ES2694411T3 - Anticuerpos anti-Tie2 y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humano aislado que se une específicamente a Tie2 humana e inhibe la señalización mediada por Tie2, en el que el anticuerpo comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo producido a partir de una estirpe celular depositada en la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) con el número de acceso PTA 12295 y una región constante de IgG4 humana.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos anti-Tie2 y usos de los mismos Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos, que son específicos para Tie2 humana.

Antecedentes

La angiogénesis es el proceso biológico por el cual se forman nuevos vasos sanguíneos. La angiogénesis aberrante se asocia a varias afecciones patológicas incluyendo, por ejemplo, retinopatías proliferativas, artritis reumatoide y psoriasis. Además, está bien establecido que la angiogénesis es crítica para el crecimiento y el mantenimiento tumoral. Tie2 es un único receptor transmembrana tirosina cinasa que se ha localizado en las células endoteliales de los vasos sanguíneos en formación y se ha demostrado que desempeña un papel en la angiogénesis. Los ligandos de Tie2 incluyen las angiopoyetinas (por ejemplo, Ang1, Ang2, Ang3 y Ang4). Se espera que el bloqueo de la interacción entre Tie2 y uno o más de sus ligandos tenga efectos terapéuticos beneficiosos en entornos donde sea ventajoso limitar o bloquear la angiogénesis.

Se mencionan anticuerpos contra Tie2, por ejemplo, en las patentes de los EE.UU. N.° 6.365.154 y 6.376.653 (documento WO 00/18437). Sin embargo, sigue existiendo la necesidad en la técnica de nuevas moléculas capaces de unirse a Tie2, especialmente anticuerpos anti-Tie2 que puedan bloquear la interacción de Tie2 con uno o más ligandos de Tie2, tales como Ang2. Dichas moléculas serían útiles para diversos fines terapéuticos y de diagnóstico.

El documento WO 00/75323 desvela antagonistas de Tek y métodos de inhibición de la angiogénesis en un mamífero mediante la administración de antagonistas de Tek. El documento US 2004/0101920 desvela métodos de utilización de una plataforma de biosensores con el fin de estudiar las interacciones entre macromoléculas. El documento WO 2006/020706 desvela agentes, tales como anticuerpos, que se unen a Tie1, Tie2 y Ang, incluyendo los que inhiben la actividad de las células endoteliales y la angiogénesis. El documento WO 2010/011242 desvela métodos y kits que utilizan antagonistas de Ang-2 para el tratamiento, la inhibición y la prevención de una infección sistémica del ántrax. Feistritzer et al (2004) J Allergy Clin. Immunol., 114, 1077-1084 desvela los efectos de los factores de crecimiento angiogénicos angiopoyetina 1 y angiopoyetina 2 sobre la función de eosinófilos in vitro y la posible implicación del receptor de angiopoyetina Tie2. Reikvam et al (2010) Expert Opin. Investig. Drugs, 19, 169183 desvela la investigación de los efectos de los anticuerpos que bloquean Tie2, Ang-2 exógeno y agentes farmacológicos sobre la proliferación de células de LMA y la liberación de mediadores angiorreguladores. AF313 de R&D Systems y AB10349 de Abcam son anticuerpos anti-Tie-2. Kosacka et al (2005) Cell Tissue Res., 320, 11-19 desvela un estudio que se centra en el efecto de Ang-1 en células ganglionares de la raíz dorsal cultivadas aisladas de ratas de un día de edad.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos como se definen en las reivindicaciones que se unen a Tie2 humana. Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para inhibir la señalización mediada por Tie2 y para tratar enfermedades y trastornos provocados por o relacionados con la actividad y/o la señalización de Tie2. Los anticuerpos de la invención bloquean la interacción entre Tie2 y Ang1, Ang2, Ang3 y Ang4.

Los anticuerpos de la divulgación pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG 1 o IgG4) o pueden comprender solo una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164: 1925-1933).

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-Tie2 que tienen sustancialmente las mismas características de unión que cualquiera de los anticuerpos anti-Tie2 de ejemplo que se describen en el presente documento. La presente divulgación incluye estirpes celulares que producen los anticuerpos anti-Tie2 que se describen en el presente documento. Como ejemplos no limitantes, las estirpes celulares que producen los anticuerpos de ejemplo H1M2055N y H2aM2760N se depositaron en los términos del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209 el 2 de diciembre de 2011. A las estirpes celulares depositadas se les han asignado los siguientes números de acceso: PTA-12295 (H1M2055N) y PTA-12296 (H2aM2760N).

La presente divulgación proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos anti-Tie2 de ejemplo que se describen en el presente documento. Los vectores de expresión recombinantes que llevan los ácidos nucleicos de la divulgación y las células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, también se incluyen en la divulgación, al igual que los métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.

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La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden las secuencias de aminoácidos de las cadenas CDR pesadas y ligeras (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3) encontradas dentro de cualquiera de los anticuerpos anti-Tie2 de ejemplo que se describen en el presente documento, incluyendo los anticuerpos producidos por las estirpes celulares depositadas PTA12295 y PTA-12296. La presente divulgación también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada y ligera (HCVR y LCVR) encontradas en cualquiera de los anticuerpos anti-Tie2 de ejemplo que se describen en el presente documento, incluyendo los anticuerpos producidos por las estirpes celulares depositadas PTA12295 y PTA-12296.

La presente divulgación incluye cualquiera de los anticuerpos anti-Tie2 de ejemplo que se describen en el presente documento que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para retirar sitios de glicosilación no deseados puede ser útil, o un anticuerpo que carece de un resto de fucosa presente en la cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) (véase Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). En otras aplicaciones, la modificación de la galactosilación puede hacerse con el fin de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-Tie2 de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta composiciones que comprenden una combinación de un anticuerpo anti-Tie2 y un segundo agente terapéutico. Los agentes de ejemplo que pueden combinarse ventajosamente con un anticuerpo anti-Tie2 incluyen, sin limitación, otros agentes que inhiben la actividad anti-Tie2 (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhibidores de péptidos, antagonistas de molécula pequeña, etc.) y/o agentes que interfieren con la señalización de Tie2 corriente arriba o abajo.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona métodos para inhibir la actividad de Tie2 usando un anticuerpo anti- Tie2 o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, en la que los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, supere, inhiba o prevenga mediante la retirada, inhibición o reducción de la actividad de Tie2. El anticuerpo anti-Tie2 de la invención actúa bloqueando la interacción entre Tie2 y un compañero de unión a Tie2 (Ang1, Ang2, Ang3 y Ang4) e inhibe la actividad de señalización de Tie2.

La presente divulgación también incluye el uso de un anticuerpo anti-Tie2 o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la divulgación en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno relacionados con o provocados por la actividad de Tie2 en un paciente.

Otras realizaciones se harán evidentes a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1. Representación lineal de Tie2 humana de longitud completa y diversas construcciones de supresión utilizadas para cartografiar el epítopo de los anticuerpos anti-Tie2 de la presente invención. Los números encima de las construcciones indican los límites de aminoácidos de las construcciones en relación con la molécula Tie2 de longitud completa (SEQ ID NO: 1).

Fig. 2. Histograma que muestra el grado de unión de la angiopoyetina (hAng1, hAng2, mAng3 o hAng4) a una punta del sensor recubierta con hTie2 pretratada con el anticuerpo anti-Tie2 H4H2055N o Control I.

Fig. 3. Histograma que muestra el grado de unión del anticuerpo anti-Tie2 (H4H2055N o Control I) a una punta de sensor recubierta con hTie2 pretratada con 100 nM de angiopoyetina (hAng1, hAng2, mAng3 o hAng4).

Fig. 4. El panel A muestra las curvas de crecimiento del tumor h29 en ratones después de la administración del anticuerpo anti-Tie2 H2M2055N (■) o del control de Fc (•). La flecha hacia abajo indica la fecha de inicio del tratamiento. El panel B muestra el crecimiento del tumor desde el inicio del tratamiento en ratones tratados con anticuerpo anti-Tie2 H2M2055N o control de Fc. El asterisco (*) indica un ensayo t de dos colas no paramétrico de Mann Whitney <0,05.

Fig. 5. Densidad de vasos del tumor H29 medida al final del experimento en ratones tratados con anticuerpo anti- Tie2 H2M2055N o control de Fc. El asterisco (*) indica un ensayo t de dos colas no paramétrico de Mann Whitney <0,05.

Fig. 6. El panel A muestra las curvas de crecimiento del tumor Colo305 en ratones después de la administración del anticuerpo anti-Tie2 H2M2055N (■) o del control de Fc (•). La flecha hacia abajo indica la fecha de inicio del tratamiento. El panel B muestra el crecimiento del tumor desde el inicio del tratamiento en ratones tratados con anticuerpo anti-Tie2 H2M2055N o control de Fc. El asterisco (*) indica un ensayo t de dos colas no paramétrico de Mann Whitney <0,05.

Fig. 7. Densidad de vasos del tumor Colo205 medida al final del experimento en ratones tratados con anticuerpo anti-Tie2 H2M2055N o control de Fc. El asterisco (*) indica un ensayo t de dos colas no paramétrico de Mann Whitney <0,05.

Descripción detallada

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Antes de que se describa la presente invención, ha de entenderse que la presente invención no se limita a los métodos particulares y las condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También ha de entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares y no pretende ser limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más del 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores entre medias (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque pueden usarse cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

Definiciones

Las expresiones "Tie2" y "fragmento de Tie2", como se usan en el presente documento, se refieren a la proteína Tie2 humana o el fragmento a menos que se especifique que son de una especie no humana (por ejemplo, "ratón Tie2", "fragmento Tie2 de ratón", "Tie2 de mono", "fragmento de Tie2 de mono”, etc.). Un "fragmento de Tie2" es cualquier porción de Tie2 que tenga menos aminoácidos que la molécula de Tie2 de longitud completa y que es capaz de unirse a un ligando de Tie2. La Tie2 humana tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 1. Las secuencias de aminoácidos de las moléculas de Tie2 de especies no humanas (por ejemplo, ratón, mono, conejo, perro, cerdo, etc.) están disponibles en fuentes públicas tales como GenBank (por ejemplo, números de acceso de GenBank NP_038718.2 (ratón); NP_001099207).1 (rata); etc).

La expresión "ligando de Tie2", como se usa en el presente documento, significa una proteína con la que la proteína Tie2 interactúa para transmitir una señal biológica in vivo. La expresión "ligando de Tie2" incluye cualquiera de las angiopoyetinas, incluyendo, por ejemplo, Ang1, Ang2, Ang3 y/o Ang4. El término "Ang1", como se usa en el presente documento, significa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 o una porción de la misma que es capaz de interactuar con Tie2. El término "Ang2", como se usa en el presente documento, significa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 o una porción de la misma que es capaz de interactuar con Tie2. El término "Ang3", como se usa en el presente documento, significa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o una porción de la misma que es capaz de interactuar con Tie2. El término "Ang4", como se usa en el presente documento, significa una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 18 o una porción de la misma que es capaz de interactuar con Tie2.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, tiene por objeto referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H, por sus siglas en inglés) y dos cadenas ligeras (L, por sus siglas en inglés) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh, por sus siglas en inglés) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl, por sus siglas en inglés) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR, por sus siglas en inglés). Cada Vh y Vl están compuestas por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CdR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes aspectos de la divulgación, las FR del anticuerpo anti-Tie2 (o la porción de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la estirpe germinal humana o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia de consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis por pares de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína sintético o modificado por ingeniería genética, de origen natural, obtenible enzimáticamente, que se una específicamente a antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivar, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas que usan cualquier técnica convencional adecuada tales como la digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y la expresión de ADN que codifican dominios variables y opcionalmente constantes de anticuerpos. Dicho ADN es conocido y/o está fácilmente disponible, por ejemplo, de fuentes comerciales, bibliotecas

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de ADN (incluyendo, por ejemplo, bibliotecas de fago-anticuerpo) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante el uso de técnicas de biología molecular, por ejemplo, para organizar uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.

Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad aislada (CDR) tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos suprimidos de dominio, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP, por sus siglas en inglés) y dominios IgNAR variables de tiburón, también están incluidos dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que es adyacente o está en fase de lectura con una o más secuencias marco conservadas. En los fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden estar situados uno con respecto a otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.

En ciertos aspectos de la divulgación, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones de ejemplo no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1- Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3;

(xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar directamente unidos entre sí o pueden estar unidos por una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado un enlace flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender un homo- dímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio constante y variable enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante un puente o puentes disulfuro).

Al igual que con las moléculas de anticuerpo completo, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en los que cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno separado o a un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico de ejemplo que se desvelan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas habituales disponibles en la técnica.

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar a través de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia de complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (CCDA) se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores de Fc (FcR) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y, por tanto, conducen a la lisis de la célula diana. La CDC y la CCDA pueden medirse usando ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la técnica. (Véase, por ejemplo, el documento US 5.500.362 y el documento 5.821.337, y Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95: 652-656). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para arreglar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de las células. Por tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si es deseable que el anticuerpo medie la citotoxicidad.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, tiene por objeto incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de estirpe germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y, en particular, CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no tiene por objeto incluir

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anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la estirpe germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco conservadas humanas.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, tiene por objeto incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (se describe más adelante), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios recombinantes (se describe más adelante), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la estirpe germinal humana. Sin embargo, en ciertos aspectos, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con las secuencias Vh y Vl de la estirpe germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la estirpe germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de la bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción estable de cuatro cadenas de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen unidos por un enlace disulfuro de cadena pesada intercatenario. En una segunda forma, los dímeros no están unidos a través de enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada (semianticuerpo) acoplada covalentemente. Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.

La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intactos se debe, pero no se limita a, diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una única sustitución de aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) a niveles observados normalmente usando una bisagra de IgG1 humana. La presente divulgación abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región Ch2 o Ch3, bisagra, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su ambiente natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o retirado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en los que el anticuerpo existe naturalmente o se produce naturalmente, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo ciertas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

La expresión "se une específicamente" o similar, significa que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. Los métodos para determinar si un anticuerpo se une específicamente a un antígeno son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Por ejemplo, un anticuerpo que "se une específicamente" a Tie2 humana, como se usa en el contexto de la presente invención, incluye anticuerpos que se unen a Tie2 humana o una porción del mismo con una Kd inferior a aproximadamente 1000 nM, inferior a

500 nM

inferior a aproximadamente 300 nM , inferior a aproximadamente 200 nM, inferior a

100 nM

, inferior a aproximadamente 90 nM , inferior a aproximadamente 80 nM, inferior a

70 nM,

inferior a aproximadamente 60 nM, inferior a aproximadamente 50 nM, inferior a

40 nM,

inferior a aproximadamente 30 nM, inferior a aproximadamente 20 nM, inferior a

10 nM,

inferior a aproximadamente 5 nM, inferior a aproximadamente 4 nM, inferior a

3 nM,

inferior a aproximadamente 2 nM, i nferior a aproximadamente nM o inferior a

aproximadamente 0,5 nM, como se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 2, en el presente documento). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a Tie2 humana puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como las moléculas de Tie2 de otras especies (no humanas).

Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueador", como se usa en el presente documento, tiene por objeto referirse a un anticuerpo cuya unión a Tie2: (i) interfiere con la interacción entre Tie2 o un fragmento de Tie2 y un ligando de Tie2 (por ejemplo, una angiopoyetina), y/o (ii) da como resultado la inhibición de al menos una función biológica de Tie2. La inhibición provocada por un anticuerpo neutralizante o bloqueador de Tie2 no necesita estar completa siempre y cuando sea detectable usando un ensayo apropiado. Se describen ensayos de ejemplo para detectar la inhibición de

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TIE2 en el presente documento.

Los anticuerpos anti-Tie2 que se desvelan en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o supresiones de aminoácidos en las regiones marco conservadas y/o CDR de los dominios variables de la cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la estirpe germinal correspondientes de las que derivaron los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento con las secuencias de la estirpe germinal disponibles de, por ejemplo, bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se desvelan en el presente documento, en los que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco conservadas y/o CDR están mutados con respecto al resto o los restos correspondientes de la secuencia de la estirpe germinal de la que derivó el anticuerpo, o con respecto al resto o los restos correspondientes de otra secuencia de la estirpe germinal humana, o con respecto a una sustitución conservadora de aminoácidos del resto o los restos correspondientes de la estirpe germinal (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento de forma colectiva "mutaciones de la estirpe germinal"). Un experto habitual en la materia, comenzando con las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera que se desvelan en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de estirpe germinal individuales o combinaciones de las mismas. En ciertos aspectos de la divulgación, todos los restos de región marco conservada y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de nuevo a los restos encontrados en la secuencia de la estirpe germinal original de la que derivó el anticuerpo. En otros aspectos, solo ciertos restos mutan de nuevo a la secuencia original de la estirpe germinal, por ejemplo, solo los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o solo los restos mutados descubiertos dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más de los restos de la región marco conservada y/o CDR mutan al resto o restos correspondientes de una secuencia de estirpe germinal diferente (es decir, una secuencia de estirpe germinal que es diferente de la secuencia de estirpe germinal de la que el anticuerpo derivó originalmente). Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la estirpe germinal dentro las regiones marco conservadas y/o CDR, por ejemplo, en las que ciertos restos individuales mutan al resto correspondiente de una secuencia particular de la estirpe germinal mientras que ciertos otros restos que difieren de la secuencia original de la estirpe germinal se mantienen o mutan al resto correspondiente de una secuencia diferente de la estirpe germinal. Una vez obtenidos, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la estirpe germinal pueden someterse a ensayo fácilmente para determinar una o más propiedades deseadas, tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión aumentada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenia reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general se incluyen en la presente divulgación.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-Tie2 que comprenden variantes que tienen una o más sustituciones conservadoras en comparación con las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR encontradas dentro de los anticuerpos anti-Tie2 de ejemplo que se desvelan en el presente documento. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-Tie2 que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones conservadoras de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR de los anticuerpos anti-Tie2 que se desvelan en el presente documento.

La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensores, por ejemplo, usando el sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences división de GE Healthcare, Piscataway, NJ).

El término "Kd", como se usa en el presente documento, tiene por objeto referirse a la constante de disociación en equilibrio de una interacción particular anticuerpo-antígeno.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un solo antígeno puede tener más de un epítopo. Por tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser ya sea conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional es producido por aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinea de manera óptima con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe una identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente el 95 % y, más preferentemente, de al menos aproximadamente el 96 %, el 97 %, el 98 % o el 99 % de las bases de nucleótidos, como se mide por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de

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secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza más adelante. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en ciertos casos, codificar un polipéptido que tenga la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.

Cuando se aplica a los polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de manera óptima, tal como los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de hueco predeterminados, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de restos que no son idénticas difieren en sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de similitud puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo alifático: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato y (7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina- valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 desvelada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para los polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente usando un software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, supresiones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, el software GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros predeterminados para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como los polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también pueden compararse usando FASTA usando parámetros predeterminados o recomendados, un programa en GCG versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de consulta y búsqueda (Pearson (2000) citado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros predeterminados. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402.

Características biológicas de los anticuerpos

La presente invención proporciona anticuerpos que bloquean la interacción entre Tie2 y un ligando de Tie2. Como se usa en el presente documento, la expresión "bloquea la interacción entre Tie2 y un ligando de Tie2" significa que, en un ensayo en el que la interacción física entre Tie2 y un ligando de Tie2 puede detectarse y/o cuantificarse, la adición de un anticuerpo de la invención reduce la interacción entre Tie2 y el ligando de Tie2 (por ejemplo, Ang1, Ang2, Ang3 y/o Ang4) en al menos un 50 %. Un ensayo de ejemplo no limitante que puede usarse para determinar si un anticuerpo bloquea la interacción entre Tie2 humana y un ligando de Tie2 se ilustra en el Ejemplo 5, en el presente documento. En una realización de ejemplo de este formato de ensayo, los anticuerpos se mezclan con proteína Tie2 y después la mezcla anticuerpo/Tie2 se aplica a una superficie recubierta con un ligando Tie 2 (en este caso, proteína Ang2). Después de retirar por lavado las moléculas no unidas, se mide la cantidad de Tie2 unida a la superficie recubierta con Ang2. Mediante el uso de cantidades variables de anticuerpo en este formato de ensayo, la cantidad de anticuerpo necesaria para bloquear el 50 % de la unión de Tie2 a Ang2 puede calcularse y expresarse como un valor de CI50. El formato de este ensayo puede invertirse de manera que se recubra la superficie con Tie2, se añada anticuerpo a la superficie recubierta con Tie2, el anticuerpo no unido se retire por lavado y, después, se añada un ligando de Tie2 a la superficie de Tie2 tratada con anticuerpo. La presente invención proporciona anticuerpos anti-Tie2 que presentan una CI50 inferior a aproximadamente 100 nM cuando se analizan en un ensayo de unión de Tie2/ligando de Tie2 como se ilustra en el Ejemplo 5 o un ensayo sustancialmente similar. Por ejemplo, la divulgación incluye anticuerpos anti-Tie2 que presentan una CI50 inferior a aproximadamente 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,4, 0,3 o 0,2 nM cuando se analizan en un ensayo de unión de Tie2/ligando de Tie2 como se ilustra en el Ejemplo 5 o un ensayo substancialmente similar.

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Otro formato de ensayo que puede usarse para determinar si un anticuerpo bloquea la interacción entre Tie2 humana y un ligando de Tie2 se ilustra en el Ejemplo 6, en el presente documento. En este formato de ensayo, se usa una estirpe celular que se modifica por ingeniería genética para expresar Tie2 humana en su superficie y que también incluye una construcción indicadora que hace que se exprese una señal detectable cuando Tie2 interactúa con un ligando de Tie2. Las células modificadas se tratan con anticuerpos anti-Tie2 y con ligando de Tie2 y se mide la señal indicadora. Mediante el uso de cantidades variables de anticuerpo en este formato de ensayo, la cantidad de anticuerpo necesaria para inhibir el 50 % de la señal indicadora observada en ausencia de anticuerpo puede calcularse y expresarse como un valor de CI50. La presente invención proporciona anticuerpos anti-Tie2 que presentan una CI50 inferior a aproximadamente 20 nM cuando se analizan en un ensayo de unión de Tie2/ligando de Tie2 como se ilustra en el Ejemplo 6 o un ensayo sustancialmente similar. Por ejemplo, la divulgación incluye anticuerpos anti-Tie2 que presentan una CI50 inferior a aproximadamente 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 nM cuando se someten a ensayo en un ensayo de unión de Tie2/ligando de Tie2 como se describe en el Ejemplo 6 o un ensayo sustancialmente similar.

Cartografiado de epítopos y tecnologías relacionadas

La proteína Tie2 humana contiene los siguientes dominios: un dominio Ig1, un dominio Ig2, un dominio de repetición de EGF, un dominio Ig3 y un dominio de repetición de fibronectina (FN) (que incluye FN1, FN2 y FN3). Estos dominios se representan gráficamente en la Figura 1. La presente divulgación incluye anticuerpos anti-Tie2 que se unen específicamente a un epítopo dentro de una o más de las siguientes regiones: (a) los dominios Ig1-Ig2-EGF (SEQ ID NO: 7); (b) los dominios de Ig2-EGF (SEQ ID NO: 8); (c) el dominio EGF (SEQ ID NO: 9); (d) los dominios Ig3-FN (SEQ ID No: 10); y/o (e) los dominios FN (SEQ ID NO: 11). (Véanse los ejemplos 3 y 4).

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-Tie2 que interactúan con uno o más aminoácidos encontrados dentro de los dominios Ig1 y/o Ig2 de Tie2. El epítopo o epítopos pueden consistir en una o más secuencias contiguas de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicadas dentro de los dominios Ig1 y/o Ig2 de Tie2. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) localizados dentro de los dominios Ig1 y/o Ig2 de Tie2. De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, se proporcionan anticuerpos anti-Tie2 que interactúan con uno o más aminoácidos ubicados dentro de uno o más segmentos de aminoácidos seleccionados entre el grupo que consiste en los aminoácidos 96-106 de la SEQ ID NO: 7, los aminoácidos 139-152 de la SEQ ID NO: 7; y los aminoácidos 166-175 de la SEQ ID NO: 7. La presente invención proporciona anticuerpos anti-Tie2 que interactúan con al menos un aminoácido dentro de cada uno de los segmentos mencionados anteriormente (es decir, dentro de cada uno de los aminoácidos 96-106, 139-152 y 166-175 de la SEQ ID NO: 7). Los anticuerpos que interactúan con los aminoácidos 139-152 y/o 166-175 de la SEQ ID NO: 7 son capaces de bloquear la interacción entre Tie2 y uno o más ligandos Tie2, tales como, por ejemplo, Ang2 (véanse los Ejemplos 4-6, en el presente documento).

Pueden usarse diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas de ejemplo incluyen, por ejemplo, un ensayo de bloqueo cruzado habitual como el que se describe en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional por rastreo con alanina, análisis por transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443-463) y análisis por corte de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. (Véase, por ejemplo, el Ejemplo 4 del presente documento). En términos generales, el método de intercambio de hidrógeno/deuterio implica marcar con deuterio la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que se produzca un intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos, excepto los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión de proteasas y análisis por espectrometría de masas, revelando de este modo los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267 (2): 252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-Tie2 que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos de ejemplo específicos que se describen en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos H1M2055N y H2aM2760N, producidos a partir de las estirpes celulares depositadas PtA-12295 y PTA-12296, respectivamente). Análogamente, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-Tie2 que compiten por la unión a Tie2 o un fragmento de Tie2 con cualquiera de los anticuerpos de ejemplo específicos que se describen en el presente documento (por ejemplo, los anticuerpos H1M2055N y H2aM2760N, producidos a partir de las estirpes celulares depositadas pTa-12295 y PTA-12296, respectivamente).

Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo o compite por unirse con un anticuerpo anti-Tie2 de referencia usando métodos habituales conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Tie2 de referencia de la invención, se permite

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que el anticuerpo de referencia se una a una proteína Tie2 o péptido en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la molécula de Tie2. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a Tie2 después de la unión a saturación con el anticuerpo anti-Tie2 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente al del anticuerpo anti-Tie2 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula Tie2 después de la unión a saturación con el anticuerpo anti- Tie2 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo anti-Tie2 de referencia de la invención. Después puede realizarse una experimentación adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión observada del anticuerpo de ensayo se debe de hecho a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Pueden realizarse experimentos de este tipo usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o superpuesto) si, por ejemplo, un exceso de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 % pero preferentemente un 75 %, un 90 % o incluso un 99 % según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cáncer Res. 1990: 50: 1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos superpuestos" si solo un subconjunto de las mutaciones de aminoácidos que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-Tie2 de referencia, la metodología de unión descrita anteriormente se realiza en dos orientaciones: en una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula de Tie2 en condiciones de saturación seguidas de una evaluación de unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de Tie2. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula de Tie2 en condiciones de saturación, seguido de una evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula de Tie2. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la molécula de Tie2, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a Tie2. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión de un epítopo superpuesto o adyacente.

Preparación de anticuerpos humanos

Se conocen en la técnica métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos. Puede usarse cualquiera de dichos métodos conocidos en el contexto de la presente invención para hacer anticuerpos humanos que se unan específicamente a Tie2 humana.

Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad para Tie2 inicialmente teniendo una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la sección experimental a continuación, los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan por características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes del ratón se reemplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo, IgG 1 o IgG4 de tipo silvestre o modificado. Si bien la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.

Bioequivalentes

Los anticuerpos anti-Tie2 y los fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos pero que conservan la capacidad de unirse a Tie2 humana. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpos comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia original, pero presentan una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Análogamente, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-Tie2 de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, supresiones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan con la secuencia descrita, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-Tie2 que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-Tie2 o fragmento de anticuerpo de la invención.

Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una sola dosis o múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción, pero no en su tasa de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes debido a que dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionales y se reflejan en el marcado, no son esenciales para conseguir concentraciones eficaces de fármaco en el cuerpo en, por ejemplo, el

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uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el fármaco particular estudiado.

En un aspecto de la divulgación, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

En un aspecto de la divulgación, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenia, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continua sin dicho cambio.

En un aspecto de la divulgación, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos de acción comunes para la condición o condiciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.

La bioequivalencia puede demostrarse mediante métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que la concentración del anticuerpo o sus metabolitos se mide en sangre, plasma, suero u otro fluido biológico en función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con, y es razonablemente predictivo de, los datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) se mide en función del tiempo; y (d) un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Pueden construirse variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-Tie2 de la invención, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o suprimiendo restos o secuencias terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, los restos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica pueden suprimirse o reemplazarse por otros aminoácidos para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpos anti-Tie2 que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.

Selectividad de especies y reactividad cruzada de especies

De acuerdo con ciertos aspectos de la divulgación, los anticuerpos anti-Tie2 se unen a Tie2 humana pero no a Tie2 de otras especies. La presente invención proporciona anticuerpos anti-Tie2 que se unen a Tie2 humana y a Tie2 de una o más especies no humanas. Los anticuerpos anti-Tie2 de la invención se unen específicamente a Tie2 humana, así como a un Tie2 de roedor (por ejemplo, Tie2 de ratón o rata). Una construcción de ejemplo que puede usarse para determinar si un anticuerpo se une específicamente a Tie2 de ratón es la construcción que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; una construcción de ejemplo que puede usarse para determinar si un anticuerpo se une específicamente a Tie2 de rata es la construcción que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. El uso de estas construcciones para evaluar la unión del anticuerpo anti-Tie2 se ilustra en el Ejemplo 2, en el presente documento.

Inmunoconjugados

La invención abarca anticuerpos monoclonales anti-Tie2 conjugados con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterápico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Se conocen en la técnica ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterápicos adecuados para formar inmunoconjugados (véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).

Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Los anticuerpos anti-Tie2 de la presente invención pueden unirse o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede estar unido funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico para Tie2 humana o un fragmento del mismo y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para una segunda diana terapéutica o está conjugado con un resto terapéutico tal como un inhibidor de la tripsina.

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Un formato de anticuerpo biespecífico de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en el que los dominios Ch3 de Ig primero y segundo difieren entre sí en al menos un aminoácido y en el que al menos una diferencia de aminoácidos reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácidos. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o suprime la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435r por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender adicionalmente una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356e, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG 1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

Formulación y administración terapéutica

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-Tie2 de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una transferencia, entrega, tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, jaleas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidra, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.

La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y el tamaño del paciente, la enfermedad diana, las condiciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida se calcula normalmente de acuerdo con el peso corporal o el área de la superficie corporal. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar una afección o enfermedad asociada a la actividad de Tie2 en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar el anticuerpo de la presente invención normalmente por vía intravenosa en una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, la frecuencia y la duración del tratamiento pueden ajustarse. Las dosificaciones y las pautas eficaces para administrar los anticuerpos Tie2 pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, el progreso del paciente puede controlarse mediante evaluación periódica y ajustarse la dosis en consecuencia. Además, la modificación a escala de la dosis entre especies puede realizarse usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8: 1351).

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptores (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede entregarse por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y una jeringuilla convencionales. Además, con respecto a la entrega subcutánea, un dispositivo de entrega de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la entrega de una composición farmacéutica de la presente invención. Un dispositivo de entrega de pluma de este tipo puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo de entrega de pluma reutilizable generalmente utiliza un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica de dentro del cartucho y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y reemplazarse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo de entrega de pluma puede reutilizarse. En un dispositivo de entrega de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. En su lugar, el dispositivo de entrega de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica contenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

Numerosos dispositivos de entrega de pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co.,

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Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OpTiPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de entrega de pluma desechables que tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a la pluma SOLOSTAR™ (sanofi- aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y KWIKPEN™ (Eli Lilly), el Autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede entregarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. En otra realización más, puede colocarse un sistema de liberación controlada en la proximidad de la diana de la composición, por lo que se requiere solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, volumen 2, páginas 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos públicamente conocidos. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio aceitoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes adyuvantes, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que puede usarse en combinación con un agente solubilizante tal como el benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se rellena preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para el uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para adaptarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenido es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas de dosificación.

Usos terapéuticos de los anticuerpos

Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado a la actividad de Tie2, incluyendo enfermedades o trastornos asociados a la angiogénesis. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención pueden usarse para tratar, por ejemplo, tumores primarios y/o metastáticos que surgen en el cerebro y las meninges, orofaringe, pulmón y árbol bronquial, tracto gastrointestinal, tracto reproductivo masculino y femenino, músculo, huesos, piel y apéndices, tejido conectivo, bazo, sistema inmunitario, células formadoras de sangre y médula ósea, hígado y tracto urinario y órganos sensoriales especiales tales como el ojo. En ciertas realizaciones, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno de la invención se usan para tratar uno o más de los siguientes cánceres: carcinoma de células renales, carcinoma pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, gliomas malignos, osteosarcoma, cáncer colorrectal, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, cáncer de ovario, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, sarcoma sinovial, cáncer de tiroides o melanoma.

Terapias de combinación

La presente divulgación incluye pautas de administración terapéutica que comprenden administrar un anticuerpo antiTie2 de la presente invención en combinación con al menos un componente terapéuticamente activo adicional. Los ejemplos no limitantes de dichos componentes terapéuticamente activos adicionales incluyen, por ejemplo, otro antagonista de Tie2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Tie2), un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, anticuerpo anti-EGFR [por ejemplo, cetuximab o panitumumab] o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de EGFR [por ejemplo, gefitinib o erlotinib]), un antagonista de otro miembro de la familia de eGfR tal como Her2/ErbB2, ErbB3 o ErbB4 (por ejemplo, anticuerpo anti-ErbB2, anti-ErbB3 o anti-ErbB4 o inhibidor de molécula pequeña de la actividad de ErbB2, ErbB3 o ErbB4), un antagonista de EGFRvlII (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a EGFRvlII), un antagonista de cMET (por ejemplo, un anticuerpo anti-cMET), un antagonista de IGF1R (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R), un inhibidor de B-raf (por

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ejemplo, vemurafenib, sorafenib, GDC-0879, PLX-4720), un inhibidor de PDGFR-a (por ejemplo, un anticuerpo anti- PDGFR-a), un inhibidor de PDGFR-p (por ejemplo, un anticuerpo anti-PDGFR-p), un antagonista de VEGf (por ejemplo, una trampa de VEGF, véase, por ejemplo, el documento US 7.087.411 (también denominado en el presente documento una "proteína de fusión inhibidora de VEGF"), anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, bevacizumab), un inhibidor de cinasa de molécula pequeña del receptor de VEGF (por ejemplo, sunitinib, sorafenib o pazopanib), un antagonista de DLL4 (por ejemplo, un anticuerpo anti-DLL4 desvelado en el documento US 2009/0142354 tal como REGN421), un antagonista de Ang2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Ang2 desvelado en el documento US 2011/0027286 tal como H1H685P), etc. Otros agentes que pueden administrarse de manera beneficiosa en combinación con los anticuerpos anti-Tie2 de la invención incluyen inhibidores de citocinas, incluyendo inhibidores de citocinas de molécula pequeña y anticuerpos que se unen a citocinas tales como IL-1, IL- 2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-17, IL-18 o a sus respectivos receptores.

La presente invención también incluye combinaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-Tie2 mencionados en el presente documento y un inhibidor de uno o más de entre VEGF, Ang2, DLL4, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EGFRvIII, cMet, IGF1R, B-raf, PDGFR-a, PDGFR-p o cualquiera de las citocinas mencionadas anteriormente, en las que el inhibidor es un aptámero, una molécula antisentido, una ribozima, un ARNip, un pepticuerpo, un nanocuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, fragmento Fab; fragmento F(ab')2; Fragmento Fd; Fragmento Fv; ScFv; Fragmento dAb; u otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos y unidades de reconocimiento mínimas). Los anticuerpos anti-Tie2 de la invención también pueden administrarse en combinación con antivíricos, antibióticos, analgésicos, corticoesteroides y/o AINE. Los anticuerpos anti-Tie2 de la invención también pueden administrarse como parte de una pauta de tratamiento que también incluye tratamiento de radiación y/o quimioterapia convencional.

El componente o los componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse justo antes, simultáneamente o poco después de la administración de un anticuerpo anti-Tie2 de la presente invención; (para los fines de la presente divulgación, dichas pautas de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-Tie2 "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional). La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-Tie2 de la presente invención se formula conjuntamente con uno o más del componente o los componentes terapéuticamente activos adicionales que se describen en otra parte del presente documento.

Usos diagnósticos de los anticuerpos

Los anticuerpos anti-Tie2 de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir Tie2 en una muestra, por ejemplo, con fines diagnósticos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Tie2 o un fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por una expresión aberrante (por ejemplo, sobreexpresión, expresión insuficiente, falta de expresión, etc.) de Tie2. Ensayos diagnósticos de ejemplo para Tie2 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti- Tie2 de la invención, en el que el anticuerpo anti-Tie2 está marcado con un marcador o una molécula indicadora detectables. Como alternativa, un anticuerpo anti-Tie2 no marcado puede usarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está el mismo marcado de forma detectable. El marcador o la molécula indicadora detectables pueden ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos de ejemplo específicos que pueden usarse para detectar o medir Tie2 en una muestra incluyen el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), el radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés).

Las muestras que pueden usarse en los ensayos de diagnóstico de Tie2 de la invención incluyen cualquier muestra de tejido o fluido obtenible de un paciente que contenga cantidades detectables de proteína Tie2 o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, los niveles de Tie2 en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente que no padece una enfermedad o afección asociada a niveles o actividad anormales de Tie2) se medirán para establecer inicialmente un nivel basal, o de referencia, de Tie2. Este nivel basal de Tie2 puede compararse con los niveles de Tie2 medidos en muestras obtenidas de individuos sospechosos de tener una enfermedad o afección relacionada con Tie2.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos habituales en la materia una divulgación y una descripción completas de cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención, y no tienen por objeto limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es o está próxima a la atomosférica.

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Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos

Se incluyó una construcción de control de ejemplo (anticuerpo anti-Tie2) en varios experimentos que se describen a continuación con fines comparativos. El anticuerpo, denominado Control I, es un anticuerpo quimérico anti-Tie2 con dominios variables de cadena pesada y ligera de ratón que tienen las secuencias de aminoácidos de los dominios correspondientes de "12H8", como se establece en la Patente de EE.UU. 6.376.653. El dominio constante de este anticuerpo es la IgG4 humana.

Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra Tie2 humana

Se generaron varios anticuerpos anti-Tie2 humanos mediante la inmunización de un ratón VELOCIMMUNE® con antígeno Tie2 humano de acuerdo con métodos convencionales (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N.° 6596.541). Usando esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos antiTie2; se describen en detalle anticuerpos de ejemplo generados de esta manera y sus correspondientes características biológicas, en los siguientes ejemplos e incluyen los anticuerpos designados como H2aM2760N, H2aM2761N, H1M2055N, H1H2304B, H1H2317B, H1H2322B, H1H2324B, H1H2331B, H1H2332B, H1H2333S, H1H2337B, H1H2338B, H1H2339B, H1H2340B y H4H2055N. Los prefijos H1M, H2M, H1H, etc. en las designaciones de anticuerpos utilizadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2M" tiene un Fc de IgG2 de ratón, mientras que un anticuerpo "H1H" tiene un Fc de IgG1 humana. Como apreciará un experto habitual en la materia, una región Fc de un anticuerpo puede modificarse o reemplazarse con una región Fc diferente, pero los dominios variables (incluyendo las CDR) seguirán siendo los mismos.

Se depositaron hibridomas que producen los anticuerpos anti-Tie2 H1M2055N y H2aM2760N en los términos del Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209 el 2 de diciembre de 2011, con los números de acceso PTA- 12295 (H1M2055N) y PTA-12296 (H2aM2760N).

Ejemplo 2. Afinidades de unión derivadas de resonancia de plasmón superficial y constantes cinéticas de anticuerpos anti-Tie2 monoclonales humanos

Las afinidades de unión y constantes cinéticas de anticuerpos anti-Tie2 monoclonales humanos se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial a 25 °C y 37 °C (Tablas 1-4). Las mediciones se realizaron en un instrumento Biacore 2000 o T200.

Para los anticuerpos con una región constante de ratón (designados como H1M o H2M), los anticuerpos se inmovilizaron en una superficie del sensor de Fc anti-ratón y se inyectaron diferentes concentraciones de construcciones de Tie2 de ratón, rata o humana (hTie2-His, mTie2-hFc y rTie2-hFc) sobre la superficie capturada del anticuerpo. Para los anticuerpos en el formato de IgG humana (designados como H1H o H4H), se empleó una superficie del sensor de anticuerpo anti-Fc humano (hTie2-His y hTie2-mFc) o una superficie del sensor de anticuerpo anti-Fab humano (mTie2-hFc y rTie2-hFc) dependiendo de la construcción Tie-2 aplicada a la superficie capturada del anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de las construcciones utilizadas en este Ejemplo son las siguientes: hTie2-His (SEQ ID NO: 2); hTie2-hFc (SEQ ID NO: 3); hTie2-mFc (SEQ ID NO: 4); rTie2-hFc (SEQ ID NO: 5); y mTie2-hFc (SEQ ID NO: 6).

Las constantes de velocidad cinética - velocidad de asociación (ka) y velocidad de disociación (kd) se determinaron mediante el ajuste de los diagramas de sensibilidad en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa usando el software de ajuste de curvas Scrubber 2.0. La constante de disociación de equilibrio (Kd) y la semivida disociativa (T1^) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinética como: Kd (M) = kd/ka; y T1^ (min) = (ln2/(60*kd).). Como se muestra en las Tablas 1-2, varios anticuerpos demostraron una unión de alta afinidad a hTie2 a ambas temperaturas sometidas a ensayo. Además, H1M2055N, H1H2332B, H1H2337B, H1H2340B y H4H2055N presentaron una unión significativa a Tie2 de ratón y rata (Tablas 3-4).

Tabla 1: Afinidades de unión de Biacore de mAb humanos contra hTie2 a 25 °C

Unión a 25 ° formato de captura de Mab

Anticuerpo

Analito ka (Ms-1) kd (s-1) Kd (Molar) T^ (min)

H2aM2760N

hTie2-His 2,91E+04 1,84E-04 6,32E-09 63

hTie2-hFc

NE NE NE NE

H2aM2761N

hTie2-His 3,33E+04 1,01E-04 3,02E-09 115

hTie2-hFc

NE NE NE NE

H1M2055N

hTie2-His 5,75E+05 1,34E-04 2,33E-10 86

hTie2-hFc

NE NE NE NE

H1H2304B

hTie2-His 1,99E+05 1,32E-03 6,66E-09 9

hTie2-mFc

5,80E+05 3,75E-05 6,46E-11 308

Anticuerpo

Analito ka (Ms-1) kd (s-1) Kd (Molar) T^ (min)

H1H2317B

hTie2-His 1,43E+05 9,26E-04 6,50E-09 12

hTie2-mFc

3,90E+05 2,36E-05 6,10E-11 489

H1H2322B

hTie2-His 1,67E+05 9,76E-04 5,84E-09 12

hTie2-mFc

4,80E+05 1,39E-05 2,90E-11 829

H1H2324B

hTie2-His 2,40E+05 9,25E-04 3,86E-09 12

hTie2-mFc

6,30E+05 5,92E-05 9,39E-11 195

H1H2331B

hTie2-His 3,63E+04 1,17E-03 3,22E-08 10

hTie2-mFc

8,20E+04 1,24E-04 1,52E-09 93

H1H2332B

hTie2-His 8,89E+04 2,23E-08 2,51E-08 5

hTie2-mFc

1,25E+05 2,13E-04 1,1E-09 54

H1H2333S

hTie2-His 5,92E+04 3,09E-04 5,21E-09 37

hTie2-mFc

SU SU SU SU

H1H2337B

hTie2-His 6,47E+04 6,49E-04 1,00E-08 18

hTie2-mFc

1,20E+05 1,11E-04 9,30E-10 104

H1H2338B

hTie2-His 4,93E+04 3,44E-04 6,99E-09 34

hTie2-mFc

SU SU SU SU

H1H2339B

hTie2-His 5,58E+04 1,25E-03 2,24E-08 9

hTie2-mFc

1,51E+05 1,02E-04 6,70E-10 114

H1H2340B

hTie2-His 7,01E+04 3,45E-03 4,92E-08 3

hTie2-mFc

1,65E+05 1,91E-04 1,16E-09 60

H4H2055N

hTie2-His 3,82E+05 4,84E-04 1,27E-09 24

hTie2-mFc

1,27E+06 9,92E-05 7,80E-11 116

Control I

hTie2-His 6,53E+04 4,57E-04 7,00E-09 25

hTie2-mFc

1,45E+05 1,16E-04 8,03E-10 99

SU = sin unión en las condiciones sometidas a ensayo NE = no sometido a ensayo

Tabla 2: Afinidades de unión de Biacore de mAb humanos contra hTie2 a 37 °C

Unión a 37 ° formato de captura de Mab

Anticuerpo

Analito ka (Ms-1) kd (s-1) Kd (Molar) T1^ (min)

H2aM2760N

hTie2-His 4,04E+04 3,06E-04 7,60E-09 38

hTie2-hFc

NE NE NE NE

H2aM2761N

hTie2-His 4,26E+04 2,87E-04 6,74E-09 40

hTie2-hFc

NE NE NE NE

H1M2055N

hTie2-His 1,08E+06 3,36E-04 3,10E-10 34

hTie2-hFc

NE NE NE NE

H1H2304B

hTie2-His 3,50E+05 3,67E-03 1,05E-08 3

hTie2-mFc

6,60E+05 1,30E-04 1,96E-10 89

H1H2317B

hTie2-His 1,74E+05 3,46E-03 1,98E-08 3

hTie2-mFc

4,60E+05 9,94E-05 2,15E-10 116

H1H2322B

hTie2-His 2,12E+05 4,74E-08 2,74E-08 2

hTie2-mFc

5,70E+05 9,72E-05 1,72E-10 119

H1H2324B

hTie2-His 2,78E+05 2,26E-03 8,12E-09 5

hTie2-mFc

7,40E+05 1,47E-04 1,99E-10 79

H1H2331B

hTie2-His 5,48E+04 4,74E-03 8,65E-08 2

hTie2-mFc

1,28E+05 1,99E-04 1,56E-09 58

H1H2332B

hTie2-His 9,58E+04 8,19E-03 8,55E-08 1

hTie2-mFc

1,81E+05 6,52E-04 3,60E-09 18

H1H2333S

hTie2-His 6,20E+04 9,83E-04 1,58E-08 12

hTie2-mFc

SU SU SU SU

Anticuerpo

Analito ka (Ms-1) kd (s-1) Kd (Molar) T1^ (min)

H1H2337B

hTie2-His 8,35E+04 2,41E-03 2,89E-08 5

hTie2-mFc

1,92E+05 2,55E-04 1,33E-09 45

H1H2338B

hTie2-His 5,55E+04 9,93E-04 1,79E-08 12

hTie2-mFc

SU SU SU SU

H1H2339B

hTie2-His 6,78E+04 4,88E-03 7,20E-08 2

hTie2-mFc

1,93E+0305 2,95E-04 1,53E-09 39

H1H2340B

hTie2-His 9,75E+04 9,98E-03 1,02E-07 1

hTie2-mFc

2,00E+05 5,15E-04 2,58E-09 22

H4H2055N

hTie2-His 5,49E+05 04 8,01E-1,46E-09 14

hTie2-mFc

1,67E+06 1,55E-04 9,30E-11 74

Control I

hTie2-His 7,48E-04 1,12E-03 1,49E-08 10

hTie2-mFc

1,80E+05 1,70E-04 9,40E-10 68

SU = sin unión en las condiciones sometidas a ensayo NE = no sometido a ensayo

Tabla 3: Afinidades de unión de Biacore de mAb humanos contra mTie2 a 25 °C

Unión a 25 ° formato de captura de Mab

Anticuerpo

Analito ka (Ms-1) kd (s-1) Kd (Molar) T1^ (min)

H2aM2760N

mTie2-hFc SU SU SU SU

H2aM2761N

mTie2-hFc SU SU SU SU

H1M2055N

mTie2-hFc 1,07E+06 1,85E-05 1,73E-11 625

H1H2304B

mTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2317B

mTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2322B

mTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2324B

mTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2331B

mTie2-hFc 4,81E+04 2,72E-03 5,65E-08 4

H1H2332B

mTie2-hFc 5,39E+04 5,76E-03 1,07E-07 2

H1H2333S

mTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2337B

mTie2-hFc 1,87E+05 1,84E-02 9,83E-08 1

H1H2338B

mTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2339B

mTie2-hFc 4,68E+04 2,63E-03 5,63E-08 4

H1H2340B

mTie2-hFc 1,36E_05 6,72E-03 4,96E-08 2

H4H2055N

mTie2-hFc 1,24E+06 6,19E-06 5,01E-12 1867

Control I

mTie2-hFc SU SU SU SU

SU = sin unión en las condiciones sometidas a ensayo

5 Tabla 4: Afinidades de unión de Biacore de mAb humanos contra rTie2 a 25 °C

Unión a 25 ° formato de captura de Mab

Anticuerpo

Analito ka (Ms-1) kd (s-1) Kd (Molar) T1^ (min)

H2aM2760N

rTie2-hFc SU SU SU SU

H2aM2761N

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1M2055N

rTie2-hFc 9,43E+05 2,55E-05 2,70E-11 454

H1H2304B

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2317B

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2322B

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2324B

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2331B

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2332B

rTie2-hFc 1,12E+05 6,18E-03 5,53E-08 2

H1H2333S

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2337B

rTie2-hFc 1,45E+05 8,46E-03 5,85E-08 1

H1H2338B

rTie2-hFc SU SU SU SU

Anticuerpo

Analito ka (Ms-1) kd (s-1) Kd (Molar) T1X (min)

H1H2339B

rTie2-hFc SU SU SU SU

H1H2340B

rTie2-hFc 1,43E+05 3,71E-03 2,59E-08 3

H4H2055N

rTie2-hFc 1,07E+06 1,00E-06 9,31E-13 11550

Control I

rTie2-hFc SU SU SU SU

SU = sin unión en las condiciones sometidas a ensayo

Ejemplo 3. Cartografiado de epítopos de mAb contra Tie2 usando Perlas Luminex

Para determinar la unión al dominio para los anticuerpos anti-Tie2, varias construcciones de supresión de dominio 5 extracelular del receptor hTie2 se unieron covalentemente a perlas xMAP de luminex (10 pg/ml de cada proteína por 107 cuentas). Las construcciones se representan en la Figura 1 y se designan como se indica a continuación: hTie2 (Ig1-Ig2-EGF) (SEQ ID NO: 7); hTie2 (Ig2-EGF) (SEQ ID NO: 8); hTie2 (EGF) (SEQ ID NO: 9); hTie2 (Ig3-FN) (SEQ ID NO: 10); y hTie2 (FN) (SEQ ID NO: 11). También se sometieron a ensayo en este Ejemplo las construcciones de ectodominio hTie2-mFc (SEQ ID NO: 4) y hTie1-hFc (SEQ ID NO: 12) de longitud completa.

10

Para la unión, se añadieron 25 pl de anticuerpo anti-Tie2 (25 pg/ml) a 75 pl de la mezcla de perlas Luminex creadas anteriormente (3x103 perlas por construcción) en tampón de unión (PBS, Tween 20 al 0,05 %, BSA 1 mg/ml, azida sódica al 0,05 %) en una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore). La incubación se realizó a temperatura ambiente (TA) durante 90 minutos o durante la noche a 4 °C con agitación. Las perlas se lavaron 3 veces con tampón de 15 lavado (PBS + Tween 20 al 0,05 %) se resuspendieron en 100 pl de tampón de unión que contenía anticuerpo anti- kappa humano marcado con PE (ficoeritrina) o anticuerpo secundario anti Fab de ratón marcado con PE y se incubaron a temperatura ambiente durante 45 min con agitación. Las muestras se lavaron dos veces más y la señal de unión (IFM) para cada perla se determinó usando un instrumento Luminex L200 o FLEXMAP3D. Se usó Tie2 humana unida a perlas como control positivo y se usó Tie1 humana unida a perlas para medir la reactividad cruzada 20 de la familia. En general, las señales de IFM mayores de 500 unidades representan una unión significativa. Los resultados se resumen en la Tabla 5.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo humano aislado que se une específicamente a Tie2 humana e inhibe la señalización mediada por Tie2, en el que el anticuerpo comprende las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo

   5 producido a partir de una estirpe celular depositada en la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) con el número de acceso PTA 12295 y una región constante de IgG4 humana.
2. 2. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

   10
3. 3. Una composición farmacéutica para su uso en la inhibición del crecimiento de un tumor en un paciente, comprendiendo la composición farmacéutica el anticuerpo de la reivindicación 1 y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

   en

   Construcciones de supresión de hTie2

   N

   Igl Ig2 EGF Ig3 FN1 FN2 FN3

   hTie2-mFc

   imagen1

   121

   344

   344

   [SEQ. ÍD ÍMO:4] hTie2 (Igl-Ig2-EGF) [seqidno:?]

   hTie2 (ig2-EGF) [seqidno:8]

   210 344

   hTie2 (EGF) [seqidno:9]

   350 730

   imagen2

   imagen3

   hTie2 (Ig3-FN) [seqidno:10] hlie2 (FN) [seqid mo:113

   m hAngl

   imagen4

   (hTie2.mFc)

   Superficie

   0 hAng2 O mAng3 0 hAng4

   t i__

   Superficie

   (Receptor

   negativo)

   imagen5

   (hTie2.mFc+ (hTie2.mFc + H4H2055N) Control I)

   Superficie Superficie

   imagen6

   Crecimiento tumoral de HT29

   en

   Curvas de crecimiento tumoral

   imagen7

   A

   Crecimiento tumoral desde el inicio del tratamiento

   1500-1

   imagen8

   B

   Densidad de vasos de HT29

   Densidad de vasos tumorales al final del experimento

   QJ

   '03

   <D

   "O

   imagen9

   w

   O

   co

   03

   >

   CU

   "O

   "O

   03

   \n C CU O

   imagen10

   Volumen tumoral (mm3)

   Crecimiento del tumor Colo205

   Curvas de crecimiento tumoral Crecimiento tumoral desde el inicio del tratamiento

   imagen11

   A

   E

   E

   cc ■_

   c

   E

   c

   <u

   E

   o

   >

   imagen12

   Densidad de vasos de Colo205

   Densidad de vasos tumorales al final del experimento (21-28 días de tratamiento)

   cu

   <D

   '<Ü

   <D

   "O

   imagen13

   (/>

   O

   (f)

   cu

   >

   CD

   ~a

   TD

   cu

   ■g

   '</)

   c

   CD

   D

   8-

   imagen14

   *

   imagen15

   imagen16