ES2708944T3

ES2708944T3 - Composiciones y métodos para la inhibición específica de la expresión de genes por DSRNA que tenga modificaciones

Info

Publication number: ES2708944T3
Application number: ES09814902T
Authority: ES
Inventors: Bob Brown
Original assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Dicerna Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2009-09-17
Publication date: 2019-04-12
Anticipated expiration: 2029-09-17
Also published as: JP2012504389A; JP2017079761A; EP2341943A4; JP2015221042A; EP2341943A2; DK2341943T3; CA2738625A1; AU2009293636A1; US20100331389A1; WO2010033225A3; JP6295232B2; PT2341943T; CA2738625C; EP2341943B1; WO2010033225A2; US20130041010A1

Abstract

Un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) que comprende: i) una primera cadena, en la que dicha primera cadena tiene de 19 a 80 nucleótidos de longitud, y ii) una segunda cadena, en la que dicha segunda cadena tiene de 19-35 nucleótidos de longitud, en el que con referencia a cualquiera de las figuras 1A, 1B, 5A y 5B, la primera y segunda cadenas forman un dúplex en la región B de 15-35 pares de base de longitud; donde la primera cadena comprende una región E en el extremo 3', donde la región E comprende un tetrabucle; y el ARN bicatenario comprende una discontinuidad entre el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena, donde el ARN bicatenario disminuye la expresión génica diana en una célula de mamífero.

Description

DESCRIPCION

Composiciones y metodos para la inhibicion espedfica de la expresion de genes por DSRNA que tenga modificaciones

Referencias cruzadas a solicitudes relacionadas

La presente solicitud esta relacionada con la prioridad de las reivindicaciones bajo 35 U.S. C. § 119 (e) a la solicitud de patente provisional de los EE. UU. N° 61/136736, presentada el 22 de septiembre de 2008 y la solicitud de patente provisional N° 61/136741, presentada el 22 de septiembre de 2008.

Antecedentes de la invencion

La supresion de la expresion genica por ARN bicatenario ha sido mostrada en una variedad de sistemas incluyendo plantas (supresion de genes postranscripcional; Napoli et al., 1990), hongos (silenciamiento genico; Romano y Marcino, 1992), y nematodos (interferencia de ARN; Fire et al., 1998). El ARN bicatenario es considerablemente mas estable que el ARN monocatenario. Por ejemplo, el documento WO2007107162 de Wengel et al. describe un ARN bicatenario. La diferencia en la estabilidad del ARN bicatenario y ARN monocatenario es pronunciada en el ambiente intracelular (Raemdonck et al., 2006). Sin embargo, los ARN pequeno de interferencia no modificados son rapidamente degradados en suero, que es un ambiente bastante rico en nucleasa. La modificacion qmmica puede estabilizar significativamente el ARN pequeno de interferencia y mejorar la potencia tanto in vitro como in vivo. En los ultimos 20 anos se han realizado extensivas quimioterapias medicinales para aplicaciones en las se utilizaban acidos nucleicos sinteticos para aplicaciones experimentales o terapeuticas in vivo, como en las areas antisentido y ribozimaticas, y cientos de compuestos han sido probados en una busqueda de modificaciones que mejoren la estabilidad de la nucleasa, aumenten la afinidad de union y, a veces, tambien mejoran las propiedades farmacodinamicas de los acidos nucleicos sinteticos (Matteucci, 1997; Manoharan, 2002; Kurreck, 2003). Muchas de estas modificaciones ya han sido probadas y se ha encontrado que tienen utilidad como modificadores para su uso en los ARN pequeno de interferencia tradicionales 21mer. Varias revisiones han proporcionado resumenes de la experiencia reciente con ARN pequeno de interferencia 21mery modificaciones qmmicas (Zhang et al., 2006; Nawrot and Sipa, 2006; Rana, 2007). Tambien han sido probados u optimizados patrones de modificacion para su uso en ARN mas largos, como los ARN pequeno de interferencia del sustrato Dicer (DARN pequeno de interferencia; Collingwood et al., 2008).

La invencion proporciona composiciones utiles en ARN de interferencia que inhiben la expresion genica y proporciona metodos para su uso. Ademas, la invencion proporciona composiciones de ARN de interferencia y metodos disenados para maximizar la potencia, mejorar el procesamiento de Dicer, mejorar la estabilidad al tiempo que se evita el sistema inmunologico y no son toxicos. Adicionalmente, varias realizaciones de la invencion son adecuadas para la smtesis de alto rendimiento y a pequena escala para satisfacer las necesidades de investigacion asf como la fabricacion a gran escala para aplicaciones terapeuticas. Estas y otras ventajas de la invencion, asf como otras caractensticas inventivas, se desprenden de la descripcion de la invencion proporcionada en el presente documento.

El documento WO2008/049078 se refiere a moleculas de ARN meroduplex que contienen al menos tres cadenas nucleotidicas, componiendo las moleculas una marca o un hueco.

Sumario de la invencion

Como se describe a continuacion, la presente invencion presenta composiciones para inhibir la expresion de la actividad de un gen en una celula mairnfero. La composicion se define en la reivindicacion 1 con las caractensticas opcionales que se proporcionan en las reivindicaciones dependientes de la reivindicacion 1.

La invencion proporciona un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) que contiene una cadena sentido y una antisentido, donde las cadenas sentido y antisentido forman un duplex en la region B; la cadena sentido contiene una region E en el extremo 3' y la region E contiene un tetrabucle; y el ARN bicatenario contiene una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido (ver figura 1).

En otro aspecto, la invencion proporciona un ARN bicatenario aislado (ARN bicatenario) que contiene una cadena sentido, y una cadena antisentido donde las cadenas sentido y antisentido forman un duplex en la region H; la cadena antisentido contiene una region J en el extremo 5' y el bucle en la region J contiene un tetrabucle; y el ARN bicatenario contiene una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido (ver figura 2).

La composicion se puede utilizar para reducir la expresion de un gen diana en una celula, que implica poner en contacto una celula con un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) en una cantidad eficaz para reducir la expresion de un gen diana en una celula en comparacion con una ARN bicatenario de referencia, donde el ARN bicatenario contiene una cadena sentido y una cadena antisentido; las cadenas sentido y antisentido forman un duplex en la region B; la cadenas sentido contiene una region E en el extremo 3' y la region E contiene un tetrabucle; el ARN bicatenario contiene una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido; y la cadena antisentido se replica en un ARN diana a lo largo de al menos 19 nucleotidos de la longitud de la cadena antisentido.

La invencion puede proporcionar una composicion farmaceutica que reduzca la expresion de un gen diana en una celula de un sujeto que contiene un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) en una cantidad efectiva que reduzca la expresion de un gen diana en una celula en comparacion con un ARN bicatenario de referencia, y un vetuculo farmaceutico aceptable, donde el ARN bicatenario contiene una cadena sentido y una cadena antisentido; las cadenas sentido y antisentido forman un duplex en la region B; la cadena sentido contiene una region E en el extremo 3' y la region E contiene un tetrabucle; el ARN bicatenario contiene una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido; y la cadena antisentido replica a un ARN diana a lo largo de menos 19 nucleotidos de la longitud de la cadena antisentido.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) que contiene una primera cadena de oligonucleotido que tiene 35-39 nucleotidos de longitud, donde los nucleotidos 11-16 del extremo 3' forman un duplex con los nucleotidos 1-6 del extremo 3' y donde los nucleotidos 7-10 del extremo 3' forman una tetrabucle; y un segunda cadena de oligonucleotidos que es 16 nucleotidos mas corta en longitud que la primera cadena de oligonucleotidos, y donde todos los nucleotidos que comienzan desde el extremo 3' de la segunda cadena de nucleotidos forman un duplex con el mismo numero de nucleotidos comenzando en el extremo 5' de la primera cadena de oligonucleotidos.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) que contiene una primera cadena de oligonucleotido que tiene de 37 a 41 nucleotidos de longitud, donde los nucleotidos 11-16 del extremo 3' forman un duplex con los nucleotidos 1-6 del extremo 3' y donde los nucleotidos 7-10 del extremo 3' forman un tetrabucle; y un segundo oligonucleotido que es 14 nucleotidos mas corto de longitud que la primera cadena de oligonucleotidos y donde todos, menos los 2 ultimos nucleotidos del extremo 3' de la segunda cadena de nucleotidos, forman un duplex con el mismo numero de nucleotidos comenzando en el extremo 5' de la primera cadena de oligonucleotidos.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) que contiene una primera cadena de oligonucleotidos que tiene 37-41 nucleotidos de longitud, donde los nucleotidos 11-16 del extremo 3' forman un duplex con los nucleotidos 1-6 del extremo 3' y donde los nucleotidos 7-10 del extremo 3' forman una tetrabucle; y una segunda cadena de oligonucleotidos que es 16 nucleotidos mas corta de longitud que la primera cadena de oligonucleotidos y donde todos los nucleotidos que comienzan a partir del extremo 3' de la segunda cadena de nucleotidos forman un duplex con el mismo numero de nucleotidos comenzando en el extremo 5' de la primera cadena de oligonucleotidos.

En otro aspecto mas, la invencion proporciona un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) que contiene una primera cadena de oligonucleotidos que tiene 37-41 nucleotidos de longitud, donde los nucleotidos 11-16 del extremo 3' forman un duplex con los nucleotidos 1-6 del extremo 3' y donde los nucleotidos 7-10 del extremo 3' forman un tetrabucle; y un segundo oligonucleotido que es 18 nucleotidos mas corto de longitud que la primera cadena de oligonucleotidos, y donde todos, menos los ultimos 2 nucleotidos del extremo 3' de la segunda cadena de nucleotidos forman un duplex con el mismo numero de nucleotidos comenzando en el extremo 5' de la primera cadena de oligonucleotidos.

En un aspecto adicional, la descripcion proporciona un ARN de doble cadena (ARN bicatenario) que contiene una cadena sentido y una cadena antisentido, donde las cadenas sentido y antisentido forman un duplex que tiene 22-43 pares de bases en longitud; y el ARN bicatenario contiene uno o mas nucleotidos modificados en cualquiera de las posiciones B*1 en la cadena sentido, B*1 en la cadena antisentido, C*1-C*3 en la cadena sentido, o C*1-C*3 en la cadena antisentido (veanse las figuras 12-17).

La invencion puede proporcionar una composicion farmaceutica para reducir la expresion de un gen diana en una celula de un sujeto que contiene un ARN aislado de doble cadena en una cantidad efectiva para reducir la expresion de un gen diana en una celula en comparacion con un ARN bicatenario de referencia y una vetuculo farmaceutica aceptable donde el ARN bicatenario contiene un cadena sentido y una cadena antisentido; las cadenas sentido y antisentido forman un duplex que tiene 22-43 pares de bases de longitud; el ARN bicatenario contiene uno o mas nucleotidos modificados en cualquiera de las posiciones B*1 en la cadenas sentido, B*1 en la cadena antisentido, C*1-C*3 en la cadena sentido, o C*1-C*3 en la cadena antisentido; la cadena antisentido replica a un ARN diana a lo largo de al menos 19 nucleotidos de la longitud de la cadena antisentido.

La invencion proporciona composiciones y metodos para la inhibicion espedfica de la expresion de genes. Las realizaciones de los aspectos de la invencion se definen en este documento. Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripcion detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripcion de los dibujos

Las figuras IA, IB, IC e ID muestran las estructuras de "ARN bicatenarios con muescas". La figura IA muestra un ARN bicatenario "antisentido con muesca" que contiene una cadena sentido con un bucle extendido (region E) en el extremo 5', una region duplex formada por la cadena antisentido con la porcion monocatenaria de la cadena sentido (region B). Cuando el a Rn bicatenario esta replicado, existe una discontinuidad donde Dicer divide la cadena antisentido (mostrada por la flecha negra). La Figura 1B muestra un ARN bicatenario "antisentido con muesca" que contiene una cadena sentido con un bucle extendido (Region E) en el extremo 5', una region duplex formada por la cadena antisentido con la porcion monocatenaria de la cadena sentido (region B), y un saliente de 3' en la cadena antisentido (Region F, mostrada por el drculo a trazos). Cuando el ARN bicatenario esta replicado, existe una discontinuidad donde Dicer divide la cadena antisentido (mostrada por la flecha negra). La figura 1C muestra un ARN bicatenario "sentido con muescas" que contiene una cadena sentido con un bucle extendido (region J) en el extremo 3', y una region duplex formada por la cadena antisentido con la porcion monocatenaria de la cadena sentido (region H). Cuando el ARN bicatenario esta replicado, existe una discontinuidad donde Dicer divide la cadena sentido (mostrado por la flecha negra). El nucleotido inmediatamente proximal al sitio de excision del Dicer debe ser un ribonucleotido (gris). La Figura 1D muestra un ARN bicatenario "sentido con muesca" que contiene un cadena sentido con un bucle extendido (Region J) en el extremo 3', y una region duplex formada por la cadena antisentido con la porcion monocatenaria de la cadena sentido (region H), y un saliente de 3' en la cadena antisentido (region F mostrada por el cfrculo a trazos). Cuando el ARN bicatenario esta replicado, existe una discontinuidad donde Dicer divide la cadena sentido (flecha negra). El nucleotido inmediatamente proximal al sitio de excision del Dicer debe ser un ribonucleotido (gris).

Las figuras 2A y 2B describen como se calculan las posiciones de los extremos 5' y 3' de las cadenas sentido y antisentido de los ARN bicatenarios con muesca de la invencion. La figura 2A muestra como se calculan las posiciones de nucleotidos a partir de los extremos 5' y 3' de las cadenas sentido y antisentido cuando la cadena sentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad esta en el mismo lado del ARN bicatenario como la cadena antisentido). Se muestra el sitio de excision de Dicer en la cadena sentido (corto, flecha negra). La figura 2B muestra como se calculan las posiciones de los nucleotidos a partir de los extremos 5' y 3' de las cadenas sentido y antisentido cuando la cadena antisentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad esta en el mismo lado del ARN bicatenario como la cadena sentido). Se muestra el sitio de excision de Dicer en la cadena antisentido (corta, flecha negra).

Las figuras 3A-3C representan ejemplos de ARN bicatenarios con muesca de la invencion en los que existe una discontinuidad en el mismo lado de la molecula de ARN bicatenario como la cadena antisentido, es decir, "ARN bicatenarios antisentido con muescas". La Figura 3A muestra ejemplos de ARN bicatenarios "antisentido con muesca" de la invencion que tienen un extremo romo. La figura 3B muestra ejemplos de ARN bicatenarios "antisentido con muesca" de la invencion que tienen un saliente 3' de 2 nucleotidos. La Figura 3C muestra ejemplos de ARN bicatenarios "antisentido con muesca" de la invencion que tienen un saliente de 3' de 4 nucleotidos. Cuando el ARN bicatenario esta replicado, existe una discontinuidad en la que Dicer divide la cadena antisentido (flecha negra).

Las figuras 4A-4C representan ejemplos de ARN bicatenarios con muescas en los que existe una discontinuidad en el mismo lado de la molecula de ARN bicatenario como la cadena sentido, es decir, "ARN bicatenarios sentido con muesca". La Figura 4A muestra ejemplos de ARN bicatenarios "sentido con muesca" que tienen un extremo romo. La Figura 4B muestra ejemplos de ARN bicatenarios "sentido con muesca" que tienen un saliente 3' de 2 nucleotidos. La figura 4C muestra ejemplos de ARN bicatenarios "sentido con muesca" que tienen un saliente 3' de 4 nucleotidos. Cuando el ARN bicatenario esta replicado, existe una discontinuidad en la que Dicer divide la cadena sentido (flecha negra).

Las figuras 5A y 5B representan lugares donde las modificaciones pueden estar presentes en los ARN bicatenarios de la invencion. La figura 5A muestra un ARN bicatenario que muestra las posiciones de modificaciones 2'-O-metilo (mostradas por o) en la region C de la molecula. La Figura 5B representa un ARN bicatenario en el que la cadena sentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad esta en el mismo lado del ARN bicatenario como la cadena antisentido; mostrado por una flecha negra). En el ARN bicatenario representado en la figura 5B el extremo 5' de la cadena sentido puede ser fosforilado (mostrado por una "p-"); el extremo 5' de la cadena grna puede estar desfosforilado; la cadena antisentido puede modificarse en las posiciones 1, 2 y 3 del extremo 3' de la cadena antisentido con 2'-O-metil (mostrado por o); y el la cadena antisentido puede modificarse en posiciones numeradas raras que comienzan en la posicion 5 el extremo 3' de la cadena antisentido con 2'-O-metilo (mostrado por o). En el ARN bicatenario representado en la figura 5B, la cadena sentido puede contener desoxirribonucleotidos (mostrado por • ) en las posiciones 11 y 12 del extremo 3' de la cadena antisentido.

Las figuras 6A y 6B representan lugares donde las modificaciones pueden estar presentes en los ARN bicatenarios con muesca. La figura 6A representa un ARN bicatenario que muestra las posiciones de modificaciones 2'-O-metilo (mostrado por o) en la region C de la molecula. La Figura 6B representa un ARN bicatenario en el que la cadena antisentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad esta en el mismo lado del ARN bicatenario como la cadena sentido; mostrado por una flecha negra). En el ARN bicatenario representado en las figuras 4B el extremo 5' de la cadena sentido puede estar fosforilado (mostrado por una "p-"); el extremo 5' de la cadena grna puede estar defosforilado; la cadena antisentido puede modificarse en las posiciones 1, 2 y 3 del extremo 3' de la cadena antisentido con 2'-O-metilo (mostrado por o); y la cadena antisentido puede modificarse en posiciones numeradas raras que comienzan en la posicion 5 el extremo 3' de la cadena antisentido con 2'-O-metilo (mostrado por o). En el ARN bicatenario representado en la Figura 6B, la cadena antisentido puede contener desoxirribonucleotidos (mostrado por • ) en las posiciones 3 y 4 del extremo 5' de la cadena antisentido.

La figura 7 muestra construcciones de ARN bicatenario para su uso en experimentos que comparan el efecto de un ARN bicatenario sin tetrabucle, el efecto de un ARN bicatenario con un tetrabucle (es decir, uUCG), el efecto de un ARN bicatenario con un tetrabucle (es dedr, UUCG) en combinacion con una muesca en el mismo lado que la cadena sentido, el efecto de un ARN bicatenario con un tetrabucle (es dedr, UUCG) en combinacion con una muesca en el mismo lado que la cadena antisentido, y el efecto de otro tetrabucle (es dedr, GAAA) en combinacion con una muesca en el mismo lado que la cadena antisentido. Las secuencias en los ARN bicatenarios se basan en la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 humana (HPRT-1CC; nos. de entrada de la base de datos NCBI NM_000194 y GI: 164518913).

La figura 8 muestra construcciones de ARN bicatenario para su uso en experimentos que modifican la cadena antisentido discontinua para determinar sus efectos en la ruta del ARN de interferencia en la etapa del procesamiento de Dicer y las etapas descendentes de la excision del Dicer (p. ej., la interaccion Ago2, reconocimiento de dianas, excision Ago2). Las secuencias en los ARN bicatenarios estan todas basadas en la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 humana (HPRT-1CC; nos. de entrada de la base de datos NM_000194 y GI: 164518913).

La figura 9 muestra construcciones de ARN bicatenario para su uso en experimentos que modifican la cadena sentido extendida para determinar sus efectos en la ruta del ARN de interferencia en la etapa del procesamiento Dicer y etapas posteriores de la excision Dicer. Las secuencias en los ARN bicatenarios se basan en la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 humana (HPRT-ICC; nos. de entrada de la base de datos NM_000194 y GI: 164518913).

La figura 10 muestra como la colocacion de una discontinuidad define la productos de excision fabricados por Dicer. La estructura del ARN bicatenario con muesca dirige un producto de excision unico con la ventaja de que se produce un cadena antisentido de 21 bases definida y cargado en RISC. Al mover la muesca, se dirige la produccion de otras longitudes de cadenas antisentido. Las modificaciones qmmicas hacen cumplir la produccion de productos no 21-mer.

La figura 11 muestra que los tetrabucles de ADN y los extremos de ADN controlan la actividad de Dicer en el ARN bicatenario. Las construcciones de ARN bicatenario se utilizan en experimentos que comparan el efecto de un ARN bicatenario sin tetrabucle, el efecto de un ARN bicatenario con un tetrabucle de ADN (es decir, d(GTTA)), el efecto de un ARN bicatenario con un tetrabucle de ADN (es decir, d(GTTA)) en combinacion con una muesca en el mismo lado que la cadena sentido, el efecto de un ARN bicatenario con un tetrabucle de ADN (es decir, d(GTTA)) en combinacion con una muesca en el mismo lado que la cadena antisentido, y el efecto de otro tetrabucle de ADN (es decir, d(TTTT)) en combinacion con una muesca en el mismo lado que la cadena antisentido. Las secuencias en los ARN bicatenarios estan todas basadas en la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 humana (HPRT-1CC; nos. de entrada de la base de datos NM_000194 y GI: 164518913).

Las figuras 12A y 12B representan la estructura de un ARN bicatenario de la invencion en relacion con su interaccion con Dicer. La figura 12A representa la estructura de un ARN bicatenario con un extremo romo formado por el extremo 5' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido. La Figura 12B representa la estructura de un ARN bicatenario con un saliente 3' en la cadena antisentido. El nucleotido inmediatamente proximo al sitio de excision de Dicer debe ser un ribonucleotido (gris).

Las figuras 13A-13F representan ejemplos de ARN bicatenarios que poseen nucleotidos modificados o universales. La Figura 13A muestra ejemplos de ARN bicatenarios que tienen dos extremos romos. La figura 13B muestra ejemplos de ARN bicatenarios que tienen un saliente 3' de 2 nucleotidos en la cadena antisentido. La Figura 13C representa ejemplos de ARN bicatenarios que tienen un saliente 3' de 4 nucleotidos en la cadena antisentido. La figura 13D muestra ejemplos de ARN bicatenarios de la invencion donde las cadenas sentido y antisentido estan conectadas por un enlazador y tienen un extremo romo formado por el extremo 5' de la cadena sentido y el extremo 3' de la cadena antisentido.

La figura 13E muestra ejemplos de ARN bicatenarios de la invencion donde las cadenas sentido y antisentido estan conectadas por un enlazador y tienen un saliente 3' de 2 nucleotidos en la cadena antisentido. La figura 13F muestra ejemplos de ARN bicatenarios de la invencion donde las cadenas sentido y antisentido estan conectadas por un enlazador y tienen un saliente 3' de 4 nucleotidos en la cadena antisentido. Las posiciones ocupadas por los nucleotidos denotados por una "N" (gris) representan posiciones donde se pueden colocar nucleotidos universales.

Las figuras 14A y 14B muestran como se calculan las posiciones de los nucleotidos a partir de los extremos 5' y 3' de las cadenas sentido y antisentido, respectivamente, de los ARN bicatenarios que poseen nucleotidos modificados o universales.

Las figuras 15A y 15B representan como se calculan las posiciones de los nucleotidos a partir de los extremos 5' y 3' de las cadenas sentido y antisentido, respectivamente, de los ARN bicatenarios que poseen nucleotidos modificados o universales.

Las figuras 16A y 16B representan como se calculan las posiciones de los nucleotidos a partir de los extremos 5' y 3' de las cadenas sentido y antisentido, respectivamente, de los ARN bicatenarios que poseen nucleotidos modificados o universales.

La figura 17 muestra las localizaciones donde las modificaciones pueden estar presentes en los ARN bicatenarios que poseen nucleotidos modificados o universales. En los ARN bicatenarios, la cadena sentido contiene nucleotidos modificados, incluidos los nucleotidos universales, en las posiciones B*1 y C*1-C*3 (mostrado en gris); y la cadena antisentido contiene nucleotidos modificados, incluidos los nucleotidos universales, en las posiciones B*1 y C*1-C*3 (mostrado en gris). Adicionalmente, en los ARN bicatenarios el extremo 5' de la cadena sentido puede estar fosforilado (mostrado por "p-"); y la cadena sentido puede contener desoxirribonucleotidos (mostrado por • ) en las posiciones 1 y 2 del extremo 3' de la cadena antisentido. El Dicer divide el ARN bicatenario en la cadena sentido entre las posiciones C*2 y C*3 y en la cadena antisentido entre las posiciones B*1 y C*3 del extremo 5' de la cadena antisentido (mostrado por flechas largas).

La figura 18 representa la estructura de un ARN bicatenario en relacion con su interaccion con Dicer.

La figura 19 muestra una excision mejorada del Dicer de sustratos de ARN bicatenario debido a nucleotidos modificados, incluidos los nucleotidos universales, ubicados en las posiciones B*1 y C*1-C*3 en las cadenas sentido y antisentido (mostradas por "N"); y/o debido a nucleotidos modificados, incluidos los nucleotidos universales, ubicados en la cadena antisentido en las posiciones 4-7 desde el extremo 5' de la cadena antisentido (mostrado por "N"). El Dicer divide el ARN bicatenario entre las posiciones C*2 y C*3 en la cadena sentido y entre las posiciones B*1 y C*1 en la cadena antisentido (mostrado por flechas largas). En los ARN bicatenarios, el extremo 5' de la cadena sentido puede estar fosforilado (mostrado por "p-"); la cadena antisentido puede modificarse en las posiciones 1, 2 y 3 del extremo 3' de la cadena antisentido con 2'-O-metilo (mostrado por o); la cadena antisentido puede modificarse en posiciones numeradas raras comenzando en la posicion 5 desde el extremo 3' de la cadena antisentido con 2'-O-metilo (mostrado por o); y la cadena sentido puede contener desoxirribonucleotidos (mostrado por • ) en las posiciones 1 y 2 del extremo 3' de la cadena antisentido. El Dicer divide el ARN bicatenario en la cadena sentido entre las posiciones 4 y 5 desde el termino 3' de la cadena sentido y en la cadena antisentido entre las posiciones 6 y 7 desde el extremo 5' de la cadena antisentido (mostrado por flechas largas). La insercion representa un sustrato de ARN bicatenario en relacion con su interaccion con Dicer. La excision del Dicer del ARN bicatenario expone el nucleotido en la posicion C*2 en la cadena sentido y el nucleotido en la posicion B*1 en la cadena antisentido. La secuencia en el ARN bicatenario esta basada en la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 humana (HPRT-ICC; nos. de entrada de la base de datos NM_000194 y GI: 164518913). Las posiciones ocupadas por nucleotidos denotados por una "N" (gris) representan posiciones donde los nucleotidos universales pueden colocarse.

La figura 20 representa la interaccion mejorada Ago2 con un ARN bicatenario despues de que la excision Dicer expone nucleotidos modificados en el ARN bicatenario. Despues de la excision del ARN bicatenario, los nucleotidos modificados, incluyendo las bases universales, en la cadena sentido en las posiciones B*1, C*1, y C*2 (posiciones 1 3 desde el extremo 3' de la cadena sentido) o en la cadena antisentido en la posicion B*1 (posicion 1 del extremo 5' de la cadena) tienen una mayor interaccion con Ago2. El Dicer divide el ARN bicatenario (mostrado por flechas largas), exponiendo asf los nucleotidos internos modificados de las cadenas sentido y antisentido. Las posiciones ocupadas por los nucleotidos denotados por una "N" (gris) representan posiciones en las que se pueden colocar nucleotidos universales.

La figura 21 representa la excision mejorada Ago2 del ARN diana por el dominio RNasa H cuando los nucleotidos modificados, incluidas las bases universales, estan presentes en las posiciones 10 y 11 del extremo 3' de la cadena antisentido creada por la excision de Dicer de un ARN bicatenario. Ago2 divide el ARN diana entre las posiciones opuestas de los nucleotidos 10 y 11 del extremo 5' de la cadena antisentido (mostrado por la flecha corta). Dicer divide el ARN bicatenario (mostrado por las flechas largas), exponiendo asf nucleotidos modificados internos de las cadenas sentido y antisentido. Las posiciones ocupadas por los nucleotidos denotados por una "N" (gris) representan posiciones donde los nucleotidos universales pueden ser colocados.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona composiciones y metodos para reducir la expresion de un gen diana en una celula, que implica poner en contacto una celula con un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) en una cantidad eficaz para reducir la expresion de un gen diana en una celula. Los ARN bicatenarios de la invencion poseen modificaciones que se anticipan para alterar la estabilidad, eficacia y/o potencia del ARN bicatenario.

En ciertos aspectos, los ARN bicatenarios de la invencion se denominan "ARN bicatenarios con muesca", con tales ARN bicatenarios que poseen un tetrabucle y una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido en el sitio de excision Dicer tanto en la cadena grna como en la cadena de pasajeros. El sustrato con muesca permite un aumento de la excision del Dicer de un ARN bicatenario de la invencion, si se comparara con el ARN bicatenario de referencia. El sustrato con muesca tambien proporciona cierta capacidad de utilizar mas modificaciones qmmicas en los ARN bicatenarios (p. ej., en una grna o una cadena de pasajeros que tiene la muesca).

En algunos aspectos, los ARN bicatenarios de la invencion tienen nucleotidos modificados o universales en la cadena sentido o antisentido en el sitio de excision de Dicer y nucleotidos modificados o universales en la cadena antisentido opuesta a donde esta dividida la cadena diana por Ago2/RISC. Se espera que un nucleotido modificado o universal en un sitio Dicer aumente la excision de Dicer de un ARN bicatenario de la invencion, en comparacion con un ARN bicatenario de referencia. Adicionalmente, se espera que un nucleotido modificado o universal en el sitio Dicer sobre la cadena antisentido expuesta por el procesamiento Dicer del ARN bicatenario tenga una mayor interaccion con Ago2, en comparacion con la de un ARN bicatenario de referencia. Se espera que un nucleotido modificado o universal en la cadena antisentido opuesta a donde se divide la cadena diana por Ago2/RISC mejore la excision del ARN diana por Ago2/RISC, en comparacion con la de un ARN bicatenario de referencia.

Ejemplos de "ARN bicatenarios con muesca" de la invencion se muestran en las figuras 7, 8 y 9, incluyendo ARN bicatenarios control como referencia para la comparacion. Tales ARN bicatenarios de la invencion poseen un tetrabucle y una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido en el sitio de excision de Dicer, ya sea en la cadena de gma como en la cadena de pasajero. Tales ARN bicatenarios de la invencion tienen la siguiente estructura: una cadena sentido y un cadena antisentido; las cadenas sentido y antisentido forman un duplex en la region B; la cadena sentido contiene una region E en el extremo 3' y la region E contiene un tetrabucle; el ARN bicatenario contiene una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido; y la cadena antisentido replica a un ARN diana a lo largo de al menos 19 nucleotidos de la longitud de la cadena antisentido. Alternativamente, tales ARN bicatenarios tienen la estructura siguiente: una cadena sentido y un cadena antisentido; las cadenas sentido y antisentido forman un duplex en la region H; la cadena antisentido contiene una region J en el extremo 5' y la region J contiene un tetrabucle; el ARN bicatenario contiene una discontinuidad entre el extremo 3' de la cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido; y la cadena antisentido replica a un ARN diana a lo largo de al menos 19 nucleotidos de la longitud de la cadena antisentido.

En un aspecto alternativo de la invencion, se proporciona un "ARN bicatenario con muesca" que tiene un sitio de discontinuidad que se desplaza desde el sitio pronosticado de la excision de Dicer. Concretamente, dentro del ARN bicatenario de la figura 1A, el sitio de discontinuidad se puede desplazar desde su ubicacion en un sitio de excision Dicer pronosticado a una posicion alternativa dentro de la Region C. Opcionalmente, el sitio de discontinuidad dentro de la region C sigue siendo 3' del sitio en el que Dicer se predice que se divida del oligonucleotido de la cadena sentido.

Un ARN bicatenario que posee nucleotidos modificados o universales se muestra en la figura 19. Tales ARN bicatenarios tienen nucleotidos modificado o universales en la cadena sentido o antisentido en el sitio de excision de Dicer y nucleotidos modificados o universales en la cadena antisentido opuesta a donde esta la cadena diana dividida por Ago2/RISC. Tales ARN bicatenarios tienen la siguiente estructura: una cadena sentido y una cadena antisentido, donde las cadenas sentido y antisentido forman un duplex que tiene 22-43 pares de bases de longitud; y el ARN bicatenario contiene uno o mas nucleotidos modificados en cualquiera de las posiciones B*1 en la cadena sentido, B*1 en la cadena antisentido, C*1-C*3 en la cadena sentido, o C*1-C*3 en la cadena antisentido.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en este documento tienen el significado comunmente entendido por cualquier persona experta en la tecnica a la que esta invencion pertenece. Las siguientes referencias proporcionan conocimientos con una definicion general de muchos de los terminos utilizados en esta invencion: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se utiliza en este documento, los siguientes terminos tienen los significados atribuidos a menos que se especifique lo contrario.

Como se usa en este documento, la expresion "acido nucleico" se refiere a los desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, o nucleotidos modificados, y sus polfmeros en una forma mono- o bicatenaria. La expresion abarca los acidos nucleicos que contienen analogos de nucleotidos conocidos o residuos de la estructura modificados o enlaces, que son sinteticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de union similares a las del acido nucleico de referencia, y que se metabolizan de manera similar a los nucleotidos de referencia. Los ejemplos de tales analogos incluyen, sin limitacion, fosforotioatos, fosfamidados, fosfonatos metflicos, fosfonatos quiral-metflicos, ribonucleotidos 2-O-metilo, acidos peptido-nucleicos (PNAS).

Como se utiliza en este documento, se utiliza "nucleotido", segun se entiende en la tecnica, para incluirlos con bases naturales (estandar), y bases modificadas muy conocidas en la tecnica. Estas bases se encuentran generalmente en la posicion 1' de una fraccion de azucar de nucleotido. Los nucleotidos generalmente comprenden una base, un azucar y un grupo fosfato. Los nucleotidos pueden estar no modificados o modificados en el azucar, la fraccion fosfato y/o la base, (tambien denominados indistintamente como analogos de nucleotidos, nucleotidos modificados, nucleotidos no naturales, nucleotidos no estandar y otros; vease, por ejemplo, Usman y McSwiggen, supra; Eckstein, et al., Publicacion internacional PCT N° WO 92/07065; Usman et al, Publicacion PCT internacional no. WO93/15187; Uhlman & Peyman, supra). Hay varios ejemplos de bases de acido nucleico modificadas conocidas en la tecnica segun lo resumido por Limbach, et al., Nucleic. Acids Res. 22:2183, 1994. Algunos de los ejemplos no limitantes de modificaciones de base que se pueden introducir en moleculas de acido nucleico incluyen hipoxantina, purina, piridin-4- ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4,6-trimetoxi benceno, 3-metiluracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5- alquilcitidinas (p. ej., 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (p. ej., ribotimidina), 5-halouridina (p. ej., 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (p. ej., 6-metiluridina), propinay otros (Burgin, et al., Biochemistry 35: 14090, 1996; Uhlman & Peyman, supra). Por "bases modificadas", en este aspecto, se entienden bases de nucleotidos distintas de la adenina, guanina, citosina y uracilo en la posicion 1' o sus equivalentes.

Como se usa en este documento, un "acido ribonucleico bicatenario" o "ARN bicatenario" es una molecula compuesta por dos cadenas de oligonucleotidos que forman un duplex. Un ARN bicatenario puede contener ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, nucleotidos modificados y combinaciones de los mismos.

Los ARN bicatenarios son sustratos para protemas y complejos protemicos en la ruta del ARN de interferencia, p. ej., Dicer y RISC. Las estructuras de los ARN bicatenarios con muesca de la invencion se muestran en las figuras IA y IB, comprendiendo tales ARN bicatenarios un duplex en la region B y un duplex en la region C. El lfmite entre la region B y la region C esta determinado por el presencia del sitio de excision Dicer en la cadena antisentido. La region C es de al menos 1 bp, preferiblemente por lo menos 2 bp o 3 bp. La region E comprende la region C y la region D. Se muestran tambien estructuras de ARN bicatenarios en las figuras 1C e ID, que comprenden un duplex en la region H y un duplex en la region I. El lfmite entre la region H y la region I se determina por la presencia del sitio de excision de Dicer en la cadena antisentido. La Region I tiene al menos 1 bp, preferiblemente al menos 2 bp o 3 bp.

La region J comprende la region I y la region D. opcionalmente, un ARN bicatenario de la invencion puede abarcar una region F. Se muestran en las figuras 12A y 12B estructuras de ARN bicatenarios de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales, que comprenden un duplex en la region B* y un duplex en la region C*. El lfmite entre la region B* y la region C* es determinado por la presencia del sitio de excision de Dicer en la cadena antisentido. La region C* tiene al menos 1 bp, preferiblemente al menos 2 bp o 3 bp.

Como se utiliza en este documento, "duplex" se refiere a una estructura helicoidal doble formada por la interaccion de dos acidos nucleicos de una sola cadena. De acuerdo con la presente invencion, un duplex puede contener las primeras y segundas cadenas que son sentido y antisentido, o que son diana y antisentido. Un duplex se forma tipicamente por la union de hidrogeno en pares de bases, es decir, "emparejamiento de bases", entre dos acidos nucleicos monocatenarios que se orientan de forma antiparalela con respecto entre sf. El emparejamiento de bases en duplex generalmente ocurre por un emparejamiento de bases de Watson-Crick, p. ej., la guanina (G) forma un par de bases con citosina (C) en el ADN y el ARN, la adenina (A) forma un par de bases con timina (T) en el ADN, y la adenina (A) forma un par de bases con el uracilo (U) en el ARN. Las condiciones en las que se pueden formar parejas de bases incluyen condiciones fisiologicas o biologicas relevantes (p. ej., intracelular: pH 7,2, 140 mM de iones potasicos; pH extracelular 7,4, 145 mM de iones de sodio). Ademas, los duplex se estabilizan apilando interacciones entre los nucleotidos. Como se utiliza en este documento, un duplex puede ser establecido o mantenido por el emparejamiento de bases o por interacciones de apilamiento. Un duplex esta formado por dos cadenas de acido nucleico complementarias, que pueden ser sustancialmente complementarias o totalmente complementarias (ver mas abajo).

Por "complementario" o "complementariedad" se entiende que un acido nucleico puede formar enlace(s) de hidrogeno con otra secuencia de acidos nucleicos, ya sea con el emparejamiento de bases de Watson-Crick o Hoogsteen tradicional. Con referencia a las moleculas nucleicas de la presente descripcion, la energfa libre de union para una molecula de acido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que se realice la funcion pertinente del acido nucleico, por ejemplo, la actividad del ARN de interferencia. La determinacion de las energfas libres de union para las moleculas de acido nucleicos es muy conocida en la tecnica (vease, p. ej., Turner, et al., CSH SYMP. Quant. Biol. LII, pp. 123-133. 1987; Fricr, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377, 1986; Turner, et al., J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785, 1987). Una complementariedad porcentual indica el porcentaje de residuos contiguos en una molecula de acido nucleico que puede formar enlaces de hidrogeno (p. ej., un emparejamiento de bases de Crick) con una segunda secuencia de acido nucleico (p. ej., 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidos de un total de 10 nucleotidos en el primer oligonucleotido, que se emparejan por bases a una segunda secuencia de acido nucleico que tiene 10 nucleotidos, representa una complementariedad del 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 100%, respectivamente). Para determinar que una complementariedad porcentual es de al menos un porcentaje determinado, el porcentaje de residuos contiguos en una molecula de acido nucleico que puede formar enlaces de hidrogeno (p. ej., emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de acido nucleico se calcula y se redondea al numero entero mas cercano (p. ej., 12, 13, 14, 15, 16 o 17 nucleotidos de un total de 23 nucleotidos en el primer oligonucleotido que se empareja por bases a una segunda secuencia de acido nucleico que tiene 23 nucleotidos, representa una complementariedad del 52%, 57%, 61%, 65%, 70% y 74%, respectivamente; y tiene al menos 50%, 50%, 60%, 60%, 70%, y 70%, respectivamente). Como se utiliza en este documento, "sustancialmente complementario" se refiere a la complementariedad entre las cadenas de tal manera que sean capaz de hibridacion en condiciones biologicas Las secuencias sustancialmente complementarias tienen un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 100% de complementariedad. Ademas, las tecnicas para determinar si dos cadenas son capaces de hibridacion bajo las condiciones biologicas examinando sus secuencias de nucleotidos son muy conocidas en la tecnica.

Los acidos nucleicos de una sola cadena que se emparejan por bases sobre un numero de bases se dice que se "hibridan". La hibridacion se determina tfpicamente bajo condiciones fisiologicas o biologicas pertinentes (p. ej., intracelular: pH 7,2, 140 mM de iones de potasio; pH extracelular 7,4, 145 mM de iones de sodio). Las condiciones de hibridacion generalmente contienen un cation monovalente y tampon biologicamente aceptable y puede o no contener un cation divalente, aniones complejos, p. ej. gluconato de gluconato potasico, especies no cargadas como sacarosa y polfmeros inertes para reducir la actividad del agua en la muestra, p. ej., PEG.

Tales condiciones incluyen condiciones en las que pueden formar pares de bases.

La hibridacion se mide por la temperatura requerida para disociar acidos nucleicos monocatenarios formando un duplex, es decir, (la temperatura de fusion; Tm). Las condiciones de hibridacion tambien son condiciones bajo las cuales se pueden formar pares de bases. Pueden utilizarse varias condiciones rigurosas para determinar la hibridacion (vease, p. ej., Wahl, G. M. y S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol.

152:507). Las condiciones de temperatura rigurosas incluiran normalmente temperaturas de al menos aproximadamente 30°C, mas preferiblemente al menos aproximadamente 37°C, y mas preferiblemente al menos aproximadamente 42°C. La temperatura de hibridacion, para tnbridos que se preve que tengan menos de 50 pares de bases de longitud, debe ser de 5-10°C menos que la temperatura de fusion (Tm) del hforido, donde la Tm se determina de acuerdo con la siguientes ecuaciones. Para tnbridos de menos de 18 pares de bases en longitud, la Tm (°C) = 2 (N° de bases A T) 4 (N° de bases G C). Para tnbridos entre 18 y 49 pares de bases en longitud, la Tm (°C) = 81,5 16,6 (log 10 [Na+]) 0,41 (% G C)-(600/N), donde N es el numero de bases en el tnbrido, y [Na+] es la concentracion de iones de sodio en el tampon de hibridacion ([Na+] para 1xSSC = 0,165 M). (Variacion de parametros adicionales, como el tiempo de hibridacion, la concentracion de detergente, p. ej., dodecil sulfato de sodio (SDS), la inclusion o exclusion del ADN vetnculo, y las condiciones de lavado son muy conocidas por los expertos en la tecnica.) Por ejemplo, un tampon de determinacion de hibridacion se muestra en la tabla 1.

Tabla 1.

Las variaciones utiles en las condiciones de hibridacion seran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica. Las tecnicas de hibridacion son muy conocidas por los expertos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger y Kimmel (Antisense to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Como se utiliza en el presente documento, "cadena de oligonucleotidos" es una molecula de acido nucleico monocatenario. Un oligonucleotido puede abarcar ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, nucleotidos modificados (p. ej., nucleotidos con modificaciones 2', analogos de bases sinteticas, etc.) o combinaciones de los mismos.

Como se usa en este documento, "cadena antisentido" se refiere a una molecula de acido nucleico monocatenaria que tiene una secuencia complementaria a la de un ARN diana. Cuando la cadena antisentido contiene nucleotidos modificados con analogos de bases, no es necesariamente complementaria en toda su longitud, pero debe, al menos, replicarse con un ARN diana.

Como se usa en este documento, "cadena sentido" se refiere a una molecula de acido nucleico monocatenaria que tiene una secuencia complementaria a la de una cadena antisentido. Cuando la cadena antisentido contiene nucleotidos modificados con analogos de bases, la cadena sentido no tiene que ser complementaria en toda la longitud de la cadena antisentido, pero debe, al menos, replicarse con la cadena antisentido.

Como se utiliza en este documento, la "cadena gma" se refiere a una molecula de acido nucleico monocatenaria de un ARN bicatenario, que tiene una secuencia complementaria a la de un ARN diana, y que produce un ARN de interferencia mediante la union a un ARN diana. Despues de la excision del ARN bicatenario por Dicer, un fragmento de la cadena gma permanece asociado con RISC, une un ARN diana como componente del complejo RISC, y promueve la excision de un ARN diana mediante RISC. Como se utiliza en este documento, la cadena grna no se refiere necesariamente a un acido nucleico monocatenario continuo y puede comprender una discontinuidad, preferiblemente en un sitio que sea dividido por Dicer. Una cadena grna es una cadena antisentido.

Como se usa en este documento, "ARN diana" se refiere a un ARN que estana sujeto a una modulacion guiada por la cadena antisentido, como la excision dirigida o el bloqueo esterico. El ARN diana podna ser, por ejemplo, ARN viral genomico, ARNm, un pre-ARNm, o un ARN no codificante. La diana preferida es el ARNm, tal como el ARNm que codifica un protema asociada a una enfermedad, como ApoB, Bcl2, HiF-1alpha, Survivin o un p21 ras, como H-ras, K ras o N-ras.

Como se utiliza en este documento, "cadena de pasajeros" se refiere a una cadena de oligonucleotidos de un ARN bicatenario, que tiene una secuencia que es complementaria a la de la cadena grna. Como se utiliza en este documento, la cadena de pasajeros no se refiere necesariamente a un acido nucleico monocatenario continuo y puede abarcar una discontinuidad, preferiblemente en un sitio que es dividido por Dicer. Una cadena de pasajeros es una cadena sentido.

Como se usa en este documento, "discontinuidad" o "muesca" es una ruptura en un enlace fosfodiester sencillo de una cadena sentido o una cadena antisentido. Una discontinuidad se refiere solo a una ruptura en un enlace fosfodiester de una cadena del duplex, y excluye las situaciones en las que faltan uno o mas nucleotidos (p. ej., un hueco). Un duplex formado por una cadena sentido o antisentido que contiene una discontinuidad es estabilizado o mantenido por las interacciones de los nucleotidos circundantes en la cadena o por la cadena complementaria. Los duplex de "ARN bicatenarios con muesca" ejemplificados consisten en una discontinuidad, pero los duplex de "ARN bicatenarios con muescas" pueden incluir dos, tres o cuatro discontinuidades, siempre que el duplex sirva como sustrato de Dicer en un ensayo in vitro del sustrato Dicer.

Como se utiliza en el presente documento, "Dicer" se refiere a una endorribonucleasa en la familia de la Rnasa III que divide un ARN bicatenario, por ejemplo, ARN de doble cadena (ARN bicatenario) o pre-microARN (ARNmi), en fragmentos de acido nucleico de doble cadena de aproximadamente 20-25 nucleotidos de longitud, generalmente con un saliente de dos bases en el extremo 3'. Con respecto a los ARN bicatenarios de la invencion, el duplex formado por un ARN bicatenario es reconocido por Dicer y es un sustrato Dicer en al menos una cadena del duplex. Para ciertos ARN bicatenarios de la invencion (p. ej., los ARN bicatenarios que tienen nucleotidos modificados o universales en la cadena sentido o antisentido en el sitio de excision de Dicer y los nucleotidos modificados o universales en la cadena antisentido opuesta a donde la cadena diana es dividida por Ago2/RISC), Dicer divide la cadena sentido del ARN bicatenario entre el cuarto y quinto nucleotido del extremo 3' de la cadena sentido o antisentido de tal ARN bicatenario de la invencion entre el sexto y septimo nucleotido del extremo 5' de la cadena antisentido. Dicer cataliza el primer paso en la ruta de interferencia del ARN, que consecuentemente produce la degradacion de un ARN diana. La secuencia de la protema del Dicer humano se proporciona en la base de datos NCBI con el numero de entrada NP_085124, incorporado en la presente como referencia.

La "excision" del Dicer se determina como sigue (p. ej., vease Collingwood et al., Oligonucleotides; 18:187-200 (2008)). En un ensayo de excision Dicer, son incubados duplex de ARN (100 pmol) en 20 pL de Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM, MgCl22,5 mM con o sin 1 unidad de Dicer humano recombinante (Stratagene, La Jolla, CA) a 37°C durante 18 24 horas. Las muestras se desalan con una placa Performa SR de 96-pocillos (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD). Se realiza una espectroscopia de masas por electropulverizacion-cromatograffa lfquida de ionizacion (ESI-LCMS) de pretratamiento y postratamiento de ARN duplex con Dicer utilizando un sistema oligo HTCS (Novatia, Princeton, NJ; Hail et al., 2004), que consiste de un sistema de datos ThermoFinnigan TSQ7000, Xcalibur, software de procesamiento de datos ProMass y HPLC Paradigm MS4 (Michrom BioResources, Auburn, CA). En este ensayo, la excision del Dicer ocurre donde al menos el 5%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 100% del sustrato de ARN bicatenario Dicer, (es decir, 25-30 bp de ARN bicatenario, preferiblemente 26-30 bp de ARN bicatenario) se divide en un ARN bicatenario mas corto (p. ej., 19-23 bp de ARN bicatenario, preferiblemente, 21-23 bp de ARN bicatenario).

Como se utiliza en este documento, un "sitio de excision de Dicer" se refiere a los sitios en los que Dicer divide un ARN bicatenario. Dicer contiene dos dominios RNasa III que tfpicamente dividen tanto las cadenas sentido o antisentido de un ARN bicatenario. La distancia media entre los dominios de RNasa III y el dominio PAZ determina la longitud de los fragmentos de acido nucleico de doble cadena cortos que produce y esta distancia puede variar (Macrae I, et al. (2006). "Structural basis for double—stranded RNA processing by Dicer". Science 311 (5758): 195-8).

Como se utiliza en este documento, un "bucle" se refiere a una estructura formada por una sola cadena de un acido nucleico, en el que las regiones complementarias que flanquean una region del nucleotido monocatenario se hibridan de una manera que la region del nucleotido monocatenario entre las regiones complementarias se excluye de la formacion duplex o del emparejamiento de bases de Watson-Crick. Un bucle es una region del nucleotido monocatenario de cualquier longitud. Ejemplos de bucles incluyen los nucleotidos no emparejados presentes en estructuras tales como horquillas, bucles de tallo, o bucles extendidos.

Como se utiliza en este documento, "bucle extendido" en el contexto de un ARN bicatenario se refiere a un bucle monocatenario y ademas 1, 2, 3, 4, 5, 6 o hasta 20 pares de bases o nucleotidos replicados flanqueando el bucle. Por ejemplo, los bucles extendidos se muestran en la figura 1A, Region E, y en la figura 1B, region J. En un bucle extendido, los nucleotidos que flanquean el bucle en el lado 5' forman asf un duplex con nucleotidos que flanquean el bucle en el lado 3', por ejemplo, la region C en la figura 1A y la region en la figura 1B. Un bucle extendido puede formar una horquilla o un lazo del vastago.

En el contexto de un ARN bicatenario, los nucleotidos que forman los pares de bases o duplex que flanquean el bucle se refieren como proximos o distales segun su posicion en referencia al bucle y la cadena que contiene el bucle. Como se usa en este documento, "proximo", en el contexto de una cadena sentido que tiene una region B de bucle extendido en el extremo 3' de una cadena sentido (con referencia a las figuras 1A-1B, y 5A y 6A), se refiere a cuando los nucleotidos que forman pares de bases o duplex que flanquean el bucle estan en las posiciones 5' en relacion con los nucleotidos que forman el tetrabucle (p. ej., los nucleotidos proximos son los nucleotidos en el extremo 5' de la region C en la cadena sentido). Como se usa en este documento, "proximo", en el contexto de una cadena antisentido que tiene una region J de bucle extendido en el extremo 5' de una cadena antisentido (con referencia a las figuras 1C-1D, y 5B y 6B), se refiere a cuando los nucleotidos que forman pares de bases o duplex que flanquean el bucle estan en las posiciones 3' en relacion con los nucleotidos que forman el tetrabucle (p. ej., los nucleotidos proximos son los nucleotidos en el extremo 3' de la region I en la cadena antisentido). Como se usa en este documento, "distal", en el contexto de una cadena sentido que tiene una region E de bucle extendido en el extremo 3' de una cadena sentido (con referencia a las figuras 1A-1B, y 5A y 6A), se refiere a cuando los nucleotidos que forman pares de bases o duplex que flanquean el bucle estan en las posiciones 3' en relacion con los nucleotidos que forman el tetrabucle (p. ej., los nucleotidos distales son los nucleotidos en la region C en el extremo 3' de la cadena sentido). Como se usa en este documento, "distal", en el contexto de una cadena antisentido que tiene una region J de bucle extendido en el extremo 5' de una cadena antisentido (con referencia a las figuras 1C-1D, y 5B y 6B), se refiere a cuando los nucleotidos que forman pares de bases o duplex que flanquean el bucle estan en las posiciones 5' en relacion con los nucleotidos que forman el tetrabucle (p. ej., los nucleotidos distales son los nucleotidos en la region I en el extremo 5' de la cadena antisentido).

Como se utiliza en este documento, "tetrabucle" en el contexto de un ARN bicatenario se refiere a un bucle (una region monocatenaria) que consiste en cuatro nucleotidos que forma una estructura secundaria estable que contribuye a la estabilidad de los nucleotidos hibridados de Watson-Crick adyacentes. Sin limitarse a la teona, un tetrabucle puede estabilizar un par de bases de Watson-Crick adyacente apilando las interacciones. Ademas, las interacciones entre los cuatro nucleotidos en un tetrabucle incluyen, entre otras, emparejamiento de bases no de Watson-Crick, interacciones de apilamiento, puentes de hidrogeno e interacciones de contacto (Cheong et al., Nature, 16 de agosto de 1990; 346 (6285): 680-2; Heus y Pardi, Science. 12 Jul de 1991; 253 (5016): 191-4). Un tetrabucle confiere un aumento de la temperatura de fusion (TM) de un duplex adyacente que es mayor de lo esperado de una secuencia de bucle modelo simple que consta de cuatro bases aleatorias. Por ejemplo, una tetrabucle puede conferir una temperatura de fusion de al menos 55°C en NaHPO4 10 mM a una horquilla que comprende un duplex de al menos 2 pares de base de longitud. Un tetrabucle puede contener ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, nucleotidos modificados y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de tetrabucles de ARN incluyen la familia UNCG de tetrabucles (p. ej., UUCG), la familia GNRA de tetrabucles (p. ej., GAAA), y el tetrabucle c Uu G (Woese et al., Proc Natl Acad Sci USA. Nov 1990; 87(21): 8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res. 11 Nov, 1991; 19(21): 5901-5). Ejemplos de tetrabucles de ADN incluyen la familia d(GNNA) de tetrabucles (p. ej., d(GTTA), la familia d(GNRA)) de tetrabucles, la familia d(GNAB) de tetrabucles, la familia d(CNNG) de tetrabucles, la familia d(TNCG) de tetrabucles (p. ej., d(TTCG)). (Nakano et al. Biochemistry, 41 (48), 14281-14292, 2002.; SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL. 78°; No. 2; pag. 731 (2000)).

Como se utiliza en el presente documento, "saliente" se refiere a los nucleotidos no emparejados, en el contexto de un duplex con dos o cuatro extremos libres en el extremo 5' o extremo 3' de un ARN bicatenario. En ciertas realizaciones, el saliente es un saliente 3' o 5' en la cadena antisentido o cadena sentido.

Como se usa en este documento, "diana" se refiere a cualquier secuencia de acido nucleico cuya expresion o actividad va a ser modulada. En realizaciones particulares, la diana se refiere a un ARN que se replica en un acido nucleico monocatenario que es una cadena antisentido en un complejo RISC. La hibridacion del ARN diana a la cadena antisentido da como resultado el procesamiento por el complejo RISC. En consecuencia, la expresion del ARN o protemas codificadas por el ARN, p. ej., ARNm, se reduce.

Como se utiliza en este documento, "referencia" se entiende como un estandar o control. Como se desprende para cualquier experto en la tecnica, una referencia apropiada es cuando solamente se cambia un elemento para determinar el efecto de un elemento.

Como se usa en este documento, "nucleotido modificado" se refiere a un nucleotido que tiene una o mas modificaciones en el nucleosido, la nucleobase, el anillo de pentosa, o el grupo fosfato. Por ejemplo, los nucleotidos modificados excluyen los ribonucleotidos que contienen monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de uridina y monofosfato de citidina y desoxirribonucleotidos que contienen monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxiguanosina, monofosfato de desoxitimidina y monofosfato de desoxicitidina. Las modificaciones incluyen las que aparecen naturalmente que resultan de la modificacion por enzimas que modifican nucleotidos, como metiltransferasas. Los nucleotidos modificados tambien incluyen nucleotidos sinteticos o no naturales. Las modificaciones sinteticas o no naturales en los nucleotidos incluyen las que tienen modificaciones 2', p.

ej., 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetil], 4'-tio, 4'-CH2-O-2'-puente, 4'-(CH2)2-O-2'-puente, 2'-LNA, y 2'-O-(N-metilcarbamato) o las que comprenden analogos de base. En relacion con los nucleotidos 2 '-modificados como se describen para la descripcion actual, por "amino" se entiende 2'-NH²o 2'-O-NH², que puede modificarse o no modificarse. Se describen tales grupos modificados, por ejemplo, en Eckstein, et al., U.S. Pat. No.

5.672.695 y Matulic-Adamic, et al., U.S. Pat. No. 6.248.878.

Con referencia a las moleculas nucleicas de la presente descripcion, pueden existir las modificaciones en patrones en una cadena del ARN bicatenario. Como se usa en este documento, "posiciones alternas" se refiere a un patron donde cada otro nucleotido es un nucleotido modificado o hay un nucleotido no modificado entre cada nucleotido modificado en una longitud definida de una cadena del ARN bicatenario (p. ej., 5'-MNMNMN-3'; 3'-MNMNMN-5'; donde M es un nucleotido modificado y N es un nucleotido no modificado). El patron de modificacion comienza desde la primera posicion de nucleotido en el extremo 5' o 3' segun cualquiera de las convenciones de numeracion de posiciones descritas en este documento. El patron de nucleotidos modificados en posiciones alternas puede recorrer toda la longitud de la cadena, pero preferiblemente incluye al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14 nucleotidos que contienen al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 nucleotidos modificados, respectivamente. Como se usa en este documento, "alternar pares de posiciones" se refiere a un patron en el que dos nucleotidos modificados consecutivos estan separados por dos nucleotidos no modificados consecutivos respecto a una longitud definida de una cadena del ARN bicatenario (p. ej., 5'-MMNNMMNNMMNN-3'; 3'-MMNNMMNNMMNN-5'; donde M es un nucleotido modificado y N es un nucleotido no modificado). El patron de modificacion comienza desde la primera posicion de nucleotido en el extremo 5' o 3' segun cualquiera de las convenciones de numeracion de posiciones descritas en este documento. El patron de nucleotidos modificados en posiciones alternas puede recorrer toda la longitud de la cadena, pero preferiblemente incluye al menos 8, 12, 16, 20, 24, 28 nucleotidos que contienen al menos 4, 6, 8, 10, 12 o 14 nucleotidos modificados, respectivamente.

Como se utiliza en el presente documento, "analogo de base" se refiere a una fraccion heterodclica que se encuentra en la posicion 1' de una fraccion de azucar de un nucleotido en un nucleotido modificado que puede incorporarse en un duplex de acido nucleico (o la posicion equivalente en una sustitucion de fraccion de azucar de nucleotido que puede incorporarse en un duplex de acido nucleico). En los ARN bicatenarios de la invencion, un analogo de base es generalmente una base purina o pirimidina excluyendo las bases comunes guanina (G), citosina (C), adenina (A), timina (T) y uracilo (U). Los analogos de bases pueden replicarse con otras bases o analogos de bases en ARN bicatenarios. Los analogos de bases incluyen los utiles en los compuestos y metodos de la invencion, por ejemplo, los descritos en US Pat. Nos. 5.432.272 y 6.001.983 de Benner y la publicacion de patente de Estados Unidos no.

20080213891 de Manoharan. Los ejemplos no limitantes de bases incluyen hipoxantina (I), xantina (X), 3p-D-ribofuranosil-(2,6-diaminopirimida; K), 3-p-D-ribofuranosil-(1-metil-pirazolo[4,3-D]pirimidina-5,7(4H,6H)-diona; P), isocitosina (iso-C), iso-guanina (iso-G), 1-p-D-ribofuranosil-(5-nitroindol), 1-p-D-ribofuranosil-(3-nitropirrol), 5-bromouracilo, 2-aminopurina, 4-tio-dT, 7-(2-tienil)-imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehndo (Pa), 2-amino-6-(2-tienil)purina (S), 2-oxopiridina (Y), difluorotolilo, 4-fluoro-6-metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol, 3-metil isocarboestirililo, 5-metil isocarbostirililo, y 3-metil-7-propinil isocarboestirililo, 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metil-imidizopiridinilo, pirrolopirizinilo, isocarboestirililo, 7-propinil isocarboestirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenil-metilindolilo, 4-metilindolil 4,6-dimetilindolilo, fenilo, nafalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbencilo, tetracenilo, pentacenilo, y sus derivados estructural (Schweitzer et al., J. Org. Chem, 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem. Soc, 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 121 :2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc, 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 122(6):1001-1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc, 121:11585-11586 (1999); Guckian et al.., J. Org. Chem, 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc Natl. Acad. Sci., 94: 10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans, 1:197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans, 1:1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc, 122(32):7621-7632 (2000); O'Neill et al., J . Org. Chem, 67:5869-5875 (2002); Chaudhuri et al., J. Am. Chem. Soc., 117:10434-10442 (1995); and U.S. Pat. No.

6.218.108). Los analogos de base tambien pueden ser una base universal.

Como se utiliza en este documento, la "base universal" se refiere a una fraccion heterodclica localizada en la posicion 1' de una fraccion de azucar de nucleotido en un nucleotido modificado, o la posicion equivalente en una sustitucion de la fraccion del azucar del nucleotido, que, cuando esta presente en un duplex de acido nucleico, puede colocarse enfrente de mas de un tipo de base sin alterar la estructura helicoidal doble (p. ej., la estructura de la estructura del fosfato). Ademas, la base universal no destruye la capacidad del acido nucleico monocatenario en el que reside para replicara un acido nucleico diana. La capacidad de un acido nucleico monocatenario que contiene una base universal para replicar un acido nucleico diana puede ser ensayada por metodos evidentes para los expertos en la tecnica (p. ej., absorbancia UV, dicndsmo circular, cambio de gel, sensibilidad de nucleasa monocatenaria, etc.). Ademas, las condiciones en las que se observa la formacion del duplex pueden variarse para determinar la estabilidad o la formacion del duplex, por ejemplo, la temperatura, cuando la temperatura de fusion (Tm) se correlaciona con la estabilidad de los duplex de acido nucleico. En comparacion con un acido nucleico monocatenario de referencia que es exactamente complementario a un acido nucleico diana, el acido nucleico monocatenario que contiene una base universal forma un duplex con el acido nucleico diana que tiene una Tm inferior a la del duplex formado con el acido nucleico complementario. Sin embargo, en comparacion con un acido nucleico monocatenario de referencia en el que se ha sustituido la base universal con una base para generar una sola discordancia, el acido nucleico monocatenario que contiene la base universal forma un duplex con el acido nucleico diana que tiene una Tm mas alta que la de un duplex formado con el acido nucleico que tiene la base desemparejada.

Algunas bases universales son capaces de emparejar bases formando enlaces de hidrogeno entre la base universal y todas las bases guanina (G), citosina (C), adenina (A), timina (T), y uracilo (U) bajo condiciones de formacion de pares de bases. Una base universal no es una base que forma un par de bases con una sola base complementaria. En un duplex, una base universal puede formar enlaces no de hidrogeno, un enlace de hidrogeno, o mas de un enlace de hidrogeno con cada una de G, C, A, T, y U opuesta a el en la cadena opuesta de un duplex. Preferiblemente, una base universal no interactua con la base opuesta a ella en la cadena opuesta de un duplex. En un duplex, se produce un emparejamiento de bases entre una base universal sin alterar la estructura helicoidal doble de la estructura del fosfato. Una base universal tambien puede interactuar con bases en nucleotidos adyacentes en la misma cadena de acido nucleico apilando las interacciones. Tales interacciones de apilamiento estabilizan el duplex, especialmente en situaciones en las que la base universal no forma ningun enlace de hidrogeno con la base colocada enfrente de ella en la cadena opuesta del duplex. Los ejemplos no limitantes de nucleotidos de union universal incluyen inosina, 1-p-D-ribofuranosil-5-nitroindol, y/o 1 -p-D-ribofuranosil-3-nitropirrol (Publ. de solicitud de Pat. US no. 20070254362 de Quay et al.; Van Aerschot et al., “An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside.” Nucleic Acids Res. 1995 Nov 11;23(21):4363-70; Loakes et al., “3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and ^{p C r . ”}Nucleic Acids Res. 1995 Jul l1;23(13):2361-6; Loakes and Brown, “5-Nitroindole as an universal base analogue.” Nucleic Acids Res. 1994 Oct 11; 22 (20): 4039-43).

Como se usa en este documento, un ARN bicatenario "sintetizado enzimaticamente" se refiere a un ARN bicatenario con una modificacion producida por la reaccion de un acido nucleico con una enzima, incluyendo enzimas de origen natural (p. ej., metiltransferasas, enzimas de mellar, quinasas, fosfatasas, sulfurilasas, ligasas, nucleasas, recombinasas). En correspondencia, como en este documento, las modificaciones "enzimaticas" se refieren a las producidas por la reaccion de un acido nucleico con una enzima, incluyendo enzimas que se dan naturalmente.

Como se usa en este documento, un ARN bicatenario "sintetizado qmmicamente" se refiere a un ARN bicatenario producido mediante el uso de reacciones qmmicas, por ejemplo, sin utilizar enzimas. Metodos de sintetizar qmmicamente moleculas de ARN se conocen en la tecnica, en particular, los metodos de smtesis qmmica descritos en Velma y Eckstein (1998) o como se describen en el presente documento. Generalmente, las construcciones de ARN bicatenario pueden ser sintetizadas mediante metodos de smtesis de oligonucleotidos en fase solida (vease, por ejemplo, Usman et al., U.S. Pat. Nos. 5.804.683; 5.831.071; 5.998.203; 6.117.657; 6.353.098; 6.362.323; 6.437.117; 6.469.158; Scaringe et al. Pat. de Estados Unidos Nos. 6.111.086; 6.008.400; 6.111.086).

Como se utiliza en este documento, "aumentar" o "mejorar" se entiende que es alterar positivamente en al menos un 5% en comparacion con una referencia en un ensayo. Una alteracion puede ser del 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, o incluso del 100% en comparacion con una referencia en un ensayo. Por "mejorar la excision Dicer" se entiende que el procesamiento de una cantidad de una molecula de ARN bicatenario por Dicer da como resultado en mas productos de ARN bicatenario divididos por Dicer o que la reaccion de excision de Dicer ocurre mas rapidamente en comparacion con el procesamiento de la misma cantidad de un ARN bicatenario de referencia en un ensayo in vivo o in vitro de esta descripcion. En una realizacion, la excision de Dicer mejorada o aumentada de una molecula de ARN bicatenario esta por encima del nivel de la observada con una molecula de ARN bicatenario de referencia apropiada. En otra realizacion, la excision de Dicer mejorada o aumentada de una molecula de ARN bicatenario esta por encima del nivel de la observada con una molecula inactiva o atenuada.

Por "mejorar la interaccion con Ago2" se quiere decir que la asociacion con Ago2 de un ARN bicatenario procesado por Dicer es mas estable o se produce mas rapidamente en comparacion con la asociacion de un ARN bicatenario de referencia en un ensayo in vivo o in vitro de esta descripcion. Por "mejorar la excision de Ago2/RISC" se entiende que el procesamiento de una cantidad de una molecula de ARN diana por Ago2/RISC unida a una cadena antisentido de un ARN bicatenario da como resultado mas ARN diana dividido por Ago2/RISC, o que la excision del ARN diana por Ago2/RISC se produce mas rapidamente en comparacion con cuando una cadena antisentido de un ARN bicatenario de referencia se asocia con Ago2/RISC en un ensayo in vitro o in vivo de esta descripcion.

Como se utiliza en este documento, se entiende por "reducir" alterar negativamente en al menos un 5% en comparacion con una referencia en un ensayo. Una alteracion puede ser de un 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, o incluso en un 100% en comparacion con una referencia en un ensayo. Por "reducir la expresion" se entiende que la expresion del gen, o el nivel de moleculas de ARN o moleculas de ARN equivalentes que codifican una o mas protemas o subunidades proteicas, o el nivel o la actividad de una o mas protemas o subunidades de protemas codificadas por un gen diana, se reduce por debajo de la observada en ausencia de las moleculas de acido nucleico (p. ej., molecula de ARN bicatenario) en un ensayo in vivo o in vitro de esta descripcion. En una realizacion, la inhibicion, regulacion a la baja o reduccion con una molecula de ARN bicatenario es inferior a la del nivel observado en presencia de una molecula inactiva o atenuada. En otra realizacion, la inhibicion, regulacion a la baja o reduccion con moleculas de ARN bicatenarias es inferior a las del nivel observado en presencia de, por ejemplo, moleculas de ARN bicatenario con secuencia revuelta o con desapareamientos. En otra realizacion, la inhibicion, regulacion a la baja o reduccion de la expresion del gen con una molecula de acido nucleico de la presente descripcion es mayor en presencia de la molecula de acido nucleico que en su ausencia.

Como se utiliza en este documento, se entiende que "celula" incluye tanto celulas procariotas (p. ej., bacterianas) como eucariotas (p. ej., de mairnfero o vegetal). Las celulas pueden ser de origen somatico o de una lmea germinal, pueden ser totipotentes o pluripotentes, y pueden dividirse o no dividirse. Las celulas pueden tambien derivarse o pueden abarcar un gameto o un embrion, una celula madre, o una celula completamente diferenciada. Por lo tanto, el termino "celula" significa que retiene su significado biologico usual y que puede estar presente en cualquier organismo como, por ejemplo, un pajaro, una planta y un mairnfero, incluyendo, por ejemplo, un ser humano, una vaca, una oveja, un simio, un mono, un cerdo, un perro, y un gato. Dentro de ciertos aspectos, el termino "celula" se refiere espedficamente a celulas de mamnferos, tales como celulas humanas, que contienen una o mas moleculas aisladas de ARN bicatenario de la presente descripcion. En aspectos particulares, una celula procesa los ARN bicatenarios dando como resultado interferencia de ARN de acidos nucleicos diana, y contiene protemas y complejos protemicos necesarios para el ARN de interferencia, p. ej., Dicer y RISC.

Como se utiliza en este documento, "animal" se entiende como un organismo multicelular, eucariotico, incluyendo un marnffero, particularmente un ser humano. Los metodos de la invencion en general comprenden administrar una cantidad efectiva de los agentes en este documento, como un agente de las estructuras de las formulas de este documento, a un sujeto (por ejemplo, animal, humano) en necesidad del mismo, incluyendo un mamffero, particularmente un ser humano. Dicho tratamiento sera convenientemente administrado a sujetos, en particular a seres humanos, que sufren, tienen, son susceptibles o estan en riesgo de padecer una enfermedad, o un smtoma de la misma.

Por "vedculo farmaceuticamente aceptable" se entiende una composicion o formulacion que permite la distribucion efectiva de las moleculas de acido nucleico de la presente descripcion en la ubicacion ffsica mas adecuada para que se produzca la actividad deseada.

La presente invencion se refiere a composiciones que contienen un ARN de doble cadena ("ARN bicatenario"), y metodos para prepararlos, que son capaces de reducir la expresion de genes diana en celulas eucariotas.

Para los aspectos de "ARN bicatenario con muesca" de la invencion, una de las cadenas del ARN bicatenario contiene una region de secuencia de nucleotidos que tiene una longitud que oscila entre aproximadamente 15 y aproximadamente 22 nucleotidos que pueden dirigir la destruccion del ARN transcrito a partir del gen diana. Tales "ARN bicatenarios con muescas" de la invencion tambien contienen un bucle extendido que contiene un tetrabucle. En algunas realizaciones, el bucle extendido que contiene el tetrabucle esta en el extremo 3' de la cadena sentido. En otras realizaciones, el bucle extendido que contiene el tetrabucle esta en el extremo 5' de la cadena antisentido.

Los aspectos de la invencion del "ARN bicatenario con muesca" se basan, al menos en parte, en el descubrimiento de que una cadena con muesca en un ARN bicatenario es mas susceptible a la modificacion qdmica porque no tiene que ser competente para la excision de RNasa III por Dicer. La presencia de una muesca en el ARN bicatenario puede permitir modificaciones para multiples propositos en cualquiera de las cadena antisentido o sentido. Sin limitacion, tales propositos ventajosos incluyen silenciar la cadena sentido, estabilizar la construccion entera, permitir la administracion, la farmacocinetica, la carga en formulaciones complejas, el aumento de la duracion de la accion, la potencia y la especificidad. Los aspectos del "ARN bicatenario" de la invencion tambien se basan en, al menos en parte, el descubrimiento de que una cadena con muesca en un ARN bicatenario puede dirigir la produccion de substancialmente solamente un producto de la excision de Dicer. La colocacion de una muesca en un ARN bicatenario en la ubicacion de uno de los dos sitios de excision de RNasa III Dicer en un ARN bicatenario dirige Dicer hacia el otro sitio, definiendo asf la excision de Dicer en el otro sitio. Sin embargo, se espera que las estructuras bicatenarias con muesca formadas a partir de tres acidos nucleicos monocatenarios sean inestables en condiciones fisiologicas o biologicas. Por lo tanto, ciertos aspectos de la invencion tambien incluyen la caractenstica de que el ARN bicatenario este formado a partir de solo dos cadenas para aumentar la estabilidad del sustrato de ARN bicatenario con muesca.

El sustrato de ARN bicatenario con muesca de dos cadenas de la invencion contiene un bucle de extension que contiene una tetrabucle. En algunas realizaciones del sustrato de ARN bicatenario con muesca, un bucle extendido que contiene un tetrabucle se coloca en el extremo 3' de la cadena sentido. En otras realizaciones del sustrato de ARN bicatenario con muesca, un bucle extendido que contiene un tetrabucle se coloca en el extremo 5 de la cadena antisentido. La estabilidad del ARN bicatenario se ve especialmente reforzada por la inclusion de un tetrabucle, que adopta una estructura con estabilidad termodinamica incluso en condiciones estrictas (p. ej., condiciones de poca sal). Otras ventajas de tal ARN bicatenario con un tetrabucle son tambien contempladas. Los extremos "desnudos" de los acidos nucleicos duplex tienen potentes efectos biologicos, incluyendo la estimulacion del sistema inmunitario. La eliminacion efectiva de uno de los extremos de la configuracion inicial del ARN pequeno de interferencia tambien reduce el potencial de inmunoestimulacion, que no es deseable en algunas aplicaciones. Los extremos del ARN bicatenario tambien son puntos clave de entrada para las helicasas y/o nucleasas; por lo tanto, un ARN bicatenario con muesca que contenga un tetrabucle debe ser mas resistente a ambos.

Otras ventajas con respecto al sustrato de ARN bicatenario con muesca que posee una tetrabucle contemplan la modificacion de los nucleotidos de las cadenas sentido y antisentido. Cuando ocurre una discontinuidad en la cadena antisentido, las modificaciones de la cadena antisentido son mas toleradas en la ruta de interferencia del ARN. Cuando la discontinuidad ocurre en la cadena sentido, las modificaciones de la cadena sentido son mas toleradas en la ruta de interferencia del ARN. La invencion permite una mayor extension de la modificacion de las cadenas sentido y antisentido. La invencion tambien permite mas tipos de modificaciones de la cadena antisentido sin interferir con el procesamiento por Dicer y/o Ago2. Ademas, se contempla que las modificaciones particulares que son mas toleradas pueden tener ventajas, por ejemplo, mejorar la union de Ago2.

Para los ARN bicatenarios de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales en sitio(s) espedfico(s) (p. ej., en la cadena sentido o antisentido en el sitio de excision de Dicer y la cadena antisentido opuesta a donde la cadena diana es dividida por Ago2/RISC), una de las cadenas del ARN bicatenario contiene una region de la secuencia de nucleotidos que tiene una longitud que oscila entre aproximadamente 22 y aproximadamente 47 nucleotidos que pueden actuar como una cadena antisentido con respecto a inhibir la expresion del ARN transcrito del gen diana. En particular, refiriendose a las figuras 12, 15A, 15B, 16A, 16B y 17, tal ARN bicatenario contiene mas de un nucleotido modificado en cualquiera de las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena sentido o las posiciones B*1, C*1-C*2 en la cadena antisentido; mas de un nucleotido modificado en cualquiera de las posiciones C*1-C*2 en la cadena sentido o en la posicion B*1 en la cadena antisentido; un nucleotido modificado en la posicion B*1 en la cadena antisentido; un nucleotido universal en la cadena antisentido en cualquiera de las posiciones C*9-C*12 en la cadena antisentido; o combinaciones de los mismos.

Estos aspectos de la invencion se basan, al menos en parte, en el descubrimiento de que se pueden realizar modificaciones en el ARN bicatenario que mejoran las interacciones o los procesamiento del ARN bicatenario por protemas en la via de interferencia del ARN. Ventajas de tales sustratos de ARN bicatenario de la invencion incluyen una mayor excision del ARN bicatenario de Dicer. Concretamente, en un tal ARN bicatenario de la invencion, estan presentes uno o nucleotidos mas modificados en las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena sentido o las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena antisentido. Estas posiciones abarcan los sitios de excision de Dicer en ambas cadenas sentido y antisentido del ARN bicatenario. En particular, los nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena sentido o las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena antisentido son importantes para la excision Dicer. Sin limitarse a ninguna teona en particular, los nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena sentido o las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena antisentido promueven la excision del ARN bicatenario por Dicer por la mayor union a Dicer o proporcionando Dicer una secuencia preferida.

Ventajas adicionales de los sustratos del ARN bicatenario de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales en un sitio o varios sitios espedficos incluyen una interaccion mejorada con Ago2. En particular, con referencia a las figuras 12, 15A, 15B, 16A, 16B y 17, los nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1 y C*2 en la cadena sentido o B*1 en la cadena antisentido son importantes para la interaccion Ago2. Sin limitarse a ninguna teona determinada, los nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1 y C*2 en la cadena sentido o posicion B*1 en la cadena antisentido, que se vuelven expuestos despues de una excision del ARN bicatenario por Dicer, realzan la union a Ago2 del ARN bicatenario procesado por Dicer. En concreto, un nucleotido modificado en la posicion B*1 en la cadena antisentido tienen una mejor interaccion con Ago2 despues de que Dicer ha procesado el ARN bicatenario. Sin estar limitados a ninguna teona particular, un nucleotido modificado en la posicion B*1 en la cadena antisentido, cuando se expone, tiene una mejor interaccion con una bolsa de union en Ago2.

Otras ventajas de esos sustratos del ARN bicatenario de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales en un sitio o varios sitios espedficos incluyen una mejor excision del ARN diana cuando la cadena antisentido o una porcion de la misma esta ligada a RISC. El ARN bicatenario puede contener un nucleotido universal en la cadena antisentido en cualquiera de las posiciones C*9-C*12 en la cadena antisentido. En un ARN bicatenario de la invencion, estas posiciones tambien corresponden a las posiciones 9-12 de un sitio de excision Dicer en la cadena antisentido. Sin limitarse a ninguna teona en particular, un nucleotido modificado en las posiciones C*9-C*12 la cadena antisentido realza la excision del ARN diana reduciendo la energfa requerida para la catalisis por Ago2/RISC. En consecuencia, un ARN bicatenario modificado de la invencion reduce la expresion genica diana en comparacion con un ARN bicatenario de referencia.

Composiciones

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona nuevas composiciones para la interferencia del ARN (ARN de interferencia). Las composiciones comprenden ya sea un acido ribonucleico bicatenario (ARN bicatenario) que es una molecula precursora, es decir, el ARN bicatenario de la presente invencion es procesado in vivo para producir un acido nucleico interferente pequeno activo (ARN pequeno de interferencia). El ARN bicatenario es procesado por Dicer en un ARN pequeno de interferencia activo que se incorpora al complejo RISC. La molecula precursora tambien se denomina una molecula precursora del ARN de interferencia en este documento. Como se utiliza en este documento, el termino ARN pequeno de interferencia activo se refiere a un ARN bicatenario en el que cada cadena se compone de ARN, analogo(s) de ARN, o ARN y ADN. El ARN pequeno de interferencia comprende entre 19 y 23 nucleotidos o comprende 21 nucleotidos. El ARN pequeno de interferencia activo tiene salientes de 2 bp en los extremos de 3' de cada cadena, de modo que la region duplex del ARN pequeno de interferencia comprende 17-21 nucleotidos, o 19 nucleotidos. Tfpicamente, la cadena antisentido del ARN pequeno de interferencia es sustancialmente complementario con la secuencia de destino del gen diana.

La region duplex se refiere a la region en dos oligonucleotidos complementarios o sustancialmente complementarios que forman pares de bases entre sf, ya sea por el emparejamiento de bases de Watson-Crick o por cualquier otra manera que permita un duplex entre cadenas de oligonucleotidos que son complementarias o sustancialmente complementarias. Por ejemplo, una cadena de oligonucleotido que tiene 21 unidades de nucleotidos puede emparejarse por bases con otro oligonucleotido de 21 unidades de nucleotidos, pero solo 19 bases en cada cadena son complementarios o sustancialmente complementarios, de modo que la "region duplex" consiste en 19 pares de bases. Los pares de bases restantes pueden, por ejemplo, existir como salientes 5' y 3'. Ademas, dentro de la region duplex, no se requiere un 100% de complementariedad; una complementariedad sustancial es permisible dentro de una region duplex. La complementariedad sustancial se refiere a la complementariedad entre las cadenas de tal manera que son capaces de hibridarse en condiciones biologicas. Las tecnicas para determinar si dos cadenas son capaces de hibridarse en condiciones biologicas son muy conocidos en la tecnica. Alternativamente, se pueden sintetizar dos cadenas y agregarlas juntas bajo condiciones biologicas para determinar si se hibridan entre sf

Como se utiliza en este documento, un ARN pequeno de interferencia que tiene una secuencia sustancialmente complementaria a una secuencia de ARNm diana significa que el ARN pequeno de interferencia tiene complementariedad de secuencia o los duplex desencadenan la destruccion del ARNm diana por la maquinaria del ARN de interferencia (p. ej., el complejo RISC) o el proceso. La molecula de ARN pequeno de interferencia se puede disenar de tal manera que cada residuo de la cadena antisentido sea complementario a un residuo en la molecula diana. En los casos en los que se utilizan nucleotidos con bases universales, la molecula de ARN pequeno de interferencia se replica con el ARNm diana. Alternativamente, se pueden hacer sustituciones dentro de la molecula para aumentar la estabilidad y/o mejorar la actividad de procesamiento de dicha molecula. Se pueden hacer sustituciones dentro de la cadena o se pueden hacer a los residuos en los extremos de la cadena.

En ciertos aspectos de la presente invencion, el ARN bicatenario, es decir, la molecula precursora del ARN de interferencia, tiene una longitud suficiente de tal manera que se procesa por Dicer para producir un ARN pequeno de interferencia. En algunas realizaciones, un "ARN bicatenario con muesca" adecuado de la invencion contiene una secuencia de oligonucleotidos sentido que contiene un bucle extendido y tiene, al menos, 19 nucleotidos de longitud y no mas de 80 nucleotidos de longitud. Este oligonucleotido sentido que contiene un bucle extendido puede tener entre aproximadamente 40, 50, 60 o 70 nucleotidos de longitud. Este oligonucleotido sentido que contiene un bucle extendido puede tener aproximadamente 35 o 37 nucleotidos de longitud o 35 nucleotidos de longitud.

En otras realizaciones, un ARN bicatenario adecuado de la invencion que posee un nucleotido modificado o universal en un sitio o varios sitios espedficos contiene una secuencia de oligonucleotidos sentido que tiene al menos 22 nucleotidos de longitud y no mas de 43 nucleotidos de longitud. Este oligonucleotido sentido puede tener entre aproximadamente 20, 30, 40 o 50 nucleotidos de longitud. En ciertas realizaciones, este oligonucleotido sentido tiene entre aproximadamente 25 y 30 nucleotidos de longitud.

El oligonucleotido antisentido de un ARN bicatenario de la invencion puede tener cualquier secuencia que se hibride al oligonucleotido sentido para formar un duplex bajo condiciones biologicas, como en el citoplasma de una celula eucariotica, o en las condiciones de una formulacion farmaceutica aceptable. Generalmente, el duplex entre las cadenas sentido y antisentido tienen, por lo menos, 19 pares de bases en longitud y no mas de aproximadamente 26 pares de bases. En general, el oligonucleotido antisentido tendra al menos 19 pares de bases complementarias con el oligonucleotido sentido, mas tfpicamente el oligonucleotido antisentido tendra aproximadamente 21 o mas pares de bases complementarias, o cerca de 25 o mas pares de bases complementarias con la secuencia del oligonucleotido sentido. En ciertas realizaciones, el oligonucleotido sentido contiene un bucle extendido que incluye un tetrabucle. En otras realizaciones, el extremo 3' de la cadena antisentido del ARN bicatenario tiene un saliente. En una realizacion particular, el saliente de 3' tiene 2 nucleotidos. La cadena sentido puede tambien tener un 5' fosfato.

En otra realizacion, un "ARN bicatenario con muesca" de la invencion (es decir, la molecula precursora del ARN de interferencia) tiene una longitud suficiente para que sea procesada por Dicer para producir un ARN pequeno de interferencia. De acuerdo con esta realizacion, un "ARN bicatenario con muesca" adecuado contiene una secuencia de oligonucleotidos antisentido que contiene un bucle extendido y tiene al menos 27 nucleotidos de longitud y no mas de 70 nucleotidos de longitud. Este oligonucleotido antisentido que contiene un bucle extendido puede tener entre aproximadamente 40, 50, 60 o 70 nucleotidos de longitud. Este oligonucleotido antisentido que contiene un bucle extendido puede tener aproximadamente 35 o 37 nucleotidos de longitud o 35 nucleotidos de longitud. El oligonucleotido sentido del ARN bicatenario puede tener cualquier secuencia que se hibride al oligonucleotido antisentido para formar un duplex en condiciones biologicas, como en el citoplasma de una celula eucariotica. Generalmente, el oligonucleotido sentido tendra al menos 19 pares de bases complementarias con el oligonucleotido antisentido, mas tfpicamente el oligonucleotido sentido tendra aproximadamente 21 o mas pares de bases complementarias, o aproximadamente 25 o mas pares de bases complementarias con la secuencia de oligonucleotidos antisentido. En ciertas realizaciones, el oligonucleotido antisentido contiene un bucle extendido que incluye un tetrabucle.

En ciertos aspectos, las secuencias de oligonucleotidos sentido y antisentido del ARN bicatenario existen en dos cadenas de oligonucleotidos separados que pueden ser sintetizadas qmmicamente y que tfpicamente son sintetizadas qmmicamente. En algunas realizaciones, ambas cadenas tienen entre 26 y 30 nucleotidos de longitud. En otras realizaciones, ambas cadenas tienen entre 25 y 30 nucleotidos de longitud. En una realizacion, una o ambas cadenas del oligonucleotidos son capaces de servir como sustrato para Dicer. En otras realizaciones, al menos una modificacion esta presente, que promueve Dicer para unirse a la estructura de ARN bicatenario en un orientacion que maximice la efectividad de la estructura del ARN bicatenario en la inhibicion de la expresion del gen. El ARN bicatenario puede contener una o mas sustituciones de base de acido ribonucleico (ARN) o de acido desoxirribonucleico (ADN).

No se requiere que los oligonucleotidos sentido y antisentido sean completamente complementarios. De hecho, en una realizacion, el extremo 3' de la cadena sentido contiene uno o mas desapareamientos o nucleotidos modificados con analogos de base. En un aspecto, cerca de dos desapareamientos o nucleotidos modificados con analogos de base son incorporados en el extremo 3' de la cadena sentido. El uso de desapareamientos o de una disminucion de la estabilidad termodinamica (espedficamente en la posicion 3'-sentido/5'-antisentido) ha sido propuesta para facilitar o favorecer la entrada de la cadena antisentido en RISC (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003), presumiblemente afectando a ciertos pasos de liberacion limitantes de la velocidad que ocurren con la entrada del ARN pequeno de interferencia en RISC. Asf, la composicion de la base terminal se ha incluido en los algoritmos de diseno para seleccionar los duplex de ARN pequeno de interferencia de 21mer activos (Ui-Tei et al., 2004; Reynolds et al., 2004). Con la excision de Dicer del ARN bicatenario de esta realizacion, la secuencia terminal del extremo pequeno que contiene los desapareamientos o nucleotidos modificados con analogos de base se deja sin emparejar con la cadena antisentido (se vuelve parte de un saliente de 3') o se divide enteramente del ultimo ARN pequeno de interferencia de 21mer. Estos desapareamientos o nucleotidos modificados con analogos de base, por lo tanto, no persisten en el componente final de ARN de RISC.

Se ha encontrado que las largas especies de ARN bicatenario que tienen duplex de 25 a aproximadamente 30 nucleotidos dan resultados inesperadamente efectivos en terminos de potencia y duracion de accion. Sin querer vincularse a ninguna teona subyacente de la invencion, se piensa que especies de ARN bicatenario mas largas sirven como sustrato para la enzima Dicer en el citoplasma de una celula. Ademas de la excision del ARN bicatenario de la invencion en segmentos menores, se piensa que Dicer facilita la incorporacion de una excision de un producto de excision de una sola cadena derivado del ARN bicatenario dividido en el complejo RISC que es responsable de la destruccion del ARN citoplasmico derivado del gen diana. Los estudios han mostrado que la capacidad de excision de una especie de ARN bicatenario por Dicer se corresponde con un aumento de la potencia y duracion de la accion de la especie de ARN bicatenario (Collingwood et al., 2008).

Un ARN bicatenario que contiene un bucle extendido con un tetrabucle se produce bajo la hibridacion de los dos oligonucleotidos que componen la composicion del ARN bicatenario. El bucle extendido que contiene el tetrabucle o la estructura tetrabucle no bloqueara la actividad de Dicer en el ARN bicatenario y no interferira con la destruccion dirigida del ARN transcrito del gen diana. Las composiciones de ARN bicatenario apropiadas tambien pueden contener una cadena sentido o antisentido formada a partir de dos oligonucleotidos separados qmmicamente unidos fuera de su region de hibridacion por grupos de union qdmica. Muchos grupos enlazantes qmmicos adecuados se conocen en la tecnica y se pueden utilizar. Los grupos adecuados no bloquearan la actividad de Dicer en el ARN bicatenario y no interferiran con la destruccion dirigida del ARN transcrito del gen diana.

En ciertas realizaciones, el ARN bicatenario, es decir, la molecula precursora del ARN de interferencia, tiene varias propiedades que mejoran su procesamiento por Dicer. Segun tales realizaciones, el ARN bicatenario tiene una longitud suficiente como para que sea procesado por Dicer para producir un ARN pequeno de interferencia activo y, al menos, una de las siguientes propiedades: (i) el ARN bicatenario es asimetrico, por ejemplo, tiene un saliente de 3' en la cadena antisentido y (ii) el ARN bicatenario tiene un el extremo modificado de 3' en la cadena sentido que dirige la orientacion directa de la union de Dicer y el procesamiento del ARN bicatenario a un ARN pequeno de interferencia activo. De acuerdo con tales realizaciones, cuando se aplica a "ARN bicatenarios con muesca", la cadena mas larga del ARN bicatenario comprende 24-30 nucleotidos. En una realizacion, el ARN bicatenario es asimetrico tal que la cadena sentido comprende 22-28 nucleotidos y la cadena antisentido comprende 24-30 nucleotidos. Por lo tanto, el ARN bicatenario resultante tiene un saliente en el extremo 3' de la cadena antisentido. El saliente tiene 1-3 nucleotidos, por ejemplo 2 nucleotidos. La cadena sentido tambien puede tener un 5' fosfato.

En otra realizacion de los "ARN bicatenarios con muesca" de la invencion, la cadena sentido es modificada para el procesamiento de Dicer mediante modificadores adecuados ubicados en las posiciones 11 y 12 del extremo 3' de la cadena sentido con un bucle extendido o en las posiciones 2 y 4 del extremo 5' de la cadena sentido con un bucle extendido, es decir, el ARN bicatenario esta disenado para dirigir la orientacion de la union y el procesamiento de Dicer.

Para cualquier aspecto de la invencion, los modificadores adecuados incluyen nucleotidos como desoxirribonucleotidos, aciclonucleotidos y moleculas similares y estericamente bloqueadas, como las moleculas fluorescentes y similares. Los aciclonucleotidos sustituyen al grupo 2-hidroxietoximetilo para el azucar de 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en los dNMP. En una realizacion, los desoxinucleotidos se utilizan como modificadores. Cuando se utilizan moleculas con bloqueos estericos, se unen al ribonucleotido en el extremo 3' de la cadena antisentido. Por lo tanto, la longitud de la cadena no cambia con el incorporacion de los modificadores. En otra realizacion, la invencion contempla la sustitucion de dos bases del ADN en el ARN bicatenario para dirigir la orientacion del procesamiento de Dicer de la cadena antisentido. En otra realizacion de la presente invencion, se sustituyen dos bases de ADN terminales para dos ribonucleotidos en el extremo 3' de la cadena sentido formando un extremo romo del duplex en el extremo 3' del cadena sentido y el extremo 5' de la cadena antisentido, y un saliente de ARN de dos nucleotidos se localiza en el extremo 3' de la cadena antisentido. Esta es una composicion asimetrica con el ADN en el extremo romo y las bases de ARN en el extremo saliente.

Para los ARN bicatenarios de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales en el sitio o sitios espedficos (por ejemplo, en la cadena sentido o antisentido en el sitio de excision de Dicer y en la cadena antisentido opuesta a donde la cadena diana es dividida por Ago2/RISC), en otras realizaciones, el ARN bicatenario tiene una longitud suficiente como para que sea procesado por Dicer para producir un ARN pequeno de interferencia activo y, al menos, una de las siguientes propiedades: (i) el ARN bicatenario es asimetrico, por ejemplo, tiene un saliente de 3' en la cadena antisentido y (ii) el ARN bicatenario tiene un extremo modificado de 3' en la cadena sentido que dirige la orientacion de la union de Dicer y el procesamiento del ARN bicatenario a un ARN pequeno de interferencia activo. De acuerdo con tales realizaciones, la cadena mas larga del ARN bicatenario comprende 19-43 nucleotidos. En una realizacion, el ARN bicatenario es asimetrico de tal manera que la cadena sentido comprende 22-43 nucleotidos y la cadena antisentido comprende 26-47 nucleotidos. Por lo tanto, el ARN bicatenario resultante tiene un saliente en el extremo 3' de la cadena antisentido. El saliente puede tener 1-4 nucleotidos, por ejemplo 2 nucleotidos. La cadena sentido puede tambien tener un 5' fosfato.

En las realizaciones adicionales, para los ARN bicatenarios que poseen nucleotidos o universales en un sitio o varios sitios espedficos, con referencia a las figuras 12, 15A, 15B, 16A, 16B y 17, la cadena sentido se modifica para el procesamiento de Dicer mediante modificadores adecuados situados en cualquiera de las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena sentido o las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena antisentido. En otras diversas realizaciones de los aspectos de la invencion, un ARN bicatenario contiene mas de un modificador en cualquiera de las posiciones B*1, C*1 y C*3 en la cadena sentido o la posicion B*1 en la cadena antisentido. En una realizacion particular de los aspectos de la invencion, un ARN bicatenario contiene un modificador en la posicion B*1 en la cadena antisentido. En todavfa otras diversas realizaciones, un ARN bicatenario contiene un nucleotido universal en la cadena antisentido en cualquiera de las posiciones B*9-B*11 en la cadena antisentido. En otras realizaciones, un ARN bicatenario contiene modificadores en cualquier combinacion de las posiciones descritas en este documento.

Las ventajas de los sustratos del ARN bicatenario de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales en un sitio o sitios espedficos incluyen una mayor excision del ARN bicatenario por Dicer, y un control mejorado sobre la longitud final del producto Dicer. Concretamente, en tal ARN bicatenario de la invencion, estan presentes uno o mas nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena sentido o las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena antisentido, que abarca los sitios de excision de Dicer en ambos sentidos y las cadenas antisentido del ARN bicatenario. Sin limitarse a ninguna teona en particular, los nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena sentido o en las posiciones B*1, C*1-C*3 en la cadena antisentido promueven la excision del ARN bicatenario por Dicer mejorando la union a Dicer o proporcionando Dicer una secuencia preferida para la excision. En diversas realizaciones de los aspectos de la invencion, el ARN bicatenario potencia la excision por Dicer en la cadena sentido o antisentido en comparacion con un ARN bicatenario de referencia. En otras realizaciones de los aspectos de la invencion, el ARN bicatenario define mas exactamente la posicion de las divisiones Dicer.

Las ventajas adicionales con respecto a los sustratos del ARN bicatenario de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales en un sitio o sitios espedficos incluyen una mejor interaccion con Ago2 despues de la excision del ARN bicatenario por Dicer. Los nucleotidos modificados en cualquiera de las posiciones descritas en este documento que mejoran la interaccion con Ago2 no interfieren con el procesamiento de Dicer, que ocurre antes de que el ARN bicatenario pueda procesarse despues por Ago2. Sin limitarse a ninguna teona en particular, los nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1 y C*2 en la cadena sentido o en la posicion B*1 en la cadena antisentido, que se vuelven expuestos despues de la excision del ARN bicatenario por Dicer, mejoran la union a Ago2 del ARN bicatenario procesado por Dicer. Ademas, sin estar limitados a ninguna teona, los nucleotidos modificados en las posiciones B*1, C*1 y C*2 en cadena sentido o la posicion B*1 en la cadena antisentido, que se vuelven expuestos despues de la excision del ARN bicatenario por Dicer, potencian la liberacion del duplex del ARN bicatenario procesado por Dicer. Sin limitarse a ninguna teona en particular, un nucleotido modificado en la posicion B*1 en la cadena antisentido, cuando se expone, tiene una mejor interaccion con una bolsa de union en Ago2. Sin estar ligado a la teona, la mejor interaccion de un nucleotido expuesto en esta posicion a Ago2 puede ocurrir a traves de la interaccion de apilamiento con un residuo de tirosina en la bolsa de union. En diversas realizaciones de los aspectos de la invencion, el a Rn bicatenario tiene una mejor interaccion con Ago2 en comparacion con un ARN bicatenario de referencia.

Otras ventajas con respecto a los sustratos del ARN bicatenario de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales en un sitio o sitios espedficos incluyen una mejor division del ARN diana cuando la cadena antisentido o una porcion de la misma esta unida a RISC. Por consiguiente, el ARN bicatenario reduce la expresion genica diana en comparacion con un ARN bicatenario de referencia. Sin limitarse a ninguna teona en particular, un nucleotido modificado en las posiciones B*9-B*11 desde el extremo 5' de la cadena antisentido potencia la excision del ARN diana reduciendo la energfa para la catalisis por Ago2/RISC. En tal ARN bicatenario de la invencion, estas posiciones tambien corresponden a las posiciones 9-12 de un sitio de excision Dicer en la cadena antisentido. Sin estar ligado a la teona, durante la excision del ARN diana por Ago2/RISC, una de las bases adyacentes al sitio de excision se extrae del duplex para distorsionar la estructura del ARN diana. La distorsion de la estructura del fosfato reduce la energfa necesaria para realizar la excision hidrolftica del enlace fosfato. En otras realizaciones de los aspectos de la invencion, el ARN bicatenario contiene un nucleotido universal en la posicion B*10 o B*11 en la cadena antisentido. En realizaciones espedficas, el ARN bicatenario contiene un nucleotido universal en la posicion 10 o 11 de un sitio de excision Dicer en la cadena antisentido. En otras realizaciones de los aspectos de la invencion, el ARN bicatenario contiene nucleotidos universales en las posiciones B*10 y B*11 en la cadena antisentido. En realizaciones espedficas, el ARN bicatenario contiene nucleotidos universales en las posiciones 10 y 11 desde un sitio de excision Dicer en la cadena antisentido. En todavfa mas realizaciones, el ARN bicatenario contiene nucleotidos universales en la cadena antisentido en las posiciones B*10 y B*11 sobre la cadena antisentido y un nucleotido universal en cualquiera de la posicion B*9, posicion B*12, o posiciones B*9 y B*12 en la cadena antisentido. En determinadas realizaciones, el ARN bicatenario contiene nucleotidos universales en las posiciones 10 y 11 de un sitio de excision Dicer en la cadena antisentido y un nucleotido universal en cualquier de la posicion 9, posicion 12, o posiciones 9 y 12 de un sitio de excision Dicer en la cadena antisentido. En varias realizaciones de los aspectos de la invencion, la cadena antisentido aumenta la excision de un ARN diana por Ago2/RISC en comparacion con una cadena antisentido de un ARN bicatenario de referencia.

Los modificadores apropiados de tales ARN bicatenarios de la invencion incluyen nucleotidos tales como desoxirribonucleotidos, didesoxirribonucleotidos, aciclonucleotidos y similares y moleculas estericamente bloqueadas, como moleculas fluorescentes y similares.

Las cadenas sentido y antisentido se hibridan bajo condiciones biologicas, como la condiciones encontradas en el citoplasma de una celula. Ademas, una region de una de las secuencias, en particular de la cadena antisentido, del ARN bicatenario tiene una longitud de secuencia de, por lo menos, 19 nucleotidos, en los que estos nucleotidos se encuentran en la region 21-nucleotido adyacente al extremo 3' de la cadena antisentido y son sustancialmente complementarios o se replican en una secuencia de nucleotidos del ARN producido a partir del gen diana.

Ademas, de acuerdo con esta realizacion, el ARN bicatenario, es decir, la molecula precursora del ARN de interferencia, tambien puede tener una o mas de las siguientes propiedades adicionales: (a) la cadena antisentido tiene un desplazamiento derecho desde el 21mer tfpico, (b) las cadenas no pueden ser completamente complementarias, es decir, las cadenas pueden contener desemparejamientos simples y (c) modificaciones de base, como los acidos nucleicos bloqueados, pueden incluirse en el extremo 5' de la cadena sentido. Un ARN pequeno de interferencia "tfpico" 21mer se disena usando tecnicas convencionales. En una tecnica, se prueban normalmente una variedad de sitios en paralelo o grupos que contienen distintos duplex de ARN pequeno de interferencia espedficos de la misma diana con la esperanza de que uno de los reactivos sea efectivo (Ji et al., 2003). Otras tecnicas utilizan reglas de diseno y algoritmos para aumentar la probabilidad de obtener moleculas efectoras del ARN de interferencia activo (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003; Ui-Tei et al., 2004; Reynolds et al., 2004; Krol et al., 2004; Yuan et al., 2004; Boese et al., 2005). Tambien se ha desarrollado la seleccion de alto rendimiento del ARN pequeno de interferencia (solicitud de patente publicada en los EE. UU. No. 2005/0042641 A1). Los sitios diana potenciales tambien pueden analizarse mediante predicciones de la estructura secundaria (Heale et al., 2005). Este 21mer se utiliza entonces para disenar un desplazamiento derecho que incluya 3-9 nucleotidos adicionales en el extremo 5' del 21mer. La secuencia de estos nucleotidos adicionales puede tener cualquier secuencia. En una realizacion, los ribonucleotidos agregados se basan en la secuencia del gene diana. Incluso en esta realizacion, no se requiere una complementariedad completa entre la secuencia diana y el ARN pequeno de interferencia antisentido.

No se requiere que los oligonucleotidos sentido y antisentido sean completamente complementarios. Solo necesitan replicarse o ser sustancialmente complementarios para hibridarse en condiciones biologicas y para proporcionar un sustrato para Dicer que produzca un ARN pequeno de interferencia suficientemente complementario a la secuencia diana. Los acidos nucleicos bloqueados, o LNA (por sus siglas en Ingles), son muy conocidos por los expertos en la tecnica (Elman et al., 2005; Kurreck et al., 2002; Crinelli et al., 2002; Braasch y Corey, 2001; Bondensgaard et al., 2000; Wahlestedt et al., 2000). En una realizacion, un LNA se incorpora en el extremo 5' de la cadena sentido. En otra realizacion, un LNA se incorpora en el extremo 5' de la cadena sentido en duplex disenados para incluir un saliente de 3' en la cadena antisentido.

En una realizacion, el ARN bicatenario tiene una estructura asimetrica, teniendo la cadena sentido una longitud de 35 nucleotidos, y teniendo la cadena antisentido una longitud de 21 nucleotidos con un 3'-saliente de 2 nucleotidos. En otra realizacion, el ARN bicatenario tiene una estructura asimetrica, teniendo la cadena sentido una longitud de 37 nucleotidos, y teniendo la cadena antisentido una longitud de 21 nucleotidos con un 3'-saliente de 2 nucleotidos. En otro realizacion mas, el ARN bicatenario tiene una estructura asimetrica, teniendo la cadena antisentido una longitud de 35 nucleotidos con un 3'-saliente de 2 nucleotidos, y teniendo la cadena sentido una longitud de 21 nucleotidos. En todavfa otra realizacion, el ARN bicatenario tiene una estructura asimetrica, teniendo la cadena sentido una longitud de 37 nucleotidos con un 3'-saliente de 2 nucleotidos, y teniendo la cadena antisentido una longitud de 21 nucleotidos. En varias realizaciones, este ARN bicatenario que tiene una estructura asimetrica contiene ademas 2 desoxirribonucleotidos en el extremo 3' de la cadena antisentido.

En otra realizacion de un aspecto de la presente invencion, el ARN bicatenario, es decir, la molecula precursora del ARN de interferencia, tiene varias propiedades que mejoran su procesamiento por Dicer. Segun esta realizacion, el ARN bicatenario tiene una longitud suficiente como para que sea procesado por Dicer para producir un ARN pequeno de interferencia y, al menos, una de las siguientes propiedades: (i) el ARN bicatenario es asimetrico, por ejemplo, tiene un saliente de 3' en la cadena sentido y (ii) el ARN bicatenario tiene un extremo modificado de 3' en la cadena antisentido que dirige la orientacion de Dicer y el procesamiento del ARN bicatenario en un ARN pequeno de interferencia activo. Segun esta realizacion, la cadena mas larga en el ARN bicatenario comprende 35-40 nucleotidos. En una realizacion, la cadena sentido comprende 35-40 nucleotidos y la cadena antisentido comprende 21-24 nucleotidos. Asf, en algunas realizaciones el ARN bicatenario resultante tiene un saliente en el extremo 3' de la cadena sentido. El saliente puede tener 1-4 nucleotidos. En otra realizacion, la cadena antisentido comprende 35-40 nucleotidos y la cadena sentido comprende 21-24 nucleotidos. Asf, en algunas realizaciones, el ARN bicatenario resultante tiene un saliente en el extremo 3' de la cadena sentido. El saliente puede tener 1-4 nucleotidos. La cadena antisentido tambien puede tener un fosfato de 5'. En otra realizacion, este ARN bicatenario que tiene una estructura asimetrica contiene ademas 2 desoxinucleotidos en el extremo 3' de la cadena antisentido.

Ademas, de acuerdo con esta realizacion, el ARN bicatenario, es dedr, la molecula precursora del ARN de interferencia, tambien puede tener una o mas de las siguientes propiedades adicionales: (a) la cadena antisentido tiene un desplazamiento derecho del 21mer tfpico y (b) las cadenas pueden no ser completamente complementarias, es decir, las cadenas pueden contener desemparejamientos simples. Un ARN pequeno de interferencia "tipico" 21mer se disena usando tecnicas convencionales, tales como las descritas mas arriba. Este 21mer se utiliza entonces para disenar un desplazamiento derecho que incluye 1-7 nucleotidos adicionales en el extremo 5' de los 21 mer. La secuencia de estos nucleotidos adicionales puede tener cualquier secuencia. Aunque los ribonucleotidos anadidos pueden ser complementarios a la secuencia del gen diana, no se requiere una complementariedad total entre la secuencia diana y el ARN pequeno de interferencia antisentido. Es decir, el ARN pequeno de interferencia antisentido resultante es lo suficientemente complementario con la secuencia diana. Los primero y segundo oligonucleotidos no son deben ser completamente complementarios. Solo necesitan ser sustancialmente complementarios para hibridarse en condiciones biologicas y proporcionar un sustrato para Dicer que produzca un ARN pequeno de interferencia lo suficientemente complementario con la secuencia diana.

En otras realizaciones, las composiciones del ARN bicatenario de la invencion que posee nucleotidos modificados o universales en un sitio o sitios espedficos contienen dos oligonucleotidos separados que pueden unirse qmmicamente fuera de su region de hibridacion por grupos de union qrnmica. Los extremos "desnudos" de los acidos nucleicos duplex tienen potentes efectos biologicos, incluida la estimulacion del sistema inmunitario. La eliminacion efectiva de uno de los extremos de la configuracion inicial de D-ARN pequeno de interferencia tambien reduce el potencial de inmunoestimulacion, que no es deseable en algunas aplicaciones. Los extremos del ARN bicatenario son tambien puntos clave de entrada para las helicasas y/o nucleasas, por lo tanto el ARN bicatenario que contiene un enlazador debe ser mas resistente a ambos.

Muchos grupos de union qrnmica adecuados son conocidos en la tecnica y se pueden utilizar. Los grupos adecuados no bloquearan la actividad de Dicer en el ARN bicatenario y no interferiran con la destruccion dirigida del ARN transcrito del gen diana. Alternativamente, los dos oligonucleotidos separados pueden unirse mediante un tercer oligonucleotido tal que se produce una estructura de horquilla durante la hibridacion de los dos oligonucleotidos que componen la composicion de dsNA. La estructura de horquilla no bloqueara la actividad de Dicer en el dsNA y no interferira con la destruccion dirigida del ARN transcrito del gen diana. En realizaciones particulares, la estructura de horquilla comprende una tetrabucle. La estabilidad del ARN bicatenario se ve especialmente reforzada por la inclusion de una tetrabucle, que adopta una estructura secundaria con estabilidad termodinamica incluso bajo condiciones estrictas (p. ej., 10 mM de NaHPO4). Tambien se contemplan otras ventajas de tal ARN bicatenario con un tetrabucle.

Una caractenstica de las composiciones del ARN bicatenario de la presente invencion es que pueden servir como sustrato para Dicer. Tfpicamente, las composiciones de ARN bicatenario de esta invencion no tendran que sertratadas con Dicer, otras RNasas o extractos que las contengan. En la presente invencion, este tipo de pretratamiento puede prevenir la interaccion de Dicer. Se conocen varios metodos y se pueden utilizar para determinar si una composicion de ARN bicatenario sirve como sustrato para Dicer. Por ejemplo, la actividad de Dicer se puede medir in vitro utilizando el kit enzimatico de Dicer recombinante (Genlantis, San Diego, Calif.) segun las instrucciones del fabricante. La actividad de Dicer se puede medir in vivo tratando las celulas con ARN bicatenario y manteniendolas durante 24 h antes de cosecharlas y aislar sus ARN. El ARN puede aislarse utilizando metodos estandar, como el kit RNeasy® (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN aislado puede ser separado en un gel al 10% de PAGE que se utiliza para preparar una transferencia de ARN estandar que se puede probar con un desoxioligonucleotido marcado adecuado, como un oligonucleotido marcado con el sistema de marcado de oligo de Starfire® (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa).

El efecto que un ARN bicatenario tiene en una celula puede depender de la celula misma. En algunas circunstancias, un ARN bicatenario podna inducir la apoptosis o el silenciamiento genico en un tipo de celula y no en otro. Por lo tanto, es posible que un ARN bicatenario sea adecuado para su uso en una celula y no en otra. Para ser considerado "adecuada", una composicion del ARN bicatenario no tiene que ser adecuada en todas las circunstancias posibles en las que podna ser utilizada, mas bien solo debe ser adecuada en un determinado conjunto de circunstancias.

Sustituciones y modificaciones

Pueden incluirse modificaciones en los ARN bicatenarios de la invencion como se describe en este documento. Preferiblemente, las modificaciones se hacen de tal manera que la modificacion no impida que la composicion del ARN bicatenario sirva como sustrato para Dicer.

La introduccion de nucleotidos sustituidos y modificados en las moleculas de ARN del sustrato Dicer proporcionan una manera de superar las posibles limitaciones de la estabilidad in vivo y la biodisponibilidad inherentes a las moleculas de ARN naturales (es decir, que tienen nucleotidos estandar) que se liberan exogenamente. Por ejemplo, el uso de nucleotidos modificados en las moleculas de ARN del sustrato Dicer puede permitir una dosis mas baja de una molecula de acido nucleico particular para un efecto terapeutico dado, que es ventajoso si un nucleotido modificado tiene un efecto de una vida media mas larga en suero. Ademas, ciertas sustituciones y modificaciones pueden mejorar la biodisponibilidad del ARN del sustrato de Dicer reconociendo celulas o tejidos particulares o mejorando la captacion celular de las moleculas de ARN del sustrato Dicer. Por lo tanto, incluso si se reduce la actividad de un ARN bicatenario modificado como se describe en este documento en comparacion con una molecula nativa de ARN, la actividad general de la molecula de ARN del sustrato Dicer modificada puede ser mayor que la de la molecula de ARN nativo debido a la mejora de la estabilidad o la liberacion de la molecula. A diferencia del ARN nativo del sustrato Dicer sin modificar, el ARN del sustrato Dicer sustituido y modificado puede tambien reducir la posibilidad de activar la respuesta de interferon, u otros efectos inmunomoduladores, por ejemplo, en seres humanos.

En una realizacion, se hacen una o mas modificaciones que mejoran el procesamiento Dicer del ARN bicatenario. En una segunda realizacion, se preparan una o mas modificaciones que dan como resultado una generacion de ARN de interferencia mas eficaz. En una tercera realizacion, se hacen una o mas modificaciones que apoyan un mayor efecto del ARN de interferencia. En una cuarta realizacion, se hacen una o mas modificaciones que dan como resultado una mayor potencia por cada molecula de ARN bicatenario que se liberara a la celula. Las modificaciones se pueden incorporar en la region del extremo 3', la region del extremo 5', tanto en la region del extremo 3' como en el extremo 5' o, en algunos casos, en varias posiciones dentro de la secuencia. Con las restricciones mencionadas mas arriba en mente, pueden ser incorporadas cualquier numero y combinacion de modificaciones en el ARN bicatenario. Cuando se presenten varias modificaciones, pueden ser iguales o diferentes. Se contemplan modificaciones en bases, fracciones de azucar, la estructura del fosfato y sus combinaciones. El extremo 5' de la cadena sentido se puede fosforilar.

Ejemplos de modificaciones previstas para la estructura del fosfato incluyen fosfonatos, incluyendo modificaciones de metilfosfonato, fosforotioato, y fosfotriester tales como alquilfosfotriesteres, y similares. Ejemplos de modificaciones contempladas para la fraccion de azucar incluyen modificaciones de 2-alquil-pirimidina, como 2'-O-metilo, T-fluoro, amino, y desoxi y similares (ver, por ejemplo, Amarzguioui et al., 2003).

Ejemplos de modificaciones previstas para los grupos base incluyen azucares no basicos, 2-O-alquil-pirimidinas modificadas, 4-tiouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo y 5-(3-aminoalil)-uracilo y similares. Tambien podnan ser incorporados acidos nucleicos bloqueados, o LNA. Se conocen muchas otras modificaciones y se pueden utilizar siempre que se cumplan los criterios anteriores. Ejemplos de modificaciones tambien se describen en las Pat. de Estados Unidos Nos. 5.684.143, 5.858.988 y 6.291.438 y en la solicitud de patente publicada en EE. UU. N° 2004/0203145 A1. Se describen otras modificaciones en Herdewijn (2000), Eckstein (2000), Rusckowski et al. (2000), Stein et al. (2001); Vorobjev et al. (2001).

Se pueden incorporar una o mas modificaciones contempladas en cualquiera de las dos cadenas. La colocacion de las modificaciones en el D-ARN pequeno de interferencia puede afectar, en gran medida, a las caractensticas del D ARN pequeno de interferencia, incluyendo la dotacion de una mayor potencia y estabilidad, la reduccion de la toxicidad, la mejora del procesamiento Dicer y la minimizacion de una respuesta inmunitaria.

En otras realizaciones, un nucleotido bicatenario, segun lo descrito en este documento que disminuye la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia de acuerdo con la presente descripcion, comprende uno o mas nucleosidos naturales o sinteticos no estandar. En las realizaciones relacionadas, el nucleosido no estandar es una o mas desoxiuridina, moleculas de acido nucleico bloqueado (LNA) (p. ej., una 5-metil uridina, LNA), o un nucleotido de union universal. En ciertas realizaciones, el nucleotido de union universal puede ser C-fenilo, C-Naftilo, inosina, azol carboxamida, 1-p-D-ribofuranosil-4-nitroindol, 1-p-D-ribofuranosil-5-nitroindol, 1-p-D-ribofuranosil-6-nitroindol o 1-p-D-ribofuranosil-3-nitropirrol.

Los nucleotidos sustituidos o modificados presentes en el nucleotido bicatenario descrito en este documento, preferiblemente en la cadena antisentido, pero tambien opcionalmente en la cadena sentido o en ambas cadenas, comprenden nucleotidos modificados o sustituidos de acuerdo con esta descripcion que tienen propiedades o caractensticas similares a los ribonucleotidos naturales o estandar. Por ejemplo, un nucleotido de doble cadena, como se describe en este documento, que puede incluir nucleotidos que tienen una conformacion norte (p. ej., el ciclo de pseudo-rotacion norte, ver, p. ej., Saenger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag Ed., 1984). Como tal, los nucleotidos qmmicamente modificados presentes en un nucleotido bicatenario como se describe en este documento, preferiblemente en la cadena antisentido, pero tambien opcionalmente en la cadena pasajero o ambas cadenas, son resistentes a la degradacion de la nucleasa y, al mismo tiempo, mantienen la capacidad de mediar el ARN de interferencia. Los nucleotidos ejemplares que tienen una configuracion norte incluyen nucleotidos de acido nucleico bloqueado (LNA) (p. ej., nucleotidos 2'-O,4'-C-metilen-(D-ribofuranosil)); nucleotidos de 2'-metoxietilo (MOE); nucleotidos de 2'-metil-tio-etilo, 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleotidos 2'-desoxi-2'-cloro, nucleotidos 2'-azido, nucleotidos 5-metiluridinas, o 2'-O-metilo. En ciertas realizaciones, el LNA es un LNA de 5-metiluridina.

Como se describe en este documento, la primera y segunda cadenas de un nucleotido bicatenario como se describe en este documento o su analogo proporcionadas por esta descripcion puede hibridarse juntas (es decir, debido a la complementariedad entre las cadenas) para formar, por lo menos, una region bicatenaria que tiene una longitud de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 pares de bases. En otras realizaciones, el nucleotido bicatenario tiene, por lo menos, una region de doble cadena que vana en longitud entre aproximadamente 26 y aproximadamente 40 pares de bases o de aproximadamente 27 a aproximadamente 30 pares de bases o de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 pares de bases. En otras realizaciones, las dos o mas cadenas de un nucleotido bicatenario, tal como se describe en este documento, pueden unirse opcionalmente mediante enlace covalente por moleculas enlazadoras nucleotfdicas o no nucleotidicas.

En ciertas realizaciones, el nucleotido bicatenario, como se describe en este documento, o su analogo comprende un saliente de uno a cuatro nucleotidos en uno o ambos extremos 3', como un saliente que comprende un desoxirribonucleotido o dos desoxirribonucleotidos (p. ej., timidina, adenina). En algunas realizaciones, un nucleotido bicatenario o sus analogos tienen un extremo romo en un extremo del acido nucleico del sustrato Dicer. En ciertas realizaciones, el extremo 5' de la primera o segunda cadena esta fosforilado. En cualquiera de las realizaciones de un nucleotido bicatenario como se describe en este documento, los salientes del nucleotido del extremo 3' pueden abarcar ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos qmmicamente modificados en un azucar, una base, o una estructura del acido nucleicos. En cualquiera de las realizaciones de un nucleotido bicatenario, tal como se describe en el presente documento, los salientes del nucleotido del extremo 3' pueden abarcar uno o mas ribonucleotidos universales. En cualquiera de las realizaciones de un nucleotido bicatenario como se describe en el presente documento, los salientes del nucleotido del extremo 3' pueden abarcar uno o mas nucleotidos adclicos. En cualquiera de las realizaciones de un nucleotido bicatenario como se describe en este documento, los nucleotidos bicatenarios pueden abarcar ademas un grupo fosfato terminal, como un 5'-fosfato (ver Martinez et al. Cell. 110:563-574, 2002; y Schwarz et al. Molec. Cell 10:537-568, 2002) o un 5',3'-difosfato.

Como se expone en este documento, la estructura del extremo de un nucleotido bicatenario como se describe en este documento que disminuye la expresion de un gen diana, por ejemplo, ARN de interferencia, puede tener un extremo romo o un saliente. En ciertas realizaciones, el saliente puede estar en el extremo 3' de la cadena antisentido o el extremo 5' de la cadena sentido. Ademas, ya que la secuencia saliente puede tener una baja especificidad respecto a un gen diana, no es necesariamente complementaria (antisentido) o identica (sentido) a una secuencia genetica diana. En otras realizaciones, un nucleotido bicatenario segun lo descrito en este documento que disminuye la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia puede abarcar ademas un bajo peso molecular estructural (p. ej., una molecula de acido nucleico natural, como un ARNt, ARNr o acidos nucleicos virales o una molecula de acido nucleico artificial), p. ej., una o mas porciones salientes del acido nucleico del sustrato Dicer.

En otras realizaciones, un nucleotido bicatenario segun lo descrito en este documento que disminuye la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia de acuerdo con la presente descripcion incluye ademas una substitucion del 2'-azucar, tal como 2'-desoxi, 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo, 2'-O-2-metoxietilo, halogeno, 2'-fluoro, 2'-O-alilo, o similares, o cualquier combinacion de los mismos. En aun mas realizaciones, un nucleotido bicatenario como se describe en este documento, que disminuye la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia segun la presente descripcion, incluye ademas un sustituyente final terminal en uno o ambos extremos de la primera cadena o la segunda cadena, tal como una fraccion de alquilo, no basica, desoxi no basica, glicerilo, dinucleotido, nucleotido adclico, desoxinucleotido invertido, o cualquier combinacion de los mismos. En ciertas realizaciones, por lo menos uno o dos ribonucleotidos del extremo 5' de la cadena sentido dentro de la region bicatenaria tiene una sustitucion 2'-azucar. En ciertas otras realizaciones, al menos uno o dos ribonucleotidos del extremo 5' de la cadena antisentido dentro de la region bicatenaria tienen una sustitucion 2'-azucar. En ciertas realizaciones, por lo menos uno o dos ribonucleotidos del extremo 5' de la cadena sentido y la cadena antisentido dentro de la region bicatenaria tienen una sustitucion 2'-azucar.

En otras realizaciones mas, un nucleotido bicatenario, como se describe en este documento, que disminuye la expresion de un gen diana (incluida su variante de empalme del ARNm) mediante el ARN de interferencia de acuerdo con la presente descripcion, incluye, al menos, un enlace internucleosido modificado, tal como, independientemente, un fosforotioato, un fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriester, aminoalquilfosfotriester, fosfonato metilico, fosfonato de alquilo, fosfonato de 3'-alquileno, fosfonato de 5'-alquileno, fosfonato quiral, fosfonoacetato, tiofosfonoacetato, fosfinato, fosforamidato, 3'-amino fosforamidato, aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriester, selenofosfato, acoplamiento de boranofosfato, o cualquier combinacion de los mismos.

Un enlace de internucleotido modificado, como se describe en este documento, puede estar presente en una o mas cadenas de un nucleotido bicatenario como se describe en este documento, por ejemplo, en la cadena antisentido, la cadena sentido, ambas cadenas, o una pluralidad de cadenas. El nucleotidico bicatenario, como se describe en este documento, puede comprender uno o mas enlaces de internucleotidos modificados en el extremo 3', el extremo 5', o ambos de los extremos 3' y 5' de la cadena antisentido o la cadena sentido o ambas cadenas. En una realizacion, un nucleotido bicatenario capaz de disminuir la expresion de un gen diana (incluyendo una variante de empalme de ARNm espedfica o seleccionada) por el ARN de interferencia tiene un enlace internucleotido modificado en el extremo 3', tal como un acoplamiento fosforotioato. Por ejemplo, esta descripcion proporciona un nucleotido bicatenario capaz de disminuir la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 o mas enlaces internucleotido del fosfotioato en una cadena del acido nucleico del substrato Dicer. En otra realizacion mas, esta descripcion proporciona un nucleotido bicatenario capaz de disminuir la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia que tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 o mas enlaces internucleotido de fosforotioato en cadenas de acido nucleico del sustrato Dicer. En otras realizaciones, un ejemplo de un nucleotido bicatenario de esta descripcion puede abarcar de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 o mas enlaces internucleotido de fosforotioato consecutivos en el extremo 5' de la cadena sentido, la cadena antisentido, ambas o una pluralidad de cadenas. En otro ejemplo, un ejemplo de un nucleotido bicatenario de esta descripcion puede abarcar uno o mas enlaces internucleotido de fosforotioato de pirimidina en la cadena sentido, la cadena antisentido, ambas cadenas, o un pluralidad de cadenas. En otro ejemplo mas, una molecula ejemplar de ARN bicatenario de esta descripcion puede abarcar uno o mas enlaces internucleotidos de fosforotioato de purina en la cadena sentido, la cadena antisentido, ambas cadenas o una pluralidad de cadenas.

En otro aspecto de la presente descripcion, se proporciona un nucleotido bicatenario que disminuye la expresion de un gen diana, que comprende una primera cadena que es complementaria a un ARNm diana y una segunda cadena complementaria a la primera cadena, en el que la primera y la segunda cadena forman una region bicatenaria, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 pares de bases o de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 pares de bases; donde al menos una base del ARN bicatenario se sustituye por un analogo de base.

Los analogos de base incluyen los descritos en las Pat. de EE.UU. Nos. 5.432.272 y 6.001.983 de Benner y la publicacion de Patente de EE.UU. No. 20080213891 de Manoharan. Ejemplos no limitativos de las bases incluyen hipoxantina (I), xantina (X), 3p-D-ribofuranosil-(2,6-diaminopirimidina; K), 3-p-D-ribofuranosil-(1-metil-pirazolo[4,3-d]pirimidin-5,7(4H,6H)-diona; P), isocitosina (iso-C), iso-guanina (iso-G), 1-p-D-ribofuranosil-(5-nitroindol), 1-p-D-ribofuranosil-(3-nitropirrol), 5-bromouracilo, 2-aminopurina, 4-tio-dT, 7-(2-tienil)-imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehndo (Pa), 2-amino-6-(2-tienil)purina (S), 2-oxopiridina (Y), difluorotolilo, 4-fluoro-6-metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol, 3-metil-isocarboestirililo, 5-metil-isocarboestirililo, y 3-metil-7-propinil-isocarboestirililo, 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metilimidizopiridinilo, pirrolopirizinilo, isocarboestirililo, 7-propinil isocarboestirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbencilo, tetracenilo, pentacenilo, y sus derivados estructurales (Schweitzer et al., J . Org. Chem, 59:7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15):291 1-2914 (2000); Moran et al., J . Am. Chem. Soc, 119:2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 121 :2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem. Soc, 118:8182-8183 (1996); Morales et al., J. Am. Chem. Soc, 122(6): 1001 -1007 (2000); McMinn et al., J. Am. Chem. Soc, 121 :1 1585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem, 63:9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:10506-1051 I (1997); Das et al., J . Chem. Soc, Perkin Trans, 1 :197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc, Perkin Trans, 1 : 1605-161 1 (2001); Wu et al., J. Am. Chem. Soc, 122(32):7621-7632 (2000:); O'Neill ct al., J. Org. Chem, 67:5869- 5875 (2002); Chaudhuri ct a1., J. Am. Chem. Soc, 117:10434-10442 (1995); y U.S. Pat. No. 6.218.108). Los analogos de base tambien pueden ser un base universal.

En ciertas realizaciones, la primera y segunda cadena de nucleotido bicatenario como se describe en este documento, que disminuye la expresion de un gen diana y tiene al menos un analogo de base, que puede hibridarse, replicarse o hibridarse conjuntamente (es decir, debido a la complementariedad entre las cadenas) para formar al menos una region de doble cadena con una longitud o una longitud combinada de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 pares de bases o de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 pares de bases. En algunas realizaciones, el nucleotido de doble cadena tiene al menos una region de doble cadena que vana en longitud entre aproximadamente 25 pares de base a aproximadamente 30 pares de bases. En otras realizaciones, el acido nucleico del sustrato Dicer tiene al menos una region bicatenaria que vana en longitud desde aproximadamente 21 a aproximadamente 40 pares de bases o desde aproximadamente 21 a aproximadamente 30 pares de bases o desde aproximadamente 25 a aproximadamente 30 pares de bases. En ciertas realizaciones, el nucleotido bicatenario o su analogo tiene un saliente de uno a cuatro nucleotidos en uno o ambos extremos de 3', tal como un saliente que comprende un desoxirribonucleotido o dos desoxirribonucleotidos (p. ej., timidina). En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico del sustrato Dicer o su analogo tiene un extremo romo en uno o ambos extremos del nucleotido bicatenario como se describe en este documento. En ciertas realizaciones, el extremo 5' de la primera o la segunda cadena esta fosforilado.

En otras realizaciones, por lo menos, un nucleosido de pirimidina del nucleotido bicatenario como se describe en este documento es un acido nucleico bloqueado (LNA) en forma de un azucar bidclico, donde R2 es oxfgeno, y la forma 2'-O y 4'-C un puente de oximetileno en el mismo anillo de ribosa. En una realizacion relacionada, el lNa tiene una sustitucion de base, como un LNA de 5-metiluridina. En otras realizaciones, al menos una, al menos tres, o todas las uridinas de la primera cadena del acido nucleico del sustrato Dicer estan sustituidas por 5-metiluridina o LNA de 5-metiluridina o, al menos, uno, por lo menos tres, o todas las uridinas de la segunda cadena del acido nucleico del sustrato Dicer se sustituyen por 5-metiluridina, LNA de 5-metiluridina, o cualquier combinacion de las mismas (p. ej., tales cambios se hacen en ambas cadenas, o algunas sustituciones incluyen 5-metiluridina solamente, LNA de 5-metiluridina, o una o mas 5-metiluridina con uno o mas LNA de 5-metiluridina).

En aun mas realizaciones, un nucleotido bicatenario o su analogo, de acuerdo con la presente descripcion, incluye ademas un sustituto final terminal en uno o ambos extremos de la primera cadena o segunda cadena, como una fraccion de alquilo, no basica, desoxi no basica, glicerilo, dinucleotido, nucleotido adclico, desoxinucleotido invertido o una combinacion de las mismas. En otras realizaciones, uno o mas enlaces internucleosido pueden modificarse opcionalmente. Por ejemplo, un nucleotido de doble cadena como se describe en este documento o uno que contenga un analogo de un nucleotido modificado de acuerdo con la presente descripcion, en donde, por lo menos, un enlace internucleosido se modifica en un enlace de fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriester, aminoalquilfosfotriester, fosfonato metflico, fosfonato de alquilo, fosfonato de 3'-alquileno, fosfonato de 5'-alquileno, fosfonato quiral, fosfonoacetato, tiofosfonoacetato, fosfinato, fosforamidato, 3'-amino fosforamidato, aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriester, selenofosfato, boranofosfato, o cualquier combinacion de los mismos.

En todavfa otra realizacion, un nucleotido bicatenario como se describe en este documento que disminuye la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia, que comprende una primera cadena complementaria a un ARNm diana y una segunda cadena complementaria a la primera cadena, en la que la primera y la segunda cadena forman una region bicatenaria no solapante de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 pares de bases o de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 pares de base. Cualquiera de las sustituciones o modificaciones descritas en este documento se contemplan tambien en esta realizacion.

En otro ejemplo de esta descripcion, el nucleotido bicatenario descrito en este documento comprende al menos dos o mas nucleosidos modificados, cada uno de los cuales puede seleccionarse independientemente de un analogo de base que comprende cualquier modificacion qmmica o, como se contempla en este documento, por ejemplo, un grupo alquilo (p. ej., metilo), halogeno, hidroxi, alcoxi, nitro, amino, trifluorometilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, alcanoflo, alcanoiloxi, arilo, aroflo, aralquilo, nitrilo, dialquilamino, alquenilo, alquinilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, dialquilaminoalquilo, haloalquilo, carboxialquilo, alcoxialquilo, carboxi, carbonilo, alcanoilamino, carbamoflo, carbonilamino, alquilsulfonilamino o heterociclo. Cuando se presentan dos o mas ribonucleotidos modificados, cada ribonucleotido modificado se puede modificar independientemente para que tenga la misma, o diferente, modificacion o sustitucion en el analogo de base y la posicion C2 en el anillo de furanosa.

En otras realizaciones detalladas, uno o mas nucleosidos modificados, incluyendo los que tienen un analogo de base descrito en esta descripcion pueden ubicarse en cualquier posicion del ribonucleotido, o cualquier combinacion de las posiciones del ribonucleotido, tanto de las cadenas antisentido como sentido de un nucleotido bicatenario de esta descripcion, incluyendo en una o mas posiciones terminales multiples como se indico anteriormente, o en cualquiera o una combinacion de multiples posiciones no terminales ("internas"). En este sentido, cada una de las cadenas sentido y antisentido puede incorporar de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 o mas de los nucleosidos sustituidos.

En ciertas realizaciones, cuando dos o mas nucleosidos modificados estan dentro de un nucleotido bicatenario como se describe en el presente documento, al menos uno de los nucleosidos modificados estara en un extremo 3' o 5' de una o ambas cadenas y, en ciertas realizaciones, al menos uno de los nucleosidos de pirimidina sustituidos estara en un extremo 5' de una o ambas cadenas. En otras realizaciones, los nucleosidos modificados se localizan en una posicion correspondiente a una posicion de una pirimidina en un nucleotido bicatenario no modificado como se describe en este documento que se construye como una secuencia homologa para dirigir un ARNm cognado, como se describe en este documento.

La sustitucion de nucleosidos modificados en un nucleotido bicatenario como se describe en este documento a menudo aumentara la resistencia a la degradacion enzimatica, tal como la degradacion exonucleolttica, incluyendo la degradacion 5’-exonucleolftica o 3’-exonucleolftica. Como tal, el nucleotido bicatenario como se describe en este documento exhibira una resistencia significativa a la degradacion enzimatica en comparacion con un nucleotido bicatenario con nucleotidos estandar y, por lo tanto, poseera mayor estabilidad, un aumento de la vida media y mayor biodisponibilidad en entornos fisiologicos (p. ej., cuando se introduzca en una celula diana eucariota). Ademas de aumentar la resistencia de los ARN del sustrato Dicer sustituido o modificado frente a la degradacion exonucleolttica, la incorporacion de uno o mas nucleosidos modificados con un analogo de base descrito en esta descripcion hara que el nucleotido bicatenario, como se describe en este documento, sea mas resistente a otros procesos de degradacion enzimatica o qmmica y, por lo tanto, lo hara mas estable y mas biodisponible como lo son de otra manera los ARN identicos del sustrato Dicer que no incluyen las sustituciones o las modificaciones. En aspectos relacionados de esta descripcion, las sustituciones o modificaciones de nucleotidos bicatenarios descritas en este documento a menudo mejoraran la estabilidad de un nucleotido bicatenario modificado para su uso en metodos de investigacion, diagnosticos y de tratamiento en donde el acido nucleico del sustrato Dicer modificado se pone en contacto con una muestra biologica, p. ej., una celula de mairnfero, un compartimento intracelular, suero u otro fluido extracelular, tejido u otro compartimento o ambiente fisiologico in vitro o in vivo. En una realizacion, se realiza el diagnostico en una muestra biologica aislada. En otra realizacion, el metodo diagnostico se realiza in vitro. En una realizacion mas, el metodo diagnostico no se realiza (directamente) sobre un cuerpo humano o animal.

Ademas de aumentar la estabilidad del nucleotido bicatenario sustituido o modificado como se describe en este documento, la incorporacion de uno o mas nucleosidos modificados con los analogos de base descritos en esta descripcion en un acido nucleico del substrato Dicer disenado para el silenciamiento genico producira otros resultados funcionales deseados, incluyendo el aumento de un punto de fusion de un acido nucleico del sustrato Dicer sustituido o modificado comparado con el nucleotido bicatenario no modificado correspondiente. Mediante el aumento de este modo del punto de fusion del nucleotido bicatenario, las sustituciones o modificaciones objeto bloquearan o reduciran a menudo la aparicion o el grado de deshibridacion parcial del nucleotido bicatenario sustituido o modificado (que normalmente aparecena y dana lugar al nucleotido bicatenario no modificado mas vulnerable a la degradacion por ciertas exonucleasas), aumentando asf la estabilidad del nucleotido bicatenario sustituido o modificado.

En otro aspecto de esta descripcion, las sustituciones o modificaciones del nucleotido bicatenario, como se describe en este documento, reduciran los "efectos inespedficos" del nucleotido bicatenario sustituido o modificado cuando se pone en contacto con un muestra biologica (p. ej., cuando se introduce en una celula eucariota diana que tiene especies no espedficas y espedficas de ARNm presentes como potenciales dianas espedficas y no espedficas). En realizaciones relacionadas, el nucleotido bicatenario sustituido o modificado de acuerdo con esta descripcion se emplea en metodos de silenciamiento genico, en el que el nucleotido bicatenario sustituto o modificado, tal como se describe en el presente documento, muestra menores efectos inespedficos, o ningun efecto, en comparacion con un nucleotido bicatenario correspondiente no modificado, por ejemplo, cuando se determina la activacion no espedfica de genes ademas de un gen diana (es decir, un gen homologo o cognado) en una celula u otra muestra biologica a la que se expone el nucleotido bicatenario modificado en condiciones que permiten que se detecte la actividad del silenciamiento genico.

En otras realizaciones, el nucleotido bicatenario de esta descripcion puede comprender una o mas cadena sentido (la segunda) que es homologa a una secuencia de un gen diana o que corresponde a esta, y una cadena antisentido (la primera) que es complementaria a la cadena sentido y una secuencia del gen diana. En las realizaciones ejemplares, al menos una cadena del nucleotido de doble cadena, tal como se describe en este documento, incorpora uno o mas de los analogos de base descritos en esta descripcion (p. ej., cuando una pirimidina se sustituye por mas de una 5-metiluridina o la ribosa se modifica para incorporar una sustitucion 2'-O-metilo o cualquier combinacion de los mismos). Estas y otras multiples sustituciones o modificaciones descritas en esta descripcion pueden introducirse en una o mas pirimidinas, o en cualquier combinacion y hasta todas las pirimidinas presentes en una o ambas cadenas de un nucleotido bicatenario como se describe en el presente documento.

En ciertos aspectos, la presente descripcion proporciona un nucleotido bicatenario que disminuye la expresion de un gen diana por el ARN de interferencia, y composiciones que comprenden uno o mas nucleotidos bicatenarios como se describe en este documento, donde, por lo menos, un nucleotido bicatenario comprende uno o mas nucleotidos(s) de union universal en la primera, segunda o tercera posicion en el anticodon de la cadena antisentido del duplex del nucleotido bicatenario y en el que el nucleotido bicatenario, tal como se describe en este documento, es capaz de unirse espedficamente a una secuencia diana, tal como un acido nucleico expresado por una celula diana. En los casos en los que la secuencia de un acido nucleico diana incluye una o mas sustituciones de nucleotidos individuales, el nucleotido bicatenario que comprende un nucleotido de union universal retiene su capacidad para unir espedficamente un acido nucleico diana, mediando asf el silenciamiento genico y, en consecuencia, superando el escape de la diana del silenciamiento genico mediado por el ARN bicatenario. Ejemplos no limitantes de nucleotidos de union universal que pueden emplearse adecuadamente en las composiciones y los metodos descritos en este documento incluyen inosina, 1-p-D-ribofuranosil-5-nitroindol, y 1 -p-D-ribofuranosil-3-nitropirrol. A los efectos de la presente descripcion, un nucleotido de union universal es un nucleotido que puede formar un par de nucleotidos unidos a hidrogeno con mas de un tipo de nucleotido.

Los ejemplos no limitantes para las composiciones anteriores incluyen la modificacion de los anticodones para tirosina (AUA) o fenilalanina (AAA o GAA), cistema (ACA o GCA), histidina (AUG o GUG), asparagina (AUU o GUU), isoleucina (UAU) y aspartato (AUC o GUC) dentro del anticodon de la cadena antisentido de la molecula de ARN bicatenario.

Por ejemplo, dentro de ciertas realizaciones, el anticodon de isoleucina UAU, para que el AUA es el codon cognado, puede modificarse de tal manera que la tercera posicion del nucleotido uridina (U) se sustituye con el nucleotido inosina de union universal (I) para crear el anticodon UAI. La inosina es un nucleotido de union universal ejemplar que puede emparejarse mediante nucleotidos con un nucleotido de adenosina (A), uridina (U) y citidina (C), pero no con la guanosina (G). Este anticodon UAI modificado aumenta la capacidad de union espedfica de la molecula de acido nucleico del sustrato Dicer y permite asf que el acido nucleico del sustrato Dicer se empareje con los ARNm que tienen uno cualquiera de AUA, UUA, y CUA en la posicion correspondiente de la cadena de codificacion, ampliando asf el numero de dianas de degradacion de acidos nucleicos disponibles a los que el acido nucleico del sustrato Dicer puede unirse espedficamente.

Alternativamente, el anticodon AUA tambien puede sustituirse o modificarse alternativamente por sustitucion de un nucleotido de union universal en la tercera o segunda posicion del anticodon tal que el anticodon, o los anticodones representados por UAI (sustitucion de la tercera posicion) o UIU (sustitucion de la segunda posicion), generan el acido nucleico del sustrato Dicer capaz de unirse espedficamente a AUA, CUA y UUA y AAA, ACA y AUA.

En ciertos aspectos, el nucleotido bicatenario descrito en este documento puede incluir desde aproximadamente 1 nucleotido de union universal a aproximadamente 10 nucleotidos de union universal. En ciertos aspectos, el acido nucleico bicatenario actualmente descrito puede comprender una cadena sentido que es homologa a una secuencia de un gen diana y una cadena antisentido que es complementaria a la cadena sentido, con la condicion de que, por lo menos, un nucleotido de la cadena antisentido del duplex de acido nucleico del sustrato Dicer complementario se sustituya de otro modo por uno o mas nucleotidos de union universal.

Segun los antecedentes, dentro del complejo de silenciamiento, el nucleotido bicatenario, tal como se describe en este documento, se coloca de manera que un acido nucleico diana pueda interactuar con el. El RISC se encontrara con miles de ARN diferentes que se encuentran en una celula tfpica en un momento dado. Pero, el nucleotido bicatenario, tal como se describe en este documento, que es un acido nucleico del sustrato Dicer, cargado en RISC se adherira bien a un acido nucleico diana que tiene una complementariedad proxima con el antisentido de la molecula de acido nucleico del sustrato Dicer. Por lo tanto, a diferencia de la respuesta del interferon frente a una infeccion viral, el complejo de silenciamiento es altamente selectivo en la eleccion de un acido nucleico diana. RISC divide la cadena de acido nucleico diana capturada en dos y libera las dos piezas del acido nucleico (ahora incapaz de dirigir la smtesis de protemas) y avanza. El RISC se mantiene intacto y es capaz de encontrar y dividir moleculas de acido nucleico diana adicionales.

Se entendera que, independientemente de la posicion en la que se sustituye uno o mas nucleotidos de union universal, el nucleotido bicatenario, tal como se describe en el presente documento, es capaz de unirse a un gen diana y a una o mas variantes de este, facilitando de este modo la degradacion del gen diana o su variante a traves de un complejo RISC. Por lo tanto, los nucleotidos bicatenarios de la presente descripcion son adecuados para su introduccion en celulas para mediar el silenciamiento genico post-transcripcional espedfico de un gen diana o sus variantes.

En una realizacion, la cadena antisentido o la cadena sentido o ambas cadenas tienen uno o mas nucleotidos modificados de 2'-O-metilo. En otra realizacion, la cadena antisentido contiene nucleotidos modificados por 2'-O-metilo. En otra realizacion, la cadena antisentido contiene un saliente de 3' que se compone de nucleotidos modificados de 2'-O-metilo. La cadena antisentido tambien podna incluir otros nucleotidos modificados por 2'-O-metilo.

Ademas, la estructura del ARN bicatenario se puede optimizar para garantizar que el segmento del oligonucleotido generado a partir de la excision de Dicer sera la porcion del oligonucleotido que es mas eficaz en la inhibicion de la expresion genica. Por ejemplo, en una realizacion de la invencion, se sintetiza un oligonucleotido de 27 bp de la estructura del ARN bicatenario en el que el segmento anticipado de 21 a 22 bp que inhibira la expresion del gen se encuentra en el extremo 3' de la cadena antisentido. Las bases restantes situadas en el extremo 5' de la cadena antisentido seran divididas por Dicer y seran desechadas.

Esta porcion dividida puede ser homologa (es decir, estar basada en la secuencia de la secuencia diana) o no homologa y se anade para extender la cadena de acido nucleico.

Preparacion de los oligonucleotidos de ARN bicatenario

Síntesis y purificacion de oligonucleotidos

Las moleculas de D-ARN pequeno de interferencia pueden disenarse para interactuar con varios sitios en el ARN mensaje, por ejemplo, las secuencias diana dentro de las secuencias de ARN descritas en este documento. La secuencia de una cadena de la molecula o molecula de D-ARN pequeno de interferencia es complementaria a las secuencias del sitio diana descritas anteriormente. Las moleculas de D-ARN pequeno de interferencia pueden sintetizarse qmmicamente utilizando los metodos descritos en este documento. Moleculas de D-ARN pequeno de interferencia inactivas que se utilizan como secuencias control se pueden sintetizar mediante aleatorizacion de la secuencia de las moleculas de D-ARN pequeno de interferencia que no es complementaria con la secuencia diana.

El ARN se puede producir enzimaticamente o por smtesis organica parcial/total, y los ribonucleotidos modificados pueden ser introducidos por smtesis enzimatica in vitro u organica. En una realizacion, cada cadena se prepara qmmicamente. Metodos para sintetizar moleculas de ARN se conocen en la tecnica, en particular, los metodos de smtesis qmmica que se describen en Vema y Eckstein (1998) o como se describen en este documento. En general, pueden ser sintetizadas construcciones de D-ARN pequeno de interferencia utilizando metodos de smtesis de oligonucleotidos en fase solida, como se describe para los ARN pequeno de interferencias 19-23mer (vease, por ejemplo Usman et al., U.S. Pat. Nos. 5.804.683; 5.831.071; 5.998.203; 6.117.657; 6.353.098; 6.362.323; 6.437.117; 6.469.158; Scaringe et al., U.S. Pat. Nos. 6.111.086; 6.008.400; 6.111.086).

En un ejemplo no limitante, los oligonucleotidos de ARN se sintetizan utilizando la qmmica de la fase fosforamidita en solidos, desprotegida y desalada en columnas NAP-5 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.) utilizando tecnicas estandar (Damha y Olgivie, 1993; Wincott et al., 1995). Los oligomeros se purifican usando intercambio cromatograffa lfquida de alta resolucion de intercambio ionico (IE-HPLC) en una columna 15Q de Amersham Source (1,0 cm veces 25 cm; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ.) usando un gradiente de pasos lineal de 15 minutos. El gradiente vana de tampones A:B 90:10 a tampones A:B 52:48, donde el tampon A es Tris 100 mM, pH 8,5 y el tampon B es Tris 100 mM, pH 8,5, NaCl 1 M. Las muestras son monitoreadas a 260 nm y los picos correspondientes a las especies de oligonucleotidos de longitud completa son recogidas, agrupadas, desaladas en columnas NAP-5 y liofilizadas.

La pureza de cada oligomero se determina por electroforesis capilar (CE) en un Beckman PACE 5000 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, Calif). Los capilares CE tienen un diametro interno de 100 um y contienen un gel de ADN monocatenario 100R (Beckman-Coulter). Tfpicamente, se inyectan aproximadamente 0,6 nmoles del oligonucleotido en un capilar, se someten a un campo electrico de 444 V/cm y se detectan por absorbancia UV a 260 nm. El tampon Tris-Borato-7 M-urea desnaturalizante se adquiere en Beckman-Coulter. Se obtienen oligorribonucleotidos que son al menos 90% puros segun lo evaluado por CE para su uso en los experimentos descritos a continuacion. La identidad del compuesto es verificada por la espectroscopfa de masas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz con detector de iones (MALDI-TOF) en un Voyager DE.TM. Biospectometry Work Station (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Pueden obtenerse masas moleculares relativas de todos los oligomeros, a menudo dentro del 0,2% de la masa molecular esperada.

Preparacion de duplex

Por ejemplo, se resuspenden oligomeros de ARN de una cadena (ARN monocatenario) a concentracion 100 |jM en tampon duplex que consta de acetato de potasio 100 mM, HEPES 30 mM, pH 7,5. Se mezclan cadenas sentido y antisentido complementarias en cantidades equimolares para producir una solucion final de 50 j M de duplex. Las muestras se calientan a 95°C durante 5 minutos y se dejan enfriar a temperatura ambiente antes de su uso. Se almacenan a -20°C oligomeros de ARN de doble cadena (ARN bicatenario). Los oligomeros de ARN monocatenario se almacenan liofilizados o en agua sin nucleasa a -80°C.

ARN de doble cadena en interferencia de ARN

Tambien se pueden utilizar metodos de interferencia de ARN en la practica de los ARN bicatenarios de la invencion. Vease, por ejemplo, Scherer y Rossi, Nature Biotechnology, 21:1457-65 (2003) para una revision sobre la eliminacion del ARNm espedfico de secuencia usando oligonucleotidos antisentido, ribozimas, ADNzimas. Vease, tambien, la solicitud internacional de patente PCT/US2003/030901 (publicacion no. WO 2004-029219 A2), presentado el 29 de septiembre de 2003 y titulada "Cell-based RNA Interference and Related Methods and Compositions". La inhibicion controlable de la expresion de un gen diana puede efectuarse controlando la smtesis del producto del gen diana en la celula diana (p. ej., los hepatocitos en el modelo de cancer de hngado). Documento WO2008021393.

Por ejemplo, al evaluar el efecto de un ARN bicatenario con muesca con un tetrabucle, las referencias apropiadas incluinan un ARN bicatenario con las mismas secuencias de nucleotidos con una muesca y sin tetrabucle, un ARN bicatenario que tiene las mismas secuencias de nucleotidos sin muesca y un tetrabucle, y un ARN bicatenario que tiene las mismas secuencias de nucleotidos sin muesca y sin tetrabucle para determinar, respectivamente, el efecto de la muesca, el efecto del tetrabucle, o el efecto combinado de la muesca y el tetrabucle, por ejemplo, un efecto sinergico. Cualquier caractenstica estructural, p. ej., muescas o modificaciones, debe estar presente en las posiciones correspondientes en ambos ARN bicatenarios que se comparan.

De manera similar, al evaluar el efecto de un ARN bicatenario con el nucleotido o los nucleotido modificados, las referencias apropiadas incluinan un ARN bicatenario con las secuencias de nucleotidos con nucleotidos comunes de ARN o ADN (A, C, G, T, U) en la posicion o posiciones correspondientes a las del nucleotido o nucleotidos modificados para determinar, respectivamente, el efecto de un nucleotido modificado, o el efecto combinado de los nucleotidos modificados, por ejemplo, un efecto sinergico. En la colocacion de nucleotidos comunes (A, C, G, T, U) en un ARN bicatenario de referencia en la posicion o posiciones correspondientes a los del nucleotido o nucleotidos modificados, los nucleotidos comunes preservan la estructura helicoidal doble de la estructura del fosfato del duplex. Como antes, cualquier caractenstica estructural, por ejemplo, salientes, muescas o bucles, debe estar presente en las posiciones correspondientes en ambos ARN bicatenarios que se comparan.

En ensayos que involucran a los ARN bicatenarios de la invencion, p. ej., los ensayos de cultivo celular de interferencia de ARN, ensayos in vitro e in vivo, una referencia apropiada es tambien un control negativo, que representa una condicion experimental en la que no se observa o se espera observar ningun efecto. Por ejemplo, al evaluar los efectos in vitro o in vivo de un ARN bicatenario de la invencion, es apropiado utilizar como control negativo el tratamiento con tampon solo u otro ARN bicatenario con la misma composicion de nucleotido, pero en el que la secuencia de nucleotidos esta codificada.

Analisis in vitro de ARN de interferencia para evaluar la actividad de D-ARN pequeno de interferencia

Un ensayo in vitro que recapitula el ARN de interferencia en un sistema sin celulas se utiliza para evaluar las construcciones de D-ARN pequeno de interferencia. Por ejemplo, este ensayo comprende un sistema descrito por Tuschl et al., 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197 y Zamore et al., 2000, Cell, 101,25-33 adaptado para su uso con agentes D-ARN pequeno de interferencia dirigidos contra ARN diana. Un extracto de Drosophila derivado del blastodermo sincitial se utiliza para reconstituir la actividad del ARN de interferencia in vitro. El ARN diana se genera mediante la transcripcion in vitro de un plasmido adecuado utilizando la T7 ARN polimerasa o mediante smtesis qrnmica. Las cadenas de D-ARN pequeno de interferencia del sentido y antisentido (por ejemplo, de 20 |jM cada una) son hibridadas mediante una incubacion en tampon (tal como 100 mM de acetato de potasio, HEPES-KOH 30 mM, pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM) durante 1 minuto a 90°C seguido de 1 hora a 37°C y luego es diluido en tampon de lisis (por ejemplo, acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7,4, acetato de magnesio 2 mM). La hibridacion puede controlarse mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa en tampon TBE y tenirse con bromuro de etidio. El lisado de Drosophila se prepara con embriones de cero a dos horas de edad de moscas de Oregon R recogidas en agar de levaduras de melaza que son decloradas y lisadas. El lisado se centrifuga y el sobrenadante se afsla. El ensayo comprende una mezcla de reaccion que contiene 50% de lisado [vol/vol], ARN (concentracion final 10-50 pM) y tampon de lisis del 10% [vol/vol] que contiene D-ARN pequeno de interferencia (concentracion final 10 nM). La mezcla de reaccion tambien contiene fosfato de creatina 10 mM, 10 jg/m l de fosfocinasa de creatina, GTP 100 jM , UTP 100 jM , CTP 100 jM , ATP 500 jM , DTT 5 mM, 0,1 U /jL de RNasin (Promega) y 100 jM de cada aminoacido. La concentracion final de acetato de potasio se ajusta a 100 mM. Las reacciones se preensamblan en hielo y se incuban previamente a 25°C durante 10 minutos antes de la adicion del ARN, luego se incuban a 25°C durante 60 minutos mas. Las reacciones se inactivan con 4 volumenes de tampon de lisis 1,25xPassive (Promega). El ARN diana se analiza por analisis RT-PCR u otros metodos conocidos en la tecnica y se comparan con las reacciones de control en las que se omite el D-ARN pequeno de interferencia de la reaccion.

De forma alternativa, el ARN diana marcado de forma interna para el ensayo se prepara mediante transcripcion in vitro en presencia de [alfa-32P] CTP, se pasa sobre una columna de Sephadex g 50 por cromatograffa Spin y se utiliza como ARN diana sin mas purificacion. Opcionalmente, el ARN diana es marcado con 5'-32P-extremo usando la enzima T4 polinucleotido quinasa. Los ensayos se realizan como se describio anteriormente y los productos de excision del ARN diana y ARN espedfico generados por ARN de interferencia se visualizan en un autorradiografo de un gel. El porcentaje de excision esta determinado por la cuantificacion PHOSPHOR IMAGER® (autorradiograffa) de bandas que representan el ARN o el ARN de control intacto a partir de las reacciones de control sin D-ARN pequeno de interferencia y los productos de excision generados por el ensayo.

Inhibicion del acido nucleico del ARN diana

Las moleculas de D-ARN pequeno de interferencia dirigidas al ARN genomico son disenadas y sintetizadas como se describio anteriormente. Estas moleculas de acido nucleico se pueden probar para determinar la actividad de excision in vivo, por ejemplo, utilizando el siguiente procedimiento. Se utilizan dos formatos para probar la eficacia de los D ARN pequeno de interferencia. En primer lugar, los reactivos se prueban en cultivo celular utilizando, por ejemplo, celulas de hepatoma humano (Huh7) para determinar la extension del ARN y la inhibicion de las protemas. Los reactivos del D-ARN pequeno de interferencia se seleccionan contra la diana como se describe en este documento. La inhibicion del ARN es medida despues de la administracion de estos reactivos por un agente de transfeccion adecuado; por ejemplo, los queratinocitos epidermicos cultivados. Las cantidades relativas del ARN diana son medidas versus actina utilizando la monitorizacion por amplificacion PCR en tiempo real (p. ej., ABI 7700 TAQMAN). Se hace una comparacion con una mezcla de secuencias de oligonucleotidos a dianas no relacionadas o a un control aleatorizado de D-ARN pequeno de interferencia con la misma longitud total y qrnmica, pero sustituido aleatoriamente en cada posicion. Se eligen los principales reactivos primarios y secundarios para la diana y se realiza la optimizacion. Despues de que se elige una concentracion optima del agente de transfeccion, se realiza una cronologfa del ARN de inhibicion con la molecula principal de D-ARN pequeno de interferencia. Ademas, se puede utilizar un formato de recubrimiento celular para determinar la inhibicion del ARN.

Ademas, tambien se puede utilizar un formato de recubrimiento celular para determinar la inhibicion del ARN.

Administracion de D-ARN pequeno de interferencia a celulas

Se siembran celulas transfectadas de forma estable con el D-ARN pequeno de interferencia, por ejemplo, a 8,5 x103 celulas por pocillo de una placa de 96 pocillos DMEM (Gibco) el dfa antes de la transfeccion. D-ARN pequeno de interferencia (concentracion final, por ejemplo, 200 pM, 1 nM, 10 nM o 25 nM) y lfpidos cationicos Lipofectamine2000 (p. ej., concentracion final 0,5 pl/pocillo) son complejados en Optimem (Gibco) a 37°C durante 20 minutos en microtubos de polipropileno. Despues de agitar fuertemente, el D-ARn pequeno de interferencia complejado se anade a cada pocillo y se incuba durante 24-72 horas.

TAQMAN® (monitorizacion de amplificacion PCR a tiempo real) y Cuantificacion LightCycler del ARNm

Se prepara ARN total a partir de celulas despues de la administracion de D-ARN pequeno de interferencia, por ejemplo, usando el kit de purificacion de 4-PCR de Ambion Rnaqueous para las extracciones a gran escala, o el kit purificacion Ambion Rnaqueous-96 para ensayos de 96-pocillos. Para el analisis TaqMan, las sondas marcadas dualmente se sintetizan, por ejemplo, con los tintes de indicador FAM o VIC covalentemente unidos en el extremo 5' y el tinte inactivador TAMARA conjugado al extremo 3'. Las amplificaciones RT-PCR de un paso se realizan, por ejemplo, en una detector de secuencias ABI PRISM 7700 usando reacciones de 50 pl consistentes en 10 pl de ARN total, cebador directo 100 nM, cebador inverso 100 mM, sonda 100 nM, tampon de reaccion PCR 1xTaqMan (PE-Applied Biosystems), MgCh 5,5 mM, 100 pM cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 0,2 U de Inhibidor de RNasa (Promega), 0,025 U AmpliTaq Gold (PE-Applied Biosystems) y 0,2 U de transcriptasa inversa M-MLV (Promega). Las condiciones de ciclacion termica pueden consistir en 30 minutos a 48°C, 10 minutos a 95°C, seguido de 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C. Se determina la cuantificacion del nivel de ARNm diana en relacion con los estandares generados a partir del ARN celular total diluido en serie (300, 100, 30, 10 ng/rxn) y normalizando, por ejemplo, 36B4 ARNm en paralelo o en reacciones del tubo TaqMan. Para la cuantificacion del ARN, se utilizan cebadores de PCR apropiados y sonda(s) espedfica(s) para los genes de control.

Transferencia Western

Se pueden preparar extractos nucleares utilizando una tecnica de micro-preparacion estandar (vease, por ejemplo, Andrews y Faller, 1991, Nucleic Acids Research, 19, 2499). Se preparan extractos protemicos a partir de los sobrenadantes, por ejemplo, usando la precipitacion de TCA. Se anade un volumen igual al 20% de TCA al sobrenadante celular, incubado en hielo durante 1 hora y sedimentado por centrifugacion durante 5 minutos. Los peletes se lavan en acetona, se secan y se resuspenden en agua. Los extractos de protemas celulares se realizan en un gel de poliacrilamida con bis-Tris NuPage al 10% (extractos nucleares) o 4-12% de Tris-glicina (extractos del sobrenadante) y se transfieren a las membranas de nitrocelulosa. El enlace no espedfico puede bloquearse mediante incubacion, por ejemplo, con leche no grasa al 5% durante 1 hora seguido de anticuerpos primarios durante 16 horas a 4°C. Despues de los lavados, se aplica el anticuerpo secundario, por ejemplo (1:10000 dilucion) durante 1 hora a temperatura ambiente y la senal se detecta con Reactivo SuperSignal (Pierce).

Inhibicion mediada por ARN de interferencia de la expresion diana

Las construcciones del D-ARN pequeno de interferencia se prueban para determinar la eficacia en la reduccion de la expresion del ARN diana, por ejemplo, utilizando el siguiente protocolo. Las celulas se colocan en placas aproximadamente 24 horas antes de la transfeccion en placas de 96 pocillos a 5000-7500 celulas/pocillo, 100 |jl/pocillo, tal que en el tiempo de transfeccion las celulas sean un 70-90% confluentes. Para la transfeccion, los D-ARN pequeno de interferencia hibridados se mezclan con el reactivo de transfeccion (Lipofectamina 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 jl/pocillo y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas de transfeccion del D-ARN pequeno de interferencia se agregan a las celulas para dar una concentracion final del D-ARN pequeno de interferencia de 50 pM, 200 pM, o 1 nM en un volumen de 150 UL. Cada mezcla de transfeccion de D-ARN pequeno de interferencia se anade a 3 pocillos para tratamientos de D-ARN pequeno de interferencia por triplicado. Las celulas son incubadas a 37°C durante 24 horas en presencia continua de la mezcla de transfeccion del D-ARN pequeno de interferencia. A las 24 horas, el ARN es preparado a partir de cada pocillo de celulas tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfeccion primero se eliminan y se desechan, luego se lisan las celulas y se prepara el ARN de cada pocillo. El nivel de ARN diana o la expresion despues del tratamiento se evalua por RT-PCR para detectar el gen diana y para la normalizacion mediante un gene de control (36B4, una subunidad de la ARN polimerasa). Se promedian los datos por triplicado y se determinan las desviaciones estandar para cada tratamiento. Los datos normalizados se representan y se determina la reduccion porcentual del ARNm diana por D-ARN pequeno de interferencia activo en comparacion con sus respectivos D-ARN pequeno de interferencia de control (p. ej., D-ARN pequeno de interferencia de control invertido).

Estabilidad serica para los D-ARN pequeno de interferencia

La estabilidad serica de los agentes D-ARN pequeno de interferencia se evalua mediante la incubacion de agentes de D-ARN pequeno de interferencia en suero bovino fetal al 50% durante varios periodos de tiempo (hasta 24 h) a 37°C. El suero se extrae y los acidos nucleicos se separan en un PAGE no desnaturalizante al 20% y se visualizan con la mancha de Gelstar. Niveles relativos de proteccion contra la degradacion de la nucleasa se evaluan para determinar el D-ARN pequeno de interferencia (opcionalmente con y sin modificaciones).

Terapia basada en interferencia de ARN

Como se sabe, los metodos de ARN de interferencia son aplicables a una amplia variedad de genes en una amplia variedad de organismos y las composiciones y metodos descritos se pueden utilizar en cada uno de estos contextos. Ejemplos de genes que pueden ser objeto de la composiciones y metodos descritos incluyen genes endogenos que son genes nativos de la celula o genes que normalmente no son nativos para la celula. Sin limitacion, estos genes incluyen oncogenes, genes de citoquinas, genes de la protema idiotipo (Id), genes de prion, genes que expresan moleculas que inducen angiogenesis, genes para moleculas de adhesion, receptores de la superficie celular, protemas implicadas en metastasis, proteasas, genes de apoptosis, genes de control del ciclo celular, genes que expresan EGF y el receptor EGF, genes de resistencia a multiples farmacos, como el gen MDR1.

Mas concretamente, el ARNm diana de la invencion especifica la secuencia de aminoacidos de una protema celular (p. ej., una protema nuclear, citoplasmica, transmembrana o asociada a la membrana). En otra realizacion, el ARNm diana de la invencion especifica la secuencia de aminoacidos de una protema extracelular (p. ej., una protema de matriz extracelular o protema secretada). Como se utiliza en este documento, la frase "especifica la secuencia del aminoacido" de una protema significa que la secuencia del ARNm se traduce en la secuencia de aminoacidos segun las reglas del codigo genetico. Las siguientes clases de protemas se enumeran con fines ilustrativos: protemas del desarrollo (p. ej., moleculas de adhesion, inhibidores de ciclina quinasa, miembros de la familia Wnt, miembros de la familia Pax, miembros de la familia de la helice Winged, miembros de la familia Hox, citoquinas/linfocinas y sus receptores, factores de crecimiento/diferenciacion y sus receptores, neurotransmisores y sus receptores); protemas codificadas con oncogenes (p. ej., ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSI, ETSI, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIM I, PML, RET, SRC, TALI, TCL3 y YES); protemas supresoras de tumores (p. ej., APC, BRCAI, BRCA2, MADH4, MCC, NF I, NF2, RB I, TP53 y WTI); y enzimas (p. ej., ACC sintasas y oxidasas, desaturasas e hidroxilasas ACP, pirofosforilasas de ADP-glucosa, ATPasas, alcohol deshidrogenasas, amilasas, amiloglucosidases, catalasas, celulasas, calcona sintasas, quitinasas, ciclooxigenasas, descarboxilasas, dextriinasas, ADN y ARN polimerasas, galactosidasas, glucanasas, glucosa oxidasas, almidon sintasas ligadas a granulos, GTPasas, helicasas, hernicelulasas, integrasas, inulinasas, invertasas, isomerasas, quinasas, lactasas, lipasas, lipoxigenasas, lisozimas, nopalina sintasas, octopina sintasas, pectinesterasas, peroxidasas, fosfatasas, fosfolipasas, fosforilasas, fitasas, sintasas del regulador del crecimiento de plantas, poligalacturonasas, proteinasas y peptidasas, pulanasas, recombinasas, transcripciones inversas, RUBISCO, topoisomerasas y xilanasas).

En un aspecto, la molecula diana del ARNm de la invencion especifica la secuencia de aminoacidos de una protema asociada a una afeccion patologica. Por ejemplo, la protema puede ser una protema asociada a un patogeno (p. ej., una protema viral implicada en la inmunosupresion del huesped, la replicacion del patogeno, la transmision del patogeno, o el mantenimiento de la infeccion), o una protema huesped que facilite la entrada del patogeno en el huesped, el metabolismo del farmaco por el patogeno o el huesped, la replicacion o la integracion del genoma del patogeno, establecimiento o propagacion de la infeccion en el huesped, o el ensamblaje de la proxima generacion de patogenos. Los patogenos incluyen virus de ARN tales como flavivirus, picornavirus, rhabdovirus, filovirus, retrovirus, incluyendo Ientivirus, o virus de ADN como adenovirus, virus de la viruela, virus del herpes, citomegalovirus, hepadnavirus u otros. Otros patogenos incluyen bacterias, hongos, helmintos, esquistosomas y tripanosomas. Otros tipos de patogenos pueden incluir elementos transponibles de mairnferos. Alternativamente, la protema puede ser una protema asociada a un tumor o una protema asociada a una enfermedad autoinmune.

El gen diana puede derivarse o estar contenido en cualquier organismo. El organismo puede ser una planta, un animal, un protozoo, una bacteria, un virus o un hongo. Vease, p. ej., U.S. Pat. No. 6.506.559.

Composiciones farmaceuticas

Formulacion y modo de administracion

En otro aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el ARN bicatenario de la presente invencion. La muestra de ARN bicatenario puede ser adecuadamente formulada e introducida en el entorno de la celula por cualquier medio que permita que una porcion suficiente de la muestra entre en la celula para inducir el silenciamiento genico, si va a ocurrir. Se conocen en la tecnica muchas formulaciones para el ARN bicatenario y se pueden utilizar siempre y cuando el ARN bicatenario consiga entrar a las celulas diana para que pueda actuar. Vease, por ejemplo, las solicitudes de patente publicadas por EE. UU. Nos. 2004/0203145 A1 y 2005/0054598 A1. Por ejemplo, los ARN bicatenarios pueden formularse en soluciones salinas tampon tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, liposomas, estructuras micelares y capsides. Se pueden utilizar formulaciones del ARN bicatenario con lfpidos cationicos para facilitar la transfeccion del ARN bicatenario en las celulas. Por ejemplo, pueden utilizarse lfpidos cationicos, como lipofectina (U.S. Pat. No. 5.705.188 por referencia), derivados de glicerol cationicos y moleculas policationicas, como la polilisina (publicacion de solicitud de PCT internacional WO 97/30731). Los lfpidos adecuados incluyen oligofectamina, lipofectamina (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.), o FuGene 6 (Roche), todos los cuales pueden ser utilizados segun las instrucciones del fabricante.

Se puede apreciar que el metodo de introduccion del ARN bicatenario en el entorno de la celula dependera del tipo de celula y de la forma en que se compone su entorno. Por ejemplo, cuando las celulas se encuentran dentro de un lfquido, una formulacion preferible es una formulacion lipfdica como en la lipofectamina, y el ARN bicatenario se puede anadir directamente al ambiente lfquido de las celulas. En varios sistemas de cultivo celular, se ha demostrado que los lfpidos cationicos mejoran la biodisponibilidad de los oligonucleotidos a las celulas en los cultivos (Bennet, et al., 1992, Mol. Pharmacology, 41, 1023-1033). Las formulaciones lipfdicas tambien pueden administrarse a animales como inyeccion intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, o por via oral o por inhalacion u otros metodos que se conocen en la tecnica. Cuando la formulacion es adecuada para la administracion en animales como los mairnferos y, mas concretamente, los seres humanos, la formulacion es tambien farmaceuticamente aceptable. Las formulaciones farmaceuticamente aceptables para administrar los oligonucleotidos son conocidas y pueden ser utilizadas. En algunos casos, puede ser preferible formular el ARN bicatenario en una solucion tampon o salina e inyectar directamente el ARN bicatenario formulado en las celulas, como en los estudios con ovocitos. Tambien se puede hacer la inyeccion directa de los duplex de ARN bicatenario. Para los metodos apropiados de introduccion del ARN bicatenario, consultar la solicitud de patente de EE.UU. No. 2004/0203145 A1.

Deben ser introducidas cantidades adecuadas de ARN bicatenario y estas cantidades se pueden determinar utilizando metodos estandar. Por lo general, las concentraciones efectivas de especies de ARN bicatenario individuales en el ambiente de una celula seran de aproximadamente 50 nanomolar o menos de 10 nanomolar o menos, o composiciones en las que se pueden utilizar concentraciones de aproximadamente 1 nanomolar o menos. En otra realizacion, los metodos utilizan una concentracion de aproximadamente 200 picomolar o menos e incluso una concentracion de aproximadamente 50 picomolar, o se puede utilizar menos en muchas circunstancias.

El metodo puede llevarse a cabo mediante la adicion de las composiciones de ARN bicatenario a cualquier matriz extracelular en la que las celulas puedan vivir siempre que la composicion del ARN bicatenario sea formulada de manera que una cantidad suficiente del ARN bicatenario pueda entrar en la celula para ejercer su efecto. Por ejemplo, el metodo se puede utilizar con celulas presentes en un lfquido, como un cultivo lfquido o medios de crecimiento celular, en explantes de tejidos, o en organismos enteros, incluidos animales, como mamnferos y, especialmente, los seres humanos.

La expresion de un gen diana puede determinarse por cualquier metodo adecuado que se conozca en la actualidad en la tecnica o que se desarrolle mas adelante. Se puede apreciar que el metodo utilizado para medir la expresion de un gen diana dependera de la naturaleza del gen diana. Por ejemplo, cuando el gen diana codifica una protema, el termino "expresion" puede referirse a una protema o transcrito derivado del gen. En tales casos, la expresion de un gen diana puede determinarse midiendo la cantidad del ARNm correspondiente al gen diana o midiendo la cantidad de esa protema. La protema se puede medir en ensayos de protemas, como por inmunotransferencia o, si la protema cataliza una reaccion que se puede medir, midiendo las tasas de reaccion. Todos estos metodos son conocidos en la tecnica y se pueden utilizar. Cuando el producto genico es una especie de ARN, la expresion se puede medir determinando la cantidad de ARN correspondiente al producto genetico. Varios metodos espedficos para detectar la expresion genica se describen en el ejemplo 1. Las mediciones se pueden hacer en celulas, extractos celulares, tejidos, extractos de tejido o cualquier otro material de una fuente adecuada.

La determinacion de si se ha reducido la expresion de un gen diana se puede realizar por cualquier metodo adecuado que pueda detectar de forma fiable los cambios en la expresion genica. Tfpicamente, la determinacion se realiza introduciendo en el medio ambiente de una celula el ARN bicatenario no digerido tal que al menos una parte de ese ARN bicatenario entra en el citoplasma y luego mide la expresion del gen diana. La misma medicion se realiza en las celulas no tratadas identicas y los resultados obtenidos de cada medicion se comparan.

El ARN bicatenario puede formularse como una composicion farmaceutica que comprenda una cantidad farmacologicamente efectiva de un ARN bicatenario y un vehnculo farmaceuticamente aceptable. Una cantidad farmaceuticamente o terapeuticamente efectiva se refiere a la cantidad de un ARN bicatenario eficaz para producir el tratamiento farmacologico, terapeutico o un resultado preventivo. Las frases "cantidad farmacologicamente efectiva" y "cantidad terapeuticamente efectiva" o, simplemente, "cantidad efectiva" se refieren a esa cantidad de un ARN eficaz para producir los resultados farmacologicos, terapeuticos o preventivos previstos. Por ejemplo, si un tratamiento clmico dado se considera efectivo cuando hay, al menos, una reduccion del 20% en un parametro mensurable asociado a una enfermedad o desorden, una cantidad terapeuticamente efectiva de un farmaco para el tratamiento de esa enfermedad o desorden es la cantidad necesaria para efectuar al menos una reduccion del 20% en ese parametro.

La frase "vehnculo farmaceutico aceptable" se refiere a un vehnculo para la administracion de un agente terapeutico. Los vehnculos ejemplares incluyen solucion salina, solucion salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de las mismas. Para los farmacos administrados por via oral, los vehnculos farmaceuticos aceptables incluyen, entre otros, excipientes farmaceuticos aceptables como diluyentes inertes, agentes desintegradores, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes apropiados incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, y lactosa, mientras que el almidon de mafz y el acido alginico son agentes desintegradores adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidon y gelatina, mientras que el agente lubricante, si esta presente, sera generalmente estearato de magnesio, acido estearico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden estar recubiertos con un material como el monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorcion en el tracto gastrointestinal. El vehnculo farmaceutico aceptable de la composicion de a Rn bicatenario descrita puede ser estructuras micelares, tales como liposomas, capsides, capsoides, nanocapsulas polimericas o microcapsulas polimericas.

Las nanocapsulas o microcapsulas polimericas facilitan el transporte y la liberacion del ARN bicatenario encapsulado o unido en la celula. Incluyen materiales polimericos y monomericos, especialmente incluyen polibutilcianoacrilato. Un resumen de los materiales y metodos de fabricacion ha sido publicado (vease Kreuter, 1991). Se conocen propiamente a partir del estado de la tecnica materiales polimericos que se forman a partir de precursores monomericos y/o oligomericos en la fase de polimerizacion/generacion de nanopartfculas, como son los pesos moleculares y la distribucion del peso molecular del material polimerico que cualquier persona experta en el campo de la fabricacion de nanopartfculas puede seleccionar adecuadamente de acuerdo con la experiencia habitual.

Las composiciones farmaceuticas adecuadamente formuladas de esta invencion se pueden administrado por cualquier medio conocido en la tecnica como por vfas parenterales, incluyendo via intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutanea, transdermica, por las vfas respiratorias (aerosoles), rectal, vaginal y topica (incluyendo la administracion bucal y sublingual). En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas son administradas por perfusion o inyeccion intravenosa o intraparenterica.

Dosificacion

En general, una unidad de dosificacion adecuada de ARN bicatenario estara en el intervalo de 0,001 a 0,25 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por dfa, o en el intervalo de 0,01 a 20 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa, o en el intervalo de 0,01 a 10 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa, o en el intervalo de 0,10 a 5 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa, o en el intervalo de 0,1 a 2,5 microgramos por kilogramo de peso corporal por dfa. La composicion farmaceutica que comprende el ARN bicatenario puede administrarse una vez al dfa. Sin embargo, el agente terapeutico tambien puede ser dosificado en unidades de dosificacion que contengan dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas subdosis administradas a intervalos apropiados durante todo el dfa. En ese caso, el ARN bicatenario contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente mas pequeno con el fin de lograr la unidad de dosificacion diaria total. La unidad de dosificacion tambien se puede componer para una sola dosis durante varios dfas, por ejemplo, mediante una formulacion de liberacion sostenida convencional que proporcione una liberacion consistente y mantenida del ARN bicatenario durante un penodo de varios dfas. Las formulaciones de liberacion sostenida son muy conocidas en la tecnica. En esta realizacion, la unidad de dosificacion contiene un multiplo correspondiente de la dosis diaria. Independientemente de la formulacion, la composicion farmaceutica debe contener un ARN bicatenario en una cantidad suficiente para inhibir la expresion del gen diana en el animal o el ser humano tratado. La composicion puede ser compuesta de tal manera que la suma de las unidades multiples del ARN bicatenario juntas contenga una dosis suficiente.

Los datos pueden obtenerse a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales para formular un intervalo de dosificacion adecuado para los seres humanos. La dosificacion de las composiciones de la invencion se basa en un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 (segun lo determinado por metodos conocidos) con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificacion empleada y la via de administracion utilizada.

Para cualquier compuesto utilizado en el metodo de la invencion, la dosis terapeuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de los ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentracion plasmatica circulante del compuesto que incluya la IC⁵⁰(es decir, la concentracion del compuesto de prueba que logra una inhibicion maxima de los smtomas) segun se determina en un cultivo celular. Dicha informacion se puede utilizar para determinar con mas precision dosis utiles en seres humanos. Los niveles de ARN bicatenario en plasma pueden ser medidos por metodos estandar, por ejemplo, por cromatograffa lfquida de alta resolucion.

Se sabe que los acidos nucleicos sinteticos, como los ARN bicatenarios, pueden estimular el sistema inmunitario innato y desencadenar una respuesta de interferon tipo I (Marques y Williams, 2005; Schlee et al., 2006). In vivo, estan presentes todos los tipos de celulas (y los receptores), por lo que hay un riesgo considerable de desencadenar el sistema inmunitario, especialmente si el ARN bicatenario es administrado mediante una herramienta de administracion basada en lfpidos. Los enfoques de administracion basados en lfpidos maximizan la exposicion de la carga al compartimiento endosomico donde se encuentran los receptores tipo Toll (TLR) 3, 7 y 8 (Heil et al., 2004; Homung et al., 2005; Sioud, 2005), que parecen ser las principales moleculas responsables del reconocimiento inmunologico de los ARN pequenos de interferencia. In vitro, el riesgo de desencadenar una respuesta inmunitaria depende, en gran medida, de la lmea celular espedfica empleada y muchas lmeas de cultivo de tejidos carecen de los receptores inmunes necesarios para responder a los ARN pequenos de interferencia. Sin embargo, ciertos tipos de celulas expresan receptores que reconocen y responden a la presencia de ARN bicatenarios mas largos, como los D-ARN pequenos de interferencia empleados en este documento, que no responden a la presencia de ARN pequenos de interferencia de 21-mer (Reynolds et al., 2006). Por ejemplo, se ha demostrado que la lmea celular de neuroblastoma T98G responde a 27-Mer pero no a los ARN bicatenarios de 21-mer, y se piensa que esta respuesta se relaciona con el reconocimiento de extremos romos en ARN mas largos por el receptor citoplasmico RIG-I (Marques et al., 2006).

La modificacion qmmica de un duplex de ARN puede bloquear la respuesta inmune frente a un secuencia que es normalmente inmuno-estimuladora, incluso in vivo (Morrissey et al., 2005b). Las bases U y G de 2'OMe parecen ser potentes en la prevencion del reconocimiento inmune y se piensa que esto ocurre a traves de una inhibicion competitiva directa de ARN no modificados que unen TLR mediante ARN que contienen 2'OMe (Judge et al., 2006; Robbins et al., 2007).

Tratamiento de la enfermedad con terapia basada en ARN de interferencia

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para tratar un sujeto que padece una enfermedad o que esta en riesgo de desarrollar una enfermedad causada por la expresion de un gen diana. En esta realizacion, el ARN bicatenario puede actuar como un nuevo agente terapeutico que controla uno o mas de los trastornos proliferativos y/o diferenciales celulares, trastornos asociados con el metabolismo oseo, trastornos inmunologicos, trastornos hematopoyeticos, trastornos cardiovasculares, trastornos hepaticos, enfermedades virales o trastornos metabolicos. El metodo comprende administrar una composicion farmaceutica de la invencion al paciente (p. ej., un ser humano), de modo que se silencie la expresion del gen diana. Debido a su alta especificidad, los ARN bicatenarios de la presente invencion reconocen espedficamente a los ARNm diana de los genes diana de las celulas y tejidos enfermos.

En la prevencion de la enfermedad, el gen diana puede ser uno necesario para la iniciacion o el mantenimiento de la enfermedad, o que se ha identificado como asociado a un mayor riesgo de contraer la enfermedad. En el tratamiento de la enfermedad, el ARN bicatenario puede ponerse en contacto con las celulas o los tejidos que exhiban la enfermedad. Por ejemplo, puede ponerse en contacto un ARN bicatenario sustancialmente identico con la totalidad de un gen mutado asociado con el cancer o con parte de este, o uno que se exprese a niveles altos en celulas tumorales, por ejemplo, aurora quinasa, con una celula cancerosa o gen tumoral o introducirse en estos.

Ejemplos de trastornos proliferativos y/o diferenciales celulares incluyen el cancer, p. ej., carcinoma, sarcoma, trastornos metastasicos o trastornos neoplasicos hematopoyeticos, por ejemplo, las leucemias. Un tumor metastasico puede surgir de una multitud de tipos de tumores, incluyendo, entre otros, los de la prostata, colon, pulmon, mama e fugado. Como se usa en este documento, los terminos "cancer", "hiperproliferativo" y "neoplasico" se refieren a celulas que tienen capacidad de crecimiento autonomo, es decir, un estado anormal de la condicion caracterizado por un crecimiento celular rapidamente proliferante. Estos terminos pretenden incluir todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncologicos, tejidos metastasicos o celulas tumorales, tejidos u organos, independientemente del tipo histopatologico o del estado de invasividad. Los trastornos proliferativos tambien incluyen trastornos neoplasicos hematopoyeticos, incluyendo las enfermedades que implican celulas hiperplasicas/neoplasicas de origen hematopoyetico, p. ej., derivadas de linajes mieloides, linfoides o eritroides, o celulas precursoras de estos.

La presente invencion tambien se puede utilizar para tratar una variedad de trastornos inmunologicos, en particular los asociados con la sobreexpresion de un gen o la expresion de un gen mutante. Los ejemplos de trastornos o enfermedades hematopoyeticas incluyen, sin limitacion, enfermedades autoinmunes (incluyendo, por ejemplo, diabetes melitus, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artrosis, artritis psoriasica), esclerosis multiple, encefalomielitis, miastenia gravis, lupus eritematoso sistemico, tiroiditis automimmune, dermatitis (incluyendo la dermatitis atopica y la dermatitis eczematosa), psoriasis, smdrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, ulcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, asma, asma alergica, lupus eritematoso cutaneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, erupciones farmacologicas, reacciones de reversion de la lepra, eritema nodoso leproso, uveitis autoinmune, encefalomielitis alergica, encefalopatfa hemorragica aguda necrotizante, perdida de audicion sensorineural progresiva bilateral idiopatica, anemia aplasica, anemia de globulos rojos puros, trombocitopenia idiopatica, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis cronica activa, smdrome de Stevens-Johnson, esprue idiopatico, liquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uvettis posterior y fibrosis pulmonar intersticial), enfermedad de injerto versus huesped, casos de trasplante y alergia.

En otra realizacion, la invencion se relaciona con un metodo para tratar enfermedades virales, incluyendo, entre otros, el virus del papiloma humano, la hepatitis C, hepatitis B, el virus del herpes simple (HSV), VIH-SIDA, poliovirus y virus de la viruela. Los ARN bicatenarios de la invencion se preparan como se describe en este documento para reconocer las secuencias expresadas de un virus, mejorando asf la actividad viral y la replicacion. Las moleculas se pueden utilizar en el tratamiento y/o diagnostico de tejidos virales infectados, tanto animales como vegetales. Ademas, tales moleculas pueden utilizarse en el tratamiento del carcinoma asociado al virus, como el cancer hepatocelular.

Los ARN bicatenarios de la presente invencion tambien se pueden utilizar para inhibir la expresion del gen de la resistencia a multiples farmacos 1 ("MDRI"). La expresion "resistencia a multiples farmacos" (MDR) se refiere ampliamente a un patron de resistencia frente a una variedad de farmacos quimioterapeuticos con diferentes estructuras qmmicas y diferentes mecanismos de accion. Aunque la etiologfa de la MDR es multifactorial, la sobreexpresion de la glicoprotema-P (Pgp), una protema de membrana que media el transporte de farmacos MDR, sigue siendo la alteracion mas comun basada en MDR en modelos de laboratorio (Childs y Ling, 1994). Ademas, la expresion de Pgp se ha vinculado al desarrollo de MDR en el cancer humano, particularmente en las leucemias, linfomas, mieloma multiple, neuroblastoma y sarcoma de tejidos blandos (Fan et al.). Estudios recientes han mostrado que las celulas tumorales que expresan la protema asociada a MDR (MRP; Cole et al., 1992), protema de resistencia pulmonar (LRP; Scheffer et al., 1995) y la mutacion de la ADN topoisomerasa II (Beck, 1989) tambien pueden dar lugar a MDR.

Modelos de cultivo celular

En varios sistemas de cultivo celular, se ha demostrado que los lfpidos cationicos mejoran la biodisponibilidad de los oligonucleotidos en cultivo de celulas (Bennet, et al., 1992, Mol. Pharmacology, 41, 1023-1033). En una realizacion, las moleculas de ARN bicatenario de la invencion son complejadas con lfpidos cationicos para experimentos de cultivo celular. Las moleculas de ARN bicatenario y las mezclas de lfpidos cationicos se preparan en DMEM sin suero inmediatamente antes de la adicion a las celulas. Se calientan DMEM mas los aditivos a temperatura ambiente (aproximadamente 20-25°C) y se anaden lfpidos cationicos a la concentracion deseada final y la solucion se agita brevemente. Las moleculas de D-ARN pequeno de interferencia se anaden a la concentracion final deseada y la solucion se agita otra vez brevemente y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. En los experimentos de respuesta a la dosis, el complejo de ARN/lfpidos se diluye en serie en el DMEM despues de una incubacion de 10 minutos. El nivel de inhibicion de la expresion genica por el ARN bicatenario es de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 100% en comparacion con un control de referencia. El nivel de inhibicion se puede medir examinando los niveles de protema, analizando la actividad de la protema o evaluando un fenotipo. La disminucion de los niveles del ARN diana por el ARN bicatenario es del 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso del 100% en comparacion con un control de referencia.

Modelo animal

Eficacia de D-ARN pequeno de interferencia en un modelo de enfermedad para raton

Se han descrito modelos de ratones de varias enfermedades (p. ej., cancer, enfermedades inflamatorias, aterosclerosis, obesidad). En consecuencia, en un modelo de enfermedad para raton se administra el agente de D ARN pequeno de interferencia de la presente invencion mediante una inyeccion hidrodinamica en la vena de cola. A 3-4 ratones por grupo (divididos en base a un agente D-ARN pequeno de interferencia espedfico probado) le son inyectados 50 |jg o 200 |jg de D-ARN pequeno de interferencia. Se utilizan metodos reconocidos en la tecnica que vanan segun el modelo utilizado para evaluar el D-ARN pequeno de interferencia. El nivel de inhibicion de la expresion genica del ARN bicatenario es 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 100% en comparacion con un control de referencia. El nivel de inhibicion se puede medir examinando los niveles de protema, ensayando la actividad proteica, o evaluando el fenotipo. La disminucion de los niveles del ARN diana por el ARN bicatenario es de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso 100% en comparacion con un control de referencia.

La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de qrnmica, biologfa molecular, microbiologfa, ADN recombinante, genetica, inmunologfa, biologfa celular, biologfa de cultivos celulares y transgenica, que pertenecen al marco de la tecnica. Vease, por ejemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2a Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3a Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, incluyendo las actualizaciones periodicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Antisense to Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 y 155 (Wu et al. eds.), lmmunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds, 1986); Riott, Essential Immunology, 6a Edicion, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4a Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000).

Otras realizaciones

A partir de la descripcion anterior, sera evidente que se pueden realizar variaciones y modificaciones en la invencion descrita en este documento para adoptarla a diversos usos y condiciones. Tales realizaciones estan tambien dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

La enumeracion de la lista de elementos en cualquier definicion de una variable en este documento incluye las definiciones de esa variable como cualquier elemento unico o combinacion (o subcombinacion) de los elementos enumerados. La descripcion de una realizacion en este documento incluye a tal realizacion como una sola realizacion o en combinacion con cualquier otra realizacion o con partes de la misma.

En caso de conflicto, la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones, prevalecera. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son ilustrativos y no pretenden limitarla.

Se hace referencia a las siguientes publicaciones: Amarzguioui, M. and Prydz (2004). “An algorithm for selection of functional siRNA sequences”. Biochem Biophys Res Commun 3 16: 1050-1058; Amarzguioui, M. et al. (2003). “Tolerance for Mutation and Chemical Modifications in a siRNA”. Nucleic Acids Research 31:589-595; Bartlett, D. W. and Davis, M. E. (2006) “Effect of siRNA nuclease stability on the in Vitro and in Vivo kinetics of siRNA-mediated gene silencing”. Biotechnol Bioeng; Beale, S. E. et al. (2005). “siRNA target site secondary structure predictions using local stable substructures”. Nucl Acids Res 33:e3O (pp1-10); Beck, W. T. (1989). “Unknotting the complexities of multidrug resistance: the involvement of DNA topoisomerases in drug action and resistance”. J Natl Cancer Inst 81:1683-1685; Boese, Q. et al. (2005). “Mechanistic insights aid computational short intervening RNA design”. Methods Enzymol 392:73-96; Bondensgaard, K. et al. (2000). “Structural studies of LNA:RNA duplexes by NMR: conformations and implications for RNase H activity”. Chemistry 6:2687-2695; Braasch, D. A. and Corey, D. R. (2001). “Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA”. Chem Biol 8:1-7; Bohula, E. A. et al. (2003). “The efficacy of small interfering RNAs targeted to the type I insulin-Iike growth factor receptor (IGFIR) is influenced by secondary structure in the IGFIR transcript”. J Biol Chem 278: 15991-15997; Bridge et al. (2003). “ Induction of an Interferon Response by RNAi Vectors in Mammalian Cells”. Nature Genetics 34:263-264; Chang et al. (1985). “Gene Expression from Both Intronless and Intron-Containing Rous Sarcoma Virus Clones is Specifically Inhibited by Anti-Sense RNA”. Molecular and Cellular Biology 5:2341-2348; Check (2003). “RNA to the Rescue?” Nature 425: 10-12; Childs, S, and V. Ling (1994). “The MDR superfamily of genes and its biological implications”. Important Adv Oncol, pp. 21-36; Chiu et al. (2003). “siRNA Function in RNAi: A Chemical Modification Analysis”. RNA 921034-1048; Cole, S. P. et al. (1992). “Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line”. Science 258:1650-1654; Collingwood, MA. et al. (2008). “Chemical Modification Patterns Compatible with High Potency Dicer-Substrate Small Interfering RNAs”. Oligonucleotides. 2008 Summer; 18(2):187-200; Crinelli, R. et al. (2002). “Design and characterization of decoy oligonucleotides containing locked nucleic acids”. Nucleic Acids Res 30:2435-2443; Damha, M. J., and Ogilvie, K. K. (1993). “Oligoribonucleotide synthesis. The silylphosphoramidite method”. Methods Mol Biol 20:81-114; Eckstein, F. (2000). “Phosphorothioate oligodeoxynucleotides: what is their origin and what is unique about them?” Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:117-21; Elman, J. et al. (2005). “Locked nucleic acid (LNA) mediated improvements in siRNA stability and functionality”. Nucleic Acids Res 33:439-447; Fan, D. et al., (1994). “Reversal of multidrug resistance In Reversal of Multidrug Resistance in Cancer”, Kellen, J. A., ed., CRC Press, Boca Raton, Fla., pp. 93-125; Fire, A. et al. (1998). “Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans”. Nature 391:806-811; Graessmann, M. et al. (1991). “ Inhibition of SV40 gene expression by microinjected small antisense RNA and DNA molecules”. Nucleic Acids Res 19:53-59; Gunnery, S., and Mathews, M. B. (1998) “RNA binding and modulation of PKR activity”. Methods 15:189-98; Hamada et al. (2002). “Effects on RNA Interference in Gene Expression (RNAi) in Cultured Mammalian Cells of Mismatches and the Introduction of Chemical Modifications at the 3'-Ends of siRNAs”. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12:301-309; Harmon (2002). “RNA Interference”. Nature 418:244-251; Haupenthal, J. et al. (2006). “ Inhibition of RNAse A family enzymes prevents degradation and loss of silencing activity of siRNAs in serum”. Biochem Pharmacol. 71, 702-710; Haupenthal, J . et al. (2007). “RNAse A-like enzymes in serum inhibit the anti-neoplastic activity of siRNA targeting polo-like kinase 1”. In. J. Cancer; Herdewijn, P. (2000). “Heterocyclic modifications of oligonucleotides and antisense technology”. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:297-310; Hohjoh, J. (2002) “RNA interference (RNAi) induction with various types of synthetic oligonucleotide duplexes in cultured human cells”. FEBS Lett 521:195-199; Ji, J. et al. (2003). “Enhanced gene silencing by the application of multiple specific small interfering RNAs”. FEBS Lett 552:247-252; Judge, A. D. et al. (2006). “Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo”. Mol Ther, 13, 494-505; Khvorova, A. et al. (2003). “Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias”. Cell 115:209-216; Kim, D. H., and J. J. Rossi (2003). “Coupling of RNAi-mediated target downregulation with gene replacement”. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 13:151-155; Kim, D. H. et al. (2004). “ Interferon induction by siRNAs and ssRNAs synthesized by phage polymerase”. Nat Biotechnol 22:321-325; Kretshmer-Kazemi Far et al. (2003). “The Activity of siRNA in Mammalian Cells is Related to Structural Target Accessibility: A Comparison with Antisense Oligonucleotides”. Nucleic Acids Research 314417-4424; Krol, J. et al. (2004). “Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design”. J Biol Chem 279:42230-42239; Kreuter, J. (1991) “Nanoparticles-preparation and applications”. En: “Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy”, Donbrow M., ed, CRC Press, Boca Raton, Fla., pp. 125-14; Kurreck, J. et al. (2002). “Design of antisense oligonucleotides stabilized by locked nucleic acids”. Nucleic Acids Res 30:1911-1918; Kurreck, J. (2003) “Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications”. Eur J Biochem. 270, 1628-1644; Levin, A. A. (1999) “A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides”. Biochim Biophys Acta, 1489, 69-84; Liu, et al. (2003). “R2D2, a Bridge Between the Initiator and Effector Steps of the Drosophila RNAi Pathway”. Science 301:1921-1925; Manoharan, M. (2002) “Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action”. Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 12, 103-128; Markovtsov, V. et al. (2000). “Cooperative assembly of an hnRNP complex induced by a tissue specific homolog of polypyrimidine tract binding protein”. Mol Cell Biol 20:7463-79; Marques, J. T. and Williams, B. R. (2005) “Activation of the mammalian immune system by siRNAs”. Nat Biotechnol, 23, 1399-1405; Marques, J . T., et al. (2006). “A structural basis of discriminating between self and nonself double-stranded RNAs in mammalian cells”. Nature Biotechnology, 24:559-565; Martinez, J. et al. (2002). “Single-stranded antisense siRNAs guide target RNA cleavage in RNAi”. Cell 110:563-574; Matteucci, M. (1997) “Oligonucleotide analogues: an overview”. Ciba Found Symp. 209, 5-14; discussion 14-18; McManus et al. (2002). “Gene Silencing in Mammals by Small Interfering RNAs”. Nature Reviews Genetics 3:737-747; Melton, D. A. (1985). “ Injected anti-sense RNAs specifically block messenger RNA translation in vivo”. Proc Natl Acad Sci USA 82: 144-148; Minks, M. A. et al. (1979). “Structural requirements of double-stranded RNA for the activation of the 2'-5'-oligo(A) polymerase and protein kinase of interferon-treated HeLa cells”. J Biol Chem 254:10180-10183; Morrissey, D. V. et al. (2005). “Potent and persistent in Vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs”. Nat Biotechnol, 23, 1002-1007; Napoli, C. et al. (1990). Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2:279-289; Nawrot, B. and Sipa, K. (2006) “Chemical and structural diversity of siRNA molecules”. Curr Top Med Chem, 6, 913-925; Ngo et al. (1998). “Double- Stranded RNA Induces mRNA Degradation in Trypanosoma brucei”. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14687-14692; Pellino et al. (2003). “R2D2 Leads the Silencing Trigger to mRNA's Death Star”. Cell 115:132-133; Persengiev, S. P. et al. (2004). “Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expression by small interfering RNAs (siRNAs)”. RNA 10:12-18; Raemdonck, K. et al. (2006). “ In situ analysis of single-stranded and duplex siRNA integrity in living cells”. Biochemistry. 45, 10614-10623; Rana, T. M. (2007) “Illuminating the silence: understanding the structure and function of small RNAs”. Nat Rev Mol Cell Biol, 8, 23 36; Reynolds, A. et al. (2004). “Rational siRNA design for RNA interference”. Nat Biotechnol 22:326-330; Robbins, M. A. et al. (2006). “Stable expression of shRNAs in human CD34(+) progenitor cells can avoid induction of interferon responses to siRNAs in vitro”. Nat Biotechnol, 24, 566-571; Romano, N. and G. Macino (1992). “Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences”. Mol Microbiol 6:3343-53; Rusckowski, M. et al. (2000). “Biodistribution and metabolism of a mixed backbone oligonucleotide (GEM 231) following single and multiple dose administration in mice”. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10:333-345; Scheffer, G. L. et al. (1995). “The drug resistance-related protein LRP is the human major vault protein”. Nat Med 1:578-582; Scherer, L. and J. J. Rossi (2004). “RNAi applications in mammalian cells”. Biotechniques 36:557-561; Scherer et al. (2003). “Approaches for the Sequence-Specific Knockdown of mRNA”, Nature Biotechnology 21:1457-1465; Schlee, M. et al. (2006). “siRNA and is Rn A: two edges of one sword”. Mol Ther, 14, 463-470; Schwarz, D. S. et al. (2003). “Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex”. Cell 115:199-208; Shen, L. et al. (2003). “Evaluation of C-5 propynyl pyrimidine-containing oligonucleotides in vitro and in vivo”. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13, 129-142; Siolas, D. et al. (2005). “Synthetic shRNAs as potent RNAi triggers”. Nat Biotechnol 23: 227-231; Sioud, M. (2005) “ Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double-stranded and single-stranded siRNAs is sequence-dependent and requires endosomal localization”. J Mol Biol. 348, 1079-1090; Skipper, (2003). “Elegant Tour de Force”. Nature Reviews Genetics 4: 79-80; Sledz et al. (2003). “Activation of the Interferon System by Short-Interfering RNAs. Nature Cell Biology 5:834-839; Stein, D. A. et al. (2001). “ Inhibition of Vesivirus infections in mammalian tissue culture with antisense morpholino oligomers”. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11:317-25; Swayze, E. E. et al. (2007). “Antisense oligonucleotides containing locked nucleic acid improve potency but cause significant hepatotoxicity in animals”. Nucleic Acids Res, 35, 687-700; Ui-Tei, K. et al. (2004). “Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference”. Nucleic Acids Res 32:936-948; Verma, S, and F. Eckstein (1998). Modified oligonucleotides: synthesis and strategy for users. Annu Rev Biochem 67:99-134; Vorobjev, P. E. et al. (2001). “Nuclease resistance and RNase H sensitivity of oligonucleotides bridged by oligomethylenediol and oligoethylene glycol linkers”. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11:77-85; Wahlestedt, C. et al. (2000). “Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids”. Proc Natl Acad Sci USA 97:5633-5638; Waterhouse et al. (2003). “Exploring Plant Genomes by RNA-Induced Gene Silencing”. Nature Reviews Genetics 4: 29-38; Wincott, F. et al. (1995). “Synthesis, deprotection, analysis and purification of RNA and ribozymes”. Nucleic Acids Res 23:2677-84; Wolin, S. L. and T. Cedervall (2002). “The La protein”. Annu Rev Biochem 71 :375-403; Xu et al. (2003). “Effective Small Interfering RNAs and Phosphorothioate Antisense DNAs Have Different Preferences for Target Sites in the Luciferase mRNAs”. Biochemical and Biophysical Research Communications 306:712-717; Yuan, B. et al. (2004). “siRNA Selection Server: an automated siRNA oligonucleotide prediction server”. Nucl Acids Res 32(ejemplar del servidor de internet):W130-134; Zhang, H. Y. et al. (2006). “RnA Interference with chemically modified siRNA”. Curr Top Med Chem, 6, 893-900.

Ejemplos

La presente invencion se describe mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustracion y que no pretenden limitar la invencion en ninguna forma. Se utilizaron tecnicas estandar muy conocidas en la tecnica o las tecnicas espedficamente descritas a continuacion.

Ejemplo 1. Ensayo de cultivo celular in vitro para evaluar la inhibicion del acido nucleico del ARN diana

Los ARN bicatenarios de la invencion se administran a celulas de hepatoma humano (Huh7) y posteriormente se miden los niveles de ARNm reconocidos en las celulas de hepatoma humano (Huh7) para evaluar la eficacia in vitro de los ARN bicatenarios de la invencion frente a los transcritos reconocidos.

Se someten a pruebas los ARN de doble cadena espedficos para el gen diana humano de la hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HPRT1; N° de entrada del GenBank n M_000194 y GI:164518913) para evaluar la eficacia en celulas de hepatoma humano (Huh7). El gen diana anterior se selecciona entre los genes de "limpieza" reconocidos en la tecnica. Los genes de limpieza se seleccionan como genes diana para el doble proposito de asegurar que los genes diana poseen una expresion fuerte y homogenea en celulas hepaticas humanas y para minimizar la variabilidad inter-animal del nivel de expresion.

En las figuras 7, 8, 9 y 11 se muestran ejemplos de ARN bicatenarios con muescas, con los controles apropiados de ARN bicatenarios que se utilizan como referencia para la comparacion. Se muestran ARN bicatenarios espedficos con muescas para reconocer HPRT1, por ejemplo, en las figuras 7, 8, 9 y 11. Pueden ser construidas secuencias espedficas de ARN bicatenarios con muesca dirigidas a GAPDH, LMNA, HNRPA1 y ATP1B3 de manera similar para reconocer a su respectivo transcrito en celulas hepaticas humanas.

En las figuras 19 y 20 se ilustran estructuras ejemplares de ARN bicatenarios utiles para el reconocimiento de HPRTI para ARN bicatenarios que poseen nucleotidos modificados o universales en un sitio o varios sitios espedficos. Pueden construirse secuencias espedficas de ARN bicatenarios que poseen tales nucleotidos modificados o universales y dirigidos a HPRTI, GAPDH, LMNA, HNRPAI y ATP1B3 de forma similar para reconocer su respectivo transcrito en celulas hepaticas humanas. Secuencias espedficas de tales D-ARN pequenos de interferencia y que reconocen HPRT1 son, por ejemplo:

Agentes de D-ARN pequeno de interferencia de HPRT1:

A.

5'-AGCAUCUCCCUCACAAUUXXXXGCC-3'

3'-ACUCGUAGAGGGAGUGUUAAXXXXCGG-5'

B.

5'-AGCAUCUCCCUCACAAUUUCCGACC-3'

3'-ACUCGUAGAGXXAGUGUUAAAGGCUGG-5'

C.

5'-AGCAUCUCCCUCACAAUUXXXXGCC-3'

3'-ACUCGUAGAGXXAGUGUUAAXXXXCGG-5'

Leyenda: mayusculas = residuos de ARN; X = xantosina

Las moleculas de D-ARN pequeno de interferencia dirigidas al ARN genomico estan disenadas y sintetizadas como se describe en este documento. Estas moleculas de acido nucleico se pueden probar in vivo para determinar la capacidad para reducir la expresion genica y la actividad de excision, por ejemplo, utilizando el siguiente procedimiento. Se utilizan dos formatos para probar la eficacia de los D-ARN pequenos de interferencia. Los reactivos se analizan en cultivo celular utilizando, por ejemplo, celulas de hepatoma humanas (Huh7) para determinar la extension del ARN y la inhibicion de la protema. Los reactivos del D-ARN pequeno de interferencia se seleccionan frenet a la diana, como se describe en este documento. La inhibicion del a Rn se mide despues de la administracion de estos reactivos por un agente de transfeccion adecuado, por ejemplo, para los queratinocitos epidermicos cultivados. Las cantidades relativas de ARN diana se miden versus actina utilizando una monitorizacion de amplificacion por PCR a tiempo real (p. ej., ABI 7700 TAQMAN). Se hace una comparacion con un combinacion de secuencias de oligonucleotidos realizadas frente a dianas no relacionados o frente a un D-ARN pequeno de interferencia control con la misma longitud total y qmmica, pero sustituido al azar en cada posicion. Se eligen los principales reactivos primarios y secundarios para la diana y se realiza la optimizacion. Despues de elegir una concentracion optima del agente de transfeccion, se realiza un curso de tiempo de inhibicion de ARN con la molecula principal de D-ARN pequeno de interferencia. Ademas, se puede utilizar un formato de recubrimiento celular para determinar la inhibicion del ARN.

Las construcciones de D-ARN pequeno de interferencia se prueban para determinar la eficacia en la reduccion de la expresion del ARN diana, por ejemplo, utilizando el siguiente protocolo. Las celulas se colocan en placas aproximadamente 24 horas antes de la transfeccion en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 celulas/pocillo, 100 pl/pocillo, tal que en el momento de la transfeccion las celulas son un 70-90% confluentes. Para la transfeccion, se mezclan los D-ARN pequenos de interferencia hibridados con el reactivo de transfeccion (Lipofectamina 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 pl/pocillo y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se agregan las mezclas de transfeccion del D-ARN pequeno de interferencia a las celulas para dar una concentracion final del D-ARN pequeno de interferencia de 50 pM, 200 pM, o 1 nM en un volumen de 150 pl. Cada mezcla de transfeccion de D-ARN pequeno de interferencia se anade a 3 pocillos para tratamientos de D-ARn pequeno de interferencia por triplicado. Las celulas son incubadas a 37°C durante 24 horas en presencia continuada de la mezcla de transfeccion de D-ARN pequeno de interferencia. A las 24 horas, se prepara el ARN a partir de cada pocillo de celulas tratadas. Los sobrenadantes con las mezclas de transfeccion primero se eliminan y se desechan, luego se lisan las celulas y se prepara el ARN de cada pocillo. Se evalua el nivel de ARN diana o la expresion despues del tratamiento mediante un metodo cuantitativo (p. ej., RT-PCR, transferencia Northern) para el gen diana y para un gen control (p. ej., actina o 36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para la normalizacion.

Alternativamente, las celulas son lisadas y se prepara protema total a partir de cada pocillo. El nivel de protema diana o la expresion despues del tratamiento se evaluan por transferencia Western y se cuantifica la senal. Se promedian los datos por triplicado y se determinan las desviaciones estandar para cada tratamiento. Los datos normalizados se promedian y se determina la reduccion porcentual del ARNm diana por los ARN bicatenarios de la invencion en comparacion con los ARN bicatenarios control apropiados (p. ej., ARN bicatenarios de control invertidos).

Por lo tanto, se puede demostrar que los ARN bicatenarios con muescas de la invencion reducen la expresion genica de una diana espedfica en celulas, especialmente en comparacion con un ARN bicatenario de referencia. Se espera que los ARN bicatenarios con muesca que poseen un tetrabucle exhiban una excision mejorada por Dicer. Sin seguir a ninguna teona particular, la excision mejorada por Dicer de un ARN bicatenario de la invencion da como resultado un aumento de los niveles de ARN pequeno de interferencia, en comparacion con un control de ARN bicatenario. Tambien se espera que la muesca en el ARN bicatenario permita mas modificaciones qrnmicas que se utilizaran en la misma cadena que la muesca aliviando de esta forma la obligacion de poseertal funcion de cadena como un sustrato de Dicer. Por lo tanto, el ARN bicatenario con muesca reduce la expresion de un gen diana y mejora la excision por Dicer en comparacion con un ARN bicatenario de referencia.

Tambien se puede demostrar que los ARN bicatenarios de la invencion que contienen nucleotidos modificados o universales reducen la expresion genica de la diana espedfica en las celulas, especialmente en comparacion con un ARN bicatenario de referencia. Se espera que tales ARN bicatenarios de la invencion muestren una excision mejorada por Dicer, una asociacion potenciada con Ago2, y/o una excision potenciada de los ARN diana por Ago2/RISC. Sin limitarse a ninguna teona, la mejor excision por Dicer de un ARN bicatenario de la invencion da como resultado niveles crecientes de ARN pequeno de interferencia, en comparacion con los de un ARN bicatenario control. Tambien, sin limitarse tampoco a ninguna teona, la mayor asociacion con Ago2 de un ARN pequeno de interferencia de un ARN bicatenario de la invencion o la mayor excision por Ago2/RISC se traduce en una mayor reduccion de la expresion genica diana, comparada con la de un ARN bicatenario control. Sin limitarse tampoco a ninguna teona particular, la mejor excision por Ago2/RISC da como resultado una mayor reduccion de la expresion genica diana, en comparacion con la de un a Rn bicatenario control. Por lo tanto, los ARN bicatenarios que contienen los nucleotidos modificados o universales reducen la expresion de un gene diana, la mayor excision por Dicer, la mejor interaccion por Ago2, y/o la mejor excision por Ago2/RlSC en comparacion con un ARN bicatenario de referencia.

Por lo tanto, el presente ejemplo muestra que los ARNs bicatenarios, que poseen las estructuras abarcadas por los ARN bicatenarios de la invencion, son inhibidores espedficos de secuencia altamente efectivos in vitro de la expresion de los genes diana en celulas de hepatoma humano (Huh7).

Ejemplo 2. Ensayo in vitro para evaluar la estabilidad en suero

La estabilidad serica de los agentes D-ARN pequeno de interferencia se evalua mediante la incubacion de agentes D ARN pequeno de interferencia en suero bovino fetal al 50% durante varios periodos de tiempo (hasta 24 h) a 37°C. El suero se extrae y los acidos nucleicos se separan en un PAGE no desnaturadoro al 20% y se visualiza con la tincion de Gelstar. Se evaluan niveles relativos de proteccion contra la degradacion de la nucleasa para D-ARN pequenos de interferencia (opcionalmente con y sin modificaciones).

Por lo tanto, se puede demostrar que los ARN bicatenarios con muescas de la invencion reducen la expresion genica de una diana espedfica, especialmente en comparacion con un ARN bicatenario de referencia. Se espera que los ARN bicatenarios con muescas de la invencion, que poseen una tetrabucle, tienen una mayor excision por Dicer.

Ejemplo 3. Ensayo in vivo de ARN bicatenario con muesca que posee un tetrabucle

La invencion proporciona composiciones para reducir la expresion de un gen diana en una celula, que implica poner en contacto con una celula con ARN bicatenario con muesca que tiene un tetrabucle en una cantidad eficaz para reducir la expresion de un gen diana en un sujeto que lo necesita. Los ARN bicatenarios con muesca de la invencion se administran sistemicamente a los ratones y, posteriormente, los ARNm reconocidos se miden en muestras hepaticas de ratones tratados. El estudio evalua la eficacia in vivo de los ARN bicatenarios de la invencion contra los transcritos dirigidos.

Se prueban agentes de ARN bicatenarios espedficos para los siguientes genes dianas de raton para la eficacia en Idgado de raton: hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HPRTI; N° de entrada del GenBank NM_013556); gliceraldelddo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; N° de entrada del GenBank NM_008084); Lamin A (LMNA; N° de entrada de GenBank NM_019390); ribonucleoprotema A1 nuclear heterogenea (HNRPA1; N° de entrada del GenBank NM_010447) y ATPasa, transporte Na+/K+, beta 3 polipeptido (ATP1B3; N° de entrada del GenBank NM_007502; dos ubicaciones distintas estan dirigidas dentro del ARNm de ATPIB3). Los genes diana precedentes se seleccionan entre los genes de "limpieza" reconocidos en la tecnica. Los genes de limpieza se seleccionan como genes diana con el doble proposito de asegurar que los genes diana poseen una expresion fuerte y homogenea en los tejidos hepaticos de raton y minimizar la variabilidad inter-animal del nivel de expresion.

Se pueden construir secuencias espedficas de ARN bicatenarios con muesca que reconocen HPRT1, GAPDH, LMNA, HNRPA1 y ATP1B3 segun la estructura de ARN bicatenarios con muescas de la invencion, con tales ARN bicatenarios con muesca que contienen cualquiera de las siguientes secuencias en la cadena antisentido para reconocer a sus respectivos transcritos:

Secuencia antisentido de HPRT1:

3'-UUCGGUCUGAAACAACCUAAACUUUAA-5'

Secuencia antisentido de GAPDH:

3'-ACUCGUAGAGGGAGUGUUAAAGGUAGG-5'

Secuencia antisentido de LMNA:

3'-CUCGAACUGAAGGUCUUCUUGUAAAUG-5'

Secuencia antisentido de HNRPA1:

3'-GUCCUGACAUAAACACUGAUUAACAUA-5'

Secuencia antisentido de ATP1B3:

3'-AUCCCUAUGUUACCAUGGAACGGUUGU-5'

Secuencia antisentido de ATP1B3:

3'-GGUCUGCCUAUAGGUGUUUAUAGCACA-5'

Leyenda: mayusculas = residuos de ARN

Se compran, alojan, tratan y sacrifican ratones (CD-1 hembras) que pesan aproximadamente 25 gramos.

Se puede realizar un estudio de seleccion inicial de dosis y de tiempos para establecer la eficacia in vivo de los ARN bicatenarios con muesca contra transcritos dirigidos, mientras que tambien se establece la dosis optima del ARN bicatenario y el tiempo de recoleccion de las muestras para las dos secuencias activas independientes inicialmente reconocidas (HPRT1). Se disuelven diferentes dosis (50 y 200 |jg) de los ARN bicatenarios con muescas que se van a probar en solucion salina tamponada con fosfato (PBS; 2,5 mL de volumen total por dosis) y se administran a ratones como inyecciones hidrodinamicas individuales a traves de la vena de la cola. Se recogen muestras hepaticas de los ratones trados con la dosis en los siguientes puntos de tiempo: 24, 48 y 72 horas, y 7 dfas despues de la administracion. Un total de cuatro animales por grupo se tratan con los ARN bicatenarios para asegurar que, al menos, 3 animales se pueden evaluar en cada dosis/punto de tiempo.

El estudio tambien se puede realizar utilizando las siguientes condiciones. Una dosis (200 jg ) del ARN bicatenario con muesca que se va a probar se disuelve en solucion salina tamponada con fosfato (PBS; 2,5 mL de volumen total por dosis) y se administra a ratones como inyecciones hidrodinamicas individuales a traves de la vena de la cola. Se recogen muestras hepaticas de ratones tratados con dosis 24 horas despues de la administracion. Un total de siete animales por grupo son tratados con cada agente de ARN bicatenario con muesca.

Los niveles de ARNm diana se evaluan utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa, ("qRT-PCR"). Se sintetizan ADNc usando una mezcla de oligo-dT y cebado aleatorio del hexamero. Las reacciones qPCR se realizan por triplicado. Se realiza una cuantificacion absoluta mediante extrapolacion frente a una curva estandar diana contra una diana de amplicon linealizado clonado. Los datos se normalizan utilizando el control como 100%. Los datos se normalizan ajustando el nivel de expresion genica control con los valores de expresion medidos del ARNm diana para todos los ratones no administrados con agentes de D-ARN pequeno de interferencia espedficos de ARNm diana, que se promedian para obtener un valor de control del 100% (p. ej., para ratones inyectados con D-ARN pequenos de interferencia de GAPDH, el conjunto de ratones HPRT1, l MnA, HNRPA1, ATP1B3-1 y ATP1B3-3 se utilizan todos como controles negativos para producir niveles normalizados de GAPDH basales. Asf, hay siete ratones de estudio y 35 ratones de control para cada rama del estudio). En la evaluacion del valor de los resultados, los valores P se calculan utilizando un Prueba T no emparejada de una cola. Los valores por debajo de 0,05 se consideran estadfsticamente significativos.

Por lo tanto, se pueden observar menores niveles de ARNm dirigidos en muestras hepaticas de ratones tratados debido al tratamiento con los ARN bicatenarios con muesca de la invencion. Se espera que los resultados de los estudios muestren que los agentes de ARN bicatenarios con muesca dirigidos contra las secuencias diana de HPRT1 sean efectivos para reducir los niveles del ARNm diana in vivo, cuando se administran concentraciones de 50 microgramos y 200 microgramos, con reducciones en los niveles de expresion del transcrito del gen diana de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% observados a las 24 horas despues de la administracion en comparacion con un control que no se espera que reduzca los niveles del transcrito genico.

Ejemplo 4. Ensayo in vivo de ARN bicatenarios que contienen nucleotidos modificados o universales

La invencion proporciona composiciones para reducir la expresion de un gen diana en una celula, lo que implica poner en contacto una celula con ARN bicatenario que contenga nucleotidos modificados o universales en una cantidad eficaz para reducir la expresion de un gen diana en un sujeto que lo necesita. Tales ARN bicatenarios de la invencion se administran sistemicamente a los ratones y, posteriormente, los niveles de ARN reconocidos se miden en muestras hepaticas de ratones tratados. El estudio evalua la eficacia in vivo de los ARN bicatenarios de la invencion que poseen nucleotidos modificados o universales contra los transcritos dirigidos.

Los agentes de ARN de doble cadena espedficos para los siguientes genes diana de raton son probados para determinar su eficacia en hngado de raton: hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HPRTI; N° de entrada del GenBank NM_013556); gliceraldehndo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; N° de entrada del GenBank NM_008084); Lamin A (LMNA; N° de entrada de GenBank NM_019390); ribonucleoprotema A1 nuclear heterogenea (HNRPA1; N° de entrada del GenBank NM_010447) y ATPasa, transporte Na+/K+, beta 3 polipeptido (ATP1B3; N°. de entrada del GenBank NM_007502; dos ubicaciones distintas estan dirigidas dentro del ARNm de ATPIB3). Como en el ejemplo 3 anterior, los genes diana anteriores se seleccionan entre los genes de "limpieza" reconocidos en la tecnica.

Pueden construirse ARN de doble cadena dirigidos a HPRT1, GAPDH, LMNA, HNRPA1 y ATP1B3 de acuerdo con la estructura de los ARN bicatenarios de la invencion, basandose en las secuencias respectivas descritas anteriormente. Las secuencias espedficas de D-ARN pequenos de interferencia que contienen nucleotidos modificados o universales de acuerdo con la estructura de la invencion y que reconocen HPRTI y GAPDH son, por ejemplo:

Agentes de D-ARN pequeno de interferencia de HPRTI:

A.

5'-AAGCCAGACUUUGUUGGAUUXXXXAUU-3'

3'-UUCGGUCUGAAACAACCUAAXXXXUAA-5'

B.

5'-AAGCCAGACUUUGUUGGAUUUGAAAUU-3'

3'-UUCGGUCUGAXXCAACCUAAACUUUAA-5'

C.

5'-AAGCCAGACUUUGUUGGAUUXXXXAUU-3'

3'-UUCGGUCUGAXXCAACCUAAXXXXUAA-5'

Agentes de D-ARN pequeno de interferencia de GAPDH:

A.

5'-UGAGCAUCUCCCUCACAAUUXXXXUCC-3'

3'-ACUCGUAGAGGGAGUGUUAAXXXXAGG-5'

B.

5'-UGAGCAUCUCCCUCACAAUUUCCAUCC-3'

3'-ACUCGUAGAGXXAGUGUUAAAGGUAGG-5'

C.

5'-UGAGCAUCUCCCUCACAAUUXXXXUCC-3'

3'-ACUCGUAGAGXXAGUGUUAAXXXXAGG-5'

Leyenda: mayusculas = residuos de ARN; X = xantosina

Se puede realizar un estudio de seleccion inicial de dosis y de tiempos para establecer la eficacia in vivo de los ARN bicatenarios con muesca que contienen nucleotidos modificados o universales contra transcritos dirigidos, mientras que tambien se establece la dosis optima del ARN bicatenario y el tiempo de recoleccion de las muestras para las dos secuencias activas independientes inicialmente reconocidas (HPRT1). Se disuelven diferentes dosis (50 y 200 |jg) de los ARN bicatenarios que se van a probar en solucion salina tamponada con fosfato (PBS; 2,5 mL de volumen total por dosis) y se administran a ratones como inyecciones hidrodinamicas individuales a traves de la vena de la cola. Se recogen muestras hepaticas de los ratones trados con la dosis en los siguientes puntos de tiempo: 24, 48 y 72 horas, y 7 dfas despues de la administracion. Un total de cuatro animales por grupo se tratan con los ARN bicatenarios para asegurar que, al menos, 3 animales se pueden evaluar en cada dosis/punto de tiempo.

El estudio tambien se puede realizar utilizando las siguientes condiciones. Una dosis (200 jg ) del ARN bicatenario que se va a probar se disuelve en solucion salina tamponada con fosfato (PBS; 2,5 mL de volumen total por dosis) y se administra a ratones como inyecciones hidrodinamicas individuales a traves de la vena de la cola. Se recogen muestras hepaticas de ratones tratados con dosis 24 horas despues de la administracion. Un total de siete animales por grupo son tratados con cada agente de ARN bicatenario.

Los niveles de ARNm diana se evaluan utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa, ("qRT-PCR"). Se sintetizan ADNc usando una mezcla de oligo-dT y cebado aleatorio del hexamero. Las reacciones qPCR se realizan por triplicado. Se realiza una cuantificacion absoluta mediante extrapolacion frente a una curva estandar diana contra una diana de amplicon linealizado clonado. Los datos se normalizan utilizando el control como 100%. Los datos se normalizan ajustando el nivel de expresion genica control con los valores de expresion medidos del ARNm diana para todos los ratones no administrados con agentes de D-ARN pequeno de interferencia espedficos de ARNm diana, que se promedian para obtener un valor de control del 100% (p. ej., para ratones inyectados con D-ARN pequenos de interferencia de GAPDH, el conjunto de ratones HPRT1, LMNA, HNRPA1, ATP1B3-1 y ATP1B3-3 se utilizan todos como controles negativos para producir niveles normalizados de GAPDH basales. Asf, hay siete ratones de estudio y 35 ratones de control para cada rama del estudio). En la evaluacion del valor de los resultados, los valores P se calculan utilizando un prueba T no emparejada de una cola. Los valores por debajo de 0,05 se consideran estadfsticamente significativos.

Por lo tanto, se pueden observar menores niveles de ARNm dirigidos en muestras hepaticas de ratones tratados debido al tratamiento con los ARN bicatenarios de la invencion que contienen nucleotidos modiciados o universales. Se espera que los resultados de los estudios muestren que los ARN bicatenarios de la invencion dirigidos contra las secuencias diana de HPRT1 sean efectivos para reducir los niveles del ARNm diana in vivo, cuando se administran concentraciones de 50 microgramos y 200 microgramos, con reducciones en los niveles de expresion del transcrito del gen diana de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% observados a las 24 horas despues de la administracion en comparacion con un control que no se espera que reduzca los niveles del transcrito genico.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de conocimieto de los expertos en la tecnica a la que pertenece la invencion.

Los metodos y composiciones descritos en este documento, representativos en este momento de las realizaciones preferidas, son ejemplares y no pretenden limitar el alcance de la invencion.

La presente invencion muestra a los expertos en la tecnica como probar varias combinaciones y/o sustituciones de las modificaciones qmmicas descritas en este documento para generar construcciones de acidos nucleicos con una mejor actividad para mediar la actividad del ARN de interferencia. Esta mejor actividad puede comprender mejorar la estabilidad, mejorar la biodisponibilidad y/o mejorar la activacion de las respuestas celulares mediadoras del ARN de interferencia. Por lo tanto, las realizaciones espedficas descritas en este documento no son limitantes y cualquier experto en la tecnica puede apreciar facilmente que las combinaciones espedficas de las modificaciones descritas en este documento pueden probarse sin excesiva experimentacion para identificar las moleculas de D-ARN pequeno de interferencia con una mejor actividad del ARN de interferencia.

La invencion descrita de forma ilustrativa en este documento puede ser puesta en practica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitacion o limitaciones que no sean espedficamente descritos en este documento.

Ademas, cuando las caractensticas o aspectos de la invencion se describen en referencia a los grupos Markush u otra agrupacion alternativa, los expertos en la tecnica reconoceran que la invencion tambien podra ser descrita de esta manera en referencia a cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush u otro grupo.

El uso de los terminos "un" y "uno/a" y "el/la" y las referencias similares en el contexto de la descripcion de la invencion (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se interpreta que abarca tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o que claramente se contradiga por el contexto. Los terminos "comprende", "tiene", "incluye" y "contiene" se interpretaran como terminos con significacion abierta (es decir, que significan "que incluye, entre otros,") a menos que se indique lo contrario. La enumeracion de intervalos de valores en este documento meramente sirve como un metodo abreviado para referirse individualmente a cada valor separado dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en este documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se hubiera citado individualmente en este documento. Todos los metodos descritos en este documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o sea contradicho claramente de otra manera por el contexto. El uso de cualquier ejemplo y de todos, o del lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") que se proporciona en este documento, pretende unicamente aclarar la invencion y no plantea ninguna limitacion del alcance de la invencion, a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresion de la memoria descriptiva debe interpretarse como indicadora de algun otro elemento no reivindicado como esencial para la puesta en practica de la invencion.

Se describen en este documento realizaciones de esta invencion, incluyendo los mejores modos conocidos por los inventores para llevar a cabo la invencion.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ARN aislado de doble cadena (ARN bicatenario) que comprende:

i) una primera cadena, en la que dicha primera cadena tiene de 19 a 80 nucleotidos de longitud, y

ii) una segunda cadena, en la que dicha segunda cadena tiene de 19-35 nucleotidos de longitud,

en el que con referencia a cualquiera de las figuras 1A, 1B, 5A y 5B, la primera y segunda cadenas forman un duplex en la region B de 15-35 pares de base de longitud;

donde la primera cadena comprende una region E en el extremo 3', donde la region E comprende un tetrabucle; y el ARN bicatenario comprende una discontinuidad entre el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena,

donde el ARN bicatenario disminuye la expresion genica diana en una celula de marnffero.

2. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 1, en donde la segunda cadena forma un extremo romo con el extremo 5' de la primera cadena o comprende un saliente de 3' que consiste en 1, 2, 3 o 4 nucleotidos.

3. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el tetrabucle comprende ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, nucleotidos modificados o combinaciones de los mismos.

4. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho tetrabucle tiene una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en UNCG, GNRA, CUUG, d(GNNA), d(GNAB), d(CNNG), d(TNCG), UUCG, GAAA, d(GTTA), y d(TTCG).

5. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el tetrabucle esta flanqueado en el extremo 5' por una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en C, CC, G, y GG, y en donde el tetrabucle esta flanqueado en el extremo 3' por una secuencia de acido nucleico que se replica con una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en C, CC, G y GG o una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en C, c C, G y GG.

6. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la segunda cadena esta desfosforilada en el extremo 5'.

7. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la primera cadena esta fosforilada en el extremo 5'.

8. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la segunda cadena se replica en un ARN diana a lo largo de al menos 19-23 nucleotidos de la longitud de la segunda cadena.

9. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el ARN bicatenario, cuando se introduce en una celula mairnfero, reduce la expresion genica diana en comparacion con un ARN bicatenario de referencia.

10. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende ademas uno o mas nucleotidos modificados.

11. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 10, en el que el nucleotido modificado tiene una modificacion seleccionada del grupo que consiste en 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetil], 4'-tio, 4'-CH2-O-2'-puente, 4'-(CH2)2-O-2'-puente, 2'-LNA, y 2'-O-(N-metilcarbamato).

12. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 10, en el que la primera cadena comprende un nucleotido modificado en la region C distal al tetrabucle o en todas las posiciones en la region C distal al tetrabucle.

13. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 10, en el que la primera cadena comprende un desoxirribonucleotido o nucleotido modificado en la region C proxima al tetrabucle en la posicion 1, 2 o 1 y 2 del extremo 3' de la primera cadena en la region C.

14. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, en el que los nucleotidos modificados son ribonucleotidos que tienen una modificacion de 2'-O-metilo.

15. El ARN bicatenario aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el ARN bicatenario mejora la excision por Dicer en comparacion con un ARN bicatenario de referencia.

16. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 1, en el que dicha segunda cadena tiene 19-23 nucleotidos de longitud.

17. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 1, en el que la primera cadena tiene 35-40 nucleotidos de longitud y la segunda cadena tiene de 21 a 24 nucleotidos de longitud.

18. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 1, en el que dicha primera cadena tiene de 35 a 39 nucleotidos de longitud, en el que los nucleotidos 11-16 del extremo 3' de la primera cadena forman un duplex con los nucleotidos 1 6 del extremo 3' de la primera cadena, y donde los nucleotidos 7-10 del extremo 3' de la primera cadena forman un tetrabucle; y donde la segunda cadena es 16 nucleotidos mas corta en longitud que la primera cadena, y donde todos los nucleotidos que comienzan en el extremo 3' de la segunda cadena forman un duplex con el mismo numero de nucleotidos comenzando en el extremo 5' de la primera cadena.

19. El ARN bicatenario aislado de la reivindicacion 1, en el que dicho duplex tiene 19-26 nucleotidos de longitud.