ES2709064T3

ES2709064T3 - Fijación y estabilización de muestras

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Publication number: ES2709064T3
Application number: ES14708231T
Authority: ES
Inventors: Andrew Simon Goldsborough; Malcolm Robert Bates
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2014-02-28
Publication date: 2019-04-15
Anticipated expiration: 2034-02-28
Also published as: US20240027309A1; AU2014222618A1; AU2014222618B2; EP3788873A1; US10393633B2; US20170328819A1; JP6527616B2; CN105392363A; US20200225128A1; CA2904765C; EP3430903B1; JP2016510976A; JP6317372B2; EP3430903A1; EP2961268A1; JP2019141098A; US20180058988A1; GB201303666D0; EP2961268B1; JP2018113982A

Abstract

Uso de un disolvente eutéctico profundo para inhibir la degradación de una biomolécula, en donde la biomolécula se selecciona entre un ARN y un ADN, opcionalmente en donde la biomolécula está presente en una muestra o tejido, opcionalmente en donde la muestra o tejido comprende un tejido sólido, plasma, suero o sangre completa, adicionalmente de manera opcional en donde la sangre completa incluye una célula tumoral circulante.

Description

DESCRIPCION

Fijacion y estabilizacion de muestras

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al uso de un disolvente eutectico profundo para inhibir la degradacion de una biomolecula, al uso de un disolvente eutectico profundo como fijador de virus, celulas o tejidos, y a un aparato para la fijacion de celulas o tejidos y/o para Inhibiendo la degradacion de una biomolecula.

Antecedentes de la invencion

La extraccion de biomoleculas intactas de una muestra biologica es una parte esencial de muchos procedimientos de diagnostico clmico y de laboratorio. La inestabilidad de biomoleculas tales como los acidos nucleicos, protemas, carbohidratos y Kpidos es bien conocida y su integridad depende de un gran numero de parametros, tales como el estado fisiologico de la muestra antes de retirarla de su entorno original, con que rapidez se extrajo la muestra de su fuente, la velocidad de enfriamiento de la muestra, la temperatura de almacenamiento de la muestra y el metodo de purificacion de biomoleculas. Es bien sabido que el tratamiento de la muestra biologica antes y durante la purificacion de biomoleculas puede acarrear cambios muy importantes en la globalidad y la integridad del analito de la muestra. Por ejemplo, es bien sabido que el ARN en particular es una molecula extremadamente labil que se dana completa e irreversiblemente en cuestion de minutos si no se maneja correctamente. Aunque el ARN es quizas una de las biomoleculas mas labiles, las protemas que incluyen modificaciones postraduccionales, los lfpidos, las moleculas pequenas de menos de 2000 daltons que son esenciales para el analisis metabolico y el ADN tambien pueden estar sujetos a procesos de degradacion sustanciales.

Aunque las enzimas celulares endogenas son responsables de la mayona de los procesos degradativos, el analito siempre tendera a hidrolizarse espontaneamente durante el almacenamiento o el procesamiento, y este proceso depende en gran medida de condiciones de almacenamiento tales como la temperatura, el contenido de agua, el pH, la luz y la estabilidad y el peso molecular de la molecula de analito, pero tambien puede depender de la calidad de los reactivos utilizados.

Uno de los enfoques mas comunes y simples para un almacenamiento satisfactorio es reducir la temperatura de la muestra biologica. En general, las muestras se almacenan a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente (20-24°C); soluciones de protemas a 4°C o -20°C, acidos nucleicos en congeladores a -20°C o -80°C, en hielo seco o en nitrogeno lfquido. Se pueden agregar agentes antimicrobianos tales como azida de sodio para controlar el crecimiento microbiano.

Es bien sabido que el ARN es particularmente sensible a la degradacion por enzimas, hidrolisis espontanea, hidrolisis catalizada por cation metalico divalente, sensibilidad a los alcalis y entrecruzamiento en muestras de FFPE (fijadas con formalina incluidas en parafina). Muchas soluciones de metales tales como plomo, magnesio y manganeso son muy destructivas para el ARN y, de hecho, son esenciales no solo para la actividad de la ribozima sino tambien para la nucleasa, tales como la ADNasa I, la nucleasa de judfa mungo y la nucleasa S1. El hierro (2+) ha sido implicado en la oxidacion de nucleobases como parte de la reaccion de Fenton que conduce a ARNr y ARNm deteriorados traduccionalmente (Honda et al., (2005) J. Biol. Chem. 280, 20978-20986), por ejemplo, la conversion de guanina en 8-oxo-guanina. Se han revisado otras posibles funciones catalfticas de los iones metalicos en las escisiones enzimaticas y no enzimaticas de los enlaces fosfodiester (Yarus, M. (1993) FASEB J. 7, 31-39). De hecho, quelantes tales como EDTA y EGTA se anaden frecuentemente a ARN o soluciones de lisis de ARN con el fin de reducir la degradacion del ARN mediante la eliminacion de iones metalicos. Las ribonucleasas ("ARNasas") son un gran grupo de enzimas ubicuas asociadas con muchas fuentes, incluyendo microbios, piel humana, polvo y el contenido de celulas y tejidos. Tambien se liberan facilmente de las vesmulas intracelulares durante la congelaciondescongelacion. Se sabe que ciertos tejidos, incluido el pancreas, son particularmente ricos en ARNasa A. La ARNasa A es una de las enzimas mas estables conocidas, que recupera facilmente su actividad enzimatica despues de, por ejemplo, la desnaturalizacion con sal caotropica lo que hace que sea extremadamente diffcil de destruir. Se requiere una alta concentracion de un caotropo tal como la guanidina (4-6M) para destruir la actividad de la ARNasa (Thompson. J. y Gillespie. D. Anal Biochem. (1987) 163:281-91).

Existen varios metodos para inhibir la actividad de las ARNasas, tales como el uso de; (i) inhibidores peptfdicos de ribonucleasa ("RNasin"), un reactivo costoso solo disponible en pequenas cantidades y espedfico para ARNasa A, B y C, (ii) agentes reductores tales como el ditiotreitol y el p-mercaptoetanol que rompen los enlaces disulfuro en la enzima ARNasa, pero el efecto es limitado y temporal, ademas de ser toxico y volatil, (iii) proteasas tales como la proteinasa K para digerir las ARNasas, pero el transporte de proteinasas en kits y su accion generalmente lenta permite que las biomoleculas del analito se degraden, (iv) reduccion de la temperatura por debajo de la temperatura activa de la enzima; por lo general, las muestras de tejidos y celulares se almacenan a -80°C o en nitrogeno lfquido, (v) anticuerpos anti-ARNasa, (vi) precipitacion de las protemas celulares incluyendo ARNasas, ADN y ARN usando disolventes tales como acetona o sales cosmotropicas tales como sulfato de amonio, una preparacion comercializada de sulfato de amonio, es conocida como RNAlater™ (Sigma-Aldrich, EE.UU.; LifeTechnologies, EE.UU.; Qiagen, Alemania), (vii) detergentes para estabilizar los acidos nucleicos en la sangre completa, tales como los que se encuentran en el ADN de PAXgene™ y Kit de extraccion de ARN (PreAnalytix, Alemania), (viii) sales caotropicas, (ix) alcoholes tales como los que se encuentran en el reactivo de estabilizacion de tejidos PAXgene™ (PreAnalytix, Alemania). Una gama de tales mezclas caotropicas se exponen en TNA Isolation and Analysis, Editor. Jones (1994) Capftulo 2.

El objetivo principal del almacenamiento de la muestra es minimizar cualquier cambio en la biomolecula del analito que pueda introducirse como resultado del procedimiento pre-analttico y la purificacion de la muestra para que el resultado analttico se asemeje lo mas posible a la complejidad y diversidad original in vivo de las biomoleculas, mejorando asf la precision, sensibilidad y especificidad del ensayo. Si bien existen varios metodos y productos disponibles para reducir la variacion pre-analftica, todos tienen varios inconvenientes que hacen que su uso sea problematico o suboptimo. Los procedimientos que son eficaces para estabilizar una clase de biomoleculas a menudo son ineficaces para estabilizar otras, por lo que el tecnico esta obligado a elegir un reactivo y un procedimiento especializados para cada analito de biomoleculas. Por ejemplo, el sistema PAXgene™ (PreAnalytix) (Patentes de Estados Unidos Num. 6.602.718 y 6.617.170) se puede utilizar para acidos nucleicos pero no para protemas y requiere etapas de purificacion prolongadas con multiples tampones de lavado, mientras que los cocteles de inhibidores de proteasas ayudan a proteger las protemas de la degradacion pero no los acidos nucleicos. El kit de estabilizacion de tejidos PAXgene™ requiere dos tratamientos separados del tejido e implica agentes qmmicos toxicos e inflamables. El tratamiento RNAlater™ de los tejidos reduce su utilidad para la inmunohistoqmmica, la histologfa y aumenta la dureza del tejido sin proteger completamente el ARN, sin embargo, se ha adoptado como el modelo de referencia para la preservacion del ARN.

No siempre es posible purificar el ARN en el momento o el lugar donde se extrae la muestra, por ejemplo, una biopsia de un quirofano de un hospital o una muestra de sangre del consultorio de un medico. En estos casos, la muestra debe almacenarse con mucho cuidado antes de la extraccion de ARN, que se puede realizar en tan solo 30 minutos, pero que suele ocurrir solo despues de varias horas o dfas despues del procesamiento en el laboratorio de patologfa del hospital. A menudo, el tiempo y la temperatura de la etapa pre-anaiftica estan mal registrados, lo que lleva a un conocimiento ambiguo de la calidad de la muestra. Como consecuencia, ha sido necesario desarrollar condiciones de almacenamiento de muestras separadas para cada tipo de tejido y uso final del ARN. Como ya se ha indicado, esto generalmente implica el uso de una solucion de estabilizacion espedfica tal como RNAlater o PAXgene o la congelacion inmediata de la muestra en nitrogeno lfquido. Al menos en el caso del reactivo de estabilizacion PAXgene, la eliminacion incompleta del estabilizador tendra un impacto negativo en los rendimientos de ARN durante la purificacion (PAXgene Blood RNA Kit Handbook, junio de 2005).

El almacenamiento del tejido puede efectuarse mediante la fijacion del tejido mediante un fijador. La "fijacion" se refiere al aumento de la resistencia mecanica, el endurecimiento, la conservacion y el aumento de la estabilidad de la muestra biologica tratada, tal como celulas frescas, biopsia o tejido, y mantiene la muestra en un estado lo mas similar posible a la de la muestra fresca original in situ, en su estado natural. La fijacion se utiliza comunmente en patologfa, histologfa, histoqmmica, citoqmmica, estudios anatomicos y estudio de celulas, y generalmente precede a etapas adicionales tales como almacenamiento, inclusion, tincion, inmunohistoqmmica y/o inmunocitoqmmica. El proceso de fijacion idealmente inhibe enzimas tales como las nucleasas y proteasas, detiene el crecimiento microbiano en la muestra y mantiene tanto la morfologfa tisular como la ultraestructura celulartal como el aparato de golgi, el nucleo, el retmulo endoplasmico, las mitocondrias, los lisosomas y las membranas citoplasmaticas. Como ejemplo, la conservacion de la morfologfa celular correcta es importante para que un patologo pueda diagnosticar la presencia, el tipo y el grado de cancer en un paciente, pero para hacer esto correctamente, la muestra tambien debe poder tenirse o etiquetarse correctamente con anticuerpos para inmunohistoqmmica. Comunmente, la muestra se trata con una solucion acuosa al 1-5% de formalina (formaldehudo) paraformaldehudo o glutaldehudo durante 1-24 horas a temperatura ambiente para permitir el entrecruzamiento de protemas y otros componentes celulares y a continuacion, despues de seccionar el tejido, se tine con tincion de hematoxilina y eosina (H y E). Aunque tambien se puede utilizar glutaraldehudo, su velocidad de penetracion en el tejido es mas lenta que con el formaldehudo (que penetra a aproximadamente 1 mm por hora cuando se anaden 18-20 volumenes con respecto al volumen del tejido). Si bien el ARN tambien se puede conservar de esta manera, en general se degrada mucho durante o despues de la fijacion con formalina, lo que hace que el analisis de la expresion genica sea altamente problematico y produzca la formacion de artefactos. Un problema espedfico es que el analito de ARN se entrecruza con otras biomoleculas, tales como protemas, por lo que, posteriormente, se debe liberar antes del analisis; este procedimiento generalmente es muy riguroso y requiere penodos prolongados a temperaturas elevadas, lo que conduce a una degradacion significativa del ARN. Otro problema de la fijacion es mantener analitos solubles tales como el ARN y las protemas en la celula para que puedan integrarse, por ejemplo, mediante hibridacion in situ o inmunohistoqmmica. Otro problema mas con la fijacion con formalina, en particular, es que la modificacion covalente de las protemas celulares da como resultado la perdida de inmunoreconocimiento antigenico que puede hacer que lastecnicas de inmunohistoqmmica sean diffciles o imposibles dependiendo del anticuerpo. Como ejemplo adicional, los tejidos fijados con formalina se incluyen rutinariamente en cera de parafina para permitir que el bloque de tejido se corte en secciones finas y se examine microscopicamente (FFPE). Otros metodos comunes de fijacion de tejidos implican el uso de metanol, etanol o acetona que dan como resultado la precipitacion de protemas en lugar del entrecruzamiento. Son particularmente necesarios metodos para reparar los tejidos, mantener una buena calidad de ARN y al mismo tiempo permitir la tincion inmunohistoqmmica. Es bien sabido que los fijadores de uso comun tales como el formaldetudo, el paraformaldetudo, el gluataldetudo y el metanol son carcinogenos potencialmente toxicos, mientras que el etanol y la acetona son altamente inflamables. El fijador ideal debena funcionar en una amplia variedad de tejidos, incluyendo neural, linfoide y graso, preservar grandes trozos de tejido y ser compatible con tecnicas inmunohistoqmmicas, histoqmmicas y de hibridacion in situ y otras tecnicas especializadas. Tambien debe ser compatible con los procedimientos automatizados de fijacion de tejidos. Una revision con protocolos detallados ha sido publicada por Bancroft (2008) 'Theory and Practice of Histological Techniques'and by Stanta (2011) 'Guidelines for Molecular Analysis in Archive Tissues' mientras que los ejemplos representativos de tejidos fijados y tenidos se pueden encontrar en Ross y Pawlina (2011) 'Histology A Text and Atlas'.

Dominguez de Maria y otros (Current Opinion in Chemical Biology, vol. 15, num. 2, pag. 220-225) describe lfquidos ionicos en biotransformaciones.

Zhao et al (Journal of Molecular Catysis B: Enzymatic, vol. 72, num. 3, pag. 163-167) describe la activacion de proteasas en disolventes eutecticos profundos.

Mamajanov et al (Angewandte Chemie Int. Ed., Vol. 122, num. 36, pag. 6454-6458) describe ADN y ARN en medios anhidros.

Compendio

En un aspecto, la presente invencion proporciona el uso de un disolvente eutectico profundo para inhibir la degradacion de una biomolecula, en donde la biomolecula se selecciona entre un ARN y un ADN, opcionalmente en donde la biomolecula esta presente en una muestra o tejido, opcionalmente en donde la muestra o tejido comprende un tejido solido, plasma, suero o sangre completa, adicionalmente de manera opcional en donde la sangre completa incluye una celula tumoral circulante.

Sorprendentemente, se ha descubierto que es posible estabilizar biomoleculas tales como ARN, ADN y protemas en muestras biologicas con disolventes eutecticos profundos (DES). Tambien se ha descubierto que las mezclas de DES se pueden utilizar para reparar y preservar la morfologfa celular en muestras biologicas tales como bloques de tejido, biopsias de cancer y sangre completa. En la presente memoria se describen metodos para estabilizar y preservar biomoleculas, celulas completas, tejidos y muestras biologicas utilizando mezclas de DES. La muestra o tejido puede comprender un tejido solido o un tejido no solido.

Sorprendentemente, los autores de la presente invencion han encontrado que muchas mezclas de DES son capaces de estabilizar y conservar el ARN, otras biomoleculas tales como protemas y ADN, celulas y estructuras tisulares. El uso de componentes individuales de DES solos en una solucion acuosa tal como Cloruro de colina (6M) o la Urea (5M) no permite la estabilizacion del ARN ni la fijacion celular, solo cuando los componentes se combinan en un DES tal como Cloruro de colina:Urea preservan y estabilizan (Tabla 1). Los autores de la presente invencion han encontrado solo, por ejemplo, que la mezcla de Cloruro de colina con Trifluoroacetamida es particularmente eficaz para estabilizar el ARN en las celulas mientras mantiene la morfologfa celular. Los autores de la presente invencion tambien han encontrado que la mezcla de cloruro de colina con sorbitol es particularmente eficaz para estabilizar el ARN en tejidos completos. Sin embargo, es util un numero extremadamente grande de otras combinaciones y proporciones de componentes de DES.

Se ha informado sobre la separacion de componentes de mezclas por lfquidos ionicos naturales y DES naturales (documento WO 2011/155829) pero no se ha informado sobre el efecto del DES sobre la estabilizacion de biomoleculas o celulas. De hecho en el documento US 2009/0117628A1 se ha demostrado que las reacciones enzimaticas pueden llevarse a cabo en un DES, y que «una variedad de reacciones enzimaticas son activas en una variedad de DES», lo que indica que las nucleasas y proteasas y otras enzimas catabolicas senan igualmente activas. Sorprendentemente, los autores de la presente invencion han encontrado que el ARN y otras biomoleculas se estabilizan en mezclas de DES y la morfologfa celular se fija, lo que demuestra que el citoesqueleto tambien esta estabilizado.

Los DES son mezclas de dos o mas componentes que cuando se combinan tienen un punto eutectico, que es la temperatura de solidificacion o congelacion (Fp). El punto eutectico de los componentes combinados es generalmente mucho mas bajo que cualquiera de los componentes individualmente o en cualquier otra proporcion de mezcla y se produce a una temperatura unica sin separacion de los componentes individuales durante la solidificacion. Las propiedades de los DES han sido descritas por A.P. Abbott, G. Capper, D.L. Davies, R.K. Rasheed, V. Tambyrajah, Chem. Comun. 7 (2003) 70-71., A.P. Abbott, D. Boothby, G. Capper, D.L. Davies, R.K. Rasheed, J. Am. Chem. Soc.126 (2004) 9142-9147, [7] G. Imperato, E. Eibler, J. Niedermaier, B. Konig, Chem.

Comun. 9 (2005) 1170-1172, S. Gore, S. Baskaran, B. Koenig, Green Chem. 13 (2011) 1009-1013, J.T. Gorke, F. Srienc, R.J. Kazlauskas, Chem. Comun. 10 (2008) 1235-1237, A.P. Abbott, J. Collins, I. Dalrymple, R.C. Harris, R. Mistry, F. Qiu, J. Scheirer, W.R. Wise, Aust. J. Chem. 62 (2009) 341-347, Y.H. Choi, J. van Spronsen, Y. Dai, M. Verberne, F. Hollmann, I.W.C.E. Arends, G.J. Witkamp, R. Verpoorte, Plant Physiol. 156 (2011) 1701-1705 y revisadas por Zhang Q, De Oliveira Vigier K, Royer S, Jerome F. Chem Soc Rev. 2012 7 de noviembre; 41(21): 7108-46.

Los DES industriales se han utilizado para el revestimiento electroqmmico, aplicaciones de minena y lubricantes de perforacion (documento US2009/0247432), aplicaciones enzimaticas industriales (documento US2009/0117628A1), preparacion de compuestos inorganicos (D. Freudenmann, S. Wolf, M. Wolff y C. Feldmann, Angew. Chem., Int. Ed., (2011), 50, 11050-11060) o compuestos organicos (S. Gore, S. Baskaran y B. Koenig, Green Chem., (2011), 13, 1009-1013), extracciones biologicas (documento WO 2011/155829), en electroqmmica como electrolitos para celulas solares sensibilizadas por colorante y electropulido de metales (H.-R. Jhong, D. Shan-Hill, C.-C. Wan, Y.-Y. Wang y T.-C. Wei, electrochem. Commun., (2009), 11, 209-211), deposito electrolttico (E. Gomez, P. Cojocaru, L. Magagnin y E. Valles, J. Electroanalytical Chem., (2011), 658, 18-24), depuracion de biodiesel (K. Shahbaz, F. S. Mjalli, M. A. Hashim y I. M. AINashef, Energy Fuels, (2011), 25, 2671-2678), solubilizacion de farmacos (H. G. Morrison, C. C. Sun y S. Neervannan, Int. J. Pharm., (2009), 378, 136-139), solubilizacion de oxidos metalicos (A. P. Abbott, D. Boothby, G. Capper, D. L. Davies y R. K. Rasheed, J. Am. Chem. Soc., (2004), 126, 9142-9147) y solubilizacion de CO2 (X. Li, M. Hou, B. Han, X. Wang y L. Zou, J. Chem. Ing. Datos, (2008), 53, 548-550). Van Spronsen et al. establecen el uso de DES de origen natural, tales como varias combinaciones de aminoacidos, azucares y acidos carboxflicos para extraccion en el documento WO2011/155829 pero no menciona su uso para la estabilizacion o la fijacion de celulas y tejidos. Los DES descritos son para fines de extraccion en lugar de estabilizacion y fijacion. Los DES no se consideran lfquidos ionicos porque (i) no estan completamente compuestos de especies ionicas y (ii) tambien pueden obtenerse de especies no ionicas, (iii) son mezclas y no compuestos. En comparacion con los lfquidos ionicos tradicionales, los DES derivados de, por ejemplo, Cloruro de colina tienen varias ventajas tales como (1) bajo coste, (2) son qmmicamente inertes al agua, (3) son faciles de preparar simplemente mezclando dos o mas componentes, (4) la mayona son biodegradables y no toxicos, (5) tiene baja volatilidad incluso cuando se calientan y (6) no son inflamables. Todos los DES son lfquidos por debajo de 150°C y muchos son lfquidos entre la temperatura ambiente y 70°C, con algunos ejemplos notables que son lfquidos por debajo de 0°C.

Con frecuencia, se obtiene un DES mezclando una sal de haluro de amonio cuaternario con una sal de metal como ZnCl2 o un donador de enlaces de hidrogeno tal como la Urea, que tiene la capacidad de formar un complejo con el anion haluro de la sal de amonio cuaternario. Sin embargo, se ha encontrado que tambien hay excepciones, como cuando no hay un anion haluro presente en el DES tal como en la Betama:Trifluoroacetamida. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "betama" se refiere a N,N,N-trimetilglicina, a menos que se especifique lo contrario. Los disolventes eutecticos profundos descritos en la presente memoria pueden incluir un componente que tiene un grupo amonio cuaternario.

El componente que tiene un grupo amonio cuaternario puede ser un componente zwitterionico que comprende adicionalmente un grupo carboxilato. Un componente bipolar preferido es la betama (N, N, N-trimetilglicina).

Alternativamente, el componente que incluye un grupo amonio cuaternario puede estar en forma de una sal con un contraion apropiado. El contraion es adecuadamente un haluro, y es preferiblemente cloruro, bromuro o yoduro, lo mas preferiblemente cloruro. Otros contraiones adecuados incluyen nitrato, tetrafluoroborato y similares. Cuando el componente esta en forma de una sal, el contraion preferiblemente no comprende un grupo carboxilato.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un metodo para estabilizar ARN en una muestra que contiene ARN, cuyo metodo comprende poner en contacto la muestra con una mezcla que contiene DES para formar una composicion que contiene ARN estabilizado.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un metodo para estabilizar ADN en una muestra que contiene ADN, cuyo metodo comprende poner en contacto la muestra con una mezcla que contiene DES para formar una composicion que contiene ADN estabilizado.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un metodo para estabilizar protemas que incluyen fosfoprotemas en una muestra que contiene peptido, cuyo metodo comprende poner en contacto la muestra con una mezcla que contiene DES para formar una composicion que contiene protema estabilizada.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un metodo para fijar la morfologfa nativa de una celula y estabilizar el ARN, el ADN y/o las protemas en una muestra bacteriana, fungica, animal o vegetal, tal como E. coli, Levadura, Nematodo, Drosophila, Pez cebra, Raton, Rata, Arabidopsis thaliana, Arroz, Trigo, Mafz, Tabaco y/o Patata.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un metodo para fijar y estabilizar la morfologfa nativa de una celula, en una muestra que contiene celulas, tal como un organo, tejido, biopsia, celula tumoral circulante (CTC), muestra de sangre, muestra de plasma, muestra de suero, celulas de cultivo tisular, saliva, orina, lfquido cefalorraqmdeo, muestra medica, ovulo, embrion o tejido adulto, o muestra FFPE, cuyo metodo comprende poner en contacto la muestra que contiene la celula con una mezcla que contiene DES para formar un fijador y un estabilizador de la estructura celular. y morfologfa compatible con recuento celular, deteccion de CTC, inmunohistoqmmica, histoqmmica, tincion y coloracion, citometna de flujo, espectrometna de masas, hibridacion in situ, microdiseccion de captura laser y analisis moleculares de, por ejemplo, a Rn , ADN y/o protemas.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un metodo para fijar y estabilizar la morfologfa nativa de una celula, en una muestra que contiene celulas, por lo que el contenido de protemas y la localizacion celular de protemas pueden determinarse mediante el uso de un colorante, un anticuerpo o un aptamero, cuyo metodo comprende poner en contacto la muestra que contiene celulas con una mezcla que contiene DES para formar un fijador y un estabilizador de la estructura y morfologfa de las celulas y, al mismo tiempo o posteriormente, la muestra se pone en contacto con un colorante, un anticuerpo o un aptamero.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un metodo para fijar y estabilizar la morfologfa nativa de una celula en una muestra que contiene celulas, por lo que el contenido de ARN y su localizacion celular se pueden determinar mediante el uso de una sonda marcada o no marcada, tal como un oligonucleotido, un cebador, un PNA, un LNA, un ADN, una secuencia de bADN o ARN, una secuencia de acido nucleico complementaria natural o sintetica, cuyo metodo comprende poner en contacto la muestra que contiene la celula con una mezcla que contiene DES para formar un fijador y un estabilizador de la estructura y morfologfa de la celula y al mismo tiempo o posteriormente, poner en contacto la muestra con una secuencia de hibridacion natural o sintetica para el analisis molecular.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un kit para estabilizar ARN, ADN y/o protema en una muestra biologica, cuyo kit comprende al menos un recipiente que contiene una mezcla de DES. El kit comprende adicionalmente instrucciones para poner en contacto la muestra con una mezcla de DES mediante la cual el ARN, el ADN y/o la protema en la muestra biologica se estabiliza contra la degradacion.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un kit para estabilizar la estructura celular en una muestra biologica, cuyo kit comprende al menos un recipiente que contiene una mezcla de DES. El kit comprende adicionalmente instrucciones para poner en contacto la muestra con una mezcla de DES, por lo que la mezcla de DES sirve como fijador y/o estabilizador de la estructura celular para estudios microscopicos y/o histologicos como tincion y coloracion, ISH y/o IHC.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un kit para fijar morfologfa y estructuras celulares y tisulares en una muestra biologica, cuyo kit comprende al menos un recipiente que contiene un fijador DES y/o una mezcla estabilizadora y, opcionalmente, en donde el recipiente es permeable y tiene una altura maxima de 10 mm en el que se sumerge y fija y/o estabiliza la muestra. Las paredes del recipiente permeable pueden ser un tamiz o rejilla o estar provistas de ranuras que permiten el paso inicial y el acceso de la mezcla de DES a la muestra de tejido o celula, y/o el contacto subsiguiente con parafina lfquida.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una combinacion de una mezcla de DES con un aditivo como fijador y estabilizador de biomoleculas que incluyen ARN, ADN y/o protemas.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona una composicion que contiene ARN estabilizado, que comprende ARN y una mezcla de DES.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona una composicion que contiene ADN estabilizado, que comprende ADN y una mezcla de DES.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona una composicion estabilizada que contiene protemas, que comprende protemas y una mezcla de DES.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de la estructura celular y/o histologfa y/o morfologfa del tejido, y un estabilizador de ARN, ADN y/o protemas.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de la estructura celular y/o histologfa y/o morfologfa del tejido, para su posterior inclusion en parafina y corte con microtomos, y opcionalmente tincion, hibridacion in situ y/o inmunohistoqmmica.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de la estructura celular y/o histologfa y/o morfologfa del tejido, para el posterior corte con el criostato congelado y, opcionalmente, tincion, hibridacion in situ y/o inmunohistoqmmica.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de la estructura celular y/o histologfa y morfologfa del tejido, para la posterior microdiseccion por captura de laser (LCM) y opcionalmente la recuperacion de protemas, ADN y ARN.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de biomoleculas y/o celulas en plasma, suero y sangre para el analisis de diagnostico posterior que incluye celulas tumorales circulantes y/o globulos blancos y/o sangre completa, incluyendo captura de celulas, recuento y/o tipificacion, tincion y/o coloracion, espectrometna de masas, hibridacion in situ y/o inmunohistoqmmica. Opcionalmente se puede llevar a cabo la recuperacion de protemas, ADN y ARN.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de exosomas, otros tipos de vesmulas, microvesmulas, cuerpos subcelulares y partmulas tales como micelas, liposomas, endosomas, residuos celulares, membranas celulares, nucleos celulares, componentes citoplasmicos tales como un compartimento endocftico, aparato de golgi, retmulo endoplasmico y/o mitocondrias. Adicionalmente, se refiere con la estabilizacion de ARN, ADN y/o protemas contenidas en exosomas derivados de sangre, suero, plasma, orina, lfquido cefalorraqmdeo y otros fluidos corporales para su almacenamiento, transporte y manejo para una prueba de diagnostico tales como extraccion, analisis y/o identificacion de miARN o ARNm contenido dentro de un exosoma u otra microvesmula extracelular.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de partmulas y moleculas pre-purificadas tales como partmulas virales, bacteriofagos, ARN, ADN, protemas tales como enzimas y anticuerpos, lfpidos y grasas y/o carbohidratos. Pre-purificada se define en la presente memoria como una muestra que consiste en mas del 80% de la partmula o molecula de interes.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de biomoleculas, bacterias, hongos y/u otros patogenos tales como Leishmania, Trypanosoma y/o Plasmodium en plasma, suero, capa leucocitaria y/o sangre para posteriores analisis de diagnostico de patogenos, incluidos diagnosticos bacterianos y/o virales.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona el uso de una mezcla de DES como estabilizador de virus, partmulas virales, acidos nucleicos virales y/o protemas tales como Influenza, VPH, VIH, VHB, VHC, Virus de la Fiebre Aftosa, Influenza, SARS y/o Virus del Nilo Occidental, en muestras biologicas tales como esputo, frotis, plasma, suero, capa leucocitaria y/o sangre para su posterior analisis de diagnostico viral.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un aparato adecuado para la fijacion de celulas o tejidos y/o para inhibir la degradacion de una biomolecula, cuyo aparato comprende: una primera capa de disolvente eutectico profundo formada por un primer disolvente eutectico profundo; y una cavidad en la primera capa de disolvente eutectico profundo para recibir una muestra que comprende la biomolecula; en donde el primer disolvente eutectico profundo es un solido o un gel. El aparato puede comprender adicionalmente una segunda capa de disolvente eutectico profundo formada por un segundo disolvente eutectico profundo, en donde la segunda capa de disolvente eutectico profundo encierra la cavidad; y en donde el segundo disolvente eutectico profundo es un solido o un gel.

El primer y/o segundo disolvente eutectico profundo pueden ser un disolvente eutectico profundo como se define en la presente memoria y preferiblemente comprenden un componente seleccionado de 3,3,3-trifluoropropanamida, 2,2-difluoro-2-fenilacetamida, urea ytiourea.

El primer y/o segundo disolvente eutectico profundo tambien pueden comprender un componente seleccionado entre cloruro de colina, yoduro de butirilcolina y N,N,N-trimetilglicina.

El aparato adecuado para la fijacion celular o tisular y/o para inhibir la degradacion de una biolmolecula de acuerdo con la invencion comprende una primera capa de disolvente eutectico profundo formada por un primer disolvente eutectico profundo. El primer disolvente eutectico profundo es un solido o un gel. Adecuadamente, los componentes del disolvente eutectico profundo se seleccionan de manera que el disolvente eutectico profundo sea solido en las condiciones de uso deseadas, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 25°C y una presion de aproximadamente 1 atm. Alternativamente o adicionalmente, el disolvente eutectico profundo se puede mezclar con un material de matriz que es un solido o un gel en las condiciones de uso deseadas.

Los disolventes eutecticos profundos particularmente preferidos para uso como primer disolvente eutectico profundo incluyen cloruro de colina:3,3,3-trifluoropropanamida, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:2; cloruro de colina:2,2-difluoro-2-fenilacetamida, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:1; cloruro de colina:trehalosa, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:1 y yoduro de butirilcolina:urea, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:2.

Si el aparato comprende un segundo disolvente eutectico profundo, el primer y segundo disolventes eutecticos profundos pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, el segundo disolvente eutectico profundo se selecciona entre cloruro de colina:3,3,3-trifluoropropanamida, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:2; cloruro de colina:2,2-difluoro-2-fenilacetamida, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:1; cloruro de colina:trehalosa, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:1; y yoduro de butirilcolina:urea, opcionalmente a una razon molar de aproximadamente 1:2.

En un aspecto adicional, la presente descripcion proporciona un kit en donde el disolvente eutectico profundo es un disolvente eutectico profundo como se define en la presente memoria.

La mejora de la calidad y la integridad del ARN suele ser notable, ya que es una de las moleculas mas fragiles de la celula debido a su longitud y sensibilidad qmmica a la agresion ambiental. Por lo comun, como regla general, se puede considerar que si las moleculas de ARNr de la celula estan intactas, el ARNm, el ADN, las protemas, los ifpidos, los carbohidratos y los metabolitos pequenos tambien estaran intactos, sin embargo, si el ARNr se degrada, las otras biomoleculas tambien se pueden degradar o no dependiendo de la sensibilidad qmmica particular de cada biomolecula. Existen algunas excepciones, por ejemplo que el tejido o la celula sean particularmente ricos en ciertas enzimas, tales como ARNasas, DNasas, lipasas, esterasas, proteasas o fosfatasas, que conduciran a una degradacion o modificacion espedfica de una clase particular de biomoleculas.

El ARN al que se hace referencia puede encontrarse, obtenerse o asociarse con una muestra tal como un virus, una celula, una celula tumoral circulante, un lfquido cefalorraqmdeo, un lavado broncoalveolar, un suero, un plasma, una sangre, exosomas, otras microvesmulas, muestras conservadas como bloques o secciones de FFPE, biopsias, tejidos solidos o lfquidos u otras muestras biologicas. Tambien puede ser una molecula que contiene nucleosidos o nucleotidos, tal como un cAMP, ATP, GTP, monomeros, dfmeros y oligomeros de desoxi- y ribo-nucleotidos, desoxio ribo-oligonucleotidos, ADN plasmfdico, ADN genomico, ADN mitocondrial, ARN tal como microARN (miARN), Piwi-ARN, ARNip, ARNt, viroides, ARN circulante, ARN no codificante hs o dh circular, ARNhn, ARNm, ARNr tal como las especies de ARNr 5S, 5,8S, 16S, 18S, 23S y 28S, y ARN viral derivado de, por ejemplo, VHC, Virus de la Enfermedad del Nilo Occidental, Virus de la Fiebre Aftosa, Influenza, SARS o ARN del VlH y/o ARN extracelular (ARNex).

Tambien puede ser una molecula derivada de un procedimiento organico sintetico, tal como un oligo-sintetizador, una mezcla de ARN y ADN, una quimera de ARN y ADN, el producto de una reaccion enzimatica tal como una transcripcion de ARN in vitro, ARN amplificado (ARNa), ribozimas, aptameros, amplificacion por PCR, amplificacion por drculo rodante (RCA) o reaccion en cadena de la ligasa (LCR), un patron de control interno o ARN de control. Los metodos de analisis de ARN que se beneficianan de esta invencion incluyen traduccion de protemas in vitro o in vivo de moldes de ARNm, polimerizacion de ARN dependiente de ARN, polimerizacion de ARN dependiente de ADN, analisis de corte y empalme de ARN, analisis de plegamiento de ARN, produccion de aptameros y ribozimas, mediciones de densidad optica (DO), estudios de interaccion de ARN: protemas, electroforesis y sedimentacion de ARN, incluidos patrones de peso molecular, productos bioconjugados de ARN, ligacion de ARN, estudios de plegamiento de ARN, huella de ARN, estudios estructurales de RMN de ARN, smtesis de oligonucleotidos de ARN, ARN in situ, hibridacion in situ (ISH), hibridacion fluorescente in situ (FISH), secuenciacion de ARN, transcripcion inversa (RT), RT-PCR, RT-qPCR, ensayos de proteccion de nucleasas, tecnicas de hibridacion tales como la transferencia Northern, ADNb y micromatrices que incluyen la preparacion de sondas, marcaje de acido nucleico fluorescente, NASBA, ARNi, tecnicas miARN tales como la extraccion y cuantificacion y aquellos metodos que requieren control de calidad y/o mediciones cuantitativas o cualitativas de ARN.

La inestabilidad se refiere a una alteracion en el peso molecular o una alteracion de la estructura qmmica de la molecula de ARN, tal inestabilidad esta asociada con el manejo, almacenamiento, transporte y/o el analisis real de la molecula de analito. La inestabilidad de la biomolecula a menudo depende de la actividad de las enzimas catabolicas naturales y, en particular, de las ARNasas que pueden alterar sustancialmente el peso molecular del ARN o implicar alteraciones de peso molecular mucho mas pequenas de la molecula de analito original. Tales ARNasas pueden tener un origen en la muestra biologica, por ejemplo, pueden liberarse progresivamente despues del manejo de la muestra o pueden liberarse masivamente como resultado de un manejo inadecuado del tejido cuando, por ejemplo, se ha congelado y descongelado, un procedimiento que generalmente conduce a la ruptura de las vesmulas intracelulares que contienen proteasas y nucleasas que, en consecuencia, inundan el citoplasma, lo que lleva a tasas muy altas de degradacion del analito. Alternativamente, la enzima degradativa puede provenir de la contaminacion externa del entorno de la muestra, tal como la contaminacion microbiana o el deterioro de la muestra. La inestabilidad del analito generalmente se asocia con una reduccion en la sensibilidad o el rendimiento del procedimiento analftico, ya sea el analito una protema, un acido nucleico, un carbohidrato, un lfpido o un metabolito. 'Degradacion' se refiere a los cambios ffsicos o qmmicos que se producen como consecuencia de la inestabilidad de los biomoleculas y/o analitos. En cuanto a algunos ejemplos de degradacion relacionada con los acidos nucleicos, la degradacion se puede referir a la desaminacion de nucleobases tal como la conversion de citosina en uracilo, la oxidacion de nucleobases tales como guanina, la perdida de grupos metilo de la metilcitosina, la perdida de una o mas nucleobases, tal como la que se produce durante la depuracion, la escision de los enlaces fosfodiester que conduce a la escision de la cadena y la perdida de uno o mas nucleotidos de la mayor parte de la molecula de acido nucleico. No se refiere solo a los cambios de la estructura secundaria o terciaria de la molecula.

"Integridad" se refiere a la integridad de una molecula y, por lo tanto, es lo opuesta a la degradacion.

"Degradacion sustancial" se refiere a una muestra que contiene al menos la mitad de las moleculas de analito que han sido escindidas o que han experimentado una reduccion de su peso molecular en 5% o mas. Los metodos para determinar la degradacion son bien conocidos y dependen de la molecula de analito (vease Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a Ed.) Cold Spring Harbor University Press, NY). La determinacion del peso molecular y, por lo tanto, el grado de degradacion de los acidos nucleicos se realiza comunmente mediante desnaturalizacion o electroforesis en gel nativo y puede incluir transferencia Southern o Northern con una sonda de hibridacion marcada. La cuantificacion de ARN puede incluir el analisis utilizando un chip de ARN y el sistema Agilent Bioanalyser 2100™ y el calculo del 'Numero de Integridad del ARN' (RIN). La degradacion del acido nucleico tambien se puede cuantificar convenientemente mediante Q-PCR para el ADN, y RT-qPCR para el ARN utilizando, por ejemplo, un Lightcycler™ (Roche) y sondas de amplificacion adecuadas. El calculo de las razones de amplificacion de RT-qPCR de los extremos 3'/5' de un ARNm, con frecuencia p-actina, despues de la transcripcion inversa utilizando un cebador oligo dT tambien se utiliza comunmente para evaluar la degradacion del ARN. Otros metodos incluyen ARNseq del contenido completo de ARNm de una celula o tejido, o la comparacion de las senales de hibridacion relativas de oligonucleotidos que representan los sitios 3' a 5' del ARNm despues del analisis utilizando Affymetrix® GeneChips®. Los acidos nucleicos monocatenarios o bicatenarios mas pequenos, de menos de 100 nucleotidos de longitud, tales como oligonucleotidos y miARN, se cuantifican con mayor precision mediante espectrometna de masas tal como MALDI-TOF MS, esta tecnica tiene la ventaja adicional de poder determinar tambien eventos de degradacion que no alteran significativamente el peso molecular del analito, tales como la depuracion o desaminacion de las nucleobases. La mayona de los analisis de miARN se llevan a cabo mediante RT-qPCR dedicado. A pesar de la sofisticacion de los metodos para determinar el grado de degradacion del ARN, es evidente que ciertas secuencias de ARNm son mucho mas sensibles a la degradacion que otras y puesto que los ARNr 18 y 28S son relativamente estables a la degradacion, son solo un marcador sustituto deficiente para la extension de la degradacion del ARNm. Actualmente, el analisis preciso de la degradacion del ARNm se realiza mejor utilizando RT-qPCR como se explico anteriormente. Para una descripcion detallada de los metodos para evaluar la degradacion del ARN como resultado de los metodos de purificacion de ARN, vease Muyal et al., (2009) Diag. Camino. 4:9.

Una "muestra pura" de ARN o ADN se refiere a una solucion de acido nucleico en agua donde la razon OD260/280 es 1,7 o superior.

Aunque, en general, la inestabilidad y la degradacion estan asociadas con una reduccion en el peso molecular total de la molecula en estudio ("el analito"), por el contrario, puede relacionarse con un aumento en el peso molecular de un complejo que se anade progresivamente durante, por ejemplo, el almacenamiento. Un ejemplo de esto ultimo sena la complejacion o agregacion de protemas en acidos nucleicos durante el almacenamiento de un tejido completo o el entrecruzamiento qmmico de las moleculas durante el procesamiento de una muestra, tal como con tejido incluido en parafina fijado con formalina ("FFPE").

"Estabilizacion" se refiere a las condiciones que conducen a una reduccion general en la cantidad de degradacion de una molecula de analito en comparacion con el control. Tal control puede ser las condiciones utilizadas sin el uso de la invencion, por ejemplo, el almacenamiento sin ningun estabilizador (Figura 11), pero la tasa de degradacion del ARN generalmente es demasiado alta para ser una comparacion util, por lo tanto, un mejor control es el disponible comercialmente RNAlater utilizado segun las instrucciones del fabricante (Num. de Cat. 76106, Qiagen, Alemania). El control puede ser un fragmento de tejido extirpado, tal como una biopsia, una muestra de sangre o suero o un fragmento de tejido almacenado en RNAlater, por ejemplo, a 4, 20 o 37°C durante 1 -16 h, o 1 - 45 dfas.

La rotura del tejido se refiere al procedimiento de descomponer una muestra de tejido grande en partfculas que son lo suficientemente pequenas como para ser lisadas por la adicion de una solucion caotropica. La rotura descompone la muestra en pedazos lo suficientemente pequenos para permitir la liberacion eficaz del analito para la consiguiente extraccion y purificacion del ARN.

Se puede llevar a cabo una etapa de "inactivacion de ARNasa" para inactivar suficientemente la ARNasa y permitir la posterior estabilizacion con una mezcla de DES sin una degradacion significativa del ARN. En la tecnica se conocen numerosos metodos para inactivar las ARNasas, tales como la degradacion enzimatica con proteasas tales como la tripsina, la quimotripsina, la papama o la proteinasa K, la reduccion del enlace disulfuro con pmercaptoetanol (Chirgwin, et al., "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease," Biochemistry, 18:5294-5299, 1979), ditiotreitol, ditioeritritol, glutation o TCEP, adicion de la protema RNasin (Life Technologies, EE.UU.), ARNsecure™ (Life Technologies, EE.UU.), tratamiento con un caotropo tal como guanidina HCl, tiocianato de guanidina (Chomczynski y Sacchi, "Single Step Method of RNA Isolation by Acid Guanidine Isothiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction," Anal. Biochem., 162:156-159, 1987; Sambrook, et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", pag. 7.16-7.52, 1989), urea, formamida, formaldel'ndo o yodoacetato de sodio, tratamiento con un detergente tal como Tween-20, Triton X-100, NP-40, SLS o SDS, EDTA, EGTA, citrato de sodio, calor o desnaturalizacion acida, inhibicion con complejos de vanadil ribonucleosidos (Berger y Birkenmeier, 1979) o entrecruzamiento con glutaraldehndo. La muestra de tejido se trata inicialmente de tal manera que la actividad de la ARNasa se reduce a al menos 50, 75 o mas preferiblemente 100% de su actividad no tratada antes del tratamiento con mezcla de DES como se describe en uno de los Ejemplos de la presente memoria. La actividad de la ARNasa residual antes del tratamiento se puede verificar un kit ARNasaAlert™ (Life Technologies, EE.UU.). Los metodos para inactivar las ARNasas en tejidos se exponen en la Patente de Estados Unidos Num. 6.777.210 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Num. 2009/0286304.

A modo de ejemplo, pero sin limitacion, el DES se realiza mezclando, o mezclando y calentando uno o mas componentes que pueden elegirse del grupo: Nitrato de colina, Tetrafluoroborato de colina, Hidroxido de colina, Bitartrato de colina, Dihidrogenocitrato de colina, p-Toluenosulfonato de colina, Bicarbonato de colina, Cloruro de colina, Bromuro de colina, Yoduro de colina, Fluoruro de colina, Cloruro de clorocolina, Bromuro de yodocolina, Hidroxido de acetilcolina, Bitartrato de acetilcolina, Dihidrogenocitrato de acetilcolina, p-Toluenosulfonato de acetilcolina, Bicarbonato de acetilcolina, Cloruro de acetilcolina, Bromuro de acetilcolina, Yoduro de acetilcolina, Fluoruro de acetilcolina, Cloruro de cloroacetilcolina, Bromuro de bromoacetilcolina, Yoduro de yodoacetilcolina, Hidroxido de butirilcolina, Bitartrato de butirilcolina, Dihidrogenocitrato de butirilcolina, p-Toluenosulfonato de butirilcolina, Bicarbonato de butirilcolina, Cloruro de butirilcolina, Bromuro de butirilcolina, Yoduro de butirilcolina, Fluoruro de butirilcolina, Cloruro de CloroButirilcolina, Bromuro de BromoButirilcolina, Yoduro de YodoButirilcolina, Cloruro de acetiltiocolina, L-Carnitina, D-Carnitina, Betama, Sarcosina, N-oxido de trimetilamina, Betama HCl, Cetilbetama, Fluoruro de cetiltrimetilamonio, Cloruro de cetiltrimetilamonio, Bromuro de cetiltrimetilamonio, Laurilbetama, Cloruro de N,N-dimetilenetanolamonio, Cloruro de N,N-dietiletanolamonio, Cloruro de beta-metilcolina, Cloruro de fosfocolina, Citrato de colina, Cloruro de benzoilcolina, Laurilsulfobetama, Cloruro de benciltrimetilamonio, Cloruro de metiltrifenilfosfonio, Bromuro de metiltrifenilfosfonio, Yoduro de metiltrifenilfosfonio, Fluoruro de metiltrifenilfosfonio, Cloruro de N-dietilenetanolamonio, Cloruro de etilamonio, Cloruro de tetrametilamonio, Bromuro de tetrametilamonio, Yoduro de tetrametilamonio, Fluoruro de tetrametilamonio, Cloruro de tetraetilamonio, Bromuro de tetraetilamonio, Yoduro de tetraetilamonio. Fluoruro de tetraetilamonio, Cloruro de tetrabutilamonio, Bromuro de tetrabutilamonio, Yoduro de tetrabutilamonio, Fluoruro de tetrabutilamonio, Cloruro de (2-cloroetil)trimetilamonio, Cloruro de terbio (III), Cloruro de cinc (II), Bromuro de cinc (II), Oxido de circonio (III), Cloruro de hierro (III), Cloruro de estano (II), Cloruro de cobre (II), Cloruro de magnesio (II); con uno o mas de otros componentes que tambien pueden formar un DES, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes agentes qrnmicos seleccionados del grupo: Urea, Formamida, Tiourea, 1-Metilurea, 1,1-Dimetilurea, 1,3-Dimetilurea, Carbohidrazida, Tetrametilurea, 1,3-bis(hidroximetil)urea, Benzamida, Reactivo T de Girad, Lactamida, Bromoacetamida, Dibromoacetamida, Tribromoacetamida, Bromofluoroacetamida, Bromodifluoroacetamida, Bromoclorofluoroacetamida, Yodoacetamida, Diyodoacetamida, Triyodoacetamida, 2-Metil-2,2-difluoroacetamida, 2-Metil-2-fluoroacetamida, 2,2-Dimetil-2-fluoroacetamida, 2-Etil-2,2-difluoroacetamida, 2-Etil-2-fluoroacetamida, 2,2-Dietil-2-fluoroacetamida, 2-Propil-2,2-difluoroacetamida, 2-Propil-2-fluoroacetamida, 2,2-Propil-2-fluoroacetamida, 2-Fluoropropionamida, 3-Fluoropropionamida, 2,2-Difluoropropionamida, 2,3-Difluoropropionamida, 3,3-Difluoropropionamida, 3,3,3-Trifluoropropionamida, 2-Fluoro-3,3,3-trifluoropropionamida, 2-Cloro-3,3,3-trifluoropropionamida, 2,2-Cloro-3,3,3-trifluoropropionamida, 2-Bromo-3,3,3-trifluoropropionamida, 2,2-Bromo-3,3,3-trifluoropropionamida, Pentafluoropropionamida, Heptafluoropropionamida, Trimetilacetamida, 1-(Trifluoroacetil)imidazol, N,O-Bis(trifluoroacetil)hidroxilamina, Bistrifluoroacetamida, N-Metil-fluoroacetamida, N-Metildifluoroacetamida, N-Metil-trifluoroacetamida, N-Metil-clorofluoroacetamida, N-Metil-clorodifluoroacetamida, N-Metilcloroacetamida, N-Metil-dicloroacetamida, N-Metil-diclorofluoroacetamida, N-Metil-tricloroacetamida, N-Metilbromoacetamida, N-Metil-dibromoacetamida, N-Metil-tribromoacetamida, N-Metil-bromofluoroacetamida, N-Metilbromodifluoroacetamida, N-Metil-bromoclorofluoroacetamida, N-Metil-yodoacetamida, N-Metil-diyodoacetamida, N-Metil-triyodoacetamida, N-Metil-2-metil-2,2-difluoroacetamida, N-Metil-2-metil-2-fluoroacetamida, N-Metil-2,2-dimetil-2-fluoroacetamida, N-Metil-2-etil-2,2-difluoroacetamida, N-Metil-2-etil-2-fluoroacetamida, N-Metil-2,2-dietil-2-fluoroacetamida, N-Metil-2-propil-2,2-difluoroacetamida, N-Metil-2-propil-2-fluoroacetamida, N-Metil-2,2-propil-2-fluoroacetamida, N-Metil-2-fluoropropionamida, N-Metil-3-fluoropropionamida, N-Metil-2,2-difluoropropionamida, N-Metil-2,3-difluoropropionamida, N-Metil-3,3-difluoropropionamida, N-Metil-3,3,3-trifluoropropionamida, N-Metil-2-fluoro-3,3,3-trifluoropropionamida, N-Metil-2-cloro-3,3,3-trifluoropropionamida, N-Metil-2,2-cloro-3,3,3-trifluoropropionamida, N-Metil-2-bromo-3,3,3-trifluoropropionamida, N-Metil-2,2-bromo-3,3,3-trifluoropropionamida, N-Metil-pentafluoropropionamida, N-Metil-heptafluorobutiramida, N,N-Dimetil-2,2,2-trifluoroacetamida, N-Etil-2,2,2-trifluoroacetamida, N,N-Dietil-2,2,2-trifluoroacetamida, N-(Hidroximetil)Trifluoroacetamida, Etiltrifluoroacetato, Ditiotreitol, Ditioeritritol, Beta-mercaptoetanol, Penicilamina, Tiopronina, Acrilamida, Metanol, Etanol, Propanol, Butanol, Formaldel'ndo, Glutaraldehndo, Taurina, Acido acomtico, Acido adfpico, Acido benzoico, Acido cftrico, Acido malonico, Acido malico, Acido DL-maleico, Acido oxalico, Acido fenilacetico, Acido fenilpropionico, Acido succmico, Acido levulmico, Acido tartarico, Acido galico, Acido p-toluenosulfonico, Glicina, Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina, Serina, Treonina, Tirosina, Cistema, Metionina, Acido aspartico, Asparragina, Acido glutamico, Glutamina, Arginina, Lisina, Histidina, Fenilalanina, Triptofano, Prolina, Etilenglicol, Trietilenglicol, Glicerol, Resorcinol, Fenol, 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,4-Butanodiol, 1,5-Pentanodiol, 1,6-Hexanodiol, 1,8-Octanodiol, 1,12-Dodecanodiol, m-Cresol, Imidazol, 1-Metilimidazol, 4-Metilimidazol, N-Metilpirrolidona, N-Etilpirrolidona, N-Bencilpirrolidona, 2-imidazolindona, tetrahidro-2-pirimidiona, Guanidina, Guanidina HCl, Isotiocianato de guanidina, Sulfato de guanidina, Acetato de amonio, Bicarbonato de amonio, Cloruro de amonio, Citrato de amonio dibasico, Formiato de amonio, Yoduro de amonio, Nitrato de amonio, Fosfato de amonio monobasico, Fosfato de amonio dibasico, Sulfamato de amonio, Sulfato de amonio, Tartrato de amonio dibasico, Isotiocianato de amonio, Benzoato de amonio, Bromuro de amonio, Fluoruro de amonio, Hidrogenosulfato de amonio, Trifluoroacetato de amonio, Tiosulfato de amonio, Adonitol, Ribitol, Ramnosa, Trehalosa, Trehalosa, D-Sorbitol, L-Sorbitol, Sorbosa, Xilitol, Glucosa, Sacarosa, Lactosa, Fructosa, Maltosa, Manosa, Manitol, Arabinosa, Galactosa, Rafinosa, Inositol, Eritritol o Xilosa.

Se apreciara que algunos compuestos descritos en la presente memoria pueden ser ionizables, es decir, algunos compuestos pueden ser acidos debiles, bases debiles o anfolitos. Se pretende que las representaciones de las formas libres de los compuestos ionizables abarquen las formas ionizadas correspondientes. Por ejemplo, las representaciones de grupos acido carboxflico abarcan los grupos carboxilato correspondientes.

Cabe senalar que ciertos componentes tales como el cloruro de cinc pueden formar un DES no solo con cloruro de colina, sino tambien con urea; tanto el cloruro de colina como el cloruro de cinc aparecen en el mismo grupo de componentes anterior, por lo tanto, ciertas mezclas de DES se pueden preparar a partir de productos qmmicos dentro del mismo grupo.

Tambien se debe tener en cuenta que la lista anterior no es exhaustiva, y que los componentes del DES no estan particularmente limitados a ningun tipo de molecula o propiedad, excepto que el enlace de hidrogeno entre los componentes de DES es frecuente pero no es un requisito absoluto.

Los disolventes eutecticos profundos utilizados de acuerdo con la presente invencion estan preferiblemente sustancialmente libres de acidos organicos. En particular, los disolventes eutecticos profundos utilizados de acuerdo con la presente invencion estan preferiblemente sustancialmente exentos de acidos organicos seleccionados entre acido malico, acido maleico, acido cftrico, acido lactico, acido piruvico, acido fumarico, acido succmico, acido lactico, acido acetico, acido acomtico, acido tartarico, acido ascorbico, acido malonico, acido oxalico, acido glucuronico, acido neuramico y acido sialico. Alternativa o adicionalmente, R6, R7 y Rs como se muestra en las Formulas II y III, se seleccionan de manera que el compuesto resultante no comprenda un grupo acido carboxflico. En una disposicion preferida, cuando R6 es OH, R7 no es carbonilo. En otra disposicion preferida, cuando R7 es -Z-C(O)Rs, Rs no es OH.

Los disolventes eutecticos profundos utilizados de acuerdo con la presente invencion estan preferiblemente sustancialmente libres de sales metalicas. En una disposicion, los disolventes eutecticos profundos estan sustancialmente libres de sales metalicas distintas de las sales de cinc o circonio. Los disolventes eutecticos profundos estan preferiblemente sustancialmente libres de NaH2PO4, Na2HPO4, NaHSO3, Na2SO4, MgCh, CaCl2, KCl, NaCl y KI. Si el disolvente eutectico profundo comprende un azucar o alcohol de azucar, el disolvente eutectico profundo preferiblemente no comprende una sal metalica.

Los disolventes eutecticos profundos utilizados de acuerdo con la presente invencion estan preferiblemente sustancialmente libres de azucares o alcoholes de azucar seleccionados entre sacarosa, glucosa, fructosa, lactosa, maltosa, celobiosa, arabinosa, ribosa, ribulosa, galactosa, ramnosa, rafinosa, xilosa, sacarosa, manosa, trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, xilitol, ribitol, galactitol, eritritol y adonitol. Si el disolvente eutectico profundo comprende una sal metalica, el disolvente eutectico profundo preferiblemente no comprende un azucar o alcohol de azucar. Tambien se debe tener en cuenta que no hay un numero maximo concreto de componentes de DES en la mezcla de DES, por ejemplo, se pueden mezclar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas componentes para producir una mezcla de DES, usualmente pero necesariamente, a razones molares enteras, por ejemplo, en una mezcla de DES de dos componentes, el componente 1 y el componente 2 se pueden mezclar a las siguientes razones: 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1 , 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10 (mol:mol) o, por ejemplo, en una mezcla de DES de tres componentes, el componente 1, el componente 2 y el componente 3 se pueden mezclar a estas razones: 10:1:1, 9:1:1, 8:1:2, 7:1:3, 6:1:4, 5:1:5, 4:1:6, 3:1:7, 2:1:8, 1:1:9, 1:2:8, 1:3:7, 1:4:6, 1:5:5, 1:6:4, 1:7:3, 1:8:2, 1:9:1, 1:10:1 ( mol:mol:mol).

El experto en la tecnica entendera que tambien son posibles otras razones de mezcla de los componentes, por ejemplo 20:1 o 1:30 (mol:mol) y que la razon molar concreta que conduce al punto eutectico no es necesariamente la razon molar optima o deseada. para el proposito particular de, por ejemplo, estabilizar el ARN y/o fijar la morfologfa celular. La actividad de estabilizacion del DES puede estar relacionada con las propiedades de enlace de hidrogeno de la mezcla de DES. No hay una restriccion o limitacion concreta en el numero de componentes o la proporcion de mezcla para preparar una mezcla de DES util para una aplicacion concreta. Las propiedades ffsicas adicionales del DES, por ejemplo, la viscosidad o la densidad, se pueden modificar anadiendo un componente adicional, o alternativamente, anadiendo un "aditivo" como se establece a continuacion. Algunas mezclas de DES se pueden preparar utilizando una razon molar fraccionaria, por ejemplo, se ha preparado ZnCl2:urea a una razon 1:3.5 (mol:mol) y, de nuevo, no existen restricciones concretas a las razones molares del componente 1 y el componente 2, o del componente 1, el componente 2 y el componente 3, etc., que se utilizan, y la razon optima de los componentes que comprenden la mezcla de DES que se utilizara para la aplicacion, tal como la fijacion de celulas, se determina empmcamente con mayor precision. Solo a modo de ejemplo, el cloruro de colina/trifluoroacetamida se puede mezclar a una razon molar de 2:1, 1,75:1, 1,5:1, 1,25:1, 1:1, 1:1,25, 1:1,5, 1:1,75 o 1:2 mol/mol, o sus cantidades fraccionarias adicionales, y posteriormente se prueba individualmente para determinar cual tiene la propiedad optima de estabilizacion del ARN y/o de fijacion celular.

Otros factores, tales como el coste o la toxicidad, tambien pueden llevar al experto a reducir la proporcion de un componente en particular y a reemplazarlo parcialmente con una alternativa mas economica. Solo por ejemplo, una mezcla de DES de Cloruro de acetilcolina:urea (1:2 mol:mol) puede, en ciertas aplicaciones, reemplazarse parcialmente con el cloruro de colina mas economico, como en el Cloruro de acetilcolina:Cloruro de colina:urea (1:1:4 mol:mol:mol).

Tambien resultara evidente para el experto que, debido a, por ejemplo, la presencia de contaminantes en los componentes utilizados para preparar el DES, tales como agua, oxidacion, absorcion de CO2, subproductos contaminantes durante la smtesis o productos de degradacion de uno de los componentes, y que la razon exacta deseada, por ejemplo solo, de una mezcla 1:1 (mol:mol) puede significar practicamente /- 10%, pero mas preferiblemente 5% e incluso mas preferiblemente 1% de diferencia en la cantidad exacta del componente 1 o del componente 2. A modo de ilustracion, un error de 5% podna potencialmente proporcionar las siguientes razones molares finales: 0,95:1, 1:0,95, 1,05:0,95 o 0,95:1,05 (mol:mol) y el efecto de este error generalmente solo puede determinarse empmcamente, por ejemplo, su efecto sobre la calidad del ARN como se expone en el Ejemplo 1. Generalmente, para eliminar contaminantes incluyendo agua, se puede llevar a cabo el conocido procedimiento de recristalizacion en etanol, seguido de un extenso vado. y/o secado qrnmico. Los metodos se establecen en 'Purification of Laboratory Chemicals' Butterworth-Heinemann (2012).

Tfpicamente, pero ciertamente no exclusivamente, un DES se prepara mezclando un aceptor de enlaces de hidrogeno de una de las siguientes clases de agentes qmmicos; (i) una sal de nitrogeno con un cation cargado positivamente, tal como nitrogeno primario, secundario, terciario o cuaternario; un ejemplo de una sal de nitrogeno es aquella con un haluro, tal como Cloruro de colina, (ii) una sal metalica tal como un haluro de sal de metal de transicion, con un donador de enlaces de hidrogeno que puede incluir (iii) una amina, (iv) un hidroxilo, (v) un aldehudo, (vi) una amida o (vii) acido carboxflico, de este modo, se incluinan donadores de enlaces de hidrogeno tales como azucares, acidos carboxflicos, ureas tales como Trifluoroacetamida y alcoholes.

En una disposicion, el disolvente eutectico profundo es un disolvente eutectico profundo tipo III o tipo IV, en donde el ARN extrafdo de 10 mg de una muestra de hugado de rata incubada a 24°C durante 20 dfas con 400 mg del disolvente eutectico profundo tiene un numero de integridad del ARN (RIN) de al menos 4,0, medido con un Agilent Bioanalyser 2100.

El numero de integridad del ARN se puede medir utilizando un kit de ARN RNA 6000 Nano total (Num. de Cat. 5067 1511, Agilent Technologies, EE.UU.) y un aparato Bioanalyser 2100 (Num. de Cat. G2939AA, Agilent Technologies, EE.UU.)

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "disolvente eutectico profundo tipo III" se refiere a un disolvente eutectico profundo que tiene al menos un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es un compuesto de amonio cuaternario o fosfonio tal como cloruro de colina o N,N,N-trimetilglicina (betama), y en donde el segundo componente es un donador de enlaces de hidrogeno, tal como la urea o la trifluoroacetamida. Un disolvente eutectico profundo de tipo IV es un disolvente eutectico profundo que comprende al menos un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es una sal metalica tal como cloruro de cinc y en donde el segundo componente es un donador de enlaces de hidrogeno, tal como la urea. Un experto en la tecnica estara familiarizado con los metodos para extraer ARN de muestras de tejido. Adecuadamente, el ARN puede extraerse utilizando un kit RNeasy Mini (Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, aunque se pueden utilizar otros metodos.

La presente invencion proporciona el uso de un disolvente eutectico profundo como fijador de virus, celulas o tejidos para producir un virus, celula o tejido fijados. Preferiblemente, al menos 75% de las celulas HeLa cultivadas en un sustrato e incubadas a 24°C durante 1 hora con el disolvente eutectico profundo permanecen ancladas despues de la sustitucion del disolvente eutectico profundo con agua e incubacion a 24°C durante 1 hora.

Un experto en la tecnica estara familiarizado con los metodos para determinar el numero de celulas que permanecen unidas a un sustrato. Por ejemplo, aproximadamente 2.000 celulas HeLa podrian crecer en un sustrato adecuado, tal como un cubreobjetos. Un ejemplo de cubreobjetos adecuado es Cellattice™: Superficie de Cultivo Celular con Escala Micrometrica con un diametro de 25 mm (Superficie de cubreobjetos de cultivo celular con escala micrometrica Num. de Cat. CLS5-25D-050 Nexcelom Bioscience, EE.UU.). El sustrato se podria colocar en una placa de cultivo de tejidos y cultivar durante la noche en un tampon apropiado, tal como 2 ml de DMEM/10% de FBS. El numero de celulas ancladas en un area definida del sustrato se puede contar manualmente utilizando una lente de microscopio objetivo 10x. El medio de cultivo tisular se puede eliminar utilizando, por ejemplo, una pipeta aspiradora y se puede reemplazar con 400 mg de un disolvente eutectico profundo. El cultivo de tejidos se puede incubar durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir la fijacion celular y a continuation eliminar el disolvente eutectico profundo reemplazado con 2 ml de agua destilada, incubar durante 1 hora a temperatura ambiente y contar manualmente el numero de celulas en un area definida de la cuadricula. Se puede calcular el porcentaje de celdas ancladas que permanecen en el area definida en comparacion con el numero original.

En disposiciones particularmente preferidas, el ARN extraido de 10 mg de una muestra de higado de rata incubada a 24°C durante 20 dias con 400 mg del disolvente eutectico profundo tiene un numero de integridad de ARN (RIN) de al menos 4,0, medido utilizando un Agilent Bioanalyser 2100 y al menos 75% de celulas HeLa cultivadas en un sustrato e incubadas a 24°C durante 1 hora con el disolvente eutectico profundo permanecen ancladas al sustrato despues de reemplazar el disolvente eutectico profundo por agua e incubation a 24°C durante 1 hora.

Opcionalmente, el disolvente eutectico profundo utilizado de acuerdo con la presente invention es un disolvente eutectico profundo tipo III, en donde el disolvente eutectico profundo comprende un compuesto que comprende un grupo trifluorometilo. El compuesto que comprende el grupo trifluorometilo puede estar presente en el disolvente eutectico profundo en una cantidad de al menos 5% en peso del disolvente eutectico profundo.

En una disposition, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es un compuesto de Formula I:

en donde:

R6 es H u OH;

R7 se selecciona entre H, CH3, Cl, Br, un oxigeno carbonflico, y

Z se selecciona entre -CH2-, O y S;

R8 es Rn o OH; y

en donde el segundo componente comprende un compuesto de Formula II o una sal del mismo:

en donde:

A se selecciona entre O, S y NH;

R₁se selecciona entre H, un grupo alqueno que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, R9, -NH2, -NH- (CH2)aCH3 y -C(R3)(R4)(R5);

en donde a es 0 o un numero entero de 1 a 5;

R2 se selecciona entre H y un grupo alquilo lineal que tiene 1 a 3 atomos de carbono;

R3 es un anillo aromatico o alifatico de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es R10;

R4 y R5 son cada uno independientemente H o F; y

en donde cada uno de Rg, R10 y R11 se selecciona independientemente entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, y grupos mono-, di- o trifluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono.

Preferiblemente, en esta disposicion, A se selecciona entre O, S y NH; R1 se selecciona entre H, -CH=CH2, R9, -NH2, -NHCH3 y -C(R3)(R4)(R5); R2 se selecciona entre H y -CH3; R3 es un anillo aromatico o alifatico de 5 o 6 miembros opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es R10; R4 y R5 son cada uno independientemente H o F; y R9, Rl0 y R11 se seleccionan cada uno independientemente entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono y grupos mono-, di- o trifluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono. Opcionalmente, R7 se selecciona entre H, Br, un oxfgeno carbomlico, y

A puede ser O o S.

R2 puede ser H.

R1 se puede seleccionar entre H, Rg, -CH=CH2 y C(R3)(R4)(R5). En esta disposicion, se prefiere que R1 sea Rg, donde Rg preferiblemente tiene un atomo de carbono.

Preferiblemente, el segundo componente es acetamida o 2-cloroacetamida.

En otra disposicion, Rg es un grupo mono-, di- o tri-fluorometilo.

El segundo componente es preferiblemente trifluoroacetamida, trifluorotioacetamida o N-metiltrifluoroacetamida. En otra disposicion, Rg tiene dos atomos de carbono, preferiblemente en donde Rg es un grupo mono-, di- o trifluoroetilo.

Se prefiere que el segundo componente sea 2,2-difluoropropanamida o 3,3,3-trifluoropropanamida. En otra disposicion, el segundo componente es formamida o acrilamida.

En una disposicion adicional, R1 es C(R3)(R4)(R5), en donde R4 y R5 son preferiblemente F.

R3 puede ser un anillo aromatico de 6 miembros opcionalmente sustituido, tal como un grupo fenilo opcionalmente sustituido. Preferiblemente, el primer componente es 2,2-difluoro-2-fenilacetamida. Alternativamente, R3 comprende un sustituyente, preferiblemente en la posicion 2 del grupo fenilo.

El sustituyente es preferiblemente un grupo mono-, di- o tri-fluorometilo. Por lo tanto, en una disposicion, el segundo componente es 2-(trifluorometil)fenilacetamida.

En otra disposicion R1 se selecciona entre -NH2 y -NHCH3. Preferiblemente, el segundo componente es urea, tiourea o 1,3-dimetilurea.

En una disposicion adicional, A es NH. En esta disposicion, el segundo componente puede ser guanidina, opcionalmente en donde la guanidina esta presente en forma de una sal hidroisotiocianato.

En otra disposicion, R7 es H. En esta disposicion, el primer componente comprende preferiblemente colina.

En otra disposicion, el primer componente comprende bromocolina.

En otra disposicion, el primer componente es N,N,N-trimetilglicina, opcionalmente en donde el segundo componente se selecciona entre trifluoroacetamida y urea.

En otra disposicion R7 es

En esta disposicion, Z puede ser O o S y R8 puede ser R11, en donde R11 tiene preferiblemente un atomo de carbono.

En esta disposicion, el primer componente comprende preferiblemente acetilcolina o acetiltiocolina.

Alternativamente R11 puede tener tres atomos de carbono, en donde el primer componente comprende preferiblemente butirilcolina.

En una disposicion adicional, Z puede ser CH2. En esta disposicion, R8 puede ser OH. En esta disposicion, el segundo componente es preferiblemente carnitina.

El primer componente puede comprender un contraion, cuyo contraion es tipicamente un anion haluro pero puede ser otro anion tal como nitrato (NO3-) o tetrafluoroborato (BF4-). El anion haluro se puede seleccionar entre fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro, preferiblemente cloruro. En esta disposicion, se prefiere que el primer componente sea cloruro de colina, opcionalmente en donde el segundo componente se selecciona entre trifluoroacetamida, trifluorotioacetamida; 3,3,3-trifluoropropanamida; 2,2-difluoro-2-fenilacetamida; tiourea y urea, preferiblemente trifluoroacetamida.

La razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta en el intervalo de 1:3 a 2:1, preferiblemente en el intervalo de 1:1,5 a 1:2,5, mas preferiblemente 1:2.

En una disposicion adicional, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es una sal haluro de colina; y en donde el segundo componente es un imidazol opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente o cada sustituyente es un grupo alquilo que tiene 1 a 3 atomos de carbono. En esta disposicion, la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta preferiblemente en el intervalo de 2,8:1 a 2:1.

La sal haluro de colina es preferiblemente cloruro de colina y el imidazol sustituido es preferiblemente un metil imidazol, tal como N-metilimidazol o 4-metilimidazol. Tambien se contempla el uso de imidazoles sustituidos con bencilo, tales como 1-bencilimidazol. Alternativamente, el imidazol no esta sustituido.

En una disposicion adicional, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente comprende un compuesto de Formula III:

en donde:

R6 es H u OH;

R7 se selecciona entre H, CH3, Cl, Br, un oxigeno carbonflico, y

Z se selecciona entre -CH2-, O y S;

en donde R8 se selecciona entre OH, un grupo alquilo que tiene de uno a tres atomos de carbono, un grupo monocloroalquilo que tiene de uno a tres atomos de carbono, y un grupo mono-, di- o tri-fluoroalquilo que tiene de uno a tres atomos de carbono; y

en donde el segundo componente es un azucar o un alcohol de azucar que tiene al menos 3 atomos de carbono. R7 se selecciona opcionalmente entre H, Br, un oxigeno carbonflico, y

El alcohol de azucar se puede seleccionar entre glicerol, trietol, xilitol, sorbitol y volemitol, preferiblemente entre glicerol, xilitol y sorbitol, y lo mas preferiblemente es sorbitol. Alternativamente, el azucar puede ser trehalosa.

En esta disposicion, el segundo componente puede comprender colina, tal como cloruro de colina. La razon molar del primer componente con respecto al segundo componente puede estar en el intervalo de 1:2 a 2:1, preferiblemente en el intervalo de 1:0,8 a 1:1,2.

En una disposicion adicional, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es un haluro de cinc (II) o haluro de circonio (IV), y en donde el segundo componente es un compuesto de Formula IV:

en donde:

A se selecciona entre O, S y NH;

R₁se selecciona entre H, un grupo alqueno que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, R9, -NH2, -NH- (CH2)nCH3, y -C(R3)(R4)(R5);

en donde n es 0 o un numero entero de 1 a 5;

R4 y R5 son cada uno independientemente H o F; y

en donde R9 se selecciona entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono y grupos mono-, di- o tri-fluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono.

El haluro de cinc (II) preferido es ZnCl2. El haluro de circonio (IV) preferido es ZrCl4. El segundo componente es preferiblemente urea. La razon molar del primer componente con respecto al segundo componente puede estar en el intervalo de 1:3 a 1:4.

El segundo componente es preferiblemente urea.

En una disposicion adicional, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es un compuesto de Formula V:

en donde:

Y- es Cl- o Br-;

X es N o P;

R12, R13, R14 y R15 son cada uno independientemente un grupo alquilo lineal que tiene 1 a 16 atomos de carbono, un grupo alcohol lineal que tiene 1 a 16 atomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo fenilo; en donde el segundo componente es un compuesto de Formula I o una sal del mismo:

en donde:

A se selecciona entre O, S y NH;

R1 se selecciona entre H, -Ch=CH2, R3, -NH2, -NHCH3 y-C(R3)(R4)(R5);

R2 se selecciona entre H y -CH3;

R3 es un anillo aromatico o alifatico de 566 miembros opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es R10; y

R4 y R5 son cada uno independientemente H o F;

en donde cada uno de R9 y R10 se selecciona independientemente entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, y grupos mono-, di- o trifluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono.

Y" puede ser Cl-. En disposiciones alternativas, Y" puede ser cualquier contrai6n adecuado, tal como un haluro, nitrato o tetrafluoroborato.

X puede ser N; En esta disposici6n, el compuesto de F6rmula V es una sal de amonio cuaternario.

Opcionalmente, cada uno de R12, R13, R14 y R15 es independientemente un grupo alquilo lineal que tiene de 1 a 16 atomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo fenilo.

Cada uno de R12, R13, R14, y R15 se puede seleccionar independientemente entre grupos alquilo lineales que tienen de 1 a 4 atomos de carbono, y es cada uno preferiblemente un grupo metilo. En esta disposici6n, el primer componente es preferiblemente cloruro de tetrametilamonio.

Alternativamente, cada uno de R12, R13, R14, y R15 es un grupo etilo. En esta disposici6n, el primer componente es preferiblemente cloruro de tetraetilamonio.

Alternativamente cada uno de R12, R13, R14 y R15 es un grupo butilo. En esta disposici6n, el segundo componente es cloruro de tetrabutilamonio o bromuro de tetrabutilamonio.

Alternativamente, el primer componente comprende:

Alternativamente, el primer componente comprende:

En otra disposici6n X puede ser P.

Al menos uno de R12, R13, R14 y R15 Puede ser un grupo fenilo. En esta disposici6n, el primer componente comprende preferiblemente metiltrifenilfosfonio y puede ser bromuro de metiltrifenilfosfonio.

En otra disposici6n A puede ser O o S.

R1 se puede seleccionar entre -NH2 y -NHCH3 y el segundo componente es preferiblemente urea. Alternativamente, el segundo componente puede ser trifluorotioacetamida. Alternativamente, el segundo componente puede ser trifluoroacetamida.

La raz6n molar del primer componente con respecto al segundo componente puede ser de 1:1,5 a 1:2,5, preferiblemente de 1:1,8 a 1:2,2.

En una disposici6n adicional, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente comprende colina y en donde el segundo componente es un alcanodiol que tiene de 5 a 7 atomos de carbono. El alcanodiol es preferiblemente hexanodiol.

En otra disposici6n adicional, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente comprende colina y en donde el segundo componente comprende una N-alquil pirrolidona, en donde el grupo N-alquilo tiene 1 a 5 atomos de carbono. Preferiblemente, la N-alquil pirrolidona es N-metilpirrolidona. Preferiblemente, la colina es cloruro de colina. En esta disposici6n, la raz6n molar del primer componente con respecto al segundo componente puede ser 1:2.

En otra disposicion, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente comprende colina, y en donde el segundo componente comprende betamercaptoetanol. En esta disposicion, la colina puede ser cloruro de colina y/o la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente puede ser aproximadamente 1:2.

En otra disposicion, el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente comprende colina, y en donde el segundo componente comprende ditiotreitol. La colina puede ser cloruro de colina. La razon del primer componente con respecto al segundo componente puede ser de aproximadamente 1:2.

Las mezclas de DES se preparan de manera mas simple a partir de productos qmmicos comercializados disponibles de comparuas de reactivos qmmicos tales como Acros Organics (Francia), TCI (Belgica), Fluka (Francia) y similares. Tfpicamente, las cantidades correctas de cada componente se anaden juntas en un tubo de polipropileno, se someten a agitacion vorticial brevemente, se calientan a 100°C por medios convencionales y, si fuera necesario para componentes o aditivos diffciles de disolver, se someten a sonicacion, lo que puede ser un metodo de mezcla extremadamente eficaz. Se debe tener cuidado con componentes tales como el Cloruro de colina, que son higroscopicos, ya que puede ser necesario un secado adicional del material a vado o mediante recristalizacion. Las existencias de mezclas de DES se pueden mantener secas al vado o por medio de desecantes como el gel de sflice. El almacenamiento es generalmente a temperatura ambiente en un tubo sellado.

Tambien se ha encontrado que el tratamiento de tejidos de plantas y animales con una mezcla de DES tal como Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) conserva el color de las hojas, flores, sangre y tejidos, posiblemente al reducir la oxidacion en comparacion con las muestras no tratadas. o las tratados con RNAlater, Formol o congelacion. La conservacion del color puede ser util para la correcta identificacion de las muestras y/o componentes de las muestras.

Se ha encontrado que la preparacion de una mezcla de DES entre el Cloruro de colina y agentes qmmicos volatiles/olorosos como Ditiotreitol, Ditioeritritol, Beta-mercaptoetanol o Fenol reduce notablemente la volatilidad y, por lo tanto, los efectos desagradables o peligrosos de la respiracion de tales agentes qmmicos. Este efecto es probablemente el resultado de los enlaces de hidrogeno entre la sustancia qmmica volatil y el cloruro de colina. No existe ninguna limitacion concreta en cuanto a la combinacion del componente volatil en la mezcla de DES, aparte de la necesidad de enlaces de hidrogeno entre los componentes. Este es tambien un medio para reducir la perdida de otros componentes volatiles, tales como los alcoholes de bajo peso molecular, otros productos qmmicos organicos, tales como los disolventes, incluyendo DMSO y formamida. Por lo tanto, la presente descripcion tambien incluye un medio para reducir la evaporacion y/o la volatilidad de los componentes para su almacenamiento o uso en un entorno abierto. Las ventajas incluyen una mejor salud y seguridad, una menor perdida de reactivos valiosos por evaporacion, una menor inflamabilidad y una eliminacion mas sencilla.

El punto eutectico de una mezcla de DES de dos o mas componentes es el punto donde la proporcion del componente 1 con respecto al otro o a los otros componentes conduce a la temperatura de fusion mas baja. Por ejemplo, el punto eutectico de una mezcla de DES de Cloruro de colina:Urea es (1:2 mol:mol) con un punto de congelacion (Pc) referido de 12°C. Desde un punto de vista practico, esto significa que el DES se puede manejar como un lfquido a temperatura ambiente, pero se solidificara lentamente en el refrigerador. Otras mezclas de DES, particularmente aquellas que contienen Cloruro de colina mezclada con Glicerol, Etilenglicol y Trifluoroacetamida o Acido fenilacetico tienen un Pc mucho mas bajo, permaneciendo lfquidas por debajo de 0°C o incluso -20°C. Aunque el manejo de lfquidos brinda ciertas ventajas, tales como la facilidad para medir volumenes exactos y mezclar, es importante tener en cuenta que esta invencion no se limita de ninguna manera a las mezclas de DES que son lfquidas a temperatura ambiente o cualquier otra temperatura concreta. Calentar y mezclar los componentes de un DES proporciona un medio para que los atomos y moleculas individuales establezcan enlaces de hidrogeno u otras interacciones con otros atomos y moleculas y, por lo tanto, produzcan la propiedad particular de la mezcla de DES. Una vez que esto ocurre, ya sea la mezcla de DES un lfquido, un gel o un solido, no necesariamente cambia su capacidad para, por ejemplo, estabilizar el ARN en una muestra de tejido. El contacto simple entre la muestra de tejido y la mezcla de DES se producira incluso cuando el DES sea solido a temperatura ambiente y se pueda producir una rapida estabilizacion. Aunque tradicionalmente los reactivos de estabilizacion de ARN son lfquidos tales como RNAlater, AllProtect, PAXgene Tissue o formalina, la invencion aqm descrita puede hacer uso de las propiedades de estabilizacion de ARN y/o fijacion de celulas de DES lfquidos, en gel o solidos. De hecho, el uso de una forma solida de un DES puede ser ventajoso cuando se manejan muestras de tejido; se puede formar un bloque solido de DES calentando el solido DES por encima de su punto eutectico para que se derrita y a continuacion vertiendolo en un recipiente adecuado para su enfriamiento y solidificacion o, moldear o cortar para que quepa en un recipiente espedfico y colocar la muestra de tejido en la superficie de DES solida para lograr estabilizacion. Convenientemente, se pueden realizar pocillos, depresiones o ranuras en la superficie del DES solido para que sirvan como ubicaciones de almacenamiento espedficas para cada muestra, recibiendo un pocillo una muestra, etc., ventajosamente con el uso de un pocillo, el area de superficie en contacto entre el DES solido y la muestra aumenta (Figura 1A), mientras que una capa adicional de un solido o lfquido DES sobre la muestra ubicada en el pocillo aumentara adicionalmente la cantidad total de DES disponible y el area de contacto con la muestra (Figura 1B). En la (Figura 1C) se muestra un tubo de recoleccion de sangre que contiene un lfquido DES y una tapa perforable para la entrada de la sangre con una jeringa o un kit de recoleccion de sangre (PreAnalytix). A modo de ejemplo, las mezclas de DES que son solidas o lfquidas a temperatura ambiente se exponen en la Tabla 1.

Se puede utilizar un aditivo combinado con una mezcla de DES. El proposito del aditivo es mejorar las propiedades de la mezcla de DES, por ejemplo, la estabilizacion de ARN, ADN y/o protemas y/o la fijacion de celulas y tejidos u otra aplicacion. Los efectos de diversos aditivos sobre la morfologfa celular, por ejemplo, se exponen en la Tabla 6. El proposito del aditivo es mejorar la propiedad de la mezcla de DES para la aplicacion concreta, por ejemplo, estabilizacion, almacenamiento, transporte de ARN y/o fijacion de celulas o tejidos. Solo a modo de ejemplo, el aditivo podna ser un (i) colorante o tinte para ayudar a manipular o tenir o procesar el tejido tal como la tincion H y E, Azul de Coomasie, Azul de Metileno, Xileno Cianol, Cristal Violeta, Fucsina, Naranja de Acridina, DAPI, Carmm, Eosina, Bromuro de Etidio, Marron Bismarck, Hoechst, Verde malaquita, Verde metilo, Azul neutro, Azul Nilo, Tetroxido de osmio, Rodamina o Safranina, (ii) detergente, sal de amonio cuaternario o saponina para mejorar la penetracion de la membrana plasmatica celular con la mezcla de DES, tal como SDS, lauril sulfato de sodio (SLS), bromuro de cetiltetrabutilamonio (CTAB), bromuro de tetrabutilamonio (TBAB), desoxicolato de sodio, Brij-35, Brij-58, NP-40, Triton X-100, Triton X-1l4, Tween-20, Tween-80, Octil beta-glucosido, CHAPS, Solanina, (iii) antimicrobiano, tal como un antibiotico o antiseptico, tal como kanamicina, estreptomicina o penicilina, nitrato de sodio, nitrito de sodio o benzoato de sodio, iv) precipitante de protemas como Acido tricloroacetico, Sulfato de amonio, Acido sulfosalidclico, Sal de cinctal como ZnCl2 o ZnSO4, (v) desecante para eliminar el exceso de agua de la mezcla de DES tal como Tamices moleculares 4A, gel de sflice, CaCl2 o LiCl, (vi) una sonda, un acido nucleico complementario de hibridacion, un peptido, protema, acido nucleico o molecula marcada, un control interno, una secuencia de bloqueo o un acido nucleico portador tal como (a) secuencias de ARN o ADN hs o dh, (b) un peptido, enzima u otra protema tal como un anticuerpo, (c) moleculas para detectar un analito, tales como biotina, peroxidasa de rabano picante, avidina, estreptavidina, una molecula marcada fluorescentemente, tal como fluorescema, Rojo Texas, LNA marcado con Alexa Fluor™, (d) una Baliza molecular Molecular Beacon™, una sonda Scorpion™, (vii) un antioxidante para eliminar el oxfgeno de la muestra y reducir los efectos oxidativos daninos durante el almacenamiento en, por ejemplo, las nucleobases de ARN o ADN, tal como Vitamina C o glutationina, (viii) un inhibidor de la ribonucleasa, tal como RNasin, SUPERase^N™, RNaseOUT™, o un inhibidor de proteasa tal como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), fluorofosfato de diisopropilo (DFP), aprotinina o Pefabloc SC™, (ix) un tampon para estabilizar el pH entre 5 y 8 o mas preferiblemente entre 6 y 7, utilizado en el intervalo de 0,5 a 20 mM tal como Tris-HCl, PIPES, MES, HEPES, MOPS, MOPSO, CAPS, CAPSO, BIPES, fosfato, imidazol, (x) quelantes para eliminar cationes metalicos divalentes, utilizados en el intervalo de 0,5-20 mM, tales como BAPTA, EDTA, EGTA, acido cftrico, D-Penicilamina, (xi) oxfgeno disuelto (en el intervalo de concentracion final de 2-20%), y/o CO2 (en el intervalo de concentracion final de 0,01-5%, un gas no reactivo como Argon (en el intervalo de concentracion final de 1-20%) y/o un tampon, nutrientes (tales como glucosa y aminoacidos) para mejorar la viabilidad de las celulas, tejidos y organismos, y/o (xii) un alcohol en el intervalo de 1-20% (p:p) para reducir la viscosidad del DES, tal como terc-butanol.

Un "aditivo" se define en la presente memoria como cualquier sustancia que se puede disolver en una mezcla de DES concreta, y puede estar presente en cantidades mayores, iguales o menores que la cantidad total de la mezcla de DES (peso:peso). Solo a modo de ejemplo, Cloruro de colina:Urea:Cloruro de cinc (1:2:0,5 mol:mol:mol), el ZnCl2 es un aditivo, o Cloruro de colina:Trifluoracetamida:Urea (1:2:0,1 mol:mol:mol), la urea es un aditivo. Tambien se debe tener en cuenta que el aditivo no tiene necesariamente ningun efecto concreto en el punto de congelacion de la mezcla de DES ni forma enlaces de hidrogeno con ninguno de los componentes de DES, sino que otorga a la mezcla de DES una propiedad unica.

Una lista no exhaustiva de posibles aditivos para una mezcla de DES son: Sal de amonio de acido ptoluenosulfonico, Sal de sodio de acido p-toluenosulfonico, Sulfato de amonio, Cloruro de amonio, Tiosulfato de amonio, Dodecilsulfato de sodio, Laurilsulfato de sodio, Benzoato de sodio, Hidroxido de dodecildimetil(3-sulfopropil)amonio, Acido dimetilbencenosulfonico, Rojo Congo, Giemsa, DAPI, Bromuro de etidio, Tincion de Mallory, Orcema, Fucina aldehfdica, Tetroxido de osmio, Trioxido de cromo, Acido cromico, Feulgen, Dicromato, Cloruro mercurico, Tincion de Hematoxilina y Eosina (H y E), Formaldelddo, Glutaraldehfdo, Acetona, Etanol, Metanol, Bromuro de metiltrifenilfosfonio, Bromuro de cetiltetrabutilamonio (CTAB), Bromuro de tetrabutilamonio (TBAB), Desoxicolato de sodio, Brij-35, Brij-58, NP-40, Triton X-100, Triton X-104, Tween-20, Tween-80, Octil beta glucosido, CHAPS, Solanina, kanamicina, estreptomicina o penicilina, nitrato de sodio, nitrito de sodio o benzoato de sodio, secuencias de ARN o ADN hs o dh, secuencias marcadas de ARN o ADN hs o dh, un aptamero, un peptido, enzima, anticuerpo, biotina, molecula marcada con biotina, peroxidasa de rabano picante, avidina, estreptavidina, GFP o una variante de la misma, Luciferasa, Fluorescema, Rodamina, Rojo Texas, Rojo Texas, Alexa Fluor™, LNA, LNA marcado, una Baliza molecular "Molecular Beacon™", una sonda Scorpion™, una sonda FISH, ADNb, cebador de PCR, oligo (dT), PNA, antioxidante, RNasin, SUPERase^N™, RNaseOUT™, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), fluorofosfato de diisopropilo (DFP), aprotinina o Pefabloc SC™, Tris-HCl, PIPES, MES, HEPES, MOPS, MOPSO, CAPS, CAPSO, BIPES, fosfato, imidazol, BAPTA, EDTA, EGTA, acido dtrico, D-Penicilamina, O2, CO2, N2, Argon, propanol, terc-butanol, Acido tricloroacetico, acido sulfosalidclico, Agua, Metanol, Etanol, Propanol, Butanol, Tetrametil urea, Imidazol, 1-Metilimidazol, 1-Etilimidazol, 1-Bencilimidazol, 4-Metilimidazol, N-Metilpirrolidona, N-Etilpirrolidona, N-Bencilpirrolidone, Guanidina, Guanidina HCl, Isotiocianato de guanidina, Ribitol, Ramnosa, Trehalosa, D-Sorbitol, L-Sorbitol, Sorbosa, Xilitol, Glucosa, Sacarosa, Lactosa, Fructosa, Maltosa, Manosa, Manitol, Arabinosa, Galactosa, Rafinosa, Inositol, Eritritol, Xilosa, Acetato de cinc, Sal de cinc de EDTA, Fosfato de cinc, Trifluoroacetato de cinc, Citrato de cinc, Sal de cinc de PTSA, Gluconato de cinc, Cloruro de cinc y/o Sulfato de cinc. Los aditivos no solubles para las mezclas de DES incluyen, pero no estan limitados a, Parafina, Gel de sflice, Sulfato de sodio o Tamices Moleculares "Molecular Sieves™", Poliacrilamida, Aerogel, Poli(acido acnlico) y/o Punto Cuantico "Quantum Dot".

Se ha encontrado que la adicion de etanol u otros alcoholes tales como el metanol y el isopropanol a un Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) tiene una fuerte influencia negativa en la estabilidad del ARN (vease la Tabla 2). No se entiende por que el etanol en particular tiene un impacto tan negativo en la estabilidad del ARN, pero un cambio en el enlace de hidrogeno de la Trifluoroacetamida con Cloruro de colina puede ser una explicacion parcial. En cualquier caso, es preferible evitar el uso de etanol a una razon molar superior a 0,1 en comparacion con el Componente 1 (Cloruro de colina). Sin embargo, si se desea procesar o almacenar muestras de tejido que se hayan tratado con la mezcla de DES en etanol u otro alcohol, el exceso de mezcla de DES se puede eliminar de la muestra de tejido con un papel absorbente, lavar dos veces en etanol del 100% antes de dejar el tejido durante penodos mas largos, esto anula el efecto negativo sobre la estabilizacion del ARN. Alternativamente, se puede utilizar el mismo metodo para reemplazar la primera mezcla de DES por una segunda mezcla de DES, por ejemplo, se puede reemplazar una mezcla de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) por un Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) u otra mezcla de DES que puede ser preferible para ciertas aplicaciones que implican la estabilizacion de ARN. Alternativamente, la muestra biologica, una vez extrafda de la mezcla de DES, se puede colocar en un ambiente desecante tal como en un recipiente hermetico que contiene Tamices moleculares, Drierita, un azucar seco (p.ej., trehalosa, xilitol o sorbitol), RNAstable® (Biomatrica, EE.UU.) o Cloruro de calcio para fines de almacenamiento. Otra alternativa mas es colocar la muestra biologica tratada en un medio de almacenamiento Kquidotal como alcohol (p.ej., metanol, etanol, propanol o butanol), RNALater (Life Technologies, EE.UU.), AllProtect (Qiagen, Alemania), tejido PAXgene, Sangre PAXgene, (PreAnalytix, Alemania), ARN GenTegra (Integenx, EE.UU.), Ar N sin celulas BcT® (Streck, EE.UU.) o Conservante CellSave (Veridex, EE.UU.). Como otra alternativa, la muestra, despues del tratamiento con la mezcla de DES, se puede transferir a una solucion de un fijador de entrecruzamiento, tal como diez volumenes de una solucion al 4% de formaldetudo o glutaldetudo, y dejar incubando durante un tiempo apropiado, por ejemplo, 15 minutos. 24 horas. Aunque el tratamiento de la muestra con un agente de entrecruzamiento tendra un efecto negativo sobre la calidad del ARN, el ADN y las protemas, el tratamiento puede mejorar la rigidez de la muestra para la preparacion de portaobjetos y su comportamiento en ciertos ensayos tales como la inmunohistoqmmica empleando anticuerpos espedficos para epttopos de protemas tratados con formalina. Otra alternativa es tratar previamente la muestra con diez volumenes de una solucion al 4% de formaldetudo o glutaldehfdo y dejar incubando durante un tiempo apropiado, por ejemplo, de 15 minutos a 24 horas, antes de retirar la muestra y anadirla a diez volumenes de mezcla de DES tal como Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) durante 15 minutos a 24 horas.

Preferiblemente, se evita el uso o la presencia de agua para reducir el riesgo de hidrolisis del analito, en particular hidrolisis de ARN, ADN y protemas. Por lo tanto, la mezcla de DES contiene 50% o menos, mas preferiblemente 40% o menos, incluso mas preferiblemente 30% o menos, aun mas preferiblemente 20% o menos, incluso mas preferiblemente 10% o menos, incluso mas preferiblemente 5% o menos y lo mas preferiblemente menos de 2% de agua (porcentaje en peso) para aplicaciones que requieren estabilizacion de ARN, ADN o protemas. Para la estructura celular y la morfologfa, y la fijacion del tejido, la mezcla de DES puede contener 50% o menos, mas preferiblemente 40% o menos, mas preferiblemente 30% o menos, mas preferiblemente 20% o menos, mas preferiblemente 10% o menos pero lo mas preferiblemente entre 10% y 5% de agua (porcentaje en peso).

Para una estabilizacion optima del ARN, se ha encontrado que es preferible la adicion de un desecante a la mezcla de cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol). Los desecantes adecuados incluyen gel de sflice, poliacrilamida, sulfato de sodio, Drierite™ y tamices moleculares. Un desecante preferido para la estabilizacion de ARN es el tamiz Molecular tipo 4A (en polvo o en forma de granulos, tal como Malla 4-12), utilizado con un peso de 5 a 50% en peso con la mezcla de DES, preferiblemente mezcla de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol). Una ventaja adicional es que se ha encontrado que los tamices moleculares reducen la cristalizacion que se produce en la mezcla de cloruro de Colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol).

Resultara evidente que se pueden preparar muchos tipos de mezclas de DES y la eleccion de un DES particular con el fin de preservar el ARN en una muestra estara determinada por una o mas de las siguientes caractensticas preferibles del DES: (1) compatibilidad con el ARN, preferiblemente debe tener un pH entre pH 4,5 y 8,5, mas preferiblemente entre pH 5 y 8, mas preferiblemente entre pH 5,5 y 7,5 y mas preferiblemente entre pH 6 y 7 cuando se mezcla con la muestra, (2) compatibilidad con los reactivos y el protocolo de purificacion de ARN, por ejemplo, no debe interferir con la union entre el ARN y la columna de sflice tal como RNeasy (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat.

74106, Qiagen, Alemania) o alterar la particion del ARN en fenol que contienen reactivos tales como TRIzol (Num. de Cat. 15596018 Life Technologies, E^e.UU.), (3) estabilizacion del ARN en la muestra de tejido con la suficiente rapidez como para alterar sustancialmente la actividad de las ribonucleasas y/o la accesibilidad del ARN a la hidrolisis. Como alternativa, el ARN se estabiliza en el tejido lo suficientemente rapido como para que el Numero de Integridad del ARN (RIN) no se reduzca en mas de 2 unidades de RIN, mas preferiblemente no mas de 1 unidades de RIN, aun mas preferiblemente no mas de 0,5 unidades de RIN y lo mas preferiblemente menos de 0,1 unidades de RIN durante el almacenamiento inicial de 18-24 horas con la mezcla de DES a temperatura ambiente en comparacion con el ARN extrafdo de una muestra de tejido fresco, sin almacenamiento, del mismo tipo, (4) tener una capacidad para estabilizar el ARN cuando el tejido representa al menos 10%, mas preferiblemente 20% e incluso mas preferiblemente al menos 50% del peso de la mezcla de DES (peso:peso), (5) no reducir el rendimiento de ARN en mas del 20% en comparacion con el tejido fresco, (6) proporcionar estabilizacion del ADN, las protemas y los grupos fosfato de las fosfo-protemas, (7) ser qmmicamente estables, no inflamables, no toxicos para el usuario y el medio ambiente, biodegradables, no reaccionar con lejfa o reactivos utilizados durante la purificacion del ARN para formar compuestos toxicos, (8) tener una vida util de al menos 6 meses a temperatura ambiente, (9) fijar y estabilizar la morfologfa e histologfa de las celulas nativas, incluidos los epftopos de anticuerpos y la organizacion subcelulary los organelos, a la vez que estabiliza el ARN y otras biomoleculas, (10) fijar y estabilizar las celulas de manera que permita posteriormente aplicaciones histologicas e inmunohistoqmmicas, por ejemplo, con anticuerpos y tintes como Hoechst o H y E, (11) estabilizar el ARN en muestras de FFPE para proteger y mejorar la reversion del entrecruzamiento con formalina a temperaturas superiores a 50°C y permitir la fusion y, por lo tanto, la facil eliminacion de la parafina de la muestra fijada, (12) fijar y estabilizar las celulas tumorales circulantes en sangre completa para permitir su purificacion, deteccion y analisis molecular.

La estabilizacion del ARN en la muestra puede ser un resultado del tratamiento con DES, o una combinacion del tratamiento con DES con otro proceso ffsico tal como la inactivacion de las ribonucleasas, la precipitacion de protemas celulares y acido nucleico como resultado del desplazamiento de las moleculas de agua o la entrada del DES disuelto en la estructura celular del tejido y que conduce a la estabilizacion del ARN o una combinacion de estos. La modificacion o alteracion de los enlaces de hidrogeno en y alrededor de la celula y el ARN, mediante DES, puede ser un factor importante para la biomolecula observada y la estabilizacion celular como se establece en esta descripcion, sin embargo, aun no se conoce el mecanismo exacto por el cual las mezclas de DES pueden estabilizarse.

La muestra o el tejido que contiene el analito puede ser un (i) lfquido tal como sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqmdeo (LCR), esputo, semen, lavado broncoalveolar (LBA), lfquido amniotico, leche y orina, (ii) solido tal como tejidos corporales (hfgado, bazo, cerebro, musculo, corazon, esofago, testmulo, ovarios, timo, rinones, piel, intestino, pancreas, glandulas suprarrenales, pulmones, hueso y medula osea), (iii) clmica para un examen medico tal como una muestra de prostata, mama o cancer, tumor o biopsia, incluida una muestra de FFPE, celulas tumorales circulantes, analisis de sangre, frotis clmicos, sangre seca, exosoma, microvesmulas (iv) tejidos animales derivados de investigacion biomedica o biologfa fundamental (mono, rata, raton, pez cebra, Xenopus, Drosophila, nematodo, levadura) y de sus diversas etapas de desarrollo (huevo, embrion, larva, adulto), (v) celulas de tejidos y cultivos de tejidos utilizados para el descubrimiento de farmacos, (vi) microbios patogenos y no patogenos tales como hongos, arqueobacterias, bacterias grampositivas y gramnegativas, incluyendo E. coli, Staphylococcus, Streptococcus, Mycobacterium, Pseudomonas y bacterias que causan Shigelosis, Difteria, Tetanos, Sffilis, Chlamydia, Legionella, Listeria y Lepra, (vii) viroides patogenos o no patogenos, bacteriofagos o virus que se encuentran en una variedad de muestras biologicas tales como bacterias, plantas, sangre, tejidos humanos, sangre de animales, suero, plasma y tejidos, y muestras clmicas, (viii) plantas tales como hojas, flores, polen, semillas, tallos y rafces de arroz, mafz, sorgo, palma, vides, tomate, trigo, cebada, tabaco, cana de azucar y Arabidopsis, (ix) tejidos fijados tales como tejidos FFPE y biopsias que con frecuencia requieren protocolos especializados para extraer acidos nucleicos de alta calidad, (x) material potencialmente patogeno asociado con amenazas de bioterrorismo tales como antrax que puede necesitar ser transportado o no desde el sitio de descubrimiento hasta la instalacion de prueba, (xi) muestras extremadamente pequenas tales como las derivadas de muestras de Microdiseccion por Captura Laser (LCM), (xii) muestras de alimentos que pueden contener enfermedades transmitidas por los alimentos, (xiii) muestras de suelo. Debe observarse que la muestra no puede obtenerse unicamente de muestras obtenidas biologicamente, sino tambien de smtesis qrnmica o enzimatica, tales como moleculas copiadas basadas en acido nucleico o productos de amplificacion tales como el ARN transcrito in vitro y productos de PCR, oligodesoxirribonucleotidos y oligoribonucleotidos, PNA y LNA. No existe una limitacion concreta para el tipo de muestra que se puede utilizar con esta invencion.

La descripcion tambien es util para la estabilizacion de los controles internos (CI) y patrones de ARN, ADN y protemas, tales como los que se incluyen en los kits de diagnostico de VIH o VHC tales como Amplicor™ (Roche Molecular Diagnostics) o para el ARN portador que se puede incluir en tales kits de diagnostico. Para este uso, el CI de ARN se transporta y almacena comunmente con el resto de los componentes del kit, a menudo a temperatura ambiente o a 4°C, lo que puede conducir a la degradacion. La estabilizacion del CI de ARN o del ARN portador mejora el comportamiento del kit y mantiene su integridad durante el transporte y almacenamiento.

Utilmente la invencion se puede utilizar para preservar virus de ARN de hebra sencilla y/o doble, incluyendo virus de ARN animales tales como Norwalk, Rotavirus, Poliovirus, Virus del Ebola, Virus Marburg, Virus Lassa, Hantavirus, Rabia, Influenza, Virus de la fiebre amarilla, Coronavirus, SARS, Virus del Nilo occidental, Virus de la hepatitis A, C (VHC) y virus E, Virus de la fiebre del Dengue, toga (p.ej., Rubeola), Rabdo (p.ej., Rabia y VSV), Picorna (Polio y Rinovirus), Myxo (por ejemplo, Influenza), Retro (p.ej. VIH, HTLV), bunya, corona y reovirus que tienen efectos profundos en la salud humana, incluyendo virus de tipo viroide tales como virus de la hepatitis D y virus de ARN de plantas y viroides tales como Tobus-, Luteo-, Tobamo-, Potex-, Tobra- Como-, Nepo-, Almo-, Cucumo-, Bromo-, Ilarvirus, viroide cadang-cadang de Coco y el viroide del tuberculo fusiforme de la patata, que tienen profundos efectos en la produccion agncola, pueden degradarse antes, durante o despues de la extraccion con fines de deteccion diagnostica. La invencion tambien se puede utilizar para estabilizar bacteriofagos de ARN monocatenario tales como el genero Levivirus que incluye el fago MS2 de Enterobacteria y el genero Allolevivirus que incluye el fago Qp de Enterobacteria, o un bacteriofago de ARN bicatenario tal como Cystovirus incluyendo el fago Pseudomonas 06 u otros tipos de fagos tales como los utilizados como controles de ^aRⁿinterno para aplicaciones de diagnostico, tales como los utilizados en Armored ARN® (Ambion). La invencion tambien puede utilizarse para estabilizar secuencias de ARN o ADN de control interno (CI) para su uso en kits de diagnostico, mezclando un DES con un acido nucleico puro.

La invencion tambien se puede utilizar para estabilizar muestras para el analisis de miARN, ARNip y otras moleculas pequenas de ARN de origen natural, tales como snRNA, snoRNA, ncRNA, snoRNA, piRNA y rasiRNA. Tambien se puede utilizar para estudios, diagnosticos y terapias que implican ARN sintetico de tipo ARNi.

Utilmente, la invencion se puede utilizar para preservar ARN viral tal como retrovirus, p.ej.. VIH, rotavirus, VHC y Virus del Nilo Occidental en mezclas de guanidina y sangre, suero, celulas plasmaticas y otros tipos de muestras de importancia medica, tales como celulas ytejidos.

Se ha encontrado que ciertas mezclas de DES, especialmente Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) tienen una fuerte actividad antimicrobiana (Ejemplo 34), lo que hace que la muestra sea mas segura para trabajar y transportar. Otras aplicaciones incluyen estabilizar y fijar muestras de suelo y/u otras muestras ambientales que pueden haber sido contaminadas deliberadamente con toxinas, virus, bacterias y/o hongos para su posterior transporte y analisis de laboratorio de ARN, ADN y/o protemas.

Por lo tanto, esta invencion se refiere a metodos para mejorar el almacenamiento, la conservacion, el archivo y el transporte, para proteger el ARN de la degradacion, para aumentar su estabilidad y, como consecuencia, para mejorar la sensibilidad analttica y la calidad del ensayo.

Resultara evidente para un experto en la tecnica que se pueden someter a ensayo varios DES para determinar su idoneidad en esta invencion anadiendolos a la muestra en una proporcion de al menos 10:1 (peso:peso) como se establece en el Ejemplo 1. Se pueden hacer comparaciones de estabilizacion relativa de ARN utilizando una solucion de control de RNAlater (10:1 (vol:peso) utilizada de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Num. de Cat. 76106, Qiagen, Alemania). Despues de la incubacion a, por ejemplo, 37°C durante un dfa o mas, el ARN se extrae de acuerdo con un protocolo convencional tal como RNeasy (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania) y su integridad se analiza mediante electroforesis en gel o mediante el uso de un kit de ARN total RNA 6000 Nano (Num. de Cat. 5067-1511, Agilent Technologies, EE.UU.) y Bioanalyser 2100 u otro metodo adecuado tal como RT-qPCR como se describe. Los rendimientos de ARN se pueden determinar mediante Espectrometna uv DO260nm y pureza mediante las proporciones OD260/230 y OD260/280 bien conocidas. Un Nanodrop ND2000 (ThermoScientific Inc., EE.UU.) es un ejemplo de un espectrometro adecuado para dicha determinacion. Una vez que las mezclas de DES adecuadas han sido identificadas, su cantidad, pureza, cantidad de agua contaminante y uso optimos se pueden determinar mediante tales pruebas adicionales.

En general, el factor unico mas importante para la optimizacion es la razon molar relativa de los componentes individuales en la mezcla de DES. En primer lugar, mezclar solo dos componentes de la mezcla de DES es el medio mas directo para identificar aproximadamente, y por medios empmcos como se describio anteriormente, los componentes que producen el efecto deseado, tales como la estabilizacion del ARN, el rendimiento, la pureza y la idoneidad para aplicaciones posteriores tales como RT-PCR o hibridacion. Sin embargo, tambien sera evidente para un experto en la tecnica que puede ser deseable una mezcla de mas de dos componentes para mejorar o anadir nuevas propiedades a la mezcla de DES. Obviamente, hay una gran cantidad de posibles mezclas de componentes que pueden llevar a una mezcla de DES, y aunque es mas facil comenzar con la preparacion, en primer lugar, de proporciones molares estequiometricas simples de los componentes de DES tal como, por ejemplo, a traves de solo por ejemplo, una razon molar 2:1, 1:1 o 1:2 (mol:mol) de Cloruro de colina y Urea. Se cree que la depresion en el punto de congelacion de las mezclas de DES de dos componentes esta dictada, al menos en parte, por el enlace de hidrogeno entre el donador de enlace de hidrogeno disponible (p.ej., cloruro de colina) y el aceptor (p.ej., urea). Sin embargo, se debe tener en cuenta que los componentes preferidos de la mezcla de DES y su razon de mezcla optima para una aplicacion concreta, tal como la preservacion de ARN o la fijacion celular, no estan necesariamente relacionados con la extension de la depresion del punto de congelacion observada. Por lo tanto, la identificacion de la mezcla de DES optima para una aplicacion se debe determinar empmcamente y, por consiguiente, pueden estar implicados ensayos de prueba y error. Sera evidente que la identificacion de la mejor mezcla para un proposito concreto de una mezcla de DES de mas de dos componentes puede implicar un esfuerzo significativo. Por lo tanto, en el primer caso y con el fin de definir rapidamente las razones molares adecuadas de los componentes, se pueden utilizar razones estequiometricas como se describio anteriormente. Una vez que se han identificado las razones molares aproximadas, se puede realizar un refinamiento adicional que implica la fijacion de la cantidad molar de un componente mientras se vanan los otros dos o mas. Cabe senalar que la molaridad de los diversos componentes del DES es variable y depende de la densidad, las razones molares y el peso molecular de los componentes individuales. A modo de ejemplo, la concentracion de cloruro de colina en una mezcla de Cloruro de colina:Urea (1:2) es de aproximadamente 5 M y la de la Urea 10 M, en comparacion con una concentracion de Cloruro de colina de 3,6 M y una Trifluoroacetamida de 7,2 M en una mezcla de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2).

La integridad de las protemas y las fosfo-protemas se puede determinar mediante PAGE 2-D preparativa o analftica, espectrometna de masas, anticuerpos anti-fosfo adecuados y ELISA como se describe en Proteome Characterization and Proteomics (2003) editado por Timothy D. Veenstra, Richard D. Smith.

Los metodos para recuperar la muestra de una mezcla lfquida viscosa de DES incluyen fijarla o unirla a un recuperador, tal como un alambre, un alfiler, un cepillo, un testigo, una malla, un inserto, atrapandolo entre dos membranas permeables o entre dos lechos polimericos que contienen suficiente DES para permitir una eficaz estabilizacion y/o fijacion de DES o el uso de un soporte de plastico moldeado capaz de sujetar la muestra durante el tratamiento. Preferiblemente, cualquier remanente de la mezcla de DES con la muestra de tejido es facilmente soluble en la solucion de lisis de ^aRⁿtal como RLT (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania), y no afecta al rendimiento de ARN o lo incrementa, no hace que la muestra precipite fuera de la solucion y, si se traslada con la muestra de ARN, no tiene ningun efecto ni mejora las aplicaciones sensibles posteriores, tales como la RT-qPCR. Los metodos para determinar los cambios en el rendimiento y la calidad del ARN son bien conocidos e incluyen metodos espectrofotometricos, el kit de ARN total ARN 6000 Nano (Num. de Cat. 5067-1511, Agilent Technologies, EE.UU.) con la cuantificacion Agilent Bioanalyser 2100 y/o RT-qPCR.

Los resultados expuestos en esta descripcion utilizando mezclas de DES son particularmente sorprendentes, ya que es bien sabido que las nucleasas tienen requisitos muy amplios para la actividad, por ejemplo, la Ribonucleasa A es una nucleasa robusta que esta activa a pH 4-10, temperaturas variables tales como 4 a 60°C, concentraciones de sodio de 0 - 3M, concentraciones de caotropo de guanidina de hasta 400 mM y pueden sobrevivir a ebullicion durante varios minutos (Raines (1998) Chem. Rev. 98:1045-1065). A pesar de ser muy diffcil de desactivar tales enzimas, el tratamiento con muchas mezclas diferentes de DES puede tener un efecto profundo sobre la actividad de la nucleasa con la consiguiente mejora en la calidad del ARN. Una explicacion es que los componentes de DES forman enlaces de hidrogeno con enzimas tales como las nucleasas y, en particular, las ribonucleasas, desplazando las moleculas de agua nativas alrededor de la enzima y conduciendo a la desnaturalizacion e inactivacion, y/o el ARN esta protegido dentro de complejos de ribonucleoprotemas tratados con DES desnaturalizados, tales como los ribosomas.

Sera evidente para un experto en la tecnica que la prueba de la eficiencia de un DES concreto para el almacenamiento de biomoleculas se puede llevar a cabo de varias maneras. En primer lugar, se puede anadir una cantidad conocida de DES a una cantidad fija de tejido pesado previamente, por ejemplo, 20 mg de hngado de rata congelado y descongelado e incubarse juntos durante penodos de tiempo variables, por ejemplo, 5, 10, 20, 40 y 60 horas a 37°C y despues de la incubacion, recuperar el tejido y recuperar el ARN u otra biomolecula mediante purificacion y analizar para determinar su integridad. La calidad del ARN se puede determinar, por ejemplo, mediante analisis de RT-qPCR o Bioanalyser 2100 (Agilent, EE.UU.).

Preferiblemente, la mezcla de DES tiene una vida util razonable despues de la preparacion, lo que significa que su actividad de estabilizacion no cambia significativamente durante el almacenamiento durante al menos seis meses o mas a temperatura ambiente.

La agitacion, el mezclado y la temperatura de la mezcla de DES con la muestra de tejido son factores importantes para la estabilizacion optima del ARN. La agitacion suave de la mezcla de DES alrededor de la muestra de tejido puede ayudar a aumentar la velocidad de estabilizacion de la muestra. Los medios para mezclar o agitar incluyen el uso de la funcion de mezcla del Thermomixer (Eppendorf, Alemania), una rueda o plataforma giratoria tal como LabRoller (LabNet, EE.UU.). Aunque la cantidad de degradacion de ARN observada con una mezcla de DES es limitada, inevitablemente se produce cierta degradacion durante el retraso entre la extraccion de la muestra de su entorno normal en el animal completo y cuando la mezcla de DES puede comenzar a reducir o inhibir completamente la actividad ribonucleasa. Con respecto a esta descripcion, una etapa clave es el retraso entre la adicion de la mezcla de DES a la muestra y la inactivacion de la ribonucleasa, y sera evidente que las ribonucleasas son mas activas a temperaturas de 25-37°C que a 4-16°C. Es preferible el enfriamiento previo del DES y el recipiente y el mantenimiento de esta temperatura reducida durante la etapa cntica del tratamiento del DES, aunque no es esencial para tejidos con niveles medios de ribonucleasa tales como el hngado de rata en comparacion con los tejidos que contienen niveles mas altos, tales como el pancreas de rata. La calidad del ARN se puede mejorar en tejidos quetienen una alta actividad ribonucleasa utilizando una temperatura reducida, tal como 4°C, de la mezcla de DES, el recipiente y el medio ambiente.

La eleccion adecuada de una mezcla de DES para conservar ARN en muestras biologicas depende de multiples propiedades ffsicas y qmmicas que se superponen. Idealmente, una mezcla de DES debena ser capaz de: (1) estabilizar rapida y eficazmente biomoleculas, incluyendo ARN, ADN, protemas, protemas modificadas posttraduccionalmente tales como fosfoprotemas, carbohidratos, lfpidos y metabolitos en una muestra biologica, (2) funcionar de manera optima para estabilizar biomoleculas tales como el ARN, cuando se anade en una razon 20:1 (peso/peso), mas preferiblemente 15:1, aun mas preferiblemente 10:1, aun mas preferiblemente 8:1, aun mas preferiblemente 6:1 aun mas preferiblemente 4:1, aun mas preferiblemente 3:1, aun mas preferiblemente 2:1 y lo mas preferiblemente una razon 1:1 con la muestra biologica, (3) ser un lfquido a menos de 120°C, aun mas preferiblemente a menos de 100°C, incluso mas preferiblemente a menos de 80°C, aun mas preferiblemente a menos de 60°C, y lo mas preferiblemente a temperatura ambiente, (4) no ser tan viscoso que trabajar con el y/o retirarlo de una muestra solida sea particularmente diffcil y tener una viscosidad a 25°C de menos de 100000 cP, incluso mas preferiblemente menos de 75000 cP, incluso mas preferiblemente menos de 50000 cP, incluso mas preferiblemente menos de 25000 cP, incluso mas preferiblemente menos de 10000 cP, incluso mas preferiblemente menos de 5000 cP, incluso mas preferiblemente menos de 2500 cP, incluso mas preferiblemente menos de 1000 cP, incluso mas preferiblemente menos de 750 cP, incluso mas preferiblemente menos de 500 cP, incluso mas preferiblemente menos de 250 cP, incluso mas preferiblemente menos de 100 cP, incluso mas preferiblemente menos de 75 cP, incluso mas preferiblemente menos de 50 cP, incluso mas preferiblemente menos de 25 cP, incluso mas preferiblemente menos de 10 cP y lo mas preferiblemente menos de 5 cP (5) tener compatibilidad con ARN y reactivos de purificacion de ARN tales como guanidina HCl, tiocianato de guanidina, tampon de lisis RLT (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania) columnas de centrifugado de sflice, esferas de sflice magneticas tales como MagNA Pure® (Roche Applied Science, Reino Unido), TRIzol® (Life Technologies, EE.UU.), (6) no reducir la union del ARN a una columna de sflice tal como RNeasy (Qiagen, Alemania) en mas de 20% y no disminuir la razon espectrofotometrica DO260/280 nm en mas de 0,2 en comparacion con una purificacion convencional, y (7) no sertoxico ni inflamable para el usuario incluso combinado con los reactivos de purificacion de ARN, (8) ser biodegradable y (9) no ser volatil.

Como ejemplo del uso del DES para la extraccion de ARN de muestras de FFPE, es bien sabido que la fijacion con formalina conduce a un entrecruzamiento multiple entre el ARN y las protemas, lo que hace que la posterior extraccion del ARN sea problematica y la calidad del ARN sea baja. El protocolo convencional para eliminar entrecruzamientos del ARN en una muestra de FFPE es calentarlo, por ejemplo a 80°C durante 15-60 minutos, sin embargo, esto causa una mayor degradacion del ARN (RNeasy FFPE Kit, Num. de Cat. 73504, Qiagen, Alemania). Al combinar DES con los reactivos necesarios para la reversion de los entrecruzamientos, el ARN puede protegerse durante la etapa de calentamiento esencial que conduce a una muestra de ARN de mejor calidad. Como ejemplo de un DES adecuado, se puede utilizar Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2) para tratar la muestra de FFPE a 80°C para eliminar la parafina y los enlaces cruzados del ARN.

Otro ejemplo del uso de DES en el campo medico es para el tratamiento de sangre completa para estabilizar las celulas tumorales circulantes (CTC). Estas celulas que derivan del tumor y a continuacion ingresan al torrente sangumeo se utilizan cada vez mas con fines de diagnostico, pronostico y terapeuticos, y tambien como criterios de valoracion para numerosas pruebas clmicas de farmacos quimioterapeuticos. Sin embargo, la estabilizacion de estas celulas en la sangre completa es problematica, por lo que el envfo de la sangre del paciente puede llevar a la perdida o dificultad para identificar correctamente las CTC y/o realizar analisis de diagnostico molecular. Utilizando una mezcla de DES para estabilizar las CTC en sangre completa in vitro supera muchos de estos inconvenientes de la tecnologfa actual de conservacion de CTC. Solo a modo de ejemplo, las CTC en sangre completa se pueden tratar con al menos seis volumenes de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) para reparar las celulas y preservar el ARN. A continuacion, las CTC se pueden recolectar y purificar utilizando cualquiera de varios metodos diferentes, como CellSieve ™ (MD, EE.UU.).

La invencion se describira con mas detalle, solo a modo de ejemplo, con referencia a los siguientes Ejemplos y Dibujos.

Breve descripcion de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B muestran un aparato de acuerdo con la invencion en el que una mezcla de DES esta dispuesta en viales tapados;

La Figura 1C muestra un aparato de referencia no de acuerdo con las presentes reivindicaciones en el que una mezcla de DES esta dispuesta en un vial tapado;

La Figura 2 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en muestras de ARN extrafdas de acuerdo con la invencion y la tecnica anterior;

La Figura 3 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ARN estabilizado en un DES de acuerdo con la invencion en un intervalo de temperatures;

La Figura 4 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa sobre el ARN conservado en el tejido de acuerdo con la invencion o la tecnica anterior;

Las Figuras 5A y B muestran los resultados de la electroforesis de agarosa en ARN estabilizado en muestras de tejido de raton utilizando un DES de acuerdo con la invencion y la tecnica anterior;

La Figura 6 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa sobre ARN conservado en cantidades variables de tejido de acuerdo con la invencion y la tecnica anterior;

La Figura 7 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ARN purificado a partir de sangre completa estabilizada con DES enriquecida con celulas HeLa;

La Figura 8 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ARN estabilizado en sangre completa enriquecida con celulas HeLa durante 18 horas antes de la extraccion;

La Figura 9 muestra la estabilizacion del ARN en sangre completa con guanidina o cloruro de colina:trifluoracetamida;

La Figura 10 muestra imagenes de microscopio optico de celulas HeLa fijadas con cloruro de colina:trifluoroacetamida de acuerdo con la invencion;

La Figura 11 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ARN degradado en muestras de tejido en ausencia de cualquier estabilizador;

La Figura 12 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ADN genomico estabilizado en celulas HeLa de acuerdo con la invencion o la tecnica anterior;

La Figura 13 muestra los resultados de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida en una proterna del hngado de raton estabilizada de acuerdo con la presente descripcion o tecnica anterior;

La Figura 14 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ADN y ARN de celulas HeLa estabilizadas y, opcionalmente sometidas a una etapa de procesamiento antes de la purificacion;

La Figura 15 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ARN y ADN cuya integridad se mide despues de la fijacion de acuerdo con la invencion o el estado de la tecnica;

La Figura 16 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ARN de embriones de Drosophila melanogaster tratados de acuerdo con la invencion o la tecnica anterior; y

La Figura 17 muestra los resultados de la electroforesis en gel de agarosa en ARN de brotes de hojas de Allium cepa estabilizado de acuerdo con la invencion o la tecnica anterior.

Ejemplos

1. Estabilizacion del ARN en muestras detejidos animales

A 400 |jl de Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) en un tubo de microcentnfuga de polipropileno de 1,5 ml convencional se le anadieron de 2 a 25 mg de muestra de hngado de rata y se preincubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la estabilizacion y/o fijacion, la muestra se puede incubar en la mezcla de DES a -80, -20, 4, 20 o 37, 42 o 55°C durante una hora a varias semanas antes de la recuperacion de la muestra de tejido con forceps seguida de una purificacion de ARN como se establece a continuacion .

La velocidad de fijacion para algunos tejidos densos, llenos de aire y/o problematicos puede mejorarse utilizando un sistema de vacfo tal como una bomba de vacfo manual Nalgene (Num. de Cat. 6132-0020, ThermoScientific, Reino Unido) durante la fijacion.

La muestra se anade a continuacion a un tubo nuevo que contiene 350 j l de tampon de lisis RLT, el tejido se homogeneiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania). Las porciones de 300 j l del producto lisado se purificaron inmediatamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyeron en 20-50 |jl de agua. El rendimiento y la pureza del ARN se compararon a continuacion mediante DO 260/280nm y la integridad del ARN se determino mediante RT-qPCR utilizando cebado con ADNc oligo dT y cebadores de ^pC^rde p-actina (QuantiTect SYBR Green PCR Kit, Num. de Cat. 204141, Qiagen, Alemania) y un LightCycler (Roche Applied Science, Francia) o mediante la obtencion del Numero de Integridad del A^rN (RIN) mediante el uso de un kit de ARN total RNA 6000 nano (numero de catalogo 5067-1511, Agilent Technologies, EE.UU.) y un aparato Bioanalyzer 2100 (Num. de Cat. G2939AA, Agilent Technologies, EE.UU.).

Otros tipos de kits de purificacion de ARN comercializados pueden reemplazar al kit RNeasy y no hay ninguna limitacion concreta sobre el tipo de kit utilizado.

La muestra de hngado se puede reemplazar por otros tipos de tejidos y celulas, tales como hngado, bazo, cerebro, musculo, corazon, esofago, testfculo, ovario, timo, rinones, piel, intestino, pancreas, glandulas suprarrenales, pulmones, medula osea o celulas tales como celulas COS-7, NIH/3T3, HeLa, 293 y CHO o incluso muestras lfquidas tales como suero, plasma o sangre.

Figura 2. A Imagen de electroforesis en gel de agarosa-EtBr al 1% de muestras de ARN de 300 ng extrafdas utilizando un kit RNeasy: Calles 1-5; estabilizado con Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) o calles 6-10 estabilizado con RNAlater (Num. de Cat. 76106, Qiagen, Alemania) en 15 mg de hugado de rata almacenado durante 5 minutos (Calles 1 6), 1 dfa (Calles 2) 7), 3 dfas (Calles 3 8), 7 dfas (Calles 4 9) o 21 dfas (Calles 5 10). Se puede observar que despues del almacenamiento a 37°C hay una estabilidad mejorada del ARN en muestras estabilizadas con Cloruro de colina:Urea en comparacion con RNAlater, a modo de comparacion despues de 7 dfas, el Numero de Integridad del ARN para la muestra de Cloruro de colina:Urea fue RlN=8, mientras que para las muestras estabilizadas con RNAlater el RIN=5,10.

2. Estabilizacion de ARN en muestras de tejidos animales utilizando otras mezclas de DES a base de cloruro de colina

A 400 j l de cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) o Cloruro de colina:Sorbitol (1:1 mol:mol) en un tubo de microcentnfuga de polipropileno de 1,5 ml convencional se anadieron 2-25 mg de muestra de hngado de rata y se preincubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la estabilizacion y/o fijacion, la muestra puede incubarse a -80, -20, 4, 20 o 37, 42 o 55°C durante una hora o varias semanas antes de la recuperacion de la muestra de tejido con forceps seguida de purificacion de ARN como se establece en el siguiente ejemplo.

A continuacion, la muestra se anade a un tubo nuevo que contiene 350 j l de tampon de lisis RLT, el tejido se homogeneiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania). Las porciones de 300 j l del lisado se purificaron inmediatamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyeron en 20-50 j l de agua. El rendimiento y la calidad del ARN se determinaron segun lo establecido en el Ejemplo 1 y la Tabla 1, y para ambas mezclas DES, la integridad del ARN fue superior en comparacion con RNAlater.

Una fuente apropiada de Cloruro de colina es el Num. de Cat. 110295000, Acros Organics, Francia, el Sorbitol es el Num. de Cat. S0065, TCI, Belgica y de Trifluoroacetamida es Num. de Cat. T0598, TCI, Belgica.

3. Estabilizacion del ARN en muestras de tejidos animales utilizando otras mezclas de DES

A 400 j l de las siguientes mezclas de DES en un tubo de polipropileno de 2 ml se les anadieron de 5 a 15 mg de tejido de rata (reserva de tejido congelado), despues de una etapa de fijacion de 20 minutos, la muestra se incubo a 37°C durante 18 horas antes de la extraccion/purificacion de ARN utilizando un kit RNeasy Micro (Num. de Cat.

74004, Qiagen, Alemania). Ya sea la mezcla de DES solida o lfquida a temperatura ambiente, el rendimiento del ARN despues de la extraccion y la calidad del ARN estan en una escala de 1-10 (indicando 0 que no hay estabilizacion e indicando 10 que no hay degradacion, en comparacion con la calidad del ARN del ^aRⁿextrafdo inmediatamente de una muestra fresca de tejido de hngado de rata = 10). Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuacion (nd = no determinado, la solucion 'Saturada' no es un DES).

Tabla 1. Estabilizacion de ARN en tejido animal utilizando una mezcla de DES de dos componentes.

Componente 1 Componente 2 Razon Liquido a Rendimiento de Calidad de mol:mol 24°C ARN ng/pl ARN 0-10 1 Cloruro de colina Urea 2:1 No 120 8 2 Cloruro de colina Urea 1:1 No 185 7 3 1Cloruro de colina Urea 1:2 Sf 221 7 Componente 1 Componente 2 Razon Liquido a Rendimiento de Calidad de mol:mol 24°C ARN ng/pl ARN 0-10 * Cloruro de colina Agua 6M Saturado 42 3 * Agua Urea 5M Saturado 0 0 Cloruro de colina Glicerol 1:2 Sf 62 4 Cloruro de colina Etilenglicol 1:2 Sf 26 3 Cloruro de colina Hexanodiol 1:2 No 94 8 Cloruro de acetilcolina Urea 1:2 Sf 156 9 0 Cloruro de acetilcolina Trifluoroacetamida 1:2 Sf 76 5 1 Cloruro de colina Acido malonico 1:1 Sf 152 1 2 Cloruro de (2-cloroetil) Urea 1:2 No 172 5 trimetilamonio

3 Cloruro de colina Trehalosa 1:1 No 285 7 4 Cloruro de colina Xilitol 1:1 Sf 236 9 5 Cloruro de colina Sorbitol 1:1 Sf 395 9 6 Cloruro de colina Isotiocianato de guanidina 1:2 No 75 7 7 Urea Isotiocianato de guanidina 1:2 No 10 0 8 Cloruro de colina Acido fenilacetico 1:1 Sf 250 3 9 Cloruro de colina ZnCl2 1:2 No 173 7 0 Carnitina Trifluoroacetamida 1:2 Gel 87 5 1 Taurina Trifluoroacetamida 1:2 No 6 4 2 Cloruro de Urea 1:2 No 80 7 tetrametilamonio

3 Cloruro de Urea 1:2 No 70 7 tetraetilamonio

4 Bromuro de Urea 1:2 No 86 5 tetrabutilamonio

5 Yoduro de Urea 1:2 No 12 1 tetrabutilamonio

6 Oxido de Trifluoroacetamida 1:2 Sf 19 2 tetrametilamonio

7 Cloruro de colina Imidazol 7:3 No 82 6 8 Bromuro de Urea 1:2 No 65 4 cetiltrimetilamonio

9 Cloruro de Trifluoroacetamida 1:2 Sf 15 6 cetiltrimetilamonio

0 CaCl2 Urea 1:3.5 No 116 2 1 ZrCl4 Urea 1:3.5 No 154 8 2 TbCl3 Urea 1:3.5 No 0 0 3 ZnCl2 Urea 1:3.5 Sf 162 5 4 ZnCl2 Trifluoroacetamida 1:3.5 No 15 6 5 Cloruro de colina N-metilpirrolidona 1:2 Sf 86 6 6 Cloruro de colina Acetamida 1:2 No 139 6 7 Cloruro de colina Tiourea 1:2 No 229 7 Componente 1 Componente 2 Razon Liquido a Rendimiento de Calidad de mol:mol 24°C ARN ng/pl ARN 0-10 Yoduro de butirilcolina Urea 1:2 No 240 7 Cloruro de acetiltiocolina Urea 1:2 No 165 6 Bromuro de colina Urea 1:2 No 122 7 Bromuro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sf 129 7 Cloruro de colina Monomero de acrilamida 1:2 Gel 164 7 Cloruro de colina 2-Cloroacetamida 1:2 Sf 196 5 Cloruro de colina Bistrifluoroacetamida 1:2 Sf 2 0 Cloruro de colina 2,2-Difluoropropanamida 1:2 Sf 191 6 Cloruro de colina 2,2,2-Trifluorotioacetamida 1:2 Sf 1183 7 Cloruro de colina 2-(Trifluorometil)- 1:2 No 94 4 fenilacetamida

Cloruro de colina 2,2-Difluoro-2- 1:1 No 338 7 fenilacetamida

Cloruro de colina 2,2,2-Trifluoro-N- 1:2 No 91 1 fenilacetamida

Cloruro de colina 3,3,3- 1:2 No 404 8 Trifluoropropanamida

Cloruro de colina Formamida 1:2 Sf 81 5 Cloruro de colina Beta-Mercaptoetanol 1:2 Sf 395 7 Cloruro de colina Ditiotreitol 1:2 Sf 202 7 Cloruro de colina Ditioeritreitol 1:2 Sf 109 2 Cloruro de colina Tiopronina 1:2 Sf 287 1 Yoduro de colina Urea 1:2 No 89 4 Dihidrogenocitrato de Urea 1:2 Sf 67 3 colina

Bitartrato de colina Urea 1:2 No 58 4 Bromuro de bromocolina Urea 1:2 No 134 6 Cloruro de colina 1,3-dimetilurea 1:2 No 127 6 Cloruro de colina Carbohidrazida 1:2 No 129 2 Cloruro de colina 1,3-bis(hidroximetil)urea 1:2 No 0 0 Cloruro de colina N-metiltrifluoroacetamida 1:2 No 40 7 Cloruro de colina Dimetiltrifluoroacetamida 1:2 Sf 22 4 Cloruro de colina Dietiltrifluoroacetamida 1:2 Sf 67 3 Cloruro de colina (1-trifluoro)acetilimidazol 1:2 Sf 22 1 Cloruro de colina Trifluoroacetato de etilo 1:2 Sf 43 0 Cloruro de colina Pentafluoropropionamida 1:2 No 62 4 Cloruro de colina Heptafluorobutiramida 1:2 No 10 4 Cloruro de colina N-Metilbis 1:2 No 14 1 (Trifluoroacetamida)

Cloruro de colina Lactamida 1:2 Sf 20 7 Cloruro de colina 2-Bromoacetamida 1:2 No 23 4 Componente 1 Componente 2 Razon Liquido a Rendimiento de Calidad de mol:mol 24°C ARN ng/pl ARN 0-10 73 Cloruro de beta- Trifluoroacetamida 1:2 Sf 19 7 metilcolina

74 Betama Urea 2:1 No 171 3 75 Betama Urea 1:1 Sf 175 6 76 Betama Urea 1:1.75 Sf 208 6 77 Betama Urea 1:1.95 Sf 30 7 78 Betama Urea 1:2 Sf 229 7 79 Betama Urea 1:2.14 Sf 169 7 80 Betama Urea 1:2.34 Sf 100 6 81 Betama Urea 1:3 No 86 4 82 Betama Urea 1:4 No 63 3 83 Betama ZnCl2 2:1 No 52 4 Betama Agua Sentado Sf 0 0 85 Betama Trifluoroacetamida 1:2 Sf 256 8 86 Carnitina Urea 1:2 Sf 217 5 87 Reactivo T de Girards Urea 1:2 Sf 72 1 88 Cloruro de Urea 1:2 No 136 8 benciltrimetilamonio

89 Cloruro de Trifluoroacetamida 1:2 Sf 35 6 benciltrimetilamonio

90 Bromuro de Etilenglicol 1:3 Sf 106 5 metiltrifenilfosfonio

91 Bromuro de Trifluoroacetamida 1:2 Sf 207 4 metiltrifenilfosfonio

92 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sf 74 9 93 Cloruro de colina Tricloroacetamida 1:2 No 29 3 94 Urea Isotiocianato de guanidina 1:2 No 10 0 Formaldelmdo (4%) - - - 4 0 * Ejemplo comparativo.

La escala cualitativa de calidad de ARN es la siguiente; 0 (altamente degradado) a 10 (maxima calidad). El analisis de ARN en la Tabla 1 y 2 se llevo a cabo de la siguiente manera; Electroforesis en gel de agarosa al 1% con TAE 0,5x tenida con bromuro de etidio, seguida de un analisis visual de una fotograffa tomada con luz ultravioleta, de la integridad de las bandas de ARNr 18S y 28S. Una muestra de ARN con una Puntuacion de calidad de ARN de 8 o mas tiene una razon de tincion de bromuro de etidio de ARNr 18S a 28S de 1:2, mientras que una muestra de ARN con una puntuacion de calidad de ARN de 5 tiene una razon de tincion de ARNr 18S a 28S de aproximadamente 1:1.

Tabla 2. Mezclas de DES de dos componentes mas aditivo

Componente 1 Componente 2 Razon Aditivo (razon molar) con Rendimiento de Calidad (mol:mol) respecto al Componente 1) ARN (ng/pl) de ARN 1 Cloruro de colina Urea 1:2 - 168 8 2 Cloruro de colina Urea 1:2 Acido p-toluenosulfonico- 246 6 amonio (0,8)

3 | Cloruro de colina Urea 1:2 Acido p-toluenosulfonico- 60 7 Componente 1 Componente 2 Razon Aditivo (razon molar) con Rendimiento de Calidad (mol:mol) respecto al Componente 1) ARN (ng/pl) de ARN sodio (0,8)

Cloruro de colina Urea 1:2 Acido 126 7 dimetilbencenosulfonico (0,8)

Cloruro de colina Urea 1:2 (NH4)2SO4 (0,015) 295 6 Cloruro de colina Urea 1:2 Cloruro de cinc (0,95) 0 0 Cloruro de colina Urea 1:2 Cloruro de cinc (0,1) 122 8 Cloruro de colina Urea 1:2 CTAB (0,125) 144 7 Cloruro de colina Urea 1:2 Dodecilsulfato de sodio (0,04) 18 9 Cloruro de colina Urea 1:2 Benzoato de sodio (0,8) 19 9 Cloruro de colina Urea 1:2 p-Toluenosulfonato de metilo 64 6

(0,1)

Cloruro de colina Urea 1:2 Isotiocianato de guanidina 19 3

(0,8)

Cloruro de colina Urea 1:2 Tiosulfato de amonio (0,07) 99 6 Cloruro de colina Urea 1:2 Hidroxido de dodecildimetil(3- 122 5 sulfopropil)amonio (0,01)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sorbitol (5% en peso:peso) 274 6 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sorbitol (10% en peso:peso) 272 5 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sorbitol (15% en peso:peso) 254 4 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sorbitol (20% en peso:peso) 96 3 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sorbitol (25% en peso:peso) 15 2 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Xilitol (5% en peso:peso) 107 6 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Ditiotreitol (9% en peso:peso) 150 7 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Cloruro de cinc (1% en 381 7 peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Acetato de cinc (1% en 370 4 peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sulfato de cinc, 7H2O (0,02% 432 8 en peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sulfato de cinc, 7H2O (0,07% 367 8 en peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sulfato de cinc, 7H2O (0,14% 433 8 en peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sulfato de cinc, 7H2O (0,7% 214 8 p:p)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sulfato de cinc, 7H2O (1% en 70 8 peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sulfato de cinc anhidro (1% 135 8 en peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sal de cinc de EDTA (1% en 214 7 peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Gluconato de cinc (1% en 250 4 peso:peso)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Gel de sflice (50% vol:vol) 340 7 Componente 1 Componente 2 Razon Aditivo (razon molar) con Rendimiento de Calidad (mol:mol) respecto al Componente 1) ARN (ng/pl) de ARN 34 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Tamices moleculares 4A 450 7 (50% vol:vol)

33 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Poliacrilato de sodio (50% 308 6 vol:vol)

34 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Healthguards® (50% vol:vol) 454 7 35 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Etanol (0,1) 293 6 36 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Etanol (0,25) 595 4 37 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Etanol (0,5) 655 3 38 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Etanol (1) 679 1 39 Trehalosa Acido citrico 1:1 Agua (1) 169 2

La escala cualitativa de calidad de ARN es la siguiente; 0 (altamente degradado) a 10 (maxima calidad). El analisis de ARN en la Tabla 1 y 2 se llevo a cabo de la siguiente manera; Electroforesis en gel de agarosa al 1% con 0,5x TAE tenida con bromuro de etidio, seguida de un analisis visual de una fotograffa tomada con luz ultravioleta, de la integridad de las bandas de ARNr 18S y 28S. Una muestra de ARN con una Puntuacion de calidad de ARN de 8 o mas tiene una razon de tincion de bromuro de etidio de ARNr 18S a 28S de 1:2, mientras que una muestra de ARN con una puntuacion de calidad de ARN de 5 tiene una razon de tincion de ARNr 18S a 28S de aproximadamente 1:1.

4. Composiciones mixtas de DES con una matriz de soporte (ejemplo de referencia)

Con el fin de mejorar la separacion ffsica de una mezcla Kquida de DES de la muestra almacenada, tal como un tejido o biopsia, el DES se mezclo con varias matrices de soporte. El material de la matriz no esta particularmente limitado, pero debe conservar la resistencia estructural incluso cuando se mezcla con el DES y, por lo tanto, no debe disolverse ni reaccionar. Preferiblemente, la matriz de soporte se puede etiquetar directamente, por ejemplo, con un codigo de barras o una fecha de caducidad de vida util por medio de una impresora o un bolfgrafo de tinta.

A 3,2 g de PEG (PM8000), agarosa, poliacrilato o fibras de celulosa 3MM (Whatmann, Reino Unido) se les anadieron 10 ml de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:1 mol:mol) y se calentaron con agitacion a 100°C durante 30 minutos para homogeneizar la mezcla que a continuacion se vertio en un recipiente adecuado para enfriarla.

Tales mezclas compuestas tienen la ventaja de ser mas faciles de manejar que las mezclas lfquidas de DES y reducir el arrastre del DES a la etapa de extraccion, por ejemplo, purificacion de ARN. El compuesto se puede verter, moldear, modelar, cortar, estratificar o formar en cualquier numero de recipientes, como placas de 96, 24 o 6 pocillos, tubos de microcentnfuga de 1,5 ml, tubos de 5, 15 o 50 ml.

5. Estabilizacion del ARN en tejido completo a diferentes temperaturas.

A 400 |jl de Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) o RNAlater en un tubo de microcentnfuga de polipropileno de 2 ml convencional se les anadieron 10 mg de muestra de hngado de rata y se preincubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la estabilizacion y/o fijacion, la muestra intacta se incubo a continuacion en la mezcla de DES a -20, 4, 37, 50 o 65°C durante 18 horas antes de la recuperacion de la muestra de tejido intacta y la purificacion de ARN como se indica en el siguiente ejemplo.

A continuacion, la muestra se anadio a un tubo nuevo que contema 350 j l de tampon de lisis RLT y el ARN se extrajo del tejido homogeneizado con guanidina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania). A continuacion se utilizaron porciones de 300 j l del producto lisado con guanidina para purificar inmediatamente el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyeron en 20 50 j l de agua. El rendimiento y la calidad del ARN se determinaron segun lo establecido en el Ejemplo 1, para la mezcla de estabilizacion de DES, la integridad del ARN fue superior a todas las temperaturas superiores a 37°C e iguales a -20 y 4°C en comparacion con RNAlater. Los resultados se muestran en la Figura 3. Calles 1, 3, 5, 7, 9 Cloruro de colina:Urea (1:2), Calles 2, 4, 6, 8, 10 RNAlater.

Sera evidente para un experto en la tecnica que el Cloruro de colina:Urea se puede reemplazar con otras mezclas de DES tales como el cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol).

6. Estabilizacion a largo plazo del ARN en tejido completo a 24°C

A 400 |jl de Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) o RNAlater en un tubo estandar de microcentnfuga de polipropileno de 2 ml se anadieron 10 mg de muestra de hugado de rata y se preincubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la estabilizacion y/o fijacion, la muestra intacta se incubo a continuacion en Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) a 24°C durante 0 a 19 dfas antes de la recuperacion de la muestra de tejido intacta y la purificacion de ARN como se indica en el siguiente ejemplo.

La muestra se anadio a un tubo nuevo que contema 350 j l de tampon de lisis RLT, y el ARN se extrajo del tejido homogeneizado de guanidina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania). A continuacion se utilizaron porciones de 300 j l del producto lisado de guanidina para purificar inmediatamente el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyeron en 20 j l de agua. El rendimiento y la calidad del ARN se determinaron segun lo establecido en el Ejemplo 1, para la mezcla de estabilizacion de DES, la integridad del ARN fue igual o superior al RNlater en todos los puntos temporales. Los resultados se muestran en la Figura 4. Calles 1, 3, 5 Cloruro de colina:Urea (1:2), Calles 2, 4, 6 muestras tratadas con RNAlater.

7. Purificacion de diferentes tipos de tejidos

A 400 j l de Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) o RNAlater en un tubo de microcentnfuga de polipropileno de 2 ml convencional se les anadieron porciones de 10 mg de cerebro de raton congelado (Calles 3 y 4) o muestras de rinon (Calles 1, 2, 5, 6) y se preincubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la estabilizacion y/o fijacion, la muestra intacta se incubo a continuacion en Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) a 37°C durante 1 a 7 dfas antes a la recuperacion de la muestra de tejido intacto y la purificacion de ARN como se describe a continuacion (Figura 5A. Calles 1, 3, 5; estabilizacion con Cloruro de colina:Urea (1:2), Calles 2, 4, 6; estabilizacion con RNAlater (Qiagen, Francia) durante 24 horas (Calles 1-4) o 7 dfas (Calles 5 y 6)).

Alternativamente, se anadieron porciones de 10 mg de tejido de raton previamente congelado a 400 j l de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida y se incubaron a 37°C durante 18 horas antes de la purificacion del ARN (Figura 5B. Calles 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15; estabilizacion con cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2), Calles 2, 4, 6, 8, 9, 10, 12, 14, 16; estabilizacion con RNAlater (Qiagen, Alemania).

La muestra se anadio a un tubo nuevo que contema 350 j l de tampon de lisis RLT, y el ARN se extrajo del tejido homogeneizado con guanidina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat.

74106, Qiagen, Alemania). A continuacion se utilizaron porciones de 300 j l del producto lisado con guanidina para purificar inmediatamente el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyeron en 20 j l de agua. El rendimiento y la calidad del ARN se determinaron segun lo establecido en el Ejemplo 1, para la mezcla de estabilizacion de DES, la integridad del ARN fue igual o superior a la de RNAlater.

8. Purificacion de diferentes cantidades de tejido

A 400 j l de Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol) o RNAlater en un tubo de microcentnfuga de polipropileno de 2 ml convencional se les anadieron 15 mg (Calles 1 y 2) o 25 mg de Imgado de rata (Calles 3 y 4) y se pre-incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la estabilizacion y/o fijacion, la muestra intacta se incubo a continuacion en Cloruro de colina:Urea a 37°C durante 18 horas antes de la recuperacion de la muestra de tejido intacta y la purificacion de ARN como se establece a continuacion.

74106, Qiagen, Alemania). A continuacion se utilizaron porciones de 300 j l del producto lisado de guanidina para purificar inmediatamente el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyeron en 20 j l de agua. El rendimiento y la calidad del ARN se determinaron segun lo establecido en el Ejemplo 1, para la mezcla de estabilizacion de DES, la integridad del ARN fue igual o superior a RNAlater en todos los puntos temporales. Los resultados se muestran en la Figura 6. Calles 1 y 3, Cloruro de colina:Urea (1:2), Calles 2 y 4, muestras tratadas con RNAlater.

Se encontro que la mezcla de DES que contema cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) fue significativamente mas eficaz para estabilizar el ARN en tejidos frescos que el cloruro de colina:urea (1:2 mol:mol). Sin embargo, si el tejido se congela primero a -20°C o -80°C, el Cloruro de colina:Urea es igual de eficaz que el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida. No se entiende por que el Cloruro de colina:Urea es menos eficaz para estabilizar el ARN en tejido fresco, pero se ha encontrado que la adicion de ZnCl2 o ZnSO4 33 mM al Cloruro de colina:Urea (2:1 mol:mol) reduce significativamente la cantidad de degradacion del ARN que se produce cuando se utilizan tejidos frescos.

De manera util, tejidos tales como hfgado, rinon y musculo tratados durante al menos una hora con un DES, tal como Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) y a continuacion congelados a -80°C son significativamente mas blandos que los tejidos no tratados permitiendo la penetracion de una aguja de biopsia. Esto es particularmente util cuando la muestra no debe descongelarse por completo, sino que solo se debe extraer una porcion para su posterior analisis. Tambien se debe tener en cuenta que el color de los tejidos tratados con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida, especialmente la sangre, no cambia ni se desvanece significativamente, mientras que las muestras no tratadas o tratadas con formol pierden rapidamente su intensidad de color, con o sin congelacion, y tal preservacion del color puede ser una Importante ventaja para analizar correctamente las muestras de biopsia y los tipos de celulas en una muestra de biopsia.

9. Purificacion de ARN de sangre completa estabilizada con DES con celulas HeLa

A 400 |jl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) se les anadieron 50 j l de sangre humana completa enriquecida con 50 j l de 150.000 celulas HeLa y se mezclaron con un pipeteo suave, se dejo que la muestra se estabilizara durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de la extraccion del ARN. Se mezclaron 50 j l (Calle 1) o 100 j l (Calle 2) de esta mezcla de sangre estabilizadas DES/celulas con 300 j l de Tampon de lisis RLT (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania) para lisar las celulas y extraer el ARN, la purificacion se llevo a cabo de la siguiente manera.

El producto lisado de sangre con guanidina se centrifugo durante 60 segundos a 14.000 g y el sobrenadante se transfirio a un tubo nuevo que contema 300 j l de etanol del 70%, se mezclo mediante pipeteo y a continuacion se transfirio a una columna de centrifugado MinElute (RNeasy Micro Kit, Num. de Cat. 74004, Qiagen, Alemania). La columna MinElute se lavo una vez con 700 j l de Tampon RW1 y a continuacion dos veces con 500 j l de Tampon RPE, se centrifugo durante 60 segundos para secar la columna antes de la elucion con 20 j l de agua segun las instrucciones del fabricante. El rendimiento de ARN se determino mediante absorbancia a DO260 nm utilizando un Nanodrop (ThermoScientific, EE.UU.) y se cargo y analizo en un gel de agarosa al 1%, 0,5XTAE.

Tabla 3. Rendimientos de ARN derivado de muestras de sangre enriquecida con celulas HeLa.

Volumen de la muestra Rendimiento total de ARN

1 50 j l 200 ng

2 100 j l 2400 ng

Los resultados se muestran en la Figura 7. Es notable que la columna de centrifugacion de silice MinElute despues del paso del producto lisado de sangre con guanidina no estuviera visiblemente contaminada con hemo. La mezcla de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida - guanidina, por lo tanto, parece proteger la membrana de silice de la contaminacion no espedfica.

10. Estabilizacion del ARN en sangre completa enriquecida con celulas HeLa utilizando Cloruro de colina:Trifluoroacetamida

A 1000 j l de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) se les anadieron 200 j l de sangre humana completa enriquecida con 50 j l de 1.000.000 celulas HeLa y se mezclaron con un pipeteo suave, la muestra se incubo durante 18 horas a temperatura ambiente antes de extraer el ARN. Se mezclaron 100 j l (Figura 8; Calle 1), 150 j l (Calle 2), 200 j l (Calle 3) o 250 j l (Calle 4) de la mezcla de sangre estabilizada DES/celulas: 250 j l de tampon de lisis RLT (RNeasy Mini Kit, Cat No. 74106, Qiagen, Alemania) para lisar las celulas y extraer el ARN, la purificacion se llevo a cabo de la siguiente manera.

El producto lisado de sangre con guanidina se centrifugo durante 60 segundos a 14.000 g y el sobrenadante se transfirio a un tubo nuevo que contema 300 j l de etanol del 70%, se mezclo mediante pipeteo y a continuacion se transfirio a una columna de centrifugado MinElute (RNeasy MinElute, Num. de Cat. 74204, Qiagen, Alemania). La columna MinElute se lavo una vez con 700 j l de Tampon RW1 y a continuacion dos veces con 500 j l de Tampon RPE, se centrifugo durante 60 segundos para secar la columna antes de la elucion con 20 j l de agua segun las instrucciones del fabricante. El rendimiento de ARN se determino utilizando un Nanodrop (Agilent, EE.UU.) y se cargo y analizo en un gel de agarosa al 0,5%, 0,5X TAE. Los datos de DO 260/280nm demuestran que el ARN esta sustancialmente libre de protemas contaminantes, mientras que los rendimientos de ARN sugieren que las columnas MinElute estan saturadas con ARN y que las columnas MinElute (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania) podnan proporcionan incluso mejores rendimientos.

Tabla 4. Rendimientos de ARN y calidad despues del almacenamiento

de muestras de sangre durante 18 horas.

Volumen de la muestra DO 260/280nm Rendimiento total de ARN

1 100 pl 2,03 640 ng

2 150 pl 2,03 1500 ng

3 200 pl 2,01 1120 ng

4 250 pl 2,09 600 ng

La estabilizacion del ARN durante la noche en sangre completa tambien se demostro como sigue. Se mezclaron 50.000 celulas HeLa con 50 pl de sangre completa humana fresca y a continuacion se anadieron las celulas y la sangre a 400 pl de Tampon RLT (Qiagen, Alemania) o 400 pl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) y se incubaron durante la noche a 24°C, el ARN se purifico segun las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini, Qiagen, Alemania). El ARN se protegio significativamente en la sangre completa de la degradacion por el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), pero se degrado cuando se almaceno durante la noche en tampon RLT. El almacenamiento de ARN en la sangre completa, ya sea en una forma celular tal como globulos blancos o celulas tumorales circulantes, en una forma subcelular tal como exosomas u otras microvesfculas, o dentro de las partfculas virales puede llevarse a cabo anadiendo 1:8 o mas preferiblemente, 1:10 de sangre completa a Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol). Alternativamente, se puede anadir ZnCl2 o ZnSO410 mM con o sin Tamices moleculares 4A al 20% p:p al Cloruro de colina:Trifluoroacetamida para mejorar adicionalmente la estabilidad del ARN.

La Figura 9 muestra la estabilizacion del ARN en sangre completa con Guanidina o Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol). En el almacenamiento de muestras durante la noche a 24°C en Tampon RLT (Qiagen, Alemania) (Calle 1) o 400 pl de cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) (Calle 2), el ARN total se degrada significativamente en Guanidina pero no en Cloruro de colina:Trifluoroacetamida.

11. Estabilizacion de sangre completa utilizando un tubo de extraccion de sangre a vacio

A un tubo de recoleccion de sangre de 10 ml de tereftalato de polietileno (PET) se le anadieron 7 ml de Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) esteril, y el tubo se cerro con un Hemogard™ (Becton Dickinson, EE.UU.) u otro cierre apropiado y el aire se retiro parcialmente para crear un vado. Alternativamente, el tubo de recoleccion de sangre puede contener ademas de los 7 ml de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) ZnSO4 para proporcionar una concentracion final en la muestra de sangre diluida de 1 mM, 5 mM, 10 mM, 33 mM, 100 mM o 200 mM. Como ejemplo de un dispositivo de tubo de extraccion de sangre, vease la Figura 1C. Se extrajeron aproximadamente 2 ml de sangre venosa completa al tubo utilizando un conjunto de recoleccion de sangre (PreAnalytix, Alemania) o mediante el llenado de una jeringa Luer-Lock y una aguja, y la transferencia de 2 ml del contenido al tubo de extraccion de sangre. Despues de la adicion de la sangre, el tubo se invirtio 10 veces para mezclar los componentes y a continuacion se incubo durante 20 minutos a temperatura ambiente para fijar y estabilizar el ARN en globulos blancos, tales como linfocitos T y B, monocitos y macrofagos (p.ej. PBMC), neutrofilos, basofilos y eosinofilos (celulas polimorfonucleares), trombocitos y cualquier bacteria o virus como se expone en la descripcion, incluidos VPH, VIH, VHC, VHB, Influenza y coronavirus implicados en el SARS. En general, los eritrocitos no permanecen intactos en esta mezcla. Otros tipos de celulas, tales como las celulas tumorales circulantes, tambien se pueden estabilizar y fijar con este metodo, lo que permite una mejor captura, analisis y almacenamiento de los CTC.

Despues del almacenamiento en el tubo de recoleccion de sangre hasta, por ejemplo, 24 horas a 37°C, 3 dfas a temperatura ambiente, 1 semana a 4°C o 3 meses a -20°C, el ARN puede extraerse de la sangre estabilizada con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida de la siguiente manera: El tubo de recoleccion de sangre se abrio y se retiro 1 ml de la muestra estabilizada y se mezclo con 3 ml de Tampon de Lisis RLT, se centrifugo durante 60 segundos a 14.000 g, se retiro el sobrenadante y se anadio a un volumen igual de etanol del 70% antes de cargarlo en una columna RNeasy MinElute (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania) o RNeasy Midi (RNeasy Midi Kit, Num. de cat. 75142, Qiagen, Alemania) y a continuacion la columna centrifugacion se lavo con Tampones RWI y RPE y el ARN se eluyo de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit.

12. Medicion de las propiedades de fijacion celular de las mezclas de DES

A cada pocillo en una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos se le anadieron 20,000 celulas HeLa recien tripsinizadas en 1 ml de DMEM/FBS al 5% y a continuacion se dejo que las celulas se unieran a la superficie de la placa incubando en un incubador de cultivo de tejido apropiado durante al menos 6 horas a 37°C. A continuacion se retiro el medio de cultivo de tejido con una pipeta de vacfo y se anadieron 400 pl de una mezcla de DES a cada pocillo mientras se examinaban los cambios morfologicos de las celulas en tiempo real con un microscopio optico 20x. La placa de cultivo de tejido se devolvio a continuacion a una incubadora a 37°C durante 90 minutes antes de un examen de microscopio adicional. La solucion salina de fosfato tamponada de Dulbecco (DPBS) se utilizo como control no toxico y los resultados se muestran en la siguiente tabla. La viabilidad celular se determino mediante tincion con Azul Tripan convencional.

Tabla 5. Efectos de diversos fijadores y aditivos sobre la morfologia celular.

Fijador (mol:mol) Efecto sobre las celulas Viabilidad celular 1* Solucion salina tamponada con fosfato de Sin cambios Sf Dulbecco

2 Cloruro de colina:urea (1:2) Las celulas se contraen y el citoplasma es No translucido

3 Cloruro de colina:Xilitol (1:1) Se desprenden, se contraen con crenacion No 4 Cloruro de colina:Sorbitol (1:1) Se desprenden, se contraen con crenacion No 5 Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2) Sin cambios No 6 Cloruro de colina:Etilenglicol (1:2) Se desprenden No 7 Cloruro de colina:urea:ZnCl2 (1:2:1) 15% lisis, celulas opacas, sin contraccion No 8 Cloruro de colina:urea:ZnCl2 (10:20:1) Celulas opacas y con reduccion de tamano No de 80%

9 Cloruro de colina:urea: CTAB (8:16:1) Citoplasma homogeneo sin contraccion. No 10 Cloruro de colina:urea: SDS (25:50:1) Morfologfa razonable, sin contraccion celular No 11 Cloruro de colina:urea:p-Toluenosulfonato de Morfologfa razonable, opaca, 80% de No metilo (3:6:1) condensacion citoplasmica

12 Cloruro de colina:urea:Benzoato de sodio Citoplasma hipercondensado, opaco No (36:72:1)

13 Cloruro de colina:isotiocianato de guanidina Las celulas se hinchan y se lisan No (2:1)

14 ZnCl2:Etilenglicol (1:4) Celulas altamente condensadas, No desprendidas en 50%

15 ZnCl2:Etilenglicol:Trifluoroacetamida (1:3:1) Citoplasma altamente condensado, ruptura y No heterogeneo.

16* RNAlater Formacion de burbujas en el citoplasma, por No lo demas intacto y opaco

* Ejemplo comparativo.

Tabla 6. Efectos de varias mezclas de DES con o sin aditivos sobre la morfologia celular Componente 1 Componente 2 Razon % Aditivo final Efecto sobre la (mol:mol) morfologia HeLa 1 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:1.8 - 2 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 - 3 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2.25 - 4 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2.5 - 5 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2.75 - 6 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:3 - 7 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 H2O (17%) 8 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 H2O (13%) 9 | Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 H2O (10%) Componente 1 Componente 2 Razon % Aditivo final Efecto sobre la (mol:mol) morfologia HeLa Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 H2O (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 H2O (2.5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Etilenglicol (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 1,6-Hexanodiol (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Etanol (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Metanol (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Dimetilformamida (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Dimetilsulfoxido (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 N-metilpirrolidona (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 N-etilpirrolidona (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Etilenurea (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Pivalamida (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 1,3-Dimetilurea (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 N,N'-Dimetilurea (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Isopropanol (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Butanol (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Glicerol (17%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 1-Metilimidazol (33%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 1-Metilimidazol (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 1-Etilimidazol (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 1-Bencilimidazol (2,5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 1-Bencilimidazol (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Tetrametilurea (1%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Tetrametilurea (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Carbonato de etileno +

(33%)

Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Imidazol 33%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Acetato de litio (33%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 4-Formil morfolina (33%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Acetonil acetona (20%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Guanidina HCI (3,4%) Cloruro de colina Acrilamida 1:2 - Cloruro de colina 2-Cloroacetamida 1:2 - Cloruro de colina Bistrifluoroacetamida 1:2 - Cloruro de colina 2,2- 1:2 - ++ Difluoropropanamida

Cloruro de colina 2,2,2- 1:2 - +

Trifluorotioacetamida

Cloruro de colina Formamida 1:2 - Cloruro de colina Metanol 1:2 - Componente 1 Componente 2 Razon % Aditivo final Efecto sobre la (mol:mol) morfologia HeLa Cloruro de colina Etanol 1:2 - Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sorbitol (5%) Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Xilitol (5%) Cloruro de colina Urea 1:2 Cloruro de colina Urea 1:2 Cacodilato de Na (10%) Cloruro de colina Urea 1:2 SDS (5%) Cloruro de colina Urea 1:2 Acido p-toluenosulfonico

Na (6%)

Cloruro de colina Urea 1:2 Triton TX-45 (12%) Cloruro de colina Urea 1:2 Benzoato de sodio (8%) Cloruro de colina Urea 1:2 Isotiocianato de

guanidina (7%)

Cloruro de colina Urea 1:2 Acido sulfosalidlico

(10%)

Cloruro de colina Urea 1:2 CTAB (8%) Cloruro de colina Urea 1:2 Cloruro de cinc (11%) Cloruro de colina Urea 1:2 p-Toluenosulfonato de +

metilo (25%)

ZnCl2 Etilenglicol 1:4 - ZnCl2 Etilenglicol: 1:3:1 -

Trifluoroacetamida

ZnCl2 Urea 1:3.5 - ZnCl2 Trifluoroacetamida 1:3.5 - Cloruro de colina Sorbitol 1:1 - Cloruro de colina Isotiocianato de 2:1 -

guanidina

Cloruro de colina Acido fenilacetico 1:2 - Cloruro de colina Acido malonico 1:2 - Cloruro de colina Acido borico 1:1.5 - Cloruro de acetilcolina Urea 1:2 - Cloruro de acetilcolina Trifluoroacetamida 1:2 - Bromuro de colina Urea 1:2 - Bromuro de colina Trifluoroacetamida 1:2 - Cloruro de beta- Trifluoroacetamida 1:2 - metilcolina

Carnitina Trifluoroacetamida 1:2 - Taurina Trifluoroacetamida 1:2 - Componente 1 Componente 2 Razon % Aditivo final Efecto sobre la (mol:mol) morfologia HeLa 77 Bromuro de Trifluoroacetamida 1:3 - metiltrifenilfosfonio

78 Grignard Reactivo T Trifluoroacetamida 1:2 - 79 Cloruro de Trifluoroacetamida 1:2 - ++ cloroetiltrimetilamonio

80 Cloruro de Trifluoroacetamida 1:2 - + cetiltrimetilamonio

81 Oxido de Trifluoroacetamida 1:2 - tetrametilamonio

82 Cloruro de colina Tricloroacetamida 1:2 -

83 Cloruro de Trifluoroacetamida 1:2 - ++ benciltrimetilamonio

84 Betama Trifluoroacetamida 1:2 - Efecto en la morfologfa de las celulas HeLa, escala (peor) a ++++ (mejor).

13. Fijacion celular con trifluoroacetamida que contiene mezclas de DES

Se cultivaron celulas de cultivo tisular HeLa en condiciones de cultivo tisular convencional en una placa de cultivo tisular de 24 pocillos hasta la confluencia, se retiro el medio DMEM/FBS de 1 ml y se reemplazo por 0,2-1,0 ml de (A) solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) o (B) Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) y se tomaron imagenes de las celulas con un microscopio optico convencional 50X. Los campos representativos de las celulas se muestran en la Figura 10, no se observaron cambios sustanciales en la morfologfa celular entre las celulas tratadas con DPBS o Cloruro de colina:Trifluoroacetamida. Como prueba para demostrar que las celulas tratadas con DES se fijaron, se retiraron el DPBS o el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida y las celulas se lavaron con 2 ml de agua del grifo, se encontro que, despues de una hora a temperatura ambiente, solo las celulas tratadas con DPBS se hincharon y a continuacion se rompieron por el efecto osmotico del agua, mientras que las celulas tratadas con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida se mantuvieron practicamente sin cambios por este tratamiento adicional, incluso despues de una inmersion de 1 mes en agua a temperatura ambiente, lo que demuestra que en efecto se habfan fijado. Ademas, como prueba de la fijacion de las celulas, estas se trataron con 1 ml de tripsina al 0,05% durante una hora a temperatura ambiente y se encontro que, a diferencia de las celulas tratadas con DPBS, no habfa ningun efecto o una degradacion visible por proteasa de las celulas y estas se mantuvieron intactas.

El cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) se puede reemplazar por Cloruro de colina:Trifluoroacetamida 1:1, 1:1.5, 1:1:75, 1:2.25, 1:2.5, 1:2.75 o 1:3 (mol:mol). Alternativamente, el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida se puede reemplazar por Betama:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) o Cloruro de acetilcolina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol). No existe una limitacion concreta para la mezcla de DES para la fijacion celular, pero las mezclas que contienen trifluoroacetamida son particularmente utiles para la fijacion celular y la estabilizacion de ARN (consulte la Tabla 1).

Las celulas de cultivo tisular y los tejidos pueden fijarse con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) a diferentes temperaturas sin que las celulas se lisen o se distorsionen. Se precalentaron porciones de 400 pl de cloruro de colina:trifluoroacetamida a 37°C, 100°C o 120°C, y se anadio una punta de pipeta precalentada a celulas HeLa en una placa de 24 pocillos. La observacion inmediata por microscopio de las celulas despues de la adicion del Cloruro de colina:Trifluoroacetamida caliente mostro que, sorprendentemente, teman una morfologfa muy similar a las celulas fijadas a temperatura ambiente. La viscosidad del Cloruro de colina:Trifluoroacetamida caliente es significativamente menor que a temperatura ambiente.

Espedficamente, las propiedades de fijacion celular del disolvente eutectico profundo se determinaron y cuantificaron de la siguiente manera: se cultivaron aproximadamente 2.000 celulas HeLa en un Cellattice™ de 25 mm: Superficie de Cultivo Celular con Escala Micrometrica (Superficie de cubreobjetos de cultivo celular con escala micrometrica Num. de Cat. CLS5-25D-050 Nexcelom Bioscience, EE.UU.) colocadas en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y cultivadas durante la noche en 2 ml de DMEM/FBS al 10%, el numero de celulas adheridas en un area definida de la cuadncula se conto manualmente utilizando una lente microscopica de objetivo 10x, a continuacion se retiro el medio de cultivo de tejidos con una pipeta de aspiracion y se reemplazo por 400 mg de un disolvente eutectico profundo, se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir la fijacion celular y a continuacion se retiro el disolvente eutectico profundo con una pipeta de aspiracion y se reemplazo por 2 ml de agua destilada, se incubo durante 1 hora a temperatura ambiente y se conto manualmente el numero de celulas en la misma area definida de la rejilla que antes del tratamiento. Se calculo el porcentaje de celulas adheridas que permanedan en la cuadncula en comparacion con el numero original y se encontro que al menos 75% de las celulas se adhirieron despues del tratamiento con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol). Observese que las celulas no deben crecer hasta la confluencia, ya que se ha encontrado que un gran numero de celulas muertas y poco adheridas se desprenden facilmente y, por lo tanto, causan errores en el recuento de celulas. Sera evidente para un experto en la tecnica que tambien se pueden determinar las propiedades de fijacion celular de otros disolventes eutecticos profundos utilizando este metodo.

14. Solubilidad de las mezclas de sal en Cloruro de colina:Urea (ejemplo de referencia)

Se encontro notablemente que el Cloruro de cinc (ZnCl2) se podfa disolver en el Cloruro de colina:Urea (1:2) para proporcionar una mezcla de DES de Cloruro de colina:Urea:ZnCl2 de 1:2:2 (mol:mol:mol), el isotiocianato de guanidina se puede disolver en Cloruro de colina:Urea para obtener una mezcla de DES de Cloruro de colina:Urea:Isotiocianato de guanidina de 1:2:5 (mol:mol:mol) y el Acetato de amonio se puede disolver en Cloruro de colina:Urea (1:2) para dar una mezcla de DES de Cloruro de colina:Urea:Acetato de amonio de 1:2:3 (mol:mol: mol).

15. Degradacion del ARN en la ausencia de un estabilizador (ejemplo comparativo)

Para determinar la velocidad de la degradacion del ARN en ausencia de una mezcla de DES u otro estabilizador, se incubaron 50 mg de hngado de rata a 20°C durante (Calle 1) 0 min, (Calle 2) 1 min, (Calle 3) 2 min, (Calle 4) 5 min, o (Calle 5) 20 min antes de la purificacion del ARN de acuerdo con el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 10.

Se encontro que el ARN se degrado notablemente despues de 5 minutos a temperatura ambiente y se degrado significativamente despues de 20 minutos. Esto proporciona un metodo para estimar la cantidad maxima de tiempo que puede permanecer intacto el ARN en un tejido antes de que comience a degradarse y, por lo tanto, la rapidez y eficacia con las que se puede comparar el fijador DES. Por ejemplo, el peso de las muestras de un tejido con una tasa relativamente baja de degradacion del ARN, tal como musculo, puede ser mayor que el de un tejido con una tasa mas alta, tal como pancreas.

16. Estabilizacion del ADN en muestras de tejidos animales.

A 400 |jl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) en un tubo de microcentnfuga de polipropileno de 1,5 ml convencional se les anadio una muestra de hugado de rata de 2 a 25 mg y se preincubo durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la estabilizacion y/o fijacion, la muestra se puede incubar a -80, -20, 4, 20 o 37, 42 o 55°C durante una hora a varias semanas antes de la recuperacion de la muestra de tejido con forceps seguida de la purificacion de ARN y a continuacion de ADN como se expone a continuacion.

Brevemente, la muestra se lisa mecanicamente en 400 j l de Tampon de lisis RLT y el ARN se eluye en al menos 40 j l de agua de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania), a continuacion se lava la membrana de sflice con 100 j l de agua, se centrifuga durante 60 segundos a 10.000 xg y el flujo directo se descarta, a continuacion se anaden 100 j l de NaOH 10 mM, se incuba a 70°C durante 15 minutos para destruir el ARN residual y a continuacion se centrifuga durante 60 segundos a 10.000 xg y el flujo directo que contiene el ADN se recoge y analiza utilizando un gel de agarosa al 1%.

Tambien se pueden utilizar kits de purificacion de ADN comercializados, tales como PureLink® (Num. de Cat.

12183018A, Life Technologies, EE.Uu .) y DNeasy Mini Kit, (DNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 69504, Qiagen, Alemania) y no existe Limitacion sobre tipo de kit o tipo de tejido que se puede utilizar para la purificacion del ADN. La muestra de hngado se puede reemplazarse por otros tipos de tejidos y celulas, tales como hngado, bazo, cerebro, musculo, corazon, esofago, testfculo, ovario, timo, rinones, piel, intestino, pancreas, glandulas suprarrenales, pulmones, medula osea o celulas tales como celulas COS-7, NIH/3T3, HeLa, 293 y CHO o incluso muestras lfquidas tales como suero, plasma o sangre.

Se encontro que el ADN extrafdo de muestras de hngado de rata que se habfan fijado y estabilizado en 400 j l de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2) en comparacion con 400 j l de RNAlater a temperatura ambiente tema un ADN significativamente mas intacto que demostraba la estabilizacion superior de la mezcla de DES en comparacion con RNAlater, un producto que se ha recomendado para preservar el ADN y el ARN. Tambien se puede anadir ZnSO41-33 mM para mejorar la estabilizacion del ADN.

Los resultados se muestran en la Figura 12. Sedimentos de celulas HeLa estabilizados en; Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) (Calles 1 y 3), RNAlater (Calles 2 y 3), durante 9 (Calles 1 y 2) o 15 dfas (Calles 3 y 4) a 24°C. El ADN en muestras estabilizadas con RNAlater esta significativamente mas degradado que con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida.

17. Estabilizacion de proteinas en muestras de tejidos animales (un ejemplo de referencia no de acuerdo con las presentes reivindicaciones)

A 400 pl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), ZnSO4.7H2O 10 mM y 40 mg de Tamices moleculares 4A en un tubo de microcentnfuga de polipropileno de 1,5 ml convencional se les anadieron 10 mg de hugado de raton congelado y descongelado durante 4, 7 o 18 dfas a 24°C. Las muestras de hugado de raton de control se incubaron en 400 pl de PBS durante 0 minutos, 36 horas, 6 dfas o 13 dfas a 24°C antes de la extraccion de protemas.

Las proteinas se extrajeron anadiendo 10 volumenes de tampon de muestra 1X (Tris-HCl 125 mM, pH 6,8, SDS al 2%, glicerol al 10%, p-mercaptoetanol al 5%, azul de bromofenol al 0,001%) a la muestra de hugado, triturando con un mortero para sedimentos durante 30 segundos y a continuacion calentando inmediatamente la muestra durante 10 minutos a 70°C, colocando el tubo en hielo durante 5 minutos y a continuacion centrifugando durante 5 minutos a 10.000 xg antes de la dosificacion de proteinas mediante el metodo de Bradford (Bio-Rad, Francia). Se mezclaron 30 pg de cada protema con tampon de Laemlli y se cargaron en un gel de acrilamida SDS-7,5% convencional y se sometieron a electroforesis durante 3 horas a 110V. A continuacion, las proteinas se transfirieron a una membrana de PVDF/ECL+ de transferencia Western y se incubaron durante la noche en TBS (Tween-20 al 0,1%), leche en polvo al 5% a 4°C con una dilucion 1:500 del anticuerpo primario anti-a-actina, la membrana se lavo tres veces con TBS (Tween-20 al 0,1%, 5% de leche en polvo) y se incubo durante 60 minutos a 24°C con una dilucion 1:100 de un anticuerpo secundario anti-IgG de raton marcado con HRP, lavado y desarrollado con un Kit Supersignal Wes Pico Chemiluminiscent (Pierce, Francia).

Los resultados se muestran en la Figura 13. Hfgado de raton estabilizado en; PBS (Calles 2-4) o Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) (Calles 5-7), durante 0 minutos (Calle 1), 36 horas (Calle 2), 6 dfas (Calle 3), 13 dfas (Calle 4), 4 dfas (Calle 5), 7 dfas (Calle 6) o 18 dfas (Calle 7) a 24°C. Las proteinas IgG y actina en las muestras almacenadas en PBS estan significativamente mas degradadas que con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida.

18. Fijacion celular con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) para inmunohistoqmmica (IHC) Las celulas HeLa se hicieron crecer hasta una densidad celular de 20% sobre un cubreobjetos de vidrio de 13 mm en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, el medio de crecimiento DMEM se retiro con una pipeta de vacfo, el borde se seco con un panuelo de papel y el cubreobjetos se transfirio a una placa de 12 pocillos y se anadieron directamente 600 pl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) sobre el cubreobjetos y se dejo durante 60 minutos en una plataforma oscilante a temperatura ambiente para permitir la fijacion. A continuacion se retiraron el cubreobjetos y las celulas del fijador, se retiro el fijador en exceso con una pipeta de vacfo y se seco con un panuelo de papel, y se lavo durante 4 x 5 minutos con 2 ml de PBS. Las celulas se bloquearon con 2 ml de PBS/BSA al 1% en una plataforma oscilante, a continuacion se anadio una dilucion adecuada, tal como 1:100, del anticuerpo primario y se dejo durante la noche a 4°C. Las celulas se lavaron a continuacion en 3 x 2 ml de PBS/BSA al 1% durante 5 minutos cada vez, y se anadio una dilucion adecuada, tal como 1:1000 de anti-IgG1 de raton de cabra Alexafluor 488 (Life Technologies, Reino Unido), del anticuerpo marcado secundario y se incubo en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las celulas se lavaron en 3 x 2 ml de PBS/BSA al 1% y a continuacion 3 x 2 ml de PBS y despues se enjuagaron brevemente en agua antes de montar con Vectashield/DAPI (Vector Labs, Reino Unido) y observar con un microscopio adecuado.

Alternativamente, se puede realizar la adicion de ZnSO4 10 mM, ZnCl2, 5% (vol:vol) N-etilpirrolidona, 5-10% de una solucion acuosa tal como agua, PBS o DMEM, 2,5% (vol:vol) de 1-Bencilimidazol o 1% (vol:vol) de Tetrametilurea al Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) antes de la fijacion celular para mejorar los resultados de la inmunohistoqmmica.

19. Fijacion de tejido de mamiferos con cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) para tincion o inmunohistoqmmica (IHC)

Se anadieron fragmentos de tejido de raton recien diseccionados, tales como hugado, rinon, pulmon, cerebro, musculo liso, esqueletico o cardfaco, bazo, timo, glandula salival, utero, testfculo, piel, ojo, lengua, esofago, estomago, intestino, pancreas, glandulas suprarrenales, vesfcula biliar, a 10 volumenes de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) y se incubaron entre 4°C o temperatura ambiente durante al menos una hora para permitir que se produjera la penetracion y la fijacion del tejido. Tambien son compatibles penodos de incubacion mas largos de mas de una hora, por ejemplo, 4, 8, 15, 24 o 72 horas. La muestra de tejido tambien se puede congelar y almacenar en la mezcla de cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) hasta que se necesite. El tiempo requerido para la fijacion del tejido dependera de una serie de factores que incluyen el tipo de tejido, el tamano, la densidad, el contenido de grasa, la forma, el area de superficie y el tipo de fijador. La determinacion del tiempo mmimo necesario para la fijacion de un tejido en particular se puede llevar a cabo simplemente incubando el tejido durante diferentes penodos de tiempo y a continuacion observando como se comporta el tejido durante el corte con el microtomo; el desgarro del tejido detectana un tiempo de fijacion insuficiente durante el paso de la cuchilla del microtomo. Un tiempo de fijacion suficiente conduce a una muestra robusta para la seccion con el microtomo pero tambien a la estabilizacion de ARN.

Despues de la fijacion en Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), el tejido se enjuaga brevemente en 10 volumenes de PBS antes de la deshidratacion en etanol del 70% durante 45 minutos, etanol del 80% durante 45 minutos, dos veces en etanol del 100% durante 30 minutos, dos veces en tolueno durante 30 minutos antes su inclusion en parafina (punto de fusion 56-58°C) a 65°C y 100°C durante 1 hora cada uno. El bloque de parafina que contiene el tejido fijado se deja enfriar a temperatura ambiente antes de cortar con el microtomo de acuerdo con los protocolos convencionales identicos a los utilizados para los tejidos fijados con formaldefndo. Los metodos detallados son expuestos por Al-Mulla y Gohlmann (2011) en Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). El tolueno se puede reemplazar por xileno o Histosol si fuera necesario.

La adicion de Sales de cinc 1-33 mM, preferiblemente 10-33 mM tales como Cloruro de cinc, Sulfato de cinc o Citrato de cinc al Cloruro de colina:Trifluoroacetamida mejora la velocidad de penetracion y fijacion del tejido por el fijador, mientras que la presencia adicional de Tamices moleculares de Tipo 4A mejoran la estabilizacion del ARN en la muestra.

La tincion de la seccion de tejido con hemotoxilina y eosina se realizo de acuerdo con metodos convencionales y bien conocidos.

20. Estabilizacion de ARN y DNA de celulas HeLa con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida despues de su inclusion en parafina

Se anadieron sedimentos de celulas HeLa (un millon de celulas) a 400 mg de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) que contema ZnCl210 mM y se fijaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las celulas fijadas se procesaron inmediatamente o se siguio un protocolo convencional de inclusion en parafina; (i) 30 minutos de inmersion en 1 ml de etanol del 100%, (ii) 15 minutos con 1 ml de tolueno, a continuacion una (iii) infiltracion de 15 o (iv) 60 minutos con 1 ml de parafina a 55°C. El ARN y el ADN se purificaron posteriormente (RNeasy, Qiagen, Alemania) y se determino el RlN (Agilent Bioanalyser 2100). El RIN del ARN de la celula HeLa disminuyo de 9,6 (Calle 1, control positivo) sin fijacion, a 8,6 (Calle 6) despues de la fijacion, la deshidratacion y la inclusion en parafina, lo que demuestra que aunque hubo cierta degradacion del ARN durante el procesamiento, la cantidad total fue muy aceptable. Tambien se encontro que la fijacion con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida dio como resultado una degradacion mucho menor del ARN que con las muestras tratadas con formaldefndo (datos no mostrados). La integridad de las muestras de ADN no cambio visiblemente, lo que demuestra que el ADN tambien se estabiliza durante la fijacion. Los resultados se muestran en la Figura 14.

21. Estabilizacion de ARN y ADN de tejido hepatico y renal de raton con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida despues de la inclusion en parafina.

Se anadieron fragmentos de 10 mg de hngado o rinon de raton a 400 pl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) que contema tanto ZnSO4 10 mM como tamices moleculares 4A (3% (peso:peso) o a 400 pl de PBS y se incubaron durante 64 horas a 4°C o 24°C. A continuacion, las muestras de tejido se procesaron de la siguiente manera: 60 minutos en etanol del 70%, 60 minutos en etanol del 80%, 60 minutos en etanol del 95%, dos veces 30 minutos en etanol del 100%, 60 minutos en etanol del 100%, dos veces 30 minutos en tolueno, 60 minutos en tolueno del 100%, 2 horas en parafina a 55°C, 5 horas en parafina a 55°C, la muestra incluida en la parafina se congelo a continuacion durante aproximadamente 2 semanas a -80°C. Posteriormente, el ARN y el ADN se purificaron retirando primero el tejido integrado del bloque de parafina con un bistun, y a continuacion lisis directa en 400 pl de tampon ^rL^tcon un mini kit RNeasy (Qiagen, Alemania) y el RIN se determino utilizando un kit de ARN total RNA 6000 Nano (Agilent Bioanalyser 2100, EE.UU.).

Los resultados se muestran en la Figura 15. Se encontro que tanto para las muestras de hngado (Calles 1-4) como de rinon (Calles 5-8), la integridad del ARN fue significativamente mejor despues del tratamiento con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida, ZnSO4 y de tamices moleculares (Calles 1, 2, 5, 6) en comparacion con PBS (Calles 3, 4, 7, 8). Como ejemplo, los valores de RIN se muestran en la Figura 14 y se encontro que disminuyeron de 7,5 a 2,4 al comparar Cloruro de colina:Trifluoroacetamida, ZnSO4 y Tamices moleculares (Calle 1) con p Bs (Calle 3) a 24°C, tambien se encontro que la calidad del ADN era significativamente mejor despues del tratamiento con Cloruro de colina:trifluoroacetamida, ZnSO4 y tamices moleculares.

22. Estabilizacion del ARN de celulas HeLa con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida, Sulfato de cinc y Tamices moleculares

Se realizo una comparacion del efecto de estabilizacion del ARN de anadir varias Sales de cinc y Tamices moleculares a Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) en muestras biologicas almacenadas con o sin agua anadida. Se utilizo un sedimento recien centrifugado de un millon de celulas HeLa como fuente de ARN, y se anadieron 400 pl de Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) a cada sedimento, a continuacion se anadio agua a una concentracion final de 10 o 15% (vol:vol) en presencia o ausencia de Sulfato de cinc 33 mM y Tamices moleculares tipo 4A al 33% (peso:peso) como se indica en la tabla. Las muestras se almacenaron durante 18 horas a 37°C antes de la purificacion del ARN utilizando columnas de centrifugado de silice (Invitek, Alemania) y la determinacion del Numero de Integridad del ARN (RIN) utilizando un Agilent Bioanalyser 2100 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Si bien la adicion de agua al sedimento de celulas HeLa/Cloruro de colina:Trifluoroacetamida reduce notablemente la integridad del ARN, la adicion de Sulfato de cinc o, mas preferiblemente, Sulfato de cinc y Tamices moleculares de Tipo 4A puede reducir sustancialmente la cantidad de degradacion del ARN cuando el agua esta presente como se indica por un aumento en el numero de RIN. Este es un medio particularmente util para mejorar la calidad del analito de la muestra cuando estan presentes cantidades sustanciales de agua (por ejemplo, mas de 10% de concentracion final en la solucion estabilizadora), tal como con muestras de tejidos mas grandes, sangre, suero, plasma o material vegetal. Tambien se puede obtener alguna mejora con muestras que contengan menos de 10% de agua cuando sea necesario un almacenamiento prolongado de la muestra.

Se ha encontrado que el Sulfato de cinc a 1-33 mM, preferiblemente 10 mM (concentracion final) es ligeramente mas eficaz para reducir la degradacion del ARN que el Cloruro de cinc o la Sal de cinc de EDTA, pero es significativamente mas efectivo que el gluconato de cinc, el acetato de cinc o el p-Toluenosulfonato de cinc (Tabla 2).

Tabla 7. Puntuaciones de RIN para ARN extraido de granulos de celulas HeLa.

Mezcla de DES (mol:mol) Aditivo Puntuacion RIN

1 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) - 8,4 2 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) agua al 10% 6,2 3 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) agua al 10% ZnSO433 mM 7,3 4 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) agua al 10%+ ZnSO433 mM Tamices moleculares 8,2 al 33%

5 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) agua al 15% 2,9 6| Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) agua al 15%+ ZnSO433 mM 5,3

23. Estabilizacion del ARN de celulas HeLa con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida con aditivos organicos

Se realizo una comparacion del efecto de estabilizacion del ARN de la adicion de N-Etilpirrolidona o Tetrametilurea a Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) en muestras biologicas almacenadas con o sin agua anadida. Se uso un sedimento recien centrifugado de un millon de celulas HeLa como fuente de ARN, y se anadieron 400 pl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) a cada sedimento, en presencia o ausencia de N-Etilpirrolidona al 2,5, 5%, 10 % o 20% (vol:vol), tetrametilurea al 5% o 20% (vol:vol) como se indica en la tabla. Las muestras se almacenaron durante 20 dfas a 24°C antes de la purificacion del ARN utilizando columnas de sflice (Mini Kit de ARN InviTrap Spin Universal Num. de Cat. 1060100200 Stratec Molecular, Alemania) y la determinacion del Numero de Integridad del ARN (RIN) utilizando un Agilent Bioanalyser 2100 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se encontro que tanto la N-etilpirrolidona como la tetrametilurea mejoraron la calidad del ARN en el sedimento de celulas HeLa despues de un almacenamiento prolongado en comparacion con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida solo.

Tabla 8: Rendimientos de ARN y calidad con N-Etilpirrolidona y Tetrametilurea.

Mezcla DES Aditivo Rendimiento de ARN ng/ul Calidad de ARN Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) - 219 7 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) N-etilpirrolidona al 2,5% 92 7 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) N-etilpirrolidona al 5% 87 8 Mezcla DES Aditivo Rendimiento de ARN ng/ul Calidad de ARN Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) N-etilpirrolidona al 10% 54 9 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) N-etilpirrolidona al 20% 139 9 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) Tetrametilurea al 5% 194 8 Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2) Tetrametilurea al 20% 211 7

La escala de calidad de ARN cualitativa es la siguiente; 0 (altamente degradado) a 10 (maxima calidad). El analisis de ARN en la Tabla 1 y 2 se llevo a cabo de la siguiente manera; electroforesis en gel de agarosa al 1% con 0,5x TAE, tenida con bromuro de etidio, seguida de un analisis visual de una fotograffa tomada con luz ultravioleta, de la integridad de las bandas de ARNr 18S y 28S. Una muestra de ARN con una puntuacion de calidad de ARN de 8 o mas tiene una razon de tincion con bromuro de etidio de ARNr 18S a 28S de 1:2, mientras que una muestra de ARN con una puntuacion de calidad de ARN de 5 tiene una razon de tincion de ARNr 18S a 28^sde aproximadamente 1:1.

24. Uso de diversas sales de amonio cuaternario y donadores de enlaces de hidrogeno.

No se pudo preparar un lfquido DES a temperatura ambiente (24°C) mezclando Cloruro de colina con cualquiera de Prolina, Oxamida, Pivalamida, 1-Etil-2-pirrol, 4-Formilmorfolina, Acetonil acetona, Carbonato de etileno, Tetrametilurea, N -Etilimidazol, 1-Bencilimidazol y/o 1,3-Dimetil-2-imidazolidona, a una razon 1:2 mol:mol. Las siguientes sales de amonio tampoco fueron capaces de formar lfquidos DES a temperatura ambiente; Fosfato de amonio y Acetato de amonio. Tanto el sulfato de amonio como el Cloruro de amonio podnan formar parcialmente, a 100°C pero no a 24°C, un lfquido a una razon mol:mol de 1:2 con Isotiocianato de guanidina, Sorbitol y/o Xilitol.

Tabla 9: Mezclas de dos componentes que utilizan una variedad de sales de amonio cuaternario. Componente 1 Componente 2 Razon (mol:mol) Liquido a 100°C Liquido a 24°C 1 Bromuro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sf Parcial 2 Cloruro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sf Sf 3 Yoduro de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sf No 4 Dihidrogenocitrato de Trifluoroacetamida 1:2 Sf No colina

5 Bitartrato de colina Trifluoroacetamida 1:2 Sf No 6 Betama Trifluoroacetamida 1:2 Sf Sf 7 Sulfato de amonio Trifluoroacetamida 1:2 No No 8 Sulfato de amonio Isotiocianato de guanidina 2:1 No No 9 Sulfato de amonio Isotiocianato de guanidina 1:2 Parcial No 10 Sulfato de amonio Xilitol 1:2 Parcial No 11 Sulfato de amonio Sorbitol 1:2 Parcial No 12 Cloruro de amonio Isotiocianato de guanidina 1:2 Parcial No 13 Cloruro de amonio Xilitol 1:2 Sf No 14 Cloruro de amonio Sorbitol 1:2 Sf No 15 Sulfato de amonio Trifluoroacetamida 1:2 No No

25. Estabilizacion del ARN en embriones de Drosophila m elanogaster

Se mezclaron 10 mg de embriones de D. melanogaster (0-24 horas) con 400 pl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) (Calles 1-3) o RNAlater (Calles 4-6) y se incubaron a 37°C durante cualquiera de 12 horas (Calles 1, 4), 2 dfas (Calles 2, 5) o 45 dfas (Calles 3, 6) antes de la purificacion del ARN (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Qiagen, Alemania). La calidad del ARN se muestra en la Figura 16, el ARN estabilizado con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida fue significativamente mejor que el del RNAlater.

26. Estabilizacion del ARN en brotes de hojas de A llium cepa.

Se mezclaron 10 mg de brotes de hojas de A. cepa con 400 |jl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) (Calles 1-3) o RNAlater (Qiagen, Alemania) (Calles 4-6) y se incubaron a 22°C durante 18 horas (Calles 1, 4), 3 dfas (Calles 2, 5) o 9 dfas (Calles 3, 6) antes de la purificacion del ARN (RNeasy Mini Kit, Num. de Cat. 74106, Alemania). La calidad del ARN se muestra en la Figura 17, el ARN estabilizado con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida fue significativamente mejor que el del RNAlater.

27. Aplicaciones de hibridacion in situ tras la estabilizacion con DES.

Las muestras de tejido se prepararon y se embebieron en parafina como se indica en el Ejemplo 21 utilizando Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) y ZnSO4 10 mM con un tiempo de fijacion de 1-24 horas a 4°C. Las muestras de tejido se procesaron despues de la siguiente manera; 60 min en etanol del 70%, 60 min en etanol del 80%, 60 min en etanol del 95%, dos veces 30 min en etanol del 100%, 60 min en etanol del 100%, dos veces 30 min en tolueno, 60 min en tolueno del 100%, 2 horas en parafina a 55°C y a continuacion 5 horas en parafina a 55°C. Despues de la preparacion en microtomo de las secciones de tejido en parafina (3-12 jm de espesor), la parafina se elimino utilizando xileno durante 10 minutos a temperatura ambiente, las secciones de tejido se hidrataron a continuacion incubando en etanol del 100%, etanol del 70%, etanol del 50%, etanol del 25% y a continuacion agua durante 5 minutos cada uno. A continuacion, las secciones de tejido se pueden tratar con proteinasa K (10 jg/ml) durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de enjuagar con PBS y pre-hibridar en 1 ml de tampon que contiene 500 j l de formamida ultrapura al 50%, 250 j l de 20xSSC, 50 j l de 10 jg / j l de ARNt de levadura y 20 j l de 50x de solucion de Denhardt y a continuacion hibridar con una sonda cromogenica o fluorescente apropiada. Los protocolos para hibridacion in situ son bien conocidos y descritos por J. M. Bridger y K Morris (2010), en Fluorescence in situ Hybridization (FISH): Protocols and Applications (Methods in Molecular Biology) and Summersgill et al., (2007) Nature Protoc. 3:220-234.

28. Preparacion de celulas para citometria de flujo.

Aproximadamente 500.000 celulas de cultivo tisular tales como HeLa, MCF-7, NCI60, PC3, Vero, GH3, MC3T3, ZF4 o IMR-90, si crecen en una superficie solida, se tripsinizaron ligeramente en primer lugar para separarlas, se mezclaron con 10 ml de EMEM/FBS al 10% y se centrifugaron en un tubo de 15 ml durante 10 minutos a 900 xg (24°C). El sedimento celular se resuspendio a continuacion en 100 j l de tampon DPBS y se mezclo inmediatamente con 1 ml de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) y se pipeteo suavemente con una pipeta de 10 ml para mezclar completamente. Se dejo que las celulas se fijaran durante 1-24 horas a 4°C o 24°C, a continuacion se anadieron 14 ml de DPBS, el contenido del tubo se mezclo mediante inversion suave y se centrifugo durante 10 minutos a 900xg y el sedimento celular se resuspendio suavemente en 100 j l de DPBS y los nucleos se tineron anadiendo 1 ml de DAPI (3 jM ) en tampon de tincion (Tris 100 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl21 mM), MgCh 0,5 mM, Nonidet P-40 al 0,1%) durante 15 minutos (24°C). Las celulas tenidas y fijadas se pueden utilizar para citometna de flujo. Se encontro que las celulas fijadas con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida eran monodispersadas y podfan clasificarse en las distintas etapas del ciclo celular de acuerdo con su fluorescencia.

29. Tratamiento en dos etapas de muestras biologicas

Se anadieron fragmentos de 10 mg de tejido de raton a 400 j l de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) que contema ZnSO4 10 mM y tamices moleculares 4A (3% (peso:peso) se incubaron a 24°C durante 1 hora, a continuacion se retiro el tejido, se froto brevemente con una toalla de papel para eliminar el exceso de estabilizante antes de la inmersion subsiguiente en, por ejemplo, 400 j l de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), Cloruro de colina:Urea (1:2 mol:mol), Cloruro de colina:Sorbitol (1:2 mol:mol), Cloruro de betama:Trifluoacetamida (1:2 mol:mol) o paraformaldetndo al 4% y a continuacion se incubo y almaceno durante al menos una hora, pero preferiblemente durante la noche. Alternativamente, una cualquiera de una serie de mezclas de DES segun lo establecido en esta solicitud puede servir como la primera solucion de estabilizacion o fijacion seguida de una segunda solucion de estabilizacion o fijacion. Como un ejemplo mas, la fijacion de tejido puede realizarse primero con, por ejemplo, paraformaldetndo al 4% durante una hora a temperatura ambiente y a continuacion transferir el tejido a 400 j l de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) que contiene tanto ZnSO4 10 mM como tamices moleculares 4A (3% (peso:peso). Este procedimiento de dos etapas proporciona un medio por el cual, por ejemplo, el estabilizador optimo para la morfologfa celular puede combinarse posteriormente con el estabilizador optimo para ARN, ADN y protemas. Tambien proporciona un medio por el cual el contenido de agua que se origina en la muestra biologica puede reducirse cambiando la mezcla estabilizadora original. Sera evidente para un experto en la tecnica que existen muchas combinaciones de la primera y la segunda mezclas y que las opciones mas apropiadas tendran que determinarse, al menos en parte, por medios empmcos, tales como la calidad de las secciones de tejido tenidas con H y E y la calidad del ARN. Tambien se debe tener en cuenta que las mezclas de estabilizacion y fijacion utilizadas pueden ser lfquidas o solidas.

30. Compatibilidad de las mezclas de DES con guanidina y reactivos de purificacion de fenol.

Ventajosamente, el Cloruro de colina:trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) es completamente soluble y compatible tanto con tiocianato de guanidina como con el virus basado en HCI, tampones de lisis celular y tisular tales como los que se encuentran en estos kits de purificacion de ARN; RNeasy Mini, (Qiagen, Alemania), PureLink™ (Life Technologies, EE.UU.), MagNA Pure LC ARN Isolation Kit III, High Pure ARN Tissue Kit y ARN Micro Amplicor HcV (Roche Applied Science, EE.UU.), NucleoSpin® Multi-8 Virus RAV (Macherey Nagel, Alemania), TEMPUS™ Blood ARN Tube (Applied Biosystems, EE.UU.), SV ARN Kit y PureYield™ Kit (Promega, EE.UU.), ToTALLY ARN™ (Ambion, EE.^uU.), GenElute™ Mammalian Total TNA Purification (Sigma-Aldrich, EE.UU.), PAXgene™ Blood ARN Kit (PreAnalytix, Alemania) y reactivos de purificacion a base de fenol tales como TRIzol (Life Technologies, EE.UU.) que permiten que muestras estabilizadas con Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) se mezclen directamente con guanidina o reactivos de purificacion de fenol sin necesidad de separar la muestra del Cloruro de colina:Trifluoroacetamida. Esto puede ser ventajoso cuando, por ejemplo, no es practico separar una muestra de tejido en la que se ha introducido el fijador, o cuando celulas individuales tales como las celulas de cultivo de tejidos, la sangre o las CTC se mezclan con un volumen mucho mayor de fijador y pueden ser diffciles o imposibles de separar por centrifugacion. Como punto de referencia, las celulas de mamfferos en RNAlater (Qiagen, Alemania) no se pueden sedimentar mediante centrifugacion o el ARN purificado mezclando la celula mas RNAlater con los tampones de lisis de guanidina, ya que los rendimientos de ARN disminuyen drasticamente.

Como ejemplo, se ha encontrado que el ARN que contiene muestras que contienen tan poco como 6% (Muestra 5, Tabla l0) o menos de Tampon RLT en Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), puede, al mezclarse con un volumen de etanol del 70% ser utilizado para unir eficazmente el ARN a una membrana de columna de centrifugado de silice (RNeasy mini, Qiagen, Alemania) con excelente rendimiento y pureza como se muestra en la Tabla 10. Se preparo un producto lisado de Imgado de raton lisando 100 mg de Imgado en 1 ml del tampon RLT, a continuacion se anadieron porciones de 20 pl del producto lisado al tampon RLT y a continuacion el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida, antes de mezclar con etanol del 70% como se muestra en la Tabla 10 y unir a una columna Rneasy Mini Spin. El ARN se purifico a continuacion de acuerdo con las instrucciones del fabricante (RNeasy mini, Qiagen, Alemania) con un volumen de elucion de 50 pl de agua. Los rendimientos de ARN y la pureza se determinaron utilizando un Nanodrop ND-1000. Se descubrio sorprendentemente que el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida no solo permitfa que la actividad caotropica de la guanidina funcionara para lisar la muestra, sino que no tema efecto en la union del ARN a la membrana de la columna de silice, por lo que los rendimientos no se vieron afectados o aumentaron ligeramente.

Ademas, el Cloruro de colina:Ttrifluoroacetamida puede reemplazar la funcion esencial de union al ARN del etanol del 70% cuando se anade al producto lisado de guanidina (20 pl), el protocolo convencional del fabricante (RNeasy Mini, Qiagen, Alemania), y como se muestra en la Tabla 11, requiere adicion de un volumen de etanol del 70% a producto lisado para permitir que el ARN se una a la membrana de sflice. Sin embargo, si no se anade etanol del 70%, el ARN no se puede unir a la membrana de sflice, y si la muestra contiene Cloruro de colina:trifluoroacetamida, el ARN puede unirse incluso en ausencia de etanol, esto proporciona un medio para reducir el numero de etapas y mejorar el procedimiento de purificacion de ARN, por ejemplo, el kit RNeasy sin la necesidad de utilizar lfquidos inflamables. Cabe senalar que ni el Cloruro de colina ni el Cloruro de colina:Urea disuelto en el tampon RLT (1:1 peso:peso) tienen esta propiedad, mientras que la Trifluoroacetamida sola disuelta en tampon RLT (1:1 peso:peso) condujo a solo 15% de rendimiento de ARN en comparacion con el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida disuelto en tampon RLT (1:1 peso:peso). Tambien se descubrio que una mezcla 1:1 de Tampon RLT: (Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) tema muy buena actividad de lisis de celulas HeLa y se podfa utilizar como tampon de lisis y union a la membrana de sflice independiente, en ausencia de etanol del 70%, los rendimientos de ARN con esta nueva mezcla fueron significativamente mejores que con el Tampon RLT solo.

Sorprendentemente, se encontro que un producto lisado de celulas HeLa preparado en 200 pl de una mezcla 1:1 de Tampon RLT: (Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), cuando se calienta a 65°C durante 10 minutos, seguido de la adicion de 1 volumen de etanol al 70% y union a una columna de silice (RNeasy Mini, Qiagen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante dieron como resultado la purificacion exclusiva del ARN pequeno (miARN, ARNt y ARNr 5S). Si se omitio la etapa de calentamiento, ARN total se purifico incluyendo las especies de ARNr 18 y 28s . Por lo tanto, el calentamiento ofrece un metodo novedoso para purificar selectivamente el ARN pequeno de un producto lisado celular. Reemplazando la trifluoroacetamida por urea en la mezcla de lisis y a continuacion el calentando se produjo una degradacion extrema del ARN, igual que calentando el producto lisado en ausencia de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida.

Tabla 10. Rendimientos de ARN de mezclas de guanidina/cloruro de colina:trifluoroacetamida.

Volumen RLT Volumen de cloruro de Volumen 70% OD Rendimiento de (guanidina) colina:trifluoroacetamida de etanol 260/280nm ARN ng/ul

1* 350 pl 0 pl 350 pl 2,05 171

2 150 pl 170 pl 350 pl 2,25 192

3 | 100 pl 220 pl 350 pl 2,22 203

Volumen RLT Volumen de cloruro de Volumen 70% OD Rendimiento de (guanidina) colina:trifluoroacetamida de etanol 260/280nm ARN ng/ul 4 50 j l 70270 j l 350 j l 2,2 198

5 0 j l 330 j l 350 j l 1,53 200

6 | 170 j l 170 j l 0 j l 2,21 52

* Ejemplo comparativo.

Tabla 11. Rendimientos de ARN de mezclas de Guanidina/Cloruro de colina:Trifluoroacetamida en ausencia de etanol para la union.

Volumen RLT Volumen y Tipo de DES Volumen de DO 260/280 Rendimiento de (guanidina) Etanol del 70% nm ARN ng/ul 1* 330 j l 0 j l de Cloruro de 0 j l 1,98 3

colina:Trifluoroacetamida

2 230l 90 j l de Cloruro de 0 j l 1,84 6,5

colina:Trifluoroacetamida

3 150 j l 170 j l de Cloruro de 0 j l 2,04 143

colina:Trifluoroacetamida

4 100 j l 220 j l de Cloruro de 0 j l 2,04 132

colina:Trifluoroacetamida

5 50 j l 270 j l de Cloruro de 0 j l 2,05 192

colina:Trifluoroacetamida

6 0 j l 330 j l de Cloruro de 0 j l 2,03 247

colina:Trifluoroacetamida

7 | 150 j l 170 j l Cloruro de colina:Urea 0 j l 2,14 9

* Ejemplo comparativo.

31. Estabilizacion del ARN Total en bacterias

Se anadieron 300 |jl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) a un sedimento de 10 mg de Escherichia coli DH5a y se incubo a 22°C durante 18 horas, a continuacion se elimino el l^quido DES y se anadieron 400 j l de Tampon RLT al sedimento, o se anadieron 400 j l de Tampon RLT directamente al sedimento y al Kquido DES, el tubo se sometio a agitacion vorticial durante 20 segundos, a continuacion se sometio sonicacion brevemente para romper las celulas y se continuo con la purificacion del ARN utilizando un kit RNeasy Mini de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Alemania). Se encontro que la integridad del ARNr 16 y 23S no se modifico en comparacion con el ARN extrafdo de un sedimento bacteriano fresco. Alternativamente, se puede anadir ZnSO4 al Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) para proporcionar una concentracion final de 1-33 mM, preferiblemente 33 mM y 10% (peso:peso) Tambien se pueden anadir tamices moleculares opcionalmente para mejorar la estabilizacion.

32. Mezclas de DES multicomponente

Se ha encontrado que se puede preparar simplemente una mezcla de DES estabilizadora de ARN mezclando mas de dos componentes juntos tales como Betama:Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (0,5:0,5:2 mol:mol:mol) en lugar de Betama:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) o Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol). Alternativamente, se pueden preparar nuevas mezclas de DES, por ejemplo, Cloruro de colina:Urea:Trifluoroacetamida (1:1:1 mol:mol:mol) o Betama:Urea:Trifluoroacetamida (1:1:1 mol:mol:mol) o incluso Betama:Cloruro de colina:Urea:Trifluoroacetamida (0,5:0,5:1:1 mol:mol:mol:mol). Dichas mezclas de DES de tres o mas componentes pueden tener propiedades novedosas interesantes, tales como viscosidad reducida, vida util mejorada, estabilidad mejorada del acido nucleico o propiedades de fijacion celular basadas en las interacciones y propiedades de todos los componentes juntos en una sola mezcla de DES.

Como ejemplo, a un sedimento de HeLa (500,000 celulas) se le anadieron 400 mg de Cloruro de colina;Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), Betama:Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (0,5:0,5:2 mol:mol:mol) o Betama:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), conteniendo cada una ZnSO4 10 mM y se incubo durante la noche a 37°C seguida de purificacion de ARN y ADN utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen, Alemania) y determinacion del RIN (Agilent Bioanalyser 2100, EE.UU.).

Resultara evidente para un experto en la tecnica que son posibles muchas de estas mezclas de DES, con componentes variables y concentraciones molares, y la mezcla mas apropiada para la aplicacion debera determinarse empmcamente.

Tabla 12. Comparacion de ARN, rendimientos de ADN y numero de integridad del ARN (RIN) de tres mezclas diferentes de DES en celulas HeLa incubadas durante la noche a 37°C.

Mezcla DES (incluyendo ZnSO410 mM) ARN ng/ul ADN ng/ul RIN 1 Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol), 251 36 9,3 2 Betama:Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (0,5:0,5:2 mol:mol:mol) 229 42 9,5 3 Betama:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) 182 30 9,4 33. Mezclas acuosas de DES para la fijacion celular

Se ha encontrado que las diluciones acuosas de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) son capaces de fijar celulas de tejido tisular y tejidos. Se anadio medio de cultivo tisular DMEM (Life Technologies, Francia) a una solucion de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida para proporcionar una concentracion final de DMEM de 0, 6, 12, 21 o 50%, a continuacion se anadieron porciones de 400 pl de la mezcla a las celulas del cultivo de tejidos HeLa en una placa de 24 pocillos y se observaron con un microscopio. Se descubrio que, si bien todas las mezclas podfan reparar las celulas sin efectos hipo- o hipertonicos sobre las celulas, el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida que contema DMEM al 6% condujo a una morfologfa celular de la mejor calidad, superior incluso al Cloruro de colina:Trifluoroacetamida puro. Cabe senalar que las diluciones de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida con mas de 15% de agua pueden hacer que la membrana celular forme microgotas y a continuacion se pierda de la celula, cuyo citoplasma permanece intacto. Las diluciones acuosas de un DES proporcionan un medio simple para reducir la viscosidad y el coste, asf como para mejorar potencialmente las propiedades de fijacion celular, sin embargo, la presencia de agua tiene un efecto perjudicial sobre la estabilidad del ARN. Sera evidente para un experto en la tecnica que se puede mezclar una gran cantidad de diferentes soluciones acuosas como agua, PBS, DPBS, soluciones de azucar o DMEM con diferentes DES y que el efecto sobre la fijacion celular y la estabilidad de la biomolecula puede tener que ser comprobado empmcamente

34. Actividad antibacteriana de las mezclas de DES (ejemplo de referencia)

Los sedimentos de 1 x 109 celulas de E. coli DH5a se trataron con 90 pl de una dilucion acuosa de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) para proporcionar una concentracion final de 90%, 9% o 0,9%, durante 25 minutos a temperatura ambiente y a continuacion se colocaron en una placa de agar y se incubaron durante la noche a 37°C para permitir el crecimiento de la colonia. Se encontro que el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida al 90%, pero no las diluciones al 9% o al 0,9%, detuvo todo el crecimiento bacteriano y la formacion de colonias. Parece que el Cloruro de colina:Trifluoroacetamida, por lo tanto, tiene una poderosa actividad antibacteriana, y sera evidente para un experto en la tecnica que penodos de tratamiento mas largos o diferentes mezclas de DES pueden conducir a un anti-efecto aun mas fuerte. Ventajosamente, se esperana que el crecimiento bacteriano se inhibiera en muestras de tejido almacenadas en Cloruro de colina:Trifluoroacetamida deteniendo el deterioro.

35. Preparacion in situ de un liquido DES

Si bien generalmente es conveniente preparar una mezcla de DES antes de su uso para la fijacion y la estabilizacion, una alternativa es anadir los dos o mas componentes del DES juntos como solidos y al mismo tiempo que la muestra. Por ejemplo, en un solo tubo, se anadieron 1,28 g de solido de Cloruro de colina a 2 g de solido de Trifluoroacetamida y a continuacion se anadieron 50-100 pl de sangre completa o 25 mg de muestra de tejido y se dejo que los solidos se mezclaran libremente y formaran una mezcla eutectica (1:2 mol:mol) en presencia de la muestra biologica. Alternativamente, los dos solidos se pueden anadir como dos capas precargadas en un recipiente adecuado, tal como un tubo de recoleccion de sangre, pero separados por una membrana que se rompe o se disuelve en contacto con la muestra, lo que permite que los componentes se mezclen y formen el lfquido DES solo en presencia de la muestra. Otra posibilidad es tener dos compartimientos abiertos en un recipiente superior adecuadamente cerrado, cada uno de los cuales se precarga con una cantidad apropiada de, por ejemplo, Cloruro de colina y el otro Trifluoroacetamida. Al agitar o invertir, los dos componentes pueden mezclarse libremente y formar un lfquido DES, si fuera necesario en presencia de la muestra.

36. Estabilizacion del ARN con celulas de cultivo de tejidos adherentes

Se cultivaron celulas de Fibroblastos Embrionarios Humanos (HEF) hasta 80% de confluencia (aproximadamente 200.000 celulas) en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos, se retiro el medio de crecimiento y se reemplazo por 400 pl de Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) o RNAlater y se incubo a 37°C durante 0, 32 horas o 9 d^as antes de la purificacion de ARN y el analisis de RIN (Agilent Bioanalyser). La Tabla 13 muestra que el ARN celular de cultivo de tejido adherente se puede conservar extremadamente bien utilizando Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol).

Tabla 13. Puntuaciones RIN para el ARN extraido de celulas adherentes de Fibroblastos Embrionarios Humanos (HEF) almacenadas a 37°C.

Tratamiento Hora RIN 1 Control 0 9,1 2 Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) 32 horas 9,1 3 Cloruro de colina:Trifluoroacetamida (1:2 mol:mol) 9 dfas 8 4 Control 0 8,8 5 RNAlater® 32 horas 9,4 6_1RNAlater® 9 dfas 7,6

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un disolvente eutectico profundo para inhibir la degradation de una biomolecula, en donde la biomolecula se selecciona entre un ARN y un ADN, opcionalmente en donde la biomolecula esta presente en una muestra o tejido, opcionalmente en donde la muestra o tejido comprende un tejido solido, plasma, suero o sangre completa, adicionalmente de manera opcional en donde la sangre completa incluye una celula tumoral circulante.

2. El uso de un disolvente eutectico profundo como fijador de un virus, celula o tejido para producir un virus, celula o tejido fijado, opcionalmente:

(a) en donde el tejido es sangre completa, opcionalmente en donde la sangre completa incluye una celula tumoral circulante, o un tejido solido; y/o

(b) que comprende adicionalmente procesar la celula o tejido fijados, cuyo procesamiento comprende uno o mas metodos seleccionados entre inclusion, corte, tincion, microscopia, hibridacion in situ, citometria de flujo, un metodo inmunohistoqmmico y un metodo inmunocitoqmmico.

3. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde:

(a) el disolvente eutectico profundo es un disolvente eutectico profundo de tipo III o tipo IV, en donde el ARN extraido de 10 mg de una muestra de higado de rata incubada a 24°C durante 20 dias con 400 mg del disolvente eutectico profundo tiene un numero de integridad den ARN de al menos 4,0 segun lo medido con un Agilent Bioanalyser 2100; y/o

(b) al menos 75% de las celulas HeLa cultivadas sobre un sustrato e incubadas a 24°C durante 1 hora con el disolvente eutectico profundo permanecen adheridas al sustrato despues de reemplazar el disolvente eutectico profundo con agua e incubar a 24°C durante 1 hora; y/o

(c) el disolvente eutectico profundo es un disolvente eutectico profundo de tipo III, y en donde el disolvente eutectico profundo comprende un compuesto que comprende un grupo trifluorometilo; y/o

(d) el disolvente eutectico profundo tiene un pH en el intervalo de 5 a 7,5, en donde opcionalmente el disolvente eutectico profundo tiene un pH en el intervalo de 6 a 7.

4. El uso de acuerdo con cualquier revindication precedente, en donde el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es un compuesto de Formula I:

en donde:

R6 es H u OH;

R7 se selecciona entre H, CH3, CI, Br, un oxigeno carbonflico, y

Z se selecciona entre -CH2-, O y S;

R8 es Rn o OH; y

en donde:

A se selecciona entre O, S y NH;

R1 se selecciona entre H, un grupo alqueno que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, Rg, -NH2, -NH-(CH2)nCH3 y -C(R3)(R4)(R5);

en donde n es 0 o un numero entero de 1 a 5;

R3 es un anillo aromatico o alifatico de 506 miembros opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es R10;

R4 y R5 son cada uno independientemente H o F; y

en donde R9, R10 y R11 cada uno se selecciona independientemente entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, y grupos mono-, di- o trifluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono.

5. El uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde:

(a) R1 se selecciona entre H, -CH=CH2, R9, -NH2, -NHCH3 y -C(R3)(R4)(R5);

R2 se selecciona entre H y -CH3;

R3 es un anillo aromatico o alifatico de 506 miembros opcionalmente sustituido,

en donde el sustituyente es R10;

R4 y R5 son cada uno independientemente H o F; y

en donde cada uno de R9, R10 y R11 se selecciona independientemente entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono y grupos mono-, di- o tri-fluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono; y/o

(b) en donde A es O o S o en donde A es NH; y/o

(c) en donde R2 es H; y/o

(d) en donde R1 se selecciona entre -NH2 y -NHCH3; y/o

(e) en donde R7 es H o en donde R7 es

opcionalmente:

(i) en donde Z es O o S y/o

(ii) en donde R8 es Rn, opcionalmente en donde R11 tiene un atomo de carbono o tres atomos de carbono; o (iii) en donde Z es CH2, opcionalmente en donde R8 es OH; y/o

(f) en donde el primer componente comprende adicionalmente un contraion, cuyo contraion es un anion haluro, opcionalmente en donde el anion haluro se selecciona entre cloruro, bromuro y yoduro, adicionalmente de manera opcional en donde el anion haluro es cloruro; y/o

(g) en donde la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta en el intervalo 1:3 a 2:1, 1:1,5 a 1:2,5, o 1:2.

6. Uso de acuerdo con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en donde R1 se selecciona entre H, R9, -CH=CH2 y C(R3)(R4)(R5), opcionalmente:

(a) en donde R1 es R9, ademas opcionalmente

(i) en donde R9 tiene un atomo de carbono, opcionalmente en donde R9 es un grupo mono-, di- o trifluorometilo; o

(ii) en donde R9 tiene dos atomos de carbono, opcionalmente en donde R9 es un grupo mono-, di- o trifluoroetilo; o

(b) en donde R1 es C(R3)(R4)(Rs), adicionalmente de manera opcional

(i) en donde R4 y R5 son F y/o

(ii) en donde R3 es un anillo aromatico de 6 miembros opcionalmente sustituido, en donde R3 es un grupo fenilo opcionalmente sustituido, adicionalmente de manera opcional, en donde el sustituyente esta en la posicion 2 del grupo fenilo y/o en donde el sustituyente es un grupo mono-, di- o tri-fluorometilo.

7. El uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el segundo componente se selecciona entre acetamida, 2-cloroacetamida, trifluoroacetamida, trifluorotioacetamida, N-metiltrifluoroacetamida, 2,2-difluoropropanamida, 3,3,3-trifluoropropanamida, formamida, acrilamida, 2,2-difluoro-2-fenilacetamida, 2-(trifluorometil)fenilacetamida, urea, tiourea, 1,3-dimetilurea y guanidina, opcionalmente en donde la guanidina esta presente en forma de una sal hidroisotiocianato.

8. El uso de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde el primer componente comprende colina, bromocolina, acetilcolina, acetiltiocolina o butirilcolina, o en donde el primer componente es carnitina.

9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde:

(a) el primer componente es N,N,N-trimetilglicina y opcionalmente, en donde el segundo componente se selecciona entre trifluoroacetamida y urea; o

(b) en donde el primer componente es cloruro de colina, opcionalmente en donde el segundo componente se selecciona entre trifluorotioacetamida; 3,3,3-trifluoropropanamida; 2,2-difluoro-2-fenilacetamida; tiourea y urea, y adicionalmente de manera opcional en donde el segundo componente es trifluorotioacetamida.

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde:

(I) el primer componente es una sal haluro de colina; y en donde el segundo componente es un imidazol opcionalmente sustituido, en donde el o cada sustituyente es un grupo alquilo que tiene 1 a 3 atomos de carbono, y opcionalmente en donde:

(a) la sal haluro de la colina es cloruro de colina; y/o

(b) el imidazol no esta sustituido o en donde el imidazol es un metilimidazol, opcionalmente N-metilimidazol o 4-metilimidazol; y/o

(c) en donde la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta en el intervalo de 2,8:1 a 2:1;

o

(II) en donde el primer componente comprende un compuesto de Formula III:

en donde:

R6 es H u OH;

R7 se selecciona entre H, CH3, Cl, Br, un oxigeno carbonflico, y

Z se selecciona entre -CH2-, O y S;

en donde Rs se selecciona entre OH, un grupo alquilo que tiene de uno a tres atomos de carbono, un grupo monocloroalquilo que tiene de uno a tres atomos de carbono, y un grupo mono-, di- o trifluoroalquilo que tiene de uno a tres atomos de carbono; y

en donde el segundo componente es un azucar o un alcohol de azucar que tiene al menos 3 atomos de carbono, y opcionalmente en donde:

(a) el alcohol de azucar se selecciona entre glicerol, xilitol y sorbitol, opcionalmente en donde el alcohol de azucar es sorbitol; o

(b) el azucar es trehalosa; y/o

(c) el primer componente comprende colina, en donde opcionalmente el primer componente es cloruro de colina; y/o

(d) la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta en el intervalo de 1:2 a 2:1, opcionalmente, en donde la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta en el intervalo de 1:0,8 a 1:1,2;

o

(III) en donde el primer componente es un haluro de cinc (II) o haluro de circonio (IV), y en donde el segundo componente es un compuesto de Formula IV:

en donde:

A se selecciona entre O, S y NH;

R₁se selecciona entre H, un grupo alqueno que tiene de 1 a 6 atomos de carbono, R9, -NH2, -NH-(CH2)nCHsy-C(R3)(R4)(R5);

en donde n es 0 o un numero entero de 1 a 5;

R3 es un anillo aromatico o alifatico de 5 0 6 miembros opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es R10;

R4 y R5 son cada uno independientemente H o F; y

en donde R9 se selecciona entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, y grupos mono-, di- o tri-fluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, opcionalmente en donde

(a) el primer componente se selecciona entre urea, ZnCl2, y ZrCl4 y/o

(b) la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta en el intervalo de 1:3 a 1:4;

o

(IV) en donde el primer componente comprende colina y en donde:

(a) el segundo componente es un alcanodiol que tiene de 5 a 7 atomos de carbono, opcionalmente en donde el alcanodiol es hexanodiol; o

(b) el segundo componente comprende una N-alquilpirrolidona, en donde el grupo N-alquilo tiene de 1 a 5 atomos de carbono, opcionalmente en donde la N-alquilpirrolidona es N-metilpirrolidona; o (c) el segundo componente comprende beta-mercaptoetanol; o (d) el segundo componente comprende ditiotreitol;

o

(V) en donde el primer componente es cloruro de colina, opcionalmente

(a) en donde el segundo componente es urea y/o en donde la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente esta en el intervalo de 0,8:2 a 1,2:2.

11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el disolvente eutectico profundo comprende un primer componente y un segundo componente, en donde el primer componente es un compuesto de Formula V:

en donde:

Y- es Cl- o Br-, opcionalmente en donde Y- es Cl-;

X es N o P;

en donde:

A se selecciona entre O, S y NH;

R₁se selecciona entre H, -Ch=CH2, R9, -NH2, -NHCH3 y -C(R3)(R4)(R5);

R2 se selecciona entre H y -CH3;

R3 es un anillo aromatico o alifatico de 506 miembros opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es R10; y

R4 y R5 son cada uno independientemente H o F;

en donde cada uno de R9 y R10 se selecciona independientemente entre grupos alquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, grupos monocloroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, y grupos mono-, di- o tri-fluoroalquilo que tienen de uno a tres atomos de carbono, opcionalmente

(i) en donde A es O o S y/o

(ii) en donde R1 se selecciona entre -NH2 y -NHCH3; y/o

(iii) en donde la razon molar del primer componente con respecto al segundo componente es de 1:1,5 a 1:2,5, opcionalmente de 1:1,8 a 1:2,2.

12. El uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde:

(a) el compuesto de Formula V es una sal de amonio cuaternario, opcionalmente en donde cada uno de R12, R13, R14 y R15 se selecciona independientemente entre grupos alquilo lineales que tienen de 1 a 4 atomos de carbono, adicionalmente de manera opcional

(i) en donde R12, R13, R14 y R15 son cada uno grupos metilo o

(ii) en donde R12, R13, R14 y R15 son cada uno grupos etilo o

(iii) en donde R12, R13, R14 y R15 son cada uno grupos butilo;

o

(b) el primer componente se selecciona entre cloruro de tetrametilamonio, cloruro de tetraetilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, bromuro de tetrabutilamonio, bromuro de metiltrifenilfosfonio, urea, trifluorotioacetamida y trifluoroacetamida;

o

(c) en donde el primer componente comprende:

o metiltrifenilfosfonio;

o

(d) en donde X es P, opcionalmente en donde al menos uno de R12, R13, R14 y R15 es un grupo fenilo.

13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde el disolvente eutectico profundo comprende adicionalmente 1-bencilimidazol;

y/o en donde el disolvente eutectico profundo comprende adicionalmente tetrametilurea;

y/o en donde el disolvente eutectico profundo comprende agua en una cantidad de hasta 50% en peso del disolvente eutectico profundo, opcionalmente en donde el disolvente eutectico profundo comprende agua en una cantidad en el intervalo de 5% a 10% en peso del disolvente eutectico profundo;

y/o en donde el disolvente eutectico profundo comprende adicionalmente al menos un aditivo seleccionado entre un colorante, un tinte, un detergente, una sal de amonio cuaternario, una saponina, un antimicrobiano, un desecante, una sonda, un control interno, un antioxidante, un inhibidor de ribonucleasa, un tampon, un quelante, un gas disuelto, un alcohol y un precipitante de protemas; opcionalmente

(a) en donde el al menos un aditivo se selecciona entre sulfato de cinc, cloruro de cinc, sal de cinc de EDTA, sulfato de amonio, tosilato de amonio y sorbitol, adicionalmente de manera opcional

(i) en donde el al menos un aditivo es sulfato de cinc y/o

(ii) en donde el disolvente eutectico profundo comprende adicionalmente sorbitol en una cantidad en el intervalo de 2,5% a 12,5% en peso del disolvente eutectico profundo y/o

(iii) en donde el disolvente eutectico profundo comprende adicionalmente gel de sflice en una cantidad en el intervalo de 40% a 60% en volumen; y/o

(b) en donde el al menos un aditivo esta presente en el disolvente eutectico profundo en una cantidad en el intervalo de 0,01% a 1% en peso del disolvente eutectico profundo, opcionalmente en donde el al menos un aditivo esta presente en una cantidad en el intervalo de 0,01% a 0,2% en peso del disolvente eutectico profundo; o en donde el al menos un aditivo esta presente en el disolvente eutectico profundo en una cantidad en el intervalo de 0,5% a 1,5% en peso del disolvente eutectico profundo, opcionalmente

(i) en donde el al menos un aditivo esta presente en el disolvente eutectico profundo en una cantidad en el intervalo de 0,8% a 1,2% en peso del disolvente eutectico profundo; y/o

(ii) en donde el al menos un aditivo es cloruro de cinc.

14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, en donde el disolvente eutectico profundo comprende adicionalmente una N-alquil pirrolidona, en donde el grupo N-alquilo tiene 1 a 5 atomos de carbono, opcionalmente

(a) en donde la N-alquilpirrolidona es:

(i) N-metilpirrolidona o

(ii) N-etilpirrolidona, opcionalmente en donde el segundo componente es trifluoroacetamida; y/o

(b) en donde la N-alquilpirrolidona esta presente en el disolvente eutectico profundo en una cantidad en el intervalo de 2% a 20% en peso del disolvente eutectico profundo.

15. Un aparato adecuado para la fijacion celular o tisular y/o para inhibir la degradacion de una biomolecula, cuyo aparato comprende:

una primera capa de disolvente eutectico profundo formada por un primer disolvente eutectico profundo; y una cavidad en la primera capa de disolvente eutectico profundo para recibir una muestra que comprende una biomolecula;

en donde el primer disolvente eutectico profundo es un solido o un gel;

opcionalmente:

(a) que comprende adicionalmente una segunda capa de disolvente eutectico profundo formada por un segundo disolvente eutectico profundo,

en donde la segunda capa de disolvente eutectico profundo encierra la cavidad; y

en donde el segundo disolvente eutectico profundo es un solido o un gel; y/o

(b) en donde el primer y/o segundo disolvente eutectico profundo es un disolvente eutectico profundo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, opcionalmente

(i) en donde el primer y/o segundo disolvente eutectico profundo incluyen un componente seleccionado entre 3,3,3-trifluoropropanamida, 2,2-difluoro-2-fenilacetamida, urea y tiourea; y/o

(ii) en donde el primer y/o segundo disolvente eutectico profundo incluyen un componente seleccionado entre cloruro de colina, yoduro de butirilcolina y N,N,N-trimetilglicina y/o

(c) en donde el aparato comprende adicionalmente un recuperador seleccionado entre un alambre, un alfiler, un cepillo, un testigo, una malla, una membrana permeable, un lecho polimerico y un soporte de plastico, cuyo recuperador se puede asociar de manera extrafble con la muestra; y/o

(d) en donde el primer y/o segundo disolvente eutectico profundo comprenden una matriz de soporte seleccionada entre polietilenglicol, agarosa, poliacrilato y celulosa.