ES2697324T3 - Proceso para proporcionar a las plantas resistencia al estrés abiótico - Google Patents

Proceso para proporcionar a las plantas resistencia al estrés abiótico Download PDF

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Anka Thümmler
Doreen Bartels
Anatoli Giritch
Yuri Gleba
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Abstract

Un proceso para proporcionar a una pluralidad de plantas una tolerancia mejorada al estrés por sequía, en el que las plantas son plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, que comprende (a) cultivar dicha pluralidad de plantas en un campo agrícola; (b) determinar si el estrés por sequía afecta a dichas plantas; (c) proporcionar a las partes aéreas de dichas plantas una suspensión que contiene células de una cepa de Agrobacterium que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una construcción de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos de interés, dicha secuencia de nucleótidos de interés proporcionando a dichas plantas una resistencia aumentada al estrés por sequía después de la expresión en dichas plantas, en donde dichas plantas se transfectan de forma transitoria con dicha molécula de ácido nucleico.

Description

DESCRIPCIÓN
P ro ce so p ara p ro p o rc io n a r a las p la n ta s re s is te n c ia al e s tré s a b ió tico
Campo de la invención
La p rese n te in ve n c ió n se re fie re a un p ro ce so p ara p ro p o rc io n a r a una p lu ra lid a d de p la n ta s una re s is te nc ia a u m e n ta d a al e stré s p o r sequía .
Antecedentes de la invención
La to le ra n c ia al e stré s a b ió tico de las p la n ta s es de g ran im p o rta n c ia para la a g ricu ltu ra en co n d ic io n e s m e d io a m b ie n ta le s a dve rsa s , ya q ue la p ro d u cc ió n de sem illa s , fru to s y b io m a sa de las p la n ta s p ue de v e rse a fe c ta d a su s ta n c ia lm e n te p o r la s e q u ía u o tro s t ip o s de e stré s a b ió tico que pueden o c u rr ir d u ra n te el p e rio d o de ve g e ta c ió n . Y a se han re a liza d o in te n to s para a u m e n ta r la to le ra n c ia de las p la n ta s de cu ltivo a va r io s tip o s de e stré s a b ió tico (p o r e je m p lo , e stré s p o r frío, e s tré s p o r ca lo r, e s tré s p o r agua, e s tré s p o r sal, se q u ía ) m e d ia n te m e d io s b io te cn o ló g ico s . El d o cu m e n to W O 2005 /033318 se re fie re a m é to d o s para m e jo ra r la to le ra n c ia al e stré s en las p la n ta s , y d e sc rib e p la n ta s tra n s g é n ica s tra n s fo rm a d a s de m a n e ra e s ta b le con A D N que co d ifica una p ro te ín a de ch o q u e p o r frío a p a rtir de b a c te ria s g ra m p o s itiva s , ta le s com o Bacillus subtilis. Se in fo rm a de una to le ra n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico para p la n ta s tra n sg é n ica s . U na p ro te ín a de ch o q u e p o r frío m e n c io n a d a en el d o cu m e n to W O 2005 /033318 es C sp B de B. subtilis.
C a s tig lio n i e t al., P la n t P h ys io lo g y 147 (2008 ) 446 -455 se re fie re a ch a p e ro n a s de A R N b a c te ria n o que con fie re n to le ra n c ia al e stré s a b ió tico en las p la n ta s y un re n d im ie n to m e jo ra d o de l g ra n o en el m a íz en co n d ic io n e s de a gua lim itad a . La to le ra n c ia al e stré s en los e s ta d io s ve g e ta tiv o y re p ro d u c tivo se in fo rm a con una m e jo r e s ta b ilid a d de re n d im ie n to en el m a íz en co n d ic io n e s de lim itac ió n de agua. T a m b ié n en este e stu d io , se u sa ron las p lan tas tra n s g é n ica s para g e n e s q ue cod ifica n las p ro te ín a s de ch o q u e p or frío.
J ia e t al., Jo u rn a l o f E x p e rim e n ta l B o ta n y 59 (4 ) (2008 ) 739-751 in fo rm a n sob re la in ve s tig a c ió n sob re el p ap e l de l gen de la ca lre ticu lin a (C R T ) en la re sp u e s ta de la p la n ta co n tra la sequía .
El d o c u m e n to W O 2010 /019838 A 2 se re fie re a la p ro d u cc ió n de p la n ta s tra n s g é n ic a s con m e jo r to le ra n c ia al e stré s y /o m e jo r re nd im ie n to . El d o c u m e n to W O 2012 /019660 A1 d e sc rib e un p ro ce so de tra n s fe c c ió n de una p lan ta , que co m p re n d e p u lv e r iza r las p artes de d icha p la n ta con una su sp e n s ió n a cu osa que co n tie n e cé lu la s de una cepa de Agrobacterium y al m e no s un a b ra s ivo su sp e n d id o en d ich a susp en s ió n .
El e stré s a b ió tico se debe a las co n d ic io n e s m e d io a m b ie n ta le s y, p o r lo tan to , a fe c ta g e n e ra lm e n te a la p lan ta co m p le ta . E sta parece s e r la razón de p o r q ué se han u sado las p la n ta s tra n s g é n ica s en la té c n ica a n te r io r para p ro p o rc io n a r a las p la n ta s p ro te ína s que a u m e n ta n la to le ra n c ia al estrés . S in e m b a rg o , la g e n e ra c ió n de líne as de p la n ta s de cu ltivo tra n s g é n ica s es un p roce so que re qu ie re m u ch o tie m p o , y que re qu ie re m u ch o s a ños de d e sa rro llo . A d e m á s, la p la n ta c ió n de cu ltivo s tra n s g é n ico s no se p e rm ite o e stá se ve ra m e n te re s tr in g id a (ta l com o su uso com o a lim e n to para a n im a le s ) en v a r io s pa íses , p o r lo que los e n fo q u e s d e sc rito s en la té c n ica a n te r io r no se pueden u sa r en d ich os países . A d e m á s, las p la n ta s tra n s g é n ica s con tien en g e n e ra lm e n te g enes m a rca d o re s s e le cc io n a b le s que se u sa ro n p ara s e le cc io n a r p la n ta s tra n s fo rm a d a s o cé lu la s de las m ism as . El uso de g en es m a rc a d o re s s e le cc io n a b le s en p la n ta s tra n s g é n ic a s es una p re o cu p a c ió n im p o rta n te p ara los c rít ico s de las p la n ta s tra n s g é n ica s , ya que la p ro p a g a c ió n de g enes con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s puede p e rju d ic a r la u tilid ad de los a n tib ió tico s en m e d ic ina , y la p ro p a g a c ió n de g e n e s con re s is te n c ia a los h e rb ic id a s en las m a le za s p ue de p e rju d ica r la u tilid ad de los h e rb ic ida s . P o r lo tan to , los m é to d o s de p ro te cc ió n co n tra el e s tré s a b ió tico de l d o c u m e n to W O 2005 /033318 y C a s tig lio n i e t al. son p ro b le m á tico s e co ló g ica m e n te .
Un o b je to de la inve nc ión es p ro p o rc io n a r a una p la n ta una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e strés a b ió tico (p a rticu la rm e n te , a la seq u ía ). O tro o b je to de la inve n c ió n es p ro p o rc io n a r un p ro ce so para p ro p o rc io n a r a una p lan ta una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e stré s a b ió tico (p a rticu la rm e n te , a la seq u ía ), que te n g a una se g u rid a d m e d io a m b ie n ta l m e jo ra d a y /o que no re qu ie ra la p rop a ga c ió n de g en es con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s o a los h e rb ic id a s en el m e d io a m b ie n te . O tro o b je to de la inve nc ión es p ro p o rc io n a r un p roce so para p ro p o rc io n a r a las p la n ta s de cu ltivo una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico (p a rticu la rm e n te a la se q u ía ) que se p ue da u sa r en p a íses d o n d e no se p e rm ite la p la n ta c ión de p la n ta s de cu ltivo tra n sg é n ica s .
Sumario de la invención
P o r con s ig u ie n te , la p re se n te inve n c ió n p ro p o rc io n a lo s igu ien te :
(1 ) Un p ro ce so p ara p ro p o rc io n a r a una p lu ra lid a d de p la n ta s u na to le ra n c ia m e jo ra d a al e s tré s p o r seq u ía , en el q ue las p la n ta s son p la n ta s m o n o co tile d ó n e a s o d ico tile d ó n e a s , q ue co m p re n d e
cu ltiv a r d ich a p lu ra lida d de p la n ta s en un ca m p o agríco la ;
d e te rm in a r si el e stré s p o r se q u ía a fe c ta a d ich a s p lan tas;
p ro p o rc io n a r a las p artes a é re a s de d ich a s p la n ta s una su sp e n s ió n que co n tie n e c é lu la s de una cepa de Agrobacterium q ue co m p re n d e una m o lé cu la de á c id o n u c le ico que co m p re n d e una co n s tru c c ió n de á c id o n u c le ico que con tien e una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés, d icha se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés p ro p o rc io n a n d o a d ich a s p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s p o r se q u ía d e s p u é s de la e xp re s ió n en d ich a s p lan tas , en d on de d ich a s p la n ta s se tra n s fe c ta n de fo rm a tra n s ito r ia con d ich a m o lé cu la de á c id o nuc le ico .
(2 ) El p ro ce so de a cu e rd o con el a rtíc u lo 1, en el que , a n te s de d ich a e ta p a de p ro p o rc io n a r a las p arte s a é re a s de d ich a p la n ta d ich a su sp e n s ió n , d ich a p la n ta o d ich a p lu ra lid a d de p la n ta s no co n tie n e (n ) un gen q ue p ro p o rc io n a a d ich a (s ) p la n ta (s ) d ich a to le ra n c ia al e stré s ab ió tico .
(3 ) El p ro ce so de a cu e rd o con el a rtíc u lo 1 o 2, en el q u e d ich a s e c u e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s co d ifica una p ro te ín a cap az de p ro p o rc io n a r a d ich a (s ) p la n ta (s ) d icha to le ra n c ia a u m e n ta d a al e s tré s p o r sequía .
(4 ) El p ro ce so de a cu e rd o con el a rtícu lo 3, en el q ue d ich a p ro te ína
- co m p re n d e o co n s is te en una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24; o
- co m p re n d e o c o n s is te en una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s que tie n e al m e n o s una ide n tid a d de se cu e n c ia del 80 % a la se c u e n c ia de a m in o á c id o s co m p le ta de u na cu a lq u ie ra de las S E Q ID N O : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24; o
- co m p re n d e o co n s is te en una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de una lon g itu d de al m e no s el 80 %, p re fe re n te m e n te , de al m e n o s el 90 %, m á s p re fe re n te m e n te , de al m e no s el 95 % del n úm e ro de res tos de a m in o á c id o s de u na cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 y una id e n tid a d de se cu e n c ia de al m e n o s el 90 % a las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24, re sp e c tiva m e n te , sob re d ich a long itud ; o
- co m p re n d e o co n s is te en una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que tie n e de 1 a 20 a d ic ion es , s u s titu c io n e s o d e le c io n e s de a m in o á c id o s en c o m p a ra c ió n con la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de una c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.
(5 ) El p roce so de a cu e rd o con el a rtícu lo 3, en el que d ich a p ro te ín a tie n e un d o m in io de ch o q u e p o r frío, p re fe re n te m e n te , d ich a p ro te ín a es una ch a p e ro n a de A R N que tie n e un s itio de un ión para A R N m o no ca ten a rio .
(6 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 3 a 5, en el que d ich a p ro te ín a co m p re n d e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la S E Q ID NO: 2 o de la S E Q ID NO : 4,
o d ich a p ro te ín a co m p re n d e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s que tie n e al m e n o s una ide n tid a d de l 80 % sob re to d o el in te rva lo de la S E Q ID NO: 1 o N O :2.
(7 ) El p ro ce so de a cu e rd o con e l a rtíc u lo 6, en el q u e d ich a p ro te ín a q ue t ie n e al m e n o s u na id e n tid a d de l 80 % so b re to d o el in te rva lo de la S E Q ID N O :2 tie n e al m e n o s los re s to s de a m in o á c id o s de C sp A de W 11 , F18, F20, F31, H 33 y F34 de E. coli en las p o s ic io n e s c o rre sp o n d ie n te s a e s ta s p o s ic io n e s en C sp A de E. coli.
(8 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 3 a 7, en el que d ich a p ro te ín a es C sp B de B. sub tilis .
(9 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 1 a 8, en el que d ich a su sp e n s ió n que puede s e r a cu o sa con tien e d ich a s cé lu la s de d ich a cepa de A g ro b a c te r iu m en una c o n ce n tra c ió n de co m o m á x im o 2 ,2 • 107, p re fe re n te m e n te , de co m o m á x im o 1.1107 , m á s p re fe re n te m e n te , de co m o m á x im o 4.4106 , m ás p re fe re n te m e n te , de com o m á x im o 1.1106 U F C /m l de d ich a susp en s ió n .
(10 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 1 a 9, en el que d ich a su sp e n s ió n con tie n e a d e m á s un a b ra s ivo su sp e n d id o en d ich a su sp e n s ió n , s ien do d ich o a b ra s ivo p re fe re n te m e n te un v e h ícu lo in o rg á n ico en p a rtícu la s p ara p o lvos h u m e cta b le s , ta le s com o s ílice o ca rbo ru nd o .
(11 ) El p roce so de a cu e rd o con el a rtícu lo 10, en el que d ich a su sp e n s ió n con tie n e d ich o a b ra s ivo en una can tid a d de e n tre 0 ,02 y 2, p re fe re n te m e n te , e n tre 0 ,05 y 1 y, m ás p re fe re n te m e n te , e n tre 0,1 y 0 ,5 % en peso de d ich a susp en s ió n .
(12 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 1 a 11, en el que d icha su sp e n s ió n co m p re n d e a d e m á s un a d yu va n te de p u lve r iza c ió n a g ríco la , p re fe re n te m e n te , un a ge n te te n s io a c tiv o o h u m e cta n te no ión ico , p re fe re n te m e n te , el a d yu va n te de p u lve r iza c ió n es un a ge n te h u m e cta n te de o rg a n o s ilico n a , ta l com o S ilw e t L-77.
(13 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 1 a 12, en el que la co n s tru cc ió n de á c ido n u c le ico e stá f la n q u e a d a p o r u na se cu e n c ia borde de A D N -T en al m e n o s un lado, que p e rm ite la tra n s fe re n c ia de d ich a co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico en las cé lu la s de d ich a p lan ta .
(14 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 1 a 13, en el que d ich a co n s tru cc ió n de á c ido n u c le ico e stá p re se n te en A D N -T y f la n q u e a d a en a m b o s lados p o r s e cu e n c ia s b o rd e de A D N -T , no c o n te n ie n d o d ich o A D N -T un m a rc a d o r s e le cc io n a b le que p e rm ita la se le cc ió n de la p la n ta o cé lu la ve g e ta l que co n te n g a d ich o A D N -T .
(15 ) El p ro ce so de a cu e rd o con u no cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 1 a 14, en el q ue d ich a s e c u e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s e stá u n ida o p e ra tiv a m e n te a un p ro m o to r a c tivo en cé lu las veg e ta les .
(16 ) El p roce so de a cu e rd o con uno cu a lq u ie ra de los a rtícu lo s 1 a 15, en el que d ich a co n s tru cc ió n de á c ido n u c le ico co d ifica un re p licó n de A D N o A R N q ue co d ifica d ich a p ro te ína .
La inve n c ió n d e sc rib e a d e m á s lo s igu ien te :
(20 ) la m o lé cu la o v e c to r de A D N p ara la tra n s fo rm a c ió n m e d ia d a p o r A g ro b a c te riu m de las p la n ta s , que co m p re n d e en el A D N -T una co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico que con tien e una se cu e n c ia de A D N de in te rés u n id a o p e ra tiva m e n te a un p rom oto r; d ich a se cu e n c ia de A D N de in te ré s co d ifica n d o una p ro te ín a cap az de p ro p o rc io n a r a una p la n ta d icha to le ra n c ia a u m e n ta d a al e stré s p o r sequ ía ; no co n te n ie n d o d ich o A D N -T un m a rc a d o r s e le cc io n a b le q ue p e rm ita la se le cc ió n de cé lu la s v e g e ta le s que co n te n g a n d icho A D N -T .
(21 ) U na cé lu la de A g ro b a c te riu m q ue co m p re n d e la m o lé cu la de A D N del a rtícu lo 20.
(22 ) La cepa de A g ro b a c te riu m que co m p re n d e una m o lé cu la de A D N h e te ró lo g a que co m p re n d e en el A D N -T una co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico que co n tie n e una se cu e n c ia de A D N h e te ró lo g a de in te ré s un ida o p e ra tiv a m e n te a un p rom o to r; d ich a s e cu e n c ia de A D N h e te ró lo g a de in te ré s co d ific a n d o una p ro te ín a ca p a z de p ro p o rc io n a r a una p lan ta una re s is te n c ia a u m e n ta d a a la seq u ía ; no co n te n ie n d o d ich o A D N -T un m a rc a d o r s e le cc io n a b le que p e rm ita la se le cc ió n de cé lu la s v e g e ta le s que co n te n g a n d icho A D N -T .
(23 ) C o m p o s ic ió n que co n tie n e cé lu la s de una cepa de A g ro b a c te riu m , d ich a cepa de A g ro b a c te r iu m que co m p re n d e una m o lé cu la de A D N h e te ró lo g a que co m p re n d e una c o n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico que co n tie n e una se cu e n c ia de A D N h e te ró lo g a de in te ré s u n ida o p e ra tiva m e n te a un p rom oto r; d icha se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s p ro p o rc io n a n d o re s is te n c ia a u m e n ta d a al e strés p o r se q u ía a una p la n ta d e sp u é s de la e xp re s ió n en d ich a p lan ta ; c o m p re n d ie n d o a d e m á s o p c io n a lm e n te d ich a co m p o s ic ió n un a ge n te h u m e cta n te p re fe re n te m e n te no ión ico ta l com o un te n s io a c tiv o de o rg a n o s ilico n a .
(24 ) La co m p o s ic ió n de a cu e rd o con el a rtícu lo 23, c o m p re n d ie n d o a d e m á s al m e no s un a bra s ivo .
(25 ) La co m p o s ic ió n de a cu e rd o con el a rtícu lo 23 o 24, en d on de d ich a co m p o s ic ió n es una su sp e n s ió n que con tie n e c é lu la s de una cepa de A g ro b a c te riu m y al m e no s un a b ra s ivo su sp e n d id o en d ich a su sp e n s ió n , en d o n d e d ich a su sp e n s ió n c o n tie n e d ich a s c é lu la s de d ich a cep a de A g ro b a c te r iu m en u na c o n ce n tra c ió n de com o m u ch o 4.4107 , p re fe re n te m e n te , de com o m u ch o 1,1 • 107, p re fe re n te m e n te , de co m o m á x im o 4.4106 , m ás p re fe re n te m e n te , de al m e no s 1,1 • 106 U F C /m l de d ich a susp en s ió n .
(27 ) U na p lan ta tra ta d a con una co m p o s ic ió n que con tie n e cé lu la s de una cepa de A g ro b a c te r iu m que co m p re n d e una m o lé cu la de á c id o n u c le ico q ue co m p re n d e una co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico q ue co n tie n e una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés, d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s p ro p o rc io n a n d o a d icha p lan ta una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e stré s p o r se q u ía d e sp u é s de la e xp re s ió n en d ich a p lan ta ; d ich a p lan ta c o n te n ie n d o en sus cé lu la s d ich a se c u e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s y e xp re sa d ich a s e c u e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés.
(28 ) U so de la m o lé cu la de A D N de l a rtíc u lo 20, la cé lu la de A g ro b a c te riu m de l a rtícu lo 21, la cep a de A g ro b a c te r iu m del a rtícu lo 22 o la co m p o s ic ió n de uno c u a lq u ie ra de los a rtícu lo s 23 a 25 p ara c o n fe rir to le ra n c ia al e stré s a b ió tico a una p lan ta .
(29 ) M é to do para c o n fe rir to le ra n c ia al e stré s a b ió tico a una p lan ta , que co m p re n d e las s ig u ie n te s e ta pa s : p re p a ra r una su sp e n s ió n que con tie n e cé lu la s de una cepa de Agrobacterium q ue co m p re n d e una m o lé cu la de á c id o n u c le ico q ue co m p re n d e una c o n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico q ue c o n tie n e una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s, d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s p ro p o rc io n a n d o a d ich a p la n ta una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s p o r se q u ía d e sp u é s de la e xp re s ió n en d ich a p lan ta ; y a p lic a r la s u sp e n s ió n p re p a ra d a en la e ta pa a n te r io r a las p artes a é re a s de d icha p lan ta .
Los in ve n to re s han e n co n tra d o s o rp re n d e n te m e n te q ue es p o s ib le a lc a n z a r re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico ta l co m o re s is te n c ia a la se q u ía en p la n ta s m e d ia n te la e xp re s ió n de m a n e ra tra n s ito r ia en p la n ta s a m e n a z a d a s p o r un e s tré s a b ió tico de una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s, p ro p o rc io n a n d o a d ich a p lan ta re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico d e sp u é s de la e xp re s ió n en d ich a p lan ta . En una re a liza c ió n , la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés co d ifica una p ro te ín a cap az de p ro p o rc io n a r a d ich as p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico . Se d ivu lg a un s is te m a de p ro te cc ió n co n tra el e s tré s a b ió tico , un k it y un m é to d o p ara p lan tas , en el q ue la p ro v is ió n de un gen e x tra ñ o (ta l com o la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s ) a d ich a p la n ta se p uede re s tr in g ir a co n d ic io n e s m e d io a m b ie n ta le s en las q ue o cu rre o se e sp e ra q u e o cu rra e s tré s a b ió tico . Si no o cu rre ni se e sp e ra n in g ún e stré s a b ió tico , no es n e ce sa rio p ro p o rc io n a r a las p la n ta s un gen e x tra ñ o o tra n sg é n , p o r e je m p lo , que co d ifiq u e d ich a p ro te ína , y se p ue de e v ita r. P o r c o n s ig u ie n te , el p ro ce so de la in ve n c ió n es útil in c lu so p ara p a íse s en los q u e no se p e rm ite la a g ric u ltu ra u tiliz a n d o p la n ta s tra n s g é n ic a s (q u e co n tie n e n un gen e x tra ñ o in c o rp o ra d o de m a n e ra e s ta b le y h e re d ita ria en un c ro m o so m a ).
La inve n c ió n p e rm ite que un s is te m a de g e s tió n de cu ltivo s en el q ue las p la n ta s a las que se p ro p o rc io n ó una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico de a cu e rd o con los p ro ce so s de la inve n c ió n p uedan e xc lu irse de u sa rse p ara la p rod u cc ión de a lim e n to s para los se res h um a no s , pero en su lugar, puedan u sa rse para la p rod u cc ió n de a lim e n to s p ara a n im a le s o p ara la p ro d u cc ió n de b io co m b u s tib le . S in e m b a rg o , las p la n ta s a las que no se p ro p o rc io n ó u na re s is te n c ia a u m e n ta d a al e stré s a b ió tico d eb ido a las c o n d ic io n e s m e d io a m b ie n ta le s fa v o ra b le s en un p e río d o de c u ltivo p u e d e n u sa rse p ara la p ro d u cc ió n de a lim e n to s p ara se re s h u m a n o s . La in ve n c ió n re p re se n ta una g ran m e jo ra en co m p a ra c ió n con los m é to d o s de m e jo ra de l e s tré s a b ió tico de la té c n ica a n te r io r (d o cu m e n to W O 2005 /033318 ; C a s tig lio n i e t al., P lan t P h ys io lo g y 147 (2008 ) 446 -455 ) en los que se p lan tan las p lan tas tra n s g é n ica s inc lu so en p e río d o s de cu ltivo en los q ue no se n e ce s ita una to le ra n c ia m e jo ra d a al estrés.
P ue s to q ue la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s que, d e sp u é s de la e xp re s ió n , p ue de p ro p o rc io n a r una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico se p ro p o rc io n a de m a n e ra tra n s ito r ia a d ich a s p la n ta s , es dec ir, sin la n e ce s id a d de un gen m a rc a d o r s e le cc io n a b le ta l com o un gen con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s o un gen con re s is te n c ia a los h e rb ic id a s y sin s e le c c io n a r las c é lu la s v e g e ta le s q u e han in c o rp o ra d o d ich o g en con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s o gen con re s is te n c ia a los h e rb ic id a s , no se in se rta en las p la n ta s n in g ú n g en con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s o gen con re s is te n c ia a los h e rb ic ida s , y se puede e v ita r en g ran m e d id a la p ro p a g a c ió n de d ich os g en es en el m e d io a m b ie n te con e stas p lan tas . P o r lo tan to , ta m b ié n p o r esta razón, el p roce so de la inve nc ión tien e una se g u rid a d m e d io a m b ie n ta l m e jo ra d a en c o m p a ra c ió n con los s is te m a s de p ro te cc ió n co n tra el e s tré s a b ió tico de la té c n ica a n te r io r que se b asan en p la n ta s tra n sg é n ica s . El h echo de p ro p o rc io n a r la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s de la in ve n c ió n de m a n e ra tra n s ito r ia a p la n ta s con c o n d ic io n e s de e s tré s a b ió tico p ro p o rc io n a una ve n ta ja se le c tiva p ara las p la n ta s tra ta d a s .
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 m u e s tra e sq u e m á tic a m e n te ve c to re s de p lá sm id o s u sa d o s p ara c lo n a r g e n e s de in te rés. pNMD2492 es un v e c to r tra n s c rip c io n a l no re p lica n te . RB y LB re p re se n ta n los b ordes d e re ch o e izq u ie rd o de A D N -T . P35S : p ro m o to r 35S del v iru s de l m o sa ico de la co liflo r; O: p o te n c ia d o r tra d u cc io n a l o m eg a; P19: s u p re so r P19 de P T G S de l v iru s de e n a n ism o ra m ifica d o de l to m a te ; Tnos: te rm in a d o r de n o p a lin a s in tasa ; T o cs : te rm in a d o r de ocs. pNMD035 es un v e c to r v ír ico b asad o en T M V con ca p a c id a d de m o v im ie n to de cé lu la a cé lu la . P act2 : p ro m o to r de gen a c tin a 2 de Arabidopsis; o: e x tre m o 5' de T V C V (v iru s de l a c la ra m ie n to de las v e n a s de nabo); R dR p: m a rco de lec tu ra a b ie rto (O R F , p o r sus s ig la s en ing lé s) de A R N p o lim e ra sa d e p e n d ie n te de A R N de c r-T M V (to b a m o v iru s que in fe c ta c ru c ífe ras ); M P: O R F de p ro te ín a de m o v im ie n to de c r-T M V ; N: re g ión 3' no tra d u c id a de c r-T M V ; T n o s o nos: te rm in a d o r de n op a lin a s in tasa ; se g m e n to s b la n co s que in te rru m p e n s e g m e n to s g rises en el R dR p y el O R F de M M P ind ican in tron es in se rta d o s en e s to s O R F para a u m e n ta r la p ro b a b ilid a d de fo rm a c ió n de re p lico n e s de A R N en el c ito p la s m a de c é lu la s ve g e ta le s , que se d e sc rib e con d e ta lle en el d o c u m e n to W O 2005049839. pNMD661 es un v e c to r b asad o en T M V q ue ca re ce de c a p a c id a d de m o v im ie n to de cé lu la a cé lu la . U na m u ta c ió n en el O R F de M P co n d u ce a un d e s p la z a m ie n to de l m a rco que im p ide la tra d u cc ió n de M P co rre c ta . pNMD670 es un v e c to r b a sad o en P V X (v iru s X de p a ta ta ) con cap ac id ad de m o v im ie n to de c é lu la a cé lu la . P V X -p o l: A R N p o lim e ra sa d e p e n d ie n te de A R N de P VX; C P: O R F de p ro te ín a de cu b ie rta : 25K , 12K y 8 ind ican ju n to s los m ó d u lo s de l tr ip le b lo q u e de g e n e s 25 K D A , 12 kD a y 8 kD a de PVX; N: re g ión no tra d u c id a 3' de p V x . pNMD694 es un v e c to r b asad o en P V X con d e le c ió n de la se cu e n c ia co d ifica n te de la p ro te ín a de cu b ie rta se inh a b ilitó para el m o v im ie n to s is té m ico y de cé lu la a cé lu la .
La Fig. 2 m u e s tra e s q u e m á tic a m e n te v e c to re s tra n s c r ip c io n a le s p ara la e xp re s ió n de la s u b u n id a d B-1 de l fa c to r de tra n s c rip c ió n n u c le a r (N F -Y B 1 ) de Arabidopsis thaliana (G e n B a n k : N M _ 129445.2 ) (co n s tru cc ió n de p lá sm id o p N M D 3486 ) y p ro te ín a de ch o qu e p o r frío C sp B de la cep a J H 642 de Bacillus subtilis sub sp . subtilis (G en B an k : A A B 01346 ) (co n s tru cc ió n de p lá sm id o p N M D 3493 ).
La Fig. 3 m u e s tra las p la n ta s N 90 -740 de Brassica napus 11 d ías d e sp u é s de la p u lve riza c ió n , 11 d ías de sequía .
La Fig. 4 m u e s tra las p la n ta s N 90 -740 de Brassica napus 18 d ías d e sp u é s de la p u lve riza c ió n , 11 d ías de sequ ía , 7 d ías de re a n u d a c ió n de l riego.
La Fig. 5 m u e s tra las p la n ta s N 90 -740 de Brassica napus 26 d ías d e sp u é s de la p u lve riza c ió n , 11 d ías de sequ ía , 7 d ías de re a n u d a c ió n de l riego, 8 d ías de sequía .
La Fig. 6 m u e s tra las p la n ta s N 90 -740 de Brassica napus 26 d ías d e sp u é s de la p u lve riza c ió n , 11 d ías de sequ ía , 7 d ías de re a n u d a c ió n de l riego, 13 d ía s de sequ ía , 1 d ía de re a n u d a c ió n de l riego.
La Fig. 7 m u e s tra e s q u e m á tic a m e n te v e c to re s v ír ic o s P V X con ca p a c id a d de m o v im ie n to s is té m ico u sa d o s para la e xp re s ió n de g en es de in te ré s en p la n ta s de to m a te . R B y LB re p re se n ta n los b ordes d e re ch o e izq u ie rd o de A D N -T . P 35S : p ro m o to r 35S de l v iru s de l m o sa ico de la co liflo r; Pv X -P O L: A R N p o lim e ra sa d e p e n d ie n te de A R N de P VX; CP: O R F de p ro te ín a de cub ie rta ; 25K , 12K y 8 ind ican ju n to s los m ó d u lo s de l tr ip le b lo q ue de g e n e s 25 K D A , 12 kD a y 8 kD a de P VX; N: re g ión no tra d u c id a 3' de PVX; G m R D 22 : se cu e n c ia c o d ifica n te de G m R D 22 (p ro te ín a de d o m in io B U R P lo ca liza d a en a p o p la s to s ) de la so ja Glycine max; B nL A S : se cu e n c ia co d ifica n te de B nL A S (gen de la fa m ilia G R A S ) de co lza Brassica napus; G F P : se cu e n c ia co d ifica n te de la P ro te ína V e rde F lu o re sce n te de m e du sa . V irG N 54 D re p re se n ta la se cu e n c ia co d ifica n te de la p ro te ín a V irG de G V 3101 de Agrobacterium tumefaciens con m u ta c ión N 54D .
La Fig. 8 m u e s tra fe n o tip o s de p la n ta s de to m a te cv. B a lco n y Red tra n s fe c ta d a s Lycopersicon esculentum e xp u e s ta s a se q u ía d u ra n te tre s se m a n a s d e s p u é s de la p u lv e r iza c ió n con a g ro b a c te r ia s q ue a lb e rg a n v e c to re s P V X para la e xp re s ió n de los g en es B n L A S y G m R D 22. La e xp o s ic ió n a la se q u ía se re a lizó d u ra n te 14 días. La Fig. 9 m u e s tra fru to s de p la n ta s de to m a te cv. B a lco n y R ed tra n s fe c ta d a s Lycopersicon esculentum e xp u e s ta s a se q u ía d u ra n te tre s se m a n a s d e sp u é s de la p u lve riza c ió n con a g ro b a c te ria s que a lb e rg a n v e c to re s p V x para la e xp re s ió n de g e n e s B nL A S y G m R D 22. La e xp o s ic ió n a la se q u ía se re a lizó d u ra n te 14 d ías. El re n d im ie n to de los fru to s se e va lu ó 100 d ías d e sp u é s de la p u lve riza c ió n . Los n ú m e ro s 1, 2, 3 etc. re p re se n ta n p lan tas ind iv idu a le s .
La Fig. 10 m u e s tra la b io m a sa de fru to s co se ch a d o s de p la n ta s de to m a te cv. B a lco n y Red tra n s fe c ta d a s Lycopersicon esculentum e xp u e s ta s a se q u ía d u ra n te tre s se m a n a s d e sp u é s de la p u lve r iza c ió n con a g ro b a c te ria s que a lb e rg a n v e c to re s PVX. La e xp o s ic ió n a la seq u ía se re a lizó d u ra n te 14 d ías. El re n d im ie n to de los fru to s se e va lu ó 100 d ía s d e s p u é s de la p u lve r iza c ió n y se c a lcu ló co m o un p ro m e d io p o r p lan ta . 1: p lan ta no tra n s fe c ta d a ; 2: p la n ta s q ue e xp re sa n el gen B nLA S ; 3: p la n ta s q ue e xp re sa n el gen G m R D 22 ; 4: p la n ta s que e xp re sa n G FP.
La F ig .11 re p re s e n ta fe n o tip o s de p la n to n e s de to m a te B a lco n y R ed tra n s fe c ta d a s con G m R D 22 , B n L A S y G F P e xp u e s to s a tra ta m ie n to con P E G 6000.
La Fig. 12 m u e s tra p la n to n e s de to m a te cv. B a lco n y Red Lycopersicon esculentum tra n s fe c ta d o s con G F P y B nL A S que e xp re sa n v e c to re s P V X d e sp u é s de 10 d ía s de re te n c ió n de la irr ig a c ió n y d e sp u é s de la re cu p e ra c ió n (2 h d e sp u é s de l riego). Las p la n ta s se p u lve riza ro n con a g ro b a c te ria s 12 d ías d e sp u é s de la s ie m b ra y se e xp u s ie ro n a seq u ía 12 d ía s d e sp u é s de la p u lve riza c ión .
Descripción detallada de la invención
Los p ro ce so s de la inve nc ión tien en su a p lica c ió n p rin c ip a l en la a gricu ltu ra , es dec ir, a g ran esca la . P o r lo tan to , e s to s p ro ce so s se re a lizan g e n e ra lm e n te con una p lu ra lida d de p la n ta s . P o r co n s ig u ie n te , los p ro ce so s se a p lican g e n e ra lm e n te a una p lu ra lid a d de p la n ta s se m b ra d a s o p la n ta da s , p o r e je m p lo , en un ca m p o a g ríco la . A n te s de re a liz a r el p roce so de la inve nc ión , las p la n ta s se m b ra d a s o p la n ta d a s p re fe re n te m e n te no con tie n e n un gen e xp re sa b le que p ro p o rc io n a a las p la n ta s la to le ra n c ia al es tré s a b ió tico que se p ro p o rc io n a en los p ro ce so s de la inve nc ión . D e fo rm a d e s ta ca b le , las p la n ta s son p re fe re n te m e n te no tra n s g é n ica s para d ich o gen.
D e sp u é s de s e m b ra r o p la n ta r las p la n ta s , un u su ario , que n o rm a lm e n te es un a g ricu lto r, puede o b s e rva r el c re c im ie n to de las p la n ta s y el e s ta d o de sa lu d de las p lan tas . A d e m á s, el u su a rio puede o b s e rva r las co n d ic io n e s m e d io a m b ie n ta le s ta le s com o el c lim a y /o la con d ic ió n de l sue lo para d e te rm in a r si se han d e sa rro lla d o , se están d e s a rro lla n d o o se p u e d e n d e s a rro lla r c o n d ic io n e s de e s tré s a b ió tic o p ara las p la n ta s . La d e te rm in a c ió n de si e s tán p rese n te s co n d ic io n e s de e s tré s a b ió tico puede im p lica r la to m a de m u e s tra s de l sue lo y e xa m en de l sue lo. C om o a lte rn a tiva o a d e m á s , la d e te rm in a c ió n de si están p rese n te s co n d ic io n e s de e s tré s a b ió tico puede im p lic a r la to m a de m u e s tra s de las p la n ta s o de una fra cc ió n de d ich a s p la n ta s y el e xa m e n de las p lan tas.
P a ra d e te rm in a r el e s tré s p o r s e q u ía o el e s tré s p o r sal, se p u e d e e x a m in a r e l c o n te n id o de a g u a o el c o n te n id o de sal, re sp e c tiva m e n te , de una o m ás m u e s tra s de sue lo . En una re a liza c ió n p re fe rid a , los p ro ce so s de la in ve n c ió n se usan p ara m e jo ra r la to le ra n c ia o re s is te n c ia (e s to s té rm in o s se usan de m a n e ra in d is tin ta en el p re se n te d o cu m e n to ) de las p la n ta s co n tra la sequ ía . P o r lo tan to , la d e te rm in a c ió n de l e stré s p o r se q u ía y el d esa rro llo p o s te rio r de d ich o e s tré s p uede im p lica r s e g u ir los p ro n ó s tico s m e te o ro ló g ico s para e va lu a r la p ro b a b ilid a d de lluvia.
La d e te rm in a c ió n de las c o n d ic io n e s de e s tré s p o r se q u ía se co n o ce en la té cn ica , vé a se , p o r e je m p lo , J o n e s e t al., Jo u rn a l o f E xp e rim e n ta l B o ta n y 58 (N o . 2 ) 119 -130 , 2007 ; Idso, A g r ic u ltu ra l M e te o ro lo g y 27, 59-70 , 1982; S h im a d a e t a l., J o u rn a l o f A rid Land S tu d ie s 22-1, 251 -254 , 2012. Las m e d ic io n e s d e l sue lo y /o las m e d ic io n e s de las p la n ta s pueden u sa rse p ara d e te rm in a r o s e g u ir el e s ta do de l a gua que a fe c ta a las p la n ta s . Los m é to d o s co n o c id o s se pueden c la s if ic a r ta m b ié n en m é to d o s d ire c to s y m é to d o s ind ire c to s . E ntre los m é to d o s d irec tos , se p ueden m e n c io n a r la m e d ic ió n de l co n te n id o de a gu a re la tivo (R W C p o r sus s ig la s en ing lé s) de l sue lo o m a te ria ve g e ta l y la m e d ic ió n d ire c ta de l p o te n c ia l de a gu a en la ho ja , p o r e je m p lo , con una cá m a ra de p res ió n , o u sa nd o se n so re s de flu jo de sav ia . E n tre los m é to d o s ind ire c to s , se p ueden m e n c io n a r las te c n o lo g ía s p o r in fra rro jo s re m o to s b a sa d a s en la e va lu a c ió n de la te m p e ra tu ra de l d o se l o m é to d o s e sp e c tro m é tr ico s re m o to s b a sa d o s en la m e d ic ió n de la re fle c ta n c ia e sp e c tra l de l d ose l. C o m o el a gu a se v u e lve una lim ita c ió n , las te m p e ra tu ra s de los cu ltivo s a um e n ta n p o rq u e no pueden tra n s p ira r su fic ie n te a gua para m a n te n e rse fre sco s . Las ho jas de las p la n ta s abren sus e s to m as p ara a d m it ir d ió x id o de ca rb o n o p ara la fo to s ín te s is y al m ism o tie m p o el v a p o r de a gu a flu ye fu e ra de la ho ja , lo que re fre sca la su p e rfic ie de la ho ja . C u a n d o el a gua de l sue lo se v u e lve una lim itac ió n , la tra n s p ira c ió n decre ce , re d u c ie n d o p o r lo ta n to el e fe c to de re fre sca m ie n to de la h o ja y h a c ie n d o que la te m p e ra tu ra de l cu ltivo a um ente . T o d o s los o b je to s e m ite n e n e rg ía o ra d ia c ión q ue se m id en com o su te m p e ra tu ra . P ara los d o se le s de los cu ltivos , la te m p e ra tu ra se m id e n o rm a lm e n te con un te rm ó m e tro in fra rro jo té rm ico . Los te rm ó m e tro s in fra rro jo s (IR T p o r sus s ig la s en ing lé s) e stán d isp o n ib le s en el com e rc io . Irm a k e t al., A g ro n o m y Jo u rn a l, 92, 1221 -1227 , 2000 ) d e sc rib e n la d e te rm in a c ió n de l índ ice de e s tré s p o r a gua de l cu ltivo (C W S I p o r sus s ig la s en in g lé s ) p a ra fin e s de p ro g ra m a c ió n de la irr iga c ió n , pero se puede u sa r ta m b ié n para d e te rm in a r el e strés p o r seq u ía en las p la n ta s para la p rese n te inve n c ió n . O tra s m e d ic io n e s p ara s e g u ir el e s ta d o de a gua son la p res ión de la tu rg e n c ia o la co n d u c ta de los e s tro m a s , y el p o te n c ia l de a gua en el sue lo o en las p lan tas . P ara no d e p e n d e r de d e te rm in a c io n e s a b so lu ta s de las m e d ic io n e s de l e s ta d o de a gu a m e n c io n a d a s a n te rio rm e n te , se p uede s e g u ir el e s ta d o de a gu a co n tin u a m e n te o re g u la rm e n te para re c o n o c e r fá c ilm e n te el d e sa rro llo del e s tré s p o r sequía .
En el e s ta d o d e se a d o de l c re c im ie n to de la (s ) p la n ta (s ) o cu a n d o el u su a rio ha d e te rm in a d o q ue la re s is te n c ia de las p la n ta s co n tra un e s tré s a b ió tico d e b e ría s e r m e jo ra d a , se p ro p o rc io n a a las p la n ta s o a sus p a rte s u na s u sp e n s ió n q ue c o n tie n e c é lu la s de una cep a de Agrobacterium q ue co m p re n d e una m o lé cu la de á c id o n u c le ico q ue co m p re n d e a c o n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico q ue co n tie n e una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s . La se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s puede , d e sp u é s de la e xp re s ió n en las p la n ta s , p ro p o rc io n a r a las p la n ta s una to le ra n c ia a u m e n ta d a al e stré s ab ió tico .
T a m b ié n se d ivu lg a un p ro ce so de p ro d u cc ió n de p la n ta s o p a rte s de d ich a s p la n ta s , q u e co m p re n d e las s ig u ie n te s e tapas:
(A ) cu ltiv a r una p lu ra lid a d de p la n ta s en un cam po;
(B ) d e te rm in a r si el e s tré s p or se q u ía a fe c ta a d ich a s p lan tas;
(C ) si se d e te rm in ó en la e ta pa (B ) q ue el e s tré s p o r se q u ía a fe c ta o p ue de a fe c ta r a d ich a s p lan tas , p ro p o rc io n a r a las p artes a é re a s de d ich a s p la n ta s una su sp e n s ió n que con tie n e cé lu la s de una cep a de A g ro b a c te r iu m que co m p re n d e una m o lé cu la de á c id o n u c le ico q ue co m p re n d e una co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico q ue c o n tie n e una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s, d ich a se c u e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s p ro p o rc io n a n d o a d ich a s p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e stré s p o r se q u ía d e sp u é s de la e xp re s ió n en d ich a s p lan tas;
(D ) c o s e ch a r d ich a s p la n ta s o sus p artes d esea da s ; y
(E ) si la e ta pa (C ) se rea lizó , u sa r la co se ch a de la e ta p a (D ) para un p ro p ó s ito para el cua l es a ce p ta b le h a b e r re a liz a d o la e ta p a (C ); o, si la e ta p a (C ) no se re a lizó , u sa r la co s e ch a de la e ta p a (D ) p ara un p ro p ó s ito p ara el cua l no es a ce p ta b le h a b e r re a liza d o la e ta pa (C).
Un p ro p ó s ito p ara el cua l la re a liza c ió n de la e ta pa (C ) p ue de no s e r a ce p ta b le es la p ro d u cc ió n de a lim e n to s para el co n su m o hum ano . Un p ro p ó s ito para el cu a l la re a liza c ió n de la e ta pa (C ) puede s e r a ce p ta b le es la p rod u cc ión de a lim e n to para a n im a le s o la p rod u cc ió n de b io co m b u s tib le . P o r lo tan to , la inve n c ió n p ro p o rc io n a un s is te m a de p ro d u cc ió n de cu ltivo s y un m é to do para p e río d o s de cu ltivo e n te ros , q ue m e jo ra fu e rte m e n te la e fic ie n c ia g loba l. P o r un lado, se puede re d u c ir la p é rd ida de cu ltivo o m a te ria ve g e ta l d e b id o a la sequ ía , y los cu ltivo s o b io m a sa g u a rd a d o s se p u e d e n u sa r p ara f in e s p ara los c u a le s no es p re o c u p a n te la m o d ifica c ió n g e n é tica . P o r o tro lado, en p e rio d o s en los no se re qu ie ren m e d ic io n e s para a u m e n ta r la to le ra n c ia a la se q u ía d eb ido a co n d ic io n e s m e te o ro ló g ica s fa vo ra b le s , las p la n ta s cu ltiva d a s no se m o d ifica n g e n é tica m e n te , lo que es p re fe rid o p o r a lg u no s c o n su m id o re s o en a lg u n o s países.
En la p re se n te inve nc ión , la se c u e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés p ue de c o d ific a r una p ro te ín a cap az de p ro p o rc io n a r a d ich as p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e stré s a b ió tico ta l com o re s is te n c ia a la se q u ía . C om o a lte rn a tiva , la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s p ue de p rod u c ir, d e sp u é s de la e xp re s ió n , un A R N q ue p ue de p ro p o rc io n a r a las p la n ta s la re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s ab ió tico .
La m o lé cu la de á c id o n u c le ico es g e n e ra lm e n te una m o lé cu la de A D N . En e ste caso, la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s co n te n id a en la m ism a es una se cu e n c ia de A D N de in te rés.
En los p ro ce so s de la inve nc ión , p a rte s de d ich a s p la n ta s se tra n s fe c ta n de m a ne ra tra n s ito r ia con d icha m o lé cu la de á c id o n uc le ico (ve c to r) para la e xp re s ió n tra n s ito r ia de d icha se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés. E sto tie n e la v e n ta ja de q ue una d e c is ió n sob re cu á n d o la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s d e b e ría e xp re sa rs e en las p lan tas, y q ué se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s debe e xp re sa rse , p uede d e m o ra rse h as ta un poco a n tes de l p u n to de tra n s fe c c ió n . El té rm in o "tra n s ito rio " s ig n ifica que no se u tilizan m é to d o s de se le cc ió n p ara s e le cc io n a r cé lu la s o p la n ta s tra n s fe c ta d a s con la m o lé cu la de á c id o n u c le ico (ve c to r) o con la co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico de c é lu la s o p la n ta s no tra n s fe c ta d a s u sa nd o , p o r e je m p lo , un a ge n te se le cc io n a b le y un gen m a rc a d o r se le cc io n a b le cap az de d e s in to x ic a r el a ge n te se le cc io n a b le . C o m o re su ltad o , el á c id o n u c le ico tra n s fe c ta d o se in tro d u ce g e n e ra lm e n te de m a n e ra no e s ta b le en el A D N c ro m o s ó m ico de la p lan ta . En su lugar, los m é to d o s de e xp re s ió n tra n s ito r ia usan el e fe c to de tra n s fe cc ió n en las m ism as cé lu la s de p la n ta s tra n s fe c ta d a s .
U na p o s ib le m a n e ra de a lc a n z a r la e xp re s ió n de d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s es el uso de re p lico n e s (v írico s ) a u to rre p lica n te s que co n tie n e n una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s. S e han d e sc rito los s is te m as de e xp re s ió n v ír ica de p la n ta s en m u ch a s p u b lica c io n e s ta n to para el uso de v e c to re s v ír ic o s de A D N co m o para el uso de v e c to re s v ír ico s de A R N , ta l com o en los d o cu m e n to s W O 2008028661 , W O 2006003018 , W O 2005071090 , W O 2005049839 , W O 2006012906 , W O 0210 'f006 o W O 020 fi8 f i64 y m u ch a s m ás p u b lica c io n e s c ita d a s en e s to s d ocu m e n to s .
Se c o n o ce n v a r io s m é to d o s p ara in tro d u c ir una m o lé cu la de á c id o n u c le ico , ta l co m o u na m o lé cu la de A D N , en una p la n ta o parte de p la n ta para la e xp re s ió n tra n s ito r ia . En la inve nc ión , las a g ro b a c te ria s se usan p re fe re n te m e n te para tra n s fe c ta r p la n ta s con la m o lé cu la de á c id o n u c le ico (ve c to r) o co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico , p o r e je m p lo , p o r a g ro in filtra c ió n . Un s is te m a y m é to d o p ara in filtra c ió n a g ran e sca la de p la n ta s p o r a g ro b a c te r ia s se d e sc rib e n en el d o c u m e n to W O 2009095183. En o tra re a liza c ió n , las p la n ta s o p arte s de p la n ta s se p u lve riza n con una su sp e n s ió n que co n tie n e c é lu la s de una cep a de Agrobacterium, que es ig u a lm e n te a d e cu a d a p ara las a p lica c io n e s a gran e sca la en m u ch a s p la n ta s , com o a p la n ta s en un ca m p o a g ríco la . D ich o s p ro ce so s de tra n s fe c c ió n p o r p u lve riza c ió n se d e sc rib e n con d e ta lle en el d o cu m e n to W O 20121019660.
La cep a de Agrobacterium p ue de p e rte n e c e r a las e sp e c ie s Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes que se usan h a b itu a lm e n te p ara la tra n s fo rm a c ió n y tra n s fe c c ió n de p la n ta s y que son co n o c id a s p o r los e xp e rto s p o r su c o n o c im ie n to g en e ra l. La cepa de Agrobacterium que se va a u sa r en los p ro ce so s de la inve nc ión co m p re n d e una m o lé cu la de A D N (p lá sm id o T i) com o d icha m o lé cu la de á c id o n uc le ico , que co m p re n d e una co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico que co n tie n e una se cu e n c ia de A D N de in te ré s . La se cu e n c ia de A D N de in te ré s puede c o d ific a r una o m ás de una p ro te ín a para e xp re sa rse en p la n ta s . La co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico está típ ic a m e n te p rese n te en el A D N -T de p lá sm id o s T i para la in tro d u cc ió n de la co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico en cé lu la s v e g e ta le s p o r el s is te m a s e c re to r de la cepa de Agrobacterium. En al m e no s un lado o en a m bo s lados, la co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico e stá f la n q u e a d a p o r una se cu e n c ia borde de A D N -T para p e rm itir la tra n s fe c c ió n de d ich a (s ) p la n ta (s ) y la in tro d u cc ió n en las c é lu la s de d ich a p la n ta de d ich a co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico . P re fe re n te m e n te , d ich a co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico e stá p re se n te en A D N -T y f la n q u e a d a en a m b o s lados p o r s e cu e n c ia s b orde de A D N -T .
M ás p re fe re n te m e n te , la co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico está p rese n te en A D N -T de un p lá sm id o T i de la cepa de Agrobacterium. Los p lá sm id o s T i p ue de n c o n te n e r un m a rc a d o r se le cc io n a b le fu e ra de d ich o A D N -T p ara p e rm itir la c lo n a c ió n y la in g e n ie ría g e n é tica en las b ac te ria s . S in e m ba rg o , el A D N -T que se tra n s fie re a las c é lu la s de d icha p la n ta p re fe re n te m e n te no co n tie n e un m a rc a d o r s e le cc io n a b le que, si e s tu v ie ra p re se n te , p e rm itir ía la se le cc ió n de una p la n ta o cé lu la s v e g e ta le s q ue co n tie n e n d ich o A D N -T . E je m p lo s de un gen m a rc a d o r s e le cc io n a b le que, en e s ta re a liza c ió n , no e s ta ría p re se n te en el A D N -T d e l p lá s m id o T i son un gen con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s o un gen con re s is te n c ia a los h e rb ic id a s . D ado que los p ro ce so s de la inve n c ió n usan la tra n s fe c c ió n y e xp re s ió n tra n s ito r ia de d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s (o d ich a p ro te ína ), los p ro ce so s no co m p re n d e n una e ta pa de s e le c c io n a r las c é lu la s v e g e ta le s q ue h ayan in c o rp o ra d o la m o lé c u la de á c id o n u c le ico de la in ve n c ió n m e d ia n te el uso de d ich o g en con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s o un g en con re s is te n c ia a los h e rb ic id a s . P o r c o n s ig u ie n te , no se n e ce s ita in c o rp o ra r n in g ún g en con re s is te n c ia a los a n tib ió tico s o gen con re s is te n c ia a los h e rb ic id a s en d ich a s p la n ta s , p o r lo que la p ro b a b ilid a d de p ro p a g a r d ich os g en es en el m e d io a m b ie n te es b a ja en los p ro ce so s de la inve nc ión .
La co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico co m p re n d e la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s de ta l m a n e ra q u e e sta ú ltim a es e xp re sa b le en c é lu la s ve g e ta le s . P ara este fin, la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s puede esta r, en d icha co n s tru cc ió n de á c id o n uc le ico , ba jo el con tro l de un p ro m o to r a c tivo en las cé lu la s ve g e ta le s . P re fe re n te m e n te , la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s co d ifica una p ro te ína cap az de p ro p o rc io n a r a las p la n ta s una to le ra n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico . E je m p lo s de la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s son una se cu e n c ia de A D N que co d ifica un re p licó n v ír ic o de A D N o un re p licón v ír ico de A R N , o un gen que se va a exp re sa r. El gen p rop o rc ion a , d e sp u é s de la e xp re s ió n , a la p lan ta una to le ra n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico . P re fe re n te m e n te , el gen co d ifica una p ro te ín a c a p a z de p ro p o rc io n a r a la p la n ta u na to le ra n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico . T a m b ié n los re p lico n e s v ír ic o s co d ifica n d ich a p ro te ín a que se va a e xp re sa r en las c é lu la s de la (s ) p la n ta (s ). La co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico puede co m p re n d e r, a d e m á s de la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s, o tras s e cu e n c ia s ta le s com o s e cu e n c ia s re g u la d o ra s p ara la e xp re s ió n de la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s , ta l com o un p ro m o to r y te rm in a d o r de la tra n sc rip c ió n . La co n s tru cc ió n de á c ido n u c le ico puede c o m p re n d e r un gen a d ic io n a l para e xp re sa rse , p o r e je m p lo , un gen que co d ifica un s u p re so r del s ile n c ia m ie n to de g enes ta l co m o la p ro te ín a P19. La e xp re s ió n de d ich o gen a d ic io n a l puede e s ta r b a jo el co n tro l de l m ism o p ro m o to r o uno d ife re n te u sa do para e x p re s a r la p ro te ín a de la in ve n c ió n . La tra n s fe re n c ia de g e n e s m e d ia d a p o r Agrobacterium y los v e c to re s p ara e lla son c o n o c id o s p o r los e xp e rto s en la m a te ria , p o r e je m p lo , a p a rtir de las re fe re n c ia s c ita d a s a n te r io rm e n te o de lib ros de te x to sob re b io te cn o lo g ía de las p la n ta s ta l com o S la te r, S co tt y Fow le r, P lan t B io te ch n o lo g y , seg un da e d ic ión , O x fo rd U n ive rs ity P ress, 2008.
C o m o se usa en el p re se n te d o cu m e n to , la e xp re s ió n "p ro m o to r a c tivo en cé lu la s v e g e ta le s " s ig n ifica una se cu e n c ia de A D N q ue es ca p a z de c o n tro la r (in ic ia r) la tra n s c rip c ió n en una cé lu la v e g e ta l. E s to inc lu ye c u a lq u ie r p ro m o to r de o rige n ve g e ta l, p e ro ta m b ié n c u a lq u ie r p ro m o to r de o rig e n no v e g e ta l q u e es ca p a z de d ir ig ir la tra n s c r ip c ió n en una cé lu la ve g e ta l, es dec ir, c ie rto s p ro m o to re s de o rigen v ír ico o b ac te ria n o ta le s com o el p ro m o to r 35S del v iru s del m o sa ico de la c o lif lo r (p ro m o to r C a M V 35 S ) (H a rp s te r e t al. (1988 ) M o l G en G enet. 212 (1 ):182 -90 , el p ro m o to r del v iru s de l tré b o l s u b te rrá n e o n.° 4 o n.° 7 (d o cu m e n to W O 9606932 ), o los p ro m o to re s de l gen de A D N -T pero ta m b ié n los p ro m o to re s e sp e c ífico s de te jid o s o e sp e c ífico s de ó rg a n o s inc lu ye nd o , pero sin lim ita c ió n los p rom o to res e sp e c ífico s de se m illa s (p o r e je m p lo , W O 89 /03887 ), p ro m o to re s e sp e c ífico s de p rim o rd io s de ó rg a n o s (An e t al. (1996 ) P la n t C e ll 8 (1 ):15 -30 ), p ro m o to re s e sp e c ífico s de l ta llo (K e lle r e t al., (1988 ) E M B O J. 7 (12 ): 3625 -3633 ), p ro m o to re s e sp e c ífico s de la ho ja (H u d sp e th e t al. (1989 ) P la n t M ol B iol. 12: 579 -589 ), p ro m o to re s e sp e c ífico s del m e só filo (ta les co m o los p ro m o to re s de R u b isco in d u c ib le s p o r la luz), p ro m o to re s e sp e c ífico s de la ra íz (K e lle r e t al. (1989 ) G e n es D ev. 3: 1639 -1646 ), p ro m o to re s e sp e c ífico s de l tu b é rcu lo (K e il e t al. (1989 ) E M B O J. 8 (5): 1323 ­ 1330), p ro m o to re s e sp e c ífico s de l te jid o v a s c u la r (P e le m a n e t al. (1989 ) G ene 84: 359 -369 ), p ro m o to re s se le c tivo s del e s ta m b re (d o c u m e n to s W O 89 /10396 , W O 92 /13956 ), p ro m o to re s e sp e c ífico s de la zo n a d e h isce n c ia (d o cu m e n to W O 97 /13865 ) y s im ila re s . P ara la e xp re s ió n tra n s ito r ia , se usan p re fe re n te m e n te los p ro m o to re s c o n s titu tivo s , es dec ir, los p ro m o to re s que no e s tán re g u la d o s p ara el d esa rro llo . S in e m ba rg o , los p rom o to res c o n s titu tivo s pueden s e r e sp e c ífico s de los te jid o s o e sp e c ífico s de los ó rga n os . Los p ro m o to re s p re fe rid o s son los q ue se usan en los e je m p lo s d e sc rito s a con tin u a c ió n .
En el p rese n te d o cu m e n to , el té rm in o "co n s tru cc ió n " s ig n ifica una co n s tru cc ió n re co m b in a n te que co m p re n d e una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s. P re fe re n te m e n te , el c o n s tru c to co d ifica al m e no s una p ro te ín a cap az de p ro p o rc io n a r a d ich a s p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s ab ió tico .
En re a liza c io n e s en las que se d esea una fu e rte e xp re s ió n de la p ro te ína , la co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico puede c o d ific a r un v e c to r v ír ico que p uede re p lica rse en cé lu la s ve g e ta le s p ara fo rm a r re p lico n e s de l v e c to r v ír ico . Para p o d e r s e r re p lica n tes , el v e c to r v ír ic o y los re p lico n e s con tien en un o rige n de re p lica c ió n que puede s e r re co n o c id o p o r una p o lim e ra sa de á c ido n uc le ico p rese n te en las cé lu las ve g e ta le s , ta l com o la p o lim e ra sa v ír ica e xp re sa d a d esde el re p licó n . En el caso de los v e c to re s v ír ico s de A R N (d e n o m in a d o s "re p lico n e s de A R N "), los re p lico ne s pueden fo rm a rse p o r tra n s c rip c ió n ba jo el co n tro l de un p ro m o to r a c tivo en las cé lu la s ve g e ta le s , d esde la co n s tru c c ió n de a D n d e s p u é s de q ue e s ta ú ltim a se h aya in tro d u c id o en los n ú c le o s de las c é lu la s ve g e ta le s . En el caso de re p lico n e s de A D N , los re p lico n e s pueden e s ta r fo rm a d o s p o r re co m b in a c ió n entre d os s itio s de re co m b in a c ió n que fla n q u e a n la se cu e n c ia que co d ific a el re p licó n v ír ico en la c o n s tru cc ió n de A D N , p o r e je m p lo , com o se d e sc rib e en los d o c u m e n to s W O 00 /17365 y W O 99 /22003. Si el re p licó n e stá c o d ifica d o p o r la co n s tru cc ió n de A D N , se p re fie re n los re p lic o n e s de A R N . El uso de A D N y v e c to re s v ír ic o s de A R N (re p lic o n e s de A D N o A R N ) se ha d e sc rito e x te n sa m e n te en la b ib lio g ra fía en el tra n s c u rso de los años. A lg u n o s e je m p lo s son las s ig u ie n te s p u b lica c io n e s de p a ten te : W O 2008028661, W O 2007137788 , W O 2006003018 , W O 2005071090 , W O 2005049839 , W O 02097080 , W O 02088369 , W O 02068664. Un e je m p lo de v e c to re s v ír ic o s de A D N son a q u e llo s b asad os en g e m in iv iru s . P ara la p rese n te inve nc ión , se pueden u sa r los v e c to re s v ír ico s o re p lico n e s b a sa d o s en v iru s de A R N de p la n ta s , e sp e c ia lm e n te , a q u e llo s b a sa d o s en v iru s de A R N m o n o ca te n a r io de se n tid o p os itivo . P o r c o n s ig u ie n te , el re p licó n v ír ic o puede s e r un re p licó n de A R N m o n o ca te n a rio de se n tid o pos itivo . E je m p lo s de d ich o s v e c to re s v ír ic o s son los b a sa d o s en el v iru s de l m o sa ico de l ta b a c o (T M V ) y en el p o te xv iru s X (P V X ). "B a sa d o en" s ig n ifica q ue el v e c to r v ír ico usa el s is te m a de re p lica c ió n ta l co m o la re p lica sa y /u o tras p ro te ín a s im p lica d a s en la re p lica c ió n de e s to s v iru s . Los v e c to re s v ír ic o s b a sad os en p o te xv iru s y los s is te m a s de e xp re s ió n se d e sc rib e n en los d o c u m e n to s E P 2061890 o W O 2008 /028661. M u ch os o tros re p lico n e s v ír ic o s de p la n ta s se d e sc rib e n en las p u b lica c io n e s de p a ten te m e n c io n a d a s a n te rio rm e n te .
En una re a liza c ió n , los p ro ce so s de la in ve n c ió n co m p re n d e n p u lv e r iz a r las p artes a é re a s de d ich a p la n ta con una su sp e n s ió n que con tie n e cé lu la s de una cepa de Agrobacterium q ue co m p re n d e una m o lé cu la de A D N q ue co m p re n d e una c o n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico que con tien e una se cu e n c ia de A D N de in te ré s, p re fe re n te m e n te , q ue co d ifica d ich a p ro te ína .
La su sp e n s ió n que puede u sa rse para p ro p o rc io n a rse a las p artes a é re a s de d ich a p la n ta es una co m p o s ic ió n líqu ida q ue co m p re n d e cé lu la s de Agrobacterium su sp e n d id a s en el líqu ido . La s u sp e n s ió n es g e n e ra lm e n te acu osa , lo q ue s ig n ifica q ue el líq u id o co n tie n e al m e n o s 50, p re fe re n te m e n te , a l m e n o s 80, m ás p re fe re n te m e n te , al m e n o s el 90 % en peso de agua. O tros c o m p o n e n te s en el líqu ido pueden s e r o tros c o m p o n e n te s de l líqu ido co m p a tib le s con el m a n te n im ie n to de las cé lu las de Agrobacterium de una fo rm a v ia b le , q ue p ue de n s e r d iso lve n te s p o la res ta le s com o a lco h o le s p o lih íd rico s o d im e tilsu lfó x id o . O tro s c o m p o n e n te s p ue de n s e r n u trie n te s, m in e ra le s o sa les, a g e n te s ta m p o n a n te s o a d yu va n te s de la p u lve riza c ió n (vé ase m ás aba jo).
La s u s p e n s ió n u sa da p ara p u lv e r iz a r p la n ta s o p arte s de las p la n ta s en el p ro ce so de la in ve n c ió n p u e d e te n e r una c o n ce n tra c ió n de c é lu la s de Agrobacterium de co m o m á x im o de 1,1 • 109 U F C /m l, que co rre sp o n d e a p ro x im a d a m e n te a un cu ltivo de Agrobacterium en m e d io LB de una d en s id a d ó p tica a 600 nm de 1. D eb ido a la a lta e fic a c ia de tra n s fe c c ió n a lca n za b le , e sp e c ia lm e n te , si la p u lv e r iza c ió n se h ace con el uso de un a b ra s ivo y /o un te n s io a c tiv o o a ge n te h u m e cta n te (vé ase m ás a ba jo ), se pueden usar, s in e m ba rg o , c o n c e n tra c io n e s m u ch o m ás ba jas, lo que p e rm ite el tra ta m ie n to de m u ch a s p la n ta s ta le s co m o ca m p o s de c u ltivo e n te ro s sin la n eces id ad de g ra n d e s fe rm e n ta d o re s para la p ro d u cc ió n de Agrobacterium. P o r lo tan to , la c o n ce n tra c ió n p ue de s e r com o m á x im o de 2 ,2 • 107 U F C /m l, p re fe re n te m e n te , co m o m á xim o , de 1,1 • 107 U F C /m l, m ás p re fe re n te m e n te , com o m á xim o , de 4 ,4 • 106 U F C /m l. En una re a liza c ió n , la co n ce n tra c ió n es co m o m á x im o de 1,1 • 106 U F C /m l de la su sp e n s ió n . P ara e v ita r la d e te rm in a c ió n de c o n c e n tra c io n e s ce lu la re s en té rm in o s de U F C /m l, las co n ce n tra c io n e s de su sp e n s io n e s a g ro b a c te ria n a s se e va lú a n fre cu e n te m e n te m id ie n d o la d en s id a d ó p tica a pa re n te a 600 nm u sa nd o un e sp e c tro fo tó m e tro . En el p rese n te d o cu m e n to , la c o n ce n tra c ió n de 1,1 • 107 U F C /m l co rre sp o n d e a una d en s id ad ó p tica ca lc u la d a a 600 nm de 0 ,01, p o r lo q ue la d e n s id a d ó p tica ca lc u la d a se d e fin e p o r u na d ilu c ió n p o r 100 v e c e s con a gua o ta m p ó n de una su sp e n s ió n que tie n e una d e n s id a d ó p tica de 1,0 a 600 nm. De m a n e ra s im ila r, las c o n c e n tra c io n e s de 4 ,4 • 106 U F C /m l y 1,1 • 106 U F C /m l c o rre sp o n d e a una d e n s id a d ó p tica ca lc u la d a a 600 nm de 0 ,004 y 0 ,001, re sp e c tiva m e n te , p o r lo que las d e n s id a d e s ó p tica s ca lcu la d a s se d e fine n p o r una d ilu c ió n p o r 250 v e c e s o p o r 1000 ve ce s , re sp e c tiv a m e n te , con a gu a o ta m p ó n de una su sp e n s ió n q ue t ie n e una d e n s id a d ó p tica de 1,0 a 600 nm.
La su sp e n s ió n q ue co n tie n e cé lu la s de una cep a de Agrobacterium u sa da para p u lv e r iza r las p la n ta s o p arte s de una p la n ta puede c o n te n e r al m e no s un a b ra s ivo su sp e n d id o en d ich a su sp e n s ió n para m e jo ra r la e fica c ia de la tra n s fe cc ió n . El a b ra s ivo que puede u sa rse es un m a te ria l en p a rtícu la s que es e se n c ia lm e n te inso lu b le en la su sp e n s ió n a cu o sa de c é lu la s de Agrobacterium. S e c re e q ue el a b ra s ivo d eb ilita , e sp e c ia lm e n te si se usa ju n to con un a ge n te h u m e cta n te , la su p e rfic ie de l te jid o ve g e ta l ta l com o las ho jas, y, p o r lo tan to , fa c ilita la p e n e tra c ió n de c é lu la s de Agrobacterium en el e sp a c io in te rc e lu la r d e l te jid o ve g e ta l. C o m o re su lta d o , la e fic a c ia de la tra n s fe cc ió n es e levada .
El m a te ria l en p a rtícu la s q ue p ue de u sa rse co m o el a b ra s ivo de la inve n c ió n p ue de s e r un m a te ria l p o rta d o r com o se usa c o m ú n m e n te com o v e h ícu lo s en p o lvo h u m e cta b le (W P ) de fo rm u la c io n e s de p es tic id as . En el co n te x to de los p o lvos h um e cta b le s , e stos ve h ícu lo s se d e n o m in a n ta m b ié n en el ca m p o de las fo rm u la c io n e s de p e s tic id a s com o "ca rg a s " o "c a rg a s ine rte s". Las fo rm u la c io n e s de p o lvo s h u m e cta b le s fo rm a n parte de l c o n o c im ie n to g e n e ra l en el ca m p o de la p ro te cc ió n de las p la n ta s . S e hace re fe re n c ia al m a n u a l E S P E C IF IC A C IO N E S DE LO S P E S T IC ID A S , "M a n u a l fo r D e ve lo p m e n t and U se o f F A O and W H O S p e c ifica tio n s fo r P es tic ide s", e d ita d o p o r la O rg a n iza c ió n M u n d ia l de la S a lu d (O M S ) y la O rg a n iza c ió n de los E s ta d os U n id os p ara la a lim e n ta c ió n y la a g ricu ltu ra , R om a, 2002 , ISBN 92 -5 -104857 -6. Las fo rm u la c io n e s de p o lvos h u m e c ta b le s p ara la p ro te cc ió n de las p la n ta s se d e sc rib e n , p o r e je m p lo , en los d o c u m e n to s EP 1810569 , E P 1488697 , E P 1908348 y E P 0789510. El a b ra s ivo p uede s e r un m a te ria l m in era l, t íp ic a m e n te un m a te ria l in o rg á n ico . E je m p lo s de d ich o s m a te ria le s p o rta d o re s son t ie rra de d ia to m e a s , ta lco , a rc illa , ca rb o n a to de ca lc io , ben to n ita , a rc illa á c id a , a ta p u lg ita , ceo lita , se ric ita , s e p io lita o s ilica to de ca lc io . T a m b ié n es p os ib le u sa r po lvo de cu a rzo ta l com o el po lvo de cu a rzo a lta m e n te puro d e sc rito en el d o cu m e n to W O 021087324. E je m p lo s p re fe rid o s son sílice , ta l com o s ílice h id ró fila p re c ip ita d a y p iróg en a y ca rb o ru n d o . Se c o n o ce n las p ro p ie d a d e s a b ra s iva s de los d ilu ye n te s o ca rg a s ta le s co m o la s ílice u sada en p o lvos h u m e c ta b le s (vé a se "P e s tic id e A p p lic a tio n M e th o d s " p o r G .A . M a tth ew s, te rce ra e d ic ión , B la ckw e ll S c ien ce , 2000 , en la p ág ina 52 de la m ism a).
C o m o p rod u cto s com e rc ia le s de m a te ria le s in o rg á n ico s p a rticu la d o s para su uso co m o a bra s ivo s , se p uede m e n c io n a r la s ílice h id ró fila S ip e rn a t™ 22 S y S ip e rn a t™ 50 S, fa b ric a d o s p o r D eg ussa . O tros p ro d u c to s son "H i-S il™ 257 ", una s ílice s in té tica , a m orfa e h id ra ta d a p ro d u c id a p or P P G Ind us trie s T a iw a n Ltd. o "H u b e rs o rb 600 ™ ", un s ilica to de ca lc io s in té tico , fa b rica d o p o r H u b e r C o rp o ra tio n . U na s ílice co m e rc ia l de ta m a ñ o su b m ic ro m é trico es H i-S il™ 233 (P P G In d u s trie s ) con un ta m a ñ o de p a rtícu la p ro m e d io de a lre d e d o r de 0 ,02 pm.
El a b ra s ivo puede te n e r un ta m a ñ o de p a rtícu la m e d io entre 0,01 y 40, p re fe re n te m e n te , e n tre 0 ,015 y 30, m ás p re fe re n te m e n te , e n tre 0 ,05 y 30, inc lu so m ás p re fe re n te m e n te e n tre 0,1 y 30, in c lu so m ás p re fe re n te m e n te e n tre 0,1 y 20, in c lu so m á s p re fe re n te m e n te e n tre 0 ,5 y 20, y m ás p re fe re n te m e n te e n tre 1,0 y 16 pm . En una re a liza c ió n , el ta m a ñ o de p a rtícu la m e d io e stá e n tre 0 ,015 y 1 o e n tre 0 ,02 y 0 ,5 pm . El ta m a ñ o de p a rtícu la m e d io es el ta m a ñ o de p a rtícu la m e d io en v o lu m e n que puede m e d irse p o r d ifra cc ió n lá se r u sa nd o un M a s te rs ize r™ de M a lve rn Ins tru m en ts , Ltd. P ara e v ita r la o b s tru cc ió n de las b o q u illa s de p u lve r iza c ió n , el ta m a ñ o de p a rtícu la m á x im o de las p a rtícu la s m ás g ra n d e s co n te n id a s en el a b ra s ivo d e b e ría s e r com o m á x im o 45 pm , p re fe re n te m e n te , co m o m á x im o 40 pm , lo que puede d e te rm in a rs e p o r ta m iza d o . Esta co n d ic ió n se co n s id e ra cum p lid a , si el re s to en el ta m iz es in fe rio r al 1,5 % en peso (se gú n IS O 3262 -19 ). El a b ra s ivo p uede te n e r un v a lo r D 90 de com o m á x im o 40 pm, p re fe re n te m e n te , com o m á x im o 30 pm , m e d id o p o r d ifra cc ió n lá se r seg ún se ha d e sc rito a n te rio rm e n te . T íp ica m e n te , los ta m a ñ o s de p a rtícu la a n te rio re s se re fie ren a ta m a ñ o s de p a rtícu la p rim a rios . El co n te n id o del a b ra s ivo en la su sp e n s ió n a cu o sa de la inve n c ió n es e n tre 0,01 y 3, p re fe re n te m e n te , e n tre 0 ,02 y 2, m ás p re fe re n te m e n te , e n tre 0 ,05 y 1 e inc lu so m ás p re fe re n te m e n te e n tre 0,1 y 0 ,5 % en p eso de d ich a susp en s ió n .
La su sp e n s ió n u tilizab le para p u lv e r iza r p a rtes de las p la n ta s con tie n e p re fe re n te m e n te un a d yu va n te de p u lve r iza c ió n a g ríco la . El a d yu va n te en a e ro so l puede se r un te n s io a c tiv o o a gen te h u m e cta n te . El te n s io a c tiv o o a ge n te h u m e c ta n te tie n e m ú ltip le s v e n ta ja s en la p re se n te inve nc ión . R educe la te n s ió n su p e rfic ia l de l a gu a de la su sp e n s ió n a cu o sa y hace que la su p e rfic ie ce rosa de las h o jas de las p la n ta s sea m á s p e rm e a b le a las a g ro b a c te ria s . A d e m á s m e jo ra la e s ta b ilid a d de la su sp e n s ió n y reduce la se d im e n ta c ió n del a b ra s ivo en la su sp e n s ió n . Los te n s io a c tiv o s u sa d o s en la p re se n te in ve n c ió n no e s tá n p a rtic u la rm e n te lim ita d o s . S in e m b a rg o , se p re fie re n los te n s io a c tiv o s no ión icos . U na m e d ic ió n q ue se usa fre c u e n te m e n te p ara d e s c r ib ir los te n s io a c tiv o s es el H LB (e q u ilib r io h id ró filo /lip ó filo ). El H LB d e sc rib e la ca p a c id a d del te n s io a c tiv o de a so c ia rse con los co m p u e s to s h id ró filo s y lipó filos . Los te n s io a c tiv o s con un e q u ilib rio H LB e le va d o se a so c ia n m e jo r con co m p u e s to s so lu b le s en a gu a q ue con los co m p u e s to s so lu b le s en ace ite .
En el p rese n te d o cu m e n to , el v a lo r de H LB d e b e ría s e r 12 o sup e rio r, p re fe re n te m e n te , al m e n o s 13. C om o te n s io a c tiv o s no ión icos , los te n s io a c tiv o s de o rg a n o s ilico n a ta l com o el h e p ta m e tiltr is ilo xa n o m o d ifica d o con p o li(ó x id o de a lq u ile n o ) son los m ás p re fe rid o s en la p re se n te in ve n c ió n ,. Un p ro d u c to c o m e rc ia l es el a d y u v a n te de a e ro so l S ilw e t l 77™ de G E A d v a n c e d M a te ria ls .
Las cep as de Agrobacterium u tiliza b le s en la inve n c ió n son a q u e lla s que se usan g e n e ra lm e n te en la té c n ica de tra n s fe c c ió n o tra n s fo rm a c ió n de p lan tas . En gen e ra l, se usan los s is te m a s de v e c to re s b in a rio s y las cep as b inarias, es dec ir, los g e n e s vir re q u e rid o s p ara tra n s fe r ir A D N -T en c é lu la s ve g e ta le s , p o r un lado, y el A D N -T , p o r o tro lado, e s tá n en p lá sm id o s se p a ra d o s . E je m p lo s de las c e p a s u tiliz a b le s de Agrobacterium se dan en el a rtícu lo de H e lle n s e t al., T re n d s in P la n t S c ie n ce 5 (2000 ) 446 -451 so b re ce p a s b in a ria s de Agrobacterium y s is te m a s de ve c to re s . En el co n te x to de una cep a de Agrobacterium b ina ria , el p lá sm id o que co n tie n e los g e n e s vir se d e n o m in a "p lá s m id o v ir" o "p lá s m id o a u x ilia r v ir". El p lá sm id o q ue co n tie n e el A D N -T q ue se d eb e tra n s fe c ta r es el d e n o m in a d o v e c to r b ina rio que ta m b ié n se d e n o m in a en el p rese n te d o c u m e n to "m o lé cu la de A D N " o "ve c to r". El té rm in o "ce p a " o "ce p a de Agrobacterium se re fie re a co m p o n e n te s de Agrobacterium d is tin to s de l v e c to r b ina rio . P o r lo tan to , en el p rese n te d o cu m e n to , una cep a b in a ria de Agrobacterium q ue no co n tie n e un v e c to r b in a rio y d e sp u é s de la in tro d u cc ió n de un v e c to r b in a rio se d e n o m in a p o r el m ism o n o m b re de la cepa.
La su sp e n s ió n de a g ro b a c te ria s puede p ro d u c irse de la s ig u ie n te m a ne ra . La m o lé cu la de A D N o v e c to r que con tie n e la c o n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico puede tra n s fo rm a rse en la cepa de Agrobacterium y los cu ltivo s de Agrobacterium tra n s fo rm a d o s se cu ltiva n o p c io n a lm e n te b a jo la a p lica c ió n de una p res ió n se le c tiva para el m a n te n im ie n to de d ich a m o lé cu la de A D N . En un m é to do , la cep a de Agrobacterium que se d eb e u sa r en los p ro ce so s de la inve n c ió n se in o cu la a co n tin u a c ió n en un m e d io de c u ltivo y se cu ltiva h as ta una co n ce n tra c ió n c e lu la r e le vad a . S e p ueden in o c u la r los cu ltivo s m ás g ran d es con v o lú m e n e s p eq ue ño s de un m e d io de cu ltivo a lta m e n te co n ce n tra d o para o b te n e r g ra n d e s ca n tid a d e s de l m e d io de cu ltivo . Las a g ro b a c te ria s se cu ltivan g e n e ra lm e n te h asta una co n c e n tra c ió n c e lu la r que co rre sp o n d e a una D O a 600 nm de al m e n o s 1, típ ica m e n te de a p ro x im a d a m e n te 1,5. D ich as s u sp e n s io n e s a g ro b a c te ria n a s a lta m e n te co n ce n tra d a s se d ilu yen d e sp u é s hasta a lc a n z a r la c o n ce n tra c ió n c e lu la r d ese a d a . P ara d ilu ir las su s p e n s io n e s a g ro b a c te ria n a s a lta m e n te co n ce n tra d a s , se usa a gu a . El a g u a p ue de c o n te n e r un ta m p ó n o sa le s. El a g u a p ue de a d e m á s c o n te n e r el te n s io a c tiv o m e n c io n a d o a n te rio rm e n te . C o m o a lte rn a tiva , las su sp e n s io n e s a g ro b a c te ria n a s co n ce n tra d a s pueden d ilu irse con agua, y c u a lq u ie r o tro a d itivo ta l co m o el te n s io a c tiv o y las s u s ta n c ia s ta m p o n a n te s o p c io n a le s se a ñ a d e n d e sp u é s o d u ra n te el p ro ce so de d ilu c ión . El a b ra s ivo p ue de a ñ a d irse a n tes , d u ra n te o d e sp u é s de la d ilu c ión . S in e m ba rg o , se p re fie re a g ita r la su sp e n s ió n d u ra n te la a d ic ión de l a b ra s ivo p ara d is p e rsa r u n ifo rm e m e n te el a b ra s ivo en la su sp e n s ió n a g ro b a c te ria n a . La e ta p a de d ilu ir la s u s p e n s ió n a g ro b a c te r ia n a c o n c e n tra d a p ue de lle va rse a cab o en el ta n q u e de p u lve riza c ió n de l p u lv e r iza d o r u sa do para la p u lve riza c ió n de las s u sp e n s io n e s d ilu idas .
El p u lv e r iz a d o r q u e se va a u tiliz a r para tra n s fe c ta r las p la n ta s o p a rte s de las p la n ta s en el p ro ce so de la inve n c ió n d e p e n d e p rin c ip a lm e n te de l n ú m e ro de p la n ta s o de l á re a q ue se va a p u lve riza r. P ara una o un p e q u e ñ o n ú m e ro de p la n ta s q ue se va a p u lve riza r, se p ue de n u sa r los p u lv e r iza d o re s de b o m b a q ue se usan a m p lia m e n te en el h o g a r y en ja rd in e r ía . E s to s p u e d e n te n e r v o lú m e n e s de l ta n q u e de p u lve r iza c ió n de e n tre 0 ,5 y 2 litros. P ara a p lic a c io n e s a e sca la m edia , se p ue de n u sa r los p u lv e r iza d o re s h id rá u lico s a cc io n a d o s m a n u a lm e n te ta le s com o p u lve r iza d o re s de m o ch ila a cc io n a d o s p o r p a la n ca o los p u lv e r iza d o re s de co m p re s ió n a cc io n a d o s m a n u a lm e n te . S in e m b a rg o , la a lta e fica c ia de la tra n s fe c c ió n a lca n za d a en la in ve n c ió n tie n e to d o su p o te n c ia l en la tra n s fe cc ió n de m u ch a s p lan tas ta le s com o p la n ta s que se cu ltiva n en un ca m p o a g ríco la o en un in ve rn a d e ro . P ara este fin, se pueden u sa r los p u lv e r iza d o re s h id rá u lic o s de a cc io n a m ie n to e lé c tr ico ta le s co m o los p u lv e r iza d o re s h id rá u lic o s m o n ta d o s en tra c to r e q u ip a d o s con b a rras de p u lve riza c ió n . Las té c n ica s de a p lica c ió n a é re a u sa n d o h e licó p te ro s o a v io n e s ta m b ié n son p o s ib le s para ca m p o s g ran d es . T o d o s e s to s tip o s de p u lve riza d o re s se con o ce n en la té c n ic a y están d e sc rito s p o r e je m p lo en el lib ro "P e s tic id e A p p lic a tio n M e th o d s " p o r G .A . M a tth ew s , te rce ra e d ic ión , B la ckw e ll S c ien ce , 2000. C on el fin de a se g u ra r una su sp e n s ió n h o m o g é n e a en los ta n q u e s de p u lve r iza c ió n de los p u lve r iza d o re s , los a e ro so le s p eq ue ño s o m e d ia n o s pueden a g ita rse a in te rva lo s re g u la re s o c o n tin u a m e n te d u ra n te la p u lve riza c ió n . Los p u lve r iza d o re s g ra n d e s ta le s co m o los p u lve r iza d o re s m o n ta d o s en tra c to r deben e s ta r e q u ip a d o s con un a g ita d o r en el ta n q u e de p u lve riza c ión .
T e n ie n d o en cu e n ta la p re se n c ia de c é lu la s a g ro b a c te ria n a s y o p c io n a lm e n te a b ra s iva s en las s u s p e n s io n e s q ue se va n a p u lve riza r, los p u lve riza d o re s u sa do s en la inve n c ió n d eb e ría n p ro d u c ir una p u lve riza c ió n con un ta m a ñ o de g o ta al m e n o s de p u lve r iza c ió n fina . A d e m á s , se p uede u sa r la p u lve riza c ió n m e d ia o p u lve r iza c ió n g rue sa en la c la s if ica c ió n de los p u lve r iza d o re s u sa d o s en el lib ro m e n c io n a d o a n te r io rm e n te p o r G .A . M a tth ew s , p ág ina 74. El o b je tivo p rin c ip a l de la p u lv e r iza c ió n de la in ve n c ió n es h u m e d e c e r el te jid o v e g e ta l con la su sp e n s ió n . P o r lo tan to , el ta m a ñ o de g o ta e xa c to no es crítico . S in e m b a rg o , la e fica c ia de la tra n s fe cc ió n p ue de m e jo ra rse a d ic io n a lm e n te p ro p o rc io n a n d o a la p u lve riza c ió n para las su p e rfic ie s de las p la n ta s m a yo r p res ión .
Es p os ib le a p lic a r los p ro ce so s de la inve n c ió n a p la n ta s tra n s g é n ica s que con tie n e n un gen q ue p ro p o rc io n a a la p la n ta c u a lq u ie r ra sgo d e s e a d o d is tin to de l ra sgo de la re s is te n c ia m e jo ra d a al e s tré s a b ió tic o p ro p o rc io n a d o en los p ro ce so s de la p re se n te invenc ión .
La inve n c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a una co m p o s ic ió n q ue c o n tie n e cé lu la s de u na cep a de Agrobacterium, d icha cepa de Agrobacterium que co m p re n d e una m o lé cu la de A D N h e te ró lo g a que co m p re n d e una co n s tru cc ió n de á c ido n u c le ico que con tie n e una se cu e n c ia de A D N h e te ró lo g a de in te ré s u n id a o p e ra tiva m e n te a un p ro m o to r; d icha se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s p ro p o rc io n a n d o a una p la n ta una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico d e sp u é s de la e xp re s ió n en d ich a p lan ta . La co m p o s ic ió n puede s e r líq u id a o só lid a . E je m p lo s de c o m p o s ic io n e s só lid a s son c o m p o s ic io n e s se ca s o lio filiza d a s que con tien en cé lu la s de d ich a cepa de Agrobacterium. Un e je m p lo de una co m p o s ic ió n líqu ida es la su sp e n s ió n m e n c io n a d a a co n tin u a c ió n . Las c o m p o s ic io n e s lio filiza d a s pueden p re p a ra rse p o r lio filiza c ió n de s u sp e n s io n e s q ue co n tie n e n c é lu la s de Agrobacterium, p re fe re n te m e n te , en p rese nc ia de a g e n te s de p ro te cc ió n con tra la co n g e la c ió n ta le s com o el g lice ro l. La co m p o s ic ió n p ue de c o m p re n d e r a d e m á s el a d yu va n te de p u lve r iza c ió n o el a g e n te h u m e c ta n te p re fe re n te m e n te no ió n ico ta l com o un te n s io a c tiv o de o rg a n o s ilico n a m e n c io n a d o a n te rio rm e n te . La co m p o s ic ió n p uede u sa rse p ara p ro d u c ir la su sp e n s ió n para p u lve riza c ió n , p o r e je m p lo , p o r d ilu c ión con a gu a o un d iso lve n te acuoso .
En el p ro ce so de la inve n c ió n , d icha se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s o d ich a p ro te ína cap az de p ro p o rc io n a r a d ich a s p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al es tré s a b ió tico puede e xp re sa rse ta n to en p la n ta s m o n o co tile d ó n e a s com o d ic o tile d ó n e a s (cu ltivo ). Las p la n ta s de cu ltivo com u n e s p ara el uso en la p rese n te in ve n c ió n in c lu ye n a lfa lfa , ceb ad a , ju d ía s , co lza , caupí, a lg o dó n , m aíz, tré b o l, loto, len te ja s , a ltram u z , m ijo , a vena , g u isan tes , caca hu e tes , a rroz, ce n te n o , tré b o l d u lce , g iraso l, g u isa n te de o lo r, so ja , so rg o tr itica le , jíca m a , fríjo l te rc io p e lo , veza , trig o , g lic in ia y p la n ta s de nueces. Las e sp e c ie s de p la n ta s p re fe rid a s p ara p ra c tic a r esta in ve n c ió n inc lu ye n , a un qu e sin re s tr icc ió n , re p re se n ta n te s de G ra m in e a e , C o m p o s ite a e , S o la n a ce a e y R osace ae . Las p la n ta s p re fe rid a s son p la n ta s que n o rm a lm e n te no e n tra n en la ca d e n a a lim e n ta ria ta le s co m o e sp e c ie s de Nicotiana, ta le s com o N. tabacum y N. benthamiana se p ueden usar.
En g e n e ra l, la p ro te ína se e xp re sa en el c ito so l de cé lu la s de d ich a s p la n ta s o p artes de las p la n ta s . En este caso, no se a ñ a d e a la e n z im a n ingún p é p tid o señ a l q ue d ir ige a la p ro te ín a en un c o m p a rtim e n to particu la r.
La p ro te ín a ca p a z de p ro p o rc io n a r a d ich a s p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico e xp re sa d a y u sada en la p re se n te in ve n c ió n es g e n e ra lm e n te u na p ro te ín a h e te ró lo g a a la p la n ta o p a rte de la p la n ta en la q u e se va a e xp re sa r en la inve nc ión , es dec ir, la p lan ta o su parte no p rod u ce la p ro te ín a de m a n e ra na tu ra l. Es p os ib le o p tim iz a r el uso de co d o n e s de g e n e s q ue c o d ifica n e s ta s e n z im a s p ara la e xp re s ió n en p la n ta s , e sp e c ia lm e n te , en la p lan ta e m p le a d a para su e xp re s ió n . La o p tim iza c ió n de co d o n e s es un m é to d o e s tá n d a r para a u m e n ta r los re n d im ie n to s de e xp re s ió n . Los g enes o p tim iza d o s p o r co d o n e s y á c id o s n uc le ico s se pueden e n c a rg a r a fu e n te s c o m e rc ia le s ta le s com o E n te le ch o n G m bH , R eg en sb u rg , A le m a n ia .
U na re s is te n c ia a u m e n ta d a al e stré s a b ió tico de una p lan ta puede d e te rm in a rse tra ta n d o una p lan ta con la su sp e n s ió n de la inve n c ió n y tra ta n d o , co m o un co n tro l o re fe re n c ia , el m ism o tip o de p la n ta en co n d ic io n e s p o r lo d e m á s idé n tica s con una su sp e n s ió n que no con tien e d ich a s cé lu las de d ich a cepa de Agrobacterium. A m b a s p la n ta s se so m e te n d e sp u é s a co n d ic io n e s idé n tica s de e stré s a b ió tico . U na re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico de la p la n ta tra ta d a de a cu e rd o con la inve n c ió n puede d e te c ta rse p o r un c re c im ie n to m ás v ig o ro so o m e jo r co n d ic ió n de sa lud .
E je m p lo s de re s is te n c ia s al e s tré s a b ió tico que pueden a u m e n ta rse son los s ig u ie n te s : re s is te n c ia a la sequía , re s is te n c ia a la sal, re s is te n c ia al e s tré s osm ó tico , re s is te n c ia al frío, re s is te n c ia a la co n g e la c ió n , re s is te n c ia al ca lo r, re s is te n c ia a m e ta les p esad os , re s is te n c ia a la h ip o x ia o re s is te n c ia al e s tré s o x id a tivo .
E je m p lo s de s e c u e n c ia s de n u c le ó tid o s de in te ré s y p ro te ín a s p a ra m e jo ra r la to le ra n c ia al e s tré s p o r s e q u ía en las p la n ta s se dan a co n tin u a c ió n . T a m b ié n se dan re fe re n c ia s a los g en es y p ro te ínas.
C sp B de Bacillus subtilis sub sp . sub tilis . Str, ta l com o JH 642 (A A B 01346 ). C a s tig lio n i e t al., P la n t P h ys io lo g y 147 (2008 ) 446 -455 y H u n g e r e t al., J. B ac te rio l. 188 (2006 ) 240 -248. La se cu e n c ia de co d ifica c ió n de C sp B o p tim iza d a p o r co d o n e s para la e xp re s ió n en p la n ta s se da co m o S E Q ID NO: 1. La se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO: 2.
G en de la p ro te ín a 7.4 (c sp A ) de ch o q u e p o r frío de E. coli. U na se cu e n c ia c o d ifica n te de la p ro te ín a C sp A a d e cu a d a para la e xp re s ió n en p la n ta s se da com o S E Q ID NO : 3. La se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO: 4.
La su b u n id a d B-1 de l fa c to r de tra n s c rip c ió n Y n u c le a r (N F -Y B 1 ) (N M _ 129445.2 ) de Arabidopsis thaliana a u m e n ta la re s is te n c ia a la se q u ía en p la n ta s tra n s g é n ica s ; v é a s e N e lson e t al., P N A S 104 (2007 ) 16450 -16455. U na se cu e n c ia co d ifica n te se da co m o S E Q ID NO : 5. U na s e cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO: 6.
B nL A S - gen de la fa m ilia G R A S . S u e xp re s ió n e c tó p ica en p la n ta s inh ib e el c re c im ie n to , re tra sa la flo ra c ió n , re tra sa la se n e sce n c ia y a u m e n ta la re s is te n c ia a la seq u ía , vé a se Y an g e t al. (2011 ) P la n t C e ll R ep 30(3 ): 373 -88. U na se cu e n c ia co d ifica n te se da co m o S E Q ID NO: 7. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO : 8.
La e xp re s ió n de IP T ( iso p e n te n il tra n s fe ra s a ) p rev ie ne la d e g ra d a c ió n de los co m p le jo s p ro te ico s fo to s in té tico s d u ra n te la se q u ía , v é a s e R ive ro e t al., P la n t C e ll P hys io l. 51 (2010 ) 1929 -1941 , y O ri e t a l., T h e P la n t C e ll 11 (1999 ) 1073 -1080. U na se cu e n c ia co d ifica n te de IPT se da co m o S E Q ID NO: 21. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO : 22.
B cW R K Y 46 - TF , un m ie m b ro de la fa m ilia de la p ro te ín a W R K Y , se in fo rm ó q u e a u m e n ta la to le ra n c ia a l e s tré s p o r frío , sa l y d e sh id ra ta c ió n en el ta b a co , véa se . W a n g e t al., M ol. B iol. R ep 39 (2012 ) 4553 -4564. U na se cu e n c ia co d ifica n te de B cW R K Y 46 se da com o S E Q ID NO : 11. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO : 12.
H aH B1 de g iraso l, A tH B 13 , A tP R 2 , A tP R 4 y A tG L U - los fa c to re s de tra n s c rip c ió n de la c re m a lle ra de leu c ina del h o m e o d o m in io con fie re n to le ra n c ia al e s tré s p o r se q u ía y p o r sa lin id a d , v é a se C a b e llo & C han (2012 ) P lan t B io te ch n o l. J. 10 (2012 ) 815 -825. U na se cu e n c ia c o d ifica n te co m p le ta con s itio s de e m p a lm e e lim in a d o s se da com o S E Q ID NO: 13. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da co m o S E Q ID NO : 14.
H o rq u illa s de b a c te ria s p a tó g e n a s de p la n ta s g ra m n e g a tiva s - e s tim u la n la m u erte c e lu la r h ip e rse n s ib le (H C D p o r sus s ig la s en ing lés), la d e fe n sa con tra p a tó g e n o s y a u m e n ta n el c re c im ie n to en las p lan tas , la to le ra n c ia a la sequía , v é a se Z h a n g e t al., J. Exp. Bot. 62 (2011 ) 4229 -4238.
B o m b a de AV P 1 H+ (p iro fo s fa ta s a v a c u o la r H 1) - las p la n ta s que so b re e xp re sa n la p iro fo s fa ta sa v a c u o la r H1 son m u ch o m á s re s is te n te s a co n ce n tra c io n e s e le va d a s de N aC l y a la p riva c ió n de a gu a que las cep as is o g é n ica s de tip o s ilve s tre ; v é a se G a x io la e t al. 2001 P N A S 98 (20 ) 11444 -11449 ; P a rk e t al., P N A S 102 (2005 ) 18830 -18835 ; Z h a n g e t al. (2011 ) P lan t S ig n a lin g & B e h a v io r 6: 6, 861 -863. U na se cu e n c ia c o d ifica n te se da com o S e Q ID NO : 17. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO : 18.
El gen S N A C 1 se n s ib le al e stré s (N A C 1 S E N S IB L E A L E S T R É S ) de l a rro z (G e n B a n k : D Q 394702 ) - S N A C 1 (N A C 1 S E N S IB L E A L E S T R É S ) a u m e n ta s ig n ifica tiva m e n te la re s is te n c ia a la se q u ía en el a rro z tra n s g é n ico en el ca m p o en co n d ic io n e s se v e ra s de e s tré s p o r se q u ía en la e ta p a re p ro d u c tiv a m ie n tra s q ue no m u e s tra c a m b io s fe n o típ ic o s o p e n a liz a c ió n en e l re n d im ie n to , v é a s e Hu e t al. (2006 ) P N A S 103: 12987 -12992. U na se cu e n c ia c o d ific a n te se da com o S E Q ID NO: 19. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO : 20.
Se p ue de a u m e n ta r la to le ra n c ia a la sal m e d ia n te la e xp re s ió n en p la n ta s de las s ig u ie n te s p ro te ína s:
G m R D 22 (p ro te ín a de l d o m in io B U R P lo ca liza d a en a p o p la s to s de la so ja ) a u m e n ta la to le ra n c ia al e s tré s p o r sa lin id a d y o sm ó tico en A ra b id o p s is y a rro z tra n s g é n ico s , a u m e n ta la p rod u cc ión de lign ina , vé a se W a n g e t al. (2012 ) P la n t C e ll E nv iron . 35 (2012 ) 1932 -1947. U na se c u e n c ia co d ific a n te de G m R D 22 se da co m o S E Q ID NO : 9. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO : 10.
H aH B1 de g iraso l, A tH B 13 , A tP R 2 , A tP R 4 y A tG L U - fa c to re s de tra n s c rip c ió n de la c re m a lle ra de le u c in a del h o m e o d o m io com o se han m e n c io n a d o a n te rio rm e n te p ueden u sa rse p ara a u m e n ta r la to le ra n c ia a la sa l de las p lan tas.
La e xp re s ió n s u p rim id a de l gen de a sco rb a to o x id a sa a p o p lá s tica a u m e n ta la to le ra n c ia a la sa l en las p lan tas , vé a se Y a m a m o to e t al. J. E xp B o ta n y 56 (2005 ) 1785 -1796. U na se cu e n c ia co d ific a n te de l gen de N. tabacum se da com o S E Q ID NO : 15. U na s e c u e n c ia de a m in o á c id o s se da co m o S E Q ID N O : 16. La e xp re s ió n de la a sc o rb a to o x id a sa p ue de su p rim irse u sa n d o la in te rfe re n c ia de A R N com o se co n o ce en la técn ica .
B o m b a de AV P 1 H+ (p iro fo s fa ta sa v a c u o la r H 1) - las p la n ta s tra n s g é n ica s que so b re e xp re sa n la p iro fo s fa ta sa v a c u o la r H1 son m u ch o m ás re s is te n te s a c o n c e n tra c io n e s e le v a d a s de N aC l y a la p riva c ió n de a g u a q ue las cep as iso g é n ica s de t ip o s ilve s tre ; v é a se G a x io la e t al. 2001 P N A S 98 (20 ) 11444 -11449 ; Z h an g e t al. (2011 ) P lan t S ig n a lin g & B e h a v io r 6: 6, 861 -863 ; para las s e cu e n c ia s vé a se arriba .
El gen S N A C 1 se n s ib le al e stré s (N A C 1 S E N S IB L E A L E S T R É S ) de l a rro z (G e n B a n k : D Q 394702 ) - S N A C 1 (N A C 1 S E N S IB L E A L E S T R É S ) a u m e n ta la to le ra n c ia a la se q u ía y a la sa l en a rro z tra n s g é n ico en el ca m p o en co n d ic io n e s se ve ra s de e s tré s p o r seq u ía , v é a se Hu et al. (2006 ) P N A S 103: 12987 -12992. U na se cu e n c ia co d ifica n te se da co m o S E Q ID NO : 19. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO: 20.
Se p ue de a u m e n ta r la to le ra n c ia al frío m e d ia n te la e xp re s ió n en p la n ta s de la s ig u ie n te p ro te ína :
B cW R K Y 46 - TF, el m ie m b ro de la fa m ilia de la p ro te ín a W R K Y . La e xp re s ió n co n s titu tiva en el ta b a co tra n sg é n ico re du jo la s u sce p tib ilid a d al e s tré s p o r frío, A B A , sal y d e sh id ra ta c ió n . W a n g e t al. (2012 ) M o l B io l Rep.
El gen O s S R O 1 c d ir ig id o a S N A C 1 m o d u la la to le ra n c ia al e s tré s o x id a tivo re g u la n d o el p e ró x id o de h id ró g e n o en el a rroz; v é a s e Y ou e t al., J. E xp e rim a n ta l B o ta n y (2013).
LeC YP1 - C ic lo filin a de to m a te . U na se cu e n c ia co d ifica n te se da co m o S E Q ID NO : 23. U na se cu e n c ia de a m in o á c id o s se da com o S E Q ID NO: 24. R e s is te n c ia a la se q u ía a tra vé s de la fo rm a c ió n de la ra íz m e jo rad a ; v é a se O h e t al. (2006 ) P lan ta 224: 133-144.
P ara p ro p o rc io n a r a las p la n ta s u na re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tic o de a cu e rd o con la p re se n te inve nc ión , c u a lq u ie ra de las p ro te ína s de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 puede e xp re sa rse en las p la n ta s . El m ism o o b je tivo puede a lca n za rse e xp re sa n d o en d ich a s p la n ta s una p ro te ín a que co m p re n d e una se c u e n c ia de a m in o á c id o s q ue tie n e una id e n tid a d de se c u e n c ia a c u a lq u ie ra de las s e c u e n c ia s de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 in fe r io r al 100 %. La p ro te ín a q ue se va a e x p re s a r p u e d e s e r una va r ia n te de p ro te ín a que tien e una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s que tie n e al m e n o s una id e n tid a d de se cu e n c ia de l 80 % a la se c u e n c ia de a m in o á c id o s co m p le ta de una cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24. La id e n tid a d de la se cu e n c ia de a m in o á c id o s p ue de s e r de al m e no s el 85 %, p re fe re n te m e n te , de al m e no s el 90 %, m á s p re fe re n te m e n te , de al m e n o s el 95 % e inc lu so m ás p re fe re n te m e n te de al m e n o s el 97 % a cu a lq u ie r se c u e n c ia de a m in o á c id o s de cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24. C a lc u la n d o el p o rc e n ta je de la id e n tid a d de la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s , d os s e c u e n c ia s se a lin e a n ó p tim a m e n te y se d e te rm in a el n ú m e ro de c o in c id e n c ia s id é n tica s de n u c le ó tid o s o res tos de a m in o á c id o s e n tre las d os se cu e n c ia s . El n ú m e ro de c o in c id e n c ia s id é n tica s se d iv id e p o r la lo n g itu d de la re g ió n a lin e a d a (es dec ir, el n ú m e ro de re s to s de a m in o á c id o s a lin e a d o s ) y se m u ltip lica p o r 100 para lle g a r a un v a lo r p o rce n tu a l de ide n tid a d de se cu e n c ia . Un hueco , es dec ir, una p os ic ió n en un a lin e a m ie n to d onde e stá p rese n te un re s to en una se cu e n c ia pero no en la o tra , se co n s id e ra una p os ic ió n con res tos no idé n tico s . Las id e n tid a d e s de las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s pueden d e te rm in a rse u sa n d o B L A S T X 2.2.14 u sa n d o los a ju s te s e s tá n d a r. Los a ju s te s e s tá n d a r p e rm ite n , p o r e je m p lo , los h u e co s de las s e cu e n c ia s en los a lin e a m ie n to s .
La lon g itu d de la reg ión a lin e a d a e stá p re fe re n te m e n te sob re to d a la lon g itu d de la p ro te ín a re sp e c tiva de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24.
En o tra re a liza c ió n , la p ro te ín a q u e se va a e x p re s a r co m p re n d e o c o n s is te en una s e c u e n c ia de a m in o á c id o s de al m e no s el 80 %, p re fe re n te m e n te , de al m e no s el 90 %, m ás p re fe re n te m e n te , al m e no s el 95 % de l n úm e ro de re s to s de a m in o á c id o s de una c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 y una ide n tid ad de s e cu e n c ia de al m e n o s el 90 % a las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24, re sp e c tiva m e n te , so b re d ich a lon g itu d . En o tra re a liza c ió n , la p ro te ína que se va a e xp re sa r co m p re n d e o co n s is te en una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de al m e no s el 80 %, p re fe re n te m e n te , de al m e no s el 90 %, m ás p re fe re n te m e n te , al m e no s el 95 % de l n ú m e ro de re s to s de a m in o á c id o s de una c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 y una id e n tid a d de s e c u e n c ia de al m e no s el 95 % a las S E Q ID N O : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 , 22 o 24, re sp e c tiva m e n te , sob re d ich a lon g itu d . En e s ta s re a liza c io n e s , la va r ia n te de p ro te ín a to d a v ía es cap az p re fe re n te m e n te de p ro p o rc io n a r a las p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico de la p ro te ín a re spe ctiva de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24, re sp e c tiva m e n te .
C o m o a lte rn a tiva , la va r ia n te de p ro te ín a p ue de ten e r, o c o n s is t ir en, una se cu e n c ia de a m in o á c id o s q ue tie n e de 1 a v a r ia s a d ic ion es , s u s titu c io n e s o d e le c io n e s de a m in o á c id o s en c o m p a ra c ió n con la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de una c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24, en d on de la v a r ia n te de p ro te ín a to d a v ía es cap az de p ro p o rc io n a r, p re fe re n te m e n te , a d ich as p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s a b ió tico . El n ú m e ro m á x im o de ad ic ion es , s u s titu c io n e s o d e le c io n e s de a m in o á c id o s puede s e r de c o m o m á x im o 20, p re fe re n te m e n te , de com o m á x im o 15, m á s p re fe re n te m e n te , de com o m á x im o 10, e inc lu so m ás p re fe re n te m e n te de com o m á x im o 5, en d on de el n ú m e ro to ta l de a d ic ion es , s u s titu c io n e s y a d ic io n e s ju n ta s d e te rm in a n el n ú m e ro de "a d ic io n e s , s u s titu c io n e s o d e le c io n e s de a m ino ác ido s ".
En o tra s re a liza c io n e s , la p ro te ína que se va a e xp re sa r tien e una s im ilitu d de s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s de al m e n o s el 90 % en c o m p a ra c ió n con la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24 sob re la lon g itu d e n te ra de e s ta s S E Q ID NO. P re fe re n te m e n te , la ide n tid ad de s e cu e n c ia s es de al m e n o s el 95 %, m ás p re fe re n te m e n te , de al m e n o s el 98 % sob re to d a la long itud de e s ta s S E Q ID NO . En o tra re a liza c ió n , la p ro te ín a q ue se va a e xp re sa r co m p re n d e o co n s is te en una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de al m e n o s el 80 %, p re fe re n te m e n te , de al m e n o s el 90 %, m á s p re fe re n te m e n te , de al m e n o s el 95 % de l n ú m e ro de re s to s de a m in o á c id o s de una cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24, y una ide n tid ad de s e cu e n c ia de al m e no s el 90 %, p re fe re n te m e n te , de al m e no s el 95 %, m á s p re fe re n te m e n te , de al m e no s el 98 % a cu a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24, re sp e c tiva m e n te , sob re d ich a long itud .
La s im ilitu d de las s e cu e n c ia s de p ro te ín a s usa una m a triz de s u s titu c ió n con p u n tu a c io n e s p ara to d o s los in te rc a m b io s p o s ib le s de un a m in o á c id o p o r o tro . El g ra d o de s im ilitu d e n tre las s e c u e n c ia s de p ro te ín a s puede , p o r e je m p lo , e va lu a rse p o r la m a triz de su s titu c ió n B LO S U M 62 (H e n ik o ff y H en iko ff, 1992, P roc. N atl. A cad . Sci. U.S. A .89 :10915 ).
La p ro te ín a c a p a z de p ro p o rc io n a r a d ich a s p la n ta s u na re s is te n c ia a u m e n ta d a al e s tré s p o r se q u ía p u e d e te n e r un d o m in io de ch o q u e p o r frío , p re fe re n te m e n te , d ich a p ro te ína es una c h a p e ro n a de A R N que tie n e un s itio de un ión p ara A R N m o n o ca te n a rio . Se co n s id e ra que las c h a p e ro n a s de A R N ta le s com o las p ro te ín a s de ch o q u e p o r frío re sue lve n las m o lé cu la s de A R N m a l p le g a d a s m e d ia n te la d e s e s ta b iliza c ió n de los d o b le te s de A R N o la u n ión a á c id o s n u c le ico s m o n o ca te n a rio s (vé ase , p o r e je m p lo , H u n g e r e t al., J. B ac te rio l. 188 (2006 ) 240 -248 ). P re fe re n te m e n te , la p ro te ín a es o es u na v a r ia n te (se g ú n se ha d e fin id o a n te r io rm e n te ) de C sp B de B. subtiliis de la S E Q ID NO: 2. En una re a liza c ió n , la p ro te ín a co m p re n d e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la S E Q ID NO: 2.
D on de la p ro te ín a es una v a r ia n te de la p ro te ín a d e fin id a p o r la se cu e n c ia de a m in o á c id o s de la S E Q ID N O :2, d icha p ro te ín a tie n e al m e no s los res tos de a m in o á c id o s de C sp A de W 11 , F18, F20, F31, H 33 y F34 de E. co li en las p o s ic io n e s c o rre sp o n d ie n te s a e s ta s p o s ic io n e s en C sp A de E. coli. Las p o s ic io n e s que co rre sp o n d e n a las p o s ic io n e s en C sp A de E. co li se pueden d e te rm in a r m e d ia n te a lin e a m ie n to y co rre sp o n d e n a un a lin e a m ie n to ó p tim o de las s e cu e n c ia s de p ro te ínas.
En una re a liza c ió n , la p ro te ín a es el fa c to r de tra n s c r ip c ió n L A S v e g e ta l de la S E Q ID NO : 8 o G m R E 222 de la S E Q ID NO: 10 o una va r ia n te de l m ism o seg ún se ha d e fin id o a n te rio rm e n te . En d icha re a liza c ió n , la p lan ta puede se r una p lan ta d ico tile d ó n e a , p re fe re n te m e n te , una p lan ta S o la n a ce a e , y m ás p re fe re n te m e n te una p lan ta de tom a te .
Ejemplos
Ejemplo de referencia 1: Determinación de la concentración celular de Agrobacterium en cultivo líquido en términos de unidades formadoras de colonias (UFC)
La c o n ce n tra c ió n de cé lu la s de Agrobacterium en su sp e n s ió n líqu ida en té rm in o s de u n id a d e s fo rm a d o ra s de co lo n ia s p o r ml (U F C /m l) de s u sp e n s io n e s líqu ida s p ue de d e te rm in a rse u sa n d o el s ig u ie n te p ro to co lo . Las cé lu la s de la ce p a ICF 320 de Agrobacterium tumefaciens t ra n s fo rm a d a s con la co n s tru c c ió n p N M D 620 c re c ie ro n en 7 ,5 m l de m e d io LBS líqu ido que co n tie n e 25 m g/l de k a n a m ic in a (A p p liC h e m , A 1493 ) y 50 m g /l de rifa m p ic in a (C a rl R oth, 4163.2 ). E l cu ltivo b a c te ria n o se in cu b ó a 28 °C con a g ita c ió n co n tin u a . La a b s o rb a n c ia o d e n s id a d ó p tica de l cu ltivo b a c te ria n o e xp re sa d a s en u n id a d e s de a b s o rb a n c ia (A U ) se co n tro ló en a líc u o ta s de 1 m l de l cu ltivo u sa nd o un e sp e c tro fo tó m e tro a una long itud de o nda de 600 nm (O D 600). La co n ce n tra c ió n c e lu la r e s tim a d a com o un n úm e ro de u n id a d e s fo rm a d o ra s de c o lo n ia s p o r m ilím e tro de cu ltivo líqu ido (U F C /m l) se p ue de a n a liz a r a v a lo re s de O D 600 de 1; 1,3; 1,5; 1,7 y 1,8. P ara e s te p ro p ó s ito , a líc u o ta s de 250 pl de c u ltivo líq u id o se d ilu y e ro n con m e d io LB S para a lc a n z a r un v o lu m e n fin a l de 25 m l (d ilu c ió n 1 :100). 2 ,5 m l de d ich a d ilu c ió n 1 :100 se m e zc la ro n con 22 ,5 m l de LBS p ara a lc a n z a r la d ilu c ión 1 :1000. Las d ilu c io n e s de c u ltivo líqu ido 1:100; 1 :1.000 ; 1 :10.000 ; 1 :100.000 ; 1 :1.000.000 ; 1 :10.000.000 y 1 :100.000.000 se p re p a ra ro n de m a n e ra s im ila r. Se d is trib u ye ro n a lícu o ta s de las tre s ú ltim a s d ilu c io n e s en m e d io LBS s o lid ifica d o con a g a r su p le m e n ta d o con 25 m g/l de ka n a m in ca y 50 m g/l de r ifa m p ic in a (250 pl de cu ltivo b a c te ria n o p o r p laca de 90 m m de d iá m e tro ). La s ie m b ra de a lícu o ta s p ara cad a d ilu c ió n se rea lizó p o r tr ip lica d o . D espu és de 2 d ías de incu ba c ió n a 28 °C, se co n ta ro n las co lo n ia s b a c te ria n a s para cada p laca. La s ie m b ra en p la cas de las d ilu c io n e s 1: 1.000.000 y 1 :10.000.000 d io com o re su lta d o p ocos c ie n to s y p ocas d e ce n a s de c o lo n ia s p o r p laca, re sp e c tiva m e n te . En cu a n to a la d ilu c ión 1 :100.000.000 p ro p o rc io n ó so lo p ocas co lo n ia s p o r p laca, e sta d ilu c ión no se usó para el cá lcu lo de la co n ce n tra c ió n ce lu la r. La c o n ce n tra c ió n c e lu la r se e s tim ó de a cu e rd o con la fó rm u la : U F C /m l = 4 x n úm e ro de co lo n ia s p o r p laca x fa c to r de d iluc ión .
P ara tra n s fo rm a r las co n ce n tra c io n e s de cé lu la s seg ún se m id ie ro n p o r las m e d ic io n e s de a b so rb a n c ia a 600 nm (en m e d io LB ) y en té rm in o s de u n id a d e s fo rm a d o ra s de cé lu las , En el p re se n te d o c u m e n to se usa la s ig u ie n te re lac ión : una O D 600 de 1,0 co rre sp o n d e a 1,1 x 109 U FC /m l.
M e d io LB S (líq u id o )
1 % de p e p to n a de so ja (h id ro liza d o p a p a ico de h a rina de so ja ; D uche fa , S 1330 )
0 ,5 % de e x tra c to de leva du ra (D u ch e fa , Y 1333 )
1 % de c lo ru ro de sod io (C a rl R oth, 9265.2 )
d isu e lto en agua, y se a ju s ta a pH 7 ,5 con N aO H 1 M (C a rl R oth, 6771.2 )
P ara p re p a ra r el m e d io LBS só lido , se c o m p le m e n tó un m e d io LB S líqu ido con a g a r al 1,5 % (C a rl R oth, 2266.2 ). Los m e d io s se so m e tie ro n a a u to c la ve a 121 °C d u ra n te 20 m in.
Ejemplo 1: Vectores usados en los siguientes ejemplos
En este e s tu d io , se u sa ro n v e c to re s tra n s c rip c io n a le s e s tá n d a r b a sa d o s en el p ro m o to r 35S C a M V a s í com o re p lico n e s v ír ic o s b a sad os en T M V y en P V X con o sin ca p a c id a d de m o v im ie n to de cé lu la a cé lu la . Los m a p a s de p lá sm id o s para los c inco tip o s de v e c to re s de c lo n a c ió n e stán re p re s e n ta d o s en la F ig. 1. En to d o s los caso s, el gen de in te ré s se inse rta u sa nd o s itios de c lo n a c ió n con sa lie n te s 5' y 3' ca tg y g a tc ( ta a g ), re sp e c tiva m e n te . El v e c to r tra n s c rip c io n a l p N M D 2492 se c reó sob re la base de p IC B V 10 , un v e c to r b in a rio d e riva d o de p B IN 19 (M a rillo n n e t e t al., 2004 , 2006 ). C o n tie n e d os ca se te s de e xp re s ió n in se rta d o s e n tre los b o rd e s d e re ch o e izq u ie rd o de l A D N -T . Un ca se te de e xp re s ió n a d y a c e n te al b o rd e d e re ch o c o n te n ía el p ro m o to r C A M V 35S , p o te n c ia d o r tra d u cc io n a l o m eg a, El s itio de c lo n a c ió n de B sa l para la in se rc ió n de l gen de in te ré s y el te rm in a d o r de nos (e n u m e ra d o en o rden se cu e n c ia l). El c a se te de e xp re s ió n a d y a c e n te al b o rd e izq u ie rd o c o n te n ía el p ro m o to r 35 S se g u id o d e l p o te n c ia d o r tra d u cc io n a l om ega, la se cu e n c ia co d ifica n te de l s u p re so r P19 de l s ile n c ia m ie n to de l v iru s de l e n a n ism o del to m a te (T B S V ) (n.° de a cce so de G e n B a n k C A B 56483.1 ) y el te rm in a d o r de ocs.
El v e c to r b a sa d o en T M V con ca p a c id a d de m o v im ie n to de é lu la a cé lu la p N M D 035 , el v e c to r b a sad o en T M V que ca rece de c a p a c id a d de m o v im ie n to de cé lu la a cé lu la p N M D 661, el v e c to r b asad o en P V X con ca p a c id a d de m o v im ie n to s is té m ico de cé lu la a cé lu la p N M D 670 y el v e c to r b asad o en P V X in h a b ilita d o para el m o v im ie n to s is té m ico y de cé lu la a cé lu la p N M D 694 ya se han d e sc rito en la p a ten te "P ro ce so para la tra n s fe cc ió n de p lan tas".
La c o n s tru c c ió n de p lá sm id o p N M D 3486 se c re ó m e d ia n te la in se rc ió n d ire c ta de la s e c u e n c ia de co d ific a c ió n de la s u b u n id a d B-1 de l fa c to r de tra n s c r ip c ió n n u c le a r (N F -Y B 1 ) de Arabidopsis thaliana (G e n B a n k : N M _ 129445.2 ) en el v e c to r de c lo n a c ió n p N M D 1426 u sa nd o el s itio de c lo n a c ió n de B sal. De m a n e ra s im ila r, la se cu e n c ia co d ifica n te o p tim iz a d a p o r co d o n e s de la p ro te ín a de ch o q u e p o r frío C sp B de la ce p a J H 642 de Bacillus subtilis sub sp . subtilis (G e n B a n k : A A B 01346 ) se inse rtó en el m ism o v e c to r de c lo n a c ió n d an do com o re su lta d o la co n s tru cc ió n de p lá sm id o p N M D 3493 (F ig . 2).
Ejemplo 2: Influencia de la expresión transitoria de los genes NF-YB1 y CspB en la resistencia a la sequía de plantas de colza.
Se p u lve riza ro n p la n ta s de 7 se m a n a s de e dad Brassica napus con la cep a C ryX de Agrobacterium tumefaciens que a lb e rg a las c o n s tru cc io n e s p N M D 3486 y p N M D 3493 (ve c to re s tra n s c rip c io n a le s q ue co n tie n e n las se cu e n c ia s co d ifica n te s de N F-Y B 1 y C sp B ba jo el co n tro l del p ro m o to r 35S , re sp e c tiva m e n te (F ig . 2). La cepa C ryX de A. tumefaciens se d e sc rib e en la so lic itud de p a ten te in te rn a c io n a l P C T /E P 2013 /000994. El riego de las p lan tas se d e tu vo el d ía de la p u lve r iza c ió n . D e sp u é s de 11 d ía s de seq u ía , las p la n ta s se re ga ro n los 7 d ía s s igu ien tes . D e sp u é s de e llo , las p la n ta s se so m e tie ro n a 13 d ía s de se q u ía y se re ga ro n de n uevo d u ra n te 1 día. A l fin a l del p rim e r tra ta m ie n to de se q u ía (11 d ía s ) to d a s las p la n ta s con N F -Y B 1 , C sp B y de con tro l sin tra ta r p a re c ía n m a rch ita s sin n in g u n a d ife re n c ia e n tre los g ru p o s (F ig . 3). D u ra n te los 7 d ía s s ig u ie n te s de rie go to d a s las p la n ta s re cu p e ra ro n la fo rm a q u e te n ía n a n te s de l tra ta m ie n to de sequ ía , las p la n ta s p a re c ía n sa lu d a b le s y v ig o ro s a s (F ig . 4). A l f in a l del se g u n d o tra ta m ie n to de se q u ía (8 d ía s ) las p la n ta s con C sp B fu e ro n lig e ra m e n te m e n o s m a rch ita s si se co m p a ró con las p la n ta s con N F-Y B 1 (F ig . 5). D e sp u é s de un d ía de riego , las p la n ta s con C sp B e s ta b a n m ás v ig o ro sa s que los o tro s d os g ru p o s (F ig . 6).
Ejemplo 3: Influencia de la expresión transitoria de genes BnLAS y GmRD22 en la resistencia a la sequía de las plantas de tomate.
P la n ta s cv B a lco n y R ed de Lycopersicon esculentum de 3 se m a n a s de e dad se p u lve r iza ro n con la cep a IC F 320 de Agrobacterium tumefaciens que a lb e rg a las co n s tru c c io n e s p N M D 7570 , p N M D 7600 y p N M D 600 (ve c to re s b a sa d o s en P V X con ca p a c id a d de m o v im ie n to s is té m ico q ue co n tie n e n las se cu e n c ia s co d ifica n te s B nLA S , G m R D 22 y G FP , re s p e c tiv a m e n te ) (F ig . 7). E l rie go de las p la n ta s se d e tu vo 3 se m a n a s d e s p u é s de la p u lve r iza c ió n . La e xp o s ic ió n a la se q u ía duró 14 d ías. A l fin a l d e l tra ta m ie n to de seq u ía , las p la n ta s tra n s fe c ta d a s con B n L A S y G m R D 22 esta ba n m e n o s m a rch ita s q ue las p la n ta s de co n tro l no tra n s fe c ta d a s (F ig . 8). D e sp u é s de 14 d ía s de s e q u ía (s a tu ra c ió n de a gu a del sue lo a p ro x im a d a m e n te 34 % ), se re ga ron de nue vo las p la n ta s h asta la co se ch a de los fru tos .
El re n d im ie n to de fru to s de las p la n ta s de to m a te e xp u e s ta s a se q u ía se e va lu ó 100 d ías d e sp u é s de la p u lve riza c ió n con a g ro b a c te ria s . Los fru to s c o se ch a d o s para las p la n ta s in d iv id u a le s in c lu id a s en el e xp e rim e n to se m u e s tra n en la F IG . 9. D e sp u é s de la e xp o s ic ió n a la sequ ía , las p la n ta s tra n s fe c ta d a s con G m R D 22 m o s tra ro n una b io m a sa m ás a lta en c o m p a ra c ió n con las p la n ta s no tra n s fe c ta d a s y las p la n ta s tra n s fe c ta d a s con B nL A S y p la n ta s con G F P (F ig.
10).
P ara e va lu a r el e fe c to de la e xp re s ió n tra n s ito r ia de B nL A S en la re s is te n c ia a la seq u ía de p la n to n e s jó ve n e s , p lá n tu la s de to m a te de 12 d ía s de edad (c v B a lco n y R ed ) que c re c ie ro n en el su e lo se p u lve r iza ro n con la su sp e n s ió n de a g ro b a c te ria s que a lb e rg a n los v e c to re s de P V X p N M D 7580 (in se rc ió n de B n L A S ) y p N M D 5800 (in se rc ió n de G F P , con tro l de tra n s fe c c ió n ). 13 d ía s d e sp u é s de la p u lve r iza c ió n , se e xp u s ie ro n los p la n to n e s a 10 d ía s de se q u ía se g u id o de rie go de nuevo . D e sp u é s de los 10 d ía s de tra ta m ie n to de seq u ía , las p lan tas tra n s fe c ta d a s con B nL A S fu e ro n m ás v ig o ro sa s y m e no s m a rch ita s en co m p a ra c ió n con los p la n to n e s no tra n s fe c ta d o s y los p la n to ne s tra n s fe c ta d o s con v e c to re s de G F P (F ig . 11, p an e l sup e rio r). La d ife re n c ia es inc lu so m ás o bv ia d e sp u é s de 2 h o ra s de re cu p e ra c ió n de a gu a (F ig . 11, pan e l in fe rio r).
Ejemplo 4: Influencia de la expresión transitoria de genes BnAS y GmRD22 en la resistencia al estrés osmótico de las plantas de tomate.
P la n to n e s de to m a te de 12 d ías de edad (cv B a lco n y R ed) que c re c ie ro n en el sue lo se p u lve riza ro n con la su sp e n s ió n de a g ro b a c te ria s que a lb e rg a n los ve c to re s de P V X p N M D 7580 (in se rc ió n de B nL A S ), p N M D 7610 ( in se rc ió n de G m R D 22 ) y p N M D 5800 ( in se rc ió n de G F P , co n tro l de tra n s fe cc ió n ). 13 d ía s d e sp u é s de la p u lve riza c ió n , los p la n to n e s se tra n s fir ie ro n a v a so s de p re c ip ita d o s que co n te n ía n una so lu c ió n al 20 % de P E G 6000 y se incu ba ro n a llí d u ra n te 20 horas. C om o se re p re se n ta en la Fig. 12, las p la n ta s tra n s fe c ta d a s con B nL A S y G m R D 22 eran m ás v ia b le s y m e no s m a rch ita s en co m p a ra c ió n con las p la n ta s no tra n s fe c ta d a s y las p la n ta s tra n s fe c ta d a s con v e c to re s de G FP.
Secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos a las que se hace referencia en el presente documento
CspB - proteína de choque por frío de Bacillus subtilis
S E Q ID NO : 1: C D S com p le to , cod ón o p tim iza d o para B ra ss ica napus, s in te tiza d o p o r E n te lech on , G e n B a n k : A A B 01346
Atgctagagggcaaagtgaagtggttcaacagcgagaagggattcggctttatcgaagtggaaggcc aggatgacgtgtttgttcacttctctgccatccaaggggaaggattcaagacactggaggaaggaca ggcagtctcattcgagatagtcgaggggaatagaggacctcaagctgcgaacgttaccaaagaggct tga
S E Q ID NO: 2: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s :
M L E G K V K W F N S E K G F G F IE V E G Q D D V F V H F S A IQ G E G F K T L E E G Q A V S F E IV E G N R G P Q A A N V T K E A
Gen de la roteína 7.4 (cspA) de choque por frío de E. coli, cds completo GenBank: M30139.1
S E Q ID NO: 3 :C D S :
Atgtccggtaaaatgactggtatcgtaaaatggttcaacgctgacaaaggcttcggcttcatcactc ctgacgatggctctaaagatgtgttcgtacacttctctgctatccagaacgatggttacaaatctct ggacgaaggtcagaaagtgtccttcaccatcgaaagcggcgctaaaggcccggcagctggtaacgta accagcctgtaa
S E Q ID NO: 4: P ro te ína :
Msgkmtgivkwfnadkgfgfitpddgskdvfvhfsaiqndgyksldegqkvsftiesgakgpaagnv tsl
NF-YB1 - Subunidad B-1 del factor de transcripción nuclear Y de Arabidopsis thaliana
S E Q ID NO: 5: se cu e n c ia o rig in a l de O R F, s in te tiza d o p o r E n te le ch o n G e n B a n k : N M _ 129445.2 atggcggatacgccttcgagcccagctggagatggcggagaaagcggcggttccgttagggagcagg atcgataccttcctatagctaatatcagcaggatcatgaagaaagcgttgcctcctaatggtaagat tggaaaagatgctaaggatacagttcaggaatgcgtctctgagttcatcagcttcatcactagcgag gccagtgataagtgtcaaaaagagaaaaggaaaactgtgaatggtgatgatttgttgtgggcaatgg caacattaggatttgaggattacctggaacctctaaagatatacctagcgaggtacagggagttgga gggtgataataagggatcaggaaagagtggagatggatcaaatagagatgctggtggcggtgtttct ggtgaagaaatgccgagctgg
S E Q ID NO: 6: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
M A D T P S S P A G D G G E S G G S V R E Q D R Y L P IA N IS R IM K K A L P P N G K IG K D A K D T V Q E C V S E F
IS F IT S E A S D K C Q K E K R K T V N G D D L L W A M A T L G F E D Y L E P L K IY L A R Y R E L E G D N K G S G K
S G D G S N R D A G G G V S G E E M P S W
BnLAS - Factor de transcripción LAS de Brassica napus cultivar Hua shuang N.° 5
S E Q ID NO: 7: C D S com p le to , s in te tiza d o p o r E u ro fin s M W G O p e ro n S itios de e m p a lm e e lim ina do s:
454 -456 :A G ^ T C ,C 651 T
G e n B a n k : H Q 324233.1
atgcttacttccttcaaatcctctagctcctcctccgaagatgccaccgagaatcctcctcctcctc ctccgttatgcctcgcctcatcttctgccgcaacatccgccgctcatcacctccgtcgtctactatt cacagctgcggatttcatctctcagtccaacgtctccgccgctcaaaacatactctcaatcctctcc tcaaactcttccccttacggggactccacggagcggctcgtccatctcttcaccaaagccttgtccg tacggatcggcttgtctgaaaacactgccacgtggacagcgaacgaaatggcttctagctccacggt ttttacaagcagtgtatgcaaagaacagttcttgtttcgaaccaagaacaacaacaactctgatctc gagtcttgttactatctttggctgaaccaactaacaccgtttattcggttctcccatttaacggcga accaagcgatcctcgacgcgactgagacaaacaacggtaacggagctttacatatacttgacttaga tatatcacaaggacttcaatggcctccgttgatgcaagccctagccgagagatcatcatcaaaccct agcagtactccacctccttccctccgcataaccggatgtggtcgagatgtaaccgtattaaaccgaa ccggagatcggttaacccggtttgctaactctctaggtcttcagtttcagtttcacacgcttgtgat cgctgaagaagacctcgccggacttttgcttcagatcagattattagctctctccgccgtacaagga gagtccatcgccgtcaactgcgtccacttccttcacagattctttaacgacgacggagacatgatcg gtcacttcctgtcggcgatcaagagcttaaaccctagaatcgtgacaatggcggagagagaagcgaa ccatggagatccttcgttcttgactagattctcagaggctttagatcatttcatggcgatatttgat tcgttggaagcgactttgccgccaaacagcaaagagaggctaaccctagagcaacggtggttcggta tggagattttggatgttgtggcggcggaagcggcggagagaaagcaaagacatcggaggtttgaggt ttgggaggagatgatgaagagacatggctttgctaacgtgccaataggaagctttgctttctctcaa gctaagcttctgcttagactccattatccttcagaaggttataatcttcagtttctcaacgactctt tgtttcttggatggaaaaatcgtcttctcttctccgtttcgtcgtggaaa
S E Q ID NO: 8: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
MLTSFKSSSSSSEDATENPPPPPPLCLASSSAATSAAHHLRRLLFTAADFISQSNVSAAQNILSILS SNSSPYGDSTERLVHLFTKALSVRIGLSENTATWTANEMASSSTVFTSSVCKEQFLFRTKNNNNSDL ESCYYLWLNQLTPFIRFSHLTANQAILDATETNNGNGALHILDLDISQGLQWPPLMQALAERSSSNP SSTPPPSLRITGCGRDVTVLNRTGDRLTRFANSLGLQFQFHTLVIAEEDLAGLLLQIRLLALSAVQG ESIAVNCVHFLHRFFNDDGDMIGHFLSAIKSLNPRIVTMAEREANHGDPSFLTRFSEALDHFMAIFD
SLEATLPPNSKERLTLEQRWFGMEILDWAAEAAERKQRHRRFEVWEEMMKRHGFANVPIGSFAFSQ AKLLLRLHYPSEGYNLQFLNDSLFLGWKNRLLFSVSSWK
GmRD22 - proteína de dominio BURP localizada en apoplastos de soja
S E Q ID NO : 9: C D S co m p le to , s in te tiza d o p o r E u ro fin s M W G O p e ro n (m u ta c ió n s ile n c io sa de C 843 G para e lim in a c ió n de s itio B saI)
G e n B an k: B T 097299.1
Atggagtatcgtctcctacccatttttactttactcaatcttgcactggtggcaatccatgctgctt tacctcctgaagtttactggaagtcggtgcttcctactacgccaatgccaaaagccatcactgatat cctttaccccgattgggtggaagagaaaagtacctcagtgaatgttggaggcaagggcgtaaacgtg catgcaggaaaaggaggaggtggcaccaatgtcaacgttggtggaaaaggatcaggcggaggcgtga acgtgcatgcaggtcacaagggaaagccagtgcatgtttctgttggctcaaagtctccattcaatta catctacgcttcaacggagactcaattacacgatgaccccaacgtcgcactcttcttcttggaaaag gacttgcatcccggaacaaagttgaacttgcacttcaccaccagttccaatattcaagccacattct tgccacgccaagttgcggattctatacccttttcatccagcaaggtggaggttgtattcaacaagtt ttccgtaaaacccgggtcagaggaggcccagatcatgaagaatactctcagtgagtgtgaagagggt ggcatcaaaggagaggaaaagtactgtgccacttcgcttgaatccatgattgatttcagcacttcca agcttggaaaaaatgttgaggttgtgtccacggaagtagtggaggacaaggaaacgggattgcagaa atacaccgtagcaccgggagtgaacaagttatcaggggacaaggctgttgtgtgccacaagcagaac tacccttatgctgttttttactgtcacaaaactgagacgacaagagcttactctgtgcctttggagg gtgctaatggggttagggttaaagcggtagcagtgtgccacactcacacgtcggaatggaaccctaa acatttggcctttcaagtgctcaaagttaagccaggaaccgttcctgtctgccacttcctacctgag gatcatgttgtttgggttcccaag
S E Q ID NO: 10: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
MEYRLLPIFTLLNLALVA1HAALPPEVYWKSVLPTTPMPKAITDILYPDWVEEKSTSVNVGGKGVNV HAGKGGGGTNVNVGGKGSGGGVNVHAGHKGKPVHVSVGSKSPFNYIYASTETQLHDDPNVALFFLEK DLHPGTKLNLHFTTSSNIQATFLPRQVADSIPFSSSKVEWFNKFSVKPGSEEAQIMKNTLSECEEG GIKGEEKYCATSLESMIDFSTSKLGKNVEWSTEWEDKETGLQKYTVAPGVNKLSGDKAWCHKQN YPYAVFYCHKTETTRAYSVPLEGANGVRVKAVAVCHTHTSEWNPKHLAFQVLKVKPGTVPVCHFLPE DHWWVPK
BcWRKY46 - Factor transcripcional WRKY46 de Brassica rapa subsp. chinensis
S E Q ID NO: 11: C D S com p le to , s in te tiza d o p o r E u ro fin s M W G O p e ron . G e n B an k: H M 585284
Atggctatggaagagaaactcgtgatcaacgaactggaacaagggagagagcttgcccaacgtttga tgagcaatctcaaagacacttcctcaatcgaatccagcaagaacttgatctctgagatcctcagtat ctaccagaatgctatttccatgttagacgacaagaaggtccttaaacgtagccgtgagatcgatgac aaagattctaagaacgtgataaaaaagaggcaagtgtttgagaagaagacagagaaagttagtttct ttgtcggagcaggacaagaaaagggttccattgatgatggttattgctggagaaagtacggtcaaaa agagattcatggatccattaatccaagaggatatttcagatgcacgcatcgattcacacagaactgt ttagcagtgaagcaagtccaaaaatcagacagagatccttccattttcgaagtgaagtatgtcggga gccacacttgtaacaacactactacgtccccaaagacaccgaacttctctatttcgatgttccaaca agaagacatcaaaccgacgaaaacagaggaagcgatgatgagtcttgaagatctcgagagcactaag aacattttcagaacgttttctttctccaactacgagattgagaatgctggtggtggttggaaaggca acctcttccatgaggatcagctgtctcctgctgcgactacgtcagggtctggaatcaccagcgaggt tgcaacagctcctgcttccgttgagaactcggagactgcagattcgtatttctcgtctttggacaat attatcgactttggaccggattggttgctgtcgtgtgacgttttgaattgg
S E Q ID NO: 12: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
MAMEEKLVINELEQGRELAQRLMSNLKDTSSIESSKNLISEILSIYQNAISMLDDKKVLKRSREIDD KDSKNVIKKRQVFEKKTEKVS FFVGAGQEKGSIDDGYCWRKYGQKE1HGSINPRGYFRCTHRFTQNC LAVKQVQKSDRDPSIFEVKYVGSHTCNNTTTSPKTPNFSISMFQQEDIKPTKTEEAMMSLEDLESTK NIFRTFSFSNYEIENAGGGWKGNLFHEDQLSPAATTSGSGITSEVATAPASVENSETADSYFSSLDN IIDFGPDWLLSCDVLNW
HaHBI - Factor de transcripción de subfamilia I de Helianthus annuus HD-Zip
S E Q ID NO: 13: C D S com p le to , s in te tiza d o p o r E u ro fin s M W G O p e ron ; s itio s de e m p a lm e e lim in a d o s G 561A , G 750 A
G e n B a n k : H Q 287802.1
Atgacttgcactggaatggctttcttctcctccaatttcatgttacaatcctcccaagaagatgacc atcatgcccctacatctctctctccaatcctcccaccttgcagtaccaccactcaagatttcagtgg tgctgctttcttgggaaaaagatctatgtcttcttactcaggtttgaacaacaacaacatggatgga tgtgatcaagaagggaacatgaatggagaagatgagttatcagatgatggatcacagcttcttgcag gagagaaaaagaggagattaaacatggaacaagtgaagacacttgagagaaactttgagttaggaaa taagcttgaacctgagaggaaaatgcaacttgcaagagcacttggactacaaccaagacagattgct atatggtttcaaaacagaagagctagatggaaaactaaacagttggaaaaagactatgatgccctca agagacagtttgaagctgttaaagctgagaatgattcactccaatctcaaaatcataaacttcatgc tgagataatggcactaaaaaatagagagccagcagaactaatcaacctcaacataaaagaaacagaa ggatcttgcagcaaccgaagcgaaaacagctctgaaatcaaactagacatctcaagaacaccggcta ccgatagccctttatcatcacaccatcaacaccaacaccagccaatacctaatctttttccatcgtc gaatatcgatagacctaattcgaataacattgtggcgcatcaacttttccacaattcgtcatcaagg ccggcagatcatcaacttcattgccacaaactcgatcaatcgaatgccattaaagaagaatgtttta gcacaatgtttgttggtatggatgatcaatcagggttttggccatggttggaacaaccacaattcaa t
S E Q ID NO: 14: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
MTCTGMAFFSSNFMLQSSQEDDHHAPTSLSPILPPCSTTTQDFSGAAFLGKRSMSSYSGLNNNNMDG
CDQEGNMNGEDELSDDGSQLLAGEKKRRLNMEQVKTLERNFELGNKLEPERKMQLARALGLQPRQIA
IWFQNRRARWKTKQLEKDYDALKRQFEAVKAENDSLQSQNHKLHAEIMALKNREPAELINLNIKETE
GSCSNRSENSSEIKLDISRTPATDSPLSSHHQHQHQPIPNLFPSSNIDRPNSNNIVAHQLFHNSSSR
PADHQLHCHKLDQSNAIKEECFSTMFVGMDDQSGFWPWLEQPQFN
NtAAO - Precursor de ascorbato oxidasa de Nicotiana tabacum
S E Q ID NO: 15: C D S com p le to , s in te tiza d o p o r E u ro fin s M W G O p e ro n .G e n B a n k : D 43624
a t g g c t t c c t t a g g c t t c t t g t t c t t c t t c t t g t t g c c a t t g a t t t t g c t t g a g t t a t c t t c a t c t a g g t c a g t a a t g g c a g c a a a a a c a c g g c a t t t t a a a t g g g a c g t g g a a t a t a t t c a t t g g t c a c c a g a t g g t g a a g a a a g t g t a g t a a t g g g a a t c a a t g g a c a g t t t c c t g g t c c a a c t a t t a g g g c a a a a g c t g g t g a t a c t g t t g c t g t t c a t c t t a c t a a c a a g c t a c a t a c t g a a g g t g t t g t c a t t c a t t g g c a t g g a a t c c g a c a g a t c g g a a c a c c a t g g g c t g a t g g a a c t g c a g c a a t t t c c c a a t g c g c c a t t a a c c c t g g a g a g a c a t t t c t c t a t a g g t t t a a a g t t g a t a a g g c a g g g a c a t a c t t c t a c c a t g g a c a c t a t g g a a t g c a a a g a t c a g c a g g g c t a t a t g g t t c a c t a a t a g t g g a a g t t g g a g a a g g t g a a a a a g a a c c a t t c c a t t a t g a t g g a g a a t t c a a t t t a t t g c t t a g t g a c t g g t g g c a c a a a g g t t c c c a t g a a c a a g a a g t t g a c c t c t c t t c c a a t c c t c t t c g t t g g a t t g g t g a a c c c c a g a c a t t g t t g c t a a a t g g g a g a g g t c a a t a c a a t t g t t c a c t t g c g g c g c g g t t t a g c a a a c c a c c a c t t c c a c a g t g c a a g t t a a g a g g g g g t g a a c a g t a c g c a c c c c a g a t t c t g c g c g t g c g t c c c a a c a a g a t t t a c a g g c t t a g g g t g g c a a g t a c t a c t g c a t t g g g t t c a c t c a g c t t g g c c a t t g g g g g t c a c a a g a t g g t g g t a g t a g a a g c a g a t g g a a a c t a t g t t c a a c c a t t t t c a g t a c a a g a c a t g g a c a t t t a t t c a g g t g a a a g c t a t t c a g t c c t t t t c a a a a c a g a t c a a g a t c c t a c c a a a a a c t a t t g g a t t t c a a t a a a t g t a a g a g g a a g a g a a c c a a a a a c a c c t c a a g g c c t c a c c t t a t t a a a c t a t c t t c c a a a t t c t g c a t c c a a a t t t c c a
a c t t t a c c a c c a c c t a t a g c a c c c c t t t g g a a t g a t t a t a a c c a t a g t a a g t c a t t t t c t a a c a a a a t t t t t g c c t t a a t g g g a t c a c c t a a g c c a c c a c c t c a g a a c c a t c g t c g t a t c a t c c t g c t c a a t a c t c a g a a c a a a a t c g a t g g t t a c a c g a a a t g g g c t a t a a a t a a c g t g t c g t t g g t c t t g c c a a c g c a a c t t t a t t t a g g c t c g a t t a g a t a t g g c a t a a a c g c g t t t g a c a c g a a a c c t c c a c c g g a c a a c t t c c c t a a g g a c t a t g a t g t c c t a a a a c a a g c a c c a a a t t c t a a t t c t a c a t a t g g t a a t g g t g t g t a t a t g c t a a a g t t c a a t a c t a c a a t t g a c a t t a t c c t a c a a a a t g c a a a t g c c t t a g c t a a a g a t g t t a g t g a a a t t c a t c c t t g g c a t t t g c a t g g a c a t g a t t t t t g g g t a t t g g g a t a t g g a g a a g g g a a a t t t a g t g a a a a a g a t g t c a a g a a g t t c a a t t t a a a g a a t c c a c c a t t g a g a a a t a c t g c t g t g a t t t t t c c c t t t g g t t g g a c t g c a c t a a g a t t t g t g a c a g a t a a t c c t g g a g t t t g g g c t t t t c a t t g t c a t a t t g a g c c a c a t t t a c a t a t g g g a a t g g g a g t t a t a t t t g c t g a a g g t g t t c a t c t t g t c a a g a a a a t a c c t a a a g a a g c t t t g g c t t g t g g t t t g a c a g g g a a a a t g t t g a t g a g t a a c a a g c a t a a t
S E Q ID NO: 16: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
MASLGFLFFFLLPLILLELSSSRSVMAAKTRHFKWDVEY1HWSPDGEESWMGINGQFPGPTIRAKA
GDTVAVHLTNKLHTEGW1HWHGIRQIGTPWADGTAAISQCAINPGETFLYRFKVDKAGTYFYHGHY
GMQRSAGLYGSLIVEVGEGEKEPFHYDGEFNLLLSDWWHKGSHEQEVDLSSNPLRWIGEPQTLLLNG
RGQYNCSLAARFSKPPLPQCKLRGGEQYAPQILRVRPNKIYRLRVASTTALGSLSLAIGGHKMVWE
ADGNYVQPFSVQDMDIYSGESYSVLFKTDQDPTKNYWISINVRGREPKTPQGLTLLNYLPNSASKFP
TLPPPIAPLWNDYNHSKSFSNKIFALMGSPKPPPQNHRRIILLNTQNKIDGYTKWAINNVSLVLPTQ
LYLGSIRYGINAFDTKPPPDNFPKDYDVLKQAPNSNSTYGNGVYMLKFNTTIDIILQNANALAKDVS
E1HPWHLHGHDFWVLGYGEGKFSEKDVKKFNLKNPPLRNTAVIFPFGWTALRFVTDNPGVWAFHCHI
EPHLHMGMGVIFAEGVHLVKKIPKEALACGLTGKMLMSNKHN
AVP1_ARATH - pirofosfatasa vacuolar H+ de Arabidopsis thaliana (AVP-3)
S E Q ID NO: 17: C D S com p le to , s in te tiza d o p o r E u ro fin s M W G O p e ron ; (con m u ta c ión de E 229D ; s itio s de e m p a lm e e lim ina do s: A 261 G , C 2004 G , A 2190 T ) G e n B an k: A E E 29349.1
a t g g t g g c g c c t g c t t t g t t a c c g g a g c t c t g g a c g g a g a t c c t t g t a c c g a t t t g t g c g g t g a t t g g t a t c g c c t t t t c g c t t t t c c a a t g g t a c g t t g t a t c t c g c g t g a a a c t c a c c t c t g a c c t c g g c g c a t c g t c t t c c g g t g g a g c t a a c a a t g g g a a g a a t g g a t a c g g t g a t t a t c t a a t c g a g g a a g a g g a a g g t g t t a a t g a c c a g a g t g t t g t c g c t a a g t g c g c t g a g a t t c a g a c t g c t a t t t c c g a g g g t g c a a c t t c a t t c c t a t t c a c g g a g t a c a a a t a t g t t g g t g t c t t c a t g a t t t t c t t t g c t g c t g t t a t c t t t g t t t t c c t c g g c t c t g t t g a g g g a t t c a g c a c t g a t a a c a a g c c t t g t a c t t a c g a c a c c a c c a g a a c c t g c a a g c c t g c a t t g g c t a c t g c a g c t t t c a g t a c c a t t g c t t t c g t g c t t g g t g c t g t t a c c t c t g t t c t a t c t g g t t t c c t t g g g a t g a a g a t t g c t a c a t a c g c t a a t g c t a g g a c c a c t t t g g a g g c g a g g a a a g g t g t t g g a a a g g c g t t c a t t g t t g c a t t c a g g t c t g g t g c t g t g a t g g g t t t c c t t c t t g c a g c g a g t g g t c t a t t g g t g c t t t a c a t t a c t a t c a a t g t g t t c a a g a t c t a t t a c g g a g a t g a c t g g g a a g g t c t t t t t g a c g c t a t t a c t g g t t a t g g t c t t g g t g g g t c t t c c a t g g c t c t c t t t g g c c g t g t t g g t g g t g g g a t c t a c a c t a a g g c t g c t g a t g t c g g c g c t g a c c t t g t c g g t a a a a t t g a g a g g a a t a t t c c a g a g g a t g a t c c a a g a a a c c c a g c t g t c a t t g c t g a t a a t g t c g g t g a c a a t g t t g g t g a c a t t g c t g g t a t g g g a t c t g a t c t c t t t g g a t c a t a t g c t g a a g c a t c a t g c g c t g c t c t t g t t g t t g c c t c g a t c t c a t c t t t c g g a a t c a a c c a c g a c t t c a c t g c c a t g t g c t a c c c a t t g c t c a t c a g t t c a a t g g g a a t c t t g g t t t g t t t g a t c a c a a c t c t c t t t g c c a c t g a c t t c t t t g a g a t t a a g c t t g t c a a g g a g a t t g a a c c a g c a t t g a a g a a c c a g c t c a t t a t c t c a a c t g t t a t t a t g a c t g t t g g t a t t g c t a t t g t g t c a t g g g t t g g c t t a c c g a c c t c c t t t a c c a t c t t c a a c t t t g g a a c a c a a a a a g t t g t c a a g a a c t g g c a g c t a t t c c t t t g t g t t t g t g t t g g t c t t t g g g c t g g a c t c a t t a t t g g t t t c g t c a c t g a g t a c t a c a c t a g t a a c g c c t a c a g c c c t g t g c a a g a t g t t g c a g a t t c a t g c a g a a c t g g t g c a g c t a c c a a t g t t a t c t t c g g c c t t g c t c t t g g t t a c a a a t c c g t c a t t a t t c c a a t c t t t g c t a t t g c t a t c a g t a t a t t c g t t a g c t t c a g c t t t g c t g c t a t g t a t g g t g t t g c t g t t g c t g c t c t t g g t a t g c t c a g t a c c a t t g c c a c t g g t t t g g c a a t t g a t g c t t a t g g t c c c a t c a g t g a c a a t g c t g g t g g t a t t g c t g a a a t g g c t g g a a t g a g c c a c c g c a t c c g t g a a a g a a c t g a t g c t c t t g a t g c c g c t g g a a a c a c c a c t g c t g c t a t t g g a a a g g g a t t t g c c a t t g g c t c t g c t g c c c t a g t c t c c t t g g c t c t c t t t g g t g c c t t t g t g a g c c g t g c a g g g a t c c a c a c c g t a g a t g t t t t g a c c c c t a a a g t t a t c a t t g g g c t c c : t t g t t g g t g c c a t g c t t c c t t a c t g g t t c t c t g c c a t g a c a a t g a a g a g t g t g g g a a g t
g c a g c t c t t a a g a t g g t t g a a g a a g t t c g c a g g c a g t t c a a c a c c a t c c c t g g a c t t a t g g a a g g a a c c g c a a a a c c a g a c t a c g c c a c a t g t g t c a a g a t c t c c a c c g a t g c t t c c a t c a a g g a a a t g a t a c c t c c t g g t t g c c t t g t c a t g c t c a c a c c t c t c a t t g t t g g t t t c t t c t t t g g a g t t g a g a c g c t c t c t g g t g t c c t c g c c g g a t c t c t t g t a t c c g g t g t t c a g a t c g c c a t a t c a g c a t c t a a c a c t g g t g g t g c c t g g g a c a a c g c c a a g a a a t a c a t c g a g g c t g g t g t a t c a g a g c a c g c a a a g a g c c t t g g a c c a a a g g g t t c a g a g c c a c a c a a g g c a g c t g t g a t t g g a g a c a c a a t t g g t g a c c c a t t g a a g g a t a c t t c a g g a c c t t c a t t g a a c a t c c t c a t c a a g c t c a t g g c t g t t g a g t c t c t t g t c t t t g c t c c c t t c t t c g c c a c t c a c g g t g g t a t c c t t t t c a a g t a c t t c
S E Q ID NO: 18: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
M V A P A L L P E L W T E IL V P IC A V IG IA F S L F Q W Y W S R V K L T S D L G A S S S G G A N N G K N G Y G D Y L IE E E E
G V N D Q S W A K C A E IQ T A IS E G A T S F L F T E Y K Y V G V F M IF F A A V IF V F L G S V E G F S T D N K P C T Y D T T R
T C K P A L A T A A F S T IA F V L G A V T S V L S G F L G M K IA T Y A N A R T T L E A R K G V G K A F IV A F R S G A V M G F L L
A A S G L L V L Y IT IN V F K IY Y G D D W E G L F D A IT G Y G L G G S S M A L F G R V G G G IY T K A A D V G A D L V G K IE R
N IP E D D P R N P A V IA D N V G D N V G D IA G M G S D L F G S Y A E A S C A A L W A S IS S F G IN H D F T A M C Y P L L IS
S M G I L V C L I T T L F A T D F F E I K L V K E I E P A L K N Q L I I S T V I M T V G I A I V S W V G L P T S F T I F N F G T Q K V
V K N W Q L F L C V C V G L W A G L I IG F V T E Y Y T S N A Y S P V Q D V A D S C R T G A A T N V IF G L A L G Y K S V I IP IF A
IA IS IF V S F S F A A M Y G V A V A A L G M L S T I A T G L A ID A Y G P I S D N A G G I A E M A G M S H R I R E R T D A L D A A
G N T T A A IG K G F A IG S A A L V S L A L F G A F V S R A G IH T V D V L T P K V I IG L L V G A M L P Y W F S A M T M K S V G S
A A L K M V E E V R R Q F N T IP G L M E G T A K P D Y A T C V K IS T D A S IK E M IP P G C L V M L T P L IV G F F F G V E T L S
G V L A G S L V S G V Q IA IS A S N T G G A W D N A K K Y IE A G V S E H A K S L G P K G S E P H K A A V IG D T IG D P L K D T S
G P S L N I L I K L M A V E S L V F A P F F A T H G G IL F K Y F
SNAC1 - Factor de transcripción NACI inducido por estrés (SNAC1) de Oryza sativa (grupo de cultivar de japónica)
S E Q ID NO: 19: C D S com p le to , cod ón o p tim iza d o p ara Nicotiana benthamiana, S in te tiza d o p or E n te lech on G e n B an k: D Q 394702.1
ATGGGAATGAGACGAGAACGAGACGCAGAAGCCGAGCTTAATCTGCCACCTGGCTTTCGTTTTCATC CGACTGATGATGAACTAGTGGAACACTACCTTTGCAGAAAAGCAGCTGGTCAAAGGCTCCCAGTTCC TATCATAGCTGAGGTTGATCTCTATAAATTTGACCCCTGGGATCTTCCGGAAAGGGCATTGTTTGGG GCTCGTGAATGGTACTTTTTCACCCCACGCGATAGGAAGTACCCAAACGGATCTCGTCCAAACAGGG CCGCTGGAAACGGTTATTGGAAAGCGACTGGAGCTGACAAGCCAGTAGCTCCTAGGGGGAGAACGCT CGGTATTAAAAAGGCTCTAGTTTTCTACGCTGGAAAAGCCCCAAGAGGCGTTAAGACTGACTGGATT ATGCATGAATATAGACTGGCTGATGCTGGAAGAGCTGCTGCGGGGGCTAAGAAAGGTAGTTTGAGAT TAGACGATTGGGTCCTCTGTCGGCTATATAACAAGAAGAACGAGTGGGAGAAGATGCAACAGGGGAA AGAGGTTAAGGAGGAAGCCTCGGATATGGTGACTTCCCAGTCGCATAGCCACACCCACTCTTGGGGA GAAACCCGCACACCAGAGTCTGAGATCGTTGATAACGACCCCTTTCCGGAATTGGATTCTTTCCCTG CCTTTCAACCTGCACCTCCACCTGCAACTGCAATGATGGTCCCGAAGAAAGAATCAATGGACGACGC AACAGCAGCAGCTGCTGCTGCCGCGACAATCCCTAGGAATAATTCAAGCCTTTTCGTAGATCTTTCC TACGACGATATTCAGGGGATGTATAGCGGCTTAGACATGTTGCCTCCCGGCGACGACTTCTATTCCT CATTGTTCGCAAGTCCCCGTGTCAAAGGAACAACACCTCGAGCAGGTGCTGGAATGGGAATGGTGCC TTTTTAA
S E Q ID NO: 20: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
MGMRRERDAEAELNLPPGFRFHPTDDELVEHYLCRKAAGQRLPVPIIAEVDLYKFDPWDL
PERALFGAREWYF FTPRDRKYPNGSRPNRAAGNGYWKATGADKPVAPRGRTLGIKKALVF
YAGKAPRGVKTDWIMHEYRLADAGRAAAGAKKGSLRLDDWVLCRLYNKKNEWEKMQQGKE
VKEEASDMVTSQSHSHTHSWGETRTPESEIVDNDPFPELDSFPAFQPAPPPATAMMVPKK
ESMDDATAAAAAAATIPRNNSSLFVDLSYDDIQGMYSGLDMLPPGDDFYSSLFASPRVKG
TTPRAGAGMGMVPF-
IPT isopentenil transferasa IPT (E88G) de Agrobacterium tumefaciens C58
S E Q ID NO: 21: C D S , M u ta c ión E 88 G G en B ank: A B 025109.1
Atggatctgcgtctaattttcggtccaacttgcacaggaaagacgtcgaccgcggtagctcttgccc agcagactgggcttccagtcctttcgctcgatcgggtccaatgttgtcctcagctgtcaaccggaag cggacgaccaacagtggaagaactgaaaggaacgagccgtctataccttgatgatcggcctctggtg aagggtatcatcgcagccaagcaagctcatgaaaggctgatgggggaggtgtataattatgaggccc acggcgggcttattcttgagggaggatctatctcgttgctcaagtgcatggcgcaaagcagttattg gagtgcggattttcgttggcatattattcgccacgagttagcagacgaggagaccttcatgaacgtg gccaaggccagagttaagcagatgttacgccctgctgcaggcctttctattatccaagagttggttg atctttggaaagagcctcggctgaggcccatactgaaagagatcgatggatatcgatatgccatgtt gtttgctagccagaaccagatcacatccgatatgctattgcagcttgacgcagatatggaggataag ttgattcatgggatcgctcaggagtatctcatccatgcacgccgacaagaacagaaattccctcgag ttaacgcagccgcttacgacggattcgaaggtcatccattcggaatgtat
S E Q ID NO: 22: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s
MDLRLIFGPTCTGKTSTAVALAQQTGLPVLSLDRVQCCPQLSTGSGRPTVEELKGTSRLYLDDRPLV KGIIAAKQAHERLMGEVYNYEAHGGLILEGGSISLLKCMAQSSYWSADFRWHIIRHELAHEETFMNV AKARVKQMLRPASGLSIIQELVDLWKEPRLRRILKEIDGYRYAMLFVSQNQITSDMLLQLDADMEDK
L1HGIAQEYL1HARRQEQKFPRVNAAAYDGFEGHPFGMY
LeCYP - Cilofilina de tomate
S E Q ID NO: 23: C D S
M 550019.1 ; gi: 170439
Atggcaaatccaaaggttttctttgaccttaccatcggtggtgcaccagctggtcgtgtggtgatgg agctcttcgccgataccactcccaaaaccgctgagaacttccgagctctttgtaccggtgagaaagg tgttggaaagatggggaagcctttgcactacaagggctcaaccttccaccgtgtgatcccagggttc atgtgtcaaggaggtgatttcaccgccggaaacgggaccggaggagagtcgatctatggagccaaat tcaacgatgagaacttcgttaagaagcacaccggccctggaatcctctccatggctaatgctggacc tggaaccaacggttctcagtttttcatctgtaccgctaagactgagtggctcaacggaaagcacgtc gtgtttggacaagttgttgaaggcatggatgtgattaagaaggcagaggctgttggatctagctctg gaaggtgctccaagcctgtggttattgctgactgcggtcaactc
S E Q ID NO: 24: S e cu e n c ia de a m in o á c id o s MANPKVFFDLTIGGAPAGRWMELFADTTPKTAENFRALCTGEKGVGKMGKPLHYKGSTFHRVIPGF MCQGGDFTAGNGTGGESIYGAKFNDENFVKKHTGPGILSMANAGPGTNGSQFFICTAKTEWLNGKHV VFGQWEGMDVIKKAEAVGS SSGRCSKPWIADCGQL S E Q ID NO: 25: reg ión de AD N - T de p N M D 2492
S E Q ID NO: 26: reg ión de AD N - T de p N M D 035
S E Q ID NO: 27: reg ión de AD N - T de pN M D 661
S E Q ID NO: 28: reg ión de AD N - T de p N M D 670
S E Q ID NO: 29: reg ión de AD N - T de p N M D 694
S E Q ID NO: 30: reg ión de AD N - T de p N M D 3486
S E Q ID NO: 31: reg ión de AD N - T de p N M D 3493

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un p ro ce so para p ro p o rc io n a r a una p lu ra lid a d de p la n ta s una to le ra n c ia m e jo ra d a al e s tré s p o r seq u ía , en el que las p la n ta s son p la n ta s m o n o co tile d ó n e a s o d ico tile d ó n e a s , q ue co m p re n d e
(a ) cu ltiv a r d ich a p lu ra lida d de p la n ta s en un ca m p o a gríco la ;
(b ) d e te rm in a r si el e stré s p o r se q u ía a fe c ta a d ich a s p lan tas;
(c ) p ro p o rc io n a r a las p artes a é re a s de d ich a s p la n ta s una su sp e n s ió n que con tien e c é lu la s de una cep a de Agrobacterium que co m p re n d e una m o lé cu la de á c id o n u c le ico que co m p re n d e una co n s tru cc ió n de á c ido n u c le ico que con tie n e una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés, d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te rés p ro p o rc io n a n d o a d ich as p la n ta s una re s is te n c ia a u m e n ta d a al e stré s p o r seq u ía d e sp u é s de la e xp re s ió n en d ich a s p lan tas , en d on de d ich a s p la n ta s se tra n s fe c ta n de fo rm a tra n s ito r ia con d ich a m o lé cu la de á c id o nuc le ico .
2. El p ro ce so de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 1, en el que la p re se n c ia o a u se n c ia de e s tré s p o r se q u ía q ue a fe c ta a d ich a s p la n ta s se d e te rm in a u sa nd o uno o m á s de los s ig u ie n te s c rite r io s : e s ta do de a gu a en el sue lo ta l com o co n te n id o de h um e da d de l sue lo , e s ta d o de a gu a en el te jid o de las p la n ta s ta l com o co n te n id o de a gu a re la tivo , índ ice de e s tré s p o r a gu a de la p lan ta , p res ió n de tu rg e n c ia o c o n d u c ta de los e s tro m a s , y p o te n c ia l h íd rico en el sue lo o en la p lan ta .
3. El p ro ce so de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 1 o 2, en el que d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s cod ifica una p ro te ín a ca p a z de p ro p o rc io n a r a d ich a (s ) p la n ta (s ) d ich a to le ra n c ia a u m e n ta d a al e s tré s p o r sequía ;
en el que d icha p ro te ína , p re fe re n te m e n te ,
1. tien e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de una c u a lq u ie ra de las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24; o
ii. t ie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s q ue tie n e al m e n o s u na ide n tid a d de se cu e n c ia de l 80 % a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s co m p le ta de una c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24; o
iii. tien e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de una lon g itu d de al m e no s el 80 %, p re fe re n te m e n te , de al m e n o s el 90 %, m ás p re fe re n te m e n te , de al m e n o s el 95 % d e l n ú m e ro de re s to s de a m in o á c id o s de una c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 y u na id e n tid a d de s e c u e n c ia de al m e n o s el 90 % a las S E Q ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 o 24, re sp e c tiva m e n te , so b re d ich a long itud ; o
iv. tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s q ue tie n e de 1 a 20 ad ic ion es , su s titu c io n e s o d e le c io n e s de a m in o á c id o s en co m p a ra c ió n con la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de una c u a lq u ie ra de las S E Q ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.
4. El p ro ce so de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 3, en el que d icha p ro te ína es C sp B de B. subtilis.
5. El p roce so de a cu e rd o con la re iv in d ica c ió n 3, en el que d ich a p ro te ín a es el fa c to r de tra n s c rip c ió n LA S ve g e ta l de la S E Q ID NO : 8 o G m R E 222 de la S E Q ID NO: 10 o una va r ia n te de l m ism o seg ún se ha d e fin id o en los a rtícu lo s ii a iv de la re iv in d ica c ió n 3.
6. El p roce so según una c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 5, en el que d ic h a (s ) p la n ta (s ) es (so n) d ico tile d ó n e a s , p re fe re n te m e n te , S o la n a ce a e , m á s p re fe re n te m e n te , p la n ta s de tom a te .
7. El p ro ce so según una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 6, en el q ue d ich a co n s tru cc ió n de á c id o n u c le ico está p rese n te en A D N -T y fla n q u e a d a en a m b o s lad o s p o r s e c u e n c ia s b o rd e de A D N -T , no c o n te n ie n d o d ich o A D N -T un m a rc a d o r s e le cc io n a b le q ue p e rm ita la se le cc ió n de la p lan ta o cé lu la ve g e ta l q ue co n te n g a d ich o A D N -T .
8. El p roce so según una c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 7, en el que d ich a se cu e n c ia de n u c le ó tid o s de in te ré s e stá u n ida o p e ra tiv a m e n te a un p ro m o to r a c tivo en cé lu la s veg e ta les .
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