ES2709391T3 - Nanopartículas para inmunoterapia - Google Patents

Abstract

Una composición de nanopartículas que comprende: una colección aislada de partículas sintéticas que comprenden un antígeno y un polímero sintético que comprende polietilenglicol eficaz para activar la maduración de células dendríticas, en la que la colección tiene un diámetro medio de partícula de 20 nm a 70 nm.

Description

DESCRIPCION

Nanoparticulas para inmunoterapia

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica prioridad a la patente de Estados Unidos con el numero de serie 60/775.132, presentada el 21 de febrero de 2006.

Campo tecnico

El campo tecnico se refiere, en algunos aspectos, a nanoparticulas con quimicas de superficie para la activacion del sistema inmunologico.

Antecedentes

Se podrian obtener muchos beneficios medicos si se pudiera entrenar el sistema inmunitario para que respondiera a antigenos de una forma deseada, tal como desarrollando tolerancia al antigeno o aprendiendo a rechazarlo. Se han tratado de aplicar diversos enfoques para afrontar este desafio, incluidos tratamientos farmacologicos sistemicos, la inyeccion de antigenos y tratamientos con anticuerpos.

Rehore A., "Poly(propylene sulfide)nanoparticles as drug carriers" Swiss Federal Institute of Technology Zurich, vol. Dissertation ETH 15861 2005, paginas 133-148, XP002730080, recuperada desde Internet: URL: http: //ecollection.library.ethz.ch/eserv/eth: 27681eth-27681-02.pdf [recuperada el 22/02/2014] expone en una disertacion sobre las propiedades de nanoparticulas de PPS.

Reddy ST, et al. informan en J Control Release, 1 de mayo de 2006; 112 (1): 26-34. Epub 10 de marzo de 2006, sobre el direccionamiento in vivo de nanoparticulas de poli(sulfuro de propileno) a celulas dendriticas de los ganglios linfaticos. El suministro de nanoparticulas biodegradables a celulas presentadoras de antigenos (CPA), especificamente celulas dendriticas (CD), tiene potencial para inmunoterapia. El estudio investiga la administracion de nanoparticulas de poli(sulfuro de propileno) (PPS) estabilizadas con poli(etilenglicol) de 20, 45 y 100 nm de diametro a CD de los ganglios linfaticos. Estas nanoparticulas consisten en un nucleo gomoso reticulado de PPS rodeado por una corona hidrofila de poli(etilenglicol). El dominio de PPS es capaz de transportar farmacos hidrofobos y se degrada en entornos oxidativos. Las particulas de 20 nm fueron las que se captaron mas facilmente por los vasos linfaticos tras una inyeccion intersticial, mientras que tanto las nanoparticulas de 20 como las de 45 nm presentaron una retencion significativa en los ganglios linfaticos, mostrando una presencia constante e intensa a las 24, 72, 96 y 120 h despues de la inyeccion. Las nanoparticulas se internalizaron por hasta un 40-50% de las CD (y CPA) de los ganglios linfaticos sin el uso de un ligando de direccionamiento, y el sitio de la internalizacion se encontraba en los ganglios linfaticos mas que en el sitio de inyeccion. Finalmente, se observo un aumento en CD (y otras CPA) que contenian nanoparticulas a las 96 h con respecto a las 24 h, lo que sugiere una infiltracion de estas celulas en los ganglios linfaticos. Por lo tanto, las nanoparticulas de PPS de 20-45 nm tienen potencial para aplicaciones inmunoterapeuticas que se dirigen especificamente a CD de los ganglios linfaticos.

Sumario de la invencion

Un nuevo enfoque, entre otros descritos en el presente documento, dirige especificamente sustancias terapeuticas a celulas presentadoras de antigenos (CPA) en una ubicacion especifica del cuerpo. Las CPA son tipicamente celulas dendriticas y macrofagos y, en algunos casos, celulas B. En el presente documento, CPA es un termino usado solo para describir celulas dendriticas y macrofagos, y excluye las celulas B. Aunque las CPA se extienden por todo el cuerpo, este enfoque dirige el agente a las CPA en una ubicacion particular: el ganglio linfatico. Las CPA se comportan de manera diferente en el ganglio linfatico en comparacion con otras partes del cuerpo, por lo que el ingreso del agente en esta ubicacion es ventajoso. Ademas, el vehiculo persiste a lo largo de horas o dias, de forma que pueda lograr sus efectos, y tambien es biodegradable. El vehiculo de administracion del agente terapeutico no solo se dirige a las CPA en el ganglio linfatico, sino que ademas activa las CPA de una forma especifica: activando el sistema del complemento. La activacion del sistema del complemento recurre a rutas conocidas de respuesta de tal forma que se pueden elegir los agentes inmunoterapeuticos apropiados. Ademas, el sistema del complemento es activado por materiales sinteticos del vehiculo de administracion sin involucrar agentes biologicos. El resultado de todas estas caracteristicas dirigidas especialmente es un vehiculo que genericamente suministra un agente terapeutico a las CPA en un momento y un lugar en los que se activan las CPA para lograr la inmunoterapia deseada. El vehiculo en si no involucra moleculas biologicas ni polipeptidos, por lo que esta listo para recibir cualquier agente sin que se provoque ningun conflicto, reaccion cruzada ni antagonismo no deseados en el sistema inmunologico.

Este enfoque incluye, en algunas formas de realizacion, particulas que tienen propiedades fisicas adecuadas y que estan dimensionadas de forma que fluyan a traves de los espacios intersticiales para penetrar en el sistema linfatico. Las particulas que son demasiado grandes no migraran de forma eficaz al sistema linfatico. Dichas particulas pueden fabricarse con polimeros sinteticos biodegradables y polimeros que activan el complemento. Dichas particulas pueden producirse mediante la reticulacion de diversos polimeros conjuntamente y la disposicion de determinados grupos funcionales que activan el complemento en una ubicacion en las particulas que este disponible para la activacion del complemento. Todas estas caracteristicas se describen en detalle a continuacion.

Segun la divulgacion de la invencion, una composicion es una composicion de nanoparticulas que comprende: una coleccion aislada de particulas biodegradables sinteticas asociadas con un agente inmunoterapeutico y que comprende un primer polimero que activa el complemento y un segundo polimero reticulado covalentemente, en la que la coleccion tiene un diametro medio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, el primer polimero carece de biomoleculas naturales que activan el complemento, y el primer polimero esta fuertemente unido al segundo polimero.

Algunas formas de realizacion de la divulgacion se refieren a un procedimiento para producir una composicion inmunoterapeutica de nanoparticulas que comprende la polimerizacion en emulsion de un primer polimero con un segundo polimero que es el emulsionante utilizado durante la polimerizacion para producir una coleccion de particulas biodegradables con un diametro medio de entre aproximadamente 20 nm y aproximadamente 100 nm, seleccionandose el segundo polimero de forma que comprenda grupos funcionales hidroxilo que activan el complemento, y la asociacion de un producto inmunoterapeutico con las particulas.

Algunas formas de realizacion de la divulgacion se refieren a un procedimiento de administracion de un agente inmunoterapeutico, comprendiendo el procedimiento la introduccion en un paciente de una coleccion de particulas biodegradables sinteticas que se dirigen especificamente a celulas presentadoras de antigenos de los ganglios linfaticos, en el que las particulas comprenden un primer polimero que activa el complemento, la coleccion tiene un diametro medio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, el primer polimero carece de biomoleculas naturales que activan el complemento, y las particulas comprenden un segundo polimero reticulado covalentemente que esta fuertemente unido al primer polimero.

Algunas formas de realizacion de la divulgacion se refieren a una composicion de nanoparticulas que comprende una coleccion aislada de particulas sinteticas que comprenden un polimero sintetico que activa el complemento, en la que la coleccion tiene un diametro medio de particula, por ejemplo, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm. Las particulas pueden asociarse adicionalmente con un antigeno. El polimero sintetico en algunas formas de realizacion carece de secuencias de aminoacidos o secuencias de sacaridos que activan el complemento, o carece completamente de aminoacidos y/o acidos nucleicos y/o sacaridos. El polimero sintetico puede incluir, por ejemplo comprende, una porcion hidrofoba que esta adsorbida en una porcion hidrofoba de un segundo polimero biodegradable que forma el nucleo de la nanoparticula para unir asi el polimero sintetico al nucleo.

Algunas formas de realizacion de la divulgacion se refieren a una composicion de nanoparticulas que comprende: una coleccion aislada de particulas sinteticas, en la que la coleccion tiene un diametro medio de aproximadamente, por ejemplo, 10 nm a aproximadamente 100 nm, en la que las particulas comprenden un farmaco inmunosupresor, y en la que las particulas estan asociadas adicionalmente con un antigeno. En algunas versiones, las particulas comprenden un copolimero de bloques anfifilico de al menos un bloque hidrofobo y al menos un bloque hidrofilo, en las que el copolimero de bloques se autoensambla en soluciones acuosas formando las particulas.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 es un montaje fotomicrografico que muestra una comparacion de la captacion de nanoparticulas por los vasos linfaticos iniciales. Representa la microlinfangiografia de fluorescencia de la red capilar linfatica en la piel de la cola de un raton despues de 90 minutos de infusion con nanoparticulas de PPS cargadas con fluorescencia de (A) 20, (B) 45 y (C) 100 nm de diametro. Las imagenes se tomaron mediante exposicion constante. La red linfatica hexagonal era claramente visible con las particulas de 20 nm. Barra = 100 pm.

La figura 2 es un montaje fotomicrografico que muestra la retencion en los ganglios linfaticos de nanoparticulas. Se muestran secciones de ganglios linfaticos de drenaje despues de inyecciones en la cola del raton con nanoparticulas de PPS de 20, 45 y 100 nm. Los ganglios linfaticos se extrajeron a las 24, 72, 96 y 120 h despues de la inyeccion. Habia una fuerte presencia de las nanoparticulas en todos los puntos temporales para las nanoparticulas de 20 y 45 nm, pero no se observaron particulas de 100 nm en los ganglios linfaticos. Barra = 200 pm.

La figura 3 es un montaje fotomicrografico que muestra la ubicacion de nanoparticulas dentro del ganglio linfatico. Se muestran secciones de ganglios linfaticos en serie a las 96 h despues de la inyeccion de nanoparticulas de PPS de 20 nm. Se identificaron celulas inmunitarias tal como se ha indicado con anticuerpos contra (A) CD3e (celulas T), (B) CD45R (celulas B) y (C) CD68 (macrofagos (Mac)) y celulas dendriticas (CD)). Las nanoparticulas estan claramente ausentes en las zonas de celulas T y celulas B, pero estan fuertemente colocalizadas con macrofagos y CD. Barra = 100 pm. (D) El marcador endotelial CD31 muestra la distribucion de las nanoparticulas (verde) con respecto a la arquitectura del seno de los ganglios linfaticos. Barra = 100 pm.

La figura 4 es un montaje fotomicrografico que muestra la internalizacion de las nanoparticulas por macrofagos y celulas dendriticas (CD). Se muestran imagenes confocales de secciones de ganglios linfaticos a las 96 h despues de la inyeccion de nanoparticulas de PPS de 20 nm. (A) La tincion para CD68, expresado tanto por macrofagos como por CD, revela la internalizacion de las nanoparticulas por estas celulas. (B) La tincion para Dec-205, que se encuentra exclusivamente en las CD, demuestra que las CD tambien internalizan las nanoparticulas. Barra = 20 pm.

La figura 5 presenta graficos de barras que muestran la cuantificacion de la absorcion celular de nanoparticulas (NP). Se utilizo un analisis de citometria de flujo para determinar la fraccion de CPA (MHCII+) y CD (CD11c+) de ganglios linfaticos que internalizaron NP (FITC+). (A) A las 24 h, despues de las inyecciones, mas del 38% de las CPA y el 50% de las CD de los ganglios linfaticos habian internalizado nanoparticulas de 20 nm. Se redujo la absorcion en ambas poblaciones celulares con nanoparticulas de 45 nm, y solo ~10% de todas las CPA absorbieron nanoparticulas de 100 nm. (B) Despues del pulsado in vitro CPA y CD con nanoparticulas durante 24 h, casi todas las CPA y CD habian internalizado nanoparticulas de los 3 tamanos. Por lo tanto, dado que los 3 tamanos de nanoparticulas son igualmente absorbidos in vitro, las diferencias observadas a continuacion en inyecciones in vivo son debidas mas probablemente a las diferencias en la captacion de nanoparticulas por los vasos linfaticos despues de la inyeccion. Estos resultados tambien indican que la absorcion de nanoparticulas tiene lugar en los ganglios linfaticos en lugar de por celulas presentes en sitios perifericos que despues migran a los ganglios linfaticos.

La figura 6 es un (A) un montaje fotomicrografico y un grafico de barras (B) que muestran un aumento de la presencia de macrofagos y celulas dendriticas (CD) con el tiempo. Se muestran secciones de ganglios linfaticos tenidas para macrofagos (Mac) y CD (celulas CD68+) y nucleos a las 24 y 96 h despues de la inyeccion de nanoparticulas (NP) de PPS de 20 nm. La colocalizacion de Mac y CD aumento a lo largo del tiempo. Barra = 100 pm. (B) Se utilizo un analisis de citometria de flujo para determinar la fraccion de celulas de ganglios linfaticos (GL) con nanoparticulas (NP+) que eran CPA (MHCII+) y CD (CD11c+) a las 24 y 96 h despues de la inyeccion de nanoparticulas de 20 nm. Hay un aumento significativo en la fraccion de celulas con nanoparticulas que son CPA y CD a las 96 h con respecto a las 24 h. Ademas, parece que casi todas las CPA con nanoparticulas a las 24 h son CD.

La figura 7 presenta graficos que muestran un aumento en la expresion de marcadores de maduracion de CD, CD86 y CD80, despues de la internalizacion de nanoparticulas (NP). (A) Un histograma tipico de expresion de CD86 de CD (CD11c+) a las 24 h despues de la inyeccion con PBS o particulas de 20 nm. Se observa un claro cambio en la expresion de CD86 para CD con nanoparticulas (CD11c+FITC+). (B) Se determina que la fraccion de celulas que expresan positivamente CD86 y CD80 es significativamente superior despues de la internalizacion de nanoparticulas. Ademas, se muestra que la expresion de CD86 y CD80 permanece en niveles mas elevados a las 96 h despues de la inyeccion.

La figura 8 presenta datos que muestran que PLURONIC F-127 se modifica de forma que los grupos OH terminales se convierten en grupos OCH³ (A). (B) La incubacion de nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) (OH-NP) con suero causa una mayor activacion del complemento que las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi (CH³-NP) medida mediante las veces que aumenta C3a en suero PBS.

La figura 9 presenta graficos que muestran que la quimica de superficie de las nanoparticulas dicta la respuesta de maduracion de CD. Las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) (OH-NP) de 25 nm maduran las CD en una medida mucho mayor que nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi (CH³-NP) de 25 nm y nanoesferas de poliestireno carboxilado (COOH-NS) de 20 nm.

La figura 10 presenta graficos que muestran que el tamano de las nanoparticulas dicta la respuesta de maduracion de CD. Las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) (OH-NP) de 25 nm inducen la maduracion de CD, mientras que las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) de 100 nm no lo hacen.

La figura 11 muestra un esquema quimico para modificar nanoparticulas y una microfotografia de las mismas en los ganglios linfaticos, en los que en (A) PLURONIC esta funcionalizado con vinilsulfona (PL-VS). La vinilsulfona se puede unir despues a las cisteinas libres de ovoalbumina (OVA). La PL-VS-OVA se mezcla despues con PLURONIC y se sintetizan nanoparticulas de 25 nm como generalmente. (B) Las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC conjugadas con OVA de 25 nm suministran OVA a los ganglios linfaticos.

La figura 12 presenta graficos que muestran que las nanoparticulas de PPS activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA (OH-OVA-NP) de 25 nm inducen la maduracion de la CD a niveles similares a los de OVA con LPS despues de las inyecciones en ratones a las 24 horas.

La figura 13 presenta graficos que muestran que las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA (OH-OVA-NP) de 25 nm causan la proliferacion de celulas T CD4 a los mismos niveles que la OVA con LPS despues de la transferencia adoptiva de celulas T desde ratones OT-II.

La figura 14 presenta graficos que muestran que las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA (OH-OVA-NP) de 25 nm, causan memoria en las celulas T CD8, medida a traves de manchas de IFN-Y/celulas de ganglios linfaticos. *, P <0,05.

La figura 15 presenta graficos que muestran los titulos de Ab (anticuerpo) de OVA a los 21 dias. Las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA (OH-OVA-NP) de 25 nm producen titulos de Ab de OVA a niveles similares a los de OVA con LPS. Las nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC terminadas en metoxi conjugadas con OVA de 25 nm y las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA de 100 nm (OH-OVA-100) producen titulos de Ab mas bajos. Las estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA de 25 nm (OH-OVA-25) producen titulos de Ab mas bajos en ratones C3-/-.

Descripcion detallada de formas de realizacion preferidas

Introduccion a la invencion

Se pueden usar nanoparticulas con propiedades adecuadas para dirigir especificamente sustancias terapeuticas a celulas presentadoras de antigenos (CPA), incluidas celulas dendriticas (CD), de los ganglios linfaticos. Los efectos del tamano de las nanoparticulas en la captacion por los vasos linfaticos, la retencion en los ganglios linfaticos y la internalizacion por CPA y CD de ganglios linfaticos se demuestran en el presente documento en respuesta a inyecciones intradermicas en ratones (que tienen capilares linfaticos de tamano similar a los de los humanos (10-80 pm) aunque estos son muy variables en ambas especies [20, 42]). Aunque se puede utilizar una diversidad de tamanos de nanoparticulas, las nanoparticulas de aproximadamente 20 nm de diametro son las que se captan con mayor facilidad y, ademas, se retienen en los ganglios linfaticos durante periodos de tiempo mas largos (de hasta 120 h) que lo que se ha informado anteriormente para otras particulas [31-34, 36]. Se ha demostrado, sorprendentemente, que determinadas sustancias quimicas de la superficie de las nanoparticulas activan el complemento. Dentro del ganglio linfatico, se ha demostrado que las nanoparticulas activadoras del complemento son internalizadas de forma eficaz por las CPA residentes (celulas MHCII+ que incluyen CD y algunos macrofagos) y otros macrofagos no presentadores de antigenos (MHCII-) sin un ligando de direccionamiento. Una gran fraccion (hasta el 50%) de las CD residentes de los ganglios linfaticos internalizo las nanoparticulas activadoras del complemento a 20 nm, y el numero aumento con el tiempo. Se encontro que la maduracion de CD tuvo lugar despues de la internalizacion de las nanoparticulas activadoras del complemento.

El tamano y la quimica de superficie son simultaneamente importantes: las nanoparticulas activadoras del complemento que no estan dimensionadas para penetrar en los vasos linfaticos con una eficacia determinada (por ejemplo, nanoparticulas de 100 nm estabilizadas con PLURONIC) no son un adyuvante tan potente como las nanoparticulas relativamente mas pequenas (por ejemplo, 25 nm) de la misma quimica, que tienen una mayor eficacia de penetracion. Las nanoparticulas no activadoras del complemento que estan dimensionadas para penetrar facilmente en los vasos linfaticos (por ejemplo, nanoparticulas de PPS de 25 nm estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi) no son un adyuvante tan potente como las nanoparticulas del mismo tamano de una quimica de superficie que activa el complemento (por ejemplo, nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC de 25 nm). La activacion del complemento desempena un papel clave en el mecanismo, como lo demuestra la deficiente respuesta inmunitaria en animales C3-/- a los que se inyecto nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC de 25 nm acopladas a antigeno. Las nanoparticulas hidroxiladas pequenas (por ejemplo, 20-45 nm) (por ejemplo, nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC) ofrecen una estrategia para administrar agentes inmunoterapeuticos a las CD y otras CPA de los ganglios linfaticos.

Se pueden utilizar determinadas quimicas de superficie para activar las CPA, incluidas las CD, y despues inducir respuestas inmunitarias adaptativas dependientes de celulas T. Algunas superficies de material pueden activar la cascada del complemento, incluidas superficies hidroxiladas [117] o superficies hidroxiladas obtenidas mediante estabilizacion con PLURONIC [118]. Las superficies de los materiales pueden conjugarse con determinadas moleculas y biomoleculas hidroxiladas para activar el complemento. Por ejemplo, los expertos pueden aplicar las tecnicas expuestas en el presente documento para realizar la conjugacion. Ademas, los implantes, dispositivos medicos u otros vehiculos, ademas de las nanoparticulas, pueden recibir una capa de polimero activador del complemento tal como se describe en el presente documento, o los polimeros o los hidroxilos pueden introducirse directamente en dichos materiales. En el desarrollo de adyuvantes, el enfoque convencional utilizado por los cientificos para activar celulas, tales como CD mediante activadores de los receptores tipo Toll, tales como lipopolisacarido (LPS). [119-121]. Pero se ha descubierto que' determinadas quimicas de superficie de las nanoparticulas pueden activar un aspecto diferente de inmunidad innata, a saber, la cascada del complemento: los ejemplos detallados en el presente documento demuestran que las nanoparticulas hidroxiladas, tales como las obtenidas mediante estabilizacion con PLURONIC, pueden activar el complemento, y que este a su vez puede activar CPA, incluidas CD, e inducir inmunidad humoral y celular dependiente de celulas T. En otro trabajo sobre nanoparticulas como adyuvantes, que no emplea un mecanismo de complemento, el tamano de las nanoparticulas polimericas determino la medida a la que alcanzaban CD y las activaban: con nanoparticulas de poliestireno carboxilado, las nanoparticulas de tamano intermedio (45 nm) son absorbidas por CD y estas se activan, pero unas mas pequenas (20 nm) no [116]. Sin embargo, con las nanoparticulas descritas en el presente documento, el complemento puede activarse y esto proporciona una potente senal para la activacion de las CD y la induccion de aspectos humorales y celulares dependientes de las celulas T de la respuesta inmunitaria adaptativa.

Se sabe que la activacion del complemento potencia la respuesta inmunitaria adaptativa, especificamente la inmunidad de celulas B. Trabajos anteriores han demostrado que las proteinas del complemento C3b y C3d pueden utilizarse como un adyuvante molecular para mejorar la inmunidad humoral dependiente de celulas B. La inmunizacion de ratones con una fusion de C3b o C3d para modelar antigenos muestra un aumento significativo en la respuesta de celulas B inmunitarias adquirida en comparacion con el antigeno libre solo [134, 135]. El mecanismo con el que actuan los adyuvantes C3b y C3d puede ser a traves de la union directa del receptor C3d (CD21/35) que se asocia con CD19, un amplificador de la activacion de celulas B conocido. Sin embargo, se ha encontrado que CD21/35 no siempre es necesario para esta respuesta de celulas B [136]. Una certeza de las fusiones C3b- y C3dantigeno es que su capacidad adyuvante para la inmunidad humoral es a traves de la interaccion directa con las celulas B [137]. Esto es diferente a la inmunidad humoral dependiente de celulas T, que se produce cuando el antigeno es absorbido por las CD tal como se ensena en el presente documento, las CD maduran, las CD se procesan y presentan antigeno a traves de MHC II a las celulas T CD4, las celulas T CD4 presentan antigeno a las celulas B, y finalmente las celulas B producen anticuerpos. Aunque se ha descubierto que el complemento esta implicado en la inmunidad dependiente de celulas T, los mecanismos por los que tiene lugar esto no se han descrito [138]. Ademas, no se ha sugerido previamente que la activacion del complemento pueda usarse como un adyuvante molecular para la inmunidad dependiente de celulas T.

Los sistemas descritos en el presente documento, sin embargo, describen como puede utilizarse la activacion del complemento como un adyuvante molecular para la inmunidad dependiente de celulas T. Ademas, algunas formas de realizacion incluyen nanoparticulas que activan el complemento a traves de quimicas de superficie de nanoparticulas. Especificamente, por ejemplo, los resultados muestran que las nanoparticulas de PPS activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC de 25 nm inducen la maduracion de CD y muestran por primera vez que la activacion del complemento a traves de superficies hidroxiladas puede utilizarse como una senal de peligro para inducir la maduracion de CD. Tambien, tal como se describe en el presente documento, por primera vez se utiliza la activacion del complemento por medio de nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC como adyuvante para la induccion de la inmunidad humoral y celular dependiente de celulas T mediada por CD.

Direccionamiento al sistema inmunologico

Las celulas presentadoras de antigenos (CPA) son celulas fagociticas muy eficaces que utilizan MHC de clase I, II y otras moleculas coestimuladoras (es decir, CD86 y CD80) para estimular las celulas T virgenes e inducir inmunidad mediada por celulas. Las CPA, que incluyen algunos macrofagos y las celulas dendriticas (CD) mas potentes, estan presentes en los tejidos perifericos en los que actuan como centinelas que, despues de la internalizacion y el procesamiento de antigenos extranos, experimentan subsiguientemente una maduracion y una migracion a los ganglios linfaticos con el fin de presentar antigenos a las celulas T [1-3]. Con los papeles criticos que desempenan las CPA y las CD en la inmunidad adaptativa, se estan realizando varios experimentos para dirigir a estas celulas agentes inmunomoduladores, tales como ADN, proteinas y polipeptidos [4-14]. Polipeptido es un termino que se refiere a dos o mas aminoacidos unidos conjuntamente, e incluye proteinas.

Los sistemas de administracion basados en polimeros y en liposomas se han centrado principalmente en el suministro de proteinas y ADN a CD perifericas, que en primer lugar internalizan los vehiculos farmacologicos y luego migran a los ganglios linfaticos dentro de un periodo de ~1-2 dias para activar las celulas T [9, 12, 13]. Hasta hace poco, no estaba claro si las CD inmaduras, capaces de absorber antigenos, estaban presentes en los ganglios linfaticos. No obstante, estudios recientes han establecido que una fraccion sustancial de las CD residentes de los ganglios linfaticos son fenotipicamente inmaduras y capaces de internalizar antigenos y particulas en los mismos [15, 16]. Por lo tanto, tal como se explica en el presente documento, las CPA residentes de los ganglios linfaticos tambien pueden utilizarse como dianas para farmacos inmunoterapeuticos u otros agentes terapeuticos. Un beneficio potencial de dirigirse a las CPA o las CD de los ganglios linfaticos en lugar de a las de los sitios perifericos es que la presentacion prematura del antigeno (es decir, una CD migratoria que expresa el antigeno en su superficie antes de alcanzar un ganglio linfatico) a menudo puede conducir a tolerancia en las celulas inmunitarias [13, 17, 18]; por lo tanto, el suministro a las CPA de los ganglios linfaticos podria evitar este problema. Ademas, otros estudios de direccionamiento de las CD utilizan ligandos de direccionamiento conjugados como anti-Dec-205 y anti-CD11c para aumentar la especificidad de las CD [4, 5, 8, 9, 12, 19].

Sin embargo, lo que no se ha apreciado convencionalmente es que se puede explotar eficazmente el hecho de que las CD son por naturaleza muy fagociticas y estan presentes en los ganglios linfaticos en concentraciones elevadas. En consecuencia, se han desarrollado materiales y procedimientos para dirigirse especificamente a estas celulas en los ganglios linfaticos, tal como se explica en el presente documento, incluyendo el direccionamiento sin el uso de un ligando de direccionamiento. Un ligando de direccionamiento se refiere a un grupo quimico que se une especificamente a un grupo quimico particular presente en una celula, por ejemplo, un receptor de superficie celular o una proteina de superficie celular. Por lo tanto, algunas formas de realizacion pueden dirigirse basandose en el tamano y en otras propiedades fisicas y se dirigen sin polipeptido exogeno, sin ligando exogeno, sin acido nucleico exogeno, sin anticuerpo o fragmento del mismo, o sin ligando exogeno para cualquiera de: un receptor, una molecula de superficie celular, una molecula de matriz extracelular, un antigeno de superficie celular, una molecula marcadora de celulas o un polisacarido.

Con el fin de dirigirse a las CPA, incluidas las CD, presentes en los ganglios linfaticos, es util, tal como se demuestra en el presente documento, disenar vehiculos de administracion que puedan ser captados facilmente por los vasos linfaticos y retenidos en ganglios linfaticos drenantes. Un vehiculo de administracion se refiere a un agente, por ejemplo, una particula que suministra un agente terapeutico, por ejemplo, un antigeno o un farmaco inmunosupresor. Un papel primordial del sistema linfatico es la captacion de liquido y particulas del espacio intersticial como un componente pequeno pero importante de la microcirculacion [20-23].

Otros estudios experimentales in vivo de direccionamiento linfatico que utilizan liposomas y particulas polimericas para investigar el sistema linfatico han indicado que el tamano de particula puede ser un factor para la captacion por los vasos linfaticos desde el espacio intersticial [21, 24-29]. Los liposomas mayores de 170 nm mostraron, en general, una captacion deficiente por los vasos linfaticos y permanecieron en el sitio de la inyeccion, mientras que las particulas en el intervalo de 40-70 nm mostraron una captacion significativa por parte de los vasos linfaticos [25].

Un estudio de este tipo que utiliza particulas de poliestireno carboxilado ensena que las particulas solo son utiles en la practica en el intervalo estrecho de 40-50 nm, porque este tamano es una senal de peligro reconocida por las CD; en consecuencia, las CD se activan en sitios dermicos y no en los ganglios linfaticos [116]. Este estudio de perlas de poliestireno mostro que las perlas se acumulan en los ganglios linfaticos en tamanos intermedios (40 nm) mas que en tamanos mas pequenos (20 nm) y mas grandes (> 100 nm) y ensenaron que 40-50 nm era el tamano que se deberia utilizar para las perlas. Mas especificamente, este estudio mostro que se encontro que particulas muy pequenas (20 nm) y particulas mas grandes (100 nm) se acumulaban significativamente menos que particulas de 40 nm en celulas que fueron positivas para marcadores de CD, tal como se indica por el antigeno de CD DEC205 [116]. Los autores ensenan que las perlas de poliestireno de 40 nm causan la activacion y la migracion de CD presentes en sitios dermicos a los ganglios linfaticos; por lo tanto, las perlas de 40 nm no podrian dirigirse a las CD residentes de los ganglios linfaticos.

Ademas, el estudio de perlas de poliestireno ensena que el tamano de las perlas es una senal de peligro para las CD porque las CD han evolucionado para reconocer los intervalos del tamano virico. El tamano de las perlas, por lo tanto, controlaria con exito el direccionamiento a CD, reconociendose el tamano correcto de las perlas por las CD en la periferia y causando la activacion de las CD. Esta ensenanza se encuentra en marcada contraposicion con el uso exitoso de nanoparticulas mas pequenas para la activacion de CD (menos de aproximadamente 40 o aproximadamente 35 o aproximadamente 25 nm) tal como se describe en el presente documento. Esta ensenanza tambien se encuentra en contraposicion con los resultados que se muestran en el presente documento de que la quimica de superficie es una senal de peligro, por ejemplo, como en las nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC que utilizan la quimica de superficie de hidroxilo para activar el complemento como una senal de peligro. Ademas, los resultados presentados en el presente documento relacionan el tamano de particula con la capacidad de direccionamiento a los ganglios linfaticos y no con el reconocimiento del tamano por CD. Por ejemplo, las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC de 25 nm fueron mejores que las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC de 100 nm en la activacion de CD y la inmunidad adaptativa de celulas T despues de la inyeccion in vivo.

Las perlas de poliestireno carboxilado se utilizaron como un sistema de modelo experimental, al menos en parte, debido a que sus caracteristicas de sintesis y de polimerizacion en emulsion convenientes dan lugar a una distribucion de tamano estrecha y controlable [116]. Las desventajas potenciales de su uso como un sistema terapeutico o profilactico estan asociadas con las perlas de poliestireno. Por ejemplo, no existe una ruta biologica por la que dichas particulas puedan degradarse y eliminarse del cuerpo. Por el contrario, un sistema biodegradable tal como se describe en el presente documento se degradara facilmente y eficazmente dando un polimero soluble en respuesta a un entorno in vivo, por ejemplo, tal como en nanoparticulas de PPS que se degradan en las condiciones oxidativas que se encuentran despues de la endocitosis y el procesamiento. Aunque la degradacion de las nanoparticulas puede ser beneficiosa, no es necesariamente un requisito para su uso como adyuvante.

Las interacciones entre la superficie de la particula y el intersticio pueden ser otro factor que desempena un papel en la captacion por los vasos linfaticos [30]. La estabilizacion esterica mediante el recubrimiento de liposomas y particulas con capas hidrofilas tales como poli(etilenglicol) (PEG) y sus copolimeros tales como PLURONICS (incluidos copolimeros de poli(etilenglicol)-bl-poli(propilenglicol)-bl-poli(etilenglicol)) puede reducir las interacciones no especificas con proteinas del intersticio, tal como se demuestra mediante la mejora de la captacion por los vasos linfaticos despues de inyecciones subcutaneas [21, 27, 31-35]. Todos estos hechos apuntan a la importancia de las propiedades fisicas de las particulas en terminos de captacion por los vasos linfaticos.

Sin embargo, mientras que las particulas mas pequenas se captan mas facilmente, tambien se escapan mas facilmente del ganglio linfatico; por lo tanto, lograr tanto una captacion por los vasos linfaticos como una retencion en los ganglios linfaticos eficaces es significativo. En consecuencia, determinadas formas de realizacion de nanoparticulas tienen caracteristicas que abordan tanto la captacion como la retencion, tal como se evidencia a partir de los ejemplos y formas de realizacion expuestas en el presente documento. Con respecto al tamano de las nanoparticulas, por ejemplo, las investigaciones del sistema linfatico indicaron que solo el 1-2% de los liposomas de 70 nm inyectados se retienen en los ganglios linfaticos posteriormente a las 12 h despues de la inyeccion [30], y que la retencion en los ganglios de liposomas grandes (> 70 nm) es mas eficaz que de liposomas mas pequenos [24, 29]. Esto aparentemente se debe en parte al hecho de que los macrofagos de los ganglios linfaticos fagocitan particulas mas grandes de manera mas eficaz. Aunque se asume convencionalmente que el recubrimiento de liposomas con protectores estericos tales como PEG deberia reducir la fagocitosis por macrofagos, se ha demostrado que dicho recubrimiento no afecta significativamente a la retencion en los ganglios linfaticos [36]. Tambien se ha asumido convencionalmente que la fagocitacion de particulas en los ganglios linfaticos se realiza principalmente por macrofagos [21, 27, 29, 30, 32, 36, 37]. Con nanoparticulas de poliestireno carboxilado, se encontro que las nanoparticulas de 20 nm se absorbian mucho menos por las CD que las nanoparticulas de 40 nm in vivo [116]. Por lo tanto, ademas de administrar medicamentos para su absorcion por macrofagos, es ventajoso administrar medicamentos a los ganglios linfaticos para su absorcion por otras CPA, incluidas las CD. Tal como se muestra a continuacion, determinadas formas de realizacion de las particulas de la presente invencion son, de hecho, absorbidas por CPA y/o CD incluso en tamanos pequenos al menos tan reducidos como 20 nm.

Estudios previos han sugerido que despues de la absorcion de antigenos, son necesarias "senales de peligro" biologicas potentes tales como citoquinas inflamatorias (es decir, el ligando CD40) para madurar las CD y subsiguientemente inducir inmunidad mediada por celulas [5, 12, 38]. Sin embargo, puede ser ventajoso renunciar a dichas senales. De hecho, en algunas formas de realizacion, son las propias nanoparticulas que se usan como un estimulo de maduracion las que evitan el uso de "senales de peligro" biologicas convencionales, por ejemplo, algunos polipeptidos, anticuerpos, secuencias de acidos nucleicos. Estos resultados se evidencian en la respuesta de maduracion de las CD que se observo despues de la internalizacion de las nanoparticulas in vivo.

Formulaciones de nanoparticulas

Tal como se documenta en el presente documento, el tamano esta relacionado con la absorcion y la retencion de nanoparticulas en los ganglios linfaticos. La captacion por los vasos linfaticos, la retencion en los ganglios linfaticos y la ubicacion dentro de los ganglios linfaticos y entre las poblaciones de celulas de nanoparticulas estan documentadas en el presente documento. Un desafio que emplea los enfoques convencionales consiste en obtener tanto una captacion por los vasos linfaticos como una retencion en los ganglios linfaticos eficaces, dado que las propiedades de las nanoparticulas, tales como el tamano y las caracteristicas de superficie, pueden tener efectos conflictivos. En general, las particulas mas pequenas presentan una mejor captacion por los vasos linfaticos que las particulas mas grandes, pero una menor retencion en los ganglios linfaticos. Se divulgan nanoparticulas con un tamano de 5 nm a 100 nm de diametro; los expertos apreciaran de inmediato que se contemplan todos los intervalos y valores dentro de los intervalos indicados explicitamente, por ejemplo, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 nm. Se divulga que las nanoparticulas se pueden producir en una coleccion de particulas que tenga un diametro medio de 5 a 100 nm; los expertos apreciaran de inmediato que se contemplan todos los intervalos y valores dentro de los intervalos indicados explicitamente, por ejemplo, de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 nm. Segun la invencion, la coleccion tiene un diametro medio de particula de 20 nm a 70 nm. La distribucion de tamano de dicha coleccion de particulas puede controlarse de forma que un coeficiente de variacion (desviacion estandar dividida por el tamano de particula promedio) alrededor de un diametro medio de una coleccion de particulas puede ser inferior a aproximadamente 50, aproximadamente 35, aproximadamente 20, aproximadamente 10, o aproximadamente 5 nm. [39]; los expertos apreciaran de inmediato que se contemplan todos los intervalos y valores dentro de los intervalos indicados explicitamente.

Las propiedades fisicas tambien estan relacionadas con la utilidad de una nanoparticula despues de su captacion y su retencion en los ganglios linfaticos. Estas incluyen propiedades mecanicas tales como rigidez o gomosidad. Segun la invencion, las formas de realizacion se basan en un nucleo gomoso, por ejemplo, un nucleo de poli(sulfuro de propileno) (PPS) con una capa superpuesta, por ejemplo, una capa superpuesta hidrofila, tal como PEG, tal como en el sistema PPS-PEG recientemente desarrollado y caracterizado para la administracion sistemica (pero no dirigida o inmunitaria) [39, 40]. El nucleo gomoso se encuentra en contraposicion con un nucleo sustancialmente rigido tal como en un sistema de nanoparticulas de poliestireno o metalicas. El termino gomoso se refiere a determinados materiales resilientes ademas de cauchos naturales o sinteticos, siendo gomoso un termino familiar para los expertos en las tecnicas de polimeros. Por ejemplo, se puede utilizar PPS reticulado para formar un nucleo gomoso hidrofobo. El PPS es un polimero que se degrada en condiciones oxidativas en polisulfoxido y finalmente en polisulfona [41], pasando de esta forma de un caucho hidrofobo a un polimero hidrofilo soluble en agua [39]. Otros polimeros de sulfuro se pueden adaptar para su uso, refiriendose la expresion polimero de sulfuro a un polimero con un azufre en el esqueleto polimerico. Otros polimeros gomosos que pueden utilizarse son poliesteres con una temperatura de transicion vitrea en condiciones hidratadas que es inferior a aproximadamente 37 °C. Segun la invencion, se utiliza un nucleo hidrofobo con una capa superpuesta hidrofila, ya que el nucleo y la capa superpuesta tienden a no mezclarse, de tal forma que la capa superpuesta tiende a expandirse estericamente mas alla del nucleo. Un nucleo se refiere a una particula que tiene una capa sobre la misma. Una capa se refiere a un material que cubre al menos una porcion del nucleo. Una capa puede estar adsorbida o unida covalentemente. Una particula o un nucleo puede ser solido o hueco. Los nucleos hidrofobos gomosos son mas ventajosos frente a los nucleos hidrofobos rfgidos, tales como nucleos cristalinos o vftreos (como en el caso del poliestireno), ya que las partfculas pueden transportar cargas mas altas de farmacos hidrofobos con los nucleos gomosos hidrofobos.

Otra propiedad ffsica es la hidrofilicidad de la superficie. Un material hidrofilo tiene una solubilidad en agua de al menos 1 gramo por litro cuando no esta reticulado. La estabilizacion esterica de partfculas con polfmeros hidrofilos puede mejorar la captacion desde el intersticio reduciendo interacciones no especfficas; no obstante, la naturaleza encubierta aumentada de las partfculas tambien puede reducir la internalizacion por parte de celulas fagocfticas en los ganglios linfaticos. Sin embargo, el desaffo de equilibrar estas caracterfsticas contrapuestas se ha cumplido, y la presente solicitud documenta la creacion de nanopartfculas para su suministro eficaz mediante los vasos linfaticos a las CD y otras CPA de los ganglios linfaticos. Por lo tanto, algunas formas de realizacion incluyen un componente hidrofilo, por ejemplo, una capa de material hidrofilo. La invencion divulga que los ejemplos de materiales hidrofilos adecuados son uno o mas de entre poli(oxidos de alquileno), poli(oxidos de etileno), polisacaridos, poli(acidos acrflicos) y polieteres segun la invencion. El peso molecular de los polfmeros en una capa puede ajustarse para proporcionar un grado util de impedimento esterico in vivo, por ejemplo, de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 100.000 o incluso superior; los expertos apreciaran de inmediato que se contemplan todos los intervalos y valores dentro de los intervalos indicados explfcitamente, por ejemplo, entre 10.000 y 50.000. Los ejemplos incluyen una partfcula con una superficie hidrofila que es un PEG derivado de un PLURONIC que se utilizo como estabilizante durante la sfntesis como una emulsion.

Las nanopartfculas pueden incorporar grupos funcionales para una reaccion adicional. Los grupos funcionales para la reaccion adicional incluyen electrofilos o nucleofilos; estos son convenientes para hacerlos reaccionar con otras moleculas. Ejemplos de nucleofilos son aminas primarias, tioles e hidroxilos. Ejemplos de electrofilos son esteres de succinimidilo, aldehfdos, isocianatos y maleimidas. Por ejemplo, utilizando nanopartfculas de PPS-PLURONIC, por ejemplo, las partfculas se sintetizan tal como se describe en el ejemplo 1 con la diferencia de que el 2% del PL^u R^o NIC esta reemplaza por PLURONIC derivado de OVA/OVA257-264/oVA323-33g. Se utiliza una cantidad total del 1,5% de PLURONIC. El tiempo de reaccion se reduce a 2 h y la base se anade en una relacion equimolar de 1:1 a tioles iniciadores para reducir la exposicion de la protefna o los peptidos a condiciones basicas durante la sfntesis de nanopartfculas. Este esquema es solo un procedimiento ejemplar para la funcionalizacion de PEG; se pueden utilizar otros diversos enfoques dependiendo de la protefna o el peptido que se esta conjugando [111].

Las nanopartfculas tambien pueden incorporar grupos funcionales o motivos para la activacion del complemento. Un grupo funcional preferido es hidroxilo, que es particularmente eficaz para la activacion del complemento tal como se documenta en el presente documento. Otros grupos funcionales que son nucleofilos pueden reaccionar con el tioester en C3. Se demuestra en el presente documento que las superficies de nanopartfculas hidroxiladas son particularmente utiles en el direccionamiento a CPA, incluidas CD, del ganglio linfatico. En el caso de las nanopartfculas de PPS de los ejemplos expuestos en el presente documento, la hidroxilacion se obtuvo mediante estabilizacion con PLURONIC terminado en grupos hidroxilo. Cuando estos grupos hidroxilo se convirtieron en grupos metoxi para bloquear el grupo hidroxilo, las nanopartfculas no funcionaron bien como adyuvantes. Cuando las nanopartfculas hidroxiladas se sometieron a ensayo en ratones C3-/-, su efecto adyuvante disminuyo enormemente. Estos resultados, combinados con mediciones descritas en los ejemplos de la activacion de C3 expuestos en el presente documento, demuestran la utilidad particular de dirigirse a las CPA, incluidas las CD, con nanopartfculas activadoras del complemento. Por consiguiente, en algunas formas de realizacion, las nanopartfculas dependen solo del OH para activar el complemento y se excluyen uno o mas de: cationes a pH 7,0-7,4, aminas, aminas primarias, aminas secundarias, aniones a pH 7,0-7,4, tioles, iones dipolares a pH 7,0- 7,4; alternativamente, dichos grupos estan presentes en la nanopartfcula, pero es una capa de polfmero en la nanopartfcula la que excluye uno o mas de dichos grupos. Alternativamente, la nanopartfcula y/o la capa no poseen ningun grupo capaz de formar un ion a un pH de 7,0 a 7,4, excepto OH.

Se pueden ubicar grupos funcionales en la partfcula segun sea necesario para su disponibilidad. Una ubicacion puede ser como grupos laterales o terminales en el polfmero central o polfmeros que son capas sobre un nucleo o polfmeros unidos a la partfcula de otra forma. Segun la invencion, se incluyen ejemplos en el presente documento que describen que el PEG estabiliza las nanopartfculas que se pueden funcionalizar facilmente para un direccionamiento celular especffico o la administracion de farmacos de protefnas y peptidos.

Se pueden utilizar polfmeros biodegradables para producir todos o algunos de los polfmeros y/o partfculas y/o capas. Biodegradable se refiere a polfmeros que estan sujetos a degradacion por hidrolisis espontanea, ataque qufmico mediante enzimas que escinden secuencias especfficas de aminoacidos o mediante la incorporacion de grupos funcionales que son sensibles a la oxidacion. Los polfmeros sujetos a hidrolisis espontanea se degradaran in vitro en solucion acuosa mantenida a un pH de 7,0 a 7,4 como resultado de grupos funcionales que reaccionan con el agua en la solucion. El termino "degradacion", tal como se usa en el presente documento, se refiere a volverse soluble, ya sea por reduccion del peso molecular (como en el caso de un poliester) o por conversion de grupos hidrofobos en grupos hidrofilos (como en el caso de PPS). Los polfmeros con grupos ester estan generalmente sujetos a hidrolisis espontanea, por ejemplo, polilactidas y poliglicolidos. Se conocen muchas secuencias peptfdicas sujetas a ataque enzimatico especffico, por ejemplo, tal como degradadas por colagenasas o metaloproteinasas: las secuencias que se degradan meramente por mecanismos de radicales libres biologicos no se degradan

g

especificamente. Los polimeros con grupos funcionales que son sensibles a la oxidacion se alteraran quimicamente por medio de agentes oxidantes suaves, siendo un ensayo para los mismos la solubilizacion mejorada por exposicion a peroxido de hidrogeno al 10% durante 20 h in vitro, Por ejemplo, el PPS es un polimero sensible a la oxidacion [39].

Aunque se utilizaron particulas de PPS como un sistema ejemplar para demostrar como fabricar y utilizar las nanoparticulas, se pueden utilizar materiales alternativos. En general, las caracteristicas para cada componente del sistema de particulas pueden mezclarse y combinarse libremente segun venga guiado por la necesidad de producir una particula funcional. Por ejemplo, pueden utilizarse otras particulas que son pequenas (por ejemplo, inferiores a aproximadamente 100 nm o inferiores a aproximadamente 70 nm) y, por lo tanto, penetran en la circulacion linfatica de forma eficaz. Dichas particulas pueden injertarse opcionalmente con una capa superpuesta de PEG, o incorporar de otra forma a las mismas un polimero hidrofilo, y opcionalmente pueden injertarse con un antigeno, senales de peligro, o ambos. Por ejemplo, un copolimero de bloque que contiene PEG se puede adsorber en una nanoparticula polimerica degradable de tamano apropiado, y el antigeno se puede unir posteriormente a la superficie de dicho polimero tratado. Como otro ejemplo, un copolimero de bloque que contiene PEG puede adsorberse en una nanoparticula inorganica de tamano apropiado, y el antigeno puede unirse posteriormente a la superficie de dicho polimero tratado. Si bien la degradacion del nucleo de las nanoparticulas puede ser deseable, no es estrictamente necesaria.

Los sistemas micelares tambien pueden presentar las mismas caracteristicas utiles que se han descrito anteriormente, incluidas las micelas formadas a partir de copolimeros de bloques AB y ABA de poli(etilenglicol) y PPS [100-104]. Cuando dichos copolimeros se forman con una fraccion molecular de poli(etilenglicol) que es relativamente elevada, por ejemplo, con un exceso de aproximadamente el 40%, se puede esperar que se formen micelas esfericas en determinadas condiciones. Estas micelas pueden ser pequenas, cumpliendo, por ejemplo, con el tamano mencionado anteriormente para su incorporacion a los vasos linfaticos, y pueden estar injertadas opcionalmente con una capa superior de PEG, o incorporar de otra forma PEG u otros polimeros para lograr propiedades similares. Ademas, pueden conjugarse con un antigeno, tal como se ensena en el presente documento, senales de peligro, o ambos, en la superficie de la micela. El copolimero de bloque puede terminar en un grupo hidroxilo, para la activacion del complemento, y es particularmente beneficioso que el bloque hidrofilo termine en un grupo hidroxilo, de forma que este grupo hidroxilo este mas facilmente disponible en la superficie de la nanoparticula micelar para su union al complemento. Dichas superficies hidroxiladas de esta forma pueden disenarse para que activen eficazmente el complemento. Un bloque hidrofilo particularmente util es PEG, terminado en un grupo hidroxilo. Ademas de las arquitecturas de polimeros formadores de micelas, se pueden seleccionar tamanos de bloque y relaciones de tamano de bloque para formar estructuras vesiculares. Tambien existe una serie de otras posibles composiciones quimicas de formulaciones micelares que pueden usarse [105-108].

Algunos sistemas de polimeros estan en si mismos nanoparticulados y estan incluidos en el termino nanoparticulas. Por ejemplo, los dendrimeros son una clase de polimeros que pueden estar nanoparticulados en el rango de 10 nm [141]. Estos polimeros comprenden un gran numero de grupos funcionales en su superficie, por ejemplo, que se han utilizado para conjugarse a biomoleculas y otros grupos [142, 143]. Analogamente, el antigeno podria conjugarse con la superficie de un dendrimero. Ademas, los grupos funcionales presentes en la superficie del dendrimero podrian optimizarse para la activacion del complemento, por ejemplo, mediante hidroxilacion. Se ha demostrado que algunos complejos de dendrimero-ADN activan el complemento [144, 145]. Por lo tanto, los dendrimeros representan una interesante quimica nanoparticulada que podria adaptarse para el direccionamiento a los vasos linfaticos utilizando las tecnicas descritas en el presente documento, para la conjugacion de antigenos y para la activacion del complemento, por ejemplo, tal como en las publicaciones de patente de Estados Unidos N° 2004/0086479, 2006/0204443 y en las patentes de Estados Unidos N26.455.071 y 6.998.115.

Por otra parte, los dendrimeros tienen una forma que es muy dependiente de la solubilidad de sus polimeros componentes en un entorno determinado, y pueden cambiar drasticamente segun el disolvente o los solutos que lo rodean, por ejemplo, cambios en la temperatura, pH, contenido de iones o despues de la absorcion por una CD. Por el contrario, las nanoparticulas que tienen dimensiones fisicas que son relativamente mas estables que los dendrimeros u otros sistemas de polimeros apenas ramificados pueden ser utiles para propositos de almacenamiento o con respecto a su actividad biologica, por ejemplo, un nucleo solido con una corona hidrofila presentara sistematicamente la corona a su entorno. Por consiguiente, algunas formas de realizacion de nanoparticulas se basan en particulas que no son dendrimeros, o que tienen un nucleo que es un solido y/o tienen un nucleo que es un hidrogel reticulado. Una nanoparticula basada en PPS no es un dendrimero y tiene un nucleo solido.

Inmunoterapia con nanoparticulas

En uso, dichas nanoparticulas son utiles como, por ejemplo, vehiculos de administracion de antigeno y farmaco para su direccionamiento a las CPA, especificamente las CD, de los ganglios linfaticos. La capacidad de suministrar antigenos y/o medicamentos y/o senales de peligro a las CD de los ganglios linfaticos es un enfoque util para inmunoterapia. La capacidad de dirigirse a las CD y otras CPA de los ganglios linfaticos de forma eficaz con nanoparticulas proporciona un procedimiento para la administracion de proteinas y polipeptidos antigenicos y acidos nucleicos que codifican antigenos. Dado que las CD estan involucradas de forma critica en el inicio de la inmunidad mediada por celulas mediante la presentacion de antigenos a las celulas T, este enfoque de administracion puede utilizarse para diversas aplicaciones de vacunas y de inmunoterapia. Ademas, las nanoparticulas son utiles como herramientas de diagnostico (por ejemplo, toma de imagenes), herramientas de investigacion (por ejemplo, tal como se comercializan en los catalogos ALDRICH o para visualizacion utilizando microscopios), o para la administracion o la visualizacion de farmacos in vitro (por ejemplo, absorcion por CPA y/o CD y/o macrofagos in vitro de farmacos o agentes de imagen).

El antigeno y/o los medicamentos y/o las senales de peligro pueden unirse covalentemente a las particulas, adsorberse en las particulas, cargarse en las particulas o mezclarse con una coleccion de particulas para su introduccion contemporanea en un paciente. Los motivos para la union covalente se explican en otra parte del presente documento, y tambien se pueden aplicar en este caso. La adsorcion se puede lograr mezclando el agente y las particulas durante un periodo de tiempo predeterminado y despues separando fisicamente las particulas de la mezcla, por ejemplo, mediante centrifugacion o filtracion. La separacion puede tener lugar antes o despues de la administracion, in vitro o en el cuerpo, por ejemplo, inyectando la mezcla y permitiendo que las fuerzas de difusion y de conveccion separen los componentes. La carga se puede realizar durante o despues de la sintesis de particulas. Por ejemplo, las particulas pueden polimerizarse en presencia del agente, que quedara atrapado, ya sea por adsorcion o por separacion de fases tal como en una polimerizacion basada en micelas. La carga despues de la sintesis puede realizarse segun sea necesario, por ejemplo, exponiendo las particulas a un agente en un primer disolvente que hincha las particulas o permite una facil difusion del agente y despues exponiendo las particulas a un segundo disolvente que contrae las particulas o las restaura a una solucion acuosa que detiene o retarda la difusion del agente, por ejemplo: cargando un medicamento hidrofobo en un disolvente organico y almacenando las particulas en una solucion acuosa. El mezclado para la introduccion concomitante se puede realizar, por ejemplo, introduciendo las particulas en una jeringa que tiene una solucion de antigeno y/o farmacos y/o senales de peligro e inyectandolas conjuntamente en un paciente.

Inmunoterapia con nanoparticulas y farmacos inmunosupresores

La inmunosupresion es una forma critica de inmunoterapia que es muy necesaria en situaciones de trasplante clinico (por ejemplo, aloinjertos) y enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, esclerosis multiple). El uso de farmacos inmunosupresores tales como corticosteroides (por ejemplo, ciclosporina A) y rapamicina ha dado lugar a grandes avances en el tratamiento de estos trastornos inmunitarios [122]. En general, se considera que las celulas T son dianas importantes de los farmacos inmunosupresores, que actuan inhibiendo los genes de las citocinas inflamatorias, principalmente IL-2 y TNF- ^y , y por lo tanto reducen la proliferacion de celulas T. Otro enfoque de inmunosupresion que se esta desarrollando es el uso de anticuerpos para bloquear los receptores de celulas T CD28 y CD40 [123]. El bloqueo de estos receptores produce una activacion insuficiente por medio de moleculas coestimuladoras ubicadas en las CD y, por lo tanto, causa un efecto de tolerancia que aborta de forma eficaz la proliferacion de celulas T. Sin embargo, el tratamiento con corticosteroides o anticuerpos bloqueadores es muy inespecifico y puede provocar efectos secundarios tales como la reduccion de la capacidad del sistema inmunitario para combatir otras infecciones. Por lo tanto, una estrategia para una inmunosupresion mas especifica, una que induzca una tolerancia especifica al antigeno, seria un avance excepcional en inmunoterapia.

Recientemente se ha descubierto que las CD pueden ser una diana para inmunosupresion; Ademas de su capacidad para estimular la inmunidad de las celulas T, las CD tambien son capaces de regular la tolerancia de las celulas T [124]. La dexametasona (Dex) es un glucocorticoide sintetico utilizado para la inmunosupresion en aplicaciones tales como la prevencion del rechazo de trasplantes de aloinjerto. Tradicionalmente, se ha pensado que los glucocorticoides actuan unicamente sobre las celulas T. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la Dex puede actuar sobre las CD para regular a la baja la expresion de las moleculas coestimuladoras y la secrecion de citoquinas inflamatorias [125,126]. Esto tiene implicaciones sustanciales para el potencial de utilizar CD para la induccion de tolerancia. Una CD que presenta antigeno a las celulas T en ausencia de moleculas coestimuladoras inducira anergia en celulas T o tolerancia al antigeno presentado.

Se pueden administrar farmacos inmunosupresores con las nanoparticulas. En algunas formas de realizacion, el antigeno puede dirigirse eficazmente a las CD de los ganglios linfaticos en virtud de su tamano y su interaccion con flujos intersticiales y su introduccion en los vasos linfaticos. La administracion de un antigeno y al mismo tiempo que los inmunosupresores para prevenir la activacion de CD conduciria a tolerancia. En dichos casos, las nanoparticulas que no activan el complemento pueden ser beneficiosas. Algunos de los principales farmacos inmunosupresores son los glucocorticoides, que son hidrofobos y pueden cargarse en el nucleo de PPS hidrofobo de las nanoparticulas. Se ha demostrado que determinados glucocorticoides tales como dexametasona, tacrolimus y ciclosporina A inhiben la maduracion y la capacidad aloestimuladora de las CD al disminuir la expresion de moleculas coestimuladoras (es decir, CD80 y CD86) y la secrecion de citoquinas inflamatorias (es decir, lL-6) y TNF-a) [125-131].

En las nanoparticulas descritas en el presente documento pueden cargarse farmacos inmunosupresores e introducirse en un paciente. Las nanoparticulas pueden dirigirse especificamente al sistema linfatico y los ganglios linfaticos, y pueden estar especificamente dirigidas a su absorcion por CPA y/o CD. Pueden administrarse ventajosamente farmacos hidrofobos u otros agentes utilizando nanoparticulas con componentes o nucleos hidrofobos. Ademas, un antigeno puede administrarse en combinacion con un farmaco. El antigeno puede estar asociado con una nanoparticula, por ejemplo, mediante coinyeccion, adsorcion o enlace covalente.

Por ejemplo, una estrategia consiste en cargar farmacos inmunosupresores hidrofobos (por ejemplo, Dex) en el nucleo de nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi (por lo tanto no hidroxiladas y no activadoras de complemento) y antigeno de injerto en la superficie. Por lo tanto, al administrar Dex u otros farmacos inmunosupresores junto con el antigeno a las CD de los ganglios linfaticos, es posible regular a la baja las moleculas coestimulantes pero aun asi suministrar el antigeno y, a su vez, causar tolerancia especifica al antigeno. Por lo tanto, pueden utilizarse nanoparticulas, por ejemplo, nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi, con la combinacion de conjugacion de antigeno y carga de farmaco inmunosupresor, para inducir tolerancia para aplicaciones tales como tratamiento para enfermedades autoinmunitarias y rechazos de trasplantes.

Inmunoterapia con nanoparticulas y antigenos

Las CPA que internalizan antigenos proteicos pueden procesar y presentar el epitopo del peptido antigenico a traves de las rutas MHC-I y II. Un enfoque inmunoterapeutico implica la union covalentemente de uno o mas antigenos a una nanoparticula, o su asociacion a la misma de otra forma. Los antigenos son polipeptidos sin o con glicosilacion que pueden ser reconocidos por un sistema inmunologico, y generalmente tienen una longitud de al menos aproximadamente tres aminoacidos. Los antigenos tambien pueden codificarse por medio de secuencias de acido nucleico tales como ADN o ARN. Por ejemplo, el ADN puede codificar un antigeno si codifica un antigeno polipeptidico presente en patogenos. Despues del suministro del ADN a los nucleos de las CPA, se produciria la expresion del antigeno del polipeptido antigenico y su presentacion en MHC I. Se pueden utilizar proteinas completas, pero se pueden utilizar fragmentos antigenicos, de forma que se pueden utilizar polipeptidos que tengan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 20 residuos; los expertos apreciaran de inmediato que se contemplan todos los intervalos y valores dentro de los intervalos indicados explicitamente, por ejemplo, menos de aproximadamente 10 residuos. Dado que se pueden usar nanoparticulas que activan directamente el sistema del complemento sin involucrar un polipeptido, se pueden utilizar antigenos que no activan el sistema del complemento. Se pueden utilizar antigenos para inmunoterapia contra muchas enfermedades diferentes. Una aplicacion especifica es para inmunoterapia tumoral. Los antigenos utiles se presentan en celulas tumorales pero no en celulas sanas. Se han identificado diversos antigenos que son especificos de determinados tipos de tumores, tales como Caspasa-8, MAGE-1, Tirosinasa, HER-2/neu y MUC-1 [112]. Teniendo esto en cuenta, se pueden utilizar nanoparticulas para suministrar dichos antigenos a CD de los ganglios linfaticos como un medio para activar celulas T para atacar tumores. Otra aplicacion es la prevencion frente a enfermedades infecciosas. La exposicion a antigenos puede crear resistencia contra dichas enfermedades o actuar como una vacuna para diversas afecciones.

Inmunoterapia con nanoparticulas y acidos nucleicos

Algunas colecciones de nanoparticulas pueden incluir nanoparticulas y acidos nucleicos, por ejemplo, ADN o ARN, que codifican un antigeno. Ademas, estas tambien pueden incluir un casete de expresion, incluir un promotor o un potenciador, ser parte de un vector, o incorporar de otra forma motivos de entrega genica tal como se sabe en estas tecnicas; veanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 7.160.695, 7.157.089, 7.122.354, 7.052.694, 7.026.162, 6.869.935. Ademas, las secuencias pueden codificar otras biomoleculas terapeuticas. Los antigenos de acidos nucleicos tales como ADN se pueden unir a nanoparticulas (por ejemplo, la superficie de nanoparticulas de PPS estabilizadas con Pluronic) tal como se describe para antigenos y otros agentes en el presente documento. Y, por ejemplo, la conjugacion de ADN-polimero se puede realizar mediante adsorcion electrostatica, biotinilacion de polimero [139]. Existen otras diversas estrategias de conjugacion quimica para unir polimeros al ADN, que pueden adaptarse para su uso en el presente documento [140]. Utilizando las nanoparticulas descritas en el presente documento, las CPA, incluidas las CD, de los ganglios linfaticos pueden ser una diana para la expresion genica del antigeno, asi como activarse para asegurar la estimulacion apropiada de celulas T.

Conjugacion de antigeno

Estan disponibles una diversidad de esquemas para unir antigenos a grupos funcionales nucleofilos o electrofilos. En general, dichos esquemas pueden adaptarse para la union de farmacos o senales de peligro, segun sea apropiado.

A modo de ejemplo, se proporciona la union de antigenos a PLURONIC en las nanoparticulas de PPS de los ejemplos. La conjugacion de antigenos a nanoparticulas de PPS se puede llevar a cabo mediante la funcionalizacion de la superficie de PLURONIC (un copolimero de bloque de PEG y PPG) con proteinas o peptidos. Se utilizaron Pluronic F127 (Sigma), divinilsulfona (Fluka), hidruro de sodio (Aldrich), tolueno (VWR), acido acetico (Fluka), dietileter (Fisher), diclorometano (Fisher) y Celite (Macherey Nagel) tal como se recibieron. La reaccion se llevo a cabo en atmosfera de argon (Messer). Se midio la RMN de 1H en cloroformo deuterado (Armar) y los desplazamientos quimicos (5) se proporcionan en ppm con respecto a la senal del patron interno tetrametilsilano (Armar) a 0,0 ppm. Una solucion de 15 g (1,18 mmol) de Pluronic F-127 en 400 ml de tolueno se seco mediante destilacion azeotropica durante 4 h utilizando una trampa Dean-Stark. La solucion se enfrio en un bano de hielo y se anadieron 0,283 g (11,8 mmol) de hidruro de sodio. La mezcla de reaccion se agito durante 15 minutos y se anadieron rapidamente 3,55 ml (35,4 mmol) de divinilsulfona (Sigma-Aldrich). Despues de agitar en la oscuridad durante 5 dias a temperatura ambiente, la reaccion se detuvo anadiendo 1,35 ml (23,6 mmol) de acido acetico. Despues de filtrar a traves de celite y concentrar el filtrado a presion reducida hasta un volumen pequeno, el producto se precipito en 1 litro de dietileter helado. El solido se retiro por filtracion, se disolvio en una cantidad minima de diclorometano y se precipito en dietileter helado cuatro veces en total. El polimero se seco al vacio para producir 6,0 g y se almaceno en atmosfera de argon a -20 °C antes de la conjugacion con OVA. La RMN mostro la presencia de vinilsulfona y el grado de funcionalizacion fue del 88%. 5 = 1,1 (m, CH3, PPG), 3,4 (m, CH, PPG), 3,5 (m, CH², PPG), 3,6 (PEG), 6,1 (d, CHcis= CH-SO²) y 6,4 (d, CHtrans= CH-SO²), 6,85 (dd, CH²= CHSO²-).

Despues pueden conjugarse antigenos peptidicos o proteicos a PLURONIC-vinilsulfona (VS). Una proteina modelo para investigar la presentacion del antigeno por CD es la ovoalbumina (OVA). La OVA posee los peptidos antigenicos OVA^257-264 y OVA^323-339 que son procesados por CD a traves de las rutas MHCI y II, respectivamente. OVA^257-264 y OVA^323-339 se conjugan con residuos de cisteina mediante el uso de un sintetizador de peptidos. Los peptidos se conjugan a continuacion con PLURONIC-VS mediante reaccion con sus tioles de cisteina. Se solubilizan 18 mg de peptido en 6,43 ml de tampon de fosfato de sodio 0,1 M a pH 8,5 para proporcionar una solucion 2 mM. Se anaden 60 mg (1,68 mM) de PLURONIC-VS. La mezcla se agita durante 3 h y se toman partes alicuotas para la deteccion de tiol por Ellman cada 15-30 min. Se solubilizan 4 mg de reactivo de Ellman (5,5'-ditio-bis-(acido 2-nitrobenzoico)) en 1 ml de fosfato de sodio 0,1 M y EDTA 1 mM (para quelar iones metalicos divalentes, que pueden oxidar sulfhidrilos) a pH 8,5. Se mezclan 15 pl con 1,5 ml de fosfato de sodio 0,1 M y 30 pl de la mezcla de reaccion desactivada con 120 pl de fosfato de sodio a pH 7. Despues de mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos, se mide la absorbancia a 412 nm. La cantidad de tioles se calcula como: c = Abs/E * D, con E (factor de extincion) = 14150 M-1 y siendo D un factor de dilucion. El PLURONIC se dializo contra agua a traves de una membrana de MWCO de 6-8 kDa y la solucion se liofilizo. El rendimiento es de ~88% con la conversion completa de los grupos vinilsulfona tal como se confirmo mediante RMN de 1H. La conjugacion de OVA a PLURONIC-VS se realiza mediante una estrategia similar utilizando tioles de cisteina libres y aminas de lisina [109-111]. El peptido/proteina PL-VS-OVA se almacena a continuacion a -20 °C hasta que se use para la sintesis de nanoparticulas.

El antigeno puede conjugarse con las nanoparticulas por otros medios, incluidos conjugacion covalente con aminoacidos que son exogenos con respecto al antigeno polipeptidico natural, conjugacion covalente con aminoacidos que son endogenos con respecto al antigeno natural, adsorcion fisicoquimica y otros medios.

Inmunoterapia con nanoparticulas y senales de peligro

Otro enfoque de inmunoterapia implica la aplicacion de senales de peligro. Los resultados expuestos en el presente documento muestran que las nanoparticulas de PPS activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) proporcionan la funcion de una senal de peligro o estimulo que madura las CD tal como se evidencia mediante el aumento en la expresion de las moleculas coestimuladoras CD86 y CD80. Aunque las nanoparticulas no requieren una senal de peligro o de maduracion no complementaria, en algunos casos la adicion de dicha senal puede ayudar adicionalmente en el desarrollo de una respuesta inmunologica. Otros estudios de direccionamiento a CD han sugerido que despues de la absorcion de antigenos, son necesarias senales de peligro tales como citoquinas inflamatorias (es decir, ligando de CD40) y/o activadores de los receptores tipo Toll (por ejemplo, LPS y ADN de CpG) para hacer madurar las CD y subsiguientemente inducir inmunidad mediada por celulas [113-115]. Las senales de peligro se identifican como biomoleculas que conducen a la regulacion al alza del gen NF- ^k B, que a su vez conduce a la maduracion de las CPA y a la liberacion de citoquinas inflamatorias. En tal caso, se podrian unir citoquinas de senal de peligro tales como el ligando CD40, ^g M-CSF o un activador del receptor tipo Toll a una nanoparticula (por ejemplo, en el nucleo o la capa superficial o la capa de polimero hidrofilo), por ejemplo, siguiendo los protocolos descritos previamente para la conjugacion de proteinas o peptidos [109-111]. Ademas, una nanoparticula se puede sintetizar con un antigeno y/o una senal de peligro no complementaria unida a su superficie.

Inmunoterapia para la produccion de anticuerpos

Algunas formas de realizacion estan dirigidas a la introduccion de un antigeno a un paciente para generar anticuerpos en el paciente contra el antigeno. Por ejemplo, las vacunas o los tratamientos antitumorales se pueden llevar a cabo de esta forma. Alternativamente, dichos enfoques pueden usarse para generar anticuerpos para su uso como reactivos cientificos, por ejemplo, en animales.

Por lo tanto, se puede introducir una combinacion de nanoparticula y antigeno en el paciente. Despues de un tiempo predeterminado (por ejemplo, 1-30 dias), se toma una muestra del paciente y se miden los anticuerpos contra el antigeno. Se pueden tomar muestras y mediciones adicionales periodicamente. Si los titulos de anticuerpos son demasiado bajos, las nanoparticulas y los antigenos se pueden reintroducir y se pueden realizar mediciones adicionales, repitiendo el proceso cuando sea necesario para llevar los titulos de anticuerpos a un nivel deseado. La combinacion se puede administrar varias veces.

Discusion de resultados experimentales

El suministro de nanopartfculas biodegradables a celulas presentadoras de antfgenos (CPA), especfficamente celulas dendrfticas (CD), se documenta en el presente documento, incluidas aplicaciones para inmunoterapia. Los ejemplos detallados en el presente documento describen el suministro de nanopartfculas de poli(sulfuro de propileno) (PPS) estabilizadas con poli(etilenglicol) de 20, 25, 45 y 100 nm de diametro a las CD presentes en los ganglios linfaticos. Las nanopartfculas de los ejemplos detallados comprenden un nucleo gomoso reticulado de PPS rodeado por una corona hidrofila de poli(etilenglicol). El dominio de PPS es capaz de transportar farmacos hidrofobos y se degrada en polfmeros solubles en entornos oxidativos. Pueden unirse a la superficie de la nanopartfcula antfgenos peptfdicos o proteicos, que incluyen antfgenos glucopeptfdicos (definidos en el presente documento como polipeptidos glicosilados), y antfgenos que codifican acidos nucleicos. Las partfculas de 20 nm se captaron mas facilmente por los vasos linfaticos despues de la inyeccion intersticial, mientras que las partfculas de 20 y 45 nm presentaron una retencion significativa en los ganglios linfaticos, mostrando una presencia constante e intensa a las 24, 72, 96 y 120 h despues de la inyeccion. Las nanopartfculas se internalizaron por parte de hasta un 40-50% de las CD (y las CPA) de los ganglios linfaticos sin el uso de un ligando de direccionamiento exogeno, y el sitio de la internalizacion se encontraba en los ganglios linfaticos mas que en el sitio de la inyeccion. Se observo un aumento de las CD (y otras CPA) que contenfan nanopartfculas a las 96 h con respecto a las 24 h, lo que mostraba una infiltracion de estas celulas en los ganglios linfaticos. Se encontro que tanto el tamano de las nanopartfculas como la qufmica de superficie influyen en la maduracion de CD despues de la inyeccion in vivo.

Se encontro que las nanopartfculas basicas de PPS tal como se sintetizaron, es decir, nucleos de nanopartfculas de PPS estabilizados con PLURONIC (un copolfmero de bloque de polietilenglicol (PEG) con polipropilenglicol), activan las CD despues de la inyeccion in vivo de las nanopartfculas, tal como se indica mediante la expresion aumentada de los marcadores de maduracion CD86, CD80 y CD40, cuando las nanopartfculas eran muy pequenas; las nanopartfculas de 25 nm activaron las CD ampliamente despues de la inyeccion in vivo, mientras que las nanopartfculas de 100 nm no lo hicieron. Cuando se utilizo una segunda qufmica de superficie de las nanopartfculas, es decir, nucleos de nanopartfculas de PPS estabilizados con un PLURONIC terminado en metoxi, incluso las nanopartfculas muy pequenas no activaron las CD despues de la inyeccion in vivo. Se demostro que las nanopartfculas estabilizadas con PLURONIC activan eficazmente el complemento, mientras que las nanopartfculas estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi no fueron eficaces en la activacion del complemento. Por lo tanto, la activacion del complemento por nanopartfculas indujo la activacion de las CD despues de la exposicion a estas nanopartfculas.

Se encontro que tanto el tamano de las nanopartfculas como la qufmica de superficie influyen en la inmunidad adaptativa despues de la inyeccion in vivo. El antfgeno se conjugo con superficies de nanopartfculas estabilizadas con PLURONIC y se encontro que inducfa fuertemente la formacion de anticuerpos solo cuando las nanopartfculas eran muy pequenas; las nanopartfculas de 25 nm indujeron la formacion de anticuerpos mucho mas intensamente que las nanopartfculas de 100 nm. Cuando se utilizo una segunda qufmica de superficie de nanopartfculas, es decir, nucleos de nanopartfculas de PPS estabilizados con un PLURONIC terminado en metoxi, incluso las nanopartfculas muy pequenas no indujeron una fuerte formacion de anticuerpos despues de la inyeccion in vivo. Ademas, cuando se inyectaron nanopartfculas estabilizadas con PLURONIC de 25 nm a ratones en los que se habfa desactivado la protefna 3 del complemento (ratones C3-/-), estas nanopartfculas no indujeron fuertemente la formacion de anticuerpos. Por lo tanto, los ejemplos detallados muestran que las nanopartfculas de tamano adecuado, por ejemplo, de 20-45 nm, tienen potencial para aplicaciones inmunoterapeuticas; por ejemplo, se pueden usar para dirigirse especfficamente y activar las CD de los ganglios linfaticos. Ademas, cuando estas nanopartfculas poseen una qufmica de superficie que activa el complemento, tal como se obtiene mediante la estabilizacion con PLURONIC, tienen un gran potencial para funcionar como vehfculos de antfgeno y como adyuvantes que inducen inmunidad adaptativa. La combinacion especial de tamano pequeno (por ejemplo, 20-45 nm) y la activacion del complemento es valiosa en formulaciones de vacunas como adyuvantes.

Por lo tanto, los ejemplos muestran que las nanopartfculas se pueden usar para la administracion dirigida de antfgenos y de farmacos a CPA, especfficamente CD, de los ganglios linfaticos. La simplicidad de este enfoque es que controlando el tamano, las nanopartfculas se pueden captar eficazmente por los vasos linfaticos y retenerse en los ganglios linfaticos (tal como se muestra, durante al menos 5 dfas), y sin utilizar ningun ligando de direccionamiento exogeno especffico; se internalizan eficazmente por las CD residentes nodales y otras CPA (por ejemplo, macrofagos). Las nanopartfculas con un tamano de hasta aproximadamente 45 nm o de hasta aproximadamente 100 nm no pueden dirigirse eficazmente a los vasos linfaticos y los ganglios linfaticos por este medio. Ademas, se demuestra que hasta aproximadamente el 40 a aproximadamente el 50% de las CD de los ganglios linfaticos residentes internalizan nanopartfculas, lo que demuestra aun mas la eficacia de este vehfculo de administracion. Tambien se demostro que despues de la exposicion a nanopartfculas de dichos intervalos de tamano que se dirigen de forma eficaz a los vasos linfaticos, cuando esas nanopartfculas activan el complemento, las CD responden volviendose mas maduras e induciendo inmunidad adaptativa dependiente de celulas T. Esta es una clara demostracion de la potencia de usar la cascada del complemento como una senal de peligro en las formulaciones de adyuvantes de presentacion de antfgenos. Se ha demostrado que la combinacion de tamano pequeno (para ingresar efectivamente en los linfaticos despues de la administracion) y la activacion del complemento (para estimular CPA, incluida la maduracion de CD), podria inducir fuertes respuestas inmunitarias adaptativas, tanto humorales dependientes de celulas T (por medio de titulos de Ab) como celulares (por medio de las mediciones de la memoria de las celulas T a traves de la proliferacion de celulas T y mediciones ELISPOT). Esta combinacion especial de tamano pequeno y activacion del complemento es muy valiosa en inmunoterapia.

El ejemplo 1 describe tecnicas de polimerizacion en emulsion para producir nanoparticulas. Estas tecnicas se pueden aplicar a una diversidad de monomeros/polimeros para producir particulas adecuadas. El ejemplo 2 se relaciona con la modificacion de PLURONIC y se puede aplicar en general a la modificacion de otros polimeros del presente documento, con variaciones que se realizan para considerar estructuras quimicas particulares.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Nanoparticulas

Se sintetizaron nanoparticulas de PPS con diametros de 20, 45 y 100 nm mediante polimerizacion en emulsion inversa tal como se describe en otra parte; en la expresion "polimerizacion en emulsion" utilizada en el presente documento incluimos polimerizacion en emulsion inversa, y en el termino "emulsion", incluimos emulsion inversa [39]. En resumen, se creo una emulsion anadiendo el emulsionante de copolimero de bloque PEG, PLURONIC F-127 (Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) y el monomero sulfuro de propileno a agua miliQ ultrapura con agitacion constante. El tetratioester de pentaeritritol iniciador protegido se sintetizo tal como se describe en otra parte [39] y, en un matraz separado, se desprotegio mezclandolo con 0,20 ml de una solucion de metilato sodico 0,5 M con agitacion durante 10 minutos. A continuacion, espues de la desproteccion, el iniciador se anadio a la emulsion de monomero y, 5 minutos mas tarde, se anadieron a la reaccion 60 pl de la base diaza[5.4.0] bicicicloundec-7-eno (DBU) y se dejo con agitacion continua durante 24 h en atmosfera inerte. Las nanoparticulas se expusieron despues al aire para producir una reticulacion de disulfuro.

Las nanoparticulas se purificaron de monomeros restantes, base o PLURONIC libre mediante 2 dias de dialisis repetida con una membrana de MWCO de 12-14 kDa (Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA) frente al agua ultrapura milliQ. Las distribuciones del tamano de las nanoparticulas se determinaron utilizando un instrumento de dispersion de la luz dinamica (Malvern, Worcestershire, Reino Unido). El marcado fluorescente se realizo anadiendo 6-yodoacetamido-fluoresceina o Alexa Fluor 488 maleimida (Molecular Probes, Eugene, OR) a 1 mg/ml de solucion de nanoparticulas a los tioles reactivos que permanecen en las nanoparticulas, y luego se agito en la oscuridad durante 6 h. Las nanoparticulas se expusieron despues al aire para la posterior reticulacion de disulfuro. La yodoacetamido-fluoresceina o la maleimida Alexa Fluor libre se elimino mediante dialisis repetida durante 1 dia utilizando una membrana de corte de PM de 25 kDa (Spectrum Laboratories) contra PBS 5 mM.

Ejemplo 2: Si'ntesis de PLURONIC terminado en metoxi

Se utilizaron Pluronic F127 (Sigma), yoduro de metilo (Fluka), hidroxido de potasio (Fluka), tiosulfato de sodio pentahidratado (Riedel de Haen), sulfato de sodio anhidro (Applichem), cloruro de sodio (Sigma), dietileter (Fisher) y diclorometano (Fisher) tal como se recibieron. Se seco tetrahidrofurano estabilizado con BHT al 0,025% (Acros) a traves de tamices moleculares antes de su uso. La reaccion se llevo a cabo en atmosfera de argon (Messer). Para la dialisis se uso un tubo de celulosa regenerada (Spectrapor) con un corte de peso molecular de 3400. Se midio la RMN de 1H en dimetilsulfoxido deuterado (Armar) y los desplazamientos quimicos (6) se proporcionan en ppm con respecto a la senal del disolvente residual a 2,5 ppm.

A una solucion de 10,0 g (0,79 mmol) de PLURONIC F127 en 100 ml de THF, se anadieron 2,99 g (53,3 mmol) de hidroxido de potasio finamente molido y 988 pl (15,9 mmol) de yoduro de metilo y la mezcla se agito en la oscuridad durante 19 h. La solucion transparente se decanta y se anaden 3,94 g de tiosulfato sodico pentahidratado, 100 ml de solucion acuosa saturada de cloruro de sodio y 100 ml de diclorometano. La mezcla se agito vigorosamente y se transfirio a un embudo de separacion. Las capas se separaron y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 100 ml). Las fracciones organicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron a presion reducida. El solido se disolvio en una cantidad minima de agua bidestilada y se dializo contra 4500 ml de agua durante un dia. La solucion acuosa transparente se satura con cloruro de sodio y se extrae con diclorometano (3 x 100 ml) y se seca sobre sulfato de sodio. Despues de la eliminacion del disolvente, el residuo se extrae en un extractor Soxhlet con dietileter durante 6 h para obtener un rendimiento despues del secado a presion reducida de 9,25 g de un solido blanco. La RMN mostro la ausencia del grupo OH a 4,6 ppm y la presencia del grupo OCH3 a 3,2 ppm. 5 = 1,1 (d, CH³, PPG), 3,2 (s, OCH³) 3,3 (m, CH, PPG), 3,4 (m, CH², PPG), 3,5 (m, PEG).

Ejemplo 3: Animates

A menos que se indique lo contrario, para este estudio se utilizaron ratones BALB/c, de 6 a 9 semanas de edad y con un peso de 20-30 g. Todos los protocolos fueron aprobados por las autoridades veterinarias del canton de Vaud segun la legislacion suiza. La anestesia se administro mediante inyeccion subcutanea de clorhidrato de ketamina a 10 mg/kg y xilazina a 1 mg/kg. Los ratones se sacrificaron por medio de asfixia con CO².

Ejemplo 4: Microlinfangiografia

Para determinar las caracteristicas de captacion relativas de las nanoparticulas despues de una inyeccion intersticial en la piel, se realizo una microlinfangiografia de fluorescencia mediante inyeccion a presion constante en la punta de la cola tal como se ha descrito anteriormente [43-45]. Se depilo la cola del raton y el raton se dispuso en la pletina del microscopio (Axiovert 200M, Zeiss) con una almohadilla termica para mantener una temperatura corporal de 37 °C. Se introdujo una solucion de 20 mg/ml de nanoparticulas de PPS fluorescentes (20, 45 o 100 nm de diametro) en solucion salina tamponada con fosfato esteril (PBS) en un cateter; una aguja de calibre 30 unida al cateter se inserto por via intradermica a ~1 mm desde la punta de la cola y se abrio una llave de paso que inicio el flujo a una presion constante de 40 mmHg. La velocidad de flujo de la solucion de nanoparticulas (supervisada mediante una burbuja que se encuentra corriente arriba en el entubado) promedio 0,1 pl/min en aproximadamente 20 mm3 de tejido (estimados a partir del volumen visible desde el deposito de inyeccion), o aproximadamente 5 pl/g/min. No se observo hinchazon visible. Las imagenes secuenciales a lo largo de la longitud de la cola se registraron en un tiempo de exposicion constante; se repitieron 3 experimentos para cada tamano de nanoparticulas.

Se utilizo una microlinfangiografia de fluorescencia en la cola del raton para evaluar la captacion por los vasos linfaticos de nanoparticulas de PPS de 20, 45 y 100 nm de diametro. Despues de la infusion con particulas de 20 nm, la red capilar linfatica hexagonal fue claramente visible despues de 90 minutos y se lleno uniformemente desde el sitio de la inyeccion (figura 1a). Por el contrario, solo se observo una red linfatica muy debil despues de la inyeccion con las particulas de 45 nm (figura 1b), y se pudo observar muy poca red con las particulas de 100 nm (figura 1c), lo que indica una captacion deficiente. Se sabe que el limite superior de tamano para la fuga de macromoleculas/protefnas/partfculas a los capilares sanguineos es de ~3,5 nm [42], por lo tanto, la fuga en la vasculatura sanguinea de nuestras particulas mas pequenas de 20 nm es, en la practica, de cero. Por lo tanto, este procedimiento confirma cualitativamente que las particulas de 20 nm se incorporan mas facilmente a los capilares linfaticos desde el espacio intersticial en comparacion con las particulas de 45 nm y 100 nm.

Ejemplo 5: Evaluacion de la distribucion de nanoparticulas en los ganglios linfaticos: retencion en los ganglios linfaticos de nanoparticulas pequenas (por ejemplo, 20-45 nm)

Para evaluar la retencion por los ganglios linfaticos, se inyectaron 20 pl de 20 mg/ml de nanoparticulas de PPS fluorescentes (20, 45 y 100 nm de diametro) en embolada en la punta de la cola del raton o la almohadilla de una pata delantera a traves de una aguja de calibre 30; los controles se realizaron con inyecciones de 20 pl de PBS. No se observo inflamacion en los sitios de inyeccion. A las 24, 72, 96 o 120 h, los ratones se sacrificaron mediante asfixia con CO2. Los ganglios linfaticos sacros y lumbares, que drenan los vasos linfaticos de la cola y las piernas, los ganglios linfaticos braquiales y axilares, que drenan los vasos linfaticos de la zona de la almohadilla de la pata delantera, se extrajeron, se congelaron instantaneamente, se crioseccionaron en secciones de 10 pm y se inmunotineron con anticuerpos contra CD3e de raton (Pharmingen, San Diego, CA), CD45R (Caltag, Burlingame, CA), CD68 (Serotec, Dusseldorf, Alemania), Dec-205 (Serotec) y CD31 (Pharmingen) para marcar celulas T, celulas B, macrofagos/CD, CD y celulas endoteliales, respectivamente. La deteccion secundaria se realizo con los anticuerpos Alexa Flour 594 nm (Molecular Probes). Se tomaron imagenes de las secciones de ganglios linfaticos con fluorescencia (Axiovert 200M, Zeiss) y microscopia de barrido laser confocal (LSM 510 Meta, Zeiss).

El tiempo de retencion en los ganglios linfaticos de nanoparticulas y liposomas se ha investigado por otros investigadores con el proposito de estudiar el sistema linfatico y, normalmente, se ha enfocado en puntos temporales en el intervalo de 6-52 h despues de la inyeccion [31-34, 36]. Los ejemplos expuestos en el presente documento describen la retencion en ganglios linfaticos de nanoparticulas de hasta 120 h, y mostraron que las particulas de 20 nm estaban significativamente presentes en niveles cualitativamente constantes en el ganglio linfatico a las 24, 72, 96 y 120 h despues de una inyeccion en embolada de 20 pl por via intradermica (figura 2). Las nanoparticulas de 45 nm tambien estaban presentes, aunque en cantidades mas bajas, en los ganglios linfaticos en todos los puntos temporales, mientras que las nanoparticulas de 100 nm no estaban presentes de forma visible en los ganglios linfaticos en ningun punto temporal (figura 2). Por lo tanto, junto con los resultados de la figura 1, estos datos muestran que 20-45 nm es un buen intervalo de tamano de nanoparticulas de PPS tanto para la captacion por vasos linfaticos como para la retencion en ganglios linfaticos, siendo 20 nm optimo, mientras que las particulas de 100 nm son demasiado grandes para una captacion por los vasos linfaticos eficaz desde el intersticio despues de una inyeccion a presion constante. Esto es coherente con estudios previos que han demostrado que los liposomas > 70 nm permanecen principalmente en el sitio de la inyeccion [24, 30].

Se evaluaron ubicaciones especificas, con respecto a las diversas celulas inmunitarias, en las que se acumulaban nanoparticulas de PPS dentro de los ganglios linfaticos. Los resultados de la tincion fueron coherentes con la arquitectura conocida de los ganglios linfaticos, en la que se pueden ver facilmente zonas especificas para linfocitos T y B [2]. Las celulas T tienden a agregarse en las regiones centrales del ganglio, mientras que las celulas B a menudo se encuentran en centros germinales ubicados hacia la membrana externa. Los otros tipos de celulas principales presentes en los ganglios linfaticos son CPA o celulas MHCII+, a saber, CD y algunos macrofagos, y su ubicacion es a menudo mas dispersa. La figura 3 muestra secciones en serie del mismo ganglio linfatico despues de una inyeccion intradermica de particulas de 20 nm. Las nanoparticulas no estaban presentes en las regiones de celulas T o celulas B (figuras 3a, b). No obstante, hubo una colocalizacion significativa de las nanoparticulas con macrofagos y CD; es decir, celulas CD68+ (figura 3c).

Generalmente se ha asumido que los liposomas y las nanoparticulas suministradas a los ganglios linfaticos son principalmente fagocitados por macrofagos en los mismos [21, 27, 29, 30, 32, 36, 37]. Sin embargo, no se ha apreciado en estas tecnicas que tambien esten presentes en los ganglios linfaticos CD inmaduras capaces de absorber antigenos [15, 16]. Con el suministro de nanoparticulas de PPS, la inmunotincion para CD68 (que, aunque es una proteina transmembrana, tambien se expresa intracelularmente [47-50]) verifico que los macrofagos y las CD habian internalizado nanoparticulas de PPS (figura 4a). Para determinar adicionalmente si las celulas CD68+ eran macrofagos, CD, o ambos, los ganglios linfaticos se inmunotineron para el receptor de CD altamente especifico Dec-205 [4, 38, 51-56]. Las celulas Dec-205+ y su colocalizacion con nanoparticulas (figura 4b) demuestran que una fraccion significativa de las celulas presentes en el ganglio linfatico que fagocitan las nanoparticulas eran, de hecho, CD. Esto sera ventajoso para administrar antigenos a los ganglios linfaticos con el fin de estimular las CPA, incluidas las CD de tipo CPA mas potentes.

Ejemplo 6: Aislamiento y tincion de celulas de ganglios linfaticos

Las celulas de los ganglios linfaticos se aislaron siguiendo un protocolo descrito previamente [46]. En resumen, despues de las inyecciones de nanoparticulas fluorescentes o PBS tal como se ha descrito anteriormente, los ganglios linfaticos se extrajeron, se trataron con agujas de calibre 26 y se digirieron en colagenasa D (Roche, Basilea, Suiza) durante 25 minutos a 37 °C. El tejido se hizo pasar despues a traves de un filtro de celulas de 70 pm (BD, Basilea, Suiza) para recuperar una suspension celular. Con la suspension celular de los ganglios linfaticos, las CPA se tineron con R-PE anti-MHC de clase II (I-A) (Chemicon, Temecula, CA) y las CD con aloficocianina anti-CD11c (Pharmingen). La maduracion de las CD se midio mediante tincion con R-PE anti-CD86 y R-PE anti-CD80 (Pharmingen).

Ejemplo 7: Internalizacion de nanoparticulas in vitro

Despues del aislamiento de las celulas de los ganglios linfaticos, las celulas se plaquearon en RPMI (FBS al 5%) a ~500.000 celulas/ml. Las celulas se pulsaron con 20 pl de 20 mg/ml de nanoparticulas fluorescentes y se incubaron durante 24 h. Las celulas se lavaron despues dos veces con HBSS y se tineron para CPA y CD tal como se ha mencionado anteriormente.

Ejemplo 8: Citometria de flujo y analisis e internalizacion de nanoparticulas in vitro: absorcion por CPA, incluidas CD

Despues de la tincion, las suspensiones de celulas de los ganglios linfaticos se analizaron mediante citometria de flujo (CyAn ADP, Dako, Glostrup, Dinamarca). Se realizo un analisis adicional utilizando el programa informatico FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). Se determino que las CPA y las CD que habian internalizado nanoparticulas fluorescentes eran MHCII+FITC+ y CD11c+FITC+, respectivamente, representando FITC el marcado de las nanoparticulas. La maduracion de CD despues de la internalizacion de nanoparticulas se evaluo calculando la fraccion de celulas que expresaban CD86 y CD80.

Se realizo un analisis de citometria de flujo para cuantificar la fraccion de CPA y CD de los ganglios linfaticos que internalizaban nanoparticulas. La figura 5a muestra que hasta un ~40% de las CPA (MHCII+) y especificamente el ~50% de las CD (CD11c+) de los ganglios linfaticos han absorbido nanoparticulas de 20 nm despues de 24 h despues de la inyeccion. En consecuencia, y en general, se contemplan aplicaciones de nanoparticulas con al menos del 10% a aproximadamente el 95% de absorcion por CPA y/o CD; los expertos apreciaran de inmediato que se contemplan todos los intervalos y valores dentro de los intervalos indicados explicitamente, por ejemplo, al menos aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 40%, o entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 75%/50%. Tambien una fraccion significativa de las CPA y las CD fagocitan nanoparticulas de 45 nm, mientras que se observo muy poca absorcion de las nanoparticulas de 100 nm despues de la inyeccion in vivo. Las CPA, incluidas las CD, podrian haber endocitado las particulas despues de llegar a los ganglios linfaticos, o se podrian haber internalizado en el lugar de la inyeccion antes de que se transportaran a los ganglios linfaticos. Si este ultimo fuera el caso, se verian particulas de 100 nm en el ganglio linfatico, ya que las CPA pueden endocitar las particulas mas grandes (1-10 pm) con la misma eficacia que las mas pequenas [13, 57]. Se verifico que el tamano de las nanoparticulas no afecto a la internalizacion de CPA o CD mediante experimentos in vitro; casi todas las CPA y CD internalizaron nanoparticulas independientemente de su tamano (figura 5b). Por lo tanto, es probable que las nanoparticulas de PPS sean absorbidas pasivamente en los vasos linfaticos perifericos y alcancen los ganglios linfaticos, donde son fagocitadas por CD o CPA residentes. Estos resultados refuerzan los hallazgos recientes de que en los ganglios linfaticos hay presencia de cantidades sustanciales de CD inmaduras capaces de internalizar antigenos [15, 16]. De hecho, las CD y otras CPA presentes en los ganglios linfaticos ofrecen una diana valiosa para iniciar la inmunidad mediada por celulas a traves de vehiculos de administracion de farmacos.

Se investigo una comparacion de la internalizacion de las nanoparticulas en diferentes momentos. Se encontro que la colocalizacion de nanoparticulas con macrofagos y CD fue visiblemente mayor a las 96 h que a las 24 h (figura 6a). Se utilizo un analisis de citometria de flujo para determinar si hubo un cambio en el tipo de macrofagos y en las CD que internalizan nanoparticulas a las 96 h con respecto a las 24 h. De todas las celulas que habian internalizado nanoparticulas a las 24 h, ~15% eran CPA (MHCII+) y ~13% fueron CD (CD11c+), lo que sugiere que la mayor parte de las CPA eran CD y que el ~85% restante de las celulas que contienen nanoparticulas eran macrofagos que no presentaban antigenos (MHCII-). A las 96 h, la fraccion de celulas con nanoparticulas que eran CPA o CD fue del 61 ± 5% y del 33 ± 3%, respectivamente (notese que esto no refleja un aumento en la fraccion de CPA y CD de los ganglios linfaticos que contienen nanoparticulas, que permanece constante en los niveles mostrados en la figura 5a). El aumento de celulas MHCII+ y CD11c+ que contienen nanoparticulas puede deberse a una infiltracion de CPA y CD en los ganglios linfaticos que despues recogen nanoparticulas libres que aun permanecen en el tejido nodal. Tambien es posible que el aumento de celulas MHCII+ con nanoparticulas se deba a la activacion de macrofagos entre las 24-96 h (es decir, macrofagos MHCII- que se activan y son por lo tanto MHCII+ despues de la internalizacion de nanoparticulas).

Una fraccion significativa de las CD de los ganglios linfaticos ya estan maduras; sin embargo, dado que hay presencia de CD inmaduras, es probable que estas celulas maduren despues de la absorcion del antigeno. Por lo tanto, se determino si las nanoparticulas de PPS activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) de 20 nm ayudan a inducir la maduracion de CD, de tal forma que no sean necesarias "senales de peligro" biologicas exogenas convencionales cuando se usan en combinacion con las nanoparticulas de PPS activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC. Despues de las inyecciones de nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC de 20 nm, la expresion del marcador de maduracion de CD CD86 aumento en comparacion con los controles que recibieron inyecciones de PBS (figura 7). La expresion de CD de CD80 tambien se midio y se determino que era significativamente mayor despues de la internalizacion de las nanoparticulas (figura 7b). Finalmente, se encontro que los niveles de expresion de CD86 y CD80 en las CD con nanoparticulas no cambiaron a las 96 h con respecto a las 24 h despues de la inyeccion. Esto sugiere que las nanoparticulas activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC de 20 nm ofrecen un estimulo de maduracion prolongada, que podria ser util para mantener la activacion de celulas T y la inmunidad mediada por celulas a lo largo de un periodo de tiempo prolongado. Por lo tanto, estos resultados muestran que las nanoparticulas PPS activadoras del complemento estabilizadas con PLURONIC pueden cumplir una doble funcion, actuando como vehiculo para la administracion de antigeno especifico a las CD y tambien como adyuvante que madura y activa las CD de los ganglios linfaticos.

Ejemplo 9: Detection de C3a en suero humano

Se recubrieron placas de 96 pocillos (Becton Dickinson) con anticuerpo monoclonal antihumano de raton C3a/C3a (desArg) (AntibodyShop, Grusbakken, Dinamarca) a una dilucion de 1:4000 en PBS a 100 gl/pocillo. Las placas se dejaron toda la noche a temperatura ambiente (TA). El anticuerpo no unido se retiro mediante una sacudida (es decir, se retiro mediante un movimiento mecanico repentino) y la placa se lavo 3x con 200 gl/pocillo de agua DI. Las placas se bloquearon durante 1,5 h a TA con 200 gl/pocillo de tampon de bloqueo (PBS Tween20 al 0,05% albumina de suero bovino al 0,5%).

El suero humano se incubo a un volumen de 1:1 con PBS, suspensiones de nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y por lo tanto, nanoparticulas hidroxiladas) y suspensiones de nanoparticulas estabilizadas con nanoparticulas terminadas en metoxi (y, por lo tanto, nanoparticulas no hidroxiladas) en tubos Eppendorf a 37 °C durante 45 min. Cuando las placas terminaron de bloquearse, se lavaron 3x con 250 gl/pocillo de tampon de lavado (PBS Tween20 al 0,05%). Despues se anadieron muestras de nanoparticulas en suero a los pocillos por triplicado a 50 gl/pocillo durante 2 horas a TA. Las muestras, despues, se retiraron mediante una sacudida y la placa se lavo con tampon de lavado 5x a 250 gl/pocillo. Despues se anadio anticuerpo de deteccion biotinilado C3a/C3a (desArg) (AntibodyShop) a una dilucion 1:4000 en un tampon de bloqueo a 50 gl/pocillo durante 2 horas a TA. Despues se retiro el anticuerpo de deteccion C3a y la placa se lavo con tampon de lavado 5x a 250 gl/pocillo. A continuacion se diluyo estreptavidina-anticuerpo HRP (R&D systems) en tampon de bloqueo a la concentracion recomendada por el ^{fabricante y se anadio a la placa a 50 gl/pocillo durante 2 horas a} Ta . ^{A continuacion se retiro mediante una} sacudida el anticuerpo HRP y la placa se lavo con tampon de lavado 5x a 250 gl/pocillo. A continuacion, se anadio reactivo de sustrato HRP (R&D systems) a 100 gl/pocillo en la oscuridad durante 45 minutos a TA. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 50 gl/pocillo de H²SO⁴2 N. Despues se leyo la placa en un lector de placas Tecan a 450 nm y 540 nm de longitud de onda. Los valores de fondo de 540 nm se restaron de 450 nm para obtener los valores finales.

El C3a presente en el suero incubado con PBS se comparo con el C3a presente despues de la incubacion con nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, nanoparticulas hidroxiladas) y con nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi (y, por lo tanto, nanoparticulas no hidroxiladas). La incubacion con las nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi condujo a un aumento de ~7 veces, y la incubacion con las nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC condujo a un aumento de ~32 veces de C3a presente en suero con PBS, tal como se muestra en la figura 8. Las nanoparticulas hidroxiladas, por lo tanto, activaron el sistema del complemento mucho mas que las nanoparticulas no hidroxiladas, segun se midio mediante la escision del C3 en suero humano dando C3a soluble y C3b unido. Esto confirma que la superficie de OH de la nanoparticula activa la ruta alternativa del sistema del complemento de forma mucho mas eficaz que una superficie de metoxi.

Ejemplo 10: Efectos de la quimica de superficie sobre la maduracion de CD

Se inyectaron por via intradermica a ratones nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, nanoparticulas hidroxiladas; producidas tal como se describe en el presente documento) de 25 nm, nanoparticulas estabilizadas con nanoparticulas de PLURONIC terminado en metoxi (y, por lo tanto, no hidroxiladas) de 25 nm, nanoesferas de poliestireno carboxilado (COOH-NS) de 20 nm (Invitrogen), PBS y LPS (30 gg) tal como se ha descrito anteriormente. Los ganglios linfaticos se extrajeron y las celulas se aislaron y se tineron para CD11c, CD86, CD80 y CD40 tal como se ha descrito anteriormente. Se realizo una citometria de flujo para determinar el perfil de maduracion de las CD de los ganglios linfaticos.

Como se observa en la figura 9, los perfiles de CD86, CD80 y CD40 para nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) en comparacion con nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi (y, por tanto, no hidroxiladas) y con nanoesferas de poliestireno carboxiladas son significativamente diferentes. Las CD de animales tratados con nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC muestran una mayor expresion de estos marcadores de maduracion de CD, ademas inducen la maduracion a niveles similares a los del LPS de control positivo. Las CD de animales tratados con nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi y de animales tratados con nanoesferas de poliestireno carboxilado produjeron respuestas de maduracion de CD casi identicas a las de la inyeccion de PBS de control negativo. Estos resultados muestran que la respuesta de maduracion CD in vivo viene dictada especificamente por la quimica de la superficie de las nanoparticulas de 20-25 nm. La superficie hidroxilada induce la maduracion de CD mientras que las superficies de metoxi y carboxilo no lo hacen. Basandose en los resultados presentados en este documento, la diferencia funcional en estas superficies se encuentra en la activacion del complemento por medio de las superficies hidroxiladas.

Ejemplo 11: Efectos del tamano sobre la maduracion de CD

Se inyectaron por via intradermica a ratones nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) de 25 nm, nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) de 100 nm y PBS tal como se ha descrito anteriormente. A continuacion, los ganglios linfaticos se extrajeron y las celulas se aislaron y se tineron para CD11c, CD86, CD80 y CD40 tal como se ha descrito en el presente documento. Se realizo una citometria de flujo para determinar el perfil de maduracion de las CD de los ganglios linfaticos.

Como se observa en la figura 10, los perfiles de CD86, CD80 y CD40 para nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y por tanto hidroxiladas) de 25 nm en comparacion con las de 100 nm de la misma quimica de superficie son significativamente diferentes. Las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 25 nm muestran una mayor expresion de estos marcadores de maduracion de CD. Las inyecciones de nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 100 nm produjeron respuestas de maduracion de CD casi identicas a las de la inyeccion de PBS de control negativo. Estos resultados muestran que la respuesta de maduracion CD in vivo esta especificamente relacionada con el tamano de las nanoparticulas. Se ha descrito en el presente documento que las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 25 nm penetran de forma eficaz en los capilares linfaticos y se transportan a los ganglios linfaticos en mucha mayor medida que las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 100 nm. Ademas, la retencion de nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 25 nm y la internalizacion por CD en los ganglios linfaticos son muy superiores a las de las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 100 nm. En el presente documento se muestra que tambien la maduracion de CD es muy superior con nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 25 nm en comparacion con nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 100 nm. La capacidad de las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC ultrapequenas de 25 nm para inducir la maduracion de la CD demuestra que el direccionamiento a los ganglios linfaticos y la quimica de la superficie son utiles para activar las CD. Basandose en los resultados de la entrada de nanoparticulas en los capilares linfaticos presentados en el presente documento, se espera que las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por tanto, hidroxiladas) de 45 nm puedan activar las CD dentro del ganglio linfatico.

Ejemplo 12: Conjugacion de OVA a nanoparticulas

La conjugacion de antigenos con nanoparticulas de PPS se puede realizar funcionalizando la superficie de Pluronic (un copolimero de bloque de PEG y PPG) con proteinas o peptidos, incluidos glicopeptidos. En este ejemplo se presenta un esquema de conjugacion para un antigeno proteico que contiene un residuo de cisteina libre para la conjugacion quimica. Pueden utilizarse otras funcionalidades en esquemas relacionados, tales como aminas en el extremo N-terminal o en residuos de lisina. El antigeno tambien puede estar adsorbido en superficies de nanoparticulas.

En el presente documento, se muestra el esquema de conjugacion para ovoalbumina (OVA). La OVA es una proteina modelo para investigar la presentacion de antigenos por CD que posee los polipeptidos antigenicos OVA257-²⁶⁴ y OVA^323-339 que son procesados por CD a traves de las rutas MHCI y II, respectivamente. El esquema de conjugacion comienza con la sintesis de la Pluronic-divinilsulfona a la que se acopla OVA a traves de un grupo tiol libre en la OVA en una reaccion de adicion de Michael. Los detalles de sintesis para ambas etapas se proporcionan a continuacion.

Se utilizaron Pluronic F127 (Sigma), divinilsulfona (Fluka), hidruro de sodio (Aldrich), tolueno (VWR), acido acetico (Fluka), dietileter (Fisher), diclorometano (Fisher) y Celite (Macherey Nagel) tal como se recibieron. La reaccion se llevo a cabo en atmosfera de argon (Messer). Se midio la RMN de rH en cloroformo deuterado (Armar) y los desplazamiento quimicos (5) se proporcionan en ppm con respecto a la senal del patron interno tetrametilsilano (Armar) a 0,0 ppm.

Una solucion de 15 g (1,18 mmol) de Pluronic F-127 en 400 ml de tolueno se seco por destilacion azeotropica durante 4 h usando una trampa de Dean-Stark. La solucion se enfrio en un bano de hielo y se anadieron 0,283 g (11,8 mmol) de hidruro de sodio. La mezcla de reaccion se agito durante 15 minutos y se anadieron rapidamente 3,55 ml (35,4 mmol) de divinilsulfona (Sigma-Aldrich). Despues de agitar en la oscuridad durante 5 dias a temperatura ambiente, la reaccion se detuvo anadiendo 1,35 ml (23,6 mmol) de acido acetico. Despues de filtrar a traves de celite y de concentrar el filtrado a presion reducida hasta un volumen pequeno, el producto se precipito en 1 litro de dietileter helado. El solido se retiro por filtracion, se disolvio en una cantidad minima de diclorometano y se precipito en dietileter helado cuatro veces en total. El polimero se seco al vacio para producir 6,0 g y se almaceno en atmosfera de argon a -20 °C antes de la conjugacion con OVA. La RMN mostro la presencia de vinilsulfona y el grado de funcionalizacion fue del 88%. 5 = 1,1 (m,, CH³, PPG), 3,4 (m, CH, PPG), 3,5 (m, CH², PPG), 3,6 (PEG), 6,1 (d, CHcis= CH-SO²) y 6,4 (d, CHtrans= CH-SO²), 6,85 (dd, CH²= CHSO²-).

Antes de la conjugacion, la PLURONIC-vinilsulfona se dializo contra agua utilizando un tubo de dialisis de celulosa regenerada con un corte de peso molecular de 6-8 kDa durante dias. El material se recupero mediante liofilizacion y se mide la RMN para confirmar que esta etapa no influye en el numero de grupos vinilsulfona. La conjugacion de OVA se realiza anadiendo 300 mg (0,023 mmol) de PLURONIC-vinilsulfona a una solucion de 50 mg (0,0011 mmol) de OVA en un tampon de fosfato de sodio 0,1 M (pH = 8,1). Despues de reaccionar durante 6 horas a 4 °C, la mezcla de reaccion se liofilizo. Se anade diclorometano y la mezcla turbia se centrifuga a 12000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. El diclorometano, que contiene PLURONIC-vinilsulfona sin reaccionar, se elimina y el precipitado se seca a presion reducida para eliminar el diclorometano residual. La PL-VS-OVA se almaceno despues a -20 °C hasta que se uso para la sintesis de nanoparticulas.

Las particulas se sintetizaron tal como se describe en el presente documento con la diferencia de que el 2% en peso de Pluronic se reemplazo por PL-VS-OVA. Se utilizo una cantidad total del 1,5% de PLURONIC con respecto al PPS (peso/volumen). Con el fin de reducir la exposicion de la proteina o los peptidos a las condiciones basicas durante la sintesis de las nanoparticulas, el tiempo de reaccion se redujo a 6 h y la base se anadio a una relacion molar de 1:1 con respecto a tioles iniciadores.

Ademas, la PL-VS-OVA puede marcarse de forma fluorescente con rodamina-yodoacetamida haciendo reaccionar los tioles libres remanentes en la OVA. Las nanoparticulas se pueden sintetizar y marcar con fluoresceinayodoacetamida para producir nanoparticulas conjugadas con OVA doblemente marcadas, marcandose OVA con rodamina y nanoparticulas con fluoresceina.

Las nanoparticulas conjugadas con OVA doblemente marcadas se inyectaron por via intradermica en ratones tal como se describe en el presente documento. Despues se extrajeron los ganglios linfaticos a las 24 y 48 h despues de la inyeccion, a continuacion se congelaron y se crioseccionaron. Las secciones de los ganglios linfaticos se observaron por medio de microscopia de fluorescencia.

Se realizo una dispersion dinamica de la luz sobre nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC conjugadas con OVA y se demostro que el tamano se mantenia a ~25 nm. Las nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC conjugadas con OVA doblemente marcadas estaban presentes en los ganglios linfaticos a las 24 y 48 h despues de la inyeccion, tal como se demuestra en la figura 11. La OVA estaba presente en las mismas ubicaciones que las nanoparticulas. Estos resultados demuestran que la funcionalizacion de las nanoparticulas con un antigeno proteico OVA de ~43 kDa de PM no afecta significativamente al tamano de las nanoparticulas. La capacidad de producir nanoparticulas conjugadas con OVA de 25 nm permite que el antigeno proteico se administre a traves de los vasos linfaticos a las CD de los ganglios linfaticos. Este suministro de antigeno a las CD de los ganglios linfaticos residentes ofrece la posibilidad de mejorar la respuesta inmunitaria adaptativa subsiguiente. La OVA se presenta a este respecto simplemente como un antigeno modelo ejemplar. Se puede utilizar de forma analoga cualquier cantidad de antigenos moleculares, incluidos peptidos, proteinas, incluidos glucopeptidos, y acidos nucleicos que codifican antigenos proteicos.

Ejemplo 13: Maduracion de CD inducida por OVA conjugada a nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC Se inyectaron por via intradermica en ratones tal como se describe en el presente documento nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC conjugadas con OVA de 25 nm y OVA mezclada con lipopolisacarido (LPS). Despues se recogieron los ganglios linfaticos y las celulas se aislaron y se tineron para CD11c, CD86, CD80 y CD40 tal como se describe en el presente documento. Se realizo una citometria de flujo para determinar el perfil de maduracion de las CD de los ganglios linfaticos.

Tal como se muestra en la figura 12, los perfiles de CD86, CD80 y CD40 para nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC conjugadas con OVA de 25 nm en comparacion con el control positivo OVA con LPS son casi iguales. Ambos muestran una expresion elevada de estos marcadores de maduracion de CD. Estos resultados muestran que la respuesta de maduracion de CD in vivo es casi la misma para OVA administrado mediante nanoparticulas de 25 nm estabilizadas con PLURONIC y para OVA inyectado conjuntamente con la senal de peligro molecular LPS. Esto sugiere la posibilidad de usar OVA conjugada a nanoparticulas pequenas, por ejemplo de 20-45 nm, que esten hidroxiladas y que activen el complemento, por ejemplo, formadas mediante la estabilizacion con PLURONIC de nanoparticulas de PPS, como vehiculos de administracion de antigeno y adyuvantes de estimulo de maduracion. Ejemplo 14: Proliferacion de celulas T

Se uso un procedimiento conocido como transferencia adoptiva de celulas T para medir la proliferacion de celulas T. Los ratones OT-II Tg (Jackson Immunoresearch) son transgenicos en el sentido en que tienen un nivel regulado al alza del receptor de celulas T OVA en celulas T CD4. Se aislaron el bazo y los ganglios linfaticos de ratones OT-II Tg para producir suspensiones celulares. Para las suspensiones de celulas del bazo, los globulos rojos se lisaron con el 1,667% de NH4Cl. Se agruparon las celulas del bazo y los ganglios linfaticos y se realizo un recuento: un total de 400 x 106 celulas recuperadas.

Las celulas se marcaron con ester succinimidilico de carboxifluorosceina (CFSE) y se resuspendieron a 20 x 106/ml en RPMI sin FBS. La solucion madre de CFSE era 5 mM en DMSO. Se realizo una primera dilucion 1/10 en PBS y se anadio el volumen necesario a las celulas para tener una concentracion final de 5 pM. Se anadio CFSE, se mezclo suavemente y se incubo con las celulas a 37 °C durante 10 minutos y se dejo con la tapa abierta y se mezclo suavemente aproximadamente cada 2 minutos (las celulas se dividieron en 2 tubos para evitar la formacion de coagulos y la muerte celular). Despues de la incubacion, se anadio RPMI con FBS al 5% para lavar las celulas, se lavo 1 x con RPMI sin FBS y 1x con PBS. Se realizo un recuento de celulas despues del marcado con CFSE para un total de 300 x 106 celulas.

Las celulas se resuspendieron en PBS a 50 x 106/ml, y se inyectaron 10 x 106 celulas (200 pl/raton) en la vena de la cola de ratones receptores congenicos CD45.1. Se mantuvo una fraccion de celulas para la verificacion mediante citometria de flujo del marcado con CFSE y la proporcion de celulas T CFSE+ inyectadas. Las celulas se tineron con CPA anti-CD4.

El dia 2, se inyectaron 20 pl de antigeno (OVA a 10 ug 5 ug en LPS o nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC conjugadas a OVA de 25 nm a 10 ug) en las almohadillas de las patas delanteras de los ratones receptores. El dia 5, los ratones se sacrificaron y de cada raton se extrajeron los ganglios linfaticos braquiales y axilares y se agruparon para formar suspensiones celulares. Las celulas se tineron para CD45.2 PE, yoduro de propidio (celulas muertas) y aloficocianina CD4. Se realizo una citometria de flujo para medir la proliferacion de celulas T.

La figura 13 (izquierda) muestra que despues de una inyeccion de PBS, todas las celulas T OT-II marcadas con CFSE se mantuvieron en un nivel de fluorescencia maximo. Sin embargo, despues de la inyeccion del control positivo OVA con LPS (centro) y OVA conjugado a nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC (y, por tanto, hidroxiladas) de 25 nm, se produce una disminucion significativa en la fluorescencia de las celulas T CD4. Esta disminucion en la fluorescencia es indicativa de poblaciones hijas de celulas, que muestran menos fluorescencia que las poblaciones progenitoras. Hubo aproximadamente 7 ciclos de proliferacion despues de la inyeccion de OVA con LPS u OVA conjugado con nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC.

Los ratones OT-II son transgenicos en el sentido de que poseen celulas T CD4 que regulan al alza el receptor de celulas T para OVA. Por lo tanto, estas celulas T son extremadamente sensibles cuando se encuentran con el antigeno OVA. Por lo tanto, la transferencia adoptiva de celulas T OT-II marcadas con CFSE en ratones WT constituye un modelo excelente para medir la proliferacion de celulas T in vivo.

En el presente documento se demuestra que las CD de los ganglios linfaticos maduran despues de la administracion de OVA conjugado a nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas) de 25 nm. Estos resultados muestran ahora que despues de esta internalizacion de nanoparticulas, el antigeno OVA se procesa al menos parcialmente a traves de la ruta MHC-II y su peptido antigenico es presentado por las CD maduras a las celulas T CD4. Las celulas T CD4, a su vez, se activan y proliferan. Las celulas T CD4 activadas son capaces de ayudar a las respuestas inmunitarias adaptativas (por ejemplo, presentando antigeno a las celulas B para la induccion de la produccion de anticuerpos). Nuestros resultados demuestran que la OVA conjugada a las estabilizadas con PLURONIC (y por lo tanto, hidroxiladas y activadoras del complemento) de 25 nm es capaz de inducir la proliferacion de celulas T a un nivel muy similar al control positivo OVA con LPS. Esto es significativo ya que sugiere que se produciran mas respuestas inmunitarias mediadas por celulas T.

Ejemplo 15: Memoria de celulas T CD8-mediciones de inmunidad celular

Se inyectaron 25 nm nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC conjugadas con OVA, OVA en PBS y OVA con LPS en ratones C57/BL6 tal como se describe en el presente documento. Los ratones recibieron una inyeccion de refuerzo a los 7 dias. A los 21 dias, los ratones se sacrificaron y se extrajeron los ganglios linfaticos y las celulas se aislaron tal como se describe en el presente documento. Se realizo un recuento de las suspensiones celulares usando un hemocitometro.

Se preparo una placa ELISPOT para IFN- ^y (eBioscience) segun el protocolo del fabricante. Se anadieron medios RPMI con suero de raton al 10% a cada pocillo a 20 gl/pocillo. A continuacion, se anadieron 2 unidades de IL-2 y 0,4 gg de CD28 a cada pocillo. A continuacion, se anadieron 20 gl/pocillo de peptido OVA323-33g MHC-I a una concentracion de 2 mM. Luego se anadieron celulas a los pocillos a 100 gl/pocillo. Algunos pocillos no recibieron peptido OVA, como control no estimulado, mientras que otros pocillos recibieron PMA como control positivo. La placa se mantuvo en una incubadora a 37 °C durante 2 dias. Despues de 2 dias, la placa ELISPOT se desarrollo segun el protocolo del fabricante. Se tomaron imagenes de los pocillos con el estereoscopio Leica MZ16FA. Los puntos en los pocillos se contaron con el programa de analisis de imagenes Matlab.

Tal como se muestra en la figura 14, despues de la inmunizacion de ratones, se utilizo un ensayo ELISPOT para determinar la cantidad de celulas T CD8 productoras de IFN- ^y (medidas por medio de manchas en la placa) despues de la reexposicion al antigeno. Los ratones que recibieron inyecciones de OVA en PBS mostraron cifras muy redicidas de celulas T IFN- ^y , mientras que hubo un aumento significativo en ratones a los que se inyecto OVA conjugada a nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y por lo tanto, hidroxiladas y activadoras del complemento) de 25 nm y control positivo OVA con LPS. De forma coherente con otros resultados presentados en el presente documento, la OVA conjugada a nanoparticulas muy pequenas (por ejemplo, 20-45 nm) que son activadoras del complemento (por ejemplo, nanoparticulas de ^p P^s estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas)) son capaces de inducir la maduracion de CD y la proliferacion de celulas T CD4. En el presente documento mostramos que la OVA conjugada a nanoparticulas de 25 nm estabilizadas con PLURONIC puede producir de forma suficiente memoria de celulas T CD8. Las celulas T CD8 responden al antigeno procesado y presentado por la ruta MHC-I. La ruta MHC-I se asocia generalmente con el antigeno que se procesa en el citoplasma de las CD. Esto sugiere que las nanoparticulas pueden suministrar antigeno para el procesamiento y presentacion de MHC-I y -II. Las celulas T CD8 tambien se conocen como celulas T asesinas citotoxicas, dado que atacan directamente al patogeno y a las celulas infectadas por patogenos. Por lo tanto, la capacidad de las nanoparticulas activadoras del complemento pequenas (por ejemplo, 20-45 nm) (por ejemplo, estabilizadas con PLURONIC) para producir memoria de celulas T CD8 muestra un gran potencial para utilizarla en vacunas.

Ejemplo 16: Titulos de anticuerpos (Ab) de inmunidad humoral

Se inyectaron en ratones C57/BL6 tal como se ha descrito anteriormente nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA de 25 nm, nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y, por tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA de 100 nm, nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi (y, por lo tanto, no hidroxiladas) conjugadas con OVA de 25 nm, OVA en PBS y OVA con LPS. Se inyectaron en ratones C3-/- nanoparticulas estabilizados con PLURONIC (y por lo tanto, hidroxiladas) conjugadas con OVA de 25 nm y OVA con LPS. El suero se aislo de sangre tomada de ratones antes de las inyecciones y a los 21 d despues de la inyeccion y se almaceno a -20 °C hasta su uso. No hubo inyecciones de refuerzo.

Se recubrieron placas de 96 pocillos (Becton Dickinson) con OVA en PBS (2 gg/ml) a 100 gl/pocillo. Las placas se dejaron toda la noche a temperatura ambiente (TA). El antigeno no unido se retiro mediante sacudida y la placa se lavo 3x con 200 gl/pocillo de agua DI. Las placas se bloquearon despues durante 1,5 horas a TA con 200 gl/pocillo de tampon de bloqueo.

Las muestras de suero de raton se diluyeron de forma seriada a partir de 1:103 hasta 1:108 en tampon de bloqueo. Cuando las placas terminaron de bloquearse, se lavaron 3x con 150 gl/pocillo de tampon de lavado. Despues se anadieron muestras de suero a los pocillos a 50 gl/pocillo durante 2 horas a TA. Las muestras de suero preinyectadas se anadieron por triplicado. Las muestras se retiraron despues mediante sacudida y la placa se lavo con tampon de lavado 5x a 150 gl/pocillo. Se diluyo HRP anti-IgG de raton en tampon de bloqueo 1:3000 y se anadio a 50 gl/pocillo durante 2 horas a TA. El anticuerpo HRP se desprendio despues y la placa se lavo con tampon de lavado 5x a 150 gl/pocillo. A continuacion, se anadio reactivo de sustrato HRP (R&D systems) a 100 gl/pocillo en la oscuridad durante 45 minutos a TA. La reaccion se detuvo mediante la adicion de 50 pl/pocillo de H2SO42 N. Despues se midio la absorbancia de la placa en el lector de placas Tecan a 450 nm y 540 nm de longitud de onda. Los valores de fondo de 540 nm se restaron de 450 nm para obtener los valores finales. Se determino una muestra positiva si el valor del suero despues de la inyeccion era superior a un valor de corte. El valor de corte se calculo a partir del promedio por triplicado preinyectado mas la desviacion estandar multiplicada por 3. La dilucion mas elevada con un valor positivo se considera el valor del titulo del anticuerpo (Ab).

Los titulos logi⁰ de Ab IgG OVA se determinaron en ratones a los que se inyectaron diversos tratamientos, tal como se muestra en la figura 15. Los ratones a los que se inyecto el control negativo de OVA con PBS no mostraron titulos positivos. Los ratones a los que se inyecto el control positivo de OVA con LPS mostraron titulos positivos entre 3-6 en ratones tanto de tipo silvestre como C3-/-. Las inyecciones de OVA conjugada con nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC de 25 nm produjeron titulos de 4, mientras que las inyecciones de OVA conjugada con nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC de 100 nm y OVA conjugada con nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi de 25 nm produjeron valores de titulos mas bajos. Finalmente, los titulos de Ab de los animales tratados con OVA conjugada con nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC de 25 nm fueron significativamente menores en ratones C3-/-.

La presencia de titulos de Ab OVA IgG es evidencia de inmunidad humoral. Una ruta para que se produzca este proceso es cuando las CD procesan antigeno y lo presentan a celulas T CD4, que despues estimulan las celulas B para producir anticuerpos contra el antigeno. Se sabe que el suministro de antigeno proteico libre en ausencia de senales de peligro no es capaz de inducir de forma significativa inmunidad humoral, y nuestros resultados demuestran esto dado que OVA en PBS no produce titulos positivos. Sin embargo, un control positivo de OVA con LPS muestra un nivel significativo de titulos tanto en ratones de tipo silvestre como en ratones C3-/-. Hemos demostrado en el presente documento que OVA conjugada a nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC (y, por lo tanto, hidroxiladas y activadoras del complemento) de 25 nm puede inducir la maduracion de CD, la proliferacion de celulas T y memoria de celulas T CD8. En el presente documento mostramos que OVA conjugada a nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC (y por lo tanto, hidroxiladas y activadoras del complemento) de 25 nm tambien puede inducir inmunidad humoral mediante la produccion de titulos de IgG anti-OVA. Las OVA conjugadas con nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC de 100 nm no producen titulos positivos, lo que demuestra que el direccionamiento a los ganglios linfaticos es crucial para la inmunidad humoral inducida por nanoparticulas. Tambien las OVA conjugadas a nanoparticulas estabilizadas con PLURONIC terminado en metoxi de 25 nm, que activan el complemento en una medida mucho menor, muestran valores de titulos de anticuerpos reducidos, lo que demuestra que el control de la quimica de superficie tambien es necesario para producir una respuesta inmunitaria fuerte de este tipo, mediada por la activacion del complemento. Finalmente, se muestra que la activacion del complemento desempena un papel significativo en la induccion de inmunidad humoral, dado que las OVA conjugadas a nanoparticulas de PPS estabilizadas con PLURONIC de 25 nm producen valores de titulo mucho mas bajos en ratones C3-/- que en ratones de tipo silvestre.

Estos resultados demuestran que las nanoparticulas de las diversas formas de realizacion que se fabrican tal como se describe en el presente documento tienen un tamano especial para operar a traves del direccionamiento a los ganglios linfaticos y una quimica de superficie especial, es decir, capaz de llevar a cabo la activacion del complemento (por ejemplo, hidroxilada, que puede obtenerse mediante la estabilizacion con PLURONIC y otros medios), se pueden utilizar para producir una fuerte inmunidad humoral dependiente de celulas T con un antigeno coinyectado. Lo que se demuestra en el presente documento es el caso en el que el antigeno se conjuga con la superficie de las nanoparticulas; los procedimientos de adsorcion para unir el antigeno a la superficie de las nanoparticulas tambien seran eficaces. La inyeccion de antigeno con dichas nanoparticulas tambien deberia ser eficaz, aunque quizas en menor medida.

Ejemplo 17: Carga de farmaco hidrofobo

La carga de farmacos hidrofobos, por ejemplo dexametasona, se logro mediante un procedimiento de evaporacion con disolvente adaptado [132,133]. En resumen, y a modo de ejemplo, el farmaco se anadio al disolvente diclorometano (1 mg/ml). Despues se anadio 1 ml de suspension de farmaco-disolvente a 1 ml de solucion de nanoparticulas de PPS a 20 mg/ml. Las emulsiones se agitaron continuamente en la oscuridad a temperatura ambiente para evaporar el disolvente. La eficacia de carga del farmaco se midio por GPC.

Estadistica

La significancia estadistica en los ejemplos se determino mediante la realizacion de un ensayo t de Student de dos colas. Los resultados indican la media ± SD y se realizaron 3-8 experimentos para cada una de las condiciones. Referencias

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composicion de nanoparticulas que comprende: una coleccion aislada de particulas sinteticas que comprenden un antigeno y un polimero sintetico que comprende polietilenglicol eficaz para activar la maduracion de celulas dendriticas, en la que la coleccion tiene un diametro medio de particula de 20 nm a 70 nm.

2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que la coleccion tiene un diametro medio de particula de 20-45 nm.

3. La composicion de la reivindicacion 1 o 2, en la que el antigeno esta unido covalentemente a la particula.

4. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el polimero sintetico carece de senales de peligro biologico.

5. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polimero sintetico comprende el polietilenglicol y ademas una porcion hidrofoba que se adsorbe en una porcion hidrofoba de un segundo polimero biodegradable que forma el nucleo de la nanoparticula para unir de esta forma el polimero sintetico al nucleo.

6. La composicion de la reivindicacion 5, en la que el segundo polimero es poli(sulfuro de propileno).

7. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el antigeno es un polipeptido.

8. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, comprendiendo ademas las particulas una senal de peligro elegida del grupo que consiste en citoquinas inflamatorias y ligandos para receptores tipo Toll.

9. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el antigeno esta unido covalentemente a la particula y el polimero sintetico carece de secuencias de aminoacidos o secuencias de sacaridos que activan el complemento.

10. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el polimero sintetico comprende al menos un bloque hidrofobo y al menos un bloque hidrofilo del polietilenglicol, en la que el copolimero sintetico se autoensambla en soluciones acuosas formando las particulas.

11. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que las particulas son biodegradables.

12. El uso de la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para la fabricacion de un medicamento para estimular un sistema inmunitario de un paciente.

13. La composicion de las reivindicaciones 1 a 11, en la que las particulas comprenden ademas un farmaco inmunosupresor.