ES2710099T3 - Progenie de células precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP) y sus usos - Google Patents

Abstract

Un procedimiento in vitro para aumentar la generación de progenie de células precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP) que tienen el fenotipo Stro-1bri, ALP-, comprendiendo el procedimiento el cultivo de células progenitoras mesenquimales STRO-1brightALP+ (MPC) en presencia de uno o más factores estimulantes seleccionados de entre el grupo que consiste en 1α,25-dihidroxivitamina D3(1,25D), factor de necrosis tumoral α (TNF-α) e interleucina-1ß (IL-1ß).

Description

DESCRIPCION

Progenie de celulas precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP) y sus usos

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a la progenie de celulas precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP por sus siglas en ingles). La presente invencion tambien se refiere a procedimientos para producir MEMP y a usos de las MEMP para aplicaciones terapeuticas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las celulas progenitoras no hematopoyeticas que residen en el cuerpo y dan lugar a celulas multipotenciales cuando se las afsla se denominan celulas precursoras mesenquimales (MPC por sus siglas en ingles). Mas espedficamente, las MPC purificadas son capaces de formar una gran cantidad de colonias celulares multipotenciales.

Simmons y col. (Advances in Bone Marrow Purging and Processing: Fourth International Symposium, paginas 271­ 280, 1994) describe el enriquecimiento de las MPC a partir de celulas de medula osea recien recolectadas mediante la seleccion de celulas que expresan el marcador de superficie celular STRO-1. Tal como lo explican los autores en las paginas 272-273, se sabe que las celulas de medula osea contienen una proporcion de MPC que son capaces de generar CFU-F. Estas CFU-F a su vez son capaces de generar, en condiciones adecuadas, un amplio espectro de tejido conectivo completamente diferenciado, incluido cartflago, hueso, tejido adiposo, tejido fibroso y estroma mielosoportador.

Las MPC y las CFU-F tfpicamente estan presentes con una incidencia muy baja en las celulas de medula osea (tfpicamente entre 0,05 %-0,001 %) y esta rareza ha sido una gran limitacion para su estudio en el pasado. Un hallazgo importante planteado en la cita de Simmons y col., 1994 (arriba) fue la identificacion de que estas MPC se podnan enriquecer a partir de celulas de medula osea recien aisladas en cierta medida mediante la seleccion de celulas positivas STRO-1. En particular, la seleccion de celulas positivas STRO-1 permitio el aislamiento de las MPC (y las CFU-F resultantes) libre de progenitores hemopoyeticos contaminantes.

El documento WO 01/04268 (Simmons y col.) proporciono otro avance importante en el enriquecimiento de las MPC mediante la identificacion de una subpoblacion dentro de esta fraccion de celulas positivas STRO-1 que contienen MPC. En particular, el documento WO 01/04268 describe la clasificacion de la poblacion de celulas positivas STRO-1 en tres subconjuntos: STRO-1duN, STRO-1intermediate y STRO-1bright. Los ensayos clonogenicos para CFU-F en las subpoblaciones clasificadas diferentes demostraron que la amplia mayona de las MPC estan presentes dentro de la fraccion de STRO-1bright.

El documento WO 2004/085630 (Gronthos y col.) describe por primera vez que las MPC estan presentes en el tejido perivascular. Uno de los beneficios de este hallazgo es que amplfa en gran medida el intervalo de tejidos de origen de los cuales se pueden aislar MPC o enriquecer y ya no existe una restriccion eficaz de la fuente de m Pc para la medula osea. Los tejidos de los cuales se pueden aislar MPC de acuerdo con los procedimientos descritos en la presente en el documento WO 2004/085630 incluyen medula osea humana, pulpa dental, tejido adiposo, piel, bazo, pancreas, cerebro, rinon, tngado y corazon. Las MPC aisladas de tejido perivascular son positivas para el marcador de superficie celular 3G5. Por lo tanto, se pueden aislar mediante el enriquecimiento de las celulas que poseen el marcador 3G5 o mediante el enriquecimiento para un marcador de superficie de desarrollo temprano presente en las celulas perivasculares como CD146 (MUC18), VCAM-1 o mediante enriquecimiento para la expresion de nivel alto del marcador de superficie celular STRO-1.

Se han descrito procedimientos para propagar las MPC aisladas in vitro (Gronthos y col. Journal of Cell Science 116: 1827-1835, 2003). La vision generalmente aceptada, sin embargo, es que la expansion de MPC in vitro produce la perdida de su naturaleza progenitora a traves de la diferenciacion.

Gronthos y col. (Blood, American Society of Hematology, EE.UU., tomo 85, n.° 4, 929-940, febrero de 1995) describen una poblacion de celulas madre estromales de medula osea adulta (BMSSC por sus siglas en ingles) o celulas madre mesenquimales. Las celulas expresan el marcador Stro-1. Las celulas son estimuladas por el agregado de una combinacion de EGF y PDGF-BB.

RESUMEN DE LA INVENCION

Los presentes inventores han realizado ahora el sorprendente hallazgo de que las MPC expandidas ex vivo generan una subpoblacion de progenie que conserva la multipotencialidad. Esta subpoblacion de progenie de MPC son celulas Stro-1bri y se denominan en la presente progenie de MPC expandidas multipotenciales (MEMP).

Los presentes inventores tambien han realizado el sorprendente hallazgo de que las MEMP son capaces de estimular la proliferacion de celulas comprometidas espedficas del tejido (TSCC por sus siglas en ingles) in vitro e in vivo. Por lo tanto, las MEMP tienen un uso potencial en una amplia gama de aplicaciones terapeuticas en las que se requiere la generacion o la reparacion de tejidos.

En consecuencia, la presente invencion proporciona un procedimiento in vitro para aumentar la generacion de progenie de celulas precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP) que tienen el fenotipo Stro-1bri, ALP-, comprendiendo el procedimiento el cultivo de celulas progenitoras mesenquimales STRO-1brightALP+ (MPC) en presencia de uno o mas factores estimulantes seleccionados de entre el grupo que consiste en 1a,25-dihidroxivitamina D3(1,25D), factor de necrosis tumoral a (TNF-a) e interleucina-1p (IL-1p).

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Perfil de expresion genica de celulas que expresan STRO-1bri o STRO-1dim derivadas de MPC cultivadas. Se prepararon suspensiones de celulas unicas de MPC de medula osea expandidas ex vivo mediante tratamiento con tripsina/EDTA. Se tineron las celulas con el anticuerpo STRO-1 que despues se revelo mediante incubacion con IgM antimurina de cabra-isotiocianato de fluorescema. Se preparo ARN celular total a partir de poblaciones purificadas de celulas que expresan STRO-1dim o STRO-1bri, despues de la clasificacion celular activada por fluorescencia (A). Utilizando el procedimiento de extraccion RNAzolB y procedimientos estandar, se aislo ARN total de cada subpoblacion y se utilizo como una plantilla para la smtesis de ADNc. Se evaluo la expresion de diversas transcripciones mediante amplificacion por PCR utilizando un protocolo estandar tal como se describio anteriormente (Gronthos y col. Journal of Cell Science 116: 1827-1835, 2003). Los conjuntos de cebadores utilizados en el presente estudio se muestran en la tabla 2. Despues de la amplificacion, se analizo cada mezcla de reaccion por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y se visualizo por tincion con bromuro de etidio (B). Se evaluo la expresion genica relativa para cada marcador celular con referencia a la expresion del gen constitutivo, GAPDH, utilizando el software ImageQant (C).

Figura 2. Patron de expresion inmunofenotfpica de celulas expandidas ex vivo derivadas de MPC de medula osea. Se prepararon suspensiones de celulas unicas de celulas expandidas ex vivo derivadas de MPC de medula osea mediante desprendimiento de tripsina/EDTA y posteriormente se incubaron con el anticuerpo STRO-1 junto con anticuerpos que identifican una amplia gama de marcadores asociados con el linaje celular. Se identifico STRO-1 utilizando IgM antimurina de cabra-isotiocianato de fluorescema, mientras que se identificaron todos los otros marcadores utilizando IgG antirraton o anticonejo de cabra-ficoeritrina. Para los anticuerpos que identifican antfgenos intracelulares, las preparaciones de celulas primero se marcaron con el anticuerpo STRO-1, se fijaron con etanol al 70 % frio para permeabilizar la membrana celular y despues se incubaron con anticuerpos espedficos del antfgeno intracelulares. Se utilizaron anticuerpos de control de isotipo coincidente en condiciones identicas. Se realizo analisis de citometna de flujo de color doble utilizando un citometro de flujo COULTER EPICS y se recogieron los datos de modo de lista. Las graficas de puntos representan 5.000 eventos de modo de lista que indican el nivel de intensidad de fluorescencia para cada marcador de celulas de linaje (eje y) y STRO-1 (eje x). Los cuadrantes vertical y horizontal se establecieron con referencia a los anticuerpos de control negativo de isotipo coincidente.

Figura 3. Desarrollo adipogenico in vitro. Se generaron suspensiones de celulas unicas mediante digestion de tripsina/EDTA a partir de cultivos secundarios de celulas expandidas ex vivo derivadas de celulas de medula osea clasificadas por STRO-1bri/VCAM-1+. Despues, se aislaron las celulas expandidas de acuerdo con su expresion de STRO-1 utilizando clasificacion de celulas activadas por fluorescencia de color unico como se muestra en la figura 1A. Las celulas derivadas de MPC clasificadas por STRO-1bri y STRO-1dim despues se colocaron en placas durante la noche, en placas de 6 pocillos, a una densidad de 1 x 105 celulas por pocillo en un medio de cultivo regular. Al dfa siguiente, se reemplazo el medio de cultivo con medio inductivo adipogenico tal como se describe en los procedimientos. Los cultivos se alimentaron dos veces por semana a partir de entonces durante un penodo total de tres semanas, momento en el que se fijaron las celulas y se tineron con aceite rojo O. Se muestran amplificaciones de potencia baja (4x) y alta (20x) que ilustran tincion de aceite rojo O de adipocitos que contienen lfpidos dispersos a traves de las capas estromales adheridas. Se identificaron, en promedio, 22 ± 5 adipocitos positivos de aceite rojo O en los cultivos de STRO-1bri (por area de unidad a 20x, n = 9 campos) en comparacion con 7 ± 2 adipocitos (por area de unidad a 20x, n = 9 campos) en los cultivos de STRO-1dim.

Figura 4. Desarrollo osteogenico in vitro. Se generaron suspensiones de celulas unicas mediante digestion de tripsina/EDTA a partir de cultivos secundarios de celulas expandidas ex vivo derivadas de celulas de medula osea clasificadas por STRO-1bri/VCAM-1+. Despues, se aislaron las celulas expandidas de acuerdo con su expresion de STRO-1 utilizando clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) de color unico como se muestra en la figura 1A. Las celulas aisladas por FACS de STRO-1bri y STRO-1dim despues se colocaron en placas durante la noche, en placas de 48 pocillos, a una densidad de 0,3 X 105 celulas por pocillo en un medio de cultivo regular (cuatro replicas por condicion). Al dfa siguiente, se reemplazo el medio de cultivo con medio inductivo osteogenico tal como se describe en los procedimientos. Los cultivos se alimentaron dos veces por semana a partir de entonces durante un penodo total de tres semanas, momento en el que se lavaron las celulas y despues se trataron con HCl 0,6 N para extraer el calcio dentro de los depositos mineralizados. Se hicieron reaccionar las muestras con o-cresol-ftalema-complexona y se leyo la reaccion colorimetrica a 570 nm. La concentracion de calcio absoluta se determino de acuerdo con una curva estandar para el calcio. (A) Las mediciones de calcio mostraron que los cultivos de STRO-1bri sintetizaron significativamente (*; p < 0,05; prueba t) mas mineral en comparacion con los cultivos de STRO-1dim. Se fijaron los cultivos replicados y se tineron para tincion de rojo Alizarina y presentaron niveles tfpicos de depositos mineralizados en las capas adheridas de los cultivos de STRO-1bri(B) y STRO-1dim(C).

Figura 5. Desarrollo condrogenico in vitro. Se generaron suspensiones de celulas unicas mediante digestion de tripsina/EDTA a partir de cultivos secundarios de celulas expandidas ex vivo derivadas de celulas de medula osea clasificadas por STRO-1briNCAM-1+. Despues, se aislaron las celulas expandidas de acuerdo con su expresion de STRO-1 utilizando clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) de color unico como se muestra en la figura 1A. Las celulas aisladas por FACS de STRO-1bri y STRO-1dim despues se sedimentaron en tubos de polipropileno a una densidad de 2,5 x 105celulas por tubo y se cultivaron en medios inductivos condrogenicos. Los cultivos se alimentaron dos veces por semana a partir de entonces durante un penodo total de tres semanas. Se recuperaron los sedimentos celulares y se utilizaron para examen histologico o preparacion de ARN total tal como se describe en los procedimientos. Las poblaciones celulares de STRO-1bri(A) y STRO-1dim(B) fueron capaces de formar sedimentos celulares que conteman celulas tipo condrocitos. Los analisis de RT-PCR indicaron que la poblacion de STRO-1bri(SB) demostro niveles mas altos de los genes asociados con el cartflago, colageno tipo X y agrecano en comparacion con la poblacion de celulas (C) STRO-1dim(SD).

Figura 6. Las celulas STRO-1bri inducen la proliferacion de celulas STRO-1dim.Se prepararon suspensiones de celula unica de MPC de medula osea expandidas ex vivo mediante tratamiento con tripsina/EDTA. Se tineron las celulas con el anticuerpo STRO-1 y se clasificaron en poblaciones de STRO-1dim o STRO-1bri con expresion de poblaciones celulares cultivadas tal como se describe en la figura 1. Se marcaron las celulas con CFSE tal como se describe en los procedimientos. Las celulas no marcadas se utilizaron para establecer un control negativo (autofluorescencia). Se utilizo Colcemid® (100 ng/ml) para inhibir la division celular y proporciono un mdice de marcado de entrada (generacion 0). Posteriormente, se agregaron STRO-1bri no marcadas nuevamente a las celulas STRO-1dim marcadas con CFSE en una proporcion de (A) 0 celulas STRO-1bri : 1x105 celulas STRO-1dim (0 %); (B) 0,05 x 105 celulas STRO-1bri : 0,95x105 celulas STRO-1dim (5 %); (C) 0,1x105celulas STRO-1bri : 0,9x105 celulas STRO-1dim (10 %); (D) 0,2x105celulas STRO-1bri : 0,8x105 celulas STRO-1dim (20 %); (E) 0,5x105 celulas STRO-1bri : 0,5x105 celulas STRO-1dim (50 %). Las mezclas de adicion se cultivaron durante un penodo de 7 dfas, se cosecharon y se analizaron mediante citometna de flujo, tal como se describe en los procedimientos. Se analizo la proliferacion celular utilizando el ModFit LT para win 32 (Version 2.0). Se descubrio que las celulas STRO-1bri (R1) estimulaban la proliferacion de las celulas STRO-1dim de forma dependiente de la dosis.

Figura 7. Las citocinas y los agentes osteotropicos aumentan la cantidad de celulas STRO-1bri en cultivo. Se cultivaron los cultivos establecidos de MPC en medio basal complementado con FCS al 10 % (A), o una gama de factores, incluidos 1x10'8 M 1a,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D) (B), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) 10 ng/ml (C), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a) 10 ng/ml (D); interleucina-1p 10 ng/ml (IL-1p) (E) y factor derivado de estroma 1-alfa (SDF-1a) 30 ng/ml (F) durante 5 dfas, tenido con mAb STRO-1 y analizado tal como se describio arriba. Se descubrio que estos factores aumentan la cantidad de MPC STRO-1bri. Los resultados que se muestran son un ejemplo representativo de 3 experimentos independientes.

Figura 8. Ratas lampinas atfmicas se sometieron a ligacion de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y se inyectaron 48 horas mas tarde con solucion salina, 1x106 celulas Stro-1dim humanas, 1x106 celulas Stro-1bri humanas o 1x106 celulas mononucleares de medula osea con agotamiento de Stro-1 humano. Dos semanas despues, se sacrifico a los animales y se fijaron los tejidos cardfacos y se tineron de forma concomitante con dos anticuerpos monoclonales: el primero fue reactivo selectivamente con antfgeno Ki67 de rata, pero no de humano, y el segundo fue reactivo con el marcador de cardiomiocitos troponina I. Las celulas doblemente tenidas, que indican la proliferacion de cardiomiocitos de rata, se detectaron mediante tecnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron 1 x 106 celulas humanas Stro-1bri presentaron cantidades 2,5-5 veces mayores de cardiomiocitos de rata proliferantes en comparacion con los animales de control que recibieron solucion salina o 1 x 106 celulas humanas Stro-1dim (p < 0,05).

Figura 9. Se inyectaron por via subcutanea ratas lampinas atfmicas con celulas tumorales de glioblastoma de rata, que secretan VEGF de forma constitutiva. Dos semanas despues, las ratas recibieron inyecciones intratumorales con solucion salina, 0,5 x 106 celulas Stro-1dim humanas o 0,5 x 106 celulas Stro-1bri humanas. Una semana despues, se sacrificaron los animales y se fijaron los tejidos tumorales y se tineron concomitantemente con dos anticuerpos monoclonales: el primero es reactivo con el antfgeno de actina de musculo liso alfa expresado por celulas de musculo liso y el segundo es reactivo con el antigeno vWF expresado por celulas endoteliales vasculares. Las estructuras doblemente tenidas, que indican arteriolas y arterias que contienen endotelio y musculo liso, fueron detectadas mediante la tecnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron 0,5 x 106 celulas humanas Stro-1bri demostraron cantidades 3,5-8 veces mayores de arteriolas y arterias en el sitio de inyeccion celular en los tumores en comparacion con los animales de control que recibieron solucion salina o 1x106 celulas humanas Stro-1dim (p < 0,05). No se observaron diferencias en los sitios distales del lugar donde se inyectaron las celulas humanas.

Figura 10. IL-1p aumenta el potencial proliferativo de las celulas expandidas a partir de MPC. Se marcaron las celulas con c Fs E tal como se describe en los procedimientos. Posteriormente, se cultivaron las celulas en presencia de IL-1p 10 ng/ml durante 5 dfas, se tineron con mAb STRO-1 y ALK PHOS y se analizaron tal como se describe arriba. (A) Los cultivos no tratados (NT) y (B) tratados con IL-1p presentan un aumento de la cantidad de celulas positivas STRO-1bri/ALP. Este aumento en la expresion de STRO-1 esta acompanado por un aumento en la proliferacion celular tal como se muestra en (C) donde los cultivos no tratados se han sometido a cuatro divisiones celulares, mientras que (D) los cultivos tratados con IL-1p presentan un aumento de la cantidad de divisiones celulares mediante el aumento de la cantidad de celulas osteoprogenitoras STRO-1bri. Los resultados que se muestran son un ejemplo representativo de 3 experimentos independientes. Tambien se obtuvieron resultados similares 1,25D, PDGF-BB, TNF-a, IL-1 p y sDF-1a se utilizaron para estimular las MPC.

Figura 11. IL-ip estimula la proliferacion de MPC y mejora su potencial de formacion de hueso en presencia del agente osteoinductivo, dexametasona. Se sembro la progenie expandida ex vivo humana (A) de MPC en placas de 96 pocillos con una densidad celular de 2.000 celulas/pocillo y se cultivo en a-MEM-10. Se suplementaron los cultivos con IL-1p a las concentraciones indicadas y la cantidad y la viabilidad de las celulas se cuantifico en d7 utilizando WST-1, tal como se describe en los procedimientos. IL-1p a una concentracion de 0,01 ng/ml aumento significativamente la cantidad de celulas a 136,6 ± 1,2 % de cultivos de control no tratados (D, P = 0,000003, prueba t de Student). Se logro un efecto de meseta a concentraciones mayores que 0,1 ng/ml. Los valores representan medios ± SEM de cultivos triplicados de cada concentracion. Se sembro la progenie expandida ex vivo (B y C) de MPC en placas de 24 pocillos a una densidad celular de 5 x 104/pocillo por triplicado, y se cultivo en condiciones osteoinductivas, tal como se describe en los procedimientos. Se trataron las celulas con IL-1p a una concentracion de 10 ng/ml y los cultivos se "alimentaron" semanalmente con medio nuevo que contema IL-1p. Se logro la liberacion de calcio libre de la matriz mediante tratamiento de las capas de celulas adheridas en condicion acida tal como se describe en los procedimientos. Se hicieron reaccionar las muestras con o-cresol-ftalema-complexona y se leyo la reaccion colorimetrica a 570 nm. La concentracion de calcio absoluta se determino de acuerdo con una curva estandar para el calcio. Los resultados mostraron que el deposito mineral aumento en las celulas tratadas con IL-1p (C) en comparacion con las celulas no tratadas (B). El nivel de calcio en las celulas tratadas con IL-1p fue significativamente mayor que en las celulas no tratadas en la semana 4 (**P = 0,00009, prueba t de Student) y la semana 6 (**P = 0,00004, prueba t de Student) (D). Los resultados que se muestran son un ejemplo representativo de 3 experimentos independientes, utilizando celulas de estroma derivadas de tres donantes diferentes.

Figura 12. IL-ip estimula la proliferacion y MPC STRO-1bri, mientras que la dexametasona induce la expresion de fosfatasa alcalina (ALP).Se sembraron cultivos establecidos de MPC humanas en una placa de 24 pocillos a una densidad celular de 3 x 104/pocillo en medio completo suplementado con (A) nada (NT), (B) IL-1p 10 ng/ml o (C) dexametasona 1 x 10'8 M y (D) IL-1p 10 ng/ml y dexametasona 1 x 10'8 M. Se cultivaron las celulas durante 21 dfas tal como se describe en los procedimientos. Los resultados sugieren que la accion mitogenica de IL-1p sirve para aumentar la cantidad de MPC STRO-1bri (B), que a su vez estimula la proliferacion de las celulas STRO-1dim (vease la figura 6). Ademas, MPC adquiere la expresion de ALP en respuesta a FCS y el ascorbato-2-fosfato presente en el medio de cultivo que aumenta en respuesta al glucocorticosteroide, dexametasona (dex) (D). La accion combinada de IL-1p y dex sirve para mejorar la formacion osea tal como se observa en la figura 11. Los experimentos se realizaron tres veces y se observo una tendencia similar en las MPC derivadas de tres donantes diferentes.

Figura 13. Efecto de PDGF sobre la formacion osea in vivo. Se cultivaron cultivos secundarios semiconfluentes de celulas expandidas ex vivo, derivadas de celulas de medula osea clasificadas por STRO-1bri/VCAM-1+ en presencia o ausencia de PDGF-BB (10 ng/ml) durante cinco dfas. Se generaron suspensiones de celulas unicas mediante digestion de tripsina/EDTA, despues se incubaron con 40 mg de partfculas de hidroxiapetita/fosfato tricalcico (HA/TCP) para implante en ratones inmunodeprimidos tal como se describe en los procedimientos. Despues de ocho semanas, se fijaron los trasplantes recolectados y se procesaron para analisis histologico. Se determino el analisis de la nueva formacion osea utilizando el software de imagenologfa Scion por area superficial (20x) de tres trasplantes replicados (A). Los cultivos pretratados con PDGF-BB demostraron una formacion osea significativamente (*; p < 0,05; prueba t) mas ectopica en comparacion con los cultivos no tratados de control. Se muestran imagenes tfpicas que ilustran hueso ectopico tenido con hematoxilina/eosina en secciones transversales que representan trasplantes no tratados (B) y tratados con PDGF (C).

Figura 14: la progenie de celulas precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP) o STRO-1bri/ ALP- MPC persiste en cultivos ex vivo de BM MPC seleccionadas por STRO-1. Se realizo inmunofluorescencia de dos colores y citometna de flujo que analizaron la expresion de STRO-1 y ALP en BM MPC seleccionadas por STRO-1 despues de 4 pasajes de cultivo ex vivo. El histograma de grafico de puntos representa 5 x 104 eventos recogidos como datos en modo de lista. Se establecieron las lmeas vertical y horizontal a niveles de reactividad de < 1,0 % de fluorescencia media obtenidos con los anticuerpos de control de isotipo coincidente, 1B5 (IgG) y 1A6.12 (IgM) tratados en las mismas condiciones.

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS FORMAS DE REALIZACION PREFERIDAS DE LA INVENCION

Los presentes inventores han realizado ahora el sorprendente hallazgo de que las MPC expandidas ex vivo contienen una subpoblacion de celulas que conserva la multipotencialidad. Mas espedficamente, los inventores han descubierto que las poblaciones expandidas derivadas de celulas MPC recolectadas se pueden separar en al menos dos poblaciones basandose en el nivel de expresion del antfgeno reconocido por el anticuerpo STRO-1 en STRO-1bri y STRO-1dim. Los datos funcionales presentados en la presente muestran que las celulas STRO-1bri expandidas estan menos comprometidas y son mas capaces de responder a factores inductivos que apoyan el desarrollo de grasa, el desarrollo de cartflago y el desarrollo de hueso. En cambio, las celulas STRO-1dim representan una poblacion mas diferenciada e incluyen tipos de celulas comprometidas espedficas de tejido (TSCC). Las celulas Stro-1bri dentro de la progenie expandida se denominan en la presente progenie de MPC expandida multipotencial (MEMP).

Los presentes inventores tambien han realizado el sorprendente hallazgo de que las MEMP son capaces de estimular la proliferacion de celulas comprometidas espedficas del tejido (TSCC) in vitro e in vivo. Por lo tanto, las MEMP tienen un uso potencial en una amplia gama de aplicaciones terapeuticas en las que se requiere la generacion o la reparacion de tejidos.

Tal como se usa en la presente, "MPC" son celulas progenitoras no hematopoyeticas que son capaces de formar un gran numero de colonias de celulas multipotenciales.

"Progenie de MPC" significa celulas derivadas de MPC. Preferentemente, la progenie de MPC es la progenie de unidades formadoras de colonias-fibroblastos (CFU-F), que a su vez se deriva de MPC. Mas preferentemente, las celulas que se derivan de MPC o CFU-F mediante expansion o cultivo ex vivo. Preferentemente, el cultivo comprende mas de dos, preferentemente mas de tres y, mas preferentemente, mas de cuatro pasajes. Despues del cultivo o la expansion, se prefiere que la poblacion enriquecida comprenda al menos 5 x 106 celulas, mas preferentemente al menos 107 celulas y, mas preferentemente, al menos 109 celulas.

Los procedimientos para preparar poblaciones enriquecidas de MPC de los cuales se puede derivar la progenie se describen en el documento WO01/04268 y WO2004/085630. En un contexto in vitro, las MPC raramente estaran presentes como una preparacion absolutamente pura y, en general, estaran presentes con otras celulas que son celulas comprometidas espedficas del tejido (TSCC). El documento WO01/04268 se refiere a recolectar dichas celulas de la medula osea en niveles de pureza de entre aproximadamente el 0,1 % y el 90 %.

La poblacion que comprende MPC de las cuales se deriva la progenie se puede recolectar directamente de una fuente de tejido o alternativamente puede ser una poblacion que ya se ha expandido ex vivo.

Por ejemplo, la progenie se puede obtener de una poblacion de MPC sustancialmente purificada recolectada, no expandida, que comprende al menos aproximadamente 0,1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 95 % de celulas totales de la poblacion en la cual estan presentes. Este nivel se puede lograr, por ejemplo, seleccionando celulas que son positivas para al menos un marcador seleccionado de entre el grupo que consiste en STRO-1bri, VCAM-1bri, t HY-1bri, CD146bri y STRO-2bri.

La poblacion que inicia las MPC se puede derivar de uno o mas tipos de tejidos presentados en el documento WO01/04268 o WO2004/085630, a saber, medula osea, celulas de la pulpa dental, tejido adiposo y piel, o tal vez mas ampliamente de tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, fngado, rinon, corazon, retina, cerebro, foKculos pilosos, intestino, pulmon, bazo, ganglio linfatico, timo, pancreas, hueso, ligamento, medula osea, tendon y musculo esqueletico.

La fuente preferida de dichas celulas es humana, sin embargo, se espera que la invencion sea tambien aplicable a animales, incluyendo animales agncolas tales como vacas, ovejas, cerdos y similares, animales domesticos tales como perros y gatos, animales de laboratorio tales como ratones, ratas, hamsteres y conejos o animales que se usan para deportes tales como caballos.

Se entendera que, al realizar la presente invencion, la separacion de las celulas que llevan cualquier marcador superficial de celula se puede efectuar a traves de una serie de procedimientos diferentes, sin embargo, los procedimientos preferidos se basan en la union de un agente de union al marcador en cuestion seguido de una separacion de los que presentan union, ya sea union de alto nivel o union de bajo nivel o ausencia de union. Los agentes de union mas convenientes son anticuerpos o moleculas basadas en anticuerpo, siendo preferiblemente anticuerpos monoclonales o basados en anticuerpos monoclonales debido a la especificidad de estos ultimos agentes. Se pueden utilizar anticuerpos para ambas etapas, sin embargo, tambien se podnan utilizar otros agentes, por lo tanto, tambien se pueden emplear ligandos para estos marcadores para enriquecer las celulas que los poseen o que carecen de estos.

Los anticuerpos o ligandos pueden enlazarse con un soporte solido para permitir una separacion bruta. Las tecnicas de separacion maximizan preferiblemente la retencion de viabilidad de la fraccion para recoger. Pueden emplearse diversas tecnicas de diferente eficacia para obtener separaciones relativamente brutas. La tecnica particular empleada dependera de la eficiencia de separacion, la citotoxicidad asociada, la facilidad y velocidad de rendimiento y la necesidad de un equipo sofisticado y/o habilidades tecnicas. Los procedimientos para la separacion pueden incluir, pero sin limitacion, separacion magnetica usando perlas magneticas recubiertas con anticuerpo, cromatograffa de afinidad e "inmunopurificacion" con anticuerpo enlazado con una matriz solida. Las tecnicas que proporcionan separacion precisa incluyen, pero sin limitacion, FACS.

Se prefiere que el procedimiento para aislar MPC, por ejemplo, comprenda una primera etapa que es una etapa de clasificacion de fase solida que utiliza, por ejemplo, MACS que reconoce expresion de alto nivel de STRO-1. Despues, se puede continuar con una segunda etapa de clasificacion, si se desea, para producir un mayor nivel de expresion de celulas precursoras tal como se describe en la memoria descriptiva de la patente WO 01/14268. Esta segunda etapa de clasificacion podna comprender el uso de dos o mas marcadores.

El procedimiento para obtener MPC tambien podna incluir la recoleccion de una fuente de las celulas antes de la primera etapa de enriquecimiento utilizando tecnicas conocidas. Por ende, el tejido se retirara quirurgicamente. Las celulas que comprenden el tejido de fuente despues se separaran en una denominada suspension de celulas unicas. Esta separacion puede conseguirse por medios ffsicos y/o enzimaticos.

Una vez obtenida una poblacion de MPC adecuada, se puede cultivar o expandir a traves de cualquier medio adecuado para obtener MEMP.

Las MEMP se pueden distinguir de MPC recien recolectadas y son positivas para el marcador STRO-1bri y negativas para el marcador fosfatasa alcalina (ALP). En cambio, las MPC recien aisladas son positivas para STRO-1bri y ALP.

Cuando se hace referencia a una celula como "positiva" de un marcador dado, puede ser que tenga una expresion baja (lo o dim) o alta (bright, bri) de ese marcador, dependiendo del grado en que el marcador este presente sobre la superficie celular, donde los terminos se relacionan con la intensidad de fluorescencia u otro color usado en el proceso de clasificacion por color de las celulas. La distincion de lo y bri se entendera en el contexto del marcador usado en una poblacion celular particular que se esta clasificando. Cuando se hace referencia en la presente memoria a una celula que es "negativa" de un marcador dado, no significa que el marcador no se exprese en absoluto en esa celula. Significa que el marcador se expresa a un nivel relativamente muy bajo por esa celula, y que genera una senal muy baja cuando se marca detectablemente.

El termino "bright", cuando se usa en la presente invencion, hace referencia a un marcador sobre una superficie celular que genera una senal relativamente alta cuando se marca detectablemente. Aunque no se desea limitarse a una teona, se propone que las celulas "bright" expresan mas de la protema marcadora diana (por ejemplo, el antfgeno reconocido por STRO-1) que otras celulas en la muestra. Por ejemplo, las celulas STRO-1bri producen una mayor senal de fluorescencia cuando se marcan con un anticuerpo STRO-1 conjugado con FITC, como se determina por analisis de FACS, que las celulas no “bright” (STRO-1dull/dim). Preferiblemente, las celulas "bright" constituyen al menos aproximadamente un 0,1 % de las celulas mononucleares de medula osea mas fuertemente marcadas contenidas en la muestra de partida. En otras realizaciones, las celulas "bright" constituyen al menos aproximadamente un 0,1 %, al menos aproximadamente un 0,5 %, al menos aproximadamente un 1 %, al menos aproximadamente un 1,5 % o al menos aproximadamente un 2 % de las celulas mononucleares de medula osea marcadas fuertemente contenidas en la muestra de partida.

En consecuencia, la presente invencion puede proporcionar una poblacion de celulas enriquecidas en donde al menos el 10 % de la poblacion de celulas total es la progenie de celulas precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP) que tiene el fenotipo STRO-1bri, ALP-.

En una realizacion preferida, al menos 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de la poblacion celular enriquecida total son MEMP que tienen el fenotipo STRO-1bri, ALP-.

En otra realizacion preferida, la poblacion de celulas enriquecida es homogenea para MEMP que tienen el fenotipo STRO-1bri, ALP-.

En aun otra realizacion preferida, las MEMP son positivas para uno o mas de los marcadores Ki67, CD44 y/oCD49c/CD29, VLA-3, a3p1.

En aun otra realizacion preferida mas, las MEMP no presentan actividad TERT y/o son negativas para el marcador CD18.

En aun otra realizacion preferida, la poblacion enriquecida de la presente invencion ademas comprende celulas comprometidas espedficas del tejido (TSCC).

Las TSCC se consideran comprometidas con un linaje de celulas o tejidos particular y se caracterizan como celulas Stro-1dim "Comprometido" significa que las celulas estan comprometidas con un tipo de celula o tejido particular, pero no necesariamente estan diferenciadas de forma terminal. Una poblacion de celulas derivadas de m Pc expandidas en presencia, por ejemplo, de FCS incluira TSCC comprometidas con diversos linajes. Por ende, una proporcion de TSCC se comprometera, por ejemplo, con hueso, una segunda proporcion de TSCC se comprometera con diferenciacion de adipocitos y tambien habra TSCC representativas de multiples linajes de celulas o tejidos diferentes. Las TSCC tienden a comprometerse con un tipo de linaje de celula o tejido, sin embargo, pueden ser bipotenciales, es decir capaces de diferenciacion adicional en uno de dos tipos de celulas o tejidos diferentes.

Los ejemplos no limitantes de linajes con los que pueden estar comprometidas las TSCC incluyen celulas precursoras oseas; progenitores hepatodticos, que son pluripotentes para celulas epiteliales de conducto biliar y hepatocitos; celulas restringidas neurales, que pueden generar precursores de celulas gliales que evolucionan hasta oligodendrocitos y astrocitos; precursores neuronales que evolucionan hasta neuronas; precursores de musculo cardiaco y cardiomiocitos y lmeas celulares beta pancreaticas secretoras de insulina sensibles a glucosa. Otras TSCC incluyen, pero sin limitacion, condrocitos, odontoblasto, productores de dentina y condrocitos y celulas precursoras de las siguientes: celulas epiteliales de pigmento retinal, celulas cutaneas tales como queratinocitos, celulas dendnticas, celulas de folfculo piloso, celulas epiteliales de conducto renal, celulas de musculo liso y esqueletico, progenitores testiculares, celulas endoteliales vasculares, tendon, ligamento, cartflago, adipocito, fibroblasto, estroma medular, musculo cardiaco, musculo liso, musculo esqueletico, pericito, celulas vasculares, epiteliales, gliales, neuronales, astrodticas y oligodendrodticas. Las TSCC tambien incluyen celulas precursoras que se dirigen espedficamente al tejido conectivo, incluidos tejidos conectivos adiposos, areolares, oseos, cartilaginosos, elasticos y fibrosos.

En una realizacion de la presente invencion, la poblacion de celulas enriquecida comprende TSCC que son mayoritariamente de un tipo de tejido.

"Mayoritariamente de un tipo de tejido" significa que al menos el 20 %, mas preferentemente, al menos el 30 %, mas preferentemente, al menos el 40 %, mas preferentemente, al menos el 50 %, mas preferentemente, al menos el 60 %, mas preferentemente, al menos el 70 %, mas preferentemente, al menos el 80 % y mas preferentemente, al menos el 90 % de todos los TSCC dentro de la poblacion son del mismo tipo de tejido.

Las MEMP y las TSCC dentro de la poblacion enriquecida se pueden derivar del mismo individuo. Alternativamente, la progenie de MPC y TSCC se puede derivar de individuos diferentes (en otras palabras, la progenie de MPC y TSCC son alogenicas).

Otro hallazgo de los presentes inventores es que la presencia de la progenie de MPC tiene un efecto estimulador sobre la proliferacion y la formacion de tejido a traves de TSCC. Esto se descubrio in vitro e in vivo. Por ende, la invencion considera un procedimiento para estimular la proliferacion de las TSCC o la formacion de tejido o ambos mediante el cultivo conjunto con la progenie de MPC o mediante contacto con el sobrenadante de cultivo, lisados celulares o fracciones de cultivos de progenie de MPC.

Los inventores han demostrado in vitro, que la proliferacion de las celulas STRO-1dim aumenta cuando la proporcion de MPC medidas como celulas STRO-1bri se mantiene en un nivel del 5 % o mayor. El grado de estimulacion aumenta progresivamente hasta un nivel en el cual las celulas Stro-1bri estan presentes hasta aproximadamente el 20 %. Se preve que los estudios realizados durante penodos mas largos en condiciones de cultivo diferentes de las utilizadas hasta ahora puedan mostrar que las concentraciones mas altas tienen efectos beneficiosos aun mayores o que los niveles mas bajos tambien pueden ser beneficiosos. Por lo tanto, se propone que la presencia de MPC en un 1, 2, 3 o 4 % tambien pueda proporcionar un beneficio.

La presente invencion tambien puede proporcionar un procedimiento para estimular la proliferacion de las TSCC mediante el cultivo conjunto de TSCC con MEMP que tienen el fenotipo Stro-1bri, ALP-, o mediante el contacto de las TSCC con sobrenadante de cultivo, lisados celulares o fracciones derivadas de MEMP que tienen el fenotipo Stro-1bri, ALP-.

En una realizacion preferida de este procedimiento, la progenie de MPC esta presente en las condiciones de cultivo conjunto con TSCC en un nivel mayor que el 1 %, mas preferentemente mayor que el 5 %, mas preferentemente mayor que el 10 %, mas preferentemente mayor que el 20 %, mas preferentemente mayor que el 30 %, mas preferentemente mayor que el 40 %, mas preferentemente mayor que el 50 %, mas preferentemente mayor que el 60 %, el 70 %, el 80 % o el 90 %.

Este procedimiento se puede aplicar igualmente a aquellas poblaciones de TSCC que normalmente no tienen progenie de MPC presente. Por ende, la progenie de MPC se puede agregar a las poblaciones de TSCC y mantener en condiciones de cultivo adecuadas durante un tiempo predeterminado. Se preve que las cantidades de celulas se pueden mantener en un nivel efectivo mediante el agregado de mas progenie de MPC una vez cada tanto, tal vez con el cambio de medio de cultivo en el cultivo en lote, o alternativamente todos los dfas, o algunos dfas en sistemas de cultivo continuos o en lote o puede ser autosuficiente en uno, dos, tres o mas pasajes si esta presente en cantidades suficientes inicialmente.

En una realizacion, las TSCC son celulas STRO-1dim derivadas de una poblacion purificada de MPC tal vez utilizando clasificacion basandose en la seleccion de STRO-1bri u otra seleccion mencionada anteriormente.

Se propone que la estimulacion de las TSCC por la progenie de MPC se puede aplicar no solo a tipos de celulas mesenquimales, sino tambien a otros. Los datos proporcionados a la fecha sobre a Rn y la expresion de marcadores de superficie celular sugieren que las TSCC representadas en la poblacion de STRO-1dim incluyen celulas o tejidos ectodermicos, endodermicos y mesodermicos. Los tipos de celulas que son estimulados por la progenie de MPC no necesariamente se derivan de MPC, sino que se pueden derivar de otras fuentes.

La progenie de MPC tambien se puede utilizar para estimular la proliferacion y/o la diferenciacion de determinadas celulas hemopoyeticas. En una realizacion, dichas celulas hemopoyeticas son celulas CD34+.

Se considera, en general, que la invencion tiene aplicabilidad para cultivo de celulas in vitro, es decir, con relacion a cultivos expandidos ex vivo, sin embargo, la invencion tambien puede tener aplicabilidad cuando las TSCC estan in situ en un sitio de tejido corporal y una poblacion que contiene progenie de MPC se administra al sitio.

En consecuencia, en una realizacion de este procedimiento, las TSCC se cultivan in vitro.

En otra realizacion de este procedimiento, las TSCC se ubican en un sitio de tejido de un sujeto in vivo, y la progenie de MPC, el sobrenadante de cultivo, los lisados celulares o las fracciones de la progenie de MPC se administran al sitio de tejido.

En otra realizacion de este procedimiento, las TSCC y la progenie de MPC son exogenas y se administran al sitio de tejido.

Alguna de estas formas de administracion puede ser adecuada, sin embargo, una administracion espaciada en el tiempo puede proporcionar un beneficio acelerado o mayor.

En otra realizacion, el procedimiento comprende someter dicha poblacion cultivada a condiciones que sesgan la diferenciacion de MPC o TSCC a un tipo de tejido espedfico.

En otra realizacion de este procedimiento, las TSCC estan comprometidas con un tipo de tejido seleccionado de entre el grupo que consiste en hueso, tejido neural, grasa, cartflago, musculo esqueletico, musculo cardfaco, tejido epitelial, osteoblastos, tendon, ligamento odontoblasto, pericito, musculo liso, tejido glial, tejido vascular, tejido endotelial, tejido hematopoyetico, tejido hepatico y tejido renal.

En otra realizacion de este procedimiento, las TSCC son celulas hemopoyeticas.

En otra realizacion, el procedimiento ademas comprende someter la poblacion de TSCC estimulada a condiciones que sesgan la diferenciacion de TSCC a un tipo de tejido espedfico.

Se preve que en condiciones de cultivo adecuadas, la gama de tipos de celulas que se pueden generar de acuerdo con este procedimiento incluyen, entre otros, los siguientes, una celula de tejido de cardlago, un condrocito, un condrocito de cartflago hialino, un condrocito de fibrocarfflago, un condrocito de cartflago elastico, una celula de tejido ligamentoso, un fibroblasto, un progenitor de condrocito, un progenitor de condrocito de cartflago hialino, un progenitor de condrocito de fibrocarfflago, un progenitor de condrocito de cartflago elastico, un progenitor de fibroblastos, una celula de tejido neural, una neurona, una celula glial, un progenitor de una neurona, un progenitor de una celula glial, una celula grasa, una celula de tejido adiposo, un adipocito, un adipocito marron, un adipocito blanco, un progenitor de un adipocito blanco, un progenitor de un adipocito marron, osteoblasto, un progenitor de un osteoblasto, un odontoblasto, un productor de dentina, condrocito, un osteocito, un progenitor de un osteocito, una celula de revestimiento oseo, un progenitor de una celula de revestimiento oseo, una celula vascular, un progenitor de una celula vascular, una celula de tendon, una celula de estroma de medula, celulas de estroma de apoyo osteoclasico y hemopoyetico, una celula de musculo cardfaco, un progenitor de una celula de musculo cardfaco, una celula de musculo liso, una celula de musculo esqueletico, un pericito, una celula endotelial, un progenitor de una celula endotelial, una celula epitelial, un progenitor de una celula epitelial, un astrocito o una celula oligodendrodtica.

Los presentes inventores tambien han disenado condiciones de cultivo para aumentar la generacion de MEMP. Las condiciones de cultivo anteriores no permitfan la expansion preferencial de MEMP. De hecho, en las condiciones de cultivo anteriores, la proporcion de MEMP disminuyo tfpicamente con el tiempo debido a su diferenciacion en TSCC Stro-1dim

En consecuencia, la presente invencion tambien proporciona un procedimiento para enriquecer las MEMP que tienen el fenotipo STRO-1bri, ALP-, comprendiendo el procedimiento el cultivo de celulas progenitoras mesenquimales STRO-1brightALP+ (MPC) en presencia de uno o mas factores estimulantes seleccionados de entre el grupo que consiste en 1a,25-dihidroxivitamina D3(1,25D), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), interleucina-1p (lL-1p) y factor derivado del estroma 1a (SDF-1a).

El o los factores estimulantes pueden incluir PDGF y/o IL-1 p.

En otra realizacion de este procedimiento de la invencion, las MPC STRO-1brightALP+del mismo se cultivan en presencia de dos o mas factores estimulantes.

La estimulacion de la proliferacion se puede aplicar a una poblacion de MPC sustancialmente purificada recolectada, no expandida, que comprende al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 95 % de celulas totales de la poblacion en la cual estan presentes. El efecto de la estimulacion de la proliferacion puede ser limitar el grado en el cual las MPC se diferencian en el cultivo ex vivo.

En otra realizacion de este procedimiento de la invencion, las MPC STRO-1brightALP+ del mismo se han expandido ex vivo.

En otra realizacion de este procedimiento de la invencion, las MPC STRO-1brightALP+ son una poblacion no expandida de MPC aisladas.

La estimulacion puede dar lugar a un aumento de la progenie de MPC que tiene el fenotipo STRO-1bri, ALP'de mas del 10 %, preferentemente mas del 20 %, preferentemente mas del 40 %, preferentemente mas del 50 % con respecto a los controles no estimulados.

En otra realizacion de este procedimiento de la invencion, las MPC utilizadas para cultivo o expansion se derivan de uno o mas tejidos que consisten en el grupo que comprende medula osea, celulas de la pulpa dental, tejido adiposo y piel, o tal vez mas ampliamente de tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, Idgado, rinon, corazon, retina, cerebro, folfculos pilosos, intestino, pulmon, bazo, ganglio linfatico, timo, pancreas, hueso, ligamento, medula osea, tendon y musculo esqueletico.

En otra realizacion de este procedimiento de la invencion, las MPC o la progenie de las mismas se cultivan o se expanden en presencia de uno o mas factores estimulantes in vivo.

Se entendera a partir de lo anterior que la invencion tiene aplicabilidad a la proliferacion in vitro de MPC, sin embargo, se puede aplicar igualmente a la proliferacion in situ in vivo. Por ende, el factor estimulante de MPC se puede administrar directamente a una lesion donde, por ejemplo, sea deseable estimular la proliferacion de las MPC residentes, por lo tanto, el factor estimulante de MPC se puede administrar solo o alternativamente combinado con una poblacion que comprende MPC. Esto ultimo se puede considerar preferible porque la cantidad de MPC en los tejidos generalmente es muy baja y, ademas, se considera que es probable que el efecto beneficioso de la generacion de tejido mesenquimal adecuado aumente a causa de la presencia de una mayor cantidad de MPC.

En otra realizacion, el procedimiento comprende ademas administrar TSCC exogenas.

La presente invencion puede proporcionar tambien un procedimiento de generacion de una poblacion celular comprometida espedfica de tejido, comprendiendo el procedimiento

el cultivo de una poblacion de celulas que comprenden MPC o progenie de las mismas y TSCC en presencia de uno o mas factores estimulantes seleccionados de entre el grupo que consiste en 1a,25-dihidroxivitamina D3(1,25D), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), interleucina-1p (IL-1p) y factor derivado del estroma 1a (SDF-1a; y

someter dicha poblacion cultivada a condiciones que sesgan la diferenciacion de MPC o TSCC a un tipo de tejido espedfico.

En una realizacion de este procedimiento, se selecciona el tipo de tejido de entre el grupo consistente en musculo cardiaco, tejido vascular, tejido oseo, tejido neural, musculo liso y tejido endotelial.

Tambien se entendera que la invencion abarca una composicion que comprende progenie de MPC y un factor estimulante. Tal composicion es probable que sea terapeuticamente beneficiosa y por tanto se preparara en una forma farmaceuticamente aceptable. La composicion podna comprender una poblacion enriquecida o purificada de progenie de MPC y uno o mas factores estimulantes.

Puede determinarse el nivel de factor o factores estimulantes presentes en la composicion empmcamente, pero en la mayona de casos es probable que sea del orden de nanogramos o decimas de nanogramos por mililitro.

En el contexto de la administracion in vivo, tambien puede resultar deseable administrar al mismo tiempo en la composicion TSCC. Por ejemplo, en el caso de una lesion en un hueso o una region del mismo, un musculo cardfaco o una region del mimo, un tejido vascular o una region del mimo o una region que comprende una o mas celulas endoteliales, la TSCC que se administra, preferentemente, esta al menos parcialmente comprometida con un tipo de celula pertinente (p. ej., un osteoblasto, un cardiomiocito o una celula endotelial). Estas se pueden proporcionar como parte de un cultivo de TSCC mezclado o de forma mas purificada, por ejemplo, clasificadas para marcadores que se sabe que estan presentes en el tipo de celula comprometida espedfica de tejido. Ademas, o alternativamente, la composicion que se administra puede incluir uno o mas factores estimulantes de diferenciacion para diferenciar las MPC que estan presentes en la composicion o presentes en el sitio diana a uno o mas tipos de tejido de interes.

Los factores que sesgan la diferenciacion de TSCC o MPC a tipos de tejido espedficos se describen en los ejemplos que se proporcionan en la presente invencion. Las condiciones que sesgan la diferenciacion de las MPC o las celulas precursoras oseas o hueso pueden implicar, por ejemplo, cultivar en aMEM suplementado con 10 % de FCS, L-ascorbato-2-fosfato 100 pM, dexametasona 10-7 M y fosfato inorganico 3 mM. Se ha mostrado que estas condiciones inducen a las celulas estromales de BM humana a desarrollar una matriz osea mineralizada in vitro (Gronthos y col., Blood. 84:4164-73, 1994).

Las condiciones adecuadas para diferenciar las TSCC en osteoblastos pueden implicar cultivar las TSCC en presencia de colageno de tipo I, fibrinogeno, fibrina, acido poliglicolico, acido polilactico, osteocalcina u osteonectina. En un ejemplo particular, se cultivan las TSCC en presencia de colageno de tipo I, fibrinogeno y fibrina. En un ejemplo alternativo, se cultivan las TSCC en presencia de colageno de tipo I, fibrinogeno, fibrina, osteocalcina y osteonectina. En el contexto de este procedimiento, pueden usarse colageno de tipo I, fibrinogeno, fibrina, acido poliglicolico, acido polilactico, osteocalcina u osteonectina solos o en presencia de un factor de crecimiento. Se entendera que esta contemplada por la presente invencion cualquier combinacion de los compuestos enumerados anteriormente en este parrafo.

A lo largo de esta invencion, la palabra "comprender", o variaciones de la misma tales como "comprende" o "que comprende", se entendera que implicara la inclusion de un elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas.

Como sera evidente, las funciones y caractensticas preferidas de un aspecto de la invencion se aplican a muchos otros aspectos de la invencion.

Produccion de celulas modificadas geneticamente

En una realizacion, la presente invencion puede proporcionar una progenie de celulas precursoras mesenquimales (MPC) modificadas geneticamente aisladas que tienen el fenotipo STRO-1bri, ALP-: Preferiblemente, las MEMP se modifican geneticamente para producir una protema heterologa. Tfpicamente, las celulas se modificaran geneticamente de tal modo que la protema heterologa se secrete de las celulas.

Las celulas modificadas geneticamente pueden cultivarse en presencia de al menos una citocina en una cantidad suficiente para soportar el crecimiento de las celulas modificadas. Las celulas modificadas geneticamente asf obtenidas pueden usarse inmediatamente (p.ej. en trasplante), cultivarse y expandirse in vitro o almacenarse para usos posteriores. Las celulas modificadas pueden almacenarse mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica, p.ej. congeladas en nitrogeno lfquido.

Modificacion genetica como se usa en la presente invencion abarca cualquier procedimiento de modificacion genetica que implique la introduccion de un polinucleotido exogeno o extrano en una MEMP o un precursor de MEMP (p. ej., una MPC) o la modificacion de un gen endogeno dentro de una MEMP o un precursor de MEMP. La modificacion genetica incluye, pero sin limitacion, transduccion (transferencia mediada por virus de ADN hospedador desde un hospedador o donante a un receptor, in vitro o in vivo), transfeccion (transformacion de celulas con genomas de ADN vmco aislados), transferencia mediada por liposoma, electroporacion, transfeccion con fosfato de calcio o coprecipitacion y otras. Los procedimientos de transduccion incluyen el cocultivo directo de celulas con celulas productoras (Bregni y col., Blood 80:1418-1422, 1992) o el cultivo con sobrenadante vmco solo con o sin factores de crecimiento y policationes apropiados (Xu y col., Exp. Hemat. 22:223-230, 1994).

Un polinucleotido codificante de un polipeptido heterologo se induce preferentemente a una celula hospedadora en un vector. El vector incluye preferiblemente los elementos necesarios para la transcripcion y traduccion de la secuencia de codificacion insertada. Los procedimientos usados para construir tales vectores son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se describen con detalle las tecnicas para construir vectores de expresion adecuados en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. (3a Ed., 2000); y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1999).

Los vectores pueden incluir, pero sin limitacion, vectores vmcos tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y herpesvirus simple; cosmidos; vectores de plasmido; vectores sinteticos y otros vehmulos recombinantes usados tfpicamente en la tecnica. Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonacion en que puede ligarse operativamente un polinucleotido son bien conocidos en la tecnica. Tales vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y estan comercialmente disponibles en fuentes tales como Stratagene (La Jolla, Calif.) y Promega Biotech (Madison, Wis.). Los ejemplos espedficos incluyen pSG, pSV2CAT, pXtl de Stratagene y pMSG, pSVL, pBPV y pSVK3 de Pharmacia.

Los vectores preferidos incluyen vectores retrovmcos (vease Coffin y col., "Retroviruses", capttulo 9, pag. 437-473, Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1997). Los vectores utiles en la invencion pueden producirse recombinantemente mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los documentos WO94/29438, WO97/21824 y WO97/21825 describen la construccion de plasmidos de empaquetamiento retrovmco y lmeas celulares de empaquetamiento. Los vectores ejemplares incluyen los vectores de expresion de mairnfero pCMV, tales como pCMV6b y pCMV6c (Chiron Corp.), pSFFV-Neo y pBluescript-Sk+. Son ejemplos no limitantes de vectores retrovmcos utiles aquellos derivados de retrovirus de murino, ave o primate. Los vectores retrovmcos comunes incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (vector MoMLV). Otros vectores derivados de MoMLV incluyen, Lmily, LINGFER, MINGFR y MINT (Chang y col., Blood 92:1-11, 1998). Los vectores adicionales incluyen aquellos basados en el virus de la leucemia de gibon (GALV por sus siglas en ingles) y virus de sarcoma murino de Moloney (MOMSV por sus siglas en ingles) y el virus formador de focos en bazo (SFFV por sus siglas en ingles). Los vectores derivados del virus de celula madre murina (MESV) incluyen MESV-MiLy (Agarwal y col., J. of Virology, 72:3720-3728, 1998). Los vectores retrovmcos incluyen tambien vectores basados en lentivirus, y los ejemplos no limitantes incluyen vectores basados en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2).

En la produccion de constructos de vector retrovmco, pueden retirarse las secuencias gag, pol y env vmcas del virus, creando espacio para la insercion de secuencias de a Dn extrano. Los genes codificados por ADN extrano se expresan habitualmente bajo el control de un promotor vmco fuerte en la repeticion terminal larga (LTR). La seleccion de las secuencias reguladoras de control apropiadas depende de la celula hospedadora usada y la seleccion esta dentro de las habilidades del especialista en la tecnica. Son conocidos numerosos promotores ademas del promotor de la LTR. Los ejemplos no limitantes incluyen el promotor del fago lambda PL, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV por sus siglas en ingles), el promotor de la region U3 del virus de sarcoma murino de Moloney (MMSV por sus siglas en ingles), virus de sarcoma de Rous (RSV por sus siglas en ingles) o virus formador de focos en bazo (SFFV); el promotor de granzima A y el promotor de granzima B. Pueden usarse adicionalmente elementos de control inducibles o multiples. La seleccion de un promotor adecuado sera evidente para aquellos especialistas en la tecnica.

Tal constructo puede empaquetarse en partfculas vmcas eficientemente si se proporcionan las funciones gag, pol y env en trans por una lmea celular de empaquetamiento. Por lo tanto, cuando se introduce el constructor de vector en la celula de empaquetamiento, las protemas gag-pol y env producidas por la celula se ensamblan con el ARN de vector produciendo viriones infecciosos que se secretan al medio de cultivo. El virus asf producido puede infectar e integrarse en el ADN de la celula diana, pero no produce partmulas vmcas infecciosas puesto que carece de secuencias de empaquetamiento esenciales. La mayona de las lmeas celulares de empaquetamiento actualmente en uso se han transfectado con plasmidos separados, conteniendo cada uno una de las secuencias de codificacion necesarias, de modo que son necesarios multiples eventos de recombinacion antes de poder producir un virus competente de replicacion. Como alternativa, la lmea celular de empaquetamiento alberga un provirus. El provirus se ha incapacitado de modo que, aunque puede producir todas las protemas requeridas para ensamblar virus infecciosos, su propio ARN no puede empaquetarse en virus. En cambio, se empaqueta el ARN producido a partir del virus recombinante. Por lo tanto, la solucion madre de virus liberada de las celulas de empaquetamiento contiene solo virus recombinantes. Los ejemplos no limitantes de lmeas de empaquetamiento retrovmcas incluyen PA12, PA317, PE501, PG13, PSI.CRIP, RDI 14, GP7C-tTA-G10, ProPak-A (PPA-6) y PT67. Se hace referencia a Miller y col., Mol. Cell Biol. 6:2895, 1986; Miller y col., Biotechniques 7:980, 1989; Danos y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460, 1988; Pear y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8392-8396, 1993; y Finer y col., Blood 83:43-50, 1994.

Otros vectores adecuados incluyen vectores adenovmcos (vease, Frey y col., Blood 91:2781, 1998; y WO 95/27071) y vectores vmcos adenoasociados. Estos vectores son conocidos en la tecnica, p. ej., tal como se describe en Chatterjee y col., Current Topics in Microbiol. And Immunol., 218:61-73, 1996; Stem cell Biology and Gene Therapy, eds. Quesenberry y col., John Wiley & Sons, 1998; y las patentes estadounidenses n. ° 5.693.531 y 5.691.176. El uso de vectores derivados de adenovirus puede ser ventajoso en ciertas situaciones, porque no son capaces de infectar celulas no en division. Al contrario que el ADN retrovmco, el ADN adenovmco no se integra en el genoma de la celula diana. Ademas, la capacidad de portar ADN extrano es mucho mayor en vectores adenovmcos que vectores retrovmcos. Los vectores vmcos adenoasociados son otro sistema de suministro util. El ADN de este virus puede integrarse en celulas no en division y se han introducido exitosamente una serie de polinucleotidos en diferentes tipos celulares usando vectores vmcos adenoasociados.

En algunas realizaciones, el constructo o vector incluira dos o mas secuencias polinucleotfdicas heterologas. Preferiblemente, la secuencia de acido nucleico adicional es un polinucleotido que codifica un marcador selectivo, un gen estructural, un gen terapeutico o un gen de citocina/quimiocina.

Puede incluirse un marcador selectivo en el constructo o vector con fines de monitorizar la modificacion genetica exitosa y para la seleccion de celulas en que se ha integrado el ADN. Los ejemplos no limitantes incluyen marcadores de resistencia a farmacos, tales como G148 o higromicina. Puede usarse seleccion negativa adicionalmente, por ejemplo, donde el marcador es el gen HSV-tk. Este gen hara a las celulas sensibles a agentes tales como aciclovir y ganciclovir. El gen NeoR (resistencia a neomicina/G418) se usa comunmente, pero puede usarse cualquier gen marcador conveniente cuyas secuencias genicas no esten ya presentes en la celula diana. Los ejemplos no limitantes adicionales incluyen factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (NGFR), protema fluorescente verde potenciada (EFGP), gen de dihidrofolato reductasa (DHFR), el gen bacteriano hisD, CD24 de murino (HSA), CD8a(lyt) de murino, genes bacterianos que confieren resistencia a puromicina o fleomicina y p-galactosidasa.

Las secuencias de polinucleotidos adicionales pueden introducirse en la celula hospedadora en el mismo vector que la secuencia de polinucleotidos codificante de la protema heterologa o la secuencia de polinucleotidos adicional puede introducirse en las celulas hospedadoras en un segundo vector. En una realizacion preferida, se incluira un marcador selectivo en el mismo vector que el polinucleotido codificante de la protema heterologa.

La presente invencion tambien abarca la modificacion genetica de la region promotora de un gen endogeno de tal modo que la expresion del gen endogeno se regule positivamente, dando como resultado una produccion aumentada de la protema codificada en comparacion con MEMP de tipo silvestre.

Administracion de factores estimulantes

Los procedimientos de la presente invencion pueden comprender la administracion de uno o mas factores estimulantes a un sujeto para enriquecer las MEMP in situ.

Estos procedimientos pueden implicar administrar uno o mas factores estimulantes tales como 1a,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de necrosis tumoral a (TNF- a), interleucina-1p (IL-1p) y factor derivado de estroma 1a (SDF-1a) por via topica, sistemica o local, tal como en un implante o dispositivo.

En una realizacion particular, la invencion proporciona un procedimiento para enriquecer las MEMP en un sujeto que lo necesita mediante la administracion de un factor estimulante de forma sistemica al sujeto. Por ejemplo, el factor estimulante se puede administrar mediante inyeccion subcutanea o intramuscular.

Esta realizacion de la invencion puede ser util para el tratamiento de enfermedades degenerativas sistemicas en las que se desea el enriquecimiento de las MEMP en tejidos particulares. Algunos ejemplos de enfermedades degenerativas sistemicas que se pueden tratar de este modo incluyen osteoporosis o fracturas, enfermedades degenerativas de cartflago, ateroesclerosis, enfermedades de la arteria periferica o enfermedades cardiovasculares y similares.

Por ende, de acuerdo con la presente invencion, se pueden utilizar factores estimulantes en una cantidad terapeutica o profilacticamente efectiva para tratar enfermedades o trastornos seleccionados de entre el grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, inflamacion cronica aguda, cancer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas y trastornos inflamatorios como artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria cronica, enfermedad pelvica inflamatoria cronica, esclerosis multiple, asma, osteoartritis, ateroesclerosis, psoriasis, rinitis, autoinmunidad y rechazo de trasplante de organos. En un ejemplo, dichas composiciones incluyen uno o mas factores estimulantes en una cantidad terapeutica o profilacticamente efectiva suficiente para utilizarse para ayudar a estimular la produccion de celulas espedficas de tejido.

Una "cantidad terapeuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante penodos de tiempo necesarios, para lograr el enriquecimiento de las MEMP.

Una "cantidad profilacticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante penodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profilactico deseado, tal como prevenir o inhibir la muerte de las MPC o la progenie derivada de estas.

En realizaciones particulares, un intervalo preferido de factores estimulantes puede ser 0,1 nM-0,1 M, 0,1 nM-0,05 M, 0,05 nM-15 |j M o 0,01 nM-10 |j M. Ha de senalarse que los valores de dosificacion pueden variar con la gravedad de la afeccion para aliviar. Para cualquier sujeto particular, pueden ajustarse regfmenes de dosificacion espedficos con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administracion de las composiciones. Los intervalos de dosificacion expuestos en la presente memoria son solo ejemplares y no limitan los intervalos de dosificacion que pueden seleccionarse por facultativos medicos.

La cantidad de factor estimulante en la composicion puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patologico, edad, sexo y peso del individuo. Los regfmenes de dosificacion pueden ajustarse para proporcionar una respuesta terapeutica optima. Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente segun se indique por las exigencias de la situacion terapeutica. Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificacion por facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. "Forma de unidad de dosificacion" como se usa en la presente memoria hace referencia a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias a los sujetos para tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el portador farmaceutico requerido.

Se apreciara que el factor estimulante puede administrarse en forma de una composicion que comprende un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Como se usa en la presente memoria, "portador farmaceuticamente aceptable" o "excipiente" incluye todos y cada uno los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares que sean fisiologicamente compatibles. En una realizacion, el portador es adecuado para administracion parenteral. Como alternativa, el portador puede ser adecuado para administracion intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, sublingual u oral. Los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que un medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmaceuticas. Tambien se pueden incorporar en las composiciones compuestos activos suplementarios.

Las formulaciones farmaceuticas para administracion parenteral pueden incluir liposomas. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehnculos de suministro o portadores que son especialmente utiles para farmacos hidrofobos. Dependiendo de la estabilidad biologica del reactivo terapeutico, pueden emplearse estrategias adicionales de estabilizacion de protema. Ademas, puede administrarse el farmaco en un sistema de suministro de farmaco orientado, por ejemplo, en un liposoma recubierto con anticuerpo espedfico de diana. Los liposomas se uniran a la protema diana y se captaran selectivamente por la celula que exprese la protema diana.

Las composiciones terapeuticas debenan ser tfpicamente esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion puede formularse en forma de solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentracion de farmaco. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partmula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composicion un agente que retarde la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Ademas, el factor estimulante puede administrarse en una formulacion de liberacion con el tiempo, por ejemplo, en una composicion que incluye un polfmero de liberacion lenta. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegeran al compuesto frente a una liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polfmeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhndridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres, acido polilactico y copolfmeros polilactico-poliglicolico (PLG). Muchos procedimientos para la preparacion de tales formulaciones estan patentados o son generalmente conocidos por los especialistas en la tecnica.

Adicionalmente, pueden prepararse suspensiones de factores estimulantes en forma de suspensiones oleosas apropiadas para inyeccion. Los disolventes o vetnculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sesamo; o esteres de acido graso sintetico tales como oleato de etilo o trigliceridos; o liposomas. Las suspensiones que se usan para inyeccion pueden contener tambien sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspension puede contener tambien estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparacion de soluciones altamente concentradas.

Las soluciones inyectables esteriles se pueden preparar mediante incorporacion del compuesto activo, en la cantidad requerida, al disolvente apropiado con uno o una combinacion de los ingredientes anteriormente enumerados, segun sea necesario, seguida de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehnculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los procedimientos de preparacion preferidos son secado al vacm y liofilizacion, que procuran un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de la solucion previamente esterilizada por filtracion del mismo. De acuerdo con un aspecto alternativo de la invencion, el factor estimulante puede formularse con uno o mas compuestos adicionales que potencien su solubilidad.

Si los compuestos estimulantes son para administrar por inhalacion, pueden suministrarse convenientemente en forma de una presentacion de pulverizador en aerosol a partir de paquetes a presion o un nebulizador; junto con el uso de un propelente adecuado, p. ej. diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dioxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol a presion, la unidad de dosificacion puede determinarse proporcionando una valvula para suministrar una cantidad medida. Pueden formularse capsulas y cartuchos de gelatina, por ejemplo, para uso en un inhalador, que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como almidon o lactosa.

Administracion de composiciones celulares de la presente invencion

Las composiciones celulares de la presente invencion que comprenden MEMP y/o TSCC pueden ser utiles para la regeneracion de tejido de diversos tipos, incluyendo hueso, cartflago, tendon, ligamento, musculo, piel y otro tejido conectivo, asf como tejidos nervioso, cardiaco, hepatico, pulmonar, renal, pancreatico, cerebral y de otros organos.

En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invencion pueden administrarse en combinacion con una matriz apropiada, por ejemplo, para soportar las MEMP y proporcionar una superficie para el crecimiento de hueso, cartflago, musculo, nervio, epidermis y/u otro tejido conectivo. La matriz puede estar en forma de biomateriales de matriz tradicionales. La matriz puede proporcionar una liberacion lenta de la protema expresada y celulas diferenciadas y/o el entorno apropiado para la presentacion de las mismas. En algunas realizaciones, se espera que diversas protemas colagenosas y no colagenosas esten reguladas positivamente y secretadas por las MEMP. Este fenomeno acelera la regeneracion de tejido al potenciar la deposicion de matriz. Las protemas de matriz pueden expresarse tambien en celulas genomanipuladas y potenciar el injerto y adhesion de las celulas trasplantadas en el area de trasplante.

La eleccion del material de matriz esta basada en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecanicas, apariencia cosmetica y propiedades de interfase. La aplicacion particular de las composiciones de base celular definira la formulacion apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, fosfato de tricalcio, hidroxiapatito, acido polilactico y poliantudridos biodegradables y qmmicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biologicamente bien definidos, tales como hueso o colageno dermico. Matrices adicionales estan comprendidas por protemas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y qmmicamente definidas, tales como hidroxiapatito sinterizado, biovidrio, aluminatos u otras ceramicas. Las matrices pueden comprender combinaciones de cualquiera de los tipos anteriormente mencionados de material, tales como acido polilactico e hidroxiapatito o colageno y fosfato tricalcico. Puede alterarse la composicion de bioceramicas, tal como en aluminato-fosfato de calcio, y procesarse para alterar el tamano de poro, tamano de partmula, forma de partmula y biodegradabilidad.

Las composiciones celulares de la invencion pueden usarse para tratar pacientes que requieran la reparacion o reemplazo de tejido de cartflago o hueso como resultado de enfermedad o traumatismo o insuficiencia del tejido para desarrollarse normalmente, o para proporcionar una funcion cosmetica, tal como acrecentar los rasgos faciales u otros del cuerpo. Los tratamientos pueden conllevar el uso de las celulas de la invencion para producir nuevo tejido de cartflago o tejido oseo. Por ejemplo, pueden usarse composiciones que comprenden celulas precursoras indiferenciadas o inducidas a la diferenciacion condrogenica para tratar una afeccion de cartflago, por ejemplo, artritis reumatoide o artrosis o una lesion traumatica o quirurgica del cartflago. Como otro ejemplo, pueden usarse composiciones que comprenden celulas precursoras oseas para tratar afecciones oseas, incluyendo enfermedades oseas metabolicas y no metabolicas. Los ejemplos de afecciones oseas incluyen desgarros de menisco, fusion espinal, retirada de disco espinal, reconstruccion espinal, fracturas oseas, deformacion osea/espinal, osteosarcoma, mieloma, displasia osea, escoliosis, osteoporosis, enfermedad periodontal, perdida de hueso dental, osteomalacia, raquitismo, osteitis fibrosa, distrofia osea renal y enfermedad de Paget del hueso.

Las composiciones celulares de la invencion pueden administrarse solas o como mezclas con otras celulas. Las celulas que pueden administrarse junto con las composiciones de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, otras celulas multipotentes o pluripotentes o condrocitos, condroblastos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, celulas de revestimiento oseo, citoblastos o celulas de medula osea. Pueden mezclarse celulas de diferentes tipos con una composicion de la invencion inmediatamente o poco antes de la administracion, o pueden cocultivarse conjuntamente durante un periodo de tiempo previamente a la administracion.

Las composiciones celulares de la invencion pueden administrarse con otros farmacos o moleculas biologicas (factores de crecimiento, factores troficos) beneficiosos. Cuando se administran las MEMP con otros agentes, pueden administrarse conjuntamente en una sola composicion farmaceutica, o en composiciones farmaceuticas separadas, simultanea o secuencialmente a los otros agentes (antes o despues de la administracion de los otros agentes). Los factores bioactivos que pueden coadministrarse incluyen agentes antiapoptoticos (p.ej., EPO, mimeticuerpos de EPO, TPO, IGF-I e IGF-II, HGF, inhibidores de caspasa); agentes antiinflamatorios (p.ej., inhibidores de p38 MAPK, inhibidores de TGF-beta, estatinas, inhibidores de IL-6 e IL-1, PEMIROLAST, TRANILAST, REMICADE, SIROLIMUS y AINE (farmacos antiinflamatorios no esteroideos; p.ej., TEPOXALINA, TOLMETINA, SUPROFENO); agentes inmunosupresores/inmunomoduladores (p.ej., inhibidores de calcineurina tales como ciclosporina, tacrolimus; inhibidores de mTOR (p.ej., SIROLIMUS, EVEROLIMUS); antiproliferativos (p.ej., azatioprina, micofenolato de mofetilo); corticosteroides (p.ej., prednisolona, hidrocortisona); anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales anti­ receptor IL-2Ralfa (p.ej., basiliximab, daclizumab), anticuerpos policlonales anti-linfocitos T (p.ej., anti-globulina de timocito (ATG); anti-globulina de linfocito (ALG); anticuerpo monoclonal anti-linfocitos T OKT3)); agentes antitrombogenicos (p.ej., heparina, derivados de heparina, urocinasa, PPack (dextrofenilalanina, prolina, arginina, clorometilcetona), compuestos antitrombina, antagonistas de receptor de plaquetas, anticuerpos anti-trombina, anticuerpos anti-receptor de plaquetas, aspirina, dipiridamol, protamina, hirudina, inhibidores de prostaglandina e inhibidores de plaquetas); y antioxidantes (p.ej., probucol, vitamina A, acido ascorbico, tocoferol, coenzima Q-10, glutation, L-cistema, N-acetilcistema) asf como anestesicos locales. Como otro ejemplo, las celulas pueden coadministrarse con un factor inhibidor de cicatrices como se describe en la patente EE. UU. n. ° 5.827.735.

En una realizacion, se administran las composiciones celulares de la invencion en forma de celulas indiferenciadas, es decir, como se cultivan en medio de crecimiento. Como alternativa, las composiciones celulares pueden administrarse despues de exposicion en cultivo a condiciones que estimulen la diferenciacion hacia un fenotipo deseado, por ejemplo, un fenotipo osteogenico.

Las composiciones celulares de la invencion pueden implantarse quirurgicamente, inyectarse, suministrarse (p. ej., mediante un cateter o jeringa) o administrarse de otro modo directa o indirectamente al sitio que necesita reparacion o acrecentamiento. Las celulas pueden administrarse mediante una matriz (p.ej., un andamiaje tridimensional). Las celulas pueden administrarse con portadores farmaceuticamente aceptables convencionales. Las vfas de administracion de las celulas de la invencion o composiciones o componentes (p.ej., MEC, lisado celular, medio acondicionado) de las mismas incluyen administracion intramuscular, oftalmica, parenteral (incluyendo intravenosa), intraarterial, subcutanea, oral y nasal. Las vfas particulares de administracion parenteral incluyen, pero sin limitacion, las vfas de administracion intramuscular, subcutanea, intraperitoneal, intracerebral, intraventricular, intracerebroventricular, intratecal, intracisternal, intraespinal y/o periespinal.

Cuando las celulas se administran en dispositivos semisolidos o solidos, la implantacion quirurgica en una localizacion precisa del cuerpo es tfpicamente un medio adecuado de administracion. Las composiciones farmaceuticas lfquidas o fluidas, sin embargo, pueden administrarse en una localizacion mas general (p.ej., a lo largo de un area afectada difusamente, por ejemplo) de la cual migran a una localizacion particular, p.ej. respondiendo a senales qrnmicas.

Otras realizaciones abarcan procedimientos de tratamiento mediante la administracion de composiciones farmaceuticas que comprenden componentes celulares (p.ej., lisados celulares o componentes de los mismos) o productos (p.ej., matriz extracelular, factores troficos y otros biologicos producidos mediante modificacion genetica).

Las formas y regfmenes de dosificacion para administrar las composiciones celulares descritas en la presente memoria se desarrollan de acuerdo con la buena practica medica, teniendo en cuenta la afeccion del paciente individual, p.ej. la naturaleza y extension de la afeccion que se este tratando, la edad, sexo, peso corporal y estado medico general, y otros factores conocidos por los facultativos medicos. Por tanto, se determina la cantidad efectiva de una composicion farmaceutica para administrar a un paciente mediante estas consideraciones como es conocido en la tecnica.

En algunas realizaciones de la invencion, puede no ser necesario o deseable inmunosuprimir un paciente previamente al inicio de la terapia con composiciones celulares de la presente invencion. Por consiguiente, el trasplante con MEMP alogenicas, o incluso xenogenicas, puede tolerarse en algunos aspectos.

Sin embargo, en otros aspectos, puede ser deseable o apropiado inmunosuprimir farmacologicamente un paciente previamente al inicio de la terapia celular. Esto puede lograrse mediante el uso de agentes inmunosupresores sistemicos o locales, o puede lograrse suministrando las celulas en un dispositivo encapsulado. Las MEMP pueden encapsularse en una capsula que sea permeable a los nutrientes y oxfgeno requeridos por la celula y a factores terapeuticos, pero la celula es impermeable a factores humorales inmunitarios y celulas. Preferiblemente, el encapsulante es hipoalergenico, se situa facil y establemente en un tejido diana y proporciona una proteccion anadida a la estructura implantada. Son conocidos en la materia estos y otros medios para reducir o eliminar una respuesta inmunitaria ante las celulas trasplantadas. Como alternativa, las MEMP pueden modificarse geneticamente para reducir su inmunogenicidad.

Puede determinarse la supervivencia de MEMP trasplantadas en un paciente vivo mediante el uso de una variedad de tecnicas de exploracion, p.ej. exploraciones por tomograffa axial computarizada (TAC), imagenologfa de resonancia magnetica (IRM) o tomograffa de emision de positrones (TEP). La determinacion de la supervivencia del trasplante puede hacerse tambien post mortem retirando el tejido diana y examinandolo visualmente o mediante un microscopio. Como alternativa, las celulas pueden tratarse con tintes que sean espedficos de celulas de un linaje espedfico. Las celulas trasplantadas pueden identificarse tambien mediante la incorporacion previa de tintes trazadores tales como microesferas marcadas con rodamina o fluorescema, azul Fast, bisbenzamida, microparffculas ferricas o productos genicos indicadores introducidos geneticamente, tales como beta-galactosidasa o beta-glucuronidasa.

La integracion funcional de MEMP trasplantadas a un sujeto puede valorarse examinando la restauracion de la funcion que estaba danada o afectada, por ejemplo, la restauracion de la funcion articular u osea o el acrecentamiento de la funcion.

Las composiciones celulares de la invencion pueden incluir uno o mas factores bioactivos, por ejemplo, pero sin limitacion, un factor de crecimiento, un factor inductor de la diferenciacion, un factor de supervivencia celular tal como un inhibidor de caspasa, un agente antiinflamatorio tal como inhibidor de cinasa p38 o un factor angiogenico tal como VEGF o bFGF. Algunos ejemplos de factores bioactivos incluyen PDGF-bb, Eg F, bFGF, IGF-1 y LIF.

Como alternativa, las MEMP para trasplantar pueden genomanipularse para expresar tales factores de crecimiento, antioxidantes, agentes antiapoptoticos, agentes antiinflamatorios o factores angiogenicos.

Las composiciones farmaceuticas de la invencion pueden comprender poblaciones homogeneas o heterogeneas de MEMP, matriz extracelular o lisado celular de las mismas, o medio acondicionado de las mismas en un portador farmaceuticamente aceptable. Los portadores farmaceuticamente aceptables para las celulas de la invencion incluyen sustancias portadoras organicas o inorganicas adecuadas que no reaccionan nocivamente con las celulas de la invencion o composiciones o componentes de las mismas. En la medida en que sean biocompatibles, los portadores farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen agua, solucion salina (tal como solucion de Ringer), alcoholes, aceites, gelatinas y carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidon, esteres de acido graso, hidroximetilcelulosa y polivinilpirrolidina. Tales preparaciones pueden esterilizarse, y si se desea, mezclarse con agentes auxiliares tales como lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presion osmotica, tampones y colorantes. Los portadores farmaceuticos adecuados para uso en la presente invencion son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en Pharmaceutical Sciences (17a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa.) y el documento WO 96/05309.

Pueden anadirse uno o mas de otros componentes a celulas trasplantadas, incluyendo componentes de matriz extracelular seleccionados tales como uno o mas tipos de colageno conocidos en la materia y/o factores de crecimiento, plasma rico en plaquetas y farmacos. Como alternativa, las celulas de la invencion pueden genomanipularse para expresar y producir factores de crecimiento. Se proporcionan en la presente memoria detalles de la genomanipulacion de las celulas de la invencion.

En una realizacion no limitante, se prepara una formulacion que comprende las celulas de la invencion para administracion directamente al sitio donde se desea la produccion de nuevo tejido, tal como tejido oseo. Por ejemplo, y no a modo de limitacion, las MEMP pueden suspenderse en una solucion de hidrogel para inyeccion. Los ejemplos de hidrogeles adecuados para uso en la invencion incluyen peptidos autoensamblantes tales como RAD16. Como alternativa, la solucion de hidrogel que contiene las celulas puede dejarse endurecer, por ejemplo, en un molde, formando una matriz que tiene celulas dispersadas en la misma previamente a la implantacion. O, una vez se endurece la matriz, pueden cultivarse las formaciones celulares de modo que las celulas se expandan mitoticamente previamente a la implantacion. El hidrogel es un polfmero organico (natural o sintetico) que se reticula mediante enlaces covalentes, ionicos o de hidrogeno creando una estructura de rejilla abierta tridimensional que atrapa moleculas de agua formando un gel. Los ejemplos de materiales que pueden usarse para formar un hidrogel incluyen polisacaridos tales como alginato y sales del mismo, peptidos, polifosfazina y poliacrilatos, que se reticulan ionicamente, o polfmeros de bloque tales como copolfmeros de bloque de oxido de polietileno-polipropilenglicol que se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. En algunas realizaciones, el soporte para la MPC o la progenie derivada de las mismas es biodegradable.

En algunas realizaciones de la invencion, la formulacion comprende un gel polimerizable in situ tal como se describe, por ejemplo, en la publicacion de solicitud de patente estadounidense 2002/0022676; Anseth y col., J. Control Release, 78(1-3): 199-209 (2002); Wang y col., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003).

En algunas realizaciones, los polfmeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas tales como agua, soluciones salinas tamponadas o soluciones acuosas de alcohol que tienen grupos laterales cargados, o una sal ionica monovalente de los mismos. Son ejemplos de polfmeros con grupos laterales acidos que pueden hacerse reaccionar con cationes los poli(fosfazenos), poli(acidos acnlicos), poli(acidos metacnlicos), copolfmeros de acido acnlico y acido metacnlico, poli(acetato de vinilo) y polfmeros sulfonados tales como poliestireno sulfonado. Pueden usarse tambien copolfmeros que tienen grupos laterales acidos formado por reaccion de acido acnlico o metacnlico y monomeros o polfmeros de vinileter. Son ejemplos de grupos acidos grupos acido carboxflico, grupos acido sulfonico, grupos alcohol halogenado (preferiblemente fluorado), grupos OH fenolicos y grupos OH acidos.

Los ejemplos de polfmeros con grupos laterales basicos que pueden reaccionar con aniones son poli(vinilaminas), poli(vinilpiridina), poli(vinilimidazol) y algunos polifosfazenos sustituidos con imino. La sal de amonio o cuaternaria de los polfmeros puede formarse tambien a partir de los nitrogenos del esqueleto o grupos imino pendientes. Son ejemplos de grupos laterales basicos los grupos amino e imino.

El alginato puede reticularse ionicamente con cationes divalentes en agua, a temperatura ambiente, formando una matriz de hidrogel. Debido a estas condiciones suaves, el alginato ha sido el polfmero mas comunmente usado para encapsulacion de celulas de hibridoma, como se describe por ejemplo en la patente de EE.UU. n. ° 4.352.883 de Lim. En el proceso de Lim, se suspende una solucion acuosa que contiene los materiales biologicos para encapsular en una solucion de un polfmero hidrosoluble, se conforma la suspension en gotitas que se configuran en microcapsulas discretas por contacto con cationes multivalentes y se reticula entonces la superficie de las microcapsulas con poliaminoacidos, formando una membrana semipermeable alrededor de los materiales encapsulados.

Los polifosfazenos son polfmeros con esqueletos consistentes en nitrogeno y fosforo separados por enlaces sencillos y dobles alternados. Cada atomo de fosforo esta unido covalentemente a dos cadenas laterales.

Los polifosfazenos adecuados para reticulacion tienen una mayona de grupos de cadena lateral que son acidos y son capaces de formar puentes salinos con cationes divalentes o trivalentes. Son ejemplos de grupos laterales acidos grupos acido carboxflico y grupos acido sulfonico. Los polifosfazenos hidrolfticamente estables estan formados por monomeros que tienen grupos laterales acido carboxflico que se reticulan por cationes divalentes o trivalentes tales como Ca2+o Al3+. Pueden sintetizarse polfmeros que se degradan por hidrolisis incorporando monomeros que tienen grupos laterales imidazol, ester de aminoacido o glicerol. Por ejemplo, puede sintetizarse un poli[bis(carboxilatofenoxi)]fosfazeno (PCPP) que se reticula con cationes multivalentes disueltos en medios acuosos a temperatura ambiente o por debajo, formando matrices de hidrogel.

Los polifosfazenos biodegradables tienen al menos dos tipos diferentes de cadenas laterales, grupos laterales acidos capaces de formar puentes salinos con cationes multivalentes y grupos laterales que hidrolizan en condiciones in vivo, p.ej., grupos imidazol, esteres de aminoacido, glicerol y glucosilo.

La hidrolisis de la cadena lateral da como resultado la erosion del polfmero. Son ejemplos de cadenas laterales hidrolizantes imidizoles no sustituidos y sustituidos y esteres de aminoacido en que el grupo esta unido al atomo de fosforo a traves de una ligadura amino (los polfmeros de polifosfazeno en que ambos grupos R estan enlazados de esta manera son conocidos como poliaminofosfazenos). Para los poliimidazolfosfazenos, algunos de los grupos "R" en el esqueleto de polifosfazeno son anillos de imidazol, enlazados con el fosforo en el esqueleto a traves de un atomo de nitrogeno de anillo. Otros grupos "R" pueden ser residuos organicos que no participan en la hidrolisis, tales como grupos metilfenoxi u otros grupos mostrados en el artfculo cientffico de Allcock y col., Macromolecule 10:824 (1977). Son conocidos en la materia procedimientos de smtesis de los materiales de hidrogel, asf como procedimientos para preparar tales hidrogeles.

Pueden incluirse tambien otros componentes en la formulacion incluyendo, pero sin limitacion, cualquiera de los siguientes: (1) tampones para proporcionar pH e isotonicidad apropiados; (2) lubricantes; (3) materiales viscosos para retener las celulas en o cerca del sitio de administracion incluyendo, por ejemplo, alginatos, agares y gomas vegetales y (4) otros tipos celulares que pueden producir un efecto deseado en el sitio de administracion tales como, por ejemplo, potenciacion o modificacion de la formacion de tejido o sus caractensticas fisicoqmmicas, o como soporte para la viabilidad de las celulas, o inhibicion de la inflamacion o del rechazo. Las celulas pueden cubrirse con una cobertura de herida apropiada para prevenir que las celulas abandonen el sitio. Tales coberturas de herida son conocidas por los especialistas en la materia.

Formulacion de un parche de tejido oseo

El cultivo o cocultivo de MEMP en un pocillo preconformado posibilita la fabricacion de un parche de tejido de grosor y volumen predeterminados. El volumen del parche de tejido resultante depende del volumen de pocillo y del numero de MEMP en el pocillo. El tejido de volumen predeterminado optimo puede prepararse por experimentacion rutinaria alterando cualquiera o ambos de los parametros anteriormente mencionados.

La superficie en contacto con la celula del pocillo puede recubrirse con una molecula contraria a la adhesion de MEMP a la superficie en contacto con la celula. Los reactivos de recubrimiento preferidos incluyen reactivos basados en silicona, es decir, reactivos basados en diclorodimetilsilano o politetrafluoroetileno, es decir TEFLON. Los procedimientos para recubrir materiales con reactivos basados en silicona, espedficamente diclorodimetilsilano, son bien conocidos en la materia. Vease, por ejemplo, Sambrook y col. (1989) "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press. Se aprecia que otros reactivos biocompatibles que previenen la adhesion de celulas con la superficie del pocillo puedan ser utiles en la practica de la presente invencion.

Como alternativa, el pocillo puede fundirse de un material biocompatible maleable o moldeable que no permita la adhesion de celulas per se. Los materiales preferidos que previenen tal adhesion celular incluyen, pero sin limitacion, agarosa, vidrio, plastico de cultivo celular no tratado y politetrafluoroetileno, es decir TEFLON. Estan comercialmente disponibles plasticos de cultivo celular no tratados, es decir plasticos que no se han tratado con ni estan compuestos por materiales que tienen una carga electrostatica, y pueden adquirirse, por ejemplo, en Falcon Labware, Becton-Dickinson, Lincoln Park, N.J. Sin embargo, no se pretende que los materiales anteriormente mencionados sean limitantes. Se aprecia que puede ser util en la practica de la presente invencion cualquier otro material biocompatible maleable o moldeable inherentemente contrario a la adhesion de MEMP.

Las MEMP en suspension pueden sembrarse y cultivarse en el pocillo preconformado. Las MEMP pueden inducirse a diferenciar en un fenotipo condrogenico u osteogenico en cultivo en el pocillo o pueden haberse inducido a diferenciar previamente a la siembra en el pocillo. Las celulas pueden diluirse por la adicion de medio de cultivo a una densidad celular de aproximadamente 1 x 105 a 1 x 109 celulas por mililitro.

Las celulas pueden formar un tapon cohesivo de celulas. El tapon cohesivo de celulas puede retirarse del pocillo e implantarse quirurgicamente en el defecto de tejido. Se preve que MPC no diferenciadas o la progenie derivada de estas se puede diferenciar in situ de este modo para formar tejido in vivo.

Los defectos oseos pueden identificarse por inferencia usando tomograffa informatizada (exploracion por TAC); examen de rayos X, imagenologfa de resonancia magnetica (IRM), analisis de fluido sinovial o marcadores sericos o mediante cualquier otro procedimiento conocido en la materia. Los defectos en mairnferos son tambien facilmente identificables visualmente durante el examen artroscopico o durante la cirugfa abierta de la articulacion. El tratamiento de los defectos puede efectuarse durante un procedimiento artroscopico o quirurgico abierto usando los procedimientos y composiciones divulgados en la presente memoria.

Por consiguiente, una vez se ha identificado el defecto, puede tratarse el defecto mediante las siguientes etapas de (1) implantar quirurgicamente en el sitio predeterminado un parche de tejido preparado mediante las metodologfas descritas en la presente memoria y (2) permitir al parche de tejido integrarse en el sitio predeterminado.

El parche de tejido tiene optimamente un tamano y una forma tales que, cuando el parche se implanta en el defecto, los bordes del tejido implantado entran en contacto directo con los bordes del defecto. Ademas, el parche de tejido puede fijarse en su lugar durante el procedimiento quirurgico. Esto puede efectuarse por fijacion quirurgica del parche en el defecto con suturas biodegradables y/o aplicando un bioadhesivo a la region de interfase del parche y el defecto.

En algunos aspectos, el tejido danado puede extirparse quirurgicamente previamente a la implantacion del parche de tejido.

Trasplante de MEMP usando andamiajes

Las composiciones celulares de la invencion o cocultivos de las mismas pueden sembrarse sobre o en un andamiaje tridimensional e implantarse in vivo, donde las celulas sembradas proliferaran en el armazon y formaran un tejido de reemplazo, tal como tejido oseo, in vivo en cooperacion con las celulas del paciente.

Por ejemplo, pero no a modo de limitacion, el andamiaje puede disenarse de tal modo que la estructura de andamiaje: (1) soporte las celulas sembradas sin degradacion posterior; (2) soporte las celulas desde el momento de la siembra hasta que se remodela el trasplante de tejido por el tejido hospedador; (2) permita adherirse a las celulas sembradas, proliferar y desarrollarse hasta una estructura de tejido que tenga suficiente integridad mecanica para soportarse a sf misma in vitro, en cuyo punto se degrada el andamiaje. Se proporciona una revision del diseno de andamiaje por Hutmacher, J. Biomat. Sci. Polymer Edn., 12(1):107-124 (2001).

Los andamiajes de la invencion pueden administrarse en combinacion con uno o cualquiera o mas factores de crecimiento, celulas, por ejemplo, citoblastos, celulas de medula osea, condrocitos, condroblastos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, celulas de revestimiento oseo o sus precursores, farmacos u otros componentes descritos anteriormente que estimulen la formacion de tejido o potencien o mejoren de otro modo la practica de la invencion. Las MEMP para sembrar sobre los andamiajes pueden genomanipularse para expresar factores de crecimiento o farmacos.

Las celulas de la invencion pueden usarse para producir tejido nuevo in vitro, que puede implantarse entonces o insertarse de otro modo en un sitio que requiera reparacion, reemplazo o acrecentamiento de tejido en un paciente.

En una realizacion no limitante, las celulas de la invencion se utilizan para producir una construccion de tejido tridimensional in vitro, que despues se implanta in vivo. Como ejemplo de la produccion de construcciones de tejido tridimensionales, vease la patente de e E. UU. n. ° 4.963.489. Por ejemplo, las celulas de la invencion pueden inocularse o "sembrarse" sobre un armazon o andamiaje tridimensional y proliferar o crecer in vitro, formando un tejido vivo que puede implantarse in vivo.

Las celulas de la invencion pueden crecer libremente en un recipiente de cultivo hasta subconfluencia o confluencia, sacarse del cultivo e inocularse sobre un armazon tridimensional La inoculacion del armazon tridimensional con una alta concentracion de celulas, p.ej. aproximadamente 106 a 5 x 107 celulas por mililitro, dara como resultado el establecimiento del soporte tridimensional en periodos relativamente mas cortos de tiempo.

Los ejemplos de andamiajes que pueden usarse en la presente invencion incluyen alfombrillas no tejidas, espumas porosas o peptidos autoensamblantes. Las alfombrillas no tejidas, por ejemplo, pueden formarse usando fibras que comprenden un copolfmero absorbible sintetico de acidos glicolico y lactico (PGA/PLA) vendido con el nombre comercial VICRYL (Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Las espumas compuestas, por ejemplo, por copolfmero de poli(epsilon-caprolactona)/poli(acido glicolico)(PCL/PGA), formadas mediante procesos tales como liofilizacion o liofilizadas como se discute en la patente de EE.UU. n. ° 6.355.699, son tambien andamiajes posibles. Pueden usarse tambien hidrogeles tales como peptidos autoensamblantes (p.ej., RAD16). Estos materiales se usan frecuentemente como soportes para el crecimiento de tejido.

El armazon tridimensional puede estar compuesto por materiales ceramicos incluyendo, pero sin limitacion, fosfato de mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri y tetra-calcio, hidroxiapatito, fluoroapatitos, sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, oxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos de magnesio y calcio, vidrios biologicamente activos tales como BIOGLASS (Universidad de Florida, Gainesvile, Fla.) y mezclas de los mismos. Existe una serie de materiales ceramicos biocompatibles porosos adecuados actualmente disponibles en el mercado comercial tales como SURGIBON (Unilab Surgibone, Inc., Canada), ENDOBON (Merck Biomaterial France, Francia), CEROS (Mathys, A. G., Bettlach, Suiza) e INTERPORE (Interpore, Irvine, Calif., Estados Unidos), y productos de injerto oseo de colageno mineralizado tales como HEALo S (Orquest, Inc., Mountain View, Calif.) y V iTo SS, RHAKOSS, y CORTOSS (Orthovita, Malvern, Pa.). El armazon puede ser una mezcla, combinacion o material compuesto de materiales naturales y/o sinteticos. En algunas realizaciones, el andamiaje esta en forma de una jaula. En una realizacion preferida, el andamiaje esta recubierto con colageno.

De acuerdo con una realizacion preferida, el armazon es un fieltro que puede estar compuesto por un hilo multifilamento compuesto por un material bioabsorbible, p.ej. copolfmeros o combinaciones de PGA, PLA, PCL, o acido hialuronico. El hilo se transforma en un fieltro usando tecnicas de procesamiento textil estandares consistentes en ondulado, corte, cardado y puncion.

En otra realizacion preferida, se siembran las celulas de la invencion sobre andamiajes de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Ademas, el armazon tridimensional puede moldearse en una forma util, tal como la de la porcion externa de una oreja, un hueso, articulacion u otra estructura espedfica en el cuerpo para reparar, reemplazar o acrecentar.

En otra realizacion preferida, se siembran las celulas sobre un armazon que comprende un dispositivo protesico para implantacion en un paciente, como se describe en la patente de EE.UU. n. ° 6.200.606. Como se describe en la misma, se han desarrollado una variedad de dispositivos protesicos clmicamente utiles para uso en procedimientos de injerto de hueso y cartflago (vease, p.ej. Bone Grafts and Bone Substitutions. Ed. M. B. Habal & A. H. Reddi, W. B. Saunders Co., 1992). Por ejemplo, se han usado y continuan usandose ampliamente en el entorno clmico dispositivos de reemplazo de rodilla y cadera efectivos. Muchos de estos dispositivos se fabrican usando una variedad de materiales inorganicos que tienen baja actividad inmunogenica, que funcionan con seguridad en el cuerpo. Los ejemplos de materiales sinteticos que se han intentado y probado incluyen aleaciones de titanio, fosfato de calcio, hidroxiapatito ceramico y una variedad de aleaciones de acero inoxidable y cobalto-cromo. Estos materiales proporcionan soporte estructural y pueden formar un andamiaje en que pueden ocurrir vascularizacion del hospedador y migracion celular.

El armazon puede tratarse previamente a la inoculacion de las celulas de la invencion para potenciar la adhesion celular. Por ejemplo, previamente a la inoculacion con las celulas de la invencion, podnan tratarse matrices de nailon con acido acetico 0,1 molar e incubarse en polilisina, PBS y/o colageno para recubrir el nailon. Podna tratarse similarmente el poliestireno usando acido sulfurico.

Ademas, las superficies externas del armazon tridimensional pueden modificarse para mejorar la adhesion o crecimiento de las celulas y la diferenciacion del tejido, tal como por recubrimiento plasmatico del armazon o adicion de una o mas protemas (p. ej., colagenos, fibras elasticas, fibras reticulares), glicoprotemas, glicosaminoglicanos (p. ej., sulfato de heparina, 4-sulfato de condroitina, 6-sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de queratina) una matriz celular y/u otros materiales tales como, pero sin limitacion, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas vegetales, entre otros.

En algunas realizaciones, el andamiaje comprende o se trata con materiales que lo vuelven no trombogenico. Estos tratamientos y materiales pueden promover y mantener tambien el crecimiento endotelial, migracion y deposicion en matriz extracelular. Los ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero sin limitacion, materiales naturales tales como protemas de membrana basal tales como laminina y colageno de tipo IV, materiales sinteticos tales como ePTFE y siliconas de poliuretanourea segmentadas tales como PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif.). Estos materiales pueden tratarse ademas para volver el andamiaje no trombogenico. Tales tratamientos incluyen agentes antitromboticos tales como heparina, y tratamientos que alteran la carga superficial del material tales como recubrimiento plasmatico.

En algunas realizaciones, la superficie del andamiaje esta texturada. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invencion, el andamiaje se proporciona con un patron de surcos y rebordes. Los surcos son preferiblemente menores de aproximadamente 500 micrometros, mas preferiblemente menores de aproximadamente 100 micrometros y lo mas preferiblemente entre aproximadamente 10 nanometros y 10 micrometros. Tales "microsurcos" permiten a las celulas alinearse y/o migrar guiadas por los surcos de superficie.

En algunas realizaciones, es importante recrear en cultivo el microentorno celular encontrado in vivo, de tal modo que puede variar la medida en que las celulas de la invencion crecen antes de la implantacion in vivo o el uso in vitro. Ademas, pueden anadirse al medio de cultivo factores de crecimiento, agentes inductores de la diferenciacion condrogenica, agentes inductores osteogenicos y factores angiogenicos previamente, durante o despues de la inoculacion de las celulas para desencadenar la diferenciacion y formacion de tejido por las MPC o la progenie derivada de estas o los cocultivos de las mismas.

El armazon tridimensional puede modificarse de modo que se potencie el crecimiento de las celulas y la produccion de tejido en las mismas, o de modo que se reduzca el riesgo de rechazo del implante. Por tanto, pueden anadirse al armazon uno o mas compuestos biologicamente activos incluyendo, pero sin limitacion antiinflamatorios, inmunosupresores o factores de crecimiento.

Usos terapeuticos para la matriz extracelular o los lisados celulares

Como alternativa para implantar las celulas de la invencion, o el tejido vivo producido a partir de estas, un sujeto que necesita reparacion, reemplazo o acrecentamiento de tejidos se puede beneficiar de la administracion de un componente o producto de MEMP (en particular cuando se han modificado geneticamente), tal como la matriz extracelular (ECM) o el lisado celular producido por estas celulas.

En algunas realizaciones, despues de que las MEMP se han cultivado in vitro, tal como, por ejemplo, mediante el uso de un sistema de andamiaje tridimensional descrito en la presente, de modo que una cantidad deseada de ECM se secrete en el armazon. Una vez que ECM se secreta en el armazon, las celulas se pueden eliminar. La ECM se puede procesar para su uso posterior, por ejemplo, como una preparacion inyectable.

En algunas realizaciones, las celulas se destruyen y los residuos celulares (p. ej., las membranas celulares) se eliminan del armazon. Este proceso se puede realizar de diferentes formas. Por ejemplo, el tejido vivo puede congelarse rapidamente en nitrogeno Kquido sin un crioconservador, o el tejido puede sumergirse en agua destilada esteril para que las celulas estallen en respuesta a la presion osmotica. Una vez que las celulas han sido destruidas, se pueden alterar las membranas celulares y se pueden eliminar los residuos celulares mediante el tratamiento con un enjuague con detergente suave, como e Dt A, CHAPS o un detergente zwitterionico. Una ventaja de usar un enjuague de detergente suave es que solubiliza las protemas ligadas a la membrana, que suelen ser altamente antigenicas.

Alternativamente, el tejido se puede digerir enzimaticamente y/o extraer con reactivos que descomponen las membranas celulares. Algunos ejemplos de dichas enzimas incluyen, entre otros, la hialuronidasa, la dispasa, las proteasas y las nucleasas (por ejemplo, la desoxirribonucleasa y la ribonucleasa). Algunos ejemplos de detergentes incluyen detergentes no ionicos como, por ejemplo, alcohol de polieter alquilanlico (TRITON™ X-100), octilfenoxi polietoxietanol (Rohm and Haas Philadelphia, Pa.), BRIJ-35, un polietoxietanol lauril eter (Atlas Chemical Co., San Diego, Calif.), polisorbato 20 (TWEEN 20™), un monolaureato de sorbitan polietoxietanol (Rohm and Haas), polietileno lauril eter (Rohm and Haas); y detergentes ionicos como, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio, alcoholes alifaticos superiores sulfatados, alcanos sulfonados y alquilarenos sulfonados que contienen 7 a 22 atomos de carbono en una cadena ramificada o no ramificada.

Los andamiajes que comprenden la ECM se pueden utilizar terapeuticamente tal como se describe arriba. Alternativamente, ECM se puede recolectar del andamiaje. La recoleccion de la ECM se puede lograr de diversas maneras, dependiendo, por ejemplo, de si el andamiaje es biodegradable o no biodegradable. Por ejemplo, si el armazon es no biodegradable, la ECM se puede retirar sometiendo el armazon a sonicacion, chorros de agua a presion alta, raspado mecanico o tratamiento suave con detergentes o enzimas, o cualquier combinacion de los anteriores.

Si el armazon es biodegradable, la ECM se puede recolectar, por ejemplo, dejando que el armazon se degrade o se disuelva en solucion. Alternativamente, si el armazon biodegradable esta compuesto por un material que se puede inyectar junto con la ECM, el armazon y la ECM se pueden procesar en su totalidad para la inyeccion posterior. Alternativamente, la ECM se puede retirar del armazon biodegradable a traves de cualquiera de los procedimientos descritos arriba para la recoleccion de ECM a partir de un armazon no biodegradable. Todos los procesos de recoleccion se disenan preferentemente para no desnaturalizar el ECM o el lisado celular producido por las celulas de la invencion.

Las realizaciones de la presente invencion se describiran ahora con mas detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Sujetos, cultivo celular y anticuerpos.

Se obtuvieron aspirados de BM de la cresta ilfaca posterior de voluntarios adultos normales (20-35 anos) segun el consentimiento informado, de acuerdo con los procedimientos aprobados por el comite de etica del Royal Adelaide Hospital, Australia Meridional. Se obtuvieron celulas mononucleares de medula osea (BMMNC) mediante centrifugado en Ficoll 1,077 g/ml (Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Noruega) a 400 g durante 30 minutos (min) y despues se lavaron y se resuspendieron con solucion salina amortiguada de Hank que contema albumina de suero bovino al 1 % y HEPES 10 mM, pH 7,35 (HBSS). Se establecieron cultivos de BMSSC primarios en □-MEM suplementado con suero fetal de ternero al 20 % y 100 □ML-ascorbato-2-fosfato como se describio anteriormente (Gronthos and Simmons, Blood 85(4):929-940, 1995) para los ensayos de eficiencia de colonia, RT-PCR, inmunohistoqmmica y estudios de desarrollo. Se generaron lmeas celulares clonales de BMSSC mediante limitacion de la dilucion a partir de colonias de dfa 14 derivadas de celulas clasificadas STRO-1bri/VCAM-1+ como se describe abajo, despues del subcultivo en medio repleto de suero para la proliferacion, RT-PCR, inmunohistoqmmica y estudios de desarrollo.

El anticuerpo STRO-1 esta disponible a nivel comercial de R&D Systems (Minneapolis, EUA). Otros anticuerpos utiles en la presente invencion se presentan en la tabla 1.

Clasificacion celular activada por magnetismo (MACS).

Esto se realizo como se describio anteriormente (Gronthos y col., Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. En Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. y Beresford J.N. (eds). Cambridge University Press UK, capftulo 3, pags. 26-42, 1998; Gronthos and Simmons, Blood 85(4): 929-940, 1995). Se incubaron aproximadamente 1 x 108 BMMNC con sobrenadante de STRO-1 a una concentracion final de 10 pg/ml durante 60 min sobre hielo. Las celulas marcadas con STRO-1 se lavaron con HBSS y se resuspendieron en 1 ml de HBSS que contema una dilucion 1/50 de IgM antirraton de cabra biotinilada (espedfico de cadena p; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) o IgG antirraton de cabra biotinilada (espedfico de cadena y; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante 45 min en hielo, respectivamente. Despues de esto, se lavaron las celulas dos veces en amortiguador MACS (Ca2+ de fuerza unica y PBS libre de Mn2+ suplementado con BSA al 1 %, EDTA 5 mM y azida de sodio al 0,01 %) y se resuspendieron en 900 □ pl de amortiguador MACS al cual se le agregaron 100 pl de microperlas de estreptavidina (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, F.R.G.). Se incubaron adicionalmente las celulas durante 15 min sobre hielo y despues de esto se agrego directamente conjugado de estreptavidina-isotiocianato de fluorescema (FITC) (1/50; Caltag Laboratories, San Francisco, CA) a la suspension durante otros 5 min. Se separaron las celulas en una columna magnetica Mini MACS (capacidad de la columna 107 celulas, Miltenyi Biotec) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes.

Clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS).

Se marcaron las celulas aisladas por MACS STRO-1+ con FITC conjugado con estreptavidina y se incubaron entonces con anticuerpo 6G10 anti-CD106 (VCAM-1) purificado o anticuerpo anti-CD146 (Mu C-18) o control de isotipo 1B5 (10pg/ml) durante 30 minutos en hielo, se lavaron y se incubaron con anticuerpo de IgG de cabra antiraton conjugado con ficoeritrina (PE) (1/50; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante 20 minutos adicionales en hielo. Se clasificaron las celulas usando un citometro de flujo FACStarPLUS (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Se cultivaron las celulas STRO-1bri/CD106+ o STRO-1bri/CD146+ en modificacion alfa de medio de Eagle suplementado con 20 % de suero fetal de ternero, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2-fosfato (100 pM), iniciando el cultivo primario en 5 % de CO2 a 37 °C de atmosfera humidificada.

Analisis de citometrfa de flujo de uno y dos colores mediante inmunofluorescencia indirecta.

Este procedimiento se ha informado anteriormente (Gronthos y col., Isolation, Purification and In Vitro Manipulation of Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells. In Marrow Stromal Cell Culture. Owen M. y Beresford J.N. (eds). Cambridge University Press UK, capftulo 3, pags. 26-42, 1998). En resumen, cultivos primarios de celulas derivadas de MPC o MPC se liberaron mediante digestion de tripsina/EDTA y despues se incubaron durante 30 min sobre hielo. Se lavaron aproximadamente 2 x 105 celulas y despues se resuspendieron en 200 pl de coctel de anticuerpo primario durante 1 h en hielo. El coctel de anticuerpo primario consistfa en concentraciones saturantes del anticuerpo monoclonal de IgM de raton STRO-1 y/o un anticuerpo monoclonal de IgG de raton para fosfatasa alcalina humana (ALP, B4-78). Para la tincion con anticuerpos reactivos con antfgenos intracelulares, primero se lavaron las celulas con PBS y despues se permeabilizaron mediante tratamiento con etanol al 70 % en hielo durante diez minutos y despues se lavaron antes de la tincion. Se trataron los Mab de control negativo de IgM e IgG isotfpicos de raton en las mismas condiciones. Despues de la incubacion con anticuerpos primarios, se lavaron las celulas y se expusieron a niveles saturantes de FITC espedfico de cadena p de IgM antirraton de cabra (dilucion 1/50) y PE espedfico de y de IgG antirraton de cabra (dilucion 1/50) o PE espedfico de Ig anticonejo (dilucion 1/50) (Southern Biotechnology Associates) en un volumen final de 100 pl. Se incubaron las celulas durante 45 min en hielo, se lavaron dos veces y despues se fijaron con FAX FIX (PBS suplementado con 1 % (v/v), 2 % (p/v) de D-glucosa y 0,01 % de azida de sodio). Se analizaron entonces las celulas en un citometro de flujo Epics®-XL-MCL (Beckman Coulter, Hialeah, FL).

Marcado con ester de succinimidil-diacetato de carboxifluorescefna (CFSE).

Se utilizo la tinta a base de fluorescema permeable a las celulas CFSE para estudiar los cambios fenotfpicos y funcionales relacionados con la division durante el desarrollo de celulas derivadas de MPC. La CFSE se une covalentemente a los componentes citoplasmaticos de las celulas, lo que da como resultado una fluorescencia brillante y uniforme, que tras la division celular se distribuye equitativamente entre las celulas hijas. Esta tecnica permite la resolucion de hasta ocho ciclos de division celular por citometna de flujo. Las suspensiones de celulas unicas de celulas derivadas de MPC expandidas ex vivo se lavaron una vez, se resuspendieron en 1 ml de PBS/BSA al 0,1 % y 2 pl de CFSE 5 mM (10 pM final) se agrego antes de la incubacion a 37 °C durante 10 min. Se inactivo la tincion mediante el agregado de 5 volumenes de medio de cultivo helado a-MEM-10 y se incubo en hielo durante 5 min. Se lavaron las celulas tres veces en el medio de cultivo y despues se colocaron en placas a densidad baja 1 X 105 en matraces de cultivo (T-25). En diferentes momentos, se separaron las celulas mediante tripsina-EDTA y se analizaron mediante analisis de citometna de flujo.

Analisis de reaction en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (PCR-TI)

Los cultivos derivados de MPC primarias se liberaron mediante tratamiento con tripsina/EDTA y despues se tineron con sobrenadante de STRO-1 como se describe arriba. Despues del lavado, se incubaron las celulas con anticuerpo de IgM antirraton de cabra conjugado con ficoeritrina (PE) (1/50; Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) durante otros 20 minutos en hielo. Se clasificaron las celulas usando un citometro de flujo FACStarPLUS (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA). Se preparo ARN celular total a partir de 2 x 106celulas primarias clasificadas STRO-1bri o STRO-1dim, sedimentos de condrocitos y otros cultivos inducidos y se lisaron utilizando el procedimiento de extraccion RNAzolB (Biotecx Lab. Inc., Houston, TX), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se uso entonces ARN aislado de cada subpoblacion como molde para la smtesis de ADNc, preparado usando un kit de smtesis de ADNc de primera hebra (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Se evaluo la expresion de diversas transcripciones mediante amplificacion por PCR utilizando un protocolo estandar tal como se describio anteriormente (Gronthos y col., J. Bone and Min. Res. 14:48-57, 1999). Los conjuntos de cebadores utilizados en el presente estudio se muestran en la tabla 2. Despues de la amplificacion, se analizo cada mezcla de reaccion por electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % y se visualizo por tincion con bromuro de etidio. Se valoro la integridad del ARN mediante la expresion de GAPDH.

Diferenciacion de CFU-F in vitro.

Se han informado anteriormente las condiciones para la induccion de celulas estromales de BM humana para desarrollar una matriz osea mineralizada in vitro cultivada en aMEM suplementado con FCS al 10 %, L-ascorbato-2-fosfato 100 |j M, dexametasona 10-7M y fosfato inorganico 3 mM (Gronthos y col., Blood. 84: 4164-4173, 1994). Se identificaron depositos minerales mediante tincion positiva de von Kossa. Se indujo la adipogenesis en presencia de metilisobutilmetilxantina 0,5 mM, hidrocortisona 0,5 j M e indometacina 60 j M como se describio anteriormente (Gimble, J. M. Marrow stromal adipocytes. In Marrow stromal cell culture. Owen M. y Beresford J.N. (eds). Cambridge: Cambridge University Press UK. capttulo 5, pags. 67-87, 1998). La tincion con aceite rojo O se utilizo para identificar celulas grasas cargadas con lfpido. Se evaluo la diferenciacion condrogenica en cultivos agregados tratados con 10 ng/ml de TGF-p3 como se describe (Pittenger y col., Science, 284:143-147, 1999).

Ensayo in vivo de formation osea.

Se tripsinaron las celulas adheridas derivadas de celulas STRO-1bl7VCAM-1+ en el pasaje 2-3, se mezclaron con 40 mg de partmulas de ceramica de hidroxiapatita/fosfato tricalcico (Zimmer Corporation, Varsovia, IN) y despues se implantaron en bolsas subcutaneas en la superficie dorsal de ratones SCID de dos meses de edad como se describio anteriormente (Gronthos y col., Proceedings of the National Academy of Sciences (EUA), 97 (25): 13625-13630, 2000). Se practicaron estos procedimientos de acuerdo con las especificaciones de un protocolo animal aprobado (Adelaide University AEC n. ° M/079/94). Se recuperaron los implantes despues de 6-8 semanas, se fijaron en paraformaldehndo al 4 % durante 2 dfas, despues se decalcificaron durante otros diez dfas en EDTA al 10 % antes de incrustarse en parafina. Para el analisis histologico, se prepararon secciones de 5 jm de los implantes y se tineron con hematoxilina y eosina (Gronthos y col., Proceedings of the National Academy of Sciences (EUA), 97 (25): 13625-13630, 2000).

Desarrollo de tejido neural. Se cultivan cultivos de monocapa en medio de neuroblastos A (Invitrogen/GIBCO) suero de caballo al 5 %, suero fetal de ternero al 1 %, L-glutamina (2 mM), transferrina (100 jg/ml), insulina (2 jg/ml), acido retinoico 0,5 mM, factor neurotrofico derivado de cerebro (10 ng/ml).

Desarrollo de grasa. Se cultivan cultivos de monocapa en modificacion alfa de medio de Eagle (JRH) suplementado con suero fetal de ternero al 10 %, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2-fosfato (100 j M), metilisobutilxantina 0,5 mM, hidrocortisona 0,5 mM, indometicina 60 mM.

Desarrollo de cartflago: Se cultivan cultivos de sedimento en tubos de polipropileno en modificacion alfa de medio de Eagle suplementado con albumina de suero bovino al 1 %, transferrina (100 jg/ml), insulina (2 jg/ml), L-glutamina (2 mM), ascorbato-2-fosfato (100 jM/ml), dexametasona (10‘8M) con BMP-7(50ng/ml), TGFp3(10ng/ml).

Desarrollo de musculo esqueletico/cardfaco. Se cultivan cultivos de monocapa en modificacion alfa de medio de Eagle suplementado con suero fetal de ternero al 10 %, L-glutamina (2 mM), ascorbato-2-fosfato (100 jM /m l) y 5-azacitodina (5 jM/ml).

Desarrollo epitelial. Se cultivan cultivos de monocapa en medio basal de queratinocitos (Clontenics) suplementado con extracto pituitario bovino (50 jg/ml), factor de crecimiento epidermico (10 ng/ml), hidrocortisona (0,5 jg/ml), insulina (5 jg/ml).

Desarrollo de osteoblastos, tendon, ligamento u odontoblastos. Se cultivan cultivos de monocapa en modificacion alfa de medio de Eagle suplementado con suero fetal de ternero al 10 %, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2-fosfato (100 j M), dexametasona (10-7M) y BMP-2 (50 ng/ml)

Desarrollo de celulas de musculo liso o pericitos. Se cultivaron cultivos de 20.000 MPC cultivadas ex vivo por pocillo en modificacion alfa de medio de Eagle suplementado con suero fetal de ternero al 10 %, L-glutamina 2 mM, ascorbato-2-fosfato (100j M), factor de crecimiento derivado de plaquetas-BB (10 ng/ml) suspendido en 200^1 de matrigel en placas de 48 pocillos.

EJEMPLO 1: las celulas cultivadas Stro-1dim son celulas precursoras mas comprometidas, mientras que las celulas Stro-1bri son celulas precursoras menos comprometidas.

Se informo anteriormente que las celulas precursoras mesenquimales multipotenciales (MPC) se pueden purificar a partir de celulas mononucleares de medula osea humana de adulto basandose en el fenotipo STRO-1bri/VCAM-1 (CD106)+ o STRO-1 bri/MUC-18 (CD146)+(Gronthos y col. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003; Shi y Gronthos JBMR 18(4): 696-704, 2003; PCTAU2004/000416). La poblacion de MPC se puede expandir facilmente in vitro en condiciones de cultivo definidas (Gronthos y col. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003). Ahora presentamos datos que caracterizan la progenie de MPC expandida ex vivo basandose en marcadores asociados con diferentes linajes celulares, a nivel de ARNm y de protema, utilizando reaccion en cadena de la polimerasa de transcripcion inversa (RT-PCR) y analisis de citometna de flujo, respectivamente. Mientras que todas las MPC de medula osea recien aisladas expresan STRO-1 en niveles altos (Stro-1bri), la mayona de las celulas regulan por disminucion la expresion de STRO-1 (Stro-1dim) despues de la expansion ex vivo (Gronthos y col. J. Cell Sci 116:1827-1835, 2003). En la primera serie de experimentos, se empleo analisis RT-PCR semicuantitativo para analizar el perfil de expresion genica de diversos genes asociados con el linaje expresados por poblaciones de STRO-1dim o STRO-1bri, aisladas por clasificacion celular activada por fluorescencia (figura 1A). Se evaluo la expresion genica relativa para cada marcador celular con referencia a la expresion del gen constitutivo, GAPDH, utilizando el software ImageQant (figura 1B, C). Ademas, se utilizo analisis de citometna de flujo de color doble para analizar el perfil de expresion de protemas de MPC expandidas ex vivo basandose en su expresion de una gama mas amplia de marcadores asociados con el linaje celular en combinacion con el anticuerpo STRO-1 (figura 2). Se presenta un resumen del fenotipo general basado en la expresion genica y de protemas de celulas cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri en la tabla 3. Los datos indican que las MPC STRO-1bri expandidas ex vivo presentan una expresion diferencialmente mayor de marcadores asociados con celulas perivasculares, incluida angiopoyetina-1, VCAM-1, SDF-1, IL-1p, TNFa y RANKL. Por el contrario, las celulas STRO-1dim expandidas ex vivo expresaron niveles mas altos de nestina, GFAP, osterix, osteocalcina, SOX9, GATA-4, leptina y cadena pesada de miosina de musculo liso. Por lo tanto, parece que las MPC STRO-1bri expandidas ex vivo presentan un fenotipo mas inmaduro y tipo perivascular en comparacion con las celulas STRO-1dim que presentan una caractenstica de fenotipo de tipos de celulas precursoras mas comprometidas que incluyen condroblastos, osteoblastos, adipoblastos, celulas epiteliales, progenitores neurales y cardiomioblastos. Las comparaciones entre los perfiles de expresion genica y de protemas de las celulas cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri se resumen en las tablas 3, 4 y 5. Se muestra una comparacion de la expresion de marcadores entre MPC recien aisladas y progenie de MPC cultivada STRO-1bri (MEMP) en la tabla 6.

EJEMPLO 2: capacidad diferencial de celulas cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri (MEMP) de diferenciarse in vitro.

Despues se analizo si las diferencias observadas en los perfiles de expresion genica y de protemas de las celulas cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri reflejaba diferencias funcionales en su capacidad de diferenciarse en multiples linajes celulares. Se aislaron cultivos de celulas derivadas de STRO-1 bri/CD146+ expandidas ex vivo por FACS basandose en su expresion de antfgeno de STRO-1 tal como se describe arriba. Las celulas cultivadas STRO-1dim y STRO-1bri aisladas por FACS se colocaron en placas posteriormente en condiciones inductivas para la formacion de grasa (figura 3), hueso (figura 4) y cartflago (figura 5). En todos los casos, las celulas cultivadas STRO-1bri mostraron mayor capacidad de formar grasa, hueso y cartflago en las condiciones especificadas en comparacion con las celulas cultivadas STRO-1dim. Los datos de estos experimentos corroboran los resultados de la expresion genica y de protemas obtenidos anteriormente, lo que demuestra que las celulas cultivadas STRO-1bri son una poblacion primitiva que contiene una proporcion alta de celulas precursoras menos comprometidas que se pueden influenciar para diferenciarse hacia cualquier linaje celular especificado en las condiciones de cultivo adecuadas (figuras 3, 4, 5) y se pueden denominar MPC. Por el contrario, las celulas cultivadas STRO-1dim contienen una proporcion alta de celulas comprometidas que representan diversos linajes y se pueden denominar TSCC. Se propone que la poblacion Stro-1dim es heterogenea y comprende celulas comprometidas por separado con una gama de tipos de tejidos diferentes.

EJEMPLO 3: las celulas STRO-1bri (MEMP) pueden modificar el potencial de crecimiento de las celulas comprometidas especificas del tejido (TSCC) in vitro e in vivo.

La identificacion de las dos poblaciones de celulas derivadas de MPC expandidas ex vivo que representa diferentes etapas de desarrollo tiene implicaciones significativas en el uso de preparaciones cultivadas completas derivadas de celulas Stro-1bri para terapias clmicas. Se disenaron estudios iniciales para analizar la influencia de MPC cultivadas STRO-1bri primitivas, menos comprometidas sobre el crecimiento de TSCC cultivadas STRO-1dim mas maduras y comprometidas. Los experimented se disenaron para agregar porcentajes crecientes de MPC cultivadas STRO-1bri aisladas por FACS con TSCC cultivadas STRO-1dim aisladas por FACS, marcadas anteriormente con una etiqueta fluorescente, CFSE. La figura 6 muestra que la proliferacion de celulas STRO-1dim marcadas es efectuada por la presencia de celulas STRO-1bri no marcadas. Cuando una celula marcada con CFSE se divide, las dos celulas hijas contienen la mitad de fluorescencia que la celula original. Por lo tanto, las diferentes generaciones de celulas hijas se representan como distribuciones fluorescentes con intensidad de fluorescencia cada vez menor y proporcional, donde la curva en el extremo derecho del histograma (intersectada por una lmea vertical) representa el punto de la poblacion de STRO-1dim inicial (figura 6). Los datos demostraron que una mayor proporcion de celulas STRO-1dim se estimulo para aumentar los indices de proliferacion, donde se muestra que mas celulas sufren al menos 3 a 4 divisiones, despues del agregado de mas del 5 % de celulas STRO-1bri. Por lo tanto, se deduce que para conseguir una expansion ex vivo sostenible y eficiente de celulas derivadas de MPC no fraccionadas, los cultivos requieren la presencia de mas del 5 % de celulas STRO-1bri dentro de la poblacion.

Se realizaron otras investigaciones para determinar si MPC cultivadas STRO-1bri mas primitivas, menos comprometidas tambien podfan afectar la capacidad de proliferacion de TSCC in vivo. Se utilizaron dos modelos in vivo para abordar esta pregunta. El primer modelo empleo ratas lampinas atfmicas que se habfan sometido a ligacion de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y se inyectaron 48 horas mas tarde con solucion salina, celulas STRO-1dim y STRO-1bri humanas cultivadas aisladas por FACs y aspirados nuevos de celulas mononucleares de medula osea con agotamiento de STRO-1 (figura 7). Despues de dos semanas, se sacrifico a los animales y se fijaron los tejidos cardfacos y se tineron de forma concomitante con dos anticuerpos monoclonales: el primero fue reactivo selectivamente con antfgeno Ki67 de rata, pero no de humano, y el segundo fue reactivo con el marcador de cardiomiocitos troponina I. Las celulas doblemente tenidas, que indican la proliferacion de cardiomiocitos de rata, se detectaron mediante tecnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron celulas humanas STRO-1bri presentaron cantidades 2,5-5 veces mayores de cardiomiocitos de rata proliferantes en comparacion con los animales de control que recibieron solucion salina o celulas humanas STRO-1dim (figura 7).

El segundo modelo utilizo ratas lampinas atfmicas inyectadas por via subcutanea con celulas tumorales de glioblastoma de rata, que secretan VEGF de forma constitutiva. Dos semanas despues, las ratas recibieron inyecciones intratumorales con solucion salina, celulas humanas STRO-1dim o STRO-1bri aisladas por FACS (figura 8). Una semana despues, se sacrificaron los animales y se fijaron los tejidos tumorales y se tineron concomitantemente con dos anticuerpos monoclonales: el primero es reactivo con el antfgeno de actina de musculo liso alfa expresado por celulas de musculo liso y el segundo es reactivo con el antfgeno vWF expresado por celulas endoteliales vasculares. Las estructuras doblemente tenidas, que indican arteriolas y arterias que contienen endotelio y musculo liso, fueron detectadas mediante la tecnica de inmunoperoxidasa. Los animales que recibieron celulas humanas STRO-1bri demostraron cantidades 3,5-8 veces mayores de arteriolas y arterias en el sitio de inyeccion celular en los tumores en comparacion con los animales de control que recibieron solucion salina o celulas humanas STRO-1dim (figura 8). No se observaron diferencias en los sitios distales del lugar donde se inyectaron las celulas humanas.

EJEMPLO 4: aumento en la cantidad de MEMP STRO-1brien cultivos celulares derivados de celulas positivas STRO-1.

Despues de demostrar la capacidad de las MEMP cultivadas STRO-1bri de aumentar la proliferacion de mas TSCC, se analizo el efecto de una gama de factores de crecimiento de aumentar la proporcion de MPC STRO-1bri expandidas ex vivo (figura 9). Se cultivaron los cultivos establecidos derivados de celulas de medula osea aisladas STRO-1bri/CD146+ en medio basal complementado con FCS al 10 % (A), o una gama de factores, incluidos 1x10'8 M 1a,25-dihidroxivitamina D3 (1,25D) (B), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) 10 ng/ml (C), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a) 10 ng/ml (D); interleucina-1p 10 ng/ml (IL-1p) (E) y factor derivado de estroma 1-alfa (SDF-1a) 30 ng/ml (F) durante 5 dfas, tenido con mAb STRO-1. (Figura 9). Se descubrio que estos factores aumentaban en gran medida la cantidad de MPC STRO-1bri in vitro.

Para investigar los mecanismos de como estos factores mejoraron el porcentaje de celulas con expresion de STRO-1bri despues de la expansion ex vivo, se marcaron Stro-1bri cultivadas con CFSE como se describe en el procedimiento y despues se expusieron a diversos factores. La figura 10 muestra un experimento representativo, donde IL-1 p aumento el potencial proliferativo de MPC marcadas con CFSE como se describe en los procedimientos. Se cultivaron las celulas en presencia de IL-1p 10 ng/ml durante 5 dfas, se tineron con mAb STRO-1 y se analizaron tal como se describe arriba. Se descubrio que IL-1 p aumento la cantidad de divisiones de MPC mediante el aumento de la cantidad de celulas osteoprogenitoras STRO-1 brillantes. Tambien se obtuvieron resultados similares 1,25D, PDGF-BB, TNF-a, IL-1p y SDF-1a se utilizaron para estimular las MPC.

EJEMPLO 5: el aumento de la proliferacion de las celulas Stro-1bri tambien aumenta la cantidad de celulas Stro-1dim.

La capacidad de mejorar la proporcion de MEMP cultivadas STRO-1bri en presencia de diversos factores tambien se correlaciona con un aumento en la cantidad de celulas Stro-1dim Por ejemplo, las celulas STRO-1bri/fos. alq.+ (figura 10B) un fenotipo que coincide con las celulas pre-osteoblasticas (Gronthos y col., J Bone Miner Res. 14: 47-56, 1999; Pan y col., Bone 34(1):112-23, 2004). Por lo tanto, analizamos si este cambio en el fenotipo tambien se correlaciona con una mayor capacidad de las MPC STRO-1bri inducidas de diferenciarse en celulas formadoras de huesos, osteoblastos. La figura 11 muestra que IL-1p no solo estimulo la proliferacion de MPC STRO-1 positivas estimuladas, sino que tambien aumento su potencial de formacion de hueso en presencia del agente osteoinductivo, dexametasona. IL-1p a una concentracion de 0,01 ng/ml aumento significativamente la cantidad de MPC a 136,6 ± 1,2 % de cultivos de control no tratados (figura 11A). Se logro un efecto de meseta a concentraciones mayores que 0,1 ng/ml. Se sembro la progenie de MPC expandida ex vivo en placas de 24 pocillos en presencia de condiciones osteoinductivas, tal como se describe en los procedimientos. Tambien se trataron las celulas con IL-1p a una concentracion de 10 ng/ml y los cultivos se "alimentaron" semanalmente con medio nuevo que contema IL-1 p. Se determino la concentracion de calcio de matriz extracelular absoluta de acuerdo con los procedimientos. Los resultados mostraron que el deposito mineral aumento en las celulas tratadas con IL-1 p (figura 11C) en comparacion con las celulas no tratadas (figura 11B). El nivel de calcio en las celulas tratadas con IL-1p fue significativamente mayor que en las celulas no tratadas en la semana 4 y la semana 6.

Los datos presentados en la figura 12 sugieren que IL-1p estimulo la proliferacion y MPC STRO-1Bri, lo que provoco una expansion de los oetoprogenitores, mientras que el agregado posterior de un agente de diferenciacion secundario, dexametasona, indujo la expresion de fosfatasa alcalina (ALP) y la perdida de expresion de STRO-1, lo que aumento de forma efectiva la cantidad de osteoblastos funcionales in vitro. El concepto de que diferentes factores pueden expandir y regular la poblacion de MPC STRO-1Bri se evaluo adicionalmente in vivo. Se cultivaron cultivos secundarios semiconfluentes de ex vivo expandidas a partir de MPC Stro-1bri en presencia o ausencia de PDGF-BB (10 ng/ml) un factor adicional que se sabe que aumenta la cantidad de MPC STRO-1bri expandidas ex vivo (consulte la figura 9C). Posteriormente, se cotrasplantaron preparaciones de celulas inducidas por PDGF y no inducidas con partfculas de hidroxiapatita/fosfato tricalcico (HA/TCP) en ratones inmunodeprimidos tal como se describe en los procedimientos. Despues de ocho semanas, el analisis de los trasplantes recolectados mostro que los cultivos pretratados con PDGF-BB mostraron formacion osea significativamente mas ectopica (figura 13C) en comparacion con los cultivos de control no tratados (figura 13B) segun lo cuantificado por Scion Imaging (figura 13A).

EJEMPLO 6: MPC STRO-1bri no comprometidas que carecen de expresion detectable de ALP persisten en cultivos ex vivo de MPC derivados de BM seleccionados por STRO-1.

Se prepararon aspirados de BM humana tal como se describe en los procedimientos y se recuperaron las MPC por seleccion MACS utilizando el mAb STRO-1. Utilizando inmunofluorescencia indirecta y citometna de flujo, se evaluo la fraccion positiva de MACS (celulas utilizadas para establecer el cultivo de inicio o P0) para detectar la proporcion de celulas que expresaban el antfgeno STRO-1 en niveles altos (STRO-1bright) y resulto ser 22,4 % de la poblacion total (no se muestran los datos). Estas celulas despues se colocaron en placas a 1 x 104 celulas por cm2 y se cultivaron en medio repleto de suero hasta lograr una confluencia del 80-90 %, como se describio anteriormente (Gronthos y col. Journal of Cell Science 116: 1827-1835, 2003). En cada pasaje, se separaron las celulas como se describe en los procedimientos y se volvieron a sembrar a 1 x 104 celulas por cm2. Se tineron muestras de celulas de cada pasaje para su expresion de STRO-1 y el marcador de TSCC, fosfatasa alcalina (ALP). Como se muestra en la figura 14, despues de 4 pasajes, mientras que la proporcion de celulas que expresan STRO-1 en niveles altos (y que carecen de niveles apreciables del marcador de TSSC, ALP) habfa cafdo a 12,7 %, estos cultivos todavfa conteman cantidades considerables de MEMP STRO-1briALP.

Tabla 1. Anticuerpos utilizados en la presente patente

Tabla 2. Cebadores de RT-PCR y condiciones para la amplificacion espedfica de ARNm humano

Tabla 3. Resumen de la expresion genica relativa en poblaciones de STRO-1Bri y STRO-1Dim. Se presenta una lista de genes que mostraron expresion medible y diferencial entre las poblaciones de STRO-1Bri y STRO-1Dim segun lo determinado mediante PCR de transcripcion inversa. Los valores representan la expresion genica relativa con referencia al gen constitutivo, GAPDH.

Tabla 4. Resumen de la expresion de la protema relativa en poblaciones de STRO-1bri y STRO-1dim. Se presenta una lista de protemas que mostraron expresion diferencial entre las poblaciones de STRO-1bri y STRO-1dim segun lo determinado mediante citometna de flujo. Los valores representan la intensidad de fluorescencia media relativa de la tincion segun lo descrito en la figura 2.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para aumentar la generacion de progenie de celulas precursoras mesenquimales expandidas multipotenciales (MEMP) que tienen el fenotipo Stro-1bri, ALP-, comprendiendo el procedimiento el cultivo de celulas progenitoras mesenquimales STRO-1brightALP+ (MPC) en presencia de uno o mas factores estimulantes seleccionados de entre el grupo que consiste en 1a,25-dihidroxivitamina D3(1,25D), factor de necrosis tumoral a (TNF-a) e interleucina-1p (IL-1p).

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1 donde las MPC STRO-1brightALP+ del mismo se cultivan en presencia de dos o mas factores estimulantes.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde las MPC STRO-1brightALP+ se han expandido ex vivo.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde las MPC STRO-1brightALP+ son una poblacion no expandida de MPC aisladas.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la estimulacion da lugar a un aumento en la progenie de MPC que tiene el fenotipo Stro-1bri, ALP- de mas del 10 % con respecto a los controles no estimulados.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la estimulacion da lugar a un aumento en la progenie de MPC que tiene el fenotipo Stro-1bri, ALP' de mas del 50 % con respecto a los controles no estimulados.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde las MPC STRO-1brightALP+ se derivan de uno o mas tejidos que consisten en el grupo que comprende medula osea, celulas de la pulpa dental, tejido adiposo y piel, tejido adiposo, dientes, pulpa dental, piel, hngado, rinon, corazon, retina, cerebro, folfculos pilosos, intestino, pulmon, bazo, ganglio linfatico, timo, pancreas, hueso, ligamento, medula osea, tendon y musculo esqueletico.