ES2708124T3 - Procedimiento para preparar moléculas heteromultiméricas - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para preparar un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, comprendiendo el procedimiento sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del 5 primer polipeptido de inmunoglobulina y sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del segundo polipeptido de inmunoglobulina para promover la formacion de un anticuerpo biespecifico, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en: (a) una IgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina; (b) una IgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina; (c) una IgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y (d) una IgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina, en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina.

Description

DESCRIPCION
Procedimiento para preparar moleculas heteromultimericas
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Campo de la Invencion
La presente invencion proporciona procedimientos para preparar moleculas heteromultimericas, tales como anticuerpos biespecificos, y composiciones que comprenden dichas moleculas. Los procedimientos incluyen la introduccion de sustituciones en aminoacidos que estan en contacto en la interfaz entre dos polipeptidos. Dichas sustituciones incluyen cambios en los aminoacidos que resultan en interacciones electrostaticas y/o hidrofobas/hidrofilas alteradas entre los polipeptidos que forman las moleculas heteromultimericas. Las sustituciones dan como resultado moleculas multimericas en las que se desfavorecen las moleculas homomultimericas, y se forman preferentemente moleculas heteromultimericas.
Tecnica Anterior
El sello distintivo de los anticuerpos monoclonales es su capacidad para unirse especificamente a un antigeno particular, lo que les permite unirse a su diana in vivo pero no a los sitios negativos para el antigeno. Una vez que se unen a una diana, los anticuerpos monoclonales terapeuticos pueden administrar una carga util toxica, actuar como agonistas o antagonistas de receptores, o como neutralizadores de ligandos. Los anticuerpos monoclonales tambien pueden modificarse para tolerarse inmunologicamente en mayor medida en varias especies. Una de tales modificaciones, que conlleva la sustitucion de aminoacidos en regiones estructurales con aminoacidos encontrados en humanos, es la humanizacion. Los anticuerpos humanizados pueden entonces modificarse aun mas. Una de tales modificaciones es armar el anticuerpo humanizado con mecanismos citotoxicos adicionales, ya sean radioisotopos, toxinas bacterianas, citoquinas inflamatorias, quimioterapeuticos o profarmacos.
Existe un numero creciente de terapias para el cancer aprobadas que son eficaces ya sea como un anticuerpo quimerizado (Rituximab) o lgG1 humanizada (Herceptin y Campath-1H), como conjugado con quimioterapeuticos (Mylotarg) o un radioisotopo (Zevalin y Bexxar). A pesar de este progreso, la eficacia de los anticuerpos monoclonales para el tratamiento del cancer es aun limitada, lo que deja un gran potencial para nuevas mejoras. Una clase de derivados de anticuerpos con la promesa de una potencia mejorada para el tratamiento del cancer son los anticuerpos biespecificos.
Los anticuerpos con una especificidad dual en sus brazos de union generalmente no ocurren en la naturaleza y, por lo tanto, se desarrollaron a traves de la tecnologia de ADN recombinante o fusion celular. La mayoria de los anticuerpos biespecificos estan disenados para reclutar eficazmente celulas efectoras citotoxicas del sistema inmunitario contra celulas diana patogenas. Despues de mas de 15 anos de investigacion exhaustiva, se han desarrollado muchos tipos diferentes de anticuerpos biespecificos, pero solo unos pocos han alcanzado los ensayos clinicos.
Entre los primeros anticuerpos biespecificos se disenaron construcciones para redirigir las celulas T contra las celulas diana del cancer. Las celulas diana se destruyen cuando los linfocitos T citotoxicos (CTL) se unen a las celulas tumorales y se activan simultaneamente por un brazo del anticuerpo biespecifico que interactua con el complejo receptor de celulas T (TCR)-CD3. Los CTL, que se consideran las celulas asesinas mas potentes del sistema inmunologico, no pueden activarse por anticuerpos monoclonales porque carecen de receptores Fey.
Otro tipo de anticuerpo biespecifico es el que se une simultaneamente a las celulas tumorales y un receptor de Fey activador, por ejemplo, CD64/FcyRI en monocitos. La union de este tipo de anticuerpo biespecifico a los receptores Fey puede provocar la activacion de celulas efectoras, sin competirse por la union simultanea de IgG normal.
Un procedimiento para generar anticuerpos biespecificos se ha denominado la estrategia "boton en ojal" (ver, por ejemplo, WO 2006/028936 , WO 98/50431 , US 2002/062010 ). El emparejamiento incorrecto de las cadenas pesadas de Ig se reduce en esta tecnologia mediante la mutacion de aminoacidos seleccionados que forman la interfaz de los dominios CH3 en la IgG humana. En las posiciones dentro del dominio CH3 en las que las dos cadenas pesadas interactuan directamente, se introduce un aminoacido con una pequena cadena lateral (ojal) en la secuencia de una cadena pesada y un aminoacido con una gran cadena lateral (boton) en la de la otra. Como resultado, se ha descrito que la interaccion de proteinas entre botones y ojales conduce a la formacion de hasta el 90% de la IgG humana biespecifica correcta por parte de las celulas huesped de mamiferos transfectadas. El documento WO 2007/147901 describe un procedimiento para producir anticuerpos biespecificos en los que las combinaciones de mutacion del dominio CH3 favorecen la formacion de heterodimeros electrostaticos.
La presente invencion proporciona procedimientos para formar preferentemente moleculas heteromultimericas mediante la mutacion de aminoacidos seleccionados que interactuan en la interfaz entre dos polipeptidos al reemplazar un residuo de aminoacido involucrado en interacciones hidrofilicas con un residuo de aminoacido mas hidrofobico y/o reemplazar un aminoacido involucrado en una interaccion de carga con otro aminoacido. Las moleculas heteromultimericas son anticuerpos biespecificos que se unen especificamente a VEGF y DLL4. Los documentos WO 2008/042236 y WO 2008/060705 divulgan anticuerpos anti-DLL4 y la terapia de combinacion de estos anticuerpos con anticuerpos anti-VEGF.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCION
La presente invencion proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, comprendiendo el procedimiento sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del primer polipeptido de inmunoglobulina y sustituyendo al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del segundo polipeptido de inmunoglobulina para promover la formacion de un anticuerpo biespecifico, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
La invencion tambien proporciona un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y
en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
La invencion tambien proporciona un anticuerpo biespecifico que comprende un primer polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:9.
La invencion tambien proporciona un polinucleotido que codifica los polipeptidos o anticuerpos mencionados anteriormente.
La invencion tambien proporciona una celula huesped que comprende el polinucleotido mencionado anteriormente. La invencion tambien proporciona un procedimiento para preparar un anticuerpo que comprende cultivar la celula huesped mencionada anteriormente en condiciones que dan como resultado la expresion del anticuerpo o polipeptido.
La invencion tambien proporciona el uso de dichos anticuerpos en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer y en el tratamiento del cancer.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1: La estructura de los dominios CH2 y CH3 del anticuerpo. La estructura se muestra en vista de cinta usando el programa de software Pymol (DeLano Scientific: LLC, California, EE. UU.) de la estructura del dominio fc del anticuerpo depositada en el PDB (archivo 1FC1) ( Deisenhofer.J. (1981) Biochemistry, 20, 2361-2370 ). Se muestran los dominios CH2 y CH3 de cada cadena en la estructura dimerica. La dimerizacion del fragmento Fc esta mediada a traves de las interacciones entre los dominios CH3.
Figura 2: La interfaz del dimero CH3. Se muestra una vista de estructura de cinta del dominio CH3. A la izquierda hay una imagen del dimero de dos dominios CH3. A la derecha hay una imagen de un solo dominio CH3 con representacion de las cadenas laterales de aminoacidos con potencial para participar en interacciones entre cadenas.
Figura 3: Los aminoacidos seleccionados estan involucrados en las interacciones entre cadenas. Se muestran tres vistas separadas del dominio CH3 dimerizado elegidas para ver mejor los residuos de aminoacidos particulares. La estructura se muestra en vista de cinta usando el programa de software Pymol (DeLano Scientific LLC, California, EE. UU.). Cada vista resalta los aminoacidos seleccionados que se postulan para contribuir al emparejamiento entre cadenas. Los aminoacidos individuales se destacan por la representacion de las cadenas laterales y por la notacion del aminoacido y la posicion. El esquema de numeracion es relativo a la region constante de lgG2 humana.
Figura 4: La alineacion de los isotipos de IgG humana. Se muestra una alineacion de la region constante de los isotipos de IgG humana lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4. El dominio CH3 esta indicado por lineas. Los aminoacidos individuales que se destacaron en la Figura 2 y la Figura 3 y se postulan para desempeharfunciones en las interacciones entre cadenas se indican mediante circulos rellenos.
Figura 5: Un formato de ensayo para evaluar la homodimerizacion y la heterodimerizacion. Para determinar la propension relativa de una variante de Fc a homodimerizar o heterodimerizar con otra variante de Fc, generamos una construccion de expresion de "mini-cuerpo" que codifica la region conectora y los dominios CH2-CH3 (aminoacidos 103-326 de la region constante de lgG2 humana) de lgG2 unida a una secuencia de serial N terminal y epitopo FLAG. Esta construccion, cuando se transfectan las celulas dirige la expresion de un dominio Fc dimerico secretado (aqui denominado "minicuerpo"). Como se revelo en el analisis de Western blot, el tamano del minicuerpo es sustancialmente mas pequeno que el tamano de un anticuerpo intacto producido al transfectar celulas con vectores de expresion que codifican cadenas pesadas y ligeras. La formacion de heterodimeros se puede evaluar mediante la transfeccion de una celula con vectores que codifican tanto el anticuerpo intacto como la construccion de dominio Fc del mini-cuerpo. La formacion de heterodimeros dara como resultado una molecula de tamano intermedio que contiene una cadena de minicuerpo y una cadena pesada de longitud completa complejada con una cadena ligera.
Figura 6: Variantes de anticuerpos queforman eficientemente dominios Fc heterodimericos. Se generaron plasmidos de vectores de expresion que codifican minicuerpos marcados con FLAG con dominios CH2 y CH3 de lgG2 humana natural (WT), y variantes (Var1, tambien denominada 13B, y Var2), una cadena pesada de longitud completa con dominios CH2 y CH3 de lgG2 humana natural (WT), o una variante (Var3/13A), y una cadena ligera de longitud completa (L2). Var1 contiene la sustitucion del aminoacido 249 Lys a Glu y la sustitucion del aminoacido 288 Lys a Glu dentro del dominio CH3. El anticuerpo Var2 contiene sustituciones del aminoacido 249 Lys a Glu, del aminoacido 286 Tyr a Phe y del aminoacido 288 Lys a Glu dentro del dominio CH3. El anticuerpo Var3 (tambien denominado 13A) contiene sustituciones del aminoacido 236 Glu a Lys y del aminoacido 278 Asp a Lys. Las celulas HEK293 se transfectaron transitoriamente con combinaciones de vectores de expresion como se indica. Se realizo un analisis Western blot no reductor con un anticuerpo anti-FLAG para revelar el tamano de los productos de anticuerpos secretados. La lgG2 humana natural exhibe facilmente homodimerizacion, como se muestra en el panel derecho donde se detecta facilmente el "minicuerpo" marcado con Flag expresado que contiene el dominio CH2-CH3 humano natural. El anticuerpo Var1 (13B) ha reducido enormemente la capacidad de homodimerizarse. El anticuerpo Var2 exhibe poca o ninguna capacidad para homodimerizarse. En el panel central y en el panel izquierdo, las variantes de minicuerpo se coexpresan con las variantes de cadena pesada de longitud completa, y se producen formas de anticuerpos heterodimeros. La coexpresion de la cadena pesada de longitud completa y el minicuerpo natural da como resultado la production de ambos homodimeros (como lo demuestra claramente el Western blot anti-FLAG en el panel central y las bandas de masa intermedias observadas en el Western blot anti-Fc en el panel derecho). Estos datos muestran que la coexpresion de Var1 (13B) y Var3 (13A) da como resultado una homodimerizacion preferencial, y que la coexpresion de Var2 y Var3 da como resultado una formation casi exclusiva de heterodimero.
Figura 7: La union de un anticuerpo biespecifico se une a dos dianas. Se realizo un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para examinar la capacidad de la variante de anticuerpo biespecifico (Var2-Var3) para unirse a los antigenos. Las placas de ELISA se recubrieron ya sea sin antigeno (-), con anticuerpo anti-FLAG (0,05 mg/ml, cion M2 de SIGMA) o con DLL4 humana recombinante (0,1 mg/ml) (aminoacidos 27-519 con marca carboxi-terminal 8xHis). Las placas recubiertas se incubaron luego con medio de cultivo celular de control (control negativo) o medio condicionado de celulas transfectadas con vectores de expresion que codifican Var2, Var3 y la cadena ligera L2 como se indica. Los resultados muestran que la variante de anticuerpo biespecifico producida por la coexpresion de las cadenas pesadas Var2 y Var3 y la cadena ligera L2 es capaz de unirse a DLL4, el anticuerpo reconocido por el anticuerpo natural original usado para generar Var3, y tambien de unirse al anticuerpo anti-FLAG debido a la marca del epitopo FLAG presentada por el brazo de la variante de cadena pesada Var2.
Figura 8: El Fab Anti-VEGF (219R0302) bloquea parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF. Las celulas HUVEC del dia 7 se seleccionaron para la inhibition de la proliferacion contra el fragmento Fab 219R0302 del anti-VEGF. Se utilizo M199- 2% FBS como medio de inanition y el volumen se normalizo a la concentration mas baja de la muestra de prueba. Se analizo el Fab 219R0302 contra varios anticuerpos de prueba, bevacizumab (Avastin) y VEGF humano recombinante como control.
Figura 9: El Fab Anti-VEGF (219R0302) bloquea la union del Fc VEGFR2 a superficie biacore de hVEGF. Se genero una superficie VEGF utilizando quimica estandar NHS/EDC en un chip CM5. El Fab 219R0302 o un Fab de control no ligador se hicieron fluir sobre la superficie y luego inmediatamente despues se inyecta VEGFR2. Como se muestra, VEGFR2 se unio bien a VEGF en el experimento del Fab de control y se bloqueo en el experimento del Fab 219R0302.
Figura 10: Las IgG anti-VEGF (219R0302y 219R0202) bloquean la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF en un grado similar al bevacizumab (Avastin). Las IgG 21R0302 y 219R0202 se reformatearon a lgG2, se expresaron y se purificaron para pruebas in vitro confirm atari as.
Figura 11: Los anticuerpos anti-VEGF 219R0302 y 219R0202 inhiben el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de tumor de mama PE13. Se inyectaron 300,000 celulas PE13 viables por via subcutanea en el flanco derecho de los ratones. El 219R0302 indujo un retraso en el crecimiento del tumor mas fuerte que el 219R0202. Avastin mostro el retraso de crecimiento mas potente, que era indistinguible del 219R0302, lo que indica que219R0302 y Avastin tienen una potencia casi equivalente en este modelo. A diferencia de 219R0302, 219R0202 fue estadisticamente diferente tanto de Avastin como de 219R0302.
Figura 12: Formatos de anticuerpos biespecificos. A) Anticuerpo biespecifico de un solo gen (SGBSP). En este formato, cada cadena ligera esta atada a su cadena pesada respectiva a traves de un conector de 30 aminoacidos (6XGGGGS); B) Anticuerpo biespecifico monovalente (MBSP). En este formato, se usa una cadena ligera comun, que puede derivarse de cualquiera de los anticuerpos originales. Una o ambas de las cadenas pesadas deben poder unirse a su diana en combination con una cadena ligera comun.
Figura 13: SGBSP y MBSP son mas del 90% de heterodimeros y el homodimero puede eliminarse variando la relacion Var3/Nar1. A) SGBSP (219R0202_21M18) y MBSP (219R0202 de cadena pesada (13AA/ar3), 21M18 de cadena pesada (13B/Var1), 21M18 de cadena ligera) purificados con proteina A son >90% puros y contienen una pequena fraccion del homodimero Var1 (SBBSP): Homodimero SGBSP 21M18 (13B/Var1); MBSP: 21M18 de cadena pesada (13B/Var1) con 21M18 de cadena ligera). Carril 1: Estandar, Carril 2: 21M18, Carril 3: MBSP, Carril 4: En bianco, Carril 5: SGBSP. Heterodimero MBSP pi ~ 7,1; homodimero MBSP 13A pi ~ 8,3; homodimero MBSP 13B pi ~ 6,2; heterodimero SGBSP pi ~ 7,8; homodimero SGBSP 13A pi ~ 8,6; homodimero SGBSP 13B pi ~ 6,4. B) La fraccion del homodimero MBSP 13B/Var1 se puede minimizar usando al menos un exceso molar de 2:1 veces de la cadena pesada 219R0202 (13A/Var3) a la cadena pesada 21M18 (13B/Var1). 13A:13B Relacion de HC: carril 1, 1:8; carril 2, 1:6; carril 3, 1:4; carril 4, 1:2; carril 5, 1:1; carril 6, 2:1; carril 7, 4:1; carril 8, 6:1; carril 9, 8:1; carril 10, escalera.
Figura 14: Los SGBSP bloquean parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF. Tanto el SGSPS 219R0302_21M18 como el 219R020221M18 inhibieron parcialmente la proliferacion de HUVEC inducida por VEGF, y este ultimo mostro una actividad significativamente mejor que el primero.
Figura 15: Los anticuerpos biespecificos se unen bien a las celulas transfectadas con hDLL4. LZ1, control de anticuerpos no especificos; SGBSP, 219R020221M18 anticuerpo biespecifico de gen unico; MBSP, 219R0202_21M18 anticuerpo biespecifico monovalente con 21M18 LC comun; Homo 13A, 219R0202 HC (con mutacion 13A) expresado solo con 21M18 LC; Homo 13B, 21M18 HC (con mutacion 13B) expresado solo con 21M18 LC. Las curvas de union se ajustaron a una transformada no lineal para obtener un valor de EC50, que se indica entre parentesis (NF, indica que no hay ajuste).
Figura 16: Tanto los SGBSP como MBSP se unen tanto a VEGF como DLL4 de manera biespecifica. Usando el ensayo de direccionamiento dual, tanto el 219R0302_21M18 como el 219R0202_21M18, tanto los SGBSP (panel A) como el MBSP (panel B) se muestran uniendose tanto a VEGF como a DLL4.
Figura 17: SGBSP muestra inhibicion parcial en el ensayo de proliferacion inducida por VEGF. SGBSP mostro una inhibicion parcial de la proliferacion inducida por VEGF en comparacion con los controles de bevacizumab (Avastin) y rhVEGF.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Se proporcionan procedimientos, composiciones y kits para generar polipeptidos heteromultimericos, tales como anticuerpos biespecificos. La invencion permite la generacion de moleculas heteromultimericas que tienen altos rendimientos. Los detalles de los procedimientos, composiciones y kits se proporcionan en el presente documento. Por "modo de realizacion" se pretende una caracteristica que no necesariamente debe tomarse por si sola para interpretar la invencion.
Un "heteromultimero", "complejo heteromultimerico", "polipeptido heteromultimerico", o "molecula heteromultimerica" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una molecula que comprende al menos un primer polipeptido y un segundo polipeptido, en la que el segundo polipeptido se diferencia en la secuencia de aminoacidos del primer polipeptido en al menos un residuo de aminoacido. El heteromultimero puede comprender un "heterodimero" formado por el primer y segundo polipeptidos o puede formar estructuras terciarias de orden superior en las que estan presentes mas polipeptidos ademas del primer y segundo polipeptidos.
Excepto cuando se indique lo contrario por el contexto, los terminos "primer" polipeptido y "segundo" polipeptido, y sus variaciones, son simplemente identificadores genericos, y no deben tomarse como identificacion de un polipeptido o componente especifico o particular de heteromultimeros de la invencion.
Los terminos "polipeptido", "peptido", "proteina" y "fragmento de proteina" se usan indistintamente en este documento para referirse a un polimero de residuos de aminoacidos. Los terminos se aplican a polimeros de aminoacidos en los que uno o mas residuos de aminoacidos son un mimetico quimico artificial de un aminoacido natural correspondiente, asi como a polimeros de aminoacidos naturales y polimeros de aminoacidos no naturales.
El termino "aminoacido" se refiere a aminoacidos naturales y sinteticos, asi como a analogos de aminoacidos y mimeticos de aminoacidos que funcionan de manera similar a los aminoacidos naturales. Los aminoacidos naturales son aquellos codificados por el codigo genetico, asi como aquellos aminoacidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los analogos de aminoacidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura quimica basica que un aminoacido natural, por ejemplo, un carbono alfa que esta unido a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfoxido, metionina metil sulfonio. Dichos analogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o esqueletos peptidicos modificados, pero retienen la misma estructura quimica basica que un aminoacido natural. Los mimeticos de aminoacidos se refieren a compuestos quimicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura quimica general de un aminoacido, pero que funciona de manera similar a un aminoacido natural. Los aminoacidos cargados negativamente incluyen acido aspartico (o aspartato) y acido glutamico (o glutamato). Los aminoacidos cargados positivamente incluyen arginina, histidina y lisina.
Como se usa en este documento, los terminos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en el sentido mas amplio e incluyen anticuerpos monoclonales (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos siempre que exhiban la actividad biologica deseada) y fragmentos de anticuerpos como se describe en el presente documento. El termino "anticuerpo biespecifico" pretende incluir cualquier anticuerpo que tenga dos especificidades de union diferentes, es decir, el anticuerpo se une a dos epitopos diferentes, que pueden ubicarse en el mismo antigeno diana o, mas comunmente, en antigenos diana diferentes.
Los anticuerpos nativos y las inmunoglobulinas son generalmente glicoproteinas heterotetramericas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) identicas y dos cadenas pesadas (H) identicas. Cada cadena ligera esta unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de una serie de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V l) y un dominio constante en su otro extremo. El dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos de aminoacidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia et al., J. Mol. Biol. 186, 651-66, 1985); Novotny and Haber, Proc. Natl Acad Sci. USA 82, 4592-4596 (1985 )). Cinco clases de inmunoglobulina humana se definen en base a su composicion de cadena pesada, y se denominan IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. Los anticuerpos de la clase IgG y clase IgA se dividen ademas en subclases, a saber, lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, e lgA1 e lgA2. Las cadenas pesadas en los anticuerpos IgG, IgA e IgD tienen tres dominios de region constante, que se designan CH1, CH2 y CH3, y las cadenas pesadas en los anticuerpos IgM e IgE tienen cuatro dominios de region constante, CH1, CH2, CH3 y CH4 . Por lo tanto, las cadenas pesadas tienen una region variable y tres o cuatro regiones constantes. La estructura y la funcion de la inmunoglobulina se revisan, por ejemplo, en Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988).
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden solo una porcion de un anticuerpo intacto, en los que la porcion retiene preferiblemente al menos una, preferiblemente la mayor parte o la totalidad, de las funciones normalmente asociadas con esa porcion cuando estan presentes en un anticuerpo intacto.
El termino "anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la poblacion son identicos, excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente especificos y se unen a un solo antigeno. Ademas, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales que tipicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un unico determinante en el antigeno. Que un anticuerpo se "une selectivamente" o "se une especificamente" significa que el anticuerpo reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, con mayor duracion, con mayor afinidad, o con alguna combinacion de lo anterior con un epitopo que con sustancias alternativas, incluidas las proteinas no relacionadas. "Se une selectivamente" o "se une especificamente" significa, por ejemplo, que un anticuerpo se une a una proteina con un valor de Kd de al menos aproximadamente 0,1 mM, pero mas generalmente de al menos aproximadamente 1 pM. "Se une selectivamente" o "se une especificamente" significa en ocasiones que un anticuerpo se une a una proteina a veces con un valor de Kd de al menos aproximadamente 0,1 pM o mejor, y otras veces de al menos aproximadamente 0,01 pM o mejor. Debido a la identidad de secuencia entre proteinas homologas en diferentes especies, la union especifica puede incluir un anticuerpo que reconozca una proteina marcadora de celulas tumorales en mas de una especie.
El termino "epitopo" o "determinante antigenico" se usan indistintamente en este documento y se refiere a la porcion de un antigeno capaz de ser reconocido y especificamente unido por un anticuerpo particular. Cuando el antigeno es un polipeptido, los epitopos pueden formarse a partir tanto de aminoacidos contiguos como de aminoacidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteina. Los epitopos formados a partir de aminoacidos contiguos se retienen tipicamente con la desnaturalizacion de proteinas, mientras que los epitopos formados por plegamiento terciario se pierden tipicamente con la desnaturalizacion de proteinas. Un epitopo tipicamente incluye al menos 3, y mas generalmente, al menos 5 u 8-10 aminoacidos en una conformacion espacial unica.
Los anticuerpos en este documento incluyen especificamente anticuerpos "quimericos" en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la (s) cadena (s) son identicas u homologas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, as! como a fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biologica deseada ( Patente de EE . UU. No. 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quimericos que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una region hipervariable del receptor se reemplazan por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), como raton, rata, conejo o primate no humano que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la region marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aun mas el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos de al menos uno, y tipicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente tambien comprendera al menos una porcion de una region constante de inmunoglobulina (Fc), tipicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mas detalles, vease Jones et al, Nature 321:522-525 (1986);Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); yPresta, Curr. Op. Struct Biol. 2:593-596 (1992 ). Vease tambien los siguientes articulos de revision y referencias citadas en los mismos: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem.
Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoacidos que corresponds a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha preparado usando cualquiera de las tecnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en este documento. Esta definicion de un anticuerpo humano excluye especificamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de union a antigeno no humanos.
Un anticuerpo de "afinidad madurada" es uno con una o mas alteraciones en una o mas de sus CDR que dan como resultado una mejoria en la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparacion con un anticuerpo original que no posee esas alteraciones. Los anticuerpos de afinidad madurada preferidos tendran afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antigeno diana. Los anticuerpos de afinidad madurada se producen mediante procedimientos conocidos en la tecnica. Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992 ), describe la maduracion de la afinidad por el barajado de los dominios VH y VL. Se describe la mutagenesis aleatoria de CDR y/o residuos estructurales por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809- 3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol.
155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
El termino "region Fc", como se usa en este documento, generalmente se refiere a un complejo de dimero que comprende las secuencias polipeptidicas C-terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina, en el que una secuencia polipeptidica C-terminal es aquella que se puede obtener mediante digestion con papaina de un anticuerpo intacto. La region Fc puede comprender secuencias Fc nativas o variantes. Aunque los limites de la secuencia Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la secuencia Fc de la cadena pesada de la IgG humana generalmente se extienden desde un residuo de aminoacido en la posicion Cys226 aproximadamente, o desde la posicion Pro230 aproximadamente, hasta el extremo carboxilo de la secuencia Fc. La secuencia Fc de una inmunoglobulina generalmente comprende dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente comprende un dominio CH4. Por "polipeptido Fc" en el presente documento se entiende uno de los polipeptidos que forman una region Fc. Se puede obtener un polipeptido Fc a partir de cualquier inmunoglobulina adecuada, como los subtipos lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4, IgA, IgE, IgD o IgM. En algunos modos de realizacion, un polipeptido Fc comprende parte o la totalidad de una secuencia bisagra natural (generalmente en su extremo N). En algunos modos de realizacion, un polipeptido Fc no comprende una secuencia bisagra funcional o natural.
La "region bisagra", "secuencia bisagra" y sus variaciones, como se usa en este documento, incluyen el significado conocido en la tecnica, que se ilustra, por ejemplo, en Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999 ); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415 ; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202 .
Tal como se usa en el presente documento, el termino "hibrida en condiciones rigurosas" pretende describir las condiciones para la hibridacion y el lavado en las que las secuencias de nucleotidos homologas entre si en al menos 60% permanecen tipicamente hibridadas entre si. En algunos modos de realizacion, las condiciones son tales que las secuencias homologas entre si en al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85% o el 90% tipicamente permanecen hibridadas entre si. Tales condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en la tecnica y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante de condiciones de hibridacion rigurosas es la hibridacion en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguida de uno o mas lavados en 0,2xSSC, 0,1% SDS a 50-65 °C.
El termino "citotoxina" o "agente citotoxico" como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que inhibe o impide la funcion de las celulas y/o causa la destruccion de las celulas. El termino pretende incluir isotopos radiactivos (por ejemplo, en 211 , I 131 , I 125, Y 90, Re 186 , Re 188, Sm 153, B i212, P 32 e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimasy sus fragmentos, como enzimas nucleoliticas, antibioticos, y toxinas como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluidos los fragmentos y/o variantes de los mismos, y los diversos agentes antitumorales o anticancerigenos descritos a continuacion. Otros agentes citotoxicos se describen a continuacion. Un agente tumoricida provoca la destruccion de las celulas tumorales.
"Farmaceuticamente aceptable" se refiere a aprobado o susceptible de aprobacion por una agenda reguladora del gobierno federal o estatal o listado en la Farmacopea de los EE. UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, incluidos los seres humanos.
"Vehiculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehiculo con el que se administra al menos un anticuerpo de la presente divulgacion.
Como se usa en este documento, el termino "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamifero), que incluye, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que sera el receptor de un tratamiento particular. Tipicamente, los terminos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.
El termino "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipeptido, polinucleotido, molecula organica pequena u otro farmaco eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un sujeto o mamifero. En el caso del cancer, la cantidad terapeuticamente eficaz del farmaco puede reducir el numero de celulas cancerosas; reducir el tamano del tumor; inhibir o detener la infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos, incluida, por ejemplo, la propagacion del cancer en tejidos blandosy huesos; inhibiry detener la metastasis tumoral; inhibiry detener el crecimiento del tumor; aliviar en cierta medida uno o mas de los sintomas asociados con el cancer, reducir la morbilidad y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; o una combinacion de tales efectos. En la medida en que el farmaco impida el crecimiento y/o elimine las celulas cancerosas existentes, se puede denominar citostatico y/o citotoxico.
Como se usa en el presente documento, los terminos "polinucleotido" o "acido nucleico" se refieren a un polimero compuesto de una multiplicidad de unidades de nucleotidos (ribonucleotido o desoxirribonucleotido o variantes estructurales relacionadas) unidas mediante enlaces fosfodiester, incluidos, entre otros, ADN o ARN. El termino abarca secuencias que incluyen cualquiera de los analogos de bases conocidos de ADN y ARN. Incluyendo, pero no limitado a, 4 acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilla, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil 2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxioxacilo, 5-metoxioxacacilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ester metilico del acido uracil-5-oxiacetico,acido uracil-5-oxiacetico, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2 tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico del acido 5-oxiacetico de N-uracilo, acido 5-oxiacetico de uracilo, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.
El termino "vector", como se usa en el presente documento, pretende referirse a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector del fago. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que segmentos de ADN adicionales pueden ligarse en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicacion y vectores episomicos de mamiferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamiferos no episomicos) pueden integrarse en el genoma de una celula huesped tras su introduccion en la celula huesped, y de este modo se replican junto con el genoma huesped. Ademas, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresion recombinantes" (o simplemente, "vectores recombinantes"). En general, los vectores de expresion de utilidad en tecnicas de ADN recombinante a menudo estan en forma de plasmidos. En la presente memoria descriptiva, "plasmido" y "vector" se pueden usar indistintamente, ya que el plasmido es la forma de vector mas comunmente utilizada.
Los polipeptidos heteromultimericos se pueden usar para tratar una variedad de trastornos. Un "trastorno" es cualquier afeccion que se beneficiaria del tratamiento con un anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades cronicas y agudas, incluidas aquellas afecciones patologicas que predisponen al mamifero al trastorno en cuestion. Los ejemplos no limitantes de trastornos a tratar en el presente documento incluyen trastornos de proliferacion celular; no leucemias y neoplasias linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitos, hipotalamicos y otros de tipo glandular, macrofago, epitelial, estromal y blastocelico; y trastornos inflamatorios, inmunologicos y otros relacionados con la angiogenesis. Los terminos "trastorno de proliferacion celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que estan asociados con cierto grado de proliferacion celular anormal. En un modo de realizacion, el trastorno de proliferacion celular es el cancer. "Tumor", como se usa en el presente documento, se refiere a todo el crecimiento y proliferacion de celulas neoplasicas, ya sean malignas o benignas, y todas las celulas y tejidos precancerosos y cancerosos.
En general, se usan antigenos especificos como dianas para los polipeptidos heteromultimericos. En un modo de realizacion, el antigeno es un antigeno tumoral. Un "antigeno tumoral", como se usa en este documento, incluye cualquier molecula que se expresa diferencialmente en una celula tumoral en comparacion con una celula normal. En algunos modos de realizacion, la molecula se expresa a un nivel detectable o significativamente mas alto o mas bajo en una celula tumoral en comparacion con una celula normal. En algunos modos de realizacion, la molecula exhibe un nivel de actividad biologica detectable o significativamente mas alto o mas bajo en una celula tumoral en comparacion con una celula normal. En algunos modos de realizacion, se sabe o se piensa que la molecula contribuye a una caracteristica tumorigenica de la celula tumoral. Numerosos antigenos tumorales son conocidos en la tecnica. Tambien se puede determinar si una molecula es un antigeno tumoral de acuerdo con tecnicas y ensayos bien conocidos por los expertos en la tecnica, como, por ejemplo, los ensayos clonogenicos, los ensayos de transformacion, los ensayos de formacion de tumores in vitro o in vivo, los ensayos de migracion en gel y el analisis de bloqueo genes, etc.
Los terminos "cancer" o "canceroso" se refieren o describen la condicion fisiologica en mamiferos que se caracteriza tipicamente por un crecimiento/proliferacion celular no regulada. Los ejemplos de cancer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma (p. Ej., Linfoma no Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos mas particulars de tales canceres incluyen cancer de celulas escamosas, carcinoma microcitico de pulmon, carcinoma pulmonar no microcitico, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon escamoso, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer de pancreas, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandula salival, cancer de rinon, cancer de higado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y varios tipos de cancer de cabeza y cuello.
Como se usa en el presente documento, "tratamiento" se refiere a la intervencion clinica en un intento de alterar el curso natural del individuo o la celula que se esta tratando, y se puede realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de la patologia clinica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen prevenir la aparicion o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los sintomas, la disminucion de cualquier consecuencia patologica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metastasis, disminuir la tasa de progresion de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad, y la remision o mejora del pronostico. En algunos modos de realizacion, los anticuerpos se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.
Una "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que sea eficaz, en dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapeutico o profilactico deseado. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" de un anticuerpo puede variar segun factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz es tambien una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial del anticuerpo se ve compensado por los efectos terapeuticamente beneficiosos.
En un aspecto, se proporcionan polipeptidos heteromultimericos que contienen sustituciones dentro de su dominio CH3 de inmunoglobulina Fc, en los que las sustituciones promueven la heterodimerizacion. Estas sustituciones comprenden la sustitucion de al menos un aminoacido en uno de los polipeptidos que contienen el dominio CH3. En un modo de realizacion, el aminoacido que se sustituye es un aminoacido cargado, o un aminoacido hidrofobo/hidrofilo.
En ciertos modos de realizacion, las sustituciones dentro del primer o segundo polipeptidos ocurren dentro de al menos un aminoacido en el que la cadena lateral se proyecta desde o esta posicionada de otra manera en la interfaz de un primer polipeptido con el segundo polipeptido y, por lo tanto, esta posicionada para interactuar con un aminoacido del segundo polipeptido que tambien se coloca en la interfaz de los dos polipeptidos. Por "interfaz" se entiende el lugar en el que los polipeptidos independientes entran en contacto entre si. En la Tabla 1 se muestran ejemplos pronosticados de aminoacidos ubicados en la interfaz de dos polipeptidos que contienen el dominio CH3. En un modo de realizacion, el cambio de la cadena lateral de aminoacidos de modo que se altera la interaction electrostatica entre el primer y segundo polipeptidos, sirve para estabilizar el heteromultimero y, con ello favorecer la formacion de heteromultimeros frente a la formacion de homomultimeros. Las moleculas de homomultimeros contendran moleculas cargadas similares y naturalmente se repeleran entre si. Las moleculas de heteromultimeros contienen pares de aminoacidos que tienen cadenas laterales que se atraeran, favoreciendo as! la formacion de heteromultimeros.
En un aspecto, se demuestra que la sustitucion de uno o mas de los aminoacidos ubicados en las posiciones 236, 245, 249, 278, 286 y 288, en uno de los polipeptidos que contienen el dominio CH3, conduce a una formacion de heteromultimero preferencial, relativa a la cantidad de homodimero formado. Las posiciones de aminoacidos enumeradas anteriormente son posiciones ubicadas dentro del dominio CH3 de lgG2 cuando los aminoacidos estan numerados comenzando con el inicio del dominio constante de cadena pesada de lgG2 humana (es decir, el extremo N-terminal de la secuencia CH1). La posicion del aminoacido es variable dentro de los cuatro isotipos de IgG, asi como entre IgG, IgA e IgD. Por lo tanto, las posiciones especificas de los aminoacidos no pretenden ser limitantes para el aminoacido ubicado en esa posicion especifica en una inmunoglobulina cualquiera, sino que mas bien pretenden abarcar los residuos de aminoacidos en todos los isotipos de inmunoglobulina en las posiciones correspondientes a las mencionadas para el dominio CH3 de la lgG2 humana. Dicha variabilidad del posicionamiento de aminoacidos dentro de los cuatro isotipos de IgG se muestra en la Tabla 1, y se muestra graficamente en las Figuras 2-4.
La formacion preferencial de polipeptidos heteromultimericos se logra seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de la carga y/o la hidrofobicidad del polipeptido en el sitio diana. Los aminoacidos se pueden agrupar de acuerdo con las similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (en A.L. Lehninger, en Biochemistry, segunda edition, pp. 73-75, Worth Publishers, Nueva York (1975 )):
(1) no polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) polar sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gin (Q)
(3) acido: Asp (D), Glu (E)
(4) basico: Lys (K), Arg (R), His (H)
Alternativamente, los residuos naturales se pueden dividir en grupos segun las propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofobico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie;
(2) hidrofilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) acido: Asp, Glu;
(4) basico: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromatico: Trp, Tyr, Phe.
En algunos modos de realizacion, los aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas se reemplazan con aminoacidos que tienen cadenas laterales acidas, o viceversa. Por ejemplo, los aminoacidos basicos lisina, arginina o histidina se reemplazan con acido aspartico o acido glutamico.
En algunos modos de realizacion, un aminoacido hidrofilo (o al menos un aminoacido relativamente hidrofilo) se sustituye con un aminoacido hidrofobo. Un ejemplo de este tipo de sustitucion es el reemplazo de un residuo de tirosina con una fenilalanina. En ciertos modos de realizacion, el reemplazo da como resultado la eliminacion de una cadena lateral hidroxilo en una posicion de aminoacido especifica en o cerca de la interfaz entre los polipeptidos que contienen el dominio CH3 y aumenta la hidrofobicidad en ese sitio.
Como se usa en este documento, "Var3" y "13A" se usan indistintamente para describir una variante que contiene una sustitucion de lisina por glutamato en la posicion 236 y una lisina por aspartato en la posicion 278. Tambien como se usa en el presente documento, "Var1" y "13B" se usan indistintamente para describir una variante que contiene una sustitucion de glutamato por lisina en la posicion 249 y un glutamato por lisina en la posicion 288.
En un modo de realizacion, el acido nucleico que codifica un aminoacido localizado en la interfaz se altera para que el primer polipeptido cambie la carga del emparejamiento de los iones de aminoacidos. Para lograr esto, el acido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoacido "original" en la interfaz del primer poli peptido se reemplaza con un acido nucleico que codifica al menos un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral cargada opuestamente con respecto al residuo de aminoacido original. Se apreciara que puede haber mas de un residuo original y sustituido correspondiente. El limite superior para el numero de residuos originales que se reemplazan es el numero total de residuos en la interfaz del primer y segundo poli peptido.
Por "acido nucleico original" se entiende el acido nucleico que codifica un primer o segundo poli peptido que se puede "alterar" (es decir, modificarse geneticamente). El acido nucleico original o de partida puede ser un acido nucleico natural o puede comprender un acido nucleico que se haya sometido a una alteracion previa (por ejemplo, un fragmento de anticuerpo humanizado). Por "alterar" el acido nucleico se entiende que el acido nucleico original se modifica reemplazando al menos un codon que codifica un residuo de aminoacido de interes. Las tecnicas para modificar geneticamente un ADN de esta manera se han revisado en Mutagenesis: a Practical Approach, MJ. McPherson, Ed., (IRL Press, Oxford, Reino Unido. (1991 ), e incluyen mutagenesis dirigida al sitio, mutagenesis en casete y mutagenesis por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), por ejemplo. Al modificar un acido nucleico original, un polipeptido original codificado por el acido nucleico original se altera asi de manera correspondiente.
El polipeptido heteromultimerico de la invencion es un anticuerpo biespecifico. En ciertos modos de realizacion, el anticuerpo biespecifico contiene el primer polipeptido que es un polipeptido de cadena pesada emparejado con un polipeptido de cadena ligera, y el segundo polipeptido que es un segundo polipeptido de cadena pesada emparejado con un segundo polipeptido de cadena ligera.
Se contemplan polipeptidos heteromultimericos con mas de dos valencias. Por ejemplo, los anticuerpos triespecificos tambien pueden prepararse usando los procedimientos descritos en el presente documento. (Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)).
En un modo de realizacion, el procedimiento comprende producir una molecula heteromultimerica, tal como un anticuerpo biespecifico, que utiliza una unica cadena ligera que puede emparejarse con los dos dominios variables de la cadena pesada presences en la molecula biespecifica. Para identificar esta cadena ligera, se pueden emplear varias estrategias. En un modo de realizacion, se identifica una serie de anticuerpos monoclonales a cada antigeno que puede ser atacado con el anticuerpo biespecifico, seguido de una determinacion de cual de las cadenas ligeras utilizadas en estos anticuerpos es capaz de funcionar cuando se combina con la cadena pesada de cualquiera de los anticuerpos identificados para la segunda diana. De esta manera, se puede identificar una cadena ligera que puede funcionar con dos cadenas pesadas para permitir la union a ambos antigenos. En otro modo de realizacion, las tecnicas de visualizacion, tales como la visualizacion de fagos, pueden permitir la identificacion de una cadena ligera que puede funcionar con dos o mas cadenas pesadas. En un modo de realizacion, se construye una biblioteca de fagos que consta de un repertorio diverso de dominios variables de cadena pesada y un unico dominio variable de cadena ligera. Esta biblioteca tambien puede utilizarse para identificar anticuerpos que se unen a varios antigenos de interes. Por lo tanto, en ciertos modos de realizacion, los anticuerpos identificados compartiran una cadena ligera comun.
En ciertos modos de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos comprenden al menos un Fv de cadena unica (scFv). En ciertos modos de realizacion, el polipeptido heteromultimerico comprende dos scFv. Por ejemplo, un scFv puede fusionarse con uno o ambos de un polipeptido que contiene el dominio CH3 contenido dentro de un poli peptido heteromultimerico. Algunos procedimientos comprenden producir una molecula biespecifica en los que una o ambas regiones constantes de la cadena pesada que comprenden al menos un dominio CH3 se utilizan junto con un dominio Fv de cadena unica para proporcionar la union al antigeno.
Las moleculas heteromultimericas pueden comprender dos brazos de union a antigeno de diferente especificidad. Por ejemplo, pueden generarse moleculas heteromultimericas que comprenden un primer polipeptido que es un brazo de union a antigeno (tal como una molecula de inmunoglobulina clasica) y un segundo polipeptido que es una proteina de fusion de inmunoglobulina. Un ejemplo de proteinas de fusion de inmunoglobulina utiles son las inmunoadhesinas.
Como se usa en el presente documento, el termino "inmunoadhesina" designa moleculas similares a anticuerpos que combinan el "dominio de union" de una proteina heterologa (una "adhesina", por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con el componente efector de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusion de la secuencia de aminoacidos de la adhesina con la especificidad de union deseada, es decir, que no es el sitio de reconocimiento y union de antigeno (sitio de combinacion de antigeno) de un anticuerpo (es decir, es "heterologo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia del dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se puede obtener de cualquier inmunoglobulina, tales como los subtipos lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4, IgA, IgE, IgD o IgM.
Se pueden generar polipeptidos heteromultimericos para unirse a cualquier antigeno o antigenos. En algunos modos de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos se unen a uno o mas antigenos seleccionados del grupo que consiste en: DLL4, VEGF, VEGFR2, Notchl, Notch2, Notch3, Notch4, Notch(pan), JAG1, JAG2, DLL(pan), JAG(pan), EGFR, ERBB2, ERBB3, ERBB(pan), c-Met, IGF-1R, PDGFR, Patched, polipeptidos de la familia Hedgehog, Hedgehog(pan), polipeptidos de la familia WNT, WNT(pan), FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, FZD(pan), LRP5, LRP6, CD20, IL-6, TNFalfa, IL-23, IL-17, CD80, CD86, CD3, CEA, Muc16, PSMA, PSCA, CD44, c-Kit, DDR1, DDR2, RSP01, RSP02, RSP03, RSP04, RSPO(pan), polipeptidos de la familia BMP, BMP(pan), BMPRIa, BMPRIb, y una combinacion de los mismos. Como se usa en este documento, "pan" pretende describir polipeptidos heteromultimericos que se unen a multiples antigenos de la misma familia. Por ejemplo, "Notch(pan)" pretende describir un polipeptido heteromultimerico que se une a mas de uno del grupo de Notchl, Notch2, Notch3 o Notch4.
En un modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico se une especificamente a DLL4 y VEGF.
En un modo de realizacion, se proporcionan anticuerpos que se unen a VEGF. En un modo de realizacion, se proporciona un anticuerpo (219R0302) que se une especificamente a VEGF, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYTFTNYWMH (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena pesada que comprende SINPSNGGTSYNEKFKR (SEQ ID NO:21) y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO:22); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende QASQDISNYVN (SEQ ID NO:23), una CDR2 de cadena ligera que comprende DASNLQT (SEQ ID NO:24) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYDDLPP (SEQ ID NO:25). En otro modo de realizacion, se proporciona un anticuerpo (219R0202) que se une especificamente a VEGF, en el que el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYTFTNYWMH (SEQ ID NO:20), una CDR2 de cadena pesada que comprende SINPSNGGTSYNEKFKR (SEQ ID NO:21) y una CDR3 de cadena pesada que comprende HYYDNSYAMDY (SEQ ID NO:22); y/o (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende RASQGINNHLAW (SEQ ID NO:26), una CDR2 de cadena ligera que comprende AASNLHS (SEQ ID NO:27) y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQYDNLPL (SEQ ID NO:28).
En un modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos VEGF y DLL4 comprenden un anticuerpo con la misma especificidad que 21M18 y bien 219R0302 o 219R0202. Estos polipeptidos heteromultimericos pueden producirse teniendo la cadena ligera unida a la cadena pesada, o usando una cadena ligera identica. En un modo de realizacion, los anticuerpos comprenden las sustituciones 13A/13B, como se describe en el presente documento, en su region Fc.
En un modo de realizacion, la secuencia de union de VEGF comprende la SEQ ID NO:17 o la SEQ ID NO:18. En un modo de realizacion, la secuencia de union de DLL4 comprende la SEQ ID NO:19. En otro modo de realizacion, el anticuerpo biespecifico comprende la secuencia de union a VEGF que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO:13 o la SEQ ID NO:15; y la secuencia de union de DLL4 que comprende la SEQ ID NO:19. En otro modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico comprende la secuencia de union de VEGF que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO:13; y la secuencia de union de DLL4 que comprende la SEQ ID NO:19. En un modo de realizacion adicional, el polipeptido heteromultimerico comprende la secuencia de union de VEGF que comprende la secuencia de la cadena pesada de la SEQ ID NO:11 y la secuencia de la cadena ligera de la SEQ ID NO:15; y la secuencia de union de DLL4 que comprende la SEQ ID NO:19.
En otro modo de realizacion, la secuencia de union de VEGF comprende un polipeptido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:10, 29 y 30. En un modo de realizacion, el polipeptido VEGF es un anticuerpo.
En algunos modos de realizacion, los polipeptidos o anticuerpos heteromultimericos son anticuerpos intactos tales como anticuerpos monoclonales o humanizados. En otro modo de realizacion, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos, tales como Fab o scFv. En un modo de realizacion, los anticuerpos/polipeptidos anti-VEGF inhiben el crecimiento tumoral.
Los polipeptidos heteromultimericos de la invencion tienen doble especificidad (bivalente) y son capaces de unirse a dos antigenos diferentes simultaneamente. En un modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos contienen dos sitios de combinacion de anticuerpos. En otro modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos son inmunoadhesinas bivalentes. Los diferentes antigenos pueden ubicarse en diferentes celulas o en la misma celula. La reticulacion del antigeno se puede mostrar in vitro, por ejemplo, proporcionando una superficie solida a la que se ha unido un primer antigeno, agregando un anticuerpo biespecifico especifico para el primer antigeno y un segundo antigeno para el cual la proteina de union tambien es especifica y detectando la presencia del segundo antigeno unido.
Los polipeptidos heteromultimericos pueden, en ciertos modos de realizacion, bloquear la interaccion entre dos receptores y sus respectivos ligandos. Por ejemplo, un anticuerpo biespecifico especifico para DLL4 y VEGF inhibe la migracion celular inducida por VEGF, asi como la senalizacion del receptor Notch. En este caso, la combinacion de dos especificidades de union al receptor es mas eficaz para inhibir la migracion celular que los anticuerpos originales individuales.
Las moleculas heteromultimericas tambien pueden ser monovalentes, lo que significa que tienen un sitio de union a antigeno. En un modo de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos monovalentes poseen un dominio variable, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 esta truncado de manera que no contiene un dominio variable. Estos segundos polipeptidos que contienen el dominio CH3 pueden poseer una etiqueta detectable. En un modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico monovalente contiene un epitopo FLAG. El epitopo FLAG es un epitopo sintetico que consta de ocho residuos de aminoacidos (DYKDDDDK). En otro modo de realizacion, el polipeptido heteromultimerico monovalente es una inmunoadhesina.
En un modo de realizacion, las moleculas heteromultimericas se producen en un primer formato denominado gen unico biespecifico (SGBSP). Para generar SBGSP, se usa un conector de 30 aminoacidos para unir, o enlazar, geneticamente, la cadena ligera a su cadena pesada ( vease, Lee et al. Mol. Immunol. 36:61-71 (1999 ). Por lo tanto, cada unidad de union SGBSP puede usar su propia cadena ligera para formar una unidad de union Fab que se une a su diana respectiva. En un modo de realizacion, los genes individuales tambien comprenden las mutaciones Var3/13A y Var1/13B. En un modo de realizacion, se usan anticuerpos anti-DLL4 y anti-VEGF para producir SGBSP. En un modo de realizacion, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se producen como SGBSP. En un modo de realizacion adicional, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se clonan con los mutantes 13B y 13A, respectivamente.
Las moleculas heteromultimericas de la invencion se producen en un segundo formato denominado biespecifico monovalente (MBSP). Los MBSP usan una cadena ligera comun con dos cadenas pesadas diferentes que comprenden las mutaciones Var3/13Ay Var1/13B. Para los MBSP, una o ambas cadenas pesadas deben unirse a su diana en combinacion con una cadena ligera comun. En algunos modos de realizacion, la cadena ligera comun es la cadena ligera original para una de las cadenas pesadas. En un modo de realizacion, se usan anticuerpos anti-DLL4 y anti-VEGF para producir SGBSP. En un modo de realizacion, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se producen como SGBSP. En un modo de realizacion adicional, las cadenas pesadas 21M18 y 219R0302/219R0202 se clonan con los mutantes 13By 13A, respectivamente.
Para expresar moleculas heteromultimericas de la invencion con combinaciones seleccionadas o aleatorias de dominios V l y V h, genes V que codifican esos dominios se ensamblan en un vector de expresion bacteriano. Por ejemplo, un vector puede ser usado que tiene secuencias que codifican una secuencia serial de secrecion bacteriana y un conector de peptidos y que tiene sitios de restriccion convenientes para la insercion de genes V l y V h. Alternativamente, podria ser deseable ensamblar primero todas las secuencias de codificacion necesarias (por ejemplo, serial de secrecion, V l, V h y el peptido conector) en una sola secuencia, por ejemplo mediante amplificacion por PCR usando cebadores que se solapan, seguido de la ligacion en un plasmido u otro vector. Cuando se desee proporcionar una combinacion especifica de dominios V l y V h, se usan cebadores de PCR especificos para las secuencias que codifican esos dominios. Cuando se desea crear diversas combinaciones de un gran numero de dominios V l y V h, se usan mezclas de cebadores para amplificar secuencias multiples.
Se dispone de vectores para la construccion y expresion de polipeptidos heteromultimericos de la invencion en bacterias que contienen secuencias de serial de secrecion y sitios de clonacion de restriccion convenientes. Las combinaciones de genes V l y V h que codifican los sitios de union especificos para un antigeno particular se aislan a partir de ADNc de hibridomas de celulas B. Alternativamente, combinaciones aleatorias de genes V l y V h se obtienen a partir de ADN genomico y los productos posteriormente cribados para la union a un antigeno de interes. Normalmente, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se emplea para la clonacion, utilizando cebadores que son compatibles con los sitios de restriccion en el vector de clonacion. Vease, por ejemplo, Dreher, M.L. et al. (1991) J. Immunol. Methods 139:197-205 ; Ward, E.S. (1993) Adv. Pharmacol. 24:1-20 ; Chowdhury, P.S. y Pastan, I. (1999) Nat. Biotechnol. 17:568-572 .
En un modo de realizacion, se proporcionan polinucleotidos que expresan los polipeptidos o anticuerpos descritos en el presente documento. En un modo de realizacion, se proporcionan polinucleotidos que se hibridan en condiciones rigurosas con los polinucleotidos que codifican los polipeptidos o anticuerpos. En un modo de realizacion, el polinucleotido comprende las secuencias de las SEQ ID NO:12, 14 o 16.
En un modo de realizacion, los anticuerpos biespecificos se preparan al expresar 1) un primer polipeptido que comprende un dominio variable de cadena pesada que corresponde a una primera especificidad conectada a un dominio variable de cadena ligera de una segunda especificidad; y 2) un segundo polipeptido que comprende un dominio variable de cadena ligera que corresponde a la primera especificidad conectada al dominio variable de cadena pesada de la segunda especificidad.
Para ciertos polipeptidos heteromultimericos, puede desearse la expresion en otras celulas huesped. Por ejemplo, los polipeptidos heteromultimericos que comprenden dominios constantes a menudo se expresan mas eficientemente en celulas eucariotas, incluidas celulas de levadura, insecto, vertebrado y mamifero. Sera necesario usar tales celulas donde se desee que el producto expresado este glicosilado. Los fragmentos de ADN que codifican el primer y segundo polipeptidos pueden clonarse, por ejemplo, en vectores de HCMV disenados para expresar cadenas ligeras humanas de cadenas pesadas humanas en celulas de mamiferos. (Vease, por ejemplo, Bendig, et al., Patente de Estados Unidos N° 5.840.299 ; Maeda, et al. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124-134 ). Tales vectores contienen el promotor y potenciador del citomegalovirus humano (HCMV) para la transcripcion de alto nivel de las construcciones de cadena ligera y cadena pesada. En un modo de realizacion preferido, el vector de expresion de la cadena ligera es pKN100 (cortesia del Dr. S. Tarran Jones, MRC Collaborative Center, Londres, Inglaterra), que codifica una cadena ligera kappa humana, y el vector de expresion de la cadena pesada es pG1D105 (cortesia de Dr. S. Tarran Jones), que codifica una cadena pesada gamma-1 humana. Ambos vectores contienen promotores y potenciadores de HCMV, origenes de replicacion y marcadores seleccionables funcionales en celulas de mamiferos y E. coli.
Un marcador seleccionable es un gen que codifica una proteina necesaria para la supervivencia o el crecimiento de celulas huesped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Los marcadores seleccionables tipicos codifican proteinas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotroficas, o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemase para Bacilli. Un marcador seleccionable particularmente util confiere resistencia al metotrexato. Por ejemplo, las celulas transformadas con el gen de seleccion de DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitive de DHFR. Una celula huesped apropiada cuando se emplea DHFR natural es la linea celular de ovario de hamster chino (CHO) deficiente en la actividad de DHFR, preparada y propagada segun lo descrito por Urlauby Chasin (1980) Proc. Natl Acad Sci. USA77, 4216 . Las celulas transformadas se exponen a continuacion a niveles aumentados de metotrexato. Esto conduce a la sintesis de multiples copias del gen DHFR y, concomitantemente, multiples copias de otros ADN que comprenden los vectores de expresion, como el ADN que codifica el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo. En otro ejemplo, las celulas de mieloma mutantes que son deficientes para la timidina quinasa (TK) no pueden usar la timidina suministrada de forma exogena cuando se usa aminopterina para bloquear la sintesis de ADN. Los vectores utiles para la transfeccion llevan un gen TK intacto que permite el crecimiento en medios suplementados con timidina.
Cuando se desea expresar una construccion genica en levadura, un gen de seleccion adecuado para uso en levadura es el gen trp1 presente en el plasmido de levadura YRp7. Stinchcomb et al., 1979 Nature, 282, 39 ; Kingsman et al., 1979, Gene 7, 141 . El gen trp1 proporciona un marcador de seleccion para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No.44076 o PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85,12 . La presencia de la lesion de trp 1 en el genoma de la celula huesped de la levadura proporciona un ambiente efectivo para detectar la transformacion por crecimiento en ausencia de triptofano. De manera similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan con plasmidos conocidos que llevan el gen Leu2.
Las celulas huesped preferidas para la transformacion de vectores y la expresion de anticuerpos de la presente invencion son celulas bacterianas, celulas de levadura y celulas de mamifero, por ejemplo, celulas COS-7, celulas de ovario de hamster chino (CHO) y lineas celulares de origen linfoide tales como celulas de linfoma, mieloma o hibridoma. Las celulas huesped transformadas se cultivan mediante procedimientos conocidos en la tecnica en un medio liquido que contiene fuentes asimilables de carbono, por ejemplo, carbohidratos, como glucosa o lactosa, nitrogeno, por ejemplo, aminoacidos, peptidos, proteinas o sus productos de degradacion, tales como peptonas, sales de amonio o similares, y sales inorganicas, por ejemplo, sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de sodio, potasio, magnesio y calcio. Ademas, el medio contiene, por ejemplo, sustancias que promueven el crecimiento, tales como oligoelementos, por ejemplo, hierro, zinc, manganeso y similares.
Las moleculas heteromultimericas encuentran uso en los procedimientos diagnosticos y terapeuticos descritos en este documento. En ciertos modos de realizacion, las moleculas descritas anteriormente se usan para detectar la expresion de una proteina marcadora de celulas tumorales en muestras biologicas como, por ejemplo, una biopsia de tejido del paciente, un derrame pleural o una muestra de sangre. Las biopsias de tejido pueden seccionarse y detectarse proteinas usando, por ejemplo, inmunofluorescencia o inmunohistoquimica. Ademas, se pueden aislar celulas individuales de una muestra y se puede detectar la expresion de proteinas en celulas fijas o vivas mediante analisis FACS. En ciertos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas se pueden usar en matrices de proteinas para detectar la expresion de un marcador de celulas tumorales, por ejemplo, en celulas tumorales, en lisados celulares o en otras muestras de proteinas. En ciertos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas de la presente invencion se usan para inhibir el crecimiento de celulas tumorales poniendo en contacto las moleculas heteromultimericas con celulas tumorales en ensayos basados en celulas in vitro, modelos animales in vivo , etc. En ciertos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas se usan para tratar el cancer en un paciente mediante la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula heteromultimerica contra uno o mas marcadores de celulas tumorales.
En algunos modos de realizacion, la molecula heteromultimerica es un anticuerpo biespecifico humanizado. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias minimas de anticuerpos no humanos (p. Ej. Roedor) dentro de la determinacion de antigeno o region hipervariable que comprenden las tres regiones de determinacion complementarias (CDR) dentro de cada cadena de anticuerpo. Dichos anticuerpos se usan terapeuticamente para reducir la antigenicidad y las respuestas HAMA (anticuerpo humano anti-raton) cuando se administran a un sujeto humano. En la practica, los anticuerpos humanizados son tipicamente anticuerpos humanos que tienen un minimo o practicamente ninguna secuencia no humana. Un anticuerpo humano es un anticuerpo producido por un humano o un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoacidos correspondiente a un anticuerpo producido por un humano.
Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Un anticuerpo se puede humanizar sustituyendo las CDR de un anticuerpo humano con las de un anticuerpo no humano (por ejemplo, raton, rata, conejo, hamster, etc.) que tengan la especificidad, afinidad y capacidad deseadas siguiendo los procedimientos de Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525 ; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327 ; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536 . El anticuerpo humanizado se puede modificar aun mas mediante la sustitucion de un residuo adicional ya sea en la region marco humana variable y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para refinary optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo.
La eleccion de los dominios variables humanos de la cadena pesada y/o ligera para usarse en la preparacion de anticuerpos humanizados puede ser importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el procedimiento de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza en base a la biblioteca completa de secuencias de aminoacidos de dominio variable humanas conocidas. Asi, en ciertos modos de realizacion, la secuencia de aminoacidos humanos que es mas homologa a la del anticuerpo de roedor del cual se toman las CDR se usa como la region marco (FR) humana para el anticuerpo humanizado ( Sims et al., 1993, J. Immunol., 151:2296; Chothia et al., 1987, J. Mol. Biol., 196:901 ). Otro procedimiento usa una FR particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas y se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes ( Carter et al., 1992, PNAS, 89; 4285 ; Presta et al. ., 1993, J. Immunol., 151:2623 ). En ciertos modos de realizacion, se usa una combinacion de procedimientos para seleccionar la FR variable humana para usarse en la generacion de anticuerpos humanizados.
Ademas, se entiende que los anticuerpos (por ejemplo, de roedor) que van a humanizarse deben conservar una alta afinidad por el antigeno, asi como otras propiedades biologicas favorables. Para lograr este objetivo, los anticuerpos humanizados pueden prepararse mediante un proceso de analisis de la secuencia original a partir del anticuerpo de roedor a humanizar y las diversas secuencias de humanizacion candidatas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales estan disponibles y son conocidos por los expertos en la tecnica. Los programas informaticos se pueden usar para ilustrary mostrar las estructuras conformacionales tridimensionales probables de las secuencias de anticuerpos candidatas seleccionadas. El uso de tales modelos permite el analisis del posible papel de los residuos en la funcion del anticuerpo a humanizar, es decir, el analisis de residuos que influyen en la capacidad del anticuerpo candidato para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse desde el anticuerpo original al anticuerpo humanizado receptor para que se logren las caracteristicas deseadas del anticuerpo. En general, los residuos en las CDR de la region de determinacion de antigeno (o region hipervariable) se conservan del anticuerpo original (por ejemplo, el anticuerpo de roedor con las propiedades de union a antigeno deseadas) en el anticuerpo humanizado para la union a antigeno. En ciertos modos de realizacion, al menos un residuo adicional dentro de la FR variable se retiene del anticuerpo original en el anticuerpo humanizado. En ciertos modos de realizacion, hasta seis residuos adicionales dentro de la FR variable se conservan del anticuerpo original en el anticuerpo humanizado.
Los aminoacidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras maduras de las inmunoglobulinas se designan Hx y Lx respectivamente, donde x es un numero que designa la posicion de un aminoacido segun el esquema de Kabat, Secuencias de proteinas de interes inmunologico, Departamento de los Estados Unidos de Salud y Servicios Humanos, 1987, 1991. Kabat enumera muchas secuencias de aminoacidos para anticuerpos para cada subgrupo, y enumera los aminoacidos mas comunes para cada posicion de residuo en ese subgrupo para generar una secuencia de consenso. Kabat usa un procedimiento para asignar un numero de residuo a cada aminoacido en una secuencia enumerada, y este procedimiento para asignar numeros de residuo se ha convertido en estandar en el campo. El esquema de Kabat es extensible a otros anticuerpos no incluidos en su compendio alineando el anticuerpo en cuestion con una de las secuencias de consenso segun Kabat por referenda a los aminoacidos conservados. El uso del sistema de numeracion de Kabat identifica facilmente los aminoacidos en posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un aminoacido en la posicion L50 de un anticuerpo humano ocupa la posicion equivalente a una posicion L50 de aminoacido de un anticuerpo de raton. Ademas, cualquiera de las dos secuencias de anticuerpos puede alinearse de manera unica, por ejemplo, para determinar el porcentaje de identidad, utilizando el sistema de numeracion de Kabat, de modo que cada aminoacido en una secuencia de anticuerpo este alineado con el aminoacido en la otra secuencia que tenga el mismo numero de Kabat. En algunos modos de realizacion, despues de la alineacion, si una region de anticuerpo en cuestion (por ejemplo, la region variable madura completa de una cadena pesada o ligera) se compara con la misma region de un anticuerpo de referenda, el porcentaje de identidad de secuencia entre las regiones del anticuerpo en cuestion y de referenda es el numero de posiciones ocupadas por el mismo aminoacido tanto en la region del anticuerpo en cuestion como de referenda, dividido entre el numero total de posiciones alineadas de las dos regiones, sin contar los espacios, multiplicado por 100 para convertirse a porcentaje.
Ademas de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos completamente humanos pueden prepararse directamente usando diversas tecnicas conocidas en la tecnica. Se pueden generar linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antigeno diana ( vease, por ejemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95 ; y Patente de Estados Unidos 5.750.373 ). Ademas, el anticuerpo humano se puede seleccionar de una biblioteca de fagos, donde esa biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos ( Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314 ; Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l. Acad. Sci., 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanos tambien se pueden producir en ratones transgenicos que contienen loci de inmunoglobulina humana que son capaces con la inmunizacion de producir todo el repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena. Este enfoque se describe en las patentes estadounidenses 5.545.807 ; 5.545.806 ; 5.569.825 ; 5.625.126 ; 5.633.425 ; y 5.661.016 .
Esta invencion engloba anticuerpos biespecificos que reconocen especificamente VEGF y DLL4. Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que son capaces de reconocer y unirse especificamente a al menos dos epitopos diferentes ( vease, por ejemplo, Wu et al., Simultaneous Targeting of Multiple Disease Mediators by a Dual-Variable-Domain Immunoglobulin, Nature Biotech., 25(11):1290-97 ). Los diferentes epitopos pueden estar dentro de la misma molecula (por ejemplo, el mismo polipeptido marcador tumoral) o en moleculas diferentes, de modo que ambos, por ejemplo, pueden reconocer y unirse especificamente a un marcador de celulas tumorales tambien. Los anticuerpos biespecificos pueden ser anticuerpos intactos o fragmentos de anticuerpos.
Los anticuerpos biespecificos ejemplares pueden unirse a dos epitopos diferentes. Los anticuerpos biespecificos tambien se pueden usar para dirigir agentes citotoxicos a celulas que expresan un antigeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de union a antigeno y un brazo que se une a un agente citotoxico o un quelante de radionuclidos, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Las tecnicas para producir anticuerpos biespecificos son comunes en la tecnica ( Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539 ; Brennan et al., 1985, Science 229:81 ; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120 ; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659 ; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225 ; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547 -1553 ; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368 ; y Patente de Estados Unidos 5.731.168 ). Tambien se contemplan anticuerpos con mas de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecificos ( Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991 ))
En ciertos modos de realizacion, se proporciona un fragmento del polipeptido heteromultimerico para, por ejemplo, aumentar la penetracion en el tumor. Se conocen varias tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos: Tradicionalmente, estos fragmentos se obtienen a traves de la digestion proteolltica de anticuerpos intactos (por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 ; Brennan et al., 1985, Science, 229:81 ). En ciertos modos de realizacion, los fragmentos de anticuerpo se producen de forma recombinante. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden expresarse y secretarse a partir de E. coli u otras celulas huesped, lo que permite la produccion de grandes cantidades de estos fragmentos. Dichos fragmentos de anticuerpos tambien pueden aislarse a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos discutidas anteriormente. El fragmento de anticuerpo tambien puede ser un anticuerpo lineal como se describe en la patente de EE. UU .5.641.870, por ejemplo, y puede ser monoespecifico o biespecifico. Otras tecnicas para la produccion de fragmentos de anticuerpos seran evidentes para el experto en la tecnica.
Ademas, puede ser deseable, especialmente en el caso de fragmentos de anticuerpos, modificar una molecula heteromultimerica para aumentar su vida media en suero. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporacion de un epitopo de union al receptor de rescate en la molecula heteromultimerica mediante la mutacion de la region apropiada o mediante la incorporacion del epitopo en una marca peptidica que luego se fusiona con la molecula heteromultimerica en cualquier extremo o en el medio (p. ej., por sintesis de ADN o peptidos).
Debe apreciarse que los anticuerpos modificados pueden comprender cualquier tipo de region variable que proporcione la asociacion del heteromultimero con los polipeptidos de interes. A este respecto, la region variable puede comprender o derivarse de cualquier tipo de mamifero que se pueda inducir para montar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antigeno asociado al tumor deseado. Como tal, la region variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de origen humano, murino, primate no humano (por ejemplo, Macaca fascicularis, macacos, etc.) o lupino. En algunos modos de realizacion, tanto la region variable como la constante de las inmunoglobulinas modificadas son humanas. En otros modos de realizacion, las regiones variables de anticuerpos compatibles (generalmente derivadas de una fuente no humana) pueden disenarse o adaptarse especificamente para mejorar las propiedades de union o reducir la inmunogenicidad de la molecula. A este respecto, las regiones variables pueden humanizarse o alterarse de otro modo mediante la inclusion de secuencias de aminoacidos importadas.
Los dominios variables en las cadenas pesada y ligera se alteran al menos al reemplazar parcialmente una o mas CDR y, si es necesario, al reemplazar parcialmente la region marco y con el cambio de secuencia. Aunque las CDR pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que se derivan las regiones marco, se preve que las CDR derivaran de un anticuerpo de diferente clase y preferiblemente de un anticuerpo de diferente especie. Puede que no sea necesario reemplazar todas las CDR con las CDR completas de la region variable donante para transferir la capacidad de union al antigeno de un dominio variable a otro. Mas bien, puede que solo sea necesario transferir aquellos residuos que son necesarios para mantener la actividad del sitio de union al antigeno. Dadas las explicaciones expuestas en la patente de EE.UU. Nos. 5.585.089,5.693.761 y 5.693.762 , estara sobradamente al aclance de los expertos en la tecnica, ya sea mediante experimentacion rutinaria o mediante pruebas de prueba y error para obtener un anticuerpo funcional con inmunogenicidad reducida.
A pesar de las alteraciones en la region variable, los expertos en la tecnica apreciaran que los heteromultimeros modificados pueden comprender anticuerpos, o fragmentos inmunorreactivos de los mismos, en los cuales al menos una fraccion de uno o mas de los dominios de la region constante se han eliminado o alterado de otro modo para proporcionar las caracteristicas bioquimicas deseadas, tales como una mayor localizacion del tumor o una vida media en suero reducida cuando se compara con un anticuerpo de aproximadamente la misma inmunogenicidad que comprende una region constante nativa o inalterada. En algunos modos de realizacion, la region constante de los anticuerpos modificados comprendera una region constante humana. Las modificaciones a la region constante comprenden adiciones, eliminaciones o sustituciones de uno o mas aminoacidos en uno o mas dominios. Es decir, los heteromultimeros modificados descritos en el presente documento pueden comprender alteraciones o modificaciones en uno o mas de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) y/o en el dominio constante de cadena ligera (CL). En algunos modos de realizacion, se contemplan regiones constantes modificadas en las que uno o mas dominios se eliminan parcial o totalmente. En algunos modos de realizacion, los anticuerpos modificados comprenderan construcciones de dominio eliminado o variantes en las que se ha eliminado el dominio CH2 completo (construcciones ACH2). En algunos modos de realizacion, el dominio de region constante omitido se reemplazara por un espaciador corto de aminoacidos (por ejemplo, 10 residuos) que proporciona parte de la flexibilidad molecular impartida tipicamente por la region constante ausente.
Se cree que los polipeptidos heteromultimericos que comprenden regiones constantes modificadas como se describe en el presente documento proporcionan funciones efectoras alteradas que, a su vez, afectan el perfil biologico del polipeptido administrado. Por ejemplo, la eliminacion o inactivacion (mediante mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de region constante puede reducir la union del receptor Fc del anticuerpo modificado circulante, aumentando asi la localizacion del tumor. En otros casos, puede ser que las modificaciones de la region constante moderen la union del complemento y, por lo tanto, reduzcan la vida media en suero y la asociacion no especifica de una citotoxina conjugada. Aun otras modificaciones de la region constante se pueden usar para eliminar enlaces disulfuro o restos de oligosacaridos que permiten una mejor localizacion debido al aumento de la especificidad del antigeno o la flexibilidad del anticuerpo. De manera similar, las modificaciones de la region constante de acuerdo con esta invencion pueden hacerse facilmente usando tecnicas de ingenieria molecular o bioquimica bien conocidas dentro del alcance del experto en la tecnica.
La invencion tambien se refiere a moleculas heteromultimericas que comprenden un polipeptido heteromultimerico conjugado a un agente citotoxico. Los agentes citotoxicos incluyen agentes quimioterapeuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, o fragmentos de las mismas), isotopos radioactivos (es decir, un radioconjugado), etc. Agentes quimioterapeuticos utiles en la la generacion de tales inmunoconjugados incluyen, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes. Entre las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas se pueden usar la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no ligadores de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina, la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfa-sarcina, las proteinas Aleurites fordii, las proteinas diantina, las proteinas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcin, crotin, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restricocin, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.. En algunos modos de realizacion, las moleculas heteromultimericas pueden conjugarse a radioisotopos, tales como 90 Y ,1251,1311,1231,111 In ,105 R h,153 Sm, 67 Cu, 67 Ga, 166 Ho, 177 Lu, 186 Re y 188 Re usando de cualquiera de una serie de quelantes conocidos o con etiquetado directo. En otros modos de realizacion, las composiciones descritas pueden comprender moleculas heteromultimericas acopladas a farmacos, profarmacos o linfocinas tales como interferon. Los conjugados de la molecula heteromultimerica y el agente citotoxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteinas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridididiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (como dimetilo adipimidato HCL), esteres activos (como disuccinimidil suberato), aldehidos (como glutareldehido), compuestos bis-azido (como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (como toleno 2,6-diisocianato), y compuestos de fluor bis-activos (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Tambien se pueden usar conjugados de un anticuerpo y una o mas toxinas de molecula pequena, como caliqueamicina, maitansinoides, tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad toxina. En algunos modos de realizacion, los polipeptidos heteromultimericos pueden formar complejos con otros ligandos inmunologicamente activos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos) en los que la molecula resultante se une tanto a la celula neoplastica como a una celula efectora tal como una celula T.
Independientemente de como se obtienen las cantidades utiles, los polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion se pueden usar en cualquiera de una serie de formas conjugadas (es decir, un inmunoconjugado) o no conjugadas. Alternativamente, los polipeptidos heteromultimericos de esta invencion pueden usarse en una forma no conjugada o "desnuda" para aprovechar los mecanismos de defensa natural del sujeto, incluida la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para eliminar las celulas malignas. La seleccion de que polipeptido heteromultimerico conjugado o no conjugado se utilizara dependera del tipo y estadio del cancer, el uso de un tratamiento complementario (por ejemplo, quimioterapia o radiacion externa) y el estado del paciente. Se apreciara que un experto en la tecnica podria realizar facilmente tal seleccion en vista de las ensenanzas del presente documento.
Los polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion pueden ensayarse para determinar la union inmunoespecifica mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Los inmunoensayos que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan tecnicas como el analisis BIAcore, el analisis FACS, la inmunofluorescencia, la inmunocitoquimica, las transferencias de Western blot, los radioinmunoensayos, ELISA, los inmunoensayos "sandwich", los ensayos de inmunoprecipitacion reacciones de precipitina, reacciones de difusion de gel precipitina, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion del complemento, ensayos inmunoradiometricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos de proteina A. Tales ensayos son rutinarios y bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York ).
En algunos modos de realizacion, la inmunoespecificidad de un poli peptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales se determina usando ELISA. Un ensayo ELISA comprende preparar antigeno, recubrir los pocillos de una placa de microtitulacion de 96 pocillos con antigeno, agregar el anticuerpo contra un marcador de celulas tumorales conjugado a un compuesto detectable como un sustrato enzimatico (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina) al pocillo, incubar por un periodo de tiempo y detectar la presencia del antigeno. En algunos modos de realizacion, la molecula heteromultimerica que se une a un marcador de celulas tumorales no se conjuga a un compuesto detectable, sino que se agrega al pocillo un segundo anticuerpo conjugado que reconoce el polipeptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales. En algunos modos de realizacion, en lugar de recubrir el pocillo con el antigeno, el anticuerpo contra un marcador de celulas tumorales puede recubrirse en el pocillo y se puede agregar un segundo anticuerpo conjugado con un compuesto detectable despues de la adicion del antigeno al pocillo recubierto. Un experto en la tecnica conocera los parametros que pueden modificarse para aumentar la serial detectada, asi como otras variaciones de los ELISA conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York en 11.2.1 ).
La afinidad de union de un polipeptido heteromultimerico por un antigeno de celulas tumorales y la tasa de desactivacion de una interaccion heteromultimero-antigeno pueden determinarse mediante ensayos de union competitiva. Un ejemplo de un ensayo de union competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubacion de un antigeno marcado (por ejemplo, 3 H o 125 I), o un fragmento o variante del mismo, con el polipeptido heteromultimerico de interes en presencia de cantidades crecientes de antigeno no marcado seguido de la deteccion del polipeptido heteromultimerico unido al antigeno marcado. La afinidad del polipeptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales y las tasas de desintegracion de la union pueden determinarse a partir de los datos mediante analisis del grafico de Scatchard. En algunos modos de realizacion, el analisis cinetico BIAcore se usa para determinar las tasas de union y desactivacion de un polipeptido heteromultimerico contra un marcador de celulas tumorales. El analisis cinetico BIAcore comprende analizar la union y disociacion de anticuerpos de chips con antigenos marcadores de celulas tumorales inmovilizadas en su superficie.
En otro aspecto de la invencion, los anticuerpos pueden estar ligados quimica o biosinteticamente a agentes antitumorales o agentes productores de senales detectables. Los agentes antitumorales unidos a un anticuerpo incluyen cualquier agente que destruya o dane un tumor al que el anticuerpo se haya unido o en el entorno de la celula a la que se ha unido el anticuerpo. Por ejemplo, un agente antitumoral es un agente toxico, como un agente quimioterapeutico o un radioisotopo. Los agentes quimioterapeuticos adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen antraciclinas (por ejemplo, daunomicina y doxorubicina), metotrexato, vindesina, neocarzinostatina, cis-platino, clorambucilo, arabinosido de citosina, 5-fluorouridina, micalanina, ricina y calicicina. Los agentes quimioterapeuticos se conjugan al anticuerpo utilizando procedimientos convencionales (ver, por ejemplo, Hermentin y Seiler (1988) Behring Inst. Mitt. 82, 197-215).
Los agentes que producen senales detectables son utiles in vivo e in vitro para fines de diagnostico. El agente que produce la serial produce una serial medible que es detectable por medios externos, generalmente la medicion de la radiacion electromagnetica. En su mayor parte, el agente productor de serial es una enzima o cromoforo, o emite luz por fluorescencia, fosforescencia o quimioluminiscencia. Los cromoforos incluyen colorantes que absorben la luz en la region ultravioleta o visible, y pueden ser sustratos o productos de degradacion de reacciones catalizadas por enzimas.
La invencion contempla ademas polipeptidos heteromultimericos a los que estan unidos restos diana o informadores. Los restos diana son los primeros miembros de los pares de union. Los agentes antitumorales, por ejemplo, se conjugan a segundos miembros de dichos pares y, por lo tanto, se dirigen al sitio donde se une el anticuerpo. Un ejemplo comun de dicho par de union es la avidina y la biotina. En un modo de realizacion, la biotina se conjuga con un polipeptido heteromultimerico de la invencion, y de este modo proporciona una diana para un agente antitumoral u otro resto que se conjuga a avidina o estreptavidina. Alternativamente, la biotina u otro resto de este tipo esta vinculado a un polipeptido heteromultimerico de la invencion y se usa como informador, por ejemplo, en un sistema de diagnostico en el que un agente productor de serial detectable esta conjugado a avidina o estreptavidina.
Los polipeptidos heteromultimericos pueden administrarse para tratamientos terapeuticos a un paciente que padece un tumor en una cantidad suficiente para prevenir o reducir la progresion del tumor, por ejemplo, el crecimiento, invasividad, metastasis y/o recurrencia del tumor. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una dosis terapeuticamente eficaz. Las cantidades eficaces para este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y del estado general del propio sistema inmunologico del paciente. Los esquemas de dosificacion tambien variaran con el estado de la enfermedad y el estado del paciente, y tipicamente variaran desde una dosis de bolo unico o infusion continua hasta multiples administraciones por dia (por ejemplo, cada 4-6 horas), o segun lo indique el medico que lo trata La condicion del paciente. Los anticuerpos de la invencion se pueden administrar en dosis unicas de hasta 40 mg/kg de peso corporal o mas. Mas preferiblemente, los anticuerpos se administran en dosis que varian de 0,2 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal. Debe observarse, sin embargo, que la presente invencion no se limita a ninguna dosis particular.
La presente invencion se puede usar para tratar cualquier tumor adecuado, que incluye, por ejemplo, tumores de mama, corazon, pulmon, intestino delgado, colon, bazo, rinon, vejiga, cabeza y cuello, ovario, prostata, cerebro, pancreas, piel, hueso, medula osea, sangre, timo, utero, testiculos, cuello uterino o higado.
Las formulaciones se preparan para el almacenamiento y uso combinando un polipeptido heteromultimerico purificado de la presente invencion con un vehiculo farm ace uticamente aceptable (por ejemplo, vehiculo, excipiente) ( Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a edicion, Mack Publishing, 2000 ). Los vehiculos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, tampones no toxicos tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; sales tales como cloruro de sodio; antioxidantes incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (por ejemplo, cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; alcohol fenol, butilico o bencilico; alquilparabenos, tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, menos de aproximadamente 10 residuos de aminoacidos); proteinas tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas; polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; carbohidratos tales como monosacchandes, disacaridos, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azucares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como el sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de proteina Zn); y tensioactivos no ionicos tales como TWEEN o polietilenglicol (PEG).
La composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar de varias formas para tratamiento local o sistemico. La administracion puede ser topica (por ejemplo, a las membranas mucosas, incluida la administracion vaginal y rectal), como parches transdermicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, liquidos y polvos; pulmonar (por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles, incluso por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidermica y transdermica); oral; o parenteral, incluida la inyeccion o infusion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal o intramuscular; o administracion intracraneal (por ejemplo, intratecal o intraventricular).
La formulacion terapeutica puede estar en forma de dosificacion unitaria. Tales formulaciones incluyen comprimidos, pildoras, capsulas, polvos, granulos, soluciones o suspensiones en agua o medios no acuosos, o supositorios para administracion oral, parenteral o rectal o para administracion por inhalacion. En composiciones solidas tales como tabletas, el ingrediente activo principal se mezcla con un vehiculo farmaceutico. Los ingredientes de comprimidos convencionales incluyen almidon de maiz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, acido estearico, estearato de magnesio, fosfato o gomas dicalcico y otros diluyentes (por ejemplo, agua) para formar una composicion solida de preformulacion que contiene una mezcla homogenea de un compuesto de la presente invencion, o una sal no toxica farmaceuticamente aceptable de los mismos. La composicion de preformulacion solida se subdivide luego en formas de dosificacion unitaria del tipo descrito anteriormente. Los comprimidos, pildoras, etc. de la nueva composicion pueden recubrirse o combinarse de otra manera para proporcionar una forma de dosificacion que ofrezca la ventaja de una accion prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender una composicion interna cubierta por un componente externo. Ademas, los dos componentes pueden separarse por una capa enterica que sirve para resistirse a la desintegracion y permite que el componente interno pase intacto a traves del estomago o se retrase en la liberacion. Se puede usar una variedad de materiales para tales capas o recubrimientos entericos, incluyendo tales materiales varios acidos polimericos y mezclas de acidos polimericos con materiales tales como laca, alcohol cetilico y acetato de celulosa.
Las formulaciones farmaceuticas incluyen polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion complejados con liposomas ( Epstein y otros, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 ; Hwang, y otros, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 y Patente de los Estados Unidos 4.485; 045 y 4.544.545 ). Los liposomas con tiempo de circulacion mejorado se describen en la Patente de Estados Unidos 5.013.556. Algunos liposomas se pueden generar por evaporacion de fase inversa con una composicion lipidica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada de PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a traves de filtros de tamano de poro definido para producir liposomas con el diametro deseado.
Los polipeptidos heteromultimericos tambien se pueden atrapar en microcapsulas. Dichas microcapsulas se preparan, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina y microcapsulas de poli- (metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion de farmacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nano-particulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones como se describe en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000 ).
Ademas se pueden preparar preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polimeros hidrofobos solidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices estan en forma de articulos conformados (por ejemplo, peliculas o microcapsulas). Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles tales como poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol de vinilo), polilactidas ( patente de EE . UU. 3.773.919 ), copolimeros de acido L-glutamico y 7 etil-L-glutamato, etilenoacetato de vinilo no degradable, copolimeros de acido lactico-glicolico degradables como LUPRON DEPOT TM (microesferas inyectables compuestas de copolimero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida), acetato de sacarosa isobutirato y poli-D-(-)-3-acido hidroxibutirico.
En algunos modos de realizacion, el tratamiento implica la administracion combinada de un polipeptido heteromultimerico de la presente invencion y un agente quimioterapeutico o coctel de multiples agentes quimioterapeuticos diferentes. El tratamiento con polipeptidos heteromultimericos puede ocurrir antes, simultaneamente o despues de la administracion de quimioterapias. Las quimioterapias contempladas por la invencion incluyen sustancias quimicas o farmacos que son conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente, tales como doxorubicina, 5-fluorouracilo, arabinosido de citosina ("Ara-C"), ciclofosfamida, tiotepa, busulfan, citoxina, taxol, metotexato , Cisplatino, melfalan, vinblastina, gemcitabina, irinotecan y carboplatino. La administracion combinada puede incluir la administracion conjunta, ya sea en una unica formulacion farmaceutica o utilizando formulaciones separadas, o administracion consecutiva en cualquier orden, pero generalmente dentro de un periodo de tiempo tal que todos los agentes activos puedan ejercer sus actividades biologicas simultaneamente. Los esquemas de preparacion y dosificacion de dichos agentes quimioterapeuticos se pueden usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante o segun lo determine empiricamente el experto en la materia. La preparacion y los esquemas de dosificacion para dicha quimioterapia tambien se describen en Chemotherapy Service Ed., MC Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).
En otros modos de realizacion, el tratamiento implica la administracion combinada de un polipeptido heteromultimerico de la presente invencion y terapia de radiacion. El tratamiento con polipeptido heteromultimerico puede ocurrir antes, simultaneamente con o despues de la administracion de radioterapia. Cualquier esquema de dosificacion para dicha radioterapia se puede usar segun lo determine el profesional experto.
En otros modos de realizacion, el tratamiento puede involucrar la administracion combinada de polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion con anticuerpos contra antigenos asociados a tumores, que incluyen, entre otros, anticuerpos que se unen al receptor de EGF (EGFR) (cetuximab/Erbitux®), el receptor erbB2 (HER2) (trastuzumab/Herceptin®), y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (bevacizumab/Avastin®). Ademas, el tratamiento puede incluir la administracion de una o mas citoquinas, puede ir acompanado de la extirpacion quirurgica de las celulas cancerosas o cualquier otra terapia que el medico tratante considere necesaria.
En otros modos de realizacion, el tratamiento puede implicar la administracion combinada de polipeptidos heteromultimericos de la presente invencion y un segundo agente terapeutico. En algunos modos de realizacion, el segundo agente terapeutico se administra para tratar un efecto secundario causado por la administracion del polipeptido heteromultimerico.
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de un polipeptido heteromultimerico de la presente invencion depende del tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad, la capacidad de respuesta de la enfermedad, si el polipeptido heteromultimerico se administra para fines terapeuticos. o con fines preventives, terapia previa, historial clinico del paciente, etc., todo a discretion del medico tratante. El polipeptido heteromultimerico se puede administrar una vez o durante una serie de tratamientos que duran desde varios dias hasta varios meses, o hasta que se efectue una cura o se logre una disminucion del estado de la enfermedad (por ejemplo, reduction del tamano del tumor). Los horarios de dosificacion optimos se pueden calcular a partir de las mediciones de la acumulacion de farmaco en el cuerpo del paciente y variaran dependiendo de la potencia relativa de un anticuerpo individual. El medico administrador puede determinar facilmente las dosis optimas, las metodologias de dosificacion y las tasas de repeticion. En general, la dosis es de 0.01 pg a 100 mg por kg de peso corporal y se puede administrar una vez o mas diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente. El medico tratante puede estimar las tasas de repeticion para la dosificacion en funcion de los tiempos de residencia medidos y las concentraciones del farmaco en los fluidos corporales o tejidos.
Se proporcionan kits que comprenden los polipeptidos heteromultimericos descritos en el presente documento y que pueden usarse para realizar los procedimientos descritos en el presente documento. En ciertos modos de realizacion, un kit comprende al menos un polipeptido heteromultimerico purificado contra un marcador tumoral en uno o mas recipientes. En ciertos modos de realizacion, un kit comprende al menos dos polipeptidos heteromultimericos. Un experto en la tecnica reconocera facilmente que los anticuerpos descritos de la presente invencion pueden incorporarse facilmente en uno de los formatos de kit establecidos que son bien conocidos en la tecnica.
Los modos de realizacion de la presente divulgacion pueden definirse adicionalmente mediante referenda a los siguientes ejemplos que describen en detalle la preparation de polipeptidos heteromultimericos de la presente divulgacion y procedimientos para usar polipeptidos heteromultimericos de la presente divulgacion. Sera evidente para los expertos en la materia que pueden realizarse muchas modificaciones, tanto de los materiales como de los procedimientos, sin apartarse del alcance de la presente divulgacion. Siempre que sea posible, se utilizaran los mismos numeros de referenda en todos los dibujos para referirse a partes iguales o similares. Como se usa en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/a", "o" y "el/la/los/las" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asi, por ejemplo, la referenda a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de tales anticuerpos o uno o mas anticuerpos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la tecnica. Ademas, todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reaction, pureza, longitudes de polipeptidos y polinucleotidos, y demas, utilizados en la memoria descriptiva, se modifican por el termino "aproximadamente", a menos que se indique lo contrario. Por consiguiente, los parametros numericos establecidos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas de la presente invencion.
Todos los diversos modos de realizacion u opciones descritos en este documento pueden combinarse en cualquiera y todas las variaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Identificacion de interacciones candidatas dentro de la interfaz de dimerizacion de anticuerpos.
Con el fin de comprender mejor la naturaleza de la interfaz de dimerizacion entre los dominios CH3 de la cadena pesada del anticuerpo, se examino la estructura cristalina de un dominio CH3 del anticuerpo (estructura reportada por primera vez por Deisenhofer). J. (1981) Biochemistry, 20, 2361-2370 ). En esta estructura, la dimerizacion de los dos fragmentos Fc esta mediada por interacciones entre cadenas entre los dominios CH3 (Figura 1). La superficie de interaccion del dominio CH3 contiene una region central de residuos hidrofobos flanqueados por residuos tanto de caracter hidrofilo como cargado. Dentro de la region hidrofoba del nucleo hay tirosinas conservadas que presentan grupos hidroxilo para interacciones hidrofilas potenciales, sirviendo asi como residuos hidrofobos y tambien sirviendo para permitir interacciones hidrofilas. La Figura 2 muestra representaciones de la estructura del dominio CH3 dimerizado. Una hebra esta sombreada mas oscura que la otra para mayor claridad. Se muestran las cadenas laterales de los aminoacidos que recubren la superficie de interaccion entre los dominios CH3. La Figura 3 destaca los aminoacidos seleccionados dentro del dominio CH3 involucrados en posibles interacciones entre cadenas en tres vistas separadas de la estructura. Los numeros de posicion de los aminoacidos en la Figura 3 son relativos a la region constante de la lgG2 humana. La Figura 4 muestra una alineacion de los dominios constantes de los isotipos de IgG humana. Se resaltan los residuos particulares que pueden participar en las interacciones entre cadenas y que se indican en la Figura 2. La Tabla 1 enumera la posicion del aminoacido correspondiente a estos residuos que estan potencialmente involucrados en interacciones entre cadenas para cada uno de los isotipos de IgG humana con nomenclatura de numeration en relation con los dominios constantes de la linea germinal de IgG humana.
Tabla 1
Aminoacido Residuo de lgG1 Residuo de lgG2 Residuo de lgG3 Residuo de lgG4
Humana # Humana # Humana # Humana #
Tyr 232 228 279 229
Leu 234 230 281 231
Ser 237 233 284 234
Glu o Asp 239 235 286 236
Glu 240 236 287 237
Lys 243 239 290 240
Gin 245 241 292 242
Ser 247 243 294 244
Thr 249 245 296 246
Leu 251 247 298 248
Lys 253 249 300 250
Asn 273 269 320 270
Lys o Asn 275 271 322 272
Thr 277 273 324 274
Val o Met 280 276 327 277
Asp 282 278 329 279
Asp 284 280 331 281
Ser 286 282 333 283
Phe 288 284 335 285
Tyr 290 286 337 287
Lys o Arg 292 288 339 289
Thr 294 290 341 291
Ejemplo 2: Identification de variantes de Fc que heterodimerizan selectivamente.
Se analizo la capacidad de varios tipos de modificaciones en el dominio CH3 de un anticuerpo para determinar su capacidad para generar anticuerpos heterodimericos espontaneos. Se razono que al reducir selectivamente las interacciones hidrofilicas que ocurren entre cada cadena CH3, podria ser posible hacer que la homodimerizacion del anticuerpo fuera menos favorable, y que al introducir simultaneamente sustituciones que hacen que la homodimerizacion sea desfavorable, pero la heterodimerizacion permisible, podria ser posible generar pares de variantes de Fc que heterodimerizasen selectivamente, pero tienen muy poca propension a homodimerizar.
Por lo tanto, se creo una serie de pares de variantes y se evaluo su capacidad para formar selectivamente anticuerpos heterodimericos. Las sustituciones de aminoacidos se introdujeron en una cadena pesada truncada (denominada minicuerpo) que contiene el conector y la region CH2-CH3 de una cadena pesada, o una cadena pesada del anticuerpo de longitud completa. El uso de dos cadenas pesadas de diferentes tamahos permitio la visualizacion de las especies de heterodimeros como una molecula de masa molecular intermedia y proporciono un ensayo para evaluar la propension relativa de los anticuerpos variantes a formar heterodimeros. Este formato de ensayo se representa en forma de caricatura en la Figura 5. Se probaron varias variantes de pares de anticuerpos. Las sustituciones de aminoacidos se introdujeron en vectores de expresion de anticuerpos que variaron la identidad de los aminoacidos seleccionados que tienen el potencial de participar en interacciones entre cadenas. Los vectores de expresion que codifican estas secuencias de anticuerpos variantes se transfectaron luego, solos o en combinacion con otras cadenas asociadas, a celulas de mamifero (celulas HEK 293 humanas). Despues de 48 horas, se recogieron los medios acondicionados de las celulas transfectadas y se sometieron a un analisis Western blot y se sondaron con un anticuerpo dirigido hacia el dominio Fc humano.
Como se muestra en la Figura 6, se diseharon pares de variantes en las que cada variante tenia poca o ninguna propension a la homodimerizacion, pero cuando se coexpresaban podian contribuir de manera eficiente a la formacion de heterodimeros. La coexpresion de la variante de anticuerpo Var2 (que contiene sustituciones de aminoacidos 249 K a E; 286 Y a F; y 288 K a E) con la variante de anticuerpo Var3 (13A) (que contiene sustituciones de aminoacidos 236 E a K; 278 D a K) da como resultado la formacion casi exclusiva de heterodimero. La combinacion simultanea tanto de la alteracion de los aminoacidos cargados para manipular las fuerzas atractivas y repulsivas para favorecer la heterodimerizacion, como de la alteracion de las interacciones de aminoacidos dentro del "nucleo" de la interfaz de dimerizacion del anticuerpo, se logro aqui mediante la eliminacion de las interacciones hidroxilo mediadas por la tirosina central a traves de su reemplazo por el residuo de aminoacido fenilalanina no polar, para reducir la propension a la homodimerizacion. Esta combinacion de manipulaciones permite tanto la reduccion efectiva de la homodimerizacion como la retencion de la heterodimerizacion.
Ejemplo 3: Union del anticuerpo biespecifico a dos dianas diferentes
Se realizo un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para examinar la capacidad de la variante de anticuerpo biespecifico (Var2-Var3) para unirse a los antigenos. Las placas de ELISA se recubrieron ya sea sin antigeno (-), con anticuerpo anti-FLAG (0,05 mg/ml, cion M2 de SIGMA) o con ligando tipo Delta 4 humano recombinante (0,1 mg/ml) (aminoacidos 27-519 con marca carboxi-terminal 8xHis). Las placas recubiertas se incubaron luego con medio de cultivo celular de control (control negativo) o medio condicionado de celulas transfectadas con vectores de expresion que codifican Var2, Var3 y la cadena ligera L2 como se indica. Despues de permitir que se produjera la union durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron y el anticuerpo unido se detecto mediante el uso de un anticuerpo secundario de anti-IgG humana conjugado con HRP. La variante de anticuerpo biespecifico producida por la coexpresion de variantes Var2 y Var3 posee actividad funcional (Figura 7). La cadena pesada Var3 (13A) y la cadena ligera emparejada son capaces de unirse a DLL4, el antigeno reconocido por el anticuerpo homodimerico primario utilizado para desarrollar Var3, y el brazo de Is cadena pesada de Var2 muestra una marca de epitopo FLAG y es capaz de interactuar con anticuerpos anti- FLAG mediante ELISA. Por lo tanto, el anticuerpo biespecifico es capaz de interactuar con dos dianas diferentes, estando cada cadena pesada involucrada en una interaccion distinta.
Ejemplo 4: Desarrollo de anticuerpos anti-VEGF.
Los ratones se inmunizaron con VEGF humano y se aislaron los bazos. Las cadenas pesadas se amplificaron por PCR y se insertaron en una biblioteca de fagemidos de genes kappa de cadena ligera humanos. En laa biblioteca de fagemidos se recuperaron y seleccionaron resultados en relacon con el VEGF humano en tres rondas sucesivas. Se aislo un panel de Fab de VEGF (+) y se analizo en una serie de ensayos para encontrar antagonistas de VEGF (ensayo de proliferacion de celulas HUVEC, ensayo de bloqueo de Biacore).
En un ensayo de proliferacion de celulas HUVEC, un Fab de VEGF (+) (219R0302) inhibio parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF (Figura 8). Brevemente, las celulas HUVEC congeladas (Lonza CC-2517) se sometieron a pases en ECGM (Lonza CC-3124) y se introdujeron en mini-bancos de germoplasma. Las celulas se descongelaron directamente a partir de celulas HUVEC de mini-bancos en medio de crecimiento, M199+FBS inactivado por calor al 10% (Gibco Cat#10082139)+50 pg/ml de EGS (BD:354006)+1X heparina 1 mM L-GIn. Para realizar un ensayo de proliferacion, se precubrio una placa de 96 pocillos (Greiner Bio-One Cat#655098) con 50 pi de 10 pg/ml de solucion de colageno de cola de rata, tipo I (BD: 354236, el colageno I se preparo en acido acetico 0,02N) a 4 °C durante la noche. Al dia siguiente, la placa se aspiro completamente para eliminar la solucion de colageno I y se lavo una vez con 200 pi de DPBS. Las celulas HUVEC se tripsinizaron fuera del matraz utilizando el reactivo de subclonacion de celulas endoteliales (Lonza: CC-5034). Todas las celulas se recogieron del matraz y se aislaron mediante centrifugacion a 1200 rpm durante 5 minutos a 4°C. Las celulas se resuspendieron en medios de inanicion/ensayo (M199+2% H. I.FBS+1XHeparina+1 mM L+5 unidades/ml Heparin-Gin) a una densidad de 10 5 celulas/ml. Las celulas se sembraron en la placa de ensayo a 5000/pocillo, 50 pl/pocillo. Las celulas se dejaron reposar durante 3 horas en una incubadora a 37°C. Las celulas se lavaron cuidadosamente una vez con DPBS mediante la adicion gota a gota de DPBS 200 pi, y luego se agregaron 100 pi de medio de inanicion. Las celulas se dejaron incubar a 37°C durante la noche. A la manana siguiente (ensayo d=0), los anticuerpos de prueba (o control): Avastin y LZ1) se prepararon en combinacion con rhVEGF (R&D 293-VE-010). En los casos en que se probo una titulacion de diferentes concentraciones de anticuerpos, se prepararon diluciones de 5 veces (a partir de 20 pg/ml de concentracion final) en combinacion con rhVEGF (5 ng/pl de concentracion final) en medios de ensayo. Estas soluciones se preincubaron a 37 °C durante 2 horas. El medio de la placa de ensayo se aspiro cuidadosamente y se agregaron a las celulas 100 pi de las mezclas de Ab:VEGF. Despues de 3-4 dias de incubacion en una incubadora a 37 °C, se agrego una mezcla adicional de Ab+rhVEGF (la misma concentracion final para Ab y rhVEGF) a cada pocillo y se dejo incubar durante otros 4 dias. En el dia 7, se agregaron 20 pi de reactivo Alamar Blue (lnvitrogenCat#DAL1025) a 200 pi de cultivo y se incubaron a 37 °C durante 5 a 6 horas. La placa se leyo con un lector de microplacas de fluorescencia (Ex=530nm/Em=590nm).
Los Fab tambien se analizaron para ver si bloqueaban la interaccion VEGF-VEGFR2 utilizando Biacore 2000. Brevemente, VEGF se inmovilizo en un chip CM5 usando quimica basada en aminas estandar (NHS/EDC). Los Fabs anti-VEGF o Fab de control se hicieron fluir sobre la superficie a 25 pg/ml y, inmediatamente despues, se hizo fluir VEGFR2 recombinante sobre la superficie a 10 pg/ml. Tras seleccion y secuenciacion adicionales, tambien se descubrio una variante de cadena ligera adicional de este Fab (219R0202) y se demostro que tenia propiedades similares (datos no mostrados). Las secuencias para el 219R0302 y el 219R0202 se muestran como las SEQ ID NO:10-16. El Fab 219R0302 bloqueo completamente la union de VEGFR2 a un VEGF en un experimento de bloqueo de Biacore (Figura 9).
Ambas IgG se reformatearon a lgG2, se expresaron y se purificaron para pruebas in vitro confirm atari as. Tanto el 219R0202 como el 219R0302 inhibieron completamente la activacion inducida por VEGF de celulas HUVEC casi en la misma medida que el bevacizumab (Avastin) (Figura 10), un agente anti-VEGF aprobado.
Las afinidades de IgG se determinaron utilizando un instrumento Biacore 2000. En resumen, las proteinas recombinantes se inmovilizaron en un chip CM5 usando quimica estandar basada en aminas (NHS/EDC). Para cada Fab e IgG, se inyectaron diferentes concentraciones (100-1 nM) sobre la superficie y se recogieron datos cineticos a lo largo del tiempo. Los datos se ajustaron utilizando la ecuacion de ajuste global simultanea para producir constantes de afinidad (KD) para cada Fab e IgG. Se determinaron las afinidades de VEGF humano y de raton 219R0202/219R0302 y se compararon con Avastin. A diferencia de Avastin, 219R0202 y 219R0302 se unen a VEGF tanto humano como de raton (Tabla 2). Este data sugiere que el epitopo 219R0202/219R0302 no es igual que Avastin, que solo se une al VEGF humano.
Tabla 2: 219R0302 y 219R0202 se unen a VEGF humano y de raton
IgG hVEGF (nM) mVEGF (nM)
219R0302 2,1 21
219R0202 1,5 23
Avastin 1,3 NB
Ambos anticuerpos tambien se analizaron en un modelo de xenoinjerto de tumor de mama (UM-PE13) y mostraron una inhibicion significativa del crecimiento del tumor (Figura 11). Brevemente, UM-PE13, una linea de xenoinjerto de tumor de mama, se determino en la Universidad de Michigan. Se utilizaron ratones NOD/SCID machos inmunocomprometidos para el establecimiento de xenoinjertos de tumores UM-PE13. Se inyectaron 300,000 celulas viables por via subcutanea en el flanco derecho de los ratones. Una vez que el tumor habia alcanzado un tamano de entre 65 y 200 m m 3, los ratones fueron aleatorizados. Como se muestra en la Figura 11,219R0302 indujo un retraso en el crecimiento del tumor mas fuerte que 219R0202. Avastin mostro el retraso de crecimiento mas potente, que era indistinguible del 219R0302, lo que indica que 219R0302 y Avastin tienen una potencia casi equivalente en este modelo. A diferencia de 219R0302, 219R0202 fue estadisticamente diferente tanto de Avastin como de 219R0302.
Ejemplo 5: Desarrollo de formatos de anticuerpos biespecfficos.
Utilizando las mutaciones de heterodimerizacion descubiertas (13A/13B, Figura 12A), se utilizaron dos formatos para generar un anticuerpo biespecifico dirigido a hDLL4 (21M18) y VEGF (219R0302, 219R0202).
En el primer formato denominado gen unico biespecifico (SGBSP), se uso un conectorde 30 aminoacidos (5xGGGGS) para unir geneticamente la cadena ligera a su cadena pesada como lo hizo con anterioridad Lee et al. (Mol. Immunol.
36:61-71 (1999 )) (Figura 12B). Al hacerlo, cada unidad de union usa su propia cadena ligera para formar una unidad de union Fab que se une a su diana respectiva. Cuando se combinan con las mutaciones biespecificas (13A/13B) descritas anteriormente, dos genes individuales diferentes se reunen para formar un anticuerpo biespecifico.
En el segundo formato llamado Biespecifico Monovalente (MBSP), se utilizo una cadena ligera comun en concierto con dos cadenas pesadas diferentes, una que alberga la mutacion 13Ay la otra que alberga la mutacion 13B (Figura 12C). Para este enfoque, una o ambas de las cadenas pesadas deben poder unirse a su diana en combinacion con una cadena ligera comun. En algunos casos, la cadena ligera comun es la cadena ligera original para una de las cadenas pesadas.
Ambos formatos de anticuerpos se construyeron utilizando 21M18 (DLL4 anti-humano) y 219R0302/219R0202 (anti-VEGF) como bloques de construccion. Las cadenas pesadas 21M18 y 219R0202/0302 se clonaron con los mutantes Fc 13B y 13A, respectivamente. Una vez expresado y purificado, cada anticuerpo biespecifico se analizo para determinar la actividad anti-DLL4 y anti-VEGF en comparacion con el anticuerpo de control.
Para evaluar el doble direccionamiento en el Biacore, se genero una superficie de VEGF de alta densidad como se describio anteriormente y el biespecifico se hizo fluir sobre ella a una alta concentracion para saturar la superficie (25 pg/ml). Inmediatamente despues de la union biespecifica a la superficie, la proteina de fusion DLL4-Fc se hizo fluir sobre la misma superficie a 10 pg/ml. Si ambos brazos del biespecifico son funcionales, entonces DLL4 deberia unirse al brazo anti-DLL4 no unido del biespecifico unido.
Ejemplo 6: Desarrollo de anticuerpo anti-DLL4/anti-VEGF de gen unico biespecifico (SGBSP)
Se creo un SGBSP utilizando 21M18y bien 219R0302 o 219R0202. Ambos SGBSP se expresaron bien y se purificaron mediante cromatografia de proteina A. Para evaluar el nivel de especies homodimericas versus heterodimericas, cada SGBSP se analizo utilizando un enfoque isoelectrico. Dado que las especies homodimericas (homodimeros 13A/13B) tienen diferentes pi de las especies heterodimericas, el gel muestra claramente que ambos SGBSP eran heterodimeros en mas del 90% en base a densitometria de gel (Figura 13A).
Para analizar su actividad anti-VEGF, los anticuerpos se analizaron en el mismo ensayo de proliferacion inducida por VEGF. Como se muestra en la Figura 14, los SGBSP tanto del 219R0302J21M18 como del 219R0202_21M18 inhibieron parcialmente la proliferacion de celulas HUVEC inducida por VEGF, y este ultimo mostro una actividad significativamente mejor que el primero. Dado que la unidad de union de VEGF es monomerica en el contexto de la biespecifica, se espera una actividad reducida debido a la perdida de avidez en comparacion con Avastin o los anticuerpos originales (219R0302/219R0202).
Los SGBSP tanto 219R0302_21M18 como 219R0202_21M18 tarn bien se analizaron respecto a su afinidad de VEGF. La afinidad de union de 219R020221M18 SGBSP fue aproximadamente 5 veces mas debil (6,9 nM) que la de 219R0202 (1,5 nM), lo que concuerda con una perdida de avidez (Tabla 3). La afinidad de union de SGBSP de 219R030221M18 fue aproximadamente 4 veces mas debil (7,6 nM) que la de 219R0302 (2,1 nM), lo que concuerda con una perdida de avidez (Tabla 3).
Tabla 3: SGBSP y MBSP VEGF Biacore Analysis.
IgG VEGF (nM)
219R0302 2,1
219R0202 1,5
219R0302_21M18 SGBSP 7,6
219R0202_21M18 SGBSP 6,9
219R0202_21M18 MBSP 21
El SGBSP de 219R0202_21M18 tambien se probo para determinar su union a celulas transfectadas con DLL4 humano en un ensayo de union FACS (Figura 15). Cuando se comparo con 21M18, hubo una perdida de aproximadamente 5 veces en la actividad de union de DLL4 debido a la perdida de avidez. En resumen, las celulas HEK293 humanas se transfectaron utilizando el reactivo de transfeccion Fugene 6 segun lo recomendado por el fabricante (Roche Inc.). Las celulas se transfectaron con un vector de expresion de ADNc que codifica DLL4 humano de longitud completa, asi como un segundo vector que codifica una proteina fluorescente verde, pcDNA-GFP, para marcar las celulas transfectadas transitoriamente. Veinticuatro a cuarenta y ocho horas despues de la transfeccion, las celulas se incubaron con diferentes concentraciones de SGBSP durante 1 hora a 37 °C. Las celulas se enjuagaron dos veces con medio de tincion (HBSS con 2% de FCS) y se incubaron con un anticuerpo secundario fluorescente, IgG antihumano de cabra H/L-ficoeritrina (PE), a una dilucion 1:200 en PBS durante 1 hora. Las celulas se analizaron por citometria de flujo utilizando un instrumento FACS Caliber (BD Bioscience). La union especifica de SBGSP se evaluo determinando la presencia de celulas positivas para la serial de GFP y la serial de PE.
Usando el ensayo de doble direccionamiento descrito anteriormente, los SGBSP tanto 219R0302_21M18 como 219R0202_21M18 mostraron union tanto a VEGF como a DLL4 como se esperaba (Figura 16A). El SGBSP tambien mostro una inhibicion parcial de la proliferacion inducida por VEGF (Figura 17). Por lo tanto, los ensayos confirman que las mutaciones biespecificas efectivamente reunieron cada unidad de union de una manera heterodimerica y que cada brazo de union es funcional.
Ejemplo 7: Desarrollo de anticuerpo anti-DLL4/anti-VEGF monovalente biespecifico (MBSP)
En el segundo ejemplo, se creo un MBSP utilizando la cadena pesada 21M18, la cadena pesada comun a 219R0302/219R0202 y la cadena ligera 21M18. El MBSP se expreso bien y se purified por cromatografia de proteina A. Para evaluar el nivel de especies homodimericas versus heterodimericas, el MBSP se analizo utilizando un enfoque isoelectrico. Dado que las especies homodimericas (homodimero 13A/13B) tienen diferentes pi del heterodimerico, el analisis de gel IEF mostro que el MBSP era heterodimero en mas del 90% en base a densitometria de gel (Figura 13A). Como se muestra en la Figura 13B, el homodimero 21M18 13B restante podria eliminarse aumentando la relacion de 21R0202 de cadena pesada (13A) a 21M18 de cadena pesada (13B).
Dado que la unidad de union de VEGF es monomerica y ha perdido su LC original en el contexto de la biespecifica, se espera una actividad de union reducida debido a la perdida de avidez y de la contribucion de la cadena ligera a la union. Como confirmacion de esta observacion, la afinidad de union de MBSP fue aproximadamente 14 veces mas debil (21 nM) que la de 219R0202 (1,5 nM), lo cual concuerda con la perdida de avidez y de la union de la cadena ligera en comparacion con el anticuerpo original (Tabla 3).
El MBSP tambien se probo para determinar la union a celulas transfectadas con DLL4 humanas en un ensayo de union FACS (Figura 15). Cuando se compare con 21M18, hubo una perdida de aproximadamente 3 veces en la actividad de union de DLL4 debido a la perdida de avidez.
Usando el ensayo de doble direccionamiento como se describio anteriormente, el MBSP mostro la union tanto a VEGF como DLL4 como se esperaba (Figura 16B). Este ensayo confirmo que las mutaciones biespecfficas efectivamente reunieron cada unidad de union de una manera heterodimerica y que cada brazo de union es funcional.
SECUENCIAS
Secuencia Var 1 (13B) (SEQ ID NO:1) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita )
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN.SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
Secuencia Var 1 (13B) - sin CH1 o bisagra (SEQ ID NO:4) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var 1 (13B) - solo CH3 (SEQ ID NO:5) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita )
KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQRSLSLSPGK
Secuencia Var 2 (SEQ ID NO:2)
■ a s t k g p s v f p l a p c s r s t s e s t a a l g g l v k d y f p e p v t v s w n s g a l t s g v h t f p a v l q s s g l y s l SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLFSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
Secuencia Var 2 - sin CH1 o bisagra (SEQ ID NO:6)
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV
v s v l t v v h q d w l n g k e y k c k v s n k g l p a p i e k t i s k t Kg q p r e p q v y t e p p s r e e m t k n q v s l t c LVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLFSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var 2 - solo CH3 (SEQ ID NO:7)
KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLFSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var3 (13A) (SEQ ID NO:3) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
AS IKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
Secuencia Var3 (13A) - sin CH1 o bisagra (SEQ ID NO:8) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRV VSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK
Secuencia Var3 (13A) - solo CH3 (SEQ ID NO:9) (las sustituciones de aminoacidos se muestran en negrita)
KTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219R0302/0202 VH Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 10)
QVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFK RKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTIHYYDNSYAMDYWGQGTSVTVSSAST
219R0302/0202 HC Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:11)
QVQLKQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFK
r k a t l t v d k s s s t a y m q l s s l t s e d s a v y y c t ih y y d n s y a m d y w g q g t s v t v s s As t k g p s v f p LAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSN
f g t q t y t c n v d h k p s n t k v d k t v e r k c c v e c p p c p a p p v a g p s v f l f p p k p k d t l m is r t p e v t c VVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNK
GLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219R0302/0202 HC Secuencia de ADN (SEQ ID NO:12)
CAGGTGCAATTGAAGCAGTCTGGGGCTGAAGTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTG CAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATGCACTGGGTGAAGGTGAGGCCTGGACAAG GCTTTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCCAGCAATGGTGGTACTAGCTACAATGAGAAGTTCAAG AGAAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGAC
a t c t g a g g a c t c t g c g g t c t a t t a c t g t a c Aa t a c a c t a c t a t g a t a a t t c c t a t g c t a t g g a c t ACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCT CTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGGCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTGAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAAC TTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAC AGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAG TGTTCCTCTTCCCCCCAAAAGCCAAGGACACCCTCATGATCTCGCGGACCCCTGAGGTCACGTGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCG TCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA GGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTACCCCAGCGAGATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
219R0302 LC Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:13)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYVNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGR GSGTHFTFTISSLQPEDLATYYCQQYDDLPPTFGRGTKLEiKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
219R0302 LC Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 14)
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATOAC
t t g c g a g g c g a g t c a g g a c a t t a g c a a c t a t g t a a a t t g g t a t c a a c a a a a a c c a g g g a a a g c c c CTAAGCTGCTGAT.CTACGATGCATCCAAOTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGG
g g a t c t g g g a g a c a t t t t a c t t t g a g c a t c a g c a g c c t g c a g c c t g a a g a t c t g g c a a c a t a t t a
c t g t c a a g a a t a t g a t g a t g t t c c t c c c a c t t t t g g c a g a g g g a c c a a g c t g g a g a t c a a a c g t a
c g g t g g c t g c a c c a g c t g t c g t c a t c t t c c c g c c a t c t g a t g a g c a g t t g a a a t c t g g a a c t g c c
t c t g t t g t g t g c c t g c t g a a t a a c t t c t a t c c c a g a g a g g c c a a a g t a c a g t g g a a g g t g g a t a a CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAGAGCACCTACA
GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
219R0202 LC Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:15)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNHLAWYQQKPGKVPKSLIYAASNLHSGVPSKFSGS GSGTHFTLIISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGEC
219R0202 LC Secuencia de ADN (SEQ ID NO: 16)
GATATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCAC TTGTCGGGCGAGTCAGGGCATCAATAATCATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCC CTAAGTCCCTCATATATGCTGCATCCAATCTCCATAGTGGCGTCCCATCAAAGTTCAGCGGCAGT GGATCTGGGACACACTTCACTCTCATCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTA CTGTCAACAGTATGATAATCTCCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTA CGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCC TCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAA CGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGAGAGCACCTACA GCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAA GTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCAGAAAGAGCTTCAAGAGGGGAGAGTGT
219R0202_SG (Var3/13A) Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 17) (la secuencia conectora esta subrayada en negrita ) (las sustituciones de 13A se muestran en negrita)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINNHLAWYQQKPGKVPKSLIYAASNLHSGVPSKFSGS GSGTHFTLIISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGAELVKPG ASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFKRKATLTVDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCTIHYYDNSYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GGLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
219R0302_SG (Var3/13A) Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO: 18) (la secuencia conectora esta subrayada en negrita) (las sustituciones de 13A se muestran en negrita)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYVNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGR GSGTHFTFTISSLQPEDLATYYCQQYDDLPPTFGRGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTA SVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE VTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLKQSGAELVKPG ASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKLRPGQGFEWIGDINPSNGGTSYNEKFKRKATLTVDKSSSTAY MQLSSLTSEDSAVYYCTIHYYDNSYAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPS NTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQFN S T FRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
21M18_SG (Var1/13B) Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:19) (la secuencia conectora esta subrayada en negrita) (las sustituciones de 13B se muestran en negrita)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATISCRASESVDNYGISFMKWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKV YACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVK KPGASVKISCKASGYSFTAYYIHWVKQAPGQGLEWIGYISSYNGATNYNQKFKGRVTFTTDTSTS TAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYDYDVGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHK PSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQ FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKT KGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSF FLY SELTVDKSRWQQGNVFS C SVMHEALHNHY TQKS LS L S PGK
21R0302/0202 CDR1 de cadena pesada (SEQ ID NO:20)
GYTFTNYWMH
219R0302/0202 CDR2 de cadena pesada (SEQ ID NO:21)
SINPSNGGTSYNEKFKR
219R0302/0202 CDR3 de cadena pesada (SEQ ID NO:22)
HYYDNSYAMDY
219R0302 CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO:23)
QASQDISNYVN
219R0302 CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO:24)
DASNLQT
219R0302 CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO:25)
QQYDDLPP
219R0202 CDR1 de cadena ligera (SEQ ID NO:26)
RASQGINNHLAW
219R0202 CDR2 de cadena ligera (SEQ ID NO:27)
AASNLHS
219R0202 CDR3 de cadena ligera (SEQ ID NO:28)
QQYDNLPL
219R0302 VL Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:29)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYVNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLQTGVPSRFSGR GSGTHFTFTISSLQPEDLATYYCQQYDDLPPTFGRGTKLEIKRT
219R0202 VL Secuencia de aminoacidos (SEQ ID NQ:30)
DIQLTQSPS5LSASVGDRVC1TCRASQG1NNHLAWYQQKPGKVPKSL1YAASNLH3GVPSKFSGS GSGTHFTLIISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRT

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para preparar un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, comprendiendo el procedimiento sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del primer polipeptido de inmunoglobulina y sustituir al menos un aminoacido dentro del dominio CH3 del segundo polipeptido de inmunoglobulina para promover la formacion de un anticuerpo biespecifico, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo biespecifico comprende una lgG2 humana, en donde los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 son glutamato, y en donde los aminoacidos en las posiciones en el el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondiente a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 es lisina.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que el anticuerpo biespecifico comprende una primera secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO:7; y una segunda secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:9.
4. Un anticuerpo biespecifico que se une especificamente a VEGF y DLL4, en el que el anticuerpo biespecifico comprende un primer y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3, en el que el anticuerpo biespecifico se selecciona del grupo que consiste en:
(a) una lgG1 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 253 y 292 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con glutamato o aspartato, y
en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 240 y 282 de la SEQ ID NO:32 se reemplazan con lisina;
(b) una lgG2 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con glutamato o aspartato, y
en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 se reemplazan con lisina;
(c) una lgG3 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 300 y 339 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con glutamato o aspartato, y
en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 287 y 329 de la SEQ ID NO:34 se reemplazan con lisina; y
(d) una lgG4 humana, en la que los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 250 y 289 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con glutamato o aspartato, y en la que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 237 y 279 de la SEQ ID NO:35 se reemplazan con lisina,
en el que el primer polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un primer polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina, y el segundo polipeptido que contiene el dominio CH3 comprende un segundo polipeptido de cadena pesada de inmunoglobulina que se une especificamente a un segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina; y en el que el primer polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina y el segundo polipeptido de cadena ligera de inmunoglobulina son identicos en secuencia de aminoacidos.
5. El anticuerpo biespecifico de la reivindicacion 4, que comprende una lgG2 humana, en donde los aminoacidos en las posiciones en el primer polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 249 y 288 de la SEQ ID NO:33 son glutamato, y
en el que los aminoacidos en las posiciones en el segundo polipeptido de inmunoglobulina correspondientes a las posiciones 236 y 278 de la SEQ ID NO:33 son lisina.
6. Un anticuerpo biespecifico de la reivindicacion 4, que comprende una primera secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7; y una segunda secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:9.
7. El anticuerpo biespecifico de una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.
8. Un anticuerpo biespecifico que comprende un primer polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene una secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:7, y un segundo polipeptido de inmunoglobulina que contiene el dominio CH3 que tiene una secuencia de aminoacidos SEQ ID NO:9.
9. Un polinucleotido aislado que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8.
10. Una celula huesped que comprende un polinucleotido de la reivindicacion 9.
11. Un procedimiento para preparar un anticuerpo que comprende cultivar la celula huesped de la reivindicacion 10 en condiciones que dan como resultado la expresion del anticuerpo o polipeptido.
12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 4-8 para su uso en el tratamiento del cancer.
13. Uso del anticuerpo de las reivindicaciones 4-8 en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento del cancer.
14. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 12, o el uso de la reivindicacion 13, en el que el tratamiento del cancer comprende un segundo agente terapeutico o multiples agentes terapeuticos.
15. El anticuerpo para el uso de la reivindicacion 14, en el que el segundo agente terapeutico es un agente quimioterapeutico.
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