ES2700398T3 - Anticuerpos mutantes y conjugación de los mismos - Google Patents

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Alice Lee
Richard Ryan Preston
David Tumelty
Wei Hong Yu
Abhijit Suresh Bhat
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Abstract

Un polipéptido que comprende un dominio kappa de cadena ligera constante de un anticuerpo humano (CLk) que comprende los restos K y H en posiciones correspondientes a las posiciones 80 y 81 de la SEQ ID NO: 6 cuando dicho dominio kappa de cadena ligera constante del anticuerpo humano está alineado con la secuencia de SEQ ID NO: 6, y caracterizado porque el dominio kappa de cadena ligera constante del anticuerpo humano comprende además un resto seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H, W en una posición correspondiente a la posición 77 de la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos mutantes y conjugación de los mismos
Antecedentes
El desarrollo de terapias bifuncionales tiene un gran potencial para aumentar las estrategias de terapia de combinación. Un agente terapéutico bifuncional puede proporcionar el beneficio de una terapia de combinación modulando 2 vías diferentes con una entidad terapéutica. Además, los agentes terapéuticos bifuncionales también pueden beneficiarse de las sinergias entre las vías y demostrar una actividad incrementada en comparación con los agentes monofuncionales. Además, los agentes terapéuticos pueden proporcionar beneficios en términos de reducción de la fabricación, almacenamiento y costes de envío, además de reducir el número de terapias administradas al paciente y simplificar los regímenes de dosificación.
La referencia a cualquier técnica en esta especificación no es, y no debe tomarse como tal, un reconocimiento de cualquier forma o sugerencia de que la técnica a la que se hace referencia forma parte del conocimiento general común.
El documento WO2008056346 proporciona compuestos dirigidos antiangiogénicos que comprenden conjugados agente dirigido antiangiogénicos-enlazador que están unidos a un sitio de combinación de un anticuerpo.
El documento WO2009136352 proporciona péptidos de unión a VEGF y péptidos de VEGF conjugados con anticuerpos solos y junto con otras moléculas antiangiogénicas.
El documento WO2012007896 se refiere a Conjugados de Anticuerpos Multifuncionales, que comprenden un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, que comprenden al menos un fragmento de una región kappa constante de cadena ligera (CLk) que comprende K188 de acuerdo con la numeración de Kabat; un enlazador que comprende fórmula X-Y-Z, en la que Z es un grupo unido covalentemente al anticuerpo a través de la cadena lateral de Kl88, Y es una cadena de conexión biológicamente compatible lineal o ramificada, y X es un grupo unido covalentemente al menos a un resto efector.
Sumario de la invención
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona un polipéptido que comprende un dominio kappa constante de la cadena ligera (CLk) de anticuerpo humano que comprende los restos K y H en las posiciones correspondientes a las posiciones 80 y 81 de la SEQ ID NO: 6 cuando dicho dominio kappa constante de la cadena ligera de anticuerpo humano se alinea con el secuencia de SEQ ID NO: 6, y caracterizada por que el dominio kappa constante de la cadena ligera de anticuerpo humano comprende adicionalmente un resto seleccionado de entre el grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H, W en una posición correspondiente a la posición 77 de la SEQ ID NO: 6.
En algunos aspectos de la invención, el resto en una posición correspondiente al resto 77 de la SEQ ID NO: 6 se selecciona de entre
(i) el grupo que consiste en A, G, I, L, R, S, T, P, N y M; o
(ii) el grupo que consiste en A, G, I, L, S, T, P y M; o
(iii) el grupo que consiste en A, G, S, T, P o M.
En algunos aspectos de la invención, el dominio kappa constante de la cadena ligera de anticuerpo humano puede estar conectado a un dominio variable de anticuerpo.
En algunos aspectos de la invención, el grupo £-amino de la cadena lateral de K que está localizado en una posición correspondiente al resto 80 de la SEQ ID NO: 6 puede estar unido covalentemente a un enlazador y el enlazador puede comprender una fórmula seleccionada del grupo que consiste en X - Y - Z , X -O-Y -Z , y X -Y -O-Z, en la que O es un grupo escindible, X1 es un grupo que se puede unir covalentemente al menos a un resto efector, Y1 es una cadena de conexión lineal o ramificada que incluye cualquier átomo seleccionado de entre el grupo que consiste en C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br e I, y Z están conectados covalentemente al grupo £-amino de la cadena lateral de K que está situada en una posición correspondiente al resto 80 de la SEQ ID NO: 6, y en la que el resto efector es un agente terapéutico, proteína, péptido, ácido nucleico, aptámero, hormona, toxina, factor de crecimiento o agente de diagnóstico.
En algunos aspectos de la invención, el grupo escindible O está presente y tiene la fórmula
Figure imgf000003_0001
en la que la línea ondulada y la línea paralela indican cada una un punto de unión al grupo X1, Y1 o Z1 según sea adecuado.
En algunos aspectos de la invención, el enlazador se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0004
en la que m, n, j y k son cada uno independientemente un intervalo cuyos límites inferiores se seleccionan del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y cuyo límite superior se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, y en el que la longitud total del enlazador no supera los 200 átomos y opcionalmente no supera los 60 átomos de longitud.
En algunos aspectos de la invención, el resto efector es una toxina que comprende fórmula:
Figure imgf000005_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que, independientemente, cada vez que está presente,
W2 es
Figure imgf000005_0002
R11 es
Figure imgf000005_0003
2
Y es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20; -carbociclo -C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C-10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C-i-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C-i0-(heterociclo C3-C3)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z2 es
Figure imgf000006_0001
R1123A es hi 1d3rBóg ^eno, alq 1uilo C1-C8 o haloalq 1uilo C1-C8;
R y R son cualquiera de los siguientes:
(i) R13A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R13B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o ha
i) R*13A lógeno; o
(i y R 13B t ^omados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
14A 14B
R y R son cualquiera de los siguientes:
(i) R14A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y
R14B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heter1o4aAralq 1u14ilBo o aralq 1uilo; o
(ii) R y R tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R15 es
Figure imgf000006_0002
heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en -alquilo C1-C8 -alquilo C1-C8-N(R')2, -alquilo C1-C8-C(O)R', -alquilo Cr C8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en la que cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R15 está
Figure imgf000007_0001
opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquilo C1-C8-N(R'¿, -alquilo C1-C8-C(O)R', -alquilo C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH,
halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en la que cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquileno C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
R16 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8 o haloalquilo C1-C8;
R22 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R23 es heterociclilo C1-C10; y
R se selecciona independientemente cada vez que está presente entre el grupo que consiste en F, Cl, I y Br;
R es -arilo, -alquileno C1-C10-arilo, en el que arilo en R que comprende arilo está sustituido con [R ]h; h es 5; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R13A es hidrógeno, X es S; y en la que el resto efector puede seleccionarse del grupo que consiste en
Figure imgf000008_0001
En algunos aspectos de la invención, el al menos un resto efector esta presente y es una proteina o peptido, y el grupo X1 del enlazador está unido covalentemente al extremo amino, al extremo carboxilo o a la cadena lateral de un resto de unión a péptido en la proteína o péptido, y en el que, opcionalmente, el resto de unión a péptido se selecciona del grupo que consiste en K, R, C, T, Y, S, ácido diaminopropiónico, ácido diaminobutírico y
Figure imgf000008_0002
En algunos aspectos de la invención, dicha CLk comprende una porción N-terminal definida por la SEQ ID NO: 225 y una porción C-terminal definida por la SEQ ID NO: 226 conectadas contiguamente por una secuencia intermedia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.
En algunos aspectos de la invención, el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241 y SEQ ID NO: 254, o un polipéptido al menos aproximadamente un 85 % idéntico al mismo.
En algunos aspectos de la invención, al menos aproximadamente el 70 % del enlazador en la composición o muestra está conjugado al grupo £-amino de la cadena lateral de K que está situada en una posición correspondiente al resto 80 de la SEQ ID NO: 6.
En algunos aspectos de la invención, al menos aproximadamente el 70 % de los polipéptidos comprende un enlazador unido covalentemente al grupo £-amino de la cadena lateral de K que está situada en una posición correspondiente al resto 80 de la SEQ ID NO: 6.
En algunos aspectos, la invención proporciona un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo comprende el polipéptido de la invención y en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, Fab, Fab', F(ab')2, Vh, diacuerpo o minicuerpo,
En algunos aspectos de la invención, el anticuerpo comprende dominios VH y VL de un anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en h38C2, rituximab, cetuximab, infliximab, adalimumab, natalizumab, omalizumab, ranibizumab, trastuzumab y palivizumab.
En algunos aspectos, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención, la composición de la invención o un anticuerpo de la invención, y que comprende además un vehículo aceptable.
En algunos aspectos, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención o un anticuerpo de la invención.
En algunos aspectos, la invención proporciona una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la invención. En algunos aspectos, la invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la invención.
En algunos aspectos, la invención proporciona un procedimiento para preparar un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC) que comprende un polipéptido de la invención o una composición de la invención, que comprende unir covalentemente el enlazador a un grupo saliente Z* de fórmula:
Figure imgf000009_0001
en la que R1 es F o Cl, h = 2, 3, 4 o 5 y hacer reaccionar el grupo enlazador-Z* con el polipéptido.
La presente divulgación proporciona un polipéptido que comprende un dominio constante de anticuerpo, comprendiendo el dominio constante de anticuerpo los restos K y H en las posiciones correspondientes a las posiciones 80 y 81 de la SEQ ID NO: 6 cuando dicho dominio constante de anticuerpo está alineado con la secuencia de SEQ ID NO: 6 y caracterizado porque el dominio constante de anticuerpo comprende además un resto seleccionado de entre el grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H, W en una posición correspondiente a la posición 77 de la SEQ ID NO: 6.
La divulgación proporciona un dominio constante de anticuerpo que comprende la SEQ ID NO: 98 (y todas las secuencias descritas en el presente documento que caen dentro del ámbito de la SEQ ID NO: 98), en el que la posición de la SEQ ID NO: 98 en dicho dominio constante corresponde a los restos 76- 81 de SEQ ID NO: 6 cuando la secuencia del dominio constante está alineada con la SEQ ID NO: 6.
Las secuencias se pueden alinear mediante alineación estructural, en la que se conoce la estructura de los dos polipéptidos, o mediante alineación de secuencia; cuando se usa la alineación de secuencia, el procedimiento se aumenta, preferentemente, usando conocimiento estructural de polipéptidos homólogos cuyas estructuras son conocidas.
La presente divulgación proporciona un polipéptido que comprende un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo, comprendiendo el dominio constante de anticuerpo los restos K188 y H181 de acuerdo con la numeración de Kabat, y caracterizado porque el dominio constante del anticuerpo comprende además un resto seleccionado de entre el grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H, W en una posición correspondiente a la posición 185 según la numeración de Kabat.
La presente divulgación proporciona un polipéptido que comprende un dominio de inmunoglobulina que comprende 7 cadenas p A, B, C, D, E, F y G conectados secuencialmente por cadenas de aminoácidos de conexión, en el que las cadenas p están dispuestas para formar una primera lámina p que comprende cadenas p A, B, D, y E, y una segunda lámina p que comprende cadenas p C, F y G, estando dichas primera y segunda láminas p unidas covalentemente entre sí, en las que las cadenas p E y F están conectadas juntas por una cadena EF, y dicha cadena EF comprende la secuencia, X1-X2-X3-X4-K5-H6 (SEQ ID NO: 98), y en la que X1, X3 y X4 son cada uno independientemente cualquier resto de aminoácido y se caracteriza porque X2 se selecciona del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H, W, y sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros, tautómeros, solvatos y profármacos de los mismos.
X2 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, G, I, L, R, S, T, P, N y M (SEQ ID NO: 99).
X2 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, G, I, L, S, T, P y M (SEQ ID NO: 100). En algunos aspectos, la cadena EF comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 103.
X2 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, N, P y M (SEQ ID NO: 123). X2 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, P y M (SEQ ID NO: 124). X2 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, G, I, V, L, S, T y M (SEQ ID NO: 125). X2 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, G, I, L, S, T y M (SEQ ID NO: 126). X2 puede ser S o T. X2 puede ser A o G. X2 puede ser I o L. Las selecciones de X2 descritas en el presente documento también se pueden aplicar a dominios constantes de anticuerpos de la divulgación, en los que la posición X2 corresponde con el resto 77 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 185 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos aspectos, la cadena EF comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 y SEQ ID NO: 126, y además se puede seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO:
224.
En algunos aspectos, puede haber una diferencia de un solo resto cuando se compara con los restos 75-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta 2 diferencias cuando se compara con los restos 75-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta 2 diferencias cuando se compara con los restos 75-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta 4 diferencias cuando se compara con los restos 75-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta dos diferencias no secuenciales cuando se compara con los restos 75-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta tres diferencias no secuenciales cuando se compara con los restos 75-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6.
En algunos aspectos, puede haber una diferencia de un solo resto cuando se compara con los restos 76-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta 2 diferencias cuando se compara con los restos 76-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta 3 diferencias cuando se compara con los restos 76-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta 4 diferencias cuando se compara con los restos 76-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, puede haber hasta dos diferencias no secuenciales cuando se compara con los restos 76-79 de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6.
El polipéptido puede comprender una a-hélice EF localizada en la cadena EF. En algunos aspectos, uno o más de los restos X1, X2, X3 y X4 de la SEQ ID NO: 98 comprenden parte de la a-hélice EF. En algunos aspectos, dos o más de los restos X1, X2, X3 y X4 de la SEQ ID NO: 98 comprenden parte de la a-hélice EF. En algunos aspectos, tres o más de los restos X1, X2, X3 y X4 de la SEQ ID NO: 98 comprenden parte de la a-hélice EF. En algunos aspectos, todos los restos X1, X2, X3 y X4 de la SEQ ID NO: 98 comprenden parte de la a-hélice EF. En algunos aspectos, los restos K5 y H6 de la SEQ ID NO: 98 no forman parte de una a-hélice. Las selecciones de X1, X2, X3, X4, K5, y H6 descritos en el presente documento también se puede aplicar a dominios constantes de anticuerpos de la divulgación, en los que las posiciones X1, X2, X3, X4, K5, y H6 se corresponden con los restos 76, 77, 78, 79, 800 y 81 de la SEQ ID NO: 6, o las posiciones 184, 185, 186,187, 188 y 189 de un dominio constante de la cadena ligera según la numeración de Kabat.
En algunos aspectos, la cadena EF comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.
En algunos aspectos de la divulgación, y con referencia particular a todas las secuencias en la solicitud con variabilidad en un resto correspondiente a X1, X1 de acuerdo con las secuencias anteriores se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, P, F, W, Y, S, T, C, M, N, Q, K, R, H, E y D. En algunos aspectos, X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, F, W, Y, S, T, C, M, N, Q, K, R, H, E y D. En algunos aspectos, X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, F, W, Y, S, T, C, M, N, Q, K, R, H, E y D. En algunos aspectos, X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, F, W, Y, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. En algunos aspectos, X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. En algunos aspectos, X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, S, T, M, N, Q, R, H, E y D. X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, S, T, M, N, Q, E y D. X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, S, T, M, N, Q, E y D. Las selecciones de X1 descritas en el presente documento también se pueden aplicar a dominios constantes de anticuerpos de la divulgación, en los que la posición X1 corresponde con el resto 76 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 184 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos aspectos de la divulgación, y con referencia particular a todas las secuencias en la solicitud con variabilidad en un resto correspondiente a X3, X3 de acuerdo con las secuencias anteriores se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, P, F, W, Y, S, T, C, M, N, Q, K, R, H, E y D. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, F, W, Y, S, T, C, M, N, Q, K, R, H, E y D. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, F, W, Y, S, T, C, M, N, Q, K, R, H, E y D. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, F, W, Y, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en I, L, F, W, Y, S, T M, N, Q, K, R, H, E y D. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en I, L, F, W, Y, M, N, Q, K, R, H, E y D. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en I, L, F, W, Y, N, Q, E y D. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en I, L, F, W e Y. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en F, W e Y. X3 se puede seleccionar del grupo que consiste en W e Y. Las selecciones de X3 descritas en el presente documento también se pueden aplicar a dominios constantes de anticuerpos de la divulgación, en los que la posición X3 corresponde con el resto 78 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 186 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat. En algunos aspectos de la divulgación, y con referencia particular a todas las secuencias en la solicitud con variabilidad en un resto correspondiente a X4, X4 de acuerdo con las secuencias anteriores se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, P, F, W, Y, S, T, C, M, N, Q, K, R, H, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, P, F, W, Y, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, F, W, Y, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, F, W, Y, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, G, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en A, I, V, L, S, T, M, N, Q, K, R, H, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en I, L, S, T, M, N, Q, K, R, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en S, T, M, N, Q, K, R, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en S, T, N, Q, K, R, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en N, Q, K, R, E y D. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en N, Q, K, R y E. X4 se puede seleccionar del grupo que consiste en Q, K y E. Las selecciones de X4 descritas en el presente documento también se pueden aplicar a dominios constantes de anticuerpos de la divulgación, en los que la posición X4 corresponde con el resto 79 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 187 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 6 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 7 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 8 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 9 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 6 y 11 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 6 y 10 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 6 y 9 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 7 y 11 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 7 y 10 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena EF tiene entre 8 y 10 restos de longitud.
La cadena EF puede comprender una a-hélice (la a-hélice de EF). El primer resto de la a-hélice de EF puede estar situado entre los primeros 3 restos de la cadena EF. El primer resto de la a-hélice de EF puede estar situado entre los primeros 2 restos de la cadena EF. El primer resto de la a-hélice de EF puede estar situado en el resto de la cadena EF. La a-hélice puede comprender al menos los restos X1 y X2 de la SEQ ID NO: 98 o una de las secuencia correspondiente en el presente documento que entren dentro del ámbito de la SEQ ID NO: 98. En algunos aspectos, los restos K5 y H6 correspondientes a la s Eq ID NO: 98 no están dentro de la a-hélice. En algunos aspectos, los restos KH correspondientes a las posiciones 80 y 81 de la SEQ ID NO: 6 no están dentro de la a-hélice. En algunos aspectos de la divulgación en relación con los dominios constantes de anticuerpo, el resto correspondiente a las posición 77 de la SEQ ID NO: 6 no está dentro de la a-hélice.
En algunos aspectos, el dominio de inmunoglobulina de la divulgación, que puede ser un dominio CL, comprende además el resto D, E, Q o N en a cadena de conexión entre las cadenas p C y D; la cadena CD. En algunos aspectos, el dominio CL comprende además el resto D, E, Q o N en la cadena CD, estando el resto situado para permitir que su cadena lateral de aminoácidos interaccione con al menos una de las cadenas laterales de K5 o H6 de la SEQ ID NO: 98. En algunos aspectos, el polipéptido comprende un resto D, E, Q o N localizado en la posición correspondiente a la posición 43 de la SEQ ID NO: 10 o s Eq ID NO: 6, en algunos aspectos, de acuerdo con la alineación de secuencia BLAST. En algunos aspectos, el resto es D, E o N. En algunos aspectos, el resto es D o E. En algunos aspectos, el resto es D o N.
En algunos aspectos, las cadenas p C y D están conectados por una cadena CD, que comprende un motivo CD C1-C2-C-C4 (Se Q ID NO: 255) en el que cada uno de C1, C2, C3 y C4 puede ser cualquier aminoácido o de otro modo especificado como se indica a continuación. El motivo CD se puede seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252 y SEQ ID NO: 253, comenzando dicho motivo CD en el primero o segundo resto de dicha cadena CD. En algunos aspectos, el motivo CD comienza en el primer resto de la cadena CD. En algunos aspectos, el motivo CD comienza en el segundo resto de la cadena CD. Favorablemente, el motivo CD no puede formar parte de una a-hélice.
En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, F, Y, W, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en I, L, V, M, P, F, Y y W. En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en I, L, V, P, F, Y y W. En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en I, L, V, P, F y W. En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en I, L, V, F y W. En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en I, L y V. En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en L y V. En algunos aspectos, el resto C1 del motivo CD puede ser V. Las selecciones de C1 del motivo CD descrito en el presente documento también pueden aplicarse a los dominios constantes de anticuerpo de la invención, en los que la posición C1 del motivo CD corresponde con el resto 42 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 150 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, F, Y, W, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, F, Y, W, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, V, M, P, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en M, P, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C2 del motivo CD puede ser D. Las selecciones de C2 del motivo CD descrito en el presente documento también pueden aplicarse a los dominios constantes de anticuerpo de la invención, en los que la posición C2 del motivo CD corresponde con el resto 43 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 151 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, F, Y, W, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, F, Y, W, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, V, M, P, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en M, P, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C3 del motivo CD puede ser N. Las selecciones de C3 del motivo CD descritas en el presente documento también se pueden aplicar a los dominios constantes de anticuerpo de la invención, en los que la posición C3 del motivo CD corresponde con el resto 44 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 152 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, F, Y, W, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, F, Y, W, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, G, V, M, P, S, T, N, Q, D, E, K, R y H. En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, V, G, M, P, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, I, L, V, G, S, T, N, Q, D y E. En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A, V, Q y S. En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede seleccionarse del grupo que consiste en A y S. En algunos aspectos, el resto C4 del motivo CD puede ser A. Las selecciones de C4 del motivo CD descritas en el presente documento también se pueden aplicar a los dominios constantes de anticuerpo de la invención, en los que la posición C4 del motivo CD corresponde con el resto 45 de la SEQ ID NO: 6, o el resto 153 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 6 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 7 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 8 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 9 y 12 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 6 y 11 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 6 y 10 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 6 y 9 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 7 y 11 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 7 y 10 restos de longitud. En algunos aspectos, la cadena CD tiene entre 8 y 10 restos de longitud.
El dominio de inmunoglobulina puede ser un dominio de anticuerpo. El dominio de anticuerpo puede ser un dominio constante de anticuerpo. El dominio constante del anticuerpo puede ser un dominio constante de cadena pesada (CH) o un dominio constante de cadena ligera (CL). Los dominios CH de anticuerpo pueden seleccionarse del grupo que consiste en CHa1, CHa2, CHa3, CH51, CH52, CH53, CHe1, CPH£2, CPHe3, CHe4, CHy1, CHy2, CHy3, CHp1, CHp2, CHp3 y CHp4.
En algunos aspectos, los dominios de inmunoglobulina de la divulgación son de origen mamífero (a pesar del procedimiento usado para generar cualquier versión mutada artificialmente o modificada de otro modo). La especie de mamífero puede ser humana, ratón, conejo, rata, roedor, cerdo, vaca, oveja, cabra, burro, caballo, camello, primate, mono, perro o gato. Los dominios de inmunoglobulina de la divulgación, y otras proteínas, tales como anticuerpos, a las que comprenden o unen pueden ser humanizados.
En algunos aspectos, la divulgación comprende dominios de inmunoglobulina mutantes, en la que un mutante se define como una secuencia que ha sido modificada o alterada por una secuencia diferente a su secuencia canónica natural, de modo que ciertas realizaciones de polipéptidos de la invención excluyen específicamente las secuencias naturales que caen dentro del ámbito de la definición. En algunos aspectos, por lo tanto, la presente divulgación se refiere a polipéptidos de la divulgación que comprenden una cadena Ef que difiere de su secuencia correspondiente de origen natural.
Los dominios de anticuerpos de la divulgación pueden excluir específicamente uno o más dominios constantes de la cadena pesada de la IgA natural (CHa1, CHa2, CHa3) de una o más especies seleccionadas del grupo que consiste en orangután de Borneo y Pongo pygmaeus, y/o uno o más dominios constantes de cadena pesada de IgM natural (CH|j1, CH|j2, CH|j3 y CH|j4) de una o más especies seleccionadas del grupo que consiste en ratón, rata, caballo, Equus caballus, Heterocephalus glaber, murciélago, Eptesicus fuscus y/o uno o más dominios constantes de cadena pesad de IgE natural (CHe1, CHe2, CHe3 y CHe4) de una o más especies seleccionadas del grupo que consiste en ser humano, chimpancé, mono, Erythrocebus patas, ratón, rata, murciélago, Cynopterus sphinx, oveja, Ovis aries, echidna y Tachyglossus aculeatus.
En algunos aspectos, uno o más dominios constantes de cadena pesada seleccionados del grupo que consiste en CHa2, CHa2, CHa3, CH51, CH62, OPH63, OPHel, CHe2, CHe3, CHe4, CHy1, CHy2, CHy3, CHjiI, CHji2, CHji3 y CHji4 una o más especies seleccionadas del grupo que consiste en ser humano, ratón, conejo, rata, roedor, cerdo, vaca, oveja, cabra, burro, caballo, camello, primate, mono, perro o gato están específicamente excluidos.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un dominio de inmunoglobulina, que puede ser un dominio constante de cadena ligera (CL), que comprende 7 cadenas-p A, B, C, D, E, F y G conectados secuencialmente por cadenas de aminoácidos, en el que las cadenas p están dispuestas para formar una primera lámina p que comprende cadenas p A, B, D y E, y una segunda lámina p que comprende cadenas-p C, F y G, dichas primera y segunda láminas p se unen covalentemente entre sí; en las que la cadena entre las láminas p E y F comprende la secuencia X1-X2-X3-X4-K5-H6 (SEQ ID NO: 98), y X1, X3 y X4 son cada uno independientemente cualquier resto de aminoácido y se caracteriza porque X2 se selecciona del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H y W, y sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros, tautómeros, solvatos y profármacos de los mismos. La divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas y muestras que comprenden dominios CL de la divulgación. En algunos aspectos, una a-hélice se encuentra secuencialmente en la cadena de conexión entre las cadenas-p- E y F.
En parte, aspectos de la divulgación se basan en el sorprendente descubrimiento de que la conjugación dirigida al sitio a un grupo KH reactivo localizado en la cadena Ef de un dominio de inmunoglobulina, que puede ser un dominio constante de cadena ligera (CL), se mejora mediante una mutación de 3 restos de aminoácidos corriente arriba que elimina la presencia de un resto ácido, tal como D o E, y que evita la introducción de los restos aromáticos F o Y u otros posibles sitios de conjugación como K o C.
El injerto de una secuencia de la divulgación en la cadena EF puede impartir una mayor especificidad de conjugación en los dominios de inmunoglobulina, en particular, los dominios CL. Esto puede ser útil cuando se conjugan enlazadores y/o restos efectores en dominios de inmunoglobulina, y dominios CL en general, y anticuerpo y partes de unión a antígeno del mismo en particular. En algunos aspectos, por lo tanto, la divulgación se refiere a una clase nueva de Conjugados de Anticuerpos Multifuncionales (MAC), que comprenden un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, conjugado covalentemente a un enlazador y/o resto efector a través de un enlazador, caracterizado porque el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo comprende un polipéptido de la divulgación, y el enlazador está unido covalentemente al grupo £-amino de la cadena lateral de K5 de la SEQ ID NO: 98.
En algunos aspectos, el dominio de inmunoglobulina de la divulgación, que puede ser un dominio CL, está conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL). Conjuntamente, estos pueden comprender una cadena ligera de anticuerpo.
En algunos aspectos, el enlace covalente entre la primera y la segunda láminas p es un enlace disulfuro. En algunos aspectos, el enlace disulfuro está entre las cadenas p B y F.
El dominio CL puede ser una cadena kappa constante de cadena ligera c(CLk) y puede ser de rata, ratón, mono, conejo, cabra, oveja, vaca, cerdo, caballo, burro, perro, gato u origen humano. En algunos aspectos, la cadena CLk comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37, SEQ iD NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 122.
En algunos aspectos, el CLk comprende una porción N-terminal definida por la SEQ ID NO: 225 y una porción en C' terminal definida por la SEQ ID NO: 226 conectada contiguamente juntas por una secuencia intermedia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.
El dominio de inmunoglobulina puede ser un dominio CLA y puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 y SEQ ID NO: 244. En algunos aspectos, el dominio CLA comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243 y SEQ ID NO: 244.
El CLA puede comprender una porción N'-terminal definida por una de SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232 o SEQ ID NO: 233 conectadas contiguamente por una secuencia intermedia a una porción C' terminal definida por la SEQ ID NO: 234 o la SEQ ID NO: 235, seleccionándose secuencia intermedia del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.
En algunas realizaciones de la divulgación en las que el dominio de inmunoglobulina comprende un dominio CLA, el dominio puede comprender adicionalmente un motivo CD como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones de la divulgación en las que el dominio de inmunoglobulina comprende un dominio CHy1, el dominio puede comprender adicionalmente un motivo CD como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones de la divulgación en las que el dominio de inmunoglobulina comprende un dominio CHy2, el dominio puede comprender adicionalmente un motivo CD como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones de la divulgación en las que el dominio de inmunoglobulina comprende un dominio CHy3, el resto X2 de la cadena EF puede no ser R; en algunos aspectos, la secuencia de la cadena F se puede seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224. En algunos aspectos, la cadena CD de un dominio CHy3 de la divulgación puede comprender además un motivo CD como se describe en el presente documento.
Cuando se conjuga con un enlazador adecuado para la conjugación con un resto efector, el grupo £-amino de la cadena lateral de K5 de SEQ ID NO: 98 puede estar unido covalentemente al enlazador.
En parte, la invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que mutando CLk-D77 a uno de A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H o W proporciona un aumento significativo en el grado de especificidad de la conjugación a CLk-K80.
La reacción del resto efector con el dominio constante de cadena ligera de un anticuerpo es particularmente deseable para minimizar, o prevenir, cualquier interferencia con la unión de la porción Fc del anticuerpo a los receptores Fc (tales como FcyR y FcRn) o la unión del anticuerpo a su objetivo respectivo. Por el contrario, la conjugación del resto efector respectivo a la porción Fc de un anticuerpo puede disminuir la semivida del anticuerpo in vivo y/o su capacidad para interaccionar con el sistema inmunológico (función efectora). La conjugación del resto efector en la región variable de cadena pesada (VH) o región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo conlleva el riesgo de disminuir la unión del anticuerpo a su afín.
La conjugación preferente del resto efector a CLk o el dominio lambda constante de cadena ligera (CLA) simplifica la creación de isotipos de MAC al permitir cambios isotípicos de los dominios constantes de cadena pesada (CH) del anticuerpo sin que afecte a los sitios de conjugación del resto efector al anticuerpo.
El enlazador y/o resto efector se pueden unir covalentemente a la cadena lateral de CLk-K80 (por ejemplo, una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, Se Q ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 y SEQ ID NO: 122). El CL está ubicado lejos de las regiones clave de un anticuerpo típico del que formaría parte, tal como la región paratopo, el dominio de unión FcRn, la bisagra, los dominios de unión a FcR; esto proporciona la ventaja de que la unión preferente en estos sitios limita la cantidad de interferencia a la interacción anticuerpo-antígeno cuando el MAC está conjugado con el resto efector.
En algún aspecto, la región CLk comprende al menos los restos 62-103 de las SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108 o SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121 o SEQ ID NO: 122. En algunos aspectos, CLk-x82 puede ser cualquier aminoácido. En algunos aspectos, CLk-x82 se puede seleccionar del grupo que consiste en K, R, G, A, V, L, I, S, T, C, M, N, Q, D, E, H, F, W e Y. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser G, A, V, L o I. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser K, R, N o Q. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser D o E. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser K, R, G, A, V, L, I, N o Q. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser D o E. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser K, R, G, A, V, L, I, N, Q, D o E. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser D o E. En algunos aspectos, CLk-X82 puede ser H, F W o Y. En algunos aspectos CLk-x82 no es prolina. En algunos aspectos, CLk-x82 es K. En algunos aspectos, CLk-x82 Es R.
En algunos aspectos, los anticuerpos de la divulgación o porciones de unión a antígeno de los mismos, comprenden un resto efector conjugado a K5 de SEQ ID NO: 98 en ambas cadenas ligeras. En algunos aspectos, el resto efector está conjugado con K5 de SEQ ID NO: 98 en una cadena ligera solo. En algunos aspectos, el resto efector solo está conjugado con K5 de SEQ ID NO: 98. En algunos aspectos, el resto efector está conjugado en K5 de SEQ ID NO: 98 en una cadena ligera y en otra ubicación en el anticuerpo, o porciones de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el resto efector está conjugado en K5 de SEQ ID NO: 98 en una cadena ligera y otras 2 ubicaciones en el anticuerpo, o porciones de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el resto efector está conjugado con K5 de SEQ ID NO: 98 en una cadena ligera y otras 3 ubicaciones en el anticuerpo, o porciones de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el resto efector está conjugado con K5 de SEQ ID NO: 98 en ambas cadenas ligeras, y en otra ubicación. En algunos aspectos, el resto efector está conjugado en K5 de SEQ ID NO: 98 en ambas cadenas ligeras, y en otras 2 ubicaciones. En algunos aspectos, el resto efector está conjugado en K5 de SEQ ID NO: 98 en ambas cadenas ligeras, y en otras 3 ubicaciones.
En algunos aspectos, la invención se refiere a un dominio de inmunoglobulina (Ig) mutado, que comprende un resto sustituido dentro del dominio de Ig mutado que corresponde a la posición 77 de la SEQ ID NO: 10; o la SEQ ID NO: 6, caracterizado porque el resto sustituido se selecciona de el grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, M, Q, N, P, H y W, con la condición de que el dominio de Ig mutado comprenda además los restos K y H en las posiciones correspondientes a las posiciones 80 y 81, respectivamente, de la SEQ ID NO: 10; o SEQ ID NO: 6. En algunos aspectos, el dominio de Ig mutado comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41,42, 44, 46, 47, 49, 50, 51,52, 54, 98, 99, 100, 101,102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 115, 116, 117, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, y 126.
Depósitos
En algunos aspectos, la invención proporciona vectores y ácidos nucleicos depositados con la ATCC, polipéptidos codificados por dichos vectores y ácidos nucleicos, composiciones que comprenden polipéptidos codificados por dichos vectores y ácidos nucleicos, y polipéptidos expresados por dichos ácidos nucleicos y vectores. Los siguientes materiales se han depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE. UU. (ATCC):
Material SEQ ID NO: N.° de registro en ATCC Fecha del depósito
hCLk-Km(3)-D77A 37 PTA-13394 12/12/2012
h38C2-[LC-D 185A] 254 PTA-13395 12/ 12/ 2012
El vector hCLk-Km (3) -D77A es un vector de clonación TA con un inserto de ADN polinucleotídico que codifica el dominio kappa constante de la cadena ligera humana (Km (3)) con una mutación D77A, como se expone en la SEQ ID NO: 37, y el vector h38C2-[LC-D185A] es un inserto de ADN polinucleotídico que codifica la cadena ligera de 38C2 humanizada con una mutación D77A, como se expone en la SEQ ID NO: 254.
En algunos aspectos, la invención proporciona una célula huésped aislada que produce de forma recombinante un dominio de inmunoglobulina de la presente invención o una proteína o anticuerpo que comprende un dominio de inmunoglobulina de la presente invención. La presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica proteínas, dominios y anticuerpos de la presente invención, y vectores que comprenden dichos polinucleótidos. Los vectores de la presente invención pueden comprender secuencias de depósito en la ATCC. En algunos aspectos, la invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo, dominio de inmunoglobulina, o proteína, que comprende cultivar una célula huésped en condiciones que dan como resultado la producción del anticuerpo, dominio de inmunoglobulina o proteína, y aislar el anticuerpo, dominio de inmunoglobulina, o proteína, del cultivo o célula huésped.
En algunos aspectos, la presente invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID NO: 240, SEQ ID NO: 241 y SEQ ID NO: 254, o un polipéptido que es al menos aproximadamente un 85 % o al menos aproximadamente un 90 % o al menos aproximadamente un 95 % o al menos aproximadamente un 96 % o al menos aproximadamente un 97 % o al menos aproximadamente un 98 % o al menos aproximadamente un 99 % idéntico a una o más de las secuencias mencionadas anteriormente.
Muestras y composiciones de la divulgación
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición o muestra de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio CL de la divulgación conjugado covalentemente con un resto efector, en el que al menos aproximadamente un 50 % del resto efector en la composición o muestra se conjuga con K5 de la SEQ ID NO: 98. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 60 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 70 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 80 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 90 %.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición (o muestra) de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio CL de la divulgación, en la que al menos aproximadamente un 50 % del anticuerpo comprende un resto efector unido covalentemente a K5 de la SEQ ID NO: 98 en al menos una cadena ligera. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 60 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 70 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 80 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 90 %. En algunos aspectos, el resto efector se conjuga covalentemente con K5 de la SEQ ID NO: 98 en ambas regiones constantes de la cadena ligera.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición (o muestra) de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio de CL de la divulgación conjugado covalentemente con un resto efector, en el que al menos aproximadamente un 30 % de la muestra comprende restos efectores conjugados en aproximadamente 2 ubicaciones por anticuerpo y en el que al menos un sitio de conjugación del resto de efector es K5 de la SEQ ID NO: 98. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 40 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 50 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 60 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 70 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 80 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 90 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 95 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 99 %.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición (o muestra) de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio de CL de la divulgación conjugado covalentemente con un resto efector, en el que al menos aproximadamente un 30 % de la muestra comprende restos efectores conjugados en aproximadamente 3 ubicaciones por anticuerpo y en el que al menos 2 sitios de conjugación del resto efector son K5 de la SEQ ID NO: 98 en cada cadena ligera. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 40 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 50 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 60 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 70 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 80 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 90 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 95 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 99 %.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición (o muestra) de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio CL de la divulgación, en el que al menos el 50 % de las moléculas de la cadena ligera están conjugadas con al menos un resto efector en K5 de la SEQ ID NO: 98. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 60 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 65 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 70 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 75 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 80 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 85 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 90 %. En algunos aspectos, es al menos aproximadamente un 95 %.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona una composición (o muestra) de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que comprende un dominio CL de la divulgación conjugado con un resto efector en K5 de la SEQ ID NO: 98, en el que al menos aproximadamente un 70 % de las moléculas de cadena pesada no están conjugadas con el resto efector. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 75 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 80 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 85 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 90 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 95 %. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente un 99 %. En algunos aspectos, sustancialmente todas las moléculas de la cadena pesada no están conjugadas con el resto efector.
En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos individuales de cadena ligera que no están conjugados tiene un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 y 55 %, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60 %. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos individuales de cadenas ligeras que se conjugan en una ubicación tiene un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50 y 55 %, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 y 95 %. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos individuales de cadena ligera que no están conjugados en 2 ubicaciones tiene un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 5, 10, 15, 20 y 25 %, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 5, 16, 7, 8, 9, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40 %.
En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos individuales de cadena pesada que no están conjugados tiene un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 50, 55, 60, 65, 70, 75 y 80 % y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 99 %. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos individuales de cadena pesada que están conjugados en una ubicación tiene un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 1, 2, 5, 10, 15, 20 y 25 % y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 y 50 %. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos individuales de cadena pesada que están conjugados en 2 ubicaciones tiene un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 y 15 % y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 2, 3, 4, 5, 10, 15 y 20 %.
En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la divulgación tiene un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 1,8, 1,85, 1,9, 1,95 y 2, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 1,6, 1,7, 1,75 1,8, 1,85, 1,9, 1,95, 2,0, 2,05, 2,1, 2,15, 2,2, 2,25, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 y 5. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la divulgación es entre aproximadamente 1,5 y aproximadamente 2,5. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la divulgación está entre aproximadamente 1,6 y aproximadamente 2,4. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la divulgación está entre aproximadamente 1,7 y aproximadamente 2,3. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la divulgación está entre aproximadamente 1,8 y aproximadamente 2,2. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la divulgación n es una cantidad seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,55, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,65, aproximadamente 1,7, aproximadamente 1,75, aproximadamente 1,8, aproximadamente 1,85, aproximadamente 1,9, aproximadamente 1,95, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,05, aproximadamente 2,1, aproximadamente 2,15, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,25, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4 y aproximadamente 2,5. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 1,7. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 1,8. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 1,9. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 2. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 2,1. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 2,1. En algunos aspectos, la cantidad es aproximadamente 2,3.
En algunos aspectos de la divulgación, el número de conjugaciones por anticuerpo es menor de 2, teniendo al menos el 50 % de la población de anticuerpos solo una única conjugación por anticuerpo. Estas muestras son ventajosas, ya que permiten que las reacciones de conjugación adicionales se dirigen al sitio CLk restante. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 1,5. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,6 y aproximadamente 1,4. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,7 y aproximadamente 1,3. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,8 y aproximadamente 1,2. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,9 y aproximadamente 1,1.
Una de las ventajas de la invención es que, dependiendo de los reactivos y las condiciones de reacción (especialmente el éster del grupo saliente y la relación molar enlazador:anticuerpo), las composiciones y las muestras de la invención se pueden generar con un número definido de restos efectores en relación con un número definido de anticuerpos. Esto puede ser especialmente útil cuando se equilibran las reactividades relativas y las ventanas terapéuticas del resto efector y el anticuerpo. Además, en algunas situaciones, aumentar el número de péptidos u otros restos activos por anticuerpo más allá de un cierto umbral puede no dar como resultado un aumento de la unión a la diana o efecto terapéutico. Es útil, por lo tanto, poder controlar el número de péptidos conjugados por anticuerpo, y al hacerlo, dirigir la localización de la conjugación para minimizar Fc o combinar la interferencia del sitio. En algunas situaciones, por lo tanto, aspectos de la invención que permiten una conjugación reducida, puede ser ventajoso, preferentemente, decorar solo un único CLk-K80. Además, mientras que la conjugación a CLk-K80 es fiable y robusta, la conjugación a otras lisinas de la superficie de los anticuerpos, cada una de las reactividades ligeramente diferentes y pl puede dar como resultado una muestra heterogénea de anticuerpos conjugados que pueden liberar moléculas conjugadas en momentos inoportunos o irregulares, tal como durante la circulación y antes de la liberación del resto efector a la diana mediante reconocimiento de anticuerpos (o liberación del anticuerpo a la diana, mediante reconocimiento con el resto efector). Esto puede ser particularmente indeseable con toxinas (es decir, un agente citotóxico con potencial utilidad para matar tumores y células tumorales).
En algunos aspectos, la toxina es una auristatina; un derivado del producto natural dolastatina 10 (MMAD). Las auristatinas representativas incluyen MMAE (N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaprolina-norefedrina) y MMAF (N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaprolina-fenilalanina).
En algunos aspectos, el anticuerpo está dirigido a una diana diferente dentro de la misma ruta que el resto efector. En algunos aspectos, el anticuerpo está dirigido a una diana diferente del resto efector.
En algunos aspectos, las VH y VL del anticuerpo utilizado para la conjugación pueden ser útiles en el campo de la oncología. Los anticuerpos adecuados incluyen; rituximab, (Rituxan™), un anticuerpo anti-CD20 quimérico, IgGlK, usado para tratar el cáncer y, en particular, el linfoma no Hodgkin y también la artritis reumatoide; cetuximab (Erbitux™) un anticuerpo anti-receptor de EGF quimérico, IgGlK, usado para tratar el cáncer, y, en particular, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello.
En algunos aspectos, el anticuerpo usado para la conjugación puede ser útil en el campo de los trastornos inmunológicos y otros trastornos autoinmunitarios. Los anticuerpos adecuados incluyen infliximab (Remicade™) un anticuerpo anti-TNFa quimérico, IgGlK, usado para tratar la artritis reumatoide, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriásica y espondilitis anquilosante; adalimumab (Humira™) un anticuerpo anti-TNFa humano, IgGlK, usado para tratar la artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil y espondilitis anquilosante; natalizumab (Tysabri™) un anticuerpo anti-integrina-a4 humanizado, IgG4K, utilizado para tratar la esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, artritis idiopática juvenil, artritis psoriásica, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn; omalizumab (Xolair™) un anticuerpo anti-IgE humanizado, IgGlK, usado para tratar el asma alérgica; ranibizumab (Lucentis™) un anticuerpo anti-VEGF humanizado, IgGlK, usado para tratar la DMA húmeda; y palivizumab (Synagis™) un anticuerpo anti-VSR a humanizado, IgGlK, usado para tratar enfermedades infecciosas, incluyendo el virus sincitial respiratorio.
En algún aspecto, los compuestos y composiciones de la invención se pueden usar para tratar las afecciones mencionadas.
Restos efectores
El resto efector puede ser un agente terapéutico, proteína, péptido, ácido nucleico, aptámero, molécula pequeña, agonista de proteínas, antagonista de proteínas, regulador metabólico, hormona, toxina, factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que puede detectarse o visualizarse fácilmente, tal como la peroxidasa de rábano picante.
En algunos aspectos, el resto efector puede ser una proteína o péptido y puede estar conectado al enlazador a través de un resto de unión a péptido. La proteína o péptido puede comprender uno o ambos de un grupo de terminación amino-terminal R1 y un grupo de terminación carboxilo-terminal R2. R1 puede ser CH3, C(O)CH3, C(O)CH3, C(O)CH2CH3, C(O)CH2CH2CH3, C(O)CH(CH3)CH3, C(O)CH2CH2CH2CH3, C(O)CH(CH3)CH2CH3, c(o)CaH5, C(O)CH2CH2(CH2CH2O)i-5Me, diclorobenzoílo (DCB), difluorobenzoílo (DFB), carboxilato de piridinilo (PyC) o amido-2-PEG, un grupo protector de amino, un grupo de ácidos grasos lipídicos o un carbohidrato. R2 puede ser OH, NH2, NH(CH3), NHCH2CH3, NHCH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH3, NHCH2CH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH2CH3, NHC6H5, NHCH2CH2OCH3, NHOCH3, NHOCH2CH3, un grupo protector de carboxi, un grupo de ácidos grasos lipídicos o un carbohidrato.
El resto de unión a proteína o péptido puede ser K, Ksh, homólogos de lisina, Dap, Dab, Orn, R, C, restos que contienen tiol, S, T, Y, D, E, N o Q. La proteína o péptido puede estar conectado al enlazador a través del extremo amino del aminoácido N-terminal. La proteína o péptido puede estar conectado al enlazador a través del extremo carboxilo del aminoácido C-terminal. Se puede añadir un resto de aminoácido adicional al extremo N o C para que funcione como un resto de enlace, ya sea por la conexión a través de la cadena lateral de aminoácidos o el extremo amino o carboxilo.
Enlazadores
En aspectos de la invención relacionados con conjugados con restos efectores, en procedimientos particulares de preparación de conjugados y MAC, se entenderá que la invención se aplica igualmente a los conjugados con los enlazadores en ausencia de restos efectores. Un ejemplo de la utilidad de tales conjugados sería como compuestos intermedios que se pueden usar de forma útil para preparar conjugados de resto efector-enlazador-polipéptido de la invención.
El resto efector de la divulgación (tal como una molécula pequeña, aptámero, ácido nucleico, proteína, o péptido) se puede unir covalentemente al anticuerpo o a la porción de unión a antígeno del mismo mediante un enlazador. El enlazador se puede unir covalentemente al péptido mediante un grupo amino de la cadena lateral del resto de unión a péptido. Este puede ser un resto de lisina. En algunas realizaciones, el resto de unión es un resto portador de tiol, tal como Cys o Ksh y el enlazador se une covalentemente al péptido a través del grupo tiol terminal del resto de unión.
El enlazador puede ser lineal o ramificado (para permitir la conjugación a más de un resto efector por adición de conjugación (AC)) y opcionalmente incluye uno o más grupos carbocíclicos o heterocíclicos. La longitud del enlazador se puede ver en términos del número de átomos lineales entre el resto efector y el anticuerpo, con fracciones cíclicas, tales como anillos aromáticos y similares, que se contarán tomando la ruta más corta alrededor del anillo. En algunas realizaciones, el enlazador tiene un tramo lineal de entre 5-15 átomos, en otras realizaciones 15-30 átomos, en aún otras realizaciones 30-50 átomos, en aún otras realizaciones, 50-100 átomos y en aún otras realizaciones 100-200 átomos. En algunas realizaciones, la longitud del enlazador es un intervalo con un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 y 200.
Otras consideraciones del enlazador incluyen el efecto sobre las propiedades físicas o farmacocinéticas del compuesto resultante, tal como la solubilidad, la lipofilicidad, la hidrofilicidad, la hidrofobicidad, la estabilidad (más o menos estable así como la degradación planificada), la rigidez, la flexibilidad, la inmunogenicidad, la modulación de la unión a anticuerpo, la capacidad para incorporarse en una micela o liposoma, y similares.
El enlazador puede ser un enlazador peptidilo. En algunas realizaciones, el enlazador peptidilo puede tener entre 3­ 20 aminoácidos de longitud, tal como las repeticiones de un único resto de aminoácido (por ejemplo, poliglicina) o combinaciones de restos de aminoácido para proporcionar un enlazador peptídico que imparte una presentación favorable del resto efector o farmacocinética. Los enlazadores peptidilo que serían más compatibles con la presencia de grupos activadores pueden carecer de restos de lisina e histidina. La SEQ ID NO: 79 es un enlazador peptidilo de ejemplo.
Como alternativa, el enlazador puede ser un enlazador no peptidilo. Ejemplos típicos de estos tipos de enlazadores serían aquellos basados en hidrocarburos de cadena lineal o ramificada o polietilenglicoles de diferentes longitudes.
Estos pueden incorporar otros grupos para afectar a la solubilidad, la rigidez, el punto isoeléctrico, tales como anillos aromáticos o no aromáticos, grupos halógenos, cetonas, aldehídos, ésteres, sulfonilos, fosfato, y así sucesivamente.
En algunos aspectos de la invención, el enlazador puede comprender la fórmula: -X1-Y1-Z -; en la que X1 es el grupo de unión al resto efector (por ejemplo, a través de un resto de unión a péptido), Y1 es una región espaciadora y Z es un resto de unión a la cadena lateral de un resto de lisina en un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGF1R).
En algunos aspectos, el enlazador puede ser de fórmula X1Y1Z* cuando no está unido al anticuerpo, en la que Z* es un grupo saliente, de modo que cuando se conjugue con el anticuerpo, el grupo saliente Z* reacciona con el sitio de conjugación del anticuerpo para formar el enlazador conjugado X1Y1Z.
X1 se puede seleccionar para permitir una estrategia de unión covalente direccional específica al resto efector (por ejemplo, a través del resto de unión a péptido). En algunos aspectos, X1 se puede seleccionar del grupo que consiste en COOH, isocianato, isotiocianato, azida de acilo, ácido sulfónico, haluro de sulfonilo, aldehído, cetona, epóxido, carbonato, reactivo de arilación, imidoéster, grupo amina y grupo maleimida. Por ejemplo, cuando el resto de unión a péptido comprende un grupo nucleófilo, X1 puede ser un grupo electrofílico y viceversa. Por ejemplo, si la cadena lateral de resto de unión a péptido comprende un grupo amina, tal como K, H, ornitina, Dap o Dab, X1 puede ser COOH u otro electrófilo reactivo de forma similar, por ejemplo, un isocianato, isotiocianato, azida de acilo, ácido sulfónico o haluro de sulfonilo, aldehído o cetona, epóxido, carbonato, reactivo de arilación o imidoéster. Si el resto de unión a péptido es D o E, X1 puede comprender un grupo nucleofílico, tal como un grupo amina. Cualquiera de estas estrategias permite que se forme un enlace covalente entre el grupo X1 y el resto de unión a péptido mediante estrategias de formación de enlace amida. Por ejemplo, cuando X1 es COOH, puede ser activado como un éster de pentafluorofenilo. En este caso, la reacción con un grupo amina en el resto de unión a péptido conduce a la formación del enlace amida, mientras que el pentafluorofenol es un grupo saliente (que puede denominarse X1*).
Figure imgf000020_0001
La flecha indica el punto de unión al resto de unión a peptido y la linea paralela representa el punto de unión al grupo Y1 del enlazador.
Figure imgf000020_0002
Cuando el grupo de unión a péptido es C, homólogos de C u otros restos que contienen grupos tiol (tales como Ksh), X1 puede comprender un grupo maleimida, lo que permite que una estrategia de reacción de adición de tiolmaleimida se una covalentemente al grupo X1 al resto de unión a péptido. En algunos aspectos, X1 puede ser maleimida:
Figure imgf000020_0003
en el que la flecha indica el punto de unión al resto de unión a péptido y la línea paralela representa la unión al grupo Y1 del enlazador. Para facilitar la nomenclatura, los enlazadores descritos en el presente documento que se han construido usando grupos maleimida se describen como enlazadores que contienen maleimida y pueden titularse MAL para indicarlo, aunque después de la construcción del enlazador, el grupo maleimida generalmente se convierte en un anillo de succinimida.
Figure imgf000020_0004
En algunos aspectos, el resto de unión es Ksh, y el grupo X1 es maleimida. En algunos aspectos, X1 puede comprender una función carboxilo activada por éster de pentafluorofenilo que puede formar una amida con la cadena lateral de lisina en el péptido.
Figure imgf000020_0005
En algunos aspectos, X1 puede comprender un grupo tiol, lo que permite que se forme un puente disulfuro entre el resto de unión a péptido y el grupo X1.
En algunas realizaciones, Y1 es una cadena de conexión biológicamente compatible que incluye cualquier átomo seleccionado de entre el grupo que consiste en C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br e I, y puede comprender uno o más aminoácidos, polímero o copolímero de bloques. Y1 se puede seleccionar de modo que proporcione una longitud total del enlazador de entre 2-100 átomos. Y1 se puede seleccionar de modo que la longitud total del enlazador esté entre 5 y 30 átomos. Y1 se puede seleccionar de modo que la longitud total del enlazador sea de 15-25 átomos. Y1 se puede seleccionar de modo que la longitud total del enlazador esté entre aproximadamente 17 y aproximadamente 19 átomos.
En algunos aspectos, Y1 puede ser un ácido aminoalcalnoico, tal como:
Figure imgf000021_0001
en el que n = 0 a 20, en algunos aspectos 1-10, en algunos aspectos, 1-5 y en algunos aspectos, 1 y, en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos, Y1 puede ser un diácido alcanoico, tal como:
Figure imgf000021_0002
en el que n = 0 a 20, en algunos aspectos 1-10, en algunos aspectos, 1-5 y en algunos aspectos, 1 y, en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos, Y1 puede ser una poliglicina, tal como:
Figure imgf000021_0003
en la que n = 0 a 10, en algunos aspectos 1-10, en algunos aspectos, 1-5 y en algunos aspectos, 1 y, en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos, Y 1 , X 1 -Y 1 , 1 Y -Z y X 1 -Y 1 -Z se pueden seleccionar del grupo que consiste en:
Figure imgf000022_0001
en la que m, n, j y k son cada uno independientemente de 0 a 30. En algunos aspectos n = 1-10, en algunos aspectos, n=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos, m = 1-10, en algunos aspectos, m=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. M puede ser 1. M puede ser 2. M puede ser 3. M puede ser 4. M puede ser 5. M puede ser 6. En algunos aspectos j = 1-10, en algunos aspectos, j=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. J puede ser 1. J puede ser 2. J puede ser 3. J puede ser 4. J puede ser 5. J puede ser 6. En algunos aspectos k = 1-10, en algunos aspectos, k = 1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para k se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para k se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. K puede ser 1. K puede ser 2. K puede ser 3. K puede ser 4. K puede ser 5. K puede ser 6. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 200 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 150 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 100 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 50 átomos. En algunos aspectos, el intervalo de la longitud total de la cadena de Y1 en números de átomos puede tener un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, y 60, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 , 65, 70, 75, 80, 85 , 90, 95 y 100. En algunos aspectos, el enlazador X1Y1Z puede ser idéntico a los grupos Y1 anteriores. En algunos aspectos, la línea ondulada se conecta al grupo X1. En algunos aspectos, las líneas paralelas se conectan al grupo X1. En algunos aspectos, la línea ondulada se conecta al grupo Z. En algunos aspectos, las líneas paralelas se conectan al grupo Z. En algunos aspectos, la línea ondulada se conecta a la cadena lateral de CLk-K80. En algunos aspectos, las líneas paralelas se conectan a la cadena lateral de CLk-K80. En algunos aspectos, la línea ondulada se conecta al resto efector. En algunos aspectos, las líneas paralelas se conectan al resto efector. En algunos aspectos, una de las líneas onduladas o paralelas son puntos de unión a una parte escindible del enlazador (O).
Grupos salientes
Z* se puede seleccionar de modo que permita una estrategia de unión covalente direccional específica a una cadena lateral de lisina en el anticuerpo. Por ejemplo, Z puede ser COOH u otro electrófilo reactivo similar para reaccionar con el £-amino de las cadenas laterales de lisina de la superficie usando una de varias estrategias posibles de formación de enlaces amida.
En algunos aspectos, Z* puede usarse para formar un éster activo. Los ésteres activos se conectan con aminas y, de este modo, pueden conjugarse con el £-amino de una cadena lateral de lisina del anticuerpo. La función Z carboxilo que permite la formación del éster activo estará presente en el extremo del grupo Y. La función alcohólica o fenólica del éster activo actúa como grupo saliente Z* durante la reacción de conjugación, lo que permite la conexión con la cadena lateral de lisina en el anticuerpo mediante la generación de una amida.
En algunas realizaciones, el grupo Z* comprende una estructura de fórmula:
Figure imgf000023_0001
en la que R' es un grupo alifático o aromático.
En algunas realizaciones, el grupo Z* tiene la fórmula:
Figure imgf000023_0002
en la que R'= cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y puede estar presente en una cantidad de entre 1 y 5. En algunas realizaciones, R1 puede ser un halógeno y pueden estar presentes 4 o 5 átomos de halógeno. En algunas realizaciones, puede haber 4 átomos R1. En algunas realizaciones, puede haber 5 átomos R1. En algunas realizaciones, Z* puede ser tetrafluorofenilo. En algunas realizaciones, Z* puede comprender la fórmula:
Figure imgf000023_0003
Pentafluorofenilo
1
en la que la línea paralela representa el punto de unión a la parte Y del enlazador.
En algunas realizaciones, Z* puede comprender la fórmula:
Figure imgf000023_0004
en la que R3, R4, R5, R6 y R7 se selecciona cada uno independientemente entre el grupo que consiste en F, Cl, H y la fórmula CR8R9R10, de modo que no más de dos de R3, R4, R5, R6 y R7 sean H, y uno de R3, R4, R5, R6 y R7 sea o n 10 8 9 10 J J JC R R R , y R, R, y R se seleccionan cada uno de forma independiente entre el grupo que consiste en F, Cl y H, de forma que no más de uno de R8, R9 y R10 pueden ser H, y en la que la línea paralela representa el punto de unión a la parte Y1 del enlazador. En algunos aspectos, el grupo Cr8R9R10 se localiza en uno de R4, R5 o R6 En algunos aspectos, el grupo CR8R9R10 se localiza en R5
En algunos aspectos, R3, R4, R5, R6 y R7 se selecciona cada uno independientemente entre el grupo que consiste en F Cl, H y la fórmula CR8R9R10, de modo que no más de uno de R3, R4, R5, R6 y R7 sea H, y uno de R3, R4, R5, R6 y R7 sea Cr8R9R10 En algunos aspectos, R3, R4, R5, R6 y R7 se selecciona cada uno independientemente entre el grupo que consiste en F, Cl y la fórmula CR8R9R10, y uno es CR8R9R10
En algunos aspectos, R3, R4, R6 y R7 son cada uno F. En algunos aspectos, R8, R9, y R10 se seleccionan cada uno de forma independiente entre el grupo que consiste en F y Cl. En algunos aspectos, R8, R9, y R10 son cada uno F. En algunas realizaciones, Z* puede comprender la fórmula:
Figure imgf000023_0005
2,3,5,6-tetrafluoro-4-(trifluorometil)fenilo
1
en la que la línea paralela representa el punto de unión a la parte Y del enlazador.
En algunos aspectos, el grupo Z* tiene la fórmula:
Figure imgf000024_0001
en la que R'= cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solo o en combinación, y h = 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 puede ser un halógeno. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl, y h = 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl, y h = 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h=5. En algunos aspectos, Z* se puede seleccionar del grupo que consiste en:
Figure imgf000024_0005
En algunos aspectos, Z* se puede seleccionar del grupo que consiste en:
Figure imgf000024_0002
En algunos aspectos, Z* se puede seleccionar del grupo que consiste en:
Figure imgf000024_0003
En algunos aspectos, Z* se puede seleccionar del grupo que consiste en:
Figure imgf000024_0004
Para tales ésteres activos, el grupo saliente es Z* y el grupo Z en sí mismo es el carbonilo unido al grupo Y1. Cuando reaccionó con el anticuerpo, el grupo Z* forma una amida, como se muestra más adelante,
Figure imgf000025_0001
En algunas realizaciones, Z es
Figure imgf000025_0002
En algunas realizaciones, el grupo Z* comprende un éster de escuarato, tal como
Figure imgf000025_0003
en la que R = grupo alifático o aromático sustituido y se puede seleccionar entre el grupo que consiste en:
Figure imgf000025_0004
En algunas realizaciones, el grupo Z comprende un grupo maleimida:
Figure imgf000025_0005
En algunos aspectos, el enlazador x 1*Y1Z* comprende un éster maleimida-PEG-PFP de la estructura:
Figure imgf000025_0006
en la que n = 1 a 12. En algunos aspectos, n = 1 a 5. En algunos aspectos n = 2. En algunos aspectos n = 1. En algunos aspectos, el enlazador x 1*Y1Z* comprende una estructura seleccionada del grupo que consiste en:
Figure imgf000026_0001
10, en algunos aspectos, n=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos, m = 1-10, en algunos aspectos, m=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. M puede ser 1. M puede ser 2. M puede ser 3. M puede ser 4. M puede ser 5. M puede ser 6. En algunos aspectos j = 1-10, en algunos aspectos, j=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. J puede ser 1. J puede ser 2. J puede ser 3. J puede ser 4. J puede ser 5. J puede ser 6. En algunos aspectos k = 1-10, en algunos aspectos, k = 1­ 5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para k se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para k se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. K puede ser 1. K puede ser 2. K puede ser 3. K puede ser 4. K puede ser 5. K puede ser 6. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 200 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 150 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 100 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 50 átomos. En algunos aspectos, el intervalo de la longitud total de la cadena de Y1 en números de átomos puede tener un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, y 60, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 , 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100.
En algunos aspectos, el MAC comprende un enlazador X1Y1Z de fórmula:
Figure imgf000027_0001
en la que n = 1 a 25. En algunos aspectos n = 1 a 20. En algunos aspectos n = 1 a 10. En algunos aspectos n = 4. N=3, En algunos aspectos n = 1.
En algunos aspectos, el MAC comprende 2 péptidos conjugados por anticuerpo. En algunos aspectos, un péptido se conjuga en cada uno de los 2 restos de CLk-K80 del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
En algunos aspectos, el polipéptido de la invención comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:
Figure imgf000028_0001
en la que -KH- es un enlace covalente a la cadena lateral de K5 de SEQ ID NO: 98, el resto efector-LR es un enlace covalente al resto efector, y m, n y j son cada uno independientemente 0-30. En algunos aspectos n = 1-10, en algunos aspectos, n=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos, m = 1-10, en algunos aspectos, m=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. M puede ser 1. M puede ser 2. M puede ser 3. M puede ser 4. M puede ser 5. M puede ser 6. En algunos aspectos j = 1-10, en algunos aspectos, j=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. J puede ser 1. J puede ser 2. J puede ser 3. J puede ser 4. J puede ser 5. J puede ser 6. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 200 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 150 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 100 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 50 átomos. En algunos aspectos, el intervalo de la longitud total de la cadena de Y1 en números de átomos puede tener un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, y 60, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100.
En algunos aspectos, el enlazador se selecciona entre el grupo que consiste en
Figure imgf000029_0001
Enlazadores escindibles
En algunos aspectos, la invención proporciona MAC como se describe en el presente documento que comprende enlazadores "no escindibles". En otros aspectos, la invención proporciona MAC que comprenden enlazadores "escindibles". La expresión "enlazador escindible" se usa en el presente documento para describir un enlazador escindido rápidamente que está diseñado para degradarse mediante enzimas intracelulares o extracelulares o cuando se somete a cambios en el pH o entorno redox para liberar la carga en la ubicación deseada. Por ejemplo, los enlazadores escindibles pueden ser, preferentemente, estables en plasma, sangre o suero, y menos estable en ambientes intracelulares.
Los enlazadores escindibles se pueden formar añadiendo una porción escindible (O) a la porción Y1 del enlazador (o porción P1, en la que el enlazador es para un sitio de combinación de anticuerpo catalítico). En consecuencia, los enlazadores pueden comprender la fórmula X1-O-Y1-Z, X1-O-Y1-Z* y P1-O-Q1-W1.
Un ejemplo representativo de una porción escindible de un enlazador es valina-citrulina carbamato de paminobencilo (Vit-CitABC) que se escinde mediante proteasas intracelulares tales como catepsina B.
Figure imgf000030_0001
en la que la línea ondulada típicamente indica el punto de unión a la porción Y1 (o Q1) del enlazador, y la línea paralela representa el punto de unión a la porción X1 (o P1) del enlazador, o incluso al propio resto efector. En algunos aspectos, por supuesto, la línea ondulada puede indicar el punto de unión a la porción del enlazador X1 o P1 (o el resto efector), y la línea paralela puede indicar el punto de unión a la porción Y1 o Q1 del enlazador.
En consecuencia, en algunos aspectos, la divulgación proporciona el enlazador de fórmula: 15
Figure imgf000031_0002
en la que m, n y j son cada uno independientemente de 0 a 30, R1 es F y h = 2, 3, 4 o 5. En algunos aspectos n = 1­ 10, en algunos aspectos, n=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos, m = 1-10, en algunos aspectos, m=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. M puede ser 1. M puede ser 2. M puede ser 3. M puede ser 4. M puede ser 5. M puede ser 6. En algunos aspectos j = 1-10, en algunos aspectos, j=1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. J puede ser 1. J puede ser 2. J puede ser 3. J puede ser 4. J puede ser 5. J puede ser 6. En algunos aspectos k = 1-10, en algunos aspectos, k = 1­ 5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para k se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para k se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. K puede ser 1. K puede ser 2. K puede ser 3. K puede ser 4. K puede ser 5. K puede ser 6. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 200 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 150 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 100 átomos. En algunos aspectos, la longitud total de Y1 no supera los 50 átomos. En algunos aspectos, el intervalo de la longitud total de la cadena de Y1 en números de átomos puede tener un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, y 60, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100.
Uso de cargas útiles basadas en auristatina
Los restos efectores basados en auristatina también son útiles en conexión con la tecnología de conjugación dirigida de la presente invención cuando se usa junto con la tecnología del enlazador apropiado. Específicamente, las cargas útiles incluyen las desveladas en la PCT/IB2012/056224, incluidas todas las sales farmacéuticamente aceptables, hidratos y formas de base libre.
En consecuencia, los siguientes restos efectores y enlazadores pueden usarse en aspectos de la invención:
Figure imgf000031_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, en la que, independientemente, cada vez que está presente,
W2 es
Figure imgf000032_0001
Y2 es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20; -carbociclo -C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno Ci-Cio-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno Ci-Cio-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C1-10, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C8)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z2 es
Figure imgf000032_0002
R1123A es hi 1d3rBógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R y R son cualquiera de los siguientes:
(iii) R13A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R13B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o halógeno; o
(iv) R y R tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
14A 14B
R y R son cualquiera de los siguientes:
(iii) R14A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y
R14B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, hetero14aAralqu 1i4loB o aralquilo; o
(iv) R y R tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R15 es
Figure imgf000033_0001
heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en -alquilo C1-C8 -alquilo C1-C8-N(R')2, -alquilo C1-C8-C(O)R', -alquilo Cr C8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en la que cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
o R15 está
Figure imgf000033_0002
opcionalmente sustituido con 1,2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquilo C1-C8-N(R')2, -alquilo C1-C8-C(O)R', -alquilo C1-C8-C(O)OR', -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en la que cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquileno C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, forman un heterociclilo C1-C10;
R16 es hidrógeno, -alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8 o haloalquilo C1-C8;
R22 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R23 es heterociclilo C1-C10; y
R17 se selecciona independientemente cada vez que está presente entre el grupo que consiste en F, Cl, I y Br;
R es -arilo, -alquileno C1-C10-arilo, en el que arilo en R que comprende arilo está sustituido con [R ]h; h es 5; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R13A es hidrógeno, X es S.
En algunos aspectos, los restos efectores pueden seleccionarse de la Tabla 73. En algunos aspectos, el resto efector es la toxina n.° 54. En algunos aspectos, el resto efector es la toxina n.° 115. En algunos aspectos, el resto efector es la toxina n.° 69.
En algunos aspectos, el resto efector cuando se conjuga con un enlazador de la invención comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en
Figure imgf000034_0001
Los restos efectores conjugados a enlazadores útiles en relación con la presente invención incluyen enlazadores de toxinas basados en auristatina, tales como los desvelados en la PCT/IB2012/056224. En algunos aspectos, los enlazadores de toxinas de la invención se pueden seleccionar de el grupo que consiste en
Figure imgf000035_0004
procedimientos de conjugación
En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para preparar un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC) que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno, estando el anticuerpo conjugado covalentemente al menos a un resto efector a través de un enlazador unido a una cadena lateral de K5 de la SEQ ID NO: 98 (o SEQ ID desvelada en el presente documento que entra dentro del ámbito de la SEQ ID NO: 98) o a una cadena lateral del resto K en un dominio constante de anticuerpo en el que la posición de K corresponde con el resto 77 de la SEQ ID NO: 6 , o el resto 185 de un dominio constante de cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat; comprendiendo dicho procedimiento: unir covalentemente el resto efector a un enlazador que termina en un grupo saliente Z* de fórmula:
Figure imgf000035_0001
1
en la que R es cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y h = 1,2, 3, 4 o 5, y haciendo reaccionar el complejo del resto efector-enlazador-grupo saliente formado de esta manera con el anticuerpo en una relación molar de entre aproximadamente 3,5:1 a aproximadamente 4,5:1 del resto efector:anticuerpo. En algunos aspectos, la relación molar es de aproximadamente 3,7:1 a aproximadamente 4,3:1. En algunas realizaciones, R1 puede ser un halógeno. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl, y h = 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl, y h = 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 4 o 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h=5. En algunos aspectos, Z* se puede seleccionar del grupo que consiste en:
Figure imgf000035_0002
R 1 puede estar presente en una cantidad de entre 3 y 5. Puede haber 3 grupos R 1.1 R puede estar presente en una cantidad de entre 4 y 5. Puede haber 4 grupos R1. Puede haber 5 grupos R1. R1 puede ser flúor. R1 puede ser cloro. R1 puede ser bromo. El grupo saliente puede comprender la fórmula:
Figure imgf000035_0003
En algunos aspectos, la divulgación proporciona procedimientos para producir un MAC, en los que el MAC comprende un anticuerpo, o fragmento del mismo, unido covalentemente al menos a un resto efector que se une a una diana adicional (tal como péptido, molécula pequeña, aptámero, molécula de ácido nucleico o proteína), caracterizado porque el resto efector comprende un enlazador con un grupo saliente de PFP capaz de reaccionar con el £-amino de los restos de lisina superficial del anticuerpo. En algunos aspectos, la divulgación proporciona un procedimiento para conjugar un resto efector (tal como un péptido) con un dominio CL de la divulgación que comprende la SEQ ID NO: 98, que comprende conjugar el resto efector con un enlazador que comprende un grupo saliente de fórmula:
Figure imgf000036_0001
en la que R1 es cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solo o en combinación,y puede estar presente en una cantidad de entre 1 y 5 y hacer reaccionar el grupo saliente con la cadena lateral de K5de SEQ ID n O: 98.
En algunos aspectos, el procedimiento comprende combinar un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo con un resto efector, en el que el resto efector está unido covalentemente a un enlazador que comprende un grupo saliente de PFP.
En algunos aspectos, la relación molar del resto efector: anticuerpo está entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 4,6:1. En algunos aspectos de la invención, la relación molar es de aproximadamente 3,7:1 y aproximadamente 4,3:1. En algunos aspectos de la invención, la relación molar del resto efector:anticuerpo es de aproximadamente 4:1. En algunos aspectos, la relación molar está entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 7:1. En algunos aspectos, la relación molar está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 6:1. En algunos aspectos, la relación molar está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 7:1. En algunos aspectos, la relación molar está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 5:1.
En aspectos de la invención en los que es deseable tener menos de 1,5 conjugaciones por anticuerpo (tal como cuando se requiere un único resto efector), la relación molar puede estar entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 6:1, en el que el tampón comprende HEPES a una concentración de al menos 0,02 M. La concentración de HEPES puede estar entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 1 M. La concentración de HEPES puede ser de entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M. En aspectos de la invención en los que es deseable tener menos de 1,5 conjugaciones por anticuerpo (tal como cuando se requiere un único resto efector), la relación molar puede estar entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 3:1.
En algunos aspectos, la relación molar preferida es un intervalo con un límite inferior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 1, aproximadamente 1 ,2 , aproximadamente 1,4, aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,8, aproximadamente 2, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,8, aproximadamente 3, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,4; aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,8, aproximadamente 6 , aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6 ,6 , aproximadamente 6 ,8 , aproximadamente 7, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,7, aproximadamente 8 , aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5 y aproximadamente 10 a 1, y un límite superior seleccionado de entre el grupo que consiste en aproximadamente 1,5, aproximadamente 1,6, aproximadamente 1,8, aproximadamente 2, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,8, aproximadamente 3, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1, aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,4; aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,8, aproximadamente 6 , aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6 ,6 , aproximadamente 6 ,8 , aproximadamente 7, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,7, aproximadamente 8 , aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10 y aproximadamente 15 a 1.
En algunos aspectos, la invención además comprende conjugar el resto efector y la proteína durante al menos aproximadamente 30 minutos. En algunos aspectos, la duración es de al menos aproximadamente 60 minutos. En algunos aspectos, la duración es de al menos aproximadamente 2 horas. En algún aspecto, la invención además comprende conjugar el esto efector y el anticuerpo a entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 40 °C. En algún aspecto, la invención comprende adicionalmente conjugar el resto efector y el anticuerpo a entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 30 °C. En algún aspecto, la invención comprende además conjugar el resto efector y el anticuerpo a entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 30 °C. En algunos aspectos, la reacción se realiza de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 25 °C. En algunos aspectos, la reacción se lleva a cabo a aproximadamente 22 °C. En algunos aspectos, la reacción se lleva a cabo a aproximadamente temperatura ambiente.
En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a un pH entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente pH 8,0. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a un pH entre aproximadamente 6,75 y aproximadamente pH 8,0. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar aproximadamente a pH 7,7. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar aproximadamente a pH 7. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar aproximadamente a pH 7,2. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar aproximadamente a pH 7,5. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar entre un intervalo de valores de pH, cuyo límite inferior se selecciona del grupo que consiste en 5,5, 6 , 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6 ,6 , 6,7, 6 ,8 , 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 y 8 , y cuyo límite superior se selecciona del grupo que consiste en 6,5, 6 ,6 , 6,7, 6 ,8 , 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,5, y 9.
En algunos aspectos, el pH puede estar por debajo de 6,5; esto puede ser particularmente útil en aplicaciones en las que se requieren menos de aproximadamente 1,5 conjugaciones por anticuerpo. En algunos aspectos, el pH está entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5.
En algunos aspectos, la concentración de sal puede estar por debajo de aproximadamente 0,2 M. La sal puede ser una sal de haluro (F, Cl, Br, I) y puede comprender un metal, tal como Li, Na, K, Ser, Mg, Ca. La sal puede ser NaCl. La sal puede ser KCl. Se pueden usar concentraciones de sal superiores a aproximadamente 0,1 M para limitar la velocidad y/o el número de conjugaciones por anticuerpo. La concentración de sal puede estar entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,1 M. La concentración de sal puede estar entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,5 M. La concentración de sal puede estar entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,3 M. En algunos aspectos, el procedimiento de la invención comprende formular el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo en un tampón de formulación a aproximadamente pH 5,5. El tampón de formulación puede ser tampón de acetato de sodio y trehalosa. Este tampón tiene la ventaja de no contener aminas primarias y se presta bien para el ajuste del pH. El anticuerpo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 mg.ml-1. En algunos aspectos, el anticuerpo puede estar presente en una cantidad de 20 mg.ml-1.
El pH del tampón de formulación se puede ajustar a aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente pH 8,0; en algunas realizaciones, el tampón de formulación se puede ajustar a pH 7,7. El pH del tampón de formulación se puede ajustar con un tampón fosfato. El tampón fosfato puede estar a una concentración de entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 80 mM. El tampón fosfato puede estar a una concentración de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 200 mM.
En algunos aspectos, la concentración de anticuerpo durante la reacción de conjugación con el resto efector/enlazador y el grupo saliente Z* puede estar en un intervalo en el que el límite inferior del intervalo se selecciona de aproximadamente 5, aproximadamente 6 , aproximadamente 7, aproximadamente 8 , aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 30 y aproximadamente 40 mg.ml-1, y el límite superior del intervalo se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 7, aproximadamente 8 , aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 500 mg.ml-1.
El resto efector puede reconstituirse a una concentración de al menos aproximadamente 2 mg.ml-1. El resto efector se puede reconstituir a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg.ml-1 en propilenglicol diluido antes de su uso y, en algunas realizaciones, puede estar en una concentración de 10 mg.ml-1.
La reacción de conjugación puede realizarse combinando el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo y el resto efector en una relación molar de 4 moles de resto efector a 1 mol de anticuerpo y incubando a aproximadamente 18 °C a aproximadamente 25 °C durante aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas. En algunas realizaciones, la reacción de conjugación entre el anticuerpo y el resto efector está a temperatura ambiente durante 2 horas. En algunas realizaciones, la reacción de conjugación dura al menos aproximadamente 2 horas. En algunas realizaciones, la reacción de conjugación dura al menos aproximadamente 30 minutos.
La reacción puede inactivarse y ajustarse a aproximadamente un pH de 5,0 a aproximadamente pH 6,0. En algunas realizaciones, la reacción inactivada se puede ajustar a pH 5,5. Esto se puede realizar usando un tampón succinato y glicina a, por ejemplo, aproximadamente pH 4,0. Este tampón tiene ventajas sobre otros tampones más comunes como TRIS u otros tampones de aminoácidos. El succinato ayuda a limitar la agregación y la precipitación durante la diafiltración, que puede ser estresante para la molécula conjugada, y la glicina contiene una amina primaria adicional.
La reacción puede ser concentrada y el resto efector sin reaccionar, las especies relacionadas (tales como los péptidos en los que el enlazador se hidrolizó mediante reacción con disolvente de agua) y otros elementos sin reaccionar de la mezcla de reacción (tal como PFP) pueden eliminarse mediante diafiltración, por ejemplo, usando una membrana de 50 kDa o cromatografía de exclusión por tamaño en un tampón succinato, glicina, cloruro de sodio y trehalosa, pH 5,5 a 30 mg.ml-1.
En algunos aspectos, el procedimiento puede comprender conjugar un resto efector a CLk-K80 En algunos aspectos, la divulgación proporciona la conjugación de un resto efector a un dominio Ig, que comprende mutar la CLA para que comprenda una SEQ ID NO: 98 en el bucle de la cadena de conexión de EF entre las cadenas-p E y F, unir al resto efector un engarce que comprende un grupo saliente Z* como se define en el presente documento y hacer reaccionar dicho complejo de resto efector-enlazador-grupo saliente con la cadena lateral de K5 de SEQ ID NO: 98.
Composiciones farmacéuticas de la invención
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el MAC y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como sus combinaciones de los mismos, y puede incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Sustancias farmacéuticamente aceptables, tales como cantidades de humectación o menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida útil o la efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Las composiciones de la presente invención pueden estar en diversas formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones infundibles e inyectables), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica previstos. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con anticuerpos en general. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.
La composición farmacéutica puede comprender además otro componente, tal como un agente antitumoral o un reactivo de imagen. Otro aspecto de la presente invención proporciona kits que comprenden MAC de la invención y composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un kit puede incluir, además del MAC o composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit puede también incluir instrucciones para su uso en un procedimiento diagnóstico o terapéutico. En algunas realizaciones, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y un agente de diagnóstico. En otras realizaciones, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tal como un agente antineoplásico adicional, agente antitumoral o agente quimioterapéutico.
Estos agentes y compuestos de la invención se pueden combinar con vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el tiempo y la repetición, dependerá de la persona particular y del historial médico de esa persona.
Los vehículos, excipientes y/o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas y pueden incluir tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; sales, tales como cloruro de sodio; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilo parabenos, tal como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o Ig; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluidos glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Los liposomas que contienen compuestos de la invención se preparan por procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se desvelan en la patente de Estados Unidos n.° 5.013.556. Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado.
Los principios activos también pueden quedar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se desvelan en Remington, Science y Practice of Pharmacy, 20a Ed., Mack Publishing (2000).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o 'poli (alcohol vinílico)), polilactidas (patente de Estados Unidos n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7-etil-L-glutamato, copolímeros no degradables de etileno-acetato e vinilo, degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por el copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), isobutirato de acetato de sacarosa y ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico.
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo son generalmente estériles. Esto se logra fácilmente mediante, por ejemplo, filtración a través de membranas de filtración estériles. Los compuestos terapéuticos de la invención se colocan generalmente en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Las emulsiones adecuadas se pueden preparar usando emulsiones de grasa comercialmente disponibles, tales como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El principio activo puede estar disuelto en una composición de emulsión premezclada o, como alternativa, puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendras) y una emulsión formada mezclando con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que se pueden añadir otros ingredientes, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas típicamente contienen hasta 20 % de aceite, por ejemplo, entre 5 y 20 %. La emulsión de grasa puede comprender gotas de grasa de entre 0,1 y 1,0 pm, particularmente 0,1 y 0,5 pm, y tienen un pH en el intervalo de 5,5 a 8,0.
Las composiciones en emulsión pueden ser aquellas preparadas mezclando un compuesto de la invención con Intralipid™ o los componentes del mismo (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua).
Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se ha expuesto anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por la vía respiratoria oral o nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables preferentemente estériles se pueden nebulizar mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente desde el dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador puede fijarse a una máscara facial, tienda o máquina de respiración a presión positiva intermitente. Las composiciones en solución, suspensión o polvo se pueden administrar, preferentemente por vía oral o nasal, a partir de dispositivos que administran la formulación de una manera apropiada.
Los compuestos y las composiciones de la invención se pueden usar junto con tratamientos establecidos para la indicación relevante. Los ejemplos incluyen 5-fluorouracilo, irinotecán, oxaliplatino, cetuximab, sunitinib y rituximab para el tratamiento de trastornos angiogénicos en particular, especialmente cáncer. Otros ejemplos incluyen ranibizumab, infliximab, adalimumab, natalizumab, omalizumab y palivizumab.
Procedimientos terapéuticos de la divulgación
Los procedimientos terapéuticos también se proporcionan en la divulgación. Un procedimiento terapéutico comprende administrar un compuesto o composición de la divulgación a un sujeto que lo necesite.
La divulgación proporciona el uso de compuestos de la divulgación o composiciones farmacéuticas de la divulgación en un procedimiento para inhibir o reducir la angiogénesis o para tratar o prevenir una enfermedad o síntoma asociado con un trastorno angiogénico. La divulgación proporciona procedimientos para inhibir o reducir la angiogénesis o tratar o prevenir una enfermedad o síntoma asociado con un trastorno angiogénico que comprende administrar a un paciente una dosis terapéuticamente eficaz de compuestos y composiciones de la divulgación. También se proporcionan procedimientos para liberar o administrar compuestos y composiciones de la divulgación y procedimientos de tratamiento que usan compuestos y composiciones de la divulgación. También se proporcionan procedimientos para tratar el cáncer que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición farmacéutica de acuerdo con la divulgación. Tal como se usa en el presente documento, una afección mediada por la angiogénesis es una afección que está causada por una actividad de angiogénesis anormal o una en la que los compuestos que modulan la actividad de la angiogénesis tienen un uso terapéutico. Las enfermedades y afecciones que pueden tratarse y/o diagnosticarse con compuestos y composiciones de la divulgación incluyen cáncer, artritis, hipertensión, enfermedad renal, psoriasis, angiogénesis del ojo asociada con un trastorno ocular, infección o intervención quirúrgica, degeneración macular, retinopatía diabética, y similares.
De manera más específica, ejemplos de "cáncer" cuando se usan en el presente documento en conexión con la presente divulgación incluyen cánceres de pulmón (NSCLC y SCLC), de la cabeza o el cuello, de ovario, de colon, de recto, de próstata, de la región anal, de estómago, de mama, de riñón o de uréter, de pelvis renal, de glándula tiroides, de vejiga, de cerebro, carcinoma de células renales, carcinoma de, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no Hodgkin, tumores del eje espinal, carcinomas de la orofaringe, hipofaringe, esófago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario; o linfoma o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. Aún más específicamente, ejemplos de "cáncer" cuando se usan en el presente documento en conexión con la presente divulgación incluyen cáncer seleccionado de cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de próstata, cáncer de la región anal o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la divulgación se refieren a trastornos hiperproliferativos no cancerosos tales como, sin limitación, degeneración macular relacionada con la edad, reestenosis después de angioplastia y psoriasis. En otra realización, la divulgación proporciona composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un mamífero que requiere la activación de IGF1R y/o Ang2, en el que la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo activador de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden usar para tratar la osteoporosis, la fragilidad o trastornos en los que el mamífero secreta muy poca hormona de crecimiento activa o no puede responder a la hormona del crecimiento.
Tal como se usa en el presente documento, una "dosis eficaz" o "cantidad eficaz" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para afectar a uno o más resultados beneficiosos o deseados. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el comienzo de la enfermedad, incluyendo los síntomas bioquímicos, histológicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como la reducción del tamaño del tumor, la propagación, la vasculatura de los tumores o uno o más síntomas de cáncer u otras enfermedades asociadas con aumento de la angiogénesis, disminución de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, mejora del efecto de otro medicamento y/o retraso de la progresión de la enfermedad de los pacientes. Una dosis eficaz puede administrarse en una o más administraciones. Para los fines de la presente divulgación, una dosis eficaz del fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para llevar a cabo un tratamiento profiláctico o terapéutico directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto clínico, una dosis eficaz de un medicamento, compuesto o composición farmacéutica puede o no puede lograrse junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, se puede considerar una "dosis eficaz" en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos y se puede considerar que un único agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes adicionales, se puede lograr o se logra un resultado deseable.
Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferentemente, un ser humano. Los mamíferos también incluyen, aunque no de forma limitante, animales de granja, animales de deporte, mascotas, primates y caballos.
Ventajosamente, la administración terapéutica de compuestos de la divulgación da como resultado una disminución de la angiogénesis y/o, en el caso de cánceres, estabilización o reducción del volumen tumoral. Preferentemente, el volumen tumoral es al menos aproximadamente un 10 % o aproximadamente un 15 % menor que antes de la administración de un MAC de la divulgación. Más preferentemente, el volumen del tumor es al menos aproximadamente un 20 % menor que antes de la administración del MAC. Aún más preferentemente, el volumen del tumor es al menos un 30 % más bajo que antes de la administración del MAC. Ventajosamente, el volumen del tumor es al menos un 40 % más bajo que antes de la administración del MAC. Más ventajosamente, el volumen del tumor es al menos un 50 % más bajo que antes de la administración del MAC. Muy preferentemente, el volumen del tumor es al menos un 60 % más bajo que antes de la administración del MAC. De la forma más preferente, el volumen del tumor es al menos un 70 % más bajo que antes de la administración del MAC.
La administración de compuestos de la divulgación de acuerdo con el procedimiento en la presente divulgación puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del receptor, si la finalidad de la administración es terapéutica o profiláctica y otros factores conocidos por los profesionales expertos. La administración de un compuesto de la divulgación puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede estar en una serie de dosis separadas.
Anticuerpos
El dominio de inmunoglobulina (Ig) es un tipo de dominio de proteína que consiste en un sándwich de 2 capas de entre 7 y 9 cadenas p antiparalelas dispuestas en dos láminas p con una topología de clave griega. Una cadena p es un tramo de cadena polipeptídica típicamente de 3 a 10 aminoácidos de longitud con una cadena principal en una conformación casi completamente extendida. Las láminas B consisten en cadenas p conectadas lateralmente por al menos dos o tres enlaces de hidrógeno en la cadena principal, formando una lámina plegada generalmente girada. La cadena principal se cambia repetidamente entre las dos láminas p. Normalmente, el patrón es ( p-horquilla en N-terminal en la lámina 1)-(p-horquilla en la lámina 2) -(cadena p en la lámina 1)-(p-horquilla en C-terminal en la lámina 2). Los cruces entre las láminas forman una "X", de modo que las horquillas en N-terminal y C-terminal están enfrentadas entre sí. Los miembros de la superfamilia de Ig se encuentran en cientos de proteínas de funciones diferentes. Los ejemplos incluyen anticuerpos, la tirosina cinasa del receptor de titina cinasa del músculo gigante. Los dominios similares a Ig pueden estar implicados en las interacciones proteína-proteína y proteína-ligando
La a-hélice es una conformación de aminoácidos enrollados o en espiral dextrógira, en la que cada grupo N-H de la cadena principal dona un enlace de hidrógeno al grupo C=O de la cadena principal del aminoácido cuatro restos antes. Esta estructura secundaria también se denomina a veces una a-hélice clásica de Pauling-Corey-Branson. Entre los tipos de estructura local en las proteínas, la a-hélice es la más regular y la más predecible de la secuencia, así como también la más prevalente.
Una inmunoglobulina (Ig) es una molécula tetramérica. En una lg de origen natural, cada tetrámero está compuesto por 2 pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa).
La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable, de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras k y A. Las cadenas pesadas se clasifican como a, 8 , £, y, y M, y definen el isotipo del anticuerpo como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, respectivamente. Dentro de cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, en las que la cadena pesada también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión al anticuerpo, de modo que una Ig intacta tiene 2 sitios de unión.
Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos láminas p empaquetadas fuertemente una contra la otra en un barril p comprimido antiparalelo. Esta estructura conservada se denomina pliegue de la inmunoglobulina (Ig). El pliegue de la lg de los dominios constantes contiene una lámina p de 3 cadenas empaquetada contra una lámina p de 4 cadenas, con cada lámina separada por cadenas; estas cadenas típicamente comprenden a-hélices, bucles, vueltas y vueltas cortas bruscas entre dos láminas p llamadas phorquillas.
Las cadenas de Ig exhiben la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por 3 regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las 2 cadenas de cada par están alineadas por las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde el extremo N hasta el extremo C, ambas cadenas ligeras y pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de las secuencias de Kabat de proteínas de interés inmunológico (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1987 y 1991)).
La identidad de los restos de aminoácido en un anticuerpo en particular que componen una CDR se puede determinar usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las CDR de anticuerpos se pueden identificar como las regiones hipervariables definidas originalmente por Kabat y col., (Kabat y col., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington DC.). Las posiciones de las CDR también se pueden identificar como las estructuras de bucle estructurales descritas originalmente por Chothia y otros (Chothia y col., 1989, Nature 342:877-883). Otros enfoques para la identificación de CDR incluyen la "definición de AbM" que es un compromiso entre Kabat y Chothia y deriva utilizando el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®), o la "definición de contacto" de las CDR basadas en contactos de antígenos observados, expuesto en MacCallum y col., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. En otro enfoque, a lo que se hace referencia en el presente documento como la "definición conformacional" de CDR, las posiciones de las CDR se pueden identificar como los restos que hacen contribuciones entálpicas a la unión al antígeno (Makabe y col., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166). Todavía otras definiciones de límite de CDR pueden no seguir estrictamente uno de loas enfoques anteriores, no obstante, solapan con al menos una porción de las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de la predicción o los hallazgos experimentales de que determinados restos o grupos de restos o incluso CDR completas no tienen un impacto significativo sobre la unión al antígeno. Tal como se usa en el presente documento, una CDR puede referirse a CDR definidas por cualquier enfoque conocido en la técnica, incluyendo combinaciones de enfoques. Los procedimientos usados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos enfoques. Para cualquier realización dada que contenga más de una CDR, las CDR (u otro resto de anticuerpo) se pueden definir de acuerdo con cualquiera de las definiciones de Kabat, Chothia, extendida, AbM, contacto y/o conformacionales.
La numeración de los restos de los dominios CLk y CLA puede variar. Por ejemplo, la numeración de CL 1 DR J 1 1 Dft J 1 1 DQ k puede 1comenzar en LC-R según la numeración de Kabat (por ejemplo, R de SEQ ID NO: 2) o LC-T de acuerdo con la numeración de Kabat (por ejemplo, T109 de SEQ ID NO: 2). La convención de numeración utilizada en el presente documento es la proporcionada por el grupo Swiss-Prot, una parte del Instituto Suizo de Bioinformática, y comienza en LC-T109. Se apreciará que cuando se prefiera un sistema de numeración diferente, la numeración de los restos especificados de la invención se puede ajustar en consecuencia. LC se refiere a cadena ligera.
Un “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión al antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por una unión específica. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, y fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una lg que es suficiente para conferir al polipéptido una unión a un antígeno específico. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb consiste en un dominio VH o un dominio VL (por ejemplo, de ser humano, de camélido o de tiburón).
En general, las referencias a anticuerpos deben interpretarse como que también hacen referencia a porciones de unión a antígeno de los mismos y, en particular, pueden incluir porciones de unión a antígeno de los mismos que comprenden la SEQ ID NO: 98 entre sus cadenas p E y F.
Un anticuerpo monocatenario (scFv) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH están emparejadas para formar moléculas monovalentes a través de un enlazador sintético que les permite formarse como una sola cadena de proteína. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, utilizando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los 2 dominios de la misma cadena, forzando de este modo que los dominios se emparejen con dominios complementarios de otra cadena y que creen 2 sitios de unión a antígeno. Una o más CDR se pueden incorporar en una molécula bien covalente o no covalentemente para formar una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar la o las CDR (s) como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede unir covalentemente la o las CDR a otra cadena polipeptídica o puede incorporar la o las CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno concreto de interés.
Las cadenas ligeras de mamífero son de dos tipos, k y A, y en cualquier molécula de anticuerpo dada, solo se produce un tipo. En seres humanos se produce aproximadamente el doble de moléculas k que A, pero en otros mamíferos esta relación puede variar. Cada molécula de cadena ligera libre contiene aproximadamente 220 aminoácidos en una única cadena polipeptídica que se pliega para formar los dominios de las regiones constantes y variables.
Durante el desarrollo de células B, un acontecimiento de recombinación a nivel de ADN une un único segmento variable (V) con un segmento de unión (J); el segmento constante (C) se une más tarde mediante corte y empalme a nivel de ARN. La recombinación de muchos segmentos V diferentes con varios segmentos J proporciona una amplia gama de reconocimiento de antígenos. La diversidad adicional se logra mediante la diversidad de unión, que resulta de la adición aleatoria de nucleótidos por la desoxinucleotidiltransferasa terminal y por hipermutación somática, que se produce durante la maduración de las células B en el bazo y en los ganglios linfáticos. Las regiones kappa constantes (CLk) están codificadas por un solo gen, mientras que las regiones constantes lambda (CLA) están codificadas por genes múltiples y sufren corte y empalme. Se conocen varios marcadores asociados con especies polimórficas particulares de CLA: IgCLAI (marcador Mcg); IGLC2 - IgCLA2 (marcador Kern-Oz); IgClA3 (Kern-Oz marcador) y IgCLA7, por ejemplo. El experto puede establecer fácilmente todos los polimorfismos identificados hasta ahora en cadenas CLA humanas. La SEQ ID NO: 93 incorpora muchos de los polimorfismos identificados actualmente. Las secuencias de la presente divulgación abarcan otros polimorfismos conocidos del CLA y anticuerpos en general. Las secuencias de la presente invención abarcan otros polimorfismos conocidos del CLk. Se han identificado dos loci polimórficos en el CLk; CLk-V/A45 y CLk-L/V83. Los tres polimorfismos identificados hasta ahora son: Km (1): CLk-V45/L83; Km (1,2): CLk-A45/L83; y Km (3): CLk-A45A/83.
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una lg de origen natural tiene 2 sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o un fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene 2 sitios de unión diferentes.
Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1) no está asociado con componentes asociados de forma natural, incluyendo otros anticuerpos asociados naturalmente, que lo acompaña en su estado nativo, (2 ) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula que no expresa el anticuerpo de forma natural o es expresado por una célula de una especie diferente o (4) no se produce en la naturaleza.
La expresión “anticuerpo humano” incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de Ig humana. En algunas realizaciones de la presente divulgación, todos los dominios variables y constantes del anticuerpo anti-IGFIR derivan de secuencias de lg humanas (un anticuerpo completamente humano). Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que deriva de una especie no humana, en el que ciertos aminoácidos en el marco y los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas se han mutado para evitar o anular una respuesta inmunitaria en seres humanos. Como alternativa, se puede producir un anticuerpo humanizado mediante condensación de los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana.
La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos.
El término “epítopo” incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse de forma específica a una Ig o receptor de linfocitos T. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y, por lo general, tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 uM, preferentemente <100 nM y, más preferentemente: <10 nM.
El término conjugado de anticuerpos multifuncionales, o MAC, se refiere a un anticuerpo como se define en el presente documento o a una porción de unión a antígeno del mismo, conjugado covalentemente con al menos un resto efector que se une a una diana. El resto efector puede ser un péptido, molécula pequeña, proteína, moléculas de ácido nucleico, toxina, aptámero o anticuerpo de unión a antígeno o fragmento del mismo. Las referencias a la conjugación de péptidos y similares a las que se hace referencia a lo largo de la memoria descriptiva se aplican generalmente a la conjugación con proteínas y anticuerpos (unión a antígeno) o fragmentos de los mismos.
Cabe esperar que los anticuerpos completamente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los anticuerpos monoclonales (Mab) de ratón o derivados de ratón y, por tanto, que incrementen la eficacia y la seguridad de los anticuerpos administrados. Se puede esperar que el uso de anticuerpos completamente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas recurrentes y crónicas, tales como inflamación y cáncer, que pueden requerir administraciones repetidas de anticuerpos. En otra realización, la invención proporciona un MAC que comprende un anticuerpo que no se une al complemento.
Además, se pueden crear anticuerpos de fusión en los que 2 (o más) anticuerpos monocatenarios están unidos entre sí. Esto es útil si se quiere crear un anticuerpo divalente o polivalente en una única cadena polipeptídica o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce por entrecruzamiento de 2 o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos; por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticuladores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen 2 grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo).
Otro tipo de anticuerpo derivado es un anticuerpo marcado. Los agentes de detección útiles con los que se puede derivatizar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fosfuros de lantánidos y similares. Un anticuerpo también puede marcarse con enzimas que son útiles para la detección, tal como peroxidasa de rábano picante, galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo está marcado con una enzima detectable, se detecta mediante la adición de reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que se puede discernir. Por ejemplo, cuando el agente peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobenzidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es detectable. También se puede marcar un anticuerpo con biotina y detectarse a través de la medición indirecta de la unión de avidina o de estreptavidina. Un anticuerpo puede estar marcado con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo también puede marcarse con un epítopo polipeptídico predeterminado reconocido por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, marcas de epítopo). En algunas realizaciones, los marcadores están unidos por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
El anticuerpo también puede derivatizarse con un grupo químico, tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo, o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida en suero o para aumentar la unión del tejido.
Especificidad de anticuerpos
En algunas realizaciones que comprenden dominios de unión a antígeno, el dominio de unión al antígeno (por ejemplo, aunque no de forma limitante, una región variable del anticuerpo que tiene todas las 6 CDR o una región equivalente que es al menos un 90 por ciento idéntica a una región variable de anticuerpo) se elige entre: abagovomab, abatacept (ORENCIA®), abciximab (REOPRO®, c7E3 Fab), adalimumab (HUMIRA®), adecatumumab, alemtuzumab (CAMPATH®, MabCampath o Campath-1H), altumomab, afelimomab, anatumomab mafenatox, anetumumab, anrukizumab, apolizumab, arcitumomab, aselizumab, atlizumab, atorolimumab, bapineuzumab, basiliximab (SIMULECT®), bavituximab, bectumomab (LYMPHOSCAN®), belimumab (LYMPHO-STAT-B®), bertilimumab, besilesomab, pcept (ENBREL®), bevacizumab (AVASTIN®), biciromab bralobarbital, bivatuzumab mertansina, brentuximab vedotina (ADCETRIS®), canakinumab (ACZ885), cantuzumab mertansina, capromab (PROSTASCINT®), catumaxomab (REMOV AB®), cedelizumab (CIMZIA®), certolizumab pegol, cetuximab (ERBITUX®), clenoliximab, dacetuzumab, dacliximab, daclizumab (ZENAP AX(®), denosumab (AMG 162), detumomab, dorlimomab aritox, dorlixizumab, duntumumab, durimulumab, durmulumab, ecromeximab, eculizumab (SOLIRIS®), edobacomab, edrecolomab (Mabl7-1A, PANOREX®), efalizumab (RAPTIVA®), efungumab (MYCOGRAB®), elsilimomab, enlimomab pegol, epitumomab cituxetán, efalizumab, epitumomab, epratuzumab, erlizumab, ertumaxomab (REXOMUN®), etaracizumab (etaratuzumab, VITAXIN®, ABEGRIN™), exbivirumab, fanolesomab (NEUTROSPEC®), faralimomab, felvizumab, fontolizumab (HUZAF®), galiximab, gantenerumab, gavilimomab (ABX-CBL(R)), gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG®), golimumab (CNTO 148), gomiliximab, ibalizumab (TNX-355), ibritumomab tiuxetán (ZEVALiN®), igovomab, imciromab, infliximab (REMICADE®), inolimomab, inotuzumab ozogamicina, ipilimumab (YERVOY®, MDX-010), iratumumab, keliximab, labetuzumab, lemalesomab, lebrilizumab, lerdelimumab, lexatumumab (HGS-ETR2, ETR2-ST01), lexitumumab, libivirumab, lintuzumab, lucatumumab, lumiliximab, mapatumumab (HGS-ETRI, TRM-I), maslimomab, matuzumab (EMD72000), mepolizumab (BOSATRIA®), metelimumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, morolimumab, motavizumab (NUMAX™), muromonab (OKT3), nacolomab tafenatox, naptumomab estafenatox, natalizumab (TYSABRI®, AnTEGRe N®), nebacumab, nerelimomab, nimotuzumab (Th ErACIM hR3®, THERACIM-hR3®, THERALOC®), nofetumomab merpentán (VERLUMA®), ocrelizumab, odulimomab, ofatumumab, omalizumab (XOLAIR®), oregovomab (OVAREX®), otelixizumab, pagibaximab, palivizumab (SYNAGIS®), panitumumab (ABXEGF, VECTIBIX®), pascolizumab, pemtumomab (THERAGYN®), pertuzumab (2C4, Om NiTARG®), pexelizumab, pintumomab, ponezumab, priliximab, pritumumab, ranibizumab (LUCENTIS®), raxibacumab, regavirumab, reslizumab, rituximab (RITUXAN®, MabTHERA®), rovelizumab, ruplizumab, satumomab, sevirumab, sibrotuzumab, siplizumab (MEDI-507), sontuzumab, stamulumab (Myo-029), sulesomab (LEUKOSCAN®), tacatuzumab tetraxetán, tadocizumab, talizumab, taplitumomab paptox, tefibazumab (AUREXIS®), telimomab aritox, teneliximab, teplizumab, ticilimumab, tocilizumab (ACTEMRA®), toralizumab, tositumomab, trastuzumab (HERCEPTIN®), tremelimumab (CP-675,206), tucotuzumab celmoleukina, tuvirumab, urtoxazumab, ustekinumab (CNTO 1275), vapaliximab, veltuzumab, vepalimomab, visilizumab (NUVION®), volociximab (M200), votumumab (HUMASPECT®), zalutumumab, zanolimumab (HuMAX-CD4), ziralimumab o zolimomab aritox.
En algunas realizaciones que comprenden dominios de unión a antígeno, el dominio de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada y ligera que tiene seis CDR, y/o compite por la unión con un anticuerpo seleccionado de la lista anterior. En algunas realizaciones que comprenden dominios de unión a antígeno, el dominio de unión a antígeno se une al mismo epítopo que los anticuerpos en la lista anterior. En algunas realizaciones que comprenden dominios de unión a antígeno, el dominio de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada y ligera que tiene seis CDR en total y se une al mismo antígeno que los anticuerpos en la lista anterior.
En algunas realizaciones que comprenden dominios de unión a antígeno, el dominio de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena ligera pesada que tiene seis (6 ) CDR en total y se une específicamente a un antígeno seleccionado entre: PDGFRa, PDGFRp, PDGF, VEGF, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, FGF, FGF2, HGF, KDR, flt-1, FLK-1, Ang-2, Ang-1, PLGF, CEA, CXCL13, Baff, IL-21, CCL21, TNF-a, CXCL12, SDF-I, bFGF, MAC-I, IL23pl9, FPR, IGFBP4, CXCR3, TLR4, CXCR2, EphA2, EphA4, EphrinB2, EGFR (ErbBI), HER2(ErbB2 o pl85neu), HER3(ErbB3), HER4 ErbB4 o tyro2), SCI, LRP5, LRP6 , RAGE, s100A8, s100A9, Navl.7, GLPI, Vs R, proteína F del VSR, proteína HA de la gripe, proteína NA de la gripe, HMGBI, CD16, CD19, CD20, CD21, CD28, CD32, CD32b, CD64, CD79, CD22, ICAM-I, FGFRI, FGFR2, HDGF, EphB4, GITR, p -amiloide, hMPV, PIV-I, PIV-2, OX40L, IGFBP3, cMet, PD-I, PLGF, neprolisina, CTD, IL-18, IL-6 , CXCL-13, IL-IRI, IL-15, IL-4R, IgE, PAI-I, NGF, EphA2, uPARt, DLL-4, avp5, avp6 , a5p1, a3p1, receptor de interferón de tipo I y de tipo II, CD 19, ICOS, IL-17, factor II, Hsp90, IGF, IGF-I, IGF-II, CD 19, GM-CSFR, PIV-3, CMV, IL-13, IL-9 y EBV.
En algunas realizaciones que comprenden dominios de unión a antígeno, el dominio de unión a antígeno se une específicamente a un miembro (receptor o ligando) de la superfamilia de TNF. Varias moléculas incluyen, pero sin limitaciones, factor de necrosis Tumoral-a ("TNF-a"), factor de necrosis tumoral-p ("TNF-p"), linfotoxina-a ("LT-a"), ligando de CD30, ligando de CD27, ligando de CD40, ligando 4-1 BB, ligando de apo-1 (también denominado ligando de Fas o ligando de CD95), ligando de Apo-2 (también conocido como TRAIL), ligando de Apo-3 (también denominado TWEAK), osteoprotegerina (OPG), a Pr IL, ligando de RANK (también conocido como TrAnCE), TALL-I (también conocido como BlyS, BAFF o THANK), DR4, DR5 (también conocido como Apo-2, TRAIL-R2, TR6 , Tango- 63, hAPO8 , TRICK2 o KILLER), DR6 , DcRI, DcR2, DcR3 (también conocido como TR6 o M68), CARI, HVEM (también conocido como ATAR o TR2), GITR, ZTNFR-5, NTR-I, TNFLI, CD30, LTBr, receptor de 4-1BB y TR9.
En algunas realizaciones que comprenden dominios de unión a antígeno, el dominio de unión a antígeno es capaz de unirse a una o más dianas elegidas entre 5T4, ABL, ABCB5, ABCFI, ACVRI, ACVRIB, ACVR2, ACVR2B, ACVRLI, AD0RA2A, Aggrecan, AGR2, AICDA, AIFI, AIGI, AKAPI, AKAP2, AMH, AMHR2, angiogenina (ANG), ANGPTI, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, anexina A2, ANPEP, APC, APOCI, AR, aromatasa, ATX, AXI, AZGPI (cinc-a-glicoproteína), B7.1, B7.2, B7-H1, BAD, BAFF, BAGI, BAII, BCR, BCL2, BCL6 , BDNF, BLNK, BLRI (MDR15), BlyS, BMP1, BMP2, BMP3B (GDFIO), BMP4, BMP6 , BMP7, BMP8 , BMP9, BMP11, BMP12, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAGI (plectina), BRCAI, C19orflO (IL27w), C3, C4A, C5, C5R1, CANTI, CASPI, CASP4, CAVI, CCBP2 (D6/JAB61), CCLI (1-309), CCLI 1 (eotaxina), CCL13 (MCP-4), CCL15 (MIP-Id), CCL16 (HCC-4), CCL17 (TARC), CCL18 (PARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), MCAF, CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MEP-2), SLC, exodus-2, CCL22(MDC/STC-I), CCL23 (MPIF-I), CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26(eotaxina-3), CCL27 (CTACK/ILC), CCL28, CCL3 (MIP-Ia), CCL4 (MIP-Ib), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCNAI, CCNA2, CCNDI, CCNEI, CCNE2, CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp- IRB/RA),CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBI1),CCR8 (CMKBR8/TERI/CKR-LI), CCR9 (GPR-9-6), CCRLI (VSHKI), CCRL2 (L-CCR), CD164, CD19, CDIC, CD20, CD200, CD-22, CD24, CD28, CD3, CD33, CD35, CD37, CD38, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45RB, CD46, CD52, CD69, CD72, CD74, CD79A, CD79B, CD8 , CD80, CD81, CD83, CD86, CD105, CD137, CDHI (E-cadherina), CDCP1CDH10, CDH12, CDH13, CDH18, CDH19, CDH20, CDH5, CDH7, CDH8 , CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6 , CDK7, CDK9, CDKNIA (p21Wapl/Cipl), CDKNIB (p27Kipl), CDKNIC, CDKN2A (pI6INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CERI, CHGA, CHGB, quitinasa, CHS-TIO, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6 , CKLFSF7, CKLFSF8 , CLDN3, CLDN7 (claudina- 7), CLN3, CLU (clusterina), CMKLRI, CMKORI (RDCI), CNRI, COLI 8AI, COL1A1.COL4A3, COL6A1, CR2, Cripto, CRP, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CTL8 , CTNNBI (b-catenina), CTSB (catepsina B), CX3CL1 (SCYDI), CX3CR1 (V28), CXCLI (GROI), CXCLIO (IP-IO), CXCLII (I-TAC/IP-9), CXCL12 (SDFI), CXCL13, CXCL 14, CXCL 16, CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78/LIX), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR4, CXCR6 (TYMSTR /STRL33/Bonzo), CYB5, CYCI, Cyr61, CYSLTRI, c-Met, DAB2IP, DES, DKFZp451J0118, DNCLI, DPP4, E2F1, ECGFI5EDGI, EFNAI, EFNA3, EFNB2, EGF, ELAC2, ENG, endoglina, ENOI, EN02, EN03, EPHAI, EPHA2, EPHA3, EPHA4, EPHA5, EPHA6 , EPHA7, EPHA8 , EPHA9, EPHAIO, EPHBI, EPHB2, EPHB3, EPHB4, EPHB5, EPHB6 , EFRINA-AI, EFRINA-A2, EFRINA-A3, EFRINA-A4, EFRINA-A5, EFRINA-A6 , EFRINA-BI, EFRINA-B2, EPHRTN-B3, EPHB4, EPG, ERBB2 (Her-2), EREG, ERK8 , receptor de estrógenos, ESRI, ESR2, F3 (TF), FADD, farnesil-transferasa, FasL, FASNf, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGFI (aFGF), FGFIO, FGFI 1, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF2 (bFGF), FGF20, FGF21 (tal como mimAb1), FGF22, FGF23, FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF8 , FGF9, FGFR3, FIGF (VEGFD), FILI (EPSILON), FBLI (ZETA), FLJ12584, FLJ25530, FLRTI (fibronectina), FLTI, FLT-3, FOS, FOSLI (FRA-I), FY (DARC), GABRP (GABAa), GAGEBI, GAGECI, GALNAC4S-6ST, GATA3, GD2, GD3, GDF5, GDF8 , GFII, GGTI, GM-CSF, GNASI, GNRHI, GPR2 (CCRIO), GPR31, GPR44, GPR81 (FKSG80), GRCCIO (CIO), gremlina, GRP, GSN (gelsolina), GSTPI, HAVCR2, HDAC, HDAC4, HDAC5, HDAC7A, HDAC9, Hedgehog, HGF, HIFIA, HIPI, histamina y receptores de histamina, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOXI, HSP90, HUMCYT2A, ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNAI, IFNA2, IFNA4, IFNA5, EFNA6 , BFNA7, IFNBI, IFN gamma, IFNWI, IGBPI, IGFI, IGFIR, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6 , DL-I, ILIO, ILIORA, ILIORB, IL-1, ILIRI (CD121a), ILIR2 (CD121b), IL­ IRA, IL-2, IL2RA (CD25), IL2RB (CD122), IL2RG (CD132), IL-4, IL-4R (CD123), IL-5, IL5RA (CD125), IL3RB (CD131), IL-6 , IL6 RA (CD126), IR6 RB (CD130), IL-7, IL7RA (CD127), IL-8 , CXCRI (IL8RA), CXCR2 (IL8RB/CD128), IL-9, IL9R (CD129), IL-10, IL10RA (CD210), IL10RB (CDW210B), IL-11, ILI IRA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL13RA1, IL13RA2, IL14, IL15, IL15RA, 1L16, IL17, IL17A, IL17B, IL17C, IL17R, IL18, IL18BP, IL18R1, IL18RAP, IL19, ILIA, ILIB, ILIFIO, IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8, DL1F9, ILIHYI, ILIRI, IL1R2, ILIRAP, ILIRAPLI, IL1RAPL2, ILIRLI, IL1RL2, ILIRN, IL2, IL20, IL20RA, IL21R, IL22, IL22R, IL22RA2, IL23, DL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL30, IL3RA, IL4, IL4R, IL6ST (glicoproteína 130), ILK, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAKI, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6 (a6-integrina), ITGAV, ITGB3, ITGB4 (P-4-integrina), JAKI, JAK3, JTB, JUN, K6 HF, KAII, KDR, KIM-1, KITLG, KLF5 (GC caja BP), KLF6 , KLKIO, KLK12, KLK13, KLK14, KLK15, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6 , KLK9, KRTI, KRT19 (queratina 19), KRT2A, KRTHB6 (queratina de tipo II específica del cabello), LAMA5, LEP (leptina), Lingo- p75, Lingo-Troy, LPS, LRP5, LRP6 , LTA (TNF- b), LTB, LTB4R (GPR16), LTB4R2, LTBR, MAC-MARCKS, MAG o Omgp, MAP2K7 (c-Jun), MCP-I, MDK, MIBI, midkina, MIF, MISRII, MJP-2, MK, MKI67 (Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3 (metalotionectina-Ui), mTOR, MTSSI, MUCI (mucina), MYC, MYD88, NCK2, neurocan, neuregulina-1, neuropilina-1, NFKBI, NFKB2, NGFB (NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgR-Nogo66 (Nogo), NgR- p75, NgR- Troy, NMEI (NM23A), NOTCH, NOTCHI, N0X5, NPPB, NROBI, NR0B2, NRIDI, NR1D2, NR1H2, NR1H3, NR1H4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NR5A1, NR5A2, NR6A1, NRPI, NRP2, NT5E, NTN4, OCT-1, ODZ1, OPN1, OPN2, OPRDI, P2RX7, PAP, PARTI, PATE, PAWR, PCA3, PCDGF, PCNA, PDGFA, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PECAMI, peg-asparaginasa, PF4 (CXCL4), plexina B2 (PLXNB2), PGF, PGR, fosfacán, PIAS2, PI3 cinasa, PIK3CG, PLAU (uPA), PLG5PLXDCI, PKC, PKC- p, PPBP (CXCL7), PPID, PRI, PRKCQ, PRKDI, PRL, PROC, PROK2, pro-NGF, prosaposina, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2 (COX-2), PTN, RAC2 (P21Rac2), RANK, ligando de RANK, RARB, RGSI, RGS13, RGS3, RNFI10 (ZNF144), Ron, R0B02, RXR, selectina, S100A2, S100A8, S100A9, SCGB 1D2 (lipofilina B), SCGB2A1 (manmaglobina 2), SCGB2A2 (manmaglobina 1), SCYEI (citocina activadora de monocitos endoteliales), SDF2, SERPENA1, SERPINA3, SERPiNb5 (maspina), SERPINEI (PAI-I), SERPINFI, SHIP-I, SHIP-2, SHBI, SHB2, SHBG, SfcAZ, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPPI, SPRRIB (Sprl), ST6GAL1, STABI, STAT6 , STEAP, STEAP2, SULF-1, Sulf-2, TB4R2, TBX21, TCPIO, TDGFI, TEK, TGFA, TGFBI, TGFBIII, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBRI, TGFBR2, TGFBR3, THIL, THBSI (trombospondina-1), THBS2/THBS4, THPO, TIE (Tie-1), TIMP3, factor tisular, TIKI2, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6JLR7, TLR8 , TLR9, TM4SF1, TNF, TNF-a, TNFAIP2 (B94), TNFAIP3, TNFRSFIIA, TNFRSFIA, TNFRSFIB, TNFRSF21, TNFRSF5, TNFRSF6 (Fas), TNFRSF7, TNFRSF8 , TNFRSF9, TNFSFIO (TRAIL), TNFSFI 1 (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B,TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF 18, TNFSF4 (ligando de OX40), TNFSF5 (ligando de CD40), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (ligando de CD27), TNFSF8 (ligando de CD30), TNFSF9 (ligando de 4-1BB), TOLLIP, receptores de tipo Toll, TLr2, TLR4, TLR9, TOP2A (topoisomerasa lia), TP53, TPMI, TPM2, TRADD, TRAFI, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAF5, TRAF6 , TRKA, TREMI, TREM2, TRPC6 , TROY, TSLP, TWEAK, tirosinasa, uPAR, VEGF, VEGFB, VEGFC, versicán, VHL C5, VLA-4, Wnt-1, XCLI (linfotactina), XCL2 (SCM-Ib), XCRI (GPR5/CCXCRI), YYI y ZFPM2.
Anticuerpos catalíticos
En algunos aspectos de la invención, el MAC comprende un anticuerpo catalítico o parte de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo frente a aldolasa.
Se hace referencia al contenido del documento US2006205670 en particular en los párrafos [0153]-[0233], que describen anticuerpos, fragmentos útiles y variantes y modificaciones de los mismos, sitios de combinación y c Dr , preparación de anticuerpos, expresión, humanización, modificación de aminoácidos, glucosilación, ADCC, CDC, aumentando la semivida en suero de los anticuerpos, vectores de expresión, sistemas huésped de mamíferos, y plegamiento, entre otros elementos de la tecnología de anticuerpos.
"Sitio de combinación", tal como se usa en el presente documento, (también conocido como el sitio de unión del anticuerpo) se refiere a la región de la Ig o los dominios de Ig que se combinan (o pueden combinar) con el determinante de un antígeno apropiado (o una proteína estructuralmente similar). El término generalmente incluye las CDR y los restos del marco adyacentes que están implicados en la unión al antígeno.
"Anticuerpos de aldolasa",como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos que contienen partes del sitio de combinación que, cuando no están comprometidas (por ejemplo, por conjugación), catalizan una reacción de adición de aldol entre un donante de cetona alifática y un aceptor de aldehído. Los anticuerpos de aldolasa se pueden generar mediante la inmunización de un animal con respuesta inmunitaria con un inmunógeno que incluye un hapteno de 1,3 dicetona de fórmula:
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acoplado a una proteína transportadora y caracterizado además por tener una lisina con un grupo £-amino reactivo en el sitio de combinación del anticuerpo. Los anticuerpos de aldolasa se caracterizan además por su actividad catalítica que está sujeta a inhibición con el hapteno 1,3-dicetona por formación de un complejo entre el hapteno 1,3-dicetona y el grupo £-amino de la lisina del anticuerpo catalítico.
Como se ha tratado, en determinadas realizaciones, determinados anticuerpos que se pueden usar para hacer MAC, las composiciones y las muestras de la invención pueden comprender una cadena lateral reactiva en el sitio de combinación del anticuerpo. Una cadena lateral reactiva puede estar presente de forma natural o puede introducirse en un anticuerpo por mutación. El resto reactivo del sitio de combinación del anticuerpo puede estar asociado con el anticuerpo, tal como cuando el resto está codificado por el ácido nucleico presente en la célula linfoide que se identificó primero que producía el anticuerpo. Como alternativa, el resto de aminoácido puede surgir mutando deliberadamente el ADN para codificar el resto en particular. El resto reactivo puede ser un resto no natural que surge, por ejemplo, mediante incorporación biosintética usando un codón único, tARN y aminoacil-tARN como se describe en el presente documento. En otro enfoque, el resto de aminoácido o sus grupos funcionales reactivos (por ejemplo, un grupo amino nucleofílico o un grupo sulfhidrilo) pueden estar unidos a un resto de aminoácido en el sitio de combinación del anticuerpo. Por lo tanto, el enlace covalente con el anticuerpo que se produce "a través de un resto de aminoácido en un sitio de combinación de un anticuerpo" como se usa en el presente documento significa que el enlace puede ser directamente a un resto de aminoácido de un sitio de combinación de anticuerpo o a través de un resto químico que está unido a una cadena lateral de un resto de aminoácido de un sitio de combinación de anticuerpo. En algunas realizaciones, el aminoácido es cisteína y el grupo reactivo de la cadena lateral es un grupo sulfhidrilo. En otras realizaciones, el resto de aminoácido es lisina y el grupo reactivo de la cadena lateral es el grupo £-amino. En algunas realizaciones, el aminoácido es K93 en la cadena pesada según la numeración de Kabat. En algunas realizaciones, el aminoácido está en HC-K99 de h38C2 de acuerdo con la numeración de las SEQ ID NO: 65 y 66.
Los anticuerpos catalíticos son una fuente de anticuerpos con sitios de combinación adecuados que comprenden una o más cadenas laterales de aminoácidos reactivos. Tales anticuerpos incluyen anticuerpos de aldolasa, anticuerpos p lactamasa, anticuerpos de esterasa y anticuerpos de amidasa.
Una realización comprende un anticuerpo de aldolasa, tal como los anticuerpos monoclonales de ratón mAb 33F12 y mAb 38C2 (cuyas VL y VH comprenden las SEQ ID NO: 68 y 69), así como versiones humanizadas y quiméricas adecuadas de tales anticuerpos (por ejemplo, h38C2IgG1: SeQ ID NO: 64 y 65 y h38C2-IgG2: SEQ ID No : 64 y 66 ). En aspectos favorables, una cadena pesada, tal como SEQ ID NO: 65 o s Eq iD NO: 66 , se usa junto con h38C2 VL (SEQ ID NO: 67) fusionada a uno de los dominios CL de la divulgación que comprende la SEQ ID NO: 98.
El mAb de ratón 38C2 (y h38C2) tiene una lisina reactiva cerca pero fuera de HCDR3, y es el prototipo de una nueva clase de anticuerpos catalíticos que se generaron mediante inmunización reactiva y que imitan mecánicamente a las enzimas aldolasas naturales. Otros anticuerpos catalíticos de aldolasa que se pueden usar incluyen los anticuerpos producidos por el hibridoma 85A2, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-1015; hibridoma 85C7, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-1014; hibridoma 92F9, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-1017; hibridoma 93F3, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-823; hibridoma 84G3, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-824; hibridoma 84G11, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-1018; hibridoma 84H9, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-1019; hibridoma 85H6, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-825; hibridoma 90G8, que tiene el número de referencia en ATCC PTA-1016. A través de una lisina reactiva, estos anticuerpos catalizan las reacciones aldólicas y retroaldólicas usando el mecanismo enamina de las aldolasas naturales.
Los compuestos de la divulgación también se pueden formar uniendo un agente de direccionamiento a una cisteína reactiva, tales como los encontrados en los sitios de combinación de anticuerpos catalíticos de tioesterasa y esterasa. Los anticuerpos que contienen aminoácidos reactivos se pueden preparar por medios bien conocidos en la técnica, incluyendo mutar un sitio de unión a anticuerpo para codificar el aminoácido reactivo o derivatizar químicamente una cadena lateral de aminoácido en un sitio de combinación de anticuerpo con un enlazador que contiene el grupo reactivo.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Cuando los compuestos de la divulgación están unidos covalentemente al sitio de combinación de un anticuerpo, y dichos anticuerpos están humanizados, es importante que dichos anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad de unión para el grupo W. Se contemplan diversas formas de anticuerpos de aldolasa murinos humanizados. Una realización utiliza el anticuerpo catalítico de aldolasa humanizado h38c2 IgG1 o h38c2 Fab con dominios constantes humanos CLk y CHy11. El gen DPK-9 de VLk de la línea germinal y el gen JK4 humano de Jk se usaron como marcos para la humanización del dominio variable de la cadena ligera kappa de m38c2, y el gen DP-47 de la línea germinal humana y el gen JH4 de JH humano se usaron como marcos para la humanización del dominio variable de cadena pesada de m38c2. La figura 8A ilustra una alineación de secuencia entre las cadenas ligeras y pesadas variables en m38c2, h38c2 y las líneas germinales humanas. h38c2 puede utilizar los dominios constantes de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, incluyendo cualquiera de sus alotipos. Otra realización utiliza un anticuerpo quimérico que comprende los dominios variables (VL y VH) de h38c2 (s Eq ID NO: 67 y 68 ) y los dominios constantes de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 que comprende un polipéptido de la divulgación que comprende la SEQ ID NO: 98 entre las láminas p E y F. La LC puede comprender la SEQ ID NO: 254. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa, Fab, Fab', F(ab')2, VH, VL, diacuerpo o minicuerpo que comprende los dominios VH y VL de h38c2. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que comprende los dominios VL y VH de h38c2 y un dominio constante seleccionado de entre el grupo que consiste en IgGl, IgG2 , IgG3 y IgG4. El anticuerpo puede ser una versión humanizada de un anticuerpo de aldolasa murino que comprende una región constante de un anticuerpo humano IgG, IgA, IgM, IgD o IgE. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende la región VL y VH de un anticuerpo de aldolasa murino (por ejemplo, SEQ ID NO: 69 y 70) y una región constante de un anticuerpo humano IgG, IgA, IgM, IgD o IgE, que comprende un polipéptido de la divulgación que comprende la SEQ ID NO: 98 entre las láminas p E y F. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es una versión completamente humana de un anticuerpo de aldolasa murino que comprende una secuencia polipeptídica de anticuerpo humano natural o nativo IgG, IgA, IgM, IgD o IgE.
Una realización usa h38c2 F(ab')2. Se puede producir h38c2 F(ab')2 mediante digestión proteolítica de h38c2 IgG1. Tal como se usa en el presente documento, "farmacocinética" se refiere a la concentración de un compuesto administrado en el suero a lo largo del tiempo. La farmacodinamia se refiere a la concentración de un compuesto administrado en tejidos diana y no diana a lo largo del tiempo y los efectos sobre el tejido diana (por ejemplo, eficacia) y el tejido no diana (por ejemplo, toxicidad). Se pueden diseñar mejoras en, por ejemplo, la farmacocinética o la farmacodinamia para un agente dirigido o agente biológico en particular, tal como mediante el uso de enlaces lábiles o mediante la modificación de la naturaleza química de cualquier enlazador (por ejemplo, cambiando la solubilidad, la carga y similares). El término “Koff" se refiere a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno. El término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros, tautómeros, solvatos y profármacos de compuestos, muestras, composiciones y composiciones farmacéuticas de la divulgación.
Enlazadores de anticuerpos catalíticos
Ciertos enlazadores adecuados para conectar agentes de direccionamiento (TA) al sitio de combinación de anticuerpos catalíticos (enlazadores de anticuerpos catalíticos: enlazadores CAb) se desvelan en el documento US2009098130. La expresión "agentes de direccionamiento" se usa en el presente documento para distinguir de la expresión "resto efector", pero es evidente que los tipos de moléculas unidas al final de un enlazador-CAb como un TA, o unidas al extremo de un enlazador-MAC como un resto efector puede ser intercambiable. En particular, los aspectos del documento US2009098130 pertenecientes a las fórmulas generales que describen (CAb-enlazadores, estructura específica de CAb-enlazador, síntesis de Cab-enlazadores y combinaciones de diferentes elementos de P1, Q1 y W1, (clasificados en él como grupos X, Y y Z, respectivamente), tal como se describe específicamente en el presente documento en general se incluyen en el presente documento.
El CAb-enlazador puede ser lineal o ramificado y, opcionalmente, incluye uno o más grupos carbocíclicos o heterocíclicos. La longitud de CAb-enlazador se puede ver en términos del número de átomos lineales, con fracciones cíclicas, tales como anillos aromáticos y similares, que se contarán tomando la ruta más corta alrededor del anillo. En algunas realizaciones, el CAb-enlazador tiene un tramo lineal de entre 5-15 átomos, en otras realizaciones 15-30 átomos, en aún otras realizaciones 30-50 átomos, en aún otras realizaciones, 50-100 átomos y en aún otras realizaciones 100-200 átomos. Otras consideraciones del CAb-enlazador incluyen el efecto sobre las propiedades físicas o farmacocinéticas del compuesto resultante, tal como la solubilidad, la lipofilicidad, la hidrofilicidad, la hidrofobicidad, la estabilidad (más o menos estable así como la degradación planificada), la rigidez, la flexibilidad, la inmunogenicidad y la modulación de la unión del anticuerpo, la capacidad para incorporarse en una micela o liposoma, y similares.
En algunos aspectos, el CAb-enlazador puede unirse covalentemente a la cadena lateral del resto de unión a TA. El enlazador puede comprender la fórmula: P1-Q1-W1; en la que Y1 es una cadena de conexión biológicamente compatible que incluye cualquier átomo seleccionado de entre el grupo que consiste en C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br y I, y puede comprender un polímero o copolímero de bloque, y está unido covalentemente al resto de unión (a través de la cadena lateral, el extremo amino o extremo carboxilo según sea apropiado) cuando el enlazador es lineal Q1 es un grupo de reconocimiento presente opcionalmente que comprende al menos una estructura de anillo; y W1 es un resto de unión que comprende un enlace covalente a una cadena lateral de aminoácido en un sitio de combinación de un anticuerpo.
Cuando está presente, Q1 puede tener la estructura opcionalmente sustituida:
Figure imgf000048_0001
en la que a, b, c, d y e son independientemente carbono o nitrógeno; f es carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre; Q1 está unido a P1 y W1 independientemente en cualesquiera 2 posiciones de anillo de suficiente valencia; y no más de 4 de a, b, c, d, e o f son simultáneamente nitrógeno y, preferentemente, a, b, c, d, y e en la estructura del anillo son cada uno carbono. En algunos aspectos, Q1 puede ser fenilo. Aunque no desea estar sujeto a ninguna teoría, se cree que el grupo Q1 puede ayudar a colocar el grupo reactivo en un sitio de combinación de anticuerpo adecuado para que el grupo W1 pueda reaccionar con una cadena lateral de aminoácido reactivo.
El CAb-enlazador puede diseñarse de manera que contenga un grupo reactivo capaz de formar un enlace covalente o no covalente con una macromolécula, tal como un anticuerpo, proteína o fragmento del mismo. El grupo reactivo se elige para su uso con un resto reactivo en un sitio de combinación particular. Por ejemplo, un resto químico para modificación por un anticuerpo de aldolasa puede ser una cetona, dicetona, p-lactama, éster activo halocetona, lactona, anhídrido, maleimida, a-haloacetamida, ciclohexil-dicetona, epóxido, aldehído, amidina, guanidina, imina, enamina, fosfato, fosfonato, epóxido, aziridina, tioepóxido, dicetona enmascarada o protegida (cetal, por ejemplo), lactama, halocetona, aldehído, y similares.
En algunas realizaciones, W1, antes de la conjugación con la cadena lateral de un resto en el sitio de combinación de un anticuerpo, incluye uno o más grupos C=O dispuestos para formar una azetidinona, dicetona, una acil plactama, un éster activo, una halocetona, un grupo ciclohexil-dicetona, un aldehído, una maleimida, un alqueno activado, un alquino activado o, en general, una molécula que comprende un grupo saliente susceptible de desplazamiento nucleofílico o electrofílico. Otros grupos pueden incluir una lactona, un anhídrido, una ahaloacetamida, una imina, una hidrazida o un epóxido. Los grupos reactivos electrófilos enlazadores de ejemplo que se pueden unir covalentemente a un grupo nucleofílico reactivo (por ejemplo, una cadena lateral de lisina o cisteína) en un sitio de combinación de anticuerpo incluyen acil p-lactama, dicetona simple, éster activo de succinimida, maleimida, haloacetamida con enlazador, halocetona, ciclohexil-dicetona, aldehído, amidina, guanidina, imina, enamina, fosfato, fosfonato, epóxido, aziridina, tioepóxido, una dicetona enmascarada o protegida (un cetal, por ejemplo), lactama, sulfonato, y similares, grupos C=O enmascarados, tales como iminas, cetales, acetales y cualquier otro grupo electrofílico conocido. En determinadas realizaciones, el grupo reactivo incluye uno o más grupos C=O dispuestos para formar una acil p-lactama, dicetona simple, éster activo de succinimida, maleimida, haloacetamida con enlazador, halocetona, ciclohexil-dicetona o aldehído. W1 puede ser un alquilo sustituido, cicloalquilo sustituido, arilo sustituido, arilalquilo sustituido, heterociclilo sustituido o heterocicliloalquilo sustituido, en el que al menos un sustituyente es un resto 1,3-dicetona, una acil p-lactama, un éster activo, una a-halocetona, un aldehído, una maleimida, una lactona, un anhídrido, una a-haloacetamida, una amina, una hidrazida o un epóxido. En algunos aspectos, el grupo W1 está unido covalentemente a un armazón de macromolécula que puede proporcionar una semivida aumentada a los péptidos de la divulgación. En algunos aspectos, el grupo W1, si está presente, está unido covalentemente al sitio de combinación de un anticuerpo.
En algunos aspectos, antes de la conjugación (por ejemplo, con el sitio de combinación de un anticuerpo), W1 tiene la estructura:
Figure imgf000048_0002
en la que q = 0-5. q puede ser 1 o 2. q puede ser 1. En otros aspectos, q puede ser 2. En algunos aspectos, después de la conjugación con el sitio de combinación del anticuerpo, W1 tiene la estructura:
Figure imgf000049_0001
en la que q = 0-5 y el anticuerpo-N- es un enlace covalente a una cadena lateral en un sitio de combinación de un anticuerpo. q puede ser 1 o 2. q puede ser 1. En otros aspectos, q puede ser 2. P1 puede ser un grupo que comprende tres componentes; P1p-P1s-P1y, en la que P1p es un grupo específicamente adaptado para ser combinable con el agente de direccionamiento, P1 es una región espaciadora del grupo P1, y P1y es un grupo adaptado para unirse al grupo W1. En algunos aspectos, P1y se selecciona de un enlace amida, un enlace enamina o un enlace guanidinio. P1y se puede seleccionar para proporcionar una molécula de hidrógeno adyacente (dentro de dos átomos) al grupo Q1. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el átomo de H puede ayudar al reconocimiento del grupo Q1 de un bolsillo hidrofóbico a través de la interacción del enlace de H, particularmente con respecto al bolsillo hidrofóbico de la hendidura de unión de un anticuerpo catalítico, tal como h38C2. Por lo tanto, el enlace amida, por ejemplo, puede estar orientado de tal manera que el grupo NH esté directamente unido al grupo Q1, proporcionando el H del grupo NH para enlaces de hidrógeno. Como alternativa, el grupo C=O de una amida puede estar unido al grupo Q1, con el H del grupo NH aproximadamente 2 átomos adyacentes al grupo Q1, pero aún está disponible para enlaces H. En algunas realizaciones, P1y está ausente. En algunas realizaciones, el grupo P1y tiene la fórmula:
Figure imgf000049_0002
En algunos aspectos, P1s se selecciona de modo que P1s no proporcione ningún grupo demasiado reactivo. P1s se puede seleccionar de modo que proporcione una longitud total de los grupos P1 de entre 2-15 átomos. P1s se puede seleccionar de modo que la longitud total del grupo P1 esté entre 2 y 10 átomos.
Los grupos X1 se pueden seleccionar de modo que la longitud total del grupo P1 sea de 4 a 8 átomos. Los grupos P1 se pueden seleccionar de modo que la longitud total del grupo P1 sea de 5 átomos. Los grupos P1 se pueden seleccionar de modo que la longitud total del grupo P1 sea de 6 átomos. En algunos aspectos, los grupos P1 pueden comprender una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000049_0003
en las que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10, y m está presente o ausente; n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ; n puede ser 1, 2, 3 o 4; n puede ser 1; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4.
P1p idealmente se selecciona para permitir una estrategia de unión covalente direccional específica al resto de unión de una molécula diana (resto de unión a TA), tal como un péptido, proteína, molécula pequeña, ácido nucleico o aptámero. Por ejemplo, cuando el resto de unión a TA comprende un grupo nucleofílico, P1p puede ser un grupo electrofílico y al contrario. Por ejemplo, si la cadena lateral del resto de unión a TA comprende un grupo amina, tal como K, H, Y, ortínina, Dap o Dab, Xp puede ser COOH u otro electrófilo reactivo similar. Si el resto de unión a TA es D o E, P1p puede comprender un grupo nucleofílico, tal como un grupo amina. Cualquiera de estas estrategias permite que se forme un enlace covalente entre el grupo P1p y el resto de unión a tA mediante estrategias de formación de enlace amida. El grupo de unión a TA es un grupo amina, P1p puede comprender la fórmula:
Y OH
P1 puede ser un polímero o copolímero de bloques biológicamente compatible y opcionalmente presente. P1 puede ser de la estructura:
Figure imgf000050_0001
en la que p es 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 32, 43, 44 o 45; w, r y s son cada uno independientemente 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20; y Rb en cada aparición es independientemente hidrógeno, alquilo C1-10 sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3-7-alquilo C1-6 sustituido o no sustituido o aril-alquilo C1-6 sustituido o no sustituido.
Cuando el resto de unión a TA es C, homólogos de C u otros restos que contienen grupos tiol, P1p puede comprender un grupo maleimida (o similar) que permite una estrategia de reacción de adición de tiol-maleimida para unir covalentemente el grupo P1p al resto de unión a TA. En algunos aspectos, P1p también puede comprender un grupo tiol, que permite que se forme un puente de disulfuro entre el resto de unión a TA y el grupo P1p. En algunos aspectos, P1p puede ser maleimida:
Figure imgf000050_0002
en la que la flecha indica el punto de unión a la molécula de direccionamiento y la línea paralela representa la unión al grupo Q1 del enlazador. Cuando el punto de unión a la molécula de direccionamiento comprende un resto de cisteína u otra cadena lateral portadora de tiol, el mecanismo de conjugación puede ser el siguiente:
Figure imgf000050_0003
En algunos aspectos, el grupo P1p comprende una maleimida sustituida:
Figure imgf000050_0004
En algunos aspectos, P1 es
Figure imgf000050_0005
en la que v y w se seleccionan de manera que la longitud de la cadena principal de X1 es de 6-12 átomos; En algunos aspectos, el enlazador a TA es de fórmula:
Figure imgf000051_0001
en la que n = 1, o 2, o 3, o 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10; n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ; n puede ser 1; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4. M puede estar ausente. M puede estar presente. En algunos aspectos, el enlazador a TA es de fórmula:
Figure imgf000051_0002
en la que n = 1, o 2, o 3, o 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10; n puede ser 1, 2, 3, 4, 5 o 6 ; n puede ser 1 ; n puede ser 2 ; n puede ser 3; n puede ser 4. M puede estar ausente. M puede estar presente.
En algunos aspectos, la porción P1 de los enlazadores-CA se puede usar como Y1, X1-Y1, Y1-Z y X1-Y1-Z, porción de enlazadores para un MAC de la invención.
Péptidos y proteínas
Aci I lis na o
Kac [tam bién AcK) se refiere a: Ksh se refiere a: A ib (ácido Z-am'noisobutírico):
H=N^ Ü H h2nJ Í , 0 h
Figure imgf000051_0003
HNyO H N y - ^ S H
O
Ácido diam 'nobutírico (D a b ) Ácido diam'nopropiónico (DapJ
Figure imgf000051_0004
Homacisteína Hormoserina Ornitina
h: ^
Figure imgf000051_0005
Generalmente, la nomenclatura usada en relación con cultivos celulares y tisulares, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación y técnicas de los mismos descritas en el presente documento, es la conocida y usada habitualmente en la materia. Los procedimientos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se tratan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Tal como se usa en el presente documento, los 20 aminoácidos naturales o convencionales y sus abreviaturas siguen los códigos de la IUPAC de una sola letra y de tres letras. "Polipéptido", "péptido", y “proteína” se usan de forma intercambiable para hacer referencia a un polímero de restos de aminoácidos. Tal como se usa en el presente documento, estos términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de origen natural. Estos términos también se aplican a polímeros de aminoácidos de origen natural.
Los aminoácidos pueden estar en forma L o en forma D, siempre que se mantengan la unión y otras características deseadas del péptido. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
A menos que se indique lo contrario con un prefijo "D", por ejemplo, D-Ala o N-Me-D-Ile, o escrito en formato de minúscula, por ejemplo, a, i, I, (versiones D de Ala, Ile, Leu), la estereoquímica del carbono a de los aminoácidos y restos aminoacilo en los péptidos descritos en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son la configuración natural o en "L".
Todas las secuencias peptídicas se escriben de acuerdo con la convención generalmente aceptada en la que el resto de aminoácido a-N-terminal está a la izquierda y el resto de aminoácido a-C-terminal está a la derecha. Tal como se usa en el presente documento, el término "extremo N" se refiere al grupo a-amino libre de un aminoácido en un péptido, y el término "extremo C" se refiere al término ácido a-carboxílico libre de un aminoácido en un péptido. Un péptido que está terminado en N con un grupo se refiere a un péptido portador de un grupo en el nitrógeno a-amino del resto de aminoácido N-terminal. Un aminoácido que está terminado en N con un grupo se refiere a un aminoácido portador de un grupo en el nitrógeno a-amino.
Tal como se usa en el presente documento, "halo", "halógeno" o "haluro" se refiere a F, Cl, Br o I.
Tal como se usa en el presente documento, "actividad biológica" se refiere a las actividades in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla, o respuestas fisiológicas que resultan de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. Por tanto, la actividad abarca efectos terapéuticos, efectos de diagnóstico y actividad farmacéutica de tales compuestos, composiciones y mezclas.
La expresión "biológicamente compatible", como se usa en el presente documento, significa algo que es biológicamente inerte o no reactivo con moléculas biológicas intracelulares y extracelulares, y no tóxicas.
El término "alquilo" por sí mismo o como parte de otro término se refiere a un hidrocarburo saturado de cadena lineal 0 ramificada que tiene el número indicado de átomos de carbono (por ejemplo, "alquilo C1-C8" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono). Cuando la cantidad de átomos de carbono no está indicada, el grupo alquilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Entre los alquilos C1-C8 de cadena lineal representativos se incluyen, aunque no de forma limitante, metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo y n-octilo; mientras que los alquilos C1-C8 ramificados incluyen,, aunque no de forma limitante, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -tent-butilo, -isopentilo y -2-metilbutilo; entre los alquilos C2-C8 insaturados se incluyen, aunque no de forma limitante, vinilo, alilo, 1 -butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo y 3-metil-1-butinilo.
La frase "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más enlaces a uno o más carbonos o hidrógenos se reemplazan por un enlace a átomos que no son de hidrógeno y que no son de carbono, tales como, aunque no de forma limitante, un átomo de halógeno en haluros tales como F, Cl, Br e I; un átomo de oxígeno en grupos tales como grupos hidroxilo, grupos alcoxi, grupos ariloxi y grupos éster; un átomo de azufre en grupos tales como grupos tiol, grupos sulfuro de alquilo y arilo, grupos sulfona, grupos sulfonilo y grupos sulfóxido; un átomo de nitrógeno en grupos tales como aminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas y enaminas; un átomo de silicio en grupos tales como en grupos trialquilsililo, grupos dialquilarilsililo, grupos alquildiarilsililo y grupos triarilsililo; y otros heteroátomos en varios otros grupos. Los grupos alquilo sustituidos también incluyen grupos en los que uno o más enlaces a uno o más átomos de carbono o hidrógeno se reemplazan por un enlace a un heteroátomo, tal como oxígeno en grupos carbonilo, carboxilo y éster; nitrógeno en grupos tales como iminas, oximas, hidrazonas y nitrilos. Los grupos alquilo sustituidos incluyen, entre otros, grupos alquilo en los que uno o más enlaces a un átomo de carbono o hidrógeno se reemplazan por uno o más enlaces a átomos de flúor. Un ejemplo de un grupo alquilo sustituido es el grupo trifluorometilo y otros grupos alquilo que contienen el grupo trifluorometilo. Otros grupos alquilo incluyen aquellos en los que uno o más enlaces a un átomo de carbono o hidrógeno se reemplazan por un enlace a un átomo de oxígeno de manera que el grupo alquilo sustituido contiene un grupo hidroxilo, alcoxi, ariloxi o heterocicliloxi. Todavía otros grupos alquilo incluyen grupos alquilo que tienen un grupo amina, alquilamina, dialquilamina, arilamina, (alquil)(aril)amina, diarilamina, heterociclilamina, (alquil)(heterociclil)amina, (aril)(heterociclil)amina o diheterociclilamina.
La frase "alquilo no sustituido" se refiere a un grupo alquilo no sustituido divalente como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, metileno, etileno y propileno son cada uno ejemplos de alquilenos no sustituidos. La frase "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo sustituido divalente como se ha definido anteriormente. Los grupos alquileno inferiores sustituidos o no sustituidos tienen de 1 a aproximadamente 6 carbonos.
La frase "cicloalquilo no sustituido" se refiere a grupos alquilo cíclicos, tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo, y tales anillos sustituidos con grupos alquilo de cadena lineal y ramificada como se ha definido anteriormente. La frase también incluye grupos de alquilo policíclicos, tales como, aunque no de forma limitante, adamantil norbornilo y biciclo[2.2.2]octilo y similares, así como dichos anillos sustituidos con grupos alquilo de cadena lineal y ramificada, como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, la frase incluiría grupos metilciclohexilo entre otros. La frase no incluye grupos de alquilo cíclico que contienen heteroátomos.
Los grupos cicloalquilo no sustituidos pueden estar unidos a uno o más átomos de carbono, átomo(s) de oxígeno, átomo(s) de nitrógeno y/o átomo(s) de azufre en el compuesto original. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquilo no sustituidos tienen de 3 a 20 átomos de carbono. En otras realizaciones, tales grupos alquilo no sustituidos tienen de 3 a 8 átomos de carbono, mientras que en otros, tales grupos tienen de 3 a 7 átomos de carbono.
La frase "cicloalquilo sustituido" tiene el mismo significado con respecto a los grupos cicloalquilo no sustituidos que los grupos alquilo sustituidos tienen con respecto a los grupos alquilo no sustituidos. Por lo tanto, la frase incluye, aunque no de forma limitante, grupos oxociclohexilo, clorociclohexilo, hidroxiciclopentilo y clorometilciclohexilo.
El término “arilo", por sí mismo o una parte de otro término, significa un radical hidrocarburo aromático carbocíclico monovalente sustituido o no sustituido de 6-20 átomos de carbono derivado mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un único átomo de carbono de un sistema de anillo aromático parental. Entre los grupos arilo típicos se incluyen, aunque no de forma limitante, radicales derivados de benceno, benceno sustituido, naftaleno, antraceno, bifenilo y similares. Un grupo aromático carbocíclico sustituido (por ejemplo, un grupo arilo) puede estar sustituido con uno o más, preferentemente de 1 a 5, de los siguientes grupos: alquilo C-i-Ca, -O-(alquilo C-i-Cs), -C(O)R', -OC(O)R',-C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en la que cada R' se selecciona independientemente entre -H, alquilo Ci-Cs y arilo no sustituido. En algunas realizaciones, un grupo aromático carbocíclico sustituido puede incluir adicionalmente uno o más de: -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR'. "Arileno" es el resto divalente correspondiente.
La expresión "alquilo sustituido" significa un alquilo en el que uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan independientemente con un sustituyente. Entre los sustituyentes típicos se incluyen, aunque no de forma limitante, -X, -R, -O-, -OR, -SR, -S-, -NR2, -NR3, =NR, -CX3, -CN, -OCN, -SCN, -N=C=O, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, -NRC(=O)R, -C(=O)NR2, -SO3-, -SO3H, -S(=O)2R, -OS(=O)2OR, -S(=O)2NR, -S(=O)R, -OP(=O)(OR)2, -P(=O)(OR)2,-PO32", PO3H2, -AsO2H2, -C(=O)R, -C(=O)X, -C(=S)R, -CO2R, -CO^, -C(=S)OR, -C(O)SR, -C(=S)SR, -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, o -C(=NR)NR2, en la que cada X es independientemente un halógeno: -F, -Cl, -Br o -I; y cada R es independientemente -H, alquilo C1-C20, heteroalquilo C1-C20, arilo C6-C20, heterociclilo C3-C8, un grupo protector o un resto de profármaco. Los grupos arilo, alquileno y heteroalquileno como se ha descrito anteriormente también pueden estar sustituidos de manera similar.
El término "aralquilo" por sí mismo o parte de otro término, significa un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, sustituido con un grupo arilo, como se ha definido anteriormente.
El término “alquileno”, por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un radical de hidrocarburo saturado de cadena lineal o ramificada o cíclico del número indicado de átomos de carbono, típicamente 1-18 átomos de carbono, y que tiene dos centros de radicales monovalentes derivados mediante la eliminación de dos átomos de hidrógeno de los mismos o dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Los radicales alquileno típicos incluyen, aunque no de forma limitante: metileno (-CH2-), 1,2-etileno -CH2CH2-), 1,3-propileno (-CH2CH2CH2-), 1,4-butileno (-CH2CH2CH2CH2-) y similares. Un alquileno "C1-C10" de cadena lineal es un grupo hidrocarburo saturado de cadena lineal de fórmula -(CH2)1-10-. Los ejemplos de un alquileno C1-C10 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, ocitileno, nonileno y decaleno.
El término "heteroalquileno" por sí mismo o como parte de otro sustituyente significa un grupo divalente derivado de heteroalquilo (como se ha tratado anteriormente). Para los grupos heteroalquileno, los heteroátomos también pueden ocupar cualquiera o ambos extremos de la cadena.
El término "heterociclilo C3-C8", por sí mismo o como parte de otro término, se refiere a un sistema de anillo monovalente aromático o no aromático sustituido o no sustituido bicíclico o tricíclico que tiene de 3 a 8 átomos de carbono (también denominados miembros del anillo) y de uno a cuatro miembros del anillo de heteroátomos seleccionados independientemente entre N, O, P o S, y derivados por la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo del anillo de un sistema de anillo parental. Uno o más de los átomos de N, C o S en el heterociclilo se pueden oxidar. El anillo que incluye el heteroátomo puede ser aromático o no aromático. A menos que se indique otra cosa, el heterociclilo está unido a su grupo colgante en cualquier heteroátomo o átomo de carbono que de como resultado una estructura estable. Los ejemplos representativos de un heterociclilo C3-C8 incluyen, aunque no de forma limitante, tetrahidrofuranilo, oxetanilo, piranilo, pirrolidinilo, piperidinilo, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, pirrolilo, tiofenilo (tiofeno), furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclilo C3-C8 puede ser sustituido con hasta siete grupos, incluyendo, aunque no de forma limitante, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8, -OR', arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(= O)2R', -S(O)R', halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en la que cada R' se selecciona independientemente entre -H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8 y arilo. En algunas realizaciones, un heterociclilo sustituido también puede incluir uno o más de: -NHC(=n H)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR'. "Heterociclo" es el resto divalente correspondiente.
El término "carbociclilo C3-C8", por sí mismo o como parte de otro término, es un anillo carbocíclico monocíclico o bicíclico no aromático saturado o insaturado monovalente de 3, 4, 5, 6 , 7 u 8 miembros derivado mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo del anillo de un sistema de anillo parental. Los grupos carbociclilo C3-C8 representativos incluyen, aunque no de forma limitante, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentadienilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 1,3-ciclohexadienilo, 1,4-ciclohexadienilo, cicloheptilo, 1,3-cicloheptadienilo, 1,3,5-cicloheptatrienilo, ciclooctilo, ciclooctadienilo, biciclo(111)pentano y biciclo(222)octano. Un grupo carbociclilo C3-C8 puede estar no sustituido o sustituido con hasta siete grupos, incluyendo, aunque no de forma limitante, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8, -OR', arilo, -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(= O)2R', -S(=O)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en el que cada R' se selecciona independientemente entre -H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C1-C8 y arilo. "carbociclo C3-C8" es el resto divalente correspondiente.
El término "heteroaralquilo" por sí mismo o parte de otro término, significa un grupo alquilo, como se ha definido anteriormente, sustituido con un grupo heterociclilo aromático, como se ha definido anteriormente. Heteroaralclo es el resto divalente correspondiente.
"Alrededor de" o "aproximadamente", cuando se usa en relación con una variable numérica medible, se refiere al valor indicado de la variable y a todos los valores de la variable que están dentro del error experimental del valor indicado (por ejemplo, dentro del intervalo de confianza del 95 % para la media) o dentro del 10 por ciento del valor indicado, lo que sea mayor.
"Cadena de conexión", o "cadena", como se usa en el presente documento, se refiere a las secuencias de aminoácidos en cualquier forma estructural terciaria distinta de una cadena p que conecta las cadenas p individuales de un dominio de inmunoglobulina. Los términos abarcan los motivos estructurales de a-hélices, vueltas, bucles y horquillas p. Los términos "a-hélices", "vueltas", "bucles" y "horquillas p" tienen el significado atribuido habitualmente a ellos en la técnica a fin de poder distinguir entre los cuatro motivos estructurales tridimensionales distintos.
El término "identidad", tal como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas polipeptídicas o dos o más moléculas de ácido nucleico, como se determina al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias de moléculas o de ácido nucleico, según sea el caso, como se determina mediante la coincidencia entre cadenas de las secuencias de nucleótidos o aminoácidos. "Identidad" mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre dos o más secuencias con alineaciones de hueco dirigidas por un modelo matemático particular de programas informáticos (es decir, "algoritmos").
El término "similitud" es un concepto relacionado, pero a diferencia de "identidad", se refiere a una medida de similitud que incluye coincidencias idénticas y coincidencias de sustitución conservadora. Dado que las sustituciones conservadoras se aplican a los polipéptidos y no a las moléculas de ácido nucleico, la similitud solo trata con las comparaciones de secuencias de polipéptidos. Si dos secuencias polipeptídicas tienen, por ejemplo, 10 de 20 aminoácidos idénticos, y el resto son todas sustituciones no conservadoras, los porcentajes de identidad y similitud serían ambos 50 %. Si en el mismo ejemplo, hay 5 posiciones más en las que hay sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad permanece en el 50 %, pero el porcentaje de similitud sería del 75 % (15 de 20). Por lo tanto, en los casos en los que hay sustituciones conservadoras, el grado de similitud entre dos secuencias polipeptídicas será mayor que el porcentaje de identidad entre dichas dos secuencias.
La expresión “sustitución de aminoácido conservadora” se refiere a una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto no nativo, de modo que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o la carga del resto de aminoácido en dicha posición. Por ejemplo, una sustitución conservadora es el resultado del reemplazo de un resto no polar en un polipéptido por cualquier otro resto no polar.
Alineación estructural
Las alineaciones estructurales, que generalmente son específicas de la proteína y algunas veces de las secuencias de ARN, utilizan información sobre la estructura secundaria y terciaria de la molécula de proteína o ARN para ayudar a alinear las secuencias. Estos procedimientos se usan para dos o más secuencias y normalmente producen alineaciones locales; sin embargo, dado que dependen de la disponibilidad de la información estructural, solo pueden usarse para secuencias cuyas estructuras correspondientes son conocidas (generalmente a través de cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN). Debido a que tanto la estructura de la proteína como del ARN está más conservada evolutivamente que la secuencia, las alineaciones estructurales pueden ser más fiables entre secuencias que están relacionadas muy de lejos y que han divergido tan ampliamente que la comparación de secuencias no puede detectar de manera fiable su similitud. Cuando no hay datos estructurales disponibles sobre una de las proteínas, aún se puede hacer una comparación si los datos estructurales están disponibles en una o, preferentemente, más proteínas estrechamente relacionadas, tales como inmunoglobulinas a través de especies y, en particular, dominios constantes de anticuerpos a través de las especies y los subtipos.
Las alineaciones estructurales se utilizan como la "referencia" en la evaluación de las alineaciones para la predicción de la estructura de proteínas basada en la homología porque alinean explícitamente regiones de la secuencia de proteínas que son estructuralmente similares en lugar de depender exclusivamente de la información de la secuencia.
El procedimiento DALI, o la alineación de matriz de distancia, es un procedimiento basado en fragmentos para construir alineaciones estructurales basadas en patrones de similitud de contacto entre hexapéptidos sucesivos en las secuencias de consulta. Puede generar alineaciones pareadas o múltiples e identificar los vecinos estructurales de una secuencia de consulta en el Banco de Datos de Proteínas (PDB). Se ha utilizado para construir la base de datos de alineación estructural de FSSP (clasificación de Fold basada en la alineación estructura-estructura de proteínas o familias de proteínas estructuralmente similares). Se puede acceder a un servidor web DALI en EBI DALI y el FSSP se encuentra en The Dali Database.
El SSAP (programa de alineación de estructura secuencial) es un procedimiento de alineación estructural basado en programación dinámica que utiliza vectores de átomo-átomo en el espacio de estructura como puntos de comparación. Se ha extendido desde su descripción original para incluir alineaciones múltiples así como pareadas, y se ha utilizado en la construcción de CATH (Clase, Arquitectura, Topología, homología), clasificación jerárquica de la base de datos de pliegues de proteínas. Se puede acceder a la base de datos CATH en la Clasificación de la estructura de proteínas CATH.
El procedimiento de extensión combinatoria de la alineación estructural genera una alineación estructural pareada mediante el uso de geometría local para alinear fragmentos cortos de las dos proteínas que se analizan y luego ensambla estos fragmentos en una alineación mayor. Según medidas tales como la distancia cuadrada media de la raíz del cuerpo rígido, distancias de restos, estructura secundaria local y características ambientales circundantes, tales como la hidrofobicidad del vecino residual, se generan alineaciones locales llamadas "pares de fragmentos alineados" y se utilizan para construir una matriz de similitud que representa todas las posibles alineaciones estructurales dentro de los criterios de corte predefinidos. A continuación, se traza un camino desde un estado de estructura de proteína al otro a través de la matriz extendiendo la alineación creciente un fragmento cada vez. Dicho camino óptimo define la alineación de extensión combinatoria. Un servidor basado en la web que implementa el procedimiento y que proporciona una base de datos de alineaciones pareadas de estructuras en el Banco de Datos de Proteínas se encuentra en el sitio web de extensión combinatoria.
Alineación de secuencias
Cuando la alineación estructural con secuencias de la invención no es posible, por ejemplo, debido a la ausencia de RMN de secuencia diana o datos de estructura cristalina, se puede usar alineación de secuencia. El experto está familiarizado con las herramientas de alineación de secuencias (tales como BLAST, CLUSTAL y otras conocidas por el experto, tales como las descritas en el presente documento) y puede alinear secuencias, particularmente secuencias de dominios constantes de anticuerpo de acuerdo con motivos estructurales conocidos, especialmente debido al gran número de estudios estructurales de ejemplo ya existentes para los dominios de inmunoglobulina, anticuerpos y dominios constantes de anticuerpo en particular, a través de subtipos y especies.
Los enfoques computacionales para la alineación de secuencias generalmente entran en dos categorías: alineaciones globales y alineaciones locales. Calcular una alineación global es una forma de optimización global que "obliga" a la alineación a abarcar toda la longitud de todas las secuencias de consulta. En contraste, las alineaciones locales identifican regiones de similitud dentro de secuencias largas que a menudo son ampliamente divergentes en general. Las alineaciones locales a menudo son preferibles, pero pueden ser más difíciles de calcular debido al desafío adicional de identificar las regiones de similitud. Se han aplicado diversos algoritmos computacionales al problema de alineación de secuencias. Estos incluyen procedimientos lentos pero formalmente correctos, como la programación dinámica y también eficiente, algoritmos heurísticos o procedimientos probabilísticos diseñados para la búsqueda de bases de datos a gran escala, que no garantizan encontrar las mejores coincidencias.
Las alineaciones globales, que intentan alinear cada resto en cada secuencia, son más útiles cuando las secuencias en el conjunto de consulta son similares y de aproximadamente el mismo tamaño. Una técnica general de alineación global es el algoritmo de Needleman-Wunsch, que se basa en la programación dinámica. Las alineaciones locales son más útiles para secuencias diferentes que se sospecha que contienen regiones de similitud o motivos de secuencia similares dentro de su contexto de secuencia más grande. El algoritmo de Smith-Waterman es un procedimiento de alineación local general también basado en la programación dinámica.
Los procedimientos de alineación de secuencia apareada se usan para encontrar las alineaciones por partes (locales) o globales que mejor coincidan de dos secuencias de consulta. Los tres procedimientos principales para producir alineamientos pareadas son los procedimientos de matriz de puntos, programación dinámica y procedimientos de texto; sin embargo, las técnicas de alineación de secuencias múltiples también pueden alinear pares de secuencias. Aunque cada procedimiento tiene sus fortalezas y debilidades individuales, los tres procedimientos pareados tienen dificultad con secuencias altamente repetitivas de bajo contenido de información, especialmente cuando el número de repeticiones difiere en las dos secuencias que se alinearán. Una forma de cuantificar la utilidad de una alineación pareada dada es la "coincidencia única máxima'" (MUM) o la subsecuencia más larga que se produce en ambas secuencias de consulta. Las secuencias MUM más largas típicamente reflejan una relación más estrecha. Se diseñan procedimientos preferidos para determinar la identidad y/o similitud para dar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informáticos disponibles para el público. Los procedimientos preferidos del programa informático para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, aunque no de forma limitante, el paquete del programa GCG, incluyendo GAP (Devereux y col., Nuc. Acids Res. 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN y FASTA (Atschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403­ 10 (1990)). El programa BLAST X está disponible públicamente en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (Altschul y col., BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, MD); Altschul y col., 1990, citado anteriormente). También se puede usar el algoritmo bien conocido de Smith Waterman para determinar la identidad. A modo de ejemplo, utilizando el algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group), dos polipéptidos para los que se determinará el porcentaje de identidad de secuencia están alineados para una coincidencia óptima de sus respectivos aminoácidos (el "tramo emparejado", según lo determinado por el algoritmo). Una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se utiliza; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que es normalmente 0,1 veces la penalización por apertura de hueco), así como una matriz de comparación, tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan junto con el algoritmo. Los parámetros preferidos para la comparación de secuencias de polipéptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-53 (1970). Matriz de comparación: BLo Su M 62 de Henikoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 10915-19 (1992). Otros algoritmos de ejemplo, penalizaciones por abertura de hueco, penalizaciones por extensión de huecos, matrices de comparación, umbrales de similitud, etc. pueden ser utilizados por los expertos en la técnica, incluidos los establecidos en el Manual del programa, Paquete Wisconsin, Versión 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares que se realizarán dependerán de la comparación específica que se realice, tal como ADN a ADN, proteína a proteína, proteína a ADN; y, adicionalmente, si la comparación es entre pares de secuencias dados (en cuyo caso generalmente se prefiere GAP o BestFit) o entre una secuencia y una gran base de datos de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).
LISTADO DE SECUENCIAS
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Descripción detallada de las figuras
Figura 1: El análisis de peso molecular intacto de MAC mediante espectrometría de masas demuestra que múltiples péptidos están unidos al anticuerpo anti-IGF1R 2.12.1.fx. Figura 1A: Datos de espectrometría de masas del anticuerpo anti-IGF1R 2.12.1.fx. Figura 1B-1D: Datos de espectrometría de masas de MAC-2, que muestra experimentos replicados de 3 lotes individuales.
Figura 2: Datos de espectrometría de masas de 2.12.1.fx (IGF1R) y 3 lotes de MAC-2 (MAC) en el que los enlaces disulfuro se han reducido. Figura 2A: Datos de espectrometría de masas de 2.12.1.fx (IGF1R), cadena ligera. Figura 2B: Datos de espectrometría de masas de 2.12.1.fx (IGF1R), cadena pesada. Figura 2C: Datos de espectrometría de masas de la cadena ligera de MAC-2, lote-1. Figura 2D: Datos de espectrometría de masas de la cadena pesada de MAC-2, lote-1. Figura 2E: Datos de espectrometría de masas de la cadena ligera de MAC-2, lote-2. Figura 2F: Datos de espectrometría de masas de la cadena pesada de MAC-2, lote-2. Figura 2G: Datos de espectrometría de masas de la cadena ligera de MAC-2, lote-3. Figura 2H: Datos de espectrometría de masas de la cadena pesada de MAC-2, lote-3.
Figura 3A: Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1.fx con sitios de escisión de quimotripsina indicados en viñetas. Los fragmentos digeridos con quimotripsina que contienen un resto de Lys (sitio de posible conjugación) se marcaron con un número desde el extremo N-terminal. El fragmento Y15 de la cadena ligera está subrayado. Figura 3B: La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1.fx con sitios de escisión de quimotripsina indicados con viñetas. Los fragmentos digeridos con quimotripsina que contienen un resto de Lys (sitio de posible conjugación) se marcaron con un número desde el extremo N-terminal.
Figura 4A: Datos de espectrometría de masas de un péptido que contiene lisina conjugado: cadena ligera Y15, que muestra datos de espectrometría de masas para anticuerpos anti-IGF1R no conjugados 2.12.1.fx (IGF1r) y MAC-2 (MAC), así como una representación del fragmento Y15. Figura 4B: Datos de espectrometría de masas del fragmento Y15 de la cadena ligera no conjugada, que muestra datos de espectrometría de masas para anticuerpos anti-IGF1R no conjugados 2.12.1.fx (IGF1r) y MAC-2 (MAC), así como una representación del fragmento Y15.
Figura 5A: Los datos seleccionados del cromatograma de LCMS de iones para el fragmento digerido con tripsina de 2.12.1.fx. Figura 5B: Los datos seleccionados del cromatograma LCMS de iones para el fragmento digerido con tripsina cuando LC-K188 está modificada con la ABP de MAC-2.
Figura 6A: Los datos seleccionados del cromatograma de LCMS de iones para el fragmento digerido con tripsina de 2.12.1.fx. Figura 6 B: Los datos seleccionados del cromatograma de LCMS de iones para el péptido digerido con tripsina cuando LC-K190 está modificada con la ABP de MAC-2.
Figura 7A: Espectros de masas de MAC-2 intacto. Figura 7B: Espectros de masas de la cadena pesada reducida para MAC-2. Figura 7C: Espectros de masas de la cadena ligera reducida para MAC-2.
Figura 8A: Alineación de la secuencia de aminoácidos de los dominios variables de m38c2, h38c2 y líneas germinales humanas. Las regiones marco (FR) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se definen de acuerdo con Kabat y col., Los asteriscos marcan las diferencias entre m38c2 y h38c2 o entre h38c2 y las líneas germinales humanas.
Figura 8B: Alineación de la secuencia de aminoácidos de la región kappa de la cadena ligera constante murina (mCLK), región kappa constante de la cadena ligera humana (hCLK) y región lambda constante de la cadena ligera humana (hCLA). Las diferencias entre mCLK y hCLK; y entre hCLK y hCLA; se muestran como asteriscos y las sustituciones conservadas se muestran como cruces. Las cadenas p A-G están subrayadas. La vuelta entre las cadenas p A y B y la a-hélice entre las cadenas p E y F se indican cada una en cursiva. Las cisteínas formadoras de enlaces disulfuro entre la primera lámina p (compuesta por las cadenas p ABDE; subrayado único) y la segunda lámina p (compuesta por las cadenas p CGF, doble subrayado) se indican por §. Los loci polimórficos conocidos en las secuencias humanas se indican en negrita.
Figura 9A: Datos de unión en ELISA para la unión al receptor de HER2 de los productos de conjugación de trastuzumab y trastuzumab-[CLK-D185A] a [PEG5-K11-SEQ: 27]. Figura 9B: Datos de unión en ELISA para la unión al receptor de HER2 de los productos de conjugación de trastuzumab y trastuzumab-[CLK-D185A] a la toxina de MmAd .
Figura 10A: Representación de un dominio constante de Ig que muestra las 7 cadenas p que forman las dos láminas p. Figura 10B: Vista de cerca de la a-hélice entre las láminas p E y F.
Figura 11. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de CLk, que muestra el "sitio de unión" reactivo del éster de halo-fenilo (clavijas pequeñas) dentro del "bolsillo de unión" estérico global creado por la estructura 3D. Las cadenas B están marcadas.
Figura 12. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina del "bolsillo de unión" a CLk, que muestra CLk-D77 y CLK-D43(como un modelo de barra) en el enlace de hidrógeno con CLk-H81 Ne o N8 , y las distancias atómicas en A.
Figura 13A y 13B. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los "bolsillos de unión" mutantes de CLk y c Lk-D77A. La distancia entre el oxígeno del carbonilo de CLk-D43 y NS de CLk-H81 difiere en 1 A entre el mutante CLk y CLk-D77A, señalando el predominio del tautómero CLk-H81 catalíticamente activo en el mutante CLk- D77A. Además, el modelado identifica un claro aumento en el tamaño total del bolsillo en el mutante CLk-D77A, que está representado por la figura. Figura 13C. Representación de la cinta según la estructura cristalina de los "bolsillos de unión" de CLk (gris) y CLk-D77A mutante (negro) superpuestos uno sobre otro. En el mutante CLk-D77A, CLk- H81 está desplazado hacia CLk-D43 por las interacciones del enlace de hidrógeno, ya que CLk-D77A no puede formar un enlace de hidrógeno con Ne de CLk-H81.
Figura 14. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina del "bolsillo de unión" a CLk. El sitio de unión se representa como un pequeño conector. Se muestran las interacciones de apilamiento de electrones n con CLk-H81, manteniendo el anillo de imidazol en la posición óptima en relación con el sustrato de éster de halo-fenilo entrante.
Figura 15A y 15B. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los "bolsillos de unión" a CLk y CLA.
La Figura 15A muestra las interacciones de electrones n entre CLk-V42 y CLk-H81, que ayudan a mantener el anillo de imidazol CLk-H81 y el par de electrones Ne en el plano necesario para el ataque nucleofílico durante la reacción catalítica. La distancia entre el centro del anillo de imidazol CLk-H81 y cada uno de los átomos de hidrógeno en el CLk-V42 es de 2,8 A, lo que permite interacciones fuertes. En la figura 15B, CLA-A49 se muestra a una distancia de 4,2 A de CLA-H82 (identificada como H81 en la figura a los efectos de la claridad de la comparación). Esta distancia se modela como muy probable que tenga una influencia significativa en la posición o forma tautomérica de CLA-H82.
Figura 16. Alineación de secuencias de hCHA1, hCHA2, hCHA3, hCLK y hCLA. Las cadenas p de CLk se indican como regiones subrayadas. Las a-hélices están indicadas en cursiva.
Figura 17. Alineación basada en la estructura cristalina de LAS secuencias de hCHA1, hCHA2, hCHA3, hCLK y hCLA de acuerdo con la homología 3D minimizada. Las cadenas p se indican como regiones dentro de una caja, las a-h 7é 7lices est oárín indicadas Q'i dentro de rollos ondulados. Los restos clave corresp 1ondientes a CLk-V42, CLk-D43, CLk-D , CLk-K , y CLk-H se identifican con cajas de líneas de puntos rectangulares que se extienden verticalmente entre las secuencias. El modelado de la estructura cristalina de los dominios que generaron esta alineación sugirió una breve rotura en la cadena p D en los dominios hCHA1, hCHA2, hCHA3 y hCLA. Otros modelos y análisis de estructuras cristalinas indican que la mayoría, si no todos los dominios constantes de anticuerpos comprenden 7 cadenas p y la cadena p D es contigua. Las dos cadenas p D modeladas en el presente documento se han indicado en consecuencia como D' y D". Las figuras 18B-31B, que representan los dominios CLA y CHy, están orientadas de tal manera que la cadena p D se encuentra en la parte inferior izquierda de la estructura que apunta hacia abajo y se extiende contra la cadena p E. Se puede observar que las cadenas p D' y D" juntas ocupan aproximadamente la misma posición relativa que la cadena p CLk D (cadenas p D y D', D" marcado en la Figura 18 como punto de referencia).
Figura 18. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y hCLA (B).
Figura 19. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y WT-hCHYl (B).
Figura 20. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y WT-hCHYl (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 21. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y hCHYl-m1-D44 mutante (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 22. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y de cambio de bucle hCHYl-T78K/Q79H/CD mutante (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 23. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y WT-hCHY2 (B).
Figura 24. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y WT-hCHY2 (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 25. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y hCHY2m mutante (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 26. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y hCHY2m-D82A mutante (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 27. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y WT-hCHY3 (B).
Figura 28. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y WT-hCHY3 (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 29. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y hCHY3m mutante (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 30. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y hCHY3m CD/EF mutante (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 31. Representación de la cinta minimizada según la estructura cristalina de los dominios hCLK (A) y hCHY3m CD/EF-m2 mutante (B), que muestra la ubicación de la cadena lateral de restos significativos.
Figura 32A y 32B. Alineación de CHy1, CHy2 y CHy3 con sus respectivos mutantes y mutante propuesto, junto con CLk y CLA.
Ejemplos
Para que la presente invención se pueda entender mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la divulgación de ninguna manera.
Descripción de las adiciones de conjugación (CA), CA promedio
Las adiciones de conjugación (CA) se miden en un armazón de anticuerpos usando la medición de masa intacta por espectrometría de masas. Tras la conjugación, la masa total del producto intacto aumenta por la masa y el número de adiciones del péptido conjugado, la toxina, etc. Si se producen adiciones múltiples, se observa una distribución de las formas conjugadas en un espectro de masas y la intensidad de señal observada de cada forma de conjugado proporciona una medida cuantitativa. Este análisis se presenta rutinariamente en una tabla enumerando cada forma de CA como un porcentaje de todas las formas de CA observadas. CA promedio (por ejemplo: el número total de CA presente en un armazón) es un valor adicional que describe la carga conjugada promedio. A continuación se proporciona un ejemplo de 2 productos de fármacos conjugados. El ejemplo 1 tiene una distribución uniforme de CA con una CA promedio = 2,00. El ejemplo 2 tiene una distribución que favorece fuertemente la presencia de 2 CA con una cantidad mínima de otras formas de conjugación. La CA promedio es similar entre estos ejemplos (2,13 frente a 2 ,00); sin embargo, el ejemplo 1 es un producto más heterogéneo que comprende más formas de conjugación, mientras que el ejemplo 2 es un producto más homogéneo que contiene principalmente 2 CA.
Tabla 1
Figure imgf000085_0001
También es posible un tratamiento analítico similar en estos armazones de anticuerpos después de que los enlaces disulfuro se hayan reducido para generar cadenas ligeras y cadenas pesadas libres. La medición de la masa intacta de las cadenas ligeras/pesadas conjugadas puede proporcionar información sobre la ubicación de CA en estas subunidades respectivas.
Explicación de la conjugación direccional con CLk-K80
Para determinar la unión específica del sitio de conjugados de fármacos a un armazón de anticuerpos, se produce un mapa peptídico. Los mapas peptídicos son el análisis de una secuencia de proteínas con detalle para caracterizar el péptido producido después de una digestión proteolítica del producto de fármaco conjugado. Una vez que la proteína se digiere, los péptidos resultantes se analizan mediante cromatografía líquida de fase inversa con detección por espectrometría de masas (RPLC/MS). La presencia de adiciones conjugadas en restos de aminoácidos discretos se observa como un desplazamiento de masa correspondiente en comparación con el péptido no conjugado. Este procedimiento se ha repetido en múltiples anticuerpos conjugados con múltiples adiciones conjugadas que usan ésteres reactivos de PFP para detectar restos de lisina. (Los datos se presentan a continuación y también en el documento WO2012007896, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento en su totalidad). En estos estudios, las siguientes observaciones fueron consistentes: 1- las adiciones de conjugado se observaron con mayor frecuencia en las LC que en las HC, 2- CLk-K80 es el resto específico preferido que está modificado, 3- muchas otras ubicaciones también están modificadas tanto en la LC como en la HC; sin embargo, cada sitio alternativo está modificado a un nivel bajo. En resumen, la conjugación de éster de halo-fenilo da como resultado la modificación preferida de CLk-K80 y la conjugación adicional se distribuye a un nivel bajo a través de múltiples restos. Por este motivo, el procedimiento de conjugación generalmente se optimiza para dar como resultado valores altos de % de CA para 2 adiciones de conjugados porque esto promueve un producto que está completamente conjugado en una única ubicación en cada LC. Mientras que niveles elevados de % de CA de 0-1 conjugados dan como resultado una modificación de CLk-K80 preferible, estas formas conjugadas también representan una cantidad significativa de armazones sin reaccionar. Los productos que muestran valores promedio de CA significativamente mayores que 2 sugieren la presencia de adiciones de conjugados que no están dirigidos a restos discretos. Cuando la HC y la LC se reducen y se analizan por separado, el % de valor de 1 CA indica el % de conjugación en una sola especie de LC y, por lo tanto, es un indicador fiable de la eficiencia de la conjugación con el resto de CLk-K80.
Ejemplo 1 Síntesis de ejemplo de los péptidos usados en los ejemplos
Ejemplo de referencia
Figure imgf000086_0001
Esquema 1: Síntesis en fase sólida de una cadena peptídica usando química de Fmoc (ilustrada como ejemplo con un péptido de unión a Ang2 típico (ABP) SEQ ID NO: 27. TFA/agua/fenol/triisopropilsilano (90:4:4:2). Resina de amida de Rink. Etapas para SPPS usando química de Fmoc: (i) Eliminación de Fmoc con un 20 % de piperidina/DMF, (ii) Acoplamiento de aminoácidos; Relación HBTU:aminoácido:HOBt:NMM con respecto a la carga de amina de resina es 5:5:5:20. El disolvente usado fue
Síntesis de compuestos de péptido-tiol-enlazador
Figure imgf000087_0001
Esquema 2: Síntesis de SEQ ID NO: 27-KSH11 (K11 sustituido con el residuo de unión KSH). Ácido S-Tritilmercaptopropiónico/HBTU/NMM (relación 5:5:10 con respecto al péptido). Intermedio del péptido tiol Ang2 protegido con tritilo.TFA/DCM/TIPS (relación 5:93:2). Tiol portador del péptido modificado con Ang2.
Un péptido de unión a Ang2 (ABP; SEQ ID NO: 27) (284 mg, 0,1 mmol) se disolvió en dimetilformamida (0,5 ml) con agitación. Por separado, Ácido S-tritilmercaptopropiónico (MPA, 62 mg, aproximadamente 0,125 mmol), HBTU (48 mg, 0,125 mmol) y N-metilmorfolina (0,025 ml, 0,25 mmol) se agitaron en DMF (0,5 ml) durante 5 minutos hasta que se disolvieron. La solución de ABP y las soluciones de MPA activado se mezclaron juntas durante 2 horas. El progreso de la reacción se controló mediante LCMS. Después de 2 horas, la solución se añadió lentamente a éter enfriado con hielo (40 ml) para precipitar el producto ABP-S-tritil-MPA. El precipitado blanco se recogió mediante filtración y luego se secó. El residuo sólido se disolvió después en una solución de ácido trifluoroacético en diclorometano (1:10, 10 ml), se añadió triisopropilsilano (TIPS) (0,050 ml) y se agitó durante 1 hora. La solución se evaporó a presión reducida hasta un aceite amarillo claro y después se precipitó el péptido tiol bruto mediante la adición de éter enfriado con hielo. El producto se recogió por centrifugación y se secó al vacío. El residuo se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50 % y luego se liofilizó, para producir el péptido tiol bruto (con una pureza de aproximadamente 80 % medida mediante análisis de HPLC). El péptido tiol bruto se purificó mediante HPLC semipreparativa para producir 145 mg de SEQ ID NO: 27-Ksh11.
Generación de intermedios de Péptido de unión a Ang2-tiol
El ensamblaje de la cadena peptídica se realizó en una escala de 0,1 mmol. La resina utilizada fue resina Fmoc-Rink-PL (150 mg, 0,67 mmol/g de sustitución). Se usaron protocolos de química de Fmoc estándar para ensamblar el péptido. La eliminación de Fmoc fue con un 20 % de piperidina/DMF durante 3 x 5 minutos y todas las etapas de lavado de resina usaron DMF. Para incorporar los aminoácidos, se empleó una única etapa de acoplamiento para cada resto, utilizando activación de HBTU/HOBt/NMM, por un período de 2 horas. El resto de unión (Ksh) se incorporó como Fmoc-Lys (NEmercaptopropionato-S-Trt)-OH. Al ensamblar la cadena, se eliminó el grupo Fmoc N-terminal y la peptidoresina se protegió mediante acetilación. La resina final se lavó con DCM y se secó durante la noche al vacío.
La eliminación acidolítica de los grupos protectores y la escisión del péptido de la resina se logró usando un cóctel de TFA/agua/ditiotreitol/triisopropilsilano (relación 90:4:4:2, 5 ml) durante 2 horas. La solución se filtró de la resina y la resina se lavó con otros 5 ml de TFA puro. Los filtrados combinados se evaporaron hasta obtener un jarabe, a continuación, la adición de éter enfriado con hielo precipitó un polvo blanco. El polvo se recogió mediante centrifugación, después se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50 % (20 ml), se congeló y se liofilizó durante la noche.
Una columna de HPLC preparativa se preequilibró con TFA acuoso diluido y acetonitrilo. Los intermedios de ABP-tiol en bruto (es decir, ABP con Ksh como resto de unión) se disolvieron en DMF (3 ml), después se adsorbieron sobre la columna y se eluyeron aplicando un gradiente de acetonitrilo en TFA diluido. Las fracciones se recolectaron automáticamente por masa (M = 1465). La elución de la columna se monitorizó con UV, las fracciones obtenidas se analizaron mediante RP-HPLC analítica.
Ejemplo 2 Estrategias de conjugación
Ejemplo de referencia
Se consideraron 5 estrategias de conjugación diferentes para conjugar péptidos a anticuerpos (las estructuras de ejemplo
se muestran usando la SEQ ID NO: 27-Ksh11 y 2.12.1.fx) (se proporcionan detalles completos en los ejemplos de PCT/US2011/053092, presentada el 11 de julio de 2011). En resumen, se han investigado los ésteres de NHS, maleimida, ésteres de escuarato, AZD y ésteres de halo-fenilo como posibles mecanismos para desarrollar conjugación direccional a anticuerpos.
Figure imgf000088_0001
Los ésteres de NHA sufrían los problemas de convertirse lentamente en una forma de ácido libre, en el que el éster de NHS se convierte en un carboxilo inactivo. Se concluyó que aunque se obtuvo cierto éxito con los ésteres de NHS, parece que la labilidad acuosa del éster de NHS resultante puede limitar su aplicación en posteriores reacciones de conjugación. A continuación se muestran ensayos adicionales de NHS-PEG2-MAL (que comprenden grupos Z* Z13).
Los escuaratos de etilo se conjugan bien con los tioles libres, pero mal con las aminas libres sobre proteínas y anticuerpos, a menos que el pH sea superior a 9.
En general, los péptidos activados con maleimida no se conjugaron bien con proteínas o anticuerpos que carecen de un tiol endógeno (derivado de una cadena lateral de cisteína libre) o un tiol introducido por otros medios químicos, por ejemplo, mediante el reactivo de Traut.
AZD reaccionó lentamente con grupos amino de anticuerpos y los intentos para aumentar el pH a 7-9 produjo niveles bajos de conjugación y niveles altos de hidrólisis de AZD (con el fin de aumentar la tendencia nucleofílica de las lisinas de superficie del anticuerpo disminuyendo su carga, ya que el pKa de las lisinas superficiales es de aproximadamente 9,1 a 11,2).
Ejemplo 3 Síntesis de ésteres de pentafluorofenilo (PFP)
Ejemplo de referencia
Figure imgf000089_0001
La presente divulgación también proporciona el uso de ésteres de pentafluorofenilo (PFP; Z*= Z1) para formar complejos estables del resto efector-enlazador. Este procedimiento tiene varias ventajas sobre otros enfoques en el sentido de que el grupo PFP se puede introducir en solución fácilmente a partir de un producto peptídico activado estable, que a su vez se puede purificar utilizando procedimientos de HPLC estándar con poca hidrólisis del éster de PFP.
La presente divulgación proporciona una ruta sintética mediante la cual un grupo éster activado, tal como PFP, se puede acoplar directamente a una lisina de la cadena lateral en el péptido mediante una reacción quimioselectiva (usando química de tiol/maleimida) o mediante el uso de un reactivo de éster bis-activo, que forma una amida con la cadena lateral del péptido pero deja el otro extremo como el éster activo.
En algunas realizaciones, la estrategia puede ser un PEG bis-ácido con cada ácido activado como un éster de PFP. En las soluciones orgánicas, con alguna base presente, el extremo del enlazador de bis-PFP reaccionó con la cadena lateral de N-£-amino de la lisina en la posición de anclaje requerida para formar un enlace amida estable, mientras que el otro extremo mantenía el otro grupo PFP. Un posible problema con esta estrategia es la posibilidad de formar dímeros peptídicos, en los que un péptido se añadiría a cada uno de los restos PFP presentes en cada extremo del enlazador. En algunos aspectos, la presente divulgación supera este problema adicional alterando la estequiometría y la adición del péptido respectivo y el enlazador bis-PEG-PFP. Una solución proporcionada por la divulgación es tener un exceso del enlazador bis-Pfp en solución y añadir lentamente el péptido en solución, de modo que siempre está presente un exceso de enlazador sobre el péptido. Con una relación de entre aproximadamente 3,7:1 a aproximadamente 4,3:1, o, en algunas realizaciones, una relación de aproximadamente 4:1, del enlazador sobre el péptido, el péptido activado por PFP requerido puede sintetizarse sin presencia de dímero. El esquema de síntesis para [Pf P-PEG5-K11-SEQ: 27] se muestra a continuación en el Esquema 3.
Síntesis de [PFP-PEG 5 -K11-SEQ: 27]
Figure imgf000089_0002
Se disolvió ácido Bis-dPEG5 (1 mmol, 338 mg) en diclorometano anhidro (5 ml), después se añadió pentafluorofenol (2 mmol, 368 mg), junto con diciclohexicarbodiimida (1 mmol, 208 mg). La solución se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de este tiempo, el producto secundario de diciclohexilurea blanco fina se separó por filtración y el filtrado se evaporó a sequedad para dar un aceite ligero de color amarillo claro. El análisis mediante TLC y HPLC indicó un producto puro con MS correcta = 670. El producto se usó en la siguiente etapa sin posterior purificación. El producto es estable durante varios meses a -20 °C.
La SEQ ID NO: 27 (730 mg) se disolvió en dimetilformamida anhidra (8 ml) y se añadió N-metilmorfolina (0,05 ml). Se colocó una alícuota de reactivo bis-dPEG5-OPfp puro (0,5 ml) en un vial de vidrio (20 ml). Con agitación enérgica, la solución SEQ ID NO: 27/NMM se añadió en 4 alícuotas de 2 ml al reactivo bis-dPEG5-OPfp durante 2 horas, a continuación, se agitó la mezcla final durante 1 hora adicional. El progreso de la conversión en el producto [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se controló mediante HPLC analítica. Al final de la reacción, la solución se filtró y se purificó directamente mediante HPLC semipreparativa en una columna de 1" C8. Las fracciones más puras (> 95 % mediante HPLC analítica) se combinaron y se liofilizaron para dar 400 mg (48 % de rendimiento) del producto final de péptido-enlazador [p Fp-PEG5-K11-SeQ: 27]. Se puede usar un mecanismo similar para generar [PFP- PEG2-MAL-Ksh11-SEQ: 27] (véase el Esquema 4).
Síntesis de [PFP-PEG2-K sh11-SEQ: 27]
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Esquema 4 Síntesis de [PFP-PEG2-K11-SEQ:27].
Maleimida-dPEG2-ácido (328 mg, 1 mmol, Quanta Biodesign), pentafluorofenol (0,103 ml, 1 mmol, PFP) y diciclohexilcarbodiimida (206 mg, 1 mmol, DCC) se disolvieron en DCM seco (10 ml) y se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El precipitado blanco fino (producto secundario de DCU) que se formó se eliminó mediante filtración y el filtrado se evaporó a sequedad al vacío. El producto se obtuvo como un polvo blanco fino con alto rendimiento (490 mg, cuantitativo). La pureza fue > 95 % mediante HPLC analítica; La MS mostró [M H]+ = 495.
Se disolvió una muestra (30-40 mg) de SEQ ID NO.27-Ksh11 en DMF anhidro (2 ml). Se añadió maleimida-PEG2-PFP (20 mg) junto con N-metilmorfolina (5 ml). La reacción se agitó y se controló a temperatura ambiente mediante HPLC para seguir el curso temporal de la formación del producto. Se observó la conversión completa del péptido de partida en el producto activado con PFP en las primeras 2 horas. La solución se filtró y el pico del producto se aisló directamente mediante HPLC semipreparativa. En cada caso, el producto se aisló con aproximadamente un 40 % de rendimiento después de la liofilización.
Ejemplo 4 Conjugación de anticuerpos
Ejemplo de referencia
Los conjugados de ejemplo de anticuerpo-resto efector MAC-1 y MAC-2 se prepararon conjugando el anticuerpo 2.12.1. fx (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) con un péptido de unión a Ang2 (SEQ ID NO: 27). MAC-1 comprende 2.12.1. fx conjugado a [PFP-PEG2-MAL-Ksh11-SEQ: 27] para dar 2.12.1.fx-[PEG2-MAL-KsH11-SEQ: 27] y MAC-2 comprende 2.12.1. fx conjugado a [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] para dar 2.12.1.fx-[PEG5-K11-SEQ: 27].
Generación de MAC-1
Figure imgf000091_0001
Esquema 5: Reacción de [PFP-PEG2-MAL-Ksh11-SEQ: 27] con una cadena lateral de lisina de un anticuerpo (Ab-K-Ab): Cuando el anticuerpo es 2.12.1.fx, el MAC es MAC-1.
Generación de MAC-2
Figure imgf000092_0001
Esquema 6: Reacción de [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] con una cadena lateral de lisina de un anticuerpo (Ab-K-Ab): Cuando el anticuerpo es 2.12.1.fx, el MAC es Ma C-2.
Se calculó el número de conjugaciones de péptidos por anticuerpo 2.12.1.fx en una muestra de cada MAC (véase la Tabla 2).
Tabla 2 Perfil de conjugación de MAC-1 y MAC-2.
Figure imgf000092_0004
Ejemplo 5 Optimización de las condiciones para la conjugación basada en PFP
EJEMPLO DE REFERENCIA
Se realizó una serie de ensayos para establecer las condiciones de reacción óptimas para la conjugación dirigida. Al final de cada conjugación de reacción, la reacción se inactivó con un tampón de succinato y glicina, reduciendo el pH a aproximadamente 5,5 e inactivando cualquier péptido libre o péptido/enlazador. El análisis de MAC-2 se realizó midiendo el peso molecular (PM) intacto del MAC utilizando detección por espectrometría de masas CON tiempo de vuelo por electropulverización después de la separación de proteínas de las sales y excipientes a través de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño.
Temperatura
El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP- PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a 18, 22 o 25 °C. Los resultados se presentan en la Tabla 3.
Tabla 3 Temperaturas de reacción en fosfato 0,06 M a 4,3:1 de péptido:anticuerpo.
Figure imgf000092_0002
pH de la reacción
El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75 u 8,0 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 4.
Tabla 4 pH en tampón fosfato sódico 0,06 M a 4,3:1 de péptido:anticuerpo.
Figure imgf000092_0003
(continuación)
Figure imgf000093_0003
Se ajustó 2.12.1.fx a 2 mg.ml-1 a pH 7,0, 7,5 y 8,0 con un tampón HEPES hasta una concentración final de 0,02 M.
[PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en DMSO a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEGa-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 5:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 5. El nivel de conjugación disminuyó por encima de pH 8,0
Tabla 5 pH en tampón HEPES 0,02 M a 5:1 de péptido:anticuerpo.
Figure imgf000093_0004
Duración de la reacción de conjugación
2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP- PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx a una relación molar de 4.3:1 y se dejó reaccionar durante 30, 60, 120, 180, 240, 300 o 2400 minutos a temperatura ambiente (Tabla 6 ).
Tabla 6 Duración de la reacción de conjugación en fosfato sódico 0,06 M a 4,3:1 de péptido: anticuerpo.
Figure imgf000093_0001
Proporción molar entre el péptido y la proteína
Se ajustó 2.12.1.fx a18 mg.ml-1a pH 7,5 con un tampón HEPES a una concentración final de HEPES 0,2 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx a una relación molar de 1, 2, 3, 4 y 5:1 (Tabla 7) y se hizo reaccionar durante al menos 2 horas a temperatura ambiente, pero la concentración elevada de tampón HEPES dio como resultado una disminución de la conjugación.
Tabla 7 Proporción molar entre el péptido y la proteína 1:1 -5:1 en HEPES 0,2 M.
Figure imgf000093_0002
(continuación)
Figure imgf000094_0004
2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP- PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx a una relación molar de 5, 7, 10, 12 y 15:1 (Tabla 8) y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente para generar un MAC con un mayor nivel de conjugación.
Tabla 8 Relación molar entre el péptido y la proteína 7:1-15:1 en fosfato sódico 0,06 M.
Figure imgf000094_0002
Para optimizar aún más la relación molar de 2.12.1.fx y [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27], 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió al anticuerpo [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] A 2.12.1.fx a una relación molar de 2,5, 2,8, 3,1, 3,4, 3,7, 4,0, 4,3 o 4,6:1 (Tabla 9) y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente.
Tabla 9 Relación molar entre el péptido y la proteína 2,5:1-4,6:1 en fosfato sódico 0,06 M.
Figure imgf000094_0001
2.12.1.fx se ajustó a 2 mg.ml-1 a pH 7,0 con un tampón HEPES hasta una concentración final de 0,02 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en DMSO a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 5, 6 , 7, 8 , 10:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 10.
Tabla 10 Relación molar entre el péptido y la proteína 5:1-10:1 en HEPES 0,02 M.
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Perfil de conjugación de 2.12.1.fx en diversas concentraciones de proteínas
Se analizaron los perfiles de conjugación de 2.12.1.fx con [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] a diversas concentraciones.
2.12.1.fx se concentró a > 50 mg/ml, se diluyó a la concentración deseada con acetato de sodio 20 mM, Trehalosa 200 mM, A pH 5,5, y SE enriqueció con fosfato sódico 60 mM, a pH 7,7. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se resuspendió con 50 % de propilenglicol y se mezcló con el anticuerpo a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan sitios de conjugación múltiples como señales distintas separadas por la diferencia de masa de un péptido. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 11 muestra el perfil de conjugación de 2.12.1.fx con péptido a diversas concentraciones de anticuerpo. A concentraciones de anticuerpos de 10 mg/ml a 50 mg/ml, la conjugación se produce a una distribución entre 0-5 adiciones con un promedio de 1,8 o más adiciones. A concentraciones de anticuerpos de 0,5 a 5 mg/ml, la conjugación se produce a una distribución entre 0-3 adiciones con un promedio de 1,5 o menos adiciones.
Tabla 11 Efecto de la concentración de anticuerpos.
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Selección de tampón de reacción
2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,7 con un tampón de carbonato de sodio, borato de sodio o fosfato de sodio hasta una concentración final de fosfato de sodio 0,05 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 1, 2, 3, 4, o 5:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. El pH bajo de la reacción dio como resultado un nivel reducido de conjugación (Tabla 12).
Tabla 12 Tampón y alteraciones del pH.
Figure imgf000095_0002
2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,5, 7,7 y 8,0 con tampón de borato de sodio y de fosfato de sodio hasta una concentración final de 0,04 M. [PFP-PEG5-K-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1 y se añadió 2.12.1.fx en una relación molar de 4,3:1 y se hizo reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente (Tabla 13).
Tabla 13 Tampón y alteraciones del pH.
Figure imgf000095_0003
2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,04 M, 0,06 M o 0,08 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 14.
Tabla 14 Concentración de fosfato.
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Efecto de los constituyentes del tampón en la conjugación
Propilenglicol: 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml-1 a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 20 mg.ml-1 (propilenglicol al 5 % en la reacción de conjugación). [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se añadió a 2.12.1.fx en una relación molar de 4.3:1 y se enriqueció con propilenglicol al 0 a 15 % adicional (porcentaje final de propilenglicol de 5, 10, 15, y 20 %) y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 15.
Tabla 15 Porcentaje de propilenglicol en fosfato sódico 0,06 M.
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NaCl: 2.12.1.fx se ajustó a 2 mg.ml-1 a pH 7,0 con un tampón HEPES hasta una concentración final de 0,02 M en presencia y ausencia de NaCl 0,14 M. [PfP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en DMSO a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 5:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. El nivel de conjugación disminuye en presencia de NaCl (Tabla 16).
Tabla 16 Concentración de cloruro de sodio en HEPES 0,02 M.
Figure imgf000096_0003
HEPES: 2.12.1.fx se ajustó a 2 mg.m-1 a pH 7,0 con un tampón HEPES hasta una concentración final de 0,2 M y 0,02 M. [PFP-PEG5-K-SEQ: 27] se reconstituyó en 50 % de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 5:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 17. El nivel de conjugación se reduce a tampón HEPES 0,2 M.
Tabla 17 Concentración de HEPES.
Figure imgf000096_0004
DMSO: 2.12.1.fx se ajustó a 15 mg.ml-1 a pH 7,7 con tampón de fosfato de sodio a una concentración final de 0,06 M y se añadió DMSO a una concentración final del 30 %. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1. Se añadió [PFP-PEG5-K11-SeQ: 27] a 2.12.1.fx en una relación molar de 4:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 18.
Tabla 18 DMSO en fosfato sódico 0,06 M.
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Discusión de los parámetros de la reacción de conjugación
Cuando la relación molar entre el resto efector (en este ejemplo, un péptido) y el anticuerpo se reduce por debajo de aproximadamente 3,5:1, el nivel de conjugación disminuye, como se ve en la Tabla 9. Como alternativa, la Tabla 10 muestra que aumentar la relación molar da como resultado un nivel aumentado de conjugación. El aumento del número de péptidos por anticuerpo generalmente disminuye la eficacia de unión del anticuerpo (en este caso 2.12.1 fx) a su antígeno (en este caso, el receptor de IGF1R), por lo tanto, la relación molar entre el péptido y el anticuerpo se optimizó para maximizar tanto la unión anticuerpo-antígeno como la unión péptido-afín.
También se encontró que variar el tampón de conjugación puede alterar el patrón de conjugación. Los excipientes que contienen amina son menos preferibles en general, ya que pueden reaccionar con el grupo de PFP. Se pueden usar tampones tales como carbonato y borato para la conjugación, pero se evitaron, ya que su pKa (ácido bórico con un pKa ~ 9 y carbonato con dos pKa de ~ 6 y ~ 11) estaban lejos del pH de conjugación de 7,7 que se identificó como óptimo para MAC-1 y MAC-2 (Tabla 12). El nivel de conjugación no solo depende de las condiciones químicas de la reacción sino también del tiempo. Después de 2 horas, la mayoría del péptido activado con PFP había reaccionado con el anticuerpo o el PFP Z* se había hidrolizado (Tabla 6).
El péptido/enlazador activado por PFP reaccionó rápidamente con los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. La conjugación se realizó a pH 6,5 a 8 en tampón fosfato para aumentar la tendencia nucleofílica de las lisinas de superficie del anticuerpo disminuyendo su carga (el pKa de lisinas en las proteínas de superficie es de aproximadamente 9,1 a 11,2), como se muestra en las Tablas 4 y 5.
Las condiciones óptimas para la conjugación de MAC-1 y MAC-2 se describen de la siguiente manera: el anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml-1 (concentración final de propilenglicol en la reacción es del 10 %). Se añadió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] al anticuerpo 2.12.1.fx en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con un tampón de succinato y glicina, reduciendo el pH a aproximadamente 6,0 e inactivando cualquier péptido libre. En algunos aspectos, la reacción puede concentrarse y especies relacionadas con péptidos (tales como péptidos en los que el enlazador se hidrolizó por reacción con disolvente acuoso) y otros elementos de la mezcla de reacción (tales como PFP) pueden eliminarse mediante diafiltración, por ejemplo, usando una membrana de 50 kDa o cromatografía de exclusión por tamaño en un tampón succinato, glicina, cloruro de sodio y trehalosa, pH 5,5 a 30 mg/ml.
Las condiciones de conjugación enumeradas anteriormente se variaron para determinar el intervalo de cada parámetro de procedimiento. Los intervalos de parámetros se establecieron en función de la variabilidad que puede producirse durante la conjugación y/o se ampliaron hasta que se observó un cambio de más del 10 % en la población de especies. La Tabla 19 resume los parámetros que dan como resultado perfiles de conjugación similares para MAC-2.
Tabla 19 Parámetros de procedimiento optimizados para MAC-2.
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Ejemplo 6 Ubicación de péptidos conjugados en anticuerpo
Ejemplo de referencia
La molécula del producto farmacológico MAC-2 consiste en una distribución de moléculas de 1-4 [PEG5-K11-SEQ: 27] unidas al anticuerpo 2.12.1.fx. Esto se determinó midiendo el peso molecular intacto (PM) de MAC-2 usando detección por espectrometría de masas de tiempo de vuelo después de la separación de proteínas de sales y excipientes a través de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño. Los datos de espectrometría de masas que demostraron que el PM del 2.12.1.fx y 3 lotes de MAC-2 se muestran en la Figura 2. La Figura 1A muestra 2.12.1.fx antes de la conjugación. Esta es una molécula uniforme que muestra un solo PM. Los lotes de MAC-2 muestran una distribución de péptidos conjugados a 2.12.1.fx; se observan entre 1 y 4 adiciones de conjugación (CA). La cantidad relativa de cada forma es consistente entre los lotes y la forma más común en cada lote tiene 2 péptidos (SEQ ID NO: 27) unidos a cada anticuerpo 2.12.1.fx individual.
Al reducir los enlaces disulfuro en el anticuerpo 2.12.1.fx, las cadenas ligeras y pesadas se observan por separado. La reducción de disulfuro se realiza tratando el anticuerpo 2.12.1.fx intacto con tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) 20 mM. La mezcla resultante de cadenas pesadas y ligeras se analiza para el peso molecular intacto como se ha descrito anteriormente. Los datos que se muestran en la Figura 2 proporcionan evidencia sobre la ubicación del ABP en 2.12.1.fx. La mayoría de la cadena ligera (> 65 %) en los lotes MAC-2 están conjugadas. La mayor parte de la cadena ligera conjugada contiene 1CA. 2CA también se observa en un nivel menor. Casi todas las cadenas pesadas observadas (> 90 %) no están modificadas, lo que sugiere que muy pocos de los péptidos conjugados se encuentran en la cadena pesada.
El mapeo de péptidos se utilizó para determinar la ubicación precisa de la conjugación. El procedimiento fue el siguiente: una alícuota de MAC-2 se desnaturalizó con clorhidrato de guanidina 8 M, los enlaces disulfuro se redujeron con TCEP y los sulfhidrilos de cisteína resultantes se alquilaron con yodoacetamida. Esta muestra de proteína tratada se digirió después con la proteasa quimotripsina (proporción 1:125 de proteasa:MAC en peso). Los péptidos digeridos con quimotripsina resultantes se detectaron luego individualmente mediante espectrometría de masas después de la separación a través de una columna de cromatografía líquida C8. Con esta técnica, MAC-2 se digirió con quimotripsina en las cadenas pesada y ligera en fragmentos en las ubicaciones indicadas en la secuencia (con viñetas) en la Figura 3. La detección por cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) del PM de cada péptido se usó a continuación para determinar qué restos de lisina se modifican mediante un péptido conjugado. Si un fragmento se modificó mediante la unión de un péptido conjugado, su PM se desplazó en consecuencia.
Los fragmentos Y1, Y6, Y9, Y10, Y20, Y25, Y26, Y29, Y32, Y33, Y34, Y37, Y40 e Y43 de la cadena pesada contienen restos de Lys. De estos, se detectó la conjugación de péptido en Y6, Y10, Y25, Y33 y Y37. Los fragmentos Y3, Y10, Y11, Y12, Y13, Y14, Y15 e Y16 de la cadena ligera contienen restos de Lys. De estos, la conjugación se detectó en Y3, Y13 y Y15.
Se descubrió que el fragmento de cadena ligera denominado Y15 (el 15° fragmento digerido con quimotripsina en la cadena ligera del extremo N) se conjuga basándose en los datos mostrados en la Figura 4. El PM del fragmento Y15 modificado en MAC se detectó claramente. En la muestra de 2.12.1.fx no conjugado, no hubo evidencia de fragmento Y15 modificado. El fragmento Y15 no modificado se observó tanto en MAC-2 como en 2.12.1.fx. La magnitud de este fragmento es mayor en la muestra 2.12.1.fx porque este fragmento completo está presente en la forma no modificada. Como este fragmento está conjugado en MAC-2, el nivel observado de Y15 sin modificar disminuye que se ve en la Figura 4 como un pico con un área más pequeña.
La cantidad de conjugación de [SEQ: 27-K11-PEG5] observada en el fragmento de cadena ligera Y15 en MAC-2 se estima midiendo el área de pico disminuida de Y15 no modificado. Después de normalizar la intensidad de la señal de modo que 2.12.1.fx no conjugado mostrara el 100 %, 3 lotes independientes de MAC-2 mostraron un 17 %, 27 % y 22 % de fragmentos Y15 no conjugados, respectivamente.
La magnitud observada de Y15 en las muestras de MAC se normalizó a la magnitud de Y15 en la muestra de 2.12.1.fx. Entre el 75-85 % de los fragmentos Y15 se determinan como modificados en MAC-2. Teniendo en cuenta que MAC-2 contiene principalmente 1-2 adiciones de conjugación, Esto sugiere que la mayor parte de la conjugación en MAC-2 se localiza en uno de los 2 restos K de fragmento de cadena ligera y 15 (LC-K188 o LC-K190). La ubicación del fragmento Y15 en relación con la secuencia de 2.12.1.fx se muestra en la Figura 3.
La digestión enzimática con tripsina se usó para discriminar entre LC-K y LC-K (la tripsina tiene especificidad por el extremo C de K y R). Como la tripsina no digiere restos de K conjugados, la digestión enzimática genera diferentes longitudes de péptidos, dependiendo de qué resto de K está conjugado. El examen de los datos de LCMS de MAC-2 que se digirió con tripsina proporciona evidencia de que el péptido se une específicamente a LC-K188. No se observó evidencia de LC-K190 modificado.
MAC-2 se redujo con TCEP y se desnaturalizó con hidrocloruro de guanidina como se ha descrito anteriormente. La concentración de proteína se ajustó a 2 mg/ml y el pH a 7,8 con tampón de digestión Tris. Se añadió tripsina purificada en una proporción de proteasa:MAC de 1:125 en peso y se incubó a 30 °C durante 4 horas. Las muestras se almacenaron a -20 °C hasta que se analizaron por LCMS. Las muestras de fragmentos se separaron en una columna de fase inversa C18 usando agua/acetonitrilo 0,1 % de fases móviles de TFA. La detección de fragmentos se controló tanto por UV a 214 nm como espectrometría de masas ESI-TOF. Todos los análisis de datos se realizaron utilizando el software MassLynx.
La formación de fragmentos en la digestión con tripsina de MAC-2 depende del sitio de conjugación del péptido. Las lisinas son el resto objetivo para la conjugación. Los datos mostrados en las Figuras 1-4 indican que el sitio predominante de unión del péptido es LC-K188 o LC-K190 El siguiente esquema muestra las reacciones de digestión con tripsina que se producirían con la conjugación a 2.12.1.fx- LC-K188] o 2.12.1.fx-[LC-K190].
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Las estructuras químicas de los dos posibles fragmentos de digestión en cuestión son las siguientes:
Figure imgf000099_0002
La figura 5 muestra los datos del cromatograma LCMS de iones seleccionado para el péptido de tripsina cuando LC-K188 está conjugado con el péptido. La figura 6 muestra los datos del cromatograma LCMS de iones seleccionados para el fragmento de tripsina cuando LC-K190 se ha modificado con un péptido conjugado. Estos datos sugieren que solo LC-K188 solo está conjugado; esta situación da como resultado una señal significativa que se detecta en MAC-2 pero está ausente en el experimento de control 2.12.1.fx. Los resultados de la modificación en LC-K190 no proporcionan ningún dato que sea único en comparación con el control negativo.
En contraste con lo que se puede esperar, el péptido/enlazador parece decorar preferentemente LC-K188 de la cadena ligera de 2.12.1.fx. Esto tiene la sorprendente ventaja de que la porción Fc del anticuerpo 2.12.1.fx no se ve afectada. Las pruebas muestran que el PK resultante de MAC-2 es aproximadamente igual al PK de 2.12.1.fx no conjugado. La conjugación inespecífica promiscua en múltiples sitios en un anticuerpo puede dar como resultado un producto con menor PK. La conjugación direccional de la divulgación, ilustrado por MAC-1 y MAC-2, proporciona la ventaja de minimizar algunos de los posibles efectos nocivos que pueden estar causados por la conjugación promiscua inespecífica, incluyendo PK más bajo. LC-K es el mismo residuo que CLk-K (es decir, K de SEQ ID NO: 6), ya que la cadena ligera (LC) comprende la región variable así como también la cadena kappa ligera constante (c Lk).
Para establecer la reproducibilidad del procedimiento, se repitió el experimento. MAC-2 se diluyó a 2 mg/ml y se analizó como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan sitios de conjugación múltiples como señales distintas separadas por la diferencia de masa de un péptido/enlazador conjugado. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza midiendo la magnitud de la señal. La figura 7A muestra un espectro representativo de MAC-2; los cálculos utilizados para la cuantificación se muestran en la Tabla 20. La adición de conjugación promedio para el MAC-2 intacto se calcula como 2.11 usando la siguiente fórmula: SUMPRODUCT (Número de adiciones de conjugación (CA), porcentaje por CA). Este ejemplo demuestra la conjugación de péptidos que se produce como una distribución entre 0-4 adiciones de péptido, siendo la forma más grande 2 adiciones de péptido y el número promedio de adiciones de péptido es 2,11. El análisis duplicado por múltiples individuos demuestra que el perfil de conjugación es consistente y reproducible.
Tabla 20 Promedio ponderado de las adiciones de conjugación: 2,11.
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(continuación)
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La extensión de la conjugación de péptidos se examinó por separado en las cadenas ligera y pesada de 2.12.1.fx. MAC-2 se desnaturalizó y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas. Las figuras 7B y 7C muestran un espectro representativo de cada cadena; el cálculo utilizado para la cuantificación se muestra en la Tabla 21. Las adiciones de conjugación promedio (CA promedio) para la cadena pesada reducida MAC-2 se calcula como 0,14 y las CA promedio para la cadena ligera reducida MAC-2 se calcula a 0,86 usando la siguiente fórmula: SUMPRODUCT (Número de adiciones de conjugación (CA), porcentaje por CA). Estos datos demuestran que la ubicación de la conjugación es mayor en la cadena ligera; la forma más abundante en la cadena ligera contiene una adición de péptido y la cadena ligera contiene un promedio de 0,86 adiciones de péptido. La conjugación en la cadena pesada se observa a un nivel significativamente más bajo. El análisis por duplicado de este experimento por múltiples individuos demuestra que el perfil de conjugación es consistente y reproducible.
Tabla 21 Caracterización de mapeo peptídico de MAC-2 que identifica la ubicación específica de la conjugación.
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MAC-2 se redujo con ditiotreitol y los restos de cisteína se alquilaron mediante carboximetilación con yodoacetamida. La quimotripsina se usó para la digestión proteolítica. Los fragmentos digeridos en solución se analizaron usando cromatografía líquida con espectrometría de masas (LCMS). Los fragmentos individuales se separaron en una columna de HPLC C18 y su masa precisa se midió en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (Q-ToF) de cuadrupolo. La masa del fragmento resultante se usó para identificar los fragmentos no modificados o fragmentos modificados con un péptido conjugado. Este experimento se interpretó centrándose en fragmentos digerido con quimotripsina que contienen un resto de lisina, ya que estos eran sitios posibles para la conjugación de péptidos. La Tabla 22 muestra una lista de todos esos fragmentos. Las entradas en blanco son fragmentos que no se detectan con esta técnica. Los fragmentos detectados que se observan con un modificador peptídico se consideran sitios potenciales de conjugación. Las entradas de la tabla para la Tabla 17 se explican a continuación:
Número de fragmento: Numeración del fragmento de quimotripsina del extremo N-terminal; los fragmentos unidos (es decir, Y1-2) indican un sitio de escisión perdido.
Inicio/fin: Numeración de la ubicación del fragmento desde el N-terminal.
Masa peptídica (Da): Masa teórica del fragmento enumerado en Daltons.
Tiempo de retención (control/analito): Tiempo de retención cromatográfica/elución en el experimento de mapeo de fragmentos LCMS.
Intensidad de la señal MS (control/analito): Magnitud de la señal observada observada por MS.
Error de masa - ppm (control/analito): Comparación de la masa teórica frente a observada del fragmento; los valores > 10, y especialmente más cerca de cero (0) demuestran una mejor precisión de masa.
Modificadores: Potenciales adiciones covalentes al fragmento; fragmento de unión a péptido-anticuerpo del resto de Lys, CAM-carboximetilación del resto de cisteína.
Los asteriscos indican la versión modificada (por ejemplo, conjugada) del fragmento respectivo. Pep indica un péptido conjugado.
La conjugación direccional de un péptido al fragmento Y15 se demuestra cuantificando el nivel de conjugación. El siguiente análisis se realizó en cada uno de los fragmentos peptídicos que se observaron que tenían conjugación durante el experimento de mapeo peptídico del producto de referencia 2.12.1.fx. La relación de la intensidad de señal observada para el péptido no modificado en el control no conjugado (armazón de anticuerpos 2.12.1.fx - sin conjugación) en comparación con el producto de referencia conjugado (MAC-2) se muestra en la Tabla 23. La señal no modificada se usa porque es posible una comparación directa de la misma señal peptídica en cada muestra. Por ejemplo, se esperaría que un péptido no conjugado tuviera la misma intensidad de señal observada en las muestras de control frente al producto, dando como resultado una relación de uno (1). La conjugación daría como resultado una disminución en la cantidad observada de péptido no modificado en la muestra del producto que estaría indicado por una relación mayor que uno (1). Los datos en la Tabla 23 se normalizaron adicionalmente para corregir la muestra y la variación experimental entre el control y el producto. La Tabla 23 demuestra que el péptido Y15 de cadena ligera está conjugado a un nivel significativamente más alto que cada uno de los otros péptidos conjugados. Esto sugiere que la conjugación se produce de manera direccional y no se distribuye aleatoriamente en los restos de K.
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Tabla 23 Conjugación direccional del péptido al fragmento Y15 en la cadena ligera.
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Ejemplo 7 Demostración de la potencia de los productos MAC
Ejemplo de referencia
Los detalles completos de los ensayos in vitro e in vivo de MAC-1 y MAC-2 se proporcionan en los Ejemplos del documento PCT/US2011/053092 (WO2012/007896). Se usó Ang2-h38C2-IgG1 como control en ciertos ejemplos. La generación y estructura de Ang2-h38C2 se describe completamente como compuesto 43 en el documento WO2008056346, con referencia particular a aspectos que se refieren a la generación del compuesto 43. En resumen, la estructura es la siguiente:
Figure imgf000105_0001
en la que el enlazador está unido covalentemente al grupo £-amino de HC-K99 (K93 según la numeración Kabat) del sitio de combinación del anticuerpo y el anticuerpo es h38c2-IgG1 (SEC ID NO: 64 y 65) (SEC ID NO: 189 y SEQ ID NO: 190 del documento WO2008/056346).
En resumen, MAC-1 y MAC-2 pudieron unirse a Ang2 y evitar su unión a Tie2 como se muestra en un ensayo de competencia Ang2, y tanto mAC-1 como MAC-2 tienen actividad similar a la del anticuerpo anti-IGF1R parental (2.12.1. fx) para competir con IGF1 por la unión de IGF1R (Tabla 24). Sorprendentemente, en comparación con Ang2-h38c2, MAC-1 y MAC-2 mostraron un aumento en la capacidad de unirse competitivamente a Ang2. Por lo tanto, la conjugación de péptidos Ang2 limitados no parece cambiar la unión innata y la inhibición del anticuerpo, y en algunos casos puede mejorar la actividad del resto efector.
Los MAC se probaron para determinar la capacidad de regular negativamente los niveles de IGF1R en una línea celular de carcinoma de colon humano Colo205. Las células se trataron durante 3 horas en cultivo con titulación de compuestos MAC. Las células se recogieron y la expresión de superficie de IGF1R se determinó mediante citometría de flujo. Se determinó el porcentaje de IGF1R regulado negativamente en comparación con el control negativo hIgG2 (Tabla 23).
Tabla 24 Capacidad de MAC-1 y MAC-2 para unir y modular IGF1R y Ang2.
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También se demostró que la conjugación de 2 péptidos por anticuerpo era ideal en términos de efectuar la autofosforilación de IGF1R y la regulación por disminución y que la conjugación de más o menos de 2 péptidos por anticuerpo disminuye la capacidad del MAC para efectuar estas funciones.
Para evaluar el efecto del número de péptidos por anticuerpo sobre la capacidad de 2.12.1.fx para modular la actividad de IGF1R, se prepararon 2 muestras de MAC-1 en las que las condiciones de reacción se establecieron para proporcionar una conjugación reducida (MAC-1 bajo) o una conjugación aumentada (MAC-1 alto) (Tabla 25). Las muestras se analizaron para determinar la capacidad para regular por disminución y fosforilar IGF1R (Tabla 25). Existe una diferencia significativa en la capacidad del MAC-1 alto en comparación con el MAC-1 bajo para modular eficazmente la ruta de IGF1R. La conjugación de más de aproximadamente 2 péptidos por anticuerpo limita la actividad funcional del MAC tanto para inhibir la autofosforilación de IGF1R como para inducir la regulación por disminución de IGF1R, en comparación con la conjugación de aproximadamente 2 o menos péptidos por anticuerpo. Por lo tanto, para modular de manera eficiente 2 rutas biológicas diferentes en una entidad bifuncional, la conjugación de aproximadamente 2 péptidos por anticuerpo puede ser ideal (dependiendo del perfil farmacocinético del péptido y de la diana).
Tabla 25 Análisis de MAC-1 alto y MAC-1 bajo.
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Ejemplo 8 Farmacocinética in vivo
Ejemplo de referencia
Los estudios PK se realizaron con ratones Swiss Webster macho y 2 monos Cynomolgus macho (Macaca fascicularis). Los detalles completos de los estudios PK se proporcionan en los Ejemplos del documento PCT/US2011/053092. En ratón, se demostró que MAC-1 y MAC-2 tenían un tiempo de residencia similar al del anticuerpo anti-IGF1R parental con semividas de fase p de 383-397 horas. La capacidad de unión de MAC-1 y MAC-2 a Ang2 demostró un tiempo de residencia similar al de Ang2-h38c2 con T1A de 105-120 horas en ratones en estudios de fase IV de dosis única. En monos cynomolgus, MAC-2 demostró un tiempo de residencia ligeramente más corto que el anticuerpo anti-IGF1R parental con T1^ de 100,4 horas. La capacidad de unión de MAC-2 a Ang2 demostró un tiempo de residencia similar al de Ang2-h38c2 con un T1^ de 97,8 horas.
Tabla 26 FC de una dosis única de MAC administrados i.v. a 10 mg/kg en ratón y mono cynomolgus. Anticuerpo a-IGF1 R administrado a 10 mg/kg en ratón y 5 mg/kg en mono. NA: no analizado.
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Ejemplo 9 Farmacología in vivo
Ejemplo de referencia
La actividad antitumoral de MAC-2 se evaluó en el modelo de xenoinjerto Colo205 (adenocarcinoma de colon humano) o MDA-MB-435 (melanoma). Los detalles completos de los estudios de tumores se proporcionan en los Ejemplos del documento PCT/US2011/053092 (WO2012/007896). La administración semanal de anticuerpo Ang2-h38c2 o anti-IGF1R (2.12.1.fx) inhibió el crecimiento del tumor Colo205. La combinación de anticuerpos Ang2-h38c2 administrados semanalmente y anti-IGF1R mostró un beneficio aditivo sobre la inhibición del crecimiento del tumor Colo205. La administración semanal de MAC-2 solo mostró un beneficio similar a la combinación. En un estudio aparte, MAC-2 inhibió de forma dependiente de la dosis el crecimiento del tumor Colo205 y los pesos finales del tumor.
El día 28, la densidad de microvasos tumorales después del tratamiento con el compuesto se redujo significativamente (~ 42 %) con MAC-2 (10 mg/kg, una vez a la semana) en comparación con el grupo tratado con vehículo, lo que confirma la actividad antiangiogénica del tratamiento con MAC-2.
Para investigar si MAC-2 tiene como objetivo tanto a Ang2 como a IGF1R in vivo, los efectos de MAC-2 sobre los niveles de expresión de Ang2 e IGF1R se evaluaron en 2 tumores independientes de xenoinjerto Colo205 tratados con vehículo, Ang2-h38c2, anticuerpo IGF1R (2.12.1.fx) o MAC-2 (respuesta a la dosis que oscila entre 0,3 mg/kg y 10 mg/kg). Los resultados mostraron que la inmunorreactividad de Ang2 e IGF1R se redujo significativamente mediante tratamiento con MAC-2 de una manera dependiente de la dosis (1, 3 y 10 mg/kg) en comparación con el grupo tratado con vehículo. El efecto de MAC-2 sobre los niveles de IGF1R fue similar al observado para un anticuerpo antagonista de IGF1R. Además, los niveles de IGF1R fosforilada se redujeron en tumores de animales tratados con MAC-2. Estos datos demuestran que el tratamiento con MAC-2 afecta a las rutas tanto de Ang2 como de IGF1R en el modelo de xenoinjerto Colo205. El tratamiento con MAC-2 no afectó al aumento de peso corporal y los ratones parecían gozar de buena salud durante todos los estudios. La eficacia antitumoral de MAC-2 también se evaluó en un modelo de xenoinjerto de melanoma MDA-MB-435. La administración semanal de MAC-2 (3 y 20 mg/kg i.p.) dio como resultado una reducción significativa del 40 % (día 67) en el crecimiento tumoral en el modelo MDA-MB-435. Por lo tanto, MAC-2 demuestra una eficacia antitumoral significativa en 2 modelos diferentes de tumor de xenoinjerto humano.
Ejemplo 10 Perfil de conjugación peptídica de varios anticuerpos
Ejemplo de referencia
Se analizaron los perfiles de conjugación de varios anticuerpos diferentes con péptidos, usando la SEQ ID NO: 27 y PEG5 como péptido y enlazador a modo de ejemplo, respectivamente. Todos los anticuerpos analizados fueron anticuerpos IgG humanos o totalmente humanizados con interacciones antigénicas bien definidas y caracterizadas. hAbAPrueba comprende un CLA (hIL22: SEQ ID NO: 136 y 137), mientras que 2.12.1.fx, mAbKPruebal (un anticuerpo IgG2 anti-Alk1, como se desvela en el documento US7537762), h38C2-IgG1 (SEQ ID NO: 64 y 65) y h38C2-IgG2 (SEQ ID NO: 64 y 66) comprenden cada uno CLk. Cada uno de los anticuerpos se intercambió con tampón en HEPES 20 mM, a pH 7,0 y se concentró a 5-20 mg/ml. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se resuspendió con 50 % de propilenglicol y se mezcló con el anticuerpo relevante a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante al menos 2 horas a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan múltiples sitios de conjugación de péptidos como señales distintas separadas por la diferencia de masa de un péptido unido. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de péptidos se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 22 muestra el perfil de conjugación de péptidos de diversos anticuerpos
Para los anticuerpos que contienen un CLk, la conjugación de péptidos se produce a una distribución entre 0-4 adiciones de péptidos, siendo la forma más grande 2 a 3 adiciones de péptidos. En cambio, para el anticuerpo que comprende CLA, hAbAPrueba, la conjugación de péptidos se produce a una distribución entre 0-4 adiciones de péptidos, siendo la forma más grande 1 a 2 adiciones de péptidos.
El grado de conjugación de péptidos se examinó por separado en las cadenas ligera y pesada. Cada muestra se desnaturalizó y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas. El perfil de conjugación de péptidos en las cadenas ligera y pesada de diversos anticuerpos se muestra en la Tabla 27. En 2.12.1.fx y hAbKPrueba1, los datos demuestran que la ubicación de la conjugación es mayor en la cadena ligera; la forma más abundante en la cadena ligera contiene 1 adición de péptido. La conjugación en la cadena pesada se observa a un nivel significativamente más bajo. En h38C2-IgG1 y h38C2-IgG2, se observan niveles comparables de conjugación en las cadenas ligera y pesada, con una ligera preferencia de conjugación en la cadena ligera. En un anticuerpo que contiene CLA (hAbAPrueba; que comprende las SEQ ID NO: 136 y 137)), la mayoría de la conjugación se produce en la cadena pesada con un bajo nivel de conjugación observado en la cadena ligera.
Tabla 27 Perfil de conjugación de diversos anticuerpos.
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Cada uno de los anticuerpos 2.12.1.fx, hAbAPrueba y hAbKPrueba1 se evaluó después del procedimiento de conjugación para determinar el efecto de las adiciones de conjugación sobre la capacidad del armazón de anticuerpo para retener su unión al receptor (en comparación con el mAb nativo) (Tabla 28). Los resultados muestran que la conjugación direccional de los péptidos a los anticuerpos de prueba no parecía alterar la unión del anticuerpo.
Tabla 28 Unión de anticuerpo al antígeno nativo respectivo antes y después de la conjugación.
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Ejemplo 11 Perfil de conjugación de péptidos de un anticuerpo IgG2-K
Ejemplo de referencia
Se analizó el perfil de conjugación de un anticuerpo IgG2 k (hABKPrueba2) con un péptido de 39 unidades (SEQ ID NO: 164). El anticuerpo se concentró a 8 mg/ml y se intercambió con tampón en HEPES 40 mM, a pH 8,0. El péptido se resuspendió con 100 % de DMSO y se mezcló con el anticuerpo a una relación molar de 5,0:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan múltiples sitios de conjugación de péptidos como señales distintas separadas por la diferencia de masa de un péptido. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de péptidos se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 29 muestra el perfil de conjugación de péptidos de hAbKPrueba2 con el péptido de 39 unidades. La conjugación de péptidos se produce a una distribución entre 0-4 CA con un promedio de 2,03 CA, y es consistente con la conjugación direccional en el CLk-K80.
Tabla 29 Perfil de conjugación del péptido de 39 unidades y hAbKPrueba2.
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En un experimento aparte, el péptido de 39 unidades se conjugó con h38C2-IgG2 con MAL-PEG2-PFP como se ha descrito anteriormente, a diferentes concentraciones molares. Además, se ensayó la unión del receptor afín al péptido de 39 unidades. Los resultados (Tabla 30) mostrados son consistentes con la conjugación direccional en CLk-K80. Además, aumentar el número promedio de péptidos por anticuerpo no aumentó sustancialmente la unión global a la diana. Esto demuestra que, en ciertas situaciones, aumentar la conjugación por anticuerpo puede no aumentar la unión a la diana, lo que demuestra una de las ventajas de la divulgación; el control del número de péptidos que se conjugan por anticuerpo puede ayudar a alcanzar la unión máxima a la diana por unidad de péptido.
Tabla 30 Perfil de conjugación del péptido de 39 unidades y H38C2-IgG2.
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Ejemplo 12 Conjugación de biotina a 2.12.1.fx Fab
Ejemplo de referencia
Se analizó el perfil de conjugación de la región Fab de 2.12.1.fx (SEQ ID NO: 4 y 64) con PFP-biotina. El anticuerpo Fab se concentró a 20 mg/ml y se intercambió por tampón en acetato de sodio 20 mM trehalosa 200 mM, a pH 5,5 y se enriqueció con fosfato de sodio 60 mM, a pH 7,7. La PFP-Biotina se resuspendió con 100 % de DMSO y se mezcló con el anticuerpo a relaciones molares sucesivas y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan sitios de conjugación múltiples como señales distintas separadas por la diferencia de masas de un péptido conjugado. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 31 muestra el perfil de conjugación de 2.12.1.fx Fab con PFP-Biotina a relaciones molares. La conjugación se produce a una distribución entre 0-2 adiciones a medida que aumenta la relación molar. El menor número de moléculas por anticuerpo fue consistente con los resultados anteriores, basado en la relación molar utilizada. Esto demuestra la flexibilidad del procedimiento para controlar la cantidad de conjugación alterando los parámetros de reacción.
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Ejemplo 12 Conjugación de biotina a h38C2-IgG1
Ejemplo de referencia
El anticuerpo h38C2-IgG1 se ajustó a 20 mg/ml con tampón HEPES a pH 7,5 a una concentración final de 0,02 M. La biotina-PFP se reconstituyó en agua a 10 mg/ml y se añadió a h38C2-IgG1 a una relación molar de 5:1 y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas. La PFP-Biotina sin reaccionar se eliminó mediante cromatografía de exclusión por tamaño y se intercambió con tampón en un tampón de histidina, glicina y sacarosa a pH 6,5. Las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. La Tabla 32 muestra el perfil de conjugación de h38C2-IgG1 con Biotina-PFP. La conjugación de h38C2-IgG1 se produce a una distribución entre 0-3 CA con un promedio de 1,1 conjugaciones. Sería posible una mayor conjugación después de la optimización de las condiciones de reacción. La reactividad de VH-K99 (K93 según la numeración de Kabat) en h38C2-IgG1 se confirmó que era > 95 % cuando se hizo reaccionar con el compuesto de prueba de anticuerpo catalítico CATC-1, y se analizó mediante cromatografía de fase inversa.
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Ejemplo 13 Perfil de conjugación de 2.12.1.fx y CLk-K80, Mutantes CLk-K82
Ejemplo de referencia
Según el mapeo de péptidos hay 2 Lys en el fragmento Y15. Para distinguir el sitio de conjugación activa, se mutaron CLk-K80 and CLk-K82 a R respectivamente o en combinación. Los mutantes del anticuerpo de prueba, 2.12.1.fx, se generaron siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene®). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los mAb mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293, y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS. Las s Eq ID NO: 12, 13 y 14 muestran las secuencias de CLk mutantes.
El anticuerpo se intercambió por tampón a tampón HEPES 0,02 M a pH 7,5 o 6,5 a 2 mg/ml. Si el pH era 6,5, el anticuerpo se enriqueció después con fosfato de sodio 60 mM, a pH 7,7. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se resuspendió con 50 % de propilenglicol y se mezcló con la proteína a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan múltiples sitios de conjugación como señales distintas separadas por la diferencia de masa de una proteína conjugada. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de proteínas se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 33 muestra el perfil de conjugación de 2.12.1.fx sin modificar, 2.12.1.fx-[CLK-K80R] (CLk: SEQ ID NO: 12), 2.12.1.fx-[CLK-K82R] (CLk: SEQ ID NO: 13) y 2.12.1.fx-[CLk-K80R-K82R] (CLk: SEQ ID NO: 14. El mutante CLk-K80R mostró una conjugación reducida. CLk-K82R tuvo una conjugación similar a la de 2.12.1.fx no conjugado. La conjugación de MAC-2 fue menor que la observada en otros ensayos debido a una combinación de tampón de HEPES/fosfato.
Tabla 33 Perfil de conjugación de mutantes de 2.12.1.fx, K80 y R82
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Ejemplo 14 Elucidación del mecanismo de conjugación direccional en K80
Ejemplo de referencia
La cadena lateral de CLk-H81 está muy cerca del grupo £-amino de CLk-K80. Dado que His a menudo participa en reacciones de transferencia de protones, es muy probable que se requiera CLk-H81 para la conjugación de CLk-K80. Con el fin de estudiar el papel de CLk-H81 en la conjugación específica del sitio CLk-K80 el anillo de imidazol se eliminó mediant ¿e O una mutación CLk-H81A. Se realizaron mutantes de CLk-D43A y J C ¿L Ok-D43A/H8 Q1 AA 1 para estudiar el papel de CLk-D en la conjugación específica de sitio y el efecto combinado de CLk-D y CLk-H .
Los mutantes se generaron siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene®). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los mAb mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293, y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS. Se generaron los siguientes mutantes de 2.12.1.fx I CLk: CLk-D43A (SEQ ID NO: 15), CLk-K80A (SEQ ID NO: 16), CLk-H81A (SEQ ID NO: 17), CLk-K82A (SEQ ID NO: 18) y CLk-D43NH81A (SEQ ID NO: 19).
Cada uno de los anticuerpos se intercambió con tampón a acetato de sodio 20 mM, trehalosa 200 m a pH 5,5 a 20 mg/ml. Las proteínas se enriquecieron a continuación con fosfato de sodio 60 mM a pH 7,7. [PFP-PEGs-K11-SEQ: 27] se resuspendió con 50 % de propilenglicol y se mezcló con el anticuerpo a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan sitios de conjugación múltiples como señales distintas separadas por la diferencia de masas de un péptido conjugado. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza midiendo la magnitud de la señal.
La Tabla 34 muestra el perfil de conjugación de los mutantes de 2.12.1.fx, 2.12.1.fx-[CLK-D43A], 2.12.1.fx-[CLK-K80A], 2.12.1.fx-[CLK- H81A], 2.12.1.fx-[CLK-K82A] y 2.12.1.fx-[CLK-D43A/H81A]. Todos los mutantes mostraron un nivel de conjugación promedio reducido en comparación con el anticuerpo 2.12.1.fx no modificado, a excepción de CLk-K80A, que mantuvo la conjugación direccional.
El grado de conjugación se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas. Cada muestra se desnaturalizó y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas. El perfil de conjugación en la cadena ligera y pesada de 2.12.1.fx y los mutantes se muestran en la Tabla 34. Todos los mutantes enumerados en la tabla mostraron un nivel de conjugación reducido en la cadena ligera en comparación con 2.12.1.fx no modificado a excepción de CLk-K80A. El nivel de conjugación de cadena pesada de los mutantes se encontraba a un nivel similar al 2.12.1.fx sin modificar. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 34.
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Ejemplo 15 Sustitución lambda/kappa
Ejemplo de referencia
La CLA en hAbAPruebal (SEQ ID NO: 136 y 137) se sustituyó por CLk para determinar si esto aumentaba el nivel, la direccionalidad y/o el control de la conjugación específica de CL. Las construcciones híbridas de sustitución de dominios CLA/CLk se generaron usando PCR por solapamiento. VLA y CLk se amplificaron por PCR usando hAbAPrueba y una cadena ligera k de mAb como moldes por separado. Estos 2 productos de PCR se mezclaron como moldes; El cebador directo de hAbAPruebal y el cebador inverso LCLk se usaron en la reacción de PCR solapada para amplificar el ADN hAbAPruebaVL/CLK completo de longitud completa. Las construcciones de anticuerpos híbridos se expresaron transitoriamente en células HEK 293 y se purificaron utilizando una columna de afinidad de Proteína A. Los anticuerpos purificados se caracterizaron usando MS. El híbrido hAbAPrueba CLk □ se unió a su ligando afín de forma similar al mAb nativo (hAbAPrueba) (Tabla 35). Las SEQ ID NO: 59, 60 y 61 son las regiones constantes de cadena ligera de hAbAPrueba, hAbAPrueba-AK (con AJ) y hAbAPrueba-AJ (con kJ).
Tabla 35 Unión de anticuerpo:antígeno de la sustitución lambda/Kappa.
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Ejemplo 16 Mutantes de hAbAPruebal: modificación de motivo
Ejemplo de referencia
Para establecer si el motivo corto "KH" era suficiente para la formación de MAC en la región correspondiente de CLA, se realizó un mutante Q(- c1on un cambio Qn de Q-l se QcOuencia simp 1le de los Q fj resid pu.0os CLA81/82 en hAbAPrueba ' para colocar una histidina al lado de K , por tanto,"K S H " se convirtió en "K H S ". Los mutantes se generaron siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Las construciones de anticuerpos mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293 y se purificaron utilizando una columna de afinidad de Proteína A. Los anticuerpos purificados se caracterizaron usando MS. El mutante hAbAPrueba-[CLA-S81H/H82S] (CL: SEQ ID NO: 62) unido a su ligando, así como el anticuerpo hAbA Prueba parental (Tabla 36).
Table 36 hAbAPrueba-S81H/H82S.
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Ejemplo 17 Perfil de conjugación de mutantes hAbAPruebal
Ejemplo de referencia
Cada anticuerpo (hAbAPrueba, hAbAPrueba-AK, hAbAPrueba-AJ y hAbAPrueba-[CLA-S81H/H82S]) se intercambió con tampón a acetato sódico 20 mM, trehalosa 200 m a pH 5,5 a 20 mg/ml. Las proteínas se enriquecieron a continuación con fosfato de sodio 60 mM a pH 7,7. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se resuspendió con 50 % de propilenglicol y se mezcló con el anticuerpo a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan múltiples sitios de conjugación de péptidos como señales distintas separadas por la diferencia de masa de un péptido. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de péptidos se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 37 muestra que el nivel general de conjugación se ha incrementado en los 2 híbridos con cambio de LC (AK y AKJ, el primero incluye un fragmento A J, el último incluye un fragmento K J). El nivel de conjugación aumenta sobre la CA promedio del control hAbAPrueba, pasando de 1,66 a 2,19 (AK) y 2,53 (AKJ) respectivamente. El mutante tuvo poco efecto en comparación con la secuencia nativa, lo que sugiere que el motivo "KH" solo no es suficiente para la formación de MAC.
El grado de conjugación de péptidos se examinó por separado en las cadenas ligera y pesada (Tabla 37). Cada muestra se desnaturalizó y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas. En los análisis reducidos, la LC de hAbAPrueba nativa tiene solo 5 % de 1CA, pero esto aumenta drásticamente a 58 % de 1CA para hAbAPrueba-AK y 63 % de 1CA para hAbAPrueba-AJ. El cambio de LC tuvo poco efecto sobre el nivel de conjugación de HC, que permaneció bastante constante (excepto por AKJ, en el que la conjugación de HC aumentó moderadamente). De nuevo, el mutante tuvo poco efecto en comparación con la secuencia nativa, lo que sugiere que el motivo "KH" solo no es suficiente para la formación de MAC. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 37.
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Las características de la unión al receptor de estas formas conjugadas también se evaluaron para determinar el efecto de la conjugación con [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] sobre la capacidad de los anticuerpos conjugados para seguir uniéndose a su ligando (Tabla 38).
Tabla 38 Unión de anticuerpo:antígeno de lambda en los anticuerpos.
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Ejemplo 18 Generación MAC usando diferentes grupos salientes
Ejemplo de referencia
Investigar si el grado de activación y/o estructura del grupo saliente éster activo era importante para definir el efecto de la conjugación direccional, se sintetizó una serie de análogos de éster activados alternativamente de [PFP-PEG2-MAL- Ksh11-SEQ: 27]. La distribución del producto conjugado se examinó mediante MS de los conjugados intactos y el grado de adición de péptidos tanto a las cadenas ligeras como a las pesadas también se determinó mediante MS después de la reducción del conjugado intacto y la separación de las cadenas ligera y pesada.
La estructura y las designaciones de los ésteres activados alternativamente se muestran a continuación. Los péptidos activados alternativamente se sintetizaron usando las mismas estrategias y procedimientos mostrados anteriormente. En resumen, cada grupo activado se incorporó a un enlazador MAL-PEG2-Z*, en el que Z* representaba el nuevo grupo saliente que reemplazaba a PFP. Para sintetizar los compuestos anteriores, una muestra (30-40 mg) del péptido ABP-tiol purificado (es decir, ABP con Ksh como resto de enlace) se disolvió en DMF anhidra (2 ml). Se añadió MAL-PEG2-Z* (20 mg) junto con N-metilmorfolina (5 ml). La reacción se agitó y se controló a temperatura ambiente mediante HPLC para seguir el curso temporal de la formación del producto. Se observó la conversión completa del péptido de partida en el producto ABP unido al éster activo en 2-6 horas. La solución se filtró y el pico del producto se aisló directamente mediante HPLC semipreparativa. Los productos se aislaron en rendimientos que varían de aproximadamente 30-50 %, después de la liofilización.
Las reacciones de conjugación se llevaron a cabo en condiciones estándar. En resumen, la solución de anticuerpo 2.12.1.fx se preparó diluyendo la solución 2.12.1.fx con fosfato de sodio, a pH 7,7 a una concentración final de 0,06 M. Por separado, la solución peptídica se preparó disolviendo el péptido a 20 mg/ml en propilenglicol, después diluyendo esta solución a 10 mg/ml con agua. Para la reacción de conjugación, las soluciones de péptido y anticuerpo se mezclaron a una relación molar de 4:1 durante el período prescrito. Para los estudios del curso de tiempo, las muestras de la solución de conjugación se inactivaron en diversos puntos de tiempo mezclando una muestra de la reacción de conjugación con una solución de ácido succínico 40 mM, glicina 200 mM, a pH 4,0 (1:1, v/v). El transcurso del tiempo de las reacciones de conjugación se siguió mediante HPLC. Se usó la SEQ ID NO: 27 como un péptido de ejemplo.
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Tabla 39 Conjugación intacta de ésteres reactivos a las 24 horas.
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(continuación)
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La Tabla 39 muestra la distribución del producto final de los conjugados intactos 24 horas después del inicio de la reacción de conjugación. Los resultados muestran que algunos de los ésteres no reaccionaron en absoluto (Z4, Z12), otros reaccionaron lentamente (por ejemplo, Z5), mientras que varios dieron perfiles que se aproximaban a los de PFP (Z1) (por ejemplo, Z3).
Cinética de conjugación
Las velocidades de adición a lo largo del tiempo para cada uno de los conjugados finales se muestran en las Tablas 39, 40, 41 y 42. 0 CA representa el anticuerpo 2.12.1.fx no derivatizado, mientras que 1, 2 o 3 CA representa adiciones de 1, 2 o 3 péptidos al anticuerpo 2.12.1.fx en cada uno de los períodos de tiempo examinados.
Tabla 40 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* que producen 0 CA.
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Tabla 41 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* que producen 1 CA.
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Tabla 42 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* que producen 2 CA.
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Tabla 43 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* que producen 3 CA.
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Distribución de cadenas ligeras y pesadas
El grado de conjugación de péptido para cada uno de los ésteres activados alternativamente se examinó por separado en las cadenas ligera y pesada. Cada muestra se desnaturalizó y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas. El perfil de conjugación de péptidos en las cadenas ligera y pesada de 2.12.1.fx y los mutantes se muestran en la Tabla 44. Casi todos los péptidos activados enumerados en la tabla mostraron un nivel de conjugación reducido en la cadena ligera en comparación con el compuesto que usaba PFP (Z1), a excepción de 2,3,6-trifluorofenilo (Z3), que mostró un nivel de conjugación similar. Los ésteres activados derivados de N-hidroxisuccinimida (NHS), es decir, imida de ácido N-hidroxil-5-norborneno-2,3-dicarboxílico y 2-hidroxilisoindolin-1,3-diona (Z8 y Z9) mostraron una mayor propensión a la derivatización de la cadena pesada.
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Tabla 44 Resumen de resultados de éster activado.
Ejemplo 19
Ejemplo de referencia
Otros ejemplos de ésteres activados alternativamente se muestran en la Tabla 45. Se examinó el curso temporal de la conjugación de varios análogos de ésteres de PFP. Disminuyendo el número y la posición de los grupos de flúor en PFP, las formas de éster activo menos reactivas pueden sintetizarse e investigarse. El éster de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo y el éster de 2,4,6-trifluorofenilo se analizaron después de la conjugación a [PEG2-MAL-Ksh11-SEQ: 27]. 1-hidroxil-pirrolidina-2,5-diona (NHS) se conjugó a [PEG5-K11-SEQ: 27],
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Después de 2 horas de conjugación, estas formas menos activadas dieron una conjugación global menor a 2.12.1.fx que PFP. El grupo NHS también mostró una conjugación global menor. Los péptidos que contienen NHS y PFP se conjugaron con 2.12.1.fx. Las formas reducidas se analizaron para ver la distribución a las 2 horas. La PFP mostró una propensión mucho mayor a la derivación de cadenas ligeras (77 % en general a LC, solo 6 % a la cadena pesada) en comparación con 1-hidroxipirrolidin-2,5-diona (NHS) (31 % en general a LC, pero 34 % en general a la cadena pesada).
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steres activados de forma alternativa - Ejemplos adicionales.
Tabla 45
Los compuestos Z1-Z15 representan diversos tipos estructurales diferentes de éster activo. Es esclarecedor considerar la serie de ésteres activos aromáticos fluorados, que tienen un número y patrón de sustitución de átomos de flúor alrededor del anillo aromático diferentes (compuestos Z1, Z2, Z3, Z11, Z14 y Z15) y considerar cómo su estructura influye sobre su reactividad y propensión a la derivatización de proteínas. La cinética de la conjugación de anticuerpos de estos derivados se puede comparar convenientemente en el punto de tiempo de 2 horas, cuando la reacción de pentafluorofenilo (Z1) se ha completado. Con un nivel creciente de sustitución de flúor alrededor del anillo, hay un nivel creciente de conjugación global y una disminución concomitante en el anticuerpo sin reaccionar. La velocidad de reacción está directamente relacionada con el pKa del grupo saliente de fenol fluorado, con los fenoles más ácidos, dando tasas de reacción más altas. Las tasas de conjugación son Z1> Z14> Z3> Z15> Z2> Z11. Los efectos sutiles de los patrones de sustitución de flúor pueden verse comparando los compuestos Z2, Z3 y Z15.
La estructura del éster activo también afectó significativamente a la direccionalidad de la reacción de conjugación. En general, los ésteres aromáticos fluorados mostraron una marcada propensión a la derivatización de cadenas ligeras (principalmente CLk-K80 como se ha mencionado anteriormente). En cambio, varios ésteres basados en derivados de N-hidroxisuccinimida (Z8, Z9 y Z13) mostraron menos preferencia, con niveles a menudo mayores de derivación de cadena pesada observada.
Ejemplo 20
Ejemplo de referencia
Se evaluó la velocidad de conjugación entre MAC-1 (enlazador PEG2-MAL-mercaptopropionilo entre el péptido y el grupo activador de PFP) y MAC-2 (enlazador PEG5 de cadena lineal entre el péptido y el grupo activador de p Fp). La Tabla 46 compara estos péptidos activados con 2.12.1x. Los resultados muestran que los péptidos activados se comportan de manera muy similar en términos de la velocidad y el grado de derivatización, a pesar de sus estructuras enlazadoras ligeramente diferentes.
Tabla 46 Comparación de la conjugación entre MAC-1 y MAC-2.
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Ejemplo 21 Efecto de la longitud del enlazador
Ejemplo de referencia
Se examinó el efecto sobre el perfil de distribución del conjugado final de tener diferentes longitudes de enlazador. Los compuestos se sintetizaron con enlazadores de PEG de diferente longitud uniendo el péptido al grupo PFP. Los resultados para la adición a 2.12.1.fx de 0, 1,2, 3 y 4 péptidos se resumen en la Tabla 47. En general, el cambio de la longitud del enlazador de PEG tuvo generalmente poco efecto sobre la distribución de los conjugados obtenidos.
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Estructura de los compuestos del ejemplo 21.
2.12.1.fx se conjugó a [PFP-PEGn-Kin-SEQ: 27]
Tabla 47 Efecto de la longitud del enlazador.
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Ejemplo 22 Conjugación de secuencias peptídicas alternativas
Para confirmar la aplicabilidad de las enseñanzas de la divulgación a través de otras secuencias peptídicas, se conjugaron la SEQ ID NO: 80 y la SEQ ID NO: 81 (péptidos de prueba 1 y 2). Las SEQ ID nO: 80 y 81 se conjugaron con PFP- PEG5] y después con 2.12.1.fx en las condiciones previamente optimizadas para la reacción con PFP-PEG5-K11-SEQ: 27]. Los resultados del análisis del perfil de conjugación y la conjugación de LC/HC se muestran en la Tabla 48. La SEQ ID NO: 80 y la SEQ ID NO: 81 mostraron ambas conjugación direccional a la cadena ligera. En un análisis posterior de las distribuciones de LC/HC, se observaron perfiles similares a los de MAC-2, con aproximadamente un 70 % de derivatización de LC y menos del 10 % en la hC.
Tabla 48 Perfil de conjugación de la SEQ ID NO 80 y la SEQ ID NO: 81.
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Ejemplo 23 Resumen del análisis de la conjugación de péptidos
Ejemplo de referencia
Los experimentos de mapeo peptídico se realizaron en una serie de combinaciones de proteína/conjugado con el fin de confirmar los parámetros importantes que conducen a la conjugación direccional en CLk-K80 en las cadenas ligeras de anticuerpo. La Tabla 49 enumera los resultados de los experimentos de mapeo peptídico realizados. Para cada parámetro de estudio, se utilizó el procedimiento de mapeo peptídico descrito anteriormente. "***" indica un alto nivel de conjugación direccional con CLk-K80 "**" y en menor medida, "*", indica que aún se observa conjugación direccional, pero puede mostrar diferencias, tales como condiciones de reacción más lentas, menos conjugación global o promediando en una cadena ligera solamente, y así puede ser más adecuado para circunstancias especiales, tal como generar MAC con entre 0,5 y 1,5 péptidos por anticuerpo (por ejemplo). "-" indica que estas condiciones de reacción no parecían favorables para la conjugación direccional en CLk-K80.
Dado que se observó en MAC-2 que CLk-K80 era la ubicación de la conjugación direccional, los estudios de mapeo peptídico en parámetros alternativos se centraron en esta ubicación. Los datos de mapeo peptídico detallados para cada parámetro de estudio no están incluidos. pero no se observaron niveles significativos de conjugación en otros restos K y las observaciones de otros MAC fueron consistentes con la conjugación direccional en CLk-K80.
Las mutaciones CLk-K80R y CLk-K80A de 2.12.1.fx dieron como resultado la pérdida de la conjugación direccional en este sitio; lo que sugiere un papel esencial para este resto específico. Las mutaciones CLk-K82R y CLk-K82A no obstaculizaron la conjugación direccional con CLk-K80, e incluso pueden potenciarla. De los otros parámetros de estudio examinados, se observó que al menos una parte del subtipo de región constante de la cadena ligera tenía un impacto significativo sobre la conjugación direccional; se determinó que era necesaria al menos una porción del subtipo kappa de la cadena ligera. La conjugación sobre un subtipo Clá (usando un anticuerpo que contiene A a modo de ejemplo, hAbAPruebal) no demostró conjugación direccional. Cuando el CLA de hAbAPruebal se mutó a una CLk, se recuperó la conjugación direccional en K80
Tabla: 49 Resumen de la conjugación direccional en CLk-K80.
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(continuación)
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Ejemplo 24 Examen de CLk-D77
Se examinaron los restos geográficamente cercanos al CLk-K80 en la estructura 3-D. El análisis inicial de la estructura cristalina sugirió la posibilidad de que CLk-D77 pudiera formar un puente de sal con CLk-K80, que podría tener un impacto sobre la conjugación direccional de CLk-K80. Para estudiar el efecto de CLk-D77 en la conjugación con CLk-K80, CLk-D77 se mutó a CLk-A77 en el anticuerpo 2.12.1.fx para crear 2.12.1.fx-[CLk-D77A] (CLk de SEQ ID NO: 37). La mutación CLk-D77A se generó en una cadena ligera de anticuerpo siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene®). La mutación se introdujo mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmó mediante secuenciación de ADN. 2.12.1. fx-[CLK-D77A] se expresó transitoriamente en células HEK 293 y se purificó usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando Ms .
2.12.1. fx y 2.12.1.fx-[CLK-D77A] (1 mg de tamaño de reacción) se ajustaron a 18 mg/ml a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El par de ejemplo péptido de prueba-enlazador [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg/ml. Se añadió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] al anticuerpo en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto conjugado se diluyó a 2 mg/ml y se analizó como una proteína conjugada intacta mediante SEC-MS para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de péptido-enlazador se realizó midiendo la magnitud de la señal.
La Tabla 50 compara el perfil de conjugación de [2.12.1.fxHPEG5-K11-SEQ: 27] y [2.12.1.fx-[CLK- D77A]-[PEG5-K11-SEQ: 27]. El perfil de conjugación de [2.12.1.fx]-[PEG5-K-SEQ: 27] se produce como una distribución entre 0-4 adiciones de péptido, siendo la forma más grande 2 adiciones de péptido y el número promedio de adiciones de péptido es de 2,16. El perfil cambia cuando el resto CLk-D77 está mutado a CLk-A77 en la proteína de armazón; el número promedio de adiciones de péptidos aumenta a 2,38 y se observa una adición significativamente menor de péptidos individuales. Este resultado sugiere que la mutación puntual única CLk-D77A tiene el efecto de aumentar la conjugación global al armazón. En ambas condiciones, el análisis duplicado (n = 3) demuestra que los perfiles de conjugaciones observados son reproducibles.
El grado de conjugación de péptidos se examinó por separado en las cadenas ligera y pesada de 2.12.1.fx y 2.12.1. fx-[CLk-D77A]. Los MAC producidos se desnaturalizaron y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas. La Tabla 50 demuestra que la conjugación promedio es mayor en la cadena ligera de 2.12.1.fx-[CLk-D77A] que 2.12.1.fx; el valor de adición de conjugado promedio para 2.12.1.fx-[CLk-D77A] es 1,15 en comparación con 0,85 para 2.12.1.fx. Además, la cadena ligera no conjugada no se detecta en 2.12.1. fx-[CLk-D77A]. La conjugación en la cadena pesada se observa a un nivel significativamente más bajo. La mayoría de las cadenas pesadas observadas para 2.12.1.fx y 2.12.1.fx-[CLk-D77A] no están conjugadas; esto es especialmente cierto en el caso de la cadena pesada 2.12.1.fx-[CLk-D77A]. Estos resultados sugieren que la mutación CLk-D77A altera la cadena ligera para hacerla significativamente más susceptible a la conjugación. El análisis duplicado de este experimento por múltiples científicos se muestra en la Tabla 50 que demuestra que el perfil de conjugación es consistente y reproducible.
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Tabla 50 Análisis de la conjugación de [PEG5-K11-SEQ: 27] a los Ab 2.12.1.fx (WT) y 2.12.1.fx-[CLK-D77A]. Rep = replicado. Rep. prom. es el promedio de los resultados de los tres experimentos repetidos, mostrándose la desviación estándar debajo (Desv. est.). % de CA del Ab muestra el % de adiciones de conjugaciones por anticuerpo, seguido de la CA promedio por anticuerpo. También se muestra un análisis reducido de las cadenas ligera y pesada, con las respectivas CA promedio por cadena. CLk-D77A muestra una tasa de 123 % de especies de % de 1CA de LC en comparación con el CLk nativa.
Ejemplo 25 Caracterización de mapeo peptídico del producto de referencia de las cadenas pesada y ligera de 2.12.1. fx-[CLK-D77A]-[SEQ: 27-K11-PEG5]
El anticuerpo 2.12.1.fx-[CLK-D77A]-[PEG5-K11-SEQ: 27] conjugado se redujo con ditiotreitol y restos de cisteína se alquilaron mediante carboximetilación con yodoacetamida. La quimotripsina se usó para la digestión proteolítica. Los fragmentos digeridos en solución se analizaron usando LCMS. Los fragmentos individuales se separaron en una columna de HPLC C18 y su masa precisa se midió en un espectrómetro de masas Q-Tof. La masa del fragmento resultante se usó para identificar fragmentos no modificados o fragmentos modificados con un grupo de conjugación [PEG5-K11-SEQ: 27]. Este experimento se interpretó centrándose en fragmentos digeridos con quimotripsina que contienen un resto de lisina y, por lo tanto, son posibles sitios para la conjugación de péptidos. Las tablas 51 y 52 enumeran todos esos fragmentos en la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente. Las entradas en blanco son fragmentos que no se detectaron con esta técnica. Los fragmentos detectados que se observaron con un modificador d e[PEG5-K11-SEQ: 27] se consideran sitios potenciales de conjugación de péptidos.
Se detectaron 2 fragmentos conjugados con [PEG5-K11-SEQ: 27] usando mapeo peptídico con LCMS del producto 2.12.1. fx-[CLK-D77A]-[PEG5-K11-SEQ: 27]. Ambos fragmentos conjugados estaban presentes en la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1. fx-[CLk-D77A]. En comparación, se detectaron 8 fragmentos conjugados a [PEG5-K11-SEQ: 27] en 2.12.1. fx-[PEG5-K11-SEQ: 27].
En general, estos resultados sugieren que los niveles de conjugación en el mutante CLk-D77A son elevados en menos sitios de conjugación, lo que posiblemente sugiera una mayor especificidad de conjugación en relación con el anticuerpo no mutado. Además, el análisis estructural ha demostrado que el resto CLK-D7 restá muy cerca (<10 A) del sitio de conjugación principal identificado CLk-K80. Se especuló que una interacción electrostática, posiblemente un puente de sal, podría existir entre el ácido carboxílico de CLk-D77 y la amina primaria de CLk-K80 La mutación CLk-D77A interrumpiría tal interacción electrostática, dando como resultado que la amina reactiva en CLk-K80 esté más expuesta y sea más susceptible a la conjugación con los ésteres reactivos de la divulgación. Aunque el análisis posterior acoplado al modelado sofisticado ayudó a construir una imagen más completa del sitio de reacción, e indicó que CLk-D77 ejerció su efecto principalmente a través de su interacción con CLk-H81, la hipótesis inicial de una interacción entre CLk-D77 y CLk-K80 fue útil para subrayar la importancia del resto CLk-D77.
Los sitios de conjugación observados en el producto 2.12.1.fx-[CLK-D77A]-[PEG5-K11-SEQ: 27] son fragmentos de quimotripsina de la cadena ligera Y3 e Y15. El análisis de las intensidades de señal para estos fragmentos sugiere que el fragmento Y15, portador del resto CLk-K80, es el sitio de conjugación principal. El fragmento Y15 solo se observa como un fragmento modificado con [PEG5-K11-SEQ: 27] a una intensidad de señal muy alta (1118572 recuentos, Tabla 52), mientras que la forma no modificada de Y15 no se observa, lo que sugiere que todo o casi todo el fragmento Y15 existe en la forma modificada. El fragmento Y3 se observa en las formas modificada con [PEG5-K11-SEQ: 271 y no modificadas; las intensidades de señal Y3 no modificadas en 2.12.1. fx-[PEG5-K11-SEQ: 27] y 2.12.1.fx-[CLK-D77A]-[PEG5-K11-SEQ: 27] están dentro del 15 %. Se observa Y3 modificado con [PEG5-K11-SEQ: 27] a un nivel relativamente bajo (9737 recuentos, Tabla 52).
Las entradas de la tabla para las Tablas 51 y 52 se explican a continuación:
Número de fragmento: Numeración de los fragmentos de quimotripsina desde el extremo N; los fragmentos unidos (es decir, Y1-2) indican un sitio de escisión perdido.
Inicio/fin: Numeración de la ubicación del fragmento desde el N-terminal.
Masa de fragmento (Da): Masa teórica del fragmento enumerado en Daltons.
Tiempo de retención (control/analito): Tiempo de retención cromatográfica/elución en el experimento de mapeo peptídico LCMS.
Intensidad de la señal MS (control/analito): Magnitud de la señal observada observada por MS.
Error de masa - ppm (control/analito): Comparación de la masa teórica frente a la observada del fragmento peptídico; los valores cercanos a cero (0) demuestran una mejor precisión de masa. La proteína de control para el tiempo de retención, la intensidad de la señal MS y el error de masa es 2.12.1.fx-[CLK-D77A] y la proteína del analito en cada caso es 2.12.1.fx-[CLK-D77A] [PEG5-K11-SEQ: 27].
Modificadores: Potenciales adiciones covalentes al fragmento; [PEG5-K11-SEQ: 27] - Péptido de unión al anticuerpo del resto de lisina, CAM-carboximetilación del resto de cisteína.
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Ejemplo 26 Examen de las mutaciones de CLk-D
El resto CLk-D77 del anticuerpo 2.12.1.fx se mutó a cada uno de los otros 18 aminoácidos además de la mutación CLk-D77A. Las CLk-D77G (SEQ ID NO: 38), CLk-D77L (SEQ ID NO: 40), CLk-D77S (SEQ ID NO: 49), CLk-D77E (SEQ ID NO: 53), and CLk-D77R (SEQ ID NO: 54) y los mutantes fueron generados siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick-Change (Stratagene®). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los otros 13 mutantes en el sitio CLk-D77 (CLk-D//V (SEQ ID NO: 39), CLk-D77I (SEQ ID NO: 41), CLk-D77P (SEQ ID NO: 42), CLk-D77F (SEQ ID NO: 43), CLk-D77W (SEQ ID NO: 44), CLk-D77Y (SEQ ID NO: 45), CLk-D77H (SEQ ID NO: 46), CLk-D77M (SEQ ID NO: 4/), CLk-D77C (SEQ ID NO: 48), CLk-D77T (SEQ ID NO: 50), CLk- D77Q (SEQ ID NO: 51), CLk-D77N (SEQ ID NO: 52), CLk-D77K (SEQ ID NO: 55) se generaron siguiendo los protocolos descritos en el kit de clonación Quick PCR (BPS Bioscience). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se clonaron en un vector p2.12.1.fxP4 modificado (Invitrogen) cortado con BglII y Nhel. El ADN insertado se confirmó mediante secuenciación de ADN. Los mAb mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293, y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
Los mutantes 2.12.1.fx y 2.12.1.fx se ajustaron a 18 mg/ml a pH / , / con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 2 /] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg/ml. El péptido/enlazador se añadió al anticuerpo en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente.
La Tabla 53 describe el perfil de conjugación global de los mutantes de CLk-D77. Se añadió CLk-D77C debido a la introdu7c7ción de un 7a7 cisteína l 7ib7re y J los res 77ultados no fueron interp 1retables. Las mutaciones CLk-D77W, CLk-D77M, CLk-D H, CLk- D Q, CLk-D N y CLk-D V no cambiaron el perfil de conjugación general en comparación con 2.12.1.fx de tipo salvaje. Las mutaciones CLk-D77F, CLK- CLk-D77K, CLk-D7/Y y CLk-D77E disminuyeron el nivel general de conjugación. Las mutaciones CLk-D77P, CLk-D77I, CLk-D77T, CLk-D77R, CLk-D77L, CLk-D7/S y CLk-D77G aumentaron el nivel general de conjugación.
El análisis de LC y HC reducidas mostró que solo las mutaciones CLk-D77F, CLk-D77K, CLk-D77Y, CLk- D77E y CLk-D77C dieron como resultado niveles reducidos de conjugación en la cadena ligera. Los niveles de conjugación en la cadena ligera aumentaron (y la conjugación en la cadena pesada disminuyó ligeramente) para CLk-D7/M, CLk-D77H, CLk-D77Q, CLk-D77N, CLk-D77W y CLk-D77V. Las mutaciones CLk-D77P, CLk-D77I, CLk-D77T, CLk-D77R, CLk-D77L, CLk-D77S y CLk-D77 G aumentaron el nivel de conjugación en la cadena ligera reduciendo el nivel de cadena ligera no conjugada. CLk-D77K aumentó el nivel de 2 conjugados en la cadena ligera debido a la introducción de otra lisina, un sitio de conjugación potencial.
Tabla 53 Análisis de la conjugación de mutantes CLk-D77 con aminoácidos alternativos (los datos se separan dentro de la tabla de acuerdo con la cantidad de proteína utilizada durante la reacción de conjugación, o porque la reacción de conjugación se estableció en un momento diferente). La disminución del nivel de conjugación para las pruebas realizadas a 0,5 y 0,25 mg/ml se debió a los bajos niveles del anticuerpo. % de CA del Ab muestra el % de adiciones de conjugaciones por anticuerpo, seguido de la CA promedio por anticuerpo. También se muestra un análisis reducido de las cadenas ligera y pesada, con las respectivas CA promedio por cadena. El % de % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna de la derecha: por ejemplo, D77Q; el valor de % de 1-LC de 81 es 126 % del respectivo % de WT 1-LC de 69 para dicho ciclo experimental. Todas las muestras se analizaron con 11 1 77 77 771 77 77
mg de Ab, a excepción del ciclo, incluyendo D M , D F y D H (0,5 mg), e incluyendo el ciclo D W y D C (0,25
mg).
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(continuación)
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Ejemplo 27 Efectos de otras mutaciones en la región CHk en la conjugación
Además de CLk-D77A, otros restos dentro de una distancia de 10Á a CLk-K80 se mutaron a alanina: CLk-K41A (SEQ ID NO: 20), V42A (SEQ ID NO: 21), CLk-D43A (SEQ ID NO: 56), CLk-N44A (SEQ ID NO: 22), CLk-L46A (SEQ ID NO: 23), CLk-Q47A (SEQ ID NO: 24), CLk-S48A (SEQ ID NO: 25), CLk-N50A (SEQ ID NO: 26), CLk-L73A (SEQ ID NO: 28), CLk-S74A (SEQ ID NO: 29), CLk-K75A (SEQ ID NO: 30), CLk-Y78A (SEQ ID NO: 31), CLk-E79A (SEQ ID NO: 32), CLk- H81A (SEQ ID NO: 33), CLk-V83A (SEQ ID NO: 34), CLk-Y84A (SEQ ID NO: 35) y CLk-R103A (SEQ ID NO: 36) también se mutaron a Ala. Los datos de CLk-D43A y CLk-H81A se tratan en el Ejemplo 14.
El mutante L73A se introdujo en 2.12.1.fx CLk utilizando el procedimiento de ligación de tres vías. Se usaron un cebador específico para el extremo 5' de 2.12.1.fx-LC (2.12.1.fx.LC.FOR: SEQ ID NO: 85) y un cebador inverso que contiene la mutación L73A deseada (L181A.REV: SEQ ID NO: 88) para PCR la primera mitad del 2.12.1.fx-LC usando 2.12.1.fx-LC DNA como molde de PCR. Este fragmento de PCR se digirió después usando las enzimas de restricción BglII y Bsal. Se usaron un cebador directo que contenía la mutación CLk-L73a (L181A.FOR: SEQ ID NO: 87) emparejado con el cebador inverso específico para el extremo 3' de 2.12.1.fx-LC (2.12.1.fx.LC.REV: SEQ ID NO: 86) para amplificar por PCR la segunda mitad de los fragmentos de ADN de 2.12.1.fx-LC portadores de mutación usando ADN de 2.12.1.fx-LC como molde de PCR. A continuación, este fragmento de PCR se digirió usando las enzimas de restricción Bsal y Nhel. Los dos fragmentos de PCR digeridos con las enzimas de restricción se ligaron con un plásmido p2.12.1.fxP4 modificado (Invitrogen®) cortado con BglII y Nhel. La secuencia de inserción se confirmó mediante secuenciación de ADN. 2.12.1.fx-[CLk-L73A] (es decir, que comprende la SEQ ID NO: 28) se expresó transitoriamente en células HEK 293 y se purificó usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
Los mutantes CLk-V42A and CLk-K75A se generaron mediante PCR de solapamiento. Las mutaciones fueron introducidas por los cebadores oligonucleotídicos. El cebador específico para el extremo 5' de 2.12.1.fx-LC (2.12.1.fx.LC.FOR) emparejó un cebador inverso portador de la mutación deseada y un cebador directo portador de la mutación deseada emparejada con el cebador inverso específico para el extremo 3' de la cadena ligera de 2.12.1. fx (2.12.1.fx.LC.FOR) se usó para amplificar por Pc R los fragmentos de ADN de 2.12.1.fx-LC usando 2.12.1. fx-LC como molde. Estos dos productos de PCR se mezclaron como moldes; Se usaron el cebador directo de y el cebador inverso de 2.12.1.fx-LC en la reacción de PCR de solapamiento para amplificar el ADN de 2.12.1.fx-LC de longitud completa con la mutación deseada. A continuación, la PCR se digirió usando las enzimas de restricción Bsal y Nhel. La PCR digerida se ligó con un plásmido p2.12.1.fxP4 modificado (Invitrogen®) cortado con BglII y NheI. La secuencia de inserción se confirmó mediante secuenciación de ADN. Los mAb mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293, y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
Los otros mutantes se generaron en 2.12.1.fx-LC siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene®). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los mAb mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293, y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
2.12.1.fx y 2.12.1.fx mutantes (1 mg de tamaño de reacción) se ajustaron a 18 mg/ml a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg/ml. El péptido/enlazador se añadió al anticuerpo en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente.
La Tabla 54 compara el perfil de conjugación de 2.12.1.fx-[PEG5-K11-SEQ: 27] con 2.12.1.fx-[mutantes CLk]-[PEG5-K11-SEQ: 27]. El perfil de conjugación de 2.12.1.fx-[PEG5-K11-SEQ: 27] se produce como una distribución entre 0-4 adiciones de péptidos, siendo la forma más grande 2 adiciones de péptido. El perfil cambia cuando los restos se mutan a Ala en la proteína del armazón; el número promedio de adiciones de [PEG5-K11-SEQ: 27] disminuyó (CLk-V42A, CLk- L46A, CLk-S74A, CLk-Y78A y CLk-Y84A) o aumentó (dobles mutantes CLk-Q47A, CLk-N50A y CLk-D A/E A) en comparación con sus controles 2.12.1.fx-[PEG5-K -SEQ: 27] correspondientes. Al comparar el perfil de conjugación de CLk- D77A/E79A con CLk-E79A, el aumento significativo de las adiciones promedio de [PEG5-K11-SEQ: 27 al anticuerpo se debe principalmente a la mutación CLk-D77 A.
El grado de la conjugación [PEG5-K11-SEQ: 27]se examinó por separado en las cadenas ligera y pesada de 2.12.1.fx y 2.12.1.fx-[mutantes CLk]. Los MAC se desnaturalizaron y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas. La Tabla 54 demuestra que las 1CA en la cadena ligera de 2.12.1.fx-[CLK-Q47A] y - [CLk- N50A] son más altas que 2.12.1.fx. Las CA promedio son 0,84 y 0,85 fueron comparables a 0,78 del anticuerpo 2.12.1.fx. Los mutantes CLk-Q47A y CLk-N5CA tienen más del 70 % de 1CA en comparación con el 59 % de 1CA del anticuerpo de tipo salvaje 2.12.1.fx. Además, los niveles de cadena ligera no conjugada de estos dos mutantes se redujeron desde el 31 % del anticuerpo de tipo salvaje hasta el 22 % y el 19 %. La V42A tenía un nivel reducido de conjugación de la cadena ligera. La CA de la cadena ligera promedio es 0,45 con un 59 % de la cadena ligera no conjugada y un 37 % de 1CA. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 54.
Conjugación de CLk-V42A, CLk-Q47A y CLk-N50A a [PEG5-K11-SEQ: 27] se repitieron y los resultados se muestran en la parte inferior de la tabla. Los niveles elevados de conjugación de cadena ligera en CLk-Q47A y CLk-N50A y la conjugación reducida de la cadena ligera en CLk-V42A se confirmaron mediante análisis de lC-EM intactos y reducidos. En general, los datos de conjugación sugieren que CLk-V42, CLk-D43 y CLk-H81 tienen todos un impacto en la conjugación direccional de PFP en CLk-K80.
Tabla 54 Análisis de conjugación de las variantes de 2.12.1.fx conjugadas con [SEQ: 27-K11-PEG5], que muestran mutantes de aminoácidos dentro de 10 A de K80 de la cadena ligera. % de CA del Ab muestra el % de adiciones de conjugaciones por anticuerpo, seguido de la CA promedio por anticuerpo. También se muestra un análisis reducido de las cadenas ligera y pesada, con las respectivas CA promedio por cadena. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 53.
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(continuación)
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Ejemplo 28 Análisis de los mutantes CLk-D43A y CLk-H81A
Para determinar si la carga, el enlace de hidrógeno o el tamaño de CLk-D43 son importantes para la conjugación direccional de CLk-K80, se mutó CLk-D43 a CLk-D43E (SEQ ID NO: 107), CLk-D43N (SEQ ID NO: 108) y CLk- D43L (SEQ ID NO: 109) respectivamente. Los mutantes se generaron en la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1.fx siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene®). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Los mAb mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293, y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
De forma similar, con el fin de evaluar el papel de CLk-H81, se evaluaron las siguientes versiones mutantes del anticuerpo de prueba 2.12.1.fx: CLk-H81N (SEQ ID NO: 110), CLk-H81Q (SEQ ID NO: 111), CLk-H81Y (SEQ ID NO: 112), CLk-H81W (SEQ ID NO: 113) y CLk-H81F (SEQ ID NO: 114).
2.12.1.fx anticuerpos y 2.12.1.fx-[CLK-mutante] -anticuerpos (1 mg de tamaño de reacción) se ajustaron a 18 mg/ml a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg/ml. El péptido/enlazador se añadió al anticuerpo en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente.
CLk-D43N tiene la conjugación global similar y los niveles de cadena ligera (Tabla 55) en comparación con el anticuerpo de tipo salvaje. CLk-D43E y CLk-D43L mostraron un nivel de conjugación de cadena ligera del nivel de conjugación general reducido.
Los mutantes CLk-H81N, CLk-H81Q, CLk-H81Y, CLk-H81W y CLk-H81F mostraron un nivel de conjugación de la cadena ligera del nivel de conjugación general reducido, lo que sugiere que se requiere el anillo de imidazol para la conjugación direccional de PFP. La reacción de conjugación no implica la interacción de apilamiento n ni los enlaces H formados con Ne2 o N51 del anillo de imidazol.
Tabla 55 Variantes de 2.12.1.fx conjugadas con [PEG5-K11-SEQ: 27] (WT es 2.12.1.1 fx). % de CA del Ab muestra el % de adiciones de conjugaciones por anticuerpo, seguido de la CA promedio por anticuerpo. También se muestra un análisis reducido de las cadenas ligera y pesada, con las respectivas CA promedio por cadena. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 53.
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Ejemplo 29 Conjugación de 2.12.1.fx-[CLk-D77A] usando diferentes ésteres reactivos
Se conjugaron 2.12.1.fx Y 2.12.1.fx-[CLK-D77A] con [PEG5-K11-SEQ: 27] usando diferentes ésteres reactivos (véanse los Ejemplos 18 y 19) (resultados mostrados en la Tabla 56). Para todos los diferentes ésteres activados, el mutante 2.12.1.fx-[CLK-D77A] dio un nivel más alto de CA promedio intacta tras la conjugación en comparación con el 2.12.1.fx wt. Otra tendencia clara fue que el nivel de Ca de 0 y 1 en 2.12.1.fx de tipo salvaje disminuyó notablemente en el mutante 2.12.1.fx-[CLK-D77A] para cada uno de los ésteres activados y que el nivel de 2 CA se incrementó en cada caso para la mayoría de los ésteres activados, a excepción de Z9.
Los resultados de los análisis LC/HC reducidos mostraron una tendencia más obvia al comparar los resultados de la conjugación de 2.12.1.fx y 2.12.1.fx-[CLK-D77A]. En cada caso, el grado de LC no derivatizada disminuyó, sustancialmente en algunos casos. Esto se acompañó de un aumento concomitante del nivel de 1 CA en la LC, de nuevo para cada éster activo diferente, de modo que, en general, aumentó la cantidad promedio de derivatización en la LC. La tendencia general para la LC fue que la cantidad de 1CA aumentó en la cantidad que 0CA disminuyó, dado que la cantidad de 2CA presente en cada caso esencialmente no se modificó.
Al considerar la HC, se puso de manifiesto otra tendencia en lo que respecta a que la cantidad ya baja de derivatización de 1CA para cada éster activo se redujo aún más. El valor atípico en esta tendencia fue Z9, el único éster no fenólico. Este éster muestra poco del efecto de conjugación direccional hacia CLk-K80 en comparación con los otros ésteres fenólicos y los niveles de derivatización de Lc y HC son similares, con solo una pequeña mejora en la direccionalidad impartida por el mutante 2.12.1.fx-[CLk-D77A]. En general, el mutante 2.12.1.fx-[CLk-D77A] proporciona una clara evidencia de conjugación direccional de LC mejorada en comparación con el 2.12.1.fx nativo para una serie de ésteres activados
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Ejemplo 30 Conjugación de trastuzumab (Herceptin®)
Con el fin de confirmar que la conjugación direccional mejorada a CLk-K80 causada por la mutación CLk-D77 se puede aplicar a otros anticuerpos que comprenden CLk, la mutación D77A también se insertó en el CLk de trastuzumab (hTrast). El ADN de la cadena ligera y la cadena pesada de trastuzumab se sintetizaron según las secuencias de aminoácidos en el banco de fármacos, número de referencia DB00072 (BIOD00098, BTD00098). El mutante hTrast-[CLk-D77A] se generó en dos etapas. En primer lugar, la mutación D77A se generó en una cadena ligera de anticuerpo siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene®). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. La VL de trastuzumab se ligó con la CLdel anticuerpo con la mutación D77A. El par de cebadores TRAST.VL.FOR (SEQ ID NO: 89) y TRAST.VL.REV (SEQ ID NO: 90) se usaron para amplificar la VL de trastuzumab. El fragmento de PCR se digirió con BglII y Bsal. El par de cebadores TRAST.CL.D185A.FOR (SEQ ID NO: 91) y TRAST.CL.D185.A.REV (SEQ ID NO: 92) se usaron para amplificar la CL con la mutación D77A. El fragmento de PCR resultante se digirió con Bsal y Nhel. Los fragmentos de PCR digeridos con enzimas de restricción se ligaron con un plásmido p2.12.1.fxP4 modificado (Invitrogen®) cortado con BglII y Nhel. La secuencia de inserción se confirmó mediante secuenciación de ADN. El mAb mutado se expresó transitoriamente en células HEK 293 y se purificó usando una columna de afinidad de proteína A. El mAb purificado se caracterizó usando MS. Trastuzumab y hTrast-[CLk-D77A] (1 mg de tamaño de reacción) se ajustaron a 18 mg/ml a pH 7,7 con un tampón fosfato hasta una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg/ml. El péptido/enlazador se añadió al anticuerpo en una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 horas a temperatura ambiente.
La Tabla 57 compara el perfil de conjugación de trastuzumab-[PEG5-K11-SEQ: 27] a hTrast-[CLK- D77A]-[PEG5-K11-SEQ: 27]. El perfil de conjugación de trastuzumab-[PEG5-K11-SEQ: 27] se produce como una distribución entre 0-4 adiciones de péptidos, siendo el número promedio de adiciones de péptidos 1,75. El perfil cambia después de la mutación D77A; el número promedio de adiciones de péptidos aumenta a 2,18 y se observan niveles generales significativamente menores de 0 y 1 adición de péptidos. Este resultado sugiere que la mutación puntual única CLk-D77A tiene el efecto de aumentar la conjugación global al armazón, como se ve en el anticuerpo de prueba 2.12.1.fx. El análisis de las cadenas ligera y pesada reducido demuestra que la conjugación promedio es mayor en la cadena ligera de hTrast-[CLk-D77A] que en trastuzumab no modificado; el valor promedio de adición de conjugado de cadena ligera para hTrast-[CLk-D77A] es 1,01 en comparación con 0,70 para trastuzumab. Además, la cadena ligera no conjugada se reduce significativamente en hTrast-[CLk-D77A]. La conjugación en la cadena pesada se observa a un nivel significativamente más bajo. La mayoría de las cadenas pesadas observadas para trastuzumab y hTrast-[CLk-D77A] están conjugadas; esto es especialmente cierto en el caso de la cadena pesada de hTrast-[CLK- D77A]. Estos resultados sugieren que la mutación CLk-D77A altera la cadena ligera para hacerla significativamente más susceptible a la conjugación.
Tabla 57 Análisis de la conjugación de [PEG5-K11-SEQ: 27] a los Ab trastuzumab (WT) y hTrast-[CLK-D77A]. Rep = replicado. Rep. prom. es el promedio de los resultados de los tres experimentos repetidos, mostrándose la desviación estándar debajo (Desv. est.). % de CA del Ab muestra el % de adiciones de conjugaciones por anticuerpo, seguido de la CA promedio por anticuerpo. También se muestra un análisis de las cadenas ligera y pesada reducido.
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Ejemplo 31 Conjugación de trastuzumab con MMAD
La Tabla 58 compara el perfil de conjugación de trastuzumab -[PEG5-MMAD] (derivado de auristatina) con hTrast-[CLk-D77A]-[PEG5-MMAD].
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El perfil de conjugación de trastuzumab-[PEG5-MMAD] se produce como una distribución entre 0-4 conjugaciones por anticuerpo, siendo la forma más grande 2 conjugaciones y el número promedio de conjugaciones es 1,65. Cuando CLk-D77A está mutada, el número promedio de conjugaciones aumenta a 2,00 y se observan significativamente menos niveles globales de adición de MMAD 0 y 1. Este resultado sugiere que la mutación puntual única CLk-D77A tiene el efecto de aumentar la conjugación global en el armazón y que esta tecnología es aplicable a un modelo de conjugación de toxina de anticuerpo.
Los análisis reducidos de las cadenas pesada y ligera demuestran que la conjugación promedio es más alta en la cadena ligera de hTrast-[CLk-D77A] que trastuzumab no modificado; el valor promedio de adición del conjugado de cadena ligera para hTrast-[CLK- D77a ] es 0,88 comparado con 0,56 para trastuzumab. Además, la cadena ligera no conjugada se reduce significativamente en hTrast-[CLk-D77A]. La conjugación en la cadena pesada se observa a un nivel significativamente más baj°. La mayoría de las cadenas pesadas observadas para trastuzumab y
D A] están conjugadas; esto es especialmente cierto en el caso de la cadena pesada de hTrast-[CLK- D A]. Estos resultados sugieren que la mutación CLk-D77A altera la cadena ligera para hacerla significativamente más susceptible a la conjugación.
Tabla 58 Análisis de la conjugación de [PEG5-MMAD] a trastuzumab (WT) y hTrast-[CLK-D77A], que también muestra un análisis reducido de LC y HC. % de CA del Ab muestra el % de adiciones de conjugaciones por anticuerpo, seguido de la CA promedio por anticuerpo. También se muestra un análisis de las cadenas ligera y pesada reducido. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 53.
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Ejemplo 32 Capacidad del trastuzumab conjugado para unirse a las dianas
La capacidad de trastuzumab y hTrast-[CLk-D77A], no conjugado y conjugado a [PEG5-K11-SEQ: 27] o [PEG5-MMAD] y para unirse al receptor Her2 se estudió usando un ensayo de ELISA de unión a Her2. Se recubrieron placas de ELISA de medios pocillos con 1 pg/ml de proteína de fusión Fc-ErbB2 en PBS y se incubaron a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado KPL y posteriormente se bloquearon con Superblock durante 1 hora a temperatura ambiente. Se prepararon diluciones en serie 10x de muestras en Superblock, con una concentración superior de 100 pg/ml. Las muestras se añadieron a los pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado KPL. Las muestras unidas se detectaron mediante incubación con una dilución 1:1000 de anticuerpo secundario Fab-HRP antihumano durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo 3 veces con tampón de lavado KPL y se detectó HRP con sustrato de TMB. La reacción se detuvo con H2SO42 M y se midió la DO a 450 nm en un lector de placas Spectramax.
Las figuras 9A y 9B demuestran que trastuzumab comercial, trastuzumab generado a partir de la secuencia disponible, y hTrast-[CLk-D77A], así como trastuzumab y hTrast-[CLk-D77A] cuando se unen a cualquiera de [PEG5-K11-SEQ: 27] o [PEG5-MMAD] muestran cada uno características de unión a Her2 similares. Estos resultados sugieren que la conjugación, principalmente en CLk-K80, no interfiere significativamente con la función de unión al receptor del anticuerpo nativo.
Ejemplo 33 Comparación de estrategias de conjugación de PFP y NHS
Trastuzumab se conjugó con [PEG5-MMAD] usando dos estrategias separadas: conjugación direccional a CLk-K80 usando éster de PFP (Z1) como el grupo Z* (que genera trastuzumab-[5PEG-MMAD]) o NHS (Z13; generando trastuzumab-[MMAD]n), que dio como resultado un patrón de conjugación más amplio a través del anticuerpo y se dosificó a ratas para comparar la tolerabilidad de los conjugados de anticuerpo y fármaco. Ambos conjugados se administraron en dosis únicas en bolo de 10, 30 y 100 mg/kg. Todos los animales a los que se administraron dosis de 10 y 30 mg/kg de ambos conjugados durante el período de estudio de una semana sobrevivieron sin pérdida significativa de peso corporal. Sin embargo, el grupo de dosis de 100 mg/kg mostró una clara diferencia entre la conjugación aleatoria (Z13) y la conjugación selectiva de sitio con CLk-K80 (Z1). Más del 50 % de los animales en dosis de 100 mg/kg del conjugado aleatorio (conjugación de NHS) murieron dentro del período de estudio de una semana mientras que todos los animales en la dosis de 100 mg/kg del conjugado selectivo de sitio (conjugación de PFP) sobrevivieron sin una pérdida de peso corporal significativa (Tabla 59). Esto puede sugerir que la conjugación preferente en CLk-K80 puede proporcionar un mecanismo más fiable para la conjugación de restos efectores que los enfoques tradicionales 'aleatorios', ya que la conjugación en múltiples restos de lisina en la superficie puede dar lugar a restos efectores que tienen patrones de escisión y degradación menos fiables.
Tabla 59 Conjugación selectiva de sitio de la toxina mejora la tolerabilidad de los conjugados de anticuerpo y fármaco. Comparación de la tolerabilidad de trastuzumab-[PEG5-MMAD] en ratas después de la conjugación usando Z1 y Z13 como grupos Z*.
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Ejemplo 34 h38C2 conjugado con toxina y enlazador escindible
Un péptido diana se conjugó con el sitio de combinación de una versión mutada de CLk-D77A del anticuerpo catalítico h38C2 (HC = SEC ID NO: 65 y LC = SEC ID NO: 37 y 67) usando un enlazador de fórmula P-Q-W como se describe en el presente documento, con un grupo p-lactama como grupo W para formar una unión covalente con la cadena lateral de K99 de SEQ ID NO: 65. Este anticuerpo conjugado se conjugó después adicionalmente con el éster activado por PFP de una toxina basada en auristatina de ejemplo unida a un enlazador escindible de carbamato de valina-citrulina p-aminobencilo ([PFP-PEG2-ValCitABC-TOXINA]).
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Se observó una distribución de conjugados con principalmente 2-3 toxinas por armazón de anticuerpo (Tabla 60). Los ensayos de citotoxicidad in v itr o de este conjugado demostraron potentes efectos antiproliferativos en las líneas celulares AU565 (CI50 = 0,4 nM) y OVCAR5 (CI50 = 0,2 nM).
Tabla 60 Perfil de conjugación de h38C2 conjugado a [PFP-PEG2-ValCitABC-TOXINA].
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Ejemplo 35
Se usó un análogo estructural de PFP, con un grupo trifluorometilo reemplazando al átomo de para-flúor, para hacer un grupo Z* derivado; 2,3,5,6-tetrafluoro-4-(trifluorometil)fenilo (Z16):
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2,3,5,6-tetrafluoro-4-(trifluorometN)fenilo
Esto se usó para generar un enlazador Z I6-PEG5, que se conjugó con el péptido de prueba SEQ ID NO: 27 y se probó en conjugación con el anticuerpo de prueba 2.12.1.fx. A diferencia de otros grupos Z* probados, este derivado dio un conjugado con un nivel ligeramente más alto de conjugación para el 2.12.1.fx nativo en comparación con 2.12.1. fx-[CLk-D77A], pero ambos niveles de conjugación intacta fueron más altos para el conjugado usando el grupo Z16 que los análogos de PFP (Z1) correspondientes (aproximadamente un 10 % de aumento en la CA promedio general en comparación con Z1). Usando Z16, tanto 2.12.1.fx nativo como las conjugaciones 2.12.1.fx-[c Lk-D77A] mostraron un nivel equivalente de 1CA y este fue menor que el observado para 2.12.1.fx nativo conjugado con [PFP- PEG5-K11-SEQ: 27]: para otras conjugaciones, el nivel de 1CA típicamente se reduce en el D77A en comparación con el anticuerpo nativo correspondiente. En general, los resultados sugieren que el grupo saliente D16 es más reactivo que Z1 (PFP) (Tabla 61).
El grupo saliente Z16 muestra una derivatización aproximadamente equivalente para los anticuerpos nativos 2.12.1. fx y 2.12.1.fx-[CLk-D77A] y la cantidad de LC no derivatizada es pequeña en ambos casos. De nuevo, el nivel general de derivatización de LC y HC aumenta usando Z*16 en comparación con Z1. El grupo saliente Z16 aparece como un éster más reactivo que e PFP, pero es posible que el grupo CF3 proporcione una interacción adicional cerca de la región CLk-K80 que también impulsa la reactividad y la derivatización preferente de la LC.
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Ejemplo 36 Síntesis de la toxina 0101
Ejemplo de referencia
Experimentación para la toxina 0101 (n.° 54 en el esquema)
Preparación de 2-metilalanil-N -[(3R, 4S, 5S) -3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R, 2R) -1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il} -5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 54)
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Etapa 1. Síntesis de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil] -2-metilalanil-N-[(3R, 4S, 5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)))-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il} -5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n. ° 53). De acuerdo con el procedimiento general D (a continuación), del n.° 32 (2,05 g, 2,83 mmol, 1 eq.) en diclorometano (20 ml, 0,1 M) y N, N-dimetilformamida (3 ml), la amina n.° 19 ((2R, 3R)-3-metoxi-2-metil-N -[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]-3-[(2S) -pirrolidin-2-il] propanamida, sal del ácido trifluoroacético) (2,5 g, 3,4 mmol, 1,2 eq.), Con HATU (1,29 g, 3,38 mmol, 1,2 eq.) y trietilamina (1,57 ml, 11,3 mmol. 4 eq.) se sintetizó el material bruto deseado, que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 % a 55 % de acetona en heptano), produciendo el n.° 53 (2,42 g, 74 %) como un sólido. LC-MS: m/z 965,7 [M+H+], 987,6 [M+Na+], tiempo de retención = 1,04 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 965,4 [M+H+], tiempo de retención = 11,344 minutos (pureza > 97 %); RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe), supuestamente una mezcla de rotámeros, señales características: 87,86-7,91 (m, 2H), [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,79 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,67-7,74 (m, 2H), [7,63 (d, J = 3,2 Hz) y 7,65 (d, J = 3,2 Hz), total 1H], 7,38-7,44 (m, 2H), 7,30-7,36 (m, 2H), 7,11-7,30 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11,4, 8,4, 4,1 Hz) y 5,52 (ddd, J = 11,7, 8,8, 4,2 Hz), total 1H], [4,49 (dd, J = 8,6, 7,6 Hz) y 4,59 (dd, J = 8,6, 6,8 Hz), total 1H], 3,13, 3,17, 3,18 y 3,24 (4 s, 6H total), 2,90 y 3,00 (2 s a, 3H total), 1,31 y 1,36 (2 s a, 6H total), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) y 1,09 (d, J = 6,7 Hz), 3H total]. Etapa 2. Síntesis de 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (n.° 54) De acuerdo con el procedimiento general A (más adelante), del n.° 53 (701 mg, 0,726 mmol) en diclorometano (10 ml, 0,07 M) se sintetizó el material bruto deseado, que se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (Gradiente: 0 % a 10 % de metanol en diclorometano). El resto se diluyó con éter dietílico y heptano y se concentró al vacío para producir el n.° 54 (406 mg, 75 %) como un sólido blanco. LC-MS: m/z 743,6 [M+H+], tiempo de retención = 0,70 minutos; HPLC (Protocolo A): m/z 743,4 [M+H+], tiempo de retención = 6,903 minutos, (pureza > 97 %); RMN 1H (400 MHz, DMSO-cfe), supuestamente una mezcla de rotámeros, señales características: 8 [8,64 (d a, J = 8,5 Hz) y 8,86 (d a, J = 8,7 Hz), 1H total], [8,04 (d a, J= 9,3 Hz) y 8,08 (d a, J= 9,3 Hz), 1H total], [7,77 (d, J = 3,3 Hz) y 7,80 (d, J = 3,2 Hz),1H total], [7,63 (d, J = 3,3 Hz) y 7,66 (d, J = 3,2 Hz),1H total], 7,13-7,31 (m, 5H), [5,39 (ddd, J = 11, 8,5, 4 Hz) y 5,53 (ddd, J = 12, 9, 4 Hz), total 1H], [4,49 (dd, J = 9, 8 Hz) y 4,60 (dd, J = 9, 7 Hz), total 1H], 3,16, 3,20, 3,21 y 3,25 (4 s, 6H total), 2,93 y 3,02 (2 s a, 3H total), 1,21 (s, 3H), 1,13 y 1,13 (2 s a, 3H total), [1,05 (d, J = 6,7 Hz) y 1,10 (d, J = 6,7 Hz), 3H total], 0,73-0,80 (m, 3H).
Procedimiento general A: Eliminación de Fmoc usando dietilamina. A una solución del compuesto que contiene Fmoc en diclorometano se añadió un volumen igual de dietilamina. El progreso de la reacción se controló mediante CL-EM (o HPLC o TLC); la reacción generalmente se completó en tres horas. Los disolventes se eliminaron al vacío y el residuo se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano. El residuo se diluyó a continuación con diclorometano y una pequeña cantidad de metanol antes de reducirse a sílice y se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, eluyendo con metanol en diclorometano, para proporcionar el material deseado.
Procedimiento general D: acoplamiento con hexafluorofosfato de O- (7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N,N'-tetrametiluronio (HATU). A una solución en agitación de la amina (1 eq.) y ácido (1,1 eq.): se añadió N,N-dimetilformamida (4:1,0,3 M en amina) HATU (1,2 eq.) seguido de Et3N (3 eq.). El progreso de la reacción se controló mediante CL-EM (o HPLC o TLC); la reacción generalmente se completó en tres horas. Los disolventes se eliminaron al vacío. El residuo se destiló azeotrópicamente tres veces con heptano y se diluyó con una pequeña cantidad de acetato de etilo antes de reducirse a sílice y se purificó mediante gel de sílice o cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 37 Preparación de MAC que comprende mAb hu08 y Toxina 0101
Hu08 es un anticuerpo anti-IL-13Ra2 humano y se describe completamente en el documento US61/723.545.
Una versión mutante de hu08, que comprende la mutación CLk-D77A se generó de acuerdo con protocolos estándar (hu08-[CLK-D77A]). La toxina-0101 (n.° 54: Ejemplo 36) se conjugó con un enlazador escindible para formar la estructura:
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y, a continuación, el enlazador de la toxina se conjugó con hu08-[CLK-D77A] de acuerdo con las técnicas descritas en el presente documento. Se generó el compuesto hu08-vc-0101, dando como resultado la conjugación no específica de múltiple de la toxina-0101 en el anticuerpo hu08 a través de la especie enlazador-toxina-0101:
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Ensayo de citotoxicidad i n v i t r o
Las líneas celulares que expresan el antígeno IL-13Ra2 y una línea celular de control negativo se cultivaron con concentraciones crecientes de hu08-[CLk-D77A]. Después de cuatro días, se evaluó la viabilidad de los cultivos. Los valores de la CI50 se calcularon mediante regresión logística no lineal y se presentan como ng de Ab/ml.
Los datos demuestran que hu08-vc0101 y hu08-[CLk40, -D77A] fueron ambos eficaces contra las dos líneas celulares positivas para IL-13Ra2 probadas (PC3MM2 y A375), que tienen una CI50 que varía de 2,5 a 7,9 ng de Ab/ml (Tabla 62). Ni hu08-vc0101 ni hu08-[CLk-D77A] fueron activos contra la línea celular negativa para IL-13Ra2, H460 y el control de no unión a IL-13Ra2, hIgG8.84-vc0101, no fue activo contra ninguna de las líneas celulares analizadas.
Tabla 62 Ensayo de citotoxicidad in vitro de hu08-[CLk-D77A]-0101.
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Modelos de xenoinjerto subcutáneo de ADC mutantes de Cys
Se inyectó ratones atímicos (desnudos) hembra s.c. células tumorales PC3MM2. A los ratones con tumores en estadios, se administró aproximadamente de 0,1 a 0,3 g (n = 8 a 10 ratones/grupo de tratamiento) por vía intravenosa cada 4 días x 4 solución salina normal (vehículo) o MAC-0001. Los compuestos se administraron según el contenido de Ab. Los tumores se midieron al menos una vez a la semana y su tamaño (mm2 /- SEM) se calculó como mm3 = 0,5 x (anchura del tumor2) x (longitud del tumor). Los datos en la Tabla 63 indican que hu08-[CLk-D77A] -0101 inhibe el crecimiento de los xenoinjertos PC3MM2.
Tabla 63 GT = grupo terminado debido a un tamaño tumoral grande
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Ejemplo 38 Actividades del conjugado de trastuzumab MMAD
Se realizaron tres conjugados de trastuzumab: trastuzumab-[5PEG-MMAD], hTrast-[CLK-D77A]-[5PEG-MMAD] y trastuzumab-(MMAD)n, en el que MMAD se conectó a un enlazador 5PEG con Z13 (NHS) como grupo saliente y se conjugó con trastuzumab sin técnicas de conjugación direccional, lo que da como resultado una conjugación no específica de MMAD a lisinas de superficie de trastuzumab (véanse los Ejemplos 30-33)
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Los tres conjugados de mAb se evaluaron en un estudio de toxicidad exploratoria en ratas en las que los animales recibieron dosis individuales en bolo intravenoso de cada ADC a 0 (vehículo), 10, 30 y 100 mg/kg (5 ratas macho/grupo) y a continuación se observaron durante 14 días. La evaluación toxicológica incluyó observaciones clínicas diarias, las mediciones semanales del peso corporal y la evaluación de la patología clínica el día de la necropsia. Se sacrificó a los animales el día 15 y los tejidos seleccionados se recogieron para el examen microscópico. Además, se tomaron muestras de sangre de todos los animales a aproximadamente 0,0833 (5 min), 6, 24 (día 2), 48 (día 3), 72 (día 4), 96 (día 5), 168 (día 8) y 312 (día 14) horas después de la dosis y se analizaron las concentraciones de anticuerpo-conjugado y del anticuerpo trastuzumab.
Resultados
Las exposiciones en plasma (basadas en la AUC) fueron en general similares a los 3 conjugados a cualquier dosis dada. La AUC(0-312) de hTrast-[CLK-D77A]-[5PEG-MMAD], trastuzumab-[5PEG-MMAD] y trastuzumab-(MMAD)n a 100 mg/kg fueron 177.000, 174.000 y 139.000 ng^h/ml, respectivamente. hTrast-[CLK-D77A]-[5PEG-MMAD] y trastuzumab-[5PEG-MMAD] fueron clínicamente bien tolerados a todas las dosis. Sin embargo, la administración de trastuzumab-(MMAD)n a 100 mg/kg se asoció con signos clínicos marcados y eutanasia prematura de 1/5 ratas el día 8. Otras ratas de este grupo disminuyeron la turgencia de la piel y disminuyeron el aumento de peso corporal. Los cambios clínicos patológicos fueron, en general, similares con hTrast-[CLK-D77A]-[5PEG-MMAD] y trastuzumab-[5PEG-MMAD] e incluyeron, en particular, leves disminuciones de la masa de glóbulos rojos (RBC) (recuento de glóbulos rojos, hemoglobina y/o hematocrito) a >10 o >30 mg/kg y aumentos mínimos de la aspartato aminotransferasa (AST) a 100 mg/kg. Los cambios en la masa de glóbulos rojos fueron más pronunciados con trastuzumab-(MMAD)n y se relacionaron con una disminución de la celularidad eritroide en la médula ósea. Otros cambios notables en la patología clínica relacionados con trastuzumab-(MMAD)n a 100 mg/kg incluyeron disminuciones moderadas en los recuentos de plaquetas y aumentos leves en la ALT, AST, ALP y bilirrubina total. Los hallazgos microscópicos fueron en general similares para hTrast-[CLK-D77A]-[5PEG-MMAD] y trastuzumab-[5PEG-MMAD] e incluyeron histiocitosis/inflamación alveolar en el pulmón, degeneración de los conductos biliares pequeños en el hígado y aumento de macrófagos corporales tangibles (que contienen desechos celulares) en la médula ósea. El aumento de mitosis en varios tejidos y la necrosis unicelular en la córnea se consideraron efectos farmacológicamente mediados de la inhibición de la tubulina, que dio como resultado la detención de la mitosis y apoptosis. Por el contrario, la administración de trastuzumab-(MMAD)n se asoció con alteraciones tisulares microscópicas más pronunciadas, que incluyeron degeneración/necrosis tubular y glomerulopatía en el riñón; necrosis de células individuales, degeneración e hiperplasia del conducto biliar y necrosis/fibrosis centrolobulillar en el hígado; histiocitosis/inflamación alveolar en el pulmón; aumento de macrófagos corporales tangibles, degeneración/disminución del número de células hematopoyéticas y osteólisis en la médula ósea; disminución de la celularidad de la zona marginal en el bazo. Cabe destacar que, la fibrosis centrolobulillar en el hígado en asociación con la alteración de la arquitectura lobulillar normal fue consistente con un cambio reparador que sugiere daño hepatocelular precoz más extenso relacionado con el tratamiento. Además, se observaron mitosis incrementadas mediadas farmacológicamente y/o necrosis de células individuales en varios tejidos.
En resumen, hTrast-[CLK-D77A]-[5PEG-MMAD] y trastuzumab-[5PEG-MMAD] fueron bien tolerados a todas las dosis (10, 30 y 100 mg/kg) y demostraron perfiles de toxicidad similares en general. La administración de trastuzumab-(MMAD)n condujo a una mortalidad prematura de 100 mg/kg y se asoció con toxicidades significativas en órganos diana en el hígado, los riñones, pulmón y médula ósea en particular.
Ejemplo 39 Modelado de CLk y CLA
La figura 10A representa un pliegue de Ig de un dominio constante de la cadena ligera que contiene una lámina p de 3 cadenas empaquetada frente a una lámina p de 4 cadenas. El pliegue se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre las cadenas p de cada lámina p, por enlaces hidrofóbicos entre residuos de láminas p opuestas en el interior, y por un enlace disulfuro entre las láminas p. La lámina p de 3 cadenas comprende cadenas p C, F y G, y la lámina p de 4 cadenas tiene cadenas p A, B, E y D. Las letras A a G indican las posiciones secuenciales de las cadenas p a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue de Ig. La unión de cada cadena p con la cadena p posterior es una cadena de conexión de aminoácidos que puede comprender o no una vuelta (A/B) o una a hélice (E/F) (figura 10B).
La figura 8B representa las estructuras secundarias a lo largo de la secuencia primaria de el CLk de ratón y humana, y el CLA humano. La cadena de conexión EF entre las cadenas p E y F de CLk y el CLA tiene una estructura secundaria idéntica y consiste en una región a-hélice de 5-6 residuos (CLk-K75-K80, y CLA-P76-S81), seguido de una vuelta de 2-3 aminoácidos (CLk- H81-K82 y CLA-H82-S84) (Figuras 8B y 10). La cadena de conexión CD lleva la cadena lateral de ácidos aspárticos estructuralmente equivalentes (CLk-D53, CLA-D45) a las proximidades de la cadena EF (aproximadamente 3,5 A), y permite que CLk-D53 interaccione con el anillo de imidazol de CLk-H81. El modelado de CLA y la comparación con CLk sugiere que CLA-D45 coopera con el anillo de imidazol de CLA-H82 de la misma manera y que la mutación de CLA-S81 a CLA-K81 recrea un entorno local similar al encontrado en el CLk, y así permite la conjugación direccional con el CLA.
En consecuencia, la presente divulgación también proporciona los dominios CLA que comprenden una de las siguientes mutaciones: CLA-S81K y CLA-K80x/S81K, en la que x es cualquier aminoácido excepto P, K, R o H, en la que la numeración es de acuerdo con la SEQ ID NO: 93. En algunos aspectos, la divulgación proporciona nuevos dominios CLA que comprenden K81, o x80/ K81, en la que x es uno de G, A, I, L, V, S, T, M, N, Q, F, Y, W, D o E. En algunos aspectos, la divulgación también proporciona un dominio CLA que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 94 y la SEQ ID NO: 95.
El modelado también sugiere que CLA-E77 estaría disponible para formar un puente de sal con cualquiera de CLA-K80 o CLA- K81de la misma manera que CLk-D77 parece formar un puente de sal a CLk-K80. Por lo tanto, la mutación de CLA-E77 a cualquiera de R, L, S, G, Q, P, N, V, I T y M es probable que facilite la conjugación direccional en CLA-K80CLA cuando S81A (es decir, deleción de S81) o CLA-K81. En consecuencia, la presente divulgación también proporciona un dominio CLA que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 96 y SEQ ID NO: 97.
Ejemplo 40 Modelado del mecanismo de conjugación de CLk-K80
Estructura y descripción de la secuencia
Las estructuras cristalinas del dominio Fab de 2.12.1.fx y h38C2-[CLk-D77A] se usaron para modelar la especificidad de la reactividad de CLk-K80 frente a una conjugación mediada por halo-fenol (tal como PFP)/éster. La experiencia con conjugaciones a través de múltiples y variados anticuerpos, así como el análisis de modelado temprano, indicó que el modelado solo debe centrarse en el CLk, dado que el resto del anticuerpo parecía ejercer muy poca, en caso de haberla, influencia sobre el mecanismo de conjugación.
Enfoque computacional
El objetivo de los cálculos computacionales fue aclarar los atributos críticos de CLk-K80 y los residuos de interacción que, preferentemente, sesgan este sitio hacia la reacción de conjugación PFP-éster. Después de que las coordenadas 3-D de CLk y CLk-D77A se seleccionaron a partir de la estructura cristalina (según las coordenadas que contenían los residuos identificados como relevantes para la conjugación direccional), las coordenadas se sometieron a protocolos computacionales estándar, tal como preparación de proteínas, unión de átomos de hidrógeno y asignación de parámetros de campo de fuerza.
Se asignaron átomos de hidrógeno a todos los átomos de aminoácidos en el dominio 3D CLk respectivo de acuerdo con los valores de pKa calculados y pl (potencial de ionización de proteínas). El pKa es el valor de un estado de protonación de un aminoácido valorable dado al pH neutro (logaritmo negativo de la concentración de hidrógeno) teniendo en cuenta la influencia de los aminoácidos en la cadena de la proteína (Spassov; A fast and accurate computational approach to protein ionization. Protein Science 2008, 17, 1955-1970). Los resultados de estos cálculos se muestran en la Tabla 64.
Tabla 64 Valores de pKa de restos de aminoácidos en CLk
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Los átomos de hidrógeno se añaden de acuerdo con el valor de pKa para todos los aminoácidos valorables y para los aminoácidos restantes, de acuerdo con el número de valencia atómica. Los cálculos indicaron que CLk-H81 no está protonado a pH 7,0-7,4 (pH fisiológico). Esta observación es consistente con el mecanismo propuesto para la reacción catalítica, en la que CLk-H81 actúa como catalizador nucleofílico. En general, se esperaría que la conjugación disminuyera a medida que el pH disminuye por debajo de un pH de aproximadamente 6,5-7,0, ya que CLk-H81 estaría protonado. A medida que el pH aumenta por encima de aproximadamente 7,4, se predijo un mayor nivel general de conjugación, ya que otros restos (especialmente lisinas) se vuelven más reactivos y contribuyen a la reacción de conjugación general, en consecuencia, cabría esperar que el efecto direccional se perdiera cada vez más a medida que aumenta el pH. Esto se correlaciona con lo que se observó en el estudio de pH mostrado en el Ejemplo 4, Tabla 4.
Minimización
CHARMm [Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics] es una técnica de minimización de energía y se utilizó para llevar las estructuras tridimensionales a la posición de equilibrio y encontrar la mejor posición geométrica para su estructura atómica. CHARMm se usó en la primera etapa con SMART Minimizer con 1000 etapas de minimización de Steepest Descent con una tolerancia de gradiente RMS de 3 [Kcal/(mol*Á)], seguida de la minimización del gradiente del conjugado con un gradiente RMS de 0,01. Para el cambio de energía, se aplicó una tolerancia de 3 [Kcal/(mol*Á)] al gradiente promedio durante un ciclo de minimización. El procedimiento Steepest Descent lleva la molécula al mínimo más cercano y el gradiente conjugado mejora la conformación final obtenida. Se usaron las cargas de Momany Rone, (como se describe en Momany & Rone; Validation of the general purpose QUANTA 3.2/CHARMm force field. Comp. Chem. 1992, 13, 888-900.) La estructura minimizada de CLk difería en 1 Á cuando se comparó con la estructura no minimizada.
Complejo entre dominios CLk y PFP-PEG2
Los complejos respectivos entre un éster de PFP y los dominios CLk y CLk-D77A se construyeron in silico para comprender mejor cada interacción. El análisis estructural de los dominios 3D CLk por el protocolo Accelrys Define and Edit Binding Site (software Discovery Studio, versión DS3.5) reveló una región que podría denominarse un "bolsillo de unión", ubicado entre las cadenas de conexión de CD y J EF, y J debaj 7o5 de 79 CLk-K80, como se muestra en la figura 11. Este bolsillo e os r í fa oc n ilitado 1 por los aminoácidos ubicados en CLk-K -E ( 'A a fy -hélice EF en la cadena de conexión de EF), CLk-K -K (bucle EF en la cadena de conexión de EF) y CLk-V (bucle CD en la cadena de conexión de CD), dando la forma y las propiedades electrostáticas requeridas por la reacción catalítica.
Para medir el tamaño del bolsillo, el protocoloDe/ine and Edit Binding Site se utilizó en la estructura de CLk minimizada previamente. Este protocolo requiere definir el dominio CLK como receptor para utilizar en él el procedimiento de llenado espacial para calcular el tamaño de la cavidad y evaluar su idoneidad para la unión de una molécula con un tamaño particular, tal como PFP. El sitio de unión de un receptor se puede representar de muchas maneras, por ejemplo, una esfera o una lista de residuos que rodean esta esfera. Para definir un sitio de enlace, el receptor se asigna primero a una retícula. Los puntos de la retícula dentro de una distancia dada de los átomos del receptor están marcados como ocupados por el receptor y, por lo tanto, no son deseables como ubicaciones para los átomos del ligando. Existen dos procedimientos para identificar un sitio de unión. El primero usa un algoritmo de "borrado" para identificar sitios en función de la forma del receptor. El segundo usa el volumen ocupado por un ligando conocido ya colocado en un sitio activo (Venkatachalam y col., Fit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J. Mol. Graph. Model 2003, 21,289-307;.
Como resultado de la ejecución del protocolo, los sitios de unión se identifican como un conjunto de puntos ubicados en una retícula que abarca la molécula considerada. Esta definición permite la medición del tamaño y la forma del sitio de unión, lo que permite su calificación como sitio de unión. PFP-PEG2 se ancló manualmente al sitio rodeado de aminoácidos identificados experimentalmente como importantes para la reacción catalítica. Estos aminoácidos fueron CLk-K , CLk-H , CLk-D y otros aminoácidos a una distancia de 10 Á de CLk-K (mostrados en la Tabla 54).
El complejo inicial entre cada dominio CLk y un éster de PFP se minimizó utilizando el procedimiento híbrido de QM/MM, aplicando el campo de fuerza CHARMm para el dominio CLk y los cálculos QM para el éster de PFP. El éster de p Fp se minimizó antes de la colocación usando primero CHARMm, luego el enfoque de QM/MM en el que el éster de PFP se trata como un sistema QM. La estructura se minimizó utilizando el protocolo de minimización CHARMm descrito anteriormente.
Para las minimizaciones del complejo, se utilizó un protocolo híbrido QM/MM en el cual los cálculos de mecánica cuántica (QM) dieron información sobre el cambio en las densidades electrónicas al interaccionar con la proteína WT o mutada, lo que nos permitió capturar la influencia del ambiente circundante sobre las densidades electrónicas del éster de PFP y su susceptibilidad a la reacción de conjugación. El protocolo QM/MM es un procedimiento híbrido en el que el sistema molecular se divide en dos regiones: en primer lugar, el éster de PFP de la región central, que se va a tratar mediante un cálculo de QM y, en segundo lugar, el dominio CLk de la región externa, tratado por procedimientos de mecánica molecular (MM).
El tratamiento QM trae un mayor nivel de teoría, lo que permite el modelado de fenómenos adicionales en comparación con las técnicas de campo de fuerza tradicionales, por ejemplo, en el que se produce una reacción química o los efectos de polarización desempeñan un papel importante. El grueso restante de la estructura se describe utilizando un CLk. de campo de fuerza. La forma en que las dos regiones pueden interaccionar y cómo se evalúa la energía QM/MM total define el protocolo QM/MM específico empleado. La energía calculada en este procedimiento está compuesta de tres partes básicas: la energía QM del éster de PFP (Eqm), CD-kappa (Emm) y la energía de interacción entre estos dos sistemas (EQmmm)- Se usa la fórmula Eto = Eqm + Emm + Eqm/mm.
En lo que se refiere a la interacción coulomb entre la densidad electrónica de la región QM y las cargas puntuales del campo de fuerza, los procedimientos QM/MM en esta aplicación siempre emplean incrustación electrónica. Esto significa que las cargas parciales del átomo del campo de fuerza entran en el cálculo de QM como un potencial externo, polarizando de este modo la densidad electrónica de QM con relación a un cálculo de QM al vacío y dando lugar a una energía de interacción electrostática entre la densidad de QM y las cargas puntuales. Al contrario que la manipulación de las interacciones electrostáticas en los procedimientos q M/MM, las interacciones de van der Waals se tratan completamente al nivel clásico. Esto significa que deben determinarse los parámetros del campo de fuerza para todos los átomos en la simulación. La energía (y las fuerzas) de interacción de QM/MM de van der Waals es parte de la energía del servidor de simulación CHARMm y se incluye como un término separado en el archivo de salida.
Cálculos
Los efectos totales observados de los experimentos in vitro durante y después de la conjugación se pueden modelar mediante técnicas computacionales usando aproximaciones graduales para describir fenómenos tales como:
1. Tamaño del bolsillo de unión a PFP, unión del éster y la dirección.
2. Estabilidad de la proteína, especialmente, la estabilidad de un bolsillo de unión a PFP.
3. Tautomerización del anillo de imidazol de CLk-H81.
4. Colocación direccional de PFP.
5. Interacción inicial entre el éster de PFP y CLk.
6. Reactividad de cada uno de los aminoácidos catalíticos.
Resultados de modelado
La identificación del bolsillo de unión en el dominio CLk permitió el modelado y la colocación del anclaje del éster de PFP.
Después de que el éster de PFP se modeló como acoplado en el respectivo sitio de unión a CLk, la estructura tridimensional del complejo se minimizó utilizando un procedimiento híbrido QM/MM. En este enfoque, el éster de PFP se definió como un sistema QM y el dominio CLk se trató mediante un procedimiento MM. Después de la minimización del complejo, se reveló una red de interacciones intermoleculares entre el CLk y el éster de PFP. Esta red estaba formada por enlaces de hidrógeno intermoleculares, interacciones hidrofóbicas y apilamiento de electrones n. Todas estas fuerzas juntas parecen estar involucradas en la formación de una red responsable de la colocación y conjugación direccional del éster de PFP a CLk-K80. La estructura minimizada del complejo indica que CLk-H81 es un aminoácido catalítico importante.
Se sabe que el resto imidazol en las cadenas laterales de histidina puede servir como un aminoácido catalítico en reacciones enzimáticas, con el imidazol actuando como un nucleófilo y formando un acilimidazol durante el estado de transición catalítica [J Phys Chem B. 2011 Oct 20; 115 (41):11895-901. Epub 23 de septiembre de 2011]. También se sabe que el anillo imidazol de la histidina puede experimentar tautomerización, dependiendo de si el átomo de N5 o Ne se une a H:
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La colocación espacial de CLk-H81 en el bolsillo de unión de PFP apunta al requerimiento de la forma tautomérica N5 del anillo imidazol de CLk-H81 para el ataque nucleofílico sobre el carbono del carbonilo del éster de PFP. También indica un requisito para que el par solitario de electrones en Ne esté en el mismo plano que el carbono del carbonilo del grupo éster de PFP. Esto es posible cuando el anillo imidazol de CLk-H81 está en la forma tautomérica N5 (véase el Esquema II). El equilibrio tautomérico puede controlarse mediante las interacciones del enlace de hidrógeno con los aminoácidos aceptores de hidrógeno vecinos. Hay dos restos de ácido aspártico, CLk-D77 y CLk-D43, en las proximidades de CLk-H81 y ambos parecen controlar el estado de tautomerización del anillo imidazol de CLk-H81.
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conjugación
La figura 12 representa la disposición 3-D de CLk-H81, CLk-D43 y CLk-D77, acompañado por las distancias entre los átomos de oxígeno de los ácidos aspárticos y los átomos de nitrógeno del anillo imidazol. El enlace de hidrógeno entre CLk-D43 y CLk-H81 estimula y estabiliza la forma tautomérica catalíticamente activa N8, mientras que el enlace de hidrógeno con CLk-D77 estimulará la forma catalíticamente inactiva de CLk-H81 Ne. Además de los enlaces de hidrógeno formados entre CLk-H81 N8 y CLk-D77 O8 (cargados negativamente), CLk-H81 N e y CLk-D77 O8, CLk-H81 N 8 pueden formar un enlace de hidrógeno con el oxígeno de carbonilo de la cadena principal de CLk-D77. Esta última interacción estabiliza la conformación catalíticamente activa de CLk-K81 N8, haciéndolo capaz de catálisis. Se sabe por el análisis mutacional y el trabajo computacional tratado en el presente documento que la conformación óptima para la reactividad de CLk-K81 implica el enlace de hidrógeno con CLk-D43 a través de N8, dado que estabiliza una conformación activa capaz de la transferencia de hidrógeno He de CLk-K80 Ne. Las otras dos formas tautoméricas de CLk-K81, por lo tanto, muy probablemente serán menos activas o inactivas en la reacción catalítica.
Modelado del efecto de la mutación C L k - D 77 A
Como se predijo a partir del modelo WT, en el dominio [CLk-D77A], CLk-H81 forma un enlace de hidrógeno con CLk-D43 a través del átomo de imidazol N8, exponiendo el par de electrones a Ne al ataque nucleofílico sobre el carbono de carbonilo del grupo éster en la molécula de PFP-PEG2 (Esquema III). La Figura 13A, 13B y 13C representan una comparación de los dominios CLk y CLk-D77A modelados por la estructura cristalina e ilustran el cambio en la posición espacial de CLk-H81 en el mutante CLk-D77A.
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Mutaciones de C L k - D 77
El modelado sugiere que las mutaciones de CLk-D77 tendrían un impacto significativo en la velocidad de conjugación de CLk-K80 Se realizó una serie de cálculos QM/MM en el dominio CLk en complejo con PFP, en el que CLk-D77 se mutó en todos los demás aminoácidos naturales (CLk-D77C se excluyó).
El modelado y el análisis experimental sugieren que CLk-D77 puede unirse a PFP y cambiar la densidad de electrones desfavorable en los átomos de éster de la fracción de PFP implicada en la reacción catalítica. La mutación CLk-D77A mejoraría después la velocidad de conjugación al permitir una mejor distribución de las densidades electrónicas en los átomos reactivos del éster de p Fp .
El análisis de los resultados del cálculo realizado en los mutantes de CLk-D77 indica que los mutantes con mejor rendimiento (en términos de eficiencia de la conjugación) probablemente sean aquellos aminoácidos hidrófobos pequeños incapaces de formar enlaces de hidrógeno con el resto de PFP. Por lo tanto, el modelado de datos sugiere las que las mutaciones CLk-D77G, CLk-D77P, CLk-D77M, CLk-D77L, CLk-D77I, CLk-D77A y CLk-D77V mejorarían la conjugación direccional. Como se ve en el Ejemplo 26, esto se confirma mediante pruebas experimentales. Todos los mutantes CLk77 con aminoácidos hidrofóbicos no tienen impacto en el equilibrio tautomérico de CLk-H81, así, CLk-H81 permanece en la forma tautomérica NS y, en consecuencia, mejoran las velocidades de conjugación.
El modelado también sugiere que la mayoría de los aminoácidos hidrofílicos es probable que den como resultado una estabilidad proteica mayor que CLk-D77 según los cálculos de QM/MM, y señala las mutaciones CLk-D77S y CLk-D77T en particular, y también CLk-D77Q, CLk-D77N, CLk-D77H y CLk-D77R como una conjugación direccional potencialmente mejorada. Como se ve en el Ejemplo 26, esto también se confirma mediante pruebas experimentales.
Además de las energías de interacción y las modificaciones de la distribución de la carga, la interacción más fuerte y las tasas de conjugación más bajas se observaron para los mutantes CLk-D77F y CLk-D77Y. El modelo indica que las cadenas laterales de estos aminoácidos aromáticos se alojan directamente en el bolsillo de unión y es probable que participen en interacciones de apilamiento de electrones n con el grupo PFP y, por lo tanto, cambian la colocación direccional del resto de PFP. Además, los aminoácidos aromáticos pueden impedir estéricamente el PFP, impidiendo un modo de unión similar al posible en la proteína WT, de modo que afecta adversamente a la colocación direccional del resto de PFP y dando como resultado una velocidad de conjugación disminuida. De forma interesante, el modelo sugiere que la cadena lateral de CLk-D77W ocupa una posición espacial ligeramente diferente a las cadenas laterales aromáticas de CLk-D77F y CLk-D77Y, con el grupo indol de CLk-D77W localizado fuera del bolsillo de unión y no se predice que interfiera con el acceso espacial de un éster halo-fenílico al bolsillo de unión. El modelo también predice que una mutación conservadora, como CLk-D77E, es probable que tenga un efecto similar sobre la forma tautomérica de CLk-H81, pero debido a la cadena lateral más grande cree una interferencia estérica adicional en el bolsillo de unión. También se predice que las mutaciones en CLk-D77C o CLk-D77K interfieren con la reactividad del sitio.
CLk-D77 favorece la presencia del átomo de hidrógeno en Ne del anillo de imidazol, mientras que CLk-D77A favorece el mantenimiento del hidrógeno en la posición N8. La distribución espacial de aminoácidos en el sitio indica la función importante de la forma tautomérica NS de CLk-H81 en la reacción catalítica que permite el ataque nucleofílico por Ne en el carbono del carbonilo del grupo éster, facilitando aún más la conjugación direccional.
Ejemplo 41 Modelado predictivo según el modelo de CLk y CLk-D77A
El impacto de las mutaciones sobre la estabilidad de la proteína y la fuerza de interacción con el éster de PFP se analizaron para identificar los mutantes más relevantes y reactivos de CLk. Para este experimento computacional, se seleccionaron y analizaron los aminoácidos clave a una distancia de 10 A del carbono Ca de CLk-K80 (excepto CLk-K80 y CLk-H81, dado el requisito único para cada uno de los residuos).
Para muchas o la mayoría de las mutaciones modeladas para la conjugación de PFP con CLk o CLk-D77A, se entenderá que, en ciertas aplicaciones,, puede ser apropiado sustituir o retener un resto que reduzca la conjugación de PFP en el CLk o CLk-D77A, como puede ser deseable reducir o aumentar el tamaño del bolsillo; tal como cuando se usan halofenoles más grandes o más pequeños como grupos Z1, o cuando la geometría precisa de un dominio de inmunoglobulina específico parece merecer tal característica.
CLk-K75
Este resto no parece tener ningún impacto directo sobre la reactividad de la conjugación de CLk-K80 en el mutante nativo o CLk-D77A mediante cálculos de QM/MM.
CLk-A76
CLk-A76 se encuentra al comienzo de la a-hélice y se encuentra en y sobre el plano que contiene el grupo carboxilo unido a hidrógeno de CLk-D77 y el grupo hidroxilo de CLk-S74 Esta ubicación permite que los aminoácidos con una gran cadena lateral interaccionen con CLk-D77 y pueden tener un impacto positivo de la reacción de conjugación, especialmente aquellos con grupos hidrofílicos capaces de formar enlaces de hidrógeno. Se esperaría que la mayoría de las sustituciones de aminoácidos en este residuo tengan poco efecto sobre la conjugación, específicamente CLk-S74A, CLk-S74D, CLk-S74E, CLk-S74I, CLk-S74L, CLK- S74M, CLk-S74F, CLk-S74W y CLk-S74V. Cabría esperar que otros restos que puedan proporcionar oportunidades de enlace de hidrógeno para mejorar la conjugación, específicamente CLk-S74R, CLk-S74N, CLk-S74Q, CLk-S74H y CLk-S74K, y en menor grado CLk-S74S, CLk-S74T y CLk-S74Y. Mientras que los restos que alteran la a-hélice pueden tener un efecto algo negativo en la conjugación direccional a CLk-K80, tal como CLk-S74G y CLk-S74P, es poco probable que la conjugación direccional se anule, simplemente se reduce. La introducción de una cisteína presentaría un riesgo del potencial de formar agregados en la expresión.
CLk-Y78
CLk-Y78 está ubicado en la a-hélice, orientado en dirección opuesta al bolsillo de unión. CLk-Y78 realiza varias interacciones hidrofóbicas con los aminoácidos circundantes y es compatible con la estructura de CLk. En consecuencia, las cadenas laterales más pequeñas (Ala, Ser, Thr y Val) o aquellas que afectan a la estabilidad o la formación de la a-hélice (Gly, Pro) tendrán más probabilidades de afectar negativamente a la reacción de conjugación a CLk-K80, aunque como no se prevé que estas mutaciones interfieran directamente con la reactividad de CLk-K80, tales mutaciones pueden no necesariamente anular la conjugación direccional. De manera adicional, CLk-Y78 parece interaccionar con la cadena lateral de CLk-R103, por lo tanto, se espera que las cadenas laterales hidrofóbicas o cargadas negativamente favorezcan la conjugación para facilitar esta interacción (Asn, Asp, Gln, Glu, Phe y Trp). No cabe esperar que otras cadenas laterales afecten a la reacción de conjugación (Arg, His, Ile, Leu, Lys y Met).
CLk-E79
El modelado sugiere que la cadena lateral de CLk-E79 apunta en la dirección opuesta al sitio de unión. Además, CLk-E79 parece formar un puente de sal con una cadena lateral de CLk-K75. Según el modelado, se postula que la mayoría de las sustituciones de aminoácidos en esta posición tendrían poco efecto sobre la reacción de conjugación (Asn, Asp, Gln, His, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr y Trp). Pequeños restos hidrofílicos o cargados probablemente favorecerían la reacción de conjugación (Ala, Arg, Ile, Leu, Lys y Val), mientras que aquellos que afectan a la estabilidad o la formación de la a-hélice (Gly, Pro) pueden afectar negativamente a la reacción de conjugación a CLk-K80, sin necesariamente anular la conjugación direccional.
CLk-V83
Este residuo no parece tener un impacto directo sobre la reacción de conjugación con CLk-K80 por datos experimentales y cálculos QM/MM.
Tabla 65 Resumen del efecto de las mutaciones en ciertos restos de CLk en la conjugación direccional con CLk-K80
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Modelado adicional
CLk-V42
CLk-V42 se posiciona al final de la cadena p C y al comienzo del bucle CD. A partir de un examen cuidadoso de la estructura, se observó que CLk-V42 se encuentra debajo del anillo de imidazol de CLk-H81 (Figuras 14 y 15). Para ayudar a determinar la naturaleza de las interacciones entre CLk-H81 y CLk-V42, se calcularon las coordenadas x, y, z del centroide para el anillo de imidazol, seguido de la medición de la distancia entre el centroide calculado y el átomo de hidrógeno H8 del CLk-V42. Esta distancia de 2,9 A indica interacciones directas entre los electrones n en el anillo de imidazol y el hidrógeno HS de CL-V42. Por lo tanto, esta interacción parece influir fuertemente en el posicionamiento óptimo de CLk-H81 en el bolsillo y para el cambio de equilibrio tautomérico al tautómero NS. Por lo tanto, aunque no es esencial, la presencia de CLk-V42 ejerce una influencia positiva en la conjugación direccional. Estos análisis son confirmados por datos experimentales, en los que se encontró que la mutación CLk-V42A causaba una disminución en la velocidad de conjugación (Tabla 54). El modelado sugiere que es probable que CLk-V42I pueda ayudar a colocar el anillo de imidazol de CLk-H81 para favorecer la conjugación direccional, aunque la cadena lateral ligeramente más grande reducirá el tamaño del bolsillo de unión general. En muchas circunstancias, esta reducción del tamaño de bolsillo puede no tener un efecto apreciable en la mecánica de conjugación direccional. CLk-V42L también puede ayudar a colocar el anillo de imidazol CLk-H81.
CLk-D43
CLk-D43 se localiza en el bucle de CD. En el CLk nativo, CLk-D43 parece interaccionar con la cadena principal de CLk-H81 y CLk-K82, de modo que contribuye a la estabilidad proteica. No se identificaron enlaces de hidrógeno entre HS de c Lk-H81 y el grupo carboxílico de CLk-D43 en la estructura cristalina de CLk. Esto puede sugerir que CLk-D43 ejerce solo una influencia mínima sobre el equilibrio tautomérico de la forma catalíticamente activa de NS de CLk-H81. Sin embargo, el análisis experimental con mutantes 2.12.1.fx-[CLk-D43A] mostró que la mutación de este resto tenía un efecto inhibidor significativo sobre la conjugación direccional. Tomado junto con el modelo general, es probable que CLk-H81 alterne entre la forma catalíticamente activa y la inactiva, formando enlaces de H entre CLk-D43 y CLk-D77 cuando lo hace, y que la eliminación del resto CLK-D43elimina una de las fuerzas que empujan a CLk-H81 hacia el tautómero NS activo.
Los análisis de la estructura cristalina de CLk-D77A revelaron un enlace de hidrógeno bien definido entre el hidrógeno NS y el grupo carboxílico CLk-D43. Esto sugiere que uno de los efectos más significativos del mutante CLk-D77A es la estabilización de la forma tautomérica catalíticamente favorable de CLk-H81 NS, como se muestra en las Figuras 13 y 14. Finalmente, la proximidad de CLk-D a CLk-H permitiría que CLk-D participara en la reacción catalítica como receptor de un átomo de hidrógeno en la última etapa del mecanismo de reacción putativo (Esquema III). Por lo tanto, el papel de CLk-D43 en el CLk nativo y c Lk-D77A mutante, parece estar en la estabilización de la forma tautomérica N8 catalíticamente activa de CLk-H81 y la participación en la reacción catalítica como receptor del átomo de hidrógeno.
Los análisis de modelado sugieren fuertemente que la unión de la molécula de PFP en el CLk nativo está controlada por las formas tautoméricas de CLk-H81 y la afinidad de esta unión está, a su vez, controlada por el estado de la constante de equilibrio tautomérica. La presencia de la forma tautomérica NS permite que el par solitario en Ne ataque nucleofílico al carbonilo de PFP (Esquema III).
CLk-D43 está implicado en la reacción catalítica al ser un aceptor de iones de hidrógeno (Esquema III). CLk-D43 se mutó in silico a los 19 aminoácidos y en la serie final de mutantes calculados, la proteína WT (que comprende CLk-D43) crea la mayor energía de interacción con el complejo CLK-éster de PFP, habiéndose también predicho que CLk-D43N tiene una longitud de cadena similar y puede formar un enlace de hidrógeno con el NS de CLk-H81, ayudando así a la forma tautomérica catalíticamente activa NS de CLk-H81. Otros residuos que probablemente sean sustituciones aceptables son CLk-D43E, CLk-D43Q y CLk-D43S, pudiendo formar estos el enlace H deseado con CLk-H81, pero es probable que tengan longitudes de cadena demasiado grandes o pequeñas para tener un tamaño óptimo para la conjugación de CLk con PFP, pero pueden ser más adecuados para optimizar un dominio de inmunoglobulina que no es CLk para la conjugación direccional con PFP u optimizar un dominio de Ig para la conjugación con un éster de halo-fenilo diferente.
CLk-N44
CLk-N44 se localiza en el bucle de CD. Su cadena lateral está apuntando hacia afuera, lejos del bolsillo de unión de PFP, y parece no tener ningún papel, ni influencia, en la reacción de conjugación. Los cálculos QM/MM predijeron que los aminoácidos polares y aquellos con una cadena lateral cargada negativamente pueden mejorar la estabilidad de la proteína debido a las interacciones putativas con CLk-K41, también ubicado fuera del bolsillo.
CLk-L46
Una mutación CLk-L46A tuvo un impacto relativamente neutro en la velocidad de conjugación, según los datos experimentales, así como a partir de los cálculos QM/MM de los inventores. CLk-L46A se encuentra fuera del bolsillo de unión a PFP, pero puede facilitar la forma del bolsillo debido al tamaño de su cadena lateral. Al estar ubicado fuera del bolsillo, también puede interaccionar con los aminoácidos ubicados fuera del bolsillo. Las mutaciones en cadenas laterales grandes e hidrofílicas pueden aumentar la estabilidad de la proteína debido a la interacción con CLk-Q39 y respaldar la forma del bolsillo de PFP según los cálculos de QM/MM.
CLk-Q47
Una mutación CLk-Q47A mejoró la velocidad de conjugación. Esta mutación es probable que ejerza un efecto al aumentar el tamaño del sitio de unión a PFP, impactando de esta manera sobre la formación de complejos y la estabilidad de las proteínas de manera positiva según los cálculos de modelado. Los aminoácidos con cadenas laterales más grandes probablemente impactarán sobre la conjugación de una manera ligeramente negativa, de acuerdo con los cálculos de QM/MM. Por lo tanto, las mutaciones en CLk-Q47A, CLk-Q47G, CLk-Q47V, CLk-Q47I, CLk-Q47L, CLk-Q47T, CLk-Q47S, CLK-Q47N, CLk-Q47D, CLk-Q47H, CLk-Q47P o CLk-Q47E probablemente serán beneficiosas o neutras; mientras que las mutaciones en CLk-Q47W, CLk-Q47F, CLk-Q47Y o CLk-Q47K pueden tener un impacto algo negativo en la conjugación de PFP a un dominio CLk. Como antes, se entenderá que, en ciertas aplicaciones,, puede ser deseable reducir el tamaño del bolsillo; tal como cuando se usan halo-fenoles más pequeños como grupos Z1, o cuando la geometría precisa de un dominio de inmunoglobulina específico parece merecer tal característica.
CLk-S48
La mutación de CLk-S48A mejoró las velocidades de conjugación según los datos experimentales: el modelado sugiere que la razón de esto se debe probablemente al cambio de las propiedades electrostáticas del bolsillo. Los aminoácidos hidrofóbicos en esta posición probablemente tendrán un impacto positivo en la conjugación direccional. Por consiguiente, las siguientes mutaciones pueden verse especialmente favorecidas: CLk-S48A, CLk-S48G, CLk-S48V, CLk-S48I, CLk-S48L, CLk-S48P y CLk-S48M. Es probable que se toleren otras mutaciones.
Ejemplo 42 Mutaciones dobles y triples de CLk-D77A
El anticuerpo 2.12.1.fx se usó para evaluar el efecto de mutaciones adicionales en la región CLk. Como antes, la numeración de los restos depende de su ubicación dentro del CLk (SEQ ID NO: 6, por ejemplo). CLk-D43 y CLk-H81 se mutaron cada uno a Ala en el anticuerpo 2.12.1.fx-[CLk-D77A] para comprender los mecanismos de conjugación. Se generaron mutaciones en la cadena ligera de 2.12.1.fx siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene). Los anticuerpos 2.12.1.fx, 2.12.1.fx-[CLK-D77A] (CLk que comprende la SEQ ID NO: 37), 2.12.1.fx-[CLK-D43A] (CLk que comprende la SEQ ID NO: 15), 2.12.1.fx, 2.12.1.fx-[CLk-D43A/D77A] (CLk que comprende la SEQ ID NO: 127), 2.12.1.fx-[CLK-D77A/H81A] (CLk que comprende la SEQ ID NO: 128) y 2.12.1.fx-[CLK-D43A/D77A/H81A] (CLk que comprende la SEQ ID NO: 129) se expresaron de forma transitoria en células HEK 293 y se purificaron utilizando la columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
Los anticuerpos expresados se intercambiaron en tampón a acetato de sodio 20 mM, trehalosa 200 mM, a pH 5,5 a 20 mg/ml. A continuación, las soluciones de anticuerpo se enriquecieron con fosfato de sodio 60 mM a pH 7,7. Se resuspendió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] con 50 % de propilenglicol y se mezcló con el anticuerpo a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan múltiples sitios de conjugación de ABP separados por la diferencia de masa de un ABP. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de ABP se realiza midiendo la magnitud de la señal. Los resultados del % de CA se muestran en la Tabla 66.
Tabla 66 Análisis de conjugación intacta de 2.12.1.fx-[mutantes CLk] con ABP.
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El grado de la conjugación de ABP se examinó por separado en las cadenas ligera y pesada de 2.12.1.fx y 2.12.1.fx-[mutantes de CLk]. Los MAC se desnaturalizaron y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas (Tabla 67).
Tabla 67 Análisis de la conjugación reducida de las cadenas ligera y pesada de 2.12.1.fx-[mutantes CLk] con ABP. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 67.
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Estos resultados son consistentes con la hipótesis del tautómero de His. En el mutante CLk-D77A, CLk-D43 estabiliza el tautómero catalíticamente activo de CLk-H81, que a su vez permite que CLk-K80 sea más receptivo y reactivo a un éster de PFP. Por el contrario, en el mutante c Lk-D43A, CLk-D77 estabiliza el tautómero inactivo de CLk-H81, por lo tanto, conduce a una reducción en la conjugación direccional observada en CLk-K80. En el mutante doble CLk-D43A/D77A, no hay interacciones entre CLk-H81 y cualquiera de CLk-D43 o CLk-D77, y en consecuencia, el doble mutante actúa más como el CLK WT.
Ejemplo 43 Análisis de CLk de conejo
Ejemplo de referencia
La región kappa de LA cadena ligera de anticuerpo de conejo (rCLK) tiene la misma estructura tridimensional que la de otras inmunoglobulinas. rCLK tiene Asp en la posición 151 (número kabat), Ser en la posición 188 e His en 189, (rCLK-D43, rCLK-S80, rCLK-H81). Se postuló que un mutante rCLK-S80K puede crear el sitio de reacción para la conjugación direccional de PFP. Para validar esta hipótesis, se construyeron dos anticuerpos quimera de conejo trastuzumab. El mAb "rTrast" (trastuzumab de conejo) comprende los dominios VL y VH de trastuzumab (SEQ ID NO: 75 y 72, respectivamente) fusionadas a rCLK y a la cadena pesada constante de conejo (rCH) (SEQ ID NO: 130 y 131, respectivamente), para generar el rTrast-LC de longitud completa (SEQ ID NO: 132) y rTrast-HC (SEQ ID NO: 133).
rTrast-[rCLK-S80K] comprende los dominios VL y VH de trastuzumab (SEQ ID NO: 75 y 72, respectivamente) fusionadas a rCLK-S80K (SEQ ID NO: 134) y a la cadena pesada constante de conejo (rCH) (SEQ ID NO: 131), para generar rTrast-LC-[rCLK-S80K] (SEQ ID NO: 135) de longitud completa y rTrast-HC (SEQ ID NO: 133).
La cadena pesada y la cadena ligera kappa1 de IgG de conejo se sometieron a PCR a partir de los plásmidos pFUSE-CHIg-rG y pFUSE2ss-CLIg-rk1 (Invivogen) respectivamente, con los extremos solapantes con los dominios variables de trastuzumab y el vector. Las regiones VH y VL de trastuzumab se sometieron a PCR a partir de genes sintéticos con extremos solapantes con el vector y los dominios constantes de conejo. Se mezclaron las PCR con vector pCEP4 modificado con PCR (Invitrogen), se cortaron con BglII y Nhel siguiendo los protocolos descritos en el kit de clonación de Quick PCR (BPS Bioscience). El ADN insertado se confirmó mediante secuenciación de ADN. La mutación rCLK-S80K se generó siguiendo los protocolos descritos en Quick PCR Cloning Kit (BPS Bioscience). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se clonaron en un vector pCEP4 modificado (Invitrogen) cortado con BglII y Nhel. El ADN insertado se confirmó mediante secuenciación de ADN.
Los mAb quiméricos se expresaron transitoriamente en células HEK 293 y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS. Cada uno de los anticuerpos se intercambió con tampón a acetato de sodio 20 mM, trehalosa 200 mM a pH 5,5 a 20 mg/ml y se enriqueció con fosfato de sodio 60 mM, a pH 7,7. Se resuspendió [PFP-PEG5-K11-SEQ: 27] con 50 % de propilenglicol y se mezcló con el anticuerpo a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan múltiples sitios de conjugación de ABP separados por la diferencia de masa de un ABP. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de ABP se realiza midiendo la magnitud de la señal. El grado de conjugación de ABP se examinó a la luz de los anticuerpos. Los MAC se desnaturalizaron y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas (Tabla 68). Tabla 68 Conjugación intacta y análisis de la cadena ligera reducida de quimeras de conejo conjugadas con ABP.
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La mutación rCLK-S80K aumentó significativamente la conjugación total (0,61 a 1,657) y 1CA en la cadena ligera (38 % a 73 %). Este resultado sugiere que se puede crear un sitio de conjugación direccional en las cadenas de CLk de especies distintas del ser humano, siempre y cuando los restos críticos, CLk-K80H81, estén presentes en la inmunoglobulina. El % del % de 1-LC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna derecha, como se describe en la Tabla 68.
Ejemplo 44 Cadena Lambda
Ejemplo de referencia
Como se demostró en el E Jjemp 1lo 10 anterior, hCLA no A d Aemuestr /a c con Jjug * *ación A d iirecciona AOl con ésteres de PFP. hCLA comparte identidad de secuencia con hCLK en hCLK-D (CLA-D ) and hCLK-H (CLA-H ) y tiene serina en lugar de hCLK-K80 (CLA-S81). Se postuló que un mutante CLA-S81K puede permitir la conjugación de PFP en el resto CLA-S81K.
Comparando las estructuras cristalinas de CLk y CLA (Figuras 17 y 18), CLk-V42 se encuentra en la parte inferior del bolsillo de unión a PFP putativo, mientras que el residuo correspondiente en CLA es CLA-A44. Como se ha analizado anteriormente, las mutaciones CLk-V42A tienen un impacto negativo en la conjugación direccional, probablemente debido a la capacidad de CLk-V42 para estabilizar la orientación del anillo de imidazol de CLk-H81. El modelado sugirió que una mutación CLA-A44V debería ejercer un efecto similar sobre CLA-H82.
Como en el Ejemplo 10 y los Ejemplos 15-17, se usó un anticuerpo monoclonal anti-IL22 humano (hIL22) como CLA de ejemplo que comprende un anticuerpo. hIL22 comprendía las SEQ ID NO: 136 y 137 (hIL22-LC y hIL22-HC, respectivamente), y la cadena ligera variable que comprende la SEQ ID NO: 138 (hIL22-CLA-VL).
Se generaron varias versiones mutantes de hIL22, para evaluar los efectos de varias mutaciones de CLA en la conjugación direccional. Todos los anticuerpos mutantes de hIL22 comprendían la SEQ ID NO: 137 (hIL22-HC) y la SEQ ID NO: 138 (hIL22-CLA-VL).
hIL22-[LKJ] comprendía el intercambio A/k como se describe en el Ejemplo 15 y comprendía una CL de SEQ ID NO: 61.hIL22-[CLA-S81Kl comprendía el intercambio de restos individuales de CLA-S81K, y comprendía la SEQ ID NO: 140. hIL22-[CLA-Q78A/s 81K] comprendía una doble mutación en el bucle, y comprendía la SEQ ID NO: 141. hIL22-[CLA-A44V/S81K] comprendía el intercambio de restos CLA-S81K y también una mutación CLA-A44V en el fondo del "bolsillo de unión", y comprendía la SEQ ID NO: 142. hIL22-[CLA-A44V/Q78A/S81K] comprendía ambas mutaciones de bucle CLA-Q78A y CLA-S81K, así como la mutación CLA-A44V del "bolsillo de unión", y comprendía la SEQ ID NO: 143. Todas las mutaciones puntuales se generaron en hIL22-LC siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron mediante secuenciación de ADN.
hIL22-[CLA-A76'84/145] comprendía la inserción de la SEQ ID NO: 145 en lugar del bucle de CLA E-F, ubicado desde CLA-P76, incluidos hasta ClA-S83. La SEQ ID NO: 145 comprende la secuencia KAAYEKHKV, que corresponde al bucle [CLk-D77A] E-F (es decir, entre las cadenas p E y F) desde [CLk-D77A]-K75 incluida hasta [CLk-D77A]-K82 incluida.
hIL22-[CLA-A76'84/145] se generó mediante PCR por solapamiento. Las mutaciones fueron introducidas por los cebadores oligonucleotídicos. El cebador específico para el extremo 5' de hIL22-LC emparejado con un cebador inverso que codifica la SEQ ID NO: 145 y un cebador directo que codifica la SEQ ID NO: 145, emparejado con el cebador inverso específico del extremo 3' de IL22-LC se usaron para amplificar por PCR fragmentos de ADN portadores de un bucle de CLk E-F usando IL22-LC como molde. Estos dos productos de PCR se mezclaron como moldes; El cebador directo de IL22-LC y el cebador inverso se usaron en la reacción de PCR por solapamiento para amplificar el ADN de IL22-LC de longitud completa con la SEQ ID NO: 145. A continuación, la PCR se digirió usando las enzimas de restricción Bsal y Nhel. La PCR digerida se ligó con un plásmido pCEP4 modificado (Invitrogen) cortado con BglII y Nhel.
Los mAb mutados se expresaron transitoriamente en células HEK 293, y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
Cada uno de los anticuerpos se intercambió con tampón a acetato de sodio 20 mM, trehalosa 200 mM a pH 5,5 a 20 mg/ml y se enriqueció con fosfato de sodio 60 mM, a pH 7,7. Se resuspendió [PFP-PEGs-K11-SEQ: 27] con 50 % de propilenglicol y se mezcló con el anticuerpo a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y el grado de conjugación de ABP se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos. Los MAC se desnaturalizaron y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada una de ellas (Tabla 69).
Tabla 69 Análisis de la conjugación reducida de la cadena ligera de lambda del anticuerpo y los mutantes.
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Una única mutación puntual CLA-S81K habilitó la conjugación de PFP con CLA. El % de 1CA de LC aumentó de 0 % a 31 % en el mutante CLA-S81K en comparación con el hIL22 no mutado, con más adiciones de conjugación que aparentemente se producen en el sitio de conjugación recién creado que en cualquier otro sitio único en el anticuerpo. Los estudios de mapeo peptídico confirmaron que los acontecimientos de conjugación se estaban produciendo en CLA-S81K (Tabla 70).
Tabla 70 Descripción general de los estudios de mapeo peptídico en hIL22-[CLA-S81K] -CL.
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Haciendo referencia de nuevo a la Tabla 69, la combinación de las mutaciones en CLA-S81K and CLA-A44V (hIL22-[CLA-A44V/S81K]) aumentó aún más el 1CA de la cadena ligera al 52 %.
De forma interesante, mientras que la mutación doble CLA-Q A/CLA-S K mejoró la conjugación de CLA-S K en comparación con WT CLA (1CA de 0 % a 11 %), la mejora fue menos pronunciada que la observada en el mutante único CLA-S81K. Esto se correlaciona bien con el modelo: el efecto de mutar CLk-D77 es eliminar el enlace de hidrógeno entre CLk-D y CLk-H permitiendo que CLk-H revierta a la forma N8 catalíticamente tautomérica. La posición correspondiente a CLk-D77 es CLA-Q78, lo que sugiere tanto el modelado como el análisis mutacional no tendrían un efecto limitante en CLA-H82 En conjunto, esto sugiere que el efecto de disminución de CLA-Q78A en la conjugación direccional está probablemente causado por una alteración en el tamaño y la forma del bolsillo de unión. Lo más sorprendente, sin embargo, fue el resultado de la mutación triple CLA-A V/Q A/S K. La conjugación direccional medida por el % de 1CA aumentó al 70 %; alcanzando niveles típicamente vistos en los dominios de CLk nativos.
Estos resultados y análisis se confirmaron por el nivel similar de conjugación direccional visto en el intercambio de bucle (hIL22-[CLA-A76'84/145]).
En general, estos datos sugirieron que la mutación CLA-Q78A mejora la direccionalidad de la conjugación de CLA-S81K, siempre que el tamaño y la forma del bolsillo de la unión estén adaptados para el grupo Z específico utilizado. Además, los resultados de los mutantes CLA sugirieron que se pueden crear sitios de conjugación direccional en inmunoglobulinas distintas de CLk, siempre que el motivo Kh esté presente en la ubicación 3D correcta. Naturalmente, el bolsillo de unión debe ser de tamaño y forma adecuados para acomodar el éster de halo-fenilo específico empleado y, como se demuestra en el presente documento, características adicionales, tales como la presencia o ausencia de restos correspondientes a CLk-V42, CLk-D43, y CLk-D77 puede tener efectos significativos sobre la velocidad y la optimización de la conjugación direccional del motivo KH en relación con el dominio de inmunoglobulina específico y el éster de halofenilo. Mientras que PFP se usó en estos ejemplos, será evidente que se pueden seleccionar otros grupos Z con niveles aceptables de conjugación direccional y utilizando técnicas racionales de modelado, se puede obtener un equilibrio entre el grupo Z deseado, el tamaño del bolsillo de unión y las mutaciones específicas requeridas para mantener un bolsillo de unión activo.
Ejemplo 45 Recreación de los sitios de conjugación de PFP en los dominios CH
Ejemplo de referencia
Los dominios CH de los anticuerpos también comprenden estructuras de inmunoglobulina. Antes de modelar los dominios como se describe en los Ejemplos 40 y 41, se postuló que mover el motivo de conjugación a la porción de bucle EF de la cadena de conexión de EF de otros dominios Ch puede permitir la conjugación direccional. Una alineación de secuencia del CHyI (SEQ ID NO: 147), CHy2 (SEQ ID NO: 155), CHy3 (SEQ ID NO: 158), Los dominios CLk (SEQ ID NO: 6) y CLA (SEQ ID NO: 57) se muestran en la Figura 16.
Se realizaron dos versiones mutantes en el dominio CH1.
En hCHY1-m1, la secuencia LGTQT (SEQ ID NO: 152), que corresponde a los restos L76-T80 de la SEQ ID NO: 147, se eliminó y se reemplazó por EKHKV (SEQ ID NO: 153), que corresponde a E79-V83 de CLk. El mutante resultante, hCHY1-m1, comprendía la Se Q ID NO: 148.
En CHY1-m2, la secuencia LGTQT (SEQ ID NO: 152), que corresponde a los restos L76-T80 de la SEQ ID NO: 147, se eliminó y se reemplazó por YEKHKV (SEQ ID NO: 154), que corresponde a Y78-V83 de CLk-. El mutante resultante, hCHY1-m2, comprendía la SEQ ID NO: 150. El resto Y adicional se incorporó para permitir que la secuencia hCHY1-m2 se alinee mejor con la secuencia de CLk.
La alineación de secuencias indicó que hCHY1 carece de un resto Asp correspondiente a CLk-D43. En consecuencia, se generaron dos mutantes adicionales; en los que cada uno de hCHY1-m1 y hCHY1-m2 se sometieron a una mutación de inserción adicional de un resto Asp entre CHy1-S43 y CHy1-G44, creando los dos nuevos mutantes de hCHY1-m1-D44 (SEQ ID NO: 149) y hCHY1-m2-D44 (SEQ ID NO:151).
Se generó una versión mutante de hCHY2 (SEQ ID NO:155), en la que los restos N85G86 de la SEQ ID NO:155 se sustituyeron con KH para generar hCHY2-m (SEQ ID NO:156). La alineación de secuencias sugirió que hCHY2 (SEQ ID NO:155) comprendía un resto de Asp (D50 en una ubicación que puede corresponder a CLk-D43).
Se generó una versión mutante de hCHY3 (SEQ ID NO:157), en la que los restos Q79G80 de la SEQ ID NO:157 se sustituyeron con KH para generar hCHY3-m (SEQ ID NO:158). La alineación de secuencias sugirió que hCHY3 (SEQ ID NO:155) comprendía un resto de Asn (N44) en una ubicación que puede corresponder a CLk-D43 Trastuzumab se usó como modelo DE Ab en el estudio. Todos los mutantes DE hTrast-CHY se expresaron con una mutación [CLk-K80A], de modo que los eventos de conjugación se producirían, preferentemente, en el dominio CHy de prueba. La mutación hTrast-LC-[CLk-K80A] (SEQ ID NO:146) se generó siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene).
Las mutaciones en los dominios CHy se generaron usando PCR por solapamiento. Las mutaciones fueron introducidas por los cebadores oligonucleotídicos. El cebador específico para el extremo 5' de HC de trastuzumab emparejado con un cebador inverso portador de la mutación deseada y un cebador directo portador de la mutación deseada emparejada con el cebador inverso específico para el extremo 3' de HC de trastuzumab se usaron para amplificar por PCR los fragmentos de ADN usando HC de trastuzumab como molde. Estos dos productos de PCR se mezclaron como moldes; el cebador directo de la cadena pesada de trastuzumab y el cebador inverso se usaron en la reacción de PCR por solapamiento para amplificar el ADN HC de trastuzumab de longitud completa con las mutaciones deseadas. A continuación, la PCR se digirió usando las enzimas de restricción Bsal y Nhel. La PCR digerida se ligó con un plásmido pCEP4 modificado (Invitrogen) cortado con BglII y Nhel.
El anticuerpo trastuzumab portador de mutaciones se expresó transitoriamente en células HEK 293 y se purificó usando una columna de afinidad de proteína A. Los mAb purificados se caracterizaron usando MS.
Los anticuerpos expresados se intercambiaron en tampón a acetato de sodio 20 mM, trehalosa 200 mM, a pH 5,5 a 20 mg/ml. Las proteínas se enriquecieron a continuación con fosfato de sodio 60 mM a pH 7,7. Se resuspendió ABP con 50 % de propilenglicol y se mezcló con la proteína a una relación molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta mediante cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-MS) para determinar el número y la cuantificación de las formas conjugadas de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma de proteína; se observan múltiples sitios de conjugación de ABP separados por la diferencia de masa de un ABP. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación de ABP se realiza midiendo la magnitud de la señal.
Tabla 71 Análisis de conjugación intacta del anticuerpo hTrast y mutantes del dominio CHy.
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El grado de conjugación de ABP se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas de trastuzumab y mutantes de trastuzumab. El producto de MAC se desnaturalizó y los enlaces disulfuro se redujeron usando hidrocloruro de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando LCMS para determinar el perfil de conjugación en cada cadena (Tabla 72).
Tabla 72 Análisis de la conjugación reducida de la cadena ligera del anticuerpo hTrast y los dominios mutantes CHy.
El % de % del % de 1-HC relativo al ciclo de WT respectivo se muestra en la columna de la derecha, como se describe en la Tabla 53, aunque en este ejemplo, hTrast-[CLK-K80A] HC 1CA se tomó como la figura de WT.
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(continuación)
Figure imgf000159_0001
La conjugación total en hTrast-[CLK-K80A]/CHYl-m1 y hTrast-[CLK-K80A]/CHYl-m2 aumentó en comparación con hTrast-[CLK-K80A], de 0,66 CA a ~ 1CA; y el 1CA de HC de estos dos mutantes aumentó de 21 % a 31 % y una mejora de aproximadamente 150 %. Esto apoya la hipótesis de que la conjugación direccional se puede introducir en dominios de inmunoglobulina distintos de CLk y CLA mediante la introducción del motivo KH.
La conjugación total en hTrast-[CLK-K80A]/CHY2m también aumentó, pero en un grado menor que el de los mutantes de CHy1. Una comparación de las secuencias de las secuencias CHyI y CHy2 muestra que en el resto correspondiente a c Lk-D77, CHv1 comprende Ser y CHy2 comprende Asp. Esto podría sugerir que una mutación similar a las mutaciones CLk-D77 en dominios CHy2 podría mejorar el grado de conjugación.
Además, la mejora en la conjugación en CHy3 HC, aunque es evidente, también fue modesto en comparación con los mutantes del dominio CHy1. La secuencia del dominio CHy3 parecía comprender Arg en una posición correspondiente a CLk-D77, y Ser en una posición correspondiente a CLk-D43.
Además, la conjugación del % de CA de HC tanto para hTrast-[CLK-K80A]/CHYl-m1-D44 como para hTrast-[CLK-K80A]/CHy1-t i2-D44 mostró un resultado muy sorprendente, en que el aumento aparente en la conjugación observado tanto en hTrast-[CLK-K80A]/CHYl-m1 como en hTrast-[CLK-K80A]/CHYl-m2 pasó de aproximadamente 150 % de WT a solo aproximadamente 114 % de WT.
Una hipótesis explicativa sugiere que la alineación de la secuencia de la Figura 17 puede no alinear con precisión los respectivos restos según donde se encuentren en una estructura 3D de inmunoglobulina.
Ejemplo 46 Modelado del pliegue de inmunoglobulina
Ejemplo de referencia
Por consiguiente, las coordenadas de la estructura cristalina para los dominios hCHY1, hCHY2 y hCHY3 se obtuvieron en el "Banco de Datos de Proteínas", mantenido por Rutgers, Universidad Estatal de Nueva Jersey, Centro de Investigación Proteómica Integral, el Centro de Supercomputación de San Diego (SDSC) y la Escuela Skaggs de Farmacia y Ciencias Farmacéuticas, San Diego. La estructura de hCHA1 se basa en la estructura de rayos X de 3dv, disponible en el "Banco de Datos de Proteínas". La estructura de hCHA2 se basa en la estructura de rayos X de 2dts disponible en el "Banco de Datos de Proteínas". La estructura de hCHA3 se basa en la estructura de rayos X de 2dts disponible en el "Banco de Datos de Proteínas". La estructura de hCLA se basa en la estructura de rayos X de 4fqh disponible en el "Banco de Datos de Proteínas".
Se generó una alineación de homología, que alinearon las secuencias de acuerdo con la estructura (Figura 17). Las comparaciones de la estructura cristalina de CLk y hCHY1-m1 (Figura 19) mostraron que la cadena de conexión hCHY-CD comprendía una a-hélice corta. El modelado sugirió que esta a-hélice CD presenta la inserción de S43 nativo y hTrast-[CLK-K80A]/CHY1-m1-D44 Asp con cadenas laterales que se extienden lejos del bolsillo de unión (Figuras 20 y 21), y que la adición de CHy1-D44 aumenta el tamaño y amplía la a-hélice CD. Además, el modelo sugiere que el resto CHy1-Q79H no está en la orientación plana óptima, lo que reduce su capacidad de participar en la reacción entre PFP y el CHy1-T78K adyacente (Figura 21).
Una comparación de los dominios CLk y CHy1-it i1-D44 de la Figura 22 sugiere que la forma del bolsillo puede optimizarse eliminando a-hélice CD en la cadena de conexión de CD, y reemplazándola con una estructura de bucle. En consecuencia, se modela y minimiza un dominio CHy1 mutante, SEQ ID NO: 165. La SEQ ID NO: 165 comprende la mutación doble CHy1-T84K/Q79H del CHy1-t i1 mutante, así como la sustitución de la cadena de conexión de CHyI CD de CHy1-N42 incluido hasta CHy1-L46 incluyendo con KVDNALA (SEQ ID NO: 166); La SEQ ID NO: 166 corresponde a los restos del dominio CLk (SEQ ID NO: 6), con un resto de Ala adicional añadido. Los resultados de modelado que se muestran en la Figura 22 sugieren que CHy1-Q79H ocupa una orientación más plana, con la ayuda del resto de Val introducido en la cadena de conexión del CD. La mutación de este residuo a Leu o Ile puede proporcionar una mayor estabilización al anillo de imidazol, debido a que las cadenas laterales más largas pueden cerrar el hueco aumentado al resto H, con respecto a la distancia en el CLk nativo. Significativamente, el modelo coloca el resto de Asp adyacente en una orientación y distancia adecuadas desde CHy1-Q79H para favorecer la forma 8-tautomérica, y estimular una mayor reactividad de CHy1-T78K.
Se realizó un modelado similar en los dominios CHy2 y CHy3. La Figura 24 compara los restos de WT clave de CLk y CHy2. Mientras CHy2-D49 y CHy2-D50 parecen estar en la posición y orientación correctas para ayudar a la conjugación direccional, CHy2-D82 ocupa una posición aún más cercana a CHy2-G86H en el modelo 3D, por lo tanto, favorece la forma £-tautomérica y reduce la reactividad de CHy2-N85K. Este modelo sugiere que el resto CHy2-D82 puede explicar el aumento relativamente bajo de la conjugación direccional que se observa en el mutante CHY2m. La Figura 26 ilustra un modelo minimizado de un mutante propuesto para CHy2: que comprende las mutaciones CHy2-D82A/N85K/G86H (SEQ ID NO: 167). Se ve una diferencia inmediata: el anillo de imidazol aparece en una orientación más plana y dentro de una distancia adecuada a CHy2-D50 para sesgar la formación del tautómero 8 y la mutación CHy2-D82A ha abierto el bolsillo de unión, lo que probablemente conduzca a una reducción de la inhibición estérica del acceso a PFP.
Las Figuras 27-29 muestran las correspondientes comparaciones de CLk con CHy3 WT y CHY3m mutante. El modelo sugiere que a pesar de no haber restos que desvíen al CHy3-G80H hacia la forma £-tautómero, la disponibilidad de CHy3-Q79K para conjugarse probablemente esté impedida estéricamente por la larga cadena lateral de CHy3-R76. La Figura 30 ilustra un modelo minimizado de un primer mutante propuesto para CHy3: hCH3Ym-CD1/EF, que comprende las mutaciones CHy3-S43V/N44D/R76A/Q79K/G80H (SEQ ID NO: 168). La diferencia del modelo se puede observar fácilmente en la Figura 30B: la disponibilidad del bolsillo de unión se ha abierto, y se ha reducido la interferencia estérica en la Lys reactiva.
Desde las distancias de la cadena lateral en la estructura modelada de la Figura 30B, es poco probable que CHy3-S43V o CHy3- N44D interaccionen con CHy3-G80H en la misma medida que los restos correspondientes en CLk. En consecuencia, un segundo mutante propuesto para CHy3 también se minimizó y modeló: hCH3Ym-CD2/EF, que comprende las mutaciones CHy3- S43L/N44E/R76A/Q79K/G80H (SEQ ID NO: 169). La introducción de restos adecuados en la cadena de conexión de CD con cadenas laterales más largas (CHy3-S43L en lugar de CHy3-S43V, y CHy3-N44E en lugar de CHy3-E44D) se modela de modo que tenga un bolsillo de unión con mayores similitudes de estructura con la de CLk ( Figura 31) y una mayor probabilidad de enlaces de hidrógeno entre CHy3- N44E y CHy3-G80H que entre CHy3- N44D y CHy3-G80H.
Las secuencias de los dominios CHy y los mutantes se alinearon con CLk y CLA (Figura 32).
La invención, por lo tanto, se ha desvelado ampliamente e ilustrado en referencia a las realizaciones representativas descritas anteriormente.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que, en aras de la claridad, se han descrito en el contexto de realizaciones separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una única realización. Por el contrario, varias características de la invención que, por brevedad, se han descrito en el contexto de una única realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada.
Se contempla específicamente que cualquier limitación tratada con respecto a una realización de la invención se puede aplicar a cualquier otra realización de la invención. Además, cualquier composición de la invención se puede usar en cualquier procedimiento de la invención, y cualquier procedimiento de la invención se puede usar para producir o utilizar cualquier composición de la invención. En particular, cualquier aspecto de la invención descrito en las reivindicaciones, solo o en combinación con una o más reivindicaciones y/o aspectos adicionales de la descripción, debe entenderse que puede combinarse con otros aspectos de la invención expuestos en otra parte en las reivindicaciones y/o descripción y/o listados de secuencias y/o dibujos
En la medida en que los ejemplos específicos encontrados en el presente documento no entran dentro del ámbito de una invención, dicho ejemplo específico puede rechazarse explícitamente.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para decir "y/o", a menos que se indique explícitamente que se refiera solo a alternativas o que la alternativa sea mutuamente excluyente, aunque la divulgación respalda una definición de que se refiere solo a alternativas y "y/o". Como se usa en el presente documento, la especificación, "un" o "uno/una" pueden significar uno o más, a menos que se indique claramente lo contrario. Como se usa en el presente documento en la reivindicación o reivindicaciones, cuando se utiliza junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "uno/una" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más. A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden los expertos en la técnica de forma habitual. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluyen pluralidades y los términos en plural incluyen el singular. Las palabras "comprende/que comprende" y las palabras "que tiene/que incluye", cuando se usan en el presente documento con referencia a la presente invención, se usan para especificar la presencia de características indicadas, números enteros, etapas o componentes, pero no excluyen la presencia o adición de una o más de otras características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos.
Tabla 73
Figure imgf000161_0001
(continuación)
Figure imgf000162_0001
(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende un dominio kappa de cadena ligera constante de un anticuerpo humano (CLk) que comprende los restos K y H en posiciones correspondientes a las posiciones 80 y 81 de la SEQ ID NO: 6 cuando dicho dominio kappa de cadena ligera constante del anticuerpo humano está alineado con la secuencia de SEQ ID NO: 6, y
caracterizado porque el dominio kappa de cadena ligera constante del anticuerpo humano comprende además un resto seleccionado del grupo que consiste en A, G, I, V, L, R, S, T, Q, P, N, M, H, W en una posición correspondiente a la posición 77 de la SEQ ID NO: 6.
2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el resto en una posición correspondiente al resto 77 de la SEQ ID NO: 6 se selecciona de entre
(i) el grupo que consiste en A, G, I, L, R, S, T, P, N y M; o
(ii) el grupo que consiste en A, G, I, L, S, T, P y M; o
(iii) el grupo que consiste en A, G, S, T, P o M.
3. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el dominio kappa de cadena ligera constante del anticuerpo humano está conectado a un dominio variable de anticuerpo.
4. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo £-amino de la cadena lateral de K que está localizado en una posición correspondiente al resto 80 de la SEQ ID NO: 6 está unido covalentemente a un enlazador y en el que el enlazador comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en X -Y -Z , X -O-Y -Z , y X -Y -O-Z, en las que O es un grupo escindible, X es un grupo que se puede unir covalentemente al menos a un resto efector, Y1 es una cadena de conexión lineal o ramificada y Z está covalentemente conectada al grupo £-amino de la cadena lateral de K que está situada en una posición correspondiente al resto 80 de la SEQ ID NO: 6 y en el que el resto efector es un agente terapéutico agente, proteína, péptido, ácido nucleico, aptámero, hormona, toxina, factor de crecimiento o agente de diagnóstico.
5. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el grupo escindible O está presente y tiene la fórmula
Figure imgf000339_0001
en la que la línea ondulada y la línea paralela indican cada una un punto de unión al grupo X1, Y1 o Z1 según sea adecuado.
6. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que el enlazador se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000340_0001
Figure imgf000341_0002
en las que m, n, j y k son cada uno independientemente un intervalo cuyos límites inferiores se seleccionan del grupo que consiste en 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y cuyo límite superior se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, y en el que la longitud total del enlazador no supera los 200 átomos y opcionalmente no supera los 60 átomos de longitud.
7. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el resto efector es una toxina que comprende fórmula:
Figure imgf000341_0001
o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en el que, independientemente, cada vez que está presente,
W2 es
Figure imgf000342_0001
R11 es
Figure imgf000342_0002
Y2 es -alquileno C2-C20-, -heteroalquileno C2-C20; -carbociclo -C3-C8-, -arileno-, -heterociclo C3-C8-, -alquileno C1-C10-arileno-, -arileno-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(carbociclo C3-C8)-, -(carbociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-, -alquileno C1-C10-(heterociclo C3-C3)- o -(heterociclo C3-C8)-alquileno C1-C10-;
Z2 es
Figure imgf000342_0003
R1123A es hi 1d3rBógeno, alquilo C1-C8 o haloalquilo C1-C8;
R y R son cualquiera de los siguientes:
(i) R13A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo, aralquilo o halógeno; y
R13B es alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo o halógeno; o
(ii) R y R tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R 14A y R 14B son cualquiera de los siguientes:
(i) R14A es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; y
R14B es hidrógeno, alquilo C1-C8, haloalquilo C1-C8, carbociclilo C3-C8, heterociclilo C1-C10, arilo, heteroaralquilo o aralquilo; o
(ii) R y R tomados juntos son alquileno C2-C8 o heteroalquileno C1-C8;
R15 es
Figure imgf000343_0001
heterociclilo C1-C10, carbociclilo C3-C8 y arilo C6-C14 opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en -alquilo C1-C8 -alquilo C1-C8-N(R')2, -alquilo C1-C8-C(O)R', -alquilo Cr C8-C(O)OR' -O-(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R' y -SR', en las que cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8 y arilo no sustituido, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10;
o R15 está
Figure imgf000343_0002
opcionalmente sustituido con 1,2, 3, 4 o 5 grupos seleccionados independientemente del grupo que consiste en alquilo C1-C8, -alquilo C1-C8-N(R')2, -alquilo C1-C8-C(O)R', -alquilo C1-C8-C(O)OR', -O(alquilo C1-C8), -C(O)R', -OC(O)R', -C(O)OR', -C(O)N(R')2, -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH,
halógeno, -N3, -N(R')2, -CN, -NHC(=NH)NH2, -NHCONH2, -S(=O)2R', -SR' y arileno-R', en las que cada R' se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C1-C8, heterociclilo C1-C8, alquileno C1-C10-heterociclilo C3-C8 y arilo, o dos R' pueden, junto con el nitrógeno al que están unidos, formar un heterociclilo C1-C10;
R156 *20es hidrógeno, -alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8 o haloalquilo C1-C8;
R22 es hidrógeno, alquilo C1-C4, heterociclilo C1-C10 o arilo C6-C14;
R23 es heterociclilo C1-C10; y
R se selecciona independientemente cada vez que está presente entre el grupo que consiste en F, Cl, I y Br;
R20 es -arilo, -alquileno C1-C10-arilo, en el que arilo en R 10 que comprende arilo está sustituido con [R 17 ]h; h es 5; y
X es O o S;
con la condición de que cuando R13A es hidrógeno, X es S; y en la que el resto efector puede seleccionarse del grupo que consiste en
Figure imgf000344_0001
8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el al menos un resto efector está presente y es una proteína o péptido, y en el que el grupo X1 del enlazador está unido covalentemente al extremo amino, al extremo carboxilo o a la cadena lateral de un resto de unión a péptido en la proteína o péptido, y en el que, opcionalmente, el resto de unión a péptido se selecciona del grupo que consiste en K, R, C, T, Y, S, ácido diaminopropiónico, ácido diaminobutírico y
Figure imgf000345_0001
9. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho CLk comprende
una porción N-terminal definida por la SEQ ID NO: 225 y una porción en C' terminal definida por la SEQ ID NO: 226
conectada contiguamente juntas por una secuencia intermedia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID
NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116,
SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID
NO: 170, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176,
SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID
NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189,
SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID
NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202,
SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, SEQ ID
NO: 209, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215,
SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID
NO: 222, SEQ ID NO: 223 y SEQ ID NO: 224.
10. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende una secuencia
seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID
NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO:
129, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143,
SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 156, SEQ ID
NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167,
SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, SEQ ID
NO: 240, SEQ ID NO: 241 y SEQ ID NO: 254, o un polipéptido al menos aproximadamente un 85 % idéntico al
mismo.
11. Una composición que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-10, en
la que al menos aproximadamente el 70 % del enlazador en la composición o muestra está conjugado al grupo £-amino de la cadena lateral de K que está situada en una posición correspondiente al resto 80 de la SEQ ID NO: 6.
12. Una composición que comprende múltiplos del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
4-10, en la que al menos aproximadamente el 70 % de los polipéptidos comprende un enlazador unido
covalentemente al grupo £-amino de la cadena lateral de K que está situada en una posición correspondiente al resto
80 de la SEQ ID NO: 6.
13. Un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo comprende el polipéptido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y en el que el anticuerpo es un anticuerpo de longitud
completa, Fab, Fab', F(ab')2, Vh, diacuerpo o minicuerpo,
14. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el anticuerpo comprende los dominios VH y VL de un
anticuerpo seleccionado de entre el grupo que consiste en h38C2, rituximab, cetuximab, infliximab, adalimumab,
natalizumab, omalizumab, ranibizumab, trastuzumab y palivizumab.
15. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 o un anticuerpo
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, que comprende además un vehículo aceptable.16789
16. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o un
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-14.
17. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16.
18. Un vector que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16.
19. Un procedimiento de preparación de un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC) que comprende un
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-10 o una composición de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 11-12, que comprende unir covalentemente el enlazador a un grupo saliente Z* de fórmula:
Figure imgf000346_0001
en la que R1 es F o Cl, h = 2, 3, 4 o 5 y hacer reaccionar el grupo enlazador-Z* con el polipéptido.
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