ES2698374T3 - Medios y procedimientos de diagnóstico de cáncer pancreático en un sujeto basándose en un panel de metabolitos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de diagnóstico de cáncer de páncreas en un sujeto que comprende las etapas de: (a) determinar en una muestra de un sujeto sospechoso de padecer cáncer de páncreas las cantidades de un grupo de biomarcadores, comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a, y (b) comparar dichas cantidades de los biomarcadores con referencias, de manera que se diagnostique el cáncer de páncreas.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios y procedimientos de diagnóstico de cáncer pancreático en un sujeto basándose en un panel de metabolitos

La presente invención se refiere al campo de procedimientos de diagnóstico. Específicamente, la presente invención contempla un procedimiento para el diagnóstico del cáncer de páncreas en un sujeto que comprende las etapas de: (a) determinar en una muestra de un sujeto sospechoso de padecer cáncer de páncreas las cantidades de un grupo de biomarcadores, comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a y (b) comparar dichas cantidades de biomarcadores con referencias, de manera que se diagnostique el cáncer de páncreas. La presente invención se refiere adicionalmente a un procedimiento para identificar si un sujeto tiene la necesidad de una terapia para el cáncer de páncreas que comprende las etapas del procedimiento mencionado anteriormente para el diagnóstico del cáncer de páncreas y una etapa adicional de identificación de un sujeto que necesite terapia para el cáncer de páncreas si se diagnostica que dicho sujeto padece el cáncer de páncreas. Además, la presente invención se refiere a un dispositivo para el diagnóstico del cáncer de páncreas en una muestra de un sujeto que comprende: (a) una unidad de análisis de dicha muestra del sujeto que contiene un detector para las cantidades de un grupo de biomarcadores, comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a, permitiendo dicho detector la determinación de cantidades de biomarcadores de dicho grupo de biomarcadores en la muestra; y unida operativamente a la misma, (b) una unidad de evaluación que comprende una unidad de procesamiento de datos y una base de datos, comprendiendo dicha base de datos una referencia almacenada y teniendo dicha unidad de procesamiento de datos incluido tangiblemente un algoritmo para llevar a cabo la comparación de las cantidades de biomarcadores del grupo de biomarcadores determinados por la unidad de análisis y la referencia almacenada y por la generación de una información del resultado basándose en la cual se puede establecer el diagnóstico.

El cáncer pancreático tiene el peor pronóstico de todos los tumores sólidos con tasas de supervivencia a los 5 años de menos del 5 % pero con una incidencia creciente (Everhart 2009, Gastroenterology 136:1134-11449). Existe una demanda reconocida ampliamente para el establecimiento de herramientas y tecnologías innovadoras para la utilización en el punto de atención de biomarcadores y nuevas herramientas de creación de imágenes moleculares para el diagnóstico precoz, estratificación del pronóstico y diagnóstico diferencial del cáncer pancreático. Los avances en estas áreas son cruciales para mejorar el pronóstico de esta enfermedad maligna, ya que la resección quirúrgica temprana en tumores en estadio temprano es actualmente el único medio eficaz de tratamiento de esta funesta enfermedad.

La mortalidad de este tipo de cáncer es la más alta de cualquier tipo de cáncer en Europa y el mundo occidental. La gente muere muy pronto después del diagnóstico debido a la falta de medios para la detección precoz. Los síntomas tempranos son raros y sin una característica. Por lo tanto, los adenocarcinomas pancreáticos (PDAC) se diagnostican comúnmente en un estadio avanzado de la enfermedad. Hasta la fecha, las mejores tecnologías de creación de imágenes para detectar el PDAC es la endoscopía con ultrasonidos (EUS), tomografía computarizada espiral (CT), colangiopancreografía por resonancia magnética (MRCP) o colangiopancreatografía endoscópica retrógrada (ERCP) (Dewitt 2006, Gastroenterol Hepatol. (4):717-25). Lamentablemente, la resolución de estas tecnologías para detectar lesiones neoplásicas en el páncreas está en el intervalo de 3-10 mm. Por lo tanto, no son capaces de detectar neoplasias pancreáticas en un estadio curable. La concentración sérica de los marcadores tumorales convencionales tales como CA19-9 está aumentada en un subconjunto de pacientes con cáncer pancrático (Fry 2008, Langenbecks Arch Surg. (393): 883-90). Sin embargo, hasta ahora todos los marcadores disponibles carecen de sensibilidad y especificidad tumoral. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para aumentar la sensibilidad diagnóstica hacia la detección de PDAC muy pequeños en estadio temprano y sus lesiones precursoras (PanIN e IPMN) así como el pronóstico de los subgrupos con tumores avanzados.

La asociación entre inflamación crónica y el desarrollo de enfermedades malignas se una reconocido durante muchos años. Para el cáncer pancreático esta asociación solo se confirmó recientemente y en una conferencia de consenso acordó una nueva clasificación para la neoplasia intraepitelial pancrática como lesiones precursoras no invasivas (Hruban 2004, Am J Surg Path (28): 977-987). La pancreatitis crónica se define como accesos recurrentes de una enfermedad inflamatoria estéril caracterizada por cambios a menudo progresivo y cambios morfológicos irreversibles, normalmente que producen dolor y una deficiencia permanente de la función pancreática. Con una incidencia de 8,2, una prevalencia de 27,4 por 100.000 de población y un 0,04% a 5% de frecuencia en especímenes de autopsia no seleccionados de pancreatitis crónica representa un trastorno frecuente del tracto gastrointestinal. Varias etiologías son responsables del desarrollo de pancreatitis crónica. Se demostró un aumento de riesgo de muerte en los pacientes que sufren pancreatitis crónicas, por cáncer pancreático, en la investigación cooperativa internacional dirigida por AB Lowenfels y colegas como un estudio multicéntrico de cohorte histórica de 2015 pacientes con pancreatitis crónica reclutados de centros clínicos en 6 países en 1993. Este estudio descubrió un riesgo acumulativo de cáncer pancreático en pacientes con pancreatitis crónica de 1,8 % después de 10 años y del 4 % después de 20 años con una relación de incidencia convencionalizada de 14,4. Para los pacientes con un mínimo de dos años de seguimiento, el riesgo de cáncer pancreático era 16,5 veces mayor que el de la población general (Lowenfels 1993, N Engl J Med (328): 1433-1437). La búsqueda de una asociación entre pancreatitis crónica y cáncer pancreático se intensificó cuando en 1996 se descubrió que una mutación puntual única en el tercer exón del gen del tripsinógeno catiónico del cromosoma 7 (7q35) estaba asociada con la pancreatitis hereditaria y se identificaron y se informó de múltiples semejantes posteriormente. Solo muy recientemente el grupo de estudio EUROPAC presentó su trabajo sobre características genéticas y clínicas en pancreatitis hereditaria. En un modelo de riesgo proporcional multinivel que emplea datos obtenidos del registro europeo de pancreatitis hereditaria este grupo presentaba 112 familias en 14 países (418 individuos afectados) (Howes 2004, Clinical Gastroenterology and Hepatology (2): 252-261). El riesgo acumulado (95 % de CI) de cáncer pancreático era un 44,0 %(50 %- 82 %). Un estudio previo también había demostrado un riesgo estimado de supervivencia al cáncer pancrático del 40 % (Lowenfels 2001, JAMA 286: 169-170, Lowenfels 1997, J Natl Cancer Inst 89: 442-44656).

En el cáncer pancreático los estudios de creación de imágenes no pueden detectar las enfermedades pancreáticas tempranas en un estadio curable, sin embargo, en los antecedentes de estudios de creación de imagen de pancreatitis crónica tales como EUS, CT o MRI disminuían la sensibilidad y especificidad hasta un grado en el que tirar una moneda al aire era igual de fiable. Por lo tanto, la detección de una enfermedad maligna pancreática en una cohorte de alto riesgo sería altamente deseable.

Existen unos cuantos informes de cambios metabólicos en pacientes que padecen enfermedades asociadas con el páncreas. Schrader y col (Schrader 2009, Pancreas 38: 416-421) sugiere que los pacientes con cáncer pancrático y pancreatitis crónica presentan cambios significativos en los niveles de aminoácidos séricos. Se ha sugerido que los esfingolípidos de la superficie celular de las células tienen una parte activa en la señalización celular (Pitson 2011, Trend Biochem Sci 36:97-107). Se sabe que las ceramidas inducen apoptosis en las células cancerosas. Los bajos niveles de esfingomielina sugiere menos respuesta al tratamiento con gemcitabina (Modrak 2009, Mol Cancer Res 7:890-896). Se ha informado de biomarcadores metabólicos únicos adicionales en los documentos WO 2011/151252 y WO 2013/079594. El documento WO 2011/101330 A1 determina marcadores de alto peso molecular para el diagnóstico del cáncer de páncreas. El documento US2012/202188 A1 describe una variedad de biomarcadores de bajo peso molecular de cáncer pancreático y procedimientos para utilizarlos para el diagnóstico de cáncer pancreático.

En conclusión, con una tasa de supervivencia de 5 años del 0,5-5 %, el cáncer pancreático tiene el pronóstico más funesto de todos los tumores humanos y representa la 4a causa que lidera las muertes mundiales relacionadas con el cáncer. Es por tanto una enfermedad con un impacto socioeconómico principal. El diagnóstico preciso que incluya su diferenciación de pancreatitis y la resección quirúrgica temprana de tumores tempranos actualmente ofrece la única posibilidad realista de mejorar el pronóstico del paciente.

El problema técnico en que se basa la presente invención se puede ver como la provisión de un medio y procedimientos para cumplir las necesidades mencionadas anteriormente. El problema técnico se resuelve por las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y en el presente documento posteriormente.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico del cáncer de páncreas en un sujeto que comprende las etapas de:

(a) determinar en una muestra de un sujeto sospechoso de padecer cáncer de páncreas las cantidades de un grupo de biomarcadores, comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a, y

(b) comparar dichas cantidades de los biomarcadores con referencias, de esta manera se diagnostica el cáncer de páncreas.

El procedimiento al que se hace referencia de acuerdo con la presente invención incluye un procedimiento que consiste esencialmente en las etapas mencionadas anteriormente o un procedimiento que incluye etapas adicionales. Sin embargo, se tiene que entender que el procedimiento, en una realización preferida, es un procedimiento que se lleva a cabo ex vivo, es decir, no se practica en el cuerpo humano o animal. El procedimiento se puede asistir, preferentemente, por automatización.

El término “diagnóstico” como se utiliza en el presente documento se refiere a la evaluación de si un sujeto padece un cáncer pancreático, o no. Como entenderán los expertos en la técnica, dicha evaluación, aunque se preferiría que así fuera, puede habitualmente no ser correcta en el 100% de los sujetos investigados. Sin embargo, el término, necesita que una parte estadísticamente significativa de los sujetos pueda evaluarse correctamente y, por lo tanto, diagnosticarse. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin problemas adicionales por el experto en la técnica utilizando distintas herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, la determinación de los intervalos de confianza, la determinación del valor p, ensayo T de Student, ensayo de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50 %, al menos del 60&, al menos del 70 %, al menos del 80 %, al menos del 90 % o al menos del 95 %. Los valores de p son preferentemente 0,2, 0,1, o 0,05. El término incluye el diagnóstico individual de cáncer pancreático o sus síntomas, así como el control continuo de un paciente. El control, es decir, el diagnóstico de la presencia o ausencia de cáncer pancreático o los síntomas que lo acompañan en distintos momentos, incluye el control de pacientes que se sabe que padecen cáncer pancreático, así como el control de los sujetos que se sabe que tienen riesgo de desarrollar un cáncer pancreático. Además, el control se puede utilizar también para determinar si un paciente se ha tratado satisfactoriamente o si al menos los síntomas del cáncer pancreático pueden mejorarse con el tiempo con una cierta terapia.

Además, el término también comprende, preferentemente, el diagnóstico diferencial del cáncer pancreático, y más preferentemente, la diferenciación entre cáncer pancreático y pancreatitis. Pancreatitis como se utiliza en el presente documento se refiere a una inflamación del páncreas. Habitualmente, la causa de la hepatitis es la activación de las enzimas pancreáticas, por ejemplo, tripsina, en el páncreas más que en el intestino delgado. La pancreatitis puede producirse como una enfermedad aguda que se produce repentinamente y dura unos pocos días c como una enfermedad crónica que persiste durante muchos años. Preferentemente, la pancreatitis a la que se hace reverencia de acuerdo con la presente invención es la pancreatitis crónica. Los síntomas típicos de pancreatitis se pueden encontrar en los libros de texto de referencia convencionales mencionados anteriormente y engloban un dolor abdominal superior grave que irradia desde la espalda, náuseas y vómitos. La diferenciación entre el cáncer pancreático y la pancreatitis se consigue preferentemente aplicando los procedimientos de la presente invención a una muestra de un sujeto del que se sabe o es sospechoso de padecer pancreatitis y comparando las cantidades de biomarcadores medidas con referencias, por lo que se diagnostica el cáncer pancrático. En una realización preferida adicional, dicho diagnóstico del cáncer pancrático da lugar al a diferenciación de si la persona que sabe o se sospecha que padece pancreatitis padece adicionalmente un cáncer pancreático.

La expresión “cáncer pancreático” o “cáncer de páncreas”, como se utiliza en el presente documento se refiere a neoplasias que se derivan de las células pancreáticas, preferentemente, de las células pancreáticas epiteliales. Por lo tanto, preferentemente, cáncer pancreático como se utiliza en el presente documento es un adenocarcinoma pancreático. Los síntomas que acompañan el cáncer pancrático se conocen bien por los libros de texto de medicina tales como el de Stedmen o Pschyrembl e incluyen dolor abdominal grave, dolor de espalda menor, y en algunos casos ictericia.

El término “biomarcador” como se utiliza en el presente documento, se refiere a una especio molecular que sirve como indicador para una enfermedad o efecto al que se hace referencia en la presente memoria descriptiva. Dicha especie molecular puede ser un metabolito en sí, que se encuentra en una muestra de un sujeto. Además, el biomarcador también puede ser una especie molecular que se derive de dicho metabolito. En tal caso, el metabolito actual se modificará químicamente en la muestra o durante el procedimiento de determinación y, como resultado de dicha modificación, la especie químicamente diferente, es decir, el analito, será la especie molecular determinada. Se tiene que entender que, en tal caso, el analito representa el metabolito actual y tiene el mismo potencial como indicador para la afección médica respectiva.

Además, un biomarcador de acuerdo con la presente invención no se corresponde necesariamente con una especie molecular. Más bien, el biomarcador puede comprender estereoisómeros o enantiómeros de un compuesto. Adicionalmente, un biomarcador también puede representar la suma de isómeros de una clase biológica de moléculas isoméricas. Dichos isómeros presentarán características analíticas idénticas en algunos casos y no son, por lo tanto, distinguibles mediante distintos procedimientos analíticos, incluyendo los que se aplican en los Ejemplos adjuntos descritos posteriormente. Sin embargo, los isómeros compartirán al menos parámetros de la fórmula con sumas idénticas y, por lo tanto, en el caso de, por ejemplo, los lípidos una longitud de cadena idéntica y un número idéntico de enlaces dobles en los ácidos grasos y/o los restos esfingo básicos.

Un metabolito como se utiliza en el presente documento se refiere al menos desde una molécula de un metabolito específico hasta una pluralidad de moléculas de dicho metabolito específico. Se tiene que entender adicionalmente que un grupo de metabolitos significa una pluralidad de moléculas químicamente diferentes en la que por cada metabolito puede estar presente desde al menos una molécula hasta una pluralidad de moléculas. Un metabolito de acuerdo con la presente invención engloba todas las clases de compuestos químicos orgánicos o inorgánicos incluyendo los que están compuestos por material biológico tales como organismos. Preferentemente, el metabolito de acuerdo con la presente invención es un compuesto de molécula pequeña. Más preferentemente, en el caso de que se considere una pluralidad de metabolitos, dicha pluralidad de metabolitos representa un metaboloma, es decir, la colección de metabolitos que están comprendidos por un organismo, un órgano, un tejido, un fluido corporal o una célula en un momento específico y en condiciones específicas.

En la Tabla l1a, se muestran paneles de biomarcador central que se aplican ventajosamente en el procedimiento de la presente invención (los denominados “paneles centrales”). En una realización preferida, se determina la lisofosfatidiletanolamina (C22:5) además de la lisofosfatidiletanolamina (C18:2), y la dirección de cambio de la lisofosfatidiletanolamina (C22:5) en el cáncer pancreático con respecto a la pancreatitis es hacia abajo. En una realización preferida adicional, los esfingolípidos, incluyendo las esfingomielinas y las ceramidas, comprende una base esfingo que comprende dos restos hidroxilo (es decir, comprenden una base d-esfingo), de las cuales ambas o, preferentemente una, pueden estar esterificadas, por ejemplo, preferentemente a un resto de ácido fosfórico o un grupo químico que comprende el mismo. En una realización preferida, la ceramida es una ceramida de la Tabla 1b y la esfingomielina es una esfingomielina de la Tabla 1b. En una realización preferida adicional, la base esfingo fosforilada es la esfingosina-1-fosfato (d16:1), una esfingosina-1-fosfato (d17:1), una esfingodienina-1-fosfato (d18:2), o una base esfingo fosforilada de la Tabla 1b, y la dirección de cambio en el cáncer pancreática con respecto a la pancreatitis es hacia abajo, respectivamente. Las esfingomielinas, ceramidas y/o bases esfingo fosforiladas que se van a utilizar en el presente documento se enumeran en la Tabla 1b.

Los grupos preferidos (paneles) de biomarcadores que comprenden los biomarcadores mencionados anteriormente de los paneles centrales se muestran en cada una de las Tablas 2 a 15. Estos grupos de biomarcadores se pueden determinar preferentemente como grupos de biomarcadores de acuerdo con la presente invención.

Además de los biomarcadores específicos mencionados en la memoria descriptivas, se pueden determinar, preferentemente, otros marcadores, así como en los procedimientos de la presente invención. Dichos biomarcadores pueden ser metabolitos biomarcadores y preferentemente los que se muestran en la 'Tabla 16 o pueden incluir biomarcadores peptídicos o polipeptídicos o glicósidos tales como el antígeno CA 19-9. Preferentemente, el antígeno CA 19-9 puede determinarse de acuerdo con la presente invención de manera numérica, es decir teniendo en cuenta sus cantidades absolutas, o de manera relativa, es decir, determinando si la cantidad que se encuentra en un paciente está por debajo o por encima de un cierto nivel de umbral, preferentemente, un umbral como se específica en los Ejemplos posteriores. El cómo se puede determinar numérica o relativamente el CA 19-9 se describe, preferentemente, en los Ejemplos adjuntos, posteriormente.

El término “muestra” como se utiliza en el presente documento se refiere a muestras de fluidos corporales, preferentemente, sangre, plasma, suero, saliva u orina, o muestras derivadas, por ejemplo, de biopsias, de células, tejidos u órganos, en particular del páncreas. Más preferentemente, la muestra es una muestra de sangre, plasma o suero, más preferentemente, una muestra de plasma. Las muestras biológicas se pueden derivar de un sujeto como se específica en cualquier parte del presente documento.

Las muestras mencionadas anteriormente se pretratan, preferentemente antes de utilizarse por el procedimiento de la presente invención. Como se describe con más detalle posteriormente, dicho pretratamiento puede incluir tratamientos necesarios para liberar o separar los compuestos o para eliminar el material excesivo o los residuos. Las técnicas adecuadas comprenden la centrifugación, extracción, fraccionamiento, ultrafiltración, precipitación proteica seguido por filtración y purificación y/o enriquecimiento de compuestos. Además, se llevan a cabo otros pretratamientos con el fin de proporcionar los compuestos en una forma o concentración adecuados para el análisis de compuestos. Por ejemplo, se si utiliza en el procedimiento de la presente invención la cromatografía de gases acoplada con espectrometría de masas, se necesitará derivar los compuestos antes de dicha cromatografía de gases. Los pretratamientos adecuados y necesarios dependen del medio que se utilice para llevar a cabo el procedimiento de la invención y son bien conocidos por el experto en la técnica. Las muestras pretratadas como se ha descrito anteriormente también están comprendidas en el término “muestra” como se utiliza de acuerdo con la presente invención.

La muestra también puede pretratarse, preferentemente, por fraccionamiento lipídico. El fraccionamiento lipídico como se utiliza en el presente contexto se refiere a un procedimiento como se describe, preferentemente, en los Ejemplos adjuntos posteriormente. En particular, el fraccionamiento lipídico se puede conseguir extrayendo los lípidos totales del suero, preferentemente, del plasma por extracción líquida/liquida, utilizando cloroformo/metanol. Los extractos lipídicos obtenidos de esta manera se fraccionan posteriormente por cromatografía líquida de fase normal (NPLC) en once grupos lipídicos diferentes de acuerdo con Christie (Journal of Lipid Research (26), 1985, 507-512). Las fracciones se analizaron por LC-MS/MS utilizando ionización por electropulverizador (ESI) e ionización química a presión atmosférica (APCI) con detección de control de reacción múltiple específica (MRM) de las transiciones de ésteres de Colesterol (CE), esteroles libres (FS), esfingomielinas (SM), y ceramidas (CER), respectivamente. Las esfingosinas y esfingosina-1-fosfato (SP) se analizaron mediante LC-MS/MS utilizando ionización con electropulverizador (ESI) con detección de control de reacción múltiple específica (MRM) de las transiciones como se describe en Schmidt H et al., Prostaglandins & other Lipid Mediators 81(2006), 162-170. Las fracciones se analizaron posteriormente por GC-MS después de la derivación con TMSH (hidróxido de trimetil sulfonio), dando lugar a los ésteres de ácidos grasos (FAME) correspondientes con los restos acilo de los lípidos separados por clases. Las concentraciones de FAME a partir de C14 a C24 se determinaron en cada fracción. Preferentemente, el fraccionamiento lipídico se utilizó para la determinación de ceramidas y esfingomielinas como biomarcadores de acuerdo con la presente invención.

El término “sujeto” como se utiliza en el presente documento se refiere, preferentemente, a mamíferos. Más preferentemente el sujeto es un primate y más preferentemente, un ser humano. El sujeto, preferentemente, es sospechoso de padecer un cáncer pancreático, es decir, puede haber mostrado ya alguno o todos los síntomas asociados con la enfermedad. Además, el sujeto puede padecer también preferentemente o será sospechoso de padecer pancreatitis y preferentemente, muestra un aumento del CA19-9 con respecto a los controles sanos. Preferentemente, el sujeto, sin embargo, aparte de las enfermedades y trastornos mencionados anteriormente está aparentemente sano. Dicho sujeto, preferentemente tiene un aumento del riesgo de desarrollar cáncer pancreático (Brand RE y col, Gut. 2007;56:1460-9). Más preferentemente, dicho sujeto que tiene un aumento del riesgo tiene uno o más parientes que padecen pancreatitis, y/o tiene una predisposición genética definida a desarrollar pancreatitis. En otra realización, el “sujeto” como se utiliza en el presente documento es un ser humano de tipo sanguíneo de Lewis negativo.

La expresión “determinación de la cantidad” como se utiliza en el presente documento se refiere a la determinación de al menos un rasgo característico de un biomarcador que se va a determinar por el procedimiento de la presente invención en la muestra. Los rasgos característicos de acuerdo con la presente invención son rasgos que caracterizan las propiedades físicas y/o químicas incluyendo las propiedades bioquímicas de un biomarcador.

Dichas propiedades incluyen, por ejemplo, el peso molecular, viscosidad, densidad, carga eléctrica, giro, actividad óptica, color, fluorescencia, quimioluminiscencia, composición elemental, estructura química, capacidad para reaccionar con otros compuestos, capacidad para desencadenar una respuesta en un sistema de lectura biológico (por ejemplo, la inducción de un indicador genético) y similares. Los v alores de dichas propiedades pueden servir como rasgos característicos y se pueden determinar por técnicas bien conocidas en la técnica. Además, el rasgo característico puede ser cualquier rasgo que se derive de los valores de las propiedades físicas y/o químicas de un biomarcador por operaciones convencionales, por ejemplo, cálculos matemáticos, tales como multiplicación, división o cálculo logarítmico. Más preferentemente, el al menos un rasgo característico permite la determinación y/o identificación química de dicho biomarcador y su cantidad. En consecuencia, el valor característico, preferentemente, también comprende la información relacionada con la abundancia del biomarcador del que se deriva el valor característico. Por ejemplo, un valor característico de un biomarcador puede ser un pico en un espectro de masas, Dicho pico contiene información característica del biomarcador, es decir, la información m/z, así como un valor de identidad que se relaciona con la abundancia de dicho biomarcador (es decir, su cantidad) en la muestra.

Como se ha expuesto anteriormente, cada biomarcador comprendido en una muestra puede determinarse, preferentemente, de acuerdo con la presente invención cuantitativa o semi-cuantitativamente. Para la determinación cuantitativa se determinará la cantidad absoluta o precisa, o se determinará la cantidad relativa del biomarcador basándose en el valor determinado por el raso característico al que se hace referencia anteriormente en el presente documento. La cantidad relativa se puede determinar en el caso en el que la cantidad precisa de un biomarcador pueda o no determinarse. En cuyo caso, se puede determinar si la cantidad en que está presente el biomarcador aumento o disminuyó con respecto a una segunda muestra que comprende dicho biomarcador en una segunda cantidad. En una realización preferida dicha segunda muestra que comprende dicho biomarcador será una referencia calculada como se especifica en otra parte del presente documento. El análisis cuantitativo de un biomarcador, por lo tanto, también incluye al que se haga referencia a veces como el análisis semi-cuantitativo de un biomarcador.

Además, la determinación como se utiliza en el procedimiento de la presente invención incluye, preferentemente, la utilización de una etapa de separación del compuesto antes de la etapa de análisis a la que se hace referencia anteriormente. Preferentemente, dicha etapa de separación del compuesto da lugar a una separación resuelta en el tiempo de los metabolitos que comprenden la muestra. Las técnicas adecuadas para la separación que se van a utilizar preferentemente de acuerdo con la presente invención, por lo tanto, incluyen todas las técnicas de separación cromatográfica tal como cromatografía líquida (LC), cromatografía líquida de altas prestaciones (HPLC), cromatografía de gases (GC), cromatografía de capa fina, cromatografía de exclusión por tamaño o de afinidad. Estas técnicas son bien conocidas en la técnica y se pueden aplicar por el experto sin mayor problema. Más preferentemente se consideran la LC y/o GC como las técnicas cromatográficas del procedimiento de la presente invención. Los dispositivos adecuados para dicha determinación de biomarcadores se conocen bien en la técnica. Preferentemente, se utiliza la espectrometría de masas, en particular la cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida espectrometría de masas (LC-MS), infusión directa espectrometría de masas o espectrometría de masas con resonancia de ion ciclotrónico transformada de Fourier (FT-ICR-MS), electroforesis capilar espectrometría de masa (CE-MS), cromatografía líquida de altas prestaciones acoplada a una espectrometría de masas (HPLC-MS), espectrometría de masas tetrapolar, y espectrometrías de masas acopladas secuencialmente, tal como MS-MS, o MS-MS-MS, plasma acoplado inductivamente espectrometría de masas (ICP-MS), pirólisis espectrometría de masas (Py-MS), espectrometría de masas con movilidad de iones o espectrometría de masas con tiempo de vuelo (TOF). Más preferentemente, se utilizan LC-MS y/o GC-MS como se describe con detalle posteriormente. Dichas técnicas se desvelan, por ejemplo, en Nissen 1995, Journal of Chromatography A, 703: 37-57, documento US 4.540.884 o documento US 5.397.894. Como alternativa o además de las técnicas de espectrometría de masas, se pueden utilizar las siguientes técnicas para la determinación de compuestos: resonancia magnética nuclear (NMR), creación de imágenes por resonancia magnética (MRI), análisis infrarrojos transformado de Fourier (FT-IR), espectroscopia de rayos ultravioletas (UV), índice de refracción (RI), detección fluorescente, detección radioquímica, detección electroquímica, dispersión de la luz (LS), espectroscopia dispersante de Raman o detección de ionización de llama (FID). Estas técnicas son bien conocidas por el experto en la técnica y puede aplicarlas sin mayor problema. El procedimiento de la presente invención será , preferentemente, asistido mediante automatización. Por ejemplo, el procesamiento de muestras o el pretratamiento puede automatizarse mediante robótica. La automatización como se describe en el presente documento anteriormente permite el uso del procedimiento de la presente invención en estrategias de alto rendimiento.

Además, el al menos un biomarcador se puede determinar también por un ensayo químico o biológico específico. Dicho ensayo comprenderá medios que permitan detectar específicamente el al menos un biomarcador en la muestra. Preferentemente, dichos medios son capaces de reconocer la estructura química del biomarcador o son capaces de identificar específicamente el biomarcador basándose en su capacidad para reaccionar con otros compuestos o su capacidad para desencadenar una respuesta en un sistema de lectura biológico (por ejemplo, la inducción de un indicador genético). Los medios que son capaces de reconocer específicamente la estructura química de un biomarcador son preferentemente los anticuerpos u otras proteínas que interactúan específicamente con estructuras químicas tales como receptores o enzimas, o aptámeros. Los anticuerpos específicos, por ejemplo, se pueden obtener utilizando el biomarcador como antígeno por procedimientos bien conocidos en la técnica. Como se hace referencia en el presente documento a anticuerpos incluyen los anticuerpos tanto policlonales como monoclonales, así como fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv, Fab, y F(ab)2 que son capaces de unirse con el antígeno o hapteno. La presente invención también incluye anticuerpos híbridos humanizados en los que las secuencias de aminoácidos de un anticuerpo donante no humano que presenta una especificidad de antígeno deseada se combinan con secuencias de un anticuerpo receptor humano. Además, se engloban los anticuerpos de cadena sencilla. Las secuencias donantes habitualmente incluirán al menos los restos de aminoácidos de unión al antígeno del donante, pero puede comprender también otros restos de aminoácidos estructural y/o funcionalmente relevantes del anticuerpo donante. Dichos híbridos se pueden preparar por varios procedimientos bien conocidos en la técnica. Las proteínas adecuadas que son capaces de reconocer específicamente el biomarcador son, preferentemente, enzimas que están implicadas en la conversión metabólica de dicho biomarcador. Dichas enzimas pueden utilizarse como una base para generar oligopéptidos que reconozcan específicamente el biomarcador. Estos oligopéptidos comprenderán, por ejemplo, los dominios o bolsillos de unión de la enzima para dicho biomarcador. Los ensayos basados en anticuerpos y/o enzimas adecuados puede sr el RIA (radioinmunoensayo), ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a encimas), ensayos inmunoenzimáticos en sándwich, inmunoensayos de electroquimioluminiscencia en sándwich (ECLIA), fluoroinmunoesnayo de lantánido potenciado por disociación (DELFIA) o inmunoensayos de fase sólida. Además, el biomarcador también se puede determinar basándose en su capacidad para reaccionar con otros compuestos, es decir, por reacción química específica. Adicionalmente, el biomarcador se puede determinar en una muestra debido a su capacidad para desencadenar una respuesta en un sistema de lectura biológico. La respuesta biológica se detectará como una lectura que indique la presencia y/o cantidad del biomarcador comprendido en la muestra. La respuesta biológica puede ser, por ejemplo, la inducción de expresión genética o una respuesta fenotípica de una célula o un organismo. En una realización preferida la determinación del al menos un biomarcador es un procedimiento cuantitativo, por ejemplo, que permita también la determinación de la cantidad de al menos un biomarcador en la muestra.

Como se ha descrito anteriormente, dicha determinación del al menos un biomarcador puede comprender, preferentemente, espectrometría de masas (MS). La espectrometría de masas como se utiliza en el presente documento engloba todas las técnicas que permitan la determinación del peso molecular, (es decir, la masa) o una variable de masas que se corresponde con un compuesto, es decir, un biomarcador, que se va a determinar de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, la espectrometría de masas como se utiliza en el presente documento se refiere a GC-MS, LC-MS, espectrometría de masas de infusión directa, FT-ICR-MS, CE-MS, HLPC-MS espectrometría de masas tetrapolar, cualquiera de las espectrometrías de masas acopladas secuencialmente tal como MS-MS o MS-MS-MS, I^c P-MS, Py-MS, TOF o cualquier estrategia combinada que utilice las técnicas mencionadas anteriormente. Es bien conocido por el experto en la técnica cómo aplicar estas técnicas. Además, existen dispositivos adecuados disponibles en el mercado. Más preferentemente, la espectrometría de masas como se utiliza en el presente documento se refiere a LC-MS y/o GC-MS, es decir, a espectrometría de masas que está unida operativamente a una etapa anterior de separación cromatográfica. Más preferentemente, la espectrometría de masas, como se utiliza en el presente documento engloba la MS tetrapolar. Más preferentemente, dicha MS tetrapolar se lleva a cabo de la siguiente manera: a) selección de un cociente de masa/carga (m/z) de un ion creado por ionización en un primer tetrapolo analítico del espectrofotómetro de masas, b) fragmentación del ion seleccionado en la etapa a) aplicando una corriente de aceleración en un tetrapolo adicional posterior que se llena con un gas de colisión y actúa como cámara de colisión, c) selección de un cociente de masa/carga de un ion creado por el procedimiento de fragmentación de la etapa b) en un tetrapolo adicional posterior, de manera que las etapas a) a c) del procedimiento se llevan a cabo al menos una vez y el análisis del cociente de masa/carga de todos los iones presentes en la mezcla de sustancias como resultado del procedimiento de ionización, por lo que el tetrapolo se llena con gas de colisión pero no se aplica la corriente de aceleración durante el análisis. Los detalles de dicha espectrometría de masas más preferido que se va a utilizar de acuerdo con la presente invención se pueden encontrar en el documento WO 03/073464.

Más preferentemente, dicha espectrometría de masas es cromatografía líquida (LC) MS y/o cromatografía de gases (GC) MS. La cromatografía líquida como se utiliza en el presente documento se refiere a todas las técnicas que permiten la separación de compuestos (es decir, metabolitos) en una fase líquida o supercrítica. La cromatografía se caracteriza porque los compuestos en una fase en una fase móvil pasan a través de una fase estacionaria. Cuando los compuestos pasan a través de la fase estacionaria a diferentes velocidades se separan en el tiempo ya que cada compuesto individual tiene su tiempo de retención específica (es decir, el tiempo que necesita el compuesto para pasar a través del sistema). La cromatografía líquida como se utiliza en el presente documento también incluye la HPLC. Los dispositivos para cromatografía líquida están disponibles en el mercado, por ejemplo, Agilent Technologies, EE. UU. La cromatografía de gases como se aplica de acuerdo con la presente invención, en principio opera de manera comparable a la cromatografía de líquidos. Sin embargo, más de tener los compuestos (es decir los metabolitos) en una fase líquida móvil que pasa a través de la fase estacionaria, los compuestos estarán presentes en un volumen gaseoso. Los compuestos pasan por la columna que puede contener materiales de soporte sólido como fase estacionaria o las paredes de las cuales pueden servir o están recubiertas con la fase estacionaria. De nuevo cada compuesto tiene un tiempo específico que es necesario para pasar a través de la columna. Además, en el caso de la cromatografía de gases se considera preferentemente que los compuestos se deriven antes de la cromatografía de gases. Las técnicas de derivación adecuadas son bien conocidas en la técnica. Preferentemente, la derivación de acuerdo con la presente invención se refiere a metoximación y trimetilsilación de, preferentemente, compuestos polares y la transmetilación, metoximación y trimetilsililación de, preferentemente, compuestos no polares (es decir, lipófilos).

El término “referencia” se refiere a valores de rasgos característicos de cada uno de los biomarcadores que pueden correlacionarse con una afección médica, es decir, la presencia o ausencia de enfermedad, estado de enfermedades o un efecto al que se hace referencia en el presente documento. Preferentemente, una referencia es un valor umbral (por ejemplo, una cantidad o relación de cantidades) para un biomarcador de manera que los valores que se encuentran en una muestra que se va a investigar que sean mayores o esencialmente idénticas al umbral son indicativos de la presencia de una afección médica mientras que los que son menores son indicativos de la ausencia de la afección médica. Se entenderá que también preferentemente, una referencia puede ser un valor de un umbral para un biomarcador de manera que los valores que se encuentran en una muestra que se va a investigar que sean menores o idénticos que el umbral son indicativos de la presencia de una afección médica mientras que los que son mayores son indicativos de la ausencia de la afección médica.

De acuerdo con el procedimiento de la presente invención mencionado anteriormente, una referencia es, preferentemente, una referencia obtenida de una muestra de un sujeto o grupo de sujetos que se sabe que padecen cáncer pancreático. En tal caso, un valor para el al menos un biomarcador que se encuentra en la muestra de ensayo que sea esencialmente idéntico es indicativo de la presencia de la enfermedad.

Además, la referencia, también preferentemente, podría ser de un sujeto o grupo de sujetos que se sabe que no padecen cáncer pancreático, preferentemente, un sujeto aparentemente sano o un grupo de estos o un sujeto que se sabe que padece pancreatitis o un grupo de estos. En tal caso, un valor para el al menos un biomarcador que se encuentra en la muestra de ensayo que esté alterado con respecto a la referencia es indicativo de la presencia de enfermedad. Los mismo se aplica mutatis mutandis para una referencia que sea, más preferentemente, el promedio o media del valor relativo o el valor de un grado de cambio de el al menos un biomarcador en una población de individuos (que comprende el sujeto que se va a investigar). Los valores relativos o grados de cambio del al menos un biomarcador de dichos individuos de la población se pueden determinar como se especifica en otra parte del presente documento. Se conoce bien en la técnica cómo calcular un valor de referencia adecuado, preferentemente, el promedio o media. La población de sujetos a la que se hace referencia anteriormente comprenderá una pluralidad de sujetos, preferentemente, al menos 5, 10, 50, 100, 1.000 o 10.000 sujetos. Se tiene que entender que el sujeto que se va a diagnosticar de la presente invención y los sujetos de dicha pluralidad de sujetos son de la misma especie.

El valor de un biomarcador de la muestra de ensayo y el valor de la referencia son esencialmente idénticos, si los valores para los rasgos característicos y, en el caso de determinación cuantitativa, los valores de intensidad son esencialmente idénticos. Esencialmente idéntico significa que la diferencia entre dos valores es, preferentemente, no significativa y se caracteriza porque los valores para la intensidad están entre al menos el intervalo entre un 1 y 99 percentil, 5 y 95 percentil, 10 y 90 percentil, 20 y 80 percentil, 30 y 70 percentil, 40 y 60 percentil del valor de referencia, preferentemente, el 50, 60, 70, 80, 90 o 95 percentil del valor de referencia. El ensayo estadístico para determinar si dos cantidades son esencialmente idénticas se conoce bien en la técnica y también se describen en cualquier lugar del presente documento.

Una diferencia que se observa para dos valores, por otro parte, será estadísticamente significativo. Una diferencia en el valor relativo o absoluto, preferentemente, es significativo fuera del intervalo entre el 45 y 55 percentil, 40 y 60 percentil, 30 y 70 percentil, 20 y 80 percentil, 10 y 90 percentil, 5 y 95 percentil, 1 y 99 percentil del valor de referencia. Los cambios relativos preferidos de las medianas o grados de cambio se describen en las Tablas adjuntas, así como en los Ejemplos. En las Tablas posteriores, se indica un cambio relativo preferido de los biomarcadores como “arriba” para un aumento y “abajo” para una disminución. El grado de cambio se expresa como un valor del área bajo la curva (AUC) en las tablas posteriores. Se indican las referencias preferidas de los cambios relativos o grados de cambio mencionados anteriormente en las Tablas posteriores también. Se entenderá que estos cambios se observan, preferentemente en comparación con las referencias indicadas en las Tablas respectivas, posteriormente.

Más preferentemente, una “referencia” para un biomarcador se obtendrá determinando los valores de al menos un rasgo característicos de dicho biomarcador del grupo de biomarcadores en un grupo de sujetos de referencia, es decir, un grupo de sujetos que se sabe que padecen la enfermedad o afección, un grupo de sujetos que se sabe que no padecen dicha enfermedad o afección, una población que comprende el sujeto que se va a investigar un grupo de muestras de biopsias de tejidos de tejido afectado por la enfermedad o tejido aparentemente sano y calcular la referencia por medidas estadísticas apropiadas incluyendo las que se hace referencia en cualquier parte del presente documento, tal como la mediana, el promedio, cuantiles, PLS-DA, procedimientos de regresión logística, ANOVA, clasificación de forest aleatoria u otras que dan un valor de umbral. El valor de umbral debería tener en consideración los ajustes clínicos deseados de sensibilidad y especificidad del ensayo de diagnóstico o pronóstico. Las cantidades del umbral que se van a utilizar como referencias pueden determinarse, preferentemente, aplicando la eficacia diagnóstica (ROC) (véase especialmente Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577). El gráfico ROC es un gráfico de todos los pares de sensibilidad/especificidad que resultan de la variación continua del umbral de decisión sobre el intervalo completo de datos observados. La actuación clínica de un procedimiento de diagnóstico depende de su precisión, es decir, de su capacidad para colocar correctamente sujetos respecto a un cierto pronóstico o diagnóstico. El gráfico ROC indica el solapamiento entre dos distribuciones representando la sensibilidad frente a 1-especificidad para el intervalo completo de umbrales adecuados para hacer una distinción. Sobre el eje y está la sensibilidad, o la fracción de positivos verdaderos, que se define como la relación del número de los resultados del ensayo positivos verdaderos respecto al producto del número de positivos verdaderos y el número de falsos negativos en los resultados del ensayo. También se hace referencia a esto como la positividad en presencia de una enfermedad o afección. Se calcula solamente a partir del subgrupo afectado. Sobre el eje x está la fracción de falsos positivos, o 1-especificidad que se define como la relación del número de resultados falsos positivos respecto al producto del número de resultados negativos verdaderos y el número de falsos positivos. Es un índice de la especificidad y se calcula completamente del subgrupo no afectado. Debido a que las fracciones de positivos verdaderos y falsos se calculan completamente por separado, utilizando los resultados del ensayo de dos subgrupos diferentes, utilizando los resultados de ensayo de dos subgrupos diferentes, el gráfico ROC es independiente de la prevalencia del evento en la cohorte. Cada punto del gráfico ROC representa un par sensibilidad/especificidad que se corresponde con un umbral de decisión particular. Un ensayo con discriminación perfecta (sin solapamiento en las dos distribuciones de resultados) tiene un gráfico ROC que pasa a través del ángulo izquierdo superior, en el que la fracción de positivos verdaderos es 1.0, o el 100 % (sensibilidad perfecta), y la fracción de falsos positivos es 0 (especificidad perfecta). El gráfico teórico de un ensayo sin discriminación (distribuciones idénticas de los resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45 ° desde el ángulo izquierdo inferior al ángulo derecho superior. La mayoría de los gráficos se encuentran entre estos dos extremos. Si el gráfico ROC fallece completamente por debajo de la diagonal de 45 °, se remedia fácilmente invirtiendo el criterio de “positividad” por “mayor que” o “menor que”. Cuantitativamente, cuanto más cerca está el gráfico del ángulo superior izquierdo, mayor es la precisión total del ensayo. Dependiendo de un intervalo de confianza deseado, se puede derivar un umbral de la curva ROC que permite el diagnóstico o predicción para un evento determinado con un equilibrio apropiado de sensibilidad y especificidad, respectivamente. En consecuencia, la referencia que se va a utilizar en el procedimiento mencionado anteriormente de la presente invención, es decir, se puede generar un umbral que permite discriminar entre sujetos que tienen un aumento del riesgo de mortalidad o los que tienen un riesgo normal entre una cohorte de sujetos que padecen inflamación aguda, preferentemente, estableciendo una ROC para dicha cohorte como se ha descrito anteriormente y derivar una cantidad de umbral de la misma. Dependiendo de una sensibilidad y especificidad deseadas para un procedimiento de diagnóstico, el gráfico ROC permite derivar umbrales adecuados.

Preferentemente, la referencia, es decir, los valores de al menos un rasgo característico del biomarcador o las realizaciones del mismo se almacenarán en un medio de almacenamiento de datos adecuado tal como una base de datos y están, por lo tanto, disponibles para las evaluaciones futuras.

El término “comparación” se refiere a la determinación de si el valor determinado de un biomarcador es esencialmente idéntico a una referencia o se diferencia de la misma. Preferentemente, se considera que un biomarcador se diferencia de una referencia si la diferencia observada es estadística significativa que se puede determinar por técnicas estadísticas a las que se hace referencia en otra parte de esta descripción. Si la diferencia no es estadísticamente significativa, el valor del biomarcador y la referencia son esencialmente idénticos. Basándose en la comparación al que se hace referencia anteriormente, se puede evaluar un sujeto en cuanto a su padece la enfermedad, o no.

La comparación está, preferentemente, asistida por automatización. Por ejemplo, se puede utilizar un programa de computadora adecuado comprende algoritmos para la comparación de dos conjuntos de datos diferentes (por ejemplo, conjuntos de datos que comprenden los valores de los rasgos característicos). Dichos programas y algoritmos de computadora se conocen bien en la técnica. Independientemente de lo anterior, una comparación se puede llevar a cabo manualmente.

En una realización preferida, las cantidades de un grupo de biomarcadores a los que se hace referencia en el presente documento de los procedimientos de la presente invención se compararán con una referencia o referencias; por lo tanto, la presencia o ausencia de una enfermedad a la que se hace referencia en el presente documento se diagnostica por comparación individual de cada biomarcador con una referencia correspondiente. En otra realización preferida, también se tiene previsto calcular una puntuación (en particular una única puntuación) basándose en las cantidades de varios, preferentemente todos los biomarcadores determinados en el procedimiento de la presente invención, y comparar esta puntuación con respecto a una puntuación de referencia calculada de las referencias correspondientes, y en el que, preferentemente, la puntuación calculada combina la información de las cantidades de biomarcadores. Preferentemente, la puntuación se puede considera como un parámetro clasificador para el diagnóstico del cáncer pancreático. La puntuación de referencia preferentemente es un valor, en particular un valor de corte que permite la diferenciación entre la presencia de la enfermedad y la ausencia de enfermedad en el sujeto que se va a ensayar. Preferentemente, la referencia es un valor único, de manera que, preferentemente, la persona que interpreta los datos no tenga que interpretar la información de las cantidades de biomarcadores para cada biomarcador individualmente.

Un agente de detección adecuado puede ser, preferentemente, un anticuerpo que se une específicamente al biomarcador en una muestra de un sujeto que se va a investigar por el procedimiento de la invención. Otro agente de detección que se puede aplicar, preferentemente, puede ser un aptámero que se une específicamente al biomarcador en la muestra. En una realización preferida más, la muestra se retira del complejo formado entre el agente de detección y el al menos un biomarcador antes de la medición de la cantidad de complejo formado. En consecuencia, en una realización preferida, el agente de detección puede inmovilizarse en un soporte sólido. En una realización preferida, la muestra se puede retirar del complejo formado en un soporte sólido aplicando una solución de lavado. El complejo formado será proporcional a la cantidad de al menos un biomarcador presente en la muestra.

Se entenderá que la especificidad y/o sensibilidad del agente de detección que se va a aplicar define el grado de proporción de al menos un biomarcador comprendido en la muestra que es capaz de unirse específicamente. Los detalles de cómo se puede llevar a cabo la determinación también se encuentra en otra parte del presente documento. La cantidad de complejo formado se transformará en una cantidad de al menos un biomarcador que refleja la cantidad cierta presente en la muestra. Dicha cantidad, preferentemente, puede ser esencialmente la cantidad presente en la muestra o puede ser, preferentemente, una cantidad que es una cierta proporción de la misma debido a la relación entre el complejo formado y la cantidad presente en la muestra original.

En una realización preferida más del procedimiento que se ha mencionado anteriormente, la etapa d) puede llevarse a cabo por una unidad analizadora, en un aspecto una unidad analizadora se define en otra parte del presente documento.

En una realización preferida del procedimiento de la invención, la cantidad determinada en la etapa d) se compara con una referencia. Preferentemente, la referencia es una referencia como se ha definido en otra parte del presente documento. En otra realización preferida más, la referencia toma en cuenta la relación proporcional entre la cantidad de complejo medida y la cantidad presente en la muestra original. Por lo tanto, las referencias aplicadas en una realización del procedimiento de la invención son referencias artificiales que se adoptan para reflejar las limitaciones del agente de detección que se ha utilizado. En otra realización preferida dicha relación también se puede tener en cuenta cuando se lleva a cabo la comparación, por ejemplo, incluyendo una etapa de normalización y/o corrección del cálculo para la cantidad determinada antes de comparar el valor de la cantidad determinada y la referencia. De nuevo, la etapa de normalización y/o corrección del cálculo para la cantidad determinada adopta la etapa de comparación de manera que las limitaciones del agente de detección que se ha utilizado se reflejen apropiadamente. Preferentemente, la comparación se lleva a cabo automáticamente, por ejemplo, asistido por un sistema de computadora o similares.

La ayuda al diagnóstico se establece basándose en la comparación que se lleva a cabo en la etapa b) colocando el sujeto (i) en un grupo de sujetos que padece cáncer pancrático con cierta probabilidad o un grupo que no los padece, o (ii) un grupo de sujetos que padece un cáncer pancreático o un grupo que padece pancreatitis. Como ya se ha expuesto en otra parte del presente documento la colocación del sujeto investigado debe no ser correcto en el 100 % de los casos investigados. Además, los grupos de sujeto en los cuales se coloca el sujeto investigado son grupos artificiales que se establecen basándose en consideraciones estadísticas, es decir, un cierto grado de probabilidad o grado preseleccionados sobre los que el procedimiento de la invención operará. Por lo tanto, el procedimiento puede establecer una ayuda de diagnóstico que puede, en un aspecto, necesitar un fortalecimiento adicional del diagnóstico por otras técnicas. Preferentemente, la ayuda al diagnóstico se establece automáticamente, por ejemplo, asistida por un sistema de computadora o similares.

En una realización preferida del procedimiento de la invención, la determinación de al menos un biomarcador se consigue por técnicas de espectrometría de masas (preferentemente GC MS y/o LC MS), NMR u otras a las que se hizo referencia anteriormente. En dichos casos, preferentemente, la muestra que se va a analizar se pretrata. Dicho pretratamiento, preferentemente, incluye la obtención de el al menos un biomarcador del material de muestra, por ejemplo, el plasma o suero puede obtenerse de la sangre completa o el al menos un biomarcador puede incluso extraerse específicamente del material de muestra. Además, para la GC MS se necesita, preferentemente, el pretratamiento adicional de la muestra, tal como la derivación, del al menos un biomarcador. Además, el pretratamiento, preferentemente, también incluye la dilución del material de la muestra y ajustando o normalizando la concentración de los componentes comprendidos en ella. En este extremo, preferentemente, se pueden añadir referencias de normalización a la muestra en cantidades predefinidas que permitan hacer una comparación de la cantidad de al menos un biomarcador y la referencia y/o entre diferentes muestras que se van a analizar.

El procedimiento de la presente invención, en una realización preferida, además comprende adicionalmente una etapa de recomendación y/o manejo del sujeto de acuerdo con el resultado de la ayuda al diagnóstico establecido en la etapa c). Dicha recomendación puede, en un aspecto, ser una adaptación del estilo de vida, nutrición y similares que ayuden a mejorar las circunstancias de la vida, la aplicación de medidas terapéuticas como se expone en otra parte del presente documento en detalle, y/o un control regular de la enfermedad.

En otra realización preferida del procedimiento mencionado anteriormente, las etapas e) y/o f) se llevan a cabo por una unidad de evaluación como se expone en cualquier parte del presente documento.

Ventajosamente, se ha descubierto en el estudio en el que se basa la presente invención que las cantidades de biomarcadores específicos del grupo de biomarcadores a los que se hace referencia en el presente documento anteriormente son indicadores del cáncer pancrático y, en particular, permite la diferenciación entre cáncer pancreático y pancreatitis. Esto es particularmente útil para el diagnóstico eficaz de la enfermedad, así como un control eficaz de los pacientes. Además, los hallazgos en que se basa la presente invención también facilitarán el desarrollo de terapias basadas en fármacos eficaces u otras intervenciones contra el cáncer pancreático como se expone con más detalle posteriormente.

Las definiciones y explicaciones de los términos que se hicieron anteriormente se aplican mutatis mutandis en las siguientes realizaciones de la presente invención excepto que se especifique otra cosa posteriormente en el presente documento.

En una realización preferida del procedimiento de la invención, dicho sujeto es sospechoso de padecer un cáncer de páncreas o una pancreatitis crónica.

En otra realización preferida del procedimiento de la presente invención, dichas referencias se derivan de una muestra de un sujeto o un grupo de sujetos que se sabe que padecen un cáncer pancreático.

En otra realización más del procedimiento de la presente invención, dichas referencias se derivan de una muestra de un sujeto o un grupo de sujetos que se sabe que no padecen cáncer pancreático.

En una realización adicional del procedimiento de la presente invención, dicho grupo de biomarcadores comprende al menos un biomarcador adicional seleccionado de entre la Tabla 16.

En otra realización preferida del procedimiento de la presente invención, dicho grupo de biomarcadores está en el grupo que se muestra en una cualquiera de las Tablas 2 a 15.

Además, en una realización preferida del procedimiento de la invención, dicho grupo de biomarcadores comprende CA19-9.

En una realización preferida del procedimiento de la presente invención, dicho diagnóstico comprende la diferenciación entre cáncer pancreático y pancreatitis.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la identificación de si un sujeto tiene la necesidad de una terapia del cáncer de páncreas que comprende las etapas del procedimiento mencionado anteriormente de la invención y la etapa adicional de identificar un sujeto que necesita terapia para el cáncer de páncreas si dicho sujeto se diagnostica de padecer un cáncer de páncreas.

La frase “necesita una terapia para el cáncer pancreático” como se utiliza en el presente documento significa que la enfermedad en el sujeto está en un estado en el que sea necesaria o beneficiosa la intervención terapéutica con el fin de mejorar o tratar el cáncer pancreático o los síntomas asociados con el mismo. En consecuencia, los hallazgos de los estudios en los que se basa la presente invención no solo permiten el diagnóstico del cáncer pancreático en un sujeto, sino que también permite la identificación de sujetos que se deberían tratar con una terapia del cáncer pancreático o cuya terapia del cáncer pancreático necesita un ajuste. Una vez que el sujeto se ha identificad, el procedimiento puede incluir una etapa de hacer recomendaciones para una terapia del cáncer pancreático.

Además, en una realización preferida del procedimiento de la invención mencionado anteriormente, dicho procedimiento comprende adicionalmente la etapa de recomendación de medidas terapéuticas o de manejo del paciente sano para el sujeto basándose en si el sujeto se diagnostica de que padece cáncer pancrático o pancreatitis.

El término “recomendación” como se utiliza en el presente documento ser refiere a hacer sugerencia de las medidas terapéuticas y/o medidas de manejo del paciente sano que sean aplicables específicamente al paciente. La recomendación, preferentemente, no engloba la aplicación actual de la terapia recomendada o las medidas de manejo de pacientes sanos.

La expresión “medidas terapéuticas o de manejo del paciente sano” como se utiliza en el presente documento se refiere a medidas terapéuticas que ayudan a curar o mejorar el cáncer pancreático o pancreatitis o ayuda a prevenir la progresión de dichas enfermedades, así como las medidas de manejo del paciente sano tal como el control incluyendo la selección de medidas de control y frecuencia de control y hospitalización. Preferentemente, dicha medidas terapéuticas o de manejo del paciente sano se selecciona de entre el grupo que consiste en: cirugía, administración de fármacos anticáncer, control del paciente, vigilancia activa y hospitalización. Las terapias de cáncer adecuadas incluyen cirugía, radiación de alta y baja dosis, y quimioterapia sistémica, por ejemplo, fármacos citostáticos, solos o en combinación con otros fármacos. Las terapias basadas en cirugía preferidas incluyen la resección del páncreas o partes del mismo, tal como la pancreaticoduodenectomía, pancreatectomía de la cola, pancreatectomía total o parcial, procedimientos de puenteo paliativos. Las terapias basadas en fármacos, preferentemente, incluyen la administración de uno o más fármacos con propiedades antitumorales que incluyen no exclusivamente los derivados del platino, por ejemplo, oxaliplatino, fluoropirimidinas, análogos de pirimidina, Gemcitabina, antimetabolitos, agentes alquilantes, antraciclinas, alcaloides de plantas, inhibidores de topoisomerasa, anticuerpo dirigidos e inhibidores de la tirosina cinasa. Los fármacos particularmente preferidos incluyen, pero no se limitan a gemcitabina sola o en combinación con erlotinib y/o oxaliplatino. Se entenderá que el procedimiento también se pueda aplicar para determinar si un sujeto se beneficiará o necesita una terapia contra las enfermedades mencionadas anteriormente. Dicho procedimiento se puede aplicar en estrategias terapéuticas como “vigilancia activa”. En esta estrategia, un sujeto que padece, por ejemplo, una pancreatitis menos avanzada se somete a un procedimiento para el diagnóstico de cáncer pancreático como se expone anteriormente en una base regular corta con el fin de detectar la aparición temprana de la progresión. Solamente después de que la progresión se volviera detectable, se tratará el sujeto mediante una terapia adecuada, tal como cirugía o radiación. Por lo tanto, la “vigilancia activa” evita los efectos secundarios perjudiciales de una terapia en sujetos que no tienen necesidad inmediata de una terapia. Evitando la terapia en este estadio se entenderá que se pueden evitar también los efectos secundarios perjudiciales de la terapia. En una realización más preferida del procedimiento de la presente invención, dicho procedimiento también comprende la etapa de aplicar que dichas medidas terapéuticas o de manejo del paciente sano como se identifica por el procedimiento mencionado anteriormente al sujeto.

La presente invención contempla un dispositivo para el diagnóstico del cáncer de páncreas en una muestra de un sujeto que comprende:

(a) una unidad de análisis para dicha muestra del sujeto que comprende un detector de las cantidades de un grupo de dichos biomarcadores comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a, permitiendo dicho detector la determinación de cantidades de biomarcadores de dicho grupo de biomarcadores en la muestra; y unida operativamente a esta,

(b) una unidad de evaluación que comprende una unidad de procesamiento de datos, comprendiendo dicha base de datos una referencia almacenada y teniendo dicha unidad de procesamiento de datos incluido tangiblemente un algoritmo para llevar a cabo una comparación de las cantidades de los biomarcadores del grupo de biomarcadores determinadas por la unidad de análisis y la referencia almacenada y para la generación de una información de salida basándose en la cual se puede establecer el diagnóstico.

Un dispositivo como se utiliza en el presente documento comprendería al menos las unidades mencionadas anteriormente. Las unidades del dispositivo están unidas entre ellas operativamente. El cómo unir los medios de manera operativa dependerá del tipo de unidades incluidas en el dispositivo. Por ejemplo, cuando el detector permite la determinación cualitativa o cuantitativa automática del biomarcador, los datos obtenidos por dicha unidad de análisis operativa automáticamente se pueden procesar, por ejemplo, mediante un programa de computadora con el fin de facilitar la evaluación en la unidad de evaluación. Preferentemente, las unidades están comprendidas por un único dispositivo en dicho caso. Dicho dispositivo puede incluir en consecuencia una unidad de análisis para el biomarcador y un dispositivo computarizado o de procesamiento de datos como unidad de evaluación para el procesamiento de los datos resultantes para la evaluación y para el estableciendo de la información de salida. Los dispositivos preferidos son en los que se puede aplicar sin el conocimiento particular de un clínico especializado, por ejemplo, dispositivos electrónicos que simplemente necesiten la carga de la muestra. La información del dispositivo, preferentemente, es un valor numérico que permite extraer conclusiones de la presencia o ausencia de un cáncer pancreático, y, por lo tanto, es una ayuda para el diagnóstico. Más preferentemente, la información de salida es un diagnóstico preliminar o una ayuda para el diagnóstico basándose en el valor numérico mencionado anteriormente, es decir, un clasificador que indica si el sujeto padece un cáncer pancrático o no. Dicho diagnóstico preliminar puede necesitar la evaluación de información adicional que se pueden proporcionarse en el dispositivo de la invención incluyendo un sistema de base de datos de conocimiento experto.

Una referencia preferida que se va a utilizar como referencia almacenada de acuerdo con el dispositivo de la presente invención es una cantidad de al menos un biomarcador que se va a analizar o valores derivados del mismo que se derivan de un sujeto o grupo de sujetos conocidos por padecer un cáncer pancreático al que se hace referencia en otra parte del presente documento. En tal caso, el algoritmo incluido tangiblemente, preferentemente, compara la cantidad determinada para al menos un biomarcador con la referencia en el que una cantidad o valor idénticos o esencialmente idénticos serán indicativos de la presencia de un cáncer pancreático en el sujeto.

De manera alternativa, otra referencia preferida que se va a utilizar como referencia almacenada de acuerdo con el dispositivo de la presente invención es una cantidad para el al menos un biomarcador que se va a analizar o valores derivados del mismo que se derivan de un sujeto o grupo de sujetos que se sabe que no padecen cáncer pancreático como se hace referencia en otra parte del presente documento. En tal caso, el algoritmo incluido tangiblemente, preferentemente, compara la cantidad determinada para el al menos un biomarcador con la referencia en la que una cantidad o valor que se diferencia de la referencia será indicativo de la presencia de un cancere pancrático en el sujeto. Las diferentes preferidas son las que se indican como cambios relativos o grados de cambio de los biomarcadores individuales de las Tablas posteriores.

Las unidades del dispositivo, también preferentemente, pueden implementarse en un sistema que comprenden varios dispositivos que están unidos entre ellos operativamente. Dependiendo de las unidades que se van a utilizar para el sistema de la presente invención, dichos medios pueden unirse funcionalmente conectando cada medio con el otro por medios que permitan el transporte de datos entre dichos medios, por ejemplo, cables de fibra de vidrio, y otros cables para el transporte de datos de alto rendimiento. No obstante, también se contempla la transferencia de datos inalámbrica entre los medios en la presente invención, por ejemplo, mediante LAN (LAN inalámbrica, W-LAN). Un sistema preferido comprende medios para la determinación de biomarcadores. Medios para la determinación de biomarcadores como se utilizan en el presente documento engloba medios para separar los biomarcadores, tal como dispositivos cromatográficos, y medios para la determinación de metabolitos, tal como dispositivos de espectrometría de masas. Los dispositivos adecuados se han descrito con detalle anteriormente. Los medios preferidos para la separación de compuestos que se va a utilizar en el sistema de la presente invención incluyen los dispositivos cromatográficos, más preferentemente dispositivos de cromatografía líquida, HPLC, y/o cromatografía de gases. Los dispositivos preferidos para la determinación de compuesto comprenden dispositivos de espectrometría de masas, más preferentemente, GC-MS, LC-MS, espectrometría de masas de infusión directa, FT-ICR-MS, CE-MS, HPLC-MS, espectrometría de masas tetrapolar, espectrometrías de masas acopladas secuencialmente (incluyendo MS-MS o MS-MS-MS), ICP-MS, Py-MS o TOF. Los medios de separación y determinación se acoplan, preferentemente, entre ellos. Más preferentemente, se utilizando LC-MS y/o GC-MS en el sistema de la presente invención como se describe con detalle en otra parte de la memoria descriptiva. Estarán comprendidos adicionalmente medios para comparar y/o analizar los resultados obtenidos de los medios para la determinación de biomarcadores.

Ejemplos

La invención se ilustrará ahora por los siguientes Ejemplos que no tienen la intención de restringir o limitar el ámbito de la presente invención.

Ejemplo 1: Preparación de pacientes, plasma y suero

Se inscribieron un total de 474 pacientes con cáncer pancreático, pancreatitis crónica, cirrosis hepática y donantes de sangre sanos en el estudio clínico. En este estudio de control de casos retrospectivos se incluyeron las muestras de 138 pacientes que padecían un adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), 159 muestras de pacientes de pancreatitis crónica (CP), muestras de 80 pacientes que padecían cirrosis hepática (LC) y 77 muestras de voluntarios sanos (donantes de sangre, ^b D). Todos los pacientes o sus representantes legales dieron su consentimiento informado por escrito y las oficinas de revisión ética local aprobaron el protocolo. Los pacientes se reclutaron consecutivamente de dos centros. Después de la extracción de sangre y la centrifugación, las muestras de plasma o suero se recolectaron en tubos de Eppendorf y se almacenaron a -80 °C para análisis posteriores. El procesamiento de muestras se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento de operación institucional convencional. Los criterios de exclusión eran una enfermedad maligna concomitante, un tratamiento curativo de una enfermedad maligna menos de 2 años antes del reclutamiento del ensayo, enfermedades quísticas concomitantes del páncreas, gestación o pacientes incapaces de dar el consentimiento informado.

Ejemplo 2: Perfil de metabolitos

MxP® Amplios y MxP® esteroides

Se aplicaron tres tipos de análisis de espectrometría de masas a todas las muestras. Se utilizaron una GC-MS (cromatografía de gas- espectrometría de masas; Agilent 6890 GC acoplada a un MSSystem Agilent 5973, Agilent, Waldbronn Alemania) y ^lC-MS/MS [cromatografía líquida-MS-MS, Agilent 1100 HPLC -System (Agilent, Waldbronn, Alemania) acoplada a un Sistema MS/MS API4000 Applied Biosystems (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania)] para el perfil amplio [van Ravenzwaay, B. y col. The use of metabolomics for the discovery of new biomarkers of effect. Toxicol Lett 172, 21-8 (2007]. Se utilizó la extracción de fase sólida LC-MS/MS [SPE-LC-MS/MS; Symbiosis Pharma (Spark, Emmen, Holanda) acoplada a un Sistema Applied Biosystems API4000 MS/MS- (Applied Biosystems, Darmstadt, Alemania)] para la determinación de niveles de esteroides. Fraccionamiento y derivación de las muestras y las tecnologías de detección se habían descrito anteriormente [van Ravenzwaay, B. y col. The use of metabolomics for the discovery of new biomarkers of effect. Toxicol Lett 172, 21-8 (2007, Roessner, U., Wagner, C., Kopka, J., Trethewey, R.N. & Willmitzer, L. Technical advance: simultaneous analysis of Metabolitos in potato tuber by gas chromatography-mass spectromeTri. Plant J23, 131-42 (2000), Mutch, D.M. y col. Metabolito profiling identifies candidate markers reflecting the clinical adaptations associated with Roux-en-Y gastric bypass surgery. PLoS One 4, e7905 (2009)]. Se retiraron las proteínas de las muestras de plasma por precipitación. Posteriormente las fracciones polares y no polares se separaron por análisis GC-MS y LC-MS/MS añadiendo agua y una mezcla de etanol y diclorometano. Para los análisis GC-MS, se trató la fracción no polar con metanol en condiciones de acidez para dar lugar a metil ésteres de ácidos grasos derivados de ácidos grasos libres y lípidos complejos hidrolizados. Las fracciones polares y no polares se derivaron adicionalmente con hidrocloruro de O-metil-hidroxilamina (20 mg/ml en piridina, 50 II) para convertir los grupos oxo en O-metiloximas y posteriormente con una agente sililante (MSTFA, 50 Il) antes del análisis GC-MS. Para los análisis de LC-MS-MS, ambas fracciones se reconstituyeron en mezclas de disolventes apropiadas. La LC de altas prestaciones (HPLC) se llevó a cabo por elución en gradiente utilizando metanol/agua/ácido fórmico en columnas de separación de fase inversa. La tecnología de detección espectrométrica de masas se aplicó como se describe en la Patente de EE. UU. 7196323, que permite el perfil de “Control de Reacción Múltiple” dirigida y de alta sensibilidad en paralelo con un análisis de exploración completo. Los esteroides y sus metabolitos relacionados se midieron por SPE-LC-MS/MS.

Lípidos MxP®

Se extrajeron los lípidos totales del plasma o el suero por extracción líquido/líquido utilizando cloroformo/metanol. Los extractos lipídicos se fraccionaron posteriormente por cromatografía en fase líquida normal (NPLC) en once grupos de lípidos diferentes de acuerdo con [Christie, W.W. Rapid separation and quantification of lipid classes by high performance liquid chromatography and mass (light-scattering) detection. J Lipid Res 26, 507-12 (1985)]. Las fracciones se analizaron por LC-MS/MS utilizando ionización por electropulverizador (ESI) e ionización química a presión atmosférica (AP-CI) con detección de control de reacción múltiple específica (MRM) de transiciones para ésteres de Colesterol (CE), esteroles libres (FS), esfingomielinas (SM), y ceramidas (CER), respectivamente. Se analizaron las esfingosinas y esfingosina-1-fosfatos (SP) por LC-MS/MS utilizando ionización con electropulverizador (ESI) con detección de control de reacción múltiple específica (MRM) de transiciones como se describe por [Schmidt, H., Schmidt, R. & Geisslinger, G. LC-MS/MS-analysis of Esfingosina-1-fosfato and related compounds in plasma samples. Prostaglandins Other Lipid Mediat 81, 162-70 (2006)]. Las clases lipídicas Monoaciliglicéridos (MAG), triacilglicéridos (TAG), Fosfatidilcolinas (PC), fosfatidilserinas (PS), fosfatidilinositoles (PI), lisofosfatidilcolinas (LPC), diacilgliceroles (DAG), ácidos grasos libres (FFA) se midieron por GC-MS. Las fracciones se analizaron por GC-MS después de la derivación con TMSH (hidróxido de trimetil sulfonio), dando lugar a metil ésteres de ácidos grasos (FAME) de C14 a C24 se determinan en cada fracción. En las tablas posteriores, cualquiera de las abreviaturas anteriores se utiliza como prefijo para un metabolito para indicar que el metabolito respectivo se ha derivado del lípido o fracción lipídica respectivos.

Ejemplo 3: Análisis del conjunto de datos y normalización

Antes del análisis estadístico, se llevó a cabo la transformación a log10 de las relaciones para asegurar la distribución normal de los datos. Se utilizó el software R 2.8.1 (paquete nlme) para el análisis de datos y las visualizaciones. El análisis estadístico se hizo con un modelo lineal simple (ANOVA) con “enfermedad”, “edad”, “género”, “BMI”, y “tiempo de almacenamiento de muestras”, y “tipo de muestra” (plasma o suero), si fuera apropiado, como efectos fijos. Se hizo el análisis de clasificación con Forest aleatorio (Liaw y Wiener (2002). Classification and Regression by random Forest. R News 2(3), 18-22.) y Elastic Net (Zou y Hastie (2005) Regularization and variable selection via the elastic net, Journal of the Royal Statistical Society, Series B) con los datos transformados a log10 que incluían CA19-9 o excluían CA19-9, como se indica en los paneles. La selección de características se hizo mediante una estrategia de búsqueda directa en el que el metabolito se correlacionaba mejor con los residuos del último modelo se añade al próximo modelo. La característica implícita de selección de Elastic Net no se aplicó. Los inventores utilizaron una validación cruzada de 10 veces con la característica de selección embebida en la construcción repetidamente de un modelo de nueve de 10 veces de entrenamiento para entonces estimar la AUC de manera sin tendencias en las veces de ensayo.

A continuación, el conjunto de metabolitos final se determinó recapacitando el clasificador de los datos completos. Los inventores analizaron tres conjuntos de datos diferentes: (1) datos de las muestras de plasma, (2) datos de las muestras de suero, y (3) datos muestras de plasma y de suero juntas. En el caso (3), el tipo de muestra se utilizó como un efecto fijo en el análisis ANOVA como se ha descrito.

Para analizar la actuación de los paneles seleccionados de los inventores, se construyó un clasificador con un forest aleatorio o análisis elastic net con estos conjuntos de metabolitos y la actuación de calificación cruzada validada se estimaba con el área bajo la curva (AUC) de un análisis de eficacia diagnóstica (ROC). La realización de los cálculos se llevó a cabo con o sin una corrección anterior con ANOVA de los datos de metabolitos para los factores de confusión (edad, género, BMI, y tipo de muestra (si fuera adecuado)).

Todos los intervalos de confianza del 95% para la AUC se derivaron de la base del modelo binomial como se describe en Zhou, Obuchowski y McClish [Statistical Methods in Diagnostic Medicine (2011), 2a Edición, by Zhou, Obuchowski y McClish]. La sunción de la binormalidad se comprobaba visualmente con un QQ-Plot.

El panel central se seleccionó de los resultados de los análisis multivariados (Forest aleatorio = RF)) y análisis univariables (ANOVA, ROC) para el diagnóstico diferencial entre el cáncer pancreático y pancreatitis de la siguiente manera:

Tabla 1a: Combinaciones de biomarcadores que forman grupos de biomarcadores (paneles centrales)

En los casos en los que los candidatos a biomarcador incluyen el CA19-9, estos datos pueden aplicarse como datos numéricos o relativos. Los datos numéricos de CA19-9 se refiere a concentraciones (U/ml) por sujeto. Para los datos relativos, se utilizó un corte definido de 37 U/ml por dicotomización de los datos en un grupo de CA19-9 bajo (< 37 U/ml) y un grupo de CA19-9 alto (> 37 U/ml); Los análisis se hicieron sobre los datos de muestras de plasma, los datos de muestras de suero y en los análisis combinados de plasma y suero.

Tabla 1b: Direcciones de la regulación de biomarcador, ceramidas preferidas, esfingomielina, y bases esfingo fosforiladas

Tabla 16: Biomarcadores adicionales para la composición del panel

(continuación)

Tabla 17: Panel número 1, Algoritmo ANOVA, Matriz Suero y plasma, CA19-9 excluido, con corrección de datos por

ANOVA

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Tabla 18: Panel número 2, Algoritmo ANOVA, Matriz Suero y plasma, CA19-9 excluido, con corrección de datos por

ANOVA

Tabla 19: Panel número 4, Algoritmo ROC, Matriz Plasma, CA19-9 excluido, sin corrección de datos por ANOVA

Tabla 20: Panel número 5, Algoritmo ROC, Matriz Suero, CA19-9 excluido, sin corrección de datos por ANOVA

Tabla 21: Panel número 10, Algoritmo RF, Matriz Suero, CA19-9 excluido, con corrección de datos por ANOVA

Tabla 22: Panel número 11, Algoritmo RF, Matriz Suero, CA19-9 numérica incluido, con corrección de datos por

ANOVA

Tabla 23: Panel número 13, Algoritmo RF, Matriz Plasma, CA19-9 relativo incluido, sin corrección de datos por

ANOVA

Tabla 24: Panel número 21, Algoritmo RF, Matriz Suero y Plasma, CA19-9 relativo incluido, con corrección de datos por ANOVA

Tabla 25: Panel número 23, Algoritmo ANOVA, Matriz Suero y Plasma, CA19-9 excluido, con corrección de datos por ANOVA

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Tabla 26: Panel número 24, Algoritmo elastic net, Matriz Plasma, CA19-9 incluido, sin corrección de datos por

ANOVA

Tabla 27: Datos de ANOVA para todos los metabolitos listados en cualquiera de las Tablas 1 a 26 para todas las matrices

(continuación)

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Tabla 28 Biomarcadores de metabolito único para el diagnóstico de cáncer pancreático

Tabla 29: Lista de biomarcadores identificados en el suero para el cáncer pancreático con respecto a pancreatitis

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Tabla 30: Lista de biomarcadores identificados en el plasma para el cáncer pancreático con respecto a pancreatitis

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Tabla 30a: Lista de biomarcadores adicionales en el plasma para el cáncer pancreático con respecto a pancreatitis

Tabla 31: Lista de biomarcadores identificados en plasma combinado con suero para el cáncer pancreático con respecto a pancreatitis

(continuación)

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Tabla 32: Lista de biomarcadores identificados en el suero para el cáncer pancreático con respecto a los controles (donantes de sangre)

Tabla 33: Lista de biomarcadores identificados en el plasma combinado con el suero para el cáncer pancreático con respecto a los controles (donantes de sangre)

Tabla 33a: Lista de biomarcadores identificados en el plasma para cáncer pancreático con respecto a controles no pancreáticos

Tabla 34: Lista de biomarcadores identificados en el suero para el cáncer pancreático con respecto a controles críticos (pancreatitis y cirrosis hepática)

Tabla 35: Lista de biomarcadores identificados en el plasma combinado con suero para el cáncer pancreático con respecto a controles críticos (pancreatitis y cirrosis hepática)

Tabla 36: Lista de biomarcadores en el suero para el cáncer pancreático con respecto a la cirrosis hepática

Tabla 37: Lista de biomarcadores identificados en el plasma combinado con suero para el cáncer pancreático con respecto a cirrosis hepática

Ejemplo 4: Pacientes y preparación de muestras

A partir de un estudio de control de casos retrospectivos, se incluyeron muestras de plasma de 79 pacientes que padecían de PDAC resecable (es decir, en estadio T1 o T2), muestras de plasma de 80 pacientes que padecían pancreatitis crónica, y muestras de plasma de 80 controles no pancreáticos (reparación de hernia y resección tiroidea). Los criterios de exclusión eran una enfermedad maligna concomitante, tratamiento curativo de enfermedad maligna menos de 2 años antes del reclutamiento para el ensayo, enfermedades quísticas concomitantes del páncreas, gestación o pacientes incapaces de dar el consentimiento informado. Después de la extracción de sangre y centrifugación, se recolectaron las muestras de plasma en tubos de Eppendorf y se almacenaron a -80 °C para análisis posteriores como se describe en el Ejemplo 2. El análisis estadístico se hizo por ANOVA como se ha descrito en el Ejemplo 3.

Los resultados se muestran en las Tablas 38 y 39.

Tabla 38: Lista de biomarcadores identificados en el plasma de cáncer pancreático resecable con respecto a pancreatitis

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Tabla 39: Lista de biomarcadores identificados en el plasma de cáncer pancreático resecable con respecto a un control no pancreático

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de diagnóstico de cáncer de páncreas en un sujeto que comprende las etapas de:

(a) determinar en una muestra de un sujeto sospechoso de padecer cáncer de páncreas las cantidades de un grupo de biomarcadores, comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a, y

(b) comparar dichas cantidades de los biomarcadores con referencias, de manera que se diagnostique el cáncer de páncreas.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho sujeto es sospechoso de padecer cáncer de páncreas o pancreatitis crónica.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dichas referencias se derivan de una muestra de un sujeto o un grupo de sujetos que se sabe que padecen cáncer pancreático.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que dichas referencias se derivan de una muestra de un sujeto o un grupo de sujetos que se sabe que no padecen cáncer pancreático.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho grupo de biomarcadores comprende al menos un biomarcador adicional seleccionado de la Tabla 16.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho grupo de biomarcadores es el grupo que se muestra en una cualquiera de las Tablas 2 a 15.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho grupo de biomarcadores comprende adicionalmente el CA19-9.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho diagnóstico comprende la diferenciación entre cáncer pancreático y pancreatitis.

9. Un procedimiento para identificar si un sujeto necesita una terapia para cáncer de páncreas que comprende las etapas del procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y la etapa adicional de identificación de un sujeto que necesita una terapia para el cáncer de páncreas si se diagnostica que dicho sujeto padece cáncer de páncreas.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha terapia para el cáncer de páncreas comprende cirugía, radioterapia, o tratamiento farmacológico.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha muestra es una muestra de plasma, sangre o suero.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha esfingomielina, ceramida y/o base esfingo fosforilada se selecciona de entre las que se enumeran en la Tabla 1b.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho cáncer de páncreas es adenocarcinoma de páncreas.

14. Un dispositivo para el diagnóstico del cáncer de páncreas en una muestra de un sujeto que comprende:

(a) una unidad de análisis para dicha muestra del sujeto que comprende un detector de las cantidades de un grupo de biomarcadores, comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a, permitiendo dicho detector la determinación de las cantidades de biomarcadores de dicho grupo de biomarcadores en la muestra; y unida operativamente a esta,

(b) una unidad de evaluación que comprende una unidad de procesamiento de datos y una base de datos, comprendiendo dicha base de datos una referencia almacenada y teniendo dicha unidad de procesamiento de datos un algoritmo incluido tangiblemente para llevar a cabo una comparación de las cantidades de los biomarcadores del grupo de biomarcadores determinados por la unidad de análisis y la referencia almacenada y para la generación de una información de salida en base a la cual se puede establecer el diagnóstico.

15. El uso de un grupo de biomarcadores comprendiendo dicho grupo al menos los biomarcadores de una de las combinaciones que se muestran en la Tabla 1a o los agentes de detección de los mismos en una muestra de un sujeto sospechoso de padecer cáncer pancreático para el diagnóstico de cáncer pancreático.