ES2707711T3 - Administración de enzimas reductoras de quinurenina para tratamiento tumoral - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una quinureninasa o un ácido nucleico que codifica una quinureninasa, para su uso en un método para el tratamiento de un tumor en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Administración de enzimas reductoras de quinurenina para tratamiento tumoral

Antecedentes de la invención

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de las solicitudes provisionales de Estados Unidos número 61/872.132, presentada el 30 de agosto de 2013 y 61/986.366, presenta el 30 de abril de 2014.

La invención se hizo con el apoyo gubernamental con la subvención n.° R01 CA154754 otorgada por los National Institutes of Health. El Gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.

1. Campo de la invención

La invención se refiere en general a composiciones para su uso en un método para el tratamiento del cáncer con enzimas que reducen la L-quinurenina o L-3-hidroxiquinurenina. Más particularmente, se refiere a la genomanipulación, optimización farmacológica y uso de enzimas bacterianas y de mamífero con actividad degradante de L-quinurenina adecuadas para tratamiento de seres humanos.

2. Descripción de la técnica relacionada

La sobreexpresión de las isoformas de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO1 o IDO2) por las células cancerosas o la reprogramación de los leucocitos de infiltración en cáncer para que expresen estas enzimas ha demostrado tener un efecto profundo sobre la atenuación de respuestas inmunitarias adaptativas contra el cáncer. IDO1 e IDO2, así como la enzima triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO), cuya expresión por las células estromales puede inducirse por algunos tumores, catalizan la etapa limitante de la velocidad en el catabolismo de triptófano (Trp) en L-quinurenina (KYN) (Godin-Ethier et al., 2011). Los tumores intercambian una molécula de KYN citosólica por una molécula de Trp extracelular usando un intercambiador de aminoácidos de tipo LAT1 (Kaper et al., 2007), que tiene el efecto doble sobre las células inmunitarias de elevar localmente los niveles de KYN mientras reduce localmente los niveles de Trp. Las células inmunitarias adyacentes internalizan KYN, donde es un ligando activador para el receptor de hidrocarburo arilo (AHR) que provoca la expresión de numerosas citocinas y quimiocinas que dan lugar a tolerancia tumoral mediante diferenciación de células inmunitarias y/o inducción de apoptosis (Della Chiesa et al., 2006; Opitz et al., 2011; Song et al., 2011). Adicionalmente, otros compuestos relacionados con KYN formados a partir de quinurenina, muy notablemente el ácido quinurénico también ejercen un efecto inmunosupresor funcionando como agonistas del GPCR huérfano GPCR35. La inhibición de la formación de KYN (y, por tanto, la inhibición de la formación de subproductos de metabolismo de KYN, incluyendo el ácido quinurénico, 3-hidroxil quinurenina y ácido quinolínico, mediante la inhibición de IDO1 o TDO ha recibido una cantidad significativa de atención como diana contra el cáncer (Chen y Guillemin, 2009; Rutella et al., 2009; Prendergast, 2011). Se han desarrollado inhibidores de análogos de sustrato, tales como 1-DL-metiltriptófano, para IDO1 y han resultado inicialmente prometedores en la superación de la tolerancia tumoral inducida por cáncer, restaurando de este modo la capacidad del sistema inmunitario nativo de combatir los tumores (Lob et al., 2009). Sin embargo, KYN también se produce por la triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO), que también se expresa frecuentemente en tumores, y esta enzima no se inhibe por 1-DL-metiltriptófano (Pilotte et al., 2012). También hay preocupaciones adicionales con el isómero de D 1-DL-metiltriptófano (1-D-MT) actualmente en ensayos clínicos en fase 1 y 2. Paradójicamente, 1-D-MT puede regular por aumento la expresión de IDO1, aumentando realmente los niveles de KYN e induciendo la inmunosupresión en determinados cánceres (Opitz et al., 2011).

El control de la producción tumoral de KYN es el centro de muchas investigaciones y tiene el potencial de tratar, entre otros, cánceres tales como cáncer de mama, carcinoma de ovario, glioblastoma y carcinoma pancreático. Se sabe KYN suprime la proliferación, así como que induce la apoptosis en linfocitos T y linfocitos NK (Opitz et al., 2011; Mandi y Vacsei, 2012) posibilitando que los tumores evadan la detección y destrucción por el sistema inmunitario de un paciente. KYN es un ligando potente del receptor de hidrocarburo arilo (AHR) cuya activación en linfocitos T induce la diferenciación en linfocitos T reguladores (Treg) CD25+FoxP3+ (Mezrich et al., 2010). También se ha demostrado que KYN evita la regulación por aumento mediada por citocinas de receptores específicos (NKp46 y NKG2D) necesaria para la eliminación celular mediada por NK en líneas de células tumorales (Della Chiesa et al., 2006), una acción que también está mediada probablemente por su efecto agonista sobre AHR (Shin et al., 2013). También hay evidencias clínicas de la vinculación de niveles de KYN en suero elevados y la supervivencia disminuida en múltiples tipos de cáncer. En pacientes sanos, los niveles de KYN en suero están en el intervalo de 0,5 a 1 pM. En pacientes con tipo de cáncer que producen KYN, tales como linfoma difuso de linfocitos B grandes, los niveles de KYN en suero se midieron en como mucho 10 veces mayores (Yoshikawa et al., 2010; de Jong et al., 2011; Yao et al., 2011) y fueron pronósticos de supervivencia entre pacientes con linfoma que reciben el mismo régimen te tratamiento; aquellos con niveles en suero por debajo de 1,5 pM mostraban una tasa de supervivencia en 3 años de un 89 %, en comparación con únicamente un 58 % de supervivencia para aquellos con niveles de KYN por encima de 1,5 pM. Esta diferencia en la supervivencia se atribuyó a los efectos inmunosupresores de KYN (Yoshikawa et al., 2010). El uso de inhibidores de IDO de molécula pequeña, tales como 1-D-MT, ha demostrado la utilidad de controlar los niveles de KYN en la restauración de la función inmunitaria, pero los efectos inespecíficos de la regulación por aumento de IDO1 por 1-DMT y la ausencia de inhibición de TDO y la isoforma IDO1 son preocupantes.

La presente invención divulga el uso de enzimas para la reducción específica de KYN y sus metabolitos en tumores y/o en la sangre. Se usan enzimas reductoras de KYN para disminuir las concentraciones de KYN para el tratamiento de tumores que expresan IDO1, IDO2 o TDO, evitando de este modo los efectos tolerogénicos mediados por el tumor y mediando en su lugar las respuestas proinflamatorias de ablación tumoral. De forma notable, el uso de enzimas para la reducción de KYN y los subproductos metabólicos de KYN evita los problemas asociados con inhibidores de moléculas pequeña de las isoformas de IDO y de TDO analizados anteriormente y evita completamente además los efectos inespecíficos que acompañan muy habitualmente a los fármacos de molécula pequeña y dan lugar a toxicidades imprevisibles y los efectos secundarios.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una composición que comprende una quinureninasa o un ácido nucleico que codifica una quinureninasa para su uso en un método para el tratamiento de un tumor en un sujeto. Aspectos de la presente invención superan una deficiencia principal en la técnica de proporcionar enzimas que comprenden secuencias polipeptídicas bacterianas y de mamífero que puedan degradar la L-quinurenina y 3-hidroxi-L-quinurenina y presentar farmacocinética favorable en suero como se desea para el tratamiento del cáncer. En algunos aspectos, la enzima quinureninasa puede tener mayor actividad catalítica hacia quinurenina que hacia 3'OH-quinurenina. Puede usarse una quinureninasa de una especie bacteriana. Dicha enzima puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7 y 13-52 o una versión modificada de las mismas. En particular, el agente terapéutico puede obtenerse de la enzima quinureninasa de Pseudomonas fluorescens, (Pf-KYNU). Como alternativa, puede usarse una quinureninasa de Saccharomyces cerevisiae o Neurospora crassa. El agente terapéutico puede obtenerse se la enzima quinureninasa de Mucilaginibacter paludis. Además, para evitar los efectos adversos debidos a la inmunogenicidad de las quinureninasas heterólogas, puede usarse la enzima de Homo sapiens u otras quinureninasas de primate que presentan un >95 % de identidad de secuencia con la enzima humana. Por ejemplo, una enzima novedosa puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7-9.

En otros aspectos, un polipéptido que comprende una quinureninasa humana o de primate nativa o modificada que puede degradar KYN y que tiene actividad hacia la degradación de 3-hidroxiquinurenina o ácido quinurénico puede estar comprendido en la composición de la presente invención. En algunas realizaciones, el polipéptido puede tener capacidad de degradación de KYN en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una eficacia catalítica por KYN (kcat/KM) de al menos o aproximadamente, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 104, 105, 106 M'1s'1 o cualquier intervalo derivable en los mismos.

Un polipéptido modificado como se analiza anteriormente puede caracterizarse por tener un determinado porcentaje de identidad en comparación con un polipéptido no modificado (por ejemplo, un polipéptido nativo) o con cualquier secuencia polipeptídica divulgada en este documento. por ejemplo el polipéptido no modificado puede comprender al menos, o hasta, aproximadamente 150, 200, 250, 300, 350, 400 restos (o cualquier intervalo derivable en los mismos) de una quinureninasa nativa. El porcentaje de identidad puede ser de aproximadamente, de como mucho o de al menos un 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % (o cualquier intervalo derivable en los mismos) entre los polipéptidos modificado y no modificado, o entre dos secuencias cualesquiera en comparación. También se contempla que el porcentaje de identidad analizado anteriormente puede referirse a una región modificada particular de un polipéptido en comparación con una región no modificada de un polipéptido. por ejemplo, un polipéptido puede contener un sitio de reconocimiento de sustrato modificado o mutante de una quinureninasa que puede caracterizarse basándose en la identidad de la secuencia de aminoácidos del sitio de reconocimiento de sustrato modificado o mutante de la quinureninasa con el de una quinureninasa no modificada o mutante de la misma especie o entre las especies. Un polipéptido humano modificado o mutante caracterizado, por ejemplo, con al menos un 90 % de identidad con una quinureninasa no modificada significa que al menos un 90 % de los aminoácidos en ese polipéptido humano modificado o mutante son idénticos a los aminoácidos en el polipéptido no modificado.

Dicho polipéptido no modificado puede ser una quinureninasa nativa, particularmente una isoforma humana u otras isoformas de primate. Por ejemplo, la quinureninasa humana nativa puede tener la secuencia de la SEQ ID NO: 8. Ejemplos no limitantes de otras quinureninasas de primate nativas incluyen la quinureninasa de Pongo abelii (Genbank iD: XP_002812508.1; SEQ ID NO: 10), la quinureninasa de Macaca fascicularis (Genbank ID: EHH54849.1; SEQ ID NO: 11), y la quinureninasa de Pan troglodytes (Genbank ID: XP_003309314.1; SEQ ID NO: 12). Los polipéptidos nativos ejemplares incluyen una secuencia que tiene aproximadamente, de como mucho o de al menos un 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad (o cualquier intervalo derivable en los mismos) de la SEQ ID NO: 8 o 10-12 o un fragmento de las mismas. Por ejemplo, el polipéptido nativo puede comprender al menos o hasta aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 415 restos (o cualquier intervalo derivable en los mismos) de la secuencia de la SEQ ID NO: 8 o 10-12.

En algunas realizaciones, la quinureninasa nativa puede modificarse por una o más modificaciones diferentes, tales como modificaciones químicas, sustituciones, inserciones, eliminaciones y/o truncamientos. Por ejemplo, las modificaciones pueden ser en un sitio de reconocimiento de sustrato de la enzima nativa. En una realización particular, la quinureninasa nativa puede modificarse por sustituciones. Por ejemplo, el número de sustituciones puede ser una, dos, tres, cuatro o más. En realizaciones adicionales, la quinureninasa nativa puede modificarse en el sitio de reconocimiento de sustrato o cualquier ubicación que pueda afectar a la especificidad de sustrato.

En una realización, está comprendida una quinureninasa humana modificada y aislada, en la que la enzima modificada tiene al menos una sustitución respecto a una quinureninasa humana nativa (véase la SEQ ID NO: 8) y en la que la al menos una sustitución incluye una sustitución de Met o Leu por una Phe normalmente encontrada en la posición 306 de quinureninasa humana nativa. Por tanto, en un aspecto, se proporciona una enzima quinureninasa humana modificada y aislada que comprende una sustitución Phe306Met. En otro aspecto, se proporciona una enzima quinureninasa humana modificada y aislada que comprende una sustitución Phe306Leu.

En algunos aspectos, la presente invención también contempla polipéptidos que comprende una quinureninasa unida a una secuencia de aminoácidos heteróloga. Por ejemplo, la quinureninasa puede unirse a la secuencia de aminoácidos heteróloga como una proteína de fusión. En una realización particular, la quinureninasa puede unirse a secuencias de aminoácidos, tales como un Fc de IgG, albúmina, una proteína de unión a albúmina o un polipéptido XTEN para aumentar la semivida in vivo.

Para la estabilidad en suero, la quinureninasa puede unirse a una o más moléculas de poliéter. En una realización particular, el poliéter puede ser polietilenglicol (PEG). El polipéptido puede unirse (por ejemplo, covalentemente) a PEG mediante resto de aminoácidos específicos, tales como lisina o cisteína. Para la administración terapéutica, dicho polipéptido que comprende la quinureninasa puede dispersarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunos aspectos, un ácido nucleico que codifica dicha quinureninasa está comprendido en la composición de la presente invención. En algunas realizaciones, el ácido nucleico tiene los codones optimizados para su expresión en bacterias. En realizaciones particulares, la bacteria es E. coli. En otros aspectos, el ácido nucleico tiene los codones optimizados para su expresión en hongos (por ejemplo, levaduras), insectos o mamíferos. La presente invención contempla además vectores, tales como vectores de expresión, que contienen dichos ácidos nucleicos. En realizaciones particulares, el ácido nucleico que codifica la quinureninasa está unido de forma funcional a un promotor, incluyendo aunque sin limitación, promotores heterólogos. En una realización, una quinureninasa puede suministrarse a una célula diana mediante un vector (por ejemplo, un vector de genoterapia). Dichos virus pueden haberse modificado por tecnología de ADN recombinante para posibilitar la expresión del ácido nucleico que codifica quinureninasa en la célula diana. Estos vectores pueden obtenerse de vectores de origen no vírico (por ejemplo, plásmidos) o vírico (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus, lentivirus, herpesvirus o virus vaccinia). Los vectores no víricos preferiblemente están en complejo con agentes para facilitar la entrada del ADN a través de la membrana celular. Los ejemplos de dichos complejos de vector no vírico incluyen la formulación con agentes policatiónicos que facilitan la condensación del ADN y sistemas de suministro basados en lípidos. Un ejemplo de un sistema de suministro basado en lípidos incluiría el suministro basado en liposomas de ácidos nucleicos.

En otros aspectos más, células hospedadoras que comprenden dichos vectores están comprendidas en la composición de la presente invención. Las células hospedadoras pueden ser bacterias (por ejemplo, E. coli, células fúngicas (por ejemplo, levaduras), células de insecto o células de mamífero.

En algunas realizaciones, los vectores se introducen en células hospedadoras para expresar la quinureninasa. Las proteínas pueden expresarse de cualquier manera adecuada. En una realización, las proteínas se expresan en una célula hospedadora de modo que la proteína se glucosile. En otra realización, las proteínas se expresan en una célula hospedadora de modo que la proteína se aglucosile.

La presente invención contempla la composición de la presente invención para su uso en métodos de tratamiento mediante la administración del péptido quinureninasa, el ácido nucleico que codifica la quinureninasa en un vector de genoterapia, o la formulación de la presente invención, o para tratar células tumorales o sujetos con cáncer. El sujeto puede ser cualquier animal, tal como un ratón. Por ejemplo, el sujeto puede ser un mamífero, particularmente un primate, y más particularmente un paciente humano. En algunas realizaciones, el método puede comprender seleccionar un paciente con cáncer.

En algunas realizaciones, el cáncer es cualquier cáncer que sea sensible a reducción de quinurenina. En una realización, la presente invención contempla un método de tratamiento de una célula tumoral o un paciente con cáncer, que comprende administrar una formulación que comprende dicho polipéptido. En algunas realizaciones, la administración se produce en condiciones de modo que al menos una parte de las células del cáncer se eliminan. En otra realización, la formulación comprende dicha quinureninasa con actividad degradante de quinurenina en condiciones fisiológicas y que comprende además una cadena de polietilenglicol unida. En alguna realización, la formulación es una formulación farmacéutica que comprende cualquiera de las quinureninasas analizadas anteriormente y excipientes farmacéuticamente aceptables. Dichos excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos para los expertos en la materia. Todas las quinureninasas anteriores pueden contemplarse como útiles para tratamiento de seres humanos.

En una realización adicional, el método de tratamiento de una célula tumoral puede comprender la administración de una formulación que comprende una quinureninasa no bacteriana (de mamífero, por ejemplo, de primate o ratón) que tiene actividad degradante de quinurenina o un ácido nucleico que codifica la misma.

La administración o tratamiento puede estar dirigido a la fuente de nutrientes de las células, y no necesariamente a las propias células. Por lo tanto, en una aplicación in vivo, el tratamiento de una célula tumoral incluye poner en contacto el medio nutriente para una población de células tumorales con la quinureninasa. En esta realización, el medio puede ser sangre, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo y líquidos corporales similares donde se desea la reducción de quinurenina.

De acuerdo con determinados aspecto de la presente invención, dicha formulación que contiene la quinureninasa puede administrarse por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostática, intrapleural, intrasinovial, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, intratumoral, intramuscular, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, a la mucosa, intrapericárdica, intraumbilical, intraocular, oral, tópica, por inhalación, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas) o por otro método o cualquier combinación de los anteriores como sabría un experto en la materia.

En una realización adicional, el método también puede comprender la administración de al menos un segundo tratamiento antineoplásico al sujeto. El segundo tratamiento antineoplásico puede ser un tratamiento quirúrgico, quimioterapia, radioterapia, crioterapia, terapia hormonal, inmunoterapia o tratamiento con citocinas. En determinados aspectos, el segundo tratamiento antineoplásico puede ser un anticuerpo anti-PD-1, anti-CTLA-4 o anti-PD-L1.

En alguna realización, se contempla una célula que comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR) y una enzima quinureninasa para su uso en el tratamiento de un sujeto con cáncer. En algunos aspectos, la célula puede transfectarse con un ADN que codifica el CAR y la quinureninasa y, en algunos casos, una transposasa.

El CAR puede estar dirigido a cualquier antígeno de célula cancerosa de interés, incluyendo, por ejemplo, HER2, CD19, CD20 y GD2. Las regiones o dominio de unión a antígeno pueden comprender un fragmento de las cadenas V^h y V^l de un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal humano particular, tal como los descritos en la patente de Estados Unidos 7.109.304. El fragmento puede ser innumerables dominios de unión a antígeno diferentes de un anticuerpo humano específico de antígeno. En una realización más específica, el fragmento es un scFv específico de antígeno codificado por una secuencia que está optimizada para el uso de codones humanos para su expresión en células humanas. Para ejemplos adicionales de CAR, véase, por ejemplo, el documento WO 2012/031744, el documento WO 2012/079000, el documento WO 2013/059593 y la patente de Estados Unidos 8.465.743.

La quinureninasa puede ser cualquier quinureninasa divulgada en este documento. Los métodos de transfección de células son bien conocidos en la técnica, pero en determinados aspectos, se emplean métodos de transfección altamente eficaces tales como electroporación. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden introducirse en células usando un aparato de nucleofección. Preferiblemente, la etapa de transfección no implica infectar o transducir las células con virus, que puede causar genotoxicidad y/o dar lugar a una respuesta inmunitaria contra las células que contienen las secuencias víricas en un sujeto tratado.

Se conoce una amplia gama de construcciones de CAR y vectores de expresión para las mismas en la técnica y se detallan adicionalmente en este documento. Por ejemplo, en algunos aspectos, el vector de expresión de CAR es un vector de expresión de ADN tal como un plásmido, vector de expresión lineal o un episoma. En algunos aspectos, el vector comprende secuencias adicionales, tales como secuencias que facilitan la expresión del CAR, tal como un promotor, potenciador, señal de poli-A y/o uno o más intrones. En aspectos preferidos, la secuencia codificante de CAR está flanqueada por secuencias de transposón, de modo que la presencia de una transposasa permite que la secuencia codificante se integre en el genoma de la célula transfectada.

En determinados aspectos, las células se transfectan además con una transposasa que facilita la integración de una secuencia codificante de CAR en el genoma de las células transfectadas. En algunos aspectos, la transposasa se proporciona como vector de expresión de ADN. Sin embargo, en aspectos preferidos, la transposasa se proporciona como un ARN expresable o una proteína, de modo que no se produzca expresión a largo plazo de la transposasa en las células transgénicas. Puede usarse cualquier sistema de transposasa de acuerdo con las realizaciones. En otros aspectos, Las células pueden infectarse con un lentivirus para facilitar la integración de la secuencia codificante de CAR y la secuencia codificante de quinureninasa en el genoma de la célula.

En la presente invención, se proporciona una composición que comprende una quinureninasa o un ácido nucleico que codifica una quinureninasa para su uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto. Dicha quinureninasa puede ser cualquier quinureninasa de las realizaciones.

Pueden emplearse realizaciones analizadas en el contexto de métodos y/o composiciones de la invención con respecto a cualquier otro método o composición descrito en este documento. Por tanto, una realización que se refiere a un método o composición puede aplicarse a otros métodos y composiciones de la invención también.

Como se usa en este documento, los términos "codificar" o "codificante", con referencia a un ácido nucleico, se usan para hacer que la invención sea fácilmente comprensible para los expertos en la materia; sin embargo, estos términos pueden usarse indistintamente con "comprender" o "comprendiendo", respectivamente.

Como se usa en la memoria descriptiva de este documento, "un" o "uno/a" puede significar uno/a o más. Como se usa en este documento, en la reivindicación o reivindicaciones, cuando se usa junto con la palabra "comprendiendo", las palabras "un" o "uno/a" puede significar uno/a o más de uno/a.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para indicar "y/o" salvo que se indique explícitamente que se hace referencia a alternativas únicamente o las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación mantiene una definición que se refiere a únicamente alternativas e "y/o". Como se usa en este documento, "otro" puede indicar al menos un segundo o más.

Durante toda esta solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, empleándose el método para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos del estudio.

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención llegarán a ser evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se dan a modo de ilustración únicamente.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención se puede entender mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en este documento.

FIG. 1 - SDS-PAGE del (carril 1) patrón de PM PRECISION PLUS PROTEIN™ (BioRad) (carriles 2-4) concentraciones crecientes de PPKYNU y (carril 5) PPKYNU modificado con PEG de 5000 de PM.

FIG. 2 - Estabilidad de P/-KYNU en (cuadrado vacío) PBS y (círculo vacío) suero humano combinado.

FIG. 3 - Eficacia de PEG-PPKYNU en un modelo de melanoma de ratón B16 autólogo medida por tasas de crecimiento tumoral. (Cuadrado relleno) PEG-PPKYNU inactivada por calor. (Círculo relleno) PEG-PPKYNU activa.

FIG. 4 - Eficacia de PEG-PPKYNU en un modelo de melanoma de ratón B16 autólogo medida por supervivencia. (Cuadrado relleno) PEG-PPKYNU inactivada por calor. (Círculo relleno) PEG-PPKYNU activa.

FIG. 5A-B - Ratones tratados con PEG-PPKYNU inactivada por calor. (•) Ratones tratados con PEG-PPKYNU activa. FIG. 5A - La población de linfocitos T reguladores CD4+ en circulación es significativamente más pequeña en el grupo tratado con PEG-PPKYNU activa. FIG. 5B - La población de linfocitos T CD8+ de infiltración tumoral muestra expresión significativamente mayor de granzima B e interferón y.

FIG. 6 - Selección genética de la actividad quinureninasa en E. coli. Células de E. coli-AtpE sembradas en placas de medio mínimo M9 con discos de papel de filtro en L-Trp (Trp), tampón (-), ácido antranílico (AA) o L-Kyn (Kyn).

FIG. 7 - Estabilidad in vitro de quinureninasa de Mucilaginibacter paludis (Mu-KYNU). Actividad como una función del tiempo de Mu-KYNU (cuadrado vacío) en PBS a 37 °C con una 1T i ^/2 = 6 h con una amplitud de un 74 % de actividad restante y una posterior 2Ti ^/2 = 150 h y (círculo relleno) en suero humano combinado a 37 °C con una 1T i ^/2 = 5 h con una amplitud de un 30 % de actividad restante y una posterior 2T i ^/2 = 73 h.

FIG. 8 - Diagrama de Kaplan-Meier de aloinjertos B16 en ratones C57BL/6J tratados con PEG-PPKYNU (--•), PEG-Pf-KYNU desactivada (-••), anti-PD1 (•••) o anti-CTLA-4 (m m ). Las flechas indican los días de tratamiento, (A) indica tratamiento con anticuerpo, (E) indica tratamiento con enzima.

FIG.9A-C - FIG. 9A - Ratones C57BL/6J que albergan aloinjertos de tumor B16 tratados con PBS (círculo) (control), anti-PDI en solitario(cuadrado), anti-PD1/PEG-Mu-KYNU (triángulo invertido) o anti-PD1/PEG-PPKYNU (triángulo bocarriba). FIG. 9B - Se observaron efectos aditivos con el tratamiento de combinación de anti-PDI/PEG-PPKYNU que elimina un 60 % de los tumores y la combinación de anti-PD1/PEG-Mu-KYNU que elimina un 20 % de los tumores en combinación con una eliminación tumoral de un 0 % con anti-PDI en solitario. FIG. 9C - Diagrama de Kaplan-Meier correspondiente.

FIG. 10A-B - FIG. 10A - Ratones C57BL/6J que albergan aloinjertos de tumor B16 tratados con PEG-Mu-KYNU inactivada por calor (■) o PEG-Mu-KYNU activa (A). FIG. 10B - Diagrama de Kaplan-Meier correspondiente que representa la mediana del tiempo de supervivencia de 25 días para PEG-Mu-KYNU (-) y la mediana del tiempo de supervivencia de 22 días para PEG-Mu-KYNU inactivada por calor (m m ) (las flechas indican los días de tratamiento).

Descripción de realizaciones ilustrativas

La quinurenina es un metabolito del aminoácido triptófano generado mediante la acción de indolamina-2,3-dioxigenasa (IDO) o triptófano-2,3-dioxigenasa (TDO). La quinurenina ejerce múltiples efectos sobre la fisiología celular, uno de los más importantes de los cuales es la modulación de las repuestas de linfocitos T. Muchas células tumorales regulan la síntesis de IDO y/o TDO elevando la concentración local de quinurenina, que viene acompañada por la reducción de triptófano. Los altos niveles de quinurenina sirven como un potente medio para inhibir la función de los linfocitos T de infiltración tumoral que de lo contrario atacarían al tumor.

La presente invención proporciona composiciones que comprenden enzimas degradantes de quinurenina como un medio para reducir los niveles de quinurenina locales en el microentorno tumoral, así como en el suero y, por tanto prevenir la supresión mediada por el tumor de la acción de los linfocitos T. Las enzimas hidrolizantes de quinurenina (quinureninasas) convierten la quinurenina en alanina y ácido antranílico, el último de los cuales no se conoce por afectar a la función de linfocitos T. Los autores de la invención generaron una preparación farmacéutica de enzima quinureninasa para posibilitar que la enzima persista durante tiempos prolongados en condiciones fisiológicas. Los autores de la invención entonces mostraron que la administración intratumoral de la enzima provoca un retardo drástico del crecimiento de un tumor agresivo en ratones.

I. Definiciones

Como se usa en este documento, los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a compuestos que comprenden aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y se usan indistintamente.

Como se usa en este documento, la expresión "proteína de fusión" se refiere a una proteína quimérica que contiene proteínas o fragmentos proteínicos unidos de forma funcional de una manera no nativa.

Como se usa en este documento, el término "semivida" (vida 1^ ) se refiere al tiempo que se requeriría para que la concentración de un polipéptido disminuyera en la mitad in vitro o in vivo, por ejemplo, después de inyección en un mamífero.

Las expresiones "en combinación funcional", "en orden funcional" y "unido de forma funcional" se refieren a una unión en la que los componentes así descritos están en una relación que les permiten funcionar de su manera pretendida, por ejemplo, una unión de secuencias de ácido nucleico de tal manera que una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de la molécula proteínica deseada, o una unión de secuencias de aminoácidos de tal manera que se produce una proteína de fusión.

Se entiende que el término "conector" se refiere a un compuesto o resto que actúa como puente molecular para unir de forma funcional dos moléculas diferentes, en el que una parte del conector está unido de forma funcional a una primera molécula y en el que otra parte del conector está unido de forma funcional a una segunda molécula.

El término "PEGilado" se refiere a la conjugación con polietilenglicol (PEG), que se ha usado ampliamente como vehículo de fármacos, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modificación. El PEG puede acoplarse (por ejemplo, unirse covalentemente) a agentes activos mediante los grupos hidroxilo al final de la cadena de PEG mediante métodos químicos; sin embargo, el propio PEG está limitado a como mucho dos agentes activos por molécula. En una estrategia diferente, se han explorado copolímeros de PEG y aminoácidos como biomaterial novedoso que retendría la biocompatibilidad de PEG, pero que tendría la ventaja añadida de numerosos puntos de adhesión por molécula (proporcionando, por tanto, mayor carga de fármaco) y que puede diseñarse sintéticamente para adecuarse a una diversidad de aplicaciones.

El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o precursor del mismo. El polipéptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier parte de la secuencia codificante para que se retenga la actividad enzimática deseada.

El término "nativo" se refiere a la forma típica de un gen, un producto génico o una característica de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente de origen natural. Una forma nativa es aquella que se observa más frecuentemente en una población natural y, por tanto, se denomina arbitrariamente la forma normal o de tipo silvestre. Por el contrario, el término "modificado", "variante" o "mutante" se refiere a un gen o producto génico que presenta modificación en la secuencia y propiedades funcionales (es decir, características alteradas) en comparación con el gen nativo o producto génico.

El término "vector" se usa para hacer referencia a una molécula de ácido nucleico transportadora en que puede insertarse una secuencia de ácidos nucleico para su introducción en una célula donde puede replicarse. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo que significa que es foránea a la célula en la que se está introduciendo el vector o que la secuencia es homologa a una secuencia de la célula, pero está una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedadora en que no se encuentra habitualmente la secuencia. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus de animales y virus de plantas) y cromosomas artificiales (por ejemplo YAC). Un experto en la materia estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes convencionales (véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1988 y Ausubel et al., 1994).

La expresión "vector de expresión" se refiere a cualquier tipo de construcción genética que comprende un ácido nucleico que codifica un ARN que puede transcribirse. En algunos casos, las moléculas de ARN después se traducen en una proteína, polipéptido o péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas de antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una diversidad de "secuencias de control", que se refieren a secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificante unida de forma funcional en una célula hospedadora particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que cumplen otras funciones también y se describen infra.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad de células y/o composición terapéutica (tal como un polinucleótido terapéutico y/o polipéptido terapéutico) que se emplea en métodos para conseguir un efecto terapéutico. La expresión "beneficio terapéutico" o "terapéuticamente eficaz", como se usa durante toda esta solicitud se refiere a cualquier cosa que promueve o potencia el bienestar del sujeto con respecto al tratamiento médico de esta afección. Esto incluye, aunque sin limitación, una reducción en la frecuencia o gravedad de los signos o síntomas de una enfermedad. Por ejemplo, el tratamiento del cáncer puede implicar, por ejemplo, una reducción en el tamaño de un tumor, una reducción en la capacidad de invasión de un tumor, reducción en la tasa de crecimiento del cáncer o prevención de la metástasis. El tratamiento del cáncer también puede referirse a prolongar la supervivencia de un sujeto con cáncer.

El término "K^m", como se usa en este documento, se refiere a la constante de Michaelis-Menten para una enzima y se define como la concentración del sustrato específico a la que una enzima dada produce la mitad de su velocidad máxima en una reacción catalizada por enzima. El término "fcat", como se usa en este documento, se refiere al número de recambio o el número de moléculas de sustrato que cada sitio enzimático convierte en producto por unidad de tiempo, y en que la enzima está funcionando a eficacia máxima. El término "kcat/KM", como se usa en este documento, es la constante de especificidad, que es una medida de la eficacia con que una enzima convierte un sustrato en producto.

La expresión "receptores de antígeno quiméricos (CAR)", como se usa en este documento, puede referirse a receptores de linfocitos T artificiales, receptores de linfocito T quiméricos o inmunorreceptores quiméricos, por ejemplo, y abarcan receptores genomanipulados que injertan una especificidad artificial en una célula efectora inmunitaria particular. Los CAR pueden emplearse para conferir la especificidad de un anticuerpo monoclonal a un linfocito T, permitiendo de ese modo que se genere una gran cantidad de linfocitos T específicos, por ejemplo, para su uso en tratamiento celular adoptivo. En realizaciones específicas, los CAR dirigen la especificidad de la célula a un antígeno asociado a tumor, por ejemplo. En algunas realizaciones, los CAR comprenden un dominio de activación intracelular, un dominio transmembranario y un dominio extracelular que comprende una región de unión a antígeno asociado a tumor. En aspectos particulares, los CAR comprenden fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales (tales los descritos en la patente de estaos unidos 7.109.304), fusionados a dominios transmembranarios CD3-zeta y endodominios. La especificidad de otros diseños de CAR puede obtenerse de ligandos de receptores (por ejemplo, péptidos) o de receptores de reconocimiento de patrones, tales como dectinas. En realizaciones particulares, se pueden abordar linfocitos B malignos redirigiendo la especificidad de los linfocitos T usando un CAR específico para la molécula de linaje B, CD19. En determinados casos, el espaciado del dominio de reconocimiento de antígeno puede modificarse para reducir la muerte celular inducida por activación. En determinados casos, los CAR comprenden dominios para señalización coestimuladora adicional, tal como CD3-zeta, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 y/u OX40. En algunos casos, pueden coexpresarse moléculas con el CAR, incluyendo moléculas coestimuladoras, genes indicadores para imágenes (por ejemplo, para tomografía de emisión de positrones), productos génicos que destruyen de forma condicionada los linfocitos T tras la adición de un profármaco, receptores de migración dirigida, quimiocinas, receptores de quimiocinas, citocinas y receptores de citocinas.

"Tratamiento" y "tratar" se refieren a la administración o aplicación de un agente terapéutico a un sujeto o la realización de un procedimiento o modalidad en un sujeto con el fin de obtener un beneficio terapéutico de una enfermedad o afección relacionada con la salud. Por ejemplo, un tratamiento puede incluir la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una quinureninasa.

"Sujeto" y "paciente" se refieren a un ser humano o un animal no humano, tal como primates, mamíferos y vertebrados. En realizaciones particulares, el sujeto es un ser humano.

II. Polipéptidos de quinureninasa

Algunas quinureninasas se refieren a proteínas y polipéptidos modificados. Realizaciones particulares se refieren a una proteína o polipéptido modificado que muestra al menos una actividad funcional que es comparable a la versión no modificada, preferentemente, la actividad degradante quinurenina o la actividad degradante de 3'-hidroxiquinurenina. En aspectos adicionales, la proteína o polipéptido puede modificarse adicionalmente para aumentar la estabilidad en suero. Por tanto, cuando la presente solicitud se refiere a la función o actividad de "proteína modificada" o un "polipéptido modificado", un experto en la materia entendería que esto incluye, por ejemplo, una proteína o polipéptido que posee una ventaja adicional sobre la proteína o polipéptido no modificado, tal como actividad degradante de quinurenina o actividad degradante de 3'-hidroxi-quinurenina. En determinadas realizaciones, la proteína o polipéptido no modificado es una quinureninasa nativa, preferiblemente una quinureninasa humana o la quinureninasa de Pseudomonas fluorescens. Se contempla específicamente que pueden implementarse realizaciones que se refieren a una "proteína modificada" con respecto a un "polipéptido modificado" y viceversa.

La determinación de la actividad puede conseguirse usando ensayos conocidos para los expertos en la materia, particularmente con respecto a la actividad de la proteína, y pueden incluir, para fines de comparación, el uso de versiones nativas y/o recombinantes de la proteína o polipéptido modificado o sin modificar.

En determinadas realizaciones, un polipéptido modificado, tal como una quinureninasa modificada, puede identificarse basándose en su aumento en la actividad degradante de quinurenina y/o 3'-hidroxi-quinurenina. Por ejemplo, pueden reconocerse sitios de reconocimiento de sustrato del polipéptido no modificado. Esta identificación puede basarse en el análisis estructural o análisis de homología. Puede generarse una población de mutantes que implican modificaciones de dichos sitios de reconocimiento de sustrato. En una realización adicional, pueden seleccionarse mutantes con actividad degradante de quinurenina aumentada de la población mutante. La selección de mutantes deseados puede incluir métodos, tales como detección de subproductos o productos de la degradación de quinurenina.

Las proteínas modificadas pueden poseer eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos; por tanto, una proteína con una eliminación, una proteína con una sustitución, y una proteína con una eliminación y una sustitución son proteína modificadas. En algunas realizaciones, estas proteínas modificadas pueden incluir además inserciones o aminoácidos añadidos, tales como con proteínas de fusión o proteínas con conectores, por ejemplo. Una "proteína con eliminación modificada" carece de uno o más restos de la proteína nativa, pero puede poseer la especificidad y/o actividad de la proteína nativa. Una "proteína con eliminación modificada" también puede tener inmunogenicidad o antigenicidad reducida. Un ejemplo de una proteína con eliminación modificada es una que tiene un resto de aminoácido eliminado de al menos una región antigénica, es decir, una región de la proteína que se ha determinado que es antigénica en un organismo particular, tal como el tipo de organismo al que puede administrarse la proteína modificada.

Las variantes de sustitución o remplazo típicamente contienen el intercambio de un aminoácido por otro en uno o más sitios dentro de la proteína y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido, particularmente sus funciones efectoras y/o biodisponibilidad. Las sustituciones pueden ser conservativas o no, es decir, un aminoácido se remplaza con uno de forma y carga similares. Las sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cisteína a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptófano a tirosina; tirosina a triptófano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina.

Además de una deleción o sustitución, una proteína modificada puede poseer una inserción de restos, que típicamente implica la adición de al menos un resto en el polipéptido. Esto puede incluir la inserción de un péptido o polipéptido de dirección o simplemente un único resto. Las adiciones terminales, llamadas proteínas de fusión, se analizan a continuación.

La expresión "equivalente biológicamente funcional" está bien comprendida en la técnica y se define adicionalmente en detalle en este documento. Por consiguiente, secuencias que tienen entre aproximadamente un 70 % y aproximadamente un 80 %, o entre aproximadamente un 81 % y aproximadamente un 90 %, o incluso entre aproximadamente un 91 % y aproximadamente un 99 % de aminoácidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de un polipéptido de control se incluyen, con la condición de que se mantenga la actividad biológica de la proteína. Una proteína modificada puede ser biológicamente equivalente funcionalmente a su equivalente nativo en determinados aspectos.

También se entenderá que secuencias de aminoácidos y ácido nucleico pueden incluir restos adicionales, tales como aminoácidos adicionales de extremo N o C o secuencias 5' o 3', y aún ser esencialmente como se expone en una de las secuencias divulgadas en este documento, siempre que la secuencia cumpla los criterios expuestos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad proteínica biológica, donde se ve afectada la expresión de la proteína. La adición de secuencias terminales se aplica particularmente a secuencias de ácido nucleico que pueden, por ejemplo, incluir diversas secuencias no codificantes que flanquean las partes 5' o 3' de la región codificante o pueden incluir diversas secuencias internas, es decir, intrones, que se sabe que se producen dentro de los genes.

III. Degradación enzimática de quinurenina para tratamiento

Los polipéptidos se usan para el tratamiento de cánceres que son sensibles a la reducción de quinurenina, con enzimas que reducen la quinurenina, para evitar los efectos tolerogénicos mediados por el tumor y en su lugar median respuestas proinflamatorias de ablación tumoral. En determinados aspectos, se contemplan quinureninasas para su uso en el tratamiento de tumores que expresan IDO1, IDO2 y/o TDO.

Determinados aspectos de la presente invención proporcionan una quinureninasa modificada para el tratamiento de enfermedades, tales como tumores. Particularmente, el polipéptido modificado puede tener secuencias polipeptídicas humanas y, por tanto, puede prevenir reacciones alérgicas en pacientes humanos, permitir la dosificación repetida y aumentar la eficacia terapéutica.

Los tumores para los que son útiles los presente métodos de tratamiento incluyen cualquier tipo celular maligno, tal como los encontrados en un tumor sólido o un tumor hemático. Los tumores sólidos ejemplares pueden incluir, aunque sin limitación, un tumor de un órgano seleccionado del grupo que consiste en páncreas, colon, ciego, estómago, cerebro, cabeza, cuello, ovario, riñón, laringe, sarcoma, pulmón, vejiga, melanoma, próstata y mana. Los tumores hemáticos ejemplares incluyen tumores de la médula ósea, neoplasias de linfocitos T o B, leucemias, linfomas, blastomas, mielomas y similares. Ejemplos adicionales de cánceres que pueden tratarse usando los métodos proporcionados en este documento incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, leucemia, cáncer escamocelular, cáncer broncopulmonar (incluyendo cáncer broncopulmonar microcítico, cáncer broncopulmonar no microcítico, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer del estroma gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervicouterino, cáncer de ovario, cáncer hepático, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de propagación superficial, melanoma maligno lentigo, melanoma lentiginoso acral, melanomas nodulares, así como linfoma de linfocitos B (incluyendo linfoma no hodgkiniano (NHL) de grado bajo/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de células no escindidas pequeño de grado alto; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia de células capilares, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda (AML) y leucemia mieloblástica crónica.

El cáncer puede ser específicamente del siguiente tipo histológico, aunque no se limita a estos: neoplasia, maligna; carcinoma; carcinoma, indiferenciado; carcinoma de gigantocitos y células fusiformes; carcinoma de células pequeñas; carcinoma papilar; carcinoma escamocelular; carcinoma linfoepitelial; carcinoma basocelular; carcinoma de pilomatriz; carcinoma de células de transición; carcinoma papilar de células de transición; adenocarcinoma; gastrinoma, maligno; colangiocarcinoma; carcinoma hepatocelular; carcinoma hepatocelular combinado y colangiocarcinoma; adenocarcinoma trabecular; carcinoma quístico adenoide; adenocarcinoma en pólipo adenomatoso; adenocarcinoma, poliposis familiar coli; carcinoma sólido; tumor carcinoide, maligno; adenocarcinoma bronquiolo-alveolar; adenocarcinoma papilar; carcinoma cromófobo; carcinoma acidófilo; adenocarcinoma oxífilo; carcinoma basófilo; adenocarcinoma de células claras; carcinoma de células granulares; adenocarcinoma folicular; adenocarcinoma papilar y folicular; carcinoma esclerosante no encapsulante; carcinoma de la corteza suprarrenal; carcinoma endometrioide; carcinoma de apéndices cutáneos; adenocarcinoma apocrino; adenocarcinoma sebáceo; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma mucoepidermoide; cistadenocarcinoma; cistadenocarcinoma papilar; cistadenocarcinoma seroso papilar; cistadenocarcinoma mucinoso; adenocarcinoma mucinoso; carcinoma de células en anillo de sello; carcinoma canalicular infiltrante; carcinoma medular; carcinoma lobular; carcinoma inflamatorio; enfermedad de Paget, de mama; carcinoma de células acinares; carcinoma adenoescamoso; adenocarcinoma con metaplasia escamosa; timoma, maligno; tumor del estroma de ovario, maligno; tecoma, maligno; tumor de células de la granulosa, maligno; androblastoma, maligno; carcinoma de células de sertoli; tumor de células de Leydig, maligno; tumor de células lipídicas, maligno; paraganglioma, maligno; paraganglioma extramamario, maligno; feocromocitoma; glomangiosarcoma; melanoma maligno; melanoma amelanótico; melanoma de propagación superficial; melanoma maligno en nevo pigmentado gigante; melanoma de células epitelioides; nevo azul, maligno; sarcoma; fibrosarcoma; histiocitoma fibroso, maligno; mixosarcoma; liposarcoma; leiomiosarcoma; rabdomiosarcoma; rabdomiosarcoma embrionario; rabdomiosarcoma alveolar; sarcoma estromal; tumor mixto, maligno; tumor mixto muleriano; nefroblastoma; hepatoblastoma; carcinosarcoma; mesenquimoma, maligno; tumor de Brenner, maligno; tumor filoides, maligno; sarcoma sinovial; mesotelioma, maligno; disgerminoma; carcinoma embrionario; teratoma, maligno; bocio ovárico, maligno; coriocarcinoma; mesonefroma, maligno; hemangiosarcoma; hemangioendotelioma, maligno; sarcoma de Kaposi; hemangiopericitoma, maligno; linfangiosarcoma; osteosarcoma; osteosarcoma yuxtacortical; condrosarcoma; condroblastoma, maligno; condrosarcoma mesenquimatoso; tumor de gigantocitos de hueso; sarcoma de Ewing; tumor odontogénico, maligno; odontosarcoma ameloblástico; ameloblastoma, maligno; fibrosarcoma ameloblástico; pinealoma, maligno; cordoma; glioma, maligno; ependimoma; astrocitoma; astrocitoma protoplásmico; astrocitoma fibrilar; astroblastoma; glioblastoma; oligodendroglioma; oligodendroblastoma; neuroectodermo primitivo; sarcoma cerebelar; ganglioneuroblastoma; neuroblastoma; retinoblastoma; tumor neurogénico olfativo; meningioma, maligno; neurofibrosarcoma; neurilemoma, maligno; tumor de células granulares, maligno; linfoma maligno; enfermedad de Hodgkin; Hodgkin; paragranuloma; linfoma maligno, linfocítico pequeño; linterna maligno, de células grandes, difuso; linfoma maligno, folicular; micosis fungoides; otros linternas no hodgkinianos especificados; histiocitosis maligna; mieloma múltiple; sarcoma de mastocitos; enfermedad inmunoproliferativa del intestino delgado; leucemia; leucemia linfoide; leucemia de células plasmáticas; eritroleucemia; leucemia de células de linfosarcoma; leucemia mieloide; leucemia basófila; leucemia eosinófila; leucemia monocítica; leucemia de mastocitos; leucemia megacarioblástica; sarcoma mieloide; y leucemia de células capilares.

La quinureninasa puede usarse en este documento como un agente antitumoral en una diversidad de modalidades para reducir la quinurenina y/o 3'-hidroxi-quinurenina del tejido tumoral, o la circulación de un mamífero con cáncer, o para la reducción de quinurenina donde se considera deseable su reducción.

La reducción puede realizarse in vivo en la circulación de un mamífero, in vitro en casos donde se desea la reducción de quinurenina y 3'-hidroxi-quinurenina en cultivo tisular u otros medios biológicos, y en procedimientos ex vivo donde se manipulan líquidos biológicos, células o tejidos fuera del organismo y posteriormente se devuelven al organismo del mamífero paciente. La reducción de quinurenina de la circulación, medio de cultivo, líquidos biológicos o células se realiza para reducir la cantidad de quinurenina accesible al material que se está tratando y, por lo tanto, comprende poner en contacto el material a reducir con una cantidad reductora de quinurenina de la quinureninasa en condiciones reductoras de quinurenina para degradar la quinurenina ambiental en el material que se pone en contacto.

La reducción puede estar dirigida a la fuente de nutrientes de las células, y no necesariamente a las propias células. Por lo tanto, en una aplicación in vivo, el tratamiento de una célula tumoral incluye poner en contacto el medio nutriente para una población de células tumorales con la quinureninasa. En esta realización, el medio puede ser sangre, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo y líquidos corporales similares donde se desea la reducción de quinurenina.

La eficacia de reducción de quinurenina y 3'-hidroxi-quinurenina puede variar ampliamente dependiendo de la aplicación, y típicamente depende de la cantidad de quinurenina presente en el material, la tasa deseada de reducción y la tolerancia del material para exposición a quinureninasa. Los niveles de quinurenina y metabolito de quinurenina en un material y, por lo tanto, las tasas de reducción de quinurenina y metabolito de quinurenina del material, pueden controlarse fácilmente por una diversidad de métodos químicos y bioquímicos bien conocidos en la técnica. Las cantidades de reducción de quinurenina ejemplares se describen adicionalmente en este documento y pueden variar de 0,001 a 100 unidades (U) de quinureninasa, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 10 U, y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 5 U de quinureninasa por mililitro (ml) de material a tratar. Las dosificaciones típicas pueden administrarse basándose en el peso corporal, y están en el intervalo de 5­ 1000 U/kilogramo (kg)/día, preferiblemente aproximadamente 5-100 U/kg/día, más preferiblemente aproximadamente 10-50 U/kg/día y más preferiblemente aproximadamente 20-40 U/kg/día,.

Las condiciones de reducción de quinurenina son condiciones de tampón y temperatura compatibles con la actividad biológica de una quinureninasa, e incluyen condiciones de temperatura, salinidad y pH moderadas compatibles con la enzima, por ejemplo, condiciones fisiológicas. Las condiciones ejemplares incluyen aproximadamente 4-40 °C, fuerza iónica equivalente a aproximadamente 0,05 a 0,2 M de NaCl y un pH de aproximadamente 5 a 9, aunque se incluyen las condiciones fisiológicas.

La invención contempla el uso de una quinureninasa como un agente antitumoral y, por lo tanto, comprende poner en contacto una población de células tumorales con una cantidad terapéuticamente eficaz de quinureninasa durante un periodo de tiempo suficiente para inhibir el crecimiento de células tumorales.

En una realización, el contacto in vivo se consigue administrando, por inyección intraperitoneal intravenosa o intratumoral, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que comprende una quinureninasa de esta invención a un paciente, reduciendo de ese modo la fuente de quinurenina de las células tumorales presentes en el paciente.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de una quinureninasa es una cantidad predeterminada calculada para conseguir el efecto deseado, es decir, para reducir la quinurenina en el tejido tumoral o en la circulación de un paciente y, de ese modo, mediar una respuesta proinflamatoria de ablación tumoral. Por tanto, los intervalos de dosificación para la administración de quinureninasa de la invención son aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado en que se reducen los síntomas de la división celular y el ciclo célula del tumor. La dosificación no debe ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardíaca congestiva, efectos neurológicos y similares. En general, la dosificación variará con la edad, estado, género y grado de la enfermedad del paciente y puede determinarse por un experto en la materia. La dosificación puede ajustarse por el médico individual en caso de cualquier complicación.

La quinureninasa puede administrarse por vía parenteral por inyección o por infusión gradual a lo largo del tiempo. La quinureninasa puede administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, oral, intramuscular, subcutánea, intracavidad, transdérmica, dérmica, puede conseguirse por medios peristálticos, puede inyectarse directamente en el tejido que contiene las células tumorales o puede administrarse mediante una bomba conectada a un catéter que puede contener un biodetector potencial para quinurenina.

Las composiciones terapéuticas que contienen quinureninasa se administran convencionalmente por vía intravenosa, como por inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. La expresión "dosis unitaria" cuando se usa en referencia a una composición terapéutica se refiere a unidades físicamente concretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, es decir, excipiente o vehículo.

Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrarse depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema del sujeto de utilizar el ingrediente activo y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para administrarse dependen del criterio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosificación adecuados para aplicación sistémica se divulgan en este documento y dependen de la vía de administración. Las pautas adecuadas para administración inicial y las dosis de refuerzo también se contemplan y se tipifican por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas mediante una inyección posterior u otra administración. Se describen en este documento administraciones múltiples ejemplares y se prefieren particularmente para mantener niveles en suero y tejido continuamente altos de quinureninasa y, a la inversa, niveles en suero y tejido bajos de quinurenina. Como alternativa, se contempla infusión intravenosa continua suficiente para mantener las concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para tratamientos in vivo.

IV. Conjugados

Las composiciones de la presente invención implican quinureninasas modificadas, tales como mediante la formación de conjugados con segmentos peptídicos heterólogos o polímeros, tales como polietilenglicol. En aspectos adicionales, las quinureninasas pueden unirse a PEG para aumentar el radio hidrodinámico de la enzima y, por tanto, aumentar la persistencia en suero. En determinados aspectos, el polipéptido divulgado puede conjugarse con un agente de dirección, tal como un ligando que tiene la capacidad de unirse específicamente y de forma estable a un receptor externo o sitio de unión en una célula tumoral (publicación de patente de Estados Unidos 2009/0304666).

A. Proteínas de fusión

Determinadas realizaciones de la presente invención se refieren a proteínas de fusión. Estas moléculas pueden tener una quinureninasa nativa o modificada unida en el extremo N o C a un dominio heterólogo. Por ejemplo, las fusiones también pueden emplear secuencias líder de otro especie para permitir la expresión recombinante de una proteína en un hospedador heterólogo. Otra fusión útil incluye la adición de una marca de afinidad proteínica, tal como una marca de afinidad de seroalbúmina o seis restos de histidina, o un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítopo de anticuerpo, preferiblemente escindible, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. Las marcas de afinidad no limitantes incluyen polihistidina, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP) y glutatión S transferasa (GST).

En una realización particular, la quinureninasa puede unirse a un péptido que aumenta la semivida in vivo, tal como un polipéptido XTEN (Schellenberger et al., 2009), dominio Fc de IgG, albúmina o péptido de unión a albúmina.

Los métodos de generación de proteínas de fusión son bien conocidos para los expertos en la materia. dichas proteínas pueden producirse, por ejemplo, por síntesis de novo de la proteína de fusión completa, o por adhesión de la secuencia de ADN que codifica el dominio heterólogo, seguida de la expresión de la proteína de fusión intacta.

La producción de proteínas de fusión que recuperan las actividades funcionales de las proteínas precursoras puede facilitarse conectando genes con un segmento de ADN de puente que codifica un conector peptídico que sufre corte y empalme entre los polipéptidos conectados en tándem. El conector sería de longitud suficiente para permitir el plegamiento apropiado de la proteína de fusión resultante.

B. Conectores

En determinadas realizaciones, la quinureninasa puede conjugarse químicamente usando reactivos de reticulación bifuncionales o fusionarse a nivel de proteína con conectores peptídicos.

Los reactivos de reticulación bifuncionales se han usado ampliamente para una diversidad de fines, incluyendo la preparación de matrices de afinidad, la modificación y estabilización de diversas estructuras, la identificación de sitios de unión a ligando y receptor y estudios estructurales. Los conectores peptídicos adecuados también pueden usarse para unir la quinureninasa, tal como conectores de Gly-Ser.

Los reactivos homobifuncionales que portan dos grupos funcionales idénticos demostraron ser altamente eficaces en la inducción de reticulación entre macromoléculas idénticas y diferentes o subunidades de una macromolécula, y la unión de ligandos polipeptídicos a sus sitios de unión específicos. Los reactivos heterobifuncionales contienen dos grupos funcionales diferentes. Aprovechando las reactividades diferenciales de los dos grupos funcionales diferentes, la reticulación puede controlarse tanto de forma selectiva como de forma secuencial. Los reactivos de reticulación bifuncionales pueden dividirse de acuerdo con la especificidad de sus grupos funcionales, por ejemplo, grupos específicos de amino, sulfidrilo, guanidino, indol, carboxilo. De estos, los reactivos dirigidos a grupos amino libres han llegado a ser especialmente populares a causa de su disponibilidad comercial, facilidad de síntesis y las condiciónes de reacción leves en que pueden aplicarse.

Una mayoría de reactivos de reticulación heterobifuncionales contienen un grupo reactivo de amina primaria y un grupo reactivo de tiol. En otro ejemplo, se describen reactivos de reticulación heterobifuncionales y métodos de uso de los reactivos de reticulación (patente de Estados Unidos n.° 5.889.155). Los reactivos de reticulación combinan un resto de hidracida nucleófilo con un resto de maleimida electrófilo, que permite el acoplamiento, en un ejemplo, de aldehidos a tioles libres. El reactivo de reticulación puede modificarse para reticular diversos grupos funcionales.

Adicionalmente, puede usarse cualquier otro agente de unión/acoplamiento y/o mecanismos conocidos para los expertos en la materia para combinar quinureninasa, tales como, por ejemplo, interacción de anticuerpo-antígeno, uniones de avidina biotina, uniones amida, uniones éster, uniones tioéster, uniones éter, uniones tioéter, uniones fosfoéster, uniones fosforamida, uniones aldehído, uniones disulfuro, interacciones iónicas e hidrófobas, anticuerpos biespecíficos y fragmentos de anticuerpo, o combinaciones de los mismos.

Se prefiere emplear un reticulante que tenga estabilidad razonable en la sangre. Se conocen numerosos tipos de conectores que contienen enlace disulfuro que pueden emplearse satisfactoriamente para conjugar agentes de dirección y terapéuticos/preventivos. Los conectores que contienen un enlace disulfuro que está estéricamente impedido pueden demostrar dar mayor estabilidad in vivo. Estos conectores, por tanto, son un grupo de agentes de unión.

Además de los reticulante impedidos, también pueden emplearse conectores no impedidos de acuerdo con ello. Otros reticulante útiles, que no se considera que contengan o generen un disulfuro protegido, incluyen SATA, SPDP y 2-iminotiolano (Wawrzynczak y Thorpe, 1987). El uso de dichos reticulantes está bien comprendido en la técnica. Otra realización implica el uso de conectores flexibles.

Una vez conjugado químicamente, el péptido generalmente se purificará para separar el conjugado de los agentes no conjugados y de otros contaminantes. Está disponible una gran cantidad de técnicas de purificación para su uso en proporcionar conjugados de un grado suficiente de pureza para hacer que sean clínicamente útiles.

Los métodos de purificación basados en la separación por tamaño, tal como filtración en gel, impregnación en gel o cromatografía de líquidos de alto rendimiento, generalmente serán los de mayor uso. También pueden usarse otras técnicas cromatográficas, tales como separación en Blue-Sepharose. Los métodos convencionales para purificar las proteínas de fusión de los cuerpos de inclusión pueden ser útiles, tales usando detergentes débiles, tales como N-lauroil-sarcosina de sodio (SLS).

C. PEGilación

En este documento, se divulgan métodos y composiciones que se refieren a la PEGilación de quinureninasa. Por ejemplo, la quinureninasa puede PEGilarse de acuerdo con los métodos divulgados en este documento.

La PEGilación es el proceso de adhesión covalente de cadenas poliméricas de polietilenglicol con otra molécula, normalmente un fármaco o proteína terapéutica. La PEGilación se consigue de forma rutinaria mediante la incubación de un derivado reactivo de PEG con la macromolécula diana. La adhesión covalente de PEG a un fármaco o proteína terapéutica puede "enmascarar" el agente del sistema inmunitario del hospedador (inmunogenicidad y antigenicidad reducidas) o aumentar el tamaño hidrodinámico (tamaño en solución) del agente, que prolonga su tiempo en circulación reduciendo la eliminación renal. La PEGilación también puede proporcionar solubilidad en agua a fármacos y proteína hidrófobas.

La primera etapa de la PEGilación es la funcionalización adecuada del polímero de PEG en uno o ambos extremos. Los PEG que se activan en cada extremo con el mismo resto reactivo se conocen como "homobifuncional", mientras que si los grupos funcionales presentes son diferentes, entonces el derivado de PEG se denomina "heterobifuncional" o "heterofuncional". Los derivados químicamente activos o activados del polímero de PEG se preparan para adherir el PEG a la molécula deseada.

La elección del grupo funcional adecuado para el derivado de PEG se basa en el tipo de grupo reactivo disponible en la molécula que se acoplará al PEG. Para proteínas, los aminoácidos reactivos típicos incluyen lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina. También puede usarse el grupo amino del extremo N y el ácido carboxílico del extremo C.

Las técnicas usadas para formar derivados de PEG de primera generación en general son hacer reaccionar el polímero de PEG con un grupo que es reactivo con grupos hidroxilo, típicamente anhídridos, cloruros ácidos, cloroformiatos y carbonatos. En la química de PEGilación de segunda generación se hacen disponibles para la conjugación grupos funcionales más eficaces, tales como aldehído, ésteres, amidas, etc.

Como las aplicaciones de la PEGilación han llegado a ser cada vez más avanzadas y sofisticadas, ha habido un aumento en la necesidad de PEG heterobifuncionales para la conjugación. Estos PEG heterobifuncionales son muy útiles en la unión de dos entidades, donde se necesita un espaciador hidrófilo, flexible y biocompatible. Los grupos finales preferidos para PEG heterobifuncionales son maleimida, vinilsulfonas, disulfuro de piridilo, amina, ácidos carboxílicos y ésteres de NHS.

Los agentes de modificación más comunes, o conectores, se basan en molécula de metoxi PEG (mPEG). Su actividad depende de la adición de un grupo modificador de proteína al extremo alcohol. En algunos casos, se usa polietilenglicol (PEG diol) como molécula precursora. El diol se modifica posteriormente en ambos extremos para generar una molécula unida a PEG hetero u homodimérica.

Las proteínas en general se PEGilan en sitios nucleófilos, tales como tioles no protonados (restos de cisteinilo) o grupos amino. Los ejemplos de reactivos de modificación especifican de cisteinilo incluyen PEG maleimida, PEG yodoacetato, PEG tioles y PEG vinilsulfona. Los cuatro son fuertemente específicos de cisteinilo en condiciones suaves y neutros a pH ligeramente alcalino, pero cada uno tiene algunos inconvenientes. El tioéter formado con las maleimidas puede ser algo inestable en condiciones alcalinas de modo que puede haber alguna limitación a las opciones de formulación con este conector. La unión de carbamotioato formada con PEG de yodo es más estable, pero el yodo libre puede modificar los restos de tirosina en algunas condiciones. Los PEG tioles forman enlaces disulfuro con tioles de proteína, pero esta unión también puede ser inestable en condiciones alcalinas. La reactividad de PEG vinilsulfona es relativamente baja en comparación con maleimida y yodo PEG; sin embargo, la unión tioéter formada es bastante estable. Su tasa de reacción más lenta puede hacer que la reacción de PEG-vinilsulfona sea más fácil de controlar.

La PEGilación específica de sitio en restos de cisteinilo nativos raramente se realiza, ya que estos restos habitualmente están en forma de enlaces disulfuro o se requieren para la actividad biológica. Por otro lado, la mutagénesis dirigida al sitio puede usarse para incorporar sitios de PEGilación de cisteinilo para conectores específicos de tiol. La mutación de cisteína debe diseñarse de modo que sea accesible para el reactivo de PEGilación y aún sea biológicamente activo después de la PEGilación.

Los agentes de modificación específicos de amina incluyen éster de NHS de PEG, tresilato de PEG, aldehído de PEG, isotiocianato de PEG y otros varios. Todos reaccionan en condiciones suaves y son muy específicos para grupos amino. El éster de NHS PEG es probablemente uno de los agentes más reactivos; sin embargo, su alta reactividad puede hacer que la reacción de PEGilación sea difícil de controlar a gran escala. El PEG aldehído forma una imina con el grupo amino, que después se reduce en una amina secundaria con cianoborohidruro de sodio. A diferencia de borohidruro de sodio, el cianoborohidruro de sodio no reducirá los enlaces disulfuro. Sin embargo, este agente químico es muy tóxico y debe manipularse cuidadosamente, particularmente a pH inferior donde llega a ver volátil.

Debido a los múltiples restos de lisina en la mayoría de las proteínas, la PEGilación específica de sitio puede ser un reto. Afortunadamente, como estos reactivos reaccionan con grupos amino no protonados, es posible dirigir la PEGilación a grupos amino de pK inferior realizando la reacción a un pH inferior. En general, el pK del grupo alfa amino es 1-2 unidades de pH inferior que el grupo épsilon amino de los restos de lisina. PEGilando la molécula a pH 7 o más bajo, frecuentemente puede obtenerse una alta selectividad para el extremo N. Sin embargo, esto es únicamente factible si la parte del extremo N de la proteína no es necesaria para la actividad biológica. Además, los beneficios farmacocinéticos de la PEGilación frecuentemente compensan una pérdida significativa de bioactividad in vitro, produciendo un producto con bioactividad in vivo mucho mayor respecto a la química de PEGilación.

Hay varios parámetros que considerar cuando se desarrolla un procedimiento de PEGilación. Afortunadamente, habitualmente no hay más de cuatro o cinco parámetros clave. La estrategia de "diseño de experimentos" para la optimización de las condiciones de PEGilación puede ser muy útil. Para reacciones de PEGilación específica de tiol, los parámetros a considerar incluyen: concentración de proteína, relación de PEG a proteína (en una base molar), temperatura, pH, tiempo de reacción y en algunos casos, la exclusión de oxígeno. (El oxígeno puede contribuir a la formación de disulfuro intermolecular por la proteína, que reducirá el rendimiento del producto PEGilado.) Los mismos factores deben considerarse (con la excepción del oxígeno) para la modificación específica de amina excepto que el pH puede ser incluso más crítico, particularmente cuando se aborda el grupo amino del extremo N.

Para ambas modificaciones específicas de amina y tiol, las condiciones de reacción pueden afectar a la estabilidad de la proteína. Esto puede limitar la temperatura, la concentración de proteína y el pH. Además, la reactividad del conector p Eg debe conocerse antes de empezar la reacción de PEGilación. Por ejemplo, si el agente de PEGilación es únicamente un 70 % activo, la cantidad de PEG usada debe asegurar que se cuentan únicamente las moléculas de PEG activas en la estequiometría de la reacción de proteína a PEG.

V. Proteínas y péptidos

En determinadas realizaciones, la presente invención se refiere a composiciones novedosas que comprenden al menos una proteína o péptido, que es una quinureninasa. Estos péptidos pueden estar comprendidos en una proteína de fusión o conjugados a un agente como se describe supra.

Como se usa en este documento, una proteína o péptido en general se refiere, aunque sin limitación, a una proteína de más de aproximadamente 200 aminoácidos, hasta una secuencia de longitud completa traducida desde un gen; un polipéptido de más de aproximadamente 100 aminoácidos; y/o un péptido de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 aminoácidos. Por motivos de conveniencia, los términos "proteína", "polipéptido", y "péptido" se usan indistintamente en este documento.

Como se usa en este documento, un "resto de aminoácido" se refiere a cualquier aminoácido de origen natural, cualquier derivado de aminoácido o cualquier mimético de aminoácido conocido en la técnica. En determinadas realizaciones, los restos de la proteína o péptido son secuenciales, sin ninguna entidad no aminoacídica interrumpiendo la secuencia de restos de aminoácido. En otras realizaciones, la secuencia puede comprender una o más moléculas no aminoacídicas. En realizaciones particulares, la secuencia de restos de la proteína o péptido puede estar interrumpida por uno o más restos no aminoacídicos.

Por consiguiente, la expresión "proteína o péptido" abarca secuencias de aminoácidos que comprenden al menos uno de los 20 aminoácidos comunes encontrados en las proteínas de origen natural, o al menos un aminoácido modificado o inusual.

Las proteínas o péptidos pueden generarse por cualquier técnica conocida para los expertos en la materia, incluyendo la expresión de proteínas, polipéptidos o péptidos mediante técnicas convencionales de biología molecular, el aislamiento de proteínas o péptidos de fuentes naturales o la síntesis química de proteínas o péptidos. Las secuencias de nucleótidos y proteínicas, polipeptídicas y peptídicas correspondientes a diversos genes se han divulgado previamente, y pueden encontrarse en bases de datos informatizadas conocidas para los expertos en la materia. Una de dichas bases de datos es el National Center for Biotechnology Information's Genbank y la base de datos GenPept (disponible en internet en ncbi.nlm.nih.gov/). Las regiones codificantes de genes conocidos pueden amplificarse y/o expresarse usando las técnicas divulgadas en este documento o como sabrían los expertos en la materia. Como alternativa, se conocen diversas preparaciones comerciales de proteínas, polipéptidos y péptidos por los expertos en la materia.

VI. Ácidos nucleicos y vectores

En determinados aspectos de la invención, secuencias de ácido nucleico que codifican una quinureninasa o una proteína de fusión que contiene una quinureninasa pueden estar comprendidas por la composición de la presente invención. Dependiendo del sistema de expresión que se use, pueden seleccionarse secuencias de ácido nucleico basadas en métodos convencionales. Por ejemplo, si la quinureninasa se obtiene de quinureninasa humana y contiene múltiples codones que se utilizan infrecuentemente en E. coli, entonces eso puede interferir con la expresión. Por lo tanto, los genes respectivos o variantes de los mismos pueden optimizarse para los codones para su expresión en E. coli. También pueden usarse diversos vectores para expresar la proteína de interés. Los vectores ejemplares incluyen, aunque sin limitación, vectores plasmídicos, vectores víricos, transposones o vectores basados en liposomas.

VII. Células hospedadoras

Las células hospedadoras pueden ser cualquiera que puede transformarse para permitir la expresión y secreción de quinureninasa y conjugados de la misma. Las células hospedadoras pueden ser bacterias, células de mamífero, levaduras u hongos filamentosos. Diversas bacterias incluyen Escherichia y Bacillus. Las levaduras que pertenecen a los géneros Saccharomyces, Kiuyveromyces, Hansenula, o Pichia encontrarían uso como célula hospedadora apropiada. Pueden usarse diversas especies de hongos filamentosos como hospedadores de expresión, incluyendo los siguientes géneros: Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Penicillium, Cephalosporium, Achlya, Podospora, Endothia, Mucor, Cochliobolus, y Pyricularia.

Los ejemplos de organismos hospedadores adecuados incluyen bacterias, por ejemplo, Escherichia coli MC1061, derivados de Bacillus subtilis BRB1 (Sibakov et al., 1984), Staphylococcus aureus SAI123 (Lordanescu, 1975) o Streptococcus lividans (Hopwood et al., 1985); levaduras, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae AH 22 (Mellor et al., 1983) o Schizosaccharomyces pombe; y hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus nidulans, Aspergillus awamori (Ward, 1989), o Trichoderma reesei (Penttila et al., 1987; Harkki et al., 1989).

Los ejemplos de células hospedadoras de mamífero incluyen células de ovario de hámster chino (CHO-K1; ATCC CCL61), células de pituitaria de rata (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rata (H-4-II-E; ATCCCRL 1548), células de riñón de mono trasformadas con SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650), y células embrionarias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Lo anterior es ilustrativo, aunque no limitante, de los muchos organismos hospedadores posibles conocidos en la técnica. En principio, pueden usarse todos los hospedadores con capacidad de secreción ya sean procariotas o eucariotas.

Las células hospedadoras de mamífero que expresan la quinureninasa y/o sus proteínas de fusión se cultivan en condiciones típicamente empleadas para cultivar la línea celular precursora. En general, las células se cultivan en un medio convencional que contiene sales y nutrientes fisiológicos, tales como RPMI, MEM, IMEM o DMEM convencionales, típicamente complementados con suero al 5 %-10 %, tal como suero bovino fetal. Las condiciones de cultivo también son convencionales, por ejemplo, los cultivos se incuban a 37 °C en cultivos estacionarios o de balanceo hasta que se consiguen los niveles deseados de las proteínas.

VIII. Purificación de proteínas

Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para los expertos en la materia. Estas técnicas implican, a un nivel, la homogeneización y fraccionamiento en bruto de las células, tejido u órgano en fracciones polipeptídicas y no polipeptídicas. La proteína o polipéptido de interés puede purificarse adicionalmente usando técnicas cromatográficas y electroforéticas para conseguir la purificación parcial o completa (o purificación hasta homogeneidad) salvo que se especifique lo contrario. Los métodos analíticos particularmente adecuados para la preparación de un péptido puro son cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión en gel, electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía de afinidad, cromatografía de inmunoafinidad y enfoque isoeléctrico. Un método particularmente eficaz de purificación de péptidos es cromatografía de líquidos de rápido rendimiento (FPLC) o incluso cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC).

Se pretende que una proteína o péptido purificado se refiera a una composición, aislable de otros componentes, en la que la proteína o péptido se purifica a cualquier grado respecto a su estado obtenible de forma natural. Una proteína o péptido aislado o purificado, por lo tanto, también se refiere a una proteína o péptido libre del entorno en que puede producirse de forma natural. En general, "purificado" se referirá a una composición proteínica o peptídica que se ha sometido a fraccionamiento para retirar otros diversos componentes, y cuya composición retiene sustancialmente su actividad biológica expresada. Cuando se usa la expresión "sustancialmente purificada", esta denominación se referirá a una composición en que la proteína o péptido forma el componente principal de la composición, tal como constituyendo aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95 % o más de las proteínas en la composición.

Son bien conocidas para los expertos en la materia diversas técnicas adecuadas para su uso en la purificación de proteínas. Estas incluyen, por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio, PEG, anticuerpos y similares, o mediante desnaturalización térmica, seguida por centrifugación; etapas de cromatografía, tales como cromatografía de intercambio iónico, de filtración en gel, de fase inversa, con hidroxiapatita y de afinidad; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel; y combinaciones de estas y otras técnicas. Como se sabe en general en la técnica, se cree que el orden de realización de las diversas etapas de purificación puede cambiarse, y que pueden omitirse determinadas etapas y aún dar como resultado un método adecuado para la preparación de una proteína o péptido sustancialmente purificado.

Los expertos en la materia conocen diversos métodos para cuantificar el grado de purificación de la proteína o péptido a la luz de la presente divulgación. Estos incluyen, por ejemplo, determinar la actividad específica de una fracción activa o evaluar la cantidad de polipéptidos dentro de una fracción por análisis de SDS/PAGe . Un método preferido para evaluar la pureza de una fracción es calcular la actividad específica de la fracción, compararla con la actividad específica del extracto inicial y calcular, por tanto, el grado de pureza en el mismo, evaluada por un "número de purificación factorial". Las unidades reales usadas para representar la cantidad de actividad dependerán, por supuesto, de la técnica de ensayo particular elegida para seguir la purificación, y si la proteína o péptido expresado muestra o no una actividad detectable.

No hay necesidades generales de que la proteína o péptido siempre se proporcione en su estado más purificado. De hecho, se contempla que productos sustancialmente menos purificados puedan tener utilidad en determinadas realizaciones. La purificación parcial puede conseguirse usando menos etapas de purificación en combinación, o utilizando diferentes formas del mismo esquema de purificación general. Por ejemplo, se aprecia que una cromatografía en columna de intercambio catiónico realizada utilizando un aparato de HPLC generalmente producirá una purificación "factorial" mayor que la misma técnica utilizando un sistema de cromatografía de baja presión. Los métodos que muestran un menor grado de purificación relativa pueden tener ventajas en la recuperación total del producto proteínico o en el mantenimiento de la actividad de una proteína expresada.

En determinadas realizaciones, puede aislarse o purificarse una proteína o péptido, por ejemplo, una quinureninasa, una proteína de fusión que contiene una quinureninasa o una quinureninasa modificada después de PEGilación. Por ejemplo, una marca de His o un epítopo de afinidad puede estar comprendido en dichas quinureninasa para facilitar la purificación. La cromatografía de afinidad es un procedimiento cromatográfico que depende de la afinidad específica entre una sustancia a aislar y una molécula a la que puede unirse específicamente. Este es un tipo de interacción de receptor-ligando. El material de la columna sintetiza acoplado covalentemente uno de los compañeros de unión a una matriz insoluble. El material de la columna entonces puede adsorber específicamente la sustancia de la solución. La elución se produce cambiando las condiciones a aquellas en que no se producirá la unión (por ejemplo, alteración del pH, fuerza iónica, temperatura, etc.). La matriz debe ser una sustancia que no adsorba moléculas a ningún grado significativo y que tenga una amplia gama de estabilidad química, física y térmica. El ligando debe a

manera que no afecte a sus propiedades de unión. El ligando también debe proporcionar unión relativamente estrecha. Debe ser posible eluir la sustancia sin destruir la muestra o el ligando.

La cromatografía de exclusión molecular (SEC) es un método cromatográfico en que moléculas en solución se separan basándose en su tamaño, o en términos más técnicos, su volumen hidrodinámico. Habitualmente se aplica a moléculas grandes o complejos macromoleculares, tales como proteínas y polímeros industriales. Típicamente, cuando se usa una solución acuosa para transportar la muestra a través de la columna, la técnica se conoce como cromatografía de filtración en gel, frente al nombre de cromatografía por impregnación en gel, que se usa cuando se usa un disolvente orgánico como fase móvil.

El principio subyacente de SEC es que partículas de diferentes tamaños eluirán (filtrarán) a través de una fase estacionaria a diferentes tasas. Esto provoca la separación de una solución de partículas basada en el tamaño. Con la condición de que todas las partículas se carguen simultáneamente o casi simultáneamente, las partículas del mismo tamaño deben eluir conjuntamente. Cada columna de exclusión molecular tiene un intervalo de masas moleculares que puede separar. El límite de exclusión define la masa molecular en el extremo superior de este intervalo y es donde las moléculas son demasiado grandes para quedarse atrapadas en la fase estacionaria. El límite de impregnación define la masa molecular en el extremo inferior del intervalo de separación y es donde las moléculas de un tamaño suficientemente pequeño pueden penetrar en los poros de la fase estacionaria completamente y todas las moléculas por debajo de esta masa molecular son demasiado pequeñas para eluir como una única banda.

La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (o cromatografía de líquidos de alta presión, HPLC) es una forma de cromatografía en columna usada frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar, identificar y cuantificar compuestos. La HPLC utiliza una columna que aloja un material de compactación cromatográfico (fase estacionaria), una bomba que mueve la fase o fases móviles a través de la columna y un detector que muestra los tiempos de retención de las moléculas. El tiempo de retención varía dependiendo de las interacciones entre la fase estacionaria, las moléculas que se están analizando y el disolvente o disolventes usados.

IX. Composiciones farmacéuticas

Se contempla que la quinureninasa novedosa puede administrarse de forma sistémica o local para inhibir el crecimiento de células tumorales y, muy preferiblemente, para eliminar células cancerosas en pacientes con cáncer con cánceres avanzados localmente o metastásicos. Pueden administrarse por vía intravenosa, intratecal y/o intraperitoneal. Pueden administrarse en solitario o en combinación con fármacos antiproliferativos. En una realización, se administran para reducir la carga cancerosa en el paciente antes de la cirugía u otros procedimientos. Como alternativa, pueden administrarse después de cirugía para asegurar que no sobrevivirá ningún cáncer restante (por ejemplo, cáncer que la cirugía no ha logrado eliminar).

No se pretende que la presente invención esté limitada por la naturaleza particular de la preparación terapéutica. Por ejemplo, dichas composiciones pueden proporcionarse en formulaciones junto con vehículos, diluyentes y excipientes líquidos, en gel o sólidos fisiológicamente tolerables. Estas preparaciones terapéuticas pueden administrarse a mamíferos para uso veterinario, tal como con animales domésticos, y uso clínico en seres humanos de una manera similar a otros agentes terapéuticos. En general, la dosificación requerida para la eficacia terapéutica variará dependiendo del tipo de uso y modo de administración, así como de las necesidades particulares de los sujetos individuales.

Dichas composiciones típicamente se preparan como soluciones o suspensiones líquidas, como inyectables. Son diluyentes y excipientes adecuados, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, las composiciones pueden contener cantidades mínimas de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes estabilizantes o agentes tamponantes de pH.

Cuando se contemplan aplicaciones clínicas, puede ser necesario preparar composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas, anticuerpos y fármacos en una forma apropiada para la aplicación pretendida. En general, las composiciones farmacéuticas pueden comprender una cantidad eficaz de una o más quinureninasas o agentes adicionales disueltos o dispersados en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las expresiones "farmacéutica o farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra indeseada cuando se administra a un animal, tal como, por ejemplo, un ser humano, según lo apropiado. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una quinureninasa aislada por el método divulgado en este documento, o ingrediente activo adicional será conocida para los expertos en la materia a la luz de la presente divulgación, tal como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., 1990. Además, para administración a animales (por ejemplo, seres humanos), se entenderá que las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por la FDA Office of Biological Standards.

Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, fármacos, estabilizantes de fármacos, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregación, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, tintes, así como materiales y combinaciones de los mismos, serían conocidos para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., 1990). Excepto en la medida de que cualquier vehículo convencional sea compatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas.

Determinadas realizaciones de la presente invención pueden comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se tienen que administrar en forma sólida, líquida o de aerosol, y si tiene que ser estéril para la vía de administración, tal como inyección. Las composiciones pueden administrarse por vía intravenosa, intradérmica, transdérmica, intratecal, intraarterial, intraperitoneal, intranasal, intravaginal, intrarrectal, intramuscular, subcutánea, a la mucosa, oral, tópica, local, por inhalación (por ejemplo, inhalación de aerosol), por inyección, por infusión, por infusión continua, por perfusión localizada que baña las células diana directamente, mediante un catéter, mediante un lavado, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas) o por otros métodos o cualquier combinación de los anteriores como sabrían los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.a Ed., 1990).

Los polipéptidos modificados pueden formularse en una composición en una forma de base libre, neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos, por ejemplo, las formadas con los grupos amino libres de una composición proteínica, o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden obtenerse de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico; o bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas de galénicas, tales como formuladas para administración parenteral, tales como soluciones inyectables o aerosoles para suministro a los pulmones, o formuladas para administraciones alimenticias, tales como cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Además, de acuerdo con determinados aspectos de la presente invención, la composición adecuada para administración puede proporcionarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable con o sin un diluyente inerte. El vehículo debe ser asimilable e incluye vehículos líquidos, semisólidos, es decir, pastas, o sólidos. Excepto en la medida en que cualquier medio, agente, diluyente o vehículo convencional sea perjudicial para el destinatario o la eficacia terapéutica de una composición contenida en el mismo, su uso en composición administrable para su uso en la práctica de los métodos es apropiado. Los ejemplos de vehículos o diluyentes incluyen grasas, aceites, agua, soluciones salinas, lípidos, liposomas, resinas, aglutinantes, rellenos y similares, o combinaciones de los mismos. La composición también puede comprender diversos antioxidantes para retardar la oxidación de uno o más componentes. Adicionalmente, la prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante conservantes, tales como diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, incluyendo, aunque sin limitación, parabenos (por ejemplo, metilparabenos, propilparabenos), clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal o combinaciones de los mismos.

De acuerdo con determinados aspectos de la presente invención, la composición se combina con el vehículo de cualquier manera conveniente y práctica, es decir, por solución, suspensión, emulsificación, mezcla, encapsulación, absorción y similares. Dichos procedimientos son rutinarios para los expertos en la materia.

En una realización específica de la presente invención, la composición se combina o mezcla minuciosamente con un vehículo semisólido o sólido. La mezcla puede realizarse de cualquier manera conveniente, tal como molienda. También pueden añadirse agentes estabilizantes en el proceso de mezcla para proteger la composición de la pérdida de actividad terapéutica, es decir, la desnaturalización en el estómago. Los ejemplos de estabilizantes para su uso en una composición incluyen tamponen, aminoácidos, tales como glicina y lisina, carbohidratos, tales como dextrosa, manosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, maltosa, sorbitol, manitol, etc.

En realizaciones adicionales, la presente invención puede referirse al uso de una composición de vehículo lipídico farmacéutico que incluye quinureninasas, uno o más lípidos y un disolvente acuoso. Como se usa en este documento, el término "lípido" se definirá incluyendo cualquiera de una amplia gama de sustancias que es característicamente insoluble en agua y extraíble con un disolvente orgánico. Esta amplia clase de compuestos es bien conocida para los expertos en la materia y según se usa el término "lípido" en este documento, no se limita a ninguna estructura particular. Los ejemplos incluyen compuestos que contienen hidrocarburos alifáticos de cadena larga y sus derivados. Un lípido puede ser de origen natural o sintético (es decir, diseñado o producido por el hombre). Sin embargo, un lípido es habitualmente una sustancia biológica. Los lípidos biológicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, grasas neutras, fosfolípidos, fosfoglicéridos, esteroides, terpenos, lisolípidos, glucoesfingolípidos, glucolípidos, sulfátidos, lípidos con ácidos grasos unidos por éter y éster, lípidos polimerizables y combinaciones de los mismos. Por supuesto, también se incluyen compuestos diferentes de los descritos específicamente en este documento que se entienden por un experto en la materia como lípidos, por las composiciones y métodos.

Un experto en la materia conocería la gama de técnicas que pueden emplearse para dispersar una composición en un vehículo líquido. Por ejemplo, la quinureninasa o una proteína de fusión de la misma puede dispersarse en una solución que contiene un lípido, disuelta con un lípido, emulsionada con un lípido, mezclada con un lípido, combinada con un lípido, unida covalentemente a un lípido, contenida como una suspensión en un lípido, contenida o en complejo con una micela o liposoma, o asociada de otro modo con un lípido o estructura lipídica mediante cualquier medio conocido para los expertos en la materia. La dispersión puede provocar o no la formación de liposomas.

La cantidad de dosificación real de una composición administrada a un paciente animal puede determinarse por factores físicos y fisiológicos, tales como el peso corporal, la gravedad de la afección, el tipo de enfermedad que se está tratando, las intervenciones terapéuticas anteriores o concurrentes, la idiopatía del paciente y según la vía de administración. Dependiendo de la dosificación y la vía de administración, la cantidad de administraciones de una dosificación preferida y/o una cantidad eficaz puede variar de acuerdo con las respuestas del sujeto. El facultativo responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la concentración de ingrediente o ingredientes activos en una composición y la o las dosis apropiadas para el sujeto individual.

En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden comprender, por ejemplo, al menos aproximadamente un 0,1 % de un compuesto activo. En otras realizaciones, un compuesto activo puede comprender entre aproximadamente un 2 % y aproximadamente un 75 % del peso de la unidad, o entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 60 %, por ejemplo, y cualquier intervalo derivable en los mismos. De forma natural, la cantidad de compuesto o compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal manera que se obtenga una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Se contemplarán factores tales como la solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas, por un experto en la materia de preparación de dichas formulaciones farmacéuticas, y por tanto, puede ser deseable una variedad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.

En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 microgramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 10 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 50 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 100 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 200 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 350 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 500 microgramos/kg/peso corporal, aproximadamente 1 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 5 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 10 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 50 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 100 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 200 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 350 miligramo/kg/peso corporal, aproximadamente 500 miligramo/kg/peso corporal, a aproximadamente 1000 miligramo/kg/peso corporal, o más por administración, y cualquier intervalo derivable en los mismos. En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en este documento, puede administrarse un intervalo de aproximadamente 5 miligramo/kg/peso corporal a aproximadamente 100 miligramo/kg/peso corporal, de aproximadamente 5 microgramos/kg/peso corporal a aproximadamente 500 miligramo/kg/peso corporal, etc., basándose en los números descritos anteriormente.

X. Tratamientos de combinación

En determinadas realizaciones, las composiciones de las presentes realizaciones para su uso en un método para el tratamiento de un tumor en un sujeto implican la administración de una quinureninasa en combinación con un segundo tratamiento o tratamiento adicional. Dicho tratamiento puede aplicarse en el tratamiento de cualquier enfermedad que esté asociada con dependencia de quinurenina. Como se comprende en la presente invención, la enfermedad puede ser cáncer.

Los métodos y composiciones, incluyendo los tratamientos de combinación, potencian el efecto terapéutico o protector, y/o aumentan el efecto terapéutico de otro tratamiento antineoplásico o antihiperproliferativo. Los métodos terapéuticos y profilácticos y composiciones pueden proporcionarse en una cantidad combinada eficaz para conseguir el efecto deseado, tal como la eliminación de una célula cancerosa y/o la inhibición de la hiperproliferación celular. Este proceso puede implicar la administración de una quinureninasa y un segundo tratamiento. El segundo tratamiento puede tener o no un efecto citotóxico directo. Por ejemplo, el segundo tratamiento puede ser un agente que regule por aumento el sistema inmunitario sin tener un efecto citotóxico directo. Un tejido, tumor o célula puede exponerse a una o más composiciones o una o más formulaciones farmacológicas que comprenden uno o más de los agentes (por ejemplo, una quinureninasa o un agente antineoplásico), o exponiendo el tejido, tumor y/o célula a dos o más composiciones o formulaciones distintas, en la que una composición comprende 1) una quinureninasa, 2) un agente antineoplásico o 3) tanto una quinureninasa como un agente neoplásico. Además, se contempla que dicho tratamiento de combinación puede usarse junto con quimioterapia, radioterapia, tratamiento quirúrgico o inmunoterapia.

Los términos "en contacto" y "expuesto", cuando se aplican a una célula, se usan en este documento para describir el proceso por el que una construcción terapéutica y un agente quimioterápico o radioterápico se suministran a una célula diana o se colocan en yuxtaposición directa con la célula diana. Para conseguir la eliminación celular, por ejemplo, ambos agentes se suministran a una célula en una cantidad combinada eficaz para eliminar la célula o evitar que se divida.

Una quinureninasa puede administrarse antes, durante, después o en diversas combinaciones respecto a un tratamiento antineoplásico. Las administraciones pueden ser en intervalos que varían de simultáneamente a minutos a días a semanas. En realizaciones donde la quinureninasa se proporciona a un paciente por separado de un agente antineoplásico, en general, se aseguraría que no transcurre un período de tiempo significativo entre el tiempo de cada suministro, de modo que los dos compuestos aún podrían ejercer un efecto ventajosamente combinados sobre el paciente. En dichos casos, se contempla que puede proporcionarse a un paciente la quinureninasa y el tratamiento antineoplásico en aproximadamente 12 a 24 o 72 h entre sí y, más particularmente, en aproximadamente 6-12 h entre sí. En algunas situaciones puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento significativamente donde transcurren de varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7) a varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre las administraciones respectivas.

En determinadas realizaciones, un ciclo de tratamiento durará 1-90 días o más (este intervalo incluye días intermedios). Se contempla que un agente pueda administrarse en cualquier dicha desde el día 1 hasta el día 90 (este intervalo incluye días intermedios) o cualquier combinación de los mismos, y otro agente se administra en cualquier día desde el día 1 hasta el día 90 (este intervalo incluye días intermedios) o cualquier combinación de los mismos. Dentro de un único día (periodo de 24 horas), al paciente se le administra una o múltiples administraciones del agente o agentes. Además, después de un ciclo de tratamiento, se contempla que hay un periodo de tiempo en que no se administra tratamiento antineoplásico. Este periodo de tiempo puede durar 1-7 días y/o 1-5 semanas y/o 1-12 meses o más (este intervalo incluye días intermedios), dependiendo del estado del paciente, tal como su pronóstico, resistencia, salud, etc. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan según lo necesario.

Pueden emplearse diversas combinaciones. Por ejemplo, a continuación una quinureninasa es "A" y un tratamiento antineoplásico es "B":

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

La administración de cualquier compuesto o tratamiento de las presente realizaciones a un paciente seguirá protocolos generales para la administración de dichos compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hay, de los agentes. Por lo tanto, en algunas realizaciones hay una etapa de control de la toxicidad que se puede atribuir al tratamiento de combinación.

A. Quimioterapia

Puede usarse una amplia diversidad de agentes quimioterápicos de acuerdo con las presentes realizaciones. El término "quimioterapia" se refiere al uso de fármacos para tratar el cáncer. Un "agente quimioterápico" se usa para connotar un compuesto o composición que se administra en el tratamiento del cáncer. Estos agentes o fármacos se clasifican por su modo de actividad dentro de una célula, por ejemplo, si afecta a alguna fase del ciclo celular y a qué fase. Como alternativa, un agente puede caracterizarse basándose en una capacidad de reticular directamente del ADN, de intercalarse en el ADN o de inducir aberraciones cromosómicas y mitóticas afectando a la síntesis de ácido nucleico.

Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclofosfamida; alquilsulfonatos, tales como busulflán, improsulfán y piposulfán; aziridinas, tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina y bullatacinona); una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecán); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno,, tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida y mostaza de uracilo; nitrosureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como los antibióticos de enediino (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma II y caliqueamicina omega II; dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos, tales como clodronato; una esperamicina; así como cromóforo neocarcinostanina y cromóforos antibióticos de enediino de cromoproteína relacionados, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina (incluyendo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolinodoxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina y desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tales como mitimicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, y zorrubicina; antimetabolitos, tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácidos fólico, tales como denopterina, pteropterina y trimetrexato; análogos de purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, y tioguanina; análogos de pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, y floxuridina; andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, y testolactona; antisuprarrenales, tales como mitotano y trilostano; reforzador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elformitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de PSK polisacárido; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; taxoides, por ejemplo, paclitaxel y docetaxel gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; complejos de coordinación de platino, tales como cisplatino, oxaliplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (por ejemplo, CPT-11); inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides, tales como ácido retinoico; capecitabina; carboplatino, procarbazina, plicomicina, gemcitabina, navelbina, inhibidores de farnesil proteína transferasa, transplatino y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los anteriores.

B. Radioterapia

Otros factores que causan daños en el ADN y se han usado ampliamente incluyen lo que se conoce habitualmente como rayos y, rayos X y/o el suministro dirigido de radioisótopos a células tumorales. Otras formas de factores que dañan el ADN también se contemplan, tales como microondas, radiación con rayos de protones (patentes de Estados Unidos 5.760.395 y 4.870.287) y radiación UV. Es muy probable que todos estos factores logren una amplia gama de daños en el ADN, en los precursores de ADN, en la replicación y reparación del ADN y en el ensamblaje y mantenimiento de los cromosomas. Los intervalos de dosificación para rayos X varían de dosis diarias de 50 a 200 roentgens durante periodos prolongados de tiempo (3 a 4 semanas), hasta dosis individuales de 2000 a 6000 roentgens. Los intervalos de dosificación para radioisótopos varían ampliamente y dependen de la semivida del isótopo, la potencia y tipo de radiación emitida y la captación por las células neoplásicas.

C. Inmunoterapia

Los expertos en la materia entenderán que las inmunoterapias pueden usarse en combinación o junto con métodos de las realizaciones. En el contexto del tratamiento del cáncer, los agentes inmunoterápicos, en general, dependen del uso de células efectoras inmunitarias y moléculas para abordar y destruir las células cancerosas. Rituximab (RITUXAN®) es uno de dichos ejemplos. Los inhibidores de los puntos de control, tales como, por ejemplo, ipilumimab, son otro de dichos ejemplos. El efector inmunitario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo específico para algún marcador de la superficie de una célula tumoral. El anticuerpo en solitario puede servir con efector de tratamiento o puede reclutar otras células para lograr realmente la eliminación celular. El anticuerpo también puede conjugarse a un fármaco o toxina (agente quimioterápico, radionúclido, cadena de ricina A, toxina colérica, toxina pertúsica, etc.) y servir simplemente como agente de dirección. Como alternativa, el efector puede ser un linfocito que porta una molécula superficial que interactúa, directa o indirectamente, con una diana celular tumoral. Diversas células efectoras incluyen linfocitos T citotóxicos y linfocitos NK.

En un aspecto de inmunoterapia, la célula tumoral debe albergar algún marcador que sea susceptible a dirección, es decir, no esté presente en la mayoría de las demás células. Existen muchos marcadores tumorales y cualquiera de estos puede ser adecuado para la dirección en el contexto de las presentes realizaciones. Los marcadores tumorales comunes incluyen CD20, antígeno carcinoembrionario, tirosinasa (p97, gp68, TAG-72, HMFG, antígeno sialil-Lewis, MucA, MucB, PLAP, receptor de laminina, erb B y p155. Un aspecto alternativo de inmunoterapia es combinar efectos antineoplásicos con efectos inmunoestimuladores. También existen moléculas inmunoestimuladoras, que incluyen: citocinas, tales como IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, gamma-IFN, quimiocinas, tales como MIP-1, MCP-1, IL-8 y factores de crecimiento, tales como ligando FLT3.

Los ejemplos de inmunoterapias actualmente en investigación o en uso son adyuvantes inmunitarios, por ejemplo, Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, dinitrocloronbenceno y compuestos aromáticos (patentes de Estados Unidos n.° 5.801.005 y 5.739.169; Hui y Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); tratamiento con citocinas, por ejemplo, interferones a, p, y y, IL-1, GM-CSF y TNF (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); genoterapia, por ejemplo, TNF, IL-1, IL-2, y p53 (Qin et al., 1998; Austin-Ward y Villaseca, 1998; patentes de Estados Unidos 5.830.880 y 5.846.945;); y anticuerpos monoclonales, por ejemplo anti-CD20, anti-gangliósido GM2, y *anti-p185 (Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; Patente de Estados Unidos 5.824.311). Se contempla que puede emplearse uno o más tratamientos antineoplásicos con los tratamientos de anticuerpo descritos en este documento.

D. Cirugía

Aproximadamente un 60 % de las personas con cáncer experimentará cirugía de algún tipo, que incluye cirugía preventiva, de diagnóstico o de estadificación, curativa y paliativa. La cirugía curativa incluye la resección en que todo a parte del tejido canceroso se retira físicamente, se escinde y/o se destruye y puede usarse junto con otros tratamientos, tales como el tratamiento de las presentes realizaciones, quimioterapia, radioterapia, tratamiento hormonal, genoterapia, inmunoterapia y/o tratamientos alternativos. La resección tumoral se refiere a la eliminación física de al menos parte de un tumor. Además de la resección tumoral, el tratamiento por cirugía incluye cirugía láser, criocirugía, electrocirugía y cirugía controlada microscópicamente (cirugía de Mohs).

T ras la escisión de parte o todas las células cancerosas, tejido o tumor, puede formarse una cavidad en el organismo. El tratamiento puede conseguirse por perfusión, inyección directa o aplicación local en la zona con un tratamiento antineoplásico adicional. Dicho tratamiento puede repetirse, por ejemplo, cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o cada 1, 2, 3, 4 y 5 semanas o cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. Estos tratamientos pueden ser de dosificaciones variables también.

E. Otros agentes

Se contempla que pueden usarse otros agentes en combinación con determinados aspectos de las presentes realizaciones para mejorar la eficacia terapéutica del tratamiento. Estos agentes adicionales incluyen agentes que afectan a la regulación por aumento de los receptores de superficie celular y las uniones GAP, agentes citostáticos y de diferenciación, inhibidores de la adhesión celular, agentes que aumentan la sensibilidad de las células hiperproliferativas a inductores apoptóticos u otros agentes biológicos. Los aumentos en la señalización intracelular elevando el número de uniones GAP aumentaría los efectos antihiperproliferativos en la población de células hiperproliferativas adyacentes. En otras realizaciones, pueden usarse agentes citostáticos o de diferenciación en combinación con determinados aspectos de las presentes realizaciones para mejorar la eficacia antihiperproliferativa de los tratamientos. Se contemplan inhibidores de adhesión celular para mejorar la eficacia de las presentes realizaciones. Son ejemplos de inhibidores de adhesión celular inhibidores de la cinasa de adhesión focal (FAK) y lovastatina. Se contempla además que otros agentes que aumentan la sensibilidad de una célula hiperproliferativa a la apoptosis, tal como el anticuerpo c225, podrían usarse en combinación con determinados aspectos de las presentes realizaciones para mejorar la eficacia de tratamiento.

XI. Kits

Determinados aspectos de la presente invención pueden proporcionar kits, tales como kits terapéuticos. Por ejemplo, un kit puede comprender una o más composiciones farmacéuticas como se describen en este documento y opcionalmente instrucciones para su uso. Los kits también pueden comprender uno o más dispositivos para conseguir la administración de dichas composiciones. Por ejemplo, un presente kit puede comprender una composición farmacéutica y catéter para conseguir la inyección intravenosa directa de la composición en un tumor canceroso. En otras realizaciones, un presente kit puede comprender ampollas prellenadas de una quinureninasa, opcionalmente formulada como un agente farmacéutico o liofilizada, para su uso con un dispositivo de suministro.

Los kits pueden comprender un recipiente con una etiqueta. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse de una diversidad de materiales, tal como vidrio o plástico. El recipiente puede alojar una composición que incluye una quinureninasa que es eficaz para aplicaciones terapéuticas o no terapéuticas, tal como se describe anteriormente. La etiqueta del recipiente puede indicar que la composición se usa para un tratamiento específico o aplicación no terapéutica, y también puede indicar directrices por su uso in vivo o in vitro, tales como las descritas anteriormente. El kit de la invención típicamente comprenderá el recipiente descrito anteriormente y uno o más recipientes diferentes que comprenden materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para su uso.

XII. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia deben apreciar que las técnicas divulgadas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por el autor de la invención que funcionan bien en la práctica de la invención y, por lo tanto, puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la materia deben apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones específicas que se divulgan y aún obtener un resultado parecido o similar sin alejarse del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 - Construcción génica, expresión y purificación de quinureninasa de Psuedomonas fluorescens

Se construyó un gen para la expresión de la enzima quinureninasa de Pseudomonas fluorescens (Pf-KYNU) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extensión solapante de cuatro bloques génicos de codones optimizados diseñados usando el programa informático DNA-Works (Hoover y Lubkowski, 2002). El gen de longitud completa incluye un sitio para la enzima de restricción XbaI en el extremo N (nucleótidos 1-6), un sitio de unión al ribosoma optimizado (RBS; nucleótidos 29-55), un codón de parada (nucleótidos 56-58), una marca de His 6 en el extremo N (nucleótidos 59-91), un gen Pf-KYNU de codones optimizados de E. coli (nucleótidos 92-1336), un codón de parada (nucleótidos 1337-1342) y un sitio para la enzima de restricción SamHI en el extremo c (nucleótidos 1342-1347) (véase la SEQ ID NO: 1). Los sitios para enzimas de restricción mencionados anteriormente se usaron para clonar el gen ensamblado en un vector pET-28a+ (Novagen). Esta construcción entonces se usó para transformar E. coli BL21 (DE3) para la expresión. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación a 210 r.p.m. en medio Terrific Broth (TB) con 50 mg/l de canamicina. La expresión se indujo cuando se alcanzó una DO⁶⁰⁰ ~1,0 añadiendo IPTG (concentración final 0,5 mM) con agitación continuada durante la noche a 37 °C. Las células entonces se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en tampón de lisis que consistía en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, fosfato de piridoxilo (PLP) 0,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 1 |jg/ml de DNasa. La lisis se consiguió mediante prensa francesa y el lisado se aclaró de los particulados por centrifugación a 20000 x g durante 1 h a 4 °C. El sobrenadante entonces se filtró a través de un filtro de jeringa de 5 jm y se aplicó a una columna de Ni-NTA/agarosa (Qiagen) preequilibrada en un tampón compuesto de fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM y PLP 0,1 mM a pH 7,4. Después de cargar el lisado en la columna, la resina se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y PLP 0,1 mM con imidazol 30 mM. A continuación, se ajustó el caudal para lavar lentamente la columna durante la noche con 100 CV de tampón PBS sin endotoxina (Corning) con PLP 0,1 mM y TRITON® X114 al 1 % v/v. Este lavado durante la noche elimina el lipopolisacárido (LPS o endotoxina) que es un contaminante típico de sistemas de expresión bacterianos. La enzima lavada entonces se eluyó en 5 CV de PBS sin endotoxina con PLP 0,1 mM con imidazol 250 mM, y la resina se aclaró con una segunda parte de 5 CV de PBS sin endotoxina con PLP 0,1 mM. En este punto, se intercambió el tampón de la enzima a PBS fresco para eliminar el imidazol, se añadió glicerol al 10 % y se congelaron inmediatamente alícuotas en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80 °C. Como alternativa, se intercambió inmediatamente el tampón de la enzima para que fuera fresco, con fosfato de sodio 100 mM estéril, pH 8,4, tanto para eliminar el imidazol como para prepararla para PEGilación (véase el ejemplo 4). Las purezas enzimáticas fueron típicamente de >95 % basadas en el análisis de SDS-PAGE y los rendimientos típicos promediaron aproximadamente 75 mg/l de cultivo. Se evaluaron las cantidades de proteínas midiendo la Abs²⁸⁰ nm y usando el coeficiente de extinción enzimática calculado de 63745 M^cirr1.

Ejemplo 2 - Construcción génica, expresión y purificación de quinureninasa de Homo sapiens

Se obtuvo un gen para la expresión de la enzima quinureninasa de Homo sapiens (fr-KYNU) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extensión solapante de cuatro bloques génicos de codones optimizados diseñados usando el programa DNA-Works (Hoover and Lubkowski, 2002). El gen de longitud completa incluye un sitio para la enzima de restricción Xbal en el extremo N (nucleótidos 1-6), un RBS optimizado (nucleótidos 28-60), un codón de inicio (nucleótidos 61-63), una marca de His6 en el extremo N (nucleótidos 64-96), un gen fr-KYNU de codones optimizados de E. coli (nucleótidos 97-1488), un codón de parada (nucleótidos 1489-1491) y un sitio para la enzima de restricción SamHI en el extremo C (nucleótidos 1492-1497) (véase la SEQ ID NO: 2). Los sitios para enzimas de restricción mencionados anteriormente se usaron para clonar el gen ensamblado en un vector pET-28a+ (Novagen). Esta construcción entonces se usó para transformar E. coli BL21 (DE3) para la expresión. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación a 210 r.p.m. en medio Terrific Broth (TB) con 50 mg/l de canamicina. La expresión se indujo cuando se alcanzó una DO⁶⁰⁰ ~1,0 añadiendo IPTG (concentración final 0,5 mM) con agitación continuada durante la noche a 37 °C. Las células entonces se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en tampón de lisis que consistía en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, fosfato de piridoxilo (Pl P) 0,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 1 jg/m l de DNasa. La lisis se consiguió mediante prensa francesa y el lisado se aclaró de los particulados por centrifugación a 20000 x g durante 1 h a 4 °C. El sobrenadante entonces se filtró a través de un filtro de jeringa de 5 jm y se aplicó a una columna de Ni-NTA/agarosa (Qiagen) preequilibrada en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y tampón PLP 0,1 mM. Después de cargar el lisado en la columna, la resina se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y PLP 0,1 mM con imidazol 30 mM. A continuación, se ajustó el caudal para lavar lentamente la columna durante la noche con 100 CV de tampón PBS sin endotoxina (Corning) con PLP 0,1 mM y TRITON® X114 al 1 % v/v. Este lavado durante la noche elimina el lipopolisacárido (LPS o endotoxina) que es un contaminante típico en la expresión bacteriana de enzimas. La enzima lavada entonces se eluyó en 5 CV de PBS sin endotoxina con PLP 0,1 mM con imidazol 250 mM y la resina se aclaró con una segunda parte de 5 CV de PBS sin endotoxina con PLP 0,1 mM. En este punto, se intercambió el tampón de la enzima a PBS fresco para eliminar el imidazol, se añadió glicerol al 10 % y se congelaron inmediatamente alícuotas en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80 °C. Como alternativa, podía intercambiarse el tampón de la enzima para que fuera fresco, con fosfato de sodio 100 mM estéril, pH 8,4, tanto para eliminar el imidazol como para prepararla para PEGilación (véase el ejemplo 4). Las purezas enzimáticas fueron típicamente de >95 % evaluadas por análisis de SDS-PAGE y los rendimientos típicos promediaron aproximadamente 20 mg/l de cultivo líquido. Se evaluaron las cantidades de proteínas midiendo la Abs²⁸⁰ nm y usando el coeficiente de extinción enzimática calculado de 76040 M' 1cirr1.

Ejemplo 3 - Construcción génica, expresión y purificación de quinureninasa de Mus musculus

Se obtuvo un gen para la expresión de la enzima quinureninasa de Mus musculus (m-KYNU) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extensión solapante de tres bloques génicos de codones optimizados diseñados usando el programa DNA-Works (Hoover et al., 2002). El gen de longitud completa incluía un sitio para la enzima de restricción Xbal en el extremo N (nucleótidos 1-6), un RBS optimizado (nucleótidos 29-58), un codón de inicio (nucleótidos 59­ 61), una marca de His6 en el extremo N (nucleótidos 62-94), un gen m-KYNU de codones optimizados de E. coli (nucleótidos 95-1483), un codón de parada (nucleótidos 1484-1486) y un sitio para la enzima de restricción SamHI en el extremo C (nucleótidos 1487-1492) (véase la SEQ ID NO: 3). Los sitios para enzimas de restricción mencionados anteriormente se usaron para clonar el gen ensamblado en un vector pET-28a+ (Novagen). Esta construcción entonces se usó para transformar E. coli BL21 (DE3) para la expresión. Las células se cultivaron a 37 °C agitando a 210 r.p.m. en medio Terrific Broth (TB) con 50 mg/l de canamicina. La expresión se indujo cuando se alcanzó una DO⁶⁰⁰ ~1,0 añadiendo IPTG 0,5 mM y se continuó durante la noche a 37 °C. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en tampón de lisis que consistía en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, fosfato de piridoxilo (PLP) 0,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 1 jg/m l de DNasa. La lisis se consiguió mediante prensa francesa y el lisado se aclaró de los particulados por centrifugación a 20 000 x g durante 1 h a 4 °C. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de jeringa de 5 |jm y se aplicó a una columna de Ni-NTA/agarosa (Qiagen) preequilibrada en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y tampón PLP 0,1 mM. Después de cargar el lisado en la columna, la resina se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y PLP 0,1 mM con imidazol 30 mM. A continuación se ajustó el caudal para lavar lentamente durante la noche con 100 CV de tampón PBS sin endotoxina (Corning) con PLP 0,1 mM y TRITON® X114 al 1 % v/v. Este lavado durante la noche eliminó el lipopolisacárido (LPS o endotoxina) que es un contaminante típico en la expresión bacteriana de enzimas. La enzima lavada se eluyó en 5 CV de PBS sin endotoxina con PLP 0,1 mM con imidazol 250 mM y la resina se aclaró con una segunda parte de 5 CV de PBS sin endotoxina con PLP 0,1 mM. En este punto, se intercambió el tampón de la enzima a PBS fresco para eliminar el imidazol, se añadió glicerol al 10 % y se congelaron inmediatamente alícuotas en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80 °C.

Ejemplo 4 - Preparación farmacológica de quinureninasa de Pseudomonas fluorescens

Para mejorar el tiempo en circulación de la enzima in vivo, se aumentó el radio hidrodinámico de las enzimas KYNU funcionalizando los grupos reactivos superficiales en la proteína por conjugación con PEG. En una realización, se funcionalizó PPKYNU por reacción de los restos de lisina superficiales con carbonato de metoxi PEG succinimidilo de 5000 PM (NANOCS). La enzima purificada sin endotoxinas se intercambió de tampón minuciosamente a fosfato de sodio 100 mM preparado recientemente, pH 8,4 y se concentró a 10 mg/ml. La solución resultante se añadió directamente a un exceso molar de 100:1 de reactivo de PEG sólido y se permitió que reaccionara a temperatura ambiente durante 1 h (FIG. 1). El PEG sin reaccionar se retiró de la solución por intercambio de todo el tampón a PBS sin endotoxina reciente en un dispositivo de filtración centrífuga de punto de corte de 100 kDa (AMICON®). La masa molecular aparente de la enzima entonces se comprobó en una columna de HPLC de exclusión molecular (Phenomenex) en PBS. Se usó una solución de patrón de PM de BioRad para generar una curva patrón y los tiempos de retención de la enzima se compararon con los de los patrones de proteína. Basándose en la curva patrón, la enzima no PEGilada tiene una masa aparente de 40 kDa, que está cerca de la masa de un monómero de PPKYNU. Se observó que la versión PEGilada de la enzima tenía una masa aparente de 1300 kDa, es decir, sustancialmente más grande que la enzima no modificada. Los niveles de endotoxina se cuantificaron usando el kit de ensayo de endotoxina cromógeno cinético Chromo-LAL (Associates of Cape Cod, Inc.). La enzima lavada de la manera descrita anteriormente típicamente producía niveles de endotoxina de 0.19 ± 0.07 UE/mg de Pt-KYNU purificada.

Ejemplo 5 - Preparación farmacológica de quinureninasa de Homo sapiens

Para mejorar el tiempo de residencia en la circulación de la enzima humana in vivo, se aumentó el radio hidrodinámico de fr-KYNU funcionalizando los grupos reactivos superficiales en la proteína por conjugación con PEG. En una realización, se funcionalizó fr-KYNU por reacción de los restos de lisina superficiales con carbonato de metoxi PEG succinimidilo de 5000 PM (NANOCS). La enzima purificada sin endotoxinas se intercambió de tampón minuciosamente a fosfato de sodio 100 mM preparado recientemente, pH 8,4 y se concentró a 10 mg/ml. La solución resultante se añadió directamente a un exceso molar de 100:1 de reactivo de PEG sólido y se permitió que reaccionara a temperatura ambiente durante 1 h. El PEG sin reaccionar se retiró de la solución por intercambio de todo el tampón a PBS sin endotoxina reciente en un dispositivo de filtración centrífuga de punto de corte de 100 kDa (AMICON®). La masa molecular aparente de la enzima se determinó usando una columna de HPLC de exclusión molecular (Phenomenex) equilibrada con PBS y los tiempos de retención se compararon con una solución de patrón de PM (BioRad). Los niveles de endotoxina se cuantificaron usando el kit de ensayo de endotoxina cromógeno cinético Chromo-LAL (Associates of Cape Cod, Inc.).

Ejemplo 6 - Ensayo para medir los parámetros cinéticos de quinureninasa

Los parámetros cinéticos de PPKYNU y fr-KYNU, así como de sus versiones PEGiladas como se describen en los ejemplos 4 y 5, se cuantificaron por un ensayo espectrofotométrico, en que se controló el descenso en la absorbancia máxima del sustrato enzimático, L-quinurenina, como una función del tiempo. Se prepararon soluciones de L-quinurenina en un tampón de PBS, pH 7,4, para producir concentraciones finales que varían de 8 pM a 250 pM. La L-quinurenina tiene un coeficiente de extinción de 4500 M ^cirr1 con una Amáx a 365 nm mientras que los productos de la reacción de quinureninasa, ácido L-antranílico y L-alanina, no absorben apreciablemente a 365 nm. Las reacciones se iniciaron añadiendo y mezclando rápidamente soluciones enzimáticas (~20 nM final) con las soluciones de sustrato y controlando la pérdida de sustrato KYN a 25 °C midiendo Abs365 nm a lo largo del tiempo. Los datos resultantes se procesaron y ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten para determinar las constantes cinéticas. La cinética de la enzima Pf-KYNU PEGilada se midió de una manera idéntica. Para la enzima no PEGilada, fcat/KM = 1,0 x 105 M'1S'1 y para la forma PEGilada, fcat/KM = 1,3 x 105 M 'V . Los parámetros cinéticos para la hidrólisis de ácido 3-hidroxi-L-quinurénico también se determinaron como se describe en esta ocasión.

Ejemplo 7- Estabilidad in vitro de quinureninasa

Para medir la estabilidad in vitro de Pf-KYNU, la enzima se añadió a tampón PBS o suero humano combinado hasta una concentración final de 10 pM y se incubó a 37 °C. Se recogieron porciones de 10 j l cada una en los puntos temporales y se añadieron a 990 j l de una solución 250 jM de L-quinurenina/PBS. La velocidad inicial de la reacción se controló midiendo el descenso de la absorbancia a 365 nm a lo largo del tiempo como se describe en el ejemplo 3. La estabilidad enzimática se determinó comparando la velocidad inicial de catálisis de L-quinurenina en cada punto temporal y comparándola con la velocidad a tiempo = 0. Los datos resultantes se representaron como el % de actividad frente al tiempo y se ajustaron a una ecuación exponencial para determinar la semivida (T¹/²). Se descubrió que la enzima Pf-KYNU tenía un T^1/2 = 34,3 horas en PBS y un T^1/2 = 2,4 horas en suero humano combinado (FIG. 2).

Ejemplo 8 - Ensayo para cuantificar los niveles de quinurenina y triptófano in vivo

Los niveles in vivo de L-quinurenina, triptófano, ácido quinurénico, 3-hidroxi-L-quinurenina y ácido L-antranílico (uno de los productos de catálisis de quinureninasa) se cuantificaron y controlaron por HPLC. Tras la necropsia de los ratones, se retiraron muestras de sangre, el tumor, el bazo y el hígado. Las muestras de sangre se centrifugaron para separar la sangre completa del suero. Las muestras tisulares se homogeneizaron en primer lugar y después se centrifugaron para retirar la parte sólida. A cada parte líquida se añadió una parte de 1:10 v/v de ácido tricloroacético al 100 % para precipitar las macromoléculas. Los sólidos se retiraron de nuevo por centrifugación y los sobrenadantes se pasaron a través de un filtro de jeringa de 0,45 pm. Los sobrenadantes tratados se aplicaron directamente a una HPLC (Shimadzu) y se separaron en una columna de C-18 analítica convencional usando un gradiente que parte de solución B al 0 % hasta solución B al 100 % donde la solución A es H²O ácido trifluoroacético al 0,1 % y la solución B es acetonitrilo ácido trifluoroacético al 0,1 %. El intervalo de absorbancia completo de 190 nm a 900 nm se recogió de forma continua para controlar todas las moléculas posibles y la espectroscopia de fluorescencia (Ex = 365 nm, Em = 480 nm) se recogió simultáneamente para controlar específicamente los niveles de quinurenina. Las concentraciones y los tiempos de retención se determinaron usando soluciones de patrón hechas de las moléculas puras (Sigma).

Ejemplo 9 - Eficacia de PEG-Pf-KYNU en el modelo de melanoma de ratón B16 autólogo

Ratones B6-WT (n = 20) se inocularon cada uno con 2,5 x 105 células de melanoma murino B16 por inyección subcutánea en el flanco. Después de permitir que los tumores se establecieran durante 10 días (media del tumor = 20 mm2) los ratones se dividieron en dos grupos de n = 10 cada uno. El grupo de control entonces se trató con 20 mg/kg de PEG-Pf-KYNU inactivada por calor por inyección intratumoral cada tres días hasta que los tumores alcanzaron 350 mm2 de tamaño. El grupo experimental se trató de una manera idéntica excepto con 20 mg/kg de PEG-Pf-KYNU activa por inyección intratumoral cada tres días hasta que los tumores alcanzaron un punto final de 350 mm2 de tamaño. Las tasas de crecimiento de los tumores de melanoma B16 se retardaron significativamente en el grupo de tratamiento al que se administró PEG-Pf-KYNU activa en comparación con el grupo tratado de forma idéntica con PEG-Pf-KYNU inactivada por calor (FIG. 3) produciendo una ampliación significativa de la vida (FIG. 4). Los linfocitos aislados de los grupos de control y de tratamiento experimental se evaluaron con paneles de anticuerpos (es decir, anti-CD45, CD4, Nk1.1, CD25, FoxP3, CD8, grancima B, IFNy, CTLA4, CD11c, CD11b, F4/80, GR-1 y Ly6-C) que revelaron que la población de linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ FoxP3+ en circulación era significativamente inferior en el grupo tratado con PEG-Pf-KYNU activa (4,8 ± 0,8 % frente a 8,6 ± 0,8 %). Además, la población de linfocitos T CD8+ de infiltración tumoral que expresan grancima B e interferón y era significativamente mayor en ratones tratados con enzima activa (26 ± 19 % frente a 4 ± 2 %) (FIG. 5A-B).

Ejemplo 10 - Proteínas de fusión de quinureninasa-scFv para dirección tumoral

En algunos aspectos, la presente invención también contempla polipéptidos que comprenden la quinureninasa bacteriana o de mamífero modificada unida a una secuencia de aminoácidos heteróloga. Por ejemplo, la quinureninasa nativa o modificada puede unirse a un anticuerpo de fragmento variable monocatenario (scFv) que se une a antígenos tumorales de superficie celular específicos. En esta realización, una proteína de fusión scFv-quinureninasa con la parte scFv de la proteína que tiene afinidad específica por un antígeno tumoral conocido, preferiblemente un antígeno específico de tumor que se internaliza a una tasa más lenta, por ejemplo, MUC-1, permitiría que la parte de quinureninasa de la proteína de fusión se suministrara a la célula tumoral y degradara KYN. Un ejemplo sería una proteína de fusión de scFv-quinureninasa donde la parte scFv se dirige y se une al receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) que está regulado por aumento en determinados tipos de cáncer de mama.

En esta realización, una proteína de fusión quinureninasa nativa o modificada-scFv anti-HER2 actuaría dirigiendo y concentrando la quinureninasa directamente en la superficie del tumor y actuando al degradar la KYN producida por el tumor.

Ejemplo 11 - Proteínas de fusión de quinureninasa-scFv anti-CTLA4

En algunos aspectos, la presente invención también contempla polipéptidos que comprenden la quinureninasa bacteriana o de mamífero modificada unida a una secuencia de aminoácidos heteróloga. Por ejemplo, la quinureninasa nativa o modificada puede unirse a un anticuerpo de fragmento variable monocatenario (scFv) que se une al receptor de antígeno de linfocitos T citotóxico 4 (CTLA-4), muerte celular programada 1 (PD-1) o ligando 1 de muerte celular programada (PD-L1). Un bloqueo de CTLA-4, PD-1 o PD-L1 mediante un anticuerpo antagonizante o fragmento de anticuerpo permite que la señal inhibidora de linfocitos T se invierta, lo que permite que CD28 estimule la activación de linfocitos T. En esta realización, una proteína de fusión de quinureninasa nativa o modificada-scFv anti-CTLA4, anti-PD-1 o anti-PD-LI actuaría eliminando tanto la señalización de interacción de proteína inhibidora:proteína como la señalización inhibidora de quinurenina. Esta realización de una proteína de fusión de quinureninasa nativa o modificada-scFv se esperaría que regulara por aumento potentemente la activación de linfocitos T y promoviera robustas respuestas antitumorales.

Ejemplo 12 - Construcciones de receptor de antígeno quimérico para el suministro de quinureninasa a linfocitos T

En algunos aspectos, La presente invención también contempla un vector lentivírico adecuado para la transfección de linfocitos T con construcciones de receptor de antígeno quimérico (CAR) de modo que se coexpresaría una quinureninasa bacteriana o de mamífero modificada además de la construcción de CAR. Las construcciones de CAR son proteínas que contienen un dominio de unión a antígeno extracelular fusionado a un dominio de señalización transmembranario y citoplasmático de una cadena CD3-Z y a menudo una molécula CD28 (Ahmed et al., 2010). El dominio de unión a antígeno puede ser un scFv diseñado para unirse a un antígeno expresado por una célula tumoral, siendo ejemplos HER2 expresado por glioblastoma u osteosarcoma, CD19 o CD20 expresado por diversas neoplasias de linfocitos B, o GD2 expresado por neuroblastoma (Lipowska-Bhalla et al., 2012) o cualquier otra diana relevante. En esta realización, el vector lentivírico, que suministra una construcción de CAR apropiada a un linfocito T, además coexpresaría una quinureninasa bacteriana o de mamífero nativa o modificada en el citosol. El linfocito T que contiene esta construcción de CAR/quinureninasa tendría la doble capacidad de 1) unirse a células tumorales específicas y 2) degradar KYN, evitando la inducción por KYN de un fenotipo regulador y/o apoptosis. En otra realización, un linfocito T expresaría una construcción de CAR que se une a un linfoma de linfocitos B grande difuso CD19+ o CD20+ mientras coexpresa una quinureninasa para degradar las altas concentraciones de KYN a menudo producidas por este tipo de tumor (Yoshikawa et al., 2010; de Jong et al., 2011; Yao et al., 2011).

Ejemplo 13 - Selección genética para la actividad quinureninasa

El aminoácido L-triptófano (L-Trp) se sintetiza a partir del precursor derivador de pentosa, corismato, por expresión de los genes biosintéticos de trp. En bacterias, tales E. coli los genes biosintéticos de trp están originados en un operón compuesto de cinco genes; trpE, trpD, trpC, trpB, y trpA. Las proteínas TrpE y TrpD son componentes del complejo de antranilato sintasa que cataliza la primera etapa en la conversión de corismato y L-glutamina en ácido antranílico y L-glutamato. El ácido antranílico entonces se convierte posteriormente en L-Trp mediante la acción de TrpC, TrpA y TrpB. Las células que carecen de un gen de antranilato sintasa funcional son auxotróficas para L-Trp y no pueden crecer en medio mínimo sin triptófano. Los autores de la invención postularon que como la quinurenina puede transportarse al citosol de muchos organismos, las células que expresan enzimas L-quinureninasa recombinantes que presentan una actividad catalítica suficientemente alta deben poder convertir la L-quinurenina citosólica en ácido antranílico y el último después posibilita la síntesis de L-Trp. Por el contrario, las células que no expresan la enzima o expresan variantes con baja actividad catalítica deben presentar nada de crecimiento o crecimiento muy lento, respectivamente, en medio mínimo con L-quinurenina.

Se obtuvieron mutantes de eliminación de trpE y trpD de E. coli de Genetic Resources en Yale CGSC. Los genotipos de las cepas fueron (F-,A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rrnB-3), A-, AtrpE772::kan, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514) y (F-, A(araD-araB)567, AlacZ4787(::rmB-3),A-,AtrpD771::kan, rph-1, A(rhaD-rhaB)568, hsdR514), respectivamente. Las células se sembraron en placas con medio mínimo M9. Después se colocaron disco de papel de filtro impregnados en L-Trp, L-Kyn, ácido antranílico o tampón en las placas, seguido de incubación a 37 °C. Las células E. coli-AtrpD crecían solamente en presencia de L-Trp, sin embargo, E. coli-AtrpE también podía crecer en presencia de ácido antranílico, pero no tampón o L-Kyn, lo que demuestra que trpC, trpA y trpB se expresaban, permitiendo el rescate la auxotrofia de L-Trp con ácido antranílico como metabolito intermedio (FIG. 6). Además, las células E. coli-AtrpE transformadas con un plásmido que alberga el gen PPKYNU crecían robustamente en placas de medio mínimo M9 en presencia de L-Kyn.

Ejemplo 14 - Construcción génica, expresión y purificación de quinureninasa bacteriana que presenta alta actividad catalítica hacia quinurenina e identidad con la quinureninasa humana

Similar a otras quinureninasas eucariotas, la enzima de Homo sapiens es muy selectiva hacia la hidrólisis de 3'-OH quinurenina y tiene una actividad catalítica aproximadamente 1000 veces inferior hacia quinurenina. A causa de su mala actividad catalítica hacia quinurenina, la enzima humana no es adecuada para fines terapéuticos. La administración de PPKYNU PEGilada (ejemplo 9), Mu-KYNU (ejemplo 22 y ejemplo 23) o Cp-KYNU (ejemplo 17) (todos los cuales presentan alta actividad catalítica hacia quinurenina en lugar de 3'-OH quinurenina) provocó un retardo del crecimiento tumoral como se muestra en el ejemplo 9 (FIG. 3). Sin embargo, la administración de quinureninasa humana PEGilada a dosificación similar o mayor no tuvo efecto sobre el crecimiento de tumores de melanoma B16 (n = 4). Sin embargo, como se muestra en el ejemplo 20, la genomanipulación de fr-KYNU puede mejorar la actividad degradante de L-quinurenina de la enzima humana. Dichas variantes de fr-KYNU genomanipuladas pueden provocar un retardo del crecimiento del tumor como se observa con Pf-KYNU PEGilada (ejemplo 9), Mu-kYn U (ejemplo 22 y ejemplo 23), y Cp-KYNU (ejemplo 17).

La Pf-KYNU presenta baja identidad de secuencia con su equivalente humano (24 % de identidad de aminoácidos).

Debido su baja identidad de secuencia con la proteína humana, Pf-KYNU puede provocar respuestas inmunitarias adversas en pacientes, así como la producción de anticuerpos neutralizantes. Por lo tanto, es importante descubrir enzimas quinureninasa que presenten alta actividad catalítica y selectividad hacia quinurenina y tengan un mayor grado de identidad de aminoácidos con la quinureninasa de Homo sapiens. Los autores de la invención identificaron varias enzimas bacterianas que presentan >38 % de identidad de aminoácidos con la quinureninasa de Homo sapiens y también alta actividad de hidrólisis de quinurenina. Las secuencias de estas enzimas se proporcionan como la SEQ ID NO: 13-52. Los porcentajes de identidad de estas enzimas en comparación con la quinureninasa de Homo sapiens se proporcionan en la tabla 1. Como ejemplo representativo, se construyó un gen para la expresión de la enzima quinureninasa de Mucilaginibacter paludis (Mu-KYNU) (SEQ ID NO: 33) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extensión solapante de dos bloques génicos de codones optimizados diseñados usando el programa informático DNA-Works (Hoover y Lubkowski, 2002). El gen de longitud completa incluye un sitio para la enzima de restricción NcoI en el extremo N, un RBS optimizado, una marca de His6 en el extremo N, un gen Mu-KYNU de codones optimizados de E. coli, un codón de parada y un sitio para la enzima de restricción EcoRI en el extremo C. Los sitios para enzimas de restricción mencionados anteriormente se usaron para clonar el gen ensamblado en un vector pET-28a+ (Novagen). Esta construcción entonces se usó para transformar E. coli BL21 (DE3) para la expresión. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación a 210 r.p.m. en medio Terrific Broth (TB) con 50 mg/l de canamicina. La expresión se indujo cuando se alcanzó una DO⁶⁰⁰ ~1,0 añadiendo IPTG (concentración final 0,5 mM) con agitación continuada durante la noche a 37 °C. Las células entonces se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en tampón de lisis que consistía en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, fosfato de piridoxilo (PLP) 0,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 1 pg/ml de DNasa. La lisis se consiguió mediante prensa francesa y el lisado se aclaró de los particulados por centrifugación a 20000 x g durante 1 h a 4 °C. El sobrenadante entonces se filtró a través de un filtro de jeringa de 5 pm y se aplicó a una columna de Ni-NTA/agarosa (Qiagen) preequilibrada en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y tampón PLP 0,1 mM. Después de cargar el lisado en la columna, la resina se lavó con 5 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y PLP 0,1 mM con imidazol 30 mM. La enzima lavada entonces se eluyó en 5 CV de PBS con PLP 0,1 mM con imidazol 250 mM. En este punto, se intercambió el tampón de la enzima a PBS fresco para eliminar el imidazol, se añadió glicerol al 10 % y se congelaron inmediatamente alícuotas en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80 °C. Las purezas enzimáticas fueron típicamente de >95 % basadas en el análisis de SDS-PAGE y los rendimientos típicos promediaron aproximadamente 75 mg/l de cultivo. Se evaluaron las cantidades de proteínas midiendo la Abs²⁸⁰ nm y usando el coeficiente de extinción enzimática calculado de 78185 M ^cirr1.

Tabla 1. Porcentajes de identidad de enzimas quinureninasa eubacterianas en comparación con quinureninasa de Homo sa iens.

Ejemplo 15 - Parámetros cinéticos de quinureninasa de Mucilaginibacterpaludis (Mu-KYNU)

Los parámetros cinéticos de Mu-KYNU se cuantificaron mediante un ensayo espectrofotométrico, en que se controló el descenso en la absorbancia máxima del sustrato enzimático, L-quinurenina, como una función del tiempo. Se prepararon soluciones de L-quinurenina en un tampón de PBS, pH 7,4, para producir concentraciones finales que varían de 16 pM a 500 pM. La L-quinurenina tiene un coeficiente de extinción de 4500 M ^cirr1 con una Amáx a 365 nm mientras que los productos de la reacción de quinureninasa, ácido L-antranílico y L-alanina, no absorben apreciablemente a 365 nm. Las reacciones se iniciaron añadiendo y mezclando rápidamente soluciones enzimáticas (~20 nM concentración final) con las soluciones de sustrato y controlando la pérdida de sustrato a 25 °C midiendo Abs365 nm a lo largo del tiempo. Los datos resultantes se procesaron y ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten para determinar las constantes cinéticas. Se determinó que Mu-KYNU tiene una fcat/KWi = 1,2 x 105 M 'V .

Ejemplo 16 - Estabilidad in vitro de quinureninasa de Mucilaginibacter paludis (Mu-KYNU)

Para medir la estabilidad in vitro de Mu -KYNU, la enzima se añadió a tampón PBS o suero humano combinado hasta una concentración final de 10 pM y se incubó a 37 °C. Se recogieron porciones de 10 pl cada una en los puntos temporales y se añadieron a 990 pl de una solución 250 pM de L-quinurenina/PBS. La velocidad inicial de la reacción se controló midiendo el descenso de la absorbancia a 365 nm a lo largo del tiempo como se describe en el ejemplo 3. La estabilidad enzimática se determinó comparando la velocidad inicial de catálisis de L-quinurenina en cada punto temporal y comparándola con la velocidad a tiempo = 0. Los datos resultantes se representaron como porcentaje de actividad frente al tiempo y se ajustaron a un modelo de descenso bifásico (Stone et al., 2010) para determinar las semividas (T^1/2). Se descubrió que la actividad de la enzima Mu-KYNU en PBS tenía una 1T^1/2 = 6 h con una amplitud de un 74 % de actividad restante y una posterior 2T^1/2 = 150 h (FIG. 7). Se determinó que la estabilidad de la enzima Mu-KYNU en suero humano combinado tenía un 1T^1/2 = 5 h con una amplitud de un 30 % de actividad restante y un posterior 2T i^/2 = 73 h (FIG. 7).

Ejemplo 17 - Construcción génica, expresión y purificación de quinureninasa de Chlamydophila pecorum

Se sintetizó un gen para la expresión de la enzima quinureninasa de Chlamydophila pecorum (Cp-KYNU) usando bloques génicos de codones optimizados de E. coli. El gen de longitud completa incluye un sitio para la enzima de restricción Ncol en el extremo N (nucleótidos 1-6), un codón de inicio (nucleótidos 3-5), una marca de His6 en el extremo N (nucleótidos 6-35), un gen Cp-KYNU de codones optimizados de E. coli (nucleótidos 36-1295), un codón de parada (nucleótidos 1296-1298) y un sitio para la enzima de restricción EcoRI en el extremo C (nucleótidos 1299­ 1304) (SEQ ID NO: 53). Los sitios para enzimas de restricción mencionados anteriormente se usaron para clonar el gen ensamblado en un vector pET-28a+ (Novagen). Esta construcción entonces se usó para transformar E. coli BL21 (DE3) para la expresión. Las células se cultivaron a 37 °C con agitación a 210 r.p.m. en medio Terrific Broth (TB) con 50 mg/l de canamicina. La expresión se indujo cuando se alcanzó una DO⁶⁰⁰ ~1,0 añadiendo IPTG (concentración final 0,5 mM) con agitación continuada durante la noche a 16 °C. Las células entonces se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en tampón de lisis que consistía en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, fosfato de piridoxilo (PLP) 0,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y 1 pg/ml de DNasa. La lisis se consiguió mediante prensa francesa y el lisado se aclaró de los particulados por centrifugación a 20000 x g durante 1 h a 4 °C. El sobrenadante entonces se filtró a través de un filtro de jeringa de 5 pm y se aplicó a una columna de Ni-NTA/agarosa (Qiagen) preequilibrada en fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y tampón PLP 0,1 mM. Después de cargar el lisado en la columna, la resina se lavó con 10 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 300 mM, y PLP 0,1 mM con imidazol 30 mM. La enzima lavada entonces se eluyó con 5 CV de PBS que contenía PLP 0,1 mM e imidazol 250 mM. Se intercambió el tampón de la enzima eluida a PBS fresco para eliminar el imidazol, se añadió glicerol al 10 % y se congelaron inmediatamente alícuotas en nitrógeno líquido para su almacenamiento a -80 °C.

Ejemplo 18 - Parámetros cinéticos de quinureninasa de Chlamydophila pecorum (Cp-KYNU)

Los parámetros cinéticos de Cp-KYNU (SEQ ID NO: 57) se cuantificaron mediante un ensayo espectrofotométrico, en que se controló el descenso en la absorbancia máxima del sustrato enzimático, L-quinurenina, como una función del tiempo. Se prepararon soluciones de L-quinurenina en tampón de PBS, pH 7,4, para producir concentraciones finales que varían de 16 pM a 500 pM. La L-quinurenina tiene un coeficiente de extinción de 4500 M ^cirr1 con una Amáx a 365 nm mientras que los productos de la reacción de quinureninasa, antranilato y L-alanina, no absorben apreciablemente a 365 nm. Las reacciones se iniciaron añadiendo y mezclando rápidamente soluciones enzimáticas (200 nM concentraciones finales) con las soluciones de sustrato y controlando la pérdida de sustrato a 25 °C midiendo Abs365 nm a lo largo del tiempo. Los datos resultantes se procesaron y ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten para determinar las constantes cinéticas. Se determinó que Cp-KYNU tiene una fcat/KM = 3 x 104 M 'V .

Ejemplo 19 - Preparación farmacológica de quinureninasa de Mucilaginibacter paludis

Para mejorar el tiempo en circulación de la enzima in vivo, se aumentó el radio hidrodinámico Mu-KYNU funcionalizando los grupos reactivos superficiales en la proteína por conjugación con PEG. En una realización, se PEGiló Mu-KYNU por reacción de los restos de lisina superficiales con carbonato de metoxi PEG succinimidilo de 5000 PM (NANOCS). Se determinó que la Mu-KYNU purificada contenía niveles de endotoxina muy bajos (<20 UE/mg) como se describe a continuación. Se intercambió completamente el tampón a tampón de fosfato de sodio 100 mM recién preparado, pH 8,4 y se concentró a más de un 1 mg/ml. La solución resultante se añadió directamente a un exceso molar de 100:1 de reactivo de PEG sólido y se permitió que reaccionara a temperatura ambiente durante 1 h con agitación. El PEG sin reaccionar se retiró de la solución por intercambio de todo el tampón a PBS sin endotoxina reciente en un dispositivo de filtración centrífuga de punto de corte de 100 kDa (Amicon). La masa molecular aparente de la enzima entonces se comprobó en una columna de HPLC de exclusión molecular (Phenomenex) en PBS usando una solución de patrón de MP de BioRad para generar una curva patrón, y se compararon los tiempos de retención enzimática con los de los patrones de proteína. Los niveles de endotoxina se cuantificaron usando el kit de ensayo de endotoxina cromógeno cinético Chromo-LAL (Associates of Cape Cod, Inc.).

Ejemplo 20 - Degradación de L-quinurenina potenciada en una variante de quinureninasa humana genomanipulada

La enzima fr-KYNU es muy selectiva hacia la hidrólisis de 3'-OH quinurenina y tiene una actividad catalítica aproximadamente 1000 veces inferior hacia L-quinurenina. A causa de su mala actividad catalítica hacia L-quinurenina, la enzima humana de tipo silvestre humana no es adecuada para fines terapéuticos. Para diseñar una actividad degradante de L-quinurenina mejorada en fr-KYNU, se construyó una colección por mutagénesis de saturación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extensión solapante usando el gen de fr-KYNU y un par de oligonucleótidos diseñados para introducir mutaciones en el codón correspondiente al aminoácido F306. F306 está ubicado dentro el sitio activo de fr-KYNU donde parece desempeñar una función en la unión al sustrato. La colección de saturación de F306 se cribó para la actividad usando el ensayo de quinureninasa en placa de microvaloración del ejemplo 6. Más de una docena de clones presentaban actividad significativa mayor que fr-KYNU de tipo silvestre y se seleccionaron para análisis adicional. La secuenciación de estos clones reveló que dos sustituciones de aminoácido en la posición F306 provocaban actividad degradante de L-quinurenina aumentada, concretamente fr-KYNU-F306M (SEQ ID NO: 55) y fr-KYNU-F306L (SEQ ID NO: 56). Estas variantes entonces se purificaron hasta homogeneidad y un análisis cinético detallado reveló un aumento de 2 veces a 5 veces en fcar/KM para L-quinurenina para fr-KYNU-F306M y fr-KYNU-F306L, respectivamente, en comparación con fr-KYNU de tipo silvestre.

Ejemplo 21 - Comparación de tratamientos con Pf-KYNU, anti-PD1 y anti-CTLA-4 en el modelo de melanoma de ratón B16 autólogo

Se evaluó la quinureninasa de Pseudomonas fluorescence PEGilada (PEG-Pf-KYNU) en el modelo de ratón de melanoma B16 en una comparación paralela con los anticuerpos inhibidores del punto de control inmunitario anti-PDI (clon RMP1-14, BioXCell n.° BE0146) o anti-CTLA-4 (clon UC10-4F10-11, BioXCell n.° BE0032). Se implantaron cincuenta mil células B16 en el flanco de ratones C57BL/B16 (día 0, n = 8 ratones cada grupo). Una vez se desarrollaron tumores palpables (día 10), los animales se trataron con 250 |jg de anti-PD1, 100 |jg de anti-CTLA-4 (200 jg la 1.a dosis según Holmgaard et al. (2013)) o 500 jg de PEG-Pf-KYNU en los tiempos mostrados (FIG. 8). Se usó PEG-Pf-KYNU inactivada con calor como control. La administración de PEG-Pf-KYNU provocó un retardo del crecimiento tumoral significativo y supervivencia prolongada de una manera indistinguible de la observada con los anticuerpos inhibidores del punto de control anti-PDI o anti-CTLA-4 (FIG. 8) para PEG-Pf-KYNU frente a la enzima inactivada o PBS únicamente.

Ejemplo 22 - Eficacia de tratamiento de combinación de Mu-KYNU o Pf-KYNU y anti-PD1 en el modelo de melanoma de ratón B16 autólogo

Las enzimas PEGiladas (PEG-Pf-KYNU y PEG-Mu-KYNU) se evaluaron en aloinjertos de melanoma B16 en combinación con el anticuerpo inhibidor del punto de control inmunitario anti-PDI (Curran et al., 2010). A cuatro grupos de ratones C57BL/6J (10 por grupo) se les implantó 50000 células B16 (día 0) y se permitió que se desarrollaran los tumores. Una vez se desarrollaron tumores palpables (día 10), los animales se trataron con 250 jg de anti-PD1 por inyección IP (clon RMP1-14, BioXCell n.° BE0146) en los días 10, 13 y 16 con o sin 500 jg de PEG-Pf-KYNU o 500 jg PEG-Mu-KYNU s.c. cerca del sitio del tumor. Los ratones recibieron un total de seis dosis de KYNU entre los días 10 y 25. A un grupo se le administro inyecciones de PBS i.p. como control para PD-1. El crecimiento del tumor se alteró drásticamente o incluso se invirtió en todos los brazos de tratamiento en comparación con el control de PBS (FIG. 9A). De forma importante, se observaron efectos aditivos con anti-PDI en combinación con KYNU, que provoca remisión completa de un 60 % de los tumores con tratamiento de PEG-Pf-KYNU/anti-PD1 y un 20 % de los tumores con tratamiento de PEG-Mu-KYNU/anti-PD1 (FIG. 9B). Los diagramas de Kaplan-Meier correspondientes se proporcionan en la FIG. 9C.

Ejemplo 23 - Eficacia de tratamientos de PEG-Mu-KYNU en el modelo de melanoma de ratón B16 autólogo

Se evaluó la quinureninasa de Mucilaginibacter paludis PEGilada (PEG-Mu-KYNU) en el modelo de ratón de melanoma B16. Se iniciaron aloinjertos implantando 50000 células B16 en los flancos de ratones C57BL/6J (día 0, n = 9 ratones por grupo). Una vez se desarrollaron tumores palpables (día 10), los animales se trataron con 500 |jg de PEG-Mu-KYNU por inyección subcutánea cerca el sitio del tumo cada tres días para un total de 6 dosis. Se usó un régimen de tratamiento idéntico con PEG-Mu-KYNU inactivada con calor como control. La administración de PEG-Mu-KYNU provocó retardo del crecimiento tumoral (FIG. 10A) con una mediana del tiempo de supervivencia prolongada de 25 días en comparación con 22 días para el control con PEG-Mu-KYNU inactivada por calor (FIG. 10B).

Todos los métodos divulgados en este documento pueden generarse y ejecutarse sin experimentación excesiva a la luz de la presente divulgación.

Referencias

Las siguientes referencias, en la medida en que proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles complementarios a los expuestos en este documento, se mencionan en este documento.

Patente de Estados Unidos n.° 4.870.287

Patente de Estados Unidos n.° 5.739.169

Patente de Estados Unidos n.° 5.760.395

Patente de Estados Unidos n.° 5.801.005

Patente de Estados Unidos n.° 5.824.311

Patente de Estados Unidos n.° 5.830.880

Patente de Estados Unidos n.° 5.846.945

Patente de Estados Unidos n.° 5.889.155

Patente de Estados Unidos n.° 7.109.304

Patente de Estados Unidos n.° 8.465.743

Publicación de patente de Estados Unidos 2009/0304666

Documento WO 2012/031744

Documento WO 2012/079000

Documento WO 2013/059593

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una quinureninasa o un ácido nucleico que codifica una quinureninasa, para su uso en un método para el tratamiento de un tumor en un sujeto.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que la quinureninasa comprende una quinureninasa de mamífero o bacteriana.

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que la quinureninasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 7-52 y 57.

4. La composición de la reivindicación 3, para su uso en un método de la reivindicación 3, en la que la quinureninasa comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 8 con una sustitución Phe3o6Met o Phe306Leu en la posición 306.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que la quinureninasa está acoplada a polietilenglicol.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que la quinureninasa comprende además un segmento peptídico heterólogo, preferiblemente en la que el segmento peptídico heterólogo es un péptido XTEN, un Fc de IgG, una albúmina o un péptido de unión a albúmina.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que la quinureninasa tiene mayor actividad catalítica hacia quinurenina que hacia 3'-OH quinurenina.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que la quinureninasa tiene una kcat/KM para quinurenina de al menos 0,5 M_1/s_1.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que el tumor es un tumor sólido.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que el tumor es un tumor hemático.

11. La composición de la reivindicación 1, para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico que codifica la quinureninasa es un vector de expresión.

12. La composición de acuerdo con la reivindicación 11, para su uso en un método de la reivindicación 1, en la que el vector de expresión que codifica la quinureninasa está comprendido en un linfocito T, en la que el linfocito T comprende además un receptor de linfocito T de antígenos quimérico expresado.