ES2703217T3 - Piensos para acuicultura que comprenden alimentos que contienen ácido estearidónico para acuicultura - Google Patents

Abstract

Un metodo para criar un salmon que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., comprendiendo el metodo alimentar el salmon con un pienso que comprende lipido, comprendiendo los acidos grasos libres y esterificados del lipido total del pienso al menos un 5,5 % (p/p) de acido estearidonico (SDA), en donde el salmon, tras haberse alimentado con el pienso durante al menos 6 semanas, tiene niveles de SDA y acido eicosatetraenoico (ETA) mas altos en el tejido muscular cuando se compara con un salmon alimentado con el mismo pienso pero que carece practicamente de SDA.

Description

DESCRIPCIÓN

Piensos para acuicultura que comprenden alimentos que contienen ácido estearidónico para acuicultura

Campo de la invención

La presente invención se refiere a alimentos para su uso en acuicultura, así como a métodos para producir dichos alimentos. La invención proporciona métodos para la crianza del salmón.

Antecedentes de la invención

La producción global de peces y crustáceos en granjas marinas se ha más que duplicado en los últimos 15 años, y su expansión produce una creciente demanda de suministro global de pescado silvestre capturado para proporcionar proteínas y aceites como ingredientes de piensos para acuicultura (Naylor et al., 2000). El suministro de alimento marino procedente de las capturas globales en pesquerías es de unos 100 millones de toneladas al año (FAO, 2001). Esta cantidad no ha aumentado desde mediados de la década de los 80 del siglo pasado y no va a aumentar en el futuro, ya que la mayor parte de las pesquerías están en o por encima de los niveles de producción sostenible, y adicionalmente están sometidas a agudos declives periódicos, debido a factores climáticos tales como El Niño (FAO, 2001; Barlow 2000). También se tiene una demanda creciente de aceite de pescado, no solo de la acuicultura, sino también desde la agricultura y las industrias nutracéutica/biomédica.

La sustitución de aceites para la industria de la acuicultura se ha centrado en varias fuentes vegetales terrestres comerciales incluidas el girasol (Bransden et al, 2003; Bell et al., 1993), canola/colza (Bell et al, 2003; Polvi y Ackman, 1992), oliva, palma (Fonseca-Madrigal et al, 2005; Bell et al, 2002) y linaza (Bell et al., 1993; Bell et al., 2004). La inclusión de aceite vegetal para sustituir todo o parte del aceite de pescado en las dietas de los peces ha dado como resultado las mismas tasas de crecimiento y relaciones de conversión de alimento (Bransden et al., 2003; Polvi y Ackman, 1992; Torstensen et al., 2004; Fonseca-Magrigal et al., 2005; Bell et al., 2002; Bell et al., 2004). Sin embargo, como estos aceites vegetales no tienen prácticamente ácidos grasos poliinsaturados w3 de cadena larga (>C20) (w3 LC-PUFA) y tienen elevados niveles de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), w6 PUFA y bajas relaciones w3/w6, los peces alimentados con dichos piensos tienen niveles reducidos de w3 LC-PUFA. Se cree que esto está asociado con una reducción en los beneficios para la salud del consumidor en comparación con los peces alimentados con una dieta rica en aceite de pescado que contiene niveles más altos de w3 LC-PUFA (Seierstad et al., 2005). Por lo tanto, la crianza de salmón con piensos de alto contenido de aceite vegetal tiene el potenciar de diluir los importantes beneficios cardiovasculares y otros beneficios que se asocian con la ingesta de pescado.

Rutas de la síntesis de LC-PUFA

La biosíntesis de LC-PUFA a partir de ácidos grasos linoleico y a-linolénico en organismos tales como microalgas, musgos y hongos se puede realizar mediante una serie de reacciones de desaturación y elongación alternantes dependientes del oxígeno como se muestra esquemáticamente en la Figura 1. En una ruta (Figura 1, II), las reacciones de desaturación están catalizadas por A6, A5, y A4 desaturasas, cada una de las cuales añade un doble enlace adicional a la cadena de carbono del ácido graso, mientras que cada reacción de A6 y A5 elongasa añade una unidad de dos átomos de carbono a la cadena. La conversión de ALA en DHA en estos organismos requiere, por tanto, tres desaturaciones y dos elongaciones. Los genes que codifican las enzimas necesarias para la producción de DHA en esta ruta aerobia se han clonado a partir de diferentes microorganismos y plantas inferiores entre las que se incluyen las microalgas, musgos, hongos.

Se ha demostrado que existen rutas alternativas para dos secciones de la ruta ALA en DHA en algunos grupos de organismos. La conversión de ALA en ETA se puede llevar a cabo mediante una combinación de una A9 elongasa y una A8 desaturasa (la denominada ruta de desaturación A8, véase la Figura 1, IV) en algunas protistas y traustoquítridos, como se pone de manifiesto por los aislados de genes que codifican dichas enzimas (Wallis y Browse, 1999; Qi et al., 2002). En mamíferos, la denominada ruta "Sprecher" convierte DPA en DHA según tres reacciones, independientes de una A4 desaturasa (Sprecher et al., 1995).

Además de estos sistemas desaturasa/elongasa, EPA y DHA también se pueden sintetizar mediante una ruta anaerobia en numerosos organismos tales como Shewanella, Mortiella y Schizochytrium (Abbadi et al., 2001). Los operones que codifican estos complejos de enzimas policétido sintasa (PKS) se han clonado desde algunas bacterias (Morita et al., 2000; Metz et al., 2001; Tanaka et al., 1999; Yazawa, 1996; Yu et al., 2000; documento WO 00/42195). El operón EPA PKS aislado de Shewanella spp se ha expresado en Synechococcus permitiendo que sintetice EPA (Takeyama et al., 1997). Los genes que codifican estas enzimas se disponen en operones relativamente grandes, y no se ha notificado su expresión en plantas transgénicas. Por lo tanto, aún debe verse si un sistema anaerobio análogo a PKS es una alternativa posible a al sistema aerobio más clásico de desaturasa/elongasa para la síntesis transgénica de LC-PUFA.

Las rutas biosintéticas de PUFA son bien conocidas (Sargent et al., 2002). Los vertebrados carecen de las desaturasas lipídicas w12 y w15 (w3) y no pueden producir ácido linoleico (18:2w6, LA) y ácido a-linolénico (18:3w3, ALA) a partir del ácido oleico (18:1w9, w6) (véase la Figura 1). La conversión de ALA en el ácido eicosapentanoico (20:5w3, EPA) y ácido docosahexaenoico (22:6w3, DHA) es ineficaz en peces marinos, que tienen elevados niveles de LC-PUFA en su dieta natural, pero es mayor en los peces de agua dulce, que tienen elevados niveles de LA y ALA y cantidad limitada de DHA en su dieta natural. Los niveles elevados de w3 LC-PUFA, que se encuentran en el salmón, no se pueden biosintetizar a partir de ALA y LA y, por tanto, deben proporcionarse a los peces en su dieta.

Desaturasas

Se ha demostrado que todas las enzimas desaturasas que participan en la biosíntesis de LC-PUFA pertenecen al grupo denominado desaturasas "de primera línea" que se caracterizan por la presencia de un dominio de citocromo b5 en el extremo N de cada proteína. El dominio cyt b5 actúa presuntamente como el receptor de los electrones necesarios para la desaturación (Sperling y Heinz, 2001). La enzima A6 desaturasa cataliza la desaturación de ácido linoleico (LA) para formar ácido gamma-linoleico (GLA, 18:3w6) y ácido linolénico (ALA) para formar ácido estearidónico (SDA, 18:4w3) (Figura 1). Los genes que codifican esta enzima se han aislado de numerosos organismos, que incluyen plantas. mamíferos, nematodos, hongos, y microalgas marinas. El sustrato ácido graso C18 para las A6 desaturasas de plantas, hongos y microalgas tiene desaturación en al menos las posiciones A9 y A12 y por lo general está unirse covalentemente a un grupo de cabeza de fosfatidilcolina (acil-PC).

La enzima A5 desaturasa cataliza la desaturación del LC-PUFA C20 que conduce al ácido araquidónico (ARA, 20:4 w6) y EPA (20:5w3). Los genes que codifican esta enzima se han aislado de numerosos organismos, incluidas algas (Thraustochytrium sp. Qiu et al., 2001), hongos (M. alpine, Pythium irregulare, Michaelson et al., 1998; Hong et al., 2002), Caenorhabditis elegans y mamíferos. También se ha identificado un gen que codifica una desaturasa A5/A6 bifuncional en el pez cebra (Hasting et al., 2001). El que codifica esta enzima podría representar una forma ancestral de la "desaturasa de primera línea" que posteriormente se duplica y evoluciona hacia diferentes funciones.

La última etapa de desturación para producir DHA se cataliza por una A4 desaturasa y un gen que codifique esta enzima se ha aislado de la especie de protista de agua dulce Euglena gracilisy de la especie marina Thraustochytrium sp. (Qiu et al., 2001; Meyer et al., 2003).

Elongasas

También se han aislado varios genes que codifican las enzimas de elongación de PUFA (Sayanova and Napier, 2004). Los miembros de esta familia de genes no están relacionados con los genes de elongasa presentes en presente superiores, tales como FAE1 de Arabidopsis, que está implicada en la extensión de ácidos grasos saturados y monoinsaturados. Un ejemplo de este último es el ácido erúcico (22:1) de Brassicas. En algunas especies de protistas, LC-PUFA se sintetizan mediante la elongación del ácido linoleico o a-linolénico con una unidad C2, antes de la desaturación con la A8 desaturasa (Figura 1 parte IV; ruta "A8-desaturación"). las actividades A6 desaturasa y A6 no se han detectado en dichas especies. En su lugar, se esperaría una actividad A9-elongasa en dichos organismos, y como respaldo de esto, se ha aislado recientemente un gen de la A9-elongasa C18 a partir de Isochrysis galbana (Qi et al., 2002).

Plantas transgénicas

Los cultivos transgénicos de cultivos de oleaginosas que se han genomanipulado para producir LC-PUFA principales mediante la inserción de varios genes que codifican desaturasas y/o elongasas se han sugerido como fuente sostenible de ácidos grasos nutricionalmente importantes. Sin embargo, el requisito de una expresión y actividad coordinadas de cinco nuevas enzimas codificadas por genes de posiblemente fuentes diferentes ha hecho que esta meta sea difícil de conseguir y por lo general se han obtenido rendimientos bajos (revisado por Sayanova y Napier, 2004; Drexler et al., 2003; Abbadi et al., 2001).

Un gen que codifica una A6-ácido graso desaturasa aislada de la borraja (Borago officinalis) se expresión en tabaco transgénico y Arabidopsis, dando como resultado la producción de GLA (18:3w6) y SDA (18:4 w3), los precursores directos de LC-PUFA, en las plantas transgénicas (Sayanova et al., 1997 y 1999). Sin embargo, esto proporciona solamente una primera etapa individual.

Piensos para acuicultura

La investigación en piensos para acuicultura se ha centrado ampliamente en enriquecer las dietas de salmón aumentando el suministro de ALA en la dieta (Bell et al., 1993) y EPA/DHA (Harel et al., 2002; Carter et al., 2003).

Existe necesidad de dietas adicionales para acuicultura que, tras su consumo, mejoren la producción de ácidos grasos poliinsaturados omega-3 de cadena larga en animales acuáticos.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han determinado que el salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., se puede producir con niveles adecuados de LC-PUFA, tales como EPA, DPA y/o DHA, sin necesidad de alimentar estos organismos con dietas que son ricas en LC-PUFA. En particular, el precursor de LC-PUFA, el ácido estearidónico (SDA), se puede proporcionar al salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp. mientras se siguen produciendo peces o crustáceos con niveles deseables de LC-PUFA.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para criar un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., comprendiendo el método alimentar el salmón con un pienso que comprende lípido, comprendiendo el ácido graso de dicho lípido al menos un 5,5 % (p/p) de ácido estearidónico (SDA).

En una realización preferida, el lípido comprende un fitoesterol.

En una realización particularmente preferida, al menos 1 % del SDA en el pienso se ha obtenido de una planta. La planta puede ser no transgénica, tal como una Echium sp., Oenothera biennis, Borago officinalis o Ribes nigrum, o transgénica. En una realización, al menos parte del SDA procede de aceite obtenido de semillas de la planta.

En una realización preferida, la planta transgénica comprende un ácido nucleico exógeno que codifica una A6 desaturasa. La planta transgénica puede comprender además un ácido nucleico exógeno que codifica una w3 desaturasa o una A15 desaturasa, que aumenta la producción de ALA en la planta. La planta transgénica puede comprender además un ácido nucleico exógeno que codifica una A12 desaturasa. Los ejemplos de plantas transgénicas adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, canola, soja, lino, otras plantas oleaginosas, cereales o granos de leguminosas.

El salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., se alimenta predominantemente con el pienso durante un periodo de al menos 6 semanas, preferentemente al menos 7 semanas e incluso más preferentemente al menos 12 semanas. En una realización, tras haberse alimentado con el pienso durante al menos 6 semanas, el salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., tiene similar aumento de peso, velocidad de crecimiento específica, aumento de peso, consumo total de alimento, relación de eficacia del alimento, índice hepatosomático y/o supervivencia cuando se compara con la misma especie de salmón alimentada con el mismo pienso pero que carece prácticamente de SDA.

El salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., tras haberse alimentado con el pienso durante al menos 6 semanas, tiene niveles de SDA y ETA más altos en el tejido muscular cuando se compara con la misma especie de salmón alimentado con el mismo pienso pero que carece prácticamente de SDA.

En una realización adicional, el salmón, tras haberse alimentado con el pienso durante al menos 6 semanas, tiene niveles de SFA en el tejido muscular menores cuando se compara con la misma especie de salmón alimentado con el mismo pienso pero que comprende aceite de pescado en lugar de aceite vegetal, que comprende al menos un 5,5 % de SDA. En realizaciones preferidas, los niveles de 14:0 y 16:0 están reducidos, por ejemplo, en al menos un 10 % o al menos un 20 %.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un pienso para un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., comprendiendo el pienso lípido, comprendiendo el ácido graso de dicho lípido al menos un 11 % (p/p) de ácido estearidónico (SDA, 18:4A6,9,12,15, w3). El pienso puede tener cualquiera de las características descritas en el presente documento en el contexto de los métodos.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., producido utilizando un método de la invención.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., en el que el ácido graso del lípido del músculo blanco de dicho salmón comprende menos del 29,6 % de SFA y al menos un 18,3 % de DHA. En determinadas realizaciones, el lípido del músculo blanco de dicho salmón comprende ácido graso que comprende menos del 28 %, menos del 27 %, o más preferentemente menos del 26 % de SFA. En otras realizaciones, el lípido del músculo blanco de dicho salmón comprende ácido graso que comprende al menos un 19 %, al menos un 20 %, al menos un 21 %, o más preferentemente al menos un 22 % de DHA.

En el presente documento se divulga un pez, en el que el ácido graso del lípido del músculo rojo de dicho salmón comprende menos del 28,2 % de SFA y al menos un 9,6 % de DHA. Tal como se divulga en el presente documento, el lípido del músculo rojo del pez puede comprender ácido graso que comprende menos del 27 %, menos del 26 %, o más preferentemente menos del 25 % de SFA. El lípido del músculo del pez puede comprender ácido graso que comprende al menos un 10 %, al menos un 11 %, o más preferentemente al menos un 12 % de DHA.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., en el que el ácido graso del lípido del músculo blanco de dicho salmón comprende al menos un 2,7 % de SDA. En realizaciones de este aspecto, el lípido del músculo blanco de dicho pez o crustáceo comprende al menos un 3 %, al menos un 3,5 %, o más preferentemente al menos un 4 % de SDA.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., en el que el ácido graso del lípido del músculo blanco de dicho salmón comprende al menos un 2,7 % de SDA. En realizaciones de este aspecto, lípido del músculo blanco de dicho salmón comprende al menos un 3 %, o más preferentemente al menos un 3,5 % de SDA.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir un pienso para salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., de acuerdo con la reivindicación 12. Otros ingredientes pueden incluir vitaminas, minerales, colina, o pigmentos tales como, por ejemplo, carotenoides o rosa carófilo.

Preferentemente, la planta es transgénica.

Preferentemente, el aceite se obtiene de la semilla de la planta.

En determinadas realizaciones, se prefiere que el ácido graso del lípido del pienso comprenda al menos un 15 %, al menos un 20 %, o al menos un 30 % (p/p) de SDA.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un pienso para salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., el método comprende premezclar un organismo transgénico, o extracto o porción del mismo, con al menos otro ingrediente, en el que el organismo está genéticamente modificado de forma que produzca SDA y/o que produzca niveles de SDA más elevados que cuando se compara con un organismo correspondiente silvestre no transgénico. El método puede comprender la etapa de extraer el aceite del organismo, por ejemplo de la semilla de una planta. La extracción puede comprender medios físicos tales como la trituración de la semilla, medios químicos tal como la extracción con un disolvente, calentamiento, u otros procesos, o cualquier combinación de los mismos. El aceite se puede purificar adicionalmente antes de mezclarlo con otros ingredientes. El método incluye preferentemente la preparación de un producto extrudido a partir de los ingredientes mezclados mediante un proceso de extrusión, adecuado para su provisión al salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., El método puede comprender la etapa de analizar el pienso, tal como por ejemplo medir el nivel de lípido o el nivel de SDA en el ácido graso, u otras mediciones.

Preferentemente, el organismo es una planta o una levadura.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un pienso producido usando un método de la invención. El pienso puede tener las características anteriormente descritas. Otros ingredientes que se pueden incluir en el pienso incluyen harina de pescado, una fuente de alto contenido de proteína que no sea harina de pescado, una fuente de almidón, vitaminas, minerales, pigmentos tales como, por ejemplo, carotenoides o rosa carófilo, o cualquier combinación de los mismos. La harina de pescado es una fuente de proteínas preferidas para los principales peces carnívoros tales como el salmón, trucha, atún, lenguado, barramundi, especialmente para el salmón atlántico. La harina de pescado, normalmente aproximadamente un 65 % de proteínas, se puede añadir en una cantidad de 20 a 700 g por kg de peso seco. Una fuente de alto contenido de proteína que no sea harina de pescado puede ser de origen vegetal o animal tal como, por ejemplo, trigo u otro gluten de cereal, harina de soja, harina de otras legumbres, caseína, concentrados de proteínas, aislados de proteínas, carne, carne y hueso, sangre, alas. Estos suponen al menos un 30 % de proteína y se puede molturar con o sin extracción de aceite. El almidón se puede añadir, normalmente a 10-150 g/kg, y puede estar en la forma de grano o harina de cereal. Para los crustáceos, harina de krill, harina de mejillón u otros componentes similares se pueden añadir a 1-200g/kg, colesterol y/o lecitina a 0-100 g/kg. La mezcla puede comprender un agente de unión tal como alginato de sodio, por ejemplo Manucol de Kelco International.

Adicionalmente, los presentes inventores han descubierto que la expresión de un gen de la A6 desaturasa en una planta productora de fibra da como resultado niveles sorprendentemente elevados de productos PUFA de la A6 desaturasa.

Como será evidente, los rasgos y características preferidas de un aspecto de la invención pueden ser aplicables a muchos aspectos diferentes de la invención.

En la totalidad de la presente memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un elemento, entero o etapa o grupo de elementos, enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o etapa o grupo de elementos, enteros o etapas.

La invención se va a describir a partir de ahora en el presente documento mediante los siguientes Ejemplos no limitativos, y con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos adjuntos

Figura 1. Posibles rutas para la síntesis de LC-PUFA w3 y w6. Los sectores mercados I, II, III, y IV corresponden a las rutas w6 (A6), w3 (A6), w6 (A8), y w3(A8), respectivamente. Los compuestos de los sectores I y III son compuestos w6, mientras que los de los sectores Il y IV son compuestos w3. "Des" se refiere a las etapas de desaturasa en la ruta catalizada por desaturasas como se indica, mientras que "Elo" se refiere a las etapas de la elongasa catalizadas por elongasas como se indica. La flecha gruesa indica le etapa de la A5 elongasa. Las flechas discontinuas indican las etapas de la ruta "Sprecher" que funciona en células de mamíferos para la producción de DFIA a partir de DPA.

Figura 2. Representación esquemática (no parte de la invención) de la construcción, pVLin-Ed6, usada para transformar lino. RB, borde derecho del ADN-T; FIPT+Cat-1, gen de resistencia a la higromicina interrumpido por el intrón Cat-1; 35SP, Promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor; LinT, Terminador de linina; ED6, secuencia de codificación de longitud completa de la A6 ácido graso desaturasa de Echium; LinP, Promotor de linina; LB, borde izquierdo del ADN-T. P, Psfl; A, Apal; X, Xhotl; N, Notl.

Clave del listado de secuencia

SEQ ID NO:1 - A6 desaturasa de seres humanos (N.° de Registro Genbank: AAD20018).

SEQ ID NO:2 - A6 desaturasa de ratón (N.° de Registro Genbank: NP_062673).

SEQ ID NO:3 - A6 desaturasa de Pythium irregulare (N.° de Registro Genbank: AAL13310).

SEQ ID NO:4 - A6 desaturasa de Borago officinalis (N.° de Registro Genbank: AAD01410).

SEQ ID NO:5 - A6 desaturasa de Anemone leveillei (N.° de Registro Genbank: AAQ10731).

SEQ ID NO:6 - A6 desaturasa de Ceratodon purpureus (N.° de Registro Genbank: CAB94993).

SEQ ID NO:7 - A6 desaturasa de Physcomitrella patens (N.° de Registro Genbank: CAA11033).

SEQ ID NO:8 - A6 desaturasa de Mortierella alpina (N.° de Registro Genbank: BAC82361).

SEQ ID NO:9 - A6 desaturasa de Caenorhabditis elegans (N.° de Registro Genbank: AAC15586).

SEQ ID NO: 10 - A6 desaturasa de Echium plantagineum.

SEQ ID NO:11 - A6 desaturasa de Echium gentianoides (N.° de Registro Genbank: AY055117).

SEQ ID NO: 12 - A6 desaturasa de Echium pitardii (N.° de Registro Genbank: AY055118).

SEQ ID NO: 13 - A5/A6 desaturasa bifunctional de Danio rerio (pez cebra).

SEQ ID NO 14 a 16 - Motivos conservados de Echium sp. A6 desaturasas.

SEQ ID NOs 17 a 22, 30 y 31 - Cebadores de oligonucleótidos.

SEQ ID NO:23 - Promotor de linina de Linum usitatissimum.

SEQ ID NO:24 - Terminador de linina de Linum usitatissimum.

SEQ ID NO:25 - Secuencia de ADNc que codifica la A6 desaturasa de Echium plantagineum.

SEQ ID NO:26 - A15 desaturasa de Perilla frutescens (N.° de Registro Genbank: AF213482).

SEQ ID NO:27 - A15 desaturasa de Brassica napus (N.° de Registro Genbank: L01418).

SEQ ID NO:28 - A15 desaturasa de Betula pendula (N.° de Registro Genbank: AAN17504).

SEQ ID NO:29 - A15 desaturasa de Arabidposis thaliana (N.° de Registro Genbank:AAC31854).

Descripción detallada de la invención

Técnicas y definiciones generales

Salvo que se defina específicamente otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la técnica (por ejemplo, en cultivo de células, biología vegetal, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, síntesis de ácidos grasos, química de proteínas, y bioquímica).

Salvo que se indique otra cosa, la proteína recombinante, los cultivos celulares, y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos convencionales, bien conocidos de los expertos en la materia. Dichas técnicas se describen y explican a lo largo de la bibliografía en fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editores), ADN Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluidas todas las actualizaciones hasta la el presente), Ed Harlow and David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente).

Tal como se usa en el presente documento, el término "lípido" se refiere generalmente a una molécula orgánica, que contiene normalmente cadena(s) de hidrocarburo, que son insolubles en agua pero que se disuelven fácilmente en disolventes orgánicos no polares. Los piensos de la invención se definen en el presente documento con respecto a la composición de su componente lipídico. Este componente lipídico incluye ácidos grasos (tanto libres como esterificados, por ejemplo, en la forma de triacilgliceroles), esteroles y lípidos polares.

Tal como se usa en el presente documento, el término "ácidos grasos" se refiere a un grupo grande de ácidos orgánicos constituido por moléculas que contienen un grupo carboxilo en el extremo de una cadena de hidrocarburo; el contenido de carbono puede variar desde C2 a C34. Los ácidos grasos pueden ser saturados (no contienen dobles enlaces en la cadena de carbono) (SFA), monoinsaturados (contienen un único enlace doble en la cadena de carbono) (MUFA), o poliinsaturados (contienen dos, tres, cuatro o más dobles enlaces en la cadena de carbono) (PUFA). Salvo que se indique otra cosa, los ácidos grasos pueden estar es un estado libre (no esterificado) o en una forma esterificada tal como parte de un triacilglicerol, diacilglicérido, monoacilglicérido, acil-CoA unido u otra forma unida, o mezclas de los mismos. El ácido graso puede estar esterificado como un fosfolípido tal como las formas de fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol o fosfatidilglicerol.

Tal como se usa en el presente documento, las expresiones "ácido graso poliinsaturado de cadena larga", "LC-PUFA" o "ácido graso poliinsaturado C20" se refiere a un ácido graso que comprende al menos 20 átomos de carbono en su cadena de carbono y al menos tres dobles enlaces carbono-carbono. Generalmente, el número de átomos de carbono en la cadena de carbono de los ácidos grasos se refiere a una cadena de carbono. Si la cadena de carbono está ramificada, el número de átomos excluye aquellos en los grupos laterales. En general, el ácido graso poliinsaturado de cadena larga es un ácido graso w3, es decir, que tiene una desaturación (doble enlace carbonocarbono) en el tercer enlace carbono-carbono desde el extremo metilo del ácido graso. Preferentemente, el ácido graso poliinsaturado de cadena larga se selecciona entre el grupo que consiste en; ácido eicosatetraenoico (ETA, 20:4a 8,11,14,17, w3) ácido eicosapentaenoico (EPA, 20:5A5,8,11,14,17; w3), ácido docosapentaenoico (DPA, 22:5A7,10,13,16,19, w3), o ácido docosahexaenoico (DHA, 22:6A4,7,10,13,16,l9, w3). Será fácilmente evidente que el LC-PUFA que está en (o limitado en cantidad o incluso excluido de) un pienso de la invención, o producido por un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., alimentado con un pienso de la invención, puede ser una mezcla de cualquiera o todos los anteriores y puede incluir otro LC-PUFA o los derivados de cualquiera de este LC-PUFA.

El uso del término "pez" incluye todos los peces vertebrados, que puede ser un pez óseo o cartilaginoso.

Tal como se usa en el presente documento, el término salmón se refiere a Salmo sp. o un Oncorhynchus sp. Más preferentemente, el salmón es un Salmo sp. Incluso más preferentemente, el salmón es salmón atlántico (Salmo salar).

En una realización, el salmón, el salmón está en una etapa "larval" o "juvenil". El desarrollo de un pez reconoce 5 periodos que se producen en el siguiente orden: periodo embriónico; periodo larval; periodo juvenil; periodo adulto; periodo senescente. El periodo larval se produce una vez que el embrión ha eclosionado y tiene la capacidad de alimentarse independientemente de la yema de huevo (o de la madre en casos raros), los sistemas de órganos se desarrollan morfológicamente y alcanzan la función fisiológica. El periodo juvenil es cuando todos los sistemas de órganos se han formado completamente y son funcionales (salvo las gónadas) y el pez tiene el aspecto de adultos en miniatura, el periodo dura hasta que las gónadas maduran. Una vez que las gónadas maduran, el pez alcanza el periodo adulto, y a continuación la senescencia cuando cesa el crecimiento y las gónadas no producen gametos (Adaptado de Moyle,P.B. y Cech.J.J. 2004. Fishes An Introduction to Ichthyology, 5a Edición, Prentice Hall).

El "crustáceo" puede ser cualquier organismo del subfilum "Crustacea", y por tanto, el crustáceo puede obtenerse de fuentes marinas y/o de fuentes de agua dulce. Dichos Crustacea incluyen, aunque no de forma limitativa, organismos tales como el krill, lapas, camarones (incluyendo langostinos), cangrejos, y langostas.

Piensos

Para los fines de la presente invención, "piensos" incluye cualquier alimento o preparación, para su consumo por un salmón, que es Salmo sp. o un Oncorhynchus sp.

La presente invención proporciona un pienso que comprende un lípido, comprendiendo el ácido graso de dicho lípido al menos un 11 % (p/p) de ácido estearidónico (SDA). La invención proporciona también métodos para usar dicho pienso para criar un salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp.

En realizaciones de la invención, el ácido graso de dicho lípido comprende al menos un 11,0 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, o al menos un 30 % (p/p) de SDA.

En realizaciones adicionales, el ácido graso de dicho lípido comprende menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, o más preferentemente menos del 8 % (p/p) de ácidos grasos saturados totales (SFA). En particular, el pienso comprende niveles reducidos de 14:0 y/o 16:0 en comparación con el pienso correspondiente preparado con aceite de pescado en lugar de con aceite vegetal que comprende al menos 11 % de SDA.

Aunque el nivel de SDA que puede producirse en el aceite de semillas de plantas transgénicas puede tener más del 40 % del ácido graso, la invención puede llevarse a cabo con aceite vegetal que tiene menos SDA, tal como, por ejemplo, al menos 5,5 % de SDA. Es decir, no todo el ALA se convierte en SDA en la planta, y el aceite puede contener SDA y ALA. Por lo tanto, en otras realizaciones adicionales, el ácido graso de dicho lípido comprende al menos un 10 %, al menos un 15 %, al menos un 16 %, al menos un 17 %, al menos un 18 %, o al menos un 19 % (p/p) de ácido alinolénico (ALA 18:3A9,12,15, w3). En una realización, el nivel de ALA está en el intervalo de 10-45 % (p/p).

Preferentemente, el lípido del pienso comprende fitosterol, que puede proporcionar un beneficio adicional. En realizaciones de la invención, el lípido comprende al menos 0,025 %, al menos un 0,05 %, o al menos 0,1 % (p/p) de fitosterol. Puede comprender al menos 0,2 % de fitosterol, normalmente, en el intervalo de 0,2-0,8 (p/p) de fitosterol. El fitosterol puede ser cualquier esterol de origen vegetal procedente de plantas tales como aunque no de forma limitativa, Echium sp., canola, soja, lino, cereal o granos de leguminosas. Los ejemplos de fitosteroles incluyen, aunque no de forma limitativa, brassicasterol, campsterol, estigmasterol, p-sitosterol o cualquier combinación de estos.

En una realización adicional, el lípido está sustancialmente exento de colesterol, que puede ser ventajoso para limitar el nivel de colesterol en el pescado o crustáceo que se produce, en particular para el pescado. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "prácticamente exento de colesterol" se refiere al lípido que comprende menos de 0,1 % (p/p) de colesterol, preferentemente a un nivel indetectable. Normalmente, el lípido obtenido de las plantas está prácticamente exento de colesterol.

En otras realizaciones, al menos un 25 %, al menos un 50 %, al menos un 75 % o al menos un 90 % del SDA se esterifica en la forma de triacilglicerol.

En otras realizaciones adicionales, el contenido de lípidos del pienso tiene al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50, al menos 100, al menos 200, o al menos 250 g/kg de materia seca. En otra realización, el contenido de lípido del pienso no es más de 350 g/kg de materia seca o cualquier intervalo entre estas cifras.

En otras realizaciones, el pienso comprende al menos 0,55, al menos 1, al menos 2,5, al menos 5, al menos 7,2, al menos 10, al menos 12,5, o más preferentemente al menos 14,3 g/kg de materia seca de SDA.

En otra realización preferida más, los ácidos grasos del contenido lipídico del pienso comprenden menos de 2 % de ERPA y/o DHA, más preferentemente menos de 1 % de EPA y/o DHA.

El SDA puede ser de cualquier fuente. En una realización preferida, el SDA se proporciona en la forma de un organismo transgénico, o extracto o porción del mismo, en el que el organismo está genéticamente modificado de tal manera que produce SDA y/o produce mayores niveles de SDA que cuando se compara con un organismo natural. Preferentemente, el organismo transgénico es una planta o levadura. En una realización particularmente preferida, el SDA se proporciona en la forma de aceite extraído de una planta, especialmente una planta transgénica. Normalmente, dicho aceite se extrae de la semilla de la planta. Sin embargo, en algunas realizaciones, el SDA puede obtenerse de un organismo no transgénico que produce naturalmente SDA. por ejemplo, Echium plantagineum.

El salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., se puede alimentar con los piensos de la presente invención en cualquier manera y cantidad, y de acuerdo con cualquier programa de alimentación empleado en el salmón, que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., de cultivo. Las tasas de alimentación varían normalmente de acuerdo con factores abióticos, principalmente estacionales tales como la temperatura, y bióticos, en particular el tamaño del animal. Los peces juveniles se alimentan normalmente con 5-10 % de su peso corporal por día durante aproximadamente 4-6 tomas de alimento por día. Los peces más grandes se alimentan normalmente con 2-5 % de su peso corporal por día durante aproximadamente 1-2 tomas de alimento por día. El salmón puede dejarse alimentar según el apetito.

Preferentemente, el salmón se alimenta al menos una vez por día, más preferentemente dos o más veces por día, tal como, por ejemplo, 2-6 o 4-6 veces por día. Se prefiere eliminar cualquier exceso de alimento tras el periodo de alimentación, por ejemplo, mediante el lavado de un sistema de canalización, o mediante la retirada de la parte inferior de la jaula marina flotante.

Los beneficios aumentan cuando el salmón se alimenta durante largos periodos de tiempo, por ejemplo, durante al menos 6, 7 o 12 semanas. Se pueden usar también piensos diferentes de los descritos en el presente documento en el periodo de tiempo, sin embargo se prefiere que el pienso de la invención se utilice predominantemente durante el periodo de tiempo incluso exclusivamente.

Tal como se usa en el presente documento, "predominantemente" significa al menos el 50 % del tiempo, en ocasiones o en cantidad, según determine el contexto.

Es preferible que el salmón se alimente del SDA que contienen los piensos como mezcla con otros ingredientes bien conocidos incluidos en las formulaciones comerciales de alimento para salmones de tal manera que proporcione un alimento completo nutricionalmente equilibrado, que incluye, aunque no de forma limitativa, materia vegetal, por ejemplo, harina, grano molido grueso, almidón o grano agrietado o procesado producido a partir de un cultivo vegetal tal como trigo u otros cereales, alfalfa, maíz, avena, patata, arroz, sojas u otras legumbres; celulosa en una forma que pueda obtenerse de la pulpa de madera, pastos, hojas de plantas, y materia residual vegetal tal como cáscaras de arroz o soja, o panochas de maíz; materia animal, por ejemplo, harina de pescado o crustáceos, aceite, proteínas o materiales solubles y extractos, krill, harina de carne, harina de huesos, harina de plumas, harina de sangre, o chicharrones; materia de algas; levaduras; bacterias; vitaminas, minerales, y aminoácidos; aglutinantes orgánicos o adhesivos; y agentes quelantes y conservantes. Se notifica una amplia variedad de formulaciones en la bibliografía de patentes y científica. Como alternativa, se usa SDA para suplementar otros alimentos, por ejemplo, piensos comerciales para salmones.

En una realización, el pienso comprende harina de pescado (que puede estar o no desgrasada), pero no comprende, como ingrediente separado, aceite de pescado, Como alternativa, el pienso puede comprender algo de aceite de pescado como un ingrediente separado añadido. Sin embargo, el nivel mínimo de SDA en el ácido graso del lípido total del pienso debe seguir siendo de al menos un 5,5 %.

En los piensos a escala comercial puede proporcionarse de forma conveniente en la forma de en la forma de gránulos de alimento presionados o extrudidos.

Los componentes utilizados en las composiciones de piensos de la presente invención pueden ser de origen semipurificado o purificado. Por semipurificado o purificado se entiende un material que se ha preparado mediante purificación de un material natural o mediante síntesis de novo.

Con respecto a las vitaminas y minerales, lo siguiente puede añadirse a las composiciones de piensos de la presente invención: calcio fósforo, potasio, sodio, cloruro, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, selenio, yodo, y Vitaminas A, E, D, C, y el complejo B. Los ejemplos de estos incluyen Stay C, que es un producto comercial de vitamina C estabilizada, fosfato trisódico o Banox E, que es un antioxidante. Se pueden añadir también otras de las mencionadas vitaminas y minerales.

Desaturasas

Los organismos útiles para producir piensos de la invención comprenden normalmente un gen que codifica una A6 desaturasa, que puede ser un transgén o un gen endógeno. Tal como se usa en el presente documento, una "A6 desaturasa" es al menos capaz de convertir ALA en SDA, y/o ácido linoleico (LA, 18:2A9,12; w6) en ácido Y-linoleico (GLA, 18:2A6,9,12; w6). Los ejemplos de A6 desaturasas adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, las que comprenden (i) una secuencia de aminoácidos como la proporcionada como la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la A6 desaturasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEC ID N°:11 o SEC ID N°:12. En una realización adicional, la A6 desaturasa se codifica mediante una región codificante de proteína de uno de los gen de la A6 desaturasa relacionados en la Tabla 1 o un gen idéntico en al menos un 75 % al mismo.

La A6 desaturasa puede tener también otras actividades tales como actividad A5 desaturasa. Dichas enzimas se conocen en la técnica como una "desaturasa A5/A6 bifuncional" o una "A5/A6 desaturasa". Estas enzimas son al menos capaces de i) convertir ALA en SDA, y ii) convertir ácido eicosatetraenoico en ácido eicosapentanoico. Se ha identificado un gen que codifica una desaturasa A5/A6 bifuncional en el pez cebra (Hasting et al., 2001). El que codifica esta enzima podría representar una forma ancestral de la "desaturasa de primera línea" que posteriormente se duplica y las copias evoluciones hacia diferentes funciones de A5 y A6 desaturasa. En una realización, la desaturasa A5/A6 bifuncional se produce de forma natural en especies de peces de agua dulce. En una realización particular, la desaturasa A5/A6 bifuncional comprende

i) una secuencia de aminoácidos como se proporciona en la SEQ ID NO: 13,

ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50 % idéntica a la SEQ ID NO:13, o

iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii).

T l 1. E m l A r if r n f n .

Los organismos útiles para producir piensos de la invención comprenden generalmente un gen que codifica una "w3 desaturasa", que puede ser un transgén o un gen endógeno. Tal como se usa en el presente documento, una "w3 desaturasa" es al menos capaz de convertir LA en ALA y/o GLA en SDA y por tanto son capaces de introducir una desaturación en el tercer enlace carbono-carbono desde el extremo w del sustrato de acilo. Dichas desaturasas también se pueden conocen en la materia como A15 desaturasas cuando están activas en un sustrato C18, por ejemplo 18:2 (LA), introduciendo una desaturación en el decimoquinto enlace carbono-carbono desde el extremo carboxilo (A) de la cadena de acilo. Los ejemplos de w3 desaturasa incluyen los descritos en Pereira et al. (2004), Horiguchi et al. (1998), Berberich et al. (1998) y Spychalla et al. (1997) o los relacionados en la Tabla 2. Los ejemplos de A15 desaturasas adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, las que comprenden (i) una secuencia de aminoácidos como la proporcionada en la SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 o Se Q ID NO:29, (ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos un 50 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28 o SEQ ID n O:29, o (iii) un fragmento biológicamente activo de i) o ii). En una realización adicional, la A15 desaturasa comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a una cualquiera de la SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEC ID N°:28 o SEC ID N°:29. En una realización adicional, la A15 desaturasa tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con un N.° de registro relacionado en la Tabla 2, o está codificada mediante una región codificante de proteína de uno de los gen de la A15 desaturasa relacionados en la Tabla 2, o una proteína o gen al menos un 75 % idéntico al mismo.

El % de identidad de un polipéptido se detemina mediante un análisis GAP (Needleman and Wunsch, 1970) (programa GCG) con una penalización por creación de hueco = 5, y una penalización por extensión de hueco = 0,3. A menos que se indique otra cosa, la secuencia de interrogación tiene al menos 15 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 15 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia de interrogación tiene al menos 50 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 50 aminoácidos. Más preferentemente, la secuencia de interrogación tiene al menos 100 aminoácidos de longitud, y el análisis GAP alinea las dos secuencias sobre una región de al menos 100 nucleótidos. Incluso más preferentemente, la secuencia de interrogación y una secuencia definida en el presente documento están alineadas en la totalidad de su longitud.

El término "polipéptido" se utiliza indistintamente en el presente documento con los términos "proteína" y "enzima".

Con respecto a los polipéptidos/enzimas definidos, se apreciará que cifras de % de identidad superiores a las anteriormente citadas abarcarán las realizaciones preferidas. Por lo tanto, cuando sea aplicable, a la luz de las cifras de % de identidad mínimo, se prefiere que el polipéptido comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 60 %, más preferentemente al menos un 65 %, más preferentemente al menos un 70 %, más preferentemente al menos un 75 %, más preferentemente al menos un 76 %, más preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 %, más preferentemente al menos un 91 %, más preferentemente al menos un 92 %, más preferentemente al menos un 93 %, más preferentemente al menos un 94 %, más preferentemente al menos un 95 %, más preferentemente al menos un 96 %, más preferentemente al menos un 97 %, más preferentemente al menos un 98 %, más preferentemente al menos un 99 %, más preferentemente al menos un 99,1 %, más preferentemente al menos un 99,2 %, más preferentemente al menos un 99,3 %, más preferentemente al menos un 99,4 %, más preferentemente al menos un 99,5 %, más preferentemente al menos un 99,6 %, más preferentemente al menos un 99,7 %, más preferentemente al menos un 99,8 %, e incluso más preferentemente sea al menos un 99,9 % idéntica a la SEQ ID NO relevante citada.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento biológicamente activo" se refiere a una parte del polipéptido/enzima definido que sigue manteniendo actividad desaturasa. Dichos fragmentos biológicamente activos se pueden determinar fácilmente mediante deleciones en serie de la proteína de longitud completa y analizando la actividad del fragmento resultante.

Células

Las células adecuadas para su uso en los piensos de la invención, o que se pueden usar para producir SDA para los piensos de la invención, incluyen cualquier célula que contenga SDA o que se pueda transformar con un polinucleótido que codifica un polipéptido/enzima descrito en el presente documento, y que es por tanto capaz de utilizarse para producir SDA, Las células hospedadoras en las que se introduce(n) el(los) nucleótido(s) pueden ser tanto células sin transformar como células que se han transformado ya con al menos una molécula de ácido nucleico. Dicha molécula de ácido nucleico puede estar relacionada con la síntesis de SDA, o no estar relacionada, Las células hospedadoras pueden ser capaces tanto de producir proteínas de forma endógena (es decir, de forma natural) o de producir dichas proteínas solo después de transformarse con al menos una molécula de ácido nucleico.

Las células pueden ser procariotas o eucariotas, Las células hospedadoras pueden ser cualquier célula capaz de producir SDA, e incluyen hongos (incluyendo levaduras), parásitos, artrópodos, células animales y vegetales. Las células hospedadoras preferidas son células de levaduras y vegetales. En una realización preferida, las células vegetales son células de semillas.

En una realización, la célula es una célula animal o una célula de alga. La célula animal puede ser de cualquier tipo de animal tal como, por ejemplo, una célula animal no humana, una célula de vertebrado no humana, una célula de mamífero no humana, o células de animales acuáticos tales como de peces o crustáceos, invertebrados, insectos, etc.

Las células pueden ser de un organismo adecuado para la fermentación. Las células fermentadoras adecuadas, normalmente microorganismos, son capaces de fermentar, es decir, convertir, azúcares, tales como glucosa o maltosa, directa o indirectamente en el producto de fermentación deseado. Los ejemplos de microorganismos fermentadores incluyen organismos fúngicos, tales como levaduras. Tal como se usa en el presente documento, "levadura" incluye Saccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Candida spp., Kluveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., Trichoderma spp., Lipomyces starkey, y Yarrowia lipolytica.

Construcciones y vectores génicos

Los organismos transgénicos, y/o células hospedadoras, que producen SDA, se transforman normalmente con un vector recombinante. El vector puede ser tanto ARN como ADN, ya sea procariota o eucariota, y normalmente es un virus o un plásmido.

Un tipo de vector recombinante comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima útil para los fines de la invención (tal como un polinucleótido que codifica una A6 desaturasa o w3 desaturasa) unida operativamente a un vector de expresión. Tal como se ha indicado anteriormente, la expresión unido operativamente se refiere a la inserción de una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión de una manera tal que la molécula pueda expresarse cuando se transforma en una célula hospedadora. Tal como se usa en el presente documento, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula hospedadora y efectuar la expresión de una molécula de ácido nucleico deseada. Preferentemente, el vector de expresión es también capaz de replicarse en la célula hospedadora. Los vectores de expresión pueden ser tanto procariotas como eucariotas, y son normalmente virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen algunos vectores que funcionan (es decir, dirigen la expresión génica) en células recombinantes, incluyendo en células bacterianas, fúngicas, endoparásitos, artrópodos, otros animales y células vegetales. Los vectores de expresión preferidos de la presente invención pueden dirigir la expresión génica en células de levaduras, animales o vegetales.

En particular, Los vectores de expresión contienen secuencias reguladoras tales como secuencias de control de la transcripción, secuencias de control de la traducción, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos deseadas. En particular, las moléculas recombinantes incluyen secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción son secuencias que controlan el inicio, alargamiento, y terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son las que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que pueda funcionar en al menos una de las células recombinantes. Los expertos en la materia conocen varias secuencias control de la transcripción.

La transformación de una molécula de ácido nucleico en una célula puede llevarse a cabo mediante cualquier método por el cual una molécula de ácido nucleico pueda insertarse en la célula. Las técnicas de transformación incluyen, aunque no de forma limitativa, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, y fusión de protoplastos. Una célula recombinante puede seguir siendo unicelular o puede crecer en un tejido, órgano o un organismo multicelular. Las moléculas de ácidos nucleicos transformadas pueden seguir siendo extracromosómicas o pueden integrarse en uno o más sitios en un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante) de tal manera que se retiene su capacidad para expresarse.

Plantas transgénicas y partes de las mismas

El término "planta" como se usa en el presente documento es un nombre que se refiere a plantas completas, pero cuando se usa como adjetivo se refiere a cualquier sustancia que está presente en, se obtiene de, se deriva de, o está relacionada con una planta, tales como, por ejemplo, órganos de la planta (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores), células individuales (por ejemplo, polen), semillas, células vegetales y similares. Las plantas proporcionadas o contempladas para su uso en la práctica de la presente invención incluyen monocotiledóneas y dicotiledóneas. En realizaciones preferidas, las plantas útiles para la producción de piensos de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, cereales y leguminosas, maíz, trigo, patatas, tapioca, arroz, sorgo, mijo, yuca, cebada, o guisantes), u otras leguminosas. Las plantas pueden hacerse crecer para la producción de raíces comestibles, tubérculos, hojas, tallos, flores o frutos. Las plantas de la invención pueden ser: maíz (Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.), lino (Linum usitatissimum), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cerale), sorgo (Sorghum bicolour, Sorghum vulgare), girasol (Helianthus annus), trigo (Tritium aestivum), soja (Glycine max), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), mandioca (Manihot esculenta), coco (Cocos nucífera), aceituna (Olea europaea), avena, o cebada,

En una realización, la planta la planta es una planta oleaginosa, preferentemente una planta de un cultivo de semillas oleaginosas. Tal como se usa en el presente documento, una "planta oleaginosa" es una especie de planta utilizada para la producción comercial de aceites a partir de las semillas de la planta. La planta de semillas oleaginosas puede ser colza oleaginosa (tal como canola) maíz, girasol, soja, sorgo, aceite de palma o lino (linaza) Adicionalmente, la planta de semillas oleaginosa pude se de diferentes Brassicas, algodón, cacahuete, amapola, mostaza semilla de ricino, sésamo, cártamo, o plantas productoras de nueces. La planta puede producir altos niveles de aceite en su fruto, tal como de oliva o coco.

Los ejemplos de algodón de, y/o útiles para, la presente invención incluye cualquier especie de Gossypium, que incluye, aunque no de forma limitativa, Gossypium arboreum, Gossypium herbaceum, Gossypium barbadense y Gossypium hirsutum.

Cuando se desea la producción de SDA es preferible que la especie de planta que se va a transformar tenga una relación endógena de ALA a LA que sea al menos de 1:1. de forma más preferente al menos 2:1. Los ejemplos incluyen la mayoría, si no todas, las semillas oleaginosas tales como linaza. Esto maximiza la cantidad de sustrato Ala disponible para la producción de SDA. Esto se puede conseguir por medios transgénicos, por ejemplo, mediante la introducción de un gen de la desaturasa A15 en la planta para aumentar los niveles del sustrato ALA para la conversión en SDA.

Las plantas producidas para el uso en piensos de la invención pueden ser siempre transgénicas, y/o transformadas con genes adicionales a los descritos en detalle en el presente documento.

Las plantas de grano que proporcionan semillas de interés incluyen plantas de semillas oleaginosa y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas leguminosas incluyen judías, guisantes, soja, altramuces y similares. Las judías incluyen guar, algarroba, alholva, habas de jardín, caupi, frijol mungo, frijol de lima, habas, lentejas, garbanzos, etc.

La expresión "extracto o porción del mismo" se refiere a cualquier parte de la planta. "Porción" se refiere generalmente a un tejido u órgano específico tal como una semilla o raíz, mientras que un "extracto" implica normalmente la ruptura de las paredes celulares y posiblemente la purificación parcial del material resultante. Naturalmente, el "extracto o su porción" comprenderá SDA. Los extractos pueden prepararse utilizando las técnicas normalizadas de la materia

Las plantas transgénicas, como se define en el contexto de la presente invención, incluyen plantas y su progenie que se han modificado genéticamente utilizando técnicas recombinantes. Esto por lo general sería causa o potenciaría la producción de al menos una proteína/enzima definida en el presente documento en la planta u órgano vegetal deseado. Las plantas transgénicas incluyen todas las partes y células de dichas plantas tales como, por ejemplo, tejidos cultivados, callo, protoplastos. Las plantas transformadas contienen material genético que no está incluido antes de la transformación. El material preferentemente queda integrado de forma estable en el genoma de la planta. dichas plantas se han incluido en el presente documento en "plantas transgénicas". Una "planta no transgénica" es aquella que no se ha modificado genéticamente mediante la introducción de material genético por técnicas de ADN recombinante. En una realización preferida, las plantas transgénicas son homocigóticas para todos y cada uno de los genes que se han introducido (transgenes) de forma que su progenie no se segrega para el fenotipo deseado.

Existen varias técnicas para introducir el material genético extraño en una célula vegetal. Dichas técnicas incluyen la aceleración de material genético revestido sobre micropartículas dirigidas al interior de las células (véanse, por ejemplo, los documentos US 4.945.050 y US 5.141.131). Las plantas se pueden transformaron utilizando tecnología de Agrobacterium (véanse, por ejemplo, el documento US 5.177.010, el documento US 5.104.310, el documento US 5.004.863, el documento US 5.159.135). También se ha utilizado la tecnología de electroporación para transformar plantas (véanse, por ejemplo, el documento WO 87/06614, el documento US 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 y WO 93/21335. Además de las numerosas tecnologías para transformar plantas, el tipo de tejido que se pone en contacto con los genes extraños también puede variar. Dicho tejido incluiría, aunque no de forma limitativa, tejido embriónico, tejido de callo tipo I y II, hipocótilo, meristemo, y similares. Prácticamente todos los tejidos vegetales se pueden transformar durante el desarrollo o diferenciación usando técnicas adecuadas conocidas para los expertos en la materia.

Numerosos vectores adecuados para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas se han descrito en, por ejemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, Supl. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; y Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, KluwerAcademic Publishers, 1990. Normalmente, los vectores de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control de la transcripción de secuencias reguladoras en 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de expresión en plantas también pueden contener una región reguladora promotora (por ejemplo, una región reguladora controladora inducible o constitutiva, regulada por el entorno o por el desarrollo, o de expresión específica en células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosoma, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación.

Los ejemplos de promotores en plantas incluyen, aunque no de forma limitativa, la subunidad pequeña de la ribulose-1,6-bisfosfato carboxilasa, promotor de la beta-conglicinina, promotor de la faseolina, promotor de glutenina de alto peso molecular (HMW-GS), promotores de genes de almidón biosintético, promotor de ADH, promotores de choque térmico y promotores específicos de tejidos, Los promotores pueden contener también determinados elementos potenciadores de secuencias que pueden mejorar la eficacia de la transcripción. Los potenciadores típicos incluyen, aunque no de forma limitativa, Adh-intrón 1 y Adh-intrón 6.

Los promotores constitutivos dirigen la expresión génica continua en casi todos los tipos de células y en todo momento (por ejemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Los promotores específicos de tejidos son responsables de la expresión génica en células o tejidos específicos, tales como las hojas o semillas (por ejemplo, zeína, oleosina, napina, ACP, globulina y similares) y estos promotores también se pueden usar.

En una realización particularmente preferida, el promotor dirige la expresión en tejidos y órganos en los que tiene lugar la biosíntesis de lípidos y aceites, especialmente en semillas vegetales tales como las células del endospermo del embrión en desarrollo. Los promotores que son adecuados son el promotor del gen napin de la colza oleaginosa (documento US 5.608.152), el promotor USP de Vicia faba (Baumlein et al., 1991), el promotor de oleosina de Arabidopsis (documento WO 98/45461), el promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (documento US 5.504.200), el promotor Bce4 de Brassica (documento WO 91/13980), el promotor del gen de linina del lino, o el promotor B4 de leguminosa (Baumlein et al., 1992), y promotores que conducen a la expresión específica en semillas en monocotiledóneas tales como maíz, cebada, trigo, centeno, arroz, y similares. Promotores notables son el promotor del gen 1pt2 o 1pt1 de la cebasa (documentos WO 95/15389 y WO 95/23230) o los promotores descritos en el documento WO 99/16890 (promtores del gen de hordeína de cebada, el gen de glutelina del arroz, el gen de orizina del arroz, el gen de prolamina del arroz, el gen de gliadina del trigo, el gen de glutelina del trigo, el gen de zeína del maíz, el gen de glutelina del avena, el gen de kasirina del sorgo, el gen de secalina del centeno). Otros promotores incluyen los descritos en Broun et al. (1998) y en el documento US 20030159173.

En determinadas circunstancias, puede ser deseable usar un promotor inducible. Un promotor inducible es responsable de la expresión de los genes en respuesta a una señal específica, tal como: un estímulo físico (genes de choque térmico); luz (RUBP carboxilasa); hormona (Em); metabolitos; y estrés. Se pueden usar otros elementos deseables para la transcripción y traducción que funcionan en plantas,

Además de los promotores vegetales, se pueden usar promotores de diferentes fuentes eficazmente en células vegetales para expresar genes extraños. Por ejemplo, promotores de origen bacteriano, tal como el promotor de octopina sintasa, el promotor de nopalina sintasa, el promotor de manopina sintasa; promotores de origen vírico, tal como el virus del mosaico de la coliflor (35S y 19S) y similares son también de utilidad.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Materiales y métodos

Extracción y aislamiento de lípido

Las muestras se criodesecaron y se extrajeron según un protocolo modificado de Bligh y Dyer (Bligh y Dyer, 1959). Una extracción monofase, CHCI3/Me0H/H20, (1:1:0,9, en vol), se usó para proporcionar un extracto lipídico total (TLE).

Las clases de lípidos se analizaron mediante un analizador Iatroscan MK V de cromatografía en capa fina-detector de ionización por llama (TLC- FID) (latron Laboratories, Japón). Las muestras se distribuyeron sobre Sill Chromarods de gel de sílice (tamaño de partículas 5 |jm) y se revelaron en un tanque de vidrio revestido con papel de filtro extraido previamente. El disolvente utilizado en la separación de lípidos fue hexano: dietil éter: ácido acético (60:17:0,1, v/v/v) (Volkman y Nichols, 1991). Después de desarrollar durante 25 minutos, los chromarods se secaron en el horno y se analizaron inmediatamente para minimizar la adsorción de contaminantes atmosféricos. Las clases de lípidos se cuantificaron mediante el programa informático DAPA (Kalamunda, WA, Australia). El FID se calibró para cada clase de compuesto: fosfatidilcolina; colesterol; éster de colesterilo; ácido oleico; hidrocarburo (escualeno); éster de cera (derivado de aceite de pescado); triacilglicérido (derivado de aceite de pescado); y DAGE (purificado de aceite de hígado de tiburón).

Una alíquita del TLE se trans-metiló en metanol:cloroformo:ácido clorhídrico (10:1:1, v/v/v) durante 1 h a 100°C. Tras adición de agua, la mezcla se extrajo tres veces con hexano:cloroformo (4:1, v/v) para producir ésteres metílicos de ácido graso (FAME). Los FAME se concentraron bajo atmósfera de nitrógeno y se trataron con N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (BSFTA, 50 j l , 60°C, 1 h) para convertir los grupos hidroxilo en sus correspondientes ésteres de trimetilsililo. Las muestras se llevaron hasta un volumen conocido con patrón de inyección interno (23:0 o 19:0 FAME) y se analizaron mediante cromatografía de gases (GC) con un Agilent Technologies 6890N GC (Palo Alto, California, EE.UU.) provisto de una columna de gel de sílice fundida capilar de metilsilicona reticulada HP-5 (50 mx0,32 mm d.i.), y un f ID. Se usó helio como gas portador. Las muestras se inyectaron, en un inyector con/sin división, y un automuestreador Agilent Technologies 7683 Series en modo sin división, para una temperatura de horno de 50°C. Después de 1 min, la temperatura del horno se aumentó hasta 150°C a 30°C min-1, después hasta 250°C a 2°C por min y finalmente hasta 300°C a 5°C min-1. Los picos se cuantificaron mediante el programa informático GC ChemStation de Agilent Technologies (Palo Alto, California, EE.UU.). Los componentes individuales se identificaron mediante los datos de sus espectros de masa y por comparación de los datos de sus tiempos de retención con los obtenidos con patrones auténticos y de laboratorio. Los resultados de GC están sometidos normalmente a un error de ±5 % del área componente individual. Los análisis GC-espectrometría de masas (GC-MS) se realizaron en un espectrómetro de masas Finnigan Thermoquest GCQ GC provisto de un inyector de columna con el programa informático ThermoquestXcalibur (Austin, Texas, EE.UU.). El GC estaba provisto de una columna capilar similar a la anteriormente descrita.

Se usó una columna polar para separar 18:1w9 and 18:3w3 que eluyeron simultáneamente en la columna HP5 Los FAME se analizaron en un cromatógrafo de gases Hewlett Packard 5890 (GC) provisto de un detector de ionización por llama (FID) a 250°C. Las muestras de FAME se inyectaron usando un inyector con/sin división en una columna polar de sílice fundida BPX-70 (50 m x 0,32 mm d.i.). El gas portador fue helio. La temperatura del horno de GC se mantuvo inicialmente al 45°C durante 2 min tras la inyección y posteriormente se aumentó a 30°C/min hasta 120°C y a 3°C/min hasta 240°C, después se mantuvo isotérmicamente durante 10 min.

Análisis estadístico

Los valores medios se notifican más o menos el error estándar de la media. Los datos de porcentaje se transformaron según el arcseno antes del análisis. La normalidad y la homogeneidad de la varianza se confirmaron y se consiguió una comparación entre medias por análisis monolateral de la varianza (ANOVA). Se consiguieron comparaciones múltiples mediante HSD de Turkey-Kramer. La significancia se aceptó como probabilidades de 0,05 o menos. El análisis estadístico se llevó a cabo usando SPSS para Windows versión 11.

Transformación de Brassica

Se esterilizaron semillas de Brassica napus (Línea BLN 1239) superficialmente enjuagándolas en etanol al 70 % (v/v) durante 2 min y a continuación se enjuagaron durante 10 min con agua corriente a 55°C. Se esterilizaron las semillas durante 20 min en lejía comercial al 25 % (10 g/l de hipoclorito de sodio) que contenía Tween-20 al 0,1 %. Las semillas se lavaron vigorosamente con H2O destilada estéril, colocadas en un medio GEM en jarras de cultivo de tejido y se mantuvieron en la cámara fría durante dos días para la germinación. Las jarras se transfirieron a baja intensidad de luz (20 |jMm2s-1) durante aproximadamente cuatro a seis días a 24°C para el crecimiento de los cotiledones. Se retiraron las raíces y los ápices en condiciones asépticas. Los segmentos de hipocótilo escindidos (10 mm) se lavaron con 50 ml de medio CIM durante aproximadamente 30 min sin agitación en la cabina de flujo laminar. Se retiró el CIM y se transfirieron los segmentos a un matraz de 250 ml con 50 ml de CIM. Se precintó con una hoja de aluminio estéril y se agitó durante 48 horas a 24°C con baja intensidad de luz (10 jMm2s-1).

Las cepas de Agrobacterium que contenían vectores de transformación de plásmidos se hicieron crecer en 5 ml de medio LB media con los antibióticos adecuados a 28°C durante aproximadamente dos días, se transfirieron a un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 45 ml de LB sin antibióticos y se cultivaron durante cuatro horas a 28°C con agitación. Las células de Agrobacterium se aglomeraron mediante centrifugación, se lavaron, y se resuspendieron suavemente en aproximadamente 20 ml de BM. La densidad óptica a 600 nm de la suspensión de Agrobacterium resultante se ajustó a 0,2 con BM. La suspensión celular se añadió a los explantes que se habían drenado del medio CIM, se mezcló brevemente y se dejó reposar durante 20 min. Se retiró la suspensión de Agrobacterium , Los explantes de hipocótilo se lavaron una vez con 50 ml de CIM y se continuó el cultivo simultáneo durante 48 horas en un agitador planetario. Tras esto, el medio era ligeramente lechoso debido al crecimiento de Agrobacterium . Se retiró el CIM y se lavaron los explantes tres veces con 50 ml de CIM durante un minuto y a continuación dos veces durante una hora en un agitador planetario a 140x g. Tras los lavados, se añadieron 50 ml de CIM que contenían 200 mg/l de Timentin® y se colocaron en un agitador planetario durante 24 horas. En condiciones estériles, el medio CIM era transparente en esta etapa.

Se llevó a cabo la regeneración de las vainas transformadas en un proceso de selección en dos etapas. Inicialmente, la concentración de higromicina en el medio SIM utilizado era de 5 mg/l. Después de aproximadamente dos semanas, los explantes con callos desarrollado se transfirieron a SIM que contenía 20 mg/l de higromicina. Cuando las vainas que se regeneran habían desarrollado hojas más largas de un cm, se escindieron cuidadosamente y se transfirieron a SEM con 20 mg/l de higromicina. Después de dos semanas, los tallos normalmente se habían alargado y los ápices se transfirieron a RIM que contenía 10 mg/l de higromicina. Las vainas sin alargamiento se subcultivaron en SEM cada dos a tres semanas hasta que fueron suficientemente largas para transferirse a RIM. Cuando las raíces tuvieron aproximadamente dos cm de longitud, se retiraron las plántulas regeneradas de las macetas de cultivo de tejido y se transfirieron al suelo para el crecimiento adicional,

Recetas de medios

Se proporciona a continuación la composición de los medios de cultivo de tejidos utilizados en este procedimiento Contenían sales MS (Murashige and Skoog, 1962), MS o vitaminas B5 (Gamborg et al., 1968), sacarosa y MES. Se ajustó el pH a 5,8 con KOH antes de la esterilización. Para los medios sólidos, se añadió agar y a continuación se autoclavaron. Se dejaron enfriar los medios que contenían agar por debajo de 50°C y se añadieron los compuestos esterilizados mediante filtro a los medios fundidos vertiéndolos tanto en sus placas Petri de plástico como en jarras de cultivo de tejido de 250 ml de policarbonato (Sarstedt, No: 75.9922519) A continuación se proporciona la composición de diversos medios con todos los aditivos: medio de germinación (GEM); medio basal (BM); medio inductor de callo (CIM, modificado por Radke et al., 1988); medio de lavado (WM); medio inductor de brotes (CIM, modificado por Radke et al., 1988); medio de elongación de brotes (SEM) y medio inductor de raíces (RIM, modificado a partir de Blocketal., 1989).

GEM: 1 x sales MS, 1 x vitaminas MS, Sacarosa (20 gl-1), MES (500 mgl-1), agar (8 gl-1), pH a 5,8.

BM: 1 x sales MS, 1 x vitaminas B5, Sacarosa (30 gl-1), MES (500 mgl-1), pH a 5,8.

CIM: 2,4-D (1,0 mgl-1) y Kinetin (1,0 mgl-1) añadido al BM.

WM: 2,4-D (1,0 mgl-1), Kinetin (1,0 mgl-1) y Timentin® (200 mgl-1) añadidos al BM

SIM: AgNO3(500 mgl-1), ribósido de zeatina (0,5 mgl-1), BAP (2,0 mgl-1), GA3(0,01 mgl-1), Timentin® (200 mgl-1), Higromicina (5 a 30 mgl-1), y Agar (8 gl-1) añadidos al BM.

SEM: 0,5 x sales MS, 0,5 x vitaminas B5, Sacarosa (10 gl-1), MES (500 mgl-1), Timentin® (200 mgl-1), Higromicina (20 a 30 mgl-1), agar (8 gl-1), pH a 5,8.

RIM: 0,5 x sales MS, 0,5 x vitaminas B5, Sacarosa (10 gl-1), MES (500 mgl-1), IBA (0,1 mgl-1), Timentin® (200 mgl-1), Higromicina (20 a 30 mgl-1), Agar (8 gl-1), pH a 5,8.

Ejemplo 2. Peces alimentados con las composiciones que incluyen SDA derivado de plantas

El ácido estearidónico (SDA, 18:4 w3) es un precursor de LC-PUFA, derivado mediante desaturación de ALA mediante la desaturasa (Figura 1). La A6 desaturasa también está implicada en otras etapas de la biosíntesis de LC-PUFA en la formación de DHA a partir de EPA en vertebrados (Yamazaki et al., 1992) y 18:2 w6 en 20:4 w6. Por lo tanto, es posible que la A6 desaturación de ALA esté fuera de competencias de la ruta w6 en peces y crustáceos cuando la dietas contengan niveles elevados de 18:2 w6, presente en aceites vegetales tales como canola y girasol.

El aceite de unas pocas fuentes vegetales como Echium plantagineum tienen SDA en su perfil de ácido graso, hasta aproximadamente un 15-20 % en porcentaje de ácido graso en el aceite. Para determinar si el aceite rico en SDA sirve como sustrato eficaz para la acumulación de w3 LC-PUFA en peces, se realizó un ensayo de alimentación in vivo usando salmón (Salmo salar L.). Las dietas incluyeron un nivel de aceite de canola al utilizado como fuente de control de ALA, como se describe en las Tablas 3 y 4.

Tabla 3. Ingrediente ^{y composición lipídica (g/kg de materia seca) de las dietas} _{experimentales}

Dieta

Aceite CO (g) ^{Aceite SO} Mezcla de aceite Aceite FO (g) (g) (g)

Ingredientes de la composición (g

kg-1)

Harina de pescado (desgrasada) 150 150 150 150

Caseína 150 150 150 150

Gluten de trigo 100 100 100 100

Soja Hipro 226 226 226 226

Aceite de pescado 0 0 0 130

Aceite de canola 130 0 65 0

Aceite SDA 0 130 65 0

Almidón Pre-Gel 150 150 150 150

Mezcla de vitamina3 3 3 3 3

Mezcla mineralb 5 5 5 5

Stay Cc 3 3 3 3

Cloruro de colina 2 2 2 2

Bentonita 50 50 50 50

CMC 10 10 10 10

Sodio Mono P 20 20 20 20

Óxido de itrio 10 10 10 10

FAME SFA total 6,7 10,8 12,2 44,9

MUFA total 81,2 41,3 56,2 32,9 18:3003 ALA 13,1 25,4 20,9 3,1

18:4w3 SDA 0,0 14,3 7,2 4,2

20:5w3 EPA 0,1 0,1 0,0 18,0

22:6w3 DHA 0,6 0,4 0,0 10,7

Total w3 13,9 40,2 28,6 39,6

18:2w6 28,2 25,8 27,0 8,0

Total w6 28,2 26,1 27,0 9,3

Otros PUFA 0,0 11,6 5,9 3,3

Total PUFA 42,1 77,9 61,5 52,2

SO, SA14 crosesencial rico en ácido estearidónico de Croda Chemicals; CO, dieta de aceite de canola; Mezcla, mezcla 1:1 de dieta de aceite de canola y aceite de ácido estearidónico; FO, dieta de aceite de pescado, SFA, Ácidos grasos saturados; MUFA, ácidos grasos monoinsaturados; PUFA, ácidos grasos poliinsaturados; CMC, Carboximetilcelulosa; DHA, Ácido docosahexanoico; EPA, SDA, Ácido estearidónico; Ácido eicosapentanoico. a Mezcla de vitamina (ASV4) a suministrar por kilogramo de alimento: 2,81 mg de tiamina HCl, 1,0 mg de riboflavina, 9,15 mg de piridoxina HCl, 25 mg de ácido nicotínico, 54,35 mg de D-pantotenato de calcio, 750 mg mio-inositol, 0,38 mg D-biotina, 2,5 mg de ácido fólico, 0,03 mg de cianocobalamina, 6350 UI de acetato de retinol, 2800 UI colecalciferol, 100 UI DL acetato de □-tocoferol, 5 mg menadona bisulfato de sodio, 100 mg Roche rovimix E50.

b Mezcla mineral (TMV4) a suministrar por kilogramo de alimento: 117 mg de CuSO4.5H2O, 7,19 mg de Kl, 1815 mg de FeSO4-7H2O 307 mg de MnSO4.H2O 659 mg de ZnSO4.7H2O, 3,29 mg de Na2SeO3, 47,7 mg de CoSO4-7H2O

c L-Ascorbil-2-polifosfato (Stay-C, Roche Vitamins Australia, French Forest, NSW, Australia).__________________

Se formularon cuatro dietas para comparar el aceite de canola (CO), dos niveles diferentes de ácido estearidónico (100 % (SO), 1:1 SO:CO (Mezcla)), y aceite de pescado (FO) (Tablas 3 y 4). El aceite de pescado se desgrasó tres veces con una mezcla 2:1 de hexano y etanol (400 ml 100 g-1 de aceite de pescado) Soja (Hamlet Protein A/S, Horsens, Dinamarca), caseína (MP Biomedcals Australasia Pty Ltd, Seven Hills NSW, Australia), gluten de trigo (Starch Australasia, Land Cove, NSW, Australia) y almidón de maíz pregelatinizado BOIIC (Penford Australia Limited, Lane Cove, NSW, Australia) se utilizaron. El aceite rico en ácido estearidónico se proporcionó como Crossential SA14 (Croda Chemicals, East Yorkshire, Reino Unido). El aceite de pescado era de Jack Mackerel (Skretting Australia, Cambridge, Tasmania Australia). Stay-C y Rovimix E50 fueron suministrados por Roche Vitamins Australia (Frenchs Forest, NSW, Australia), y los restantes ingredientes fueron suministrados por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). El óxido de itrio se usó como marcador de la digestibilidad. Las dietas se fabricaron en gránulos de 3 mm de diámetro con un California Pellet Mill (CL-2), se secaron y se almacenaron a -5°C.

El experimento de alimentación se llevó a cabo en la School of Aquaculture, Universidad de Tasmania, Launceston, Australia. Se obtuvieron alevines de salmón atlántico (Salmo salar) de Wayatinah Salmon hatchery (SALTAS, Tasmania, Australia) y se almacenaron aleatoriamente en tanques de 300 l con 25 peces por tanque. Se aclimataron durante 10 días. Los tanques se mantuvieron a una temperatura constante de 15,0°C y un fotoperiodo de 16:8 (luzoscuridad). Los peces se mantuvieron en un sistema de circulación parcialmente con agua nueva. El agua se trató por medios físicos, Uv y biofiltros, con una sustitución continua de aproximadamente un 15 % diario. El oxígeno disuelto, pH, amoniaco, nitrato, nitrito, y cloro se controlaron diariamente para garantizar que la calidad del agua permanecía en los parámetros recomendados para el salmón atlántico (Wedemeyer, 1996).

^T i ab ^blla 4^.. ^C . ^o .^m i\^{posición de ácido graso del lípido en las dietas ( % de ácido graso}

_total).

FA CO SE SO SE Mix SE FO SE

14:0 0,23 0,00 0,13 0,02 0,21 0,01 6,38 0,08

16:0 1,58 0,79 4,30 1,24 5,57 0,93 19,23 0,20

18:0 2,58 0,01 3,83 0,02 3,19 0,01 3,90 0,04

Otros Sat 0,75 0,01 0,06 0,00 0,44 0,00 5,02 0,01 Total Sat 5,13 8,33 9,40 34,53

16:1w7 0,28 0,00 0,17 0,03 0,25 0,00 7,06 0,05 18:1w9 52,03 0,17 24,45 0,06 37,54 0,06 10,88 0,19 18:1w7 3,28 0,02 1,04 0,02 2,18 0,02 2,69 0,01 20:1w9 0,96 0,00 0,74 0,01 0,87 0,00 1,66 0,01 Otros

_Mono 5,92 0,06 5,32 0,17 2,42 0,12 3,02 0,03 Total Mono 62,47 31,73 43,26 25,31

18:3w3 10,07 0,03 19,57 0,04 16,04 0,03 2,39 0,04 18:4w3 0,00 0,00 11,01 0,09 5,57 0,03 3,20 0,06 20:4w3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,73 0,01 20:5w3 0,05 0,02 0,05 0,02 0,00 0,00 13,85 0,12 22: 5w3 0,14 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 1,46 0,02 22:6w3 0,43 0,01 0,33 0,06 0,41 0,01 8,26 0,08 Otros w3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,59 0,00 Total w3 10,68 30,96 22,01 30,46

18:2w6 21,71 0,04 19,82 0,03 20,81 0,01 6,18 0,10 18:3w6 0,00 0,00 8,20 0,06 4,33 0,02 0,64 0,06 20:3w6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 20:4w6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,80 0,01 22:5w6 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,19 0,03 Otros w6 0,00 0,00 0,23 0,04 0,00 0,00 0,00 0,00 Total w6 21,71 28,25 25,13 7,82

Otros

0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

PUFA

Total 32,40 59,21 47,15 38,28

PUFA

Los peces se anestesiaron inicialmente (50 mg l-1, benzocaína) y se registraron los pesos y las longitudes. Se sacrificaron cuatro peces y se evaluaron para determinar el contenido y la composición de lípidos inicial. Veinticinco peces se distribuyeron aleatoriamente en doce tanques de 300 l. Los pesos de los peces no fueron significativamente diferentes entre los tanques (43,6g±0,7). Las cuatro dietas se alimentaron por triplicado en una relación de 1,1 % de peso corporal al día ( % BW d-1), en dos alimentaciones iguales a las 0900 y 1700 horas con alimentadores de cinta automáticos. Cada tres semanas, todos los peces se anestesiaron 50 mg l-1, benzocaína) y se pesaron. Los peces se dejaban sin alimento el día anterior a la medición. Cada 7 días, se estimó el consumo de alimento total (kg DM) a partir del alimento que no se había consumido por recogida en los colectores de sedimentos. La cantidad de alimento no consumido se estimó a partir del número de gránulos no consumidos usando el peso promedio de un gránulo de cada alimento (Helland et al., 1996).

Las velocidades de crecimiento específicas (SGR) se calcularon como

SGR ( % día-1) = 100 x (In (W²/W ¹)) x d-1

donde W ¹ y W ² son los pesos (g) a dos tiempos y d es el número de días.

Al finalizar el experimento, los peces se dejaron sin alimento el día anterior a ser anestesiados (50 mg l-1, benzocaína) y se determinaron el peso y longitud de las aletas. Tres peces por tanque se sacrificaron por golpe en la cabeza tras inmersión en anestésico. Las muestras de tejido se disecaron, y el músculo rojo y el músculo blanco se muestrearon a lo largo de la aleta dorsal. Las muestras se congelaron a -80°C hasta el análisis.

Resultados

No se observaron diferencias significativas entre el pescado alimentado con las cuatro dietas con respecto al peso inicial y final, aumento de peso, velocidad de crecimiento específica (SPR), consumo total de alimento (FC), relación de eficacia del alimento (FER), índice hepatosomático (HSI) o supervivencia, determinados usando ANOVA (Tabla 5).

Después de 42 días no hubo diferencias estadísticas en la composición de los lípidos analizados con respecto a las clases de lípidos para los diferentes grupos de la dieta, tanto en el músculo rojo como en el blanco (Tablas 6 y 7). Las clases de lípidos predominantes en el músculo rojo fueron TAG (94,0-96,7 %). Hubo significativamente menos TAG (p>0.02) en el pescado alimentado (42,0-67,0 %) en comparación con la medida inicial (82,0 %) para el músculo blanco.

Para la composición de ácido graso, hubo niveles más elevados significativamente (p>0,01) para 18:3w3 y 18:4w3, en los tejidos tanto del músculo rojo como del músculo blanco, los peces alimentados con SO que en los peces alimentados con la dieta Mixta. Los niveles de 18:3w3 y 18:4w3 fueron significativamente mayores que en los peces alimentados con FO y CO (Tablas 6 y 7). Hubo niveles más elevados significativamente (p>0,01) en los tejidos de ambos músculos de 22:6 w3 y total w3 en las dietas FO y SO en comparación con las dietas Mixta y CO. Hubo niveles más elevados significativamente (p>0,01) de 20:5 w3 en los peces alimentados con FO y SO en comparación con los peces alimentados con CO en los tejidos tanto del músculo rojo como del blanco. La relación de w3/w6 fue significativamente menor (p>0,01) en el pescado alimentado con la dieta CO y mixta en comparación con las dietas SO y FO.

Tabla 5. Crecimiento y eficacia del salmón atlántico alimentado con piensos experimentales de aceite de canola (CO), aceite rico en ácido estearidónico (SO),

_______________________ 1:1 CO:SO (Mezcla) y Aceite de pescado (FO) (media ± SE)._______________________

Alimento

CO Mix SO FO

Inicial 46,2 ± 2,5 44,6 ± 1,1 44,8 ± 1,1 42,3 ± 1,2 Peso final

81,4 ± 8,4 80,1 ± 1,9 76,9 ± 2,2 76,5 ± 3,3 (g)

Aumento

de peso 35,1 ± 5,9 35,5 ± 0,8 32,1 ± 2,0 34,1 ± 3,1 (g)

SGR ( % 1,2 ± 0,2 1,3 ± 0,0 1,2 ± 0,1 1,2 ± 0,1

día-1) FC 41,4 ± 2,0 41,9 ± 0,8 40,5 ± 0,7 38,0 ± 1,8 _total

(g DM)

_{FER (g/g} 0,8 ± 0,1 0,8 ± 0,0 0,8 ± 0,1 0,9 ± 0,0 DM)

_{HSI ( %)} 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,1 0,9 ± 0,2 0,9 ± 0,1

Supervive

_ncia 98,7 ± 1,4 98,7 ± 1,4 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 SO, dieta rica en ácido estearidónico; CO, dieta de aceite de canola; Mezcla, mezcla 1:1 de dieta rica en aceites de canola y de ácido estearidónico; FO, dieta de aceite de pescado;

DM, Materia seca

1SGR, Velocidad de crecimiento específica = 100 x (In (Wf¡na|(g)/W¡n¡dai(g)) x número de días (d)-1

2FC, Consumo total de alimento = Cantidad total (g Dm) consumida por un individuo durante 42 días.

3FER, relación de eficacia del alimento = aumento de peso total (g)/ consumo de alimento total (g DM).

4HSI, índice hepatosomático = 100 (peso del hígado (g WW) / peso corporal total (g WW)). Supervivencia durante el experimento de crecimiento.______________________________________________________________________

En ambos tejidos musculares, la dieta de FO sorprendentemente proporcionó niveles más elevados significativamente (p>0,01) de 14:0, 16:0 y saturados totales en comparación con el alimento CO y Mixto. La dieta de FO proporcionó niveles más elevados significativamente (p>0.01) de 14:0 en ambos tejidos musculares y de 16:0 y saturados totales en el músculo rojo en comparación con los peces alimentados con la dieta SO. En ambos tejidos musculares, El salmón alimentado con FO y SO tuvo niveles más bajos significativamente (p>0,01) de 18:1 w9 y MUFA total MUFA en comparación con los peces alimentados con la dieta CO y mixta. Hubo niveles más elevados significativamente (p>0,01) de 18:2 w6 y total w6 en los peces alimentados con la dieta CO y mixta.

Discusión

La inclusión de SO a 130 o 65 g/kg de dieta para alevines de salmón atlántico no alteró significativamente el crecimiento o las tasas de conversión de alimento en comparación con otras dietas experimentales durante el ensayo de crecimiento de 42 días en agua dulce (Tabla 5). Hubo poco efecto entre las dietas según los perfiles de clase lipídica (Tablas 6 y 7). Hubo significativamente menos TAG en el músculo blanco de los peces alimentados en comparación con la dieta debido a la inclusión de aceite en la dieta a un nivel de 130 g/kg en comparación con la dieta comercial (aprox. 300 g/kg) con la que se alimentaban antes del experimento.

Los perfiles de FA en el músculo de los peces están estrechamente relacionados con el perfil de FA de su dieta. Se había demostrado anteriormente para el salmón alimentado usando aceites de canola, girasol y lino, es decir, dietas ricas en ALA y sin EPA y DHA, que había una reducción significativa en total w3 y w3 LC-PUFA, en particular DHA y EPA (Bransden et al., 2003; Bell et al., 2003; Polvi y Ackman, 1992; Bell et al., 2004). Por lo tanto, una conversión mínima, o acumulación poco importante de, LC-PUFA se produjo cuando el pescado se alimentaba con aceite vegetal. En dichos estudios, las velocidades de crecimiento y la salud de los peces alimentados con los aceites vegetales no se vieron alterados.

En el estudio descrito en el presente documento, los tamaños de los alevines de salmón atlántico fueron inicialmente 43,6g± 0,7 g hasta un peso final de 72,4 g ± 1,9 g. Los peces estaban en una etapa de crecimiento importante. Antes de la esmoltificación, el salmón atlántico almacena FA, especialmente w3 LC-PUFA, antes de la energía que requiere la transferencia al agua salada, durante la cual, el salmón experimenta cambios principales en su metabolismo de los lípidos.

La inclusión de SDA a 14,3 o 7,2 g/kg afectó significativamente los perfiles de FA del salmón (Tablas 6 y 7). Los peces alimentados con la dieta que contenía los niveles más elevados de SDA tuvieron significativamente mayores niveles de EPA, DPA, DHA y total w3 en las muestras de músculo que los peces alimentados con dieta CO. En algunos aspectos, la composición de ácido graso de los tejidos de los peces mejoró con respecto a los peces alimentados con dieta FO. Por ejemplo, el nivel de grasa saturada se redujo. La dieta SO también tuvo ventajas por su característica al combinarse con los niveles elevados de LC-PUFA.

Ni la dieta CO ni la dieta SO contenían EPA o DHA en niveles importantes, siendo < 0,7 % del ácido graso presente en el lípido, donde el nivel traza tiene probablemente su origen en el componente de harina de pescado. Por lo tanto, la mayor acumulación de EPA, DPA y DHA en los tejidos de los peces debe haber representado un aumento en la biosíntesis de ácidos grasos a partir de DHA en el pescado.

Este experimento mostró que niveles elevados de total w3, DHA y EPA se podrían mantener en un pez como el salmón sin inclusión como FA en la dieta. Este experimento también demostró que los niveles de ácidos grasos conseguidos, como se recoge en las Tablas 6 y 7, por ejemplo los niveles de SDA, EPA, DPA, DHA, total LC-PUFAw3, o total w3 PUFA (incluye los ácidos grasos C18), fueron niveles mínimos que se podrían lograr mediante alimentación de los peces con una dieta que incluyera SDA derivados de plantas, y que incluso podrían esperarse niveles más elevados usando dietas con niveles incluso más elevados de s Da y/o tiempos de alimentación más prolongados.

La conversión de ALA en SDA implica la desaturación en la posición A6 de la cadena de carbono con etapas de elongación de la cadena adicionales, seguido por A5 desaturación para formar EPA. La síntesis de EPA en DHA requiere elongaciones adicionales de la cadena y también implica a 6 desaturación en la conversión de 24:5 w3 en 24:6 w3 antes del acortamiento de la cadena para dar DHA (Figura 1); esto se denomina la ruta Sprecher. Con la conversión de 18:2 w6 en 20:4 w6 que también usa la A6 desaturasa, fue posible que los elevados niveles de 18:2 w6 en aceites vegetales pudieran competir por esta enzima, y por tanto se produciría una conversión mínima de ALA en SDA en la ruta w3. Los inventores han descubierto aquí que este problema se puede atenuar añadiendo SDA a la dieta de los peces. Los resultados indican que se podría usar un aceite vegetal rico en SDA como fuente de aceite de la dieta para piensos de acuicultura y, de forma importante, que el uso de aceite de SDA no afecta a la cantidad de w3 LC-PUFA en el perfil de FA del músculo del salmón.

Ejemplo 3. Piensos de gamba y de langosta

Para alimentar a langostas, gambas u otros crustáceos con dietas con un alto contenido de aceite de SDA, se pueden usar las siguientes composiciones alimenticias (Tabla 8) Se proporcionan los valores como g/kg de materia seca.

Ejemplo 4. Aislamiento de un gen que codifica la Ap-Desaturasa de Echium plantagineum

Algunas especies de plantas tales como la onagra (Oenothera biennis), la borraja común (Borago officinalis), grosella negra (Ribes nigrum), y alguna especie de Echium que pertenece a la familia de las Boraginacae contiene los ácidos grasos w6 y w3 desaturados, ácido Y-linolénico (18:3w6, GLA) y ácido estearidónico (18:4w3, DSA) en sus lípidos TAG de hojas y semillas (GuilGuerrero et al., 2000). GLA y SDA se han reconocido como ácidos grasos beneficiosos en la nutrición humana. La primera etapa en la síntesis de LC-PUFA es una A6-desaturación. GLA se sintetiza mediante una A6-desaturasa que introduce un doble enlace en la posición A6 de LA. La misma enzima es también capaz de introducir un doble enlace en la posición A6 de ALA, produciendo SDA. Se han clonado los genes de la A6-desaturasa a partir de miembros de las Boraginacae, similares a la borraja (Sayanova et al., 1997) y dos especies de Echium (Garcia-Maroto et al., 2002).

T l . Pi n m l n

Echium plantagineum es una planta anual nativa de la Europa mediterránea y África del norte. El aceite de sus semillas es poco usual ya que tiene una relación única de ácidos grasos w3 y w6 y contiene altas cantidades de GLA (9,2 %) y SDA (12,9 %) (GuilGuerrero et al., 2000), sugiriendo la presencia de actividad A6-desaturasa implicada en la desaturación de ácidos grasos w3 y w6 en las semillas de esta planta.

Clonación del gen EpID6Des de E. plantagineum

Se usaron cebadores degenerados incorporados en los sitios de restricción Xbal o Sacl que corresponden a las secuencias de los aminoácidos de los extremos N y C MANAIKKY (SEQ ID NO: 14) y EALNTHG (SEQ ID NO:15) las conocidas Echium pitardii y Echium gentianoides (Garcia-Maroto et al., 2002) Se usaron A6-desaturasas para la amplificación de la RT-PCR de las secuencias de la A0-desaturasa de E. plantagineum usando a ADN polimerasa proofreading Pfu Turbo® (Stratagene). El producto de la amplificación de la PCR de 1,35 kb se insertó en pBluescript SK(+) en los sitios Xbal y Sacl para generar el plásmido pXZP106. Se determinó la secuencia de nucleótidos de la inserción. Esta comprendía un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 483 restos de aminoácidos (SEQ ID NO:10) que tenía un alto grado de homología con las otras A6-desaturasas de E. gentianoides notificadas (SEQ ID NO: 11), E pitardii (SEQ ID NO:12) y Borago officinalis (SEQ ID NO:4). esta tiene un dominio del citocromo b5 en el extremo N, incluyendo el motivo h PGg (SEQ ID NO:16) en la región de unión a hemo, como se notificó para las otras A6- y A8-desaturasas (Sayanova et al. 1997; Napier et al. 1999). Además, la A6 desaturasa de E. plantagineum contiene tres secuencias de histidina conservadas presentes en la mayoría de las desaturasas de 'primera línea' (Napier et al., 1999). El análisis de los agrupamientos de los miembros representativos de las A6 y A8 desaturasas mostró un agrupamiento evidente del gen clonado con las otras A6-desaturasas, especialmente aquellas de las especies Echium,

Expresión heteróloga del gen de la Ap-desaturasa E. plantagineum en levadura

Se llevaron a cabo experimentos de expresión en levaduras para confirmar que el gen de E. plantagineum (secuencia de ADNc proporcionada como SEQ ID NO:25) codificó una enzima A6-desaturasa. el fragmento génico se insertó como un fragmento Xfoal Sacl en los sitios Smal-Sacl del vector de expresión en levadura pSOS (Stratagene) que contiene el promotor ADH1 constitutivo, dando como resultado el plásmido pXZP271. este se transformó con la cepa de levadura S288Ca mediante un método de choque término y las colonias transformantes seleccionando mediante la siembra en placas en placas de medio mínimo. Para el análisis de la actividad enzimática, se hicieron crecer 2 ml de cultivos clonados de levaduras a una D.O^.600 de 1.0 en medio mínimo de levaduras en presencia de NP-40 al 0,1 % a 30°C con agitación. Precursores de ácidos grasos libres, se añadieron cualquiera de ácido linoleico como linolénico como soluciones madre 25 mM en etanol, con el fin de que la concentración final de ácido graso fuera 0,5 mM. Se transfirieron los cultivos a 20°C y se hicieron crecer durante 2-3 días con agitación. Se recogieron células de levaduras mediante centrifugación repetida y se lavaron en primer lugar con NP-49 al 0,1 %, a continuación NP-40 al 0,05 % y finalmente con agua. Se extrajeron los ácidos grasos y se analizaron. Se confirmaron las identidades de los picos de ácidos grasos mediante CG-EM.

Las células de levaduras transgénicas que expresaban Echium EpID6Des fueron capaces de convertir LA y ALA en GLA y SDA, respectivamente. Alrededor de 2,9 % de LA se convirtió en GLA y 2,3 % de ALA se convirtió en SDA, confirmando la actividad A6-desaturasa codificada por el gen clonado.

Expresión funcional del gen de la A6-desaturasea de E. plantangineum A6-desaturasa en tabaco transgénico

A fin de demostrar que el gen EpID6Des podría conferir la síntesis de ácidos grasos A6 desaturados en plantas transgénicas, el gen se expresó en plantas de tabaco. Para ello, el fragmento génico se escindió de pXZPIOt como un fragmento Xfoal-Sacl y se clonó en el vector de expresión de plantas pB1121 (Clonetech) en el sitio Xfoal y Sacl; bajo el control de un promotor CaMV de 35S constitutivo, para generar el plásmido de expresión en planta pXZP341 Este se introdujo en AGL1 de Agrobacterium tumefaciens , y se usó para la transformación del tejido de la planta de tabaco W38, mediante selección con kanamicina.

se llevó a cabo la hibridación de la transferencia Northern de las plantas transformadas para detectar la expresión del gen introducido, y los ácidos grados totales presentes en los lípidos de las hojas del tabaco W38 silvestre y el tabaco transformado se analizaron como se describe anteriormente. Las plantas no transformadas contenían cantidades notables de LA (21 % de los ácidos grasos totales y ALL (37 % de los ácidos grasos totales) en lípidos de las hojas. Según se esperaba, ni GLA ni SDA, productos de A6-desaturación, se detectaron en la hoja no transformada. Asimismo, las plantas transgénicas de tabaco transformadas con el vector pB1121 tuvieron una composición de ácidos grasos similar en las hojas que las plantas W38 no transformadas. Por el contrario, las hojas de las plantas transgénicas de tabaco que expresan el gen EpID6Des mostraron la presencia de picos adicionales con tiempos de retención correspondientes a GLA y SDA. La identidad de los picos g La y SDA se confirmaron mediante GC-Ms . De forma destacable, los ácidos grados de las hojas de las plantas que expresan el gen EpID6Des contenían consistentemente aproximadamente una concentración dos veces mayor de GLA que de SDA incluso cuando los ácidos grasos A6 desaturados totales llegaron hasta el 30 % de los ácidos grasos totales en los lípidos de las hojas (Tabla 9).

Tabla 9. Composición de ácido graso en el lípido procedente de hojas de tabaco transgénico ( %).

Planta 16:0 18:0 18:1 18:2 GLA 18:3 SDA ^{Total productos A6-} _desaturados

W38 21,78 5,50 2,44 21,21 - 37,62 - -ET27-1 20,33 1,98 1,25 10,23 10,22 41,10 6,35 16,57

ET27-2 18,03 1,79 1,58 14,42 1,47 53,85 0,48 1,95

ET27-4 19,87 1,90 1,35 7,60 20,68 29,38 9,38 30,07

ET27-5 15,43 2,38 3,24 11,00 0,84 49,60 0,51 1,35

ET27-6 19,85 2,05 1,35 11,12 4,54 50,45 2,19 6,73

ET27-8 19,87 2,86 2,55 11,71 17,02 27,76 7,76 24,78

ET27-11 17,78 3,40 2,24 12,62 1,11 51,56 0,21 1,32

ET27-12 16,84 2,16 1,75 13,49 2,71 50,80 1,15 3,86

El análisis Northern de múltiples líneas independientes de tabaco transgénico mostró niveles variables del transcrito EpID6Des que por lo general se correlacionan con los niveles de productos A6-desaturados sintetizados en las plantas. Por ejemplo, la planta transgénica ET27-2 que contenía bajos niveles del transcrito EpID6Des sintetizaron solamente un 1,95 % de sus lípidos totales de las hojas como ácidos grasos A6-desaturados. Por otro lado, la planta transgénica ET27-4 contenía niveles significativamente mayores del transcrito EpID6Des y tenían también una proporción mucho más alta (30 %) de ácidos grasos A6-desaturados en los lípidos de las hojas.

El análisis de las plantas de tabaco individuales mostró que, sin excepción, GLA estaba presente a mayor concentración que SDA incluso aunque estuviera presente mayor concentración de ALA que de lA en las plantas no transformadas. Por el contrario, la expresión de EpID6Des en levadura ha resultado en niveles de aproximadamente equivalentes de conversión de LA en GLA y de ALL en SDA. Las semillas de Echium plantagineum, por otra parte, contienen niveles más elevados de SDA que de GLA. EplD6Des probablemente realiza su propia desaturación in vivo en semillas de Echium plantagineum sobre LA y ALA esterificado a fosfatidilcolina (PC) (Jones and Harwood 1980). En el ensayo con hojas de tabaco, es más probable que la enzima que desatura LA y ALA esterificado al lípido de cloroplastos monogalactosildiacilglicerol (MGDG) (Browse and Slack, 1981). En el ensayo de levaduras, los precursores de ácido graso libre LA y ALA añadidos al medio muy probablemente entran en la combinación acil-CoA disponible para actuar en EpID6Des según esta forma.

En conclusión, la planta transgénica de tabaco descrita en el presente documento se puede usar para producir piensos de la invención

Expresión funcional del gen de la A6-desaturasa de E. platangineum en semillas transgénicas

Para mostrar la expresión específica de semillas del gen de la A6-desaturasa de Echium, la región de codificación se insertó en el casete de expresión específico de semilla de la siguiente forma. Un fragmento Ncol-Sacl que incluye la región de codificación de la A6-desaturasa se insertó en pXZP6, un derivado de pBluescriptSK que contiene un terminador Nos, dando como resultado el plásmido pXZP157. El fragmento Smal-Apal que contiene la región de codificación y el terminador EplD6Des-NosT se clonó en pWVec8-Fp1 después del promotor Fp1, dando como resultado el plásmido pXZP345. El plásmido pXZP345 se usó para transformar plantas de Arabidopsis silvestres, ecotipo Columbia, y las plantas transgénicas se seleccionaron mediante selección con higromicina B. Las plantas transgénicas transformadas con este gen se designaron platas "DP".

El análisis de la composición de ácido graso del aceite de semilla de la semilla T2 procedente de las plantas T1 transformadas con la construcción mostró la presencia de GLA y SDA en todas las líneas, con niveles de productos de A6-desaturación que alcanzan al menos el 11 % (Tabla 10). Esto demuestra la eficaz A6-desaturación de LA y ALA en la semilla.

Ejemplo 5. Transformación de lino con una construcción génica de una A6 ácido graso desaturasa específica de las semillas de Echium

La región de codificación completa del gen de la proteína de la A6 ácido graso desaturasa de Echium se amplificó mediante PRC con los siguientes cebadores que incorporan un sitio Xhol en ambos extremos: Ed6F: 5'-ACTCGAGCCACCATGGCT AAT G CAAT CAA-3' (SEQ IC NO:17) y Ed6R: 5'-CCTCGAGCTCAACCATGAGTATTAAGAG-3' (SEC ID N°: 18). La PCR se llevó a cabo por calentamiento a 94°C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 40 s, 62°C durante 40 s y 72°C durante 1 min 20 s. Después del último ciclo, las reacciones se incubaron durante 10 min a 72°C. El fragmento de la PCR se clonó en un vector pGEMTeasy® (Promega) y se secuenció para garantizar que no se habían introducido errores inducidos por la PCR. La inserción se digirió a continuación con Xhol y se insertó en el sitio Xhol del vector binario, pWBVec8, en orientación de sentido directo entre el promotor derivado de un gen de la proteína de almacenamiento 2S del lino específicamente expresada en semillas, linina, y su sitio de poliadenilación/terminador de la transcripción.

Tabla 10. Composición de ácido grasos en semillas de Arabidopsis transgénicas que expresan A6-desaturasa de Echium.

Ácido graso (%) . Total A6.

^Planta 18: 2A9,i 18:

16:018: 0 18: -1A9 3A6,9,12 18: 3A9’12’15 „ q

4a6'9'12'1 20:0 20:1 Productos de 2 (LA) desaturación ( %)

(GLA) _{(ALA) 18:}

Columbi

a

DP-2 8,0 2,8 22,9 27,3 2,5 11,3 0,7 1,6 15,8 3,2

DP-3 7,8 2,7 20,6 25,9 3,0 12,1 0,8 1,7 17,8 3,8

DP-4 7,8 2,8 20,4 28,5 1,2 13,7 0,4 1,7 16,1 1,5

DP-5 8,2 3,2 17,4 29,3 1,2 14,2 0,3 2,1 15,6 1,6

DP-7 8,2 2,9 18,4 26,7 5,0 12,7 1,4 1,7 15,2 6,4

DP-11 9,0 3,5 17,8 28,4 3,0 13,4 0,9 2,1 13,9 3,8

DP-12 8,6 3,0 18,9 27,8 3,3 12,6 1,0 1,8 15,4 4,3

DP-13 8,7 2,9 14,4 27,3 8,5 13,7 2,6 1,7 12,4 11,1

DP-14 9,3 2,9 14,2 32,3 2,1 15,4 0,7 1,8 12,8 2,8

DP-15 8,2 2,9 17,8 30,1 0,3 15,3 0,2 1,9 15,5 0,5

DP-16 8,0 2,8 19,5 29,2 2,7 13,1 0,8 1,7 14,2 3,5

El vector binario, pWBVec8 contenía un gen de resistencia a la higromicina como marcador seleccionable para la transformación de plantas (Wang et al., 1998). La construcción, desginada pVLin-Ed6 y que contenía el gen de la A6 ácido graso desaturasa de Echium para expresión específica en semillas se muestra esquemáticamente en la Figura 2. Se había demostrado anteriormente que el promotor (SEQ ID NO:23) y el terminador (SEQ ID NO:24) de linina transmitían la expresión de una forma muy específica en embriones de lino en desarrollo, que se expresaban al máximo en semillas de lino al mismo tiempo que se acumula el aceite en las semillas de lino. Ambos elementos promotor y terminador de linina fueron capaces de impulsar la expresión específica en semillas en los transgenes del lino en niveles comparables al promotor fuertemente activo de legumbres faseolina.

Se escindieron aproximadamente 150 hipocotilos de plántulas de 6-7 días de edad de cultívares Ward de lino hechos crecer en condiciones estériles en medio MS. Se ha descubierto que este cultivar produce la mayor eficacia de transformación entre los diferentes cultívares de lino, sin embargo, otros muchos cultívares también son adecuados para la transformación génica. Los hipocotilos se inocularon y se cultivaron simultáneamente con la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciensque contiene la construcción binaria pVLin-Ed6 de una forma similar a la descrita para la tranformación de Brassica en el Ejemplo 1. Tras un periodo de cultivo simultáneo de 3-4 días a 24°C, los hipocotilos se transfirieron a un medio de selección que era medio MS que contenía 200 mg/l de cefotaxima, 10 mg/l de higromicina, 1 mg/l de BAP (6-bencil-aminopurina) y 0,1 mg/l de NAA (ácido naftalenoacético). El desarrollo de los brotes se inició al cabo de 2 semanas. Los brotes se transfirieron a medio MS nuevo con los mismos aditivos, salvo que NAA se redujo a 0,02 mg/l. Después de 2-3 semanas, los brotes verdes sanos se transfirieron a medio MS nuevo sin reguladores del crecimiento para la inducción de raíces. Los brotes enraizados se plantaron con sustrato en invernadero.

La naturaleza transgénica de las plantas de lino regeneradas se confirmó mediante amplificación por PCR de la secuencia de la A6 ácido graso desaturasa de Echium con los cebadores Ed6sl, 5'-ACTCTGTTTCTGAGGTGTCCA-3' (SEQ ID NO: 19); y Ed6a1, 5'-CATATTAACCCTAGCCATACACAT-3' (SEC ID N°: 20). El ADN extraído de las plantas de lino individuales regeneradas se usó como molde en reacciones de la PCR usando las siguientes condiciones de amplificación: desnaturalización a 94°C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 40 s, 58°C durante 40 s y 72°C durante 1 min. Las semillas establecidas en las primeras 40 plantas transgénicas de lino se analizaron para determinar la presencia de SDA y GLA usando extracción de lípidos seguida por cromatografía de gases. Se espera que se produzcan elevados niveles de SDA en muchas de las plantas, y que los niveles de SDA serán más grandes que los nivales de GLA.

Las semillas de las plantas o extractos de lino transformadas tales como el aceite o el grano molido grueso de semillas se puede usar para alimentar peces o crustáceos.

Ejemplo 6. (no forma parte de la invención) Tranformación de algodón con una construcción específica de semillas que expresa una A6 ácido graso desaturasa de Echium

Las semillas de algodón contienen solamente cantidades poco importantes (<0,5 % de ácidos grasos totales) de ácido a-linolénico (ALA). Para producir ALA en mayores niveles en el aceite de algodón, se transformó algodón (Gossypium hirsutum) con una construcción génica específica de semillas que expresa un gen FAD3de Brassica napus (Arondel et al., 1992) (secuencia de aminoácidos de la proteína codificada se proporciona como SEQ ID NO:27). El número de registro del clon de ADNc de este gen fue L01418. La región de codificación de la proteína completa del gen FAD3 de B. napusse amplificó mediante la PCR usando los cebadores BnFAD3-S1, 5'-CTC- CAGCGATGGTTGTTGCTAT-3' (SEQ ID NO:21) y BnFAD3-AI, 5'-AATGTCTCTGGTGACGTAGC-3' (SEC ID N°: 22). El producto de la PCR se clonó en un vector pGEMTeasy® (Promega) y se escindió mediante digestión de restricción con Notl. La secuencia de codificación de FAD3 de B. napus se introdujo en la orientación de sentido directo en el sitio Notl entre las secuencias del promotor y el terminador del gen de lectina de soja (Cho et al., 1995), para proporcionar una construcción de expresión específica en semillas. Este vector contenía un gen NPTII que transmite resistencia a la kanamicina como marcador seleccionable para la transformación de plantas. Este vector se introdujo en Agrobacterium y se usó en la transformación del algodón como se describe en Liu et al (2002). Se obtuvieron plantas transgénicas independientes que expresaban el gen FAD3, y se guardaron las líneas que acumulaban ALA.

Se llevaron a cabo experimentos de transformación usando un casete de lectina específico de semilla similar que expresaba una A6 ácido graso desaturasa, para convertir LA en GLA y ALA en SDA. La región de codificación de la proteína completa de la A6 desaturasa de Echium plantagineum (Zhou et al., 2006; SEQ ID NO:25) se amplificó mediante la PCR usando los siguientes cebadores que incorporan un sitio Smal en el extremo 5', y Sacl en el extremo 3'. Ed6F: 5'-ATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGCTAATGCAATCAAGAAGTA-3' (SEQ ID NO:30) y Ed6R: 5'-TTGGAGCTCAACCATGAGTATTAAGAGCTTC-3' (SEC ID N°: 31). El fragmento de la PCR se clonó en un vector pGEM-Teasy® (Promega) y se secuenció para garantizar no se habían introducido errores inducidos por la PCR. El gen de la A6 desaturasa amplificada por p Cr se clonó en los correspondientes sitios Smal/Sacl en una orientación de sentido directo detrás del promotor del nabo (Fp1) y antes de la señal de terminación con poliadenilación nos3'. La cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens que tiene la construcción resultante, pGNapinE6D, se usó para la variedad de algodón Coker315 según el método descrito por Liu et al. (2002).

Se obtuvieron nueve plantas fértiles transformadas independientemente. Las plantas de algodón transformadas fueron positivas para la presencia del transgén, y la expresión de las semillas en desarrollo, mediante PCR y análisis de transferencia Northern del ARN expresado. 15 semillas maduras individuales de cada una de estas plantas transgénicas primarias se sometieron al análisis de la composición de ácidos grasos usando cromatografía de gases (GC) como se ha descrito anteriormente. Sorprendentemente, se descubrieron elevados niveles de ácido Y-linolénico (GLA) que se acumulaban en cuatro líneas transgénicas, mientras que no había GLA detectable en las plantas de control no transformadas. Se observaron niveles de GLA mayores del 15 % en muchas semillas, y el nivel alcanzó más del 25 % en algunas semillas que probablemente no eran homocigóticas para el gen de la A6 desaturasa introducido. La acumulación de GLA se realiza principalmente a expensas del ácido linoleico. De hecho, la conversión de LA en GLA (medido como %GLA x 100/ ( %LA %GLA) en la oleaginosa) fue muy eficaz en estas semillas de algodón con respecto a las semillas de otras plantas, que es más del 25 % en muchas semillas y alcanza más del 45 % en algunas semillas.

Las líneas de algodón que contienen ambos genes se producirán cruzando los transformantes que expresan el gen FAD3 y los transformantes que expresan el gen de la a 6 desaturasa, para producir líneas que contienen SDA. Según los métodos anteriormente descritos, las plantas oleaginosas como algodón o lino se pueden producir, lo que produce al menos un 5,5 % de SDA en base peso en el ácido graso de la semilla oleaginosa. Preferentemente, el nivel de SDA en el ácido graso es al menos un 11 %, al menos un 15 %, al menos un 20 %, al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 % o al menos un 50 % en base de peso. La eficacia de la conversión de ALA en SDA (medido como %SDA x 100/ ( %ALA %SDA) en la oleaginosa) es al menos un 25 % y preferentemente al menos un 45 %. Es decir, al menos un 25 %, preferentemente al menos un 45 % del ácido graso poliinsaturado en la semilla de algodón o lino que tiene una cadena de carbono de C18 o mayor desaturada en la posición A6.

Esta solicitud reivindica la prioridad respecto del documento US 60/737.946.

Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que se ha incluido en la presente memoria descriptiva es únicamente con el fin de proporcionar un contexto para la presente invención. No debe tomarse como una declaración que cualquiera de estas materias forma una parte de la base de la técnica anterior o que fueran parte del conocimiento general común en el campo relevante de la presente invención tal como existe antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para criar un salmón que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., comprendiendo el método alimentar el salmón con un pienso que comprende lípido, comprendiendo los ácidos grasos libres y esterificados del lípido total del pienso al menos un 5,5 % (p/p) de ácido estearidónico (SDA), en donde el salmón, tras haberse alimentado con el pienso durante al menos 6 semanas, tiene niveles de SDA y ácido eicosatetraenoico (ETA) más altos en el tejido muscular cuando se compara con un salmón alimentado con el mismo pienso pero que carece prácticamente de SDA.

2. El método de la reivindicación 1 en el que los ácidos grasos libres y esterificados de dicho lípido total comprenden al menos un 11 % (p/p) de SDA.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el lípido del pienso comprende un lípido vegetal.

4. El método de la reivindicación 3, en el que la planta es una planta transgénica que comprende una A6 desaturasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 75 % a la secuencia de aminoácidos definida en el n.° de registro de GenBank AY234127.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que los ácidos grasos libres y esterificados del lípido total del músculo blanco del salmón obtenido mediante el mismo comprende menos del 29,6 % de ácido graso saturado (SFA), al menos un 18,3 % de ácido docosahexanoico (DHA), y al menos un 2,1 % de SDA.

6. El método de la reivindicación 5, en el que los ácidos grasos libres y esterificados del lípido total del músculo blanco del salmón comprenden al menos un 2,7 % de SDA.

7. Un pienso adecuado para un salmón que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., comprendiendo el pienso lípido, comprendiendo los ácidos grasos libres y esterificados del lípido total del pienso al menos un 11 % (p/p) de ácido estearidónico (SDA), en donde el pienso comprende uno o más de harina de pescado en una cantidad de 2o a 700 g por kg de peso seco, una fuente de proteínas que no sea harina de pescado y almidón a 10-150 g/kg, y en donde la fuente de proteína comprende trigo u otro gluten de cereal, harina de soja, harina de otras legumbres, caseína, sangre o plumas.

8. El pienso de la reivindicación 7, en el que el lípido comprende un lípido vegetal.

9. El pienso de la reivindicación 8, en el que la planta es una planta transgénica que comprende una A6 desaturasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 75 % a la secuencia de aminoácidos definida en el n.° de registro de GenBank AY234127.

10. Un salmón que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., en donde los ácidos grasos libres y esterificados del lípido total del músculo blanco del salmón tienen menos del 29,6 % de SFA, al menos un 18,3 % de ácido docosahexanoico (DHA) y al menos un 2,7 % de ácido estearidónico (SDA).

11. El salmón de acuerdo con la reivindicación 10, en donde los ácidos grasos libres y esterificados del lípido total del músculo blanco del salmón comprenden al menos un 3,5 % de SDA.

12. Un método para producir un pienso para salmón que es un Salmo sp. o un Oncorhynchus sp., comprendiendo el método premezclar aceite obtenido de una planta con al menos otro ingrediente seleccionado entre harina de pescado en un cantidad de 20 a 700 g por kg de peso seco, una fuente de proteínas que no sea harina de pescado y almidón a 10-150 g/kg, para producir un pienso que comprende lípido y dicho otro ingrediente, comprendiendo los ácidos grasos libres y esterificados del lípido del pienso al menos un 11 % (p/p) de ácido estearidónico (SDA), en donde la fuente de proteína comprende trigo u otro gluten de cereal, harina de soja, harina de otras legumbres, caseína, sangre o plumas.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dicha planta es una planta transgénica que comprende una A6 desaturasa que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos un 75 % a la secuencia de aminoácidos definida en el n.° de registro de GenBank AY234127.

14. Un método para producir un aceite de pescado que comprende ácido estearidónico (SDA), ácido eicosapentanoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexanoico (DHA) o cualquier combinación de los mismos, comprendiendo dicho método extraer aceite de un salmón de acuerdo con las reivindicaciones 10 u 11.