ES2700404T3 - Uso de TM9SF4 como biomarcador para exosomas asociados a tumores - Google Patents

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Antonio Chiesi
Paolo Guazzi
Natasa Zarovni
Pietro Ferruzzi
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Abstract

Método para determinar in vitro la presencia de un tumor en un sujeto, comprendiendo tal método: a) proporcionar una muestra biológica obtenida a partir de ese sujeto, b) aislar vesículas extracelulares a partir de la muestra, en el que esta etapa de aislamiento de vesículas extracelulares comprende el aislamiento de vesículas extracelulares positivas a TM9SF4, c) determinar, a partir de las vesículas extracelulares aisladas en la etapa b), el nivel o la presencia de un biomarcador adecuado, y d) comparar el nivel o la presencia del biomarcador determinado en la etapa c) con uno o más valores de referencia, caracterizado porque las vesículas extracelulares positivas para TM9SF4 se aíslan a través de la unión a un anticuerpo anti-TM9SF4.

Description

DESCRIPCIÓN
Uso de TM9SF4 como biomarcador para exosomas asociados a tumores.
La presente invención se refiere a biomarcadores de microvesículas extracelulares para la determinación del estado de transformación tumoral o la presencia de un tumor en un sujeto, y a los usos de tales biomarcadores y a métodos de diagnóstico usando tales biomarcadores.
Antecedentes de la invención
Al contrario que los tumores malignos (o cancerosos), los tumores benignos son normalmente masas de células que carecen de la capacidad para invadir el tejido circundante o para metastatizar. Además, los tumores benignos tienen generalmente una velocidad de crecimiento más lenta que los tumores malignos y las células tumorales están habitualmente más diferenciadas.
Aunque la mayor parte de los tumores benignos no son potencialmente mortales, muchos tipos de tumores benignos tienen el potencial para volverse cancerosos (malignos) a través de un proceso conocido como transformación tumoral.
El cáncer no metastásico (primario o recurrente) es un cáncer que no se ha diseminado a partir del sitio primario (lugar donde se inició) a otros lugares en el cuerpo.
El cáncer metastásico es un cáncer que se ha diseminado desde la parte del cuerpo donde inició (el sitio primario) a otras partes del cuerpo.
El desarrollo de neurofibromas benignos a menudo puede estar vinculado una mutación del gen supresor de tumores NF1 en células del linaje de células de Schwann1-3. Estas neoplasias pueden experimentar frecuentemente una transformación adicional a tumores malignos de la vaina nerviosa periférica (MPNST)1-3. Actualmente está poco claro qué tipos celulares son particularmente susceptibles a la formación de MPNST, cuáles son los cambios moleculares que provocan el desarrollo de MPNST a partir de los neurofibromas o qué otros factores en el entorno tumoral podrían contribuir a la neoplasia. Además, se observan gliomas, particularmente astrocitomas pilocíticos del nervio óptico, y leucemias, con frecuencia aumentada en la población con NF13.
Los MPNST tienen un pronóstico muy malo dado que no responden a la quimioterapia o radioterapia convencional, y tienen una elevada propensión a metastatizar4-7. Los pacientes con NF1 y sus familias son muy conscientes de estos hechos, lo cual es el porqué de que el desarrollo de un MPNST sea la complicación más temida por los pacientes que padecen esta enfermedad8. Sin embargo, la detección temprana a menudo se ve dificultada por el hecho de que los MPNST se desarrollan frecuentemente dentro de grandes neurofibromas preexistentes, lo que hace que el nuevo crecimiento o progresión sea difícil de detectar y distinguir, incluso con MRI. Este retraso en el diagnóstico probablemente es la causa del mal desenlace de MPNST en NF1 con respecto a sus homólogos esporádicos. Esto constituye el mayor impulso para la identificación de alteraciones moleculares que puedan detectarse de manera no invasiva y sean indicativas del inicio y la progresión de MPNST en pacientes con NF1, que serían útiles en el examen y diagnóstico temprano, así como en la monitorización de la enfermedad o el desenlace terapéutico en la práctica preclínica y clínica.
Se acepta generalmente que existen múltiples subtipos de neurofibromas que difieren en su ubicación y patrón de crecimiento, su asociación con NF1 y su potencial para la transformación maligna. Muchos investigadores en ciencia clínica y básica clasifican ampliamente los neurofibromas como variantes o bien dérmicas o bien plexiformes1. Los neurofibromas plexiformes son variantes de neurofibromas que se producen casi exclusivamente en pacientes con NF1 y se cree que son congénitos; se distinguen de los neurofibromas intraneurales localizados por su patrón de crecimiento plexiforme característico. Los neurofibromas plexiformes tienen el riesgo más alto de transformación maligna a m PnST1.
De manera similar a la transformación de los neurofibromas a MPNST, otros tumores benignos tienen el riesgo de transformarse en sus homólogos malignos. Este es el caso, por ejemplo, de la hiperplasia prostática benigna (BPH) a cáncer de próstata, pólipos de colon a cáncer colorrectal, nevos benignos a melanoma, estados de mama no cancerosos a cáncer de mama, nódulos pulmonares a cáncer pulmonar, astrocitoma en estadio temprano a glioblastoma y tumores ováricos benignos a cáncer ovárico. La mayor parte de estos cánceres también pueden metastatizarse.
Las vesículas extracelulares (EV) son una clase de orgánulos unidos a membranas secretados por diversos tipos celulares9. Las EV incluyen, sin limitación, (i) exosomas: vesículas membranosas de 30-100 nm de diámetro de origen endocítico, (ii) ectosomas (también denominados microvesículas de desprendimiento, SMV): vesículas membranosas grandes (50-1000 nm de diámetro) que se desprenden directamente desde la membrana plasmática (PM) y (iii) cuerpos apoptóticos (50-5000 nm de diámetro): liberados por células moribundas.
Los exosomas son nanovesículas extracelulares lipídicas naturales producidas y liberadas prácticamente por todos los tipos celulares de manera finamente regulada y funcionalmente relevante de modo que la composición de proteínas y ARNm refleja el tipo y estado de una célula original10-14. Estas vesículas tienen estabilidad y capacidad intrínseca para cruzar las barreras biológicas, de modo que los exosomas originados a partir de diferentes tejidos puedan encontrarse en fluidos biológicos fácilmente accesibles tales como la sangre15-17. Dados sus papeles y características biológicas, los exosomas se consideran centinelas tempranos de alteraciones en la homeostasis y metabolismo celular y tisular, y son una fuente atractiva para la identificación de biomarcadores novedosos relevantes para enfermedades, así como la presentación de marcadores tisulares conocidos en un paradigma de biopsia líquida. Esto es una premisa y promesa importante del uso de ensayos dirigidos a exosomas en el diagnóstico de enfermedades complejas, tales como cáncer. El desafío principal yace en la asociación de marcadores asociados a exosomas, tanto proteínas como ARN, a un tejido particular, en una condición particular, y la optimización de disoluciones y ensayos fiables, asequibles y no invasivos dirigidos a exosomas que puedan implementarse de manera realista en la investigación y práctica clínica18-21.
Actualmente existe la necesidad de biomarcadores de vesículas extracelulares que puedan determinar la presencia de un tumor (ya sea benigno, maligno o metastásico) o el estado de transformación de un tumor (de benigno a maligno y de no metastásico a metastásico)
La proteína TM9SF4 (SEQ ID NO: 1) es una proteína transmembrana recientemente descrita que pertenece a la superfamilia transmembrana 9 (Transmembrane-9 Superfamily, TM9SF), una familia bien definida de proteínas caracterizadas por un dominio N-terminal hidrófilo grande seguido por nueve dominios transmembrana22. Se sabe que esta proteína se sobreexpresa en melanoma y en leucemia mieloide aguda y síndromes mielodisplásicos, esto último debido a una amplificación de tres a diez veces de un fragmento del cromosoma 20 (20q 11.21) que lleva el gen TM9SF4 completo2324. TM9SF4 está implicado en la fagocitosis de bacterias y en el fenotipo caníbal de células de melanoma metastásico, un fenómeno relacionado a menudo con un mal pronóstico25,2. Se han detectado frecuentemente células cancerosas caníbales en cáncer gástrico y de colon27-30
Se ha mostrado recientemente que TM9SF4 se une a V-ATPasa, una bomba de protones reguladora del pH sobreexpresada en varios tumores. Esta interacción estabiliza de manera aberrante la bomba de protones en su estado activo con las consecuentes alteraciones en el gradiente de pH, lo que a su vez está asociado con resistencia a fármacos e invasividad de células de cáncer de colon31.
La proteína CD9 (SEQ ID NO: 2) es un miembro de la superfamilia transmembrana 4, también conocida como la familia de tetraspanina. Las tetraspaninas son glicoproteínas de superficie celular con cuatro dominios transmembrana que forman complejos multiméricos con otras proteínas de superficie celular. La proteína codificada funciona en muchos procesos celulares incluyendo diferenciación, adhesión y transducción de señales, y la expresión de este gen desempeña un papel crítico en la supresión de la motilidad y metástasis de células cancerosas. Se encuentra en la superficie de exosomas y se considera la proteína de mantenimiento de exosomas para el análisis cuantitativo de nanovesículas derivadas de plasma.
Los miARN miARN21 (SEQ ID NO: 3) son una clase de ARN no codificantes pequeños cuyos productos maduros tienen ~22 nucleótidos de largo. Regulan negativamente la expresión génica induciendo inhibición de la traducción o degradación de transcritos32. Se ha encontrado que miR-21 está regulado por incremento en muchos estados patológicos incluyendo cáncer y enfermedades cardiovasculares33. La identificación de varias dianas de miARN que son realmente oncogenes o supresores de tumores clásicos ha conducido a la idea ampliamente aceptada de que los miARN desempeñan papeles fundamentales en el inicio, la progresión y la metastasización del cáncer34,35. miR-21 se indicó por primera vez como supresor apoptótico en diversas líneas celulares36.
RNU6 (SEQ ID NO: 4) es una molécula de ARN no codificante (ARNnc) que funciona en la modificación de otros ARN nucleares pequeños (ARNnp). La obtención precisa del perfil de microARN (miRNA) es una etapa esencial para la comprensión de la significación funcional de estos ARN pequeños en procesos tanto fisiológicos como patológicos. Se sabe bien que la normalización es una de las etapas más críticas en qRT-PCR y genes comúnmente usados para este fin, tales como U6 y 5S37, ya se ha descrito que se expresan de manera diferencial en cáncer, lo que hace que estos genes no sean adecuados como controles internos.
Descripción de la invención
En un primer aspecto de esta invención, se proporciona un método para la determinación in vitro de la presencia de un tumor en un sujeto, comprendiendo tal método:
a) proporcionar una muestra biológica obtenida a partir de ese sujeto,
b) aislar vesículas extracelulares a partir de dicha muestra, en el que esta etapa de aislamiento de vesículas extracelulares comprende el aislamiento de vesículas extracelulares positivas para TM9SF4,
c) determinar, a partir de las vesículas extracelulares aisladas en la etapa b), el nivel o la presencia de un biomarcador adecuado, y
d) comparar el nivel o la presencia del biomarcador determinado en la etapa c) con uno o más valores de referencia, caracterizado porque las vesículas extracelulares positivas para TM9SF4 se aíslan a través de la unión a un anticuerpo anti-TM9SF4.
En otra realización, al menos una porción de las vesículas extracelulares son exosomas.
En una realización, el tumor es cáncer de colon.
En otra realización, el tumor es cáncer gástrico.
En otra realización, el tumor es cáncer de mama.
En otra realización, el tumor es cáncer pulmonar.
En otra realización, el tumor es melanoma.
En otra realización, el tumor es cáncer pancreático.
En otra realización, el tumor es cáncer ovárico.
En otra realización, el tumor es cáncer prostático.
En otra realización, el tumor es un tumor del sistema nervioso central.
En una realización particular, el tumor del sistema nervioso central es glioblastoma.
En otra realización, el tumor es MPNST.
En una realización, el biomarcador de la etapa c) es la proteína CD9.
En otra realización, el biomarcador de la etapa c) es miR-21.
En otra realización, el biomarcador de la etapa c) es RNU6.
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores de este primer aspecto de la invención representa realizaciones adicionales de la invención.
En un segundo aspecto para esta invención, se proporciona un método para la determinación in vitro del estado de transformación tumoral en un sujeto, comprendiendo tal método:
a) proporcionar una muestra biológica obtenida a partir de ese sujeto,
b) aislar vesículas extracelulares a partir de dicha muestra, en el que esta etapa de aislamiento de vesículas extracelulares comprende el aislamiento de vesículas extracelulares positivas para TM9SF4,
c) determinar, a partir de las vesículas extracelulares aisladas en la etapa b), el nivel o la presencia de un biomarcador adecuado, y
d) comparar el nivel o la presencia del biomarcador determinado en la etapa c) con uno o más valores de referencia, caracterizado porque las vesículas extracelulares positivas para TM9SF4 se aíslan a través de la unión a un anticuerpo anti-TM9SF4.
En una realización, la muestra biológica de la etapa a) se obtiene a partir de un paciente afectado por un tumor benigno.
En otra realización, al menos una porción de las vesículas extracelulares son exosomas.
En una realización, el estado de transformación tumoral es la transformación a un MPNST.
En otra realización, el estado de transformación tumoral es la transformación a un cáncer colorrectal.
En una realización, el biomarcador de la etapa c) es la proteína CD9.
En otra realización, el biomarcador de la etapa c) es miR-21.
En otra realización, el biomarcador de la etapa c) es RNU6.
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores de este segundo aspecto de la invención representa realizaciones adicionales de la invención.
Un tercer aspecto de esta invención se refiere al uso de vesículas extracelulares positivas para TM9SF4 en una prueba para determinar la presencia de un tumor o el estado de transformación tumoral en un sujeto caracterizado porque la presencia del tumor o el estado de transformación tumoral se determina mediante un método según el primer o segundo aspecto de esta invención.
En una realización, al menos una parte de las vesículas extracelulares son exosomas.
En una realización, el tumor es cáncer de colon.
En otra realización, el tumor es cáncer gástrico.
En otra realización, el tumor es cáncer de mama.
En otra realización, el tumor es cáncer pulmonar.
En otra realización, el tumor es melanoma.
En otra realización, el tumor es cáncer pancreático.
En otra realización, el tumor es cáncer ovárico.
En otra realización, el tumor es cáncer prostático.
En otra realización, el tumor es un tumor de sistema nervioso central.
En una realización particular, el tumor de sistema nervioso central es glioblastoma.
En otra realización, el tumor es MPNST.
En una realización, el estado de transformación tumoral es la transformación a un MPNST.
En otra realización, el estado de transformación tumoral es la transformación a un cáncer colorrectal.
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores de este tercer aspecto de la invención representa realizaciones adicionales de la invención.
En un cuarto aspecto de esta invención, se proporciona el uso de un kit para determinar la presencia de un tumor o un estado de transformación tumoral en un sujeto, comprendiendo tal kit un anticuerpo anti-TM9SF4 y un reactivo seleccionado de la lista que consiste en un anticuerpo anti-CD9, un cebador de miR-21 o un cebador de RNU6. En una realización, el tumor es cáncer de colon.
En otra realización, el tumor es cáncer gástrico.
En otra realización, el tumor es cáncer de mama.
En otra realización, el tumor es cáncer pulmonar.
En otra realización, el tumor es melanoma.
En otra realización, el tumor es cáncer pancreático.
En otra realización, el tumor es cáncer ovárico.
En otra realización, el tumor es cáncer prostático.
En otra realización, el tumor es un tumor de sistema nervioso central.
En una realización particular, el tumor de sistema nervioso central es glioblastoma.
En otra realización, el tumor es MPNST.
En una realización, el estado de transformación tumoral es la transformación a un MPNST.
En otra realización, el estado de transformación tumoral es la transformación a un cáncer colorrectal.
En otra realización, el kit comprende además instrucciones para parámetros operativos adecuados en forma de una etiqueta o prospecto separado.
Cualquier combinación de las realizaciones anteriores de este cuarto aspecto de la invención representa realizaciones adicionales de la invención.
En todos los aspectos y realizaciones de la presente invención, una “muestra biológica” es por ejemplo una muestra tumoral, un líquido corporal, una muestra de plasma, una muestra de orina o una muestra de saliva.
En todos los aspectos y realizaciones de la presente invención, un “sujeto” es o bien un ser humano o bien un mamífero.
Debido a la naturaleza micelar de las vesículas extracelulares tales como los exosomas, algunas biomoléculas presentes en estas vesículas pueden detectarse sin lisar las vesículas porque residen en la membrana, mientras que algunas otras sólo pueden detectarse después de la lisis de las vesículas porque están ubicadas dentro de la vesícula.
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Ejemplos
A continuación, a modo de ejemplo solamente, hay una descripción detallada de la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos, en los cuales:
La figura 1 compara los niveles de los biomarcadores TM9SF4 y CD9 medidos por FACS en una línea celular de MPNST (S462, primera columna), una línea de neurofibroma plexiforme (54836T_003, segunda columna) y un línea celular de neurofibroma dérmico (1201A078, tercera columna). La mediana de los valores demuestra que los biomarcadores, cuando se detectan a partir de la membrana del exosoma, pueden diferenciar entre estados benignos (neurofibroma plexiforme, neurofibroma dérmico) y malignos (MPNST).
La figura 2 muestra los resultados de una prueba de Elisa de tipo sándwich en donde 40, 20, 10 y 5 pg de exosomas purificados por un protocolo de ultracentrifugación, a partir de medios acondicionados que se originan de una línea celular de glioblastoma (U87) o tres líneas celulares de MPNST (S462, T265 y 88-14) o de una línea celular de riñón embrionario humano (HEK293), se capturan con un anticuerpo anti-TM9SF4 y se detectan con un anticuerpo anti-CD9, lo que muestra que estos biomarcadores se expresan en la membrana exosómica, y que este ensayo de Elisa de tipo sándwich particular puede usarse para detectar neurofibroma maligno (MPNST) u otros exosomas derivados de tumores sólidos (por ejemplo, glioblastoma) y no exosomas purificados de HEK293. La razón con respecto al fondo notificada en el eje de las ordenadas corresponde a los valores de absorbancia de cada muestra divididos entre la absorbancia promedio de fondo (PBS solo, 0 pg = razón con respecto al fondo 1).
Figura 3A. La evaluación por IHC de TM9SF4 en sujetos con cáncer colorrectal (CRC) y cáncer gástrico (GC) en comparación con tejido circundante sano y lesiones preneoplásicas (pólipos hiperplásicos y adenoma tubulovelloso, y displasia gástrica, respectivamente) reveló una tinción altamente específica del tejido tumoral en estadios tanto temprano como avanzado, con poca o ninguna expresión en tejido sano o displásico. En total, el 90% de los cánceres examinados expresaron fuertemente TM9SF4, y el nivel de expresión (puntuación de IHC) se correlacionaba significativamente con el estadio de enfermedad. Figura 3B. Tinción por IHC de células positivas para TM9SF4/mm2 en cánceres de mama, pulmón y melanoma en comparación con los tejidos circundantes sanos. La figura reveló un número significativo superior de células positivas para TM9SF4/mm2 en todos los tejidos cancerosos analizados.
La figura 4 muestra los resultados de una prueba de ELISA de tipo sándwich donde 100 pl de muestras de plasma preaclaradas (véanse materiales y métodos) obtenidas a partir de pacientes en estadio tumoral temprano (clasificación de TNM T1-2N0M0) o avanzado (clasificación de TNM T3-4NxMx) se han sometido a inmunocaptura mediante placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo frente a TM9SF4. La detección por anticuerpo frente a CD9 reveló valores altamente específicos de razón con respecto al fondo de las muestras de plasma tumoral en estadios tanto temprano como avanzado, con muy baja expresión en muestras de plasma de donantes sanos. Los números en el gráfico de barras correspondían al número de observaciones para cada grupo de estudio. Se calculó la razón con respecto al fondo dividiendo los valores de absorbancia de muestras entre el valor del fondo (sólo PBS en el pocillo de razón con respecto al fondo = 1).
La figura 5 muestra los resultados de una prueba de ELISA de tipo sándwich donde 100 pl de muestras de plasma preaclaradas (véanse materiales y métodos) obtenidas a partir de pacientes con tumores se han sometido a inmunocaptura mediante placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo frente a TM9SF4. La detección por anticuerpo frente a CD9 reveló valores altamente específicos de razón con respecto al fondo de las muestras de plasma tumoral con muy baja expresión en muestras de plasma de donantes sanos. En el eje horizontal se notifica el grupo tumoral y el número de observaciones (N). Se calculó la razón con respecto al fondo dividiendo los valores de adsorbancia de muestras entre el valor del fondo (sólo PBS en el pocillo de razón con respecto al fondo = 1).
La figura 6 representa una curva de característica operativa del receptor (ROC) calculada por el programa GraphPad Prism usando los datos de cáncer colorrectal (CRC) notificados en la figura 5. El grupo de donantes sanos se usó para calcular la especificidad y el umbral óptimo del ensayo de tipo sándwich de ELISA para TM9SF4/CD9 en las muestras de plasma. La figura muestra cómo, al asumir un umbral >6,925, la prueba tiene una sensibilidad >92% y una especificidad >95%.
La figura 7 representa una curva ROC calculada por el programa GraphPad Prism usando los datos de cáncer gástrico notificados en la figura 5. El grupo de donantes sanos se usó para calcular la especificidad y el umbral óptimo del ensayo de tipo sándwich de ELISA para TM9SF4/CD9 en las muestras de plasma. La figura muestra cómo, al asumir un umbral >7,025, la prueba tiene una sensibilidad >83,9% y una especificidad >95%.
La figura 8 representa una curva ROC calculada por el programa GraphPad Prism usando los datos de cáncer de mama notificados en la figura 5. El grupo de donantes sanos se usó para calcular la especificidad y el umbral óptimo del ensayo de tipo sándwich de ELISA para TM9SF4/CD9 en las muestras de plasma. La figura muestra cómo, al asumir un umbral >7,004, la prueba tiene una sensibilidad >88,2% y una especificidad >95%.
La figura 9 representa una curva ROC calculada por el programa GraphPad Prism usando los datos de cáncer de próstata notificados en la figura 5. El grupo de donantes sanos se usó para calcular la especificidad y el umbral óptimo del ensayo de tipo sándwich de ELISA para TM9SF4/CD9 en las muestras de plasma. La figura muestra cómo, al asumir un umbral >7,005, la prueba tiene una sensibilidad >75,8% y una especificidad >95%.
La figura 10 muestra los resultados de una prueba de ELISA de tipo sándwich donde 100 pl de muestras de SUERO preaclaradas (véanse materiales y métodos) obtenidas a partir de pacientes con tumores, se han sometido a inmunocaptura mediante placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo frente a TM9SF4. La detección por anticuerpo frente a CD9 reveló valores superiores significativos de razón con respecto al fondo de las muestras de suero tumoral, en comparación con muestras de suero de donantes sanos. Estos resultados sugieren que la prueba ELISA TM9SF4/CD9 es adecuada también para muestra de plasma de cáncer de páncreas.
La figura 11-A muestra los resultados de una prueba de ELISA de tipo sándwich donde 100 pl de muestras de plasma preaclaradas (véanse materiales y métodos) obtenidas a partir de siete cánceres colorrectales (CRC n.° 1 a n.° 7) y el grupo de control (donantes sanos, HD), se han sometido a inmunocaptura mediante placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo frente a TM9SF4. La figura 11 -B muestra la expresión relativa de miR-21 derivado de vesículas extracelulares (EV) (normalizado a miR-451) a partir de 100 pl del MISMO conjunto de muestras. Las vesículas positivas a TM9SF4 se capturaron usando perlas recubiertas con anticuerpo anti-TM9SF4 y el ARN se extrajo y analizó por RT-qPCR tal como se describe en la sección de materiales y métodos. El umbral de diagnóstico (línea horizontal) para el ensayo de ELISA se ajustó tal como se describió anteriormente (véanse materiales y métodos), y para el ensayo de miR-21 se ajustó a un valor 2 veces mayor que el valor medio del grupo de control. Sorprendentemente, 6 de 7 muestras de c Rc mostraron resultados de diagnóstico coincidentes, lo que sugiere una correlación entre estos dos ensayos basados en inmunocaptura con TM9SF4.
La figura 12 muestra la expresión relativa de miR-21 derivado de EV (normalizado a miR-451 o a miR-574) a partir de 100 pl de plasma de pacientes de cáncer (cáncer colorrectal (CRC) N = 7; cáncer gástrico N = 6; cáncer de mama N = 6; enfermedad de próstata N = 5; melanoma N = 5; ovario N = 6; cáncer pulmonar N= 6) y grupo de control (donantes sanos N = 11). Las EV positivas para TM9SF4 se capturaron usando perlas recubiertas con anticuerpo anti-TM9SF4 y el ARN se extrajo y analizó por RT-qPCR tal como se describe en la sección de materiales y métodos. Los datos sugieren que el miR-21 derivado de EV se sobreexpresa en el plasma de pacientes de cáncer y que tanto miR-451 como miR-574 son miAR de referencia adecuados para determinar la expresión relativa de miRNA derivados de tumores a partir de las EV.
La figura 13 muestra la expresión relativa del RNU6 derivado de EV y miR-21 derivado de EV (normalizados a miR-223) a partir de 1 ml de sobrenadante celular concentrado (10X) de líneas celulares dérmicas, plexiformes y de MPNST. Las EV positivas para TM9SF4 se capturaron usando perlas recubiertas con anticuerpo anti-TM9SF4 y el ARN se extrajo y analizó por RT-qPCR tal como se describe en la sección de materiales y métodos. Los datos sugieren que el RNU6 y miR-21 derivados de EV se sobreexpresan en el sobrenadante de líneas celulares cancerosas humanas (MPNST) pero no en el sobrenadante de líneas celulares derivadas de tumores benignos (plexiformes) o líneas celulares normales (dérmicas).
La figura 14-A muestra la expresión relativa de miR-21 derivado de EV (normalizado a miR-451) a partir de 100 pl de plasma de un paciente con cáncer de próstata y un donante sano. Las EV se capturaron usando perlas recubiertas con anticuerpo anti-CD9 o perlas recubiertas con anticuerpo anti-TM9SF4. Se extrajo el ARN y se analizó por RT-qPCR tal como se describe en la sección de materiales y métodos. La figura 14-B muestra la expresión relativa de miR-21 derivado de EV (normalizado a miR-451) a partir de 100 pl de suero de un paciente con cáncer colorrectal (CRC) y un donante sano. Las EV se capturaron usando perlas recubiertas con anticuerpos anti-CD9 y anti-CD63, o perlas recubiertas con anticuerpo anti-TM9SF4, y el ARN se extrajo y analizó por RT-qPCR tal como se describe en la sección de materiales y métodos. Los datos de las figuras 14-A y B sugieren que la inmunocaptura de EV derivadas de tumores con perlas recubiertas con anticuerpo anti-TM9SF4 enriquece miR-21 (un miARN asociado a cáncer bien conocido) TANTO EN plasma COMO en suero. A la inversa, la captura de EV con anticuerpos que seleccionan como diana marcadores genéricos de EV (CD9 o CD63) no enriquece miR-21.
La figura 15 muestra la expresión relativa de miR-21 derivado de EV (normalizado a miR-451) a partir de 100 pl de plasma de un paciente con cáncer de próstata y un donante sano. Las EV se capturaron usando perlas recubiertas con anticuerpo anti-TM9SF4 o perlas recubiertas con anticuerpos IgG de isotipo coincidente (ISO) para evaluar la unión inespecífica. Se extrajo el ARN y se analizó por RT-qPCR tal como se describe en la sección de materiales y métodos. Los datos muestran el enriquecimiento específico de las EV positivas para TM9SF4 usando perlas recubiertas con Ac anti-TM9SF4 mientras que se observó una baja unión inespecífica en el plasma del paciente con cáncer.
La figura 16 muestra los resultados de una prueba de ELISA de tipo sándwich donde 100 pl de muestras de plasma preaclaradas (véanse materiales y métodos) obtenidas a partir de pacientes con tumores y donantes sanos, se han sometido a inmunocaptura mediante placas de 96 pozos recubiertas con anticuerpo frente a CD9. La detección por anticuerpo frente a TM9SF4 reveló que la inversión del anticuerpo de captura y detección, utilizado en la figura 5, no es útil para distinguir muestras de plasma de origen tumoral de muestras de plasma de donantes sanos. La razón con respecto al fondo se calculó dividiendo los valores de adsorbancia de muestras entre el valor del fondo (sólo PBS en el pozo de razón con respecto al fondo = 1).
MÉTODOS
A continuación se encuentra una descripción de los métodos usados en los ejemplos para el aislamiento y análisis de los exosomas. El experto en la técnica reconocerá que existen métodos equivalentes alternativos.
Aislamiento de exosomas por protocolo de ultracentrifugación.
El medio acondicionado para la preparación y análisis de exosomas debe recogerse a partir de células de interés confluentes al 80-90%.
El sobrenadante del cultivo celular se recoge en condiciones estériles y se le añaden inhibidores de proteasas diluidos 1:1.000, se preaclara por filtración (0,2 pm) y se somete ultracentrifugación (aprox. 50 ml/tubo) a 110.000 g durante 1,5 horas a 4°C. Entonces se retira el sobrenadante y se descarta. El sedimento se resuspende en 100 pl de PBS helado antes de su dilución en 50 ml de PBS 1x helado, y se somete a ultracentrifugación a 110.000 g durante 1,5 horas a 4°C. El sedimento resultante se resuspende en 100 pl de PBS y se agita con vórtex durante 30 segundos antes de recoger con pipeta para experimentación.
Protocolo convencional para la detección de marcadores proteicos por análisis de FACS
La concentración exosómica se cuantifica usando el método de Bradford para la cuantificación de proteínas. Los exosomas aislados a partir de sobrenadantes de líneas celulares se incuban a 4°C durante la noche con perlas de látex con aldehído/sulfato (4% p/v, 4 pm) en una razón de 1:20. Después de una etapa de lavado en PBS, los exosomas adsorbidos sobre la superficie de las perlas se incuban en PBS BSA al 0,5% con el anticuerpo primario relevante (para una concentración final de 5 pg/ml) y se mantienen 1 h a 4°C. Después de una etapa de lavado con PBS BSA al 0,5%, las muestras se incuban durante 45 a 4°C con el anticuerpo secundario correspondiente (AlexaFluor 488 de ratón, conejo o cabra diluido 1:1000). Después de una etapa de lavado final en PBS, las muestras se resuspenden en 300 pl de PBS y se analizan en FACSCalibur (BD). Se usan anticuerpos de isotipo coincidente o anticuerpos secundarios solos como control negativo. Se lee la mediana de la intensidad de fluorescencia de cada muestra usando el canal FLI y se normaliza para su control negativo.
Recogida de muestras:
Los criterios de inclusión comprendieron sólo un caso de cáncer recién diagnosticado, ninguno de los pacientes había recibido previamente tratamiento de radio o quimioterapia ni se sometieron a cirugía antes de la recogida de sangre. Todos los pacientes otorgaron su consentimiento firmado antes de incluirse en el estudio. El estudio lo realizó el Riga East University Hospital y lo aprobó un comité ético local, y era conforme con la Declaración de Helsinki. La sangre, habiéndose recogido en tubos de EDTA de 10 ml, se invirtió suavemente y se centrifugó a 1500 g 10' a TA en 30 minutos desde el momento de la recogida de sangre.
El centro de transfusiones del North Estonia Hospital proporcionó plasma de donantes sanos certificados.
Examen inmunohistoquímico del tejido
Se sometieron a inmunotinción secciones de tejidos para visualizar células que eran positivas para TM9SF4. Se logró la recuperación de antígenos mediante la incubación de los portaobjetos en tampón Tris/EDTA a pH = 9,0 en horno de microondas científico durante 30 min. La actividad peroxidasa endógena se bloqueó con H2O2 al 3,0% durante 10 min. La unión inespecífica de anticuerpos primarios se bloqueó con suero de caballo normal antes de la incubación con anticuerpos. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpo policlonal de conejo frente a TM9SF4 (dilución 1:400). Los portaobjetos se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora a una dilución 1:100. La unión de los anticuerpos se detectó usando el reactivo EnVision (1 hora a temperatura ambiente). El color de la reacción de inmunoperoxidasa se reveló incubando los portaobjetos con diaminobencidina durante 7 min. Un control negativo que omitió el anticuerpo primario se incluyó para cada experimento.
Obtención de imágenes y cuantificación de células.
Para cada muestra se dio una puntuación según la intensidad de la tinción nucleica o citoplásmica (sin tinción = 0, tinción débil = 1, tinción moderada = 2, tinción fuerte = 3) y el grado de células teñidas (0% = puntuación 0; - 10% = 1; 11-50% = 2; 51> = puntuación 3. Negativo significa área de tinción del 0%. Focalmente positivo significa área de tinción del 1-80%, difusamente positivo significa área de tinción del 81-100%. Para cáncer de mama, pulmón y melanoma se ha contado el número de células positivas para cáncer/mm2.
Análisis de datos
Los resultados para datos morfológicos se expresaron como las medias DE. Los datos morfológicos e inmunohistoquímicos se analizaron por ANOVA bidireccional seguido por prueba a posteriori de Bonferroni para comparación entre grupos. La correlación con datos clínicos e histopatológicos se evaluó mediante la prueba de Spearman. En todas las pruebas, un valor de p de <0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se usó el software SPSS versión 21 para el análisis estadístico.
Protocolo convencional para la detección de marcadores proteicos mediante ensayo de ELISA de tipo sándwich: Ensayo de ELISA para exosomas purificados por medios acondicionados ultracentrifugados: Se cargan 40, 20, 10 y 5 pg/100 pl de PBS de exosomas aislados y 100 pl de PBS como control negativo (0 pg) en una placa de 96 pocillos prerrecubierta con anticuerpo frente a TM9SF4 (2 pg/ml) (placa transparente). Brevemente, se recubren previamente placas de 96 pocillos con el anticuerpo de captura relevante, se lavan tres veces con PBS TWEEN al 0,05% (tampón de lavado), se añaden los exosomas aislados y se incuban durante la noche a 37°C. Después de tres lavados con tampón de lavado, se incuban las placas con anticuerpo de detección frente a CD9, se incuban durante 2 h a 37°C, se lavan tres veces con tampón de lavado, se incuban durante una hora a 37°C con el anticuerpo secundario correspondiente y se lavan tres veces con tampón de lavado. Se añaden 100 pl de TMB (tetrametilbencidina) a cada pocillo y, después de 5 minutos, se detiene la reacción por la adición de 100 pl de disolución de detención (ácido sulfúrico 1 N).
La absorbancia O/D se lee con un instrumento M1000 Tecan a 450 nm.
Ensayo de ELISA para líquidos biológicos (plasma y suero):
Las muestras de plasma y suero se almacenan a -80°C, se descongelan a temperatura ambiente y se preaclaran después de la adición de un cóctel de inhibidores de proteasas 1:500 centrifugando a 1200 g 20' 4°C, transfiriendo el sobrenadante a otro vial y centrifugando de nuevo a 10000 g 30' 4°C. El sobrenadante obtenido se denomina preaclarado y se usa para el siguiente análisis.
Brevemente, se incuban 100 pl de plasma o suero preaclarado durante la noche a 4°C en placas de 96 pocillos prerrecubiertas con anticuerpo frente a TM9SF4 (2 pg/ml). Después de tres lavados con tampón de lavado, se incuban las placas con anticuerpo de detección frente a CD9, se incuban durante 2 h a 4°C, se lavan tres veces con tampón de lavado, se incuban durante una hora a 4°C con el anticuerpo secundario correspondiente y se lavan tres veces con tampón de lavado. Se añade una cantidad de 100 pl de TMB (tetrametilbencidina) a cada pocillo y, después de 5 minutos, se detiene la reacción mediante la adición de 100 pl de disolución de detención (ácido sulfúrico 1 N).
La absorbancia O/D se lee con un instrumento M1000 Tecan a 450 nm.
Preparación de perlas recubiertas con TM9SF4
Las perlas recubiertas con un anticuerpo frente a TM9SF4 pueden obtenerse usando el método conocido por el experto en la técnica, o modificaciones del mismo.
Extracción de ARN y miARN a partir de exosomas inmunocapturados.
Aislamiento de exosomas por inmunocaptura a través de perlas prerrecubiertas con TM9SF4: medios de cultivo o líquidos biológicos (plasma y suero)
Se añade una cantidad de 10 ml de sobrenadante a partir del cultivo celular a inhibidores de proteasas diluidos a 1:1000 y concentrados 10X usando unidades de filtración centrífuga (Millipore). Se incuba entonces una cantidad de 1 ml de medio 10X durante la noche a 4°C con inmunoperlas prerrecubiertas con anticuerpo frente a TM9SF4.
Las EV inmunocapturadas se lavan tres veces con PBS Tween al 0,01%, y se tratan con 0,7 ml de QIAZOL.
Se diluyen 100 pl de plasma o suero preaclarado con 900 pl de PBS 1X y se incuba durante la noche a 4°C en un rotador con 10 pl de perlas prerrecubiertas con TM9SF4. Las perlas se lavan tres veces con PBS Tween al 0,01%, y se tratan con 0,7 ml de QIAZOL.
Se extrae el ARN total usando el kit de extracción de ARN total (Hansabiomed) y se cuantifica el ARN eluido en el instrumento Nanodrop.
Amplificación de miARN y snoARN, y análisis de RT-qPCR
Los miRNA se sometieron a transcripción inversa usando un kit de RT miScript II (Qiagen) y se amplificaron 0,3 ng de ADNc mediante qRT-PCR en el sistema de detección por PCR en tiempo real CFX96™ (BIORAD) con el kit de PCR miScript SYBR Green (Qiagen), usando ensayos con cebadores miScript (Qiagen) que seleccionan como diana miR-21 (múmero de catálogo: MS00009079), RNU6, (número de catálogo: Ms 00033740) y los miARN de referencia miR-451 (número de catálogo: MS00004242), miR-574 (número de catálogo: MS00032025) y miR-223 (número de catálogo: MS00003871).
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Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Método para determinar in vitro la presencia de un tumor en un sujeto, comprendiendo tal método:
    a) proporcionar una muestra biológica obtenida a partir de ese sujeto,
    b) aislar vesículas extracelulares a partir de la muestra, en el que esta etapa de aislamiento de vesículas extracelulares comprende el aislamiento de vesículas extracelulares positivas a TM9SF4,
    c) determinar, a partir de las vesículas extracelulares aisladas en la etapa b), el nivel o la presencia de un biomarcador adecuado, y
    d) comparar el nivel o la presencia del biomarcador determinado en la etapa c) con uno o más valores de referencia,
    caracterizado porque las vesículas extracelulares positivas para TM9SF4 se aíslan a través de la unión a un anticuerpo anti-TM9SF4.
  2. 2. Método según las la reivindicación 1, en el que al menos una porción de las vesículas extracelulares son exosomas.
  3. 3. Método según las reivindicaciones 1-2, en el que el tumor se selecciona de la lista que consiste en cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer pulmonar, melanoma, cáncer pancreático, cáncer ovárico, cáncer prostático, tumor del sistema nervioso central, glioblastoma o MPNST.
  4. 4. Método según las reivindicaciones 1-3, en el que el biomarcador de la etapa c) se selecciona de la lista que consiste en la proteína CD9, miR-21 o RNU6.
  5. 5. Método para determinar in vitro el estado de transformación tumoral en un sujeto, comprendiendo tal método:
    a) proporcionar una muestra biológica obtenida a partir de ese sujeto,
    b) aislar vesículas extracelulares a partir de dicha muestra, en el que esta etapa de aislamiento de vesículas extracelulares comprende el aislamiento de vesículas extracelulares positivas para TM9SF4,
    c) determinar, a partir de las vesículas extracelulares aisladas en la etapa b), el nivel o la presencia de un biomarcador adecuado, y
    d) comparar el nivel o la presencia del biomarcador determinado en la etapa c) con uno o más valores de referencia,
    caracterizado porque las vesículas extracelulares positivas para TM9SF4 se aíslan a través de la unión a un anticuerpo anti-TM9SF4.
  6. 6. Método según la reivindicación 5, en el que la muestra biológica de la etapa a) se obtiene a partir de un sujeto afectado por un tumor benigno.
  7. 7. Método según las reivindicaciones 5-6, en el que al menos una porción de las vesículas extracelulares son exosomas.
  8. 8. Método según las reivindicaciones 5-6, en el que el estado de transformación tumoral es la transformación a un MPNST o a un cáncer colorrectal.
  9. 9. Método según las reivindicaciones 5-8, en el que el biomarcador adecuado se selecciona de la lista que consiste en la proteína CD9, miR-21 o RNU6.
  10. 10. Uso de vesículas extracelulares positivas para TM9SF4 en una prueba para determinar la presencia de un tumor o el estado de transformación tumoral en un sujeto, caracterizado porque la presencia del tumor o el estado de transformación tumoral se determina mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
  11. ii. Uso según la reivindicación 10, en el que las vesículas extracelulares son exosomas.
  12. 12. Uso según las reivindicaciones 10-11, en el que el tumor se selecciona de la lista que consiste en cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer pulmonar, melanoma, cáncer pancreático, cáncer ovárico, cáncer de próstata, tumor del sistema nervioso central, glioblastoma o MPNST.
  13. 13. Uso según las reivindicaciones 10-11, en el que el estado de transformación tumoral es la transformación a MPNST o a cáncer colorrectal.
  14. 14. Uso de un kit para determinar en un método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 ó 9 la presencia de un tumor o un estado de transformación tumoral en un sujeto, comprendiendo tal kit un anticuerpo anti-TM9SF4 y un reactivo seleccionado de la lista que consiste en un anticuerpo anti-CD9, un cebador de miR-21 o un cebador de RNU6.
  15. 15. Uso según la reivindicación 14, en el que el tumor se selecciona de la lista que consiste en cáncer de colon, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer pulmonar, melanoma, cáncer pancreático, cáncer ovárico, cáncer prostático, tumor del sistema nervioso central, glioblastoma o MPNST.
  16. 16. Uso según la reivindicación 14, en el que el estado de transformación tumoral es la transformación a un MPNST o a un cáncer colorrectal.
  17. 17. Uso según las reivindicaciones 14-16, que comprende además instrucciones para parámetros operativos adecuados, en forma de una etiqueta o prospecto separado.
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