ES2709217T3 - Enzimas y métodos para la síntesis del estireno - Google Patents

Abstract

Una célula hospedadora que comprende: (a) una proteína de fusión expresada recombinantemente que comprende un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa; y (b) un transportador unido a la membrana expresado recombinantemente.

Description

DESCRIPCION

Enzimas y metodos para la slntesis del estireno

INCORPORACION DEL LISTADO DE SECUENCIAS

[0001] En la presente memoria se proporciona y se incorpora a modo de referencia una copia en papel del listado de secuencias y una copia en soporte informatico del listado de secuencias que contiene el archivo con el nombre «32990-5_ST25.txt», el cual tiene un tamano de 151.674 bytes (medido en MS-DOS). Este listado de secuencias consiste en las SECs. N.° ID: 1-44.

ANTECEDENTES

[0002] La tecnologla objeto de esta invencion por lo general se refiere a enzimas y metodos para la bioslntesis de estireno.

[0003] El estireno (vinilbenceno) es un compuesto organico con la formula qulmica CsHs. Este hidrocarburo clclico es un llquido incoloro y oleoso que se evapora facilmente y que tiene un olor dulce similar al del caucho. A concentraciones mas elevadas, el estireno emite un olor menos agradable. El estireno tiene el mismo nombre que los arboles del genero Styrax (Styrax platanifolius), de los que se puede extraer savia (un tipo de resina de benjul). Varias especies de planta contienen estireno de manera natural en concentraciones bajas. Diversos alimentos, como las frutas, las verduras, los frutos secos, las bebidas y las carnes tambien contienen estireno.

[0004] En un plano industrial, el estireno es el precursor del poliestireno y de varios copollmeros. La presencia del grupo vinilo permite que el estireno polimerice. Se producen aproximadamente 6.800 millones de kilogramos (15.000 millones de libras) anualmente. La produccion de estireno en los Estados Unidos aumento de manera espectacular durante los anos 40, cuando se popularizo como materia prima para la fabricacion del caucho sintetico. En la actualidad, entre los productos importantes desde un punto de vista comercial se incluyen el poliestireno, el acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), el caucho de estireno-butadieno (SBR), el latex de estireno-butadieno, el estireno-isoprenoestireno (SIS), el estireno-etileno/butileno-estireno (S-EB-S), el estireno-divinilbenceno (S-DVB), la resina de estirenoacrilonitrilo (SAN) y los poliesteres insaturados. Estos materiales se utilizan en el caucho, el plastico, el aislamiento, la fibra de vidrio, las tuberlas, los automoviles y las piezas de buques, los recipientes para alimentos y los refuerzos de moqueta.

[0005] El estireno se produce en cantidades industriales sobre todo a partir del etilbenceno, que a su vez se manufactura a gran escala mediante alquilacion del benceno con etileno. Constituye uno de los productos petroqulmicos mas importantes. Existen varios metodos para producir estireno. La deshidrogenacion del etilbenceno es el medio mas comun de produccion. El etilbenceno se mezcla en fase gas con 10-15 veces su volumen en vapor a elevada temperatura, y se hace pasar sobre un lecho de catalizador solido. La mayorla de catalizadores para la deshidrogenacion del etilbenceno son de oxido de hierro (III), potenciado con oxido de potasio o carbonato de potasio en diversos porcentajes. El vapor desempena varios papeles en esta reaccion. Es la fuente de calor para alimentar a la reaccion endotermica, y elimina el coque que tiende a formarse en el catalizador de oxido de hierro por medio de la reaccion de desplazamiento del vapor de agua. El potenciador de potasio acelera esta reaccion de descoquizacion. El vapor tambien diluye el reactivo y los productos, desplazando la posicion del equilibrio qulmico hacia los productos. Una planta habitual de produccion de estireno consiste en dos o tres reactores en serie, que operan al vaclo para aumentar la conversion y la selectividad. Las conversiones por paso habituales son de aproximadamente un 65% con dos reactores y de un 70-75% con tres reactores. La selectividad a estireno es de un 93-97%. Los principales subproductos son el benceno y el tolueno. Debido a que el estireno y el etilbenceno tienen puntos de ebullicion similares (145 y 136 °C, respectivamente), su separacion requiere torres de destilacion altas y elevados cocientes de retorno/reflujo. A su temperatura de destilacion, el estireno tiende a polimerizar. A fin de reducir este problema, las primeras plantas de produccion de estireno anadlan azufre elemental para inhibir la polimerizacion. Durante los anos 70, se desarrollaron nuevos inhibidores de los radicales libres que consistlan en retardantes que contenlan fenoles nitrados. Mas recientemente, se han desarrollado varios aditivos que muestran una mayor inhibicion de la polimerizacion.

[0006] Dado que el estireno es un compuesto petroqulmico indispensable utilizado en muchos productos qulmicos, urge encontrar otros metodos de produccion, especialmente metodos que no requieran combustibles fosiles como materia prima de alimentacion. Por lo tanto, a pesar de la disponibilidad de metodos para producir estireno, existe una necesidad continua de encontrar nuevos metodos eficientes y menos costosos para producir monomeros de estireno.

La patente china n^ 101.397.568 (A) describe un metodo de expresion, purificacion y cristalizacion, elucidacion estructural y el campo de tecnologla de aplicacion de la ferulato descarboxilasa, que pertenece al campo de la biologla molecular y la aplicacion de la microbiologla. En ella se describe un medio para obtener la secuencia de la region codificante de la enzima clave, la ferulato descarboxilasa, que descompone el acido ferulico para generar 4-vinilguayacol en Enterobacter sp. Px6-4 mediante el metodo de la clonacion genica, expresar la enzima en una gran cantidad en el colibacilo (E. coli BL21) mediante tecnologla de expresion heterogenea, obtener la ferulato descarboxilasa como productos puros mediante purificacion, cristalizar la ferulato descarboxilasa por el metodo de cristalizacion de la gota colgante, y obtener la estructura y el centro activo de la enzima. Con la invencion se puede obtener una gran cantidad de ferulato descarboxilasa muy activa, y aporta directrices teoricas para reconstruir bacterias obtenidas mediante tecnicas de ingenierla genetica, as! como para mejorar la produccion de 4-vinilguayacol mediante el analisis del centro activo de la enzima y, por lo tanto, tiene una buena aplicabilidad potencial.

McKenna, R. y Nielsen, D.R., 2011. Bioslntesis del estireno a partir de glucosa con E. co limodificada mediante tecnicas de ingenierla genetica. En Metabolic engineering, 13(5), pags. 544-554 se expone que mediante el diseno de novo y el desarrollo de una nueva ruta metabolica, el estireno se puede sintetizar de otra manera a partir de sustratos renovables como la glucosa. La conversion de la 1 -fenilalanina sintetizada endogenamente en estireno se logro mediante la coexpresion de la fenilalanina amonio liasa y la trans-cinamato descarboxilasa. Las isoenzimas candidatas para cada paso se cribaron a partir de fuentes geneticas procedentes de bacterias, levaduras y plantas. La sobreexpresion de PAL2 de Arabidopsis thaliana y FDC1 de Saccharomyces cerevisiae (originariamente clasificada como ferulato descarboxilasa) en un huesped de Escherichia coli que sobreproducla 1 -fenilalanina dio lugar a la acumulacion en concentraciones de hasta 260 mg/l en cultivos en matraz agitado. Los valores que se pueden lograr ya se acercan al umbral de toxicidad del estireno (estimado en ~300 mg/l).

Rangarajan, E.S., Li, Y., lannuzzi, P., Tocilj, A., Hung, L.W., Matte, A. y Cygler, M., 2004. Crystal structure of a dodecameric FMN-dependent UbiX-like decarboxylase (Pad1) from Escherichia coli O157H7. En Protein science, 13(11), pags. 3006-3016 se describe la estructura cristalina de la flavoprotelna Padl de Escherichia coli O157:H7 complejada con el cofactor FMN, determinada por el metodo de difraccion anomala multiple y refinada a una resolucion de 2,0 A. Esta protelna se describe como un paralogo de la UbiX (3-octaprenil-4-hidroxibenzoato carboxiliasa, identidad de secuencia del 51%), que cataliza el tercer paso en la bioslntesis de la ubiquinona, y de la Pad1 de Saccharomyces cerevisiae (identidad del 54%), una enzima que confiere resistencia frente a los acidos fenilacrllicos (compuestos antimicrobianos) por medio de la descarboxilacion de estos compuestos. Cada monomero de Pad1 consiste en un pliegue clasico de Rossmann que contiene una molecula de FMN unida no covalentemente. El pliegue de la Pad1 es similar al de la MrsD, una enzima asociada a la slntesis lantibiotica; la EpiD, una peptidil-cistelna descarboxilasa; y la enzima AtHAL3a, que descarboxila la 4'-fosfopantotenoilcistelna a 4'-fosfopantetelna durante la bioslntesis de la coenzima A, todas con una ubicacion similar del sitio de union del FMN en la interfaz entre dos monomeros, a pesar de la escasa similitud entre sus secuencias.

SUMARIO

[0007] La tecnologla objeto de esta invencion por lo general se refiere a la bioslntesis del estireno. Algunas realizaciones de la tecnologla objeto de esta invencion estan basadas, en parte, en el entendimiento de que la fenilalanina se puede transformar en estireno por medio de una ruta de dos pasos de desaminacion y descarboxilacion, utilizando el acido trans-cinamico (tCA) como intermedio. Hay dos tipos de enzimas que participan directamente en este proceso, la fenilalanina amonio liasa (PAL), que transforma la fenilalanina en tCA, y la cinamato descarboxilasa, que transforma el tCA en estireno. Las celulas hospedadoras que expresan estos dos tipos de enzimas se pueden cultivar en un biorreactor para producir estireno a partir de sustratos renovables como la glucosa.

Segun un primer aspecto de la invencion se proporciona una celula hospedadora que comprende: (a) una protelna de fusion expresada recombinantemente que comprende un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa; y (b) un transportador unido a la membrana expresado recombinantemente.

En determinadas realizaciones del primer aspecto, la cinamato descarboxilasa producida por dicha celula es una cinamato descarboxilasa mutada que comprende una mutacion en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde a una posicion seleccionada del grupo que consiste en: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 de la SEC. N.° ID: 8, y combinaciones de las mismas.

En determinadas realizaciones del primer aspecto, la fenilalanina amonio liasa producida por dicha celula es una fenilalanina amonio liasa que comprende una secuencia aminoacldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N^ ID: 2, SEC. N^ ID: 4, SEC. N^ ID: 6 y un fragmento funcional o variante de las mismas.

Segun un segundo aspecto de la invencion se proporciona un metodo para cristalizar una protelna de fusion que comprende un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa expresada por la celula hospedadora de cualquier reivindicacion precedente, donde el metodo comprende

(a) obtener la protelna de fusion expresada por la celula hospedadora de cualquier reivindicacion anterior; (b) proporcionar una solucion de la protelna de fusion a una concentracion de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml;

(c) mezclar la solucion de la protelna de fusion con una solucion de deposito en una relacion de volumenes de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1;

(d) anadir acido 3-hidroxicinamico a la solucion del paso (a) o del paso (b) a una concentracion final de acido 3-hidroxicinamico del 0,01% en p/v al 1% en p/v;

(e) y mantener la mezcla del paso (c) a una temperatura de 1 °C a 20 °C adecuada para la formation del cristal de la protelna de fusion, de manera que la protelna de fusion cristalizada se encuentra formando un complejo con el acido 3-hidroxicinamico.

[0008] La tecnologla objeto de esta invention se refiere a una protelna de fusion que comprende: (a) un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa y (b) un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa.

[0009] En determinados ejemplos, la fenilalanina amonio liasa procede de un organismo seleccionado del grupo que consiste en: una Arabidopsis, una Anabaena, una Nostoc y una Saccharomyces. En un ejemplo de realization, la fenilalanina amonio liasa comprende una secuencia aminoacldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N.° ID: 2, SEC. N^ ID: 4, SEC. N^ ID: 6, y un fragmento funcional o variante de las mismas.

[0010] En determinados ejemplos, la cinamato descarboxilasa se obtiene a partir de un organismo seleccionado del grupo que consiste en: una Arabidopsis, una Anabaena, una Nostoc y una Saccharomyces. En un ejemplo de realizacion, la cinamato descarboxilasa comprende una secuencia aminoacldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N^ ID: 8; SEC. N^ ID: 10; SEC. N^ ID: 16; SEC. N^ ID: 18; SEC. N^ ID: 20; SEC. N^ ID: 22; SEC. N^ ID: 24; SEC. N^ ID: 26; SEC. N^ ID: 28; SEC. N^ ID: 30; SEC. N^ ID: 32; SEC. N^ ID: 34; SEC. N^ ID: 36; SEC. N^ ID: 38; y un fragmento funcional o variante de las mismas. Por ejemplo, la cinamato descarboxilasa puede comprender una secuencia aminoacldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N^ ID: 8; SEC. N^ ID: 10; SEC. N^ ID: 16; SEC. N^ ID: 18; SEC. N^ ID: 20; SEC. N^ ID: 22; SEC. N^ ID: 24; SEC. N^ ID: 26; SEC. N^ ID: 28; SEC. N^ ID: 30; SEC. N^ ID: 32; SEC. N^ ID: 34; SEC. N^ ID: 36; y SEC. N^ ID: 38.

[0011] Una variante funcional de una cinamato descarboxilasa puede comprender una secuencia aminoacldica que es identica en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a cualquiera de las SEC. N^ ID: 8; SEC. N^ ID: 10; SEC. N^ ID: 16; SEC. N^ ID: 18; SEC. N^ ID: 20; SEC. N^ ID: 22; SEC. N^ ID: 24; SEC. N^ ID: 26; SEC. N^ ID: 28; SEC. N^ ID: 30; SEC. N^ ID: 32; SEC. N^ ID: 34; SEC. N^ ID: 36; y SEC. N^ ID: 38. Como otra posibilidad, o de manera adicional, una variante funcional de una cinamato descarboxilasa puede comprender: I en una position que corresponde al residuo 173 de la SEC. N^ ID: 8, A en una posicion que corresponde al residuo 174 de la SEC. N^ ID: 8, R en una posicion que corresponde al residuo 175 de la SEC. N^ ID: 8, V en una posicion que corresponde al residuo 188 de la SEC. N^ ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 189 de la SEC. N^ ID: 8, K en una posicion que corresponde al residuo 90 de la SEC. N^ ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 194 de la SEC. N^ ID: 8, E en una posicion que corresponde al residuo 280 de la SEC. N^ ID: 8, M en una posicion que corresponde al residuo 286 de la SEC. N^ ID: 8, F en una posicion que corresponde al residuo 291 de la SEC. N^ ID: 8, y F en una posicion que corresponde al residuo 440 de la SEC. N^ ID: 8.

[0012] En determinados ejemplos, la cinamato descarboxilasa puede comprender una cinamato descarboxilasa mutada que comprende una mutation en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde a una de las siguientes posiciones: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 de la SEC. N^ ID: 8, o una combination de las mismas. Por ejemplo, la cinamato descarboxilasa mutada puede comprender una mutacion en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde a una de las siguientes posiciones: 175, 190, 193 de la SEC. N^ ID: 8, y una combinacion de las mismas.

[0013] En determinadas realizaciones, la cinamato descarboxilasa puede comprender una cinamato descarboxilasa mutada que comprende una elimination, una sustitucion o una adicion de un residuo aminoacldico en una de las posiciones de la SEC. N^ ID: 8 seleccionadas de: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 y una combinacion de las mismas. Por ejemplo, un residuo aminoacldico en una de las siguientes posiciones: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440 o 441 de la SEC. N^ ID: 8 se puede sustituir con otro residuo aminoacldico. En otro ejemplo, la cinamato descarboxilasa mutada comprende una eliminacion, una sustitucion o una adicion de un residuo aminoacldico en una de las posiciones de la SEC. N^ ID: 8: 175, 190, 193 y una combinacion de las mismas.

[0014] En un ejemplo, la protelna de fusion de la tecnologla objeto de esta invencion tambien comprende un conector que enlaza covalentemente el primer dominio con el segundo dominio. El conector de la protelna de fusion descrita en la presente memoria puede ser un conector peptldico, por ejemplo, un conector peptldico que comprende de 2 a 15 aminoacidos. Los conectores peptldicos pueden incluir, por ejemplo, los que se muestran en el Cuadro 1.

[0015] Tambien se proporcionan acidos nucleicos que codifican las protelnas de fusion descritas en la presente memoria, un vector que comprende el acido nucleico que codifica la protelna de fusion, y celulas hospedadoras que comprenden el vector descrito en la presente memoria.

[0016] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a un metodo para producir estireno que comprende (a) poner en contacto la celula hospedadora con un sustrato fermentable (preferentemente un sustrato de carbono o un sustrato de nitrogeno), donde la celula hospedadora comprende una protelna de fusion que comprende: (i) un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y (ii) un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa; y (b) cultivar la celula en un medio de cultivo durante el tiempo suficiente para producir estireno. El metodo ademas puede comprender la recoleccion de estireno a partir del cultivo celular. Cualesquiera de las protelnas de fusion descritas en la presente memoria se pueden utilizar para producir estireno.

[0017] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a una cinamato descarboxilasa que comprende (a) cualquiera de las SEC. N.° ID: 16; SEC. N.° ID: 18; SEC. N.° ID: 20; SEC. N.° ID: 22; SEC. N.° ID: 24; SEC. N.° ID: 26; SEC. N.° ID: 28; SEC. N.° ID: 30; SEC. N.° ID: 32; SEC. N.° ID: 34; SEC. N.° ID: 36; y SEC. N.° ID: 38; (b) una secuencia aminoacldica que es identica en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a cualquiera de las SEC. N^ ID: 16; SEC. N^ ID: 18; SEC. N^ ID: 20; SEC. N^ ID: 22; SEC. N^ ID: 24; SEC. N^ ID: 26; SEC. N^ ID: 28; SEC. N^ ID: 30; SEC. N^ ID: 32; SEC. N^ ID: 34; SEC. N^ ID: 36; y SEC. N^ ID: 38, con el requisito de que dicha secuencia aminoacldica no sea la SEC. N^ ID: 8; ni (c) un fragmento funcional de (a) ni de (b).

[0018] En determinados ejemplos, la cinamato descarboxilasa comprende: I en una posicion que corresponde al residuo 173 de la SEC. N^ ID: 8, A en una posicion que corresponde al residuo 174 de la SEC. N^ ID: 8, R en una posicion que corresponde al residuo 175 de la SEC. N^ ID: 8, V en una posicion que corresponde al residuo 188 de la SEC. N^ ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 189 de la SEC. N^ ID: 8, K en una posicion que corresponde al residuo 190 de la SEC. N^ ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 194 de la SEC. N^ ID: 8, E en una posicion que corresponde al residuo 280 de la SEC. N^ ID: 8, M en una posicion que corresponde al residuo 286 de la SEC. N^ ID: 8, F en una posicion que corresponde al residuo 291 de la SEC. N^ ID: 8, y F en una posicion que corresponde al residuo 440 de la SEC. N^ ID: 8.

[0019] En determinados ejemplos, la cinamato descarboxilasa comprende cualesquiera de las SEC. N^ ID: 16; SEC. N^ ID: 18; SEC. N^ ID: 20; SEC. N^ ID: 22; SEC. N^ ID: 24; SEC. N^ ID: 26; SEC. N^ ID: 28; SEC. N^ ID: 30; SEC. N^ ID: 32; SEC. N^ ID: 34; SEC. N^ ID: 36; y SEC. N^ ID: 38.

[0020] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a una cinamato descarboxilasa mutada que comprende una mutacion en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde a una de las siguientes posiciones: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 de la SEC. N^ ID: 8 y una combinacion de las mismas. Por ejemplo, la cinamato descarboxilasa mutada puede comprender una mutacion en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde a una de las siguientes posiciones: 175, 190, 193 de la SEC. N^ ID: 8, y una combinacion de las mismas.

[0021] En determinadas realizaciones, la cinamato descarboxilasa mutada comprende una eliminacion, una sustitucion o una adicion de un residuo aminoacldico en una de las posiciones de la SEC. N^ ID: 8: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 y una combinacion de las mismas. En determinadas realizaciones, la mutacion es una sustitucion.

[0022] En determinadas realizaciones, la cinamato descarboxilasa mutada comprende una eliminacion, una sustitucion o una adicion de un residuo aminoacldico en una de las posiciones de la SEC. N^ ID: 8: 175, 190, 193 y una combinacion de las mismas.

[0023] Tambien se proporcionan acidos nucleicos que codifican las cinamato descarboxilasas descritas en la presente memoria, celulas hospedadoras que comprenden las cinamato descarboxilasas descritas en la presente memoria y celulas hospedadoras que comprenden los acidos nucleicos descritos en la presente memoria.

[0024] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a un metodo para la produccion de estireno que comprende: (a) poner en contacto una celula hospedadora con un sustrato fermentable (preferentemente un sustrato de carbono o un sustrato de nitrogeno), donde la celula hospedadora comprende: (i) una fenilalanina amonio liasa segun se describe en la presente memoria; y (ii) una cinamato descarboxilasa segun se describe en la presente memoria; y (b) cultivar la celula en un medio de cultivo durante el tiempo suficiente para producir estireno.

[0025] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a una celula hospedadora que comprende: (a) una fenilalanina amonio liasa expresada recombinantemente segun se describe en la presente memoria; (b) una cinamato descarboxilasa expresada recombinantemente segun se describe en la presente memoria; y (c) un transportador unido a la membrana expresado recombinantemente segun se describe en la presente memoria. La fenilalanina amonio liasa y la cinamato descarboxilasa se pueden expresar como dos protelnas independientes, o pueden estar enlazadas covalentemente mediante un conector segun se describe en la presente memoria.

[0026] En un ejemplo, el transportador unido a la membrana es un transportador con dominio de union a ATP (transportador ABC). Por ejemplo, el transportador ABC es un transportador ABC bacteriano, como uno que procede de Pseudomonas putida. Preferentemente, el transportador ABC es una bomba de salida de resistencia a disolventes, como la bomba SrpABC derivada de Pseudomonas putida S12.

[0027] La tecnologla objeto de esta invencion tambien proporciona un metodo para cribar protelnas candidatas mutadas atendiendo a la actividad de cinamato descarboxilasa, donde el metodo comprende: (a) proporcionar una muestra de protelna que comprende una protelna candidata, y un sustrato seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, acido trans-cinamico, tirosina, acido cumarico y combinaciones de los mismos; (b) combinar la muestra de protelna y la muestra del sustrato para formar una mezcla, e incubar la mezcla en condiciones que permitan que una cinamato descarboxilasa mutada transforme el sustrato en un producto seleccionado del grupo que consiste en estireno, 4-hidroxiestireno y una combinacion de los mismos; y (c) exponer la mezcla a un material de deteccion que comprende una resina polimerica que absorbe el vapor del producto. En un ejemplo, la cinamato descarboxilasa mutada puede transformar el acido trans-cinamico en estireno a una velocidad que es similar o superior a la de la enzima nativa (por ejemplo, FDC1). En otro ejemplo, la cinamato descarboxilasa mutada puede transformar el acido cumarico en 4-hidroxiestireno a una velocidad que es similar o superior a la de la enzima nativa. En determinados ejemplos, la protelna candidata comprende una protelna de fusion que comprende una cinamato descarboxilasa mutada.

[0028] En un ejemplo, la tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a un metodo para cribar protelnas candidatas atendiendo a la actividad de cinamato descarboxilasa que comprende: (a) proporcionar una muestra de protelna que comprende la protelna candidata y una muestra de sustrato que comprende el acido trans-cinamico; (b) combinar la muestra de protelna y la muestra de sustrato para formar una mezcla, e incubar la mezcla en condiciones que permitan que la cinamato descarboxilasa transforme el acido trans-cinamico en estireno; y (c) exponer la mezcla a un material de deteccion que comprende una resina polimerica que absorbe el vapor de estireno.

[0029] En determinados ejemplos, el material de deteccion tambien comprende un marcador detectable que produce un cambio de color en presencia de estireno. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser 4-nitrobencilpiridina. El material de deteccion puede estar unido a un soporte solido. En determinadas realizaciones, la resina polimerica comprende un grupo funcional aromatico.

[0030] En determinados ejemplos, el cambio de color se puede detectar mediante espectrofotometrla. Por ejemplo, el cambio de color se puede detectar mediante mediciones de la absorbancia de la muestra a una longitud de onda de aproximadamente 600 nm.

[0031] El metodo de cribado descrito en la presente memoria, pero no reivindicado, se puede utilizar para cribar simultaneamente una pluralidad de protelnas candidatas.

[0032] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a un metodo para aislar a una cinamato descarboxilasa producida recombinantemente que comprende (a) proporcionar un hospedador bacteriano que comprende un acido nucleico que codifica una cinamato descarboxilasa operativamente enlazada a una secuencia promotora; (b) cultivar el hospedador bacteriano en un medio de cultivo para expresar la cinamato descarboxilasa en la celula hospedadora, en el que la celula hospedadora se cultiva a una temperatura de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 25 °C; y (c) aislar la cinamato descarboxilasa de la celula hospedadora, donde el aislamiento se lleva a cabo en un ambiente anaerobico.

[0033] En determinados ejemplos, una o mas soluciones amortiguadoras utilizadas para aislar la cinamato descarboxilasa comprenden un agente reductor, como tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), p-mercaptoetanol y una combinacion de los mismos.

[0034] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a un metodo para cristalizar una cinamato descarboxilasa, donde el metodo comprende: (a) proporcionar una solucion de cinamato descarboxilasa a una concentracion de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; (b) mezclar la solucion de cinamato descarboxilasa con una solucion de deposito en una relacion de volumenes de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1; y (c) mantener la mezcla de la solucion de cinamato descarboxilasa y la solucion de deposito a una temperatura adecuada para la formacion de cristales de la cinamato descarboxilasa.

[0035] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a un cristal de cinamato descarboxilasa, donde la cinamato descarboxilasa se encuentra formando un complejo con el acido 3-hidroxicinamico.

[0036] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se refiere a un metodo para producir estireno, donde el metodo comprende: (a) poner en contacto una celula hospedadora con un sustrato de carbono fermentable, donde la celula hospedadora que comprende (i) una fenilalanina amonio liasa; y (ii) una cinamato descarboxilasa; y (b) cultivar la celula hospedadora en un medio de cultivo durante el tiempo suficiente para producir estireno, donde un material absorbente absorbe el vapor del estireno producido.

[0037] En la presente memoria tambien se describe un metodo para detectar simultaneamente la actividad de fenilalanina amonio liasa y cinamato descarboxilasa, donde el metodo comprende: (a) proporcionar una protelna de fusion que comprende: (i) un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y (ii) un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa; (b) mezclar la protelna de fusion con un sustrato en condiciones que permiten que la protelna de fusion transforme el sustrato en un producto; y (c) detectar la cantidad de sustrato restante, o la cantidad de producto, o una combinacion de los mismos. En determinados ejemplos, el cribado comprende detectar la perdida del sustrato, o la cantidad de un producto, como acido trans- cinamico, estireno y derivados posteriores del estireno. Por ejemplo, el cribado puede comprender detectar la cantidad de acido trans-cinamico o estireno, o una combinacion de los mismos.

[0038] La tecnologla objeto de esta invencion se ilustra, por ejemplo, segun diversos aspectos descritos mas abajo. Diversos ejemplos de aspectos de la tecnologla objeto de esta invencion estan descritos en clausulas numeradas ( l, 2, 3, etc.) para facilitar la lectura. Estas se proporcionan como ejemplos y no limitan la tecnologla objeto de esta invencion. Cabe senalar que cualesquiera de las clausulas dependientes se pueden combinar en cualquier combinacion, y poner en la clausula respectiva independiente, por ejemplo, la clausula 1 o la clausula 17. Las otras clausulas se pueden presentar de una manera similar.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0039] La invencion se define en las reivindicaciones y cualesquiera de las siguientes figuras que esten fuera del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invencion, y se proporcionan para fines de comparacion.

La Figura 1A es una ilustracion esquematica de la estructura predicha de la FDC1 de levadura. La Figura 1B muestra cuatro posibles sitios de union del tCA en la FDC1 (sitios A-D). La Figura 1C muestra el sitio de union predicho del sustrato (tCA) en la FDC1 de levadura.

La Figura 2A muestra la expresion de la FDC1 en E. coli a 37 °C, utilizando tres soluciones amortiguadoras distintas. La FDC1 producida recombinantemente solo se acumula en las fracciones insolubles de los sedimentos (cuerpos de inclusion). La Figura 2B muestra la expresion de la FDC1 en E. coli a 16 °C. La FDC1 soluble se detecto en el sobrenadante.

La Figura 3 muestra el analisis por SDS-PAGE de la FDC1 purificada.

La Figura 4 muestra el efecto del pH en la actividad de la FDC1. La enzima mostro la maxima actividad a pH 6,5, y se considero que tenia una actividad relativa del 100%. El eje de las x representa los valores de pH de las distintas soluciones amortiguadoras de reaccion.

La Figura 5 muestra la estabilidad de la FDC1 con el pH. La enzima mostro una buena estabilidad con el pH. No perdio ninguna actividad cuando se incubo durante 30 minutos a pH 6,0 antes de la reaccion, y se considero que tenia una actividad relativa del 100%. El eje de las x representa los valores de pH a los que la proteina se incubo durante 30 minutos antes de la reaccion enzimatica.

La Figura 6 muestra el efecto de la temperatura en la actividad de la FDC1. La enzima mostro la maxima actividad cuando la reaccion se llevo a cabo a 50 °C, y se considero que tenia una actividad relativa del 100%. El eje de las x representa las temperaturas a las que se llevaron a cabo las reacciones enzimaticas.

La Figura 7 muestra la estabilidad de la FDC1 con la temperatura. La enzima mostro la maxima actividad a 50 °C, y no perdio ninguna actividad cuando se incubo a 50 °C durante 30 minutos antes de la reaccion (lo que se considera como una actividad relativa del 100%). El eje de las x representa las temperaturas a las que la enzima se incubo antes de la reaccion enzimatica.

La Figura 8 muestra la estabilidad de la FDC1 con la temperatura a 50 °C durante diversos intervalos de tiempo. La enzima mostro la maxima actividad cuando se incubo a 50 °C durante 30 minutos antes de la reaccion, y se considero que tenia una actividad relativa del 100%. El eje de las x representa la duracion (en minutos) de la incubacion de la enzima a 50 °C antes de la reaccion enzimatica.

La Figura 9 muestra el efecto de los cofactores en la actividad de la FDC1. La actividad especlfica se muestra como nmol de estireno producido por mg de enzima por minuto.

La Figura 10A muestra el efecto de los iones metalicos en la actividad de la FDC1. La Figura 10B muestra el efecto de Zn2+ y Fe3+ en la actividad de la FDC1. La actividad especlfica se muestra en nmol de estireno producido por mg de enzima por minuto.

La Figura 11 muestra la especificidad de la FDC1 por el sustrato. La enzima mostro la maxima actividad cuando el acido frans-cinamico se utilizo como sustrato, y se considero que tenia una actividad relativa del 100%.

La Figuras 12A y 12B representan el analisis cinetico de la FDC1. El eje de las x representa la reaccion enzimatica a diversas concentraciones de sustrato. La actividad especlfica se muestra como nmol de estireno producido por mg de enzima por minuto.

La Figura 13 ilustra el proceso de mutagenesis aleatoria para crear FDC mutadas, y el cribado de alto rendimiento de las FDC1 mutadas realizado por colorimetria.

La Figura 14 muestra la produccion de estireno por FDC1 mutadas. El eje de las y representa la cantidad de estireno producido por las FDC1 mutadas. El eje de las x representa los aminoacidos que se han cambiado en las FDC1 mutadas.

La Figura 15 muestra la actividad de las proteinas de fusion FDC-PAL. El eje de las x muestra la longitud de los conectores.

La Figura 16 es una ilustracion esquematica de la estructura predicha de la proteina de fusion FDC-PAL.

La Figura 17 muestra que la produccion de estireno aumento significativamente con la coexpresion de un transportador ABC.

La Figura 18A muestra la produccion de estireno y tCA a parti r de glucosa.

La Figura 18B muestra la produccion de estireno a partir de acido frans-cinamico o fenilalanina.

La Figura 19 muestra el uso de la resina STRATA-X® encima de un tubo de cultivo (izquierda) o sobre una placa de cultivo de 96 pocillos (derecha).

La Figura 20 muestra el analisis por SDS-PAGE de la FDC1 purificada.

La Figura 21A muestra un mapa de densidad electronica comun con un modelo inicial de la estructura cristalina de la FDC(K190E).

La Figura 21B muestra una unidad asimetrica de la estructura cristalina de la FDC(K190E).

DESCRIPCION DETALLADA

A. INTRODUCCION

[0040] La tecnologia objeto de esta invencion por lo general se refiere a la biosintesis del estireno. Determinadas realizaciones de la tecnologia objeto de esta invencion estan basadas, en parte, en el entendimiento de que la fenilalanina se puede transformar en estireno por medio de una ruta de dos pasos de desaminacion y descarboxilacion, utilizando el acido frans-cinamico (tCA) como intermedio. En este proceso participan de manera directa dos tipos de enzimas: la fenilalanina amonio liasa (PAL), que transforma la fenilalanina en tCA, y la cinamato descarboxilasa, que transforma el tCA en estireno. Las celulas hospedadoras que expresan estos dos tipos de enzimas se pueden cultivar en un biorreactor para producir estireno a partir de sustratos renovables, como la glucosa.

[0041] En concreto, se han adoptado diversos enfoques para aumentar la bioproduccion de estireno. Por ejemplo, como se describe y ejemplifica en la presente memoria, se han disenado protelnas de fusion en las que la fenilalanina amonio liasa y la cinamato descarboxilasa estan covalentemente enlazadas mediante un conector. La protelna de fusion saca partido del fenomeno de «canalizacion del sustrato». La canalizacion del sustrato se refiere a un fenomeno por el cual los sustratos se suministran eficientemente de una enzima a otra sin equilibrarse con otras poblaciones de los mismos sustratos. En efecto, esto crea poblaciones locales de metabolites a elevadas concentraciones con respecto a las encontradas en otras regiones de la celula. Debido a que el producto de la fenilalanina amonio liasa (acido frans-cinamico) es consumido por la cinamato descarboxilasa, la proximidad entre estas dos enzimas (mediante la union covalente de las dos enzimas en la forma de una protelna de fusion) proporcionarla un uso mas eficiente del sustrato. Como tal, las protelnas de fusion en las que estas dos enzimas estan unidas se benefician del fenomeno de la canalizacion del sustrato, y pueden reducir los costes de produccion y aumentar el numero de reacciones enzimaticas que pueden tener lugar durante un perlodo de tiempo determinado. Como otra posibilidad, tambien se puede utilizar un complejo proteico en el que la fenilalanina amonio liasa y la cinamato descarboxilasa forman un complejo proteico mediante una interaccion no covalente.

[0042] Por lo tanto, la tecnologla objeto de esta invencion proporciona una protelna de fusion que comprende: (i) un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa y (ii) un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa. Tambien se proporcionan celulas hospedadoras que comprenden las protelnas de fusion descritas en la presente memoria, as! como un metodo para utilizar la protelna de fusion para la produccion de estireno.

[0043] En otro enfoque, se ha disenado una biblioteca de cinamato descarboxilasas mutadas, y se han cribado atendiendo a su actividad. Se identificaron cinamato descarboxilasas mutadas que mostraban actividades catallticas mas elevadas que la forma nativa. Algunas de las cinamato descarboxilasas mutadas descritas en la presente memoria aumentaron la produccion de estireno al doble o al triple. Estas cinamato descarboxilasas mutadas se pueden introducir en celulas hospedadoras para potenciar la bioproduccion de estireno.

[0044] En otro ejemplo, un metodo de cribado colorimetrico de alto rendimiento puede permitir el cribado a gran escala de cinamato descarboxilasas mutadas o protelnas de fusion. El cribado colorimetrico descrito en la presente memoria es sumamente reproducible y con este se pueden cribar aproximadamente 1000 cinamato descarboxilasas mutadas y protelnas de fusion en un solo dla. Esto puede proporcionar un cribado rapido y recursivo de los enzimas que participan en la bioslntesis del estireno y compuestos relacionados, lo que proporciona un metodo importante para mejorar la bioslntesis del estireno.

[0045] Por lo tanto, la tecnologla objeto de esta invencion proporciona cinamato descarboxilasas mutadas, celulas hospedadoras que comprenden una cinamato descarboxilasa mutada, as! como un metodo para utilizar las cinamato descarboxilasas mutadas en la produccion de estireno. En la presente memoria tambien se proporcionan, aunque no se reivindican, bibliotecas de cinamato descarboxilasas mutadas y un metodo de cribado de protelnas candidatas atendiendo a la actividad de cinamato descarboxilasa.

[0046] Otro problema que limita la bioproduccion de estireno es la toxicidad del estireno para las celulas hospedadoras. Se sabe que la acumulacion de compuestos aromaticos hidrofobicos dentro de la membrana citoplasmatica perturba su integridad. A fin de reducir la toxicidad del estireno y aumentar su produccion, en la celula hospedadora se introdujo un transportador ABC (una bomba de salida que elimina el disolvente organico de la celula). Como se describe y se ejemplifica en la presente memoria, la produccion de estireno por celulas de E. coli que expresan el transportador ABC fue casi cuatro veces mayor.

[0047] Por lo tanto, en un aspecto, la tecnologla objeto de esta invencion proporciona una celula hospedadora que comprende: (a) una fenilalanina amonio liasa expresada recombinantemente; (b) una cinamato descarboxilasa expresada recombinantemente; y (c) un transportador ABC expresado recombinantemente. Tambien se proporciona un metodo para utilizar el transportador ABC para la produccion de estireno.

B. DEFINICIONES

[0048] Como se utilizan en la presente memoria, las formas en singular «un», «uno», «una», «el» y «la» incluyen las referencias al plural a menos que el contenido claramente indique lo contrario.

[0049] Los terminos «acido cinamico» y «cinamato» se utilizan de manera intercambiable en la memoria descriptiva, y se abrevian como «AC». El termino «acido trans-cinamico» se abrevia como tCA.

[0050] El termino «cinamato descarboxilasa» se refiere a una enzima que cataliza la conversion del acido trans-cinamico en estireno. El termino abarca la cinamato descarboxilasa nativa o de origen natural, as! como fragmentos funcionales o variantes de una cinamato descarboxilasa nativa. La cinamato descarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae descrita en la presente memoria tambien se denomina ferulato descarboxilasa (FDC o FDC1). El acido ferulico es tambien un acido fenilacrllico.

[0051] El termino «control», como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una muestra que proporciona un medio para realizar una comparacion. Por ejemplo, en un ensayo de cribado para determinar la actividad de cinamato descarboxilasa, un «control» puede ser una muestra paralela que comprende una cinamato descarboxilasa cuya actividad se ha caracterizado (por ejemplo, una cinamato descarboxilasa nativa, una cierta cinamato descarboxilasa mutada, etc.). Como otra posibilidad, un control puede ser un valor llmite predeterminado, o un valor que esta presente en una base de datos (por ejemplo, un cuadro, una base de datos electronica, una hoja de calculo, etc.).

[0052] Una posicion aminoacldica «que corresponde a» una posicion de referencia es una posicion que se alinea con una secuencia de referencia, segun se identifica al alinear las secuencias aminoacldicas. Dichas alineaciones se pueden realizar manualmente o mediante programas de alineacion de secuencias bien conocidos, como ClustalW2, Blast 2, etc.

[0053] Una protelna «procede» de un organismo cuando la protelna se alsla a partir de ese organismo, o se modifica o se genera (por ejemplo, sintetizada qulmicamente o producida recombinantemente) utilizando information de la protelna de ese organismo.

[0054] El termino «marcador detectable» se refiere a un compuesto qulmico que se anade a (o se deposita sobre) un material que absorbe el estireno, en una cantidad efectiva para detectar vapor de estireno. Los marcadores detectables preferidos son compuestos qulmicos que en presencia de estireno sufren una reaction qulmica, y producen una sustancia que se puede detectar por colorimetrla. La respuesta qulmica del marcador detectable es preferiblemente dependiente de la concentration.

[0055] El termino «sustrato de carbono fermentable» se refiere a una fuente de carbono que las celulas hospedadoras descritas en la presente memoria pueden metabolizar, y en particular, a las fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacaridos, oligosacaridos, polisacaridos, sustratos de un carbono y una combinacion de los mismos.

[0056] El termino «fragmento funcional» de protelna se refiere a un fragmento peptldico que es una parte de la protelna completa, y que posee sustancialmente la misma actividad biologica, o desempena sustancialmente la misma funcion que la protelna completa (por ejemplo, lleva a cabo la misma reaccion enzimatica). Por ejemplo, un fragmento funcional de una PAL puede catalizar la conversion de la fenilalanina en acido cinamico, y un fragmento funcional de una FDC puede catalizar la conversion del acido cinamico en estireno.

[0057] El termino «variante funcional» de una protelna se refiere a una protelna en la que uno o mas residuos aminoacldicos se han cambiado sin alterar la funcion ni la conformation global de la protelna de referencia. Entre las variantes funcionales se incluyen, por ejemplo, aquellas en las que un aminoacido se ha reemplazado con otro que tiene propiedades similares (como, por ejemplo, polaridad, capacidad para formar puentes de hidrogeno, acidez, basicidad, hidrofobicidad, aromaticidad, etc.). Los aminoacidos con propiedades similares son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la arginina, la histidina y la lisina son aminoacidos hidrofllicos-basicos y se puede intercambiar. De manera similar, la isoleucina, un aminoacido hidrofobico, se puede reemplazar con leucina, metionina o valina. Se preve que dichos cambios tengan un efecto escaso o nulo en el peso molecular aparente o el punto isoelectrico de la protelna o el polipeptido.

[0058] El termino «homologo/a» en todas sus formas gramaticales y variantes ortograficas se refiere a la relation entre polinucleotidos o protelnas que poseen un «origen evolutivo comun», incluidos los polinucleotidos o protelnas de superfamilias, y las protelnas o polinucleotidos o homologos de especies distintas (Reeck et al., Cell 50:667, 1987). Dichos polinucleotidos o protelnas presentan homologla de secuencia, segun queda reflejado por la similitud entre sus secuencias, ya sea en terminos del porcentaje de identidad o de la presencia de motivos o aminoacidos especlficos en posiciones conservadas. Por ejemplo, dos protelnas homologas pueden tener secuencias aminoacldicas que son identicas en aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100%.

[0059] En este sentido, las tecnicas para determinar la «similitud» entre secuencias aminoacldicas son bien conocidas en la tecnica. En general, «similitud» significa la comparacion exacta de aminoacido a aminoacido de dos o mas polipeptidos en el lugar adecuado, donde los aminoacidos son identicos o poseen propiedades qulmicas y/o flsicas, como la carga o la hidrofobicidad, similares. A continuacion, se puede determinar lo que se denomina el «porcentaje de similitud» entre las secuencias polipeptldicas comparadas. Las tecnicas para determinar la identidad de las secuencias de los acidos nucleicos y de aminoacidos tambien son bien conocidas en la tecnica e incluyen determinar la secuencia nucleotldica del ARNm para ese gen (normalmente por medio de un ADNc intermedio) y determinar la secuencia aminoacldica codificada por este, y compararla a una segunda secuencia aminoacldica. En general, «identidad» se refiere a una correspondencia exacta de nucleotido a nucleotido, o de aminoacido a aminoacido, de dos secuencias polinucleotldicas o polipeptldicas, respectivamente. Dos o mas secuencias polinucleotldicas se pueden comparar determinando su «porcentaje de identidad», del mismo modo que dos o mas secuencias aminoacldicas. Los programas disponibles en la version 8 del Paquete Wisconsin para analisis de secuencias (que se pueden obtener del Grupo de computacion genetica (Genetics Computer Group), Madison, Wisconsin, EE.UU.), como, por ejemplo, el programa GAP, pueden calcular tanto la identidad entre dos polinucleotidos como la identidad y similitud entre dos secuencias polipeptldicas, respectivamente. Los expertos en la materia conocen otros programas para calcular la identidad o similitud entre secuencias.

[0060] Los terminos «mutacion» o «mutada» como se utilizan en la presente memoria, se refieren a una eliminacion, una insertion o una sustitucion de un nucleotido o un residuo aminoacldico de una secuencia nativa. Una «secuencia nativa» hace referencia a la secuencia que se encuentra con mas frecuencia en la naturaleza, y a partir de la cual se definen las formas mutadas.

[0061] El termino «operativamente enlazado/a» se refiere a la asociacion de secuencias del acido nucleico a un unico fragmento de acido nucleico de manera que la funcion de uno esta afectada por el otro. Por ejemplo, un promotor esta operativamente enlazado a una secuencia codificante cuando puede afectar a la expresion de esa secuencia codificante (es decir, la secuencia codificante se encuentra bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden estar operativamente enlazadas a secuencias reguladoras en orientation sentido y antisentido.

[0062] El termino «fenilalanina amonio liasa», abreviado como PAL, se refiere a una enzima que cataliza la conversion de la fenilalanina en acido frans-cinamico. El termino abarca la fenilalanina amonio liasa nativa o de origen natural, as! como fragmentos funcionales o variantes de una fenilalanina amonio liasa nativa.

[0063] El termino «cinamato descarboxilasa mutada» se refiere a una enzima que cataliza la conversion del acido frans-cinamico en estireno, o la conversion del acido cumarico en 4-hidroxiestireno.

[0064] El termino «recombinante» se refiere a una biomolecula, por ejemplo, un gen o una protelna, que (1) se ha suprimido de su entorno natural, (2) no esta asociada a todo el polinucleotido, ni a una parte de este, en que el gen se encuentra de manera natural, (3) esta enlazada operativamente a un polinucleotido al que no esta enlazada de manera natural, o (4) no se encuentra en la naturaleza. El termino «recombinante» se puede utilizar en referencia a ADN clonados aislados, analogos polinucleotldicos sintetizados qulmicamente, o analogos polinucleotldicos sintetizados biologicamente mediante sistemas heterologos, as! como protelnas y/o ARNm codificados por dichos acidos nucleicos.

[0065] Una referencia a un elemento en singular no tiene por objeto significar «uno/a y solo uno/a» a menos que se indique especlficamente, sino «uno o mas». El termino «algunos» se refiere a uno/a o mas. Los encabezados y subencabezados subrayados, en cursiva y/o en negrita se utilizan unicamente para facilitar la lectura, no limitan la tecnologla objeto de esta invention y no se hace referencia a ellos en relation con la interpretation de la memoria descriptiva de la tecnologla objeto de esta invencion. Se pretende que todos los equivalentes estructurales y funcionales de los elementos de las diversas configuraciones descritas en toda esta description que los expertos en la materia conozcan, o que posteriormente pasen a conocer, esten abarcados por la tecnologla objeto de esta invencion. Ademas, nada de los que esta descrito en la presente memoria tiene por objeto estar dedicado al publico, independientemente de si dicha descripcion figura de manera expllcita en la anterior memoria descriptiva.

[0066] A menos que se indique lo contrario, el porcentaje de identidad de dos polipeptidos o secuencias polinucleotldicas se refiere al porcentaje de residuos aminoacldicos o nucleotidos identicos en toda la longitud de la secuencia mas corta de las dos.

C. FENILALANINA AMONIO LIASA

[0067] La fenilalanina amonio liasa (EC 4,3,1,24; formalmente EC 4,3,1,5) es una enzima que cataliza la reaction qulmica:

L-fenilalanina <=> trans-cinamato NH³

Entre otros nombres que se suelen utilizar para esta enzima se incluyen tirasa, fenilalanina desaminasa, tirosina amonio liasa, L-tirosina amonio liasa, fenilalanina amonio liasa, PAL y L-fenilalanina amonio liasa. La PAL es una enzima procedente de organismos no mamlferos y ampliamente distribuida en plantas y levaduras.

[0068] En una lista representativa de PAL (identificadas por el numero de acceso del Genbank y la especie) se incluyen: Q9ATN7 Agastache rugosa; 093967 Amanita muscaria (mosca agarica); P35510, P45724, P45725, Q9SS45, Q8RWP4 Arabidopsis thaliana (berro comun); Q6ST23 Bambusa oldhamii (bambu gigante); Q42609 Bromheadia finlaysoniana (orquldea); P45726 Camellia sinensis (te); Q9MAX1 Catharanthus roseus (vincapervinca rosada) (vincapervinca de Madagascar); Q9SMK9 Cicer arietinum (garbanzo); Q9XFX5, Q9XFX6 Citrus Clementina x Citrus reticulate; Q42667 Citrus Ziman (limon); Q8H6V9, Q8H6W0 Coffea canefora (cafe Robusta); Q852S1 Daucus carota (zanahoria); O23924 Digitalis lanata (dedalera); O23865 Daucus carota (zanahoria); P27991 Glycine max (soja); 004058 Helianthus annuus (girasol comun); P14166, (Q42858) Ipomoea batatas (boniato); q 8g ZR8, Q8W2E4 Lactuca sativa (lechuga de campo); 049835, 049836 Lithospermum erythrorhizon; P35511, P26600 Lycopersicon esculentum (tomate); P35512 Malus domestica (manzana) (Malus sylvestris); Q94C45, Q94F89 Manihot esculenta (tapioca) (mandioca); P27990 Medicago sativa (alfalfa); P25872, P35513, P45733 Nicotiana tabacum (tabaco comun); Q6T1C9 Quercus suber (alcornoque); P14717, P53443, Q7M1Q5, Q84VE0, Q84VE0 Oryza sativa (arroz); P45727 Persea americana (aguacate); Q9AXI5 Pharbitis nil (violeta) (campanilla japonesa); P52777 Pinus taeda (pino taeda); Q01861, Q04593 Pisum sativum (guisante); P24481, P45728, P45729 Petroselinum crispum (perejil) (Petroselinum hortense); cultivar del hlbrido Q84L12 de Phalaenopsis x Doritaenopsis; P07218, P19142, P19143 Phaseolus vulgaris (frljol) (judla verde); Q7XJC3, Q7XJC4 Pinus pinaster (pino marltimo); Q6UD65 Populus balsamifera subsp. trichocarpa x Populus deltoides; P45731, Q43052, 024266 Populus kitakamiensis (alamo); Q8H6V5, Q8H6V6 Populus tremuloides (alamo temblon); P45730 Populus trichocarpa (alamo negro); 064963 Prunus avium (cereza); Q94EN0 Rehmannia glutinosa; P11544 Rhodosporidium toruloides (levadura) (Rhodotorula gracilis); P10248 Rhodotorula rubra (levadura) (Rhodotorula mucilaginosa); Q9M568, Q9M567 Rubus idaeus (frambuesa); P31425, P31426 Solanum tuberosum (patata); Q6SPE8 Stellaria longipes (estelaria de tallo largo); P45732 Stylosanthes humilis (stylo); P45734 Trifolium subterraneum (trebol subterraneo); Q43210, Q43664 Triticum aestivum (trigo); Q96V77 Ustilago maydis (hongo del fruto del malz); P45735 Vitis vinifera (uva); y Q8VXG7 Zea mays (malz).

[0069] Tambien se conocen las estructuras cristalinas de diversas PAL (identicadas por el codigo de accesion del PDB y la especie): 1T6J (Rhodosporidium toruloides); 1T6P (Rhodosporidium toruloides); 1W27 (Petroselinum crispum); 1Y2M (Rhodosporidium toruloides); 2NYF (Nostoc punctiforme); y 3nz4 (Taxus canadensis). La PAL de Rhodosporidium toruloides (tambien denominada Rhodotorula glutinis) es un homotetramero, en el que cada subunidad tiene una forma de «caballito de mar» que se engrana cabeza con cola con otras dos subunidades, de manera que se maximizan las interacciones con las subunidades adyacentes y se obtiene un tetramero estrechamente encajado. El ensamblaje del tetramero origina una agrupacion de cuatro cistelnas vecinales (residuos 140, 455, 467 y 530), con los atomos de azufre de la Cys467 y la Cys530 separados por una distancia de 3,62 A. La estructura del cuerpo principal de la PAL tiene un nucleo central de helices a casi paralelas de distintas longitudes. Solo una seccion de lamina p es mas larga que tres residuos (hebras de residuos 231-237 y 240-246); reside en la region de embudo que desemboca en el sitio activo. MacDonald, et al., A modem view of phenylalanine ammonia lyase, Biochem Cell Biol. 2007; 85(3):273-82.

[0070] En la tecnica se conocen genes o polinucleotidos que codifican la PAL procedentes de fuentes vegetales y microbianas. Vease, por ejemplo, la patente europea n.^° 321.488 (R. toruloides); la patente W 0 n.^° 9.811.205 (Eucalyptus grandis y Pinus radiate); la patente W 0 nY 9.732.023 (Petunia); la patente japonesa nY 05.153.978 (Pisum sativum); la patente W 0 nY 9.307.279 (patata, arroz). Las secuencias de diversos genes de la PAL se pueden determinar facilmente a partir de la bibliografla, las bases de datos publicas (vease por ejemplo GENBANK^® nY de acceso AJ010143 y X75967) u otras fuentes comerciales. Por ejemplo, los ADNc completos de la PAL1 (At2g37040), PAL2 (At3g53260) y PAL4 (At3g10340) de Arabidopsis se pueden adquirir del Centro de recursos biologicos para Arabidopsis (Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC) de la Universidad del estado de 0hio (EE.UU.) con los numeros de inventario G10120 (en el vector pENTR223.1), G12256 (en el vector pENTR223.1) y U24927 (en el vector pENTR/D-T0P0), respectivamente.

[0071] En determinadas realizaciones, la fenilalanina amonio liasa de la tecnologla objeto de esta invencion se obtiene de un organismo seleccionado del grupo que consiste en: una Arabidopsis, una Anabaena, una Nostoc y una Saccharomyces. Entre otros organismos fuente preferidos se incluyen, por ejemplo, las levaduras como Rhodotorula, Rhodosporidium y Sporobolomyces; las bacterias como Streptomyces; y las plantas como el guisante, la patata, el arroz, el eucalipto, el pino, el malz, la petunia, Arabidopsis, el tabaco y el perejil.

[0072] La tecnologla objeto de esta invencion tambien abarca homologos (incluidos ortologos), fragmentos funcionales o variantes funcionales de los ejemplos de PAL descritas en la presente memoria. En la tecnica son bien conocidos los metodos para obtener homologos y variantes de PAL, incluidos, por ejemplo, los protocolos dependientes de secuencias. Entre los ejemplos de protocolos dependientes de secuencias se incluyen, por ejemplo, la hibridacion de acidos nucleicos, la amplificacion de ADN y ARN (por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR)), etc.

[0073] Por ejemplo, los genes que codifican homologos de una PAL se pueden aislar directamente utilizando la totalidad o una parte de las secuencias conocidas como sondas de ADN para hibridacion con el fin de realizar el cribado de bibliotecas obtenidas de cualquier planta, hongo, levadura o bacteria deseados mediante tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Se pueden disenar sondas oligonucleotldicas especlficas basadas en las secuencias de acidos nucleicos descritas en la bibliografla y se pueden sintetizar mediante metodos conocidos en la tecnica (Maniatis, infra). Ademas, las secuencias completas se pueden utilizar directamente para sintetizar sondas de ADN mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica, tales como el marcado del ADN mediante cebadores aleatorios, el desplazamiento de mella, o las tecnicas de marcado de los extremos, o sondas de ARN que utilizan los sistemas de transcripcion in vitro disponibles. Ademas, se pueden disenar y utilizar cebadores especlficos para amplificar las secuencias completas de interes o una porcion de estas. Los productos de amplificacion resultantes se pueden marcar directamente durante las reacciones de amplificacion o se pueden marcar despues de las reacciones de amplificacion, y se pueden utilizar como sondas para aislar ADNc completo o fragmentos genomicos en las condiciones de rigor adecuadas.

[0074] Ademas, en los protocolos de reaccion en cadena de la polimerasa se pueden utilizar dos segmentos cortos de las secuencias descritas en la bibliografla para amplificar fragmentos mas largos de acidos nucleicos que codifican genes homologos de ADN o ARN. La reaccion en cadena de la polimerasa tambien se puede realizar en una biblioteca de fragmentos de acidos nucleicos clonados en donde la secuencia de un cebador procede de las secuencias descritas en la bibliografla, y la secuencia del otro cebador se aprovecha de la presencia de tramos de acido poliadenllico en el extremo 3' del precursor del ARNm que codifica los genes bacterianos. Como otra posibilidad, la secuencia del segundo cebador puede estar basada en secuencias derivadas del vector de clonacion. Por ejemplo, un experto en la materia puede seguir el protocolo RACE (Frohman et al., PNAS EE.UU. 85:8998 (1988)) para generar los ADNc mediante PCR con el fin de amplificar las copias de la region comprendida entre un punto unico en el transcrito y el extremo 3' o 5'. Se pueden disenar cebadores orientados en las direcciones 3' y 5' a partir de secuencias descritas en la bibliografla. Mediante el uso de sistemas 3'-RACE o 5'-RACE disponibles en el mercado, se pueden aislar fragmentos especlficos en 3' o 5' del ADNc (Ohara et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 86:5673 (1989); Loh et al., Science 243:217 (1989)).

[0075] Las secuencias del acido nucleico y la protelna de un homologo o una variante tambien se pueden identificar utilizando una «secuencia de consulta» para realizar una busqueda en bases de datos publicas a fin de identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas.

[0076] Por lo tanto, en un ejemplo de realizacion, la fenilalanina amonio liasa de la tecnologla objeto de esta invencion comprende una secuencia aminoacldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N.° ID: 2, SEC. N.° ID: 4, SEC. N^ ID: 6 y un fragmento funcional o variante de las mismas. Las SEC. N^ ID: 2, SEC. N^ ID: 4 y SEC. N^ ID: 6 son las secuencias aminoacldicas de la PAL1, PAL2 y PAL4 de Arabidopsis, respectivamente. Las variantes de la PAL pueden incluir a aquellas secuencias polipeptldicas que comprenden una secuencia aminoacldica que es identica en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 75%, en aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, o en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a cualquiera de las SEC. N^ ID: 2, SEC. N^ ID: 4, SEC. N^ ID: 6 o un fragmento de las mismas. El fragmento puede comprender aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 residuos aminoacldicos de la PAL completa.

[0077] En otro ejemplo, la fenilalanina amonio liasa de la tecnologla objeto de esta invencion comprende una secuencia aminoacldica codificada por una secuencia polinucleotldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N^ ID: 1, SEC. N^ ID: 3, SEC. N^ ID: 5, y un fragmento o variante de las mismas. Las SEC. N^ ID: 1, SEC. N^ ID: 3, y SEC. N^ ID: 5 son las secuencias nucleotldicas que codifican la PAL1, PAL2 y PAL4 de Arabidopsis, respectivamente. Algunas variantes de la secuencia codificante de la PAL pueden incluir aquellas secuencias polinucleotldicas que son identicas en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 75%, en aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a cualquiera de las SEC. N^ ID: 1, SEC. N^ ID: 3, SEC. N^ ID: 5 o un fragmento de las mismas. El fragmento puede comprender aproximadamente 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 o 2100 nucleotidos de la secuencia codificante de la PAL completa.

[0078] Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias aminoacldicas o de dos secuencias polinucleotldicas, las secuencias se alinean para poder compararlas de manera optima (por ejemplo, se pueden introducir brechas en la secuencia de una primera secuencia aminoacldica o del acido nucleico para lograr un alineamiento optimo con una segunda secuencia aminoacldica o del acido nucleico, y las secuencias no homologas se pueden descartar para fines de comparacion). A menos que se indique lo contrario, un alineamiento es un alineamiento global, (es decir, el porcentaje de residuos aminoacldicos o nucleotidos identicos en toda la longitud de la secuencia mas corta de las dos). Si se desea realizar un alineamiento local, preferentemente, la longitud de una secuencia alineada para su comparacion es de aproximadamente un 30%, de aproximadamente un 40%, de aproximadamente un 50%, de aproximadamente un 60%, de aproximadamente un 70%, de aproximadamente un 80% o de aproximadamente un 90% de la longitud de la secuencia mas corta de las dos.

D. CINAMATO DESCARBOXILASA

[0079] La cinamato descarboxilasa es una enzima que cataliza la conversion del acido trans-cinamico en estireno.

[0080] En determinadas realizaciones, la cinamato descarboxilasa de la tecnologla objeto de esta invencion se obtiene a partir de un organismo seleccionado del grupo que consiste en: una Arabidopsis, una Anabaena, una Nostoc y una Saccharomyces.

1. FDC1 y OHBA1

[0081] En un ejemplo de realizacion, la cinamato descarboxilasa de la tecnologla objeto de esta invencion se obtiene a partir de Saccharomyces cerevisiae. La cinamato descarboxilasa de Saccharomyces cerevisiae descrita en la presente memoria tambien se denomina ferulato descarboxilasa (FDC o FDC1). La secuencia de la FDC/FDC1 se da a conocer en las patentes de EE.UU. n.^° 5.955.137 y 6.468.566.

[0082] Como se describe y se ejemplifica en la presente memoria, la cinamato descarboxilasa completa de Saccharomyces cerevisiae comprende 503 aminoacidos (SEC. ID: 8). En la Figura 1A se muestra un modelo informatico de la FDC1 completa; y en la Figura 2B se muestran cuatro posibles sitios de union del tCA, siendo el sitio C el mas probable. Los analisis adicionales del sitio C muestran que 1173, A174, R175, V188, 1189, K190 (no se muestra por claridad de la figura), I194, E280, M286, F291 y F440 participan en la union del sustrato (Figura 1C). La secuencia nucleotldica que codifica la FDC1 se muestra como SEC. N^ ID: 7.

[0083] Los estudios cineticos muestran que la Km para la FDC nativa es aproximadamente 688 pM y la V^max es aproximadamente 6,17 nmolmg ^{- 1} min^-1. Ademas de al tCA, la FDC1 tambien se une a otros sustratos, incluidos el acido ferulico, el acido 2-metilcinamico y el acido 4-hidroxicinamico.

[0084] Otro ejemplo de cinamato descarboxilasa es la 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato carboxiliasa de Aspergillus niger (OHBA1; SEC. N^ ID: 10). La secuencia nucleotldica que codifica la OHBA1 se muestra como SEC. N^ ID: 9.

[0085] La tecnologla objeto de esta invencion tambien abarca homologos (incluidos ortologos), fragmentos funcionales o variantes funcionales de los ejemplos de cinamato descarboxilasas descritas en la presente memoria. Los homologos y las variantes de cinamato descarboxilasas se pueden obtener mediante los metodos descritos mas arriba.

[0086] Por ejemplo, una variante funcional puede ser una secuencia que (i) es identica en aproximadamente un 50%, en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a la SEC. N^ ID: 8, (ii) comprende al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 de los siguiente residuos: I en una posicion que corresponde al residuo 173 de la SEC. N^ ID: 8, A en una posicion que corresponde al residuo 174 de la SEC. N^ ID: 8, R en una posicion que corresponde al residuo 175 de la SEC. N^ ID: 8, V en una posicion que corresponde al residuo 188 de la SEC. N^ ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 189 de la SEC. N^ ID: 8, K en una posicion que corresponde al residuo 190 de la SEC. N^ ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 194 de la SEC. N^ ID: 8, E en una posicion que corresponde al residuo 280 de la SEC. N^ ID: 8, M en una posicion que corresponde al residuo 286 de la SEC. N^ ID: 8, F en una posicion que corresponde al residuo 291 de la SEC. N^ ID: 8, y F en una posicion que corresponde al residuo 440 de la SEC. N^ ID: 8; y una combinacion de (i) y (ii).

[0087] Los residuos aminoacldicos que «corresponden a» una posicion determinada de la SEC. N^ ID: 8 se pueden identificar mediante alineamiento de la secuencia de interes con la SEC. N^ ID: 8. Como ejemplo, el alineamiento de la FDC1 y la OHBA1 se muestra mas abajo (la FDC1 es la secuencia de consulta; la OHBA1 es la secuencia de referencia).

[0088] En un ejemplo de realizacion, la cinamato descarboxilasa de la tecnologla objeto de esta invencion comprende una secuencia aminoacldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N.° ID: 8, SEC. N.° ID: 10, y un fragmento funcional o variante de las mismas. Entre las variantes de la cinamato descarboxilasa se pueden incluir aquellas secuencias polipeptldicas que comprenden una secuencia aminoacldica que es identica en aproximadamente un 50%, en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 75%, en aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a cualquiera de las SEC. NF ID: 8, SEC. NY ID: 10, o un fragmento de las mismas. El fragmento puede comprender aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 residuos aminoacldicos de la cinamato descarboxilasa completa.

[0089] En otro ejemplo de realizacion, la cinamato descarboxilasa de la tecnologla objeto de esta invencion comprende una secuencia aminoacldica codificada por una secuencia polinucleotldica seleccionados del grupo que consiste en: SEC. NY ID: 7, SEC. NY ID: 9, y un fragmento o variante de las mismas. Algunas variantes de la secuencia codificante de la cinamato descarboxilasa pueden incluir aquellas secuencias polinucleotldicas que son identicas en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 75%, en aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a cualquiera de las SEC. NY ID: 7, SEC. NY ID: 9 o un fragmento de las mismas. El fragmento puede comprender aproximadamente 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 o 2100 nucleotidos de la secuencia codificante completa.

2. Ejemplos de FDC1 mutadas

[0090] Con base en el analisis estructural de la FDC1 de levadura, los residuos 155-156, 159, 162-164, 172-175, 187-196, 226-227, 280, 285-287, 291, 326, 331, 360-361, 395-396, 398 y 440-441 de la FDC1 (SEC. NY ID: 8) fueron identificados como sitios potenciales para la mutagenesis. Por lo tanto, en otro aspecto, la tecnologla objeto de esta invencion proporciona una cinamato descarboxilasa mutada, donde se introduce una mutacion en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde a una de las siguientes posiciones: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 de la SEC. N.° ID: 3313318, y una combinacion de las mismas. La mutacion puede ser una mutacion por elimination, insertion o sustitucion.

[0091] En un ejemplo de realization, la cinamato descarboxilasa mutada comprende una mutacion en una position de residuo aminoacldico que corresponde al residuo 190 de la SEC. NT ID: 8. Preferentemente, el residuo que corresponde a la posicion 190 se reemplaza con uno de los siguientes: E, C, D, V, N, L, H. En otro ejemplo de realizacion, la cinamato descarboxilasa mutada comprende una mutacion en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde al residuo 175 de la SEC. N^T ID: 8. Preferentemente, el residuo que corresponde a la posicion 175 se reemplaza con I.

[0092] En determinadas realizaciones, la cinamato descarboxilasa mutada es una FDC1 mutada, donde una mutacion se introduce en una de las siguientes posiciones en la SEC. N^T ID: 8: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 y una combinacion de las mismas.

[0093] En determinadas realizaciones, la cinamato descarboxilasa mutada es una FDC1 mutada, donde una mutacion se introduce en una de las siguientes posiciones en la SEC. N^T ID: 8: 175, 190, 193 y una combinacion de las mismas.

[0094] En determinadas realizaciones, la cinamato descarboxilasa mutada es una forma mutada de la FDC1 que comprende una de las mutaciones en la SEC. N^T ID: 8: K190E, K190C, K190H, K190P, K190L, K190R, K190D, K190v , K190S, K190N, R175I, H193P y una combinacion de las mismas.

[0095] En determinados ejemplos, la cinamato descarboxilasa mutada comprende cualesquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en la SEC. N^T ID: 16; SEC. N^T ID: 18; SEC. N^T ID: 20; SEC. N^T ID: 22; SEC. N^T ID: 24; SEC. N^T ID: 26; SEC. N^T ID:28; SEC. N^T ID: 30; SEC. N^T ID: 32; SEC. N^T ID: 34; SEC. N^T ID: 36; y SEC. N^T ID: 38.

[0096] La cinamato descarboxilasa de la tecnologla objeto de esta invention tambien puede comprender una variante o fragmento funcional de la cinamato descarboxilasa mutada descrita en la presente memoria. Entre las variantes de cinamato descarboxilasa se pueden incluir aquellas secuencias polipeptldicas que comprenden una secuencia aminoacldica que es identica en aproximadamente un 50%, en aproximadamente un 60%, en aproximadamente un 70%, en aproximadamente un 75%, en aproximadamente un 80%, en aproximadamente un 85%, en aproximadamente un 90%, en aproximadamente un 95%, en aproximadamente un 96%, en aproximadamente un 97%, en aproximadamente un 98%, en aproximadamente un 99% o incluso en un 100% a cualquiera de las SEC. N^T ID: 16; SEC. N^T ID: 18; SEC. N^T ID: 20; SEC. N^T ID: 22; SEC. N^T ID: 24; SEC. N^T ID: 26; SEC. N^T ID: 28; SEC. N^T ID: 30; SEC. N^T ID: 32; SEC. N^T ID:34; SEC. N^T ID: 36; SEC. N^T ID: 38; y un fragmento de las mismas. El fragmento puede comprender aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 residuos aminoacldicos de la cinamato descarboxilasa completa.

[0097] Como otra posibilidad, o de manera adicional, las variantes pueden comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 de los siguientes residuos: I en una posicion que corresponde al residuo 173 de la SEC. N^T ID: 8, A en una posicion que corresponde al residuo 174 de la SEC. N^T ID: 8, R en una posicion que corresponde al residuo 175 de la SEC. N^T ID: 8, V en una posicion que corresponde al residuo 188 de la SEC. N^T ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 189 de la SEC. N^T ID: 8, K en una posicion que corresponde al residuo 190 de la SEC. N^T ID: 8, I en una posicion que corresponde al residuo 194 de la SEC. N^T ID: 8, E en una posicion que corresponde al residuo 280 de la SEC. N^T ID: 8, M en una posicion que corresponde al residuo 286 de la SEC. N^T ID: 8, F en una posicion que corresponde al residuo 291 de la SEC. N.o ID: 8, y F en una posicion que corresponde al residuo 440 de la SEC. N.o ID: 8.

[0098] Tambien se proporcionan bibliotecas de cinamato descarboxilasas mutadas. La biblioteca comprende una pluralidad de cinamato descarboxilasas mutadas. Por ejemplo, la biblioteca puede comprender cinamato descarboxilasas mutadas que representan aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18 o aproximadamente 19 mutaciones distintas en una posicion de interes determinada. Por ejemplo, la biblioteca puede comprender aproximadamente 19 formas mutadas distintas en las que el K190 de la FDC1 (SEC. NT ID: 8) esta reemplazado con cada uno de los otros 19 aminoacidos. Como otra posibilidad, la biblioteca puede comprender cinamato descarboxilasas mutadas que representan aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18 o aproximadamente 19 mutaciones en posiciones distintas. Por ejemplo, se puede realizar un barrido de alanina para crear bibliotecas de formas mutadas en las que los residuos aminoacldicos en distintas posiciones se han reemplazado con alanina.

[0099] Los cambios en la secuencia aminoacldica se pueden generar realizando cambios en la secuencia del acido nucleico que codifica la secuencia aminoacldica. Una secuencia del acido nucleico que codifica una cinamato descarboxilasa mutada se puede preparar mediante metodos conocidos en la tecnica, basandose en la presente memoria descriptiva para secuencias determinadas. Entre estos metodos se incluyen, entre otros, la preparacion mediante mutagenesis dirigida (o mediada por oligonucleotidos) (Coombs et al., Proteins (1998), 259-311, 1 plate. Editor(es): Angeletti, Ruth Hogue. Editorial: Academic, San Diego, California, EE.UU.); mutagenesis por PCR o por PCR propensa a error (Melnikov et al., Nucleic Acids Research, (Feb. 15, 1999) Vol. 27, No. 4, pags. 1056-1062); mutagenesis por insercion de un casete de una secuencia del acido nucleico preparada con anterioridad; «reordenamiento aleatorio de genes» (patente de EE.UU. n.° 5.605.793; patente de EE.UU. n.° 5.811.238; patente de EE.UU. n75.830.721; y patente de EE.UU. n75.837.458); todas estos metodos son bien conocidos en la tecnica.

[0100] Como otra posibilidad, se puede utilizar la mutagenesis in vivo con materiales disponibles en el mercado, como la cepa XL 1-Red de E. coli y la cepa mutada XL 1-Red XL de Epicurian coli de STRATAgene (STRATAgene, La Jolla, California, EE.UU. Greener and Callahan, Strategies 7:32-34) (1994)). Esta cepa es deficiente en tres de las principales rutas de reparacion del ADN (mutS, mutD y mutT), lo que produce una tasa de mutaciones 5000 veces mas elevada que en la forma nativa.

3. Metodo de cribado

[0101] La tecnologla objeto de esta invencion proporciona un metodo para cribar protelnas candidatas atendiendo a la actividad de cinamato descarboxilasa, que comprende (a) proporcionar una muestra de protelna que comprende la protelna candidata y una muestra de sustrato que comprende acido trans-cinamico; (b) combinar la muestra de protelna y la muestra de sustrato par formar una mezcla, e incubar la mezcla en unas condiciones que permitan que una cinamato descarboxilasa transforme el acido trans-cinamico en estireno; y (c) exponer la mezcla a un material de deteccion que comprende (i) una resina polimerica que absorbe el vapor de estireno; y (ii) un marcador detectable que produce un cambio de color en presencia de estireno. Un cambio en el color del material de deteccion indica que la protelna candidata tiene actividad de cinamato descarboxilasa.

[0102] Para el cribado de FDC mutadas, se ha desarrollado un ensayo de cribado de alto rendimiento. El cribado de una gran poblacion de la biblioteca de protelnas constituye el cuello de botella para la evolucion molecular de la protelna. La caracterizacion funcional de la descarboxilasa se suele realizar con instrumentos anallticos, como HPLC o LC-MS. Aunque el HPLC es muy sensible, requiere mucho tiempo, es caro y genera residuos como metanol o acetonitrilo, y no es adecuado para aplicaciones que requieran una elevada capacidad.

[0103] Para sortear estos escollos tecnicos, la tecnologla objeto de esta invencion proporciona un metodo de ensayo colorimetrico basado en espectroscopla. En primer lugar, una protelna candidata y el tCA se incuban en unas condiciones que permiten que una cinamato descarboxilasa transforme el acido trans-cinamico en estireno. Normalmente, las condiciones de incubacion deben permitir a una cinamato descarboxilasa mostrar una actividad enzimatica optima (por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 65 °C, de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 55 °C, de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 60 °C, o de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 55 °C; a un pH de entre 6 y 10, de entre 6 y 8, o de entre 5,5 y 7,5; en presencia de iones metalicos a concentraciones de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM; etc.). La protelna candidata y el tCA se pueden incubar durante aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora; aproximadamente 90 minutos, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 2,5 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 3,5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 4,5 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas o aproximadamente 8 horas, para permitir que se produzca la cantidad suficiente de estireno.

[0104] En segundo lugar, la mezcla de reaccion se expone a un material de deteccion que comprende (i) una resina polimerica que absorbe el vapor de estireno; y (ii) un marcador detectable que produce un cambio de color en presencia de estireno. Debido a que el estireno se evapora, el material de deteccion se puede colocar encima de la mezcla de reaccion para absorber el vapor de estireno (sin tener que sumergirlo en la mezcla de reaccion). Por lo tanto, el material de deteccion se puede unir a un soporte solido, y se puede invertir durante el proceso de deteccion para absorber el vapor de estireno. Vease, por ejemplo, la Figura 19.

[0105] Entre las resinas polimericas preferidas para la absorcion del vapor de estireno se incluyen, por ejemplo, las resinas hidrofobicas de fase inversa, que tienen un grupo funcional hidrocarbonado o aromatico (por ejemplo, un anillo aromatico de benceno) que se puede unir a compuestos polares y apolares. Mas preferentemente, las resinas hidrofobicas tienen un grupo funcional hidrocarbonado o aromatico, y no tienen ningun grupo polar. Entre los ejemplos de resinas hidrofobicas de fase inversa se incluyen las resinas adsorbentes de C18, C8, fenilo, SDB-L y combinaciones de las mismas.

[0106] Ejemplos de resinas polimericas que se pueden utilizar para absorber compuestos organicos volatiles (como el vapor de estireno) incluyen, por ejemplo, las resinas polimericas STRATA-X® (Phenomenex), las resinas polimericas Amberlite (Sigma-Aldrich), las resinas polimericas DOWEX™ o las resinas polimericas AMBERJET™ (The Dow Chemical Compani), las resinas polimericas Macronet™, las resinas polimericas PuroSorb™ o las resinas Chromalite® (PuroLite), etc. El area superficial y la distribution del tamano de poro de la resina deben ser adecuados para la absorcion de compuestos organicos volatiles. Debido a que una resina polimerica tiene pocos grupos funcionales (a menudo el grupo funcional unico dominante es el que confiere a la superficie sus caracteristicas de adsorcion), se puede determinar la afinidad (por ejemplo, el parametro de solubilidad de Hansen) y predecir la capacidad adsorbente con base en parametros termodinamicos. Diversos estudios han mostrado que se puede establecer una correlation entre la capacidad adsorbente de diversos solutos y resinas polimericas, y los parametros de solubilidad.

[0107] Otros materiales adecuados para absorber el vapor de estireno incluyen el carbon activado y los materiales celulosicos. Por ejemplo, las rebabas de algodon dadas a conocer en la patente de EE.UU. n.° 2002/0.151.622 como materiales celulosicos se pueden utilizar en la presente invention para absorber compuestos organicos volatiles.

[0108] El material de detection tambien comprende un marcador detectable que produce un cambio de color en presencia de estireno. Un ejemplo de marcador detectable es la 4-nitrobencilpiridina (NBP). El electron no apareado de la NBP reacciona con el anillo de oxirano del oxido de estireno para dar un cromoforo azul.

[0109] Si se desea, el cambio de color del material detectable se puede determinar mediante un ensayo cuantitativo, como mediante espectrofotometrla. El cambio de color tambien se puede determinar cualitativamente. A veces, el cambio de color resultarla evidente a un observador.

[0110] Si se desea, la actividad de la protelna candidata se puede comparar con un control. Un control puede ser una muestra paralela que comprende una cinamato descarboxilasa cuya actividad se ha caracterizado (por ejemplo, una cinamato descarboxilasa nativa, o una cierta cinamato descarboxilasa mutada que sirve como la secuencia base para mutaciones posteriores). Como otra posibilidad, un control puede ser un valor llmite predeterminado, o un valor que esta presente en una base de datos (por ejemplo, una tabla, una base de datos electronica, una hoja de calculo, etc.).

[0111] Como se muestra en la Figura 13, el ensayo de cribado se puede llevar a cabo en mas de un ciclo, y se puede combinar con modelado por ordenador para el diseno racional y para la mejora de la actividad de las cinamato descarboxilasas.

[0112] En determinados ejemplos, el cribado de las cinamato descarboxilasas mutadas que pueden transformar el acido frans-cinamico en estireno, o transformar el acido cumarico en 4-hidroxiestireno, se puede realizar mediante el metodo descrito en la presente memoria. En determinados ejemplos, la protelna candidata que se esta cribando puede ser una protelna de fusion que comprende una cinamato descarboxilasa mutada.

4. Produccion recombinante y purificacion de la cinamato descarboxilasa

[0113] La tecnologla objeto de esta invencion tambien proporciona un metodo de produccion recombinante y purificacion de la cinamato descarboxilasa, como la FDC. En concreto, la tecnologla objeto de esta invencion proporciona un metodo para aislar una cinamato descarboxilasa producida recombinantemente, que comprende; (i) proporcionar un hospedador bacteriano que comprende un acido nucleico que codifica una cinamato descarboxilasa operativamente enlazada a una secuencia promotora; (ii) cultivar el hospedador bacteriano en un medio de cultivo para expresar la cinamato descarboxilasa en la celula hospedadora, en el que la celula hospedadora se cultiva a una temperatura de aproximadamente 10 °C a aproximadamente 25 °C; y (iii) aislar la cinamato descarboxilasa de la celula hospedadora, donde el aislamiento se lleva a cabo en un ambiente anaerobico.

[0114] En algunos ejemplos, cultivar la celula hospedadora bacteriana (por ejemplo, E. coli) a una temperatura mas baja puede promover significativamente el plegamiento correcto de la cinamato descarboxilasa producida recombinantemente, como la FDC1. Disminuir la temperatura de cultivo tambien facilita la conversion de una protelna agregada o plegada incorrectamente a una forma funcionalmente soluble. En determinados ejemplos, el cultivo celular crece a una temperatura de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 °C.

[0115] En el metodo de produccion recombinante de la cinamato descarboxilasa, como la FDC1, tambien se pueden utilizar agentes reductores, como tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) o p-mercaptoetanol. Por lo tanto, para aislar la cinamato descarboxilasa se utilizan una o mas soluciones amortiguadoras que pueden comprender un agente reductor, como TCEP a una concentration de aproximadamente 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM o 100 mM; o p-mercaptoetanol a una concentracion de aproximadamente 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM o 100 mM; y una combination de los mismos.

[0116] Las muestras y los extractos celulares que contienen la cinamato descarboxilasa recombinante (como la FDC1) mantenidos en un ambiente anaerobico tambien presentan actividad de cinamato descarboxilasa.

[0117] La cinamato descarboxilasa producida recombinantemente (como la FDC1) mantiene la actividad de cinamato descarboxilasa en presencia de iones metalicos. Entre los metales ionicos adecuados se incluyen, por ejemplo, los iones de calcio, zinc, magnesio, hierro o manganeso, o una combinacion de los mismos. El ion metalico puede estar presente en una concentration de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM, como aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,2 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 100 mM; de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 15 mM, o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. Preferentemente, el ion metalico es un ion de un metal alcalinoterreo o un ion de un metal de transition.

[0118] La cinamato descarboxilasa purificada descrita en la presente memoria es adecuada para la cristalizacion.

5. Preparacion de la forma cristalina de la cinamato descarboxilasa

[0119] A fin de adquirir mas conocimientos sobre la estructura de la cinamato descarboxilasa, se desarrollo un metodo para cristalizar esta protelna. Tradicionalmente, para la cristalizacion se utilizan los metodos de difusion de vapor de la gota colgante y la gota sentada. Ambos metodos requieren un sistema cerrado, es decir, el sistema se debe sellar para aislarlo del exterior utilizando un recipiente hermetico o aplicando grasa de alto vaclo entre las superficies de vidrio.

[0120] La tecnologla objeto de esta invention proporciona un metodo para cristalizar una cinamato descarboxilasa, donde el metodo comprende (a) proporcionar una solution de cinamato descarboxilasa a una concentracion de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml; (b) mezclar la solucion de cinamato descarboxilasa con una solucion de deposito en una relation de volumenes de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1; y (c) mantener la mezcla del paso (b) a una temperatura adecuada para la formation de cristales de cinamato descarboxilasa.

[0121] Preferentemente, la concentracion de protelna en el paso (a) es de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, y mas preferentemente de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. La relacion de volumenes de la solucion de cinamato descarboxilasa y la solucion de deposito es preferentemente de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 5:1, y mas preferentemente de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 2:1. Normalmente, se mezclan de 1 a 2 pl de la solucion de cinamato descarboxilasa (concentracion de protelna de aproximadamente 5,0 a 10,0 mg/ml) con 1 a 2 pl de una solucion de deposito en un recipiente. La mezcla se pone boca abajo en un pocillo, que contiene la solucion de deposito (por lo general aproximadamente 500 pl) y el sistema se incuba a una temperatura de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 20 °C, preferentemente de aproximadamente 4 °C a aproximadamente 12 °C. Inicialmente, la gota de solucion de protelna contiene una concentracion de precipitante insuficiente para la cristalizacion, pero a medida que al agua se evapora de la gota y se transfiere al deposito, la concentracion de precipitante aumenta hasta el nivel necesario para la cristalizacion. Puesto que el sistema esta en equilibrio, estas condiciones se mantienen hasta que la cristalizacion ha finalizado.

[0122] La cristalizacion de la cinamato descarboxilasa se puede mejorar si la protelna forma un complejo con una molecula pequena. Por ejemplo, la molecula pequena se puede anadir a la solucion de la protelna en el paso (a) o a la mezcla de protelna/deposito en el paso (b) para permitir la formacion de un complejo protelna-molecula pequena. Normalmente, la concentracion final de la molecula pequena en la mezcla del paso (b) es de aproximadamente 0,01% (p/v) a aproximadamente 1% (p/v), preferentemente de aproximadamente 0,05% (p/v) a aproximadamente 0,5% (p/v), y mas preferentemente de aproximadamente 0,08% (p/v) a aproximadamente 0,2% (p/v).

[0123] Entre las moleculas pequenas adecuadas se incluyen los sustratos de la cinamato descarboxilasa (por ejemplo, el acido frans-cinamico) y sus analogos, como el acido 3-hidroxicinamico, el acido ferulico, el acido 2-metilcinamico, el acido 4-hidroxicinamico, el acido 3,4-dimetoxicinamico, el acido 2,5-dimetoxicinamico y combinaciones de los mismos.

[0124] El metodo de cristalizacion se puede mejorar aun mas mediante la inclusion de uno o mas aditivos en la solucion, como MnCl² a una concentracion de aproximadamente 0,001 M a aproximadamente 0,1 M, y preferentemente de aproximadamente 0,005 M a aproximadamente 0,02 M; polivinilpirrolidona K15 a una concentracion de aproximadamente un 0,1% (p/v) a aproximadamente un 2,5% (p/v), y preferentemente de aproximadamente un 0,25% (p/v) a aproximadamente un 1% (p/v); sulfobetalna no detergente 201 (NDSB-201, C⁸H¹¹NO³S) a una concentracion de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 1 M, y preferentemente de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 0,3 M; clorhidrato de benzamidina a una concentracion de aproximadamente un 0,2% (p/v) a aproximadamente un 10% (p/v), y preferentemente de aproximadamente un 1% (p/v) a aproximadamente un 3% (p/v); con todas las concentraciones determinadas en la mezcla de protelna-deposito del paso (b).

E. PROTEINAS DE FUSION Y COMPLEJOS PROTEICOS

[0125] En otro aspecto, la tecnologla objeto de esta invention proporciona una protelna de fusion que comprende: (i) un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y (ii) un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa. Como otra posibilidad, una fenilalanina amonio liasa y una cinamato descarboxilasa pueden formar un complejo proteico por medio de una interaction o interacciones no covalentes.

[0126] La protelna de fusion o el complejo proteico descritos en la presente memoria se benefician del fenomeno de la «canalizacion de sustratos». La canalization del sustrato se refiere a un fenomeno por el cual los sustratos se suministran eficientemente de una enzima a otra sin equilibrarse con otras poblaciones de los mismos sustratos. La protelna de fusion o el complejo proteico pueden canalizar los intermedios entre enzimas secuenciales, y controlar el flujo de sustratos a ramas competidoras de la ruta. En efecto, esto crea poblaciones locales de metabolites a elevadas concentraciones con respecto a las encontradas en otras regiones de la celula.

[0127] Cualquiera de las fenilalanina amonio liasas o cinamato descarboxilasas descritas en la presente memoria se pueden utilizar para producir una protelna de fusion. En determinadas realizaciones, la protelna de fusion tambien comprende un conector que enlaza covalentemente el primer dominio (PAL) y el segundo dominio (cinamato descarboxilasa). El conector preferentemente comprende uno o mas residuos aminoacldicos (por ejemplo, un conector aminoacldico o un conector peptldico). Los residuos aminoacldicos del conector pueden comprender L-aminoacido(s), D-aminoacido(s), analogos de aminoacidos o una combination de los mismos. Otros posibles conectores incluyen, por ejemplo, un enlace covalente, un alquilo de C1-C6, un cicloalquilo como un ciclopentilo o un ciclohexilo, un cicloalquenilo, un arilo o un heteroarilo. Un conector tambien puede comprender una combinacion de uno o mas aminoacido(s) con otra parte conectora (como un alquilo de C1-C6, un cicloalquilo-(C5, C6), un arilo o un heteroarilo).

[0128] En una realization determinada, el conector es un conector peptldico. El peptido conector puede tener una longitud de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35 o 40 aminoacidos. Preferentemente, la longitud del conector es de 2 a 15 aminoacidos.

[0129] En determinadas realizaciones, el conector es un conector de glicina/serina, es decir, un peptido conector que consiste fundamentalmente en glicina y serina. En un ejemplo de realizacion, el conector comprende GS o GSG. En otro ejemplo de realizacion, el conector comprende el motivo Gly-Ser-Gly (GSG), como GGSG (SEC. N.° ID: 39), (GS)*3 (SEC. NA ID: 40), (GGSG)*2 (SEC. NA ID: 41), SGGSGGSGG (SEC. NA ID: 42), GGSGGGSGGGSG (SEC. NA ID: 43), (GGGGS)*3 (SEC. NA ID: 44), como se describe a continuation en el Cuadro 1.

Cuadro 1 Conectores de glicina/serina

[0130] Las protelnas de fusion descritas en la presente memoria se pueden producir mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, cuando el conector es un conector peptldico, la protelna de fusion se puede producir mediante tecnologla de ADN recombinante convencional. Se pueden acoplar otros tipos de conectores mediante, por ejemplo, tecnicas convencionales de conjugation. Vease, por ejemplo, Hermanson et al., Bioconjugate Techniques, 2.a Ed., 2008; Academic Press.

[0131] La protelna de fusion puede comprender multiples unidades de fenilalanina amonio liasa y cinamato descarboxilasa. En determinadas realizaciones, la protelna de fusion puede ser PAL-FDC, PAL-FDC-PAL-FDC o PAL-FDC-FDC-PAL, etc. Por ejemplo, el FDC puede estar en el extremo 5' del ADN que codifica la protelna de fusion, y el PAL puede estar en el extremo 3' del ADN que codifica la protelna de fusion. En otro ejemplo, el PAL puede estar en el extremo 5' del ADN que codifica la protelna de fusion, y el FDC puede estar en el extremo 3' del a Dn que codifica la protelna de fusion. Ademas, la unidad de cinamato descarboxilasa de la protelna de fusion puede ser nativa (WT) o una forma mutada, como cualquiera de las protelnas FDC mutadas descritas mas arriba. Por ejemplo, la protelna de fusion puede ser PAL-FDC(WT) o PAL-FDC(K190E).

[0132] Como otra posibilidad o de manera adicional, la fenilalanina amonio liasa y la cinamato descarboxilasa pueden formar un complejo proteico por medio de una interaccion o interacciones no covalentes. Un «complejo proteico» se refiere a una asociacion de mas de una protelna. Las protelnas del complejo se pueden asociar mediante, por ejemplo, asociacion funcional, estereoqulmica, conformacional, bioqulmica o electrostatica. Se pretende que el termino abarque asociaciones de cualquier numero de protelnas.

[0133] Como otra posibilidad, o de manera adicional, la fenilalanina amonio liasa y la cinamato descarboxilasa se pueden modificar para incluir una «parte que interactua». Por ejemplo, una enzima puede comprender un anticuerpo, y la otra puede comprender un antlgeno afln; o una enzima puede comprender un ligando, y la otra puede comprender un receptor afln; una enzima puede comprender biotina, y la otra puede comprender avidina, etc. Las partes que interactuan pueden interaccionar entre si, de manera que las dos enzimas se aproximan la una a la otra. Se puede utilizar cualquier par de partes que interactuan.

F. CELULAS HOSPEDADORAS Y CULTIVOS CELULARES

[0134] En los metodos descritos en la presente memoria se utilizan celulas hospedadoras para producir estireno. Una celula hospedadora puede proceder de una bacteria, hongo (por ejemplo, levadura), protista (por ejemplo, algas), planta, insecto, anfibio, pez, reptil, ave, mamlfero (incluidas personas), o puede ser una celula de hibridoma. Las celulas hospedadoras pueden ser celulas sin modificar o llneas celulares, o llneas celulares modificadas geneticamente (por ejemplo, para facilitar la produccion de estireno). En algunas realizaciones, la celula hospedadora es una llnea celular que se ha modificado para permitir el crecimiento en las condiciones deseadas, como a una temperatura mas baja.

[0135] Como se describe en la presente memoria, las celulas hospedadoras adecuadas que expresan fenilalanina amonio liasa o cinamato descarboxilasa se pueden cultivar, a veces a gran escala (es decir, aproximadamente 1 litro, aproximadamente 10 litros, al menos 100 litros, etc.), para producir cantidades utiles desde el punto de vista comercial de estireno u otros compuestos obtenidos posteriormente a partir del estireno (compuestos que se producen por medio del tratamiento adicional del estireno en estos microorganismos a traves de rutas enzimaticas o biologicas).

[0136] Los metodos descritos en la presente memoria se pueden aplicar a cualquier tamano de biorreactor y/o matraz de cultivo celular. Por ejemplo, los metodos se pueden aplicar en biorreactores o cultivos celulares de 1 L, 10 L, 30 L, 50 L, 100 L, 150 L, 200 L, 300 L, 500 L, 1000 L, 2000 L, 3000 L, 4000 L, 5000 L, 10.000 L o de mayor capacidad.

[0137] El pH del medio llquido se puede mantener constante, es decir, regulado durante el perlodo de cultivo, o no. Los cultivos pueden crecer en discontinuo, en semicontinuo o en continuo. Los nutrientes se pueden proporcionar al inicio de la fermentacion, o se pueden proporcionar en semicontinuo o en continuo.

[0138] Entre los componentes del medio se incluyen, por ejemplo, la solucion amortiguadora, el contenido en aminoacidos, el contenido en vitaminas, el contenido en sales, el contenido en minerales, el contenido en suero, el contenido en la fuente de carbono, el contenido en llpidos, el contenido en acidos nucleicos, el contenido en hormonas, el contenido en oligoelementos, el contenido en amonlaco, el contenido en cofactores, el contenido en indicadores, el contenido en moleculas pequenas, el contenido en hidrolizados y el contenido en moduladores de la enzima.

[0139] El medio de cultivo a utilizar debe cumplir adecuadamente los requisitos de las cepas en cuestion. Se pueden encontrar descripciones de medios de cultivo para diversos microorganismos en el libro de texto Manual of Methods for General Bacteriology de la Sociedad norteamericana debacteriologla (American Society for Bacteriology) (Washington D.C., EE.UU., 1981). Estos medios que se pueden utilizar conforme a la tecnologla objeto de esta invencion normalmente comprenden una o mas fuentes de carbono, fuentes de nitrogeno, sales inorganicas, vitaminas y/o oligoelementos.

[0140] Las fuentes de carbono para uso en el medio de cultivo de las celulas hospedadoras comprenden glucidos, como mono-, di- o polisacaridos. Algunos ejemplos de fuentes de carbono son la glucosa, la fructosa, la manosa, la galactosa, la ribosa, la sorbosa, la ribulosa, la lactosa, la maltosa, la sucrosa, la rafinosa, el almidon o la celulosa. Los glucidos tambien se pueden anadir al medio a traves de compuestos complejos como la melaza u otros subproductos procedentes del refinado del azucar. La adicion de mezclas de diversas fuentes de carbono tambien puede presentar ventajas. Otras posibles fuentes de carbono son los aceites y las grasas como, por ejemplo, el aceite de soja, el aceite de girasol, el aceite de cacahuete y/o la grasa de coco, los acidos grasos como, por ejemplo, el acido palmltico, el acido estearico y/o el acido linoleico, los alcoholes y/o polialcoholes como, por ejemplo, el glicerol, el metanol y/o el etanol, y/o los acidos organicos como, por ejemplo, el acido acetico y/o el acido lactico.

[0141] Las fuentes de nitrogeno suelen ser compuestos nitrogenados organicos o inorganicos, o materiales que comprenden estos compuestos. Ejemplos de fuentes de nitrogeno comprenden el amoniaco en forma liquida o gas, o sales de amonio como el sulfato de amonio, el cloruro de amonio, el fosfato de amonio, el carbonato de amonio o el nitrato de amonio, nitratos, la urea, aminoacidos o fuentes nitrogenadas complejas como el licor de maiz macerado, la harina de soja, la proteina de soja, el extracto de levadura, el extracto de carne, etc. Las fuentes de nitrogeno se pueden utilizar de manera individual o como una mezcla.

[0142] En una realizacion, las sales inorganicas presentes en el medio de cultivo comprenden aproximadamente una de las sales de cloruro, fosforo y sulfato con calcio, magnesio, sodio, cobalto, molibdeno, potasio, manganeso, zinc, cobre o hierro.

[0143] Como fuentes de azufre para la production de derivados del estireno que contienen azufre se pueden utilizar compuestos inorganicos que contienen azufre, como, por ejemplo, sulfatos, sulfitos, ditionitas, tetrationatos, tiosulfatos, sulfuros o compuestos organicos de azufre como mercaptanos y tioles.

[0144] Como fuente de fosforo se puede utilizar el acido fosforico, el dihidrogenofosfato de potasio o el hidrogenofosfato de dipotasio, o las sales correspondientes de sodio.

[0145] Otros componentes que se pueden anadir al medio de cultivo para mantener los iones metalicos en solution comprenden dihidroxifenoles como el catecol o el protocatecuato, y acidos organicos como el acido citrico.

[0146] El medio de cultivo puede comprender uno o mas iones metalicos, como el calcio, el zinc, el magnesio, el hierro, el manganeso y una combination de los mismos. El ion metalico puede estar presente en una concentration de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 100 mM, como aproximadamente 0,1 mM, aproximadamente 0,2 mM, aproximadamente 0,5 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 100 mM; de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 25 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 15 mM, o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 10 mM. Preferentemente, el ion metalico es un ion de un metal alcalinoterreo o un ion de un metal de transition.

[0147] Los medios de fermentation utilizados conforme a la tecnologia objeto de esta invention para cultivar las celulas hospedadoras de la tecnologia objeto de esta invencion normalmente tambien comprenden otros factores de crecimiento como vitaminas o potenciadores del crecimiento, que incluyen, por ejemplo, la biotina, la riboflavina, la tiamina, el acido folico, el acido nicotinico, el pantotenato y la piridoxina. Los factores de crecimiento y las sales a menudo proceden de componentes complejos del medio, como el extracto de levadura, la melaza, el licor de maiz macerado, etc. Ademas, es posible anadir precursores adecuados al medio de cultivo. La composition exacta de los compuestos del medio depende en gran medida del experimento en particular y se decide de manera individual para cada caso especifico. Se puede encontrar information sobre el cultivo del medio en el libro de texto Applied Microbial. Physiology, A Practical Approach (Editores: P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, 1RL Press (1997) pags. 53-73). El medio de crecimiento tambien se puede obtener de proveedores comerciales, como, por ejemplo, Standard 1 (Merck), BHI (caldo de infusion cerebro-corazon, DIFCO), etc.

[0148] Todos los componentes del medio se esterilizan, o bien con calor (20 min a 1,5 bar y 121° C), o bien mediante esterilizacion por filtration. Los componentes se pueden esterilizar juntos o, si fuera necesario, por separado. Todos los componentes del medio pueden estar presentes al inicio del cultivo o se pueden anadir en continuo o en discontinuo, segun se prefiera.

[0149] La temperatura del cultivo celular se seleccionara principalmente con base en el intervalo de temperaturas a las que el cultivo celular permanece viable, a las que se produce un elevado nivel de polipeptido, a las que el plegamiento incorrecto y/o la agregacion del polipeptido son menores, a las que el polipeptido muestra una modification postraduccional (por ejemplo, glicosilacion, fosforilacion, etc.) mas extensa o mas conveniente, o cualquier combinacion de estos u otros factores que el profesional considere importantes. En general, la mayoria de celulas hospedadoras crecen bien y pueden producir elevados niveles de proteina o polipeptido dentro de un intervalo de aproximadamente 15 °C a 45 °C. En determinadas realizaciones, el cultivo celular crece a una temperatura de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 °C en uno o mas puntos temporales durante el proceso de cultivo celular. Los expertos en la materia tendran la habilidad de seleccionar la temperatura o temperaturas adecuadas para el crecimiento de las celulas, dependiendo de las necesidades de las celulas y de las necesidades de produccion.

[0150] Ademas, el cultivo se puede someter a uno o mas cambios de temperatura durante el transcurso del cultivo. Cuando se modifica la temperatura del cultivo, el cambio de temperatura puede ser relativamente gradual. Por ejemplo, completar el cambio de temperatura puede llevar varias horas o dlas. Como otra posibilidad, el cambio de temperatura puede ser relativamente abrupto. La temperatura se puede aumentar o disminuir constantemente durante el proceso de cultivo. De manera adicional, o como otra posibilidad, la temperatura se puede aumentar o disminuir en cantidades discretas en distintos puntos temporales durante el proceso de cultivo. La(s) temperatura(s) o intervalo(s) de temperatura(s) posteriores pueden ser mas bajos o mas elevados que la(s) temperatura(s) o intervalo(s) de temperatura(s) previos o iniciales. Un experto en la materia sabra que la tecnologla objeto de esta invencion abarca multiples cambios de temperatura. Por ejemplo, la temperatura se puede modificar una vez (a una temperatura o intervalo de temperaturas mas alto o mas bajo), las celulas se mantienen a esta temperatura o intervalo de temperaturas durante un determinado intervalo de tiempo, tras el cual la temperatura se puede modificar de nuevo a otra temperatura o intervalo de temperaturas, que puede ser mas alto o mas bajo que la temperatura o intervalo de temperaturas de la temperatura o intervalo de temperaturas anterior. La temperatura del cultivo despues de cada cambio discreto puede ser constante o se puede mantener dentro de un intervalo de temperaturas determinado.

[0151] Al igual que con la temperatura o intervalo de temperaturas iniciales, la temperatura o intervalo de temperaturas del cultivo celular despues del cambio o cambios de temperatura por lo general se selecciona principalmente con base en la temperatura o temperaturas a las que el cultivo celular permanece viable, el intervalo en el que se produce una cantidad elevada de protelna. Por ejemplo, un cultivo celular bacteriano puede crecer a 37 °C tras la siembra para favorecer la proliferation celular; una vez las celulas alcanzan la densidad deseada, se induce la expresion de una protelna recombinante, y la temperatura se modifica a 25 °C para reducir el plegamiento incorrecto o la agregacion de la protelna producida recombinantemente.

[0152] Tambien se contemplan las condiciones anaerobicas. Entre los ejemplos de hospedadores bacterianos anaerobicos se incluyen, por ejemplo, Bacteroids, Fusobacterium, Clostridium, Propionibacterium, Lactobacillus, Peptococcus, Peptostreptococcus y Veillonella.

[0153] Si se desea, el estireno producido en las celulas hospedadoras puede ademas sufrir una reaction enzimatica y transformarse en un derivado posterior del estireno, como el tolueno, el xileno, el poliestireno, el ABS, el caucho de estireno-butadieno (SBR), el latex de estireno-butadieno, el estireno-isopreno-estireno (SIS), el estirenoetileno/butileno-estireno (S-EB-S), el estireno-divinilbenceno (S-DVB), la resina de estireno-acrilonitrilo (SAN), poliesteres insaturados, etc. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las celulas hospedadoras de la tecnologla objeto de esta invencion pueden transformar un determinado porcentaje del estireno producido en un derivado posterior del estireno. Por ejemplo, la celula hospedadora puede transformar aproximadamente un 5% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 15% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 10% a aproximadamente un 25% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 35% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 30% a aproximadamente un 45% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 40% a aproximadamente un 55% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 50% a aproximadamente un 65% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 60% a aproximadamente un 75% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 70% a aproximadamente un 85% del estireno en un derivado posterior, o de aproximadamente un 80% a aproximadamente un 95% del estireno en un derivado posterior.

1. Hospedadores microbianos

[0154] Entre los microorganismos utiles para la production de estireno se pueden incluir las bacterias, como las bacterias entericas (por ejemplo, Escherichia y Salmonella), Bacillus, Acinetobacter, actinomicetos (como Streptomyces), Corynebacterium, metanotrofos (como Metilosinus), Methylomonas, Rhodococcus, Pseudomona, cianobacterias (como Rhodobacterand, Synechocistis), Klebsiella, Pantoea, Corynebacterium, Clostridium, etc.; levaduras, como Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Debaryomyces, Mucor, Pichia y Torulopsis; hongos filamentosos como Aspergillus, Arthrobotrys; algas, etc.

[0155] Aunque cualesquiera de los microorganismos mencionados arriba serlan utiles para la produccion de estireno, se prefieren las cepas mutadas de bacterias que sobreproducen fenilalanina. La cepa «que sobreproduce fenilalanina» es una cepa microbiana mutada que produce una cantidad mas elevada de fenilalanina con respecto a la de la cepa nativa que no contiene la mutation. La fenilalanina se encuentra presente de manera natural en los microorganismos. Sin embargo, para una slntesis optima del estireno, la celula hospedadora preferentemente sobreproduce fenilalanina de manera que la cantidad de sustrato no limita la produccion de estireno por la celula hospedadora. En la tecnica se conocen metodos para aumentar la slntesis de aminoacidos aromaticos en un microorganismo.

[0156] Un ejemplo concreto de una E. coli que sobreproduce fenilalanina es la cepa NST74 de E. coli (patente de EE.u U. n.° 4.681.852). Entre otras cepas que sobreproducen fenilalanina se incluyen, por ejemplo, Corynebacterium glutamicum (Ikeda, M. and Katsumata, R. Metabolic engineering to produce tyrosine or phenylalanine in a tryptophanproducing Corynebacterium glutamicum strain, Appl. Environ. Microbial. (1992), 58(3), pags. 781-785); Microbacterium ammoniafilum (ATCC, 10155); Corynebactrium lillium (NRRL-B-2243), Brevibacterium divaricatum (NRRL-B-2311); Arthrobacter citreus (ATCC, 11624). Otras cepas adecuadas que sobreproducen fenilalanina se pueden encontrar, por ejemplo, en Maiti et al, Supra and Metabolic Engineering for Microbial Production of Aromatic Amino Acids and Derived Compounds, J. Bongaertes et al, Metabolic Engineering, vol. 3, 289-300), 2001.

[0157] La celula hospedadora tambien se puede seleccionar para que tenga una mayor resistencia frente a un analogo toxico de un aminoacido aromatico (por ejemplo, la fenilalanina). Por ejemplo, se pueden seleccionar microorganismos mutados para que sean resistentes frente a analogos toxicos (m-fluoro-) de la fenilalanina. Estas formas mutadas insensibles a menudo producen elevadas cantidades de fenilalanina y tirosina (patente britanica n.° 1.071.935; patente de EE.UU. n^ 3.709.785).

[0158] Tambien es posible obtener una celula hospedadora recombinante que produzca mas fenilalanina mediante la sobreexpresion de uno o mas genes clave en la bioslntesis de la fenilalanina (Ikeda 2003. Amino acid production processes, pags. 1-35 en T. Scheper (Ed.), Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, vol. 79. Springer-Verlag, Berlin Heidelberg).

[0159] Se pueden utilizar metodologlas de ADN recombinante convencionales para obtener un acido nucleico que codifique una protelna descrita en la presente memoria (por ejemplo, fenilalanina amonio liasa, cinamato descarboxilasa o una protelna de fusion), incorporar el acido nucleico en un vector de expresion, e introducir el vector en una celula hospedadora, como las descritas en Sambrook, et al. (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3.a edicion, Cold Spring Harbor, (2001); Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1995). Un acido nucleico que codifica una protelna se puede insertar en un vector o vectores de expresion de manera que los acidos nucleicos esten operativamente enlazados a las secuencias de control transcripcional y traduccional (como una secuencia promotora, una secuencia de terminacion de la transcripcion, etc.). El vector de expresion y las secuencias de control de expresion por lo general se eligen para que sean compatibles con la celula hospedadora utilizada para la expresion.

[0160] La expresion de protelnas en un hospedador microbiano descrito en la presente memoria se puede mejorar aun mas mediante la optimizacion de codones. Por ejemplo, modificar un codon menos comun con un codon mas comun puede afectar a la semivida del ARNm o alterar su estructura al introducir una estructura secundaria que interfiere con la traduccion del mensaje. Se puede optimizar la totalidad o una parte de una region codificante. En algunos casos, la modulacion deseada de la expresion se logra mediante la optimizacion de practicamente todo el gen. En otros casos, la modulacion deseada se logra mediante la optimizacion de una parte de la secuencia completa del gen, y no de la secuencia completa.

[0161] El uso de codones de cualquier secuencia codificante se puede ajustar para lograr una propiedad deseada, por ejemplo elevados niveles de expresion en un tipo determinado de celula. El punto de partida para dicha optimizacion puede ser una secuencia codificante con un 100% de codones comunes, o una secuencia codificante que contiene una mezcla de codones comunes y no comunes.

[0162] Se pueden generar dos o mas secuencias candidatas que difieran en el uso de codones, y se pueden analizar para determinar si poseen las propiedades deseadas. Las secuencias candidatas se pueden evaluar por ordenador para investigar la presencia de elementos reguladores, como silenciadores o potenciadores, y para investigar la presencia de regiones de la secuencia codificante que se podrlan transformar en dichos elementos reguladores mediante una alteracion del uso de codones. Entre los criterios adicionales se puede incluir el enriquecimiento en determinados nucleotidos, por ejemplo, A, C, G o U, la preferencia codonica por un aminoacido en particular, o la presencia o ausencia de una estructura secundaria o terciaria de ARNm en particular. El ajuste a la secuencia candidata se puede realizar con base en varios de dichos criterios.

[0163] En determinadas realizaciones, la secuencia del acido nucleico para la que se han optimizado los codones puede expresar su protelna a un nivel de aproximadamente un 110%, de aproximadamente un 150%, de aproximadamente un 200%, de aproximadamente un 250%, de aproximadamente un 300%, de aproximadamente un 350%, de aproximadamente un 400%, de aproximadamente un 450% o de aproximadamente un 500% con respecto al expresado por la secuencia del acido nucleico para la que no se han optimizado los codones.

[0164] Ademas del acido nucleico que codifica la protelna, el vector de expresion tambien puede contener secuencias reguladoras que controlan la expresion de la protelna en una celula hospedadora, como promotores, potenciadores u otros elementos de control de la expresion que controlan la transcripcion o la traduccion del acido nucleico o acidos nucleicos. Dichas secuencias reguladoras se conocen en la tecnica (vease, por ejemplo, Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press (1990)). Los expertos en la tecnica apreciaran que el diseno del vector de expresion, incluida la selection de secuencias reguladoras puede depender de factores tales como la election de la celula hospedadora a transformar, el nivel de expresion deseado de protelna, etc.

[0165] Ademas de las secuencias que codifican la protelna y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes de la tecnologla objeto de la presente invencion pueden contener otras secuencias, como secuencias que regulan la replicacion del vector en las celulas hospedadoras (por ejemplo, orlgenes de la replicacion) y genes marcadores seleccionables.

[0166] El vector o vectores de expresion que codifican la protelna se pueden introducir por transformacion o por transfeccion en una celula hospedadora mediante tecnicas convencionales, como electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio o transfeccion con DEAE-dextrano.

[0167] Para la production comercial de estireno, se pueden aplicar diversos metodos de fermentation. Por ejemplo, la produccion a gran escala se puede realizar mediante fermentacion en discontinuo o en continuo.

[0168] Una fermentacion en discontinuo clasica consiste en un sistema cerrado en el que la composition del medio se fija al inicio de la fermentacion y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentacion. Por lo tanto, al inicio de la fermentacion, el medio se inocula con el microorganismo o microorganismos deseados, y se deja que la fermentacion transcurra sin anadir nada al sistema. Sin embargo, normalmente la concentration de la fuente de carbono en una fermentacion «en discontinuo» es limitada y con frecuencia se intenta controlar factores como el pH y la concentracion de oxlgeno. En los sistemas en discontinuo, la composicion en metabolitos y biomasa del sistema cambia constantemente hasta el momento en que la fermentacion se para. En los cultivos en discontinuo, las celulas pasan de una fase de latencia estatica a una fase de elevado crecimiento logarltmico y, finalmente, a una fase estacionaria en la que la tasa de crecimiento es inferior o nula. Si no se tratan, las celulas en fase estacionaria con el tiempo mueren. Las celulas en fase logarltmica por lo general son responsables de la mayor parte de la produccion de producto final o intermedio.

[0169] Una variation del sistema convencional en discontinuo es el sistema en semicontinuo. Los procesos de fermentacion en semicontinuo tambien son adecuados para la tecnologla objeto de esta invencion y comprenden un sistema en discontinuo convencional, con la exception de que el sustrato se anade en incrementos a medida que la fermentacion avanza. Los sistemas en semicontinuo son utiles cuando la represion por catabolito puede inhibir el metabolismo de las celulas y cuando se desea tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. En los sistemas en semicontinuo es diflcil medir la concentracion real de sustrato y, por lo tanto, la concentracion se estima sobre la base de los cambios en factores mensurables, como el pH, el oxlgeno disuelto y la presion parcial de los gases residuales, como el CO². Las fermentaciones en discontinuo y en semicontinuo son habituales y bien conocidas en la tecnica, y se pueden encontrar ejemplos en Brock, T. D.; Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, 2.^a ed.; Sinauer Associates: Sunderland, Mass., 1989; o Deshpande, M. V. Appl. Biochem. Biotechnol. 36:227, (1992).

[0170] La produccion comercial de estireno tambien se puede llevar a cabo mediante fermentacion en continuo. La fermentacion en continuo consiste en un sistema abierto donde un medio de fermentacion definido se anade continuamente a un biorreactor y la misma cantidad de medio acondicionado se extrae simultaneamente para su tratamiento. La fermentacion en continuo por lo general mantiene los cultivos a una densidad elevada y constante, y las celulas se encuentran principalmente en su fase de crecimiento logarltmico.

[0171] La fermentacion en continuo permite la modulation de cualquier numero de factores que afecten al crecimiento celular o a la concentracion de producto final. Por ejemplo, un metodo mantendra un nutriente limitante, como la fuente de carbono o de nitrogeno, a una velocidad fija y permitira que se moderen todos los otros parametros. En otros sistemas, varios factores que afectan al crecimiento se pueden alterar de manera continua, mientras que la concentracion celular, determinada a partir de la turbidez del medio, se mantiene constante. Los sistemas en continuo tratan de mantener condiciones de crecimiento en equilibrio y, por lo tanto, la perdida de celulas debida a la elimination del medio se debe compensar con la tasa de crecimiento celular en la fermentacion. Los metodos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento en los procesos de fermentacion en continuo, as! como las tecnicas para aumentar al maximo la velocidad de formation del producto, son bien conocidos en la tecnica de la microbiologla industrial y en el Brock (supra) se describen diversos metodos.

2. Hospedadores vegetales

[0172] Las celulas vegetales tambien se pueden utilizar como hospedadores para la produccion de estireno. Los hospedadores vegetales preferidos son cualquier variedad que promueva un nivel elevado de expresion de fenilalanina amonio liasa y/o cinamato descarboxilasa. Entre las plantas verdes adecuadas se incluyen, por ejemplo, la soja, la colza (Brassica napus, B. campestris), el girasol (Helianthus annus), el algodon (Gossypium hirsutum), el malz, el tabaco (Nicotiana tabacum), la alfalfa (Medicago sativa), el trigo (Triticum sp), la cebada (Hordeum vulgare), la avena (Avena sativa, L), el sorgo (Sorghum bicolor), el arroz (Oryza sativa), Arabidopsis, las verduras cruclferas (broccoli, coliflor, col, chirivla, etc.), el melon, la zanahoria, el apio, el perejil, el tomate, la patata, la fresa, el cacahuete, la uva, el cultivo de semillas de cesped, la remolacha azucarera, la cana de azucar, la judla, el guisante, el centeno, la linaza, los arboles de madera dura, los arboles de madera blanda y los pastos forrajeros. Entre las especies de alga se incluyen, por ejemplo, hospedadores importantes desde un punto de vista comercial como la espirulina, la Haematococcus y la Dunaliella. Entre las plantas adecuadas tambien se incluyen el biocombustible, la biomasa y las plantas para cultivos de bioenergla. Entre los ejemplos de plantas se incluyen la Arabidopsis thaliana, el arroz (Oryza sativa), el mijo perenne (Panicum vigratum), la Brachypodium spp., la Brassica spp. y la Crambe abyssinica.

[0173] En algunas realizaciones, la celula vegetal es una celula vegetal de Arabidopsis, una celula vegetal de tabaco, una celula vegetal de petunia o una celula de un cultivo de semillas oleaginosas (incluidas, por ejemplo, una celula vegetal de soja, una celula vegetal de canola, una celula vegetal de colza, una celula vegetal de palma, una celula vegetal de girasol, una celula vegetal de algodon, una celula vegetal de malz, una celula vegetal de cacahuete, una celula vegetal de linaza, una celula vegetal de sesamo, etc.).

[0174] Las celulas hospedadoras adecuadas se pueden modificar mediante tecnicas de ingenierla genetica para que expresen fenilalanina amonio liasa y cinamato descarboxilasa. Por ejemplo, el acido nucleico que codifica la fenilalanina amonio liasa o la cinamato descarboxilasa se pueden enlazar operativamente a los promotores que puedan dirigir la expresion de una protelna en los tejidos deseados y en el estadio deseado de desarrollo. Se puede utilizar cualquier promotor y/o terminador adecuados que puedan inducir la expresion de una region codificante. Algunos ejemplos de promotores y terminadores adecuados incluyen a aquellos de la nopalina sintasa (nos), octopina sintasa (ocs) y los genes del virus del mosaico de la coliflor (CaMV).

[0175] Un tipo de promotor de origen vegetal eficiente que se puede utilizar es un promotor de origen vegetal de alto nivel. Entre los promotores de alto nivel origen vegetal que se pueden utilizar en la tecnologla objeto de esta invencion se incluyen el promotor de la subunidad pequena (ss) de la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa, por ejemplo, de la soja (Berry-Lowe et al., J. Molecular and App. Gen., 1:483-498) (1982)), y el promotor de la protelna de union a la clorofila a/b. Se sabe que en las celulas vegetales estos dos promotores son inducidos por la luz (vease, por ejemplo, Genetic Engineering of Plants, an Agricultural Perspective, A. Cashmore, Plenum, N.Y. (1983), pags. 29-38); Coruzzi, G. et al., The Journal of Biological Chemistry, 258: 1399 (1983), y Dunsmuir, P. et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 2:285 (1983)).

[0176] Se pueden utilizar metodologlas convencionales de ADN recombinante para obtener un acido nucleico que codifique una protelna descrita en la presente memoria, incorporar el acido nucleico en un vector de expresion e introducir el vector en una celula hospedadora. La eleccion de vector depende del metodo utilizado para transformar los hospedadores vegetales. Un experto en la materia conocera bien los elementos geneticos que deben estar presentes en el vector plasmldico a fin de transformar, seleccionar y propagar con exito las celulas hospedadoras que contienen el vector. Un experto en la materia tambien entendera que distintos acontecimientos independientes de transformacion produciran distintos niveles y pautas de expresion (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418) (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86) (1989)), y, por lo tanto, que se deben cribar multiples acontecimientos a fin de obtener llneas que muestren los patrones y el nivel de expresion deseados. Dicho cribado se puede llevar a cabo mediante transferencia de Southern de ADN (Southern, J. Mol. Biol. 98, 503, (1975)). Northern analysis of ARNm expression (Kroczek, J. Chromatogr. Biomed. Appl., 618 (12): 133-145) (1993)), analisis de la expresion de protelnas mediante transferencia de Western o analisis fenotlpicos.

[0177] La expresion de protelnas en un hospedador vegetal descrita en la presente memoria se puede mejorar mas mediante la optimizacion de codones, como se describe mas arriba. En determinadas realizaciones, la secuencia del acido nucleico para la que se han optimizado los codones puede expresar su protelna a un nivel de aproximadamente un 110%, de aproximadamente un 150%, de aproximadamente un 200%, de aproximadamente un 250%, de aproximadamente un 300%, de aproximadamente un 350%, de aproximadamente un 400%, de aproximadamente un 450% o de aproximadamente un 500% del expresado por la secuencia del acido nucleico para la que no se han optimizado los codones.

[0178] La tecnologla objeto de esta invencion tambien proporciona celulas hospedadoras transgenicas o celulas hospedadoras que se han transformado con uno o mas acidos nucleicos dados a conocer en la presente memoria. La molecula de acido nucleico puede estar integrada de manera estable en el genoma de la celula, o la molecula de acido nucleico tambien puede estar presente como una molecula extracromosomica. Dicha molecula extracromosomica puede ser autorreplicante. Se entiende que las celulas, tejidos o sujetos transformados abarcan no solo el producto final de un proceso de transformacion, sino tambien la progenie transgenica de los mismos.

[0179] La introduction de un acido nucleico de la tecnologla objeto de esta invencion en una celula vegetal se puede llevar a cabo mediante diversos metodos conocidos por los expertos en la materia, incluidos, entre otros, la insertion de una secuencia del acido nucleico de interes en un plasmido de Agrobacterium rhizogenes o un plas Rm₁ido Ti de Agrobacterium tumefaciens, la microinyeccion, la electroporation o la precipitation directa. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones, la expresion transitoria de una secuencia del acido nucleico o gen de interes se puede llevar a cabo mediante metodos de agroinfiltracion. A este respecto, una suspension de Agrobacterium tumefaciens que contiene la secuencia del acido nucleico o el gen de interes puede crecer en un cultivo y a continuation, se puede inyectar a una planta colocando la punta de una jeringa contra el reverso de una hoja mientras se aplica una contrapresion suave en el otro lado de la hoja. A continuacion, la solution de Agrobacterium se inyecta en los espacios con aire dentro de la hoja a traves de los estomas. Una vez dentro de la hoja, Agrobacterium transforma una parte de las celulas vegetales con el gen de interes, en donde dicho gen a continuacion se expresa de forma transitoria.

[0180] Como otro ejemplo, un vector o acido nucleico de interes se pueden introducir por transformacion en una celula vegetal mediante tecnicas de bombardeo con particulas. A este respecto, una suspension de embriones vegetales puede crecer en un cultivo liquido y a continuacion, se puede bombardear con plasmidos o acidos nucleicos que estan acoplados a particulas de oro, donde las particulas de oro unidas al plasmido o acido nucleico de interes se pueden propulsar a traves de las membranas de los tejidos vegetales, como el tejido embrionario. Tras el bombardeo, los embriones transformados se pueden seleccionar utilizando un antibiotico adecuado para generar nuevos cultivos embrionarios en suspension transformados y propagados mediante clonacion.

[0181] Para obtener mas informacion sobre metodos para transformar y producir celulas vegetales transgenicas, veanse las patentes de EE.UU. n.° 4.459.355; 4.536.475; 5.464.763; 5.177.010; 5.187.073; 4.945.050; 5.036.006; 5.100.792; 5.371.014; 5.478.744; 5.179.022; 5.565.346; 5.484.956; 5.508.468; 5.538.877; 5.554.798; 5.489.520; 5.510.318; 5.204.253; 5.405.765; las patentes europeas n.° 267.159; 604.662; 672.752; 442.174; 486.233; 486.234; 539.563; 674.725; y las patentes mundiales n.° WO 91/02071 y WO 95/06128.

3. Reduccion de la toxicidad del estireno

[0182] En otro aspecto, la tecnologia objeto de esta invencion proporciona una celula hospedadora que comprende: (a) una fenilalanina amonio liasa expresada recombinantemente; (b) una cinamato descarboxilasa expresada recombinantemente; y (c) un transportador unido a la membrana expresado recombinantemente.

[0183] Un problema significativo que limita la bioproduccion de estireno es la toxicidad del estireno para las celulas hospedadoras. Se sabe que la acumulacion de compuestos aromaticos hidrofobicos dentro de la membrana citoplasmatica perturba su integridad. Para reducir la toxicidad del estireno y aumentar su produccion, se puede introducir un transportador unido a la membrana (por ejemplo, una bomba de salida) en la celula hospedadora para eliminar el disolvente organico de la celula. Por lo tanto, la celula hospedadora muestra un fenotipo tolerante hacia los disolventes hidrofobicos.

[0184] En una realizacion, el transportador unido a la membrana puede ser un transportador ABC (transportador con dominio de union a ATP), que son proteinas transmembranarias que aprovechan la energia procedente de la hidrolisis de la adenosina trifosfato (ATP) para llevar a cabo determinados procesos biologicos, incluidos la translocacion de diversos sustratos a traves de las membranas y procesos no relacionados con el transporte, como la traduccion de ARN y la reparation de ADN. Transportan una amplia variedad de sustratos a traves de las membranas extracelulares e intracelulares, incluidos productos del metabolismo, lipidos y esteroles, y farmacos. Las proteinas se clasifican en transportadores ABC con base en la secuencia y la organization de su dominio o dominios de union a ATP (ABC, por sus siglas en ingles).

[0185] En la presente memoria se proporcionan celulas hospedadoras que expresan un transportador ABC que permite que las celulas hospedadoras secreten estireno en el medio de cultivo. En concreto, el transportador ABC es una bomba de resistencia a disolventes. Se ha demostrado que las bombas de resistencia a disolventes que confieren resistencia o tolerancia frente a los disolventes organicos poseen una especificidad muy amplia, y absorben como sustratos compuestos organicos, como compuestos aromaticos, alcoholes, alcanos, etc., atendiendo a sus caracteristicas fisicoquimicas (por ejemplo, acumulacion en la membrana bacteriana) (Kieboom et al. 1998. J. Biol. Chem. 273:85-91). Los compuestos aromaticos tambien se reparten eficazmente en la membrana celular, donde actuan como sustratos para las bombas de resistencia a disolventes.

[0186] En una realizacion de la tecnologia objeto de esta invencion, una celula hospedadora comprende un miembro de la familia de bombas de protones de tipo resistencia/nodulacion/division celular (RND). Las bombas de salida tipo RND pertenecen a las bombas de multirresistencia a farmacos (MDR). Estas tienen una especificidad frente a sustratos extremadamente amplia y protegen a las celulas bacterianas de las acciones de los antibioticos en ambos lados de la membrana citoplasmatica. Se ha demostrado que los miembros de esta familia estan implicados en la expulsion de los antibioticos, metales y oligosacaridos que participan en la transduction de senales de la nodulacion. Las bombas de salida tipo RND suelen funcionar como ensamblajes de tres componentes que se extienden por las membranas exterior y citoplasmatica, asi como por el espacio periplasmico, de las bacterias gram-negativas. Ejemplos de bombas de salida tipo RND adecuadas para su uso en un metodo de la tecnologia objeto de esta invencion se pueden encontrar en Tseng, T. T., Gratwick, K. S., Kollman, J., Park., D., Nies, D. H., Goffeau, A., & Saier Jr., M. H. (1999), J. Mol. Microbial. Biotechnol. 1: 107-125.

[0187] En una realizacion, la celula hospedadora comprende la bomba srpABC de resistencia a disolventes de P. putida S12 (Isken et al. 1996 J. Bacterial. 178:6056; Kieboom et al. 1998. J. Biol. Chem. 273:85-91). Las secuencias aminoacidicas deducidas de las proteinas codificadas por los genes srpABC tienen una amplia homologia con las de la familia RND de bombas de salida. Consta de tres componentes proteicos que juntos se extienden por las membranas internas y externas de las bacterias gram-negativas: un transportador unido a la membrana interna (analogos de la SrpB), un canal en la membrana externa (analogos de la SrpC) y una proteina conectora periplasmica (analogos de la SrpA). En Kieboom et al. (1998 J. Biol. Chem. 273:85-91) se muestran dendrogramas con la relation filogenetica de la SrpA, la SrpB y la SrpC con otras protelnas que participan en la multirresistencia a farmacos. Las protelnas codificadas por srpABC son las que muestran mas homologla con las de la bomba de multirresistencia a farmacos codificada por mexAB/oprM y encontrada en Pseudomonas aeruginosa. La SrpA, la SrpB y la SrpC son identicas en un 57,8, 64,4 y 58,5% a la MexA, la MexB y la OprM, respectivamente. En una realization, una celula hospedadora comprende una bomba de salida que consiste en un transportador unido a la membrana interna, un canal en la membrana externa y una protelna conectora periplasmica que pertenece a la familia RND de bombas de salida, donde las protelnas muestran una identidad de secuencia (homologla) de aproximadamente un 50%, de aproximadamente un 55%, de aproximadamente un 60%, de aproximadamente un 70%, de aproximadamente un 80%, de aproximadamente un 85%, de aproximadamente un 95%, de aproximadamente un 98%, de aproximadamente un 99% o incluso del 100% con respecto a las protelnas SrpA, SrpB o SrpC de P. putida S12. Se puede utilizar cualquier equivalente funcional de bombas de salida de disolventes conocidas que puedan utilizar un compuesto aromatico como sustrato.

[0188] En una realizacion, la celula hospedadora puede transformar el sustrato de carbono fermentable en un aminoacido aromatico (por ejemplo, fenilalanina), que a continuation se transforma en estireno. Una vez producido, el estireno se transporta activamente fuera de la celula hospedadora mediante una bomba de salida, preferentemente mediante un miembro de la familia de bombas de protones de tipo resistencia/nodulacion/division celular (RND), como la srpABC.

[0189] La bacteria P. putida S12 tambien se ha modificado mediante tecnicas de ingenierla genetica como sistema de tolerancia a disolventes para la bioslntesis del p-hidroxibenzoato y del p-hidroxiestireno (Verhoef et al., 2007, Bioproduction of p-hydroxybenzoate from renewable feedstock by solvent-tolerant Pseudomonas putida S12. Journal of Biotechnology 132, 49-56; Verhoef et al., 2009, Bioproduction of p-hydroxystyrene from glucose by the solventtolerant bacterium Pseudomonas putida S12 in a two-phase water-decanol fermentation. Applied and Environmental Microbiology 75, 931-936). La cepa obtenida mediante tecnicas de ingenierla genetica se puede utilizar para la bioproduccion de estireno. Se pueden obtener otros huespedes mediante tecnicas de ingenierla genetica de una manera similar para aumentar la tolerancia a los compuestos organicos.

G. RECOLECCION DEL ESTIRENO A PARTIR DEL CULTIVO CELULAR

[0190] El estireno se puede recolectar del cultivo celular mediante metodos convencionales. Por ejemplo, las celulas hospedadoras se pueden eliminar mediante filtration o centrifugation. Las fases acuosa y oleosa se pueden separar por centrifugacion o por cromatografla. Se pueden utilizar tecnicas adicionales de adsorcion, destilacion y microfiltracion para purificar mas el estireno. Un esquema general de purification conlleva la elimination de los inhibidores de la polimerizacion con una solution acuosa alcalina (normalmente NaOH al 5-10%), el lavado en agua destilada, el secado y la destilacion fraccionada a presion reducida, la microfiltracion de estireno monomerico en fase gas, y una combinacion de los mismos.

[0191] Por lo tanto, la tecnologla objeto de esta invention proporciona una ruta biologica de bajo coste para la production de estireno, el cual es de utilidad en un abanico de materiales comerciales, incluido el poliestireno, el ABS, el caucho de estireno-butadieno (SBR), el latex de estireno-butadieno, el SIS (estireno-isopreno-estireno), el S-EB-S (estireno-etileno/butileno-estireno), el estireno-divinilbenceno (S-DVB), la resina de estireno-acrilonitrilo (SAN) y los poliesteres insaturados. Estos materiales se utilizan en el caucho, el plastico, el aislamiento, la fibra de vidrio, tuberlas, automoviles y piezas de buque, recipientes para alimentos y refuerzo de moqueta.

H. BIOSINTESIS DEL ESTIRENO

[0192] Normalmente, el estireno se puede producir mediante la incubation de un sustrato descrito en la presente memoria (como la glucosa, la fenilalanina o el acido trans-cinamico) con la celula hospedadora que comprende cualquier cinamato descarboxilasa descrita en la presente memoria o cualquier protelna de fusion descrita en la presente memoria. La concentration de glucosa durante la incubacion normalmente es de aproximadamente un 0,02% a aproximadamente un 3%, preferentemente de aproximadamente un 0,05% a aproximadamente un 1,5%, y mas preferentemente de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 1%. La concentracion de acido trans-cinamico durante la incubacion normalmente es de aproximadamente un 0,02% a aproximadamente un 0,5%, y preferentemente de aproximadamente un 0,05% a aproximadamente un 0,2%. La concentracion de fenilalanina durante la incubacion normalmente es de aproximadamente un 0,02% a aproximadamente un 0,5%, y preferentemente de aproximadamente un 0,05% a aproximadamente un 0,2%. En una realizacion, tras la adicion del sustrato, las celulas hospedadoras se cultivan continuamente durante aproximadamente 10 a aproximadamente 72 horas, y preferentemente durante aproximadamente 15 a aproximadamente 36 horas, a una temperatura de aproximadamente 16°C a aproximadamente 37 °C, y preferentemente de 22 °C a aproximadamente 30 °C.

[0193] Con base en lo anterior, la tecnologla objeto de esta invencion proporciona un metodo para producir estireno, donde el metodo comprende (a) poner en contacto una celula hospedadora con un sustrato de carbono fermentable, donde la celula hospedadora comprende una protelna de fusion como las descritas mas arriba; y (b) cultivar la celula hospedadora en un medio de cultivo durante un tiempo suficiente para producir estireno.

[0194] La tecnologla objeto de esta invencion tambien proporciona un metodo para producir estireno, donde el metodo comprende (a) poner en contacto una celula hospedadora con un sustrato de carbono fermentable, donde la celula hospedadora comprende (i) una fenilalanina amonio liasa; y (ii) una cinamato descarboxilasa mutada como las descritas mas arriba; y (b) cultivar la celula hospedadora en un medio de cultivo durante un tiempo suficiente para producir estireno.

[0195] La tecnologla objeto de esta invencion tambien proporciona una celula hospedadora que comprende: (a) una fenilalanina amonio liasa expresada recombinantemente; (b) una cinamato descarboxilasa expresada recombinantemente; y (c) un transportador unido a la membrana expresado recombinantemente. Por lo tanto, la tecnologla objeto de esta invencion tambien proporciona un metodo para producir estireno, donde el metodo comprende (a) poner en contacto la celula hospedadora de arriba con un sustrato de carbono fermentable; y (b) cultivar la celula hospedadora en un medio de cultivo durante un tiempo suficiente para producir estireno.

[0196] En los metodos convencionales, la bioslntesis del estireno se realiza en recipientes cerrados para evitar que el estireno se evapore del recipiente. Este sistema cerrado no puede mantener las condiciones opcionales anaerobicas (condiciones optimas) para que un sistema biologico produzca estireno. Por lo tanto, con el metodo convencional, el estireno producido se acumula en el recipiente cerrado y pasado un tiempo, la bioslntesis del estireno se para debido al efecto de toxicidad del estireno en el sistema de bioslntesis (por ejemplo, una celula hospedadora). Sorprendentemente, la inclusion de un material absorbente para eliminar el vapor de estireno del proceso de bioslntesis no solo permite una deteccion fiable del estireno producido (por ejemplo, por el metodo de detection de la actividad de las FDC mutadas descrito mas arriba), sino que tambien mejora el rendimiento de la bioslntesis del esti reno.

[0197] Por lo tanto, la tecnologla objeto de esta invencion tambien proporciona un metodo para producir estireno, donde el metodo comprende: (a) poner en contacto una celula hospedadora con un sustrato de carbono fermentable, donde la celula hospedadora comprende (i) una fenilalanina amonio liasa; y (ii) una cinamato descarboxilasa; y (b) cultivar la celula hospedadora en un medio de cultivo durante un tiempo suficiente para producir estireno, donde un material absorbente absorbe el vapor de estireno producido.

[0198] En este ejemplo, la fenilalanina amonio liasa y la cinamato descarboxilasa pueden incluir tanto protelnas nativas como protelnas mutadas. Por ejemplo, la cinamato descarboxilasa tambien puede ser una protelna FDC mutada como la descrita mas arriba. Ademas, la fenilalanina amonio liasa y la cinamato descarboxilasa pueden estar presentes como protelnas independientes o como una protelna de fusion, como las protelnas de fusion PAL-FDC(WT) o PAL-FDC(K190e ) descritas mas arriba.

[0199] En un ejemplo, una resina polimerica que puede absorber moleculas organicas absorbe el vapor de estireno, mientras que se permite que el aire circule libremente por el sistema de bioslntesis (por ejemplo, una celula hospedadora). Cualquier material absorbente utilizado en el proceso descrito mas arriba de cribado de alto rendimiento segun la actividad de cinamato descarboxilasa tambien se puede emplear en el proceso de bioslntesis del estireno con dispositivos similares (Figura 19). Por ejemplo, la columna STRATA-X® (que contiene resina polimerica de fase inversa) se puede utilizar para absorber el vapor de estireno producido a partir de una celula hospedadora (por lo tanto, reduciendo la toxicidad para la celula hospedadora), a la vez que se permite que el oxlgeno pase a traves de la resina para mantener condiciones anaerobicas opcionales para el crecimiento celular. Normalmente, este metodo permite producir estireno en una concentration superior a 1 g/L.

[0200] Todos los metodos descritos mas arriba para la production de estireno, incluidos el metodo en el que se utiliza una protelna de fusion, el metodo en el que se utiliza una cinamato descarboxilasa mutada, el metodo en el que se utiliza un transportador unido a la membrana y el metodo en el que se elimina el vapor de estireno con un material absorbente, tambien se pueden utilizar para la produccion de 4-hidroxiestireno. En un ejemplo, se puede utilizar tirosina o acido cumarico, o ambos, como sustratos en los metodos descritos mas arriba para producir 4-hidroxiesti reno.

[0201] La capacidad para construir una protelna de fusion y para analizar rapidamente la actividad de cinamato descarboxilasa en un gran numero de muestras permite la deteccion simultanea de la actividad de las unidades de PAL y cinamato descarboxilasa en la protelna de fusion, de manera que se pueda lograr un mayor rendimiento global de estireno. Este proceso resulta ventajoso con respecto al proceso de determinar la actividad de PAL y cinamato descarboxilasa por separado antes de construir una protelna de fusion.

[0202] Por lo tanto, la tecnologla objeto de la presente invencion tambien proporciona un metodo para detectar simultaneamente la actividad de fenilalanina amonio liasa y cinamato descarboxilasa, donde el metodo comprende: (a) proporcionar una protelna de fusion que comprende: (i) un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y (ii) un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa; (b) mezclar la protelna de fusion con un sustrato en condiciones que permiten que la protelna de fusion transforme el sustrato en un producto; y (c) detectar la cantidad restante de sustrato, o la cantidad de producto, o ambas.

[0203] En un ejemplo, la tecnologla objeto de la presente invencion tambien proporciona un metodo para detectar simultaneamente la actividad de fenilalanina amonio liasa y cinamato descarboxilasa, donde el metodo comprende: (a) proporcionar una protelna de fusion que comprende: (i) un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y (ii) un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa; (b) proporcionar un sustrato seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, acido frans-cinamico, tirosina, acido cumarico y combinaciones de los mismos; (c) incubar la protelna de fusion y el sustrato en condiciones que permitan que la protelna de fusion transforme el sustrato en un producto seleccionado del grupo que consiste en estireno, 4-hidroxiestireno y una combinacion de los mismos; y d) detectar la cantidad restante de sustrato, o la cantidad de producto, o ambas.

[0204] La protelna de fusion, como la PAL-FDC o la PAL-FDC(K190E), se puede preparar utilizando cualesquiera de las PAL y cinamato descarboxilasas descritas mas arriba. Normalmente, se mezcla un sustrato (como fenilalanina o acido frans-cinamico) con la protelna de fusion, y se detecta simultaneamente la actividad de PAL y de cinamato descarboxilasa en la protelna de fusion mediante determinaciones de la cantidad restante de sustrato, o la cantidad de producto, o ambas. Por ejemplo, cuando la fenilalanina como sustrato se mezcla con la protelna de fusion, se puede determinar la cantidad de acido frans-cinamico y estireno como productos. En este ejemplo, la concentracion de acido cinamico refleja tanto su produccion a partir de fenilalanina (por la PAL) como su conversion en estireno (por la cinamato descarboxilasas), y la concentracion de estireno refleja la produccion global de estireno por la protelna de fusion a partir de cualquier sustrato (Figura 18). De manera similar, cuando el acido frans-cinamico se mezcla con la protelna de fusion para su conversion en estireno, se puede determinar la cantidad restante de acido frans-cinamico como sustrato y la cantidad de estireno producido.

[0205] En un ejemplo, la detection simultanea de la actividad de fenilalanina amonio liasa y cinamato descarboxilasa se puede realizar en condiciones similares a las utilizadas en los ensayos de cribado de alto rendimiento descritos en la presente memoria para detectar la actividad de cinamato descarboxilasa. En un ejemplo de realization, la deteccion del estireno comprende exponer la mezcla de la protelna de fusion y el sustrato a una resina polimerica que absorbe el vapor de estireno. Entre las resinas adecuadas se incluyen las resinas hidrofobicas, como las resinas sorbentes de C18, C8, fenilo, SDB-L y combinaciones de las mismas.

EJEMPLOS

[0206] La invencion se define en las reivindicaciones, y cualesquiera de los siguientes ejemplos que queden fuera del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invencion, pero se proporcionan para fines de comparacion.

[0207] La tecnologla objeto de esta invencion tambien se define en los siguientes ejemplos. Se debe entender que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la tecnologla objeto de esta invencion, se facilitan unicamente a tltulo ilustrativo. Con base en la explication anterior y estos ejemplos, un experto en la materia puede determinar las caracterlsticas fundamentales de la tecnologla objeto de esta invencion y, sin alejarse del alcance de esta, puede realizar diversos cambios y modificaciones a la tecnologla objeto de esta invencion para adaptarla a diversos usos y condiciones.

EJEMPLO I. PRODUCCION POR RECOMBINACION, PURIFICACION Y CARACTERIZACION DE LA FDC1 DE LEVADURA.

1. Expresion de la FDC1 de levadura en E . c o li

[0208] La descarboxilacion del acido frans-cinamico (tCA) por la ferulato descarboxilasa (FDC1) es el ultimo paso en la ruta biosintetica del estireno para producir estireno. Aunque en una publication se afirmo que la expresion de la FDC1 por si sola era insuficiente para la conversion del tCA en estireno (Jiang ef al., 2005, Applied and Environmenfal Microbiology, 71: 2962-2969; Clausen ef al., 1994, Gene, 142: 107-112), mas recientemente, se publico que la expresion de la FDC1 por si sola era suficiente para la conversion in vivo del tCA en estireno (McKenna ef al., 2011, Mefabolic Engineering, 13 (5): 544-554). McKenna especulo que otras protelnas, como la Ubix de E. coli, que se asocian in vivo a la FDC1, permiten la conversion del tCA en estireno. No existe ninguna publicacion que muestre claramente que la FDC1 por si sola, sin asociarse a ninguna otra protelna, sea suficiente para transformar el tCA en estireno.

[0209] Para examinar la actividad in vifro de la FDC1 purificada, se construyo un vector de expresion y la FDC1 se expreso en E. coli en diversas condiciones. El plasmido pDESTl 7-FDC1 se introdujo por transformation en celulas competentes de la cepa BL21 (DE3) de E. coli. El medio de caldo Terrific suplementado con ampicilina (100 pg/ml) se inoculo con un cultivo crecido durante toda la noche y diluido 1000 veces. Las bacterias se cultivaron a 37 °C hasta alcanzar una OD600 de 0,8 a 1,0, en cuyo momento se anadio isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG) a una concentracion final de 0,2 mM, y el cultivo se continuo durante 3 horas a la misma temperatura. Se utilizaron tres soluciones amortiguadoras distintas para comprobar la expresion de la FDC1. La solution amortiguadora A contenla solution amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM a pH 7,5, cloruro de sodio 500 mM, imidazol 10 mM, pME 20 mM, PMSF 0,5 mM, MgCl210 mM, ADNasa 2 pg/ml, ARNasa 2 pg/ml y lisozima a 4 pg/ml. La solucion amortiguadora B contenla solucion amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM a pH 7,0, DTT 1 mM, tiosulfato de sodio 50 mM, glicerol al 20%, NaCl 500 mM, MgCh 10 mM, imidazol 20 mM, ADNasa 2 pg/ml, ARNasa 2 pg/ml y lisozima a 4 pg/ml. La solucion amortiguadora C estaba compuesta por la solucion amortiguadora A que contenla tiosulfato de sodio 50 mM y glicerol al 20%.

[0210] A 37 °C, la FDC1 recombinante no se expreso como una forma soluble en E. coli, y formo cuerpos de inclusion, como se muestra en la Figura 2A. Los protocolos convencionales para la expresion de protelnas recombinantes no se pueden aplicar a la FDC1.

[0211] Para producir la FDC1 funcional en E. coli, la expresion de la FDC1 se indujo a diversas temperaturas (37 °C, 30 °C, 25 °C, 18 °C y 16 °C) en presencia de IPTG a diversas concentraciones (0,2 mM, 0,5 mM). La concentracion de IPTG no mostro un efecto significativo en la expresion; sin embargo, a temperaturas mas bajas la expresion y la solubilidad de esta protelna mejoraron. La expresion optima de la FDC1 se logro tras la induccion con IPTG 0,2 mM a 16 °C durante 16 horas (Figura 2B). Las celulas se recolectaron mediante centrifugacion a 4500 rpm a 4 °C, se lavaron una vez con solucion amortiguadora de IX PBS y, a continuacion, se almacenaron a -80 °C.

[0212] La expresion de la FDC1 se estudio mediante SDS-PAGE (gel de acrilamida al 10% en placa con un grosor de 0,75 mm) utilizando el protocolo de Laemmli. Para la tincion de la banda de la protelna se utilizo azul brillante de Coomassie R-250.

[0213] Nuestros resultados indicaron que la expresion de la FDC1 a una temperatura mas baja y a una concentracion mas baja de IPTG contribuyo al correcto plegamiento de la enzima, y a la conversion de formas agregadas o plegadas incorrectamente a una forma soluble y funcional.

2. Purificacion de la FDC1 de levadura

[0214] No existen publicaciones sobre la purificacion y caracterizacion de la FDC1 de levadura. Para estudiar la actividad y las propiedades de la FDC1, se purifico la FDC1 funcional que se produjo recombinantemente a partir de E. coli.

[0215] La purificacion se llevo a cabo en un ambiente anaerobico a 4 °C. Las celulas se suspendieron en solucion amortiguadora A (compuesta por Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 que contenla Na2S2O350 mM, TCEP 25 mM, NaCl 500 mM, PMSF 0,5 mM, p-mercaptoetanol 20 mM, glicerol al 20% e imidazol 10 mM) que contenla MgCh 10 mM, Triton X-100 al 0,2%, ADNasa 2 pg/ml, ARNasa 2 pg/ml y lisozima a 4 pg/ml. Las celulas se rompieron mediante ultrasonicacion y el sobrenadante se recupero mediante centrifugacion a 15.000 g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante resultante se filtro a traves de un filtro de PES de 0,45 pm y a continuacion, se deposito en una columna de afinidad de Ni+-agarosa (GE Healthcare) equilibrada con la solucion amortiguadora A. La columna se lavo bien con solucion amortiguadora A hasta que todas las protelnas que se unen de manera no especlfica se eluyeron de la columna. La protelna se eluyo con solucion amortiguadora A que contenla imidazol 250 mM. El contenido de protelna se determino mediante espectrofotometrla a 280 nm. La protelna estaba bastante pura (Figura 3).

[0216] Se purifico la FDC1 recombinante que podia transformar el tCA en estireno. Sin embargo, la proteina perdio su actividad muy rapidamente durante la purificacion. La actividad de la proteina se puede mantener cuando la purificacion se realiza en condiciones anaerobicas, como al anadir cantidades mas elevadas de agentes reductores (Na2S2O350 mM, TCEP 25 mM y p-mercaptoetanol 20 mM) a las soluciones amortiguadoras.

3. Ensayos para determinar la actividad de las FDC1 producidas recombinantemente

[0217] A fin de estudiar la funcion de la FDC1 recombinante in vitro, se investigaron los efectos de diversas condiciones (por ejemplo, soluciones amortiguadoras a distintos pH, diversas concentraciones de sustrato y diversos disolventes organicos para la extraccion del producto) en la actividad enzimatica de la FDC1.

[0218] Primeramente, se desarrollo un ensayo enzimatico muy exacto y reproducible, con el que se podia determinar la actividad de la FDC1 a una concentracion baja de sustrato.

[0219] La mezcla de reaccion estandar para la descarboxilacion consistia en solucion amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM (pH 6,5) que contenia ditiotreitol 5 mM, acido trans-cinamico 1,4 mM y enzima (0,50 mg) en un volumen final de 1,0 ml. La reaccion se inicio mediante la adicion de la enzima y se incubo a 30 °C durante 5 min. La reaccion se paro mediante la adicion de 24 pl de acido acetico glacial (17,4 N), tras lo cual se anadio 2-propanol en un volumen igual a la mezcla de reaccion para solubilizar el producto. La cantidad de estireno producida se determino mediante HPLC utilizando un UHPLC Dionex Ultimate3000 equipado con un cargador de muestras automatico, un detector UV/Vis de diodos en serie y una columna de fase inversa Acclaim 120 C18 (2,1 x 150 mM, Dionex, EE.UU.). Las muestras se resolvieron a un caudal de 1 ml/min en acido acetico al 0,15% (A) con un gradiente de concentracion en aumento de acido acetico al 0,15% (B): 0 a 4 min, 5%; 4 a 5 minutes, 5 a 40 %; 5 a 7 min, 40 a 45%; 7 a 8 min, 45 a 85%; 8 a 12 min, 85 a 95%; 12 a 14 minutes, 95 a 5%. La actividad especlfica se expreso en U (nmol de estireno)mg-1 min-1.

4. Efecto del pH en la actividad de la FDC1

[0220] El pH de la solucion amortiguadora es uno de los principales factores que pueden afectar a la reaccion enzimatica. Se llevaron a cabo reacciones respectivas en soluciones amortiguadoras a pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 y 8,5 para evaluar el pH optimo para la actividad de la FDC1. Para los valores de pH de 6,0 a 7,5 se utilizo una solucion amortiguadora de fosfato de potasio, y para los valores de pH de 8,0 y 8,5 se utilizo una solucion amortiguadora de Tris-HCl. La mezcla de reaccion estaba compuesta por acido cinamico a 200 pM, DTT 5 mM, soluciones amortiguadoras a varios pH a 100 mM y 150 pl de extracto crudo de FDC1 en un volumen final de 1 ml. Las mezclas de reaccion se incubaron durante 30 minutos a 30 °C. El estireno se extrajo con 100 pl de butanol. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la exception de que la mezcla de reaccion no contenla sustrato. Se encontro que el pH optimo para la descarboxilacion en el extracto crudo de FDC1 era aproximadamente 6,5. Nuestros resultados muestran que la solucion amortiguadora tiene un efecto significativo en la actividad de la FDC1, y la FDC1 mostro una actividad mas elevada a un pH de 6,5 (Figura 4). Esta information es util para la production industrial de estireno.

5. Estabilidad de la FDC1 con el pH

[0221] La solucion amortiguadora tambien afecta a la estabilidad de la FDC1 y a la velocidad de la reaccion. Para estudiar la estabilidad de la FDC1, la protelna se incubo en soluciones amortiguadoras a distintos pH, de 5,0 a 11,0.

[0222] La protelna (extracto crudo, 586 pl) se anadio a 112 pl de soluciones amortiguadoras a 500 mM a un pH de 5. 6, 7, 8, 9, 10 y 11, y se incubo a 30 °C durante 30 minutos. Despues del tratamiento en soluciones amortiguadoras a distintos pH, se anadio una allcuota de protelna (42 mg) a una solucion amortiguadora de fosfato de potasio 100 mM (concentration final) a pH 6,5, DTT 5 mM y acido cinamico 1,4 mM, y se enraso a un volumen final de 2 ml. A continuation, la mezcla de reaccion se incubo durante 8 minutos a 30 °C. El estireno se extrajo mediante la adicion de 250 pl de butanol. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenla sustrato. Se encontro que el extracto crudo de FDC1 era estable en el intervalo de pH de 6 a 10 (Figura 5). Esta protelna es estable y activa en un amplio intervalo de pH y se puede utilizar para la produccion industrial de estireno.

6. Efecto de la temperatura en la actividad de la FDC1

[0223] La temperatura puede afectar a la estabilidad de la FDC1 y a la velocidad de la reaccion. El efecto de temperatura en la velocidad de la reaccion se describe por la ecuacion de Arrhenius. Como regla general, la velocidad de reaccion de muchas reacciones se duplica o triplica por cada aumento de 10 °C en la temperatura, aunque el efecto de la temperatura puede ser mucho mayor o menor.

[0224] Para evaluar la temperatura optima para la FDC1, se llevaron a cabo reacciones respectivas a temperaturas de 25 °C, 30 °C, 32 °C, 35 °C, 40 °C, 50 °C y 60 °C durante 30 minutos. La protelna (extracto crudo de FDC1, 13 mg) se anadio a mezclas de reaccion que contenlan fosfato de potasio 25 mM a pH 6,5, DTT 5 mM y acido cinamico 1,4 mM en un volumen de 1 ml. Tras la reaccion, se anadio 1 ml de propanol a las mezclas de reaccion mezclas para disolver el estireno. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenla sustrato. La temperatura optima para la actividad de la FDC1 fue de aproximadamente 50 °C (Figura 6).

[0225] De manera inesperada, la enzima mostro una actividad maxima a una temperatura mas elevada que otras enzimas de levadura. Esta informacion es de utilidad para la produccion industrial de estireno, ya que una cantidad considerable del coste asociado a la fermentation se debe al enfriamiento del sistema de fermentation. Dado que la enzima FDC es activa a una temperatura de reaccion mas elevada, el intervalo de temperaturas para la fermentacion se puede controlar para aumentar el rendimiento y reducir el coste de enfriamiento.

7. Estabilidad de la FDC1 con la temperatura

[0226] Para estudiar la estabilidad de la FDC1 con la temperatura, se llevaron a cabo reacciones respectivas a temperaturas de 30 °C, 50 °C, 60 °C y 70 °C durante 30 minutos. Tras la incubation a diversas temperaturas, se anadio una allcuota de protelna (42 mg) a una solucion amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM a pH 6,5, DTT 5 mM y tCA 1,4 mM en un volumen final de 1 ml. Las mezclas de reaccion se incubaron durante 8 minutos a 30 °C. El estireno se extrajo con 250 pl de butanol y se cuantifico mediante HPLC con una columna C18. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenla sustrato. La enzima se mantuvo estable a 50 °C (Figura 7).

[0227] La estabilidad del extracto crudo de FDC1 a 50 °C tambien se evaluo mediante la incubacion por separado del extracto crudo a 50 °C durante 10, 30, 60 y 120 minutos. Tras la incubacion de la proteina durante varios tiempos, se anadio una alicuota (42 mg) a solucion amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM a pH 6,5, DTT 5 mM y tCA 1,4 mM en un volumen final de 1 ml. A continuacion, las mezclas de reaccion se incubaron durante 5 minutos a 30°C. El estireno se extrajo tras la adicion de 250 pl de butanol a las mezclas de reaccion y se cuantifico mediante HPLC. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia sustrato. La proteina se mantuvo estable a 50 °C durante 2 h (Figura 8). Este resultado demuestra que la proteina retuvo un 100% de su actividad incluso despues de incubarla durante aproximadamente 2 horas. Esta information es de utilidad para la production industrial de estireno, debido a la termoestabilidad de la FDC1.

8. Efecto de los cofactores en la actividad de la FDC1

[0228] Para examinar el efecto de los cofactores en la actividad enzimatica de la FDC1, se llevaron a cabo reacciones con diversos cofactores. Se evaluaron los efectos de varios cofactores, incluidos la tiamina pirofosfato (TPP), la biotina y el piridoxal fosfato (PLP), en la actividad de la FDC1. Las mezclas de reaccion que contenian solucion amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM a pH 6,5, DTT 5 mM, tCA 0,5 mM, cofactor a 0,5 mM y 0,5 mg de FDC1 purificada en un volumen de 1 ml se incubaron durante 30 minutos a 30 °C. El estireno se extrajo con 250 pl de butanol. Para el control experimental se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia cofactores. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia sustrato.

[0229] Ninguno de los cofactores aumento la actividad de la FDC1. De hecho, se observo que disminuian la actividad de la FDC1 (Figura 9). Este resultado demostro que esta enzima no necesita ninguno de los cofactores comunmente conocidos para mostrar actividad.

9. Efecto de los iones metalicos en la actividad de la FDC1

[0230] Para estudiar el efecto de los iones metalicos en la actividad de la FDC1, se llevaron a cabo reacciones con diversos iones metalicos, incluidos ZnSO4, FeCb, MnCl2, MgSO4, CaCl2, MnSO4 y FeSO4. Las mezclas de reaccion que contenian solucion amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM a pH 6,5, tCA 1,4 mM, DTT 5 mM, ion metalico a 10 mM y 0,5 mg de FDC1 purificada en un volumen final de 1 ml se incubaron durante 5 minutos a 30 °C. Tras la reaccion, se anadio 1 ml de propanol a las mezclas de reaccion para solubilizar el estireno. Para el control experimental se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia iones metalicos. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia sustrato. Los iones Ca2+, Mg2+, Zn2+ y Fe3+ aumentaron la actividad de la FDC1 (Figura 10A).

[0231] Los efectos del Zn2+ y Fe3+ en la actividad de la FDC1 se investigaron mas en profundidad utilizando EDTA para contrarrestar los efectos de los iones metalicos. Las mezclas de reaccion que contenian solucion amortiguadora de fosfato de potasio 25 mM a pH 6,5, tCA 1,4 mM, DTT 5 mM, ion metalico a 10 mM, EDTA 10 mM y 0,5 mg de FDC1 purificada en un volumen final de 1 ml se incubaron durante 5 minutos a 30°C. Tras la reaccion, se anadio 1 ml de propanol a las mezclas de reaccion para solubilizar el estireno. Para el control experimental se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia iones metalicos ni EDTA. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia sustrato. Las reacciones que contenian el ion metalico y EDTA mostraron una actividad similar a la del control (Figura 10B), lo que indica que los iones Zn2+ y Fe3+ aumentan la actividad de la FDC1. Segun los resultados presentados en las Figuras 10A y 10B, la actividad enzimatica de la FDC1 aumento en presencia de metales ionicos, y no se debio a un artefacto experimental. Para la produccion industrial de estireno, esta informacion indica que la adicion de determinados iones metalicos al medio de cultivo puede favorecer la biosintesis del estireno.

10. Especificidad frente al sustrato

[0232] A fin de examinar si la FDC1 es altamente especifica frente al tCA (o si muestra promiscuidad con otros sustratos), se analizo el tCA y sus sustratos analogos, como el acido ferulico, el acido 2-metilcinamico, el acido 2-hidroxicinamico, el acido 3-hidroxicinamico, el acido 4-hidroxicinamico, el acido 3,4-dimetoxicinamico y el acido 2,5-dimetoxicinamico. Las mezclas de reaccion de amortiguador de fosfato de potasio 25 mM a pH 6,5 que contenian DTT 5 mM, sustrato 0,2 mM y 0,5 mg de FDC1 purificada se ajustaron a un volumen final de 1 ml. A continuacion, las mezclas de reaccion se incubaron durante 5 minutos a 30 °C. Tras la reaccion, se anadio 1 ml de propanol a las mezclas de reaccion para solubilizar el estireno. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenia sustrato. Los sustratos acido ferulico, acido 2-metilcinamico y acido 4-hidroxicinamico mostraron una actividad del 57%, 35% y 68%, respectivamente, en comparacion con el tCA (Figura 11). La enzima no mostro ninguna actividad para los sustratos acido 2-hidroxicinamico, acido 3-hidroxicinamico, acido 3,4-dimetoxicinamico y acido 2,5-dimetoxicinamico (Figura 11). La enzima no mostro especificidad estricta frente al tCA; en su lugar, mostro una actividad moderada para el acido ferulico, el acido 2-metilcinamico y el acido 4-hidroxicinamico.

[0233] Los analisis de la especificidad frente al sustrato contribuiran a dilucidar el sitio de union del sustrato y el mecanismo de la actividad enzimatica. Ademas, este abanico de sustratos indico que se puede utilizar el mismo sistema de fermentacion para producir distintos monomeros industriales. Ademas de convertir el acido cinamico en estireno, ahora se puede producir 4-hidroxi-3-metoxiestireno (tambien conocido como, 4-vinilguayacol, 4VG) a partir del acido ferulico; 2-metilestireno a partir del acido 2-metilcinamico; y 4-hidroxiestireno (tambien conocido como 4-vinilfenol) a partir del acido 4-hidroxicinamico.

11. Cinetica

[0234] A fin de examinar la eficiencia catalltica de esta protelna, se realizaron estudios cineticos de la FDC1 utilizando el tCA como sustrato. Para medir las constantes cineticas de equilibrio de la FDC1 nativa, la actividad enzimatica se determino a diferentes concentraciones de tCA (100-2000 pM). Las reacciones se realizaron en un total de 1,0 ml de mezcla de reaccion estandar con 0,5 mg de protelna purificada, y se dejaron avanzar durante 5 min a 30 °C. El estireno se extrajo con 250 pl de butanol. Para el control experimental negativo se utilizaron las mismas condiciones, con la excepcion de que la mezcla de reaccion no contenla sustrato. Las actividades se cuantificaron mediante un metodo de ensayo convencional. Se realizaron ensayos duplicados y se promediaron los resultados. La Vmax y la Km se determinaron mediante analisis de regresion no lineal de los datos de velocidad-concentracion ajustados a la ecuacion de Michaelis-Menten.

[0235] La Km para la FDC1 nativa fue 688 pM y la Vmax fue 6,17 nmol-mg^-min-1. La eficiencia catalltica de esta protelna fue 8,4 M'1S'1, que es mas baja que la de otras enzimas nativas. La eficiencia catalltica mas baja de la FDC1 constituye el mayor obstaculo para la produccion de estireno. La ingenierla de protelnas basada en la estructura sera un buen enfoque para la evolucion molecular de la FDC1 con el fin de aumentar la actividad.

EJEMPLO II. FDC1 MUTADAS Y BIBLIOTECAS DE FORMAS MUTADAS

1. Modelos de la estructura de la FDC1

[0236] No hay estructura terciaria de la FDC1 que se pueda utilizar para analizar los sitios de union del sustrato. Una estructura de una protelna homologa (3-octaprenil-4-hidroxibenzoato descarboxilasa, codigo de PDB: 2IDB) mostro unicamente una identidad del 20% con la FDC1. Para analizar el sitio de union del sustrato se construyo un modelo para la FDC1 truncada mediante el programa SWISMODEL y un modelo para la FDC1 completa mediante el programa I-TASSER. Estos dos modelos son fiables ya que se superponen muy bien. Debido a que la menor eficiencia catalltica de la FDC1 constituye un cuello de botella para la produccion de cantidades mas elevadas de estireno, aplicamos un metodo combinado de biologla molecular y biologla estructural para la evolucion en el laboratorio de un modelo basado en protelnas de la secuencia completa de la FDC1 nativa (Figura 1A).

[0237] Acoplamiento simulado del sustrato con la FDC1. Para la evolucion en el laboratorio de la protelna, se examino el sitio de union del sustrato en la FDC1. No hay publicaciones sobre el sitio de union del sustrato en la FDC1. El acoplamiento simulado del tCA con la FDC1 se realizo con el programa informatico SWISDOCK. Tras el acoplamiento simulado, se encontraron cuatro posibles sitios de union (Figura 1B).

[0238] Tras el analisis de la estructura, el sitio C se estudio para la evolucion molecular con el fin de mejorar la actividad. Sin limitar el alcance de la tecnologla objeto de esta invention, se plantea la hipotesis de que I173, A174, R175, V188, I189, K190 (no se muestra por claridad en la figura), I194, E280, M286, F291 y F440 contribuyen a la union del sustrato (Figura 1C). Por lo tanto, los residuos hidrofobicos (A174, I194 y V188) crean un bolsillo para la union del anillo de fenilo del tCA; y el R175, con carga positiva, forma puentes de hidrogeno con el grupo carboxilo del tCA y el E280, que tiene carga negativa.

2. Mutagenesis por saturacion de la FDC1

[0239] Debido a que la mutagenesis convencional no mejoro la actividad de la FDC1, se aplico la mutagenesis por saturacion dirigida. La mutagenesis por saturacion permite el cambio de un aminoacido a los otros 19 posibles residuos aminoacldicos. La mutagenesis por saturacion se realizo en los sitios 155-156, 159, 162-164, 172-175, 187-196, 226­ 227, 285-287, 291, 326, 331, 360-361, 395-396, 398 y 440-441 de la FDC1 mediante la estrategia de mutagenesis dirigida con el kit QuickChange (STRATAgene, California, EE.UU.) utilizando cebadores degenerados NNK (N representa la mezcla de A, T, G, C y K para G/T). El codon NNK esta degenerado 32 veces y codifica los 20 aminoacidos sin codones raros. Los productos de la PCR realizada con el kit QuikChange se examinaron mediante electroforesis en gel de agarosa y a continuation, 15 pl de los productos de PCR se digirieron con 1 pl de Dpnl (New England Biolabs) a 37 °C durante 4 horas para eliminar el plasmido molde. Allcuotas (2 pl) de los productos digeridos se introdujeron por transformation en celulas competentes BL21-Gold (DE3) (STRATAgene, California, EE.UU.) y se inocularon en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenlan kanamicina. Se confirmo la calidad de la biblioteca obtenida mediante secuenciacion del ADN. La biblioteca abarca un 90% de mutagenesis (17 formas mutadas de 19). Para abarcar un 100% (19 formas mutadas de 19), cribamos 150 formas mutadas para cada sito.

3. Metodo colorimetrico para el cribado de alto rendimiento de la biblioteca de FDC1 mutadas

[0240] El cribado de una poblacion de gran tamano de la biblioteca de protelnas constituye el cuello de botella para la evolucion molecular de la protelna. La caracterizacion funcional de la descarboxilasa se suele realizar con instrumentos anallticos, como HPLC o LC-MS. Aunque el HPLC es muy sensible, requiere mucho tiempo, es caro y genera residuos como metanol o acetonitrilo, y no es adecuado para aplicaciones que requieran una elevada capacidad. Para superar estas barreras tecnicas, se desarrollo un metodo de ensayo colorimetrico basado en la espectroscopia, que consistla fundamentalmente en la deteccion del estireno producido enzimaticamente a partir del tCA. El metodo detallado se facilita mas abajo.

[0241] Las transformadas (ejemplo II.2) se inocularon en placas de 96 pocillos (NUNC, Roskilde, Dinamarca) que contenlan 100 pl de CL por pocillo, y se incubaron a 37 °C durante la noche. A continuation, los cultivos se mezclaron con una cantidad igual de glicerol al 50% y se almacenaron a -80 °C como la placa principal. Una allcuota de cultivo de 10 pl se inoculo en placas de pocillos profundos de 2 ml (USA Scientific) con 1 ml de caldo Terrific (TB) por pocillo y se incubo a 37 °C hasta que la OD600 alcanzo un valor de 1,0. A continuacion, los cultivos se indujeron con IPT^g 0,2 mM y se incubaron a 18 °C durante 20 horas con agitation a 250 rpm.

[0242] Las celulas se recolectaron y se suspendieron con 0,25 ml de solution amortiguadora de PBS a pH 7,0 y el sustrato (tCA) se anadio a una concentration final de 1 g/L. El cultivo se incubo a 30 °C durante 4 horas y el producto volatil, el estireno, se recupero con una placa de fase inversa STRATA-X® de 96 pocillos que contenla 10 mg de resina polimerica (Phenomenex) sobre la placa de cultivo (Figura 19). A fin de evitar la difusion del vapor de estireno, para sellar los pocillos se utilizaron alfombrillas de silicona con prehendidura de 96 pocillos entre la placa de cultivo de 96 pocillos y la placa de fase inversa STRATA-X® de 96 pocillos. El producto se recupero con 200 pl de propanol por cada pocillo y la cantidad de producto se determino mediante el metodo colorimetrico.

[0243] Se evaluaron diversas sustancias qulmicas como indicador para la deteccion del estireno, incluida la NBP (4-nitrobencilpiridina) como indicador preferido. El estireno se mezclo con citocromo P450 BM-3 en solucion amortiguadora de fosfato 50 mM a pH 8,0. La reaction de oxidation del estireno se inicio anadiendo NADPH 0,2 mM, y la mezcla de reaccion se incubo a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitacion. La solucion de NBP se anadio a la mezcla y se incubo a temperatura ambiente durante otros 5 minutos con agitacion, lo que produjo un precipitado blanco. El tubo o la placa que contenla las mezclas de reaccion se calentaron a 70 °C durante 30 minutos y se enfriaron sobre hielo durante 5 minutos. Tras anadir dimetilformamida (150 pl) y K2CO31M (25 pl) la mezcla de reaccion adquirio un color azul que se puede medir inmediatamente mediante espectrofotometrla a 600 nm. El electron no apareado de la NBP reacciona con el anillo de oxirano del oxido de estireno para dar un cromoforo azul cuyo color azul se puede monitorizar mediante espectrofotometrla a 600 nm.

[0244] Los cultivos en placa de 96 pocillos que contenlan estireno se monitorizaron directamente utilizando este metodo de alto rendimiento (Figura 13). Con este metodo se puede detectar estireno en concentraciones tan bajas como 1,0 mM. Este metodo colorimetrico es muy rapido y menos caro, es reproducible y puede realizar mediciones en 1000 colonias en un solo dla.

[0245] Las formas mutadas que mostraron una actividad mas elevada se confirmaron mediante HPLC con una columna C18 ACQUITY UPLC Be H (1,7 pm, 2,1 x 50 mm, Waters, EE.UU.). Las muestras se resolvieron a un caudal de 1 ml/min en acetonitrilo (A) al 30% con un gradiente de concentracion en aumento de acetonitrilo (B): durante 1 min, 95%; entonces a 1 min, 30%. La absorcion por UV se monitorizo a 254, 280 y 310 nm. Los residuos aminoacldicos cambiados en las formas mutadas que mostraron la actividad mas elevada se confirmaron con la secuencia de ADN.

[0246] Se identificaron varias posibles formas mutadas unicas (como K190E, K190C, K190D, K190V, K190N, K190L, K190H y R175I) que produclan una cantidad de estireno significativamente mas elevada en comparacion con la forma nativa (Figura 14). Las formas mutadas K190E, K190C y K190V produjeron 3 veces mas, y la forma mutada R175I produjo 1,5 veces mas estireno, que la forma nativa. Como tal, las FDC1 mutadas produjeron una cantidad significativamente mas elevada de estireno que la forma nativa. La mutagenesis en distintos sitios mostro un efecto aditivo o sinergico en la evolucion proteica de la metiltransferasa (Bhuiya et al., 2010, Journal of Biological Chemistry, 285: 277-285). La mutagenesis en los sitios K190 y R175 de la FDC1 puede aumentar aun mas la production de estireno.

[0247] Se llevo a cabo la produccion de estireno manteniendo el cultivo en un ambiente aerobico. La FDC1 nativa produjo la mitad de estireno en condiciones anaerobicas, en comparacion con la cantidad producida en condiciones aerobicas. Con la columna STRATA-X® se puede atrapar el estireno volatil y mantener las condiciones aerobicas.

EJEMPLO III. PROTEINAS DE FUSION FDC1-PAL

[0248] Expresion de la protelna de fusion FDC-PAL2 en E. coli. Se incluyeron canales artificiales en la produccion de estireno. Para construir la protelna de fusion de la PAL2 y la FDC mediante la tecnologla Gateway, se disenaron cuatro cebadores para la amplification por PCR. El cebador FDC-5' contenla la secuencia CACC, y el cebador FDC 3' tenia un conector de 9 aminoacidos y dos sitios de restriccion Ncol y Pstl en el extremo 3'. Por consiguiente, para fusionar la PAL2 con la FDC, el cebador PAL2-5' tenia un sitio Ncol, y el cebador PAL2-3' tenia un sitio Pstl. El gen de la FDC (~1,5 kb) y el gen de la PAL2 (2,2 kb) se amplificaron utilizando los cebadores de arriba y se clonaron en el vector Gateway® pDEST17. Los constructos de la proteina de fusion de la PAL2 y la FDC se introdujeron por transformacion en la cepa BL21(DE3). Tambien se pueden obtener proteinas de fusion de la FDC mutada y la PAL mediante el proceso descrito mas arriba.

[0249] El uso de un conector para las proteinas de fusion se evaluo con base en la informacion sobre la ruta de biosintesis del resveratrol. Los resultados previos muestran que la proteina de fusion produjo 15 veces mas producto en comparacion con la expresion de dos proteinas independientes (Yechun Wang et al. (2011), JACS, 133: 20684­ 20687). Los resultados indican que el conector desempena un importante papel en la proteina de fusion en lo que respecta a la mejora de la ruta de biosintesis. Se disenaron conectores de distintas longitudes, con 2, 3, 4, 6, 8, 9, 12 y 15 aminoacidos, utilizando el motivo GSG y se examino el efecto de los conectores en la ruta de biosintesis del resveratrol. Encontramos que el conector con 9 aminoacido mostraba el rendimiento mas elevado, en comparacion con los otros conectores (Figura 15). Con base en nuestros descubrimientos, disenamos conectores de 9 aminoacidos para nuestras proteinas de fusion PAL-FDC.

[0250] Con base en la observacion anterior, se desarrollo un modelo informatico para demostrar que el conector artificial realmente aumentaba la canalizacion de metabolitos. El conector de 9 aminoacidos conectaba a dos proteinas (Figura 16) de tal manera que se evitaba la difusion del intermedio (en este caso el acido cinamico), lo que permitia que un segundo enzima (FDC) pudiera captar eficientemente el intermedio, lo que en ultima instancia aumenta la cantidad final de estireno producido. El modelo informatico predijo que la distancia entre los dos centros de reaccion (marcados con las dos flechas) es de 70 A o menos, y forma un canal metabolico.

[0251] El analisis de la expresion mostro que la concentracion de estireno en el medio era de aproximadamente 615 mg/L. Esta proteina de fusion produjo aproximadamente 6 veces mas estireno que la FDC expresada en E. coli (95 mg/L en el medio). Esta cantidad de estireno tambien fue mucho mas elevada que la obtenida con las proteinas PAL2 y FDC no fusionadas (expresadas en levadura, con una concentracion de estireno de 69 mg/L). Estos analisis indican que la proteina de fusion de la PAL2 y la FDC se puede utilizar para mejorar la bioproduccion de estireno.

EJEMPLO IV. EXPRESION DE UN TRANSPORTADOR ABC EN E . C O L I

[0252] Algunas bacterias han desarrollado multiples mecanismos para adaptarse a condiciones desfavorables. Por ejemplo, las cepas de Pseudomonas disponen de aproximadamente tres estrategias para hacer frente a la toxicidad de los disolventes organicos, es decir, estructura modificada de la membrana, bombas de salida activas y detoxificacion enzimatica. En este trabajo, se produjo un huesped de E. coli recombinante que expresaba una bomba de salida (denominada bomba de resistencia a disolventes). La bomba, un miembro de la familia de transportadores ABC, se compone de tres subunidades: conector periplasmico (srpA); transportador unido a la membrana interna (srpB); y canales en la membrana externa (srpC). La secuencia completa (~6 kb) de la bomba srpABC se clono a parti r de ADN genomico de P. putida. En primer lugar, el clon se inserto en el vector pENTR con resistencia a la zeocina y a continuation, en el vector de expresion pCONA-2-DEST de E. coli con resistencia a la kanamicina.

[0253] Finalmente, la bomba se introdujo por transformacion en la cepa BL21 (DE3) de E. coli resistente a la ampicilina que contenia la fusion de PAL2 y FDC. Tras la expresion de prueba de 5 clones en matraces, se selecciono un clon para otro experimento con fermentador. Se inocularon 50 ml de cultivo crecido durante la noche en 1,5 L de medio LB que contenia los antibioticos adecuados. Cuando las celulas alcanzaron una OD600 de aprox. 0,8, se anadio IPTG 5 mM al cultivo para la induction. Despues de 2 h, se anadio el sustrato fenilalanina a una concentracion final de 5 g/L en el cultivo celular. El vapor de estireno se rastreo en una botella que contenia 250 ml de butanol. Las muestras procedentes de la fermentation nocturna (~16 horas) se tomaron y se analizaron por HPLC con una columna Acclaim RSLC C18 y detection a 280 nm. Despues de 16 h de fermentacion, apenas se encontro estireno en el medio, pero se encontro estireno a una concentracion elevada en el butanol. En comparacion con el control que solo contiene la fusion de PAL2 y FDC, el clon que contiene genes triples (fusion de PAL2 y FDC con srpABC) pudo producir casi cuatro veces mas producto, es decir, 521 mg/L frente a 139 mg/L (vease la Figura 17).

EJEMPLO V. BIOSINTESIS DEL ESTIRENO

[0254] Produccion de estireno a partir de glucosa. Se construyo un vector que comprendia la proteina de fusion FDC1(K190E)-PAL, y se introdujo por transformacion en cepas que producian fenilalanina (ATCC 31884 y HG), que se hicieron crecer en LB que contenia ampicilina y/o kanamicina. Los cultivos crecieron a 30 °C durante 12 horas, tras lo cual los cultivos se recolectaron y una alicuota de estos se inoculo en medio M9. Los cultivos crecieron a 30 °C hasta que la OD600 alcanzo un valor de 0,8 y entonces, se indujeron con IPTG 0,2 mM y se continuo el cultivo a 30 °C o 37 °C durante 48 h. El estireno volatil se recupero con la columna STRATA-X®. La cantidad de fenilalanina, tCA y estireno se determino por HPLC. La cepa con numero 31884 de la ATCC produjo 177 mg/L de estireno a partir de glucosa a 30 °C; no se observo acumulacion de tCA ni de fenilalanina (Figura 18A). La cepa HG produjo 13,1 mg/L de estireno y 5,0 mg/L de tCA a partir de glucosa a 30 °C; no se observo acumulacion de fenilalanina (Figura 18 A).

[0255] Resulta interesante que las cepas BL-21(DE3) produjeron 182 mg/L de estireno a partir de glucosa mediante la coexpresion de la protelna de fusion FDC-PAL y el vector productor de fenilalanina (HGTM) a 37 °C. El sistema completo de produccion de estireno a partir de glucosa es transferible a cualquier sistema hospedador.

[0256] Cuando la FDC-PAL produjo estireno a partir de fenilalanina, con la columna STRATA-X® se produjo una concentracion de estireno 25 veces mayor (125 mg/L), en comparacion con la obtenida en condiciones anaerobicas y sin la columna STRATA-X® (5 mg/L). La columna STRATA-X® mantiene condiciones aerobicas, atrapa el estireno volatil y lo elimina, lo que, en ultima instancia, aumenta la produccion de estireno y elimina el efecto de toxicidad en el cultivo.

[0257] Produccion de estireno a partir de acido trans-cinamico o L-fenilalanina. Los nucleotidos que codifican la FDC nativa, la FDC mutada (K190E), la protelna de fusion FDC(WT)-PAL y la protelna de fusion FDC(K190E)-PAL se introdujeron por transformacion en E. coli BL-21 (DE3). Las celulas crecieron en LB a 30 °C durante la noche. Las celulas se recolectaron y se lavaron con medio M9. Las celulas se inocularon a 2,0 ml de medio M9 con una OD600 inicial de 0,3 y se cultivaron a 30 °C hasta que la OD600 del cultivo alcanzo un valor de 0,6 a 0,8, A continuacion, las celulas se indujeron con IPTG 0,2 mM durante 8,0 h a 30 °C. Las celulas transformadas con la FDC nativa y FDC(K190E) fueron alimentadas con acido trans-cinamico al 0,1%. Las celulas transformadas con las protelnas de fusion FDC(WT)-PAL y FDC(K190E)-PAL fueron alimentadas con, o bien acido trans-cinamico al 0,1%, o bien L-fenilalanina al 0,1%. Las celulas alimentadas se cultivaron en continuo durante 36 horas. La columna STRATA-X® se utilizo para recuperar el estireno. El producto se eluyo a partir de la columna con butanol y la cantidad se determino mediante HPLC.

[0258] Como se muestra en la Figura 18B, las celulas transformadas con la protelna mutada FDC(K190E) produjeron una cantidad mas elevada de estireno (758 mg/L) que las transformadas con la FDC nativa (175 mg/ml). En comparacion, la FDC(K190E) fusionada con la PAL produjo una cantidad de estireno ligeramente mas baja a partir de tanto el acido trans-cinamico como de la L-fenilalanina que la FDC nativa fusionada con la PAL.

EJEMPLO VI. PURIFICACION DE LA CINAMATO DESCARBOXILASA PARA SU CRISTALIZACION

[0259] Se construyo un vector de expresion de la FDC1 que tenia 6 histidinas y SUMO en el extremo amino. El ADN que codifica la FDC1 se introdujo por transformacion en celulas competentes de E. coli (Rosetta 2) y se hizo crecer en LB que contenia ampicilina. Los cultivos crecieron en LB a 37 °C durante la noche. Los cultivos se inocularon en medio de caldo Terrific y crecieron a 37 °C hasta que la OD600 alcanzo un valor de 0,8 a 1,0, momento en el que se anadio IPTG a una concentracion final de 0,2 mM, y el cultivo se continuo a 16 °C durante 16 horas. Las celulas se recolectaron mediante centrifugacion durante 15 minutos a 4°C a 4500 rpm. El sedimento celular se suspendio en la solucion amortiguadora A (solucion amortiguadora de fosfato de potasio 50 mM, tiosulfato de sodio 50 mM, TCEP-HCl 50 mM, NaCl 500 mM, p Ms F 0,5 mM, MgCh 10 mM, imidazol 10 mM, pME 20 mM y glicerol al 20% ajustado a pH 7,5) que contenia Triton X-100 al 0,1%, RNAsa 2 pg/ml, DNAsa 2 pg/ml y lisozima a 4 pg/ml. Las celulas se rompieron mediante ultrasonicacion 10 veces a una amplitud de 15, durante un tiempo de proceso de 5 segundos y con pulsos intermitentes de 1 segundo. El sobrenadante se recupero mediante centrifugacion durante 15 minutos a 15.000 rpm a 4 °C. El sobrenadante se filtro a traves de un filtro de PES de 0,45 pM y se aplico a una columna de afinidad de Ni+-agarosa (GE Healthcare). La columna se lavo con la solucion amortiguadora A hasta que las proteinas que se unen de manera no especifica se eluyeron de la columna. La FDC1 se eluyo con fosfato de potasio 50 mM, tiosulfato de sodio 50 mM, TCEP-HCl 50 mM, cloruro de sodio 500 mM, PMSF 0,5 mM, cloruro de magnesio 10 mM, imidazol 250 mM, pME 20 mM y glicerol al 20% ajustado a pH 8,0. Se obtuvo un total de 45,0 mg de proteina despues de la columna de afinidad de Ni+-agarosa.

[0260] Se anadio hidrolasa (0,5 mg) para disociar el SUMO de la FDC1. La digestion se llevo a cabo a 4 °C mediante dialisis de la proteina durante la noche en 1 L de fosfato de potasio 25 mM, tiosulfato de sodio 50 mM, NaCl 500 mM, DTT 5 mM y glicerol al 20% ajustado a pH 7,5. La dialisis se continuo a la manana siguiente en un litro fresco de solucion amortiguadora de dialisis durante 2-4 horas.

[0261] Purificacion sustractiva. La columna de afinidad de Ni+-agarosa se lavo con agua, se recargo con sulfato de niquel y se equilibro con la solucion amortiguadora A antes de depositar la proteina en la columna. La protelna se deposito en una columna, el eluyente se recupero y se anadieron 15 ml de solucion amortiguadora A, que se recupero como eluyente. Despues de recuperar toda la FDC1 , la columna se lavo con una solucion amortiguadora de elucion para eliminar el SUMo y la hidrolasa de la columna. El eluyente que contiene la FDC1 se combino y se determino la cantidad de protelna. Tras la purificacion sustractiva, se encontro un total de 27,5 mg. La proteina se dializo durante la noche en la columna Q con 1 L de solucion amortiguadora A (fosfato de potasio 25 mM, DTT 5 mM y tiosulfato de sodio 25 mM ajustado a pH 7,5).

[0262] Cromatografia de intercambio anionico. La columna Q (GE Healthcare) de intercambio anionico se equilibro con la solucion amortiguadora A para la columna Q. La proteina se deposito en la columna y se lavo con solucion amortiguadora A hasta que todas las protelnas que se unen de manera no especifica se eluyeron de la columna. La

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una celula hospedadora que comprende: (a) una protelna de fusion expresada recombinantemente que comprende un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa; y (b) un transportador unido a la membrana expresado recombinantemente.

2. La celula hospedadora de la reivindicacion 1, donde la cinamato descarboxilasa producida por dicha celula es una cinamato descarboxilasa mutada que comprende una mutacion en una posicion de residuo aminoacldico que corresponde a una posicion seleccionada del grupo que consiste en: 155, 156, 159, 162, 163, 164, 172, 173, 174, 175, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 226, 227, 280, 285, 286, 287, 291, 326, 331, 360, 361, 395, 396, 398, 440, 441 de la SEC. N.° ID: 8, y combinaciones de las mismas.

3. La celula hospedadora de la reivindicacion 1, donde la fenilalanina amonio liasa producida por dicha celula es una fenilalanina amonio liasa que comprende una secuencia aminoacldica seleccionada del grupo que consiste en: SEC. N7 ID: 2, SEC. N7 ID: 4, SEC. N7 ID: 6, y un fragmento funcional o variante de las mismas.

4. Un metodo para cristalizar una protelna de fusion que comprende un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, y un segundo dominio que comprende una cinamato descarboxilasa expresada por la celula hospedadora de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, el metodo comprende:

a) obtener la protelna de fusion expresada por la celula hospedadora de cualesquiera de las reivindicaciones anteriores;

b) proporcionar una solucion de la protelna de fusion a una concentracion de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml;

c) mezclar la solucion de la protelna de fusion con una solucion de deposito en una relacion de volumenes de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 10:1;

d) anadir acido 3-hidroxicinamico a la solucion del paso (a) o del paso (b) a una concentracion final de acido 3-hidroxicinamico del 0,01% en p/v al 1% en p/v; y

e) mantener la mezcla del paso (c) a una temperatura de 1 °C a 20 °C adecuada para la formacion del cristal de la protelna de fusion, de manera que la protelna de fusion cristalizada se encuentra en un complejo con el acido 3-hidroxicinamico.