ES2698527T3 - Generación de células iPS humanas mediante un ARN autorreplicante sintético - Google Patents

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Abstract

Un ARN replicón de alfavirus que comprende: al menos un dominio de replicasa no estructural procedente de un alfavirus y al menos una secuencia heteróloga no de alfavirus que codifica al menos dos factores de reprogramación (RFs) para inducir la generación de células madre pluripotentes cuando se expresa en una célula somática, en donde los al menos dos RFs son seleccionados de la lista que consiste en KLF4, OCT-4, SOX-2, c-MYC o n-MYC o I-MYC, GLIS1 y NANOG.

Description

DESCRIPCIÓN
Generación de células iPS humanas mediante un ARN autorreplicante sintético
Campo técnico
Se proporcionan métodos y composiciones útiles para producir y propagar células madre a partir de fibroblastos. La descripción se refiere a la producción de células madre pluripotentes inducidas (iPS, del inglés “induced Pluripotent Stem”) y a métodos de uso de las mismas.
Antecedentes
Las células madre son una fuente potencial a partir de la cual se pueden regenerar órganos, se pueden reparar tejidos, se pueden preparar o administrar factores biológicos o se pueden tratar enfermedades o trastornos.
Hiroshi Ban et al (2011) PNAS; 108; 14234 describe vectores de virus Sendai sensibles a la temperatura que pueden usarse para generar células madre pluripotentes inducidas (IPSCs). El documento WO2009/067563 presenta la generación de IPSCs usando vectores retrovirales. Los documentos WO97/38087 y WO2005/116192 presentan replicones de ARN de alfavirus y su uso en la transformación de células madre. El documento WO2014/072061 presenta el uso de vectores replicones de virus del bosque de Semliki que comprenden vectores de des-diferenciación para generar IPSCs.
Compendio
La generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a partir de pacientes es importante para usar terapéuticamente células madre. La generación de células iPS requiere la expresión de varios factores de transcripción pluripotentes o de Factores de Reprogramación (RFs), que incluyen Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Glis1 (y potencialmente Nanog y Lin28). Sin embargo, debido a las preocupaciones con la integración de vectores de aDN (virus y ADN desnudo) en el genoma durante la generación de células iPS, se excluyen estas estrategias de ser usadas posteriormente en pacientes.
La descripción describe una estrategia para generar células madre pluripotentes inducidas (iPS) expresando ectópicamente RFs que usan un ARN autorreplicante sintético procedente de un alfavirus modificado (p.ej., el virus de Encefalitis Equina Venezolano (VEE)). El alfavirus se ha diseñado para expresar, en una realización, cuatro RFs que dieron como resultado las siguientes ventajas sobre las estrategias de transfección de ARNm: 1) se utiliza una única especie de ARN capaz de autorreplicarse por un número limitado de divisiones celulares, reduciendo de este modo el número de transfecciones; 2) es capaz de codificar en uno, dos, tres, cuatro o más marcos de lectura abiertos (ORFs) de RF; y 3) expresa consistentemente todos los genes de RF en niveles umbral elevados a lo largo de múltiples divisiones celulares. El uso de la cadena principal autorreplicante de un alfavirus (eliminando los genes estructurales) para expresar los RFs requiere solo de 3 a 4 transfecciones (e incluso de solo 1 o 2) en los fibroblastos humanos primarios para generar células iPS. La generación del tránscrito RF-ARN de alfavirus utiliza un kit de transcripción SP6 (o T7) in vitro que no requiere de condiciones especiales y, por ello, simplifica adicionalmente la estrategia para un uso amplio. Expresando los cuatro RFs en niveles elevados consistentes en el tiempo en la misma célula, combinado con la replicación del ARN de RF de alfavirus para un número limitado de generaciones de células múltiples, la estrategia de ARN de RF de alfavirus solventa los dos problemas de ineficiencia principales asociados al intento de generar células iPS mediante transfecciones diarias repetidas durante >14 días de cuatro mARNs de RF individuales. El ARN de RF de alfavirus es una estrategia ectópica que no utiliza un intermedio de ADN y, por tanto, no existe la posibilidad de que se pueda producir la mutación integrativa de las estrategias de células iPS basadas en vector de ADN. Además, la cadencia de pérdida de replicón de ARN por degradación se puede regular mediante la retirada de B18R del medio. Usando esta estrategia, se generaron >100 clones de células iPS a partir de protocolos de ARN de RF de alfavirus OCT4/KLF4/SOX2/c-MYC y OCT4/KLF4/SOX2/GLIS1 a partir de dos poblaciones de fibroblastos humanos parenterales independientes. Adicionalmente, la estrategia se puede modificar para expresar combinaciones de RF alternativas y/o la inserción de ORFs de RF adicionales en la cadena principal de ARN de RF para refinar la generación de células iPS a partir de tipos celulares específicos o para uso en dirigir la transdiferenciación.
La descripción proporciona un ARN de replicón de alfavirus que comprende al menos un dominio de replicasa no estructural de un alfavirus y al menos una secuencia heteróloga no de alfavirus que codifica factores para inducir la generación de células madre pluripotentes cuando se expresa en una célula somática. En una realización, el replicó comprende secuencias obtenidas a partir de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste en virus de Encefalitis Equina Oriental (EEE), virus de Encefalitis Equina Venezolana (VEE), virus de Everglades, virus Mucambo, virus Pixuna y virus de Encefalitis Equina Occidental (WEE). En otra realización, el replicón comprende secuencias obtenidas de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste en virus de Sindbis, virus de Bosque de Semliki, virus Middelburg, virus Chikungunya, virus O'nyong-nyong, virus Ross River, virus del Bosque de Barmah, virus Getah, virus Sagiyama, virus Bebaru, virus Mayaro, virus Una, virus Aura, virus Whataroa, virus Babanki, virus Kyzylagach, virus J de las Highlands, virus Fort Morgan, virus Ndumu y virus Buggy Creek. En otra realización adicional, la al menos una secuencia heteróloga no de alfavirus comprende al menos 2, 3, 4 o 5 secuencias heterólogas no de alfavirus. En otra realización adicional, de cualquiera de las anteriores se selecciona la secuencia heteróloga no de alfavirus de un polinucleótido que codifica un polipéptido KLF, un polipéptido SOX-2, un polipéptido OCT-3/4, un polipéptido c-MYC o n-MYC o L-MYC, un polipéptido GLIS1, un polipéptido NANOG y cualquier combinación de los mismos. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido k Lf codifica un polipéptido KLF que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:8. En otra realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido KLF codifica un polipéptido KLF que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:8. En otra realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido KLF comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:7, donde “T” es “U”. En otra realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido SOX-2 codifica un polipéptido SOX-2 que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:6. En otra realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido SOX-2 que codifica un polipéptido SOX-2 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:6. En otra realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido SOX-2 comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:5, donde “T” es “U”. En otra realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido OCT-4 codifica un polipéptido OCT-4 que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:4. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido OCT-4 codifica un polipéptido OCT-4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:4. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido OCT-4 comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:3, donde “T” es “U”. En otra realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido c-MYC codifica un polipéptido c-MYC que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:10. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido c-MYC que codifica un polipéptido c-MYC que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:10. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido c-MYC comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:9, donde “T” es “U”. En otra realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido GLIS1 codifica un polipéptido GLIS1 que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:34. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido GLIS1, codifica un polipéptido GLIS1 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:34. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido GLIS1 comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:33, donde “T” es “U”. En otra realización, el polinucleótido que codifica el polipéptido NANOG codifica un polipéptido NAOG que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:2. En una realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido NANOG codifica un polipéptido NANOG que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:2. En otra realización adicional, el polinucleótido que codifica el polipéptido NANOG comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:1, donde “T” es “U”. En una realización de cualquiera de las anteriores, el replicón comprende de 5' a 3': (replicasas de ARN de VEE) - (promotor) - (RF1) - (péptido de auto-ruptura) - (RF2) - (péptido de auto-ruptura) - (RF3) - (IRES o promotor central) - (RF4) - (IRES o promotor opcional) - (marcador seleccionable opcional) - (3'UTR y cola poliA de VEE) - (marcador seleccionable opcional) -promotor; donde RF1-4 son factores que inducen la des-diferenciación de una célula somática a células pluripotentes, donde RF2-3 son opcionales, RF3-4 son opcionales o RF4 es opcional; donde RF1-4 se seleccionan del grupo que consiste en Oct-4, Klf4, Sox-2, c-Myc, Nanog y Glisl. En otra realización, el replicón comprende una secuencia que es idéntica en un 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32 desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 7561, donde “T” de la secuencia es sustituido por “U”, seguido de dos o más RFs, seguido de un 3'UTR y cola poliA, donde los dos o más RFs se seleccionan del grupo que consiste en Oct-3/4, Sox-2, Klf4, c-Myc, Nanog y Glis1; donde las más de una secuencias codificadoras de Rf pueden estar separadas por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) o un promotor pequeño. En una realización adicional, el replicón comprende una secuencia que es idéntica en al menos un 95%, 98%, 99% o 100% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32, donde “T” es “U”.
La descripción también proporciona una composición que comprende células humanas transformadas con un replicón como se ha descrito en cualquiera de las realizaciones anteriores y de realizaciones descritas adicionalmente en la presente memoria. En una realización, la composición comprende además medio condicionado con B18R. En otra realización, las células humanas son células somáticas. En una realización adicional, las células humanas son fibroblastos.
La descripción también proporciona un método para preparar células madre que comprende cultivar la composición descrita anteriormente y en otros sitios de la presente memoria, durante al menos 30 días en condiciones que expresen las secuencias codificadoras del replicón y aislar las células madre.
La descripción también proporciona un método para preparar células madre que comprende transformar células somáticas con un replicón de la descripción, cultivar las células somáticas en condiciones que promueven la expresión del replicón y aislar las células madre. El cultivo comprende cultivar las células en medio condicionado con B18R. En otra realización, el medio condicionado con B18R es producido mediante transfección de ARNm de B18R en fibroblastos humanos primarios.
La descripción también proporciona células madre aisladas obtenidas a partir de los métodos descritos en la presente memoria, donde las células madre están libres de ADN o ARN retroviral.
La descripción también proporciona un método que comprende poner en contacto una célula somática humana in vitro con un replicón de ARN autorreplicante ectópico que comprende polinucleótidos que codifican al menos dos factores de des-diferenciación seleccionados del grupo que consiste en un (i) KLF4, (ii) OCT4, (iii) SOX2, (iv) c-MYC o n-MYC o L-MYC, (v) GLIS1 y (vi) NANOG; cultivar la célula somática para expresar el factor de des-diferenciación; seleccionar células que presentan una morfología de célula madre y/o marcadores de célula madre; y subcultivar las células para obtener una población de células madre inducidas. En una realización, las células se seleccionan detectando la expresión de un antígeno de rechazo de tumor 1-60 y/o 1-81.
La descripción también proporciona un sistema de vector para producir células madre humanas, que comprende al menos un replicón de a Rn autorreplicante que comprende uno o más polinucleótidos heterólogos no de alfavirus que codifica al menos dos factores de des-diferenciación seleccionados del grupo que consiste en un KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, GLIS1 y NANOG. En una realización, el replicón comprende (a) Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, o (b) Oct4, Sox2, Klf4 y Glis1. El al menos un replicón de ARN autorreplicante es derivado de un alfavirus. En una realización adicional, el alfavirus es VEE.
La descripción también proporciona una célula somática humana aislada que comprende un replicón de ARN ectópico que comprende dos o más secuencias de polinucleótido de des-diferenciación que codifican factores de des­ diferenciación seleccionados del grupo que consiste en Klf4, Oct4, Sox2, c-Myc o n-Myc o L-Myc, NANOG y GLIS1. En una realización adicional, donde en las condiciones de cultivo para expresar los polinucleótidos de des­ diferenciación en el replicón de ARN ectópico, la célula somática se des-diferencia.
La descripción también proporciona una población celular que comprende la célula somática humana que contiene un replicón de ARN ectópico que comprende una o más secuencias de polinucleótido de des-diferenciación.
La descripción también proporciona una población celular obtenida poniendo en contacto una célula somática humana con un replicón de ARN autorreplicante ectópico que comprende polinucleótidos que codifican al menos cuatro factores de des-diferenciación seleccionados del grupo que consiste en un (i) KLF4, (ii) OCT4, (iii) SOX2, (iv) c-MYC o n-MYC o L-MYC, (v) GLIS1 y (vi) NANOG; cultivar la célula somática para expresar el factor de des-diferenciación; seleccionar células que presentan una morfología de célula madre y/o marcadores de célula madre; y subcultivar las células para obtener una población de células madre inducidas. Las células pueden ser seleccionadas detectando la expresión de un antígeno de rechazo de tumor 1-60 y/o 1-81.
La descripción también proporciona células de fibroblasto humanas recombinantes que contienen una molécula de ARN ectópica que codifica B18R. El ARN que codifica B18R puede comprender la SEQ ID NO:39, donde “T” es reemplazada con “U”. O el ARN puede codificar un polipéptido que comprende la secuencia establecida en la SEQ ID NO:40.
La descripción también proporciona un método para preparar medio acondicionado con B18R que comprende cultivar una célula de fibroblasto humano transformada con ARN que codifica B18R en las condiciones que permiten la expresión de B18R, y aislar el medio del cultivo.
Descripción de las figuras
Figura 1A-E: muestra la construcción y la persistencia de replicones de ARN de RF de VEE sintéticos en fibroblastos humanos primarios. (A) Esquema de replicón de ARN de RF de VEE. Extremo 5' de nsP1-4: proteínas no estructurales 1-4; extremo 3' C, E2, E1: proteínas estructurales. Localizaciones de promotor interno 26S, péptido 2A de cambio de ribosoma, secuencia IRES, gen de resistencia de puromicina (Puro) y las regiones correspondientes a detecciones de PCR de replicón según se indica. (B) La co-transfección de ARNm de B18R con replicón de ARN de VEE permite expresar GFP de VEE en el día 1. (C) El medio acondicionado con B18R (B18R-CM) y la selección de puromicina son requeridos para la persistencia de ARN de GFP de VEE a lo largo de 7 días. (D) B18R-CM y puromicina son requeridos para la retención de ARN de GFP de VEE. Fotografías de expresión de GFP en el día 7 según se indica. Barra, 200 |jm. (E) Análisis de inmunotinción de factores de reprogramación expresados por ARN de VEE expresados en células HFFs en el día 1 frente a expresión de retrovirus (RV-4Fs).
Figura 2A-E: muestra la generación de células iPS mediante ARN de RF de VEE. (A) Esquema del protocolo de generación de células iPS con ARN de RF de VEE epigenético. Se llevaron a placa fibroblastos humanos en el día 0 (d0) y se co-transfectaron (Tfx) con replicón de ARN de RF de VEE más ARNm de B18R (ratio 3:1) en el día 1 (confluente, ~4x105 células) y se trataron con puromicina hasta el día 7 (o 10) según se indica. Las células fueron cultivadas en B18R-CM hasta que las colonias de células iPS fueron aisladas en el día 25-30. (B) Se generaron colonias de células iPS teñidas con fosfatasa alcalina con ARN VEE-OKS-iM, pero no con ARN VEE-OMKS. (C) Tinción con fosfatasa alcalina de colonias de células iPS generadas a partir de BJ o HFFs del protocolo de transfección en los días 1, 4, 7, 10, según se indica. (D) Imágenes típicas de colonias de células iPS en el día 26 para ARN de VEE-OKS-iM y en el día 22 para ARN de v Ee -OKS-ÍG a partir de fibroblastos BJ o HFFs según se indica. Barra, 100 jm ). (E) Tinción de inmunohistoquímica de genes marcadores de ES pluripotentes en clones de células iPS aisladas generados como se indica. Se obtuvieron resultados similares para 26 clones de células iPS adicionales (30 clones en total). Barra, 100 jm ; cuadro interior, amplificación 10x.
Figura 3A-E: muestra la caracterización de clones de células iPS de ARN de RF de VEE. (A) Expresión de genes marcadores de ES mediante análisis qRT-RCR de clones de iPS de VEE-OKS-iM de BH y HFF como se indica. (B) Análisis de metilación de ADN de regiones promotoras NANOG y OCT4. Círculo relleno, metilado; Círculo hueco, desmetilado. Los números de la parte superior indican el número de CpG relativo al sitio de inicio de la transcripción. (C) Análisis de gráfico de puntos del perfil de secuencia de ARNm a escala de genoma de BJ-OKS-iM n°2 y BJ-OKS-iG n°5 en comparación con fibroblastos BJ humanos originales y células madre embrionarias HUES9 humanas con pluripotencia NANOG, OCT4, SOX2 según se indica. (D) Dendrograma jerárquico no supervisado del análisis de secuencias de ARN a escala de genoma que muestra la agrupación de cuatro clones de células iPS independientes con HUES9 en comparación con los fibroblastos BJ. (E) Formación de teratoma del clon BJ-OKS-iM n°21 en ratones nude. AE1/AE3 (citoqueratina), NF-1 (células neuronales) y GFAP (células neuronales) usados para marcadores de ectoderma; Desmin (células musculares) usadas para marcador de mesoderma; y AFP (endoderma primitivo y definitivo) usado para marcador de endoderma. Barra, 100 pm.
Figura 4: muestra el análisis RT-PCR para comprobar la existencia de replicón de ARN. Medida de la sensibilidad de PCR con el plásmido de replicón OKS-iM-RNA. Se realizaron PCRs para las regiones nsP2, nsP4 y OCT4-T2A-KLF4 (OK) con 100, 10 y 1 fg de plásmido (Panel superior). RT-PCR de clones de iPSCs HFF-OKS-iM. ; control positivo, el ARN total se preparó desde un día después de la transfección de replicón OKS-iM-RNA. -; control negativo, el ARN total se preparó a partir de HFFs transfectadas de imitación. Los ARNs totales de clones de células iPS se prepararon a partir del pasaje 8 (Panel inferior).
Figura 5: muestra el análisis del cariotipo de clones de células iPS. El cariotipado de banda-G de los clones HFF-OKS-iM-1, BJ-OKS-iM-2, BJ-OKS-iM-21 y BJ-OKS-iG-5 se llevó a cabo en veinte células de metafase de banda-G de cada clon y se evaluó como cariotipo humano masculino normal en todos los clones (línea celular GENETICS).
Figura 6A-B: muestra clones de células iPS cultivados con células cebadoras STO. Las células fueron recolectadas y después inyectadas intramuscularmente o subcutáneamente en los músculos de la pata trasera o en el flanco dorsal de ratones nude. Después de 5 a 8 semanas de la inyección, los tumores fueron diseccionados y fijados con paraformaldehído al 4% (A) Análisis de teratoma de clon HFF-OKS-iM n°1 en ratones nude. AE1/AE3 (citoqueratina), NF-1 (células neuronales) usados para marcadores de ectoderma; Desmin (células musculares) usadas para marcador de mesoderma; y AFP (endoderma primitivo y definitivo) usado para marcador de endoderma. Barra, 100 pm. (B) Tinción H&E de teratomas de clones 3 y 5 de BJ-OKS-iG. Barra, 100 pm.
Figura 7A-D: muestra que (A) el medio acondicionado con B18R es útil para la existencia persistente de replicón de ARN de VEE. Arriba; % de células positivas de GFP, Abajo: valor medio de fluorescencia g Fp en la población positiva de GFP. (B) Fotografías de células. Barra, 200 pm. (C) Expresión de proteínas de RFs en el día 10 como se indica. (D) El B18R-CM es requerido para la generación de células iPS en cultivo de cebador. Se co-transfectaron HFFs con ARN de OKS-iM y ARNm de B18R como se ha indicado, y a continuación las células fueron cultivadas en presencia de B18R-CM y puromicina. Las células fueron pasadas a células cebadoras STO en el día 10 (transfecciones en los días 1, 3, 8) o en el día 11 (transfecciones en los días 1,4, 7, 10), y se cultivaron en presencia o en ausencia de B18R-CM más/menos puromicina.
Descripción detallada
Tal como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto claramente indique lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una pluralidad de dichas células y la referencia al “agente” incluye referencia a uno o más agentes conocidos por los especialistas en la técnica, etcétera.
Asimismo, el uso de “o” significa “y/o” a menos que se especifique lo contrario. De forma similar, “comprende”, “comprende”, “que comprende”, “ incluye” y “que incluye” son intercambiables y no pretenden ser limitativos.
Debe entenderse asimismo que cuando las descripciones de las diversas realizaciones usan el término “que comprende”, los especialistas en la técnica entenderá que en algunos casos específicos una realización puede ser descrita alternativamente usando el lenguaje “que consiste esencialmente en” o “que consiste en”.
Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria al llevar a la práctica los métodos y composiciones descritos, los ejemplos de métodos, dispositivos y materiales se describen en la presente memoria.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado empleado habitualmente por los especialistas en el campo de la técnica a la cual pertenece la descripción. Por tanto, tal como se usan a lo largo de la presente solicitud, los siguientes términos tendrán los siguientes significados.
Aunque las células madre pluripotentes inducidas (células iPS) son virtualmente idénticas a las células ES a un nivel molecular y funcional, existen impedimentos críticos para la traducción de sus potenciales terapéuticos en aplicaciones médicas. Uno de los problemas es que debido a que los protocolos estándar actuales para la reprogramación y propagación de células iPS incluyen materiales derivados de animales que no son adecuados para fines clínicos potenciales, es necesario desarrollar un método completamente definido para generar y expandir células hiPS.
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son descritas por el equipo de Shinya Yamanaka de la Universidad de Tokio, Japón. Yamanaka identificó genes que son particularmente activos en células madre embrionarias, y usó retrovirus para transfectar fibroblastos de ratón con una selección de dichos genes. Eventualmente, se aislaron cuatro genes clave de pluripotencia esenciales para la producción de células madre pluripotentes; Oct-3/4, SOX2, c-Myc y Klf4. Las células fueron aisladas mediante selección de antibióticos para células Fbx15+. El mismo grupo publicó un estudio junto a otros dos grupos de investigación independientes de Harvard, MIT, y la Universidad de California, Los Angeles, que demostró con éxito la reprogramación de fibroblastos de ratón en iPS e incluso la producción de una quimera viable.
La generación de células iPS humanas mediante expresión retroviral de cuatro factores de reprogramación (RFs; también denominados factores de des-diferenciación) abrió el potencial de terapias de medicina regenerativa basadas en células madre personalizadas, específicas de paciente. Sin embargo, el potencial mutágenico insercional de retrovirus combinado con el potencial de la activación de gen RF latente, especialmente c-MYC, descarta completamente las estrategias basadas en ADN integrativo para uso en terapias de medicina regenerativa. Se han desarrollado otras estrategias de iPS basadas en ADN empleando vectores episomales, adenovirus, transposón piggyBac integrado y escindido o lentivurus floxeado; sin embargo, estas estrategias o bien adolecen de una baja eficiencia de generación de células iPS o bien requieren estrategias de escisión genómica que dejan atrás una etiqueta de elemento de ADN insertado. Las estrategias de células iPS basadas en ARN con virus Sendai o transfección de ARNm evitan los potenciales problemas de integración asociados a las estrategias basadas en ADN y son métodos inherentemente más seguros para aplicaciones clínicas. Aunque el virus Sendai ofrece una estrategia de iPS razonablemente eficiente, los problemas asociados a la replicación persistente de virus Sendai en clones de células iPS requiere una etapa de selección negativa seguida de varias etapas de reclonación desde el nivel de célula individual hasta aislar iPS libres de virus aislado, dichos procesos resultan en una división y pasaje de células iPS excesivos. Una de las estrategias no basadas en ADN más prometedoras implica la transfección diaria de cuatro ARNms de RF individuales (más ARNm de GFP) a lo largo de 16 días. Desafortunadamente, esta estrategia sigue siendo problemática. Por ejemplo, se han llevado a cabo experimentos para reemplazar los retrovirus KLF4 y c-MYC con los correspondientes ARNms transfectados y los resultados fueron validados; sin embargo los retrovirus OCT4 y SOX2 no pudieron ser reemplazados con ARNms transfectados. El problema parece tener su origen en la rápida degradación de los ARNms de RF combinada con el nivel inconsistente de expresión de umbral célula-a-célula con el tiempo, lo que deriva del intento de transfectar cuatro ARNms independientes en la misma célula en una base diaria durante >14 días durante la reprogramación. Consecuentemente, sigue existiendo una necesidad significativa de una estrategia no basada en ADN sencilla y altamente reproducible para generar células iPS humanas.
La descripción proporciona métodos y composiciones para generar células iPS a partir de células somáticas (p.ej., células de fibroblastos). Las composiciones y el método comprenden el uso de replicones derivados de alfavirus. Los replicones comprenden una secuencia de a Rn que codifica proteínas de alfavirus no estructurales necesarias para la replicación y 1, 2, 3, 4 o más secuencias codificadoras heterólogas al alfavirus y que inducen la des-diferenciación de células somáticas en fenotipos de célula madre.
Tal como se usa en la presente memoria, el término “alfavirus” tiene su significado convencional en la técnica, e incluye diversas especies tales como virus de encefalitis equina venezolana (VEE), virus de encefalitis equina oriental (EEE), virus de Everglades (EVE), virus Mucambo (MUC), virus Pixuna (PIX) y virus de Encefalitis Equina Occidental, todos los cuales son miembros del grupo VEE/EEE de alfavirus. Otros alfavirus incluyen, p.ej., el virus de Bosque de Semliki (SFV), virus Sindbis, virus Ross River, virus Chikungunya, S.A. AR86, virus del Bosque de Barmah, virus Middelburg, virus O'nyong-nyong, virus Getah, virus Sagiyama, virus Bebaru, virus Mayaro, virus Una, virus Aura, virus Whataroa, virus Babanki, virus Kyzylagach, virus J de las Highlands, virus Fort Morgan, virus Ndumu y virus Buggy Creek. Los alfavirus particularmente útiles en las construcciones y métodos descritos en la presente memoria son alfavirus del grupo VEE/EEE.
Los términos “replicón de ARN de alfavirus”, “ARN de replicón de alfavirus”, “replicón de vector de ARN de alfavirus” y “ARN de replicón de vector” se usan de forma intercambiable para referirse a una molécula de ARN que expresa genes de proteína no estructurales, de tal modo que puede dirigir su propia replicación (amplificación) y comprende, como mínimo, secuencias de reconocimiento de replicación de alfavirus 5' y 3', secuencias de codificación para proteínas no estructurales de alfavirus, y un tracto de poliadenilación. Adicionalmente puede contener uno o más elementos (p.ej., secuencias IRES, promotores de núcleo o mini-promotores y similares) para dirigir la expresión, lo que se refiere a la transcripción y la traducción, de una secuencia de ARN heteróloga. El replicón de alfavirus de la descripción puede comprender, en una realización, secuencias de reconocimiento de replicación de alfavirus 5' y 3', secuencias de codificación para proteínas no estructurales de alfavirus, un tracto de poliadenilación y una o más secuencias de codificación seleccionadas del grupo que consiste en SOX-2, c-Myc, OCT-3/4, Klf, Glis1 y Nanog.
El término “polinucleótido”, “ácido nucleico” o “ácido nucleico recombinante” se refiere a polinucleótidos tales como el ácido desoxirribonucleico (ADN), y, cuando sea apropiado (particularmente en referencia a un replicón), ácido ribonucleico (ARN).
El término “expresión” con respecto a un gen o polinucleótido se refiere a la transcripción del gen o polinucleótido y, según sea apropiado, a la traducción de un tránscrito de ARNm a una proteína o polipéptido. Así, como quedará claro a partir del contexto, la expresión de una proteína o polipéptido es el resultado de la transcripción y/o traducción del marco de lectura abierto.
Los especialistas en la técnica reconocerán que, debido a la naturaleza degenerada del código genético, se puede usar una variedad de codones que se diferencian en sus secuencias de nucleótido para codificar un aminoácido dado.
Un polinucleótido o secuencia génica particular que codifica un polipéptido descrito en la presente memoria son referenciados meramente para ilustrar una realización de la descripción, y la descripción incluye polinucleótidos de cualquier secuencia que codifica un polipéptido que comprende la misma secuencia de aminoácidos de los polipéptidos y proteínas de las enzimas utilizadas en los métodos de la descripción. De un modo similar, un polipéptido puede tolerar típicamente una o más sustituciones, eliminaciones e inserciones de aminoácidos en su secuencia de aminoácidos sin perder o sin presentar una pérdida significativa de una actividad deseada. La descripción incluye dichos polipéptidos con secuencias de aminoácidos alternativas, y las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ARN o ADN mostradas en la presente memoria meramente ilustran realizaciones de la descripción.
La descripción proporciona polinucleótidos en la forma de vectores de expresión de ADN recombinante, replicones de ARN o plásmidos, como se describe más detalladamente en otros sitios de la presente memoria, que codifican uno o más polipéptidos.
Un polipéptido de la descripción puede ser amplificado usando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genómico, como plantilla y los cebadores de oligonucleótido apropiados según las técnicas de amplificación PCR estándares y los procedimientos descritos más adelante en la sección de Ejemplos. El ácido nucleico amplificado de este modo puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizarse mediante análisis de secuencia. Adicionalmente, se pueden preparar los oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de nucleótido mediante técnicas sintéticas estándar, p.ej., empleando un sintetizador de ADN automatizado.
En una realización, un replicón de la descripción comprende una secuencia que es idéntica en un 90%, 95%, 98%, 99% o 100% a la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32, desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 7561 (incluyendo donde “T” de la secuencia puede ser sustituida por “U”), seguida de dos o más RFs seleccionados del grupo que consiste en Oct-3/4, Sox-2, Klf4, c-Myc, Nanog y Glis1. Cuando hay presente más de un RF, las secuencias codificadoras pueden separarse mediante un sitio de entrada de ribosoma (iReS) o un promotor pequeño (p.ej., un núcleo) tal como SP1. El orden de los RFs no es crítico para la descripción; por tanto el orden puede ser Klf4, Oct-3/4, Sox-2, c-Myc o puede ser Sox-2, Klf4, Oct-3/4, c-Myc, u Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc o cualquier variación del orden de los RFs. El replicón puede comprender además un marcador seleccionable (p.ej., un marcador de resistencia a antibiótico). Las secuencias codificadoras de los RFs pueden estar separadas por péptidos de autoruptura tales como T2A y/o E2A.
El replicón puede comprender desde 5' a 3': (replicasas de ARN de VEE) - (promotor 26S) - (RF1) - (péptido de autoruptura) - (RF2) - (péptido de auto-ruptura) - (RF3) - (IRES o promotor central) - (RF4) - (IRES o promotor opcional) - (marcador seleccionable opcional) - (3'UTR y cola poliA de VEE); donde RF1-4 son factores que inducen la des­ diferenciación de una célula somática a células pluripotentes, donde RF2-3 son opcionales, RF3-4 son opcionales o RF4 es opcional; donde RF1-4 se seleccionan del grupo que consiste en Oct-4, Klf4, Sox-2, c-Myc, Nanog y Glis1. El replicón de lo anterior es una molécula de ARN. En una realización adicional, el replicón se deriva de VEE e incluye una mutación para reducir la patogenicidad. El VEE puede ser un replicón de ARN basado en la cepa TC-83 (cepa de vacuna) con una mutación puntual (mutación nsP2P773 a S), que redujo el efecto citopático del replicón.
En cualquiera de las anteriores realizaciones, los RFs incluyen variantes y secuencias de polinucleótido generadas. Por ejemplo, un RF puede comprender homólogos y variantes de un polipéptido OCT-4, un polipéptido KLF4, un polipéptido SOX-2, un polipéptido c-MYC, un polipéptido NANOG o GLIS1. Por ejemplo, una secuencia codificadora de RF para NANOG útil en cualquiera de las realizaciones de replicón descritas en la presente memoria puede comprender (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la sEq ID NO:2; (ii) un polinucleótido que comprende al menos un 95% de identidad con respecto a la sEq ID NO:1 y que codifica un polipéptido que tiene actividad de NANOG; (iii) un polinucleótido que tiene una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:1 o (iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:2 que contiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácido conservativas y donde el polipéptido presenta actividad Nanog; y donde cualquiera de las anteriores secuencias de ácido nucleico puede tener “T” reemplazado por “U”. Por ejemplo, una secuencia codificadora de RF para Oct-4 útil en cualquiera de las realizaciones de replicón descritas en la presente memoria puede comprender (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:4; (ii) un polinucleótido que comprende al menos un 95% de identidad con respecto a la SEQ ID NO:3 y que codifica un polipéptido que tiene actividad Oct-4; (iii) un polinucleótido que tiene una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:3 o (iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:4 que contiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácido conservativas y donde el polipéptido presenta actividad Oct-4; y donde cualquiera de las anteriores secuencias de ácido nucleico puede tener “T” reemplazado por “U”. Por ejemplo, una secuencia codificadora de RF para Sox-2 útil en cualquiera de las realizaciones de replicón descritas en la presente memoria puede comprender (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:6; (ii) un polinucleótido que comprende al menos un 95% de identidad con respecto a la SeQ ID NO:5 y que codifica un polipéptido que tiene actividad Sox-2; (iii) un polinucleótido que tiene una secuencia como la establecida en la SEQ iD NO:5 o (iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:6 que contiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácido conservativas y donde el polipéptido presenta actividad SOX-2; y donde cualquiera de las anteriores secuencias de ácido nucleico puede tener “T” reemplazado por “U”. Por ejemplo, una secuencia codificadora de RF para KLF4 útil en cualquiera de las realizaciones de replicón descritas en la presente memoria puede comprender (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:8; (ii) un polinucleótido que comprende al menos un 95% de identidad con respecto a la sEq ID NO:7 y que codifica un polipéptido que tiene actividad KLF4; (iii) un polinucleótido que tiene una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:7 o (iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:8 que contiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácido conservativas y donde el polipéptido presenta actividad KLF4; y donde cualquiera de las anteriores secuencias de ácido nucleico puede tener “T” reemplazado por “U”. Por ejemplo, una secuencia codificadora de RF para c-MYC útil en cualquiera de las realizaciones de replicón descritas en la presente memoria puede comprender (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:10; (ii) un polinucleótido que comprende al menos un 95% de identidad con respecto a la s Eq ID NO:9 y que codifica un polipéptido que tiene actividad c-MYC; (iii) un polinucleótido que tiene una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:9 o (iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:10 que contiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácido conservativas y donde el polipéptido presenta actividad c-MYC; y donde cualquiera de las anteriores secuencias de ácido nucleico puede tener “T” reemplazado por “U”. Por ejemplo, una secuencia codificadora de RF para GLIS1 útil en cualquiera de las realizaciones de replicón descritas en la presente memoria puede comprender (i) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:34; (ii) un polinucleótido que comprende al menos un 95% de identidad con respecto a la SEQ ID NO:33 y que codifica un polipéptido que tiene actividad GLIS1; (iii) un polinucleótido que tiene una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:33 o (iv) un polinucleótido que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO:34 que contiene de 1 a 10 sustituciones de aminoácido conservativas y donde el polipéptido presenta actividad GLIS1; y donde cualquiera de las anteriores secuencias de ácido nucleico puede tener “T” reemplazado por “U”.
Nanog es un gen expresado en células madre embrionarias (ESCs) y desempeña un papel en el mantenimiento de la pluripotencia. Se cree que Nanog actúa con SOX2. En la SEQ ID NO:1 y 2 se presentan un polinucleótido y un polipéptido que codifican Nanog, respectivamente. Adicionalmente, la SEQ ID NO:1 comprende una secuencia de ADN, en la que se reconocerá que “T” puede ser reemplazado por “U”. La proteína humana NANOG (véase, p.ej., Número de acceso NP_079141) es una proteína de 305 aminoácidos con una estructura de homeodominio que está localizada en el componente nuclear de las células. De forma similar a NANOG, la región N-terminal de NANOG humana es rica en residuos de Ser, Thr y Pro y el extremo C comprende repeticiones de Trp. El homeodominio en la NANOG humana va desde aproximadamente el residuo 95 hasta aproximadamente el residuo 155. Se conocen homólogos de Nanog humana.
Un “polipéptido Oct” se refiere a cualquiera de los miembros existentes de la familia Octamer de factores de transcripción, o a variantes de los mismos que mantienen la actividad de factor de transcripción, similares (con una actividad de al menos el 50%, 80% o 90%) con respecto al miembro de la familia natural más próximo, o a polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión a ADN del miembro de la familia natural, y además pueden comprender un dominio de activación transcripcional. Los ejemplos de polipéptidos Oct incluyen Oct-1, Oct-2, Oct-3/4, Oct-6, Oct-7, Oct-8, Oct-9 y Oct-11. Por ejemplo, Oct-3/4 (aquí referido como “Oct4”) contiene el dominio POU, una secuencia de 150 aminoácidos conservada entre Pit-1, Oct-1, Oct-2 y uric-86. Véase Ryan, A. K. & Rosenfeld, M. G. Genes Dev.
11, 1207-1225 (1997). En algunas realizaciones, las variantes presentan al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 85%, 90% o 95% a lo largo de toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia de polipéptidos Oct natural, tal como los enumerados anteriormente o tal como los enumerados en el número de acceso del Genbank NP002692.2 (Oct4 humano) o NP038661.1 (Oct4 de ratón). Los polipéptidos Oct (p.ej., Oct3/4) pueden proceder de humano, ratón, rata, bovino, porcino u otros animales. Generalmente, se usará la misma especie de proteína de la especie de células que están siendo manipuladas. Oct-4 (Octamer-4) es un factor de transcripción de homeodominio de la familia POU y regula la expresión de numerosos genes (véase, p.ej., J. Biol. Chem., Vol. 282, Número 29, 21551-21560, 20 de julio, 2007). En la SEQ ID NO:3 y 4 se presentan un polinucleótido y un polipéptido que codifican un Oct4, respectivamente. Adicionalmente, la SEQ ID NO:3 comprende una secuencia de ADN, en la que se reconocerá que “T” puede ser reemplazado por “U”. Se conocen homólogos de Oct-4 humano, como se establece en los siguientes números de acceso NP_038661.1 y NM_013633.1 (Mus musculus), NP_001009178 y NM_001009178 (Rattus norvegicus), y NP_571187 y NM_131112 (Danio rerio).
SRY (región Y determinante del sexo)-box 2, también conocido como SOX2, es un factor de transcripción que desempeña una función en la auto-renovación de células madre embrionarias no diferenciadas y en la transactivación de Fgf4, así como en la modulación del doblado de ADN (véase, p.ej., Scaffidi et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, Número 50, 47296-47302, 14 de diciembre, 2001). Un “polipéptido Sox” se refiere a cualquiera de los miembros naturales de los factores de transcripción HMG-box relacionados con SRY (Sox), que se caracterizan por la presencia del domino de grupo de alta movilidad (HMG), o a variantes de los mismos que mantienen una actividad de factor de transcripción similar (con una actividad de al menos el 50%, 80% o 90%) con respecto al miembro de la familia natural más próximo, o a polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión a ADN del miembro de la familia natural, y además pueden comprender un dominio de activación transcripcional. Véase, p.ej., Dang, D. T., et at., Int. J. Biochem. Cell Biol. 32: 1103-1121 (2000). Los ejemplos de polipéptidos Sox incluyen, p.ej., Sox1, Sox-2, Sox3, Sox4, Sox5, Sox6, Sox7, Sox8, Sox9, Sox10, Sox11, Sox12, Sox13, Sox14, Sox15, Sox17, Sox18, Sox-21 y Sox30. Se ha demostrado que Sox1 produce células iPS con una eficiencia similar a Sox2, y también se ha demostrado que los genes Sox3, Sox15 y Sox18 generan células iPS, aunque con algo menos de eficiencia que el Sox2. Véase Nakagawa et al., Nature Biotechnology 26: 101-106 (2007). En algunas realizaciones, las variantes presentan al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 85%, 90% o 95% a lo largo de su secuencia completa en comparación con un miembro de la familia de polipéptidos Sox naturales, tal como los enumerados anteriormente o como el incluido en el número de acceso Genbank CAA83435 (Sox2 humano). Los polipéptidos Sox (p.ej., Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 o Sox18) pueden proceder de humano, ratón, rata, bovino, porcino u otros animales. Generalmente, se empleará la misma especie de proteína que la especie de las células que están siendo manipuladas. En la SEQ ID NO:5 y 6 se presentan un polinucleótido y un polipéptido que codifican un Sox2, respectivamente. Adicionalmente, la SEQ ID NO:5 comprende una secuencia de ADN, en la que se reconocerá que “T” puede ser reemplazado por “U”. Se conocen homólogos de Sox2 humano.
El factor 4 de tipo Kruppel, también conocido como KLF4, desempeña una función en el mantenimiento y crecimiento de las células madre. Un “polipéptido Klf” se refiere a cualquiera de los miembros naturales de la familia de factores de tipo Kruppel (Klfs), proteína de dedo de zinc que contienen secuencias de aminoácido similares a las de regulador Kruppel de estructura embrionaria de Drosophila, o a variantes de los miembros naturales que mantienen una actividad de factor de transcripción similar (con una actividad de al menos el 50%, 80% o 90%) con respecto al miembro de la familia natural más próximo, o a polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión a ADN del miembro de la familia natural, y además pueden comprender un dominio de activación transcripcional. Véase Dang, D. T., Pevsner, J. & Yang, V. W., Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000). Los ejemplos de miembros de la familia de Klf incluyen Klf1, Klf2, Klf3, Klf-4, Klf5, Klf6, Klf7, Klf8, Klf9, Klf10, Klf11, Klf12, Klf13, Klf14, Klf15, Klf16 y Klf17. Se descubrió que Klf2 y Klf-4 son factores capaces de generar células iPS en ratones, así como los genes relacionados Klf1 y Klf5, aunque con una menor eficiencia. Véase Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26: 101-106 (2007). En algunas realizaciones, las variantes tienen al menos una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 85%, 90% o 95% a lo largo de toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia de polipéptidos de Klf natural tal como los enumerados anteriormente o como los incluidos en el número de acceso de Genbank CAX16088 (Klf4 de ratón) o CAX14962 (Klf4 humano). Los polipéptidos de Klf (p.ej., Klf1, Klf4 y Klf5) pueden proceder de humano, ratón, rata, bovino, porcino u otros animales. Generalmente, se usará la misma especie de proteína que la especie de las células que están siendo manipuladas. Para el alcance en que se describe un polipéptido Klf en la presente memoria, puede ser reemplazado por un polipéptido de receptor beta relacionado con estrógeno (Essrb). De esta manera, se pretende que para cada realización de polipéptido de Klf descrita en la presente memoria, se describa igualmente una correspondiente realización que emplea Essrb en lugar de un polipéptido Klf4. En la SEQ ID NO:7 y 8 se presentan un polinucleótido y un polipéptido que codifican un KLF4, respectivamente. Adicionalmente, la SEQ ID NO:7 comprende una secuencia de ADN, en la que se reconocerá que “T” puede ser reemplazado por “U”. Se conocen homólogos de KLF4 humano e incluyen NP_034767, NM_010637 (Mus musculus).
La familia MYC de genes celulares está compuesta por c-myc, N-myc y L-myc, tres genes que actúan en la regulación de la proliferación, diferenciación y apoptosis de células (Henriksson y Luscher 1996; Facchini y Penn 1998). Un “polipéptido Myc” se refiere a cualquiera de los miembros naturales de la familia Myc (véase, p.ej., Adhikary, S. & Eilers, M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6: 635-645 (2005)), o variantes de los mismos que mantienen una actividad similar de factor de transcripción (con una actividad de al menos el 50%, 80% o 90%) con respecto al miembro de la familia natural más próximo, o a polipéptidos que comprenden al menos el dominio de unión a ADN del miembro de la familia natural, y además pueden comprender un dominio de activación transcripcional. Los ejemplos de polipéptidos Myc incluyen, p.ej., c-Myc, N-Myc y L-Myc. En algunas realizaciones, las variantes presentan una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 85%, 90% o 95% a lo largo de su secuencia completa con respecto a un miembro de la familia de polipéptidos Myc natural, tal como los enumerados anteriormente o el incluido en el número de acceso Genbank CAA25015 (Myc humano). Los polipéptidos Myc (p.ej., c-Myc) pueden proceder de humano, ratón, rata, bovino, porcino u otros animales. Generalmente, se usará la misma especie de proteína que la especie de células que están siendo manipuladas. Aunque los genes de la familia myc presentan una estructura y una actividad biológica comunes. El n-Myc es un miembro de la familia MYC que codifica una proteína con un dominio básico hélice-buclehélice (bHLH). Las estructuras genómicas de c-myc y N-myc se organizan de forma similar y constan de tres exones. La mayor parte del primer exón y la porción 3' del tercer exón contienen regiones no traducidas que portan secuencias reguladoras transcripcionales o post-transcripcionales. La proteína N-myc se encuentra en el número y dimeriza con otra proteína bHLH para unirse a ADN. En la SEQ ID NO:9 y 10 se presentan un polinucleótido y un polipéptido que codifican un c-Myc, respectivamente. Adicionalmente, la SEQ ID NO:9 comprende una secuencia de ADN, en la que se reconocerá que “T” puede ser reemplazado por “U”. En la técnica se conocen homólogos y variantes de la familia Myc de proteínas.
Glis1 (dedo de zinc 1 de la familia Glis) es un gen que codifica una proteína de tipo Krüppel del mismo nombre, cuya localización está en el cromosoma 1p32.3. El gen está enriquecido en óvulos no fertilizados y en embriones en la etapa de una célula y puede usarse para promover la reprogramación directa de células somáticas a células madre pluripotentes inducidas. Glis1 se puede utilizar como uno de los cuatro factores usados en la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas. Los otros tres factores de transcripción usados son Oct3/4, Sox2 y Klf4. Un Glis1 humano (NM_147193) se presenta en la SEQ ID NO:33 y 34 (ADNc y polipéptido, respectivamente).
El ADNc que codifica para oct4 (pour5f1), sox2, klf4, c-myc (n-myc o L-myc), Glis1 y nanog humanos, sus variantes y homólgoos, puede ser clonado y expresado usando técnicas conocidas en el campo de la técnica. Usando las secuencias establecidas en la presente memoria se pueden clonar polinucleótidos que codifican uno o más factores de des-diferenciación en un vector adecuado para la expresión en un tipo celular de interés.
Una “actividad” RF (p.ej., una actividad de variante de RF) se refiere a la capacidad para des-diferenciar una célula somática cuando se expresa en combinación con otros RFs, tal como es conocido en la técnica. Por ejemplo, una variante de Oct-4 se puede evaluar en términos de actividad de Oct-4 co-expresando la variante de Oct-4 en una célula somática con kfl4, Sox-2 y c-myc y determinando si la célula somática se des-diferencia. Si la célula se des­ diferencia, entonces se puede decir que la variante de Oct-4 presenta actividad de Oct-4.
En otra realización, el replicón comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32. En otra realización adicional, el replicón comprende una secuencia que idéntica en aproximadamente el 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% a la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32, y donde cuando el replicón es transfectado en una célula somática, la célula somática es “inducida” para convertirse en una célula madre. Adicionalmente, cualquiera de SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32, donde “T” es reemplazado por “U”.
En una realización, la SEQ ID NO:29 proporciona un replicón de la descripción. En otra realización, la secuencia de la SEQ ID NO:29 tiene “T” reemplazado por “U”. El replicón comprende a Rn replicasas de VEE desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 7561, una secuencia Oct-4 humana desde el nucleótido 7592 hasta 8671, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura T2A desde el nucleótido 8678-8731, una secuencia Klf4 humana desde 8738-10147, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura E2A desde el nucleótido 10154-10213, una secuencia de Sox-2 humana desde 10223-11176, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 11195-11805, una secuencia de c-Myc humana desde 11818-13140, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 13165-13776, un gen de resistencia de puromicina desde 13777-14376, el 3'UTR y cola poli-A de VEE desde 14383­ 14510, un gen de resistencia de ampicilina desde 14679-15539 y un promotor SP6 desde 16320-16337.
En una realización, la SEQ ID NO:30 proporciona un replicón de la descripción. En otra realización, la secuencia de la SEQ ID NO:30 tiene “T” reemplazado por “U”. El replicón comprende a Rn replicasas de VEE desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 7561, una secuencia Oct-4 humana desde el nucleótido 7592 hasta 8671, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura T2A desde el nucleótido 8678-8731, una secuencia Klf4 humana desde el nucleótido 8738-10147, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura E2A desde el nucleótido 10154-10213, una secuencia de Sox-2 humana desde 10223-11176, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 11195-11805, una secuencia de c-Myc humana desde 11818-13140, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 13165-13776, un gen de resistencia de puromicina desde 13777-14376, el 3'UTR y cola poli-A de VEE desde 14383-14510, un gen de resistencia de ampicilina desde 14679-15539 y un promotor T7 desde 16319-16336.
En una realización, la SEQ ID NO:31 proporciona un replicón de la descripción. En otra realización, la secuencia de la SEQ ID NO:31 tiene “T” reemplazado por “U”. El replicón comprende a Rn replicasas de VEE desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 7561, una secuencia Oct-4 humana desde el nucleótido 7592 hasta 8671, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura T2A desde el nucleótido 8678-8731, una secuencia Klf4 humana desde el nucleótido 8738-10147, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura E2A desde el nucleótido 10154-10213, una secuencia de Sox-2 humana desde 10223-11176, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 11195-11805, una secuencia de Glis1 humana desde 11818-13680, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 13689-14300, un gen de resistencia de puromicina desde 14301-14900, el 3'UTR y cola poli-A de VEE desde 14907-15034, un gen de resistencia de ampicilina desde 15203-16063 y un promotor SP6 desde 16844-16861.
En una realización, la SEQ ID NO:32 proporciona un replicón de la descripción. En otra realización, la secuencia de la SEQ ID NO:32 tiene “T” reemplazado por “U”. El replicón comprende ARN replicasas de VEE desde el nucleótido 1 hasta aproximadamente el nucleótido 7561, una secuencia Oct-4 humana desde el nucleótido 7592 hasta 8671, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura T2A desde el nucleótido 8678-8731, una secuencia Klf4 humana desde el nucleótido 8738-10147, una secuencia codificadora para un péptido de auto-ruptura E2A desde el nucleótido 10154-10213, una secuencia de Sox-2 humana desde 10223-11176, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 11195-11805, una secuencia de Glis1 humana desde 11818-13680, un sitio de entrada de ribosoma interno desde 13689-14300, un gen de resistencia de puromicina desde 14301-14900, el 3'UTR y cola poli-A de VEE desde 14907-15034, un gen de resistencia de ampicilina desde 15203-16063 y un promotor T7 desde 16843-16860.
En otra característica de la descripción, se puede usar más de un replicón de alfavirus, comprendiendo cada replicón una o más secuencias codificadoras para factores que inducen a una célula somática a convertirse en una célula madre, donde la combinación de los más de uno replicones de alfavirus incluyen toda la secuencia codificadora correspondiente a todos los RFs necesarios para inducir la des-diferenciación en una célula madre.
En realizaciones más específicas, un replicón de alfavirus comprende secuencias codificadoras para la expresión de OCT-3/4, SOX-2, KLF, c-MYC, GLIS1 y/o NANOG. El replicón de alfavirus puede comprender secuencias codificadoras para OCT-4, KLF4, SOX-2, GLIS1 y c-MYC.
El replicón también puede ser diseñado para expresar proteínas estructurales de alfavirus. Las Patentes de EE.UU. n° 7.045.335, 7.078.218, 7.425.337 y 7.442.381 describen numerosas construcciones para dichos replicones de ARN que consisten en las secuencias de reconocimiento de replicación de alfavirus 5' y 3', las secuencias codificadoras para proteínas no estructurales de alfavirus, y un tracto de poliadenilación. Los replicones de ARN de alfavirus pueden contener una o más mutaciones atenuantes, siendo una mutación atenuante una eliminación, adición o sustitución de uno o más nucleótido(s), o una mutación que comprende el reordenamiento o la construcción quimérica que da como resultado una pérdida de la virulencia en un virus vivo que contiene la mutación en comparación con el alfavirus natural apropiado.
Los términos “proteína(s) estructural(es) de alfavirus” se refieren a una, o una combinación de proteínas estructurales codificadas por alfavirus. Éstas son producidas por el virus como una poliproteína y se representan generalmente en la bibliografía como C-E3-E2-6k-E1. E3 y 6k actúan como señales de traslocalización/transporte de membrana para las dos glicoproteínas, E2 y E1. De esta manera, el uso del término E1 en la presente memoria se puede referir a E1, E3-E1, 6k-E1 o E3-6k-E1, y el uso del término E2 en la presente memoria se puede referir a E2, E3-E2, 6k-E2 o E3-6k-E2. Se pueden introducir mutaciones atenuantes en una cualquiera o más de las proteínas estructurales del alfavirus.
Adicionalmente, y como se ha mencionado anteriormente, los homólogos de enzimas útiles para generar metabolitos son contemplados entre los microorganismos y métodos proporcionados en la presente memoria. El término “homólogos” usado en relación a una enzima o gen original de una primera familia o especie se refiere a distintas enzimas o distintos genes de una segunda familia o especie que son determinados a través de análisis funcional, estructural o genómico para ser una enzima o gen de la segunda familia o especie que corresponde a la enzima o gen originales de la primera familia o especie. Lo más habitual es que los homólogos tengan similitudes funcionales, estructurales o genómicas. Se conocen las técnicas mediante las cuales los homólogos de una enzima o gen pueden ser clonados fácilmente usando sondas genéticas y PCR. La identidad de las secuencias clonadas como homólogas se puede confirmar usando ensayos funcionales y/o mediante mapeado genético de los genes.
Una proteína tiene “homología” o es “homóloga” respecto a una segunda proteína si la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína tiene una secuencia similar a la secuencia de ácido nucleico que codifica la segunda proteína. Alternativamente, una proteína tiene homología respecto a una segunda proteína si las dos proteínas tienen secuencias de aminoácido “similares”. (Por tanto, el término “proteínas homólogas” se define con el significado de que las dos proteínas tienen secuencias de aminoácido similares).
Tal como se usa en la presente memoria, dos proteínas (o una región de las proteínas) son sustancialmente homólogas cuando las secuencias de aminoácido tienen una identidad de al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácido, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias son alineadas con el objetivo de una comparación óptima (p.ej., se pueden introducir huecos en una o en ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para un alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas se pueden descartar para los fines de comparación). La longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos puede ser de al menos el 30%, típicamente al menos el 40%, más típicamente al menos el 50%, incluso más típicamente al menos el 60%, e incluso más típicamente al menos el 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Entonces se comparan los residuos de aminoácido o los nucleótidos de las correspondientes posiciones de aminoácido y de nucleótido. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente de la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas para dicha posición (tal como se usa en la presente memoria la “ identidad” de aminoácido o de ácido nucleico es equivalente a “homología” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.
Cuando se usa “homólogo” en referencia a proteínas o péptidos, se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas a menudo difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una “sustitución de aminoácido conservativa” es aquella en la que un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (p.ej., carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácido difieren entre ellas en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de homología puede ajustarse al alza para incluir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para realizar dicho ajuste son bien conocidos por los especialistas en la técnica (véase, p.ej., Pearson et al., 1994).
Una “sustitución de aminoácido conservativa” es aquella en la que el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Dichas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p.ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p.ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p.ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (p.ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p.ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Los siguientes seis grupos contienen todos aminoácidos que son sustituciones conservativas entre ellos: 1) Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Alanina (A), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
La homología de secuencia para polipéptidos, que también se puede referir como porcentaje de identidad de secuencia, se mide típicamente usando un software de análisis de secuencia. Véase, p.ej., el “Sequence Analysis Software Package” del “Genetics Computer Group (GCG)”, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705. El software de análisis de proteínas coteja secuencias similares usando la medida de la homología asignada a las diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo las sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como “Gap” y “Bestfit” que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tal como los polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Véase, p.ej., GCG Versión 6.1.
Un algoritmo típico usado para comparar una secuencia molecular con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos es el programa de ordenador BLAST (Altschul, 1990; Gish, 1993; Madden, 1996; Altschul, 1997; Zhang, 1997), especialmente blastp o tblastn (Altschul, 1997). Los parámetros típicos para BLASTp son: valor de expectación: 10 (por defecto); Filtro: seg (por defecto); Coste para abrir un hueco: 11 (por defecto); Coste para extender un hueco: 1 (por defecto); Alineaciones máximas: 100 (por defecto); Tamaño de la palabra: 11 (por defecto); N° de descripciones: 100 (por defecto); Matriz de penalización: BLOWSUM62.
Cuando se hace una búsqueda en una base de datos que contiene secuencias procedentes de un gran número de organismos diferentes, es típico comparar secuencias de aminoácido. Las búsquedas en bases de datos con secuencias de aminoácido se pueden medir mediante algoritmos diferentes a blastp conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden comparar secuencias de polipéptido con FASTA, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, 1990). Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácido se puede determinar usando FASTA con sus parámetros por defecto (con un tamaño de palabra de 2 y con la matriz de puntuación PAM250), según se proporciona en GCG Versión 6.1.
Tal como se describe en la presente memoria, las composiciones y métodos de la descripción proporcionan la capacidad de des-diferenciarse a células somáticas para formar células madre (p.ej., inducir la formación de células madre). Las células madre son células capaces de diferenciación en otros tipos de células, que incluyen aquellas que tienen una función especializada particular (p.ej., células específicas de tejido, células parenquimales y progenitoras de las mismas). Existen diversas clases de células madre, que pueden caracterizarse por su capacidad para diferenciarse en un tipo de célula/tejido deseado. Por ejemplo, las “células progenitoras” pueden ser multipotentes o pluripotentes. Las células progenitoras son células que dan lugar a diferentes tipos de células terminalmente diferenciadas, y células que son capaces de dar lugar a diversas células progenitoras. El término “pluripotente” o “pluripotencia” se refiere a células con la capacidad para dar lugar a células de progenie que pueden someterse a diferenciación, en las condiciones apropiadas, en tipos de células que colectivamente demuestran características asociadas con los linajes celulares de todas las tres capas germinales (endoderma, mesoderma y ectoderma). Las células madre pluripotentes pueden contribuir a todos los tejidos derivados embrionarios de un animal prenatal, postnatal o adulto. Un ensayo estándar aceptado en la técnica, tal como la capacidad para formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad, se puede usar para establecer la pluripotencia de una población de células; sin embargo, la identificación de diversas características de las células madre pluripotentes también puede usarse para detectar células pluripotentes. “Características de células madre pluripotentes” se refiere a las características de una célula que distinguen a las células madre pluripotentes de otras células. La capacidad para dar lugar a progenie que puede someterse a diferenciación, en las condiciones apropiadas, en tipos de células que colectivamente demuestran características asociadas con los linajes celulares de las tres capas germinales (endoderma, mesoderma y ectoderma) es una característica de célula madre pluripotente. La expresión o no expresión de determinadas combinaciones de marcadores moleculares también son características de células madre pluripotentes. Por ejemplo, las células madre pluripotentes humanas expresan al menos alguno, y en algunas realizaciones todos, los marcadores de la siguiente lista no limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-caderina, UTF-1, Oct4, Rex1 y Nanog. Las morfologías celulares asociadas a las células madre pluripotentes son también características de células madre pluripotentes. En comparación, una célula madre pluripotente es capaz de diferenciarse en un subconjunto de células en comparación con una célula madre pluripotente. Por ejemplo, una célula madre multipotente puede ser capaz de someterse a diferenciación en una o dos de las tres capas germinales. Tal como se usa en la presente memoria, “células no pluripotentes” se refiere a células de mamífero que no son células pluripotentes. Los ejemplos de dichas células incluyen células diferenciadas, así como células multipotentes. Los ejemplos de células diferenciadas incluyen, aunque sin limitación, células de un tejido seleccionado entre médula ósea, piel, músculo esquelético, tejido graso y sangre periférica. Los ejemplos de tipos celulares incluyen, aunque sin limitación, fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos y células T.
Otra clase de células incluso más primitiva (es decir, no comprometidas para un destino de diferenciación particular) que las células madre pluripotentes son las denominadas células madre “totipotente” (p.ej., ovocitos fertilizados, células de embriones en los estadios de desarrollo de dos y cuatro células), que tienen la capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de células de la especie particular. Por ejemplo, una única célula madre totipotente podría dar lugar a un animal completo, así como a cualquiera de la miríada de tipos celulares que se dan en la especie particular (p.ej., humanos).
Las células madre pluripotentes son un tipo de células que se someten a una auto-renovación a la vez que mantienen la capacidad de dar lugar a todos los tejidos derivados de las tres capas germinales y a todos los linajes de células germinales. Aunque las células madre embrionarias humanas (hES) pluripotentes derivadas de blastocitos humanos son una fuente prometedora para las terapias basadas en células para tratar enfermedades y trastornos tales como la enfermedad de Parkinson, el infarto de miocardio, la lesión de médula espinal, y la diabetes mellitus, su potencial clínico está limitado por su inmunogenicidad y por preocupaciones éticas.
El término “célula precursora”, “célula progenitora” y “célula madre” se usan de forma intercambiable en la técnica y en la presente memoria y se refieren a una célula pluripotente, o sin linaje comprometido, progenitora, que es potencialmente capaz de un número ilimitado de divisiones mitóticas para renovar su línea o para producir células de progenie que se diferenciarán en fibroblastos o en una célula progenitora de linaje comprometido y su progenie, que es capaz de auto-renovación y es capaz de diferenciarse en un tipo celular parenquimal. Al contrario que las células madre pluripotentes, las células progenitoras de linaje comprometido generalmente se consideran incapaces de dar lugar a numerosos tipos celulares que difieren unos de otros fenotípicamente. En su lugar, dan lugar a uno o posiblemente dos tipos celulares de linaje comprometido.
La descripción demuestra que células humanas terminalmente diferenciadas (p.ej., fibroblastos dérmicos humanos) pueden ser inducidas a des-diferenciarse usando un sistema de expresión de ARNm ectópico (p.ej., un sistema de replicón). La descripción contempla el uso de una variedad de secuencias codificadoras de des-diferenciación (también denominadas Factores de Reprogramación (RFs)) que comprenden, por ejemplo, un polinucleótido que codifica KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC (L-MYC), GLIS1, NAn OG o cualquier combinación de los mismos (p.ej., KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC (L-Myc) y opcionalmente NANOG). La des-diferenciación se puede lograr poniendo en contacto la célula, in vivo o in vitro, con uno o más vectores de ARN auto-replicantes que permanecen ectópicos para el genoma de la célula hospedante y codifican factores que inducen la des-diferenciación. El vector de ARN autoreplicante ectópico de la descripción puede ser controlado cultivando una célula hospedante transformada con el vector de ARN auto-replicante en presencia de B18R. Los métodos para promover la des-diferenciación proporcionan métodos para promover la regeneración de células y tejidos de mamífero dañados por lesión o enfermedad. La descripción también proporciona métodos para enriquecer células madre inducidas y poblaciones que comprenden dichas células madre enriquecidas.
La generación de células madre pluripotentes específicas de paciente tiene el potencial de acelerar drásticamente la implementación de células madre en usos clínicos para tratar enfermedades degenerativas. La descripción proporciona métodos para emplear fácilmente células estromales donadas, tal como fibroblastos dérmicos, de un paciente y generar células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPS o iPS) mediante expresión ectópica de un conjunto de factores de des-diferenciación que comprende ARN que codifica (i) KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC (L-Myc), NANOG o cualquier combinación de los mismos; (ii) Kl F4, OCT4, SOX2 y GLIS1; y (iii) KLF4, OCT4, SOX2 y NANOG. Las líneas celulares generadas son fisiológica y morfológicamente indistinguibles de las células madre embrionarias humanas (HESC) generadas a partir de la masa celular interior de un embrión humano. Las células hiPS comparten un perfil de expresión génica casi idéntico a dos líneas de HESC establecidas.
El término “des-diferenciación” es familiar para la persona especialista en el campo de la técnica. En general, des­ diferenciación significa la regresión de la célula de linaje comprometido al estatus de una célula madre, por ejemplo, “induciendo” un fenotipo des-diferenciado. Por ejemplo, como se describe adicionalmente en la presente memoria, KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, Gl iS1 y/o Nanog pueden inducir la des-diferenciación y la inducción de mitosis en células inhibidas mitóticamente de linaje comprometido.
En una realización, la descripción proporciona un cultivo celular que comprende células somáticas humanas que han sido transformadas con un replicón de la descripción. En una realización, las células somáticas son fibroblastos. Las células somáticas también pueden ser queratinocitos. En otra realización, el replicón comprende una secuencia que es idéntica en un 90%, 95%, 98%, 99% o 100% a la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32 desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 7561 (incluyendo donde “T” de la secuencia puede ser sustituido por “U”), seguido de dos o más RFs seleccionados del grupo que consiste en Oct-3/4, Sox-2, Klf4, c-Myc, Nanog y Glis1, seguido de un 3'UTR y cola poliA de VEE. Las más de una secuencias codificadoras de RF pueden estar separadas por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) o por un promotor pequeño (p.ej., un núcleo) tal como SP1. El orden de los RFs no es crítico para la descripción; por tanto, el orden puede ser Klf4, Oct-3/4, Sox-2, c-Myc, o puede ser Sox-2, Klf4, Oct-3/4, c-Myc, u Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc, o cualquier variación del orden de los RFs. En una realización, el replicón comprende una secuencia que es idéntica al menos aproximadamente en un 95%, 98%, 99% o 100% a una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32. En otra realización adicional, las células son cultivadas en medio acondicionado que comprende B18R y/o son co-transformadas con un polinucleótido que codifica B18R.
La descripción también proporciona métodos para fabricar una célula madre a partir de una célula somática, que comprenden la transformación de la célula somática con un replicón de ARN como se describe en la descripción, y cultivar la célula somática en las condiciones que promueven la expresión de secuencias codificadoras en el replicón, y cultivar las células durante un periodo de tiempo suficiente para des-diferenciar las células en células madre. En una realización, las células son sometidas a pasaje al menos 5, 10, 15, 20 o más veces. En otra realización, las células son cultivadas durante al menos 10, 20, 30 o más días. En otra realización adicional, las células son cultivadas en medio acondicionado que comprende B18R o son co-transformadas con un polinucleótido que codifica B18R.
La descripción también proporciona cultivos de células madre inducidas obtenidos mediante los métodos descritos en la presente memoria. Las células madre pueden no contener ninguno de los factores RF en el ADN genómico de la célula. Las células madre pueden no contener ningún ADN o ARN retroviral (p.ej., células madre que están libres de ADN o ARN retroviral).
En una realización, la descripción proporciona células madre inducidas aisladas, individualmente o en poblaciones. El término “aisladas” o “purificadas” cuando se refiere a células madre de la descripción significa células que están sustancialmente libres de células que portan marcadores asociados con la dedicación de linaje. Las células madre pluripotentes inducidas humanas pueden estar libres de dichos tipos celulares contaminantes en al menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%. Las células madre aisladas también pueden estar sustancialmente libres de moléculas solubles naturales. Tal como se discute más detalladamente a continuación, una célula madre sustancialmente purificada de la descripción puede obtenerse, por ejemplo, mediante extracción (p.ej., vía centrifugación de gradiente de densidad y/o citometría de flujo) de una fuente de cultivo. La pureza se puede medir mediante cualquier método apropiado. Una célula madre de la descripción puede purificarse al 99%-100%, por ejemplo, mediante citometría de flujo (p.ej., análisis FACS), tal como se discute en la presente memoria. Dichas células iPS purificadas carecerán de a Dn o ARN retroviral alguno.
La descripción también proporciona una población enriquecida de células madre inducidas. Una “población enriquecida de células madre inducidas” es aquella en la que las células madre inducidas de la descripción han sido separadas parcialmente de otros tipos de células, de tal modo que la población resultante de células tiene una mayor concentración de células madre inducidas que la población original de células. La población enriquecida de células madre inducidas puede presentar una concentración de células madre inducidas que es aproximadamente 10 veces, 100 veces, 500 veces, 1000 veces, 2000 veces, 3000 veces, 4000 veces, 5000 veces, 6000 veces, 7000 veces, 8000 veces, 9000 veces o 10000 veces o más que la que tenía la población original antes de la separación. Las células madre inducidas de la descripción, por ejemplo, pueden suponer al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 35%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más de la población enriquecida de células madre. La población enriquecida de células madre inducidas puede obtenerse, por ejemplo, seleccionando contra células que presentan marcadores asociados a células diferenciadas, u otros tipos celulares no deseados, y/o seleccionando para células que presentan marcadores (p.ej., TRA-1-81 y/o TRA-1-60) asociados a células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción, y/o regenerando células madre aisladas en sistemas de cultivo definidos. Alternativamente, o adicionalmente, el enriquecimiento para la expresión de un marcador, la pérdida de expresión de un marcador también pueden usarse para el enriquecimiento. Dichas células iPS enriquecidas carecerán del ARN o ADN retroviral típicamente usado para transformar células con RFs.
La descripción también proporciona líneas celulares de células madre inducidas. Tal como se usa en la presente memoria, una “línea celular” significa un cultivo de células madre de la descripción, o células de progenie de las mismas, que pueden ser reproducidas durante un periodo de tiempo extendido, preferiblemente de forma indefinida, término que incluye, por ejemplo, células que son cultivadas, criopreservadas y re-cultivadas siguiendo la criopreservación. Tal como se usa en la presente memoria, un “cultivo” significa una población de células madre inducidas crecidas en un medio y opcionalmente sometidas al correspondiente pasaje. Un cultivo de células madre puede ser un cultivo primario (p.ej., un cultivo que no ha sido sometido a pasaje) o puede ser un cultivo secundario o posterior (p.ej., una población de células que ha sido subcultivada o sometida a pasaje una o más veces).
La descripción también proporciona células que son des-diferenciadas en células madre (es decir, células madre inducidas) que comprenden características que incluyen la capacidad de auto-renovación y diferenciación en mesoderma, endoderma y epiderma, donde las células des-diferenciadas pueden ser producidas mediante expresión de uno o más RFs ectópicos para el genoma celular del hospedante usando un vector de ARN replicante. El vector de replicón puede ser derivado de un alfavirus (p.ej., virus de encefalitis equina venezolana).
Los usos terapéuticos de las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción incluyen el trasplante de las células madre pluripotentes inducidas humanas, de poblaciones de células madre, o de su progenie, en individuos para tratar una variedad de estados patológicos que incluyen enfermedades y trastornos que son resultado de cánceres, neoplasmas, lesiones, infecciones víricas, diabetes, etcétera. Las células madre o las poblaciones de células madre (que incluyen células madre alteradas genéticamente) son introducidas en un sujeto que necesite dichas células madre o su progenie, o que necesite un KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG, GLIS1 o cualquier combinación de las mismas, proteína o molécula codificada o producida por la célula genéticamente alterada. Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas humanas se pueden administrar a pacientes de cáncer que han sido sometidos a una quimioterapia que ha matado, reducido o dañado células madre u otras células de un sujeto, donde las células madre inducidas reemplazan a las células dañadas o muertas. En otro ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas humanas pueden ser transfectadas o transformadas (además de los factores de des­ diferenciación) con al menos un factor terapéutico adicional. Por ejemplo, una vez que las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción son aisladas u obtenidas mediante los métodos de la descripción, las células madre pueden ser transformadas con un polinucleótido que codifica un polipéptido terapéutico. Dicho método y composiciones pueden proporcionar biorreactores de células madre para la producción de un polipéptido deseado o pueden usarse para la administración génica o la terapia génica. En este ejemplo, las células iPS pueden ser aisladas, transformadas con un polinucleótido que codifica un polipéptido terapéutico y a continuación pueden ser implantadas o administradas a un sujeto, o pueden ser diferenciadas en un tipo celular deseado e implantadas y administradas al sujeto. En estas condiciones, el polinucleótido es expresado en el interior del sujeto para la administración del polipéptido producido.
Si las células humanas son derivadas de una fuente heteróloga (no autóloga/alogénica) con respecto al sujeto receptor, típicamente se administra una terapia de inmunosupresión concomitante, p.ej., la administración del agente inmunosupresor ciclosporina o FK506. Sin embargo, debido al estado inmaduro de las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción, dicha terapia inmunosupresora puede no ser requerida. Por consiguiente, las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción pueden administrarse a un receptor en ausencia de terapia inmunomoduladora (p.ej., inmunosupresora). Alternativamente, las células pueden encapsularse en una membrana, que permite el intercambio de fluidos pero evita el contacto célula/célula. El trasplante de células microencapusladas es conocido en la técnica, p.ej., Balladur et al., 1995, Surgery 117: 189-94, 1995; y Dixit et al., 1992, Cell Transplantation 1: 275-79.
Las células pueden introducirse directamente en la sangre periférica o pueden depositarse en otras localizaciones del cuerpo, p.ej., en un tejido deseado, o en partículas microportadoras en el peritoneo. Por ejemplo, se pueden trasplantar de 102 a 109 células en un único procedimiento, y según se requiera se pueden realizar trasplantes adicionales.
La diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas humanas o la des-diferenciación de células de linaje comprometido (mitóticamente inhibidas) puede ser inducida ex vivo, o alternativamente puede ser inducida por contacto con tejido in vivo, (p.ej., por contacto con fibroblastos o componentes de la matriz celular). Opcionalmente, se puede co-administrar o administrar posteriormente al sujeto un agente diferenciador o un agente de des­ diferenciación (p.ej., KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MyC, NANOG, GLIS1, o cualquier combinación de los mismos, o un agonista de los mismos).
Se ha demostrado previamente que el trasplante de células de isleta beta proporciona una terapia para pacientes con diabetes (Shapiro et al., 2000). Las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción proporcionan una fuente alternativa de células de isleta para prevenir o tratar la diabetes. Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas de la descripción se pueden generar, aislar y diferenciar en un tipo celular pancreático y administrarse a un sujeto. Alternativamente, las células madre pluripotentes inducidas pueden administrarse al páncreas del sujeto y diferenciarse en células de isleta in vivo. Por consiguiente, las células son útiles para el trasplante con el objetivo de prevenir o tratar la aparición de diabetes.
La descripción contempla que se pueden usar los métodos in vitro descritos en la presente memoria para el trasplante autólogo de células des-diferenciadas o re-diferenciadas (p.ej., las células son recolectadas y devueltas al mismo individuo). La descripción contempla además que los métodos in vitro descritos en la presente memoria puedan usarse para trasplantes no autólogos. En un ejemplo, el trasplante se produce entre un donante y un receptor relacionados genéticamente. En otro ejemplo, el trasplante se produce entre un donante y un receptor no relacionados genéticamente. En cualquiera de los ejemplos anteriores, la descripción contempla que las células des-diferenciadas pueden expandirse en cultivo y almacenarse para una posterior recuperación y uso. De forma similar, la descripción contempla que las células re-diferenciadas pueden expandirse en cultivo y almacenarse para una posterior recuperación y uso.
Las composiciones y métodos de la descripción pueden aplicarse a un procedimiento en el que células diferenciadas (de linaje comprometido) son retiradas de un sujeto, des-diferenciadas en cultivo, y a continuación reintroducidas en dicho individuo o, estando aún en cultivo, ser manipuladas para re-diferenciarse siguiendo rutas de diferenciación específicas (p.ej., células pancreáticas, células neuronales, células hepáticas, células cutáneas, células cardiovasculares, células gastrointestinales, etc.). Dichas células re-diferenciadas pueden introducirse entonces en el individuo. Por ejemplo, se pueden extraer fibroblastos diferenciados, des-diferenciarlos (p.ej., mediante expresión ectópica de un replicón de la descripción que comprende KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, GLIS1, NANOG o cualquier combinación de los mismos) y expandirlos mitóticamente y a continuación re-diferenciarlos (p.ej., con un antagonista de KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NAnOg, GLIS1, o cualquier combinación de los mismos) o con factores (que incluyen estímulos físicos) que se sepa que producen la diferenciación de hESCs hasta una ruta de linaje comprometido. El método puede comprender la extracción de células diferenciadas de un sujeto lesionado o enfermo. Las células des-diferenciadas procedentes de células tomadas de un sujeto lesionado pueden devolverse posteriormente al sujeto lesionado o enfermo para tratar una lesión o una enfermedad degenerativa. Las células des-diferenciadas pueden reintroducirse en el sitio de la lesión, o las células pueden reintroducirse en un sitio distante de la lesión. De forma similar, las células se pueden recolectar a partir de un sujeto lesionado, des-diferenciarse in vitro, re-diferenciarse in vitro, y trasplantarse de vuelta al sujeto para tratar una lesión o una enfermedad degenerativa.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción pueden ser aisladas de una muestra obtenida de un sujeto mamífero. El sujeto puede ser cualquier mamífero (p.ej., bovino, ovino, porcino, canino, felino, equino, primate), que incluye un humano. La muestra de células puede obtenerse de cualquiera de una serie de fuentes diferentes que incluyen, por ejemplo, médula ósea, tejido fetal (p.ej., tejido hepático fetal), sangre periférica, sangre del cordón umbilical, páncreas, etc.
La descripción también proporciona métodos para establecer y/o mantener poblaciones de células madre, o su progenie, así como poblaciones mixtas que comprenden tanto células madre como células de progenie, y las poblaciones de células así producidas. Como con las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción, una vez que un cultivo de células o un cultivo mixto de células madre es establecido, la población de células es expandida mitóticamente in vitro mediante pasaje a medio fresco, puesto que la densidad celular dicta las condiciones que conducen a la proliferación celular, con o sin formación de tejido. Dichos métodos de cultivo pueden incluir, por ejemplo, el pasaje de células en medio de cultivo que carece de determinados factores de crecimiento que inducen la diferenciación (p.ej., IGF, EGF, FGF, VEGF, y/u otro factor de crecimiento), en presencia de un agente que estimula (p.ej., un agonista) KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG, GLIS1 o cualquier combinación de los mismos, en presencia de KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG, Glis1 o cualquier combinación de los mismos, o cualquier combinación de los anteriores. Los cultivos que comprenden fibroblastos y células de tipo fibroblasto que comprenden células madre y células de fibroblasto pueden ser transferidos a medio fresco cuando se alcanza una densidad celular suficiente. Algunos tipos de células madre no demuestran el típico contacto de inhibición-apoptosis o se vuelven quiescentes cuando la densidad es máxima. Por consiguiente, se pueden usar técnicas de pasaje apropiadas para reducir la inhibición por contacto y la quiescencia, por ejemplo, transfiriendo una porción de las células a un nuevo recipiente de cultivo con medio fresco. Dicha eliminación o transferencia se puede realizar en cualquier recipiente de cultivo.
Una vez que las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción han sido establecidas en cultivo, como se ha descrito anteriormente, pueden ser mantenidas o almacenadas en “bancos” celulares que comprenden cultivos in vitro continuos de células que requieren una transferencia regular o como células que han sido criopreservadas.
La criopreservación de células madre, o de otras células de la descripción, se puede llevar a cabo según métodos conocidos, tales como los descritos en Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester. Por ejemplo, aunque no a modo de limitación, las células pueden ser suspendidas en un “medio de congelación” tal como, por ejemplo, medio de cultivo que además comprende 15-20% de suero fetal bovino (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), con o sin 5-10% de glicerol, a una densidad, por ejemplo, de aproximadamente 4-10 x 106 células/mL. Las células fueron dispensadas en viales de vidrio o plástico, que a continuación fueron sellados y transferidos a una cámara de congelación de un congelador programable o pasivo. La velocidad óptima de congelación puede determinarse empíricamente. Por ejemplo, se puede usar un programa de congelación que proporciona un cambio en la temperatura de -1 °C/min a lo largo del calor de fusión. Una vez que los viales que contienen las células han alcanzado los -80 °C, son transferidos a un área de almacenamiento en nitrógeno líquido. Las células criopreservadas se pueden almacenar durante un periodo de años, aunque deberían ser comprobadas al menos cada 5 años para mantenimiento de la viabilidad.
Las células criopreservadas de la descripción constituyen un banco de células, de las que se pueden retirar porciones mediante descongelación y a continuación usarse para producir un cultivo de células madre que comprende células madre, según se necesite. La descongelación generalmente debería llevarse a cabo rápidamente, por ejemplo, transfiriendo un vial desde el nitrógeno líquido hasta un baño de agua a 37 °C. El contenido descongelado del vial debería ser transferido inmediatamente en condiciones estériles a un recipiente de cultivo que contenga el medio apropiado. Es aconsejable que las células del medio de cultivo sean ajustadas a una densidad inicial de aproximadamente 1-3 x 105 células/mL. Una vez en el cultivo, las células se pueden examinar diariamente, por ejemplo, con un microscopio invertido, para detectar la proliferación celular, y se pueden subcultivar tan pronto como alcancen una densidad apropiada.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción se pueden retirar de un banco celular según se necesiten, y usarse para la producción de nuevas células madre, tanto in vitro, por ejemplo, como un cultivo de tejido tridimensional, como se describe más adelante, como in vivo, por ejemplo, mediante la administración directa de células al sito en el que se necesitan los fibroblastos o el tejido. Tal como se describe en la presente memoria, las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción se pueden usar para producir nuevo tejido para uso en un sujeto, donde las células han sido aisladas originalmente de la propia sangre de dicho sujeto, o de otro tejido (es decir, células autólogas). Alternativamente, las células de la descripción se pueden usar como células donantes ubicuas para producir nuevo tejido para uso en cualquier sujeto (es decir, células heterólogas).
Una vez establecido, un cultivo de células madre puede usarse para producir células de progenie y/o fibroblastos capaces de producir nuevo tejido. La diferenciación de células madre en fibroblastos u otros tipos de células, seguida de la producción de tejido a partir de las mismas, se puede activar mediante factores de crecimiento exógenos específicos, o cambiando las condiciones de cultivo (p.ej., la densidad) de un cultivo de células madre. Puesto que las células son pluripotentes, pueden usarse para reconstituir un sujeto irradiado y/o un sujeto tratado con quimioterapia; o como fuente de células para linajes específicos, facilitando su maduración, proliferación y diferenciación en uno o más linajes seleccionados. Los ejemplos de factores que pueden usarse para inducir la diferenciación incluyen eritropoyetina, factores estimulantes de colonia, p.ej., GM-CSF, G-CSF o M-CSF, interleucinas, p.ej., IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, etcétera, factor inhibidor de leucemia (LIF), factor Steel (Stl), o similares, cocultivar con células de tejido comprometido, u otros tipos de células de linaje comprometido para inducir a las células madre para que se conviertan en comprometidas para un linaje particular.
En otro ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas humanas pueden ser modificadas genéticamente para expresar genes para tipos específicos de factores de crecimiento para una diferenciación exitosa y/o mejorada en fibroblastos, otras células estromales, o células parenquimales y/o el reemplazo tanto pre- como post-implantación.
Las células de la descripción se pueden usar para tratar sujetos que requieren la reparación o el reemplazo de tejido como consecuencia de una enfermedad o un trauma. El tratamiento puede contemplar el uso de las células de la descripción para producir nuevo tejido, y el uso del tejido así producido, según cualquier método conocido actualmente en la técnica o para ser desarrollado en el futuro. Por ejemplo, las células inducidas (p.ej., células que comprenden un vector de expresión ectópico que expresa KLF4, OCt 4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-m Yc , NANo G, Glis1 o cualquier combinación de los mismos) de la descripción se puede implantar, inyectar o administrar de otro modo directamente al sitio del tejido dañado, de tal modo que producirá in vivo nuevo tejido. En un ejemplo, la administración incluye la administración de células madre modificadas genéticamente.
En un ejemplo, una formulación que comprende las células de la descripción se prepara para inyección directamente al sitio en el que se desea la producción de nuevo tejido. Por ejemplo, y no a modo de limitación, las células de la descripción se pueden suspender en una disolución de hidrogel para inyección. Alternativamente, la disolución de hidrogel que contiene las células se puede dejar endurecer, por ejemplo, en un molde para formar una matriz que tenga las células dispersas en ella antes de la implantación. Una vez que la matriz se ha endurecido, las formaciones celulares se pueden cultivar de tal modo que las células se expanden mitóticamente antes del implante. Un hidrogel es un polímero orgánico (natural o sintético) que está reticulado vía enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura abierta tridimensional, que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Los ejemplos de materiales que pueden usarse para formar un hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato y sales del mismo, polifosfazinas y poliacrilatos, que son reticulados iónicamente, copolímeros de bloque de óxido de polietilenopolipropilen glicol que son reticulados mediante temperatura o pH, respectivamente. Los métodos de síntesis de los materiales de hidrogel, así como los métodos para preparar dichos hidrogeles, son conocidos en la técnica.
Dichas formulaciones celulares pueden comprender además uno o más componentes adicionales, que incluyen componentes de matriz extracelular seleccionados, tales como uno o más tipos de colágeno conocidos en la técnica, y/o factores de crecimiento y fármacos. Los factores de crecimiento que pueden ser incorporados de forma útil en la formulación celular incluyen uno o más factores de crecimiento de tejido conocidos en la técnica tales como, aunque sin limitación, cualquier miembro de la familia TGF-p, IGF-I y -II, hormona de crecimiento, BMPs tales como BMP-13, y similares. Alternativamente, las células de la descripción pueden ser modificadas genéticamente para expresar y producir factores de crecimiento tales como BMP-13 o TGF-p. También se pueden incluir otros componentes en la formulación, que incluyen, por ejemplo, tampones para proporcionar el pH y la isotonicidad apropiados, lubricantes, materiales viscosos para retener las células en el sitio de administración o en las proximidades (p.ej., alginatos, agares y gomas vegetales) y otros tipos de células que pueden producir un efecto deseado en el sitio de administración (p.ej., potenciamiento o modificación de la formación de tejido o de sus características fisicoquímicas, soporte para la viabilidad de las células, o inhibición de la inflamación o del rechazo). Las células pueden ser cubiertas con un recubrimiento apropiado para heridas para evitar que las células se alejen del sitio. Dichos recubrimientos para heridas son bien conocidos por los especialistas en la técnica.
Alternativamente, las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción se pueden sembrar en una estructura tridimensional y cultivarse para permitir que las células se diferencien, crezcan y rellenen la matriz o sean implantadas in vivo inmediatamente, donde las células sembradas proliferarán sobre la superficie de la estructura y formarán tejido de reemplazo in vivo en cooperación con las células del sujeto. Dicha estructura puede ser implantada en combinación con un factor de crecimiento cualquiera, o más de uno, fármacos, tipos de células adicionales, u otros componentes que estimulan la formación, o potencian o mejoran de algún otro modo la práctica de la descripción.
En otro ejemplo adicional, las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción pueden usarse en conjunción con un sistema de cultivo tridimensional en un “biorreactor” para producir construcciones de tejido que poseen las propiedades bioquímicas, físicas y estructurales críticas del tejido humano nativo cultivando las células y el tejido resultante en las condiciones ambientales que se experimentan habitualmente por parte del tejido nativo. El biorreactor puede incluir una serie de diseños. Típicamente, las condiciones de cultivo incluirán aplicar un estrés fisiológico sobre la construcción que contiene las células que sea similar al que encontrarán in vivo.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas, su progenie, y el tejido de la descripción se pueden usar en una variedad de aplicaciones. Éstas incluyen, aunque sin limitación, trasplante o implante de las células en una forma diferenciada, una forma no diferenciada, una forma des-diferenciada. Dichas células y tejidos sirven para reparar, reemplazar o aumentar el tejido que ha sido dañado debido a enfermedad o trauma, o que ha fallado en desarrollarse con normalidad.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas y el tejido producido según la descripción puede usarse para reparar o reemplazar tejido dañado o destruido o para aumentar el tejido existente.
Adicionalmente, las células o el tejido de la descripción pueden usarse, por ejemplo, para cribar in vitro en términos de eficacia y/o citotoxicidad de los compuestos, alérgenos, factores de crecimiento/reguladores, compuestos farmacéuticos, etcétera, en células madre, para elucidar el mecanismo de determinadas enfermedades determinando cambios en la actividad biológica de las células madre (p.ej., cambios en la expresión o la actividad, la capacidad proliferativa, la adhesión de KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, Na No G, Glisl o cualquier combinación de los mismos), para estudiar el mecanismo mediante el cual los fármacos y/o factores de crecimiento operan para modular la actividad biológica de las células madre (p.ej., la expresión o actividad de KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG, Glis1 o cualquier combinación de los mismos), para diagnosticar y monitorizar el cáncer en un paciente, para terapia génica, administración de genes o administración de proteínas; y para producir productos biológicamente activos.
Las células madre pluripotentes inducidas humanas también se pueden usar en el aislamiento y evaluación de factores asociados con la diferenciación y maduración de células madre. De esta manera, las células madre pluripotentes inducidas humanas se pueden usar en ensayos para determinar la actividad de los medios, la implicación con dedicación de linajes particulares, o similares. Son aplicables varios sistemas y se pueden diseñar para inducir la diferenciación de las células madre pluripotentes inducidas humanas empleando diversos tipos de estrés fisiológico.
Las células madre humanas pluripotentes inducidas humanas, su progenie, y los tejidos derivados de las mismas de la descripción se pueden usar in vitro para cribar una amplia variedad de agentes en términos de su efectividad y citotoxicidad de agentes farmacéuticos, factores de crecimiento/reguladores, agentes anti-inflamatorios, y similares. Para este fin, las células o cultivos de tejido de la descripción se pueden mantener in vitro y ser expuestos al agente que va a ser evaluado. La actividad de un agente citotóxico se puede medir por su capacidad de dañar o matar células madre o su progenie en cultivo. Esto se puede determinar fácilmente mediante técnicas de tinción. El efecto de los factores de crecimiento/reguladores se puede determinar analizando el número de células vivas in vitro, p.ej., mediante recuentos celulares totales, y mediante recuentos celulares diferenciales. Esto se puede llevar a cabo usando técnicas citológicas y/o histológicas estándar, que incluyen el uso de técnicas inmunocitoquímicas que emplean anticuerpos que definen antígenos celulares específicos de tipo. El efecto de diversos fármacos sobre las células de la descripción se puede determinar en un cultivo en suspensión o en un sistema tridimensional. En un ejemplo se puede analizar el efecto de un agente de ensayo sobre las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción.
Las células madre que expresan un producto génico de interés, o tejido producido in vitro a partir de las mismas, se pueden implantar en un sujeto que sea deficiente en dicho producto génico. Por ejemplo, son de interés particular los genes que expresan productos capaces de prevenir o aliviar síntomas de diversos tipos de enfermedades o trastornos vasculares, o que previenen o promueven trastornos inflamatorios. Por ejemplo, las células de la descripción pueden ser modificadas genéticamente para expresar un producto génico anti-inflamatorio que serviría para reducir el riesgo de fallo de implantación u otro cambio degenerativo en el tejido debido a una reacción de inflamación. Por ejemplo, una célula madre de la descripción puede ser modificada genéticamente para expresar uno o más productos génicos anti-inflamatorios que incluyen, por ejemplo, péptidos o polipéptidos que corresponden al idiotipo de anticuerpos que neutralizan factor estimulante de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), TNF, IL-1, IL-2, u otras citosinas inflamatorias. Se ha demostrado que la IL-1 reduce la síntesis de proteoglicanos y colágenos de tipo II, IX y XI (Tyler et al., 1985, Biochem. J. 227: 69-878; Tyler et al., 1988. Coll. Relat. Res. 82: 393-405; Goldring et al., 1988, J. Clin. Invest. 82: 2026-2037; y Lefebvre et al., 1990, Biophys. Acta. 1052: 366-72). El TNF también inhibe la síntesis de proteoglicanos y de colágeno de tipo II, aunque es mucho menos potente que la IL-1 (Yaron, I., et al., 1989, Arthritis Rheum. 32: 173-80; Ikebe, T., et al., 1988, J. Immunol. 140: 827-31; y Saklatvala, J., 1986, Nature 322: 547-49). Asimismo, por ejemplo, las células de la descripción pueden modificarse para expresar el gen que codifica la proteína reguladora de complemento humana que previene el rechazo de un injerto por parte del hospedante. Véase, por ejemplo, McCurry et al., 1995, Nature Medicine 1: 423-27. En otra realización, las células madre pluripotentes inducidas humanas pueden modificarse para incluir un gen o secuencia de polinucleótidos que expresa o hace que sea expresado un factor angiogénico.
Las células madre inducidas de la descripción expresan uno o más marcadores asociados al fenotipo de célula madre pluripotente humana y/o carecen de uno o más marcadores asociados a una célula diferenciada (p.ej., una célula que tiene una capacidad reducida para la auto-renovación, la regeneración o la diferenciación) y/o una célula de origen neuronal. Una molécula es un “marcador” de un tipo celular deseado si aparece en un porcentaje suficientemente elevado de células del tipo celular deseado, y si aparece en un porcentaje suficientemente bajo de células de un tipo celular no deseado. Se puede obtener un nivel deseado de purificación del tipo celular deseado a partir de una población de células que comprenden tipos celulares tanto deseados como no deseados seleccionando las células de la población de células que tienen el marcador. Un marcador puede presentarse, por ejemplo, en el 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% o más del tipo celular deseado, y puede presentarse en menos del 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% o menos de un tipo celular no deseado.
Tal como se ha discutido anteriormente, las células madre inducidas de la descripción o las células madre inducidas que han sido diferenciadas se caracterizan por la presencia y/o la ausencia de determinados marcadores que son reconocidos específicamente por una molécula. Por consiguiente, la descripción proporciona métodos para marcar células madre inducidas de la descripción. En un ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas humanas pueden ser marcadas con una molécula (p.ej., un anticuerpo) que reconoce específicamente un marcador que está asociado a una célula madre inducida de la descripción. En otro ejemplo, una población de células se puede poner en contacto con una molécula que se une específicamente a un marcador (p.ej., TRA-1-81) en las condiciones que permitan a la molécula unirse al marcador, donde la población de células comprende al menos una célula madre que tiene dicho marcador. En otro ejemplo, una población de células se puede poner en contacto con una molécula que se une específicamente a un marcador en las condiciones que permiten que la molécula se una al marcador, donde la población de células comprende células madre que no tienen el marcador y células no madre que tienen el marcador. La molécula usada puede ser, por ejemplo, un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, o un ligando. La molécula opcionalmente puede comprender un resto adicional, por ejemplo, uno que es detectable (p.ej., una marca fluorescente o colorimétrica) o uno que ayuda al aislamiento de las células marcadas (p.ej., un resto que sea ligado por otra molécula o una partícula magnética).
En una realización, la población de células somáticas transformadas es sometida a una tinción viva para un Antígeno de Rechazo de Tumor 1-61 y 1-81 (TRA-1-60, TRA-1-81). TRA-1-60 y TRA-1-81 se pueden obtener comercialmente, por ejemplo, en Chemicon International, Inc. (Temecula, Calif., EE.UU.). La detección inmunológica de estos antígenos usando anticuerpos monoclonales ha sido usada para caracterizar células madre pluripotentes en combinación con otros marcadores (Shamblott M. J. et al. (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et al. (2000). PNAS 97: 11307­ 11312; Thomson J. A. et al. (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B. E. et al. (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J. K. et al. (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et al. (2000). J. Cell Science 113: 5-10). En una realización, una población de células somáticas que han sido transformadas con al menos un vector de ARN ectópico que comprende un KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, y opcional o alternativamente NANOG o Glis1 son enriquecidas en células que comprenden la expresión de TRA-1-81 o TRA-1-60. En una realización adicional, las células también pueden enriquecerse para la pérdida de un marcador detectable asociado a un vector retroviral.
La descripción también proporciona métodos para aislar células madre inducidas de la descripción. Las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción se pueden aislar, por ejemplo, utilizando moléculas (p.ej., anticuerpos, derivados de anticuerpos, ligandos o moléculas de fusión de péptido de Fc) que se unen a un marcador (p.ej., un TRA-1-81, un TRA-1-60 o una combinación de marcadores) en las células madre pluripotentes inducidas humanas, y seleccionando de este modo positivamente células que se unen a la molécula (es decir, una selección positiva). Otros ejemplos de métodos de selección positiva incluyen métodos para promover preferentemente el crecimiento de un tipo celular deseado en una población mixta de tipos celulares deseados y no deseados. Alternativamente, usando moléculas que se unen a marcadores que no están presentes en el tipo celular deseado, pero que están presentes en un tipo celular no deseado, las células no deseadas que contienen dichos marcadores pueden ser eliminadas de las células deseadas (es decir, una selección negativa). Otros métodos de selección negativa incluyen matar o inhibir el crecimiento de forma preferente de un tipo celular deseado de una población mixta de tipos celulares deseados y no deseados. Por consiguiente, usando una selección negativa, una selección positiva, o una combinación de ambas, se puede preparar una población enriquecida de células madre.
Los procedimientos de separación pueden incluir separación magnética, usando partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos, cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal, o agentes como los usados en conjunción con un anticuerpo monoclonal, p.ej., complemento y citotoxinas, y “cribar” con anticuerpo unido a una matriz sólida (p.ej., una placa), u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen los clasificadores celulares activados por fluorescencia, que pueden presentar diversos niveles de sofisticación, p.ej., una pluralidad de canales de color, canales de detección de bajo ángulo o de dispersión de luz obtusa, y canales de impedancia. De forma conveniente, los anticuerpos se pueden conjugar con marcadores, tales como partículas magnéticas, lo que permite una separación directa, biotina, que puede eliminarse con avidina o estreptavidina ligada a un soporte, fluorocromos, que pueden usarse con un clasificador celular activado por fluorescencia, o similares, para permitir una separación fácil del tipo celular particular. Se puede emplear cualquier técnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células madre pluripotentes inducidas humanas. En una realización, las células madre son incubadas con un anticuerpo contra un marcador (p.ej., un anticuerpo TRA-1-81) y las células de tinción positiva para el marcador son seleccionadas manualmente y subcultivadas.
Se pueden usar combinaciones de métodos de enriquecimiento para mejorar el tiempo o la eficacia de la purificación o enriquecimiento. Por ejemplo, tras una etapa de enriquecimiento para eliminar células que tienen marcadores que no son indicativos del tipo celular de interés, las células pueden ser separadas o enriquecidas adicionalmente mediante un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) u otra metodología que tenga una elevada especificidad. Con un FACS se puede emplear análisis multi-color. Las células se pueden separar en base al nivel de tinción para un antígeno particular, o la carencia del mismo. Se pueden usar fluorocromos para marcar anticuerpos específicos para un antígeno particular. Dichos fluorocromos incluyen ficobiliproteínas, p.ej., ficoeritrinina y aloficocianinas, fluoresceína, rojo Texas, y similares.
Se puede usar cualquier marcador específico de tipo para seleccionar para o contra un tipo celular particular. Los marcadores de células madre inducidas útiles para el enriquecimiento comprenden marcadores expresados tales como TRA-1-81 y pérdida de marcadores (p.ej., GFP) asociada a un vector retroviral u otro vector exógeno.
Una vez aisladas las células madre, opcionalmente se pueden propagar en medio apropiado en presencia o ausencia de una capa cebadora. Adicionalmente, las células madre pluripotentes inducidas humanas de la invención se pueden cultivar en un sistema de biorreactor.
Una vez que las células madre pluripotentes inducidas humanas de la descripción han sido establecidas en cultivo, como se ha descrito anteriormente, pueden ser mantenidas o almacenadas en “bancos” celulares que comprenden cultivos in vitro de células que requieren una transferencia regular o como células que han sido criopreservadas. En algunas realizaciones, las células del banco son usadas para el tratamiento autólogo de un sujeto.
Se puede aislar fácilmente fibroblastos desintegrando un órgano o tejido apropiado, que va a actuar como fuente de fibroblastos. Esto se puede realizar fácilmente usando técnicas conocidas por los especialistas en el arte de la técnica. Por ejemplo, el tejido o el órgano pueden ser desintegrados mecánicamente y/o pueden ser tratados con enzimas digestivas y/o agentes quelantes que debilitan las conexiones entre células colindantes, haciendo posible dispersar el tejido en una suspensión de células individuales sin que se produzca una ruptura celular apreciable. La disociación enzimática se puede conseguir moliendo el tejido y tratando el tejido molido con uno de una cualquiera de una serie de enzimas digestivas, tanto solas como en combinación. Éstas incluyen, aunque sin limitación, tripsina, quimotripsina, colagenasa, elastasa y/o hialuronidasa, ADNasa, pronasa, dispasa, etc. La ruptura mecánica también se puede conseguir mediante una serie de métodos, que incluyen, aunque sin limitación, el uso de molinillos, mezcladores, tamices, homogeneizadores, celdas de presión o insonadores, por nombrar unos pocos. Para una revisión de las técnicas de disgregación de tejido, véase Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2nd Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, pp. 107-126.
Una vez que el tejido ha sido reducido a una suspensión de células individuales, la suspensión se puede fraccionar en subpoblaciones, a partir de la cual se pueden obtener fibroblastos y/u otras células estromales y/o elementos. Esto también se puede llevar a cabo usando técnicas estándar para la separación celular que incluyen, aunque sin limitación, la clonación y selección de tipos celulares específicos, la destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa), la separación basada en la capacidad de aglutinación celular diferencial en la población mixta, procedimientos de congelación-descongelación, propiedades de adherencia diferencial de las células de la población mixta, filtración, centrifugación convencional y zonal, elutriación centrífuga (centrifugación en contracorriente), separación gravitatoria unitaria, distribución contracorriente, electroforesis y clasificación celular activada por fluorescencia. Para una revisión de técnicas de selección clonal y separación celular, véase Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2nd Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 y 12, pp. 137-168.
El aislamiento de fibroblastos puede, por ejemplo, llevarse a cabo se indica a continuación: muestras de tejido fresco son lavadas intensamente y molidas en disolución salina equilibrada de Hanks (HBSS) a fin de eliminar el suero. El tejido molido es incubado durante 1-12 horas en una disolución recién preparada de una enzima disociadora tal como tripsina. Después de esta incubación, las células disociadas son suspendidas, peletizadas por centrifugación y llevadas a discos de cultivo. Todos los fibroblastos se unirán antes que las otras células, por lo tanto, se pueden aislar y crecer las células estromales apropiadas.
Cuando las células des-diferenciadas van a ser usadas para trasplante o implante in vivo es útil obtener las células estromales a partir de tejidos del propio paciente.
Se pueden usar sondas y cebadores de oligonucleótido para identificar la expresión de varios factores descritos en la presente memoria, así como en procedimientos de clonación y amplificación. Una sonda de oligonucleótido o un cebador se refieren a una molécula de ácido nucleico de entre 8 y 2000 nucleótidos de longitud. Más particularmente, la longitud de dichos oligonucleótidos puede oscilar entre aproximadamente 8, 10, 15, 20 o de 30 a 100 nucleótidos, pero típicamente será de aproximadamente 10 a 50 (p.ej., de 15 a 30 nucleótidos). La longitud apropiada para los oligonucleótidos en los ensayos de la descripción bajo un conjunto particular de condiciones puede determinarse empíricamente por parte del especialista en la técnica.
Los cebadores y sondas de oligonucleótido se pueden preparar mediante cualquier método adecuado, que incluye, por ejemplo, la clonación y la restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa basada en las secuencias conocidas de polinucleótido y polipéptido KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG o cualquier combinación de los mismos. En la técnica se conocen varios ortólogos de otras especies.
Las sondas y cebadores de oligonucleótidos pueden comprender análogos de ácido nucleico tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido, análogos de ácido nucleico bloqueado (LNA), y análogos de morfolino. El extremo 3' de la sonda se puede funcionalizar con una captura o marca detectable para ayudar a la detección de un ácido nucleico KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG, Glis1 o cualquier combinación de los mismos.
Cualquiera de los oligonucleótidos o ácidos nucleicos de la descripción se pueden marcar incorporando una etiqueta detectable medible con medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, dichas marcas pueden comprender sustancias radiactivas (32P, 35S, 3H, 125I), colorantes fluorescentes (5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluoreno, digoxigenina), biotina, nanopartículas, y similares. Dichos oligonucleótidos típicamente son marcados en sus extremos 3' y 5'.
Los cebadores y sondas de oligonucleótidos se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido. Los especialistas en la técnica conocen los soportes sólidos, que incluyen las paredes de los pocillos de la bandeja de reacción, tubos de ensayo, partículas de poliestireno, partículas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de látex, vidrio y similares. El soporte sólido no es crítico y puede ser seleccionado por el especialista en la técnica. De esta manera, las partículas de látex, las micropartículas, las partículas magnéticas o no magnéticas, las membranas, los tubos de plástico, las paredes de pocillos de microtitulación, el vidrio o las partículas de sílice, y similares, son todos ejemplos adecuados. Los métodos adecuados para inmovilizar oligonucleótidos sobre una fase sólida incluyen interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes, etcétera. El soporte sólido se puede elegir por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura. Las sondas o cebadores de oligonucleótidos se pueden unir o inmovilizarse sobre un soporte sólido de forma individual o en grupos de aproximadamente 2-10.000 oligonucleótidos distintos de la descripción en un soporte sólido individual. Se puede usar un sustrato que comprende una pluralidad de cebadores o sondas de oligonucleótido de la descripción para detectar o amplificar KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG, Glis1 o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las sondas de oligonucleótidos se pueden usar en una tira de oligonucleótidos tal como las comercializadas por Affymetrix y descritas en la Patente de EE.UU. n° 5.143.854; en las publicaciones PCT WO 90/15070 y 92/10092. Estos sistemas se pueden producir empleando métodos de síntesis mecánica o métodos de síntesis dirigidos por luz, que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. La descripción contempla además anticuerpos capaces de unirse específicamente a un polipéptido KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG o Glis1.
Una población de referencia o de control se refiere a un grupo de sujetos o individuos que se predice que son representativos de la población general. Una muestra de ensayo se mide para determinar la cantidad de KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYc o L-MYC, NANOG o Glis1 o de cualquier combinación de los mismos, en la muestra, donde la cantidad se compara con una muestra de control.
En otro ejemplo, la descripción proporciona métodos para diferencia células madre para un linaje comprometido que comprenden inhibir la expresión o la actividad de KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, NANOG o Glis1, o de cualquier combinación de los mismos. Los agentes de diferenciación útiles a este respecto incluyen, por ejemplo, anticuerpos, oligonucleótidos antisentido, construcciones de ARNi, o ribozimas.
Las técnicas de cultivo útiles en los métodos de la descripción se describen en la Publicación de Patente Internacional n° WO 2010/120875.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar determinados aspectos de la descripción y para asistir a los especialistas en la técnica a la hora de llevar a la práctica la descripción. Estos Ejemplos no deben considerarse en modo alguno como limitativos del alcance de la descripción de ninguna manera.
Ejemplos
Ejemplo de referencia 1
Células. Se obtuvieron de ATCC fibroblastos BJ de prepucio y la línea celular STO. Los fibroblastos de prepucio humano (HFF) humanos y la línea celular ES humana HUES-9 fueron obtenidos de fuentes existentes. BJ, HFFs y STO fueron cultivadas en DMEM que contenía un 10% de FBS, MEM aminoácidos no esenciales (NEAA), piruvato, penicilina y estreptomicina. Las células HUES-9 e iPS fueron cultivadas con medio de cultivo ES en D-MEM de bloqueo que contenía un 20% de SR de bloqueo, GlutaMAX, NEAA, 2-mercaptoetanol (todos de Invitrogen), penicilina, estreptomicina y bFGF (10 ng/mL). Se prepararon células cebadoras STO mediante tratamiento con mitomicina C (10 |jg/mL, Sigma). Para el cultivo libre de cebador de clones de células iPS y HUES-9, las células fueron sometidas a pasaje en pocillos recubiertos de Matrigel™ (BD Bioscience) y se cultivaron en el medio acondicionado preparado a partir de células cebadoras STO con medio de cultivo ES.
Construcción de plásmidos: los ADNcs que codifican para OCT4 (n° de acceso NM_002701), c-MYC (n° de acceso NM_002467) y GlIS1 (n° de acceso BC104911) fueron obtenidos de Open Biosystems. SOX2 (n° de acceso NM_003106), KLF4 (n° de acceso NM_004235), nAnOG (n° de acceso BC099704) están disponibles en la ATCC. El B18R (n° de acceso D01019) se obtuvo de Addgene. Los ADNcs se usaron como plantillas para la amplificación PCR para añadir sitios de enzima de restricción y/o secuencia Kozak, y se clonó en vector pBluescript SK+ para comprobar secuencias de ADNc. A continuación los ADNcs fueron clonados en vector pTNF (Promega) para la síntesis de ARNm y pCX4bsr1 para la producción de retrovirus. Para la expresión multicistrónica empleando secuencias de péptido 2A víricas, se maduraron oligos F2A, oligos T2A y oligos E2A (Tabla 1) y se clonaron en sitios EcoRI/Spel, Spel/Xbal y Xbal/Notl de vector pBluescript SK+, respectivamente. Los ADNcs de factores de reprogramación fueron ligados con secuencias de péptido 2A en marco, y a continuación se clonaron en pVEE-S-IRES-Puro. Los pVEE-S-IRES-Puro fueron construidos a partir de p5'VEE/S/GFP/Pac3 para clonar factores de reprogramación. Resumidamente, los genes GFP/Pac y 3'UTR parcial en p5'VEE/S/GFP/Pac fueron eliminados con digestión de Xbal/Mfel, y a continuación se introdujeron los múltiples sitios de clonación (MCS; Ndel, Ascl, BbvCI, Clal, Mfel, Fsel y Notl) (Tabla 1), IRES y gen de resistencia a Puromicina de pCX4puro. Este vector se renombró como pVEE-IRES-Puro por comodidad. Para generar ARN con ARN polimerasa T7, el promotor SP6 (ATTTAGGTGACACTATAG (véase, p.ej., SEQ ID NO:31 desde 16844-16861)) fue reemplazado por promotor T7 (TAATACGACTGACTATAG (véase, p.ej., SEQ ID NO:32 desde 16843-16860)) mediante PCR (Tabla 1) usando el fragmento SacI/BstZ17I del vector VEE como plantilla (el promotor SP6 está localizado adyacente al sitio SacI).
Tabla 1: Cebadores para clonación PCR
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ARNm y síntesis de ARN de replicón. Se usó el plásmido pTNT-B18R para la síntesis de ARNm de B18R. El vector pTNT contiene una secuencia líder 5' de p-globina y una cola poli (A) sintética (30 bases) para potenciar la expresión de genes. 30 bases de poli (A) no fueron suficientes para estabilizar el ARNm, por lo que se añadió más cola poli (A) mediante polimerasa de cola poli (A). La síntesis de ARNm de B18R se llevó a cabo con nucleótidos modificados usando el kit de Sistema de Producción de ARN a Gran Escala RiboMAX SP6 (Promega). La modificación se llevó a cabo mediante el reemplazo del 100% de UTP por pseudouridina (Psi) (TriLink Biotechnologies) o del 25% de UTP y CTP con Psi y 5-metil-citidina (5mc) (TriLink Biotechnologies), respectivamente. Tras la reacción de transcripción, la plantilla de ADN se eliminó mediante digestión con ADNasa. El ARNm se purificó mediante extracción con Fenol/Cloroformo/alcohol de isoamilo (PCI) y Cloroformo/alcohol de isoamilo (CI), y a continuación se concentró mediante precipitación en acetato de amonio (2,5 M), que precipita selectivamente a Rn , aunque dejando la mayoría de la proteína, ADN y NTPs no incorporados en el sobrenadante, según el protocolo del fabricante (Epicentre). Típicamente, se usaron 10 |jg de plásmido linealizado para una escala de reacción de 100 jL y se recibieron aproximadamente 400 jg de ARNm. Para el capping 5' del ARNm, se usó ScriptCap m7G Capping System™ y ScriptCap 2'-O-Metiltransferasa (Epicentre, actualmente disponible en CELLSCRlPT) para producir a Rn cap 1-capped, que procede a completar cuantitativamente el capping. Tras el Capping 5', el ARNm fue purificado brevemente mediante precipitación en acetato de amonio, y a continuación se añadió cola poli(A) adicional mediante polimerasa de poli(A) (Epicentre, actualmente disponible en CELLSCRIPT). El ARNm que porta el Capping 5' y la cola poli(A) fue purificado mediante extracción con PCI y CI, seguido de precipitación en amonio. Para la síntesis de ARN de replicón, se linealizó plásmido plantilla mediante digestión con MluI, y a continuación se usó para la síntesis de ARN del mismo modo que para la síntesis de ARNm. La síntesis de replicón de ARN se llevó a cabo sin modificación de ARN. Después del tratamiento de ADNasa, el ARN sintetizado se purificó mediante precipitación de acetato de amonio sin purificación orgánica debido a que la mayoría del ARN grande fue atrapado en una fase intermedia tras la extracción orgánica. Al ARN de replicón se añadió Capping 5' y cola poli(A) como se ha descrito antes, y a continuación se purificó mediante precipitación en acetato de amonio sin purificación orgánica. Todos los ARNs fueron resuspendidos en la Disolución de Almacenamiento de ARN (Ambion) a una concentración de 1 jg / jL y se almacenó a -80°C hasta su uso.
Preparación de medio acondicionado con B18R (B18R-CM). ARNm de B18R doble modificado al 25% (1 jg por 1 pocillo de placa de 6 pocillos) fue transfectado en HFFs con Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de 3 h, las células fueron cultivadas en DMEM avanzado (Invitrogen) que contenía un 15% de FCS (ES cell qualified, Millipore), penicilina y estreptomicina, o medio de cultivo ES. El medio de cultivo fue recolectado al siguiente día, se filtró y se diluyó 5 veces con medio de cultivo celular, y a continuación se usó como B18R-CM (20% de B18R-CM). La actividad de B18R-CM fue medida brevemente a través de la eficacia de una transfección repetida de ARNms.
Generación de iPS mediante transfección de replicón. Se sometió a pasaje células BJ o HFFs en una placa de 6 pocilios en el día 0 y se cultivó hasta una confluencia de ~90-100% (4 x 105 células/pocillo) en el día 1. Se transfectó una mezcla de 1 |jg de ARN (ratio 3:1 de replicón de ARN de VEE a ARNm de B18R) con Lipofectamine 2000. Se usó ARNm modificado con B18 doblemente al 25% o ARNm modificado con Psi al 100% para la co-transfección. Después de 3 h, se cambió el medio de transfección al DMEM avanzado (Invitrogen) que contenía un 15% de FCS (ES cell qualified, Millipore), penicilina y estreptomicina. Las células fueron cultivadas en medio que contenía B18R-CM y puromicina (0,8 jg/mL) del día 2. El medio se cambió todos los días y se llevaron a cabo transfecciones cada 3 días (día 1, 4, 7, 10 o 14). Se usó medio ES del día 7. La puromicina se retiró el día 7 o el día 11. Un día después de la transfección final, las células fueron sometidas a pasaje a cebador STO y se cultivaron en medio ES que contenía B18R-CM. El medio ES se cambió todos los días y se cultivó hasta que se generaron las colonias de células iPS. Las colonias fueron seleccionadas mecánicamente para aislamiento de clones o teñidas con el kit de detección de fosfatasa alcalina (Millipore) o con disolución de tinción de AP preparada manualmente que contenía 1 mg/mL de FastRed TR (Sigma) y 0,4 mg/mL de 1-Naftil fosfato (Sigma) en tampón AP (Tris 100 mM, NaCl 100 mM y MgCh 50 mM, pH 9,5).
RT-PCR para la detección de replicón de ARN. Los ARNs totales fueron aislados con el mini kit RNeasy (Qiagen) o con TRIzol (Invitrogen). Los ARNs purificados con TRIzol fueron purificados a continuación mediante precipitación en acetato de amonio. La síntesis de ADNcs se llevó a cabo con el Kit de transcripción QuantiTect Rev. (Qiagen) o con el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad) a partir de 1 jg de ARN total. Se usaron 1-2 jL de 20 jL de reacción a RT para la amplificación PCR. La PCR se llevó a cabo con ADN polimerasa Taq (NEB) suplementada con potenciador PCRx (Invitrogen): 3 minutos a 94°C durante la desnaturalización inicial; 36 ciclos de 94 °C durante 25 s, 56 °C durante 25 s, 68 °C durante 30 s; seguido de 72 °C durante 5 minutos. Las secuencias de cebador usadas en la RT-PCR se han descrito en la Tabla 1.
RT-PCR TaqMan. Los ARNs totales de los cultivos libres de cebador de clones de iPSCs, HUES-9, BJ y HFFs fueron aislados con el mini kit RNeasy. Las reacciones de RT-PCR TaqMan fueron llevadas a cabo usando una reacción en una etapa de ARN-a-Ct (Applied Biosystems) según el protocolo del fabricante. Por reacción se usaron 10 ng de ARN total. Los cebadores y las sondas fueron obtenidos del catálogo de AB TaqMan Gene Expression Assay (GAPDH, Hs99999905_m1; POU5F1 Hs03005111_g1; Sox2 Hs01053049_s1; DNMT3B Hs00171876_m1; TERT Hs00972656_m1; Lin28 Hs00702808_s1; Nanog Hs02387400_g1; TDGF1 Hs02339499_g1). Las reacciones de PCR cuantitativa se llevaron a cabo por triplicado, y las condiciones fueron las siguientes: 20 min a 55 °C, 10 min a 95 °C, 40 ciclos de 95 °C durante 0,15 min, 65 °C durante 1 min. Los datos fueron analizados en el sistema de PCR en tiempo real 7300 (Applied Biosystems) usando el método delta-delta Ct.
Secuenciamiento genómico de bisulfito. La conversión de citosinas no metiladas en urasilo de ADN genómico se llevó a cabo con el kit EZ DNA Methylation-Gold (Zymo Research) según el protocolo del fabricante. Los ADNs genómicos convertidos fueron usados a continuación para amplificación mediante PCR de la región de promotor de OCT4 o NANOG con ADN polimerasa ZymoTaq™ (Zymo Research). Los productos de PCR fueron clonados en el vector T de pBluescript SK+, y a continuación fueron secuenciados. Las secuencias de cebador usadas para PCR fueron descritas en la Tabla 1.
Formación de teratoma. Los clones de iPSC fueron cultivados con células cebadoras STO. Las células fueron recolectadas mediante un tratamiento con acutasa, y a continuación fueron inyectadas intramuscular o subcutáneamente en los músculos de la pata trasera o en el flanco dorsal de ratones nude (células cultivadas en disco de aproximadamente 10 cm para 1 inyección). Después de 5 a 8 semanas de inyección, los tumores fueron diseccionados y fijados con paraformaldehído al 4%. Los tumores fueron embebidos en parafina y se realizó un seccionamiento y después una tinción o inmunotinción con hematoxilina y eosina (H&E) de tres marcadores de capas germinales. Se usó AE1/AE3 (citoqueratina), NF-1 (células neuronales) y GFAP (células neuronales) para marcadores de ectoderma, Desmin (células musculares) para marcador de mesoderma, y AFP (endoderma primitivo y definitivo) para marcador de endoderma.
Tinción de inmunofluorescencia. Las células fueron lavadas dos veces en PBS y fijadas en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos. Las células lavadas fueron tratadas con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 10 minutos. Las células fueron bloqueadas con BSA al 2% durante 1 h a temperatura ambiente (RT), y a continuación se incubaron con anticuerpos primarios en PBS a 4 °C durante una noche. Las células fueron lavadas e incubadas con anticuerpos secundarios seguido de la incubación con DAPI o Hoechst 33342, y después se lavaron y clasificaron en PBS. Los anticuerpos primarios, tal como los anticuerpos anti-Oct4 de conejo, anti-Nanog y anti-Sox2 de cabra, anti-SSEA4 de ratón, anti-Tra-1-60 y anti-Tra-1-81, fueron usados en diluciones entre 1:100 y 1:500. Se usaron anticuerpos secundarios Alexa Fluor 488 (BD Biosciences) en diluciones 1:800.
Anticuerpos. Los anticuerpos usados en esta investigación son los indicados a continuación; anti-OCT4 (sc-9081), anti-KLF4 (sc-20691), anti-GLIS1 (sc-67584), anti-c-MYC (sc-42), anti-LIN28 (sc-54030), TRA-1-60 (sc-21705), SSEA1 (sc-21702) y SSEA4 (sc-21704) de Santa Cruz; anti-SOX2 (AF2018) y anti-NANOG (AF1997) de R&D Systems; TRA-1-81 (09-0011) de Stemgent; AE1/AE3 (RB-9010P0), Desmin (MS-376-S0), AFP (RB-365) y GFAP (Rb-087) de Labvision; NF-1 (NB-300-155) de Novus Biological.
Secuencia de ARN. Los ARNs totales fueron aislados con el mini kit RNeasy (Qiagen), y la biblioteca de ADNc de cada célula se sintetizó y analizó como se conoce en la técnica.
Para desarrollar una estrategia de generación de iPS basada en ARN, los esfuerzos se focalizaron en una estrategia que: 1) utilizar una única especie de ARN capaz de autorreplicarse por un número limitado de divisiones celulares, reduciendo de este modo el número de transfecciones; 2) fuera capaz de codificar al menos cuatro marcos de lectura abiertos (ORFs) de factor de reprogramación; y 3) expresaran de forma consistente todos los cuatro genes RF a unos niveles umbral elevados a lo largo de múltiples divisiones celulares. Para expresar ectópicamente los cuatro RFs, se usó un replicón de ARN de virus de encefalitis equina venezolana (VEE) modificado, no infeccioso, autorreplicante, que está siendo investigado actualmente como plataforma de expresión para el desarrollo de vacunas. El replicón de VEE es un ARN de especie individual de cadena positiva que imita el ARNm celular con un 5'-Cap y una cola poli(A) que no utiliza un intermedio de ADN, de tal modo que no hay potencial para integración genómica. VEE codifica proteínas complejas de replicación no estructural (nsP) como único ORF en el extremo 5' del ARN que está separado del ORF de la proteína estructural vírica en el extremo 3' (Fig. 1a). Petrakova et al. demostraron la capacidad de expresar proteínas exógenas reemplazando las proteínas estructurales 3' de ORF con GFP. Sin embargo, la exposición de células a ARN de VEE de cadena sencilla induce una fuerte respuesta inmune innata de IFN-alfa/beta que ha limitado de forma grave esta estrategia.
Para evaluar el replicón de ARN de VEE, el ORF 3' fue reemplazado por GFP, seguido de un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) y un gen de resistencia a puromicina (Puror) (Fig. 1a). El ARN de VEE-GFP fue producido usando un kit de transcripción in vitro de polimerasa SP6 estándar seguido de un capping en 5', y adición de cola poli(A), dando lugar a un tránscrito de ARN de 11500 nt de longitud completa con un rendimiento elevado. Para mitigar la respuesta inmune innata al ARN de VEE-GFP, se usó la proteína B18R del virus Vaccinia Occidental, que se une y neutraliza IFNs de tipo I. Se llevó a cabo una comparación de la transfección de fibroblastos de prepucio humano primarios (HFFs) con ARN de VEE-GFP sola, en presencia de la proteína B18R recombinante o con co-transfección de ARNm de B18R. En consonancia con la inducción de una respuesta inmune innata fuerte a las células expuestas a ARN de cadena sencilla, en ausencia de B18R, se observó poca o ninguna expresión de GFP (Fig. 1b). Aunque la adición de proteína B18R recombinante aumentó la expresión de GFP, el nivel de fluorescencia de GFP fue muy bajo. Sin embargo, la co-transfección de replicón de ARN de VEE-GFP con ARNm de B18R dio como resultado niveles elevados de expresión de GFP en HFFs (Fig. 1b-d), demostrando que se requiere B18R para una expresión eficiente de proteínas a partir del replicón de ARN de VEE.
La generación de células iPS requiere una expresión consistente a nivel alto de factores de los factores de reprogramación durante > 7 días; por tanto, se examinó la persistencia del replicón de VEE-GFP en fibroblastos. Se co-transfectaron HFFs con replicón de ARN de VEE-GFP y ARNm de B18R (ratio 3:1) en el día 1, a continuación se cultivaron en presencia o ausencia de medio acondicionado (CM) con B18R más/menos puromicina en el día 2. Aunque las células transfectadas con ARN de VEE-GFP/ARNm de B18R mostraron un nivel elevado de expresión de GFP en el día 1, el nivel de expresión se redujo rápidamente a lo largo de los siguientes días hasta los niveles de línea base en el día 7 (Fig. 1e). Además, en ausencia de exposición continua a B18R-CM, las células transfectadas con ARN de VEE-GFP dejaron de crecer y/o fueron asesinadas por la respuesta inmune innata (Fig. 1d). Por el contrario, las células transfectadas con ARNm de VEE-GFP/ARNm de B18R tratadas con B18R-CM/puro mantuvieron de forma persistente unos niveles elevados de expresión de GFP en >90% de las células con características de crecimiento saludable (Fig. 1d,e). Estos resultados demostraron la capacidad de la exposición a B18R para superar el problema de la respuesta inmune innata inducida por ARN de VEE, y también demostraron la capacidad para retener o degradar de forma selectiva al replicón de ARN de VEE frente a las células por exposición a o retirada de B18R-CM.
El ORF 3' del replicón de ARN de VEE se diseñó para codificar un único ORF combinado de tres factores de reprogramación, OCT4, KLF4, SOX2, separados por péptidos 2A de espaciado ribosomales internos. Los ORFs venían seguidos de un IRES, después de c-MYC (OKS-iM) o GLIS18 (OKS-iG), lo que evita la inestabilidad genómica inducida por c-MYC, seguido de un segundo IRES y el gen de resistencia a puromicina (Puror) (Fig. 1a; Tabla 1). De forma similar al protocolo de ARN de VEE-GFP, los ARNs de VEE-RF fueron producidos mediante transcripción in vitro de SP6, capping 5' y adición de cola poli(A), dando lugar a ARN de VEE-OKS-iM de ~14500 nt o ARN de VEE-OKS-iG de ~15000 nt, de longitud completa en un alto rendimiento. La co-transfección de replicones de ARN de VEE-OKS-iM o de ARN de VEE-OKS-iG más ARNm de B18R (ratio 3:1) en BJ o fibroblastos humanos HFF dio como resultados en niveles elevados extendidos de expresión para los cuatro RFs que superaron los niveles de expresión de RF de los retrovirus (Fig. 1f). Estas observaciones demostraron la capacidad para expresar cuatro factores de reprogramación a partir de único replicón de ARN de VEE-RF sintético en células humanas primarias, aunque utilizando B18R para bloquear la respuesta inmune innata.
Para desarrollar un protocolo de generación de células iPS basado en ARN, se evaluaron varios parámetros, que incluyen el número y el calendario de transfecciones de ARN de VEE-RF, la selección para la retención de replicón de ARN de VEE-RF mediante puromicina, y la organización genética del replicón de ARN de VEE-RF (Fig. 1a, 2a). Aunque incluso una transfección sencilla o doble de ARN de RF dio como resultado la generación de células iPS, tres o cuatro transfecciones en presencia de B18R de forma consistente dieron como resultado la mayor generación de colonias positivas para fosfatasa alcalina (AP+) (Fig. 2b-d). Se aislaron mecánicamente >100 colonias de células iPS a partir de los protocolos de ARN de VEE-OKS-iM y VEE-OKS-iG y tuvieron una tasa de éxito >95% en términos de capacidad de los clones de tipo iPS aislados para dividirse continuamente y retener una morfología de célula madre embrionaria humana (hESC). De los >100 clones de tipo iPS aislados, 30 clones fueron aislados para la expresión de marcadores de células madre mediante inmunofluorescencia. Los 30 clones de iPS de ARN de VEE-RF analizados (6x clones de HFF-OKS-iM, 12x clones de BJ-OKS-iM, 6x clones de HFF-OKS-iG, 6x clones BJ-OKS-iG) mostraron todos una fuerte tinción nuclear de OCT4, SOX2 y NANOG endógenos, y una fuerte tinción de superficie celular de SSEA4, TRA-1-60 y TRA-1-81, con tinción negativa de SSEA1 (Fig. 2e). Para eliminar el replicón de ARN de VEE-RF, todos los protocolos de iPS retiraron B18R-CM y puromicina en el día 7 o 10 durante la reprogramación (Fig. 2a). Para confirmar la pérdida completa de replicones de ARN de VEE-RF, se desarrolló un protocolo altamente sensible y específico de qRT-PCR capaz de detectar <10 femtogramos del replicón de ARN de VEE-RF (Fig. 4). Como era de esperar, el análisis qRT-PCR demostró que todos los clones de células iPS habían perdido el replicón de ARN de VEE-RF (Tabla 2). Además, el análisis de cariotipo de 4 clones de células iPS independientes (BJ-OKS-iM n° 2 y n° 21, BJ-OKS-iG n°5, HFF-OKS-iM n°1) demostró cariotipos diploides normales (Fig. 5).
Tabla 2: Detección de replicón de ARN de RF mediante qRT-PCR
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a; indica clones del replicón de ARN OKS-iM, iG indica clones del replicón de ARN OKS-iG. b; regiones
correspondientes a RT-Pc R, R1; nsP2, R2; nsP4, R3; Oct4-T2A-Klf4 (OK), c; transfección sobre placa (PL) antes
de pasaje a células cebadoras, d; transfección después de pasaje a células cebadoras (FD). ; banda positiva
detectada, /-; banda tenue detectada; -; no se detecta banda. ND, no realizado.
Para caracterizar adicionalmente los clones de células iPS establecidos, se analizó la expresión de genes marcadores de ES humanos mediante qRT-PCR. En consonancia con los niveles de expresión en células HUES9 ES humanas, los clones de iPS generados a partir de fibroblastos BJ y HFF originales con el protocolo de ARN de VEE-RF de OKS-iM o de OKS-iG expresaron niveles robustos de OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, TDGF1, DNMT3B y TERT endógenos, al contrario que los niveles de expresión bajos o nulos en los fibroblastos de BJ y HFF originales (Fig. 3a). Una característica de la pluripotencia inducida es una metilación de ADN reducida de dinucleótidos CpG en las regiones promotoras de OCT4 y NANOG. El secuenciamiento genómico de bisulfito de ambas regiones promotoras, OCT4 y NANOG, mostró una desmetilación extensiva en los clones de células iPS en comparación con los fibroblastos originales (Fig. 3b). Para investigar perfiles de expresión de ARNm de genoma amplio en los clones de células iPS, cuyo secuenciamiento de ARN genómico (ARN-seq) se llevó a cabo en los clones de células iPS generadas mediante ARN de VEE-RF de OKS-iM y OKS-iG, las células BJ y HUES-9 ES originales controlan. Los cuatro clones de células iPS analizados mediante ARN-seq mostraron una agrupación jerarquizadas no supervisada y marcas de expresión características de las células HUES9 humanas que eran altamente divergentes de los fibroblastos humanos originales (Fig. 3c,d). Finalmente, la pluripotencia in vivo de los clones de células iPS humanas fue evaluada para determinar su capacidad para diferenciarse en células de las tres capas germinales mediante formación de teratoma en ratones inmunocomprometidos. Todos los clones de iPS de ARN de VEE-RF analizados formaron teratomas que contenían tipos celulares representativos de las tres capas germinales, se detectaron mediante tinción H&E que se confirmó mediante tinción de inmunohistoquímica (Fig. 3e; Fig. 6). Colectivamente, estas observaciones confirman la capacidad de los replicones de ARN de VEE-RF de OKS-iM y de OKS-iG para generar de forma eficiente células iPS humanas pluripotentes.
La generación de células iPS tiene un gran potencial para el desarrollo de terapias personalizadas de células madre; sin embargo, seguía sin disponerse de un método claro, directo y consistente basado en ARN para generar células iPS. La descripción proporciona una estrategia basada en ARN simple y altamente reproducible para generar células iPS mediante transfección de un único replicón de ARN de VEE-RF sintético que expresa uno, dos, tres, cuatro o más factores de reprogramación independientes. Las células iPS generadas mediante ARN de VEE-RF adquieren una completa pluripotencia a través de criterios biológicos y moleculares in vivo que se asemejan a células ES humanas. La generación del tránscrito de ARN de VEE-RF utiliza un kit de transcripción in vitro SP6 estándar que no requiere condiciones especiales y, por tanto, simplifica adicionalmente la estrategia para un uso amplio. Expresando los cuatro RFs en niveles elevados consistentes a lo largo del tiempo en la misma célula en combinación con la replicación del ARN de VEE-RF durante un número limitado de generaciones múltiples de células, la estrategia de ARN de VEE-RF resuelve los dos problemas de falta de eficiencia principales asociados al intento de generar células iPS mediante transfecciones diarias repetidas diariamente durante >14 días de cuatro ARNms de RF individuales. De forma importante, el ARN de v EE-RF es una estrategia ectópica de golpea-y-corre que no utiliza un intermedio de ADN y, por lo tanto, no existe la posibilidad de que se dé una mutación integrativa como en las estrategias de células iPS basadas en vector de ADN. Además, la pérdida programada de replicón de ARN de VEE-RF por degradación se puede regular retirando B18R del medio. Usando la estrategia de ARN de VEE-RF, se generaron >100 clones de células iPS independientes con de los protocolos de ARN de VEE-RF OCT4/KLF4/SOX2/c-MYC y OCT4/KLF4/SOX2/GLIS1 a partir de poblaciones de fibroblastos humanos originales independientes. Adicionalmente, la estrategia de ARN de VEE-RF se puede diseñar para expresar combinaciones de RF alternativas y/o la inserción de ORFs de RF adicionales en la cadena estructural de ARN de RF para refinar la generación de células iPS a partir de tipos celulares específicos, o para uso en dirigir la trans-diferenciación. En resumen, la estrategia de replicón de ARN de VEE-RF tiene una amplia aplicabilidad para la generación eficiente de células iPS humanas con uso definitivo en terapias de células madre humanas y medicina regenerativa.
Números de acceso. Los datos de ARN-Seq han sido enviados y se puede acceder a los mismos mediante el número de acceso de “Gene Expression Omnibus” (GEO) GSE38265.
Tabla 3. Generación de células iPS con replicón de ARN de VEE-RF.
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un ARN replicón de alfavirus que comprende:
al menos un dominio de replicasa no estructural procedente de un alfavirus y al menos una secuencia heteróloga no de alfavirus que codifica al menos dos factores de reprogramación (RFs) para inducir la generación de células madre pluripotentes cuando se expresa en una célula somática, en donde los al menos dos RFs son seleccionados de la lista que consiste en KLF4, OCT-4, SOX-2, c-MYC o n-MYC o I-MYC, GLIS1 y NANOG.
2. El ARN replicón de alfavirus de la reivindicación 1, en donde el replicón comprende secuencias obtenidas de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste en virus de la encefalitis equina oriental (EEE), virus de la encefalitis equina venezolana (VEE), virus Everglades, virus Mucambo, virus Pixuna y virus de la encefalitis equina occidental (WEE).
3. El ARN replicón de alfavirus de la reivindicación 1, en donde el replicó comprende secuencias de un alfavirus seleccionado del grupo que consiste en virus de Sindbis, virus de Bosque de Semliki, virus Middelburg, virus Chikungunya, virus O'nyong-nyong, virus Ross River, virus del Bosque de Barmah, virus Getah, virus Sagiyama, virus Bebaru, virus Mayaro, virus Una, virus Aura, virus Whataroa, virus Babanki, virus Kyzylagach, virus J de las Highlands, virus Fort Morgan, virus Ndumu y virus Buggy Creek.
4. El ARN replicón de alfavirus de cualquier reivindicación precedente, en donde el replicón comprende secuencias obtenidas del virus de la encefalitis equina venezolana.
5. El ARN replicón de alfavirus de la reivindicación 1, en donde la al menos una secuencia heteróloga no de alfavirus comprende al menos 2, 3, 4 o 5 secuencias heterólogas no de alfavirus.
6. El ARN replicón de alfavirus de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5,
(i) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido KLF4 codifica un polipéptido KLF4 que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:8; o
(ii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido KLF4 codifica un polipéptido KLF4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:8; o
(iii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido KLF4 comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:7; en donde “T” es “U”; o
(iv) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido SOX-2 codifica un polipéptido SOX-2 que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:6; o
(v) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido SOX-2 codifica un polipéptido SOX-2 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:6; o
(vi) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido Sox-2 comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:5; en donde “T” es “U”; o
(vii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido OCT-4 codifica un polipéptido OCT-4 que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:4; o
(viii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido OCT-4 codifica un polipéptido OCT-4 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:4; o
(ix) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido OCT-4 comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:3; en donde “T” es “U”; o
(x) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido c-MYC codifica un polipéptido c-MYC que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:10; o
(xi) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido c-MYC codifica un polipéptido c-MYC que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:10; o
(xii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido c-MYC comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:9; en donde “T” es “U”; o
(xiii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido GLIS1 codifica un polipéptido GLIS1 que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:34; o
(xiv) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido GLIS1 codifica un polipéptido GLIS1 que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:34; o
(xv) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido GLIS1 comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:33; en donde “T” es “U”; o
(xvi) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido NANOG codifica un polipéptido NANOG que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a una secuencia de la SEQ ID NO:2; o
(xvii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido NANOG codifica un polipéptido NANOG que tiene una secuencia de la SEQ ID NO:2; o
(xviii) en donde el polinucleótido que codifica el polipéptido NANOG comprende una secuencia como la establecida en la SEQ ID NO:1; en donde “T” es “U”.
7. El ARN replicón de alfavirus de la reivindicación 1, en donde el replicón comprende de 5' a 3': (replicasas de ARN de VEE) -(promotor) -(R F 1) — (péptido de auto-ruptura) -(R F 2) — (péptido de auto-ruptura) -(R F 3) -(IR ES o promotor central) — (RF4) — (IRES o promotor opcional) — (marcador seleccionable opcional) — (3'UTR y cola poliA de VEE) — (marcador seleccionable opcional) — promotor; donde RF1-4 son factores que inducen la des-diferenciación de una célula somática en células pluripotentes, donde RF2-3 son opcionales, RF3-4 son opcionales o RF4 es opcional; en donde RF1-4 se seleccionan del grupo que consiste en Oct-4, Klf4, Sox-2, c-Myc, Nanog y Glisl.
8. El ARN replicón de alfavirus de la reivindicación 1 o 7, en donde el replicón comprende una secuencia que es idéntica en un 90%, 95%, 98%, 99% o 100% con respecto a la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32 desde aproximadamente la posición 1 hasta aproximadamente la posición 7561, en donde “T” de la secuencia es sustituido por “U”, seguido de dos o más RFs, seguido de un 3'UTR y cola poliA, donde los dos o más RFs se seleccionan del grupo que consiste en Oct-4, Sox-2, Klf4, c-Myc, Nanog y Glis1; en donde las secuencias codificadoras de los dos o más RFs pueden estar separadas por un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) o un promotor pequeño, preferiblemente en donde el replicón comprende una secuencia que es idéntica en al menos un 95%, 98%, 99% o 100% a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:29, 30, 31 o 32, en donde “T” es “U”.
9. Una composición que comprende células humanas que comprenden un replicón de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que preferiblemente comprende además medio acondicionado con B18R.
10. La composición de la reivindicación 9 en medio acondicionado con B18R, en donde las células humanas son células somáticas, o en donde las células humanas son fibroblastos.
11. Un método in vitro para preparar células madre que comprende cultivar la composición de la reivindicación 9, durante al menos 30 días en las condiciones que expresen las secuencias codificadoras del replicón y aislar las células madre.
12. Un método in vitro para preparar células madre que comprende transformar células somáticas con un replicón de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 in vitro, cultivar las células somáticas en medio acondicionado con B18r en las condiciones que promueven la expresión del replicón y aislar las células madre.
13. El método de la reivindicación 11 o 12, en donde el medio acondicionado con B18R es producido mediante transfección de ARNm de B18R en fibroblastos humanos primarios.
14. Un método in vitro para preparar células madre que comprende:
poner en contacto una célula somática humana con un replicón de ARN de alfavirus autorreplicante ectópico que comprende un polinucleótido que codifica al menos de dos a cuatro factores de des-diferenciación seleccionados del grupo que consiste en un (i) KLF4, (ii) OCT4, (iii) SOX2, (iv) c-MYC o n-MYC o L-MYC, (v) GLIS1 y (vi) NANOG, in vitro,
cultivar la célula somática en medio acondicionado con B18R para expresar el factor de des-diferenciación;
seleccionar las células que presentan una morfología de célula madre y/o marcadores de célula madre; y
subcultivar las células para obtener una población de células madre inducidas, preferiblemente en donde las células son seleccionadas detectando la expresión de un antígeno de rechazo tumoral 1-60 y/o 1-81.
15. Un sistema de vector para producir células madre humanas, que comprende:
al menos un replicón de ARN autorreplicante derivado de un alfavirus, preferiblemente en donde el alfavirus es VEE, en donde el replicón comprende un polinucleótido que codifica al menos dos factores de des-diferenciación seleccionados del grupo que consiste en KLF4, OCT4, SOX2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, GLIS1, NANOG o cualquier combinación de los mismos, preferiblemente en donde el replicón comprende:
(a) Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc, o
(b) Oct4, Sox2, Klf4 y Glis1.
16. Una célula o población de células somáticas humanas aisladas que comprenden un replicón de ARN de alfavirus ectópico que comprende dos o más secuencias de polinucleótido de des-diferenciación que codifican factores de des­ diferenciación seleccionados del grupo que consiste en KLF4, OCT-4, SOX-2, c-MYC o n-MYC o L-MYC, GLIS1 y NANOG, preferiblemente en donde, en las condiciones de cultivo que expresan los polinucleótidos de desdiferenciación en el replicón de ARN de alfavirus ectópico, la célula somática se des-diferencia.
17. Un medio que comprende una población de células de la reivindicación 16, en donde el medio inhibe la degradación del replicón de ARN de alfavirus ectópico.
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