IA-2 relacionada con la fosfatasa.
Resistencia a la insulina
En algunos casos, el trastorno es la "resistencia a la insulina", que puede identificarse mediante cualquier medio conocido en la tecnica, y se caracteriza por una capacidad reducida de la insulina para disminuir los niveles de glucosa en sangre. La resistencia a la insulina puede identificarse o caracterizarse mejor por la presencia de uno o mas polimorfismos (incluyendo, por ejemplo, polimorfismos que conducen a niveles de expresion alterados, por ejemplo, niveles de expresion elevados o reducidos, asf como variantes de secuencia codificante de productos genicos, tales como protefnas) en uno o mas de los siguientes genes: RETN, PTPN1, TCF1 (OMIM 142410; vease, por ejemplo, polimorfismo 0011), PPP1R3A (OMIM 600917; vease, por ejemplo, polimorfismos 0001, 0003), PTPN1 (oMiM 176885; vease, por ejemplo, polimorfismo 0001), ENPP1 (OMiM 173335; vease, por ejemplo, polimorfismo 0006), IRS1 (OMIM 147545; vease, por ejemplo, polimorfismo 0002), EPHX2 (OMIM 132811; vease, por ejemplo, polimorfismo 0001), leptina (OMIM 164160vease, por ejemplo,polimorfismos 0001 y 0002), receptor de leptina (OMIM 601007, vease, por ejemplo, polimorfismos 0001, 0002, 0004 y 0005) o el receptor de insulina (INSR, OMIM 147670, vease, por ejemplo, polimorfismo 0001-0037).
Sfndrome metabolico
En algunos casos, el trastorno es el sfndrome metabolico. Como se usa en el presente documento, la expresion "sfndrome metabolico" se refiere a un grupo de sfntomas que ocurren juntos y aumentan el riesgo de la enfermedad arterial coronaria, apoplejfa y diabetes de tipo 2. De acuerdo la Asociacion Americana del Corazon y el Instituto Nacional del Corazon, los Pulmones y la Sangre, el sfndrome metabolico tambien conocido como Sfndrome X) esta presente si un sujeto tiene tres o mas de los siguientes signos:
1) presion arterial igual o superior a 130/85 mmHg;
2) azucar en sangre en ayunas (glucosa) igual o superior a 100 mg/dl;
3) perfmetro de la cintura (longitud alrededor de la cintura):
- varones: 101,6 cm (40 pulgadas) o mas;
- mujeres: 88,9 cm (35 pulgadas) o mas;
4) colesterol HDL bajo:
- varones - inferior a 40 mg/dl;
- mujeres- inferior a 50 mg/dl;
5) trigliceridos igual o superior a 150 mg/dl.
El sfndrome metabolico se puede diagnosticar midiendo la presion arterial del sujeto, el nivel de glucosa en sangre, el nivel de colesterol HDL, el nivel de colesterol LDL, el nivel de colesterol total y el nivel de trigliceridos.
En algunos casos, el sujeto tiene obesidad central (perfmetro de la cintura >= 80 cm para las mujeres; >= 90 cm para los varones asiaticos, incluyendo las etnias centroamericanas y sudamericanas, y >= 94 cm para todos los demas varones), IMC >30 kg/m2, trigliceridos elevados (>= 150 mg/dl, o tratamiento especffico para esta anomalfa lipfdica),
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colesterol HDL reducido (< 40 mg/dl en varones, < 50 mg/dl en mujeres o tratamiento especffico para esta anomalfa lipfdica), presion arterial elevada (PAS >= 130 mmHg o PAD >= 85 mmHg o tratamiento de la hipertension diagnosticada previamente) o glucosa plasmatica elevada en ayunas (GPA >= 100 mg/dl o diagnostico de diabetes de tipo 2 previo), incluyendo combinaciones de los mismos. El sujeto que se va a tratar mediante los metodos descritos puede tener o tiene un mayor riesgo de padecer sfndrome metabolico, segun lo definido por la Federacion Internacional de la Diabetes en "The IDF consensus worldwide definition of the metabolic syndrome", publicado en 2006, es decir, el sujeto tiene una obesidad central (como se ha descrito anteriormente y/o un IMC > 30 kg/m2) Y dos cualquiera de entre trigliceridos elevados, colesterol HDL reducido, presion arterial elevada o glucosa plasmatica en ayunas elevada. En algunos casos, el sfndrome metabolico se caracteriza, o se caracteriza mejor, por la presencia de una mutacion en un locus seleccionado entre 3q27 (vease, por ejemplo, OMIM 605552) y/o 17p12 (vease, por ejemplo, OMIM 605572) en el sujeto.
Trastornos causados por mutaciones de MC4R
La presente invencion se refiere a un polipeptido aislado para su uso en un metodo para tratar un trastorno caracterizado por una respuesta atenuada de MC4R hacia la hormona estimulante de la a-melanocortina (a-MSH). El metodo comprende administrar una cantidad eficaz de un agonista del receptor de la melanocortina-4 (MC4R). En algunos casos, el sujeto es un portador heterocigotico de una mutacion de MC4R que genera la respuesta atenuada de MC4R a la hormona estimulante de la a-melanocortina (a-MSH). Debido a que los portadores heterocigoticos conservan la capacidad de responder al ligando natural de MC4R, el tratamiento de los trastornos asociados con MC4R en portadores heterocigoticos mediante la administracion de un agonista de MC4R no se basa en el conocimiento del tipo de mutacion de MC4R.
En algunos casos, el trastorno es la obesidad, por ejemplo, la obesidad asociada a MC4R. El trastorno tambien puede ser sfndrome metabolico.
El gen MC4R humano (hMC4R) es una protefna bien caracterizada codificada por una secuencia genomica que tiene el numero de acceso del GenBank CH471077. Las mutaciones en el receptor de MC4R son una causa asociada de obesidad infantil grave. Se ha observado que la frecuencia en los portadores de las mutaciones de MC4R en una poblacion obesa de inicio en la juventud es de alrededor el 2,5 %, con la frecuencia mas alta del 6 % entre los ninos con obesidad grave. Los seres humanos con mutaciones de MC4R muestran un fenotipo mas o menos similar al descrito para los ratones con mutaciones en el gen del receptor de MC4. Esas personas muestran hiperfagia clara, hiperinsulinemia, aumento de la masa grasa, acompanada de masa corporal magra, densidad mineral osea y tasa de crecimiento lineal, sin cambios en los niveles de cortisol, gonadotropina, tiroides y esteroides sexuales. En contraste con la eliminacion del receptor de MC4, la hiperfagia y la hiperinsulinemia tienden a disminuir con la edad en los sujetos humanos. Al igual que en los ratones con desactivacion de MC4R, el fenotipo en los portadores heterocigoticos es intermedio en comparacion con los portadores homocigoticos. La hiperfagia presentada observada tras una comida de ensayo es menos grave que la observada en personas con deficiencia de leptina. La gravedad de la disfuncion del receptor de MC4 observada en ensayos in vitro puede predecir la cantidad de alimento ingerido en una comida de ensayo por el sujeto que porta esa mutacion en particular, y se correlaciona con el inicio y la gravedad del fenotipo obeso. Se han asociado al menos 90 mutaciones diferentes del receptor de MC4 con la obesidad, y es probable que se descubran mutaciones adicionales en el receptor de MC4, lo que conduce a un fenotipo de obesidad similar.
Los ejemplos de las mutaciones de MC4R que causan obesidad en seres humanos se describen en Farooqi et al., The Journal of Clinical Investigation, julio de 2000, vol. 106 (2), pag. 271-279 y Vaisse et al., The Journal of Clinical Investigation, julio de 2000, vol. 106(2), pag. 253-262.
Otras mutaciones adicionales que potencialmente causan obesidad en los seres humanos incluyen: R18H, R18L, S36Y, P48S, V50M, F51L, E61K, I69T, D90N, S94R, G98R, I121T, A154D, Y157S, W174C, G181D, F202L, A219 V, I226T, G231S, G238D, N240S, C271R, S295P, P299L, E308K, I317V, L325F y 750DelGA, segun lo descrito en Xiang et al., "Pharmacological characterization of 30 human melanocortin-4 receptor polymorphisms with the endogenous proopiomelanocortin-derived agonists, synthetic agonists, and the endogenous agouti-related protein antagonist". Biochemistry, 8 de junio de 2010; 49(22):4583-600.
Otros ejemplos de mutaciones que potencialmente causan obesidad en los seres humanos son las enumeradas en la “Online Mendelian Inheritance” (OMIM), una base de datos de genes y trastornos geneticos humanos, con el numero de acceso 155541 (MC4R) (mas exactamente, n.° de acceso 155541.0001-155541.0023) en la URL
http://omim.org/entry/155541. Los ejemplos representativos incluyen 4-BP DEL, NT631; 4-BP INS, NT732; TYR35TER; ASP37VAL; SER58CYS; ILE102SER; ASN274SER; 1-BP INS, 112A; 4-BP DEL, 211CTCT; ILE125LYS; ALA175THR; ILE316SER; TYR287TER; ASN97ASP; 15-BP DEL (codones delta88-92); y SER127LEU.
En algunos casos, la mutacion de MC4R produce la retencion de la actividad de senalizacion de MC4R.
Las mutaciones en la secuencia genomica que codifica MC4R pueden detectarse mediante los metodos que son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la secuencia genomica puede clonarse usando cebadores de nucleotidos, tales como, por ejemplo, los cebadores descritos en Farooqi et al., The Journal of Clinical Investigation,
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julio de 2000, vol. 106 (2), pag. 271-279 y Vaisse et al., The Journal of Clinical Investigation, julio de 2000, vol. 106(2), pag. 253-262, y la secuencia clonada analizada usando secuenciadores y software disponibles en el mercado.
La actividad de MC4R puede medirse mediante los metodos conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, se pueden transfectar celulas transitoriamente con el ADN de MC4R clonado, ponerse en contacto las celulas transfectadas con un agonista de MC4R (por ejemplo, a-MSH), y medirse el nivel intracelular de AMPc, el mensajero secundario de MC4R, mediante un ensayo electroquimiluminiscente descrito, por ejemplo, en Roubert et al., Journal of Endocrinology (2010) 207, pag. 177-183. Se puede determinar una reduccion en la senalizacion de MC4R comparando el nivel intracelular de AMPc producido en respuesta a un agonista dado por un MC4R de tipo silvestre con el producido por un MC4R mutante.
Los moduladores de MC4R (por ejemplo, agonistas) tambien se pueden usar para tratar a los pacientes que padezcan otros trastornos, tales como la disponibilidad reducida de los agonistas naturales del MC4R. El ejemplo de dichos pacientes incluye individuos heterocigoticos u homocigoticos para mutaciones en los genes importantes en la via dependiente de la leptina (“Nature Clinical Practice Endocrinology and Metabolism”, 2006; 2; 6; 318 y NEng J Med: 2007; 356; 3; 237), el procesamiento de la proopiomelanocortina (Nature Genetics, 1998, 155; Cell Metabolism, 2006; 3; 135; Annals Acad Med, 2009, 38; 1; 34), o mutaciones en los genes que codifican las prohormonas convertasas.
Modos de administracion
La administracion de un compuesto o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, o una composicion que comprende un compuesto o una sal farmaceutica de un compuesto de la invencion util para poner en practica los metodos descritos en el presente documento, puede ser continua, por hora, cuatro veces al dfa, tres veces al dfa, dos veces al dfa, una vez al dfa, una vez cada dos dfas, dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes o una vez cada dos meses, o mas prolongada, o alguna otra pauta posologica intermitente.
Los ejemplos de administracion de un compuesto o de una composicion que comprende un compuesto o una sal farmaceutica de un compuesto de la invencion incluyen la administracion periferica. Los ejemplos de la administracion periferica incluyen la forma de administracion oral, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, rectal, transdermica, bucal, sublingual, inhalacion, pulmonar o intranasal.
Terapia de combinacion
Un peptido descrito en el presente documento puede usarse para el tratamiento de cualquiera de los trastornos sensibles a la modulacion de MC4R, mediante la administracion en combinacion con uno o mas otros compuestos farmaceuticamente activos ("segundo agente"). Dicha administracion de combinacion puede ser por medio de una sola forma farmaceutica que incluya uno o mas peptidos descritos en el presente documento y uno o mas segundos agentes, dichas formas farmaceuticas individuales incluyen un comprimido, una capsula, un pulverizado, un polvo de inhalacion, un lfquido inyectable o similares. Como alternativa, la administracion de la combinacion puede ser por medio de la administracion de dos formas farmaceuticas diferentes, conteniendo una forma farmaceutica uno o mas peptidos descritos en el presente documento, e incluyendo la otra forma farmaceutica uno o mas segundos agentes. En este caso, las formas farmaceuticas pueden ser iguales o diferentes. Sin el deseo de limitar las terapias de combinacion, lo siguiente ilustra ciertas terapias de combinacion que pueden emplearse.
Un peptido descrito en el presente documento puede combinarse con uno o mas segundos agentes utiles en el tratamiento de diversos trastornos relacionados con el peso y la alimentacion, tales como la obesidad y/o el sobrepeso. En particular, un segundo agente puede ser un farmaco antiobesidad que afecte el gasto de energfa, la glucolisis, la gluconeogenesis, la glucogenolisis, la lipolisis, la lipogenesis, la absorcion de grasa, el almacenamiento de grasa, la excrecion de grasa, el hambre y/o la saciedad y/o los mecanismos de deseo, el apetito/la motivacion, la ingesta de alimentos o la motilidad gastrointestinal. Los farmacos que reducen el consumo de energfa incluyen, en parte, diversos agentes farmacologicos, conocidos como farmacos anorexicos, que se usan como adyuvantes de la terapia conductual en los programas de reduccion de peso.
En general, una dosis total de los agentes o medicamentos para el control de la obesidad, cuando se usan en combinacion con uno o mas peptidos descritos en el presente documento puede variar de 0,1 a 3.000 mg/dfa, preferentemente de aproximadamente 1 a 1.000 mg/dfa, y mas preferentemente de aproximadamente 1 a 200 mg/dfa en una o dos o cuatro dosis divididas. La dosis exacta, sin embargo, es determinada por el medico asistente, y depende de factores tales como la potencia del compuesto administrado, la edad, el peso, el estado y la respuesta del paciente.
Uno o mas peptidos descritos en el presente documento pueden combinarse con uno o mas segundos agentes utiles en el tratamiento de la diabetes.
Uno o mas peptidos descritos en el presente documento se pueden combinar ademas o alternativamente con uno o mas segundos agentes utiles en el tratamiento de enfermedades, trastornos y/o afecciones asociados con la obesidad y/o el sobrepeso, tales como la resistencia a la insulina; la tolerancia alterada a la glucosa; la diabetes de tipo 2; el sfndrome metabolico; la dislipidemia (incluyendo hiperlipidemia); la hipertension; los trastornos del corazon (por
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ejemplo, enfermedad coronaria, infarto de miocardio); trastornos cardiovasculares; enfermedad del hfgado graso no alcoholico (incluyendo la esteatohepatitis no alcoholica); trastornos de las articulaciones (incluyendo la osteoartritis secundaria); reflujo gastroesofagico; apnea del sueno; aterosclerosis; apoplejfa; enfermedades macro y microvasculares; esteatosis (por ejemplo, en el hfgado); calculos biliares; y trastornos de la vesfcula biliar.
Segundo agente
Los uno o mas segundos agentes se seleccionan, por ejemplo, entre: insulina y analogos de insulina;
secretagogos de insulina, incluyendo sulfonilureas (por ejemplo, glipizida) y reguladores de glucosa prandiales (a veces denominados "secretagogos de accion corta"), tales como las meglitinidas (por ejemplo, repaglinida y nateglinida);
los agentes que mejoran la accion de la incretina: una incretina, un mimetico de la incretina, agentes que mejoran la funcion de la incretina, por ejemplo, GLP-1, GIP; agonistas de GLP-1 (por ejemplo, exenatida y liraglutida (VICTOZA)), inhibidores de la DPP-4 (por ejemplo, vildagliptina, saxagliptina y sitagliptina); agentes sensibilizantes a la insulina, incluyendo los agonistas gamma del receptor activado por el proliferador de peroxisomas (PPARy), tales como las tiazolidindionas (por ejemplo, pioglitazona y rosiglitazona), y agentes con cualquier combinacion de actividad PPAR alfa, gamma y delta;
agentes que modulan el equilibrio hepatico de la glucosa, por ejemplo, biguanidas (por ejemplo, metformina), inhibidores de fructosa 1,6-bisfosfatasa, inhibidores de glicogeno fosforilasa, inhibidores de la glicogeno sintasa quinasa y activadores de la glucoquinasa;
agentes disenados para reducir/ralentizar la absorcion de glucosa del intestino, tales como los inhibidores de la alfa-glucosidasa (por ejemplo, miglitol y acarbosa);
agentes que antagonizan las acciones de o reducen la secrecion del glucagon, tales como los analogos de amilina (por ejemplo, pramlintida);
agentes que evitan la reabsorcion de la glucosa por el rinon, tales como los inhibidores del transportador de glucosa dependiente del sodio 2 (SGLT-2) (por ejemplo, dapagliflozina);
agentes disenados para tratar las complicaciones de la hiperglucemia prolongada, tales como los inhibidores de la aldosa reductasa (por ejemplo, epalrestat y ranirestat);
agentes usados para tratar las complicaciones relacionadas con las microangiopatfas;
agentes antidislipidemicos, tales como los inhibidores de la HMG-CoA reductasa (estatinas, por ejemplo,
rosuvastatina) y otros agentes reductores del colesterol;
agonistas de PPARa (fibratos, por ejemplo, gemfibrozilo y fenofibrato);
secuestrantes de acidos biliares (por ejemplo, colestiramina);
inhibidores de la absorcion del colesterol (por ejemplo, esteroles vegetales (es decir, fitosteroles), inhibidores sinteticos);
inhibidores de la protefna de transferencia de esteres de colesterol (CETP); inhibidores del sistema de transporte
de acido biliar ileal (inhibidores de IBAT);
resinas de union a acidos biliares;
acido nicotfnico (niacina) y sus analogos;
antioxidantes, tales como el probucol;
acidos grasos omega-3;
agentes antihipertensivos, incluyendo los antagonistas del receptor adrenergico, tales como los bloqueadores beta (por ejemplo, atenolol), los bloqueadores alfa (por ejemplo, doxazosina) y los bloqueadores alfa/beta mixtos (por ejemplo, labetalol);
agonistas del receptor adrenergico, incluyendo los agonistas alfa-2 (por ejemplo, clonidina); inhibidores de la enzima conversora de la angiotensina (ECA) (por ejemplo, lisinopril), bloqueadores de los canales de calcio, tales como dihidropiridinas (por ejemplo, nifedipina), fenilalquilaminas (por ejemplo, verapamilo) y benzotiazepinas (por ejemplo, diltiazem);
antagonistas del receptor de angiotensina II (por ejemplo, candesartan); antagonistas del receptor de aldosterona (por ejemplo, eplerenona); farmacos adrenergicos de accion central, tales como los agonistas alfa centrales (por ejemplo, clonidina); y agentes diureticos (por ejemplo, furosemida);
moduladores de la hemostasia, incluyendo los antitromboticos, tales como los activadores de la fibrinolisis; antagonistas de la trombina;
inhibidores del factor VIIa; anticoagulantes, tales como los antagonistas de la vitamina K (por ejemplo, warfarina), heparina y sus analogos de bajo peso molecular, los inhibidores del factor Xa y los inhibidores directos de la trombina (por ejemplo, argatroban); agentes antiplaquetarios, tales como inhibidores de la ciclooxigenasa (por ejemplo, aspirina), inhibidores del receptor de adenosina difosfato (ADP) (por ejemplo, clopidogrel), inhibidores de la fosfodiesterasa (por ejemplo, cilostazol), inhibidores de la glicoprotefna IIB/IIA (por ejemplo, tirofiban) e inhibidores de la reabsorcion de adenosina (por ejemplo, dipiridamol);
agentes antiobesidad, tales como supresores del apetito (por ejemplo, efedrina), incluyendo los agentes noradrenergicos (por ejemplo, fentermina) y agentes serotoninergicos (por ejemplo, sibutramina), inhibidores de la lipasa pancreatica (por ejemplo, orlistat), moduladores de la protefna de transferencia microsomal (MTP), moduladores de diacilglicerolactransferasa (DGAT) inhibidores y antagonistas del receptor cannabinoide (CB1) (por ejemplo, rimonabant);
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agentes modificadores del comportamiento de la alimentacion, tales como moduladores del receptor de orexina y
moduladores de la hormona concentradora de melanina (MCH);
moduladores del neuropeptido Y (NPY)/del receptor del NPY;
moduladores de la piruvato deshidrogenasa quinasa (PDK);
moduladores del receptor de serotonina;
moduladores de la leptina/del receptor de leptina;
moduladores de la ghrelina/del receptor de ghrelina;
un agente que potencia la funcion de los linfocitos beta;
un agente que estimula el gasto de energfa (por ejemplo, estimulantes beta-adrenergicos,
agonistas de UCP-1, moduladores y estimulantes de la grasa parda);
un agente que induce la lisis de los adipocitos (por ejemplo, un anticuerpo);
nicotina o una ayuda para la abstinencia de la nicotina;
estrogeno, un modulador natural o sintetico de un receptor de estrogeno;
un modulador del receptor p-opioide; y
agentes moduladores de la transmision de monoaminas, tales como los inhibidores selectivos de la reabsorcion de la serotonina (ISRS) (por ejemplo, fluoxetina), inhibidores de la reabsorcion de la noradrenalina (INNA), inhibidores de la reabsorcion de la noradrenalina-serotonina (IRSN), bloqueadores de la reabsorcion de monoaminas triples (por ejemplo, tesofensina) e inhibidores de la monoamina oxidasa (IMAO) (por ejemplo, toloxatona y amiflamina), o una de sus sales farmaceuticamente aceptables.
Un agonista de MC4R y un segundo agente pueden administrarse con la administracion simultanea, secuencial o separada de dietas muy bajas en calorfas (DMBC) o dietas bajas en calorfas (DBC).
Polipeptidos aislados de la presente divulgacion
Los polipeptidos aislados (por ejemplo, agonistas de MC4R) pueden ser los de Formula (I) o una de sus sales farmaceuticamente aceptables:
Un polipeptido aislado de la siguiente formula estructural (I):
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R1 - A1 - A2 - A3 - A4 - A5 - A6 - A7 - A8 - R2
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que:
R1 es H o un acilo C1-C6;
R2 es -NR3R4, u -OR5 en la que R3, R4, y R5 son cada uno independientemente H o un alquilo C1-C6;
A1 es un resto de aminoacido seleccionado entre Arg, Lys, Orn, His, Nle, Phe, Val, Leu, Trp, Tyr, Ala, Ser, Thr, Gln, Asn, Asp, Glu o TzAla; o
A1 es un resto seleccionado de un alquilo C1-C12 opcionalmente sustituido, un arilo C6-C18 opcionalmente sustituido, un heteroarilo C5-C18 opcionalmente sustituido, un aralquilo en el que la parte arilo es un arilo C6-C18 opcionalmente sustituido, y la parte alquilo es un alquilo C1-C12 opcionalmente sustituido, o un heteroaralquilo, en la que la parte heteroarilo es un heteroarilo C5-C18 opcionalmente sustituido, y la parte alquilo es un alquilo C1-C12 opcionalmente sustituido;
A2 y A8 son cada uno independientemente un resto de aminoacido seleccionado de Cys, hCys, Pen, Asp, Glu, Lys, Orn, Dbu o Dpr, en la que A2 y A8 se seleccionan por pares para poder formar un enlace covalente entre sus respectivas cadenas laterales;
A3 esta ausente o es un resto de aminoacido seleccionado de Ala, Tie, Val, Leu, Ile, Cha, Pro, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Phe, Gln, Sar, Gli, Asn, Aib o resto Y, en la que Y es un aminoacido seleccionado de los aminoacidos representados por las siguientes formulas estructurales:
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en las que:
R11 y R12, cada uno independientemente, es H, -CH3, fenilo o bencilo;
R21, R22, R23, y R24, cada uno es independientemente H, -CH3, -CF3, fenilo, bencilo, F, Cl, Br, I, - OCH3, u -OH; R31, R32, R33, R34, R41, R42, y R43, cada uno es independientemente H, -CH3, -CF3, fenilo, bencilo, F, Cl, Br, I, - OCH3, u -OH;
A4 esta ausente o es un resto de aminoacido seleccionado de Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, una His opcionalmente sustituida, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp o resto X, en las que X es un aminoacido seleccionado de los aminoacidos representados por las siguientes formulas estructurales:
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en las que:
R51 y R52, cada uno independientemente, es H, -CH3, fenilo o bencilo;
R61, R62, R63, y R64, cada uno es independientemente H, -CH3, -CF3, fenilo, bencilo, F, Cl, Br, I, - OCH3, u - OH;
R71, R72, R73, R74, R81, R82, y R83, cada uno es independientemente H, -CH3, -CF3, fenilo, bencilo, F, Cl, Br, I, - OCH3, u -OH;
R5 es un Phe opcionalmente sustituido, un 1-Nal opcionalmente sustituido o un 2-Nal opcionalmente sustituido;
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A6 es Arg; y A7 es T rp,
en las que cualquier resto de aminoacido esta en configuracion L o D.
En algunos casos, A3 esta ausente o es un resto de aminoacido seleccionado de Ala, Tie, Val, Leu, Ile, Cha, Pro, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Phe, Gln, Sar, Gli, Asn o Aib; y A4 esta ausente o es un resto de aminoacido seleccionado de Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, una His opcionalmente sustituida, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp o resto X, en las que X es un aminoacido representado por la siguiente formula estructural:
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Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente y mas adelante con respecto a la Formula (I).
En algunos casos, A3 y A4, cada uno independientemente, es un resto de un aminoacido seleccionado de los aminoacidos representados por las siguientes formulas estructurales:
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y
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Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente y mas adelante con respecto a la Formula (I).
En algunos casos, A3 y A4 estan ambos ausentes. Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente y mas adelante con respecto a la Formula (I).
En algunos casos, cuando A4 es un aminoacido, A3 no es Aib ni Gly. Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente con respecto a la Formula (I).
En algunos casos, cuando A4 es His y A5 es un D-Phe o 2-Nal, A3 no es un D-aminoacido ni L-Ala. Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente con respecto a la Formula (I).
En algunos casos, cuando cada A2 y A8 se selecciona de Cys, hCys o Pen, entonces: (a) cuando A4 esta ausente, entonces A3 no es L-His; (b) cuando A3 esta ausente, entonces A4 no es L-His; y (c) cuando A4 es His, entonce A3 no es Glu, Leu ni Lys. Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente con respecto a la Formula (I).
En algunos casos: 1) A3 y A4 no estan ambos ausentes; 2) cuando A4 es un aminoacido, A3 no es Aib ni Gly; y 3) cuando A4 es His y A5 es un D-Phe o 2-Nal, A3 no es un D-aminoacido ni L-Ala; 4) cuando cada A2 y A8 se selecciona de Cys, hCys o Pen, entonces: (a) cuando A4 esta ausente, entonces A3 no es L-His; (b) cuando A3 esta ausente, entonces A4 no es L-His; y (c) cuando A4 es His, entonce A3 no es Glu, Leu ni Lys. Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente con respecto a la Formula (I).
En otro caso, los polipeptidos de Formula (I), A4 es un L-aminoacido. En otros casos mas, A4 esta ausente. Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente con respecto a la Formula (I).
En algunos casos, A5 puede ser un 1-Nal opcionalmente sustituido o un 2-Nal opcionalmente sustituido, por ejemplo, un D-2-Nal opcionalmente sustituido. A5 puede estar sustituido en cualquiera de los cinco atomos de carbono aromaticos con un sustituyente seleccionado entre F, Cl, Br, I, -CH3, -OH, -CN, amina, -NO2, u -OCH3.
En un caso adicional, los polipeptidos de Formula (I), A5 es un D-Phe opcionalmente sustituido. A5 puede estar
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sustituido en cualquiera de los cinco atomos de carbono aromaticos con un sustituyente seleccionado entre F, Cl, Br, I, -CH3, -OH, -CN, amina, -NO2, u -OCH3. Los ejemplos adecuados de A5 incluyen, pero sin limitacion, un resto de D- aminoacido seleccionado entre: Phe, Phe(2'-F), Phe(2'-Cl), Phe(2'-Br), Phe(2'-I), Phe(2'-CN), Phe(2'-CH3), Phe(2'- OCH3), Phe(2'-CF3), Phe(2'-NO2), Phe(3'-F), Phe(3'-Cl), Phe(3'-Br), Phe(3'-I), Phe(3'-CN), Phe(3'-CH3), Phe(3'-OCH3), Phe(3'-CF3), Phe(3'-NO2), Phe(4'-F), Phe(4'-Cl), Phe(4'-Br), Phe(4'-I), Phe(4'-CN), Phe(4'-CHa), Phe(4'-OCHa), Phe(4'- CF3), Phe(4'-NO2), Phe(4'-t-Bu), Phe(2',4'-diF), Phe(2',4'-diCl), Phe(2',4'-diBr), Phe(2',4'-diI), Phe(2',4'-di-CN), Phe(2',4'-di-CH3), Phe(2',4'-di-OCH3), Phe(3',4'-diF), Phe(3',4'-diCl), Phe(3',4'-diBr), Phe(3',4'-diI), Phe(3',4'-di-CN), Phe(3',4'-di-CH3), Phe(3',4'-di-OCH3), Phe(3',5'-diF), Phe(3',5'-diCl), Phe(3',5'-diBr), Phe(3',5'-diI), Phe(3', 5'-di-CN), Phe(3',5'-diCHa), Phe(3',5'-di-OCHa) o Phe(3',4',5'-triF). Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente con respecto a la Formula (I).
En un caso adicional, los polipeptidos de Formula (I), A5 es un D-2-NaI opcionalmente sustituido. A5 puede estar sustituido en cualquiera de los cinco atomos de carbono aromaticos con un sustituyente seleccionado entre F, Cl, Br, I, -CH3, -OH, -CN, amina, -NO2, u -OCH3.
En otro caso mas, los polipeptidos de Formula (I), A4 es His, opcionalmente sustituida en cualquier posicion sustituible con un sustituyente seleccionado entre F, Cl, Br, I, -CH3, -Oh, -CN, amina, -NO2, bencilo u -0CH3. Los valores y valores preferidos del resto de las variables son como se han definido anteriormente con respecto a la Formula (I).
En un caso particular, los compuestos descritos son aquellos polipeptidos de Formula (I) que poseen CE50 con respecto a MC4R de aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 10 nM, por ejemplo, 0,01-3 nM, mientras que poseen la proporcion de CE50(MC1R)/CE50(MC4R) de al menos 10.
En otro caso, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-Cys-D-Ala-His-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys-NH2 (SEQ m NO: 1)
Ac-Arg-Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys-NH2
(SEQ .ID NO: 2)
Ac-Arg-Cys-D-Ata-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys-NH2 (SEQ m NO: 3)
1 , 1 fSEG ID NO- 4)
Ac-Arg-Cys-D-Ala-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys-NH2 ^ ^ ■ '
*.......................... " "~1 (SEQ ID NO: 5)
Ac-Arg-Cys-D-Ala-Ser-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys-NH2
f~~~——~—~~——1 Ac-Arg-Cys-D-Ala-Thr-D-Phe(p-CN)-Arg-Tip-Cys-NH2 (SEQ ID NO: 6)
f I
Ac-Arg-Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-1 rp-Cys-NH2 (SEQ ID NO: 7)
imagen16
Ac-Arg-Cys-D-VaI-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys-NH2 (SEQ ID NO: 11)
5
10
15
20
25
30
35
Ac-Arg-Cys-D-Val-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys-NH2 (SEQ ID NO: 12)
Ac-Arg-Cys-D-Scr-Pro-D-Phc-Arg-Trp-Cys-NHi (SEQ ID NO: 13),
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En otro caso mas, los polipeptidos descritos incluyen una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
I......................................I
Ac-Arg-hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys-NI^ (SEQ ID NO: 14)
Ae-Arg-hCys~Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys~NH2 (SEQ ID NO: 15)
Ac-Arg-liCys-Ala-D-Phc-Arg-Tip-C'ys-OH
Ac-Ai^-Cys-D-AlaJ3-Phc-Arg-Trp-hiys“N'I h
(SEQ ID NO: 16) (SEQ ID NO: 17)
imagen17
Ac-Arg-liCys-D-AIs-D-Phe(P-F)-Arg-Trp-Cys-NH2 (SEQ IDN0: 19)
imagen18
Ac-Nle-hCy s-Pro-D-Phe - Arg-T rp-Cys-NI l2
A rg-hCys-Pro-O-Ph e-A rg-Trp-Cys-N H 2
(SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22)
Cl 1 r(CI i2)4*C.'()-hC ys-Pro-D-Plic-Arg-Ttp-Cys-NIli (SEQ ID NO: 23)
Bon/yl-CO-hC’ys-Pn>-D-Phe-Arg-Trp-C’ys-NH2 (SEQ ID NO: 24),
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En un caso adicional, los polipeptidos descritos incluyen el polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-Asp-D-Ala-D-Plic-Arg-Trp-Dbii-NHn (SEQ ID NO. 25)
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25
30
35
40
45
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Ac-Arg-Dpr-D-AIa-D-Phe-Arg-Trp-GIu-NHj (SEQ ID NO: 28)
Ac-Arg-Dpr-D-Ala-D-Phc(4-F)-Arg-Trp-Glu-NH2 (SEQ ID NO: 29) Ac-Arg-Dpr-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Glu-NIE (SEQ ID NO: 30)
Ac-Arg-Dpr-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Glu-OH (SEQ ID NO: 31)
Ac-Nle-Dpr-Ala-D-Phf-Arg-Trp-oiu-NHi (SEQ ID NO: 32)
imagen21
CH3-(CH2)4-CO-Dpr-Ala-D-Phe-Arg-Trp-GlLi-NII; (SEQ ID NO: 34)
Benzyl-CO-Dpr-Ala-D-Plie-Arg-Trp-Glu-NHi (SEQ ID N0: 35)>
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
En otro caso mas, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por la formula (I), en la que 4 es un resto de aminoacido seleccionado de Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, una His sustituida, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp o resto X. Los ejemplos de dichos peptidos incluyen peptidos representados por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-His(3-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 36) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 37) Ac-Arg-ciclo[cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 9) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 8) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 7) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Arg-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 38) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 39) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-D-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 40) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 2) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 4) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Atc-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 41) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-QAla-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 42) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-sChp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 43) o Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-X-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2, (SEQ ID NO: 44) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En algunos casos, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 15) Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 14) Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2; (SEQ ID NO: 45) Ac-Arg-ciclo[Glu-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Dpr]-NH2; (SEQ ID NO: 26)
Ac-Arg-ciclo[Glu-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Dpr]-NH2; (SEQ ID NO: 27)
5
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Ac-Arg-ciclo[hCys-Aib-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 46) Ac-Arg-ciclo[hCys-Sar-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 47) Ac-Arg-ciclo[hCys-Val-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 48) Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Val-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 49) Ac-Arg-ciclo[hCys-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 50) Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 51) Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2; (SEQ ID NO: 52) Ac-Arg-ciclo[D-Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2; (SEQ ID NO: 53) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2; (SEQ ID NO: 17) Ac-Arg-ciclo[Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2; (SEQ ID NO: 54) Ac-Arg-ciclo[D-hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 55) Ac-Arg-ciclo[hCys-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SeQ ID NO: 20) o Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2, (SEQ ID NO: 56) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En otro caso, los polipeptidos descritos incluyen polipeptidos representados por la formula (I), en la que 3 es un resto de aminoacido seleccionado de Tie, Val, Leu, Ile, Cha, Pro, Ser, Thr, Lys, Arg, His, Phe, Gln, Sar, Gli, Asn o Aib; y A4 es un resto de aminoacido seleccionado de Atc, Ala, QAla, Aib, Sar, Ser, Thr, Pro, Hyp, Asn, Gln, una His sustituida, Trp, Tyr, Lys, Arg, sChp o resto X. Son ejemplos de dichos polipeptidos los polipeptidos representados por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-ciclo[Cys-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 57) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 11) o Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2, (SEQ ID NO: 58) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En un caso adicional, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-TzAla-ciclo[Cys-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 59) o Ac-Glu-ciclo[Cys-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2, (SEQ ID NO: 60) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En otro caso mas, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 37) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 8) o Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2, (SEQ ID NO: 7) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En un caso adicional, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Leu-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 61) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ile-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 62) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Tle-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 63) o Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2, (SEQ ID NO: 10) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En un caso adicional, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-2-Nal-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 64) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-2-Nal-Arg-Trp-Cys]-NH2; (SEQ ID NO: 65) o Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-2-Nal-Arg-Trp-Cys]-NH2, (SEQ ID NO: 66) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
En un caso adicional, los polipeptidos descritos incluyen un polipeptido representado por una cualquiera de las siguientes formulas estructurales:
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH; (SEQ ID NO: 67) Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH; (SEQ ID NO: 68) o Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-OH, (SEQ ID NO: 69) o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
5
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EJEMPLIFICACION Sintesis de peptidos
Los peptidos de la presente invencion se prepararon mediante sintesis de peptidos en fase solida convencional. La cadena peptidica se sometio a elongacion de manera escalonada comenzando con su derivado de aminoacido del extremo C-terminal acoplado a una resina de soporte solido seleccionada apropiadamente que se sabe que es adecuada para la sintesis de peptidos. Para la sintesis de peptido con una funcion de amida C-terminal, se empleo resina Rink-amida-MBHA como soporte solido. Para la sintesis de peptidos con la funcion carboxilo libre C-terminal, se pueden utilizar resinas tales como resina de cloruro de 2-clorotritilo, Wang o resina Merrifield que forman un enlace ester con el Fmoc-aminoacido. La mayorfa de estos tipos de resina de Fmoc-aminoacido unidos a ester estan disponibles en el mercado de diversas fuentes y, en general, se usan cuando es posible.
Sintesis de peptidos ciclados con disulfuro
Se ensamblo el derivado lineal de una amida de peptidos cfclicos de disulfuro usando qufmica de Fmoc en un sintetizador de peptidos de fase solida. Se dispuso la resina Fmoc-Rink-amida en un recipiente de reaccion y se hincho con NMP. Luego se trato con piperidina al 20 % en NMP durante 15 minutos, seguido de 3 lavados de NMP. La resina se ensayo para una prueba de Kaiser positiva (Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinge, C. D. y Cook, P. I. Anal. Biochem., 1990, 34: 595-598). Se volvio a suspender en NMP y se mezclo con el primer derivado de Fmoc-aminoacido C-terminal requerido y HOBt. La reaccion de acoplamiento se inicio mediante la adicion de reactivo HBTU y DIPEA. T ras mezclar durante 2-3 horas, se confirmo la finalizacion del acoplamiento mediante una prueba de Kaiser negativa en una pequena parte alfcuota de la resina extrafda de la mezcla de reaccion. La resina se lavo tres veces con NMP. Posteriormente, se retiro el grupo Fmoc como se ha descrito anteriormente y se repitio todo el ciclo con el segundo derivado de Fmoc-aminoacido C-terminal como se ha descrito. Se repitio el mismo ciclo de reacciones secuencialmente con cada uno de los aminoacidos entrantes. Se uso el ensayo de color de cloranilo (Vojkovsky, T. Pept. Res., 1995, 8: 236-237), en lugar de la prueba de Kaiser para las pruebas positivas de desproteccion de Fmoc del resto de prolina en la secuencia peptidica, asf como para verificar la finalizacion del acoplamiento de un aminoacido a la prolina (una prueba de cloranilo negativa). En el caso de los peptidos con grupo acetilo N-terminal, la resina peptidica con desproteccion de Fmoc se trato durante 10 minutos con anhfdrido acetico y piridina. La resina, despues de dar negativo en la prueba de Kaiser, se lavo con NMP, diclorometano y se seco al vacfo. Los derivados de Fmoc- aminoacidos se usaron para la sintesis de estos peptidos. Los derivados de aminoacidos trifuncionales usados fueron los siguientes: Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-hCys(Trt)-OH, Fmoc-Pen(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(But)-OH, Fmoc-His(1-Me)-OH, Fmoc-His(3- Me)-OH y Fmoc-Glu(OBut)-OH.
Para escindir el peptido de la resina, asf como para desproteger las funciones de la cadena lateral, se tomo la resina peptidica en: TIS al 2 %/agua al 5 %/DTT al 5 % (p/v)/TFA al 88 %. Se dejo mezclar la solucion durante 3,5 horas y luego se filtro. Se filtro el filtrado con eter etflico anhidro frfo. Se recogio el precipitado por centrifugacion. Se decanto el disolvente y se volvio a suspender el sedimento peptfdico en eter recien preparado. El tratamiento con eter se repitio dos veces mas. Se seco el peptido al vacfo. Se diluyo el producto peptfdico lineal en bruto a una concentracion de 2 mg/ml en acido acetico al 5 % y se anadio gota a gota yodo/metanol 0,5 M con agitacion vigorosa hasta lograr un color amarillo palido persistente de la solucion. Se agito la solucion durante 10 minutos mas. A continuacion, se inactivo el exceso de yodo mediante la adicion de tiosulfato de sodio 1 M mezclando hasta que la mezcla se volvio incolora. Se liofilizo la solucion de peptido ciclado y se purifico el polvo en bruto mediante HPLC preparativa usando una columna C-18 de fase inversa. Se agruparon las fracciones del producto purificado y se liofilizaron. Los peptidos se analizaron por espectrometrfa de masas usando una tecnica de ionizacion por electronebulizacion y se identificaron para corregir la masa.
Sintesis de peptidos ciclados con lactama
Los peptidos lactamicos cfclicos tambien se sintetizaron mediante metodos convencional de sintesis de peptidos en fase solida. Para los peptidos con Dpr C-terminal, se transfirio una resina Fmoc-Dpr(Mtt)-BHA a un reactor sintetizador de peptidos en fase solida. El grupo Fmoc se retiro como se ha descrito anteriormente, y el siguiente aminoacido protegido por Fmoc, tal como, por ejemplo, Fmoc-Trp(Boc)-OH, se acoplo a la resina a traves de procedimientos de acoplamiento convencionales. Se retiro el grupo protector Fmoc y los aminoacidos restantes se anadieron individualmente en el orden correcto, repitiendo los procedimientos de acoplamiento y desproteccion hasta que se completo la secuencia de aminoacidos. Para el acido glutamico, se empleo el acoplamiento de Fmoc-Glu(OPip). A continuacion, se acetilo el peptido completamente ensamblado en el extremo N segun el metodo descrito anteriormente para la serie de peptidos disulfuro. Se retiraron las cadenas laterales protegidas ortogonalmente. Por ejemplo, una resina peptidica con una cadena de Glu lateral protegida ortogonalmente como ester de 2-fenilisopropilo (OPip) o Dpr como 4-metiltritilo (Mtt), se escindio mediante el tratamiento con TFA al 1 % en dicolorometano. Se suspendio la resina peptidica desprotegida en NMP y se trato con HBTU/DIPEA. Tras la ciclacion (una prueba de Kaiser negativa), se lavo la resina peptidica con DCM y se seco. Se escindio el peptido cfclico de la resina junto con cualquiera de los grupos protectores restantes usando acido trifluoroacetico (TFA) en presencia de agua y 1,2- etanoditiol (EDT). Se recogio el producto por precipitacion tras la adicion de eter anhidro frfo y se recogio por
centrifugacion. La purificacion final se realizo mediante HPLC de fase inversa usando una columna C-18 de fase inversa. Se recogio el peptido purificado por liofilizacion y se analizo su masa por espectrometrfa de masas usando la metodologfa de pulverizacion electronica.
5 En la Tabla 2, se proporcionan los ejemplos de los compuestos de la presente divulgacion.
Tabla 2: Compuestos ilustrativos de la divulgacion
Compuesto
1
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Leu-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 61)
2
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ile-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 62)
3
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Tle-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 63) Tle = t-butil-glicina
4
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 10)
5
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-His(3-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 36)
6
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 37)
7
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 9)
8
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 8)
9
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7)
10
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Arg-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 38)
11
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 39)
12
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-D-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 40)
13
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 2)
14
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 4)
S1
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Atc-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 41) OOrN"’ COaH Ate =
S2
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-QAla-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 42) QAla= N =
S3
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-sChp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 43) HOgC 2 sChp = _
S4
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-X-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 44) N=\ ">C h2n co2h X =
15
Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 15)
16
Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 14)
17
Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 45)
18
Ac-Arg-ciclo[Glu-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Dpr]-NH2 (SEQ ID NO: 26)
19
Ac-Arg-ciclo[Glu-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Dpr]-NH2 (SEQ ID NO: 27)
S5
Ac-Arg-ciclo[hCys-Aib-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 46)
5
10
15
20
25
30
35
Compuesto
S6
Ac-Arg-ciclo [hCys-Sar-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 47)
S7
Ac-Arg-ciclo [hCys-Val-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 48)
S8
Ac-Arg-ciclo [hCys-D-Val-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 49)
S9
Ac-Arg-ciclo [hCys-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 50)
S10
Ac-Arg-ciclo [hCys-D-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 51)
S11
Ac-Arg-ciclo [hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 52)
S12
Ac-Arg-ciclo [D-Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 53)
S13
Ac-Arg-ciclo [Cys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 17)
S14
Ac-Arg-ciclo [Pen-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-hCys]-NH2 (SEQ ID NO: 54)
S15
Ac-Arg-ciclo [D-hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 55)
D1
Ac-Arg-ciclo [hCys-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 20)
D2
Ac-Arg-ciclo [hCys-D-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 56)
20
Ac-Arg-ciclo[Cys-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 57)
21
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 11)
D3
Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-His(1-Me)-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 58)
D4
Ac-TzAla-ciclo[Cys-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 59) TzAla = 3-(1,2,4-triazol-1-il)-L-Ala N i M O nh2
22
Ac-Glu-ciclo[Cys-Ala-His-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 60)
A. Ensayos de union a radioligandos:
Los ensayos de union a receptores para determinar la constante de union (Kd) o la concentracion de inhibicion (CI50) para desplazar un ligando radiomarcado del receptor de un peptido cfclico de la invencion pueden realizarse mediante cualquier medio conocido en la tecnica.
Como ejemplo, se preparan preparados de membrana celular para un ensayo de union a partir de celulas CHO-K1 transfectadas para expresar de forma estable los subtipos 1, 3, 4 o 5 del receptor hMC. Se lleva a cabo la inhibicion competitiva de [125I](Tyr2)-(Nle4-D-Phe7)-alfa-MSH([125I]-NDP-a-MSH en placas de polipropileno de 96 pocillos. En resumen, las membranas celulares (1-10 pg de protefna/pocillo), preparadas como se ha descrito anteriormente, se incuban en Tris-HCl 50 mM a pH 7,4 que contiene BSA al 0,2 %, MgCh 5 mM, CaCh 1 mM y 0,1 mg/ml de bacitracina, con concentraciones crecientes del compuesto de ensayo y [125I]-NDP-a-MSH 0,1-0,3 nM durante aproximadamente 120 minutos a 37 °C. El ligando [125I]-NDP-a-MSH unido se separa del [125I]-NDP-a-MSH libre mediante filtracion a traves de placas filtrantes de fibra de vidrio GF/C (Unifilter®, Meriden, CT, EE. UU.) previamente empapadas con polietilenimina (PEI) al 0,1 % (p/v). Los filtros se lavan tres veces con Tris-HCl 50 mM a pH 7,4 a una temperatura de aproximadamente 0-4 °C y luego se analizan para determinar su radiactividad. Los datos se analizan mediante analisis de regresion no lineal asistido por ordenador.
Ensayo de estimulacion de AMP cfclico
Los ensayos funcionales para determinar el estado agonista o antagonista de un peptido cfclico de la invencion se pueden realizar mediante cualquier medio conocido en la tecnica.
Ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL)
La estimulacion de los niveles de AMP cfclico intracelular (AMPc) por los peptidos se determina de una manera dependiente de la dosis mediante un ensayo de electroquimioluminiscencia (ECL) (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, EE.UU.; denominado de aquf en adelante "MSD"). En resumen, se suspenden las celulas CHO-K1 que expresan de forma estable los subtipos de receptores de hMC en el tampon de ensayo RMPI 1640® (el tampon RMPI 1640 contiene IBMX 0,5 mM y coctel de protefnas al 0,2 % (bloqueador A de MSD)). Se dispensan aproximadamente 7.000 celulas/pocillo de las celulas CHO-K1 transgenicas que expresan de forma estable los subtipos 1, 3, 4 o 5 del receptor hMC en placas de multiples matrices (MSD) de 384 pocillos que contienen electrodos de carbono integrados y se recubren con anticuerpo anti-AMPc. Se anaden concentraciones crecientes de los compuestos de ensayo, y las celulas se incuban durante aproximadamente 40 minutos a 37 °C. Se anade un tampon de lisis celular (solucion salina tamponada con HEPES con MgCl2 y Triton X-100® a pH 7,3) que contiene coctel de
5
10
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20
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40
45
50
protefnas al 0,2 % y AMPc marcado con rutenio TAG™ 2,5 nM (MSD), y las celulas se incuban durante aproximadamente 90 minutos a temperatura ambiente. Al final del segundo perfodo de incubacion, se anade el tampon de lectura (solucion tamponada con Tris que contiene un correactante ECL y Triton X-100 a p H 7,8), y se determinan inmediatamente los niveles de AMPc de los lisados celulares mediante deteccion de ECL con un lector Sector Imager 6000 reader® (MSD). Los datos se analizan usando un analisis de regresion no lineal asistido por ordenador (ajuste XL; IDBS) y se presentan como un valor de CE50. La CE50 representa la concentracion de un compuesto agonista que se necesita para obtener el 50 % de la respuesta de reaccion maxima, por ejemplo, el 50 % del nivel maximo de AMPc determinado usando el ensayo descrito anteriormente.
Ensayo de medicion de AMPc
Se cultivan celulas transfectadas con MC4-R humano hasta la confluencia en placas de 96 pocillos (sembrando aproximadamente 250.000 celulas por pocillo). Se tratan las celulas por triplicado con isobutilmetilxantina 0,2 mM (IBMX) y se graduan las concentraciones del peptido o, como alternativa, del peptido en presencia de NDP-MSH 20 nM. Las celulas tratadas de manera similar, pero solo con NDP-MSH 20 nM sirven como controles positivos en un volumen de 200 pl. Tambien se incluye un blanco de tampon que sirve como control negativo. Tras la incubacion de una hora a 37 °C, se lisan las celulas mediante la adicion de 50 pl de un tampon de lisis celular. El AMPc total acumulado en 250 pl de este medio de incubacion se cuantifica usando un kit de ensayo de AMPc de bajo pH disponible en el mercado (Amersham BioSciences) segun el procedimiento especificado por el proveedor del kit. Se considera agonista a un peptido que muestra una acumulacion de AMPc en el intervalo igual o superior al de alfa-MSH como control positivo. Se representan los datos para el agonista y se ajustan para determinar el valor de CE50. Un peptido que muestra una acumulacion en el mismo intervalo que el control negativo (tampon blanco en ausencia de alfa-MSH) no es eficaz a la concentracion del ensayo. Se considera antagonista un peptido que muestra una acumulacion atenuada si hay inhibicion en el AMPc cuando tambien esta presente en el ensayo alfa-MSH. Se puede realizar un ensayo similar con las celulas hMC-1R, hMC-3R y hMC-5R.
Medicion de la acumulacion de AMPc a traves de un sistema indicador de /3-galactosidasa (p-Gal)
Se uso un sistema de lectura por quimioluminiscencia, que usa un sistema de complementacion de fragmentos enzimaticos (EFC) con p-galactosidasa (p-Gal) como sistema indicador funcional. Este sistema de ensayo para diversos sistemas receptores de melanocortina se encuentra disponible en el mercado (sistema de ensayo cAMP Hunter GPCR, Discoverx Corp, Fremont, CA). Este ensayo utiliza la enzima p-Gal que se divide en dos partes complementarias; AE para el aceptor enzimatico y DE para el donante enzimatico. En el ensayo, se hace que la parte DE condensada al AMPc compita con el AMPc generado por las celulas para unirse a un anticuerpo especffico de AMPc. A continuacion, se anade la AE para formar p-Gal activo con cualquier DE-AMPc no unido. Esta enzima activa luego convierte un sustrato quimioluminiscente para generar una senal de salida que se registra en un lector de microplacas convencional.
En resumen, se siembran en placas 10.000 celulas por pocillo durante la noche y se incuba cada pocillo (celulas incubadas con 10 pl de tampon de ensayo) con una concentracion en serie x4 del compuesto de ensayo en el tampon de ensayo celular (5 pl) y reactivo de anticuerpo AMPc (5 pl) durante 30 min a 37 °C. Luego se anade el tampon de lisis celular (20 pl) que contiene el fragmento de enzima acoplado a DE-AMPc y el sustrato indicador (Emerald II- Galacton Star, 5:1) y se incuba durante 60 min a temperatura ambiente. A continuacion, se anaden 20 pl de reactivo de fragmento AE de p-Gal. Tras una incubacion adicional durante 120 min a temperatura ambiente, se mide la quimioluminiscencia con un lector de placas (Envision) y se usan los datos para calcular los valores de CE50 para el peptido de ensayo.
Los resultados se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3: Valores de CE50 (nM) de los compuestos ilustrativos de la invencion
Ensayo de AMPc (CE50) Proporciones de los valores de CE50
Compuesto
MC1R MC3R MC4R MC5R MC 1/4 MC 3/4 MC 5/4
1
0,47 0,79 0,70 91 0,68 1,13 130
2
0,69 0,96 1 420 0,69 0,96 420
3
1 0,7 0,7 672 1 1 930
4
1,25 1,59 1,34 782 0,93 1,19 584
5
4,1 405,8 1,15 1.085 4 350 945
6
30,4 4,3 0,7 467 40 6 662
7
273 >10 uM 34 259 8 >290
7
8
71 8,6 1,6 255 40 5 155
9
248 81 3 1.490 90 30 530
10
6,2 3,9 2,7 2,31 1,45
Ensayo de AMPc (CE50) Proporciones de los valores de CE50
Compuesto
MC1R MC3R MC4R MC5R MC 1/4 MC 3/4 MC 5/4
11
300,9 >1.000 45,1 6,67 >22,2
12
13
280 >10 uM 56 707 5 >200
13
14
169 >10 uM 24 283 7 >400 12
15
4 1 0,26 42 15 3,8 161
16
888 3.158 7,5 >10.000 120 420 >1.338
17
195 233 13,7 2.181 15 17 159
22
1,7 9,9 <0,5 1.282 >3 >20 >2.563

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
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    30
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    50
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un polipeptido aislado seleccionado de:
    Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 7); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 8); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 2); Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 51); Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 52); Ac-Arg-ciclo[Cys-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 57); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 11); Ac-TzAla-ciclo[Cys-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 59); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 9); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 39); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 4); Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 15); Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 14); o Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 45), o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
  2. 2. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Asn-D-Phe-Arg-Trp-Cys]- NH2 (SEQ ID NO: 7) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  3. 3. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]- NH2 (SEQ ID NO: 8) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  4. 4. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe-Arg-Trp-Cys]- NH2 (SEQ ID NO: 2) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  5. 5. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 51) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  6. 6. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 52) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  7. 7. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-Arg-ciclo[Cys-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 57) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  8. 8. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Val-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]- NH2 (SEQ ID NO: 11) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  9. 9. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que es Ac-TzAla-ciclo[Cys-Ala-Gln-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 59) o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  10. 10. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, polipeptido que se selecciona de:
    Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Trp-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 9); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Tyr-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 39); Ac-Arg-ciclo[Cys-D-Ala-Pro-D-Phe(p-F)-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 4); Ac-Arg-ciclo[hCys-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 15); Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Cys]-NH2 (SEQ ID NO: 14); o Ac-Arg-ciclo[hCys-D-Ala-D-Phe-Arg-Trp-Pen]-NH2 (SEQ ID NO: 45), o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos.
  11. 11. El polipeptido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en un metodo para tratar un trastorno que es sensible a la modulacion de MC4R.
  12. 12. El polipeptido aislado para el uso de la reivindicacion 11, en el que el trastorno se selecciona de: una enfermedad inflamatoria aguda o cronica; una enfermedad con un componente autoinmunitario; una enfermedad metabolica; diabetes o afeccion diabetalogica relacionada; proliferacion neoplasica; una afeccion medica reproductiva o sexual; una enfermedad o afeccion debida al tratamiento de o acceso a un organismo; una enfermedad cardiovascular; enfermedad pulmonar; una agresion al sistema inmunitario; enfermedad dermatologica; afeccion conductual; afeccion del sistema nervioso central o neuronal; afeccion o enfermedad asociada con el consumo de alcohol; afeccion o enfermedad renal; desequilibrio de lipoprotefnas de baja densidad/lipoprotefnas de alta densidad/trigliceridos; resistencia a la insulina; enfermedad del hfgado graso no alcoholico; o un trastorno de abuso de sustancias.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
  13. 13. El polipeptido aislado para el uso de la reivindicacion 12, en el que la enfermedad inflamatoria aguda o cronica es inflamacion general, enfermedad inflamatoria del intestino, inflamacion cerebral, sepsis o choque septico;
    en el que la enfermedad con un componente autoinmunitario es artritis reumatoide, artritis gotosa y esclerosis multiple; en el que la enfermedad metabolica es la obesidad, un trastorno de la alimentacion, el sfndrome de Prader-Willi, anorexia, bulimia, desgaste por SIDA, caquexia, caquexia por cancer, desgaste en ancianos debiles o sfndrome metabolico;
    en el que la diabetes o la afeccion diabetalogica relacionada es diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2 o retinopatfa; en el que la proliferacion neoplasica es cancer de piel o cancer de prostata;
    en el que la afeccion medica reproductiva o sexual es endometriosis, hemorragia uterina en mujeres, disfuncion sexual, disfuncion erectil o disminucion de la respuesta sexual en la mujer;
    en el que la enfermedad o afeccion debida al tratamiento del o acceso al organismo es el rechazo de un trasplante de organo, lesion por isquemia y reperfusion, tratamiento de lesion de la medula espinal, tratamiento para acelerar la curacion de heridas; o perdida de peso causada por la quimioterapia, radioterapia, inmovilizacion temporal o permanente, o dialisis;
    en el que la enfermedad cardiovascular es choque hemorragico, choque cardiogenico, choque hipovolemico, trastornos cardiovasculares o caquexia cardfaca;
    en el que la enfermedad pulmonar es el sfndrome de dificultad respiratoria aguda, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, asma o fibrosis pulmonar;
    en el que la agresion al sistema inmunitario es alergia o rechazo de un trasplante de organo;
    en el que la enfermedad metabolica es psoriasis, agotamiento de la pigmentacion de la piel, acne, formacion de queloides o cancer de piel; en el que la afeccion conductual, del sistema nervioso central o neuronal es ansiedad, depresion, memoria o disfuncion de la memoria, percepcion del dolor o dolor neuropatico;
    en el que la afeccion o enfermedad asociada con el consumo del alcohol es el abuso de alcohol o alcoholismo; o en el que la afeccion o enfermedad renal es caquexia renal o natriuresis.
  14. 14. El polipeptido aislado para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en el que el trastorno se caracteriza por una respuesta atenuada del receptor de melanocortina-4 (MC4R) a la hormona estimulada por la a-melanocortina.
  15. 15. Una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 en un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
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