ES2710452T3 - Vectores de terapia génica para la adrenoleucodistrofia y la adrenomieloneuropatía - Google Patents

Vectores de terapia génica para la adrenoleucodistrofia y la adrenomieloneuropatía Download PDF

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Abstract

Vector lentiviral que comprende: (a) una LTR de VIH-1 izquierda (5'); (b) una señal de empaquetamiento Psi (Ψ ); (c) un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); (d) un elemento de exportación retroviral de RRE; y (e) un promotor con sitio de unión a cebador dl587rev sustituido, con región de control negativo delecionada, potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (MND), unido operativamente a un ADNc que codifica para un polipéptido de casete de unión a ATP humano, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); (f) una LTR de VIH-1 de autoinactivación (SIN) derecha (3'); y (g) una secuencia de poliadenilación de β-globina de conejo sintética; en el que el vector lentiviral no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).

Description

DESCRIPCION
Vectores de terapia genica para la adrenoleucodistrofia y la adrenomieloneuropatfa
Antecedentes
Campo tecnico
La presente invencion se refiere generalmente a vectores de terapia genica. En particular, la presente invencion se refiere a vectores lentivirales que proporcionan terapia genica para la adrenoleucodistrofia y la adrenomieloneuropatfa.
Descripcion de la tecnica relacionada
La adrenoleucodistrofia cerebral infantil (CCALD) es un trastorno neurologico genetico ligado al cromosoma X muy raro, a veces rapidamente progresivo en ninos varones (edad media de edad de aparicion 7; intervalo 3-15 anos) que, si no se trata, conduce a un estado vegetativo, y en ultima instancia a la muerte, en el plazo de una media de 5 anos tras el diagnostico.
La CCALD a menudo se presenta inicialmente como enfermedad de Addison, pero el diagnostico se realiza habitualmente basandose en disminuciones “repentinas” de atencion, pensamiento, concentracion, y otras funciones cerebrales con hallazgos confirmatorios de desmielinizacion cerebral en imagenes de resonancia magnetica (MRI). Antes de la desmielinizacion, la MRI del cerebro del paciente es normal, y no hay anomalfas en el desarrollo neurologico. El transcurso clmico puede ser “lento” al principio, pero puede volverse rapidamente progresivo e irreversible con la perdida generalizada de mielina en el cerebro. Los terminos “lento” y “repentino” son relativos en que la duracion de desmielinizacion no se conoce realmente, pero la rapida disminucion de la funcion cognitiva y motora puede producirse en cualquier momento y por motivos desconocidos. En efecto, los cambios en la MRI preceden a los smtomas, y pueden ser completamente anomalos con desmielinizacion generalizada en un momento cuando hay muy pocas manifestaciones clmicas de la enfermedad. La incidencia de adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X (ALD) en los Estados Unidos es de aproximadamente 1:21.000 nacimientos de varones con aproximadamente el 35% que desarrolla CCALD; se diagnostican aproximadamente de 35 a 40 ninos varones con CCALD cada ano. La causa de la enfermedad es una mutacion del gen de miembro 1 (ABCD1), de la subfamilia D (ALD), de casete de union a ATP que conduda a un producto genico de la protema de adrenoleucodistrofia disfuncional o ausente (ALDP). La ALDp se localiza en los peroxisomas celulares, donde participa en la degradacion de acidos grasos de cadena muy larga (VLCFA) (longitudes de cadena de > 20 carbonos) a acidos grasos mas cortos, que se usan para mantener la estructura y funcion celulares.
La fisiopatologfa de las manifestaciones en el sistema nervioso central (SNC) de CCALD no se entiende bien, pero la desmielinizacion surge debido a una acumulacion local de VLCFA que no puede metabolizarse porque la ALDP defectuosa no admite ese proceso en la microglia cerebral. La fase rapidamente progresiva de la enfermedad esta provocada por inflamacion, posiblemente provocada por acilacion de protemas celulares por los VLCFA, lo que aumenta la perdida de mielina. La fase rapidamente progresiva de CCALD puede dar como resultado que un nino se deteriore desde una capacidad funcional normal a estar gravemente discapacitado en el plazo de meses.
El unico tratamiento disponible es el trasplante de celulas madre hematopoyeticas alogenicas (HCT) para proporcionar celulas que producen ALDP funcional. Puesto que las microglias cerebrales se derivan de la medula osea, el trasplante de celulas madre humanas de un donante emparentado totalmente compatible usando celulas que producen ALDP funcional puede mejorar o detener potencialmente el avance de la desmielinizacion. Sin embargo, dado que se tarda de 12 a 18 meses en que el HCT alogenico estabilice la enfermedad, y dada la naturaleza progresiva de la enfermedad, el trasplante debe realizarse lo antes posible tras el diagnostico. Esto es a veces problematico debido a los tiempos de anticipacion diagnostica necesarios para encontrar donantes de celulas madre de medula osea emparentados o no emparentados compatibles. El uso de celulas madre alogenicas tambien presenta un riesgo de fallo del injerto y el desarrollo de enfermedad injerto contra huesped aguda y cronica (GvHD). Estas complicaciones pueden conducir a muerte y su incidencia aumenta cuando se usan donantes no emparentados como fuente de celulas madre hematopoyeticas alogenicas.
Otra fuente de reemplazo de ALDP es el uso de trasplantes de celulas de sangre del cordon umbilical compatibles, mas normalmente, parcialmente compatibles. El uso de celulas madre de sangre del cordon umbilical (CBSC) es problematico, con un riesgo de fallo del injerto y tiempo prolongado para incorporacion del injerto lo que requiere soporte de transfusion prolongado. En efecto, todas las formas de HCT alogenico implican un 10-15% de riesgo de mortalidad relacionada con el trasplante, y hasta un 30% de riesgo de enfermedad de injerto contra huesped cronica. Biffi et al., Hum Mol Genet., 2011,20(R1):R42-53, dan a conocer una estrategia de terapia genica para tratar leucodistrofias usando vectores lentivirales. El documento WO 02/087341 da a conocer LTR retrovirales para su uso en vectores lentivirales de terapia genica.
Por tanto, existe la necesidad en la tecnica de terapias contra la adrenoleucodistrofia mas seguras y mas eficaces. La presente invencion proporciona soluciones a estos y otros problemas.
Breve sumario
Por tanto, la aparicion de la frase “en una realizacion” en diversos sitios en la totalidad de esta memoria descriptiva no se refiere necesariamente a la misma realizacion. Ademas, los rasgos, estructuras o caractensticas particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o mas realizaciones.
La presente invencion se refiere a un vector lentiviral que comprende: (a) una LTR de VIH-1 izquierda (5'); (b) una senal de empaquetamiento Psi (Y); (c) un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); (d) un elemento de exportacion retroviral de RRE; y (e) un promotor con sitio de union a cebador dl587rev sustituido, con region de control negativo delecionada, potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (MND), unido operativamente a un ADNc que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP humano, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); (f) una LTR de v IH-1 de autoinactivacion (SIN) derecha (3'); y (g) una secuencia de poliadenilacion de p-globina de conejo sintetica; en el que el vector lentiviral no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
La presente invencion se refiere ademas a una celula de mairnfero que comprende dicho vector lentiviral.
La presente invencion se refiere ademas a una celula de empaquetamiento que comprende: un primer polinucleotido que codifica para gag, un segundo polinucleotido que codifica para pol, un tercer polinucleotido que codifica para env y dicho vector lentiviral.
La presente invencion se refiere ademas a una celula productora que comprende dicho vector lentiviral.
La presente invencion se refiere ademas a una partfcula de vector producida por dicha celula productora.
La presente invencion se refiere ademas a una celula huesped transducida con dicho vector lentiviral, en la que la celula es una celula madre somatica, una celula progenitora o una celula madre hematopoyetica, y en la que la celula no es una celula madre embrionaria humana.
La presente invencion se refiere ademas a una celula progenitora o madre hematopoyetica transducida con dicho vector, para su uso en un metodo de tratamiento de adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatia.
La presente invencion se refiere ademas a dicho vector lentiviral, para su uso en terapia genica, en el que la terapia genica trata o previene la adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatfa.
En diversos ejemplos, la presente divulgacion contempla, en parte, un vector que comprende: una LTR retroviral izquierda (5'); un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportacion retroviral; un promotor activo en una celula microglial, unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); y una LTR retroviral derecha (3'); en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En ejemplos particulares, el vector es un vector lentiviral.
En ejemplos relacionados, el lentivirus es VIH.
En ejemplos mas particulares, el lentivirus es VIH-1.
En determinados ejemplos, el promotor de la LTR 5' se reemplaza con un promotor heterologo.
En ejemplos adicionales, el promotor heterologo es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de virus del sarcoma de Rous (VSR), o un promotor del virus de simio 40 (SV40).
En ejemplos adicionales particulares, el promotor heterologo es un promotor de CMV.
En ejemplos adicionales, la LTR 5' o LTR 3' es una LTR lentiviral.
En otros ejemplos, la LTR 5' y LTR 3' son LTR lentivirales.
En determinados ejemplos particulares, el lentivirus es VIH-1.
En ejemplos particulares, la LTR 3' comprende una o mas modificaciones.
En determinados ejemplos particulares, la LTR 3' comprende una o mas deleciones.
En ejemplos adicionales, la LTR 3' es una LTR de autoinactivacion (SIN).
En algunos ejemplos, el elemento de exportacion retroviral es un elemento de respuesta rev (RRE).
En ejemplos adicionales, el cPPT/FLAP es de VIH-1.
En determinados ejemplos, el promotor comprende un promotor sustituido de sitio de union a cebador dl587rev en la region de control negativo delecionada, potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (MND) o fragmento transcripcionalmente activo del mismo.
En ejemplos particulares, el polinucleotido que codifica para el polipeptido de ABCD1 es un ADNc.
En ejemplos relacionados, el ADNc comprende una secuencia de Kozak optimizada.
En determinados ejemplos, la secuencia de Kozak optima es (GCC)RCCATGG, en la que R es una purina (A o G). En ejemplos particulares, el polinucleotido codifica para un polipeptido de ABCD1 humano.
En diversos ejemplos, la presente divulgacion contempla, en parte, un vector lentiviral que comprende: una LTR izquierda (5'); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor MND unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de ABCD1 humano; una LTR derecha (3'); y una secuencia de poliadenilacion; en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En ejemplos particulares, el vector lentiviral comprende una senal de empaquetamiento Psi (Y).
En determinados ejemplos, la secuencia de poliadenilacion es una secuencia de poliadenilacion de p-globina de conejo de senal o poliadenilacion de hormona del crecimiento bovino.
En determinados ejemplos particulares, el vector lentiviral comprende una LTR 5' o LTR 3' de VIH-1.
En ejemplos adicionales, la LTR 3' es una LTR de SIN.
En diversas realizaciones, la presente invencion contempla, en parte, un vector lentiviral que comprende: una LTR de VIH-1 izquierda (5'); una senal de empaquetamiento Psi (Y); un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportacion retroviral de RRE; un promotor con sitio de union a cebador dl587rev sustituido, con region de control negativo delecionada, potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (MND), unido operativamente a un ADNc que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP humano, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); una LTR de VIH-1 de autoinactivacion (SIN) derecha (3'); y una secuencia de poliadenilacion de p-globina de conejo sintetica; en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En diversas realizaciones, la presente invencion contempla, en parte, una celula de mairnfero que comprende un vector segun la invencion.
En realizaciones particulares, la presente invencion contempla, en parte, una celula de empaquetamiento que comprende: un primer polinucleotido que codifica para gag, un segundo polinucleotido que codifica para pol, un tercer polinucleotido que codifica para env y un vector segun la invencion.
En determinadas realizaciones, la presente invencion contempla, en parte, una celula productora que comprende un vector segun la invencion.
En realizaciones adicionales, la presente invencion contempla, en parte, partfculas de vector producidas por la celula productora.
En diversos ejemplos particulares, la presente divulgacion contempla, en parte, un vector que comprende: al menos una LTR; un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportacion retroviral; y un promotor activo en una celula microglial, unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En diversos ejemplos determinados, la presente divulgacion contempla, en parte, un vector que comprende: al menos una LTR; un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor MND unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de ABCD1 humano; y una secuencia de poliadenilacion; en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En diversos ejemplos adicionales, la presente divulgacion contempla, en parte, un vector que comprende: al menos una LTR de VIH-1 de SIN; una senal de empaquetamiento Psi (Y); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor MND, unido operativamente a un ADNc que codifica para un polipeptido de ABCD1 humano; y una secuencia de poliadenilacion de p-globina de conejo, en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En diversas realizaciones, la presente invencion contempla, en parte, una celula huesped transducida con el vector, en el que la celula huesped es una celula madre somatica, una celula progenitora, o una celula madre hematopoyetica, en la que la celula no es una celula madre embrionaria humana.
En realizaciones particulares, la presente invencion contempla ademas, en parte, los vectores lentivirales de la invencion para su uso en terapia genica, en los que la terapia genica trata o previene la adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatia.
En diversas otras realizaciones, la presente invencion contempla, en parte, una celula madre hematopoyetica o progenitora transducida con un vector de la invencion para su uso en un metodo de tratamiento de adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatia.
En determinadas realizaciones, la celula es una celula madre hematopoyetica.
Breve descripcion de los identificadores de secuencia
SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADNc que codifica para ABCD1 humano.
SEQ ID NO: 2 es una secuencia de ADNc que codifica para ABCD1 humano.
SEQ ID NO: 3 es una secuencia de polinucleotido de promotor MND.
Breve descripcion de las varias vistas de los dibujos
La figura 1 muestra un mapa esquematico de constructos del vector de MND-ALD usados en estudios preclmicos y clmicos. Todos los vectores tienen el ADNc de ABCD-1 humano bajo el control del promotor MND para la expresion de alto nivel. Las modificaciones de seguridad a pLBP100 y pLBP140 incluyen: 2 codones de terminacion en la region codificante gag, una delecion de 400 pb en U3 de la LTR de VIH derecha y la senal de poliA de p-globina de conejo (rpgppA). LTR de VIH, repeticion terminal larga del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1; Y+, senal de empaquetamiento; cPPT/fragmento, tramo de polipurina central; RRE, elemento de respuesta rev; ppt, tramo de polipurina. El vector pLBP140 difiere del vector pLBP100 en la introduccion del elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota mutado (mut6) pero funcional (AWPRE).
La figura 2 muestra transduccion con los vectores lentivirales pLBP100 y pLBP140 y cultivos de lfquidos y metilcelulosa a corto plazo en experimentos.
La figura 3 muestra transduccion con los vectores lentivirales pLBP100 y pLBP140 seguido por cultivos de lfquidos y metilcelulosa a corto plazo o cultivo a largo plazo sobre estromas MS5 de soporte.
La figura 4 muestra el numero de progenitores mieloides (UFC-GM; figura 4A) y eritroides (BFU-E; figura 4B) tras la transduccion de celulas CD34+ humanas normales. Se realizaron transducciones usando o bien pLBP100 (p100) o bien pLBP140 (p140) lo que implica cuatro experimentos separados.
La figura 5 muestra la frecuencia de LTC-IC. Tras la dilucion limitante y el cultivo conjunto estromal de 5 semanas con transferencia a cultivos de metilcelulosa para la enumeracion de CFC secundarios y la estimacion de frecuencias con intervalos de confianza del 95% usando el programa L-Calc™.
La figura 6 muestra la eficacia de la integracion de vectores en progenitores a corto plazo. (A) Numero de copias del vector (VCN) sobre celulas a los 7, 14, 28, 31 y 35 dfas en cultivo lfquido. (B) VCN promedio de cultivos de CFC de 14 dfas agrupados. (C) Porcentaje de colonias mieloides positivas para el vector. Se indican los numeros de colonias positivas totales analizadas.
La figura 7 muestra la eficacia de la integracion de vectores en progenitores a corto plazo frente a largo plazo (LTC-IC). (A) VCN promedio de cultivos de CFC de 14 dfas agrupados. (B) Porcentaje de colonias mielodies positivas para el vector. Se indican los numeros de colonias positivas y totales analizadas.
La figura 8 muestra la expresion de protema de ALD (ALDP) en celulas transducidas mediante citometna de flujo. (A1 y A2) Histogramas que muestran fluorescencia de PE para celulas transducidas simuladas, pLBP100 y pLBP140 de diferentes experimentos. (B) Porcentaje de celulas ALDP positivas a los 7 dfas (expts. 072010 y 091410), 14 dfas (expt. 081010) y 28 dfas (expt. 080610). (C) MFI como una relacion sobre los controles simulados que muestran niveles relativos de expresion de ALDP entre las celulas ALDP .
La figura 9 muestra un mapa esquematico de un constructo del vector de MND-ALD. El vector tiene el ADNc de ABCD-1 humano bajo el control del promotor MND para la expresion de alto nivel. LTR de VIH, repeticion terminal larga del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1; Y+, senal de empaquetamiento; cPPT/fragmento, tramo de polipurina central; RRE, elemento de respuesta rev; ppt, tramo de polipurina. El vector no contiene una secuencia de WPRE.
La figura 10 muestra la relacion de la correccion de VLCFA a simulado frente a VCN en 4496 celulas transducidas con p100 y p140 a diversas MOI.
Descripcion detallada
A. Vision general
La presente invencion se refiere generalmente a vectores virales y terapias de celulas transducidas mas seguras y mas eficaces para adrenoleucodistrofias y adrenomieloneuropatfas. Sin querer limitarse a ninguna teona particular, los solicitantes contemplan que las celulas madre hematopoyeticas de ninos varones con ALD son de otro modo normales y dado que las microglias son de origen de medula osea, la complementacion del gen de ABCD1 defectuoso con el ADNc de ABCD1 normal en las celulas madre hematopoyeticas de los sujetos podna conducir a normalizacion de niveles de ALDP en la microglia cerebral. Por tanto, la transferencia genica ex vivo del ADNc de ABCD1 normal en celulas madre hematopoyeticas CD34+ autologas usando vectores de la presente invencion, seguido por trasplante tras ablacion de medula osea, puede dar como resultado la estabilizacion de la funcion del SNC y una cafda en los niveles de VLCFA plasmaticos asociados con los efectos mortales de ALD.
Por consiguiente, las composiciones y los metodos de la presente invencion podnan representar un avance medico significativo en el tratamiento de ninos con ALD, puesto que permitira un rapido tratamiento con un riesgo significativamente disminuido de incorporacion hematopoyetica del fallo de injerto y eliminacion de GvHD aguda y cronica. El tiempo es basicamente la esencia en esta poblacion debido al potencial de rapido deterioro del SNC y la espera de 12-18 meses antes de observarse estabilizacion de la enfermedad con HCT.
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique espedficamente lo contrario, metodos convencionales de biologfa molecular y tecnicas de ADN recombinante dentro de la experiencia en la tecnica, muchos de los cuales se describen a continuacion con el fin de ilustracion. Tales tecnicas se explican totalmente en la bibliograffa. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edicion, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); ADN Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985) ; Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986) ; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).
B. Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entienden comunmente los expertos habituales en la tecnica a la que pertenece la invencion. Para los fines de la presente invencion, los siguientes terminos se definen a continuacion.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “retrovirus” se refiere a un virus de ARN que transcribe de manera inversa su ARN genomico en una copia de ADN bicatenario lineal y posteriormente, integra de manera covalente su ADN genomico en un genoma del huesped. Los retrovirus pertenecen a la familia Retroviridae, que se compone de numerosos virus encapsulados, no icosaedricos que poseen dos copias de un genoma de ARN monocatenario que tiene una region dimerizada corta. Los retrovirus son una herramienta comun para la insercion de genes (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). Una vez se integra el virus en el genoma del huesped, se denomina “provirus.” El provirus sirve como un molde para ARN polimerasa II y dirige la expresion de moleculas de ARN que codifican para las protemas estructurales y enzimas necesarias para producir nuevas partfculas virales.
Los retrovirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: virus de leucemia murina de Moloney (M-MuLV), virus del sarcoma murino de Moloney (MoMSV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor de mama murino (MuMTV), virus de leucemia de simio del gibon (GaLV), virus de leucemia felina (FLV), espumavirus, virus de leucemia murina de Friend, virus de celulas madre murinas (MSCV) y virus del sarcoma de Rous (RSV)) y lentivirus. Tal como se usa en el presente documento, el termino “lentivirus” se refiere a un grupo (o genero) de retrovirus complejos. Los retrovirus ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: VIH (virus de la inmunodeficiencia humana; incluyendo VIH tipo 1, y VIH tipo 2); virus de Visna-Maedi (VMV); el virus de artritis-encefalitis caprina (CAEV); virus de anemia infecciosa equina (EIAV); virus de la inmunodeficiencia felina (FIV); virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV); y virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV). En una realizacion, se prefieren estructuras principales de vector basadas en VIH (es decir, elementos de secuencia que actuan en cis de VIH).
Pueden usarse vectores retrovirales y mas particularmente vectores lentivirales en la practica de la presente invencion. Por consiguiente, el termino “retrovirus” o “vector retroviral”, tal como se usa en el presente documento se pretende que incluya “lentivirus” y “vectores lentivirales” respectivamente.
El termino “vector” se usa en el presente documento para referirse a una molecula de acido nucleico que puede transferir o transportar otra molecula de acido nucleico. El acido nucleico transferido se une generalmente a, por ejemplo, se inserta en, la molecula de acido nucleico del vector. Un vector puede incluir secuencias que dirigen la replicacion autonoma en una celula, o puede incluir secuencias suficientes para permitir la integracion en ADN de celula huesped. Los vectores utiles incluyen, por ejemplo, plasmidos (por ejemplo, plasmidos de ADN o plasmidos de ARN), cosmidos, cromosomas artificiales bacterianos y vectores virales. Los vectores virales utiles incluyen, por ejemplo, retrovirus y lentivirus de replicacion defectuosa.
Tal como sera evidente para un experto en la tecnica, el termino “vector viral” se usa ampliamente para referirse o bien a una molecula de acido nucleico (por ejemplo, un plasmido de transferencia) que incluye elementos de acido nucleico derivados de virus que normalmente facilitan la transferencia de la molecula de acido nucleico o integracion en el genoma de una celula o bien a una partfcula viral que media en la transferencia de acidos nucleicos. Las partfculas virales incluiran normalmente diversos componentes virales y a veces tambien componentes de celulas huesped ademas de acido(s) nucleico(s).
El termino vector viral puede referirse o bien a un virus o partfcula viral que puede transferir un acido nucleico en una celula o al acido nucleico transferido en sl Los vectores virales y plasmidos de transferencia contienen elementos geneticos estructurales y/o funcionales que se derivan principalmente de un virus. El termino “vector retroviral” se refiere a un vector viral o plasmido que contiene elementos geneticos estructurales y funcionales que se derivan principalmente de un retrovirus. El termino “vector lentiviral” se refiere a un vector viral o plasmido que contiene elementos geneticos estructurales y funcionales, incluyendo LTR que se derivan principalmente de un lentivirus. El termino “hnbrido” se refiere a un vector, LTR u otro acido nucleico que contiene tanto secuencias retrovirales, por ejemplo, lentivirales, como secuencias virales no lentivirales. Un vector hforido puede referirse a un vector o plasmido de transferencia que comprende secuencias retrovirales por ejemplo, lentivirales, para transcripcion inversa, replicacion, integracion y/o empaquetamiento y secuencias promotoras subgenomicas de alfavirus, protemas no estructurales y/o sitios de reconocimiento de polimerasa.
En realizaciones particulares, los terminos “vector lentiviral”, “vector de expresion lentiviral” pueden usarse para referirse a plasmidos de transferencia lentivirales y/o partfculas lentivirales infecciosas. Cuando se hace referencia en el presente documento a elementos tales como sitios de clonacion, promotores, elementos reguladores, acidos nucleicos heterologos, etc., debe entenderse que las secuencias de estos elementos estan presentes en forma de ARN en las partfculas lentivirales de la invencion y estan presentes en forma de ADN en los plasmidos de ADN de la invencion.
En cada extremo del provirus hay estructuras denominadas “repeticiones terminales largas” o “LTR.” El termino “repeticion terminal larga (LTR)” se refiere a dominios de pares de bases ubicados en los extremos de ADN retrovirales que, en su contexto de secuencia natural, son repeticiones directas y contienen regiones U3, R y U5. Las LTR proporcionan generalmente funciones fundamentales para la expresion de genes retrovirales (por ejemplo, promocion, iniciacion y poliadenilacion de transcritos genicos) y para replicacion viral. La LTR contiene numerosas senales reguladoras que incluyen elementos de control de la transcripcion, senales de poliadenilacion y secuencias necesarias para la replicacion e integracion del genoma viral. La LTR viral se divide en tres regiones denominadas U3, R y U5. La region U3 contiene los elementos potenciadores y promotores. La region U5 es la secuencia entre el sitio de union a cebador y la region R y contiene la secuencia de poliadenilacion. La region R (repeticion) esta flanqueada por las regiones U3 y U5. La LTR que se compone de regiones U3, R y U5, aparece tanto en el extremo 5' como 3' del genoma viral. Adyacente a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la transcripcion inversa del genoma (el sitio de union a cebador de ARNt) y para el empaquetamiento eficaz de ARN viral en partfculas (el sitio de Psi).
Tal como se usa en el presente documento, el termino “senal de empaquetamiento” o “secuencia de empaquetamiento” se refiere a secuencias ubicadas dentro del genoma retroviral que se requieren para la insercion del ARN viral en la partfcula o capside viral, vease por ejemplo, Clever et al., 1995. J. de Virology, vol. 69, n.° 4; pags. 2101-2109. Varios vectores retrovirales usan la senal de empaquetamiento minima (tambien denominada secuencia psi [Y]) necesaria para la encapsidacion del genoma viral. Por tanto, tal como se usa en el presente documento, los terminos “secuencia de empaquetamiento”, “senal de empaquetamiento”, “psi” y el sfmbolo “Y ”, se usan en referencia a la secuencia no codificante requerida para encapsidacion de hebras de ARN retroviral durante la formacion de partfculas virales.
En diversas realizaciones, los vectores comprenden LTR 5' y/o LTR 3' modificadas. Las modificaciones de la LTR 3' se realizan a menudo para mejorar la seguridad de sistemas lentivirales o retrovirales volviendo la replicacion de virus defectuosa. Tal como se usa en el presente documento, el termino “replicacion defectuosa” se refiere a un virus que no puede realizar replicacion completa y eficaz de modo que no se producen viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral de replicacion defectuosa). El termino “replicacion competente” se refiere a un virus silvestre o virus mutante que puede realizar replicacion, de modo que la replicacion viral del virus puede producir viriones infecciosos (por ejemplo, progenie lentiviral de replicacion competente).
Vectores de “autoinactivacion” (SIN) se refiere a vectores de replicacion defectuosa, por ejemplo, vectores retrovirales o lentivirales, en los que la region de potenciador-promotor de LTR derecha (3'), conocida como la region U3, se ha modificado (por ejemplo, mediante delecion o sustitucion) para evitar la transcripcion viral mas alla de la primera ronda de replicacion viral. Esto es porque se usa la region U3 de LTR derecha (3') como molde para la region U3 de LTR izquierda (5') durante replicacion viral y, por tanto, el transcrito viral no puede elaborarse sin el potenciador-promotor U3. En una realizacion adicional de la invencion, la LTR 3' se modifica de modo que la region U5 se reemplaza, por ejemplo, con una secuencia de poli(A) ideal. Debe indicarse que tambien se incluyen modificaciones a las LTR tales como modificaciones a la LTR 3', la LTR 5', o tanto la LTR 3' como 5', en la invencion.
Se proporciona un potenciamiento de seguridad adicional reemplazando la region U3 de la LTR 5' con un promotor heterologo para conducir la transcripcion del genoma viral durante la produccion de partfculas virales. Los ejemplos de promotores heterologos que pueden usarse incluyen, por ejemplo, promotores de virus de simio viral 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardfo), citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, inmediatamente temprano), virus de leucemia murina de Moloney (MoMLV), virus del sarcoma de Rous (RSV) y virus del herpes simple (HSV) (timidina cinasa). Los promotores tipicos pueden activar altos niveles de transcripcion de una manera independiente de Tat. Este reemplazo reduce la posibilidad de recombinacion para generar virus de replicacion competente porque no hay secuencia de U3 completa en el sistema de produccion de virus.
En algunas realizaciones, los vectores virales comprenden un elemento TAR. El termino “TAR” se refiere al elemento genetico de “respuesta de transactivacion” ubicado en la region R de LTR lentivirales (por ejemplo, VIH). Este elemento interactua con el elemento genetico transactivador lentiviral (tat) para potenciar la replicacion viral. Sin embargo, este elemento no se requiere en realizaciones en las que la region U3 de la LTR 5' se reemplaza por un promotor heterologo.
La “region R” se refiere a la region dentro de LTR retrovirales que empiezan en el inicio del grupo de encapsulacion (es decir, el inicio de la transcripcion) y que terminan inmediatamente antes del inicio del tramo de poli A. La region R tambien se define como que esta flanqueada por las regiones U3 y U5. La region R desempena un papel durante la transcripcion inversa para permitir la transferencia de ADN naciente desde un extremo del genoma hasta el otro.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “elemento FLAP” se refiere a un acido nucleico cuya secuencia incluye el tramo de polipurina central y secuencias de terminacion centrales (cPPT y CTS) de un retrovirus, por ejemplo, VIH-1 o VIH-2. Se describen elementos FLAP adecuados en la patente estadounidense n.° 6.682.907 y en Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. Durante la transcripcion inversa de VIH-1, la iniciacion central del ADN de hebra positiva en el tramo de polipurina central (cPPT) y la terminacion central en la secuencia de terminacion central (CTS) conducen a la formacion de una estructura de ADN de tres hebras: el fragmento de ADN central de VIH-1. Sin querer limitarse a ninguna teona, el fragmento de ADN puede actuar como un determinante cis-activo de la importacion nuclear del genoma lentiviral y/o puede aumentar el tttulo del virus. En realizaciones particulares, las estructuras principales del vector lentiviral comprenden uno o mas elementos FLAP en 5' o en 3' de los genes heterologos de interes en los vectores. Por ejemplo, en realizaciones particulares, un plasmido de transferencia incluye un elemento FLAP. En una realizacion, un vector de la invencion comprende un elemento FLAP aislado de VIH-1.
En una realizacion, los vectores de transferencia lentivirales comprenden uno o mas elementos de exportacion. El termino “elemento de exportacion” se refiere a un elemento regulador postranscripcional que actua en cis que regula el transporte de un transcrito de ARN desde el nucleo hasta el citoplasma de una celula. Los ejemplos de elementos de ARN de exportacion incluyen, pero no se limitan a, el elemento de respuesta rev (RRE) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (vease, por ejemplo, Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; y Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), y el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis B (HPRE). Generalmente, el elemento de exportacion de ARN se coloca dentro de la UTR 3' de un gen, y puede insertarse como una o multiples copias.
La expresion de secuencias heterologas en vectores virales puede aumentarse incorporando elementos reguladores postranscripcionales, y sitios de poliadenilacion eficaces y opcionalmente, senales de terminacion de la transcripcion en los vectores. Una variedad de elementos reguladores postranscripcionales puede aumentar la expresion de un acido nucleico heterologo en la protema, por ejemplo, elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota (WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); el elemento regulador postranscripcional presente en el virus de la hepatitis B (HPRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); y similares (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766). El elemento regulador postranscripcional esta ubicado generalmente en el extremo 3' de la secuencia heterologa de acido nucleico. Esta configuracion da como resultado la smtesis de un transcrito de ARNm cuya porcion 5' comprende las secuencias codificantes de acido nucleico heterologas y cuya porcion 3' comprende la secuencia de elemento regulador postranscripcional. En realizaciones preferidas, los vectores de la invencion carecen de o no comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE porque, en algunos casos, estos elementos aumentan el riesgo de transformacion celular y/o no aumentan sustancialmente o significativamente la cantidad de transcrito de ARNm o aumentan la estabilidad de ARNm. Por tanto, en algunas realizaciones, los vectores de la invencion carecen de o no comprenden un WPRE o HPRE como medida de seguridad adicional.
Los elementos que dirigen la terminacion y poliadenilacion eficaces de los transcritos de acidos nucleicos heterologos aumentan la expresion genica heterologa. Las senales de terminacion de la transcripcion se encuentran generalmente aguas abajo de la senal de poliadenilacion. El termino “sitio de poliA” o “secuencia de poliA” tal como se usa en el presente documento denota una secuencia de ADN que dirige tanto la terminacion como poliadenilacion del transcrito de ARN naciente mediante ARN polimerasa II. La poliadenilacion eficaz del transcrito recombinante es deseable ya que los transcritos que carecen de una cola de poli A son inestables y se degradan rapidamente. Los ejemplos ilustrativos de senales de poliA, incluyen una secuencia de poliA ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), una secuencia de poliA de hormona de crecimiento bovino (BGHpA), una secuencia de poliA de p-globina de conejo (rpgpA) u otra secuencia de poliA heterologa o endogena adecuada conocida en la tecnica.
En determinadas realizaciones, un vector lentiviral comprende ademas un elemento aislante. Los elementos aislantes pueden contribuir a proteger secuencias expresadas por lentivirus, por ejemplo, polipeptidos terapeuticos, de efectos de sitio de integracion, que pueden mediarse mediante elementos que actuan en cis presentes en ADN genomico y conducir a expresion desregulada de secuencias transferidas (es decir, efecto de posicion; vease, por ejemplo, Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:16433; y Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471). En algunas realizaciones, los vectores de transferencia comprenden un elemento aislante en una o ambas LTR o en cualquier parte en la region del vector que se integra en el genoma celular. Los aislantes adecuados para su uso en la invencion incluyen, pero no se limitan a, el aislante de p-globina de pollo (vease Chung et al., 1993. Cell 74:505; Chung et al., 1997. PNAS 94:575; y Bell et al., 1999. Cell 98:387). Los ejemplos de elementos aislantes incluyen, pero no se limitan a, un aislante de un locus de p-globina, tal como HS4 de pollo.
Segun determinadas realizaciones espedficas de la invencion, la mayona o todas las secuencias de estructura principal viral del vector se derivan de un lentivirus, por ejemplo, VIH-1. Sin embargo, debe entenderse que pueden usarse muchas fuentes diferentes de secuencias lentivirales, y numerosas sustituciones y alteraciones en determinadas de las secuencias lentivirales pueden acomodarse sin alterar la capacidad de un vector de transferencia de realizar las funciones descritas en el presente documento. Ademas, se conoce una variedad de vectores lentivirales en la tecnica, vease Naldini et al., (1996a, 1996b, y 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, patentes estadounidenses n.os 6.013.516; y 5.994.136, cualquiera de las cuales puede adaptarse para producir un vector viral o plasmido de transferencia de la presente invencion.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos “polinucleotido” o “acido nucleico” se refieren a ARN mensajero (ARNm), Ar N, ARN genomico (ARNg), ARN de hebra (ARN(+)), ARN de hebra - (ARN(-)), ADN genomico (ADNg), ADN complementario (ADNc) o ADN. Los polinucleotidos incluyen polinucleotidos mono y bicatenarios. Preferiblemente, los polinucleotidos de la invencion incluyen polinucleotidos o variantes que tienen al menos aproximadamente el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de referencia descritas en el presente documento (vease, por ejemplo, la lista de secuencias), normalmente cuando la variante mantiene al menos una actividad biologica de la secuencia de referencia. En diversas realizaciones ilustrativas, la presente invencion contempla, en parte, secuencias de polinucleotido de vector viral y plasmido de transferencia y composiciones que las comprenden. En realizaciones particulares, la invencion proporciona polinucleotidos que codifican para polipeptidos terapeuticos.
Tal como se usa en el presente documento, los terminos “variante de polinucleotido” y “variante” y similares, se refieren a polinucleotidos que presentan identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleotido de referencia o polinucleotidos que se hibridan con una secuencia de referencia en condiciones rigurosas que se definen a continuacion en el presente documento. Estos terminos incluyen polinucleotidos en los que uno o mas nucleotidos se han anadido o delecionado, o reemplazado con diferentes nucleotidos en comparacion con un polinucleotido de referencia. En este aspecto, se entiende bien en la tecnica que determinadas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones pueden realizarse a un polinucleotido de referencia mediante lo cual el polinucleotido alterado conserva la funcion o actividad biologica del polinucleotido de referencia.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “aislado” significa un material que esta sustancialmente o esencialmente libre de componentes que lo acompanan normalmente en su estado nativo. Por ejemplo, un “polinucleotido aislado”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polinucleotido que se ha purificado a partir de las secuencias que lo flanquean en un estado que se produce de manera natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que se ha retirado de las secuencias que son normalmente adyacentes al fragmento.
Los terminos que describen la orientacion de los polinucleotidos incluyen: 5' (normalmente el extremo del polinucleotido que tiene un grupo fosfato libre) y 3' (normalmente el extremo del polinucleotido que tiene un grupo hidroxilo libre (OH)). Las secuencias de polinucleotido pueden anotarse en la orientacion 5' a 3' o en la orientacion 3' a 5'.
Los terminos “complementario” y “complementariedad” se refieren a polinucleotidos (es decir, una secuencia de nucleotidos) relacionados por las normas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la hebra complementaria de la secuencia de ADN 5' A G T C A T G 3' es 3' T C A G T A C 5'. La ultima secuencia se escribe a menudo como el complemento inverso con el extremo 5' a la izquierda y el extremo 3' a la derecha, 5' C A T G A C T 3'. Una secuencia que es igual a su complemento inverso se dice que es una secuencia palindromica. La complementariedad puede ser “parcial”, en la que solo algunos de las bases de acidos nucleicos se emparejan segun las normas de apareamiento de bases. O, puede haber complementariedad “completa” o “total” entre los acidos nucleicos.
El termino “casete de acido nucleico” tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias geneticas dentro del vector que pueden expresar un ARN, y posteriormente, una protema. El casete de acido nucleico contiene el gen de interes. El casete de acido nucleico esta orientado de manera posicional y secuencial dentro del vector de modo que el acido nucleico en el casete puede transcribirse en ARN, y cuando sea necesario, traducirse en una protema o un polipeptido, experimentar modificaciones postraduccionales apropiadas requeridas para la actividad en la celula transformada, y translocarse al compartimento adecuado para la actividad biologica mediante direccionamiento a compartimentos intracelulares apropiados o secrecion en compartimentos extracelulares. Preferiblemente, el casete tiene sus extremos 3' y 5' adaptados para insercion facil en un vector, por ejemplo, tiene sitios de endonucleasa de restriccion en cada extremo. En una realizacion preferida de la invencion, el casete de acido nucleico contiene la secuencia de un gen terapeutico usado para tratar la adrenoleucodistrofia o la adrenomieloneuropatia. El casete puede retirarse e insertarse en un vector plasirndico o viral como una unica unidad.
Los polinucleotidos incluyen un polinucleotido de interes. Tal como se usa en el presente documento, el termino “polinucleotido de interes” se refiere al polinucleotido, por ejemplo, un polinucleotido que codifica para un polipeptido (es decir, un polipeptido de interes), insertado en un vector de expresion que se desea expresar. En determinadas realizaciones, el polinucleotido de interes codifica para un polipeptido que proporciona un efecto terapeutico en el tratamiento o la prevencion de una enfermedad o trastorno, que puede denominarse “polipeptido terapeutico”, por ejemplo, gen de casete de union a ATP, subfamilia D (ALD), miembro 1 (ABCD1). Los polinucleotidos de interes, y polipeptidos codificados de los mismos, incluyen tanto polinucleotidos que codifican para polipeptidos silvestres, asf como variantes funcionales y fragmentos de los mismos. En realizaciones particulares, una variante funcional tiene al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95% o al menos el 99% de identidad con un polinucleotido de referencia silvestre correspondiente o secuencia de polipeptido. En determinadas realizaciones, una variante funcional o fragmento tiene al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de una actividad biologica de un polipeptido silvestre correspondiente. Las secuencias de polinucleotidos representativas adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, los ADNc de ACBD1 humanos expuestos en SEQ ID NO: 1-2.
Los polinucleotidos de la presente invencion, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sf, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores y/o potenciadores, regiones no traducidas (UTR), secuencias de Kozak, senales de poliadenilacion, sitios de enzimas de restriccion adicionales, sitios de clonacion multiples, sitios de entrada ribosomicos internos (IRES), sitios de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, sitios LoxP, FRT y Att), codones de terminacion, senales de terminacion de la transcripcion y polinucleotidos que codifican para polipeptidos de autoescision, marcadores de epttopos, tal como se da a conocer en cualquier parte en el presente documento o tal como se conoce en la tecnica, de modo que su longitud global puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que un fragmento de polinucleotido de casi cualquier longitud pueda emplearse, limitandose la longitud total preferiblemente por la facilidad de preparacion y uso en el protocolo de ADN recombinante previsto.
El termino “promotor” tal como se usa en el presente documento se refiere a un sitio de reconocimiento de un polinucleotido (ADN o ARN) al que se une ARN polimerasa. El termino “potenciador” se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias que pueden proporcionar transcripcion potenciada y en algunos casos pueden funcionar de manera independiente a su orientacion en relacion con otra secuencia de control. Un potenciador puede funcionar de manera cooperativa o aditiva con promotores y/u otros elementos potenciadores. El termino “promotor/potenciador” se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias que pueden proporcionar tanto funciones de promotor como de potenciador. En una realizacion, un vector de la invencion comprende un promotor con sitio de union a cebador dl587rev sustituido, con region de control negativo delecionada, potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (MND) (Challita et al., J Virol. 69(2):748-55 (1995); SEQ ID NO: 3).
En realizaciones particulares, un vector de la invencion comprende secuencias de control exogenas, endogenas o heterologas tales como promotores y/o potenciadores. Una secuencia de control “endogena” es una que esta unida de manera natural con un gen dado en el genoma. Una secuencia de control “exogena” es una que se coloca en yuxtaposicion a un gen mediante manipulacion genetica (es decir, tecnicas de biologfa molecular) de modo que la transcripcion de ese gen esta dirigida por el potenciador/promotor unido. Una secuencia de control “heterologa” es una secuencia exogena que es de una especie diferente a la celula que se esta manipulando geneticamente.
El termino “unido operativamente”, se refiere a una yuxtaposicion en la que los componentes descritos estan en una relacion que los permite funcionar de su manera prevista. En una realizacion, el termino se refiere a una union funcional entre una secuencia de control de la expresion de acidos nucleicos (tal como un promotor, y/o potenciador) y una segunda secuencia de polinucleotido, por ejemplo, un polinucleotido de interes, en el que la secuencia de control de la expresion dirige la transcripcion del acido nucleico correspondiente a la segunda secuencia.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “promotor constitutivo” se refiere a un promotor que sigue de manera constante o continua la transcripcion de una secuencia unida operativamente. Los promotores constitutivos pueden ser un “promotor ubicuo” que permite la expresion en una amplia variedad de tipos celulares y tisulares o un “promotor espedfico de tejido” que permite la expresion en una variedad limitada de tipos celulares y tisulares. Los promotores ubicuos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), un virus de simio viral 40 (SV40) (por ejemplo, temprano o tardfo), un promotor de LTR de virus de leucemia murina de Moloney (MoMLV), una LTR de virus del sarcoma de Rous (RSV), un promotor de virus del herpes simple (HSV) (timidina cinasa), promotores de H5, P7.5 y P11 de virus vaccinia, un promotor de factor de elongacion 1-alfa (EF1a), respuesta de crecimiento temprana 1 (EGR1), ferritina H (FerH), ferritina L (FerL), gliceraldetndo-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), factor de iniciacion de la traduccion eucariota 4A1 (EIF4A1), protema 5 de choque termico de 70 kDa (HSPA5), protema p de 90 kDa de choque termico, miembro 1 (HSP90B1), protema de choque termico de 70 kDa (HSP70), p-cinesina (P-KIN), el locus humano ROSA 26 (Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), un promotor de ubiquitina C (UBC), un promotor de fosfoglicerato cinasa-1 (PGK), un promotor de p-actina de pollo/potenciador de citomegalovirus (CAG) y un promotor de p-actina.
Puede ser deseable usar un promotor espedfico de tejido para lograr expresion espedfica del tipo tisular, espedfica del linaje o espedfica del tejido de una secuencia deseada de polinucleotido (por ejemplo, para expresar un acido nucleico particular que codifica para un polipeptido en solo un subconjunto de tipos celulares o tejidos o durante fases espedficas del desarrollo). Los ejemplos ilustrativos de promotores espedficos del tejido incluyen, pero no se limitan a: un promotor B29 (expresion de celulas B), un promotor de factor de transcripcion Runt (CBFa2) (expresion espedfica de celulas madre), un promotor CD14 (expresion de celulas monodticas), un promotor CD43 (expresion de leucocitos y plaquetas), un promotor CD45 (expresion de celulas hematopoyeticas), un promotor CD68 (expresion de macrofagos), un promotor CYP450 3A4 (expresion de hepatocitos), un promotor de desmina (expresion muscular), un promotor de elastasa 1 expresion de celulas acinares pancreaticas, un promotor de endoglina (expresion de celulas endoteliales), un promotor de protema 1 espedfico de fibroblasto (FSP1) (expresion de celulas de fibroblastos), un promotor de fibronectina (expresion de celulas de fibroblastos), un promotor de tirosina cinasa relacionado con fms (FLT1) (expresion de celulas endoteliales), un promotor de protema acida fibrilar glial (GFAP) (expresion de astrocitos), un promotor de insulina (expresion de celulas beta pancreaticas), un promotor de integrina, alfa 2b (ITGA2B) (megacariocitos), un promotor de molecula 2 de adhesion intracelular (lCAM-2) (celulas endoteliales), un promotor de interferon beta (IFN-P) (celulas hematopoyeticas), un promotor de queratina 5 (expresion de queratinocitos), un promotor de mioglobina (MB) (expresion muscular), un promotor de diferenciacion miogenica 1 (MYOD1) (expresion muscular), un promotor de nefrina (expresion de podocitos), un promotor de protema 2 de gamma-carboxiglutamato de hueso (OG-2) (expresion de osteoblastos), un promotor de 3-oxoacido CoA transferasa 2B (Oxct2B), (expresion haploide-espermatida), un promotor de protema B tensioactiva (SP-B) (expresion pulmonar), un promotor de sinapsina (expresion neuronal), un promotor de protema del smdrome de Wiskott-Aldrich (WASP) (expresion de celulas hematopoyeticas).
En una realizacion, un vector de la presente invencion comprende un promotor y/o potenciador espedfico de tejido que expresa un polipeptido deseado, por ejemplo, ABCD1, en celulas microgliales, por ejemplo, un promotor MND (SEQ ID NO: 3).
Tal como se usa en el presente documento, “expresion condicional” puede referirse a cualquier tipo de expresion condicional que incluye, pero no se limita a, expresion inducible; expresion reprimible; expresion en celulas o tejidos que tienen un estado fisiologico, biologico o patologico particular, etc. Esta definicion no se pretende que excluya la expresion espedfica del tipo celular o del tejido. Determinadas realizaciones de la invencion proporcionan expresion condicional de un polinucleotido de interes, por ejemplo, la expresion se controla sometiendo una celula, tejido, organismo, etc., a un tratamiento o condicion que provoca que el polinucleotido se exprese o que provoca un aumento o disminucion en la expresion del polinucleotido codificado por el polinucleotido de interes.
Los ejemplos ilustrativos de promotores/sistemas inducibles incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles por esteroides tales como promotores para genes que codifican receptores de glucocorticoides o estrogenos (inducibles mediante tratamiento con la hormona correspondiente), promotor de metalotionina (inducible mediante tratamiento con diversos metales pesados), promotor MX-1 (inducible mediante interferon), el sistema regulable por mifepristona “GeneSwitch” (Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), los sistemas reguladores dependientes de tetraciclina Cumate GeneSwitch inducibles (documento WO 2002/088346), etc.
Tambien puede lograrse expresion condicional usando una ADN recombinasa espedfica del sitio. Segun determinados ejemplos de la divulgacion, el vector comprende al menos uno (normalmente dos) sitio(s) para recombinacion mediada por una recombinasa espedfica del sitio. Tal como se usa en el presente documento, los terminos “recombinasa” o “recombinasa espedfica del sitio” incluyen protemas excisivas o integradoras, enzimas, cofactores o protemas asociadas que estan implicadas en reacciones de recombinacion que implican uno o mas sitios de recombinacion (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, siete, diez, doce, quince, veinte, treinta, cincuenta, etc.), que pueden ser protemas silvestres (vease Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), o mutantes, derivados (por ejemplo, protemas de fusion que contienen las secuencias de protemas de recombinacion o fragmentos de las mismas), fragmentos, y variantes de las mismas. Los ejemplos ilustrativos de recombinasas adecuadas para su uso en ejemplos particulares de la presente divulgacion incluyen, pero no se limitan a: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, OC31, Cin, Tn3 resolvasa, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 y ParA.
Los vectores pueden comprender uno o mas sitios de recombinacion para cualquiera de una amplia variedad de recombinasas espedficas del sitio. Debe entenderse que el sitio diana para una recombinasa espedfica del sitio se requiere ademas de cualquier sitio(s) para la integracion de un vector, por ejemplo, un vector retroviral o vector lentiviral. Tal como se usa en el presente documento, los terminos “secuencia de recombinacion”, “sitio de recombinacion”, o “sitio espedfico de recombinacion” se refieren a una secuencia particular de acido nucleico a la que una recombinasa reconoce y se une.
Por ejemplo, un sitio de recombinacion para Cre recombinasa es loxP que es una secuencia de 34 pares de bases que comprende dos repeticiones invertidas de 13 pares de bases (que actuan como los sitios de union a recombinasa) que flanquean una secuencia nucleo de 8 pares de bases (vease la figura 1 de Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)). Otros sitios de loxP a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: lox511 (Hoess et al., 1996; Betke y Sauer, 1997), lox5171 (Lee y Saito, 1998), lox2272 (Lee y Saito, 1998), m2 (Langer et al., 2002), lox71 (Albert et al., 1995) y lox66 (Albert et al., 1995).
Los sitios de reconocimiento adecuados para la FLP recombinasa incluyen, pero no se limitan a: FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3 (Schlake y Bode, 1994), F4, F5 (Schlake y Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff etal., 1988).
Otros ejemplos de secuencias de reconocimiento son las secuencias attB, attP, attL y attR, que se reconocen por la enzima recombinasa X integrasa, por ejemplo, fi-c31. La ^31 SSR media recombinacion solo entre los sitios heterotfpicos attB (34 pb de longitud) y attP (39 pb de longitud) (Groth et al., 2000). attB y attP, denominadas por los sitios de union para la fago integrasa en los genomas bacterianos y de fagos, respectivamente, contienen ambas repeticiones invertidas imperfectas que se unen probablemente mediante homodfmeros ^C31 (Groth et al., 2000). Los sitios de producto, attL y attR, son eficazmente inertes a recombinacion mediada por ^C31 adicional (Belteki et al., 2003), haciendo que la reaccion sea irreversible. Para catalizar inserciones, se ha encontrado que ADN que lleva attB se inserta en un sitio de attP genomico mas rapidamente que un sitio de attP en un sitio de attB genomico (Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). Por tanto, las estrategias tfpicas posicionan por recombinacion homologa un “sitio de acoplamiento” que lleva attP en un locus definido, que luego se asocia con una secuencia entrante que lleva attB para la insercion.
Tal como se usa en el presente documento, un “sitio de entrada de ribosomas interno” o “IRES” se refiere a un elemento que promueve la entrada de ribosomas interna directa en el codon de iniciacion, tal como ATG, de un cistron (una region codificante de protemas), conduciendo de ese modo a la traduccion independiente de cap del gen. Vease, por ejemplo, Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) y Jackson y Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000. En realizaciones particulares, los vectores contemplados por la invencion, incluyen uno o mas polinucleotidos de interes que codifican para uno o mas polipeptidos. Para lograr una traduccion eficaz de cada una de la pluralidad de polipeptidos, las secuencias de polinucleotido pueden separarse mediante una o mas secuencias de IRES o secuencias de polinucleotido que codifican para polipeptidos de autoescision.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “secuencia de Kozak” se refiere a una secuencia corta de nucleotidos que facilita enormemente la union inicial de ARNm a la pequena subunidad del ribosoma y aumenta la traduccion. La secuencia de Kozak de consenso es (GCC)RCCATGG, donde R es una purina (A o G) (Kozak, 1986. Cell. 44(2):283-92, y Kozak, 1987. Nuclec Acids Res. 15(20):8125-48). En realizaciones particulares, los vectores contemplados por la invencion, comprenden polinucleotidos que tienen una secuencia de Kozak de consenso y que codifican para un polipeptido deseado, por ejemplo, ABCD1.
En realizaciones particulares, los vectores comprenden una secuencia de poliadenilacion 3' de un polinucleotido que codifica para un polipeptido que va a expresarse. Las secuencias de poliadenilacion pueden promover la estabilidad de ARNm mediante la adicion de una cola de poliA al extremo 3' de la secuencia codificante y por tanto, contribuir a una eficacia traduccional aumentada. Los sitios de poliadenilacion reconocidos incluyen una secuencia de poliA ideal (por ejemplo, AATAAA, ATTAAA AGTAAA), una secuencia de poliA de hormona de crecimiento bovino (BGHpA), una secuencia de poliA de p-globina de conejo (rpgpA) u otra secuencia de poliA heterologa o endogena adecuada conocida en la tecnica.
En determinadas realizaciones, los vectores comprenden un gen de seleccion, tambien denominado marcador seleccionable. Genes de seleccion tfpicos que codifican para protemas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, higromicina, metotrexato, Zeocin, blasticidina o tetraciclina, (b) deficiencias auxotroficas de complemento, o (c) proporcionan nutrientes cnticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica para D-alanina racemasa para Bacilli. Puede usarse cualquier numero de sistemas de seleccion para recuperar lmeas celulares transformadas. Estas incluyen, pero no se limitan a, los genes de timidina cinasa de virus del herpes simple (Wigler et al., 1977. Cell 11:223-232) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., 1990. Cell 22:817-823) que pueden emplearse en celulas tk o aprt, respectivamente.
Una “celula huesped” incluye celulas transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleotido de la invencion. Las celulas huesped pueden incluir celulas de empaquetamiento, celulas productoras y celulas infectadas con vectores virales. En realizaciones particulares, las celulas huesped infectadas con vector viral de la invencion son para su uso en la administracion a un sujeto que necesita terapia.
La produccion a gran escala de partmulas virales a menudo es necesaria para lograr un tftulo viral razonable. Se producen partmulas virales transfectando un vector de transferencia en una lmea celular de empaquetamiento que comprende genes estructurales y/o accesorios virales, por ejemplo, genes gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx o nef u otros genes retrovirales.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “vector de empaquetamiento” se refiere a un vector de expresion o vector viral que carece de una senal de empaquetamiento y comprende un polinucleotido que codifica para uno, dos, tres, cuatro o mas genes estructurales y/o accesorios virales. Normalmente, los vectores de empaquetamiento se incluyen en una celula de empaquetamiento, y se introducen en la celula por medio de transfeccion, transduccion o infeccion. Los metodos para transfeccion, transduccion o infeccion los conocen bien los expertos en la tecnica. Un vector de transferencia lentiviral de la presente invencion puede introducirse en una lmea celular de empaquetamiento, por medio de transfeccion, transduccion o infeccion, para generar una celula o lmea celular productoras. Los vectores de empaquetamiento de la presente invencion pueden introducirse en celulas o lmeas celulares humanas mediante metodos convencionales que incluyen, por ejemplo, transfeccion, lipofeccion o electroporacion de fosfato de calcio. En algunas realizaciones, los vectores de empaquetamiento se introducen en las celulas junto con un marcador dominante seleccionable, tal como neomicina, higromicina, puromicina, blasticidina, Zeocin, timidina cinasa, DHFR, Gln sintetasa o ADA, seguido por seleccion en presencia del farmaco apropiado y aislamiento de clones. Un gen marcador seleccionable puede unirse ffsicamente a genes codificados por el vector de empaquetamiento, por ejemplo, por IRES o peptidos virales de autoescision.
Las protemas de la envuelta viral (env) determinan la variedad de celulas huesped que pueden infectarse en ultima instancia y transformarse mediante retrovirus recombinantes generados a partir de las lmeas celulares. En el caso de lentivirus, tales como VIH-1, VIH-2, SIV, FIV y EIV, las protemas env incluyen gp41 y gp120. Preferiblemente, las protemas virales env expresadas por celulas de empaquetamiento de la invencion se codifican en un vector separado de los genes virales gag y pol, tal como se ha descrito previamente.
Los ejemplos ilustrativos de genes env derivados de retrovirus que pueden emplearse en la invencion incluyen, pero no se limitan a: envuelta de MLV, envuelta de 10A1, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, ebola, Sendai, FPV (virus de peste aviar), y envueltas de virus de la gripe. De manera similar, pueden utilizarse los genes que codifican para envuelta s de virus de ARN (por ejemplo, familias de virus de ARN de Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) asf como de los virus de ADN (familias de Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae e Iridoviridae). Los ejemplos representativos incluyen, FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, rabia, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10, EIAV.
En otras realizaciones, las protemas de la envuelta para el pseudotipoado de un virus de presente invencion incluyen, pero no se limitan a cualquiera de los siguientes virus: gripe A tal como H1N1, H1N2, H3N2 y H5N1 (gripe aviar), gripe B, virus de la gripe C, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis D, virus de la hepatitis E, rotavirus, cualquier virus del grupo de virus de Norwalk, adenovirus entericos, parvovirus, virus de la fiebre del dengue, viruela de los simios, Mononegavirales, lyssavirus tales como virus de la rabia, virus de murcielago de Lagos, virus Mokola, virus Duvenhage, virus del murcielago europeo 1 y 2 y virus del murcielago australiano, Ephemerovirus, Vesiculovirus, virus de la estomatitis vesicular (VEV), virus del herpes tales como virus del herpes simple tipos 1 y 2, varicela zoster, citomegalovirus, virus de Epstein-Bar (VEB), virus del herpes humano (v Hh ), virus del herpes humano tipo 6 y 8, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus del papiloma, virus del herpes gamma murino, Arenavirus tales como virus de la fiebre hemorragica argentina, virus de la fiebre hemorragica boliviana, virus de la fiebre hemorragica asociado a Sabia, virus de la fiebre hemorragica venezolana, virus de la fiebre de Lassa, virus Machupo, virus de la coriomeningitis linfodtica (LCMV), Bunyaviridiae tal como virus de la fiebre hemorragia de Crimea-Congo, Hantavirus, fiebre hemorragica con virus que provoca smdromes renales, virus de fiebre del Valle del Rift, Filoviridae (filovirus) incluyendo fiebre hemorragica del ebola y fiebre hemorragica de Marburgo, Flaviviridae incluyendo virus de la enfermedad de la selva de Kaysanur, virus de la fiebre hemorragica de Omsk, virus que provoca encefalitis de transmision por pulgas y Paramyxoviridae tal como virus Hendra y virus de Nipah, viruela mayor y viruela menor (viruela), alfavirus tales como virus de la encefalitis equina venezolana, virus de la encefalitis equina oriental, virus de la encefalitis equina occidental, coronavirus asociado a SARS (SARS-CoV), virus del Nilo Occidental, cualquier virus que provoca encefalitis.
En una realizacion, la invencion proporciona celulas de empaquetamiento que producen retrovirus recombinante, por ejemplo, lentivirus, pseudotipado con la glicoprotema VSV-G.
Los terminos “pseudotipo” o “pseudotipado” tal como se usan en el presente documento, se refieren a un virus cuyas protemas de la envuelta viral se han sustituido con las de otro virus que posee caractensticas preferibles. Por ejemplo, VIH puede pseudotiparse con protemas de la envuelta de protema G del virus de la estomatitis vesicular (VEV-G), que permite que VIH infecte una variedad mas amplia de celulas porque las protemas de la envuelta de VIH (codificadas por el gen env) dirigen normalmente el virus a celulas que presentan CD4+. En una realizacion preferida de la invencion, las protemas de la envuelta lentiviral se pseudotipan con VEV-G. En una realizacion, la invencion proporciona celulas de empaquetamiento que producen retrovirus recombinante, por ejemplo, lentivirus, pseudotipado con la glicoprotema de la envuelta de VEV-G.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “lmeas celulares de empaquetamiento” se usa en referencia a lmeas celulares que no contienen una senal de empaquetamiento, pero expresan de manera estable o transitoria protemas estructurales virales y enzimas de replicacion (por ejemplo, gag, pol y env) que son necesarias para el empaquetamiento correcto de partmulas virales. Cualquier lmea celular adecuada puede emplearse para preparar celulas de empaquetamiento de la invencion. Generalmente, las celulas son celulas de mamffero. En una realizacion particular, las celulas usadas para producir la lmea celular de empaquetamiento son celulas humanas. Las lmeas celulares adecuadas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, celulas CHO, celulas BHK, celulas MDCK, celulas C3H 10T1/2, celulas FLY, celulas Psi-2, celulas BOSC 23, celulas PA317, celulas WEHI, celulas COS, celulas BSC 1, celulas BSC 40, celulas BMT 10, celulas VERO, celulas W138, celulas MRC5, celulas A549, celulas HT1080, celulas 293, celulas T 293, celulas B-50, celulas 3T3, celulas NIH3T3, celulas HepG2, celulas Saos-2, celulas Huh7, celulas HeLa, celulas W163, celulas 211 y celulas 211A. En realizaciones preferidas, las celulas de empaquetamiento son celulas 293, celulas 293T o celulas A549. En otra realizacion preferida, las celulas son celulas A549.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “lmea celular productora” se refiere a una lmea celular que puede producir partmulas retrovirales recombinantes, que comprende una lmea celular de empaquetamiento y un constructo de vector de transferencia que comprende una senal de empaquetamiento. La produccion de partmulas virales infecciosas y disoluciones de reserva virales puede llevarse a cabo usando tecnicas convencionales. En la tecnica se conocen metodos de preparacion de disoluciones de reserva virales y se ilustran, por ejemplo, por Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633, y N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113. Pueden recogerse partmulas de virus infecciosos de las celulas de empaquetamiento usando tecnicas convencionales. Por ejemplo, las partmulas infecciosas pueden recogerse mediante lisis celular, o recogida del sobrenadante del cultivo celular, tal como se conoce en la tecnica. Opcionalmente, las partmulas de virus recogidas pueden purificarse si se desea. Los expertos en la tecnica conocen bien tecnicas de purificacion adecuadas.
La insercion de un(os) gen(es) u otra secuencia de polinucleotido usando un vector retroviral o lentiviral por medio de infeccion viral en vez de mediante transfeccion se denomina “transduccion.” En una realizacion, los vectores retrovirales se transducen en una celula a traves de infeccion e integracion de provirus. En determinadas realizaciones, una celula se “transduce” si comprende un gen u otra secuencia de polinucleotido insertado en la celula mediante infeccion usando un vector viral o retroviral. En realizaciones particulares, una celula transducida comprende el gen u otra secuencia de polinucleotido insertado por un vector retroviral o lentiviral en su genoma celular.
En realizaciones particulares, las celulas huesped transducidas con vector viral de la invencion que expresa un polipeptido terapeutico, por ejemplo, un polipeptido de ABCD1, son para su uso en la administracion a un sujeto para tratar y/o prevenir una enfermedad, trastorno o estado, por ejemplo, adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatia. Otros metodos se refieren al uso de vectores virales en terapia genica, para los que pueden utilizarse determinadas realizaciones de la presente invencion, pueden encontrarse en, por ejemplo, Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. y Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. y Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744­ 52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. y Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. y Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; y Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8. Tal como se usa en el presente documento, a menos que el contexto deje claro lo contrario, “tratamiento”, y palabras similares tales como “tratado”, “que trata” etc., indica un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo y preferiblemente resultados clmicos. Tratamiento puede implicar opcionalmente o bien la reduccion o bien la mejora de smtomas de la enfermedad o el estado, o el retraso del avance de la enfermedad o el estado. Tal como se usa en el presente documento, a menos que el contexto deje claro lo contrario, “prevenir”, y palabras similares tales como “previno”, “que previene” etc., indica un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de la aparicion o recurrencia de, una enfermedad o estado. Tambien se refiere a retrasar la aparicion o recurrencia de una enfermedad o estado o retrasar la aparicion o recurrencia de los smtomas de una enfermedad o estado. Tal como se usa en el presente documento, “prevencion” y palabras similares tambien incluyen reducir la intensidad, el efecto, los smtomas y/o la carga de una enfermedad o estado antes de la aparicion o recurrencia de la enfermedad o el estado.
Tal como se usa en el presente documento, una “cantidad eficaz” o una “cantidad terapeuticamente eficaz” de una celula transducida huesped o una sustancia es aquella cantidad suficiente para afectar un efecto biologico deseado, tal como resultados beneficiosos, incluyendo resultados clmicos.
Tal como se usa en el presente documento “portador farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes de retardo de la absorcion e isotonicos, y similares que son fisiologicamente compatibles, incluyendo medios de cultivo celulares farmaceuticamente aceptables. En una realizacion, el portador es adecuado para administracion parenteral. El portador puede ser adecuado para administracion intravascular (por ejemplo, intravenosa o intraarterial), intraperitoneal o intramuscular. Los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones esteriles acuosas y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones esteriles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica. Salvo en la medida en la que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las celulas transducidas, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmaceuticas de la invencion.
Los artmulos “un”, “una” y “el/la” se usan en el presente documento para referirse a uno o a mas de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artmulo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o mas de un elemento.
El uso de la alternativa (por ejemplo, “o”) debe entenderse que significa o bien uno, ambos o bien cualquier combinacion de los mismos de las alternativas. Tal como se usa en el presente documento, los terminos “incluir” y “comprenden” se usan como sinonimos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “sobre” o “aproximadamente” se refiere a una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud que vana en tanto como el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1% con respecto a una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud de referencia. En una realizacion, el termino “sobre” o “aproximadamente” se refiere a un intervalo de cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud del ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% o ±1% de aproximadamente una cantidad, nivel, valor, numero, frecuencia, porcentaje, dimension, tamano, cantidad, peso o longitud de referencia.
En toda esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, las palabras “comprender”, “comprende” y “que comprende” se entendera que implican la inclusion de una etapa o elemento o grupo de etapas o elementos declarados, pero no la exclusion de cualquier otra etapa o elemento o grupo de etapas o elementos. Por “que consiste en” quiere decirse que incluye, y se limita a, lo que sigua a la frase “que consiste en.” Por tanto, la frase “que consiste en” indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por “que consiste esencialmente en” quiere decirse que incluye cualquiera de los elementos enumerados despues de la frase, y se limita a otros elementos que no interfieren con o contribuyen a la actividad o accion especificada en la divulgacion para los elementos enumerados. Por tanto, la frase “que consiste esencialmente en” indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, pero que ningun otro elemento es opcional y pueden o no estar presentes segun si afectan o no a la actividad o accion de los elementos enumerados.
La referencia en toda esta memoria descriptiva a “una realizacion” significa que un rasgo, estructura o caractenstica particulares descritos en relacion con la realizacion se incluye en al menos una realizacion de la presente invencion. Por tanto, la aparicion de la frase “en una realizacion” en diversos sitios en toda esta memoria descriptiva no hace necesariamente referencia a la misma realizacion. Ademas, los rasgos, estructuras o caractensticas particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o mas realizaciones.
En la siguiente descripcion, se exponen determinados detalles espedficos con el fin de proporcionar una compresion completa de las diversas realizaciones de la invencion. Sin embargo, un experto en la tecnica entendera que la invencion puede practicarse sin estos detalles. Ademas, debe entenderse que los vectores individuales, o grupos de vectores, derivados de las diversas combinaciones de las estructuras y sustituyentes descritos en el presente documento, se dan a conocer mediante la presente solicitud al mismo grado que si cada vector o grupo de vectores se hubiera establecido de manera individual. Por tanto, la seleccion de estructuras de vectores particulares o sustituyentes particulares esta dentro del alcance de la presente divulgacion.
C. Vectores virales
Se han sometido a prueba vectores retrovirales y lentivirales y se ha encontrado que son vehfculos de insercion adecuados para la introduccion estable de genes de interes en el genoma de una amplia variedad de celulas diana. Muchos disenos de vectores se han optimizado para una maxima eficacia de transduccion y expresion de transgenes incluyendo secuencias FLAP, RRE, y HPRe o WPRE. En particular, los expertos en la tecnica a menudo incluyen secuencias reguladoras postranscripcionales para aumentar la expresion de transgenes. De manera sorprendente, los presentes inventores han descubierto que la inclusion de una secuencia de WPRE no aumenta significativamente la expresion o
Esta configuracion da como resultado smtesis de un transcrito de ARNm cuya porcion 5' comprende las secuencias codificantes de acido nucleico heterologas y cuya porcion 3' comprende la secuencia de elemento regulador postranscripcional. En realizaciones preferidas, los vectores de la invencion carecen de o no comprenden un elemento regulador postranscripcional tal como un WPRE o HPRE porque en algunos casos estos elementos aumentan el riesgo de transformacion celular y/o no aumentan sustancialmente o significativamente la cantidad de transcrito de ARNm o aumentan la estabilidad de ARNm. Por tanto, en algunas realizaciones, los vectores de la invencion carecen de o no comprenden un WPRE o HPRE como medida de seguridad adicional.
La presente invencion proporciona ademas vectores de transferencia, que pueden usarse para poner en practica los metodos de la presente invencion.
Aunque el experto en la tecnica apreciara que tales vectores de transferencia pueden producirse usando una variedad de diferentes vectores virales, en realizaciones particulares, el vector de transferencia es un vector lentiviral, en parte puesto que los vectores lentivirales pueden proporcionar insercion, integracion y expresion a largo plazo eficaces de transgenes en celulas que no se dividen tanto in vitro como in vivo. Una variedad de vectores lentivirales se conocen en la tecnica, vease Naldini et al., (1996a, 1996b y 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, patentes estadounidenses n.os 6.013.516; y 5.994.136, cualquiera de los cuales puede adaptarse para producir un vector de transferencia de la presente invencion. En general, estos vectores se basan en plasmidos o en virus, y estan configurados para portar las secuencias esenciales para la transferencia de un acido nucleico que codifica para un polipeptido terapeutico en una celula huesped.
El genoma lentiviral y el ADN proviral incluyen tres genes encontrados en retrovirus: gag, pol y env, que estan flanqueados por dos secuencias de repeticion terminal larga (LTR). El gen gag codifica para las protemas estructurales internas (matriz, capside y nucleocapside); el gen pol codifica para la ADN polimerasa dirigida por ARN (transcriptasa inversa), una proteasa y una integrasa; y el gen env codifica para glicoprotemas de la envuelta viral. Las LTR 5' y 3' actuan para promover la transcripcion y poliadenilacion de los ARN de virion, respectivamente. Los lentivirus tienen genes adicionales incluyendo vif, vpr, tat, rev, vpu, nef y vpx. Adyacentes a la LTR 5' hay secuencias necesarias para la transcripcion inversa del genoma (el sitio de union al cebador de ARNt) y para encapsidacion eficaz de a Rn viral en partfculas (el sitio de Psi).
En realizaciones adicionales, el vector lentiviral es un vector de VIH. Por tanto, los vectores pueden derivarse de virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1), virus de la inmunodeficiencia humana 2 (VIH-2), virus de la inmunodeficiencia de simio (SIV), virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), virus de la enfermedad de Jembrana (JDV), virus de anemia infecciosa equina (EIAV), virus de encefalitis y artritis caprina (CAEV) y similares. Se prefieren generalmente estructuras principales de vectores basados en VIH (es decir, elementos de secuencia que actuan en cis de genes de VIH y VIH gag, pol y rev) en relacion con la mayona de aspectos de la presente invencion en la que los constructos basados en VIH son los mas eficaces en la transduccion de celulas humanas.
En diversas realizaciones, los vectores de la invencion comprenden un promotor operativamente en una celula microglial unido operativamente a un gen que codifica para un polipeptido que proporciona terapia para adrenoleucodistrofias y/o adrenomieloneuropatfas. Los vectores pueden tener una o mas LTR, en las que cualquier LTR comprende una o mas modificaciones, tales como una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de nucleotidos. Los vectores pueden comprender ademas uno de mas elementos auxiliares para aumentar la eficacia de transduccion (por ejemplo, un cPPT/FLAP), empaquetamiento viral (por ejemplo, una senal de empaquetamiento Psi (Y), RRE) y/u otros elementos que aumentan la expresion genica terapeutica (por ejemplo, secuencias de poli (A)), excepto porque los vectores de la invencion no comprenden un WPRE o HPRE.
En un ejemplo particular, el vector de transferencia de la divulgacion comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportacion retroviral; un promotor activo en una celula microglial, unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); y una LTR retroviral derecha (3'); en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En un ejemplo particular, el vector de transferencia de la divulgacion comprende una LTR retroviral izquierda (5'); un elemento de exportacion retroviral; un promotor activo en una celula microglial, unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); una LTR retroviral derecha (3'); y una secuencia de poli(A), en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE). En otro ejemplo particular, la divulgacion proporciona un vector lentiviral que comprende: una LTR izquierda (5'); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor m Nd unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de ABCD1 humano (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-2); una LTR derecha (3'); y una secuencia de poliadenilacion; en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En una realizacion determinada, la invencion proporciona un vector lentiviral que comprende: una LTR de VIH-1 izquierda (5'); una senal de empaquetamiento Psi (Y); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor MND, unido operativamente a un ADNc que codifica para un polipeptido de ABCD1 humano; una LTR de VIH-1 de autoinactivacion (SIN) derecha (3'); y una secuencia de poliadenilacion de p-globina de conejo sintetica; en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En otro ejemplo, la divulgacion proporciona un vector que comprende: al menos una LTR; un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP); un elemento de exportacion retroviral; y un promotor activo en una celula microglial, unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En un ejemplo particular, la presente divulgacion proporciona un vector que comprende al menos una LTR; un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor MND unido operativamente a un polinucleotido que codifica para un polipeptido de ABCD1 humano; y una secuencia de poliadenilacion; en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
En un ejemplo determinado, la presente divulgacion proporciona al menos una LTR de VIH-1 de SIN; una senal de empaquetamiento Psi (Y); un cPPT/FLAP; un RRE; un promotor MND, unido operativamente a un ADNc que codifica para un polipeptido de ABCD1 humano; y una secuencia de poliadenilacion de p-globina de conejo, en el que el vector no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
El experto en la tecnica apreciara que pueden crearse muchos otros ejemplos diferentes a partir de los ejemplos existentes de la divulgacion, de modo que el transgen terapeutico se exprese en una celula microglial en un vector retroviral que carece de un elemento WPRE o HPRE.
D. Composiciones y formulaciones
La presente divulgacion incluye ademas composiciones farmaceuticas que comprenden celulas transducidas producidas segun metodos descritos en el presente documento y un portador farmaceuticamente aceptable. El portador puede ser adecuado para administracion parenteral. El portador puede ser adecuado para administracion intravenosa, intraperitoneal o intramuscular. Los portadores farmaceuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones esteriles acuosas y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones esteriles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica.
Las composiciones de la divulgacion pueden comprender uno o mas polipeptidos, polinucleotidos, vectores que los comprenden, celulas transducidas, etc., tal como se describe en el presente documento, formulados en disoluciones farmaceuticamente aceptables o fisiologicamente aceptables para la administracion a una celula o un animal, o bien solos, o bien en combinacion con una o mas de otras modalidad de terapia. Se entendera tambien que, si se desea, las composiciones de la divulgacion pueden administrarse en combinacion con otros agentes tambien, tales como, por ejemplo, otras protemas, polipeptidos, moleculas pequenas o diversos agentes farmaceuticamente activos. Practicamente no existe lfmite a los demas componentes que tambien pueden incluirse en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten de manera adversa a la capacidad de la composicion para suministrar la terapia genica prevista.
En las composiciones farmaceuticas de la divulgacion, la formulacion de excipientes farmaceuticamente aceptables y disoluciones de portador la conoce bien los expertos en la tecnica, asf como el desarrollo de regfmenes de tratamiento y dosificacion adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una variedad de regfmenes de tratamiento, incluyendo por ejemplo, administracion y formulacion oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular.
En determinadas circunstancias, sera deseable administrar las composiciones dadas a conocer en el presente documento por via parenteral, por via intravenosa, por via intramuscular, o incluso por via intraperitoneal tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.543.158; patente estadounidense n.° 5.641.515 y patente estadounidense n.° 5.399.363. Pueden prepararse disoluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmaceuticamente aceptables en agua mezclada de manera adecuada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones esteriles acuosas y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones esteriles inyectables (patente estadounidense n.° 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida hasta el punto de que exista una facil jeringabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe conservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Puede mantenerse la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal, y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administracion parenteral en una disolucion acuosa, por ejemplo, la disolucion debe tamponarse de manera adecuada si es necesario y el diluyente lfquido hacerse en primer lugar isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas disoluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. En este sentido, un medio acuoso esteril que puede emplearse lo conoceran los expertos en la tecnica en vista de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosificacion puede disolverse en 1 ml de disolucion de NaCl isotonica y o bien anadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o bien inyectarse en el sitio de infusion propuesto (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edicion. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000). Alguna variacion en la dosificacion se producira necesariamente segun el estado del sujeto que esta tratandose. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual. Ademas, para la administracion a seres humanos, las preparaciones deben cumplir normas de esterilidad, pirogenicidad y de seguridad y pureza generales tal como lo requiere la Oficina de Normas Biologicas de la FDA.
Pueden prepararse disoluciones inyectables esteriles incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con los diversos otros componentes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido por esterilizacion por filtracion. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehuculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los demas componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado a vado y de secado por congelacion que producen un polvo del principio activo mas componente deseado adicional a partir de una disolucion esterilizada por filtracion previamente del mismo.
Las composiciones dadas a conocer en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhudrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien pueden derivarse a partir de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares. Tras la formulacion, las disoluciones se administraran de manera compatible con la formulacion de dosificacion y en cantidad tal que es terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion tales como disoluciones inyectables, capsulas de liberacion de farmaco, y similares.
Tal como se usa en el presente documento, “portador” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersion, vehmulos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes de retardo de la absorcion e isotonicos, tampones, disoluciones de portador, suspensiones, coloides, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce bien en la tecnica. Salvo en la medida en la que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapeuticas. Tambien pueden incorporarse principios activos complementarios en las composiciones.
La frase “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reaccion alergica o adversa similar cuando se administra a un ser humano. La preparacion de una composicion acuosa que contiene una protema como principio activo se entiende bien en la tecnica. Normalmente, tales composiciones se preparan como productos inyectables, o bien como disoluciones o bien suspensiones lfquidas; tambien pueden prepararse formas solidas adecuadas para disolucion en, o suspension en, ifquido antes de la inyeccion. La preparacion tambien puede emulsionarse.
Las composiciones pueden administrarse mediante nebulizadores intranasales, inhalacion y/u otros vehmulos de administracion de aerosol. Metodos para administrar genes, polinucleotidos y composiciones de peptido directamente a los pulmones por medio de nebulizadores de aerosol nasal se han descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.756.353 y la patente estadounidense n.° 5.804.212. Asimismo, la administracion de farmacos usando resinas microparticuladas intranasales (Takenaga et al., 1998) y compuestos de lisofosfatidilglicerol (patente estadounidense n.° 5.725.871) tambien se conocen bien en las tecnicas farmaceuticas. Asimismo, se describe la administracion de farmaco transmucosa en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno en la patente estadounidense n.° 5.780.045.
La administracion puede producirse mediante el uso de liposomas, nanocapsulas, micropartmulas, microesferas, partmulas lipfdicas, vesmulas, opcionalmente mezclando con polipeptidos de CPP, y similares, para la introduccion de las composiciones de la presente divulgacion en celulas huesped adecuadas. En particular, las composiciones de la presente divulgacion pueden formularse para administracion o bien encapsuladas en una partmula lipfdica, un liposoma, una vesmula, una nanoesfera, una nanopartmula o similar. La formulacion y el uso de tales vehmulos de administracion pueden llevarse a cabo usando tecnicas conocidas y convencionales. Las formulaciones y composiciones de la divulgacion pueden comprender uno o mas supresores y/o activadores comprendidos por una combinacion de cualquier numero de polipeptidos, polinucleotidos y moleculas pequenas, tal como se describe en el presente documento, formulados en disoluciones farmaceuticamente aceptables o fisiologicamente aceptables (por ejemplo, medio de cultivo) para administracion a una celula o un animal, o bien solos, o bien en combinacion con una o mas de otras modalidades de terapia. Se entendera tambien que, si se desea, las composiciones de la divulgacion pueden administrarse en combinacion con otros agentes tambien, tales como, por ejemplo, celulas, otras protemas o polipeptidos o diversos agentes farmaceuticamente activos.
En un ejemplo particular, una formulacion o composicion segun la presente divulgacion comprende una celula puesta en contacto con una combinacion de cualquier numero de polipeptidos, polinucleotidos y moleculas pequenas, tal como se describe en el presente documento.
En determinados aspectos, la presente divulgacion proporciona formulaciones o composiciones adecuadas para la administracion de sistemas de vector viral (es decir, transduccion mediada por virus) incluyendo, pero sin limitarse a, vectores retrovirales (por ejemplo, lentivirales).
Las formulaciones a modo de ejemplo para la administracion ex vivo tambien pueden incluir el uso de diversos agentes de transfeccion conocidos en la tecnica, tales como fosfato de calcio, electoporacion, choque termico y diversas formulaciones de liposoma (es dedr, transfeccion mediada por Kpidos). Los liposomas, tal como se describe en mayor detalle a continuacion, son bicapas lip^dicas que atrapan una fraccion de fluido acuoso. El ADN se asocia de manera espontanea con la superficie externa de liposomas cationicos (en virtud de su carga) y estos liposomas interaccionaran con la membrana celular.
En determinados aspectos, la presente divulgacion proporciona composiciones farmaceuticamente aceptables que comprenden una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas polinucleotidos o polipeptidos, tal como se describe en el presente documento, formulados junto con uno o mas portadores farmaceuticamente aceptables (aditivos) y/o diluyentes (por ejemplo, medio de cultivo celular farmaceuticamente aceptable).
Los ejemplos particulares de la divulgacion pueden comprender otras formulaciones, tales como las que se conocen bien en la tecnica farmaceutica, y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edicion. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000.
E. Metodos de terapia genica
Los vectores retrovirales proporcionan metodos mejorados de terapia genica para la adrenoleucodistrofia y la adrenomieloneuropatfa. Tal como se usa en el presente documento, el termino “terapia genica” se refiere a la introduccion de un gen en un genoma celular. En diversas realizaciones, un vector viral de la invencion comprende un promotor que expresa un transgen terapeutico que codifica para un polipeptido que proporciona beneficios curativos, preventivos o de mejora a un sujeto al que se le diagnostica o que se sospecha que padece una adrenoleucodistrofia o una adrenomieloneuropatfa. El virus puede infectar y transducir la celula in vivo, ex vivo o in vitro. En realizaciones ex vivo e in vitro, las celulas transducidas pueden administrarse entonces a un sujeto que necesita terapia. La presente invencion contempla que los sistemas de vector, las partfculas virales y las celulas transducidas de la invencion puedan usarse para tratar, prevenir y/o mejorar una adrenoleucodistrofia o una adrenomieloneuropatfa en un sujeto.
En diversas realizaciones, los vectores retrovirales son para su uso en la administracion mediante inyeccion directa a una celula, tejido u organo de un sujeto que necesita terapia genica, in vivo. En otras diversas realizaciones, las celulas se transducen in vitro o ex vivo con vectores de la invencion. Las celulas transducidas son entonces para su uso en la administracion a un sujeto que padece adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatfa.
Las celulas adecuadas para transduccion y administracion en los metodos de terapia genica dados a conocer en el contexto de la invencion incluyen, pero no se limitan a celulas madre, celulas progenitoras y celulas diferenciadas. En determinadas realizaciones, las celulas transducidas son celulas madre de medula osea, celulas madre de cordon umbilical o celulas madre mesenquimatosas.
En diversas realizaciones, el uso de celulas madre se prefiere porque tienen la capacidad de diferenciarse en los tipos celulares apropiados cuando se administran a un nicho biologico particular, in vivo. El termino “celula madre” se refiere a una celula que es una celula indiferenciada que puede (1) autorrenovarse a largo plazo, o la capacidad de generar al menos una copia identica de la celula original, (2) diferenciacion al nivel de celula individual en multiples, y en algunos casos solo uno, tipos celulares especializados y (3) de regeneracion funcional in vivo de tejidos. Las celulas madre se subclasifican segun su potencial de desarrollo como totipotentes, pluripotentes, multipotentes y oligo/unipotentes. “Autorrenovacion” se refiere a una celula con una capacidad unica de producir celulas hijas inalteradas y de generar tipos celulares especializados (potencia). La autorrenovacion puede lograrse de dos maneras. La division celular asimetrica produce una celula hija que es identica a la celula parental y una celula hija que es diferente de la celula parental y es una celula progenitora o diferenciada. La division celular asimetrica no aumenta el numero de celulas. La division celular simetrica produce dos celulas hijas identicas. “Proliferacion” o “expansion” de celulas se refiere a celulas que se dividen de manera simetrica.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “pluripotente” significa la capacidad de una celula de formar todos los linajes del cuerpo u organismo (es decir, el propio embrion). Por ejemplo, las celulas madre embrionarias son un tipo de celulas madre pluripotentes que pueden formar celulas de cada una de las tres capas germinales, el ectodermo, el mesodermo y el endodermo. Tal como se usa en el presente documento, el termino “multipotente” se refiere a la capacidad de una celula madre adulta de formar multiples tipos celulares de un linaje. Por ejemplo, las celulas madre hematopoyeticas pueden formar todas las celulas del linaje de celulas sangumeas, por ejemplo, celulas linfoides y mieloides.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “progenitor” o “celulas progenitoras” se refiere a celulas que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en celulas mas maduras. Muchas celulas progenitoras se diferencian a lo largo de un unico linaje, pero pueden tener una capacidad proliferativa bastante amplia.
Las celulas madre hematopoyeticas (HSC) dan lugar a celulas progenitoras hematopoyeticas comprometidas (HPC) que pueden generar todo el repertorio de celulas sangumeas maduras a lo largo de la vida de un organismo. El termino “celula madre hematopoyetica” o “HSC” se refiere a celulas madre multipotentes que dan lugar a todos los tipos de celulas sangumeas de un organismo, incluyendo linajes mieloide (por ejemplo, monocitos y macrofagos, neutrofilos, basofilos, eosinofilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, celulas dendnticas) y linfoide (por ejemplo, celulas T, celulas B, celulas NK), y otros conocidos en la tecnica (vease Fei, R., et al., patente estadounidense n.° 5.635.387; McGlave, et al., patente estadounidense n.° 5.460.964; Simmons, P., et al., patente estadounidense n.° 5.677.136; Tsukamoto, et al., patente estadounidense n.° 5.750.397; Schwartz, et al., patente estadounidense n.° 5.759.793; DiGuisto, et al., patente estadounidense n.° 5.681.599; Tsukamoto, et al., patente estadounidense n.° 5.716.827). Cuando se trasplantan en animales o seres humanos irradiados de manera mortal, las celulas progenitoras y madre hematopoyeticas pueden repoblar el conjunto de celulas hematopoyeticas eritroides, de neutrofilos-macrofagos, megacariocitos y linfoides.
En realizaciones preferidas, las celulas transducidas son celulas progenitoras y/o madre hematopoyeticas aisladas de medula osea, sangre del cordon umbilical o circulacion periferica. En realizaciones particulares preferidas, las celulas transducidas son celulas madre hematopoyeticas aisladas de medula osea, sangre del cordon umbilical o circulacion periferica.
Las celulas de la invencion pueden ser autologas/autogenicas (“propias”) o no autologas (“no propias”, por ejemplo, alogenicas, singenicas o xenogenicas). “Autologas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a celulas del mismo sujeto. “Alogenicas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a celulas de la misma especie que difieren geneticamente con respecto a la celula en comparacion. “Singenicas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a celulas de un sujeto diferente que son geneticamente identicas a la celula en comparacion. “Xenogenicas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a celulas de una especie diferente a la celula en comparacion. En realizaciones preferidas, las celulas de la invencion son alogenicas.
Un “sujeto”, tal como se usa en el presente documento, incluye cualquier animal que presenta un smtoma de una adrenoleucodistrofia o una adrenomieloneuropatfa que puede tratarse con los vectores de terapia genica, productos terapeuticos basados en celulas y metodos dados a conocer en otra parte en el presente documento. Los sujetos adecuados (por ejemplo, pacientes) incluyen animales de laboratorio (tales como raton, rata, conejo o cobaya), animales de granja y animales domesticos y mascotas (tales como un gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, preferiblemente, pacientes humanos. Los sujetos tfpicos incluyen animales que presentan cantidades aberrantes (cantidades menores o mayores que un sujeto “normal” o “sano”) de una o mas actividades fisiologicas que pueden modularse mediante terapia genica.
Tal como se usa en el presente documento “tratamiento” o “tratar”, incluye cualquier efecto beneficioso o deseable de los smtomas o patologfa de una enfermedad o estado patologico, y puede incluir incluso reducciones mmimas en uno o mas marcadores medibles de la enfermedad o el estado que esta tratandose. El tratamiento puede implicar opcionalmente o bien la reduccion o la mejora de smtomas de la enfermedad o el estado, o bien el retraso del avance de la enfermedad o el estado. “Tratamiento” no indica necesariamente erradicacion o cura completa de la enfermedad o el estado, o smtomas asociados de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, “prevenir”, y palabras similares tales como “previno”, “que previene” etc., indican un enfoque para prevenir, inhibir o reducir la probabilidad de la aparicion o reaparicion de una enfermedad o estado. Tambien se refiere a retrasar la aparicion o reaparicion de una enfermedad o estado o retrasar la aparicion o reaparicion de los smtomas de una enfermedad o estado. Tal como se usa en el presente documento, “prevencion” y palabras similares tambien incluyen reducir la intensidad, el efecto, los smtomas y/o la carga de una enfermedad o estado antes de la aparicion o reaparicion de la enfermedad o el estado.
Tal como se usa en el presente documento, el termino “cantidad” se refiere a “una cantidad eficaz” o “una cantidad eficaz” de un virus o celula terapeutica transducida para lograr un resultado beneficioso o profilactico o terapeutico deseado, incluyendo resultados clmicos.
Una “cantidad profilacticamente eficaz” se refiere a una cantidad de un virus o celula terapeutica transducida eficaz para lograr el resultado profilactico deseado. Normalmente, pero no necesariamente, puesto que se usa una dosis profilactica en sujetos antes de o en un estadio anterior de la enfermedad, la cantidad profilacticamente eficaz es menor que la cantidad terapeuticamente eficaz.
Una “cantidad terapeuticamente eficaz” de un virus o celula terapeutica transducida puede variar segun factores tales como el estado patologico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad de las celulas madre y progenitoras para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapeuticamente eficaz tambien es una en la que cualquier efecto toxico o perjudicial del virus o celulas terapeuticas transducidas se compensa por los efectos terapeuticamente beneficiosos. El termino “cantidad terapeuticamente eficaz” incluye una cantidad que es eficaz para “tratar” un sujeto (por ejemplo, un paciente).
En una realizacion preferida, la invencion proporciona celulas transducidas con el potencial de desarrollarse en celulas microgliales cerebrales. En realizaciones particulares, se transducen celulas madre hematopoyeticas con un vector de la invencion y para su uso en un metodo de tratamiento de adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatfa. Las celulas madre hematopoyeticas son el origen de celulas microgliales cerebrales y, por tanto, se prefieren.
Las celulas transducidas pueden administrarse como parte de un trasplante de medula osea en un individuo que se ha sometido o no a terapia ablativa de medula osea. En una realizacion, las celulas transducidas de la invencion se administran en un trasplante de medula osea a un individuo que se ha sometido a terapia de medula osea quimioablativa o radioablativa. En realizaciones preferidas, el sujeto es un varon joven.
En una realizacion, el uso comprende que una dosis de celulas transducidas se administre a un sujeto por via intravenosa. En realizaciones preferidas, el uso comprende que celulas madre hematopoyeticas transducidas se administren por v^a intravenosa a un sujeto.
En realizaciones particulares, el uso comprende que los pacientes reciban una dosis de celulas madre hematopoyeticas transducidas de aproximadamente 1 x 105 celulas/kg, aproximadamente 5 x 105 celulas/kg, aproximadamente 1 x 106 celulas/kg, aproximadamente 2 x 106 celulas/kg, aproximadamente 3 x 106 celulas/kg, aproximadamente 4 x 106 celulas/kg, aproximadamente 5 x 106 celulas/kg, aproximadamente 6 x 106 celulas/kg, aproximadamente 7 x 106 celulas/kg, aproximadamente 8 x 106 celulas/kg, aproximadamente 9 x 106 celulas/kg, aproximadamente 1 x 107 celulas/kg, aproximadamente 5 x 107 celulas/kg, aproximadamente 1 x 108 celulas/kg, o mas en una unica dosis intravenosa. En una realizacion determinada, el uso comprende que los pacientes reciban una dosis de celulas madre hematopoyeticas transducidas de aproximadamente 1 x 105 celulas/kg a aproximadamente 1 x 108 celulas/kg, de aproximadamente 1 x 106 celulas/kg a aproximadamente 1 x 108 celulas/kg, de aproximadamente 1 x 106 celulas/kg a aproximadamente 9 x 106 celulas/kg, de aproximadamente 2 x 106 celulas/kg a aproximadamente 8 x 106 celulas/kg, de aproximadamente 2 x 106 celulas/kg a aproximadamente 8 x 106 celulas/kg, de aproximadamente 2 x 106 celulas/kg a aproximadamente 5 x 106 celulas/kg, de aproximadamente 3 x 106 celulas/kg a aproximadamente 5 x 106 celulas/kg, de aproximadamente 3 x 106 celulas/kg a aproximadamente 4 x 108 celulas/kg, o cualquier dosis intermedia de celulas/kg.
Las celulas transducidas pueden estimulares con citocinas para su expansion usando metodos existente en la tecnica. En diversas realizaciones, el uso comprende que a los sujetos se les administren 1, 2, 3, 4, 5, o mas dosis a lo largo de dfas, meses o anos, segun sea necesario para mantener o aumentar la terapia.
En realizaciones particulares, se transducen celulas madre hematopoyeticas con un vector de la invencion que comprende un promotor activo en celulas microgliales, por ejemplo, un promotor MND, que se une operativamente a un gen que codifica para un polipeptido, por ejemplo, ABCD1, que puede usarse para tratar, prevenir o mejorar una adrenoleucodistrofia y/o adrenomieloneuropatfa en un sujeto.
La presente invencion se describira ahora mas completamente mediante los siguientes ejemplos. Esta invencion, sin embargo, puede realizarse de muchas formas diferentes y no debe interpretarse como limitada a las realizaciones expuestas en el presente documento; mas bien, estas realizaciones se proporcionan para que esta divulgacion sea exhaustiva y completa, y transmitiran totalmente el alcance de la invencion a los expertos en la tecnica.
Ejemplos
Ejemplo 1
Comparacion de transducciones genicas en celulas madre hematopoyeticas humanas normales usando vectores lentivirales ABCD1 con o sin el WPRE
Resumen experimental:
Un vector lentiviral que comprende un promotor MND unido operativamente a un ADNc que codifica para ACBD1 humano, y un vector de elemento WPRE (vease la figura 1; CG1711 MND-ALD) no esta disponible para desarrollo comercial. Como resultado, los solicitantes emprendieron un programa de desarrollo de vectores para identificar un vector lentiviral apropiado para llevarlo a futuros ensayos clmicos. El vector comercialmente aceptable se elaboro como resultado del programa de desarrollo de vectores y no altero el gen de ABCD-1 unido operativamente al promotor MND. De manera sorprendente, la retirada del WPRE del vector no altero la eficacia de transduccion y expresion de transgenes en celulas humanas hematopoyeticas. Se realizaron las siguientes series de experimentos en celulas hematopoyeticas usando ensayos de progenitores a corto y largo plazo para comparar dos vectores de MND-ALD, pLBP10o (vease la figura 1 y Se Q ID NO: 1; se retiro WPRE) y pLBP140 (vease la figura 1; tiene WPRE funcional), que difenan con respecto a la presencia de WPRE.
Constructos de vectores lentivirales
Todos los vectores lentivirales conteman el ADNc de casete de union a ATP humano normal, subfamilia D (AL), miembro 1 (ABC1) bajo el control del promotor MND. La figura 1 y la tabla 1 resumen los diferentes componentes y su posicion en los vectores de MND-ALD CG1711, pLBP100 y pLBP140.
Tabla 1: Resumen de vectores
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Transduccion
Se produjeron sobrenadantes de pLBP100 y pLBP140 lentivirales mediante transfeccion con fosfato de calcio de celulas 293T con 5 plasmidos (vectores pLBP100 o pLBP140, HPV 275 - gag-pol, YN 15 - VSV-G env, p633 - rev, HPV601 - tat). Se obtuvo pLBP100 concentrado tras ultracentrifugacion, se resuspendio en medio SCGM (CellGenix Inc., Alemania GMBH), y se crioconservo a <-70°C en crioviales de un unico uso. Se determinaron los tttulos infecciosos a partir del analisis citometrico de flujo de celulas 3T3 transducidas.
Se realizo la comparacion de los vectores lentivirales pLBP100 y pLBP140 para determinar la transduccion de celulas madre hematopoyeticas humanas entre los cuatro experimented separados resumidos en la tabla 2. Se ilustran procedimientos y ensayos para experimentos realizados en las figuras 2 y 3 respectivamente.
Tabla 2: Resumen experimental
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Se lavaron celulas CD34+ de medula osea (BM) humanas nuevas (Lonza, Walquersville, MD) o celulas CD34+ de sangre periferica movilizadas (mPB) con G-CSF humano nuevas o crioconservadas (AllCells, LLC, Emeryville, CA) y se cultivaron durante 18 horas en SCGM complementado con IL-3 recombinante humana (60 ng/ml), Flt-3L (100 ng/ml), TPO (100 ng/ml) y SCF (100 ng/ml) (Peprotech) a una concentracion celular de 1 x 106 celulas/ml. Entonces se retiraron las celulas, se lavaron y se resuspendieron en volumenes de 200 |il unicos (expt. 080610) o por triplicado (expts. 072010, 081010 y 091410) en placas de 96 pocillos de fondo plano a una concentracion de 2 x 106 celulas/ml en sobrenadante de s Cg M (control simulado) o pLBP100 o pLBP140) a MOI de 8,6 a 25 (1,7-5,0 x 107 TU/ml de titulo final) complementado con las mismas concentraciones de citocinas y sulfato de protamina 8 |ig/ml anadido con virus. En el expt. 080610, se realizaron transducciones en placas de 96 pocillos recubiertas previamente con retronectina 20 |ig/ml (Takara Bio Inc, Shiga, Japon) con incubacion durante la noche a 4°C.
Ensayos de progenitor a corto plazo
A las 24 horas tras la adicion del virus, se lavaron las celulas y, o bien (1) se resuspendieron en medio SCGM complementado con la misma concentracion de citocinas y se incubaron adicionalmente durante 21 dfas o bien (2) 1- se cultivaron en medio MetoCult H4434 (Stem Cell Technologies) para determinar las celulas formadoras de colonias (CFC).
Las colonias mieloides (UFC-GM) y eritroides (BFU-E) totales se enumeraron a los 14 dfas y las celulas se suspendieron en PBS, se lavaron y se preparo ADN genomico con el kit DNEASy (QIAGEN) (1-2 x 106 celulas viables).
Ensayo de celulas iniciadoras de cultivo a largo plazo (LTC-IC)
Se inocularon ocho placas de 96 pocillos con la lmea celular estromal de medula osea de raton MS-5 en medio Alfa complementado con suero bovino fetal al 10% y se irradiaron con radiacion gamma (30 Gy) cuando se hicieron casi confluentes.
A los dos dfas tras la irradiacion, se inocularon las capas estromales de MS-5 establecidas previamente con celulas de prueba CD34+ humanas en 200 |il de SFEM StemSpan (medio libre de suero, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) a diversas diluciones con 16 pocillos por dilucion (2000 celulas por pocillo en 16 pocillos, 1000 celulas por pocillo en 16 pocillos, 500 celulas por pocillo en 16 pocillos, 250 celulas por pocillo en 16 pocillos, 125 celulas por pocillo en 16 pocillos, 62 celulas por pocillo en 16 pocillos, 31 celulas por pocillo en 16 pocillos, 16 celulas por pocillo en 16 pocillos, 8 celulas por pocillo en 16 pocillos). Se cultivaron 100.000 celulas CD34+ adicionales a granel durante 5 semanas en celulas alimentadoras MS-5. Cada semana, se reemplazaron 100 |il del medio por 100 |il de SFEM StemSpan nuevo. Tras 5 semanas, se recogieron los cultivos y entonces se sembro el contenido completo en Metocult™ GF+ H4434 (500 |il de metilcelulosa por pocillo de placas de 12 pocillos) para el crecimiento de 14 dfas de las colonias. Despues se recogieron colonias individuales y se extrajo ADN para analisis de PCR posterior usando cebadores dirigidos a secuencias gag en el vector y cebadores dirigidos a una secuencia genomica (gen Epo) con el fin de tener un control positivo que confirme la presencia de ADN genomico tras la extraccion (n.° de SOP GTX/RE/PBM/M-023 y LTGC/RE/PBm /m -07). Las frecuencias y los intervalos de confianza del 95% de LTC-IC se calcularon usando el software L-calc, version 1.1 (Stem Cell Technologies).
Determinacion del numero de copias del vector (VCN)
Se determino el VCN promedio por celula a partir de PCR cuantitativa (tiempo real) (QPCR) en preparaciones de ADN de o bien cultivos lfquidos o bien celulas de colonias agrupadas en cultivos en metilcelulosa tras dilucion y lavado en PBS. Se realizo QPCR en el sistema de deteccion de secuencias ABI Prism 7000 con reactivos ABI y placas de 96 pocillos.
Sonda de gag y cebadores humanos usados para cuantificar el vector:
GAG-F (cebador directo) 5'ggagctagaacgattcgcagtta 3'
GAG-R (cebador inverso) 5' ggttgtagctgtcccagtatttgtc 3'
GAG-P (sonda, antisentido) 5'-(FAM)-acagccttctgatgtctctaaaaggccagg-(TAMRA)-3'
Sonda de ^-actina y cebadores humanos usados para cuantificar ADN genomico para normalizacion:
Sonda: 5' VIC-cctggcctcgctgtccaccttcca-TAMRA
Directo-5' tccgtgtggatcggcggctcca 3'
Inverso-5' ctgcttgctgatccacatctg 3'.
Se evaluo una centesima parte del ADN genomico eluido (aproximadamente 50-100 ng) usando mezcla maestra universal 1x TaqMan®, 0,72 uM cada cebador y sonda 0,35 uM en una reaccion de 25 ul con el programa de cuantificacion absoluta y programa de ciclado termico por defecto.
Expresion de transgenes mediante citometria de flujo
Se realizo la expresion de la protema ABCD1 (ALDP) se realizo en celulas fijadas y permeabilizadas (reactivos de fij. y perm. A y B, n.os de cat. GAS001 y GAS002, Invitrogen) usando el anticuerpo monoclonal de raton anti-ALDP humano (ABCD1) (clon 1D6, n.° de lote LV1383343, Chemicon) seguido por tincion con AcM de rata anti-IgG1 de raton conjugado con PE (clon A85-1, BD Pharmingen). Se uso el clon de anticuerpo monoclonal de IgG1 de raton MOPC-21 (BioLegend) como control de isotipo.
Analisis estad^stico
Se analizo la comparacion de los valores de grupo dentro de cada experimento usando prueba de la U de Mann-Whitney no parametrica de dos colas (GraphPad Prism v. 3.0) y cuando el tamano de muestra fue suficiente (n = >3). La significacion entre los grupos se determino a un valor de p de por debajo de 0,05.
Resultados:
Efecto sobre las frecuencias de celulas progenitoras
Se comparo el rendimiento de progenitores mieloides (UFC-GM) y eritroides (BFU-E) funcionales para los cuatro experimented en la figura 4 y no muestran efecto significativo de la adicion de sobrenadantes de o bien pLBP100 o bien pLBP140 para transducciones por triplicado en un primer conjunto de experimentos (experimentos 072010, 081010 y 091410). Para el segundo conjunto de experimentos (experimentos 080610) en los que se compararon seis conjuntos de cultivos en metilcelulosa para transducciones individuales, se observo un aumento significativo en progenitores mieloides con adicion de pLBP100 mientras que se observo una disminucion significativa del rendimiento de colonias eritroides tras el tratamiento con pLBP100 y disminuyo ademas tras la transduccion de pLBP140.
Las frecuencias del LTC-IC mas primitivo fueron en promedio menores tras la transduccion con los dos vectores lentivirales (figura 5) pero, dado que los intervalos de confianza del 95% se solapaban, entonces estas diferencias no fueron significativas (p > 0,05).
Eficacia de transduccion mediante PCR del vector
El analisis de PCR en tiempo real de ADN genomico aislado de celulas mantenidas en cultivo lfquido a lo largo de 35 dfas mostro un numero de copias del vector (VCN) estimado mayor en todos los puntos de tiempo para pLBP100 en comparacion con pLBP140 en el segundo conjunto de experimentos (figura 6A).
Esto tambien se vio reflejado en el VCN promedio mayor para CFC agrupadas que crecen en los cultivos de metilcelulosa y el porcentaje de colonias mieloides positivas para el vector del mismo experimento (figura 6B y C). La comparacion entre los experimentos por triplicado del primer conjunto de experimentos, sin embargo, no mostro diferencia significativa en VCN de colonias agrupadas o del porcentaje de colonias que dieron positivo para el vector. La figura 7 muestra que el VCN promedio y el porcentaje de colonias mieloides positivas para el vector disminuyeron tras el LTC-IC de 5 semanas tanto para los grupos de vector con las celulas transducidas con pLBP100 que teman de nuevo mayor VCN (1,1 frente a 0,4 copias) como la proporcion de colonias positivas (el 51% frente al 35%). Expresion de transgenes de ALDP mediante citometria de flujo
Se muestran ejemplos de perfiles de fluorescencia de celulas tenidas a nivel intracelular con el anticuerpo anti-ALDP en los histogramas en la figura 8A1 y A2 a partir de los cuales se determino el porcentaje positivo (determinado a mas alla del 0,5% de los respectivos controles simulados) y la razon de la mediana de las intensidades de fluorescencia (MFI) y se presentan en la figura 8B y C. El nivel de expresion de transgenes vario entre los experimentos con un porcentaje promedio mayor de celulas de expresion que se produce para los grupos de pLBP100 en comparacion con pLBP140 en los expts. 072010 y 080610. Sin embargo, se observo lo contrario en el expt. 091410 y niveles comparables en el expt. 081010. Las comparaciones estadfsticas entre los experimentos por triplicado no mostraron diferencias significativas o bien en el porcentaje de celulas ALDP+ o bien el MFI (p >0,05). Conclusiones:
Se realizaron comparaciones entre cuatro experimentos separados usando dos preparaciones del vector lentiviral pLBP100 preclmico y tres preparaciones del vector pLBP140 que contema WPRE y que implicaban transducciones de celulas CD34+ humanas normales que se originan a partir de medula osea o sangre periferica movilizada con GCSF. Con la excepcion de un aumento en progenitores mieloides y una disminucion en progenitores eritroides en el experimento 080610, no hubo toxicidad significativa de los sobrenadantes, o bien para progenitores tempranos o bien los LTC-IC mas primitivos. Hubo una tendencia a eficacias de transduccion menores para el pLBP140 segun el VCN promedio o la proporcion de colonias mieloides que contienen vector o LTC-IC pero esto no fue estadfsticamente significativo para aquellos experimentos de tamano de muestra suficiente (n=3). El nivel de expresion de transgenes dado por los dos vectores produjo resultados dispares, mostrando dos experimentos un mayor porcentaje de celulas ALDP+ a partir de pLBP100 y mostrando un experimento un porcentaje menor en comparacion con pLBP140. Estas diferencias no fueron estadfsticamente significativas.
En general, parece no haber ninguna ventaja al anadir el WPRE al vector de MND-ALD. Por tanto, los vectores de la presente invencion proporcionan una seguridad aumentada y eficacia igual o superior en comparacion con vectores que contienen WPRE. Ademas, los resultados muestran que los vectores de la invencion son muy adecuados para desarrollo adicional y aplicacion clmica.
Ejemplo 2
Evaluacion de la correccion funcional de deficiencia en protema ALD en fibroblastos humanos primarios con ALD defectuosa
Resumen experimental
La acumulacion de acidos grasos de cadena muy larga (VLCFA), particularmente la cadena C26, se denomina a menudo el “distintivo” bioqmmico de ALD. Hubbard, Mol Genet. Metab. 97:212-220 (2009). La transduccion de celulas defectuosas con vectores retrovirales que contiene el ADNc de ABCD1 restaura los niveles de proteina ALD (ALDP) funcionales y da como resultado un nivel disminuido de VLCFA. Esto se ha mostrado en diferentes poblaciones celulares incluyendo lmeas de fibroblastos primarios de pacientes con ALD.
El ensayo de liso-PC C26:0 (ensayo de LPC), desarrollado en el Kennedy Krieger Institute (Baltimore, MD), mide VLCFA mediante cromatograffa de lfquidos y espectrofotometna de masas en tandem. Este metodo se desarrollo para gotas de sangre de recien nacidos y tambien se valido en plasma y fibroblastos cutaneos cultivados. En este ejemplo, se uso el ensayo de liso-PC C26:0 para demostrar la correccion funcional del defecto bioqmmico en fibroblastos de pacientes con ALD. El fin de este experimento era comparar la eficacia de los vectores pLBP100 (p100) y pLBP140 (p140) en la reduccion de los niveles de VLCFA en celulas de fibroblastos con ALD defectuosa modificadas por vector.
Lmeas celulares
Se obtuvieron celulas de fibroblastos humanos primarios GM04496 y AG01440 del Coriell Cell Repository (Camden, NJ, EE.UU.). Las celulas GM04496 son fibroblastos humanos no transformados aislados de un paciente negativo para ALD con una mutacion desconocida del gen de ABCD1. Las celulas AG01440 son fibroblastos humanos normales. Las celulas se hicieron crecer en DMEM (GIBCO Life Technologies, Carlsbad, CA) con FBS al 15% (HyClone FBS, GIBCO Life Technologies) a 37°C, el 5% de CO2 en un incubador humidificado.
Las celulas TF-1 (numero de ATCC® CRL-2003™) son una lmea de linfoblastos humanos derivados de una eritroleucemia de medula osea. Las celulas se hicieron crecer en RPMI-1640 (GIBCO Life Technologies) con FBS al 10%.
Las celulas 293T (Universidad de Stanford) que se usan para producir vectores lentivirales se hicieron crecer en DMEM con FBS al 10%.
Protocolo de transduccion y siembra en placa para el ensayo de Liso-PC
Se transdujeron celulas subconfluentes con sobrenadante viral en medios Polybrene 8 ug/ml (bromuro de hexadimetrina, Sigma, St Louis MO) durante 14-16 h. Se reemplazo medio nuevo al dfa siguiente. Tan pronto como 3 dfas tras la transduccion, la mayona de las celulas se sembraron en placa por triplicado en placas de 12 pocillos (2 replicas para extraccion lipfdica y una para analisis de protemas. (N.° de Falcon 35-3043). Un numero equivalente de celulas de control normales (293t , AG01440 o TF-1) tambien se sembraron en placa o se centrifugaron. Se lavaron las monocapas celulares dos veces con tampon 1X HBSS (GIBCO Life Technologies) y se congelaron in situ a -20°C. El metodo de congelacion se sometio a prueba en primer lugar en Kennedy Krieger y se determino que era comparable a la cosecha de monocapas celulares nuevas. Las celulas restantes se mantuvieron en cultivo.
Aislamiento de ADN genomico y determinacion del numero de copias del vector (VCN)
Las celulas restantes tras la siembra en placa para el ensayo de LPC se mantuvieron en cultivo para la cosecha de ADN genomico hasta al menos el dfa 9 tras la transduccion para el aislamiento de ADN y el analisis de VCN. Se completo la extraccion de lfpidos y protemas en el Kennedy Krieger Institute.
Resultados:
Analisis de liso-PC de celulas 4496 y diversos controles normales y negativos
Las celulas 4496 y celulas 1440 de fibroblastos normales se sembraron en placa para su analisis. ALDP fue detectable en celulas TF-1 y celulas 293 mediante inmunotincion y citometna de flujo. Por tanto, estas celulas tambien se sometieron a ensayo como controles positivos alternativos (es decir, fenotipo de ALDP normal) para niveles iniciales de LPC C26:0. Las muestras se evaluaron en cuatro analisis independientes.
Los niveles iniciales de LPC C26:0 oscilaron entre proteina 3-50 pmol/mg en celulas con un fenotipo normal, y las celulas 4496 teman niveles elevados en cada analisis. En general, hubo al menos una diferencia de 5 veces (razon por debajo de 0,2) en los niveles de LPC C26:0 en celulas normales en comparacion con 4496. Esta razon fue similar a los resultados notificados para las gotas de sangre de pacientes.
Comparacion de celulas 4496 transducidas con p100 y p140
Se transdujeron celulas 4496 con p100 y p140. Se analizaron las celulas para determinar VLCFA y VCN tal como se describe en el presente documento. Los resultados del ensayo de LisoPC se muestran en la tabla 3. Se calcula el

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Vector lentiviral que comprende:
(a) una LTR de VIH-1 izquierda (5');
(b) una senal de empaquetamiento Psi (Y);
(c) un tramo de polipurina central/fragmento de ADN (cPPT/FLAP);
(d) un elemento de exportacion retroviral de RRE; y
(e) un promotor con sitio de union a cebador dl587rev sustituido, con region de control negativo delecionada, potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (MND), unido operativamente a un ADNc que codifica para un polipeptido de casete de union a ATP humano, subfamilia D, miembro 1 (ABCD1); (f) una LTR de VIH-1 de autoinactivacion (SIN) derecha (3'); y
(g) una secuencia de poliadenilacion de p-globina de conejo sintetica;
en el que el vector lentiviral no comprende un elemento regulador postranscripcional de marmota (WPRE).
2. Celula de mairnfero que comprende un vector lentiviral segun la reivindicacion 1.
3. Celula de empaquetamiento que comprende: un primer polinucleotido que codifica para gag, un segundo polinucleotido que codifica para pol, un tercer polinucleotido que codifica para env y un vector lentiviral segun la reivindicacion 1.
4. Celula productora que comprende un vector lentiviral segun la reivindicacion 1.
5. Partfcula de vector producida por la celula productora segun la reivindicacion 4.
6. Celula huesped transducida con el vector lentiviral segun la reivindicacion 1, en la que la celula es una celula madre somatica, una celula progenitora o una celula madre hematopoyetica, y en la que la celula no es una celula madre embrionaria humana.
7. Celula progenitora o madre hematopoyetica transducida con un vector segun la reivindicacion 1, para su uso en un metodo de tratamiento de adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatfa.
8. Celula progenitora o madre hematopoyetica segun el uso segun la reivindicacion 7, en la que la fuente de las celulas progenitoras o madre hematopoyeticas es medula osea, sangre del cordon umbilical o circulacion periferica.
9. Celula progenitora o madre hematopoyetica segun el uso segun la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en la que la celula progenitora o madre hematopoyetica es una celula madre hematopoyetica CD34+ autologa.
10. Vector lentiviral segun la reivindicacion 1, para su uso en terapia genica, en el que la terapia genica trata o previene la adrenoleucodistrofia o adrenomieloneuropatfa.
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