ES2708758T3 - Predicción de características híbridas - Google Patents

Abstract

Un método para predecir el nivel o cantidad de heterosis en plantas, de manera que se identifican las moléculas de sRNA (o ARN pequeño) que están relacionadas con un rasgo híbrido y se analizan las líneas parentales que son adecuadas para la producción de híbridos a fin de hallar el nivel de expresión de las moléculas de sRNA identificadas; y de manera que la identificación de las moléculas de sRNA comprende los siguientes pasos: a) determinar el alcance de la expresión de rasgos o características en diferentes híbridos producidos a partir de líneas parentales genéticamente diferentes; y b) analizar las líneas parentales de los híbridos testados en cuanto a la expresión de su sRNA.

Description

DESCRIPCION

Prediccion de caractensticas hnbridas

La presente invencion esta relacionada con un metodo para predecir el nivel de heterosis en plantas, tal y como se determina en las reivindicaciones.

Un hnbrido se define como la descendencia o el resultado de un cruce entre dos padres o progenitores, normalmente lmeas endogamicas, con un acervo genetico diferente. Las lmeas endogamicas que se usan, por ejemplo, en el mejoramiento comercial del ir ^ z hnbrido (Duvick & Cassman; 1999; 'Post-green revolution trends in yield potential of temperate maize in the north-central United States'; Crop Sci.; 39: 1622-1630) son individuos sin heterocigosidad que se producen mediante retrocruzamiento constante o como haploides duplicados por medio de tecnicas biotecnologicas (Geiger & Gordillo; 2009; 'Doubled haploids in hybrid maize breeding'; Maydica; 54: 485-499).

Cuando se cultivan o desarrollan como hnbridos y se producen cruzando dos progenitores geneticamente diferentes, muchas especies animales y vegetales presentan unas mayores tasas de crecimiento y producen una mayor biomasa y, en el caso de las cosechas y los animales de granja, proporcionan un mayor rendimiento y una mayor productividad. Este fenomeno se conoce como vigor hnbrido o heterosis (Shull; 1908; 'The composition of a field of maize'; American Breeders Association; 4: 296-301) y puede aplicarse a casi todos los aspectos de la biologfa y a todas las caractensticas de las plantas y los animales cuando un hnbrido supera a sus progenitores.

El alcance de la heterosis en plantas y animales puede variar enormemente y se calcula como el incremento en comparacion con el valor promedio de ambos progenitores (heterosis de ambos padres o MPH, por las siglas en ingles de 'mid-parent heterosis') o como el incremento en comparacion con el progenitor con el mayor rendimiento (heterosis del mejor padre o BPH, por las siglas en ingles de 'best-parent heterosis).

La heterosis tiene una importancia enorme en muchos cultivos, asf como en el mejoramiento animal y vegetal, y la produccion de hnbridos que tengan un nivel elevado de heterosis resulta conveniente para el mejoramiento (Duvick; 1986; 'Plant breeding: past achievements and expectations for the future'; Econ. Bot.; 40: 289-297). A pesar de los analisis geneticos intensivos, la base molecular del fenomeno de la heterosis aun no se entiende completamente. Para explicar los beneficios que se derivan de la complementacion, la combinacion o la interaccion de dos alelos diferentes en los hnbridos, se usan modelos geneticos no exclusivos de dominancia (Bruce; 1910; 'The Mendelian theory of heredity and the augmentation of vigor'; Science 32: 627-628; Davenport; 1908; 'Degeneration, albinism and inbreeding'; Science 28: 454-455), sobredominancia (Shull; 1908; 'The composition of a field of maize'; American Breeders' Association 4: 296-301; East; 1936; 'Heterosis'; Genetics 21: 375-397) y epistasis o epistasia (Stuber; 1994; 'Heterosis in plant breeding'; Plant Breed Rev 12: 227-251; Goodnight; 1999; 'Epistasis and heterosis', en Coors JG, Pandey S, editores; 'The Genetics and Exploitation of Heterosis in Crops'; Madison: American Society of Agronomy; pags. 59-67). Tambien se han creado modelos hipoteticos que explican estas interacciones mediante redes reguladoras de genes (Omholt et al.; 2000; 'Gene regulatory networks generating the phenomena of additivity, dominance and epistasis'; Genetics 155: 969-980). Sin embargo, particularmente los mecanismos de heterosis con rasgos cuantitativos complejos como el rendimiento o el crecimiento vegetativo no se entienden bien (Birchler et al.; 2010; 'Heterosis'; Plant Cell 22: 2105-2112).

Las explicaciones geneticas de los modelos propuestos para al menos una parte de la heterosis observada en hnbridos no proporcionan informacion cuantitativa sobre el alcance de la heterosis.

Por consiguiente, aparte de las explicaciones geneticas, se intento describir la heterosis a nivel molecular. Se partio del supuesto de que las diferencias cuantitativas de las reservas de ARNm de algunos genes que existen entre los progenitores y sus hnbridos contribuyen a la base molecular de la heterosis. Esta expresion genica diferencial de los hnbridos en comparacion con los progenitores endogamicos pudo observarse en el pasado en diversos estudios. Estos estudios mostraron grandes cambios en el transcriptoma de los hnbridos en comparacion con sus progenitores (Stupar et al.; 2008; 'Gene expression analyses in maize inbreds and hybrids with varying levels of heterosis'; BMC Plant Biol. 8: 33; Guo et al.; 2006; 'Genome-wide transcript analysis of maize hybrids: allelic additive gene expression and yield heterosis'; Theor. Appl. Genet. 113: 831-845; Swanson-Wagner et al.; 2006; 'All possible modes of gene action are observed in a global comparison of gene expression in a maize F1 hybrid and its inbred parents'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 103: 6805-6810; Meyer et al.; 2007; 'Heterosis associated gene expression in maize embryos 6 days after fertilization exhibits additive, dominant and overdominant pattern'; Plant Mol. Biol.; 63: 381-391; Jahnke et al.; 2010; 'Heterosis in early seed development: a comparative study of F1 embryo and endosperm tissues 6 days after fertilization'; Theor. Appl. Genet. 120: 389-400; Uzarowska et al.; 2007; 'Comparative expression profiling in meristems of inbred-hybrid triplets of maize based on morphological investigations of heterosis for plant height'; Plant Mol. Biol. 63: 21-34; Stupar & Springer; 2006; 'Cis-transcriptional variation in maize inbred lines b73 and Mo17 leads to additive expression patterns in the F1 hybrid'; Genetics 173: 2199-2210), que eran o bien aditivos o no aditivos. Una expresion genica aditiva determina una expresion hnbrida de acuerdo con el promedio de la expresion genica parental. Una expresion hnbrida aditiva puede explicarse mediante una expresion genica diferencial cisregulada. En una expresion no aditiva, la expresion hnbrida difiere de la expresion promedio de ambos progenitores, lo que sugiere una contribucion diferencial de los transfactores (Wittkopp et al.; 2004; 'Evolutionary changes in cis and trans gene regulation'; Nature 430: 85-88).

Por lo tanto, los estudios suponen que estan involucrados ambos genes aditivamente expresados y diferencialmente cis-regulados (Guo et al.; 2004; 'Allelic variation of gene expression in maize hybrids'; Plant Cell 16: 1707-1716; Springer & Stupar; 2007; 'Allelic variation and heterosis in maize: How do two halves make more than a whole?'; Genome Res. 17: 264-275; Thiemann et al.; 2010; 'Correlation between parental transcriptome and field data for the characterization of heterosis in Zea mays'; L. Theor. Appl. Genet. 120: 401-413), asf como genes no aditivos diferencialmente trans-regulados. Los posibles efectos trans que pueden desempenar un papel son ARNs pequenos, que pueden afectar, entre otros, al epigenoma (Ha et al.; 2009; 'Small RNAs serve as a genetic buffer against genomic shock in Arabidopsis interspecific hybrids and allopolyploids'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU. 106: 17835­ 17840). Se observaron cambios en el epigenoma, a nivel de la metilacion del ADN, entre hnbridos y progenitores endogamicos de Arabidopsis y arroz (Groszman et al.; 2011; 'Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 108: 2617-2622; He et al.; 2010; 'Global Epigenetic and Transcriptional Trends among Two Rice Subspecies and Their Reciprocal Hybrids'; Plant Cell 22: 17-33). En el caso del arroz se observo un vinculo entre los patrones de metilacion del ADN y la expresion genica en hnbridos (Chodavarapu et al.; 2012; 'Transcriptome and methylome interactions in rice hybrids'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 109: 12040-12045). En el caso del mafz y la remolacha azucarera, pudo demostrarse que los cambios en la metilacion del ADN no se limitan a los transposones, sino que tambien se dan en las regiones de codificacion de genes (Zhao et al.; 2007; 'Epigenetic inheritance and variation of DNA methylation level and pattern in maize intra-specific hybrids'; Plant Science 172: 930-938; Zhang et al.; 2007; 'Endosperm-specific hypomethilation, and meiotic inheritance and variation of DNA methylation level and pattern in sorghum (Sorghum bicolor L.) inter­ strain hybrids'; Theor. Appl. Genet. 115: 195-207).

Los ARNs pequenos estan estrechamente vinculados con la metilacion del ADN (Lister et al.; 2008; 'Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis'; Cell 133: 523-36). Contribuyen a la estabilidad del genoma y son unos reguladores importantes de la expresion genica (Van Wolfswinkel & Ketting; 2010; 'The role of small non-coding RNAs in genome stability and chromatin organization'; J. Cell Sci.; 2010; 123: 1825-39). Los ARNs pequenos tienen una longitud de 15 nt a 40 nt y provocan o bien un silenciamiento genico transcripcional (TGS, por sus siglas en ingles) o bien un silenciamiento genico post-transcripcional (PTGS, por sus siglas en ingles). Dependiendo de las diferentes vfas o rutas biosinteticas, se dividen en siRNAs (ARNs pequenos de interferencia; tambien llamados ARNips) y mi-ARNs o micro-ARNs (microRNA o miRNA, en ingles) (Bartel; 2004; 'MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function'; Cell 116: 281-297). Los mi-ARNs se derivan de los, asf llamados, genes MIR que codifican transcriptos monocatenarios y que luego forman una estructura de horquilla y, posteriormente, se convierten en mi-ARNs maduros gracias a las protemas DICER (Bartel; 2004; 'MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function'; Cell 116: 281-297). Sin embargo, los siRNAs provienen de ARNs bicatenarios y tienen una gran variedad de lugares de origen y/o biogenesis. Los ARNs bicatenarios que pueden llevar a la formacion de siRNAs se derivan, por ejemplo, de regiones de secuencia complementarias inversas (repeticion invertida) de ARN transcrito, pares de transcripcion naturales cis-antisentido, polimerasas de ARN dependiente del ARN (RDRs), la replicacion de virus de ARN o regiones genomicas ricas en retroelementos (Khraiwesh et al.; 2012; 'Role of miRNAs and siRNAs in biotic and abiotic stress responses of plants'; Biochim. Biophys. Acta 1819: 137-48). Los ARNs bicatenarios se convierten en siRNAs bicatenarios cortos mediante DICER. Son, entre otras cosas, importantes represores de transposones y secuencias virales (Mallory & Vaucheret; 2006; 'Functions of microRNAs and related small RNAs in plants'; Nat. Genet. 38: S31-S36).

La primera prueba de la participacion de ARNs pequenos en el efecto de heterosis vino del mafz y Arabidopsis y mostro una expresion diferencial de ARNs pequenos entre fnbridos y lmeas endogamicas (Barber et al.; 2012; 'Repeat associated small RNAs vary among parents and following hybridization in maize'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 106: 10444-10449; Groszmann et al.; 2011; 'Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 108: 2617-2622). En estos estudios, los siRNAs de 24 nt se redujeron en los hnbridos y los mi-ARNs reguladores expresados no aditivamente. Los siRNAs reducidos estaban relacionados principalmente con genes reguladores y sus regiones laterales y tambien mostraron una asociacion con la expresion genica en los hnbridos. Se ha sugerido que estos -asf llamados- epialelos regulados epigeneticamente podnan contribuir a la heterosis mediante la variacion hnbrida (Groszmann et al.; 2011; 'Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 108: 2617-2622). En el caso del mafz, se ha identificado un tipo determinado de siRNAs largos de 22 nt expresados diferencialmente (Nobuta et al.; 2008; 'Distinct size distribution of endogenous siRNAs in maize: Evidence from deep sequencing in the mop1-1 mutant'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 105: 14958-14963). Un estudio realizado en dos lmeas endogamicas y sus hnbridos redprocos revelo que los siRNAs de 22 nt expresados diferencialmente entre las lmeas endogamicas y los hnbridos provienen de ciertos retrotransposones y podnan contribuir a la heterosis debido a la variabilidad (Barber et al.; 2012; 'Repeat associated small RNAs vary among parents and following hybridization in maize'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 106: 10444-10449). Un estudio posterior sobre el mafz con hnbridos redprocos y sus progenitores revelo unas alteraciones epigeneticas complejas en los hnbridos en comparacion con sus progenitores basandose en la metilacion del ADN, la modificacion de la histona y los ARNs pequenos (Shen et al.; 2012; 'Genome-Wide Analysis of DNA Methylation and Gene Expression Changes in Two Arabidopsis Ecotypes and Their Reciprocal Hybrids'; The Plant Cell 24: 875-892). Scholten et al. plantean la hipotesis de que los ARNs pequenos no codificantes tienen un potencial de prediccion ('Diagnostics in plant breeding'; [20130101]; pags. 265ff).

Pero las observaciones realizadas hasta la fecha no dan muestra alguna de una influencia directa y cuantitativa de los ARNs pequenos sobre la heterosis.

Actualmente, la produccion de hnbridos con una heterosis fuerte se lleva a cabo principalmente basandose en pruebas de campo de prueba y error. A tal efecto, se cruzan progenitores geneticamente diferentes y se cultiva su descendencia para analizar sus caractensticas (Windhausen et al.; 2012; 'Effectiveness of genomic prediction of maize hybrid performance in different breeding populations and environments'; G3 2: 1427-1436). Puesto que caractensticas importantes como la produccion solo pueden medirse en fases tardfas del ciclo vital, estas pruebas requieren mucho tiempo. Ademas, en algunos casos la distancia genetica entre dos progenitores tiene una correlacion inconsistente con la heterosis y, por lo tanto, resulta insuficiente para predecir el rendimiento del hnbrido (Melchinger; 1999; 'Genetic diversity and heterosis'; en: Coors JG, Pandey S (editores); 'The genetics and exploitation of heterosis in crops'; ASA-CSSA; Madison; pags. 99-118). Debido a estas limitaciones, durante el proceso de mejoramiento se analizan muchos hnbridos no aptos, lo que conlleva unos costes elevados. Mas particularmente, a tenor del gran numero de lmeas endogamicas que se producen ahora en los programas de mejoramiento comercial de fnbridos en cada ciclo de mejoramiento, los posibles fnbridos no pueden analizarse por completo debido al elevado coste de las pruebas de campo, lo cual provoca perdidas significativas de companeros de cruce potencialmente extraordinarios (Schrag et al.; 2006; 'Prediction of single-cross hybrid performance for grain yield and grain dry matter content in maize using AFLP markers associated with QTL'; Theor. Appl. Genet. 113: 1037-1047).

Se han desarrollado metodos que permiten realizar una prediccion de caractensticas hnbridas basandose en marcadores geneticos que indican polimorfismos de la secuencia de ADN entre las lmeas parentales (Schrag et al.; 2006; 'Prediction of single-cross hybrid performance for grain yield and grain dry matter content in maize using AFLP markers associated with QTL'; Theor. Appl. Genet. 113: 1037-1047; Schrag et al.; 2009; 'Molecular marker-based prediction of hybrid performance in maize using unbalanced date from multiple experiments with factorial crosses'; Theor. Appl. Genet. 118: 741-751). La prediccion precisa y fiable en base a los marcadores geneticos sigue siendo un desaffo (Windhausen et al.; 2012; 'Effectiveness of Genomic Prediction of Maize Hybrid Performance in Different Breeding Populations and Environments'; G3 2: 1427-1436; Reif et al.; 2012; 'Gemomic prediction of sunflower hybrid performance'; Plant Breed; 132: 107-114). Tambien se usaron marcadores geneticos en combinacion con datos de metabolitos de lmeas parentales para predecir rasgos o caractensticas hnbridas (Gartner et al.; 2009; 'Improved Heterosis Prediction by Combining Information on DNA- and Metabolic Markers'; PLOS ONE 4: e5220; Riedelsheimer et al.; 2012; 'Genomic and metabolic prediction of complex heterotic traits in hybrid maize'; Nature Publishing Group 44: 217-220). Estos modelos experimentales usados para integrar multiples niveles de datos muestran la gran demanda y el enorme interes que existen para mejorar la precision y la fiabilidad de los metodos para la prediccion de rasgos hnbridos.

A partir de estudios en los que se observo que la expresion genica se ve alterada en los hnbridos en comparacion con las lmeas parentales, se concluyo que los efectos hnbridos estan relacionados con los patrones de expresion genica modificada (Hochholdinger & Hoecker; 2007; 'Towards the molecular basis of heterosis'; Trends in Plant Science 12: 427-432). Las predicciones sobre el rendimiento y la heterosis de los hnbridos podnan realizarse en base a los perfiles de transcripcion parentales en el mafz (Fu et al.; 2012; 'Partial least squares regression, support vector machine regression, and transcriptome-based distances for prediction of maize hybrid performance with gene expression data'; Theor. Appl. Genet. 124: 825-833; Frisch et al.; 'Transcriptome-based distance measures for grouping of germplasm and prediction of hybrid performance in maize'; Theor. Appl. Genet. 120: 441-450) y en Arabidopsis (Stokes et al.; 2010; 'An association transcriptomics approach to the prediction of hybrid performance'; Mol. Breeding 26: 91-106).

Asimismo, en el caso del tomate (Shivaprasad et al.; 2011; 'Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs'; The EMBO Journal 31: 257-266), Arabidopsis (Groszmann et al.; 2011; 'Changes in 24-nt siRNA levels in Arabidopsis hybrids suggest an epigenetic contribution to hybrid vigor'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 108: 2617-2622), el mafz ('Repeat associated small RNAs vary among parents and following hybridization in maize'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. u U.; 109: 10444-10449) y el arroz (Chodavarapu et al.; 2012; 'Transcriptome and methylome interactions in rice hybrids'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 109: 12040-12045), se descubrio recientemente que la expresion de ARNs pequenos difiere entre progenitores y sus hnbridos. Mas particularmente, las diferencias en la expresion de ARNs de 24 nt originaron la hipotesis de un componente epigenetico de la heterosis.

Sin embargo, todos los metodos conocidos anteriormente no pueden aplicarse para predecir cuantitativamente la heterosis o el rendimiento de un hnbrido espedfico y, por lo tanto, para determinar las lmeas parentales mas prometedoras. Aun no se conoce un metodo que permita, en base a las lmeas parentales, una prediccion exacta de la cantidad o nivel de heterosis o vigor hnbrido de los hnbridos resultantes. Por consiguiente, el objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo asf que permita, en base a las lmeas parentales, una prediccion exacta de la cantidad o nivel de heterosis o vigor hnbrido de los hnbridos resultantes.

De acuerdo con la invencion, este objetivo se alcanza mediante un metodo en el que se identifican las moleculas de ARN pequeno o sRNA (por sus siglas en ingles) que estan relacionadas con un rasgo o caractenstica hnbrida y se analizan las lmeas parentales que son adecuadas para la produccion de hnbridos a fin de hallar los niveles de expresion de las moleculas de ARN pequeno identificadas; de manera que la identificacion de las moleculas de ARN pequeno comprende los pasos de:

a) determinacion del alcance de la expresion de rasgos o caractensticas en diferentes hnbridos producidos a partir de lmeas parentales geneticamente diferentes; y

b) analisis de las lmeas parentales de los hnbridos testados en cuanto a la expresion de su ARN pequeno. De este modo, la invencion permite la seleccion de organismos adecuados para la produccion de hnbridos vegetales que tengan un mayor vigor hnbrido o heterosis en uno o mas rasgos hnbridos, como la produccion, la fertilidad, la resistencia al estres, etc.

El metodo de acuerdo con la invencion, tal y como se especifica en las reivindicaciones, puede iniciarse con moleculas de ARN pequeno identificadas previamente, de manera que se seleccionan las lmeas parentales mas prometedoras en base a la expresion de estas moleculas de ARN pequeno. Por otra parte, es posible identificar nuevas moleculas de ARN pequeno. Esto resulta necesario, por ejemplo, cuando para ciertos organismos no se ha designado ninguna molecula correspondiente de ARN pequeno o los organismos no se han analizado hasta el momento en busca de un rasgo particular.

Por consiguiente, una realizacion preferida de la invencion proporciona la identificacion de moleculas de ARN pequeno, que comprende los pasos de:

a) cultivar plantas o animales de lmeas parentales geneticamente diferentes;

b) cruzar dichas plantas o animales para producir hnbridos;

c) determinar el alcance de la expresion de rasgos o caractensticas en tnbridos diferentes;

d) analizar las lmeas parentales de los hnbridos testados en cuanto a la expresion de su ARN pequeno. El analisis de las lmeas parentales en cuanto al nivel de expresion de las moleculas de ARN pequeno identificadas se realiza, por ejemplo, determinando el numero de moleculas de ARN pequeno. De este modo, se determina la expresion diferencial de ARN pequeno entre las lmeas parentales geneticamente diferentes.

De manera sorprendente, se descubrio que los perfiles de expresion de los -asf llamados- ARNs pequenos o 'sRNAs' (por sus siglas en ingles) que tienen una longitud de entre 15 y 40 nucleotidos, que no codifican protemas, permiten sacar conclusiones sobre los rasgos hnbridos. Mas particularmente, estos sRNAs pueden usarse para hacer predicciones sobre el alcance de la heterosis u otras caractensticas de los hnbridos resultantes del cruce de plantas o animales. De este modo, la presente invencion proporciona unos beneficios significativos para el proceso de mejoramiento, ya que las predicciones sobre los rasgos hnbridos pueden realizarse con una generacion de adelanto sin necesidad de recoger datos de campo para los genotipos exactos. En comparacion con un metodo que utiliza perfiles de expresion del ARNm, la presente invencion se distingue por una exactitud de prediccion particularmente alta.

Las mediciones de la expresion de sRNAs en organismos individuales o en un grupo de organismos, como en lmeas endogamicas o hnbridos con un esquema de cruce factorial de una poblacion reproductora, preferiblemente se realizan utilizando una secuenciacion de alto rendimiento (por ejemplo, pirosecuenciacion, secuenciacion mediante hibridacion, secuenciacion de ADN semiconductor de iones, secuenciacion por smtesis de puentes, secuenciacion de dos bases, secuenciacion de extremo pareado) o una secuenciacion de alto rendimiento mediante la medicion de la reaccion de moleculas individuales (por ejemplo, protones, fluoroforos) o metodos convencionales, por ejemplo, el metodo de Maxam y Gilbert (Maxam & Gilbert; 1977; 'A new method for sequencing DNA'; Proc. Natl. Acad. Sci.; EE. UU.; 74: 560-564) o el metodo dideoxi de Sanger (Sanger & Coulson; 1975; 'A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase'; Journal of Molecular Biology; 94: 441-448), a fin de registrar cuantitativamente de la manera mas exhaustiva posible los sRNAs individuales existentes. Si un conjunto predeterminado de sRNAs se usara para la prediccion, los datos de expresion del sRNA pueden medirse utilizando metodos de PCR; por ejemplo, RT-PCR cuantitativo (Varkonyi-Gasic et al.; 2007; 'Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs'; Plant Methods 3: 12) o experimentos con chips o micromatrices (Bowtell & Sambrook; 2003; 'DNA microarrays: a molecular cloning manual'; Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor; Ney York; EE. UU.).

Preferiblemente, los datos de expresion del sRNA deben normalizarse para obtener una comparabilidad optima entre las diferentes mediciones. Para este fin pueden usarse diversos metodos. Para los datos de expresion a partir de la secuenciacion, los valores de expresion pueden ajustarse, por ejemplo, mediante un factor de escala como la profundidad de secuenciacion. De manera alternativa, puede realizarse una normalizacion mediante controles endogenos o artificiales.

Otro metodo posible es la normalizacion por cuantiles, promedio o de varianza (McCormick et al.; 2011; 'Experimental design, preprocessing, normalization, and differential expression analysis of small RNA sequencing experiments'; Silence 2: 2).

Los datos de caractensticas utilizados para la asociacion con los datos de expresion del sRNA pueden obtenerse de forma cualitativa y/o cuantitativa a partir de experimented de campo/en invernadero y experimentos de laboratorio o durante el proceso de produccion o de reproduccion. Los datos cuantitativos o cualitativos de las caractensticas pueden obtenerse a partir de lmeas endogamicas, hteridos, transgenicos u otros genotipos.

El analisis correlativo de los datos de sRNA con los datos de caractensticas puede llevarse a cabo usando un conjunto fijo y predeterminado de sRNAs o un conjunto de sRNAs espedfico para hteridos de un estudio de asociacion.

Preferiblemente, la asociacion de los datos de expresion del sRNA con los datos cualitativos de las caractensticas se lleva a cabo mediante una prueba de probabilidad binomial. Los individuos se dividen en dos o mas grupos cualitativos dependiendo de sus caractensticas, y se analiza la probabilidad de una asociacion no aleatoria de diversos patrones de expresion del sRNA (ver Ejemplo 1). Por ejemplo, los patrones de expresion del sRNA pueden ser expresiones diferenciales entre diferentes individuos (por ejemplo, progenitores hteridos), asf como diferencias en los valores de expresion absolutos. La identificacion de sRNAs expresados diferencialmente puede obtenerse estableciendo una expresion minima y un pariente mmimo y/o una diferencia absoluta en la expresion. De manera alternativa, una expresion diferencial puede establecerse mediante pruebas o test estadfsticos (por ejemplo, una prueba F, una prueba T, ANOVA o analisis de la varianza). Preferiblemente, se usan replicas biologicas y/o tecnicas. La asociacion de los datos de expresion del sRNA con los datos cualitativos de las caractensticas puede realizarse tal y como se ha explicado en relacion a los datos cualitativos de las caractensticas, de manera que los valores cuantitativos de las caractensticas se dividen preferiblemente en dos tipos o clases cualitativas (por ejemplo, valores caractensticos altos y bajos). De manera alternativa a una prueba de probabilidad binomial, los sRNAs relacionados pueden identificarse mediante metodos de regresion parametricos/no parametricos (por ejemplo, regresion lineal) u otros metodos matematicos de reconocimiento de patrones (por ejemplo, SVM, Random Forest, redes neurales). Ademas del estudio cuantitativo de los datos de expresion de sRNAs individuales para la asociacion con datos de las caractensticas, estos datos de expresion tambien pueden integrarse basandose en ciertos criterios (por ejemplo, anotaciones/regiones de secuencias genomicas). Una posibilidad adicional es el estudio meramente cualitativo de sRNAs (por ejemplo, la expresion a ciertos niveles) para la asociacion con datos caractensticos mediante, por ejemplo, una prueba de probabilidad binomial.

La prediccion de datos de las caractensticas puede realizarse usando los datos de expresion del sRNA de un individuo o en base a los datos de expresion de los progenitores de una prole. Para realizar una prediccion, la expresion del sRNA y los datos de las caractensticas de otros individuos (para la prediccion de las caractensticas de los individuos) o los datos de expresion del sRNA de los progenitores y los datos de las caractensticas de su prole deben existir hasta cierto punto. La prediccion se realiza determinando los parametros de prediccion (por ejemplo, los parametros de regresion) basados en los individuos conocidos y aplicando estos parametros a los datos de expresion del sRNA del individuo que tenga el rasgo que se va a predecir.

Los parametros de prediccion pueden determinarse basandose en los datos absolutos de expresion del sRNA o, alternativamente, mediante mediciones de distancia (por ejemplo, entre progenitores de una prole o individuos y un individuo de referencia).

En resumen, la invencion comprende el uso de analisis de expresion del sRNA de plantas, o de sus hteridos y/o lmeas endogamicas o cualesquiera otros genotipos, tal y como se determina en las reivindicaciones, (1) para realizar predicciones sobre el alcance de la heterosis y otros rasgos o caractensticas en plantas o animales y (2) para identificar companeros de cruce que proporcionen combinaciones ventajosas respecto a sus perfiles de sRNA y cuyas proles proporcionen mejores prestaciones respecto a uno o mas rasgos. De este modo, por ejemplo, puede identificarse un conjunto de 11272 sRNAs, lo cual permite realizar la prediccion de la heterosis para la produccion de granos en el mafz y tambien puede usarse como un conjunto completo o parcial para la prediccion de caractensticas analogas en otras especies vegetales.

La invencion permite que un cultivador realice una prediccion de la heterosis de diferentes rasgos y la prediccion de caractensticas no heteroticas examinando los perfiles de expresion del sRNA. La invencion tambien permite la prediccion de caractensticas mediante el analisis de las etapas muy tempranas (por ejemplo, plantulas) de la misma generacion o de la siguiente. El material de muestras de sRNA que se usa para generar los datos de expresion del sRNA puede diferir respecto a la etapa de desarrollo o el tejido de las caractensticas expresadas. Esto significa que los tejidos utilizados para la investigacion de sRNAs no deben ser identicos a los de las mediciones de las caractensticas. Esto conlleva un menor tiempo y menos dinero gastado en el cultivo, y tambien a lo largo de todo el proceso de seleccion para la reproduccion. Ademas, la utilizacion de etapas tempranas de desarrollo permite unas condiciones de cultivo controladas (por ejemplo, un invernadero, una camara de crecimiento) y, de este modo, se puede realizar una prediccion replicable o reproducible. En el caso del mejoramiento vegetal, pueden evitarse las pruebas de campo testando las plantulas de las lmeas parentales o los genotipos parentales para predecir las proles.

A efectos de la presente solicitud, las plantas incluyen, por ejemplo, cereales como el trigo, la cebada, el arroz o el mafz, vegetales como el pimenton, las cebollas, las zanahorias o los tomates, frutas como la manzana, la pera, la cereza o la uva, y otros vegetales economicamente importantes como las legumbres, las hierbas (por ejemplo, Miscanthus) o algas para la produccion de biomasa o arboles para obtener madera (por ejemplo, el chopo).

Un requisito para la heterosis en plantas es el mejoramiento de lmeas endogamicas o lmeas poco heterocigotas para la produccion de tnbridos. Esto resulta mas facil en plantas con una alogamia que se da de manera natural (polinizacion cruzada). Tambien existe la posibilidad de usar la esterilidad masculina, que se divide en la -asf llamada- 'Esterilidad masculina genica (nuclear)' (o GMS, por sus siglas en ingles) y la 'Esterilidad masculina citoplasmica' (o CMS, por sus siglas en ingles) (Bruce; 1910; 'The Mendelian theory of heredity and the augmentation of vigor'; Science 32: 627-628).

Otras aplicaciones de la presente divulgacion incluyen los animales, excepto los humanos, como los mairnferos, las aves y los peces. Los ejemplos en los que la heterosis desempena un papel importante incluyen los animales de granja, como el ganado, los cerdos, las ovejas, las cabras, los pollos o los pavos. Los peces de cultivo pisdcola en los que la heterosis es importante incluyen, por ejemplo, el salmon o la carpa. Tambien es posible aplicar la divulgacion a animales reproductores no relevantes agrariamente como caballos de carrera o perros. Para la presente invencion, la asociacion directa y cuantitativa de sRNAs con la heterosis u otras caractensticas se utiliza para la prediccion.

Los estudios tambien han revelado grandes diferencias en los perfiles de expresion del sRNA entre lmeas endogamicas diferentes y entre lmeas endogamicas y sus proles hfbridas. Las investigaciones sobre las poblaciones de sRNA de diversas lmeas endogamicas y de los correspondientes datos de campo exhaustivos permiten determinar el impacto directo de algunos sRNAs sobre la heterosis.

La investigacion de un total de 21 lmeas endogamicas de dos grupos heteroticos de mafz (mafz mellado y mafz duro) condujo a la anteriormente mencionada identificacion de 11 272 sRNAs cuya expresion parental diferencial esta relacionada con la heterosis de la produccion de grano. De estos, 6915 fueron negativos y 4357 fueron positivos y estaban relacionados con la heterosis de la produccion de grano.

Por consiguiente, la heterosis en tnbridos de mafz puede predecirse con exito en base a la expresion parental diferencial de sRNA. Puesto que la heterosis es un fenomeno generalizado que no se limita al mafz u otros granos, sino que tambien se da en animales, la utilizacion de sRNAs descrita en el presente documento, tanto en un conjunto completo como parcialmente, tambien es bastante concebible en otras especies vegetales y animales, siempre y cuando estos se conserven y se prediga un rasgo heterotico similar al de la produccion de grano. De lo contrario, el metodo de acuerdo con la invencion requiere la identificacion de nuevos conjuntos predictivos de sRNAs mediante la asociacion de datos de expresion del sRNA y los respectivos datos de caractensticas de los progenitores y los tnbridos. Con estos sRNAs predictivos es posible realizar una prediccion para otros companeros de cruce.

La invencion que se describe en el presente documento, y que se especifica en las reivindicaciones, es complementaria con otros metodos usados para la prediccion de caractensticas tnbridas y puede combinarse en modelos integrados con diferentes niveles de datos, como marcadores geneticos (por ejemplo, SNPs y otros marcadores de ADN), mRNA, protemas o datos de metabolitos (Riedelsheimer et al.; 2012; 'Genomic and metabolic prediction of complex heterotic traits in hybrid maize'; Nature Publishing Group 44: 217-220).

La presente invencion tambien esta relacionada con el uso de moleculas de sRNA para la prediccion de rasgos tnbridos en plantas, tal y como se especifica en las reivindicaciones. Mas particularmente, las moleculas de sRNA son moleculas de sRNA parental expresadas diferencialmente que estan relacionadas con el alcance o magnitud de la expresion del rasgo tnbrido. El numero de moleculas de sRNA permite realizar una buena prediccion sobre el alcance de la heterosis.

Ejemplo

Figura 1: regresion lineal de las distancias binarias combinadas Db de 98 tnbridos

Figura 2: precision o exactitud de la prediccion -basada en el sRNA- de la heterosis para la produccion de grano

Se midio la expresion del sRNA de lmeas endogamicas de mafz de los dos grupos heteroticos (mafz duro y mellado). El mafz es adecuado para estos estudios debido al rango comparativamente grande de niveles de heterosis.

Se cultivaron un total de 21 lmeas endogamicas con un esquema de cruce de 7x14 en condiciones controladas.

Cuatro de las siete Imeas de mafz duro teman un acervo genetico de 'European Flint' y las tres restantes, 'Flint/Lancaster'. Ocho de las Imeas de mafz mellado teman un acervo genetico de 'Iowa Stiff Stalk Synthetic' y seis, de 'lodent'. Los datos de campo de los 98 hnbridos del esquema de cruce y los de las Imeas endogamicas se obtuvieron en diferentes lugares de Alemania. Las pruebas de campo se realizaron con una disposicion experimental de 2 filas con 2-3 replicas o duplicados. La produccion de grano se midio en Mg/ha con una humedad de grano de 155g/kg. La heterosis de cada par de lmea endogamica y su hnbrido se determino como MPH (por las siglas en ingles de 'mean parental heterosis', es decir, 'heterosis parental promedio') en Mg/Ha con una humedad de grano de 155 g/kg.

Se agruparon cinco replicas biologicas de plantulas de cada lmea endogamica 7 dfas despues de la siembra y se aislo el ARN del total del material biologico. El 'sRNAoma' se analizo mediante secuenciacion profunda de Illumina. Los adaptadores de secuenciacion se eliminaron de los datos de secuenciacion en bruto y se eliminaron las regiones de secuencia que tuvieran una calidad de secuenciacion baja inferior a un 99,9%. Todas las secuencias redundantes con una longitud de entre 15 nt y 40 nt se combinaron para el siguiente analisis y se determino su numero de secuencia (expresion del sRNA).

Los datos de expresion del sRNA se normalizaron por cuantiles con una modificacion que evitaba la asignacion de datos de expresion normalizados a sRNAs sin expresar (Bolstad et al.; 2003; 'A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias'; Bioinformatics 19: 185-93).

Los valores de expresion normalizados por cuantiles se normalizaron a un numero de secuencia por millon de secuencias por biblioteca de secuenciacion (recuento de lecturas por millon de lecturas normalizadas por cuantiles, o 'rpmqn', por sus siglas en ingles). Esto permite realizar una comparacion de diferentes bibliotecas de secuencias y diferentes profundidades de secuenciacion.

Se asumio que los sRNAs que teman una expresion minima de 0,5 rpmqn se expresaban por definicion. Los expresados diferencialmente fueron los sRNAs con una diferencia minima de la expresion con un factor >=2, o, si un progenitor estaba por debajo de la expresion minima, la expresion minima del otro progenitor debfa multiplicarse por la diferencia de expresion minima (= 1 rpmqn).

La asociacion de sRNAs parentales expresados diferencialmente con la heterosis se baso en el metodo de Frisch et al. (Frisch et al.; 2010; 'Transcriptome-based distance measures for grouping of germplasm and prediction of hybrid performance in maize'; Theor. Appl. Genet. 120: 441-450) con la ampliacion a sRNAs negativamente asociados. Segun sus niveles de heterosis, los 98 hnbridos se dividieron en dos tipos o clases (heterosis baja/alta) y, para cada sRNA en ambos tipos, se determino el numero de fnbridos con expresion parental diferencial. Para cada sRNA se determino ^oi y oh, en correspondencia con el numero de hnbridos en los tipos de heterosis baja y alta, cuyos progenitores tienen una expresion diferencial del sRNA examinado. La probabilidad de distribucion binomial calculada posteriormente representa la probabilidad de expresion diferencial, que se distribuye de manera desigual en los dos tipos, y, por lo tanto, se relaciona con el MPH de produccion de grano. La probabilidad se calcula de acuerdo con la Formula 3 como una funcion del numero de expresion diferencial del sRNA en los tipos o clases definidas (Formula 1 o 2).

Los valores-p < 0,05, de acuerdo con la correccion FDR de Benjamini-Hochberg (Benjamini & Hochberg; 1995; 'Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing'; J. R. Statist. Soc. B 57: 289-300), indican una asociacion significativa del sRNA testado con el MPH de produccion de granos. Se determino la distancia binaria combinada Db de cada hnbrido basandose en un conjunto de analisis de sRNAs que comprendfa el numero nf,p0s, correspondiente a los sRNAs asociados positivamente, y el numero nfneg, correspondiente a los sRNAs asociados negativamente, asf como los numeros de sRNAs expresados diferencialmente, nd,pos, de los sRNAs asociados positivamente y ndneg, de los sRNAs asociados negativamente, del conjunto de analisis (Formula 4):

De los datos de expresion del sRNA de las 21 lmeas endogamicas, se identificaron un total de 11272 sRNAs que estan asociados o relacionados significativamente con la heterosis de la produccion de granos. 4357 de estos sRNAs estan positivamente asociados y 6915 estan negativamente asociados con la heterosis de la produccion de granos.

Una regresion lineal de las distancias binarias combinadas Db, basada en los 11 272 sRNAs -de los 98 hforidos testados- significativamente asociados con la heterosis de la produccion de granos, mostro una alta correlacion de r = 0,933 con el rasgo asociado de heterosis de la produccion de granos (Figura 1).

Esta alta correlacion sugiere una elevada exactitud de prediccion de los sRNAs. Para confirmar este supuesto, se llevaron a cabo validaciones cruzadas de tipo-0 y tipo-2 como se describen en Frisch et al. (Frisch et al.; 2010; 'Transcriptome-based distance measures for grouping of germplasm and prediction of hybrid performance in maize'; Theor. Appl. Genet. 120: 441-450) con un total de 100 realizaciones. A tal fin, se determinaron dos conjuntos no superpuestos de progenitores endogamicos en cada validacion, el conjunto de determinacion a traves del cual se determinan los parametros de prediccion, y el conjunto de predicciones para cuyos hforidos se predice la heterosis de la produccion de granos. Para cada validacion cruzada, se determinan todos los sRNAs relacionados o asociados con la heterosis de la produccion de granos (p > 0,05, sin correccion de errores) basandose en los hfbridos posibles del conjunto de determinacion. Basandose en los sRNAs asociados determinados del conjunto de destino, puede determinarse la distancia binaria combinada Db de los progenitores del conjunto de determinacion de cada uno de los hfbridos. Los parametros a (intercepto o interseccion del eje y) y b (pendiente) de la ecuacion lineal (Formula 5) pueden calcularse para el conjunto de determinacion mediante el metodo de mmimos cuadrados (minimizacion de menos cuadrados) utilizando los valores H y Db conocidos para los hfbridos del conjunto de destino. Los parametros de prediccion calculados (a y b) y la distancia binaria Db, que se calcula individualmente para cada hfbrido del conjunto de prediccion en base a los sRNAs asociados del conjunto de destino, se usan entonces para predecir la heterosis de la produccion de granos H para cada uno de estos hfbridos (Formula 5).

En cada prueba de validacion cruzada, la distancia binaria combinada Db se calcula para cada hfbrido de parejas de progenitores endogamicos del conjunto de prediccion de acuerdo con la Formula 4, y el valor caractenstico de la heterosis de la produccion de granos H se calcula por medio de los parametros de regresion determinados a y b determinados mediante el conjunto de destino, tal y como se ha explicado anteriormente, de acuerdo con la Formula 5. La precision o exactitud de la prediccion se determina por medio de los coeficientes de correlacion de los valores caractensticos conocidos y predichos para la heterosis de la produccion de grano de los hfbridos del conjunto de prediccion. Los resultados de las validaciones de tipo-0 y tipo-2 se muestran en la Figura 2.

El metodo de acuerdo con la presente invencion permite realizar unas predicciones de gran calidad sobre los datos de expresion del sRNA para la heterosis y, mas particularmente, para la produccion de grano.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para predecir el nivel o cantidad de heterosis en plantas, de manera que se identifican las moleculas de sRNA (o a Rn pequeno) que estan relacionadas con un rasgo hforido y se analizan las lmeas parentales que son adecuadas para la produccion de hforidos a fin de hallar el nivel de expresion de las moleculas de sRNA identificadas; y de manera que la identificacion de las moleculas de sRNA comprende los siguientes pasos:

a) determinar el alcance de la expresion de rasgos o caractensticas en diferentes hforidos producidos a partir de lmeas parentales geneticamente diferentes; y

b) analizar las lmeas parentales de los hforidos testados en cuanto a la expresion de su sRNA.

2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, que se caracteriza por el hecho de que las moleculas de sRNA tienen una longitud de entre 15 y 40 nucleotidos.

3. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que se caracteriza por el hecho de que las moleculas de sRNA no codifican protemas.

4. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza por el hecho de que se lleva a cabo una determinacion de la expresion del sRNA diferencial entre lmeas parentales geneticamente diferentes.

5. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza por el hecho de que el rasgo o caractenstica es el rendimiento o produccion.

6. Un metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza por el hecho de que se realiza un analisis en plantulas sobre la expresion del sRNA de las lmeas parentales.

7. El uso de moleculas de sRNA para la prediccion del nivel o cantidad de heterosis en plantas.

8. El uso de acuerdo con la reivindicacion 7, que se caracteriza por el hecho de que las moleculas de sRNA son moleculas de sRNA parental expresado diferencialmente que estan relacionadas con el alcance o magnitud de la expresion de un rasgo.