ES2704711T3 - Anticuerpos anti-receptor P2X7 y fragmentos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo de dominio único para unión a un receptor P2X7, definiéndose el anticuerpo de dominio único por la fórmula general: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en la que: FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas; CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad; y en las que: CDR1 tiene una secuencia:PMKDMG; CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGGTYYADSVKG; y CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-receptor P2X7 y fragmentos de los mismos

Campo de la técnica

La invención se refiere a receptores purinérgicos, a anticuerpos y fragmentos relacionados de los mismos para unión con dichos receptores, a producción de dichos anticuerpos y fragmentos y a uso de dichos anticuerpos y fragmentos para detección y terapia de cáncer.

Estado de la técnica

La referencia a cualquier técnica anterior en la memoria descriptiva no es, y no debería interpretarse como, un reconocimiento de ninguna forma de sugerencia de que esa técnica anterior forma parte del conocimiento general común en Australia o cualquier otra jurisdicción o que podría esperarse razonablemente que esta técnica anterior se determinara, entendiera y considerara relevante por un experto en la materia.

Los receptores purinérgicos (P2X) son canales selectivos de cationes abiertos por ATP. Cada receptor se compone de tres subunidades proteicas o monómeros. Hasta la fecha se han identificado siete genes separados que codifican monómeros de P2X: P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6, P2X7.

Los receptores P2X7 son de interés particular ya que se entiende que la expresión de estos receptores está limitada a células que tienen el potencial de experimentar muerte celular programada, tales como timocitos, células dendríticas, linfocitos, macrófagos y monocitos. Hay algo de expresión de receptores P2X7 en homeostasis normal, tal como en eritrocitos.

Resulta interesante que se ha encontrado un receptor P2X7 que contiene uno o más monómeros que tienen una isomerización cis en Pro210 (de acuerdo con SEQ ID NO: 1) y que está desprovisto de función de unión a ATP en células que se entiende que son incapaces de experimentar muerte celular programada, tales como células preneoplásicas y células neoplásicas. Esta isoforma del receptor se ha denominado receptor “no funcional”.

Los anticuerpos generados a partir de inmunización con un péptido que incluye Pro210 en cis se unen con receptores P2X7 no funcionales. Sin embargo, no se unen con receptores P2X7 capaces de unirse con ATP. En consecuencia, estos anticuerpos son útiles para detectar de forma selectiva muchas formas de carcinoma y cánceres hemopoyéticos y para el tratamiento de algunas de estas afecciones.

Los documentos WO02/057306A1 y WO03/020762A1 analizan ambos una sonda para distinguir entre receptores P2X7 funcionales y receptores P2X7 no funcionales en forma de un anticuerpo monoclonal.

El documento WO2009/033233 analiza un epítopo presente en receptores no funcionales pero no receptores funcionales y anticuerpos para unión con los mismos.

El documento WO2008/043145 describe hibridomas que producen anticuerpos contra receptor de P2X7 no funcional. Hasta la fecha ha sido muy difícil obtener reactivos serológicos que se unen con receptores P2X7 no funcionales en células vivas con afinidad deseable. Son deseables en general reactivos de mayor afinidad en aplicaciones para la detección y el tratamiento de cáncer.

Existe la necesidad de reactivos mejorados para unión con receptores P2X7, particularmente para nuevos anticuerpos y fragmentos de los mismos que son capaces de diferenciar entre receptores P2X7 que se unen a ATP y que no se unen ATP en células vivas.

Resumen de la invención

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 1

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

en la que

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad:

en las que:

CDR1 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: DNEPMG, RNHDMG, SGYAMA, GMYNMS, PASNMS, GSYAMA, GAYAMS, DGYNMS, TYDMAW, QEYGMG, ARYPMAN, SSYAMA, AKYPMW, SSYAMS, DNVEMS y PMKDMG.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 2:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR3 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR2 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SIADSGNHTYYADSVKG, AISGSGGSTYYADSVKG, TILSDGSRTYYADSVKG, SINATGGRTYYADSVKG, SITASGYRTYYADSVKG, TISTSGSSTYYADSVKG, TINGSGLATYYADSVKG, SITANGNSTYYADSVKG, SIAAAGSRTYYADSVKG, SITPSGDKTYYADSVKG, SIDGGGLQTYYADSVKG, TIDGNGLITYYADSVKG, SIGPGGARTYYADSVKG, TITSDGLRTYYADSVKG, SIGSKGEDTYYADSVKG, AISGSGGSTYYANSVKG, AISGSGGGTYYADSVKG, SIGTKGEYTYYADSVKG, SIGSKGEYTYYADSVKG y AISGSGGGTYYANSVKG.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 3:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR3 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: KQRGLNRYRAQFDY, EPKPMDTEFDY, KIKTFRNHSVQFDY, KFNGFSHRQYNFDY, KQGQISNFPRFDY, KVRFATSKSINFDY, KCSSCTSLNANFDY, KASYSRPYNFQFDY, KQRSISIRPMFDY, KVRSMSYAHFDFDY, KASAPKYFRFDY, KLQRYDRYTLNFDY, KPWRVYSYDRFDY, KVHTFANRSLNFDY, QTVNVPEPAFAY y EPSHFDRPFDY.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 4:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR1 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (P/R)(N/M)(H/K)DMG.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 5:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR2 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: AISGSGG(S/G)TYYA(D/N)SVKG.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 6:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR3 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 7:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR3 tiene una secuencia: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY; y

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/P/C)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 8:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR1 tiene una secuencia: (P/R)(N/M)(H/K)DMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGG(S/G)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY; y

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/P/C)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la formula general 9:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR1 tiene una secuencia: (P/R)(N/M)(H/K)DMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGG(S/G)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EP(K/S)(P/H)(M/F)D(T/R)(E/P)FDY;

FR1 tiene una secuencia: EVQLLE(S/P)GGGLVQPGGSLRLSCAASG(Y/F/V)(R/T/N)(I/F/V);

FR2 tiene una secuencia: W(V/A)RQAPGKGLEW(V/A)S;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNS(R/K)NTLYLQMNS(L/M)RAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/P/C)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

Según la invención reivindicada se proporciona un anticuerpo de dominio único para unión con un receptor P2X7, el anticuerpo de dominio único. En una realización se proporciona un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el anticuerpo de dominio único por la fórmula general:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

y en las que:

CDR1 tiene una secuencia: PMKDMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGGTYYADSVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el anticuerpo de dominio único por la formula general 10:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR1 tiene una secuencia: PMKDMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGGTYYADSVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY;

FR1 tiene una secuencia: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTF;

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: PSPGTLVTVLE, WGQGTLVTVSS, WGQGTLVTVLS, RSPGTLVTVSS, PSPGTQVTVSS, PSPGTLVTVSS, RSQGTLVTVSS, WSQGTLVTVSS, RGQGTLVTVSS, RFQGTLVTVSS, WSPGTLVTVSS, GSPGTLVTVSS, WGPGTLVTVSS, RGPGTLVTVSS, CGPGTLVTVSS, RSCGTLVTVSS o RSPGTLVTVLE.

Según la invención reivindicada, se proporciona un anticuerpo de dominio único para unión con un receptor P2X7, definiéndose el anticuerpo de dominio único por la formula general:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

CDR1 tiene una secuencia: PMKDMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGGTYYADSVKG;

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY; y

FR1 tiene una secuencia: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTF;

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: RSQGTLVTVSS, RSPGTLVTVSS, RSCGTLVTVSS, o PSPGTLVTVSS, preferentemente RSQGTLVTVSS.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia como se describe en el presente documento, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento y que incluye una o más mutaciones para aumentar la afinidad de dicho sitio por la unión con un receptor P2X7.

En otra realización reivindicada se proporciona un sitio de unión a antígeno como se describe en el presente documento en el que una secuencia de aminoácidos que forma una o más de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR3 es una secuencia humana.

En otra realización reivindicada se proporciona un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv anti-receptor P2X7 que incluye un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia como se describe en el presente documento, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento.

En otra realización reivindicada se proporciona un diacuerpo o triacuerpo que incluye un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia como se describe en el presente documento, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento.

En otra realización reivindicada se proporciona una proteína de fusión que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo como se describe en el presente documento.

En otra realización reivindicada se proporciona un conjugado en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo o proteína de fusión como se describe en el presente documento conjugado con un marcador o un agente citotóxico.

En otra realización reivindicada se proporciona un anticuerpo para unión con un sitio de unión a antígeno de un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento.

En otra realización reivindicada se proporciona un ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno, o una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento.

En otra realización descrita se proporciona un vector que incluye un ácido nucleico descrito en el presente documento.

En otra realización descrita se proporciona una célula que incluye un vector o ácido nucleico descrito en el presente documento.

En otra realización descrita se proporciona un animal o tejido derivado del mismo que incluye una célula descrita en el presente documento.

En otra realización reivindicada se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización descrita se proporciona una composición de diagnóstico que incluye un sitio de unión a antígeno, o que incluye una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento, un diluyente y opcionalmente un marcador.

En otra realización descrita se proporciona un kit o artículo de fabricación que incluyen un sitio de unión a antígeno, o que incluyen una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento

En otra realización descrita se proporciona un uso de una secuencia de acuerdo con una o más de CDR1, CDR2, FR1, FR2, FR3 y FR4 como se describe en el presente documento para producir un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7.

En otra realización descrita se proporciona un uso de un sitio de unión a antígeno o una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento para producir un sitio de unión a antígeno anti-receptor P2X7 que tiene afinidad aumentada por el receptor P2X7.

En otra realización descrita se proporciona una biblioteca de moléculas de ácido nucleico producidas a partir de la mutación de un sitio de unión a antígeno o una secuencia de CDR y/o FR como se describe en el presente documento, en el que al menos una molécula de ácido nucleico en dicha biblioteca codifica un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7.

En otra realización descrita se proporciona un método para producir un sitio de unión a antígeno anti P2X7 como se describe en el presente documento que incluye expresar un ácido nucleico como se describe en el presente documento en una célula o animal como se describe en el presente documento.

En otra realización descrita se proporciona un método para el tratamiento de cáncer o una afección o enfermedad asociada con la expresión del receptor P2X7 no funcional en un individuo que incluye la etapa de proporcionar un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se describe en el presente documento a un individuo que requiere tratamiento para cáncer o dicha afección o enfermedad.

En otra realización descrita se proporciona un uso de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer o una afección o enfermedad asociada con la expresión de receptor P2X7 no funcional.

En una realización reivindicada, se proporciona un anticuerpo de dominio único como se describe en el presente documento, o un dominio variable de inmunoglobulina, Fab, diacuerpo, triacuerpo, scFv, proteína de fusión o conjugado o composición farmacéutica como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de cáncer o una afección inflamatoria.

En otra realización descrita se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer o enfermedad o afección asociada con la expresión de receptor P2X7 no funcional, que incluye la etapa de poner tejidos o células para los que la presencia o ausencia de cáncer debe determinarse con un reactivo en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición de diagnóstico como se describe en el presente documento y detectar la unión del reactivo con los tejidos o células. El método puede realizarse in vivo o in vitro.

Típicamente los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la invención se unen con receptores P2X7 no funcionales, especialmente receptores en los que Pro210 de P2X7 está en conformación cis. En ciertas realizaciones, los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la invención no se unen con receptores P2X7 funcionales, especialmente receptores en los que Pro210 de P2X7 está en conformación trans.

Típicamente los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la invención se unen con receptores P2X7 no funcionales en células vivas. En otras realizaciones, el sitio de unión a antígeno no se une con receptores en tejidos celulares muertos o fijos, tales como los que se estudian en histología o citología.

En una realización, los sitios de unión a antígeno de acuerdo con la invención se unen con receptores P2X7 en células vivas con afinidades en el intervalo de 0,1 a 5 nM.

La invención proporciona un anticuerpo de dominio único que incluye un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, preferentemente con un receptor P2X7, como se describe en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Positivos de ELISA de dAb de ciclo 2 explorados en Biacore a partir del fago de ciclo 2

Figura 2. PEP2-420 nM, sin péptido, cáncer del cuello uterino, objetivo x10

Figura 3. PEP2-420 nM, péptido 0,1 mM, cáncer del cuello uterino, sección seriada, unión limitada

Figura 4. PEP2-420 nM, péptido 1,0 mM, cáncer del cuello uterino, sección seriada, sin unión

Figura 5. PEP2-420 nM, sin péptido, cáncer de cuello uterino, objetivo x10

Figura 6. PEP2-420 nM, péptido 0,1 mM, cáncer de cuello uterino, sección seriada, unión limitada

Figura 7. PEP2-420 nM, péptido 1,0 mM, cáncer de cuello uterino, sección seriada, sin unión

Figura 8. PEP2-420 nM, sin péptido, cáncer de cuello uterino

Figura 9. PEP2-420 nM, péptido 10 pM, cáncer de cuello uterino, sección seriada, unión no afectada

Figura 10. PEP2-420 nM, melanoma, objetivo x20

Figura 11. dAb-Fc candidato que se expresa a un peso molecular de 75 kDa

Figura 12. Trazas que pueden resolverse fácilmente a partir del fondo incluyen el dAb de control, HEL4-Fc (verde), PEP2-47, P^ep2-42, PEP2-42-1, PEP2-2 (azul) con otros agentes de unión de mayor afinidad por encima. El caudal fue de 50 pl/min.

Figura 13. El dominio extracelular de P2X747-332 con marcador c-Myc C terminal y marcador HA N-terminal unido con anclaje transmembrana PDGFR para su uso en la exploración de agentes de unión a antígeno conformacional E200 expresados en células HEK293.

Figura 14. Transferencia de Western SDS-PAGE de lisado celular y proteínas expresadas en superficie que expresan el ECD1, P2X7 de tipo silvestre (WT) y los dos mutantes de receptor P2X7 no funcionales R307Q y E496A. El ECD1 se expresa a 52 kDa, los tres receptores P2X7 a 75 kDa. Un control anti-cadherina en la sección inferior está a 98 kDa y anti-actina en el lisado celular a 42 kDa.

Figura 15. SDS-PAGE de ECD2 (47-306) y una construcción mutante K193A(47-306) que muestra las fracciones de proteína A 1-5 y el sobrenadante (NB) con patrones de peso molecular a la izquierda.

Figura 16. SDS-PAGE tanto no reducido como reducido de dAb-Fc y ECD2-Fc junto con transferencias de Western correspondientes que reaccionaron con anticuerpo anti-P2X7.

Figura 17. Una selección de dAb ensayados a 5 pM. La tinción se detectó con Fab anti IgG humano.

Figura 18. Citometría de flujo de la unión de dAb-Fc con el pDisplay-ECD2 en células HEK que muestra unión celular más estrecha por especies de mayor afinidad.

Figura 19. Seguimientos por Biacore de clones de PEP2-42 seleccionados que muestran unión mejorada con el péptido E200.

Figura 20. Secuencias de clones de PEP2-42.

Figura 21. Árbol de rutas de modulación de afinidad desde el agente de unión candidato al dominio extracelular expresado de receptor diana.

Figura 22. Trazas de Biacore del clon PEP2-2-3 Fc a concentraciones crecientes procesadas frente a 10UR de péptido E200.

Figura 23. Trazas de Biacore de clones producidos por exploración de NNS de Trp103 en PEP2-2-1.

Figura 24. Unión por citometría de flujo de PEP2-2-1 con células que expresan ECD1 o ECD2 junto con controles (simulación y pDisplay solamente).

Figura 25. Seguimientos de Biacore que muestran unión competitiva entre PEP2-2-1, péptido E200 y ECD2 (47­ 306).

Figura 26. dAb candidatos 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc que se unen con células PC3 de próstata vivas a 0-20 pg/ml.

Figura 27. dAb candidatos 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc que se unen con células MDA MB 231 de mama vivas a 0-20 pg/ml.

Figura 28. dAb candidatos 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc que se unen con células SKOV-3 ováricas vivas a 0-20 pg/ml.

Figura 29. dAb candidatos 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc que se unen con células 786-O renales vivas a 0-20 pg/ml.

Figura 30. dAb candidatos 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc que se unen con células G361 de melanoma vivas a 0­ 20 pg/ml.

Figura 31. dAb candidatos 2-2-1 Fc, 2-2-3 Fc y 2-2-8 Fc que se unen con células NCI-H596 de pulmón vivas a 0­ 20 pg/ml.

Figura 32. Citometría de flujo de linfocitos y monocitos humanos de PMBC que no muestran unión con PEP2-2-1 Fc o PEP2-2-3 Fc.

Figura 33. Citometría de flujo de células LNCap de próstata que muestran unión con PEP2-2-1 Fc, PEP2-2-3 Fc y HLA mientras que el control de HEL4 no muestra unión por encima de solamente la secundaria.

Figura 34. Ensayo de CTB que muestra inhibición del crecimiento celular de PC3 durante 5 días en presencia de PEP2-2-1 Fc y PEP2-2-3 Fc aumentados en comparación con HEL4 Fc de control.

Figura 35. Ensayo de CTB que muestra inhibición del crecimiento celular de COLO205 durante 3 y 5 días en presencia de PEP2-2-1 Fc y PEP2-2-3 Fc aumentados en comparación con HEL4 Fc de control.

Figura 36. Ensayo de CTB que muestra inhibición del crecimiento celular de A375 durante 3 y 5 días en presencia de PEP2-2-1 Fc y PEP2-2-3 Fc aumentados en comparación con HEL4 Fc de control.

Figura 37. Trazas de Biacore del dominio de dAb PEP2-2-12 ensayado a 10, 5, 2,5, 1 y 0,5 nM.

Figura 38. Trazas de Biacore del dominio de PEP2-2-12Alexa488 ensayado a 5 y 2,5 nM.

Figura 39. Trazas de Biacore del dominio de PEP2-472-12Alexa488 ensayado a 10 y 5 nM.

Figura 40. Alineamiento de secuencias de dAb.

Figura 41. (SEQ ID NO: 1) Secuencia de P2X7.

Figura 42. (SEQ ID NO: 2) Secuencia de ECD2.

Figura 43 (SEQ ID NO: 3) Secuencia de ECD1.

Figura 44. Mapa de la construcción pcDNA3.1 PEP2-2-1 dAb-FC.

Figura 45 (SEQ ID NO: 198) Secuencia de pcDNA3.1 PEP2-2-1 dAb-FC.

Descripción detallada de la invención

Se hará ahora referencia en detalle a determinadas realizaciones de la invención descrita. Aunque la invención descrita se describirá junto con las realizaciones, se entenderá que la intención no es limitar la invención descrita a esas realizaciones. Por el contrario, se pretende que la invención descrita abarque todas las alternativas, modificaciones y equivalentes, que pueden incluirse en el alcance de la presente invención como se define por las reivindicaciones.

Un experto en la materia reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, que podrían usarse en la práctica de la presente invención. La presente invención no está limitada de ninguna manera a los métodos y materiales descritos.

Se entenderá que la invención desvelada y definida en la presente memoria descriptiva se extiende a todas las combinaciones alternativas de dos o más de los elementos individuales mencionados o evidentes a partir del texto o los dibujos. Todas estas combinaciones diferentes constituyen diversos aspectos alternativos de la invención.

Como se usa en el presente documento, excepto cuando el contexto requiera otra cosa, no se pretende que el término “comprender” y variaciones del término, tales como “que comprende”, “comprende” y “comprendido”, excluyan aditivos, componentes, números enteros o etapas adicionales.

Para fines de interpretar la presente memoria descriptiva, se aplicarán las siguientes definiciones y siempre que sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que cualquier definición expuesta entre en conflicto con cualquier documento incorporado en el presente documento por referencia, la definición expuesta posteriormente prevalecerá.

“Receptorpurinérgico" se refiere en general a un receptor que usa una purina (tal como ATP) como un ligando. “Receptor P2X/ se refiere en general a un receptor purinérgico formado a partir de tres subunidades proteicas o monómeros, teniendo al menos uno de los monómeros una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se muestra en SEQ ID NO: 1. “Receptor PTXf puede ser un receptor funcional o no funcional como se describe posteriormente. “Receptor P2X/ abarca variantes de origen natural del receptor P2X7, por ejemplo, en las que los monómeros de P2X7 son variantes de corte y empalme, variantes alélicas e isoformas incluyendo formas truncadas o secretadas de origen natural de los monómeros que forman enlaces P2X7 (por ejemplo, una forma que consiste en la secuencia de dominio extracelular o forma truncada de la misma), formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas de corte y empalme alternativo) y variantes alélicas de origen natural. En ciertas realizaciones de la invención, los polipéptidos monoméricos de P2X7 de secuencia nativa desvelados en el presente documento son polipéptidos de secuencia nativa de longitud completa o maduros que comprenden la secuencia de aminoácidos de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 1. En ciertas realizaciones el receptor P2X 7 puede tener una secuencia de aminoácidos que está modificada, por ejemplo diversos aminoácidos de la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1 pueden sustituirse, suprimirse o puede insertarse un resto.

“Receptor P2X 7 funcionar se refiere en general a una forma del receptor P2X7 que tiene un sitio de unión o hendidura para unión con ATP. Cuando se une con ATP, el receptor forma una estructura de tipo poro que permite la entrada de iones de calcio en el citosol, una consecuencia de lo cual puede ser muerte celular programada. En homeostasis normal, la expresión de receptores P2X7 funcionales está limitada en general a células que experimentan muerte celular programada tales como timocitos, células dendríticas, linfocitos, macrófagos y monocitos. También puede haber algo de expresión de receptores P2X7 funcionales en eritrocitos.

^{“Receptor P2X 7 no funciona} r ^{se refiere en general a una forma del receptor P2X7 en la que uno o más de los} monómeros tiene una isomerización cis en Pro210 (de acuerdo con SEQ ID NO: 1). La isomerización puede surgir de cualquier acontecimiento molecular que conduzca a plegamiento erróneo del monómero, incluyendo por ejemplo, mutación de secuencia primaria del monómero o procesamiento postraduccional anómalo. Una consecuencia de la isomerización es que el receptor es incapaz de unirse con ATP, o se une de otro modo con ATP con una menor afinidad que la observada entre ATP y receptores que no contienen una isomerización en Pro210. En las circunstancias, el receptor no puede formar un poro y esto limita el grado en el que los iones de calcio pueden entrar en el citosol. Los receptores P2X7 no funcionales se expresan en una amplia serie de cánceres epiteliales y hematopoyéticos.

“Dominio extracelular’ (ECD) usado en el presente documento son receptor P2X7 (47-306) (SEQ ID NO: 2) (ECD2) y receptor P2X7 (47-332) (SEQ ID NO: 3) (ECD1). El receptor P2X7 (47-306) (SEQ ID NO: 2) es los aminoácidos 47 a 306 de SEQ ID NO: 1. El receptor P2X7 (47-332) (SEQ ID NO: 3) es los aminoácidos 47 a 332 de SEQ ID NO: 1. “Anticuerpos" o “inmunoglobulinas" o “Ig" son proteínas gamma globulinas que se encuentran en la sangre, u otros fluidos corporales de vertebrados que actúan en el sistema inmunitario para unirse con antígenos, identificando y neutralizando de este modo objetos ajenos.

Los anticuerpos son en general una glucoproteína heterotetramérica compuesta de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena L se une con una cadena H por un enlace disulfuro covalente. Las dos cadenas H se unen entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L tiene también enlaces disulfuro intracatenarios espaciados regularmente.

Las cadenas H y L definen dominios Ig específicos. Más particularmente, cada H tiene en el extremo N, un dominio variable (Vh) seguido de tres dominios constantes (Ch) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios Ch para isotipos p y £. Cada cadena L tiene en el extremo N terminal un dominio variable (V^l) seguido de un dominio constante (Cl) en su otro extremo. El Vl se alinea con el Vh y el Cl se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (C^h1).

Los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, 8, £, y y p, respectivamente. Las clases y y a se dividen adicionalmente en subclases basándose en diferencias relativamente menores en la secuencia y función de C^h, por ejemplo, los seres humanos expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. La cadena L de cualquier especie vertebrada puede asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

El dominio constante incluye la parte Fc que comprende las partes carboxilo-terminales de ambas cadenas H mantenidas juntas por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos tales como ADCC se determinan por secuencias en la región Fc, siendo dicha región también la parte reconocida por receptores de Fc (FcR) hallados en ciertos tipos de células.

El emparejamiento de un V^h y V^l juntos forma una “región variable" o un “dominio variable" que incluye los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede denominarse “ VH". El dominio variable de la cadena ligera puede denominarse “ VL". El dominio V contiene un sitio de unión a antígeno que afecta a la unión a antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. Las regiones V abarcan aproximadamente 110 restos de aminoácidos y consisten en tramos relativamente invariantes denominados regiones marco conservadas (FR) (generalmente aproximadamente 4) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas “regiones hipervariables" (generalmente aproximadamente 3) que son de 9-12 aminoácidos de longitud cada una. Las FR adoptan en gran medida una configuración en lámina p y las regiones hipervariables forman bucles que conectan con, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p.

“Región hipervariable”, “HVR" o “HV" se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son de secuencia hipervariable y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en el VH (H1, H2, H3) y tres en el VL (L1, L2, L3). Se usan varias delimitaciones de región hipervariable y están abarcadas en el presente documento. Las Regiones Determinantes de Complementariedad (CDR) de Kabat se basan en la variabilidad de secuencia y son las más habitualmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)).

Los restos de “marco conservado" o “FR" son los restos de dominio variable distintos de los restos de región hipervariable definidos en el presente documento.

“Un péptido para formar un sitio de unión a antígeno” se refiere en general a un péptido que puede formar una conformación que confiere la especificidad de un anticuerpo para antígeno. Los ejemplos incluyen anticuerpo completo o estructuras relacionadas con anticuerpo completo, fragmentos de anticuerpo completo que incluyen un dominio variable, dominios variables y fragmentos de los mismos, incluyendo cadenas ligeras y pesadas, o fragmentos de cadenas ligeras y pesadas que incluyen algunas pero no todas las regiones hipervariables o regiones constantes.

Un anticuerpo “intacto” o “completo" es uno que comprende un sitio de unión a antígeno así como un C^l y al menos dominios constantes de cadena pesada, Ch1, Ch2 y Ch3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de secuencia nativa humana) o variante de secuencia de aminoácidos de los mismos.

Las “estructuras relacionadas con anticuerpo completo" incluyen formas multimerizadas de anticuerpo completo. “Fragmentos de anticuerpo completo que incluyen un dominio variable" incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

El fragmento Fab consiste en una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (Vh) y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, tiene un único sitio de unión a antígeno.

Un fragmento Fab' difiere de fragmentos Fab por tener pocos restos adicionales en el extremo carboxilo terminal del dominio Ch1 incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab' - SH es la designación en el presente documento para Fab' en el que el resto o los restos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo de tiol libre.

Un fragmento F(ab')2 corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por enlaces disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente y aún son capaces de entrecruzarse con el antígeno.

Un “Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación no covalente, estrecha.

En una especie Fv monocatenaria (scFv), un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera pueden unirse covalentemente por un enlazador peptídico flexible de modo que las cadenas ligeras y pesadas pueden asociarse en una estructura “dimérica” análoga a la de una especie de Fv bicatenaria. A partir del plegamiento de estos dos dominios surgen seis bucles hipervariables (3 bucles de cada una de las cadenas H y L) que contribuyen con los restos de aminoácidos para la unión a antígeno y confieren especificidad de unión a antígeno para el anticuerpo.

“Fv monocatenario” también abreviado como “sFv" o “scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpo V^h y V^l conectados para formar una única cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido de scFv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para unión a antígeno.

^{Un “dominio variable individua} r ^{es la mitad de un Fv (que comprende solamente tres CDR específicas para un} antígeno) que tiene la capacidad de reconocer y unirse con antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión completo.

“Diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Los fragmentos de anticuerpo pequeños se preparan construyendo fragmentos sFv (véase párrafo precedente) con enlazadores cortos (de aproximadamente 5-10 restos) entre los dominios Vh y Vl de modo que se consiga emparejamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando como resultado un fragmento bivalente, es decir, fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno.

Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv “de cruce" en los que los dominios V^h y V^l de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas. También se conocen en general en la técnica triacuerpos y tetracuerpos.

Un “anticuerpo aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o se ha recuperado de un componente de su ambiente pre-existente. Los componentes contaminantes son materiales que interferirían con usos terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos.

Un “anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha realizado usando cualquiera de las técnicas para realizar anticuerpos humanos como se desvela en el presente documento. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende restos de unión a antígeno no humanos. Pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en este campo, incluyendo bibliotecas de presentación en fagos. Pueden prepararse anticuerpos humanos administrando el antígeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta a exposición antigénica, pero cuyos loci endógenos se han deshabilitado.

Las formas "humanizadas” de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de roedor) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que se han reemplazado restos de una región hipervariable del receptor por restos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad del anticuerpo deseada. En algunos casos, se reemplazan restos de región marco conservada (FR) de la inmunoglobulina humana por restos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.

“Anticuerpo monoclonal’ se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigiéndose contra un único sitio antigénico o determinante en el antígeno. Además de su especificad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse no contaminados por otros anticuerpos. Pueden prepararse anticuerpos monoclonales por la metodología de hibridoma, o pueden realizarse usando métodos de A^d N recombinante en células bacterianas, eucariotas animales o vegetales. Los "anticuerpos monoclonales’’ también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos en fagos.

Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen anticuerpos "quiméricos” en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a u homóloga de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena o las cadenas son idénticas a u homólogas de secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que muestran la actividad biológica deseada. Los anticuerpos quiméricos de interés en el presente documento incluyen anticuerpos "primatizados” que comprenden secuencias de unión a antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo, Mono del Viejo Mundo, Simio, etc.), y secuencias de región constante humana.

La expresión "anticuerpo anti-receptor PTXj” o “un anticuerpo que se une con el receptor PTXf se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse con el receptor P2X7 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en la dirección al receptor P2X7, típicamente receptor P2X7 no funcional. Preferentemente, el alcance de la unión de un anticuerpo de receptor P2X7 con una proteína receptora no relacionada es menor de aproximadamente el 10 % de la unión del anticuerpo con el receptor P2X7 como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas relaciones, un anticuerpo que se une con receptor P2X7 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 pM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM o < 0,1 nM. Un anticuerpo anti­ receptor P2X7 no funcional es generalmente uno que tiene alguna o todas de estas características serológicas y que se une con receptores P2X7 no funcionales pero no con receptores P2X7 funcionales.

Un anticuerpo "con afinidad madurada’’ es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo parental que no posee esa alteración o esas alteraciones. Los anticuerpos con afinidad madurada preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno diana. Se producen anticuerpos con afinidad madurada por procedimientos conocidos en la técnica.

Un anticuerpo "de bloqueo’’ o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno con el que se une. Los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo agonista’’, como se usa en el presente documento, es un anticuerpo que imita al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés.

La "afinidad de unión’’ se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). En general, “afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y puede representarse en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen con antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen con el antígeno más rápidamente y tienden a permanecer unidos más tiempo. Se conoce en la técnica una diversidad de métodos para medir la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para fines de la presente invención.

Los inventores han determinado las secuencias de CDR de varios clones de dominio variable que han descubierto que se unen con la diana de ECD. Estas secuencias de CDR se muestran en la Tabla 1 posterior.

En una realización descrita se proporciona un péptido que tiene una secuencia como se muestra en la Tabla 1. Estos péptidos son particularmente útiles para construir sitios de unión a antígeno, dominios variables, anticuerpos y fragmentos relacionados.

T l 1 n i DR

Los inventores han determinado las secuencias FR de varios clones de dominio variable que han descubierto que se unen con la diana de ECD. Estas secuencias de FR se muestran en la Tabla 2 a continuación. Podrían usarse otras secuencias de FR con las CDR anteriormente descritas para formar un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7 no funcional.

T l 2 R i n m r n r

En ciertas realizaciones se proporciona un sitio de unión a antígeno que tiene una secuencia mostrada en la Tabla 3 a continuación:

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 11 ^/

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR1 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (R/P/D)(N/M)(H/K/V)(D/E)M(G/S)

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 12:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR2 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (A/S)I(S/G)(G/S/T)(S/K)G(G/E)(S/G/D/Y)TYYA(D/N)SVKG.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 13:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR3 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (E/Q)(P/T)(K/S/V)(P/H/N)(M/F/V)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y

en las que A1 se refiere a ningún aminoácido entre (E/P) y F o alanina.

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 14:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR3 tiene una secuencia: (E/Q)(P/T)(K/S/V)(P/H/N)(M/F/V)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y y

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/C/P)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 15:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR1 tiene una secuencia: (R/P/D)(N/M)(H/K/V)(D/E)M(G/S);

CDR2 tiene una secuencia: (A/S)I(S/G)(G/S/T)(S/K)G(G/E)(S/G/D/Y)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: (E/Q)(P/T)(K/S/V)(P/H/N)(M/F/V)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y; en la que A1 se refiere a ningún aminoácido entre (E/P) y F o alanina,

y

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/C/P)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

Se describe en el presente documento un sitio de unión a antígeno para unión con un receptor P2X7, definiéndose el sitio de unión a antígeno por la fórmula general 16:

FR1 - CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

en las que:

CDR1 tiene una secuencia: (R/P/D)(N/M)(H/K/V)(D/E)M(G/S);

CDR2 tiene una secuencia: (A/S)I(S/G)(G/S/T)(S/K)G(G/E)(S/G/D/Y)TYYA(D/N)SVKG;

CDR3 tiene una secuencia: (E/Q)(P/T)(K/S/V)(P/H/N)(M/F/V)(D/P)(T/R/E)(E/P)(A1)F(A/D)Y, en la que A1 se refiere a ningún aminoácido entre (E/P) y F o alanina;

FR1 tiene una secuencia: EVQLLE(S/P)GGGLVQPGGSLRLSCAASG(Y/F/V)(RT/N)(I/F/V);

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNS(L/M)RAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: (W/R/P/G/C)(G/S/F)(Q/C/P)GT(L/Q)VTV(S/L)(S/E).

En ciertas realizaciones descritas el sitio de unión a antígeno es uno que tiene al menos 75 %, preferentemente 80 %, más preferentemente 85 %, más preferentemente 90 %, más preferentemente 95 %, más preferentemente 98 % o 99 % de identidad con un sitio de unión a antígeno mostrado en la Tabla 3.

En ciertas realizaciones descritas, la CDR es una que tiene al menos 75 %, preferentemente 80 %, más preferentemente 85 %, más preferentemente 90 %, más preferentemente 95 %, más preferentemente 98 % o 99 % de identidad con un CDR mostrada en la Tabla 1.

El porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales, por medio de programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, Estados Unidos 53711) como se desvela en Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se usa GAP con los siguientes ajustes para comparación de secuencias polipeptídicas: penalización de creación de hueco de 3,0 y penalización de extensión de hueco de 0,1.

La identidad de secuencia de moléculas polinucleotídicas se determina por métodos similares usando GAP con los siguientes ajustes para comparación de secuencias de ADN: penalización de creación de hueco de 5,0 y penalización de extensión de hueco de 0,3.

En otras realizaciones descritas se proporciona un sitio de unión a antígeno o CDR y/o FR que tiene una secuencia como se ha descrito anteriormente y que incluye una o más mutaciones para aumentar la afinidad de dicho sitio para unión con un anti-receptor P2X7. La mutación puede dar como resultado una sustitución, inserción o deleción de un resto en una o más de CDR1, CDR2 o CDR3 o una o más de FR1, FR2, FR3 o FR4.

Marks et al. (1992) BioTechnology 10:779 que describe maduración de afinidad por redistribución de dominios VH y VL; Barbas et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 9 1:3809; Schier et al. (1995) Gene 169:147-155, Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155:1994; Jackson et al. (1995), J. Immunol. 154/7):3310; y Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol.

226:889, que describen mutagénesis aleatoria de restos de región hipervariable y/o marco conservado, son ejemplos de procedimientos conocidos en la técnica para maduración de afinidad de sitios de unión a antígeno. En ciertas realizaciones descritas, se muta un ácido nucleico que codifica una o más de las secuencias mostradas en la Tabla 1 o la Tabla 3 para crear una biblioteca de secuencias diversa. La biblioteca se explora después frente a una diana que incluye un epítopo de un receptor P2X7 no funcional. Se muestra un método ejemplar en los Ejemplos del presente documento.

En otra realización reivindicada se proporciona un sitio de unión a antígeno como se ha descrito anteriormente en el que una secuencia de aminoácidos que forma una o más de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 deriva de una secuencia humana o en forma de una secuencia humana.

El sitio de unión al antígeno puede presentarse en una forma humanizada que incluye secuencias de inmunoglobulina no humanas (por ejemplo, murinas) y humanas. Típicamente todas excepto las secuencias de CDR del sitio de unión a antígeno son de una especie no humana tal como ratón, rata o conejo. En algunos casos, los restos de marco conservado del sitio de unión a antígeno también pueden ser no humanos. Cuando el sitio de unión a antígeno se proporciona en forma de un anticuerpo completo, típicamente al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc) es humana, permitiendo por lo tanto diversas funciones efectoras humanas. Se conocen bien en la técnica métodos para humanizar sitios de unión a antígeno no humanos, incluyendo ejemplos de procesos adecuados los de Jones et al., (1986) Nature, 321: 522; Riechmann et al., (1988) Nature, 332: 323; Verhoeyen et al., (1988) Science, 239: 1534.

Los métodos de presentación en fagos descritos en el presente documento usando bibliotecas de anticuerpo derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana son útiles para generar sitios de unión a antígeno humanos y anticuerpos humanos.

Además, pueden usarse mamíferos transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Estos ratones pueden generarse por inserción aleatoria o dirigida de los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana en células madre embrionarias. Los genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera del hospedador pueden hacerse no funcionales por la inserción o por algún otro acontecimiento de recombinación, por ejemplo por deleción homocigota de la región JH del hospedador. Las células madre embrionarias transfectadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos que después se crían para producir descendencia homocigota que expresa sitios de unión a antígeno humanos. Después de la inmunización con un epítopo de P2X7, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos. Un beneficio de los sistemas de animales transgénicos es que es posible producir isotipos terapéuticamente útiles porque los transgenes de inmunoglobulina humana se reordenan durante la diferenciación de linfocitos B y posteriormente experimentan cambio de clase y mutación somática en los ratones transgénicos.

Los dominios variables que incluyen CDR y FR de la invención pueden haberse hecho menos inmunogénicos reemplazando restos expuestos en superficie para hacer que el anticuerpo parezca propio para el sistema inmunitario. Padlan, E.A., 1991, Mol. Immunol. 28, 489 proporciona un método ejemplar. En general, la afinidad se conserva porque el empaquetamiento interno de restos de aminoácidos en la cercanía del sitio de unión a antígeno permanece sin cambios y en general los restos de CDR o restos adyacentes que influyen en características de unión no deben sustituirse en estos procesos.

En otra realización se proporciona un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab o scFv anti-receptor P2X7 que incluye un sitio de unión a antígeno como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, el sitio de unión a antígeno tiene una secuencia como se muestra en la Tabla 3.

Los fragmentos de anticuerpo de menor peso molecular, en comparación con anticuerpos completos pueden tener acceso mejorado a tumores sólidos y eliminación más rápida lo que puede ser particularmente útil en aplicaciones de diagnóstico terapéuticas e in vivo.

Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo incluyendo digestión proteolítica de anticuerpos intactos y expresión recombinante en células hospedadoras. Con respecto a estos últimos, como se describe posteriormente, los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse todos en y secretarse de E. coli, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fagos de anticuerpos y pueden recuperarse fragmentos Fab'-SH directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2. En otro enfoque, se aíslan fragmentos F(ab')2 directamente de cultivo de células hospedadoras recombinantes.

En ciertas realizaciones, el sitio de unión a antígeno se proporciona en forma de un fragmento Fv monocatenario (scFv). Fv y scFV son adecuados para unión no específica reducida durante su uso in vivo ya que tienen sitios de combinación intactos que están desprovistos de regiones constantes. Pueden construirse proteínas de fusión que incluyen scFv para producir fusión de una proteína efectora en el extremo amino o carboxilo terminal de un scFv. En otras realizaciones se proporciona un diacuerpo o triacuerpo u otro anticuerpo multiespecífico que incluye un sitio de unión a antígeno como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ensamblarse usando dominios polipeptídicos que permiten la multimerización. Los ejemplos incluyen las regiones CH2 y CH3 de las regiones Fc y las CH1 y Ckappa/lambda. Otros dominios de multimerización de proteínas de origen natural pueden usarse incluyendo dominio de cremallera de leucina (bZIP), motivo de hélice-bucle-hélice, dominio de homología de Src (SH2, SH3), una mano EF, un dominio de unión a fosfotirosina (PTB), u otros dominios conocidos en la técnica.

En otra realización se proporciona un dominio de fusión o una proteína heteróloga que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo como se ha descrito anteriormente.

Un polipéptido heterólogo puede fusionarse de forma recombinante o conjugarse de forma química con un extremo N o C terminal de un sitio de unión a antígeno o molécula que lo contiene de la invención.

El polipéptido heterólogo con el que el anticuerpo o sitio de unión a antígeno se fusiona puede ser útil para dirigir las células que expresan el receptor P2X7, o útil para alguna otra función tal como purificación, o aumentar la semivida in vivo de los polipéptidos, o para su uso en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica.

En realizaciones preferidas, una secuencia de aminoácidos marcadora tal como un péptido de hexa-histidina es útil para purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras incluyen, pero sin limitación, el marcador “HA”, que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe y el marcador “flag”.

Además, el sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo de la invención puede modificarse por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos de bloqueo/protección conocidos, escisión proteolítica, enlace con un ligando celular u otra proteína, etc.

Los sitios de unión a antígeno de la invención pueden componerse de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos o enlaces peptídicos modificados, es decir, isósteros peptídicos, y pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes. Los sitios de unión a antígeno de la invención pueden modificarse por procesos naturales, tales como por procesamiento postraduccional, o por técnicas de modificación química que se conocen bien en este campo. Dichas modificaciones se describen bien en textos básicos, así como en la bibliografía de investigación. Las modificaciones pueden producirse en cualquier parte en el sitio de unión a antígeno, incluyendo la cadena principal peptídica, las cadenas laterales de aminoácidos y los extremos amino o carboxilo terminal, o en restos tales como carbohidratos. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo o distintos grados en varios sitios en un sitio de unión a antígeno dado. Además, un sitio de unión a antígeno dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Un sitio de unión a antígeno puede ramificarse, por ejemplo, como resultado de ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los sitios de unión a antígeno cíclicos, ramificados y cíclicos ramificados pueden resultar de procesos naturales pos-traduccionales o pueden realizarse por métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glucosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación.

En otra realización se proporciona un conjugado en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo o proteína de fusión como se ha descrito anteriormente conjugada con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, un fármaco, un agente inhibidor del crecimiento, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), o un marcador tal como un isótopo radiactivo (es decir, un conjugado de radio). En otro aspecto, la invención proporciona además métodos para usar los inmunoconjugados. En un aspecto, un inmunoconjugado comprende cualquiera de los dominios variables anteriores unido covalentemente con un agente citotóxico o un agente detectable.

En otra realización se proporciona un anticuerpo para unión con un sitio de unión a antígeno de un dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se ha descrito anteriormente.

En otra realización se proporciona un ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo o triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se describe en el presente documento.

Puede generarse un polinucleótido que codifica una CDR o FR de acuerdo con una cualquiera de las fórmulas generales descritas anteriormente, o un sitio de unión a antígeno comprendido por las mismas, a partir de un ácido nucleico de cualquier fuente, por ejemplo por síntesis química o aislamiento de una biblioteca de ADNc o genómica. Por ejemplo puede generarse una biblioteca ADNc a partir de una célula productora de anticuerpos tal como un linfocito B, célula plasmática o célula de hibridoma y el ácido nucleico relevante aislarse por amplificación por PCR usando oligonucleótidos dirigidos al clon de interés particular. Después pueden clonarse ácidos nucleicos aislados en vectores usando cualquier método conocido en la técnica. La secuencia de nucleótidos relevante puede después mutarse usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida, PCR, etc. (véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar sitios de unión a antígeno que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos.

En otra realización descrita se proporciona un vector que incluye un ácido nucleico descrito anteriormente. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector por una diversidad de procedimientos. En general, se inserta ADN en un sitio o en sitios de endonucleasas de restricción apropiados usando técnicas conocidas en este campo. En general los componentes del vector incluyen, pero sin limitación, uno o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transpiración. La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligamento convencionales que se conocen por los expertos en la materia.

El sitio de unión a antígeno puede producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N terminal de la proteína o el polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del A^d N que codifica sitios de unión a antígeno que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o líderes de enterotoxina termoestable II. Para secreción de levadura la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de levadura, líder de factor alfa o líder de fosfatasa ácida o el líder de glucoamilasa de C. albicans. En la expresión de células de mamífero, pueden usarse secuencias señal de mamífero para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o una relacionada, así como líderes secretores virales.

Pueden obtenerse secuencias polinucleotídicas que codifican componentes polipeptídicos del sitio de unión a antígeno de la invención usando técnicas recombinantes convencionales como se ha descrito anteriormente. Pueden sintetizarse polinucleótidos usando técnicas sintetizadores de nucleótidos o PCR. Una vez obtenidas, las secuencias que codifican los polipéptidos se insertan en un vector recombinante capaz de replicar y expresar polinucleótidos heterólogos en hospedadores procariotas. Muchos vectores que están disponibles y se conocen en la técnica pueden usarse en relación con la presente invención. La selección de un vector apropiado dependerá principalmente del tamaño de los ácidos nucleicos para insertar en el vector y la célula hospedadora particular para transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación o expresión del polinucleótido heterólogo o ambos) y su compatibilidad con la célula hospedadora particular en la que reside.

En general, se usan en relación con estos hospedadores vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicón y de control que derivan de especies compatibles con la célula hospedadora. Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas, así como secuencias de marcaje que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Dichas secuencias se conocen bien para una diversidad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación de plásmido pBR322, que contiene genes que codifican resistencia a ampicilina (Amp) y tetraciclina (Tet) y por tanto proporciona medios fáciles para identificar células transformadas, es adecuado para la mayoría de bacterias Gram negativas, el origen de plásmido 2 pm, es adecuado para levadura, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. pBR322, sus derivados u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos también pueden contener, o modificarse para contener, promotores que pueden usarse por el organismo microbiano para expresión de proteínas endógenas.

Además, pueden usarse vectores de fagos que contienen secuencias de replicón y de control que son compatibles con el microorganismo hospedador como vectores transformantes en relación con estos hospedadores. Por ejemplo, pueden utilizarse bacteriófagos tales como XGEM.TM.-11 en la preparación de un vector recombinante que puede usarse para transformar células hospedadoras susceptibles tales como E. coli LE392.

El vector de expresión de la invención descrita puede comprender dos o más pares de promotor-cistrón (siendo un cistrón el segmento de ADN que contiene toda la información para la producción de un único polipéptido). Un promotor es una secuencia reguladora no traducida localizada cadena arriba (5') de un cistrón que modula su expresión. Los promotores procariotas típicamente quedan en dos clases, inducibles y constitutivos. El promotor inducible es un promotor que inicia niveles aumentados de transcripción del cistrón bajo su control en respuesta a cambios en la condición de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.

Se conocen bien un gran número de promotores reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales. El promotor seleccionado puede unirse operativamente con ADN cistrónico que codifica la cadena ligera o pesada retirando el promotor de ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector de la invención. Tanto la secuencia promotora nativa como muchos promotores heterólogos pueden usarse para dirigir la amplificación y/o expresión de los genes diana. En algunas realizaciones, se utilizan promotores heterólogos, ya que permiten en general mayor transcripción y mayores rendimientos de gen diana expresado en comparación con el promotor polipeptídico diana nativo.

Se conocen bien promotores reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales. Los promotores adecuados para uso con hospedadores procariotas incluyen el promotor PhoA, los sistemas de promotor de pgalactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac o el trc. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente con el ADN que codifica un sitio de unión a antígeno de la invención. Sin embargo, otros promotores que son funcionales en bacterias (tales como otros promotores bacterianos o de fago conocidos) también son adecuados. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo de este modo que un experto en la materia los una operativamente con cistrones que codifican las cadenas ligeras y pesadas diana usando enlazadores o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido.

En un aspecto de la invención descrita, cada cistrón dentro del vector recombinante comprende un componente de secuencia señal de secreción que dirige la translocación de los polipéptidos expresados a través de una membrana. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN polipeptídico diana que se inserta en el vector. La secuencia señal seleccionada para el fin de la presente invención descrita debería ser una que se reconoce y procesa (es decir se escinde por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para células hospedadoras procariotas que no reconocen ni procesan las secuencias señal nativas de los polipéptidos heterólogos, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes de enterotoxina termoestable II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA y MBP. En una realización de la invención descrita, las secuencias señal usadas en ambos cistrones del sistema de expresión son secuencias señal de STII o variantes de las mismas.

En otro aspecto, la producción de las inmunoglobulinas según la invención descrita puede producirse en el citoplasma de la célula hospedadora, y por lo tanto no requiere la presencia de secuencias señal de secreción dentro de cada cistrón. A este respecto, se expresan cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, se pliegan y se ensamblan para formar inmunoglobulinas funcionales dentro del citoplasma. Ciertas cepas hospedadoras (por ejemplo, las cepas de E. coli trxB-) proporcionan condiciones de citoplasma que son favorables para la formación de enlaces disulfuro, permitiendo de este modo el plegamiento y ensamblaje apropiado de subunidades proteicas expresadas.

La presente invención descrita proporciona un sistema de expresión en el que la relación cuantitativa de componentes polipeptídicos expresados puede modularse para maximizar el rendimiento de sitios de unión a antígeno secretados y ensamblados de forma apropiada de la invención. Dicha modulación se consigue al menos en parte por modulación simultánea de potencias de traducción para los componentes polipeptídicos.

Con respecto a expresión en células hospedadoras eucariotas, los componentes del vector generalmente incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.

Un vector para su uso en una célula hospedadora eucariota también puede contener una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N terminal de la proteína madura o el polipéptido de interés. La secuencia de señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa (es decir, se escinde por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. En la expresión de células de mamífero, las secuencias señal de mamífero así como líderes secretores virales, por ejemplo, la señal gD del herpes simple, están disponibles.

El ADN para dicha región precursora se liga en fase de lectura con ADN que codifica el anticuerpo.

En general, no es necesario un componente de origen de replicación para los vectores de expresión de mamíferos. Por ejemplo, el origen de SV40 puede usarse típicamente solamente porque contiene el promotor temprano.

Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles de medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilos.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Las células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármacos y por lo tanto sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de dicha selección dominante usan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico que codifica sitios de unión a antígeno, tales como DHFR o timidina quinasa, metalotioneína I y II, preferentemente genes de metalotioneína de primate, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc. Una célula hospedadora apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular CHO deficiente en actividad de DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096), preparada y propagada. Por ejemplo, se identifican en primer lugar células transformadas con el gen de selección de DHFR cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Como alternativa, las células hospedadoras (particularmente hospedadores de tipo silvestre que contienen un DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo, proteína de DHFR de tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como aminoglucósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglucosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina o G418.

Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un promotor unido operativamente con el sitio de unión a antígeno que codifica la secuencia de ácido nucleico para dirigir la síntesis de ARNm. Se conocen bien promotores reconocidos por una diversidad de células hospedadoras potenciales.

Los genes eucariotas tienen en general una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia hallada 70 a 80 bases cadena arriba del inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para adición de la cola de poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan convenientemente en vectores de expresión eucariotas.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para su uso con hospedadores de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glucolíticas incluyendo enolasasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3­ fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.

Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. La transcripción de sitios de unión a antígeno de vectores en células hospedadoras de mamífero se controla, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y Virus de Simio 40 (SV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.

La transcripción de un ADN que codifica el sitio de unión a antígeno por eucariotas superiores puede aumentarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Las secuencias potenciadoras incluyen las conocidas de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.

Los vectores de expresión usados en células hospedadoras eucariotas (células de levadura, hongos, insectos, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias están disponibles habitualmente de las regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica un sitio de unión a antígeno.

En otra realización descrita se proporciona una célula que incluye un vector o ácido nucleico descrito anteriormente. La molécula de ácido nucleico o el vector puede estar presente en la célula hospedadora modificada genéticamente o el hospedador bien como una molécula independiente fuera del genoma, preferentemente como una molécula que es capaz de replicación, o bien puede integrarse de forma estable en el genoma de la célula hospedadora o el hospedador.

La célula hospedadora de la presente invención descrita puede ser cualquier célula procariota o eucariota.

Son ejemplos de células procariotas las usadas generalmente para clonación como E. coli o Bacillus subtillis. Además, las células eucariotas comprenden, por ejemplo, células fúngicas o animales.

Son ejemplos de células fúngicas adecuadas las células de levadura, preferentemente las del género Saccharomyces y más preferentemente las de la especie Saccharomyces cerevisiae.

Son ejemplos de células animales, por ejemplo, células de insectos, células de vertebrados, preferentemente células de mamífero, tales como por ejemplo, HEK293, NSO, CHO, MDCK, U2-OS, Hela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sh, CaSki, C33A. Estas células hospedadoras, por ejemplo células CHO, pueden proporcionar modificaciones pos-traduccionales a las moléculas de anticuerpo de la invención, incluyendo retirada de péptidos líderes, plegamiento y ensamblaje de cadenas H (pesada) y L (ligera), glucosilación de la molécula en los lados correctos y secreción de la molécula funcional.

Pueden obtenerse líneas celulares adecuadas adicionales conocidas en la técnica de depósitos de líneas celulares, como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC).

En otra realización descrita se proporciona un animal que incluye una célula descrita anteriormente. En ciertas realizaciones descritas, los animales y tejidos de los mismos que contienen un transgén son útiles en la producción de los sitios de unión a antígeno de la invención. La introducción de las moléculas de ácido nucleico como transgenes en hospedadores no humanos y su expresión posterior puede emplearse para la producción de los sitios de unión a antígeno, por ejemplo, la expresión de dicho transgén en la leche del animal transgénico proporciona medios para obtener los sitios de unión a antígeno en cantidades cuantitativas. Los transgenes útiles a este respecto comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, secuencias codificantes para los sitios de unión a antígeno descritos en el presente documento, unidos operativamente con estructuras promotoras y/o potenciadoras de un gen específico de glándula mamaria, como caseína o betalactoglobulina. El animal puede ser mamíferos no humanos, más preferentemente ratones, ratas, ovejas, terneros, perros, monos o simios.

En otra realización reivindicada se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se ha descrito anteriormente y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se conocen bien o se determinan fácilmente por los expertos en la materia métodos para preparar y administrar sitios de unión a antígeno de los mismos a un sujeto que lo necesite. La vía de administración del sitio de unión a antígeno puede ser oral, parenteral, por inhalación o tópica.

El término parenteral como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal.

Aunque todas estas formas de administración están claramente contempladas como pertenecientes al alcance de la invención, una forma de administración sería una solución para inyección, en particular para inyección intravenosa o intraarterial o goteo. Habitualmente, una composición farmacéutica adecuada para inyección puede comprender un tampón (por ejemplo, tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo polisorbato), opcionalmente un agente estabilizante (por ejemplo, albúmina humana), etc.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones estériles acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como etil oleato. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio tamponado. En la invención objeto, los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, tampón fosfato 0,01-0,1 M y preferentemente 0,05 M o solución salina 0,8 %. Otros vehículos parenterales habituales incluyen soluciones de fosfato sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reforzadores de fluidos y nutrientes, reforzadores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

Más particularmente, las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles, en dichos casos, la composición debe ser estéril y debería ser fluida en la medida en que exista fácil inyectabilidad. Debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y preferentemente conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Se describen formulaciones adecuadas para uso en los métodos terapéuticos desvelados en el presente documento en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., 16a ed. (1980).

Puede conseguirse prevención de la acción de microorganismos por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando un compuesto activo (por ejemplo, sitio de unión a antígeno) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido de esterilización por filtrado. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización, lo que produce un polvo de un principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. Las preparaciones para inyecciones se procesan, se cargan en recipientes tales como ampollas, bolsas, frascos, jeringas o viales, y se sellan en condiciones asépticas de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Además, las preparaciones pueden envasarse y venderse en forma de un kit. Dichos artículos de fabricación preferentemente tendrán etiquetas o prospectos que indican que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que padece o está predispuesto a trastornos.

Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de trastornos como se describe en el presente documento varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, sitio diana, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Habitualmente, el paciente es un ser humano pero también pueden tratarse mamíferos no humanos incluyendo mamíferos transgénicos. Las dosificaciones del tratamiento pueden valorarse usando métodos rutinarios conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y eficacia.

Para el tratamiento de ciertos trastornos con un sitio de unión a antígeno, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del hospedador. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, preferentemente al menos 1 mg/kg. También se pretende que los intermedios de dosis en los intervalos anteriores estén dentro del alcance de la invención. Puede administrarse a los sujetos dichas dosis diariamente, en días alternos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otro programa determinado por análisis empírico. Un tratamiento ejemplar implica la administración en múltiples dosificaciones durante un periodo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales implican la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los programas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, dos o más sitios de unión a antígeno con diferentes especificidades de unión se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada sitio de unión a antígeno administrado queda dentro de los intervalos indicados.

Un sitio de unión a antígeno desvelado en el presente documento puede administrarse en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica midiendo los niveles en sangre del polipéptido diana o molécula diana en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración del polipéptido en plasma de 1-1000 |jg/ml y en algunos métodos 25-300 jg/ml. Como alternativa, los sitios de unión a antígeno pueden administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la semivida del sitio de unión a antígeno en el paciente. La semivida de un sitio de unión a antígeno también puede prolongarse mediante fusión con un polipéptido estable o resto, por ejemplo, albúmina o PEG. En general, los anticuerpos humanizados muestran la semivida más larga, seguido de anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. En una realización, el sitio de unión a antígeno de la invención puede administrarse en forma no conjugada. En otra realización, los sitios de unión a antígeno para uso de los métodos desvelados en el presente documento pueden administrarse múltiples veces en forma conjugada. En otra realización más, los sitios de unión a antígeno de la invención pueden administrarse en forma no conjugada, después en forma conjugada, o viceversa.

La dosificación y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administran composiciones que comprenden anticuerpos o un cóctel de los mismos a un paciente que aún no tiene la patología o antes de la patología para potenciar la resistencia del paciente. Se define que dicha cantidad es una “dosis profilácticamente eficaz”. En este uso, las cantidades precisas dependen de nuevo del estado de salud del paciente y la inmunidad general, pero en general varían de 0,1 a 25 mg por dosis, especialmente 0,5 a 2,5 mg por dosis. Se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas.

En aplicaciones terapéuticas, se requiere en ocasiones una dosificación relativamente alta (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 400 mg/kg de molécula de unión, por ejemplo, sitio de unión a antígeno por dosis, usándose más habitualmente dosificaciones de 5 a 25 mg para radioinmunoconjugados y dosis mayores para moléculas conjugadas con fármacos de citotoxina) a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se ha reducido o terminado, y preferentemente hasta que el paciente muestra alivio parcial o completo de síntomas de la enfermedad. A continuación, puede administrarse al paciente un régimen profiláctico.

En una realización, un sujeto puede tratarse una molécula de ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, en un vector). La dosis para ácidos nucleicos que codifican polipéptidos varían de aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 |jg a 10 mg, o 30-300 |jg de ADN por paciente. La dosis para vectores virales infecciosos varían de 10-100, o más, viriones por dosis. Pueden administrarse agentes terapéuticos por medios parenterales, tópicos, intravenosos, orales, subcutáneos, intraarteriales, intracraneales, intraperitoneales, intranasales o intramusculares para tratamiento profiláctico y/o terapéutico, en algunos métodos, se inyectan agentes directamente en un tejido particular donde se han acumulado células de receptor P2X7 no funcional, por ejemplo, inyección intracraneal. Se prefiere inyección intramuscular o infusión intravenosa para administración del anticuerpo, en algunos métodos, se inyectan anticuerpos terapéuticos particulares directamente en el cráneo. En algunos métodos, se administran anticuerpos como una composición o un dispositivo de liberación sostenida.

Un sitio de unión a antígeno de la invención puede administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son eficaces en el tratamiento del trastorno o afección que necesita tratamiento (por ejemplo, profiláctico o terapéutico).

En otra realización reivindicada se proporciona una composición farmacéutica que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado como se ha descrito anteriormente, un diluyente y opcionalmente un marcador.

En ciertas realizaciones, los sitios de unión a antígeno o molécula que los incluye se marcan de forma detectable. Pueden usarse muchos marcadores diferentes incluyendo enzimas, radioisótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, y compuestos bioluminiscentes. Se usan habitualmente fluorocromos (fluoresceína, rodamina, Texas Red, etc.), enzimas (peroxidasa de rábano rusticano, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, etc.), isótopos radiactivos (32P o 125l), biotina, digoxigenina, metales coloidales, compuestos quimio o bioluminiscentes (dioxetanos, luminol o acridinios).

Los métodos de detección dependen del tipo de marcador usado e incluyen autorradiografía, microscopía de fluorescencia, reacciones enzimáticas directas e indirectas. Los ejemplos incluyen transferencia de Western, ensayos de superposición, RIA (Radioinmunoensayo) e IRMA (Ensayo radioinmunométrico inmunitario), EIA (Inmunoensayo Enzimático), ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas), FIA (Inmunoensayo Fluorescente) y CLIA (Inmunoensayo Quimioluminiscente).

En otra realización descrita se proporciona un kit o artículo de fabricación que incluye un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente.

En otras realizaciones descritas se proporciona un kit para su uso en una aplicación terapéutica mencionada anteriormente, incluyendo el kit:

- un recipiente que contiene una composición terapéutica en forma de uno o más de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica;

- una etiqueta o un prospecto con instrucciones para su uso.

En ciertas realizaciones descritas el kit puede contener uno o más principios activos o ingredientes adicionales para el tratamiento de un cáncer o para prevenir una complicación relacionada con el cáncer descrita anteriormente, o una afección o enfermedad asociada con la expresión del receptor P2X7 no funcional.

El kit o “artículo de fabricación” puede comprender un recipiente y una etiqueta o un prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, envases de tipo blíster, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición terapéutica que es eficaz para tratar la afección y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o el prospecto indican que la composición terapéutica se usa para el tratamiento de la afección elegida. En una realización, la etiqueta o el prospecto incluyen instrucciones para su uso e indican que la composición terapéutica puede usarse para tratar un cáncer o para prevenir una complicación que surge de un cáncer.

El kit puede comprender (a) una composición terapéutica; y (b) un segundo recipiente con un segundo principio activo o ingrediente contenido en el mismo. El kit en esta realización de la invención puede comprender además un prospecto que indica que el principio activo y otros principios activos pueden usarse para tratar un trastorno o prevenir una complicación que surge de cáncer. Como alternativa, o adicionalmente, el kit puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

En cierta realización descrita la composición terapéutica puede proporcionarse en forma de un dispositivo, desechable o reutilizable, que incluye un receptáculo para contener la composición terapéutica. En una realización, el dispositivo es una jeringa. El dispositivo puede contener 1-2 ml de la composición terapéutica. La composición terapéutica puede proporcionarse en el dispositivo en un estado que está listo para su uso o en un estado que requiera mezcla o adición de componentes adicionales.

En otra realización descrita se proporciona un kit o artículo de fabricación que incluye un sitio de unión a antígeno , dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o una composición de diagnóstico como se ha descrito anteriormente.

En otras realizaciones descritas se proporciona un kit para su uso en una aplicación de diagnóstico mencionado anteriormente, incluyendo el kit:

- un recipiente que contiene una composición de diagnóstico en forma de uno o más de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión o conjugado;

- una etiqueta o un prospecto con instrucciones para su uso.

El kit o “artículo de fabricación" puede comprender un recipiente y una etiqueta o un prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, paquetes de tipo blíster, etc. Los recipientes pueden formarse a partir de una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición de diagnóstico que es eficaz para la detección de cáncer y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). La etiqueta o el prospecto indica que la composición de diagnóstico se usa para detectar la afección elegida. En una realización descrita, la etiqueta o el prospecto incluye instrucciones para su uso e indica que la composición de diagnóstico puede usarse para detectar un cáncer o una enfermedad o afección caracterizada por expresión del receptor P2X7 no funcional.

El kit puede comprender (a) una composición de diagnóstico; y (b) un segundo recipiente con un segundo agente de diagnóstico o segunda etiqueta contenida en el mismo. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, etc.

En otra realización descrita se proporciona un método para producir un sitio de unión a antígeno anti-P2X7 como se ha descrito anteriormente incluyendo expresar un ácido nucleico como se ha descrito anteriormente en una célula o animal no humano como se ha descrito anteriormente.

La producción de un sitio de unión a antígeno de la invención requiere en general un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el sitio de unión a antígeno de la invención. Puede obtenerse un polinucleótido que codifica un sitio de unión a antígeno de la invención y subclonarse en un vector para la producción de un sitio de unión a antígeno por tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en este campo, incluyendo técnicas descritas en el presente documento. Se contemplan muchos sistemas de expresión diferentes incluyendo el uso de células de mamífero incluyendo células humanas para la producción y secreción de sitios de unión a antígeno. Los ejemplos de células incluyen 293F, CHO y la línea celular NSO.

Pueden construirse vectores de expresión que contienen secuencias codificantes de proteínas y señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas usando métodos conocidos en la técnica. Estos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. En ciertas realizaciones descritas se proporciona un vector replicable que tiene un ácido nucleico que codifica un sitio de unión a antígeno unido operativamente con un promotor.

Las células transfectadas con un vector de expresión pueden cultivarse por técnicas convencionales para producir un sitio de unión a antígeno. Por lo tanto, en ciertas realizaciones descritas, se proporcionan células hospedadoras o transfectantes celulares que contienen un polinucleótido que codifica un sitio de unión a antígeno de la invención unido operativamente con un promotor. El promotor puede ser heterólogo. Puede utilizarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector expresión y en ciertos sistemas la maquinaria de transcripción del sistema de vector está particularmente adaptada a la célula hospedadora. Por ejemplo, pueden transfectarse células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO) con un vector que incluye el elemento promotor génico temprano intermedio mayor del citomegalovirus humano. Adicionalmente o como alternativa, puede usarse una célula hospedadora que modula la expresión de secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico según se requiera, incluyendo diversas formas de modificación post-traduccional. Los ejemplos de células hospedadoras de mamífero que tienen procesos de modificación post-traduccionales particulares incluyen células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, NSO, CRL7030 y HsS78Bs.

Dependiendo del uso pretendido para la molécula proteica, pueden seleccionarse provechosamente varios vectores de expresión bacteriana. En un ejemplo, pueden usarse vectores que provocan la expresión de altos niveles de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente, tales como el vector de expresión de E. coli pUR278 cuando va a producirse una gran cantidad de un sitio de unión a antígeno. El producto de expresión puede producirse en forma de una proteína de fusión con lacZ. Otros vectores bacterianos incluyen vectores pIN y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos ajenos como proteínas de fusión con glutatión-S-transferasa (GST). Estas proteínas de fusión son generalmente solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión con matriz de afinidad de glutatión-agarosa seguido de elución en presencia de glutatión libre. Puede proporcionarse un sitio de escisión por proteasa de trombina y/o factor Xa en el polipéptido expresado de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto de GST.

Puede usarse el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes ajenos en un sistema de insectos incluyendo células de Spodoptera frugiperda. El promotor particular usado puede depender de dónde se inserte la codificación de proteína en la secuencia. Por ejemplo, la secuencia puede clonarse individualmente en el gen de polihedrina y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina.

Pueden usarse sistemas de expresión basados en virus con células de mamífero tales como un adenovirus por el que la secuencia codificante de interés puede ligarse con el promotor tardío adenoviral y secuencia líder tripartita. Después puede usarse recombinación in vitro o in vivo para insertar este gen quimérico en el genoma adenoviral. Las inserciones en la región E1 o E3 darán como resultado un virus recombinante viable que es capaz de expresar el sitio de unión a antígeno en células hospedadoras infectadas. Pueden requerirse señales de inicio específicas que incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes para traducción eficaz de secuencias codificantes de sitios de unión a antígeno insertados. Pueden obtenerse señales y codones de inicio y de control de la traducción de una diversidad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. Pueden usarse elementos potenciadores de la transcripción y terminadores de la transcripción para potenciar la eficacia de expresión de un sistema basado en virus.

Cuando se requiera producción de alto rendimiento, a largo plazo, de proteínas recombinantes, se prefiere expresión estable. En general se usa un gen marcador seleccionable de modo que después de la transfección, las células se cultiven durante 1-2 días en un medio enriquecido y después se transfieran a un medio que contiene un medio selectivo en el que pueden explorarse las células que contienen el marcador seleccionable correspondiente, por ejemplo, resistencia a antibióticos. El resultado es que las células que tienen el plásmido integrado de forma estable en sus cromosomas crecen y forman focos que a su vez pueden clonarse y expandirse en líneas celulares. Los genes de la timidina quinasa, hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa del virus del herpes simple son ejemplos de genes que pueden emplearse en células tk-, hgrpt- o aprT-, respectivamente proporcionando de este modo sistemas de selección apropiados. Los siguientes genes: dhfr, que confiere resistencia a metotrexato; gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico; neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418; e hygro, que confiere resistencia a higromicina son ejemplos de genes que pueden usarse en sistemas de selección antimetabolitos.

Un sitio de unión a antígeno de la invención puede purificarse por un sistema de expresión recombinante por métodos conocidos incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad (especialmente afinidad por los antígenos específicos Proteína A o Proteína G) y cromatografía en columna de filtración en gel), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. La purificación puede facilitarse proporcionando el sitio de unión a antígeno en forma de una proteína de fusión.

Puede producirse grandes cantidades de los sitios de unión a antígeno de la invención por un proceso que puede cambiarse de escala partiendo de un sistema de expresión piloto en un laboratorio de investigación que se aumenta de escala hasta un biorreactor de escala analítica (típicamente biorreactores de 5 l a aproximadamente 50 l) o biorreactores de escala de producción (por ejemplo, pero sin limitación 75 l, 100 l, 150 l, 300 l o 500 l). Los procesos que pueden cambiarse de escala deseables incluyen en los que hay niveles de bajos a indetectables de agregación como se mide por HPSEC o rCGE, típicamente no más de 5 % de agregación en peso de la proteína hasta no más del 0,5 % en peso de agregación de proteína. Adicionalmente o como alternativa, pueden desearse niveles indetectables de fragmentación medidos con respecto al área máxima total que representan el sitio de unión a antígeno intacto en un proceso que puede cambiarse de escala de modo que al menos el 80 % y hasta el 99,5 % o más del área máxima total represente sitio de unión a antígeno intacto. En otras realizaciones, el proceso que puede cambiarse de escala de la invención produce sitios de unión a antígeno a eficacia de producción de aproximadamente 10 mg/l a aproximadamente 300 mg/l o más.

En otra realización se proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad o afección caracterizado por la expresión del receptor p2X7 no funcional en un individuo que incluye la etapa de proporcionar un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente a un individuo que requiere un tratamiento para dicha afección. Típicamente la afección es cáncer, especialmente un cáncer epitelial como se describe en el presente documento.

Las enfermedades pre-neoplásicas y neoplásicas son ejemplos particulares a los que pueden aplicarse los métodos de la invención. Los ejemplos generales incluyen tumores de mama, tumores colorrectales, adenocarcinomas, mesotelioma, tumores de vejiga, tumores de próstata, tumor de células germinales, hepatoma/colangiocarcinoma, tumores neuroendocrinos, neoplasia de la hipófisis, tumor de células pequeñas de ciclo 20, cáncer de células escamosas, melanoma, fibroxantoma atípico, seminomas, no seminomas, tumores celulares de leydig del estroma, tumores de células de Sertoli, tumores cutáneos, tumores renales, tumores testiculares, tumores cerebrales, tumores ováricos, tumores estomacales, tumores orales, tumores de vejiga, tumores óseos, tumores del cuello uterino, tumores esofágicos, tumores laríngeos, tumores hepáticos, tumores pulmonares, tumores vaginales y tumor de Wilms.

Los ejemplos de cánceres particulares incluyen pero sin limitación adenocarcinoma, adenoma, adenofibroma, adenolinfoma, adontoma, cánceres relacionados con SIDA, neuroma acústico, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adenocístico, cáncer adrenocortical, metaplasia mieloide agnogénica, alopecia, sarcoma de partes blandas alveolar, ameloblastoma, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfoide con eosinofilia, angioma esclerosante, angiomatosis, apudoma, cáncer anal, angiosarcoma, anemia aplásica, astrocitoma, ataxiatelangiectasia, carcinoma de células basales (piel), cáncer de vejiga, cánceres de hueso, cáncer de intestino, glioma del tronco encefálico, tumores del cerebro y el SNC, cáncer de mama, branquioma, tumores del SNC, tumores carcinoides, cáncer del cuello uterino, tumores cerebrales infantiles, cáncer infantil, leucemia infantil, sarcoma de tejidos blandos infantil, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cánceres colorrectales, linfoma de linfocitos T cutáneo, carcinoma (por ejemplo, Walker, células basales, basoescamosas, Brown-Pearce, ductales, tumor de Ehrlich, Krebs 2, células de Merkel, mucinosas, pulmón de células no pequeñas, células en granos de avena, papilar, cirroso, bronquiolar, broncogénico, células escamosas y células transicionales), carcinosarcoma, displasia del cuello uterino, cistosarcoma filoides, cementoma, cordoma, coristoma, condrosarcoma, condroblastoma, craneofaringioma, colangioma, colesteatoma, cilindroma, cistadenocarcinoma, cistadenoma, dermatofibrosarcoma protuberante, tumor de células redondeadas pequeñas desmoplásicas, carcinoma ductal, disgerminoma, cánceres endocrinos, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer esofágico, sarcoma de Ewing, cáncer de los conductos biliares extra-hepáticos, cáncer del ojo; melanoma del ojo, retinoblastoma, cáncer de las trompas de Falopio, anemia de Fanconi, fibroma, fibrosarcoma, cáncer de la vesícula biliar, cáncer gástrico, cánceres gastrointestinales, tumor carcinoide gastrointestinal, cánceres genitourinarios, tumores de células germinales, enfermedad trofoblástica gestacional, glioma, cánceres ginecológicos, tumores de células gigantes, ganglioneuroma, glioma, glomangioma, tumor de células de la granulosa, ginandroblastoma, tumores malignos hematológicos, leucemia por tricoleucitos, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, cáncer de mama hereditario, histiocitosis, enfermedad de Hodgkin, papilomavirus humano, lunar hidatidiforme, hipercalcemia, cáncer de hipofaringe, hamartoma, hemangioendotelioma, hemangioma, hemangiopericitoma, hemangiosarcoma, hemangiosarcoma, trastornos histiocíticos, histiocitosis maligna, histiocitoma, hepatoma, hidradenoma, hondrosarcoma, opoma pequeño inmunoproliferativo, melanoma intraocular, cáncer de células de islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, histiocitosis de células de langerhans, cáncer de la laringe, leiomiosarcoma, leucemia, síndrome de li-fraumeni, cáncer de labios, liposarcoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfedema, linfoma, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, leiomiosarcoma, leucemia (por ejemplo, células b, células mixtas, células nulas, linfocitos t, crónico de linfocitos t, asociado a htlv-ii, linfangiosarcoma, agudo linfocítico, crónico linfocítico, mastocitos y mieloide), leucosarcoma, tumor de células de leydig, liposarcoma, leiomoma, leiomiosarcoma, linfangioma, linfangiocitoma, linfagioma, linfagiomioma, linfangiosarcoma, cáncer de mama masculino, tumor rabdoide maligno del riñón, meduloblastoma, melanoma, cáncer de células de Merkel, mesotelioma, cáncer metastásico, cáncer de boca, neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, mieloma, trastornos mieloproliferativos, síndrome carcinoide maligno, enfermedad cardiaca carcinoide, meduloblastoma, meningioma, melanoma, mesenquimoma, mesonefroma, mesotelioma, mioblastoma, mioma, miosarcoma, mixoma, mixosarcoma, cáncer nasal, cáncer nasofaríngeo, nefroblastoma, neuroblastoma, neurofibromatosis, síndrome de rotura de Nijmegen, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas (nsclc), neurilemoma, neuroblastoma, neuroepitelioma, neurofibromatosis, neurofibroma, neuroma, neoplasias (por ejemplo, de hueso, de mama, del sistema digestivo, colorrectal, de hígado), cánceres oculares, cáncer esofágico, cáncer de la cavidad oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma, cáncer ovárico de ostomía, cáncer de páncreas, cáncer paranasal, cáncer paratiroideo, cáncer de la glándula parótida, cáncer del pene, tumores periféricos neuroectodérmicos, cáncer de la hipófisis, policitemia vera, cáncer de próstata, osteoma, osteosarcoma, carcinoma ovárico, papiloma, paraganglioma, paraganglioma no cromafina, pinealoma, plasmacitoma, protooncogén, cánceres poco habituales y trastornos asociados, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, síndrome de Rothmund-Thomson, reticuloendoteliosis, rabdomioma, cáncer de las glándulas salivares, sarcoma, schwannoma, síndrome de Sezary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas (sclc), cáncer del intestino delgado, sarcoma de tejido blando, tumores de la médula espinal, carcinoma de células escamosas (piel), cáncer de estómago, sarcoma sinovial, sarcoma (por ejemplo, sarcomas experimentales de Ewing, de Kaposi y de mastocitos), tumor de células de Sertoli, sinovioma, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer tiroideo, cáncer de células transicionales (vejiga), cáncer de células transicionales (pelvis-renal/uréter), cáncer trofoblástico, teratoma, tumor de células de la teca, timoma, tumor trofoblástico, cáncer de la uretra, cáncer del sistema urinario, uroplaquinas, sarcoma uterino, cáncer del útero, cáncer vaginal, cáncer de la vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y tumor de Wilms.

Otras enfermedades y afecciones incluyen diversas afecciones inflamatorias. Los ejemplos pueden incluir un componente proliferativo. Los ejemplos particulares incluyen acné, angina, artritis, neumonía de aspiración, enfermedad, empiema, gastroenteritis, inflamación, gripe intestinal, nee, enterocolitis necrotizante, enfermedad inflamatoria pélvica, faringitis, pid, pleuresía, dolor de garganta, rojez, rubor, garganta dolorida, gripe estomacal e infecciones del tracto urinario, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica o polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria crónica.

En otra realización descrita se proporciona un uso de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFsv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente en la fabricación de un medicamento para tratamiento de cáncer.

La cantidad de dosificación, frecuencia de dosificación, vías de administración, etc. se han descrito en detalle anteriormente.

En otra realización descrita se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer que incluye la etapa de poner en contacto tejidos o células para los que debe determinarse la presencia o ausencia de cáncer con un reactivo en forma de un sitio de unión a antígeno, dominio variable de inmunoglobulina, anticuerpo, Fab, dab, scFsv, diacuerpo, triacuerpo, proteína de fusión, conjugado o composición de diagnóstico como se ha descrito anteriormente y detectar la unión del reactivo con los tejidos o células. El método puede realizarse in vivo o in vitro.

Para diagnóstico in situ, el sitio de unión a antígeno puede administrarse al organismo para diagnosticar por inyección intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, intraarterial u otras vías de modo que pueda producirse una unión específica entre un sitio de unión a antígeno de acuerdo con la invención con una región epitópica en el receptor P2X7 no funcional. El complejo de anticuerpo/antígeno puede detectarse convenientemente mediante un marcador unido al sitio de unión a antígeno o un fragmento funcional del mismo o cualquier otro método de detección conocido en la técnica.

Los inmunoensayos usados en aplicaciones de diagnóstico según la invención descrita y como se describen en el presente documento típicamente se basan en antígenos marcados, anticuerpos o reactivos secundarios para detección. Estas proteínas o reactivos pueden marcarse con compuestos que se conocen en general por los expertos habituales en la materia incluyendo enzimas, radioisótopos y sustancias fluorescentes, luminiscentes y cromogénicas incluyendo, pero sin limitación, partículas coloreadas, tales como oro coloidal y perlas de látex. De estos, el marcaje radiactivo puede usarse para casi todos los tipos de ensayos y con la mayoría de variaciones. Los marcadores conjugados con enzimas son particularmente útiles cuando debe evitarse la radiactividad o cuando sean necesarios resultados rápidos. Los fluorocromos, aunque requieren un equipamiento caro para su uso, proporcionan un método de detección muy sensible. Los anticuerpos útiles en estos ensayos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, y anticuerpos policlonales con afinidad purificada.

Como alternativa, el sitio de unión a antígeno puede marcarse indirectamente por reacción con sustancias marcadas que tienen una afinidad por inmunoglobulina, tales como proteína A o G o anticuerpos secundarios. El sitio de unión a antígeno puede conjugarse con una segunda sustancia y detectarse con una tercera sustancia marcada que tiene una afinidad por la segunda sustancia conjugada con el sitio de unión a antígeno. Por ejemplo, el sitio de unión a antígeno puede conjugarse con biotina y el conjugado de sitio de unión a antígeno-biotina detectarse usando avidina o estreptavidina marcada. De forma similar, el sitio de unión a antígeno puede conjugarse con un hapteno y el conjugado de sitio de unión a antígeno-hapteno detectarse usando anticuerpo anti-hapteno marcado.

En ciertas realizaciones descritas, los inmunoensayos utilizan un método de doble anticuerpo para detectar la presencia de un analito, en el que el sitio de unión a antígeno se marca indirectamente por reactividad con un anticuerpo secundario que se ha marcado con un marcador detectable. El anticuerpo secundario es preferentemente uno que se une con anticuerpos del animal del que deriva el sitio de unión a antígeno. En otras palabras, si el sitio de unión a antígeno es un anticuerpo de ratón, entonces el anticuerpo secundario, marcado, es un anticuerpo anti­ ratón. Para que el sitio de unión a antígeno se use en el ensayo descrito en el presente documento, este marcador es preferentemente una perla recubierta con anticuerpo, particularmente una perla magnética. Para que el sitio de unión a antígeno se emplee en el inmunoensayo descrito en el presente documento, el marcador es preferentemente una molécula detectable tal como una sustancia radiactiva, fluorescente o electroquimioluminiscente.

También puede emplearse dentro del alcance de la presente invención descrita un sistema de anticuerpo doble alternativo, denominado con frecuencia sistemas de formato rápido porque se adaptan a determinaciones rápidas en presencia de un analito. El sistema requiere alta afinidad entre el sitio de unión a antígeno y el analito. De acuerdo con una realización de la presente invención, la presencia del receptor P2X7 no funcional se determina usando un par de sitios de unión a antígeno, cada uno específico para la proteína del receptor P2X7. Uno de dichos pares de sitios de unión a antígeno se denomina en el presente documento “sitio de unión de antígeno detector” y el otro de dicho par de sitios de unión a antígeno se denomina en el presente documento “sitio de unión a antígeno de captura”. El sitio de unión a antígeno de la presente invención puede usarse como un sitio de unión a antígeno de captura o un sitio de unión a antígeno detector. El sitio de unión a antígeno de la presente invención también puede usarse como sitio de unión a antígeno tanto de captura como detector, juntos en un único ensayo. Una realización de la presente invención descrita usa por lo tanto el método de tipo sándwich de sitios de unión a antígeno doble para detectar el receptor P2X7 no funcional en una muestra de fluido biológico. En este método, el analito (proteína de receptor P2X7 no funcional) se intercala entre el sitio de unión a antígeno detector y el sitio de unión a antígeno de captura, inmovilizándose de forma irreversible el sitio de unión a antígeno de captura en un soporte sólido. El sitio de unión a antígeno detector contendría un marcador detectable, para identificar la presencia del sándwich de analito-sitio de unión a antígeno y por lo tanto la presencia del analito.

Las sustancias de fase sólida ejemplares incluyen, pero sin limitación, placas de microtitulación, tubos de ensayo de poliestireno, perlas magnéticas, de plástico o de vidrio y portaobjetos que se conocen bien en el campo de radioinmunoensayo e inmunoensayo enzimático. Se conocen bien por los expertos en la materia métodos para acoplar sitios de unión a antígeno a fases sólidas. Más recientemente, se han empleado varios materiales porosos tales como nylon, nitrocelulosa, acetato de celulosa, fibras de vidrio y otros polímeros porosos como soportes sólidos.

Se pretende que los siguientes ejemplos se ilustren pero sin limitación la presente invención descrita.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 - IDENTIFICACIÓN DE CANDIDATOS DE dAB PARA UNIÓN CON RECEPTORES NO FUNCIONALES EN CÉLULAS VIVAS

Objetivo: Los experimentos descritos en el presente documento han sido para encontrar sitios de unión a antígeno que se unen con el péptido E200.

Antecedentes: Los antisueros que se unen con P2X7 tienen baja afinidad por P2X7 como se expresa en células de cáncer de hígado ya que la conformación de la diana epitópica en células de cáncer vivas difiere. Para identificar candidatos de dAb para agentes de unión de alta afinidad, fue necesario en primer lugar identificar una diana adecuada, sabiendo que se requiere una buena diversidad de secuencias de agentes de unión para ampliar la exploración del espacio conformacional para abarcar compuestos candidatos adecuados. Se seleccionó el péptido E200 como una diana adecuada para identificar candidatos de dAb.

Materiales y métodos: El péptido E200 se realizó por síntesis de fase sólida en Chiron Mimotopes. Se sintetizó una serie de conjugados para identificar los que más probablemente eran útiles para fines de exploración. Estos incluían conjugados proteicos BSA, DT y ovoalbúmina unidos con el residuo cys C terminal en el péptido E200 mediante MCS. Una cuarta variante implicaba biotinilar el péptido E200 en el extremo C terminal.

Se identificaron inicialmente clones candidatos como positivos para ELISA en exploraciones tanto de fase sólida como de fase de solución. Estas se realizaron frente a los péptidos tanto conjugados como no conjugados. Se sintetizaron péptidos adicionales (200-208 y 207-215) para diferenciar más completamente las regiones de unión de los diversos clones candidatos. Se ensayaron las propiedades de solución usando SEC-MALLS de los clones candidatos para asegurar que eran adecuados para desarrollo posterior.

Resultados:

Se identificó y se aisló un gran número de candidatos de primera generación que se unieron inicialmente con el péptido E200 con afinidad de unión en el intervalo de K^d |^jM como se mide por Biacore y después se unieron de forma detectable por citometría de flujo con células cancerosas vivas que expresaban la diana del receptor P2X7 no funcional en su superficie. Los anticuerpos de dominio único producidos a partir de biblioteca de presentación en fagos Domantis explorada frente al antígeno peptídico E200 mostraron una K^d del orden de 1 ^j M usando análisis de unión de Biacore. Los clones candidatos que se llevan adelante mostraron diversidad en sus características de unión. Tres dAb candidatos, PEP2-2, PEP2-4 y PEP2-5 mostraron la mayor afinidad cuando se ensayaron en células de cáncer de próstata humana PC3 vivas por citometría de flujo. La exploración adicional implicó el uso de inmunohistoquímica convencional en la que se incubó tejido humano normal y canceroso con el dAb seleccionado marcado con el marcador Myc al que se añadió anticuerpo anti-Myc con HRp. Se añadió diaminobenzoato (DAB) para reaccionar con cualquier HRP restante después de completarse las etapas de lavado debidas. PEP2-4 y PEP2-5 se unieron moderadamente al tejido tumoral pero no al tejido normal tal como próstata y piel humana mientras que PEP2-2 fue un ejemplo de un candidato de dAB que mostró poca unión eficaz con tejido en la exploración inicial. Se realizó selección pasiva usando los péptidos E200, el conjugado E200-BSA, el conjugado de E200 y ovoalbúmina y el conjugado de E200-DT mientras que la exploración de solución usó el péptido biotinilado ensayado después usando estreptavidina. Las selecciones tanto pasivas como en solución de los numerosos dAb candidatos funcionó bien con agentes de unión específicos que demostraban una buena diversidad de secuencia en forma de dominios V^h individuales. La exploración frente al péptido E200 y partes más pequeñas (200-208 y 207-215) reveló que los dab candidatos se unían con diferentes regiones. Se llevaron adelante los que tenían las mejores propiedades de solución, que eran la mayor solubilidad de monómeros. Los que demostraron características de unión de Biacore bifásico no se llevaron adelante. Todos mostraron unión j M con el péptido E200. En última instancia se llevaron a cabo un total de cinco ciclos de exploración como se muestra en el Ejemplo 5. Un ejemplo de los resultados del Ciclo 2 se muestra en la Figura 1.

A continuación hay un ejemplo de dAb que se une con tejido canceroso en el que se tiñó tejido canceroso de cuello uterino humano con dAb marcado con c-Myc PEP2-4 y después se desarrolló usando anticuerpo de ratón anti-Myc (1:600) seguido del sistema de detección del polímero secundario Mach4 de Biocare Medical y DAB. Para inhibir la unión, se añadió el sustrato peptídico al primario a concentraciones de 0 (Figura 2), 25 nM (sin pérdida de unión), 0,25 j M (sin pérdida de unión), 10 j M (sin pérdida de unión), 0,1 mM (Figura 3) y 1 mM (Figura 4).

No se observó inhibición de la unión a una concentración menor de 0,01 mM lo que indica que el ideal para 50 % de inhibición es de aproximadamente 40-50 j M.

Se muestra un segundo conjunto de secciones seriadas en las Figuras 5-7 de diferentes secciones tisulares, aumento también 10x.

La diferencia entre péptido de competición añadido 0 y 10 ^j M en contraste fue mínima como se muestra en las Figuras 8 (sin péptido) y 9 (péptido 10 ^j M).

Hay una clara inhibición a 100 j M sin inhibición a 10 j M lo que indica que la unión al 50 % de inhibición parece ser de aproximadamente 40-50 ^j M en este sistema.

Una sección de tejido de melanoma humano teñido de forma similar con dAb PEP2-420 nM se muestra en la Figura 10 posterior.

Conclusión: Se identificaron sitios de unión a antígeno en forma de candidatos de dAb para unión de P2X7 con células PC3 de alta afinidad. Se desconocía si estos sitios de unión a antígeno interaccionan con un epítopo lineal o conformacional y se investigó posteriormente. El refinamiento de los candidatos requirió exploración adicional frente a un epítopo conformacional que representaba la forma del sitio de unión a antígeno diana E200 como se expresa en células cancerosas.

Ejemplo 2 - DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CANDIDATOS DE dAb EN FORMATO dAb-Fc Objetivo: Los experimentos descritos en el presente documento han sido para mejorar la afinidad de sitios de unión a antígeno que se unen con el péptido E200 mediante el formateo de dab candidatos como dAb-Fc.

Antecedentes: Se consiguió unión cooperativa de los dab candidatos produciendo dAb-Fc de formato convencional con el subtipo IgG1 Fc de tipo humano. Estos formatos permitieron más exploración considerada de los clones de dAb candidatos permitiendo la eliminación de dab candidatos de alta afinidad para los que el formateo como dAb-Fc proporcionó poco beneficio debido a problemas de solubilidad. Después se seleccionarían soluciones conformacionales favorables para ciclos adicionales de exploración.

Resultados: Los primeros dab formateados PEP2-4 y PEP2-5 que se habían seleccionado como candidatos de alta afinidad del Ejemplo 1 mostraron poca unión adicional con el péptido E200 mientras que PEP2-2 y otros (2-47, 2-42) se beneficiaron con una mejora típica en K^d de 100-1000 veces. El formateo de los diversos candidatos dio como resultado una buena expresión como se desvela en el gel SDS-PAGE en la Figura 11.

La mejora de la unión es evidente con los candidatos que incluyen PEP2-2, PEP2-42, PEP2-47 mostrados en la Figura 12 en los que la micro placa de Biacore se recubrió con 100 UR de E200 y cada dAb-Fc se procesó a 100 nM.

Ejemplo 3 - DETERMINACIÓN DE UN EPÍTOPO CONFORMACIONAL PARA EXPLORACIÓN FRENTE A CANDIDATOS DE dAb

Objetivo: Los experimentos descritos en el presente documento han sido para determinar un epítopo conformacional apropiado para encontrar dAb que se unen con el péptido E200 y también se unen con un epítopo conformacional.

Antecedentes: Los agentes de unión de alta afinidad son para unirse con un dominio extracelular del receptor P2X7 no funcional. La secuencia de P2X7 se muestra en SEQ ID NO: 1. Hay varias construcciones posibles que podrían desarrollarse pero hubo que determinar cuál de estas modelarían los epítopos conformacionales como se observa en una célula cancerosa viva. Fue necesario particularmente una diana que pudiera unirse con una fase sólida para posteriores experimentos de maduración de afinidad.

Se comenzó con ECD1 que tiene la estructura 47-332 porque este constituye todos los aminoácidos que forman el dominio extracelular entre los dominios transmembrana TM1 y TM2 incluyendo el segmento intra-membranoso potencial en el extremo C terminal del segmento de 325-332. Incluyendo todos los restos se consideró probable que la estructura en torno al E200 diana se conservara.

Materiales y métodos: Se construyó ECD1 de forma recombinante usando procedimientos de biología molecular convencionales y se expresó en células E. coli como proteína soluble y se formateó como ECD-Fc y en pDisplay para inmunofluorescencia, transferencia de Western y citometría de flujo. La estructura de pDisplay tuvo la forma mostrada en el esquema de la Figura 13.

Resultados: Se compararon la expresión en superficie celular del P2X7 en forma de tipo silvestre (WT) y en dos formas mutantes de longitud completa no funcionales (R307Q y E496A) junto con el ECD1 en células HEK293E y se midió con Transferencia de Western. Los lisados celulares y la expresión en superficie celular se comparó en las tres formas y se añadió el marcaje al ECD1. Se usó anticadherina como un control de normalización. Las células se biotinilaron con sulfo-NHS-SS-biotina, la reacción se detuvo y se realizó lisis con detergente suave. En este estadio se conservó una alícuota para indicación de la proteína celular total. La proteína biotinilada se capturó con resina de neutravidina que se lavó y eluyó con DTT 50 mM. El sobrenadante se conservó para una indicación del grupo intracelular de proteína específica. Las muestras se procesaron después en SDS PAGE reductor convencional/Western (Figura 14).

La expresión en superficie celular indica una reducción de los niveles de los mutantes no funcionales en comparación con WT en la superficie celular. La expresión de ECD1 de pDisplay expresado es eficazmente alta. Esta forma de la proteína se marca por anticuerpos para la forma no funcional del receptor, la forma específica de tumor y puede por lo tanto considerarse una posible forma representativa de tumor. Los monocitos, por el contrario, que expresaban la forma WT, fueron incapaces de unirse con los dAb. La eficacia de unión de los dab con el pDisplayECD1 fue menor que lo que indicaban los niveles de expresión que debería haber sido. Esto indica que la unión del epítopo diana en células vivas tienen impedimento estérico y la estructura de ECD1 es subóptima.

Conclusión: Aunque la construcción ECD1 se unió con candidatos de dAb lo que indica unión con un epítopo conformacional, la unión fue subóptima lo que planteó dudas con respecto a si esta construcción sería útil para estudios de maduración de afinidad.

Ejemplo 4 - DETERMINACIÓN DE LA CONSTRUCCIÓN ADICIONAL PARA MADURACIÓN DE AFINIDAD DE dAb CANDIDATOS

Objetivo: Producir una construcción que podría usarse en estudios de maduración de afinidad.

Antecedentes: El Ejemplo 3 reveló que ciertas isoformas de ECD podrían no reproducir epítopos conformacionales de P2X7 como se observa en tumores vivos. Se decidió intentar una construcción adicional en forma de la estructura 47-306 (ECD2).

Materiales y métodos: Se construyó ECD2 de forma recombinante como en el Ejemplo 3, en forma soluble, formato Fc y como pDisplay para inmunofluorescencia, Transferencia de Western y citometría de flujo.

Resultado: Se muestra en la Figura 15 expresión de ECD2 como una construcción de Fc. Se muestra un SDS-PAGE reductor con fracciones de Proteína A en dos formas: WT (funcional) y formas mutantes K139A (no funcionales). Se identificaron dAb que se unían con la construcción ECD2. NB es una alícuota del sobrenadante que representa proteína no unida con Proteína A.

Las especies de dAb-Fc PEP2-4 y PEP2-5 junto con dAb de control HEL4 se procesaron en geles no reducidos y reducidos y Western correspondientes procesados en las fracciones reveladas con anticuerpo anti-P2X7 (Figura 16). Tanto la expresión de dAb-Fc como la expresión de ECD2-Fc está clara. Los geles reducidos muestran marcaje específico en el ECD2Fc del anticuerpo anti-P2X7 a 62 kDa con un fragmento proteolítico de menor peso molecular (monocatenario) a 31 kDa. Los Western correspondientes muestran reactividad con ambas bandas de ECD2 pero ninguna con HEL4Fc, PEP2-4Fc o PEP2-5Fc.

La unión por citometría de flujo con células HEK293E vivas que expresaban pDisplay-ECD2 se mejoró claramente (Figura 17). La selección de unión de células vivas con HEL4 como el agente de unión de control negativo mostró claras mejoras con un mayor porcentaje de células positivas detectadas con dAb candidatos lo que indica que el epítopo diana tenía menos impedimento estérico y estaba disponible para unión (Figura 18).

Conclusión: Se han identificado sitios de unión a antígenoque se unen con el receptor P2X7 no funcional en células vivas y en ECD2. La retirada de los restos 307-332, comenzando a una estimación de 3 nm del sitio del epítopo de E200 tiene unión mejorada con la retirada de impedimento estérico parcial. No se produce pérdida de conformación de E200 incluso aunque se esperaría que el segmento 307-332 estabilizara el plegamiento proteico ya que interacciona estrechamente con el segmento N terminal.

Ejemplo 5 - Generación de diversos agentes de alta afinidad.

Objetivo: Generar sitios de unión a antígeno con alta afinidad por el receptor P2X7 no funcional.

Antecedentes: Los sitios de unión a antígeno del Ejemplo 1 que tienen las siguientes secuencias:

se usaron como puntos de partida para ciclos por iteraciones de selección aleatoria y exploración sujetos a problemas de unión en el formato de Fc, solubilidad y posesión de una traza de disociación unifásica en Biacore. PEP2-2 y PEP2-47 poseían las características requeridas y se seleccionaron para maduración de afinidad incluso aunque tenían sorprendentemente menor afinidad de dominio individual por las dianas conformacional de ECD2 y de péptido E200 que otros dab candidatos tales como PEP2-4 y PEP2-5.

Materiales y métodos: Se maduró la afinidad de los dominios V^h seleccionados incluyendo 2-2, 2-47 y descendientes mediante 6 ciclos de diversificación de secuencia que incluían todas las CDR así como todas las regiones marco conservadas mediante diversificación de NNS que tomaron muestras de los 20 aminoácidos en cada posición. El armazón de la biblioteca de V^h originado del V^h humano que dio lugar al control de HEL4 sin unión y los diversos agentes de unión positivos tiene la secuencia:

VHD EVQLLEPGGGLVQPGGSLRLSCAASGVNVSHDSMTWVRQAPGKGLEWVSAIRGPNGSTYYADSVKGRFTISR DNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGARHADTERPPSQQTMPFWGQGTLVTVSS

Se generaron bibliotecas propensas a errores con una tasa de error de 2,7 aminoácidos. Se exploraron grupos de clones frente al E200 inicialmente y después el ECD2 por ELISA de fagos con respecto a afinidad de unión aumentada. Se subclonaron ocho bibliotecas propensas a errores en el vector de expresión de dAb soluble pDOM38 sin marcador. Se llevó a cabo selección pasiva hasta el Ciclo 3. Se exploró un total de 1000 clones por Biacore a partir de las bibliotecas de Ciclo 5 PEP2-42, PEP2 agrupados y la biblioteca de Ciclo 4 PEP2 agrupados. El grupo de clones representa los clones de PEP2 2-1, 2-2, 2-11, 2-13, 2-30, 2-34, 2-42 y 2-47. Se observó mejora en las velocidades de disociación por Biacore. La exploración de ELISA frente a E200 biotinilado 1 nM mostró mejora de CE50 del intervalo de 107 a 106 pg/ml en el Ciclo 3 a 104 pg/ml en el Ciclo 5, muy por encima de los dAb de control. Se muestra en la Figura 19 el seguimiento por Biacore de clones de PEP2-42 seleccionados para péptido E200. El clon parental y los dab de control de HEL4 están en la parte inferior de la figura. Se muestran variaciones de secuencia de los clones seleccionados en la siguiente figura. Los 32 clones mostrados tienen todos velocidades de disociación mejorada. Las curvas de velocidades de disociación quedaron en dos familias y se seleccionaron clones en consecuencia (Figura 20) con E/F (azul a la izquierda) que representan una curva de velocidad de disociación clásica y G/H (rojo a la izquierda) un tipo bifásico irregular. Los valores de Kd son 76 nM para el clon 6 y 200 nM para el clon 7.

Se obtuvo determinación de las características bioquímicas y/o biofísicas de los sitios de unión a antígeno por SEC-MALLS. Los que tenían características de solución monomérica se seleccionaron frente a los que tenían propensión a agregarse. Se descubrieron en general clones con una solubilidad en PBS > 10 mg/ml.

Se usó exploración de NNS, particularmente de parte de la región CDR3 variable, pero extendiéndose a los restos críticos en F4 tales como los restos 103-105 para refinar la unión a antígeno.

Resultados:

El árbol familiar de maduración de afinidad de anticuerpos se muestra en la Figura 21. Se muestra un ejemplo de la unión mejorada por Biacore en forma del clon PEP2-2-3Fc en la Figura 22. El canal se recubrió con 10 UR de péptido E200 y después se cargó con PEP2-2-3 100 pM, 250 pM, 500 pM y 1 nM en orden ascendente en la figura. El ajuste de curva revela una Kd de 130 pM. El valor correspondiente para el dAb no formateado PEP2-2-3 frente a E200 es de 7 nM, lo que muestra un aumento más moderado en la unión para los dab de alta afinidad cuando se formatean como dAb-Fc en comparación con el aumento de los dab parentales tales como PEP2-2 que aumentaron de 1 pM a 300 pM.

Los valores correspondientes para la Kd cuando se miden frente a ECD2 en forma de solución o como una construcción de ECD-Fc mostraron una unión significativamente menor frente al epítopo conformacional, produciendo PEP2-2-3 Fc un valor de 1,5 nM, PEP2-2-1 560 pM y PEP2-472-1 584 pM como ejemplos.

Se muestran ejemplos de KD de PEP2-Fc derivado de Biacore usando E200 en la siguiente Tabla.

El efecto de la exploración de NNS en la posición 103 en PEP2-2-1 se muestra en la Figura 23. La traza 1 es solamente tampón y la Traza 5 es un ejemplo típico de unión mejorada obtenida intercambiando un resto de Arg por el Trp.

La unión de clones candidatos seleccionados con células HEK293 que expresaban control de simulación (sin unión), pDisplay-ECD1 (unión moderada), pDisplay-ECD2 (mayor unión) y control de pDisplay (sin unión) se ve en la Figura 24.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo de dominio único para unión a un receptor P2X7, definiéndose el anticuerpo de dominio único por la fórmula general:

FR1- CDR1- FR2- CDR2- FR3- CDR3- FR4

en la que:

FR1, FR2, FR3 y FR4 son cada una regiones marco conservadas;

CDR1, CDR2 y CDR3 son cada una regiones determinantes de complementariedad;

y en las que:

CDR1 tiene una secuencia: PMKDMG;

CDR2 tiene una secuencia: AISGSGGGTYYADSVKG; y

CDR3 tiene una secuencia: EPKPMDTEFDY.

2. Un anticuerpo de dominio único para unión a un receptor P2X7, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

FR1 tiene una secuencia: EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTF;

FR2 tiene una secuencia: WVRQAPGKGLEWVS;

FR3 tiene una secuencia: RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA;

FR4 tiene una secuencia: RSQGTLVTVSS, RSPGTLVTVSS, RSCGTLVTVSS o PSPGTLVTVSS.

3. Un anticuerpo de dominio único para unión a un receptor P2X7, de acuerdo con la reivindicación 2, en el que: FR4 tiene una secuencia de RSQGTLVTVSS.

4. Un dominio variable de inmunoglobulina, Fab, diacuerpo, triacuerpo, scFv, proteína de fusión o conjugado que incluye un anticuerpo de dominio único de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un anticuerpo de dominio único de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o dominio variable de inmunoglobulina, Fab, diacuerpo, triacuerpo, scFv, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 4, en el que una secuencia de aminoácidos que forma una o más de FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 es una secuencia humana.

6. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo de dominio único de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o dominio variable de inmunoglobulina, Fab, diacuerpo, triacuerpo, scFv, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 4.

7. Una composición farmacéutica que incluye un anticuerpo de dominio único de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o dominio variable de inmunoglobulina, Fab, diacuerpo, triacuerpo, scFv, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 4 y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Un anticuerpo de dominio único de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o dominio variable de inmunoglobulina, Fab, diacuerpo, triacuerpo, scFv, proteína de fusión o conjugado de acuerdo con la reivindicación 4, o composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento del cáncer o de una afección inflamatoria.