ES2710850T3 - Uso de Cry1Da en combinación con Cry1Ca para el control de insectos resistentes - Google Patents

Abstract

Una planta transgénica que comprende ADN que codifica una proteína insecticida Cry1Da y ADN que codifica una proteína insecticida Cry1Ca.

Description

DESCRIPCION

Uso de CryIDa en combinacion con CryICa para el control de insectos resistentes

Antecedentes de la invencion

Los seres humanos cultivan el maz para aplicaciones alimentarias y energeticas. Los seres humanos tambien cultivan muchos otros cultivos, incluyendo la soja y el algodon. Los insectos comen y danan las plantas y, por lo tanto, socavan estos esfuerzos humanos. Miles de millones de dolares se gastan cada ano para controlar las plagas de insectos y miles de millones se pierden por el dano que infligen. Los insecticidas qmmicos organicos sinteticos han sido las principales herramientas utilizadas para controlar las plagas de insectos, pero los insecticidas biologicos, tales como las protemas insecticidas derivadas de Bacillus thuringiensis (Bt), han desempenado un papel importante en algunas areas. La capacidad de producir plantas resistentes a los insectos mediante la transformacion con genes de protemas insecticidas Bt ha revolucionado la agricultura moderna y ha aumentado la importancia y el valor de las protemas insecticidas y sus genes.

Varias protemas Bt se han utilizado para crear plantas transgenicas resistentes a los insectos que se han registrado y comercializado con exito hasta la fecha. Estos incluyen CrylAb, CrylAc, CrylF y Cry3Bb en mafz, CrylAc y Cry2Ab en algodon, y Cry3A en patata.

Los productos comerciales que expresan estas protemas expresan una unica protema, excepto en los casos en que se desee el espectro insecticida combinado de 2 protemas (por ejemplo, CrylAb y Cry3Bb en mafz combinado para proporcionar resistencia a plagas de lepidopteros y al gusano de la rafz, respectivamente) o donde la accion independiente de las protemas las hace utiles como una herramienta para retrasar el desarrollo de la resistencia en poblaciones de insectos susceptibles (por ejemplo, CrylAc y Cry2Ab en el algodon combinado para proporcionar el control de resistencia para la yema del tabaco). Vease tambien la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos N° 2009/0313717, que se refiere a una protema Cry2 mas un Vip3Aa, CrylF o C rylA para el control de Helicoverpa zea o armigerain. El documento WO 2009/132850 se refiere a CrylF o C rylA y Vip3Aa para controlar Spodoptera frugiperda. La Publicacion de la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2008/0311096 se refiere en parte a Cry1Ab para controlar el ECB resistente a Cry1 F.

Es decir, algunas de las cualidades de las plantas transgenicas resistentes a los insectos que han llevado a una rapida y generalizada adopcion de esta tecnologfa tambien dan lugar a la preocupacion de que las poblaciones de plagas desarrollaran resistencia a las protemas insecticidas producidas por estas plantas. Se han sugerido varias estrategias para preservar la utilidad de rasgos de resistencia a los insectos basados en Bt que incluyen el despliegue de protemas a una dosis alta en combinacion con un refugio, y la alternancia, o el co-despliegue, con diferentes toxinas (McGaughey et al. (1998), "B.t. Resistance Management", Nature Biotechnol. 16:144 - 146).

Las protemas seleccionadas para su uso en una pila de manejo resistente a insectos (IRM) necesitan ejercer su efecto insecticida independientemente de modo que la resistencia desarrollada a una protema no confiera resistencia a la segunda protema (es decir, no hay resistencia cruzada a las protemas). Si, por ejemplo, una poblacion de plagas que es resistente a la "Protema A" es sensible a la "Protema B", se concluina que no existe resistencia cruzada y que una combinacion de Protema A y Protema B sena efectiva para retrasar la resistencia a la Protema A sola.

En ausencia de poblaciones de insectos resistentes, las evaluaciones pueden hacerse basandose en otras caractensticas que se supone estan relacionadas con el mecanismo de accion y el potencial de resistencia cruzada. La utilidad de la union mediada por receptores en la identificacion de protemas insecticidas que probablemente no presentan resistencia cruzada ha sido sugerida (van Mellaert et al., 1999). El principal predictor de la falta de resistencia cruzada inherente en este enfoque es que las protemas insecticidas no compiten por los receptores en una especie de insecto sensible.

En el caso de que dos toxinas Bt compitan por el mismo receptor, entonces si ese receptor muta en ese insecto de modo que una de las toxinas ya no se une a ese receptor y, por lo tanto, ya no es un insecticida contra el insecto, podna ser el caso de que el insecto tambien fuera resistente a la segunda toxina (que se une competitivamente al mismo receptor). Es decir, se dice que el insecto es resistente a ambas toxinas Bt. Sin embargo, si dos toxinas se unen a dos receptores diferentes, esto podna ser una indicacion de que el insecto no sena simultaneamente resistente a esas dos toxinas.

Por ejemplo, la protema Cry1Fa es util en el control de muchas especies de plagas de lepidopteros, incluyendo la barrenadora europea del mafz (ECB, Ostrinia nubilalis (Hubner)) y el gusano de la cana (FAW, Spodoptera frugiperda), y es activa contra la barrena de la cana de azucar (SCB, Diatraea saccharalis). La protema Cry1Fa, tal como se produce en plantas de mafz transgenicas que contienen el evento TC1507, es responsable de un rasgo de resistencia a los insectos lfder en la industria para el control de FAW. Cry1Fa se despliega adicionalmente en los productos Herculex®, SmartStax™, y WideStrike™.

Otras toxinas Cry se enumeran en el sitio web del comite de nomenclatura oficial de B.t. (Crickmore et al., lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Actualmente hay cerca de 60 grupos principales de toxinas "Cry" (Cry1-Cry59), con toxinas Cyt adicionales y toxinas VIP y similares. Muchos de cada grupo numerico tienen subgrupos de letras mayusculas, y los subgrupos de letras mayusculas tienen sub-subgrupos de letras minusculas. (Cry1 tiene A-L, y C rylA tiene a-i, por ejemplo).

Breve compendio de la invencion

La presente invencion se refiere al descubrimiento sorprendente de que CryIDa y CryICa no compiten por los sitios de union en las preparacione de membranas celulares del intestino del cogollero del mafz (Spodoptera frugiperda; FAW). Como reconocera un experto en la tecnica con el beneficio de esta descripcion, las plantas que producen ambas de estas protemas (que incluyen porciones insecticidas de las protemas de longitud completa) pueden retrasar o prevenir el desarrollo de la resistencia a cualquiera de estas protemas insecticidas a solas.

De este modo, la presente invencion se refiere en parte al uso de una protema CryIDa en combinacion con una protema CryICa. Las plantas que producen ambas de estas protemas se incluyen dentro del alcance de la presente invencion.

La presente invencion se refiere tambien en parte a pilas triples o "piramides" de tres (o mas) toxinas, siendo CryIDa y CryICa el par base. En algunas realizaciónes piramidales preferidas, la combinacion de las toxinas seleccionadas proporciona una accion no resistente a la resistencia contra FAW. Agunas combinaciones piramidales preferidas de “tres sitios de accion” incluyen el par de protemas base objeto mas CrylFa, Vip3Ab, CrylBe, o CrylE como la tercera protema para reconocer FAW. Estas pilas triples particulares, de acuerdo con la presente invencion, proporcionan de manera ventajosa y sorprendente tres sitios de accion contra FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar la necesidad de areas de refugio.

Tambien se pueden anadir toxinas/genes adicionales de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, si CrylFa o CrylBe se apilan con el par de protemas objeto (tanto CrylFa como CrylBe son ambas activas contra fAw y barrenadora europea del mafz (ECB)),la adicion de dos protemas adicionales a esta triple pila, en la que las dos protemas anadidas reconocen ECB, proporcionana tres sitios de accion contra FAW, y tres sitios de accion contra ECB. Estas dos protemas anadidas (la cuarta y quinta protemas) se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en Cry2A, Cryll, DIG-3 y CrylAb. Esto dana lugar a una pila de cinco protemas con tres sitios de accion contra dos insectos (e Cb y FAW).

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere al descubrimiento sorprendente de que CryIDa y CryICa no compiten por unirse entre sf en el intestino de los cogolleros del mafz (FAW; Spodoptera frugiperda). De este modo, una protema CryIDa se puede usar en combinacion con una protema CryICa en mafz transgenico (y otras plantas, por ejemplo, algodon y soja, por ejemplo) para retrasar o evitar que FAW desarrolle resistencia a cualquiera de estas protemas solas. El par de protemas objeto puede ser eficaz para proteger plantas (tales como plantas de mafz y/o plantas de soja) contra el dano causado por el cogollero del mafz resistente a Cry. Es decir, un uso de la presente invencion es proteger el mafz y otras especies vegetales economicamente importantes de los danos y la perdida de rendimiento causados por las poblaciones de cogolleros del mafz que podnan desarrollar resistencia a las protemas CryIDa o CryICa.

Por lo tanto, la presente invencion muestra una pila de gestion resistente a los insectos (IRM) que comprende CryIDa y CryICa para prevenir o mitigar el desarrollo de la resistencia por FAW a cualquiera o ambas de estas protemas.

Se describen tambien composiciones para controlar plagas de lepidopteros que comprenden celulas que producen una protema insecticida CryIDa y una protema insecticida CryICa.

La invencion comprende ademas un huesped transformado que produce tanto una protema insecticida CryIDa como una protema insecticida CryICa, en donde dicho huesped es una celula de planta. El o los polinucleotidos objeto estan preferiblemente en una construccion genetica bajo control de un promotor o promotores no de Bacillus thuringiensis. Los polinucleotidos objeto pueden comprender el uso de codones para una expresion mejorada en una planta.

Se pretende ademas que la invencion proporcione un metodo de control de un insecto cogollero del mafz que comprende poner en contacto dicho insecto con una cantidad eficaz de una composicion que contiene una protema que contenga la toxina nuclear Cry1 Da y ademas contiene una protema que contenga la toxina nuclear Cry1 Ca.

Una realización de la invencion comprende una planta de mafz que comprende un gen expresable en una planta que codifica una protema insecticida CryICa y un gen expresable en una planta que codifica una protema insecticida CryIDa, y una semilla de dicha planta.

Una realización adicional de la invencion comprende una planta de mafz en la que un gen expresable en plantas que codifica una protema insecticida CryICa y un gen expresable en una planta que codifica una protema insecticida CryIDa se han introgresado en dicha planta de mafz y semilla de dicha planta.

Como se describe en los Ejemplos, los estudios de union a receptores competitivos usando la protema CryIDa radiomarcada muestran que la protema Cry1Ca no compite por la union en tejidos FAW a los que Cry1Da se une. Estos resultados tambien indican que la combinacion de protemas Cry1 Da y CryICa puede ser un medio eficaz para mitigar el desarrollo de resistencia en poblaciones FAW a cualquiera de estas protemas. De este modo, basandose en parte en los datos descritos en este documento, se cree que la coproduccion (apilamiento) de las protemas CryICa y CryIDa puede usarse para producir una pila IRM de dosis alta para FAW.

Se pueden anadir otras protemas a este par. Por ejemplo, la presente invencion se refiere tambien en parte a pilas triples o "piramides" de tres (o mas) toxinas, siendo CryIDa y CryICa el par base. En algunas realizaciónes piramidales preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres sitios de accion separados contra FAW. Algunas combinaciones piramidales preferidas de “tres sitios de accion” incluyen el par base de protemas objeto mas mas CrylFa, Vip3Ab, CrylBe, o CrylE como la tercera protema para reconocer FAW. Por "sitios de accion separados", se quiere significar que cualquiera de las protemas dadas no causa resistencia cruzada entre sf. Estas pilas triples particulares, de acuerdo con la presente invencion, proporcionan de manera ventajosa y sorprendente tres sitios de accion contra FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar la necesidad de areas de refugio.

Tambien se pueden anadir toxinas/genes adicionales de acuerdo con la presente invencion. Por ejemplo, si CrylFa o CrylBe se apilan con el par de protemas objeto (tanto CrylFa y CrylBe son ambas activas contra FAW y barrenadora europea del mafz (ECB)), la adicion de dos protemas adicionales a esta triple pila en la que las dos protemas anadidas se dirigen a ECB proporcionana tres sitios de accion contra FAW, y tres sitios de accion contra ECB. Estas dos protemas anadidas (la cuarta y quinta protemas) se pueden seleccionar del grupo que consiste en Cry2A, Cry1I, DIG-3 (vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de Serie 61/284.278 (presentada el 16 de diciembre de 2009) y el documento US 2010 00269223), y CrylAb. Esto dana lugar a una pila de cinco protemas con tres sitios de accion contra dos insectos (ECB y FAW).

Por lo tanto, una opcion de despliegue es utilizar el par de protemas objeto en combinacion con una tercera toxina/gen, y usar estas pilas triples para mitigar el desarrollo de la resistencia en FAW a cualquiera de estas toxinas. Por consiguiente, la presente invencion tambien se refiere en parte a pilas triples o "piramides" de tres (o mas) toxinas. En algunas realizaciónes piramidales preferidas, las toxinas seleccionadas tienen tres sitios de accion separados contra FAW.

Entre las opciones de despliegue de la presente invencion se incluiran dos, tres, o mas protemas de las protemas objeto en regiones cultivadas donde FAW puede desarrollar poblaciones resistentes.

Para uso de CrylFa mas CrylC, vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de serie 61/284,281 (presentada el 16 de diciembre de 2009), que muestra que Cry1C es activo contra FAW resistente a Cry1F. Para uso de Cry1Fa mas Cry1D, vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° de serie 61/284,252 (presentada el 16 de diciembre de 2009), que muestra que Cry1D es activo contra FAW resistente a Cry1F. Estas dos solicitudes tambien muestran que Cry1C no compite con Cry1F por la union en preparaciones de membrana FAW, y que Cry1D no compite con Cry1F por la union en preparaciones de membrana FAW. Al ser Cry1Fa activo contra FAW y ECB, Cry1Da mas Cry1Ca mas Cry1Fa, de acuerdo con la presente invencion, proporcionaran, de manera ventajosa y sorprendente, tres sitios de accion contra FAW. Esto puede ayudar a reducir o eliminar la necesidad de areas de refugio.

Cry1Fa se despliega en los productos Herculex®, SmartStax™ y WidesStrike™. El par de genes objeto (Cry1Da y Cry1Ca) podnan combinarse en, por ejemplo, un producto Cry1Fa tal como Herculex®, SmartStax™ y WideStrike™. Por consiguiente, el par de protemas objeto podnan ser significativas para reducir la presion de seleccion sobre estas y otras protemas. El par de protemas objeto podna usarse como en las tres combinasciones de genes para el mafz y otras plantas (algodon y soja, por ejemplo).

Como se discutio anteriormente, tambien se pueden anadir toxinas/genes adicionales de acuerdo con la presente invencion. Para el uso de Cry1E (para controlar FAW), vease la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el N° de Serie 61/284.278 (presentada el 16 de diciembre de 2009). Para uso de Cry1Ab (para controlar el BCE), vease la Publicacion de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2008/0311096.

Las plantas que producen cualquiera de las combinaciones de protemas en cuestion se incluyen dentro del alcance de la presente invencion. Pueden anadirse tambien toxinas/genes adicionales, pero las pilas particulares expuestas anteriormente, de forma ventajosa y sorprendente, proporcionan multiples sitios de accion contra FAW y/o ECB. Esto puede ayudar a reducir o eliminar la necesidad de areas de refugio.

Tambien puede usarse el GENBANK para obtener las secuencias para cualquiera de los genes y protemas descritos o mencionados en la presente memoria. Vease el Apendice A, a continuacion. Las secuencias relevantes tambien estan disponibles en patentes. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.188.960 y la Patente de Estados Unidos N° 5.827.514 describen protemas que contienen toxina nuclear Cry1Fa adecuadas para su uso en la realización de la presente invencion. La patente de Estados Unidos N° 6.218.188 describe secuencias de ADN optimizadas para plantas que codifican protemas que contienen la toxina nuclear Cry1Fa que son adecuadas para su uso en la presente invencion.

Las combinaciones de protemas descritas en este documento se pueden usar para controlar plagas de lepidopteros. Los lepidopteros adultos, por ejemplo, las mariposas y polillas, se alimentan principalmente del nectar de las flores y son un importante efector de polinizacion. Casi todas las larvas de lepidopteros, es decir, las orugas, se alimentan de plantas y muchas son plagas graves. Las orugas se alimentan del follaje o dentro de este o en las rames o el tallo de las plantas, privando a la planta de nutrientes y a menudo destruyendo la estructura ffsica de la planta. Ademas, las orugas se alimentan de frutas, tejidos y granos y harinas almacenadas, arruinando estos productos para la venta o reduciendo gravemente su valor. Tal como se utiliza en la presente memoria, la referencia a las plagas de lepidopteros se refiere a varias etapas de la vida de la plaga, incluyendo las etapas larvarias.

Algunas toxinas quimericas de la presente invencion comprenden una porcion completa de toxina nuclear N-terminal de una toxina Bt y, en algun punto mas alla del extremo de la porcion de toxina nuclear, la protema tiene una transicion a una secuencia heterologa de protoxina. La porcion de toxina N-terminal, activa de forma insecticida, de una toxina Bt se denomina toxina "nucleo". La transicion desde el segmento de toxina nuclear al segmento de protoxina heterologa puede producirse aproximadamente en la union toxina/protoxina o, en alternativa, puede conservarse una porcion de la protoxina nativa (que se extiende mas alla de la porcion de toxina nuclear), ocurriendo la transicion a la protoxina heterologa posteriormente.

Como ejemplo, una toxina quimerica de la presente invencion, es una porcion de toxina de nucleo completo de CryIDa (aproximadamente los primeros 600 aminoacidos) y/o una protoxina heterologa (los aminoacidos restantes en el extremo C). En una realización preferida, la porcion de una toxina quimerica que comprende la protoxina se deriva de una toxina proteica CrylAb. En una realización preferida, la porcion de una toxina quimerica que comprende la protoxina se deriva de una toxina de la protema CrylAb.

Cualquier persona experta en esta tecnica apreciara que las toxinas Bt, incluso dentro de una cierta clase tal como CrylCa, variaran en cierta medida en longitud y en la ubicacion precisa de la transicion desde la porcion de la toxina del nucleo a la porcion de la protoxina. Tfpicamente, las toxinas CrylCa tienen una longitud de aproximadamente 1150 a aproximadamente 1200 aminoacidos. La transicion de la parte de la toxina del nucleo a la porcion de protoxina tfpicamente ocurrira entre aproximadamente el 50% y aproximadamente el 60% de la toxina de longitud completa. La toxina quimerica de la presente invencion incluira la extension completa de esta porcion de toxina nuclear N-terminal. De este modo, la toxina quimerica comprendera al menos aproximadamente el 50% de toda la longitud de la protema de la toxina de Cry1 Bt. Esto sera tfpicamente al menos aproximadamente 590 aminoacidos. Con respecto a la porcion de protoxina, la extension total de la porcion de protoxina de CrylAb se extiende desde el extremo de la porcion de toxina de nucleo hasta el extremo C de la molecula.

Genes y toxinas. Los genes y las toxinas utiles de acuerdo con la presente invencion incluyen no solo las secuencias de longitud completa descritas, sino tambien los fragmentos de estas secuencias, variantes, mutantes y protemas de fusion que retienen la actividad pesticida caractenstica de las toxinas espedficamente ejemplificadas en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, los terminos "variantes" o "variaciones" de genes se refieren a secuencias de nucleotidos que codifican las mismas toxinas o que codifican toxinas equivalentes que tienen actividad pesticida. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "toxinas equivalentes" se refiere a toxinas que tienen la misma actividad biologica o esencialmente la misma contra las plagas diana como las toxinas reivindicadas.

Tal como se usa en el presente documento, los lfmites representan aproximadamente el 95% (CryIDa y CrylCa), 78% (Cry1 D y Cry1 C), y 45% (Cry1) de identidad de secuencia, por "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum y D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol. 62: 807 - 813. Estos cortes tambien se pueden aplicar a las toxinas del nucleo solamente.

Debe ser evidente para cualquier persona experta en esta tecnica que los genes que codifican las toxinas activas pueden ser identificados y obtenidos a traves de varios medios. Los genes o porciones de genes espedficos ejemplificados en este documento pueden obtenerse a partir de los aislamientos depositados en un deposito de cultivo. Estos genes, o porciones o variantes de los mismos, tambien pueden construirse sinteticamente, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de genes. Las variaciones de genes pueden construirse facilmente utilizando tecnicas estandar para realizar mutaciones puntuales. Ademas, pueden hacerse fragmentos de estos genes utilizando exonucleasas o endonucleasas comercialmente disponibles segun procedimientos estandar. Por ejemplo, pueden usarse enzimas tales como Bal31 o mutagenesis dirigida al sitio para cortar sistematicamente los nucleotidos de los extremos de estos genes. Los genes que codifican fragmentos activos tambien se pueden obtener usando una variedad de enzimas de restriccion. Las proteasas pueden usarse para obtener directamente fragmentos activos de estas toxinas proteicas.

Los fragmentos y equivalentes que retienen la actividad plaguicida de las toxinas ejemplificadas estanan dentro del alcance de la presente invencion. Ademas, debido a la redundancia del codigo genetico, una variedad de diferentes secuencias de ADN pueden codificar las secuencias de aminoacidos descritas en la presente memoria. Esta dentro de la habilidad de cualquier persona entrenada en la tecnica crear estas secuencias de ADN alternativas que codifican las mismas, o esencialmente las mismas, toxinas. Estas secuencias de ADN variantes estan dentro del alcance de la presente invencion. Como se usa en este documento, la referencia a la secuencia “esencialmente igual” se refiere a secuencias que tienen sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoacidos que no afectan materialmente a la actividad pesticida. Tambien se incluyen en esta definicion fragmentos de genes que codifican protemas que retienen actividad pesticida.

Un metodo adicional para identificar los genes que codifican las toxinas y partes de genes utiles de acuerdo con la presente invencion es mediante el uso de sondas de oligonucleotidos. Estas sondas son secuencias de nucleotidos detectables. Estas secuencias pueden ser detectables en virtud de un marcador apropiado o pueden hacerse inherentemente fluorescentes como se describe en la Solicitud Internacional No. WO93/16094. Como es bien conocido en la tecnica, si la molecula sonda y la muestra de acido nucleico se hibridan formando una fuerte union entre las dos moleculas, puede suponerse razonablemente que la sonda y la muestra tienen homologfa sustancial. Preferiblemente, la hibridacion se lleva a cabo bajo condiciones rigurosas mediante tecnicas bien conocidas en la tecnica, como se describe, por ejemplo, en Keller, G. H, M. M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Algunos ejemplos de concentraciones de sales y combinaciones de temperaturas son los siguientes (en orden creciente de rigurosidad): 2X SSPE o SSC a temperatura ambiente; 1X SSPE o SSC a 42°C; 0,1X SSPE o SSC a 42°C; 0,1X SSPE o Ss C a 65°C. La deteccion de la sonda proporciona un medio para determinar de una manera conocida si ha ocurrido la hibridacion. Tal analisis de sonda proporciona un metodo rapido para identificar genes que codifican la toxina de la presente invencion. Los segmentos de nucleotidos que se utilizan como sondas de acuerdo con la invencion se pueden sintetizar usando un sintetizador de ADN y procedimientos estandar. Estas secuencias de nucleotidos tambien se pueden usar como cebadores de PCR para amplificar los genes de la presente invencion.

Toxinas variantes. Ciertas toxinas de la presente invencion se han ejemplificado espedficamente en la presente memoria. Dado que estas toxinas son simplemente ejemplos de las toxinas de la presente invencion, debena ser facilmente evidente que la presente invencion comprende toxinas variantes o equivalentes (y secuencias de nucleotidos que codifican toxinas equivalentes) que tienen la misma actividad pesticida o similar de la toxina ejemplificada. Las toxinas equivalentes tendran una homologfa de aminoacidos con una toxina ejemplificada. Esta homologfa de aminoacidos sera tfpicamente mayor que 75%, preferiblemente mayor que 90% y mas preferiblemente mayor que 95%.

La homologfa de aminoacidos sera la mayor en regiones cnticas de la toxina que representan la actividad biologica o estan implicadas en la determinacion de la configuracion tridimensional que en ultima instancia es la responsable de la actividad biologica. A este respecto, ciertas sustituciones de aminoacidos son aceptables y pueden esperarse si estas sustituciones estan en regiones que no son cnticas para la actividad o son sustituciones conservativas de aminoacidos que no afectan a la configuracion tridimensional de la molecula. Por ejemplo, los aminoacidos se pueden colocar en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, basicos y acidos. Las sustituciones conservadoras por las que un aminoacido de una clase se sustituye por otro aminoacido del mismo tipo caen dentro del alcance de la presente invencion siempre y cuando la sustitucion no altere materialmente la actividad biologica del compuesto. A continuacion se muestra una lista de ejemplos de aminoacidos pertenecientes a cada clase.

En algunos casos, tambien se pueden hacer sustituciones no conservadoras. El factor cntico es que estas sustituciones no deben perjudicar significativamente a la actividad biologica de la toxina.

Huespedes recombinantes. Los genes que codifican las toxinas de la presente invencion se pueden introducir en una amplia variedad de huespedes microbianos o vegetales. La expresion del gen de la toxina resulta, directa o indirectamente, en la produccion y mantenimiento intracelular del plaguicida. La transferencia conjugada y la transferencia recombinante se pueden usar para crear una cepa Bt que exprese a las toxinas de la presente invencion. Otros organismos huesped tambien pueden ser transformados con uno o ambos genes de la toxina usados entonces para lograr el efecto sinergico. Con huespedes microbianos adecuados, por ejemplo, Pseudomonas, los microbios se pueden aplicar al sitio de la plaga, donde proliferaran y se ingeriran. El resultado es el control de la plaga. Alternativamente, el microbio que aloja el gen de la toxina puede ser tratado bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina y estabilizan la celula. La celula tratada, que retiene la actividad toxica, puede aplicarse entonces al medio ambiente de la plaga diana.

Cuando el gen de la toxina Bt se introduce a traves de un vector adecuado en un huesped microbiano, y dicho huesped se aplica al medio ambiente en un estado vivo, es esencial que se utilicen ciertos microbios huespedes. Se seleccionan huespedes de microorganismos que se sabe que ocupan la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera y/o rizoplano) de uno o mas cultivos de interes. Estos microorganismos se seleccionan de manera que sean capaces de competir exitosamente en el entorno particular (cultivo y otros habitats de insecto) con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionar un mantenimiento estable y la expresion del gen que expresa el plaguicida polipepffdico, y, deseablemente, proporcionar una mejor proteccion del plaguicida frente a la degradacion e inactivacion del medio ambiente.

Se sabe que un gran numero de microorganismos habitan el filoplano (la superficie de las hojas de la planta) y/o la rizosfera (el suelo que rodea las rafces de las plantas) de una amplia variedad de cultivos importantes. Estos microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De particular interes son microorganismos, tales como bacterias, por ejemplo, los generos Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc y Alcaligenes; hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, los generos Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula y Aureobasidium. Son de particular interes las especies bacterianas de fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus y Azotobacter vinlandii; y especies de levaduras de fitosfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. De particular interes son los microorganismos pigmentados.

Esta disponible una amplia variedad de metodos para introducir un gen Bt que codifica una toxina en un huesped de microorganismo en condiciones que permitan el mantenimiento estable y la expresion del gen. Estos metodos son bien conocidos por los expertos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.135.867.

Tratamiento de las celulas. Bacillus thuringiensis o celulas recombinantes que expresan las toxinas Bt pueden tratarse para prolongar la actividad de la toxina y estabilizar la celula. La microcapsula de pesticida que se forma comprende la toxina Bt o toxinas dentro de una estructura celular que se ha estabilizado y protegera la toxina cuando la microcapsula se aplica al entorno de la plaga diana. Las celulas huesped adecuadas pueden incluir procariotas o eucariotas, estando normalmente limitadas a aquellas celulas que no producen sustancias toxicas para organismos superiores, tales como mairnferos. Sin embargo, podnan utilizarse organismos que producen sustancias toxicas para organismos superiores, donde las sustancias toxicas son inestables o el nivel de aplicacion es suficientemente bajo como para evitar cualquier posibilidad de toxicidad para un huesped m ai^ero . Como anfitriones, de particular interes seran los procariotas y los eucariotas inferiores, tales como los hongos.

La celula normalmente estara intacta y estara sustancialmente en la forma proliferativa cuando se trata, en lugar de en forma de esporas, aunque en algunos casos pueden emplearse esporas.

El tratamiento de la celula microbiana, por ejemplo, un microbio que contiene el gen de la toxina B.t. pueden ser por medios qmmicos o ffsicos, o por una combinacion de medios qmmicos y/o ffsicos, siempre y cuando la tecnica no afecte negativamente a las propiedades de la toxina, ni disminuya la capacidad celular de proteger la toxina. Ejemplos de reactivos qmmicos son agentes halogenantes, particularmente halogenos del numero atomico 17-80. Mas particularmente, se puede usar yodo en condiciones suaves y durante un tiempo suficiente para conseguir los resultados deseados. Otras tecnicas adecuadas incluyen el tratamiento con aldetffdos, tales como glutaraldetffdo; anti-infecciosos, tales como cloruro de zefirano y cloruro de cetilpiridinio; alcoholes, tales como isopropilo y etanol; varios fijadores histologicos, tales como lugol yodo, fijador de Bouin, diversos acidos y fijador de Helly (vease: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman and Company, 1967); o una combinacion de agentes ffsicos (calor) y qmmicos que preservan y prolongan la actividad de la toxina producida en la celula cuando la celula se administra al medio huesped. Los ejemplos de medios ffsicos son radiacion de longitud de onda corta, tal como la radiacion gamma y radiacion X, congelacion, irradiacion UV, liofilizacion y similares. Los metodos para el tratamiento de celulas microbianas se describen en las Patentes de Estados Unidos. Numeros 4.695.455 y 4.695.462.

Las celulas generalmente tendran una estabilidad estructural mejorada que aumentara la resistencia a las condiciones ambientales. Cuando el plaguicida esta en una proforma, el metodo de tratamiento celular debe seleccionarse de manera que no inhiba el procesamiento de la proforma a la forma madura del plaguicida por el patogeno de plaga diana. Por ejemplo, el formaldetffdo reticulara las protemas y podna inhibir el procesamiento de la proforma de un plaguicida polipepffdico. El metodo de tratamiento debe retener al menos una porcion sustancial de la biodisponibilidad o bioactividad de la toxina.

Las caractensticas de particular interes en la seleccion de una celula huesped con fines de produccion incluyen la facilidad de introduccion del gen o genes B.t. en el huesped, la disponibilidad de sistemas de expresion, la eficiencia de expresion, la estabilidad del plaguicida en el huesped y la presencia de capacidades geneticas auxiliares. Las caractensticas de interes para su uso como microcapsula de pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentacion y empaquetado intracelular o formacion de cuerpos de inclusion; supervivencia en ambientes acuosos; falta de toxicidad de los mamfferos; atractivo para las plagas por ingestion; facilidad de matar y fijar sin danar la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen la facilidad de formulacion y manipulacion, econoirna, estabilidad al almacenamiento, y similares.

Crecimiento de celulas. El huesped celular que contiene el gen o genes B.t. insecticidas se puede cultivar en cualquier medio nutriente conveniente, donde la construccion de ADN proporciona una ventaja selectiva, proporcionando un medio selectivo de manera que sustancialmente todas, o todas, las celulas retengan al gen B.t. Estas celulas pueden ser luego cosechadas de acuerdo con los procedimientos convencionales. Alternativamente, las celulas pueden ser tratadas antes de la cosecha.

Las celulas B.t. que producen las toxinas de la invencion se pueden cultivar usando tecnicas de fermentacion y medios de la tecnica estandar. Una vez completado el ciclo de fermentacion, las bacterias se pueden cosechar separando primero las esporas B.t. y los cristales del caldo de fermentacion por medios bien conocidos en la tecnica. Las esporas y cristales B.t. recuperadas se pueden formular en un polvo humectable, concentrado lfquido, granulos u otras formulaciones mediante la adicion de tensioactivos, dispersantes, vehmulos inertes y otros componentes para facilitar el manejo y la aplicacion de plagas particulares. Estas formulaciones y procedimientos de aplicacion son bien conocidos en la tecnica.

Formulaciones. Granulos de cebo formulados que contienen un atrayente y esporas, cristales y toxinas de los aislamientos B.t. o microbios recombinantes que comprenden los genes obtenibles a partir de los aislados B.t. descritos en este documento, se pueden aplicar al suelo. El producto formulado tambien se puede aplicar como tratamiento de recubrimiento de semillas o de rafz o como tratamiento total de la planta en etapas posteriores del ciclo del cultivo. Los tratamientos de plantas y suelos de celulas B.t. se pueden emplear como polvos humectables, granulos o polvos, mezclando con diversos materiales inertes, tales como minerales inorganicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botanicos (mazorcas de mafz en polvo, cascaras de arroz, cascaras de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes de adhesivo separador, agentes estabilizantes, otros aditivos pesticidas o tensioactivos. Las formulaciones lfquidas pueden ser acuosas o no acuosas y emplearse como espumas, geles, suspensiones, concentrados emulsionables o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reologicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o polfmeros.

Como apreciana cualquier experto en la materia, la concentracion de pesticida variara ampliamente dependiendo de la naturaleza de la formulacion particular, particularmente si es un concentrado o se usa directamente. El plaguicida estara presente en al menos 1% en peso y puede ser 100% en peso. Las formulaciones secas tendran de aproximadamente 1-95% en peso del plaguicida mientras que las formulaciones lfquidas seran generalmente de aproximadamente 1-60% en peso de los solidos en la fase lfquida. Las formulaciones tendran generalmente de aproximadamente 102 a aproximadamente 104 celulas/mg. Estas formulaciones se administraran a aproximadamente 50 mg (lfquido o seco) a 1 kg o mas por hectarea.

Las formulaciones se pueden aplicar al medio ambiente de la plaga de lepidopteros, por ejemplo, follaje o suelo, por vaporizacion, pulverizacion, aspersion o similares.

Transformacion de plantas. Un huesped recombinante preferido para la produccion de las protemas insecticidas de la presente invencion es una planta transformada. Los genes que codifican protemas de toxina Bt, como se describe en este documento, se pueden insertar en celulas vegetales usando una variedad de tecnicas que son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, un gran numero de vectores de clonacion que comprenden un sistema de replicacion en Escherichia coli y un marcador que permite la seleccion de las celulas transformadas estan disponibles para la preparacion para la insercion de genes extranos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, serie pUC, serie M13mp, pACYC184, entre otros. Por consiguiente, el fragmento de ADN que tiene la secuencia que codifica la protema de la toxina Bt puede insertarse en el vector en un sitio de restriccion adecuado. El plasmido resultante se utiliza para la transformacion en E. coli. Las celulas de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado, despues se recogen y se lisan. Se recupera el plasmido. El analisis de secuencias, el analisis de restriccion, la electroforesis y otros metodos bioqmmicos y biologicos moleculares se llevan a cabo generalmente como metodos de analisis. Despues de cada manipulacion, la secuencia de ADN utilizada puede escindirse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plasmido puede clonarse en el mismo plasmido o en otros plasmidos. Dependiendo del metodo de insercion de genes deseados en la planta, pueden ser necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa el plasmido Ti o Ri para la transformacion de la celula vegetal, entonces se debe unir como mmimo el borde derecho, pero a menudo el borde derecho e izquierdo del T-ADN del plasmido Ti o Ri, como la region flanqueante de los genes a insertar. El uso de T-ADN para la transformacion de celulas de planta ha sido intensamente investigado y suficientemente descrito en el documento EP 120 516, Lee y Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986) y An et al., (1985), y esta bien establecido en la tecnica.

Una vez que el ADN insertado ha sido integrado en el genoma de la planta, este es relativamente estable. El vector de transformacion contiene normalmente un marcador seleccionable que confiere la resistencia en las celulas vegetales transformadas a un biocida o un antibiotico, tal como Bialaphos, Kanamicina, G418, Bleomicina, o Higromicina, entre otros. Por lo tanto, el marcador empleado individualmente debena permitir la seleccion de celulas transformadas en lugar de celulas que no contienen el ADN insertado.

Se dispone de un gran numero de tecnicas para insertar ADN en una celula huesped vegetal. Esas tecnicas incluyen la transformacion con T-DNA usando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformacion, fusion, inyeccion, bioKstica (bombardeo de micropartmulas), o electroporacion, as ^ como otros metodos posibles. Si se utilizan agrobacterias para la transformacion, el ADN a insertar tiene que ser clonado en plasmidos especiales, a saber, ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios se pueden integrar en el plasmido Ti o Ri por recombinacion de homologos debido a secuencias que son homologas a las secuencias en el T-DNA. El plasmido Ti o Ri tambien comprende la region vir necesaria para la transferencia del T-DNA.

Los vectores intermedios no pueden replicarse en Agrobacteria. El vector intermedio puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plasmido auxiliar (conjugacion). Los vectores binarios pueden replicarse ellos mismos tanto en E. coli como en Agrobacteria. Comprenden un gen marcador de seleccion y un enlazador o polienlazador que estan enmarcados por las regiones frontera derecha e izquierda del ADN-T. Pueden transformarse directamente en Agrobacteria (Holsters et al., 1978). El Agrobacterium usado como celula huesped comprende un plasmido que lleva una region vir. La region vir es necesaria para la transferencia del T-DNA a la celula de planta. Puede contener T-DNA adicional. La bacteria asf transformada se utiliza para la transformacion de celulas de planta. Los explantes de plantas se pueden cultivar ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes para la transferencia del ADN a la celula de planta. Las plantas enteras pueden entonces regenerarse a partir del material vegetal infectado (por ejemplo, trozos de hoja, segmentos de tallo, rames, pero tambien protoplastos o celulas cultivadas en suspension) en un medio adecuado, que puede contener antibioticos o biocidas para la seleccion. Las plantas asf obtenidas pueden entonces ser ensayadas en cuanto a la presencia del ADN insertado. No se hacen demandas especiales de los plasmidos en el caso de la inyeccion y la electroporacion. Es posible utilizar plasmidos ordinarios, tales como, por ejemplo, derivados de pUC.

Las celulas transformadas crecen dentro de las plantas de la manera usual. Pueden formar celulas germinales y transmitir el(los) rasgo(s) transformado(s) a las plantas progenie. Tales plantas pueden crecer de la manera normal y cruzarse con plantas que tienen los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos hforidos resultantes tienen las propiedades fenotfpicas correspondientes.

En una realización preferida de la presente invencion, las plantas se transformaran con genes en los que se ha optimizado el uso de codones para plantas. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.380.831. Aunque algunas toxinas truncadas se ejemplifican en la presente memoria, es bien conocido en la tecnica de Bt que las toxinas de tipo 130 kDa (de longitud completa) tienen una mitad N-terminal que es la toxina nuclear y una mitad C-terminal que es la protoxina "cola. De este modo, se pueden usar "colas" apropiadas con toxinas truncadas/nucleares de la presente invencion. Vease p. ej. la Patente de Estados Unidos N° 6.218.188 y la Patente de Estados Unidos N° 6.673.990. Ademas, se conocen en la tecnica metodos para crear genes Bt sinteticos para uso en plantas (Stewart y Burgin, 2007). Un ejemplo no limitativo de una planta transformada preferida es una planta fertil de mafz que comprende un gen expresable en una planta que codifica una protema Cry1Da, y que ademas comprende un segundo gen expresable en una planta que codifica una protema Cry1Ca.

La transferencia (o introgresion) del rasgo o de los rasgos determinados por Cry1Da y Cry1Ca en lmeas de mafz consangumeas puede lograrse mediante la reproduccion recurrente por seleccion, por ejemplo mediante retrocruzamiento. En este caso, un progenitor recurrente deseado se cruza primero con un donante endogamico (el progenitor no recurrente) que lleva el gen(es) apropiado(s) para los rasgos determinados por Cry1D- y Cry1C-. La progenie de este cruce se vuelve a acoplar entonces al progenitor recurrente seguido por la seleccion en la progenie resultante para el/los rasgo(s) deseado(s) a ser transferidos del progenitor no recurrente. Despues de tres, preferiblemente cuatro, mas preferiblemente cinco o mas generaciones de retrocruzamientos con el progenitor recurrente con seleccion para el/los rasgo(s) deseado(s), la progenie sera heterocigotica para los loci que controlan el/los rasgo/s que se transfieren, pero sera como el progenitor recurrente para la mayona o casi todos los otros genes (vease, por ejemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360 - 376).

Estrategias de Manejo de la Resistencia de Insectos (IRM). Roush et al., por ejemplo, describen las estrategias de dos toxinas, tambien llamadas "piramides" o "pilas", para el manejo de cultivos transgenicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777 - 1786).

En su sitio web, la Agencia de Proteccion Ambiental de los Estados Unidos (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) publica los siguientes requisitos para proporcionar refugios no transgenicos (es decir, no B.t.) (una seccion de cultivos no Bt / mafz) para uso con cultivos transgenicos que producen una unica protema Bt activa contra plagas diana."Los requisitos estructurados espedficos para los productos de mafz Bt (Cry1Ab o Cry1 F) protegidos por el barrenador del mafz son los siguientes:

Refugios estructurados: 20% de refugio de mafz Bt no Lepidoptero en el Cinturon de Mafz;

50% de refugio Bt no Lepidoptero en Cinturon de Algodon

Bloques

Internos (es decir, dentro del campo Bt)

Externos (es dedr, campos separados dentro de 1/2 milla (1/4 de milla si es posible) del campo Bt para maximizar el acoplamiento al azar)

Franjas en el campo

Las franjas deben tener al menos 4 filas de ancho (preferiblemente 6 filas) para reducir los efectos del movimiento larvario"

Ademas, la Asociacion Nacional de Productores de Mafz, en su sitio web: (ncga.com/insect-resistance-managementfact-sheet-bt-corn)

tambien proporciona una orientacion similar con respecto a los requisitos de refugio. Por ejemplo: "Requisitos del IRM del barrenador del mafz:

-Plantar al menos el 20% de sus acres de mafz para refugiar hforidos

-En las regiones productoras de algodon, el refugio debe ser del 50%

-Debe ser sembrado dentro de 1/2 milla de los hfbridos de refugio

-El refugio se puede plantar como franjas dentro del campo Bt; las franjas de refugio deben tener al menos 4 filas de ancho

-El refugio puede tratarse con plaguicidas convencionales solo si se alcanzan los umbrales economicos para los insectos objetivo

-Los insecticidas pulverizables basados en Bt no se pueden usar en el mafz de refugio

-Debe plantarse un refugio adecuado en todas las fincas con mafz Bt"

Como lo indican Roush et al. (por ejemplo, en las columnas de la derecha de las paginas 1780 y 1784), el apilamiento o piramide de dos protemas diferentes cada una eficaz contra las plagas diana y con poca o ninguna resistencia cruzada puede permitir el uso de un refugio mas pequeno. Roush sugiere que para una pila exitosa, un refugio de tamano menor del 10% de refugio, puede proporcionar un manejo de resistencia comparable a un 50% de refugio para un rasgo unico (no piramidal). Para los productos de mafz Bt piramidales actualmente disponibles, la Agencia de Proteccion Ambiental de los Estados Unidos requiere que se deposite significativamente menos refugio estructurado (generalmente 5%) de mafz no Bt que para productos de un solo rasgo (generalmente 20%).

Existen varias maneras de proporcionar los efectos IRM de un refugio, incluyendo varios patrones de siembra geometricos en los campos (como se menciono anteriormente) y mezclas de semillas dentro de bolsa, como se describe mas adelante por Roush et al. (supra) y la Patente de Estados Unidos N° 6.551.962.

Los porcentajes anteriores, o relaciones de refugio similares, se pueden usar para las pilas o piramides dobles o triples objeto. Para las pilas triples con tres sitios de accion contra una unica plaga objetivo, un objetivo sena cero refugio (o menos del 5% de refugio, por ejemplo). Esto es particularmente cierto para la superficie comercial - de mas de 10 acres por ejemplo.

A menos que se indique espedficamente o se implique, los terminos "un", "uno/a", y "el/ella" significan "al menos uno" tal como se utiliza en este documento.

Los siguientes son ejemplos que ilustran procedimientos para poner en practica la invencion.

Estos ejemplos no deben ser interpretados como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de la mezcla de disolventes son en volumen a menos que se indique lo contrario. Todas las temperaturas estan en grados Celsius.

Ejemplos

Ejemplo 1- 125I- Marcado de protemas Cry

Yodacion de toxinas Cry. Las toxinas Cry truncadas purificadas se yodaron usando perlas de yodo o yodo-gen (Pierce). En resumen, se lavaron dos perlas de yodo dos veces con 500 pL de solucion salina tamponada con fosfato, PBS (fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5) y se colocaron en un tubo de centrifugacion de 1,5 mL detras del blindaje de plomo. A esto, se anadieron 100 pL de PBS. En una campana y mediante el uso de las apropiadas tecnicas de manejo radioactivo, se anadieron 0,5 mCi de Na125I (17.4 Ci/mg, Lot 0114, Amersham) a la disolucion de PBS con las perlas de yodo. Se dejo reaccionar a los componentes durante 5 minutos a temperatura ambiente, despues se anadieron a la disolucion 2-25 pg de la protema Cry truncada altamente pura y se dejo reaccionar durante 3-5 minutos adicionales. La reaccion se termino retirando la disolucion de perlas de yodo y aplicandola a una columna de centrifugado desalinizadora Zeba (InVitrogen) equilibrada en PBS. Se lavo cada perla de yodo dos veces con 10 pL de PBS y la disolucion de lavado tambien se aplico a la columna desalinizadora. La disolucion radioactiva se eluyo a traves de la columna desalinizadora mediante centrifugacion a 1000 x g durante 2 min. En el caso de Cry1Da, se utilizo el metodo yodo-gen para llevar a cabo el procedimiento de radiomarcaje. Usando este procedimiento, se limpio primero la toxina Cry en tampon fosfato 100 mM (pH 8), de lipopolisacaridos (LPS) pasandola varias veces a traves de una pequena columna de poliximina de 0,5 mL. Se anadieron 20 pg de la toxina CryIDa libre de LPS al tubo de yodo-gen (Pierce Chem. Co.), despues 0,5 mCi de Na125I. La mezcla de reaccion se agito durante 15 min a 25°C. La disolucion se retiro del tubo y se anadieron 50 pL de Nal 0,2M no radiomarcado para terminar la reaccion. La protema se dializo frente a PBS con 3 cambios de tampon para retirar cualquier 125l no unido.

La radio-pureza de las protemas Cry yodadas se determino por SDS-PAGE, fosfoimagen y conteo gamma. En resumen, se separaron 2 pL de la protema radioactiva mediante SDS-PAGE. Despues de la separacion, los geles se secaron usando un aparato de secado de gel BioRad, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Se tomaron imagenes de los geles secosenvolviendolos en pelmula Mylar™ (12 pm de grosor) y exponiendolos bajo una pantalla de fosforo de almacenamiento de Molecular Dynamics (35 cm x 43 cm), durante 1 hora. Las placas se desarrollaron usando un generador de imagenes de fosforo Molecular Dynamics Storm 820 y las imagenes se analizaron usando el software ImageQuant™. La banda radioactiva junto con las areas inmediatamente por encima y por debajo de la banda se cortaron del gel usando una cuchilla de afeitar y se contaron en un contador gamma. La radioactividad solo se detecto en la banda de la protema Cry y en areas debajo de la banda. No se detecto radioactividad por encima de la banda, lo que indica que todos los contaminantes radioactivos consistfan en componentes proteicos mas pequenos que la protema Cry truncada. Estos componentes lo mas probablemente representen productos de degradacion.

Ejemplo 2- Protocolo de preparacion de BBMV

Preparacion y fraccionamiento de BBMV solubilizado. Finalmente, Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis o las larvas de Heleothis. Zea se mantuvieron en ayunas durante toda la noche y despues se diseccionaron por la manana despues de enfriarlas en hielo durante 15 minutos. El tejido del intestino medio se retiro de la cavidad del cuerpo, dejando atras el intestino posterior unido al tegumento. El intestino medio se coloco en un volumen 9X de tampon de homogeneizacion enfriado con hielo (manitol 300 mM, EGTA 5 mM, tris. base 17 mM, pH 7,5), complementado con un 1Coctel Inhibidor de Proteasa (Sigma P-2714) diluido segun lo recomendado por el proveedor. El tejido se homogeneizo con 15 golpes de un homogeneizador de tejido de vidrio. Los BBMv se prepararon mediante el metodo de precipitacion con MgCh de Wolfersberger (1993). En resumen, se mezclo un volumen igual de una disolucion de MgCl²24 mM en manitol 300 mM con el homogeneizado de intestino medio, se agito durante 5 minutos y se dejo reposar en hielo durante 15 minutos. La disolucion se centrifugo a 2.500 x g durante 15 min a 4°C. El sobrenadante se guardo y el sedimento se suspendio en el volumen original de tampon de homogeneizacion diluido 0,5-X y se centrifugo nuevamente. Los dos sobrenadantes se combinaron, se centrifugaron a 27.000 x g durante 30 min a 4°C para formar la fraccion de BBMV. El sedimento se suspendio en 10 mL de tampon de homogeneizacion y se complemento con inhibidores de proteasa y se centrifugo nuevamente a 27.000 x g durante 30 min a 4°C para lavar los BBMV. El sedimento resultante se suspendio en un Tampon de Almacenamiento de BBMV (HEPES 10 mM, KCl 130 mM, glicerol al 10%, pH 7,4) hasta una concentracion de aproximadamente 3 mg/mL de protema. La concentracion de protema se determino utilizando el metodo de Bradford (1976) con albumina de suero bovino (BSA) como estandar. La determinacion de la fosfatasa alcalina se realizo antes de congelar las muestras usando el ensayo Sigma siguiendo las instrucciones del fabricante. La actividad espedfica de esta enzima marcadora en la fraccion de BBMV tfpicamente aumento 7 veces en comparacion con la que se encuentra en la fraccion de homogeneizado del intestino medio. Los BBMV se alicuotaron en muestras de 250 pL, se congelaron instantaneamente en N² lfquido y se almacenaron a -80°C. 1La concentracion final de los componentes del coctel (en pM) es AEBSF (500), Ed TA (250 mM), Bestatina (32), E-64 (0,35), Leupeptina (0,25) y Aprotinina (0,075).

Ejemplo 3- Método para medir la union de protemas 125l Cry a protemas BBMV

Union de protemas 125I-Cry a protemas BBMV. Para determinar la cantidad optima de protema BBMV para usar en los ensayos de union, se genero una curva de saturacion. La protema Cry (0,5 nM) radiomarcada con 125l se incubo durante 1 hora a 28°C con diversas cantidades de protema BBMV, en el intervalo de 0-500 pg/mL en tampon de union (NaHPO⁴ 8 mM, KH²PO⁴2 mM, NaCl 150 mM, albumina de suero bovino al 0,1%, pH 7,4). El volumen total fue 0,5 mL. La protema Cry unida a 125l se separo de las no unidas tomando muestras de 150 pL de la mezcla de reaccion por triplicado, de un tubo de centrifugacion de 1,5 mL en un tubo de centrifugacion de 500 pL y centrifugando las muestras a 14.000 x g durante 6 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiro con cuidado y el sedimento se lavo con cuidado tres veces con tampon de union fno como el hielo. La parte inferior de la centnfuga que contema el sedimento se corto y se coloco en un tubo de cultivo de vidrio de 13 x 75 mm. Las muestras se contaron durante 5 minutos cada una en el contador gamma. Los recuentos contenidos en la muestra se restaron de los recuentos de fondo (reaccion sin ninguna protema) y se representaron graficamente frente a la concentracion de protema BBMV. Se determino que la cantidad optima de protema a utilizar es de 0,15 mg/mL de protema BBMV. Para determinar la cinetica de union, se genero una curva de saturacion. En resumen, los BBMV (150 pg/mL) se incubaron durante 1 hora a 28°C con concentraciones crecientes de toxina 125I-Cry, en el intervalo de 0,01 a 10 nM. La union total se determino muestreando 150 pL de cada concentracion por triplicado, centrifugando la muestra y contando como se describe anteriormente. La union inespedfica se determino de la misma manera, con la adicion de 1.000 nM de la toxina Cry no radioactiva tripsinizada homologa anadida a la mezcla de reaccion para saturar todos los receptores no espedficos de sitios de union. La union espedfica se calculo como la diferencia entre la union total y la union no espedfica.

Los ensayos de union competitiva homologa y heterologa se realizaron usando 150 pg/mL de protema BBMV y 0,5 nM de protema Cry radiomarcada con 125I. La concentracion de la de toxina Cry no radiomarcada competitiva anadida a la mezcla de reaccion se encontro en el intervalo de 0,045 a 1.000 nM y se anadio al mismo tiempo que el ligando radioactivo, para asegurar una verdadera competencia de union. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 1 hora a 28°C y la cantidad de protema 125I-Cry unida a su toxina receptora con una union no espedfica de sustrato, medida como se describe anteriormente. Se determino el cien por cien total de union en ausencia de un ligando competidor. Los resultados se representaron en una grafica semi-logantmica como porcentaje de union espedfica total frente a la concentracion de ligando competitivo agregado.

Ejemplo 4 - Resumen de Resultados

LaFigura 1 muestra el porcentaje de union espedfica de 125I-Cry1Da (0,5 nM) en BBMV de FAW frente a la competencia de Cry1Da homologo no marcado (o) y Cry1Ca heterologo (■). La curva de desplazamiento para la competencia homologa por Cry1Da da como resultado una curva con forma sigmoidal que muestra un desplazamiento del 50% del radioligando a aproximadamente 1,5 nM de Cry1Da. Cry1Ca no desplaza la union espedfica de 125I-Cry1Da a cualquier concentracion probada, hasta 1.000 nM, o 2.000 veces la concentracion de 125I Cry1Da utilizada en el ensayo.

Lista de referencias

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Apendice A

Lista de delta-endotoxinas - de sitio web de Crickmore et al. (citado en la solicitud)

El numero de entrada es la entrada NCBI

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una planta transgenica que comprende ADN que codifica una protema insecticida Cry1 Da y ADN que codifica una protema insecticida CrylCa.

2. La planta transgenica de la reivindicación 1, comprendiendo ademas dicha planta ADN que codifica una tercera protema insecticida, seleccionandose dicha tercera protema del grupo que consiste en CrylFa, Vip3Ab, CrylBe, y CrylE.

3. La planta transgenica de la reivindicación 2, en donde dicha tercera protema es seleccionada del grupo que consiste en CrylFa y CrylBe, la planta ademas comprende ADN que codifica las cuarta y quinta protemas insecticidas seleccionadas del grupo que consiste en Cry2A, Cry1I, DIG-3 y CrylAb.

4. Semilla de una planta segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha semilla comprende dicho ADN.

5. Una mezcla de semillas que comprende semillas de refugio de plantas de refugio no Bt, y una pluralidad de semillas de la reivindicación 4, en donde dichas semillas refugio comprenden menos que el 40% de todas las semillas en la mezcla.

6. Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha planta se selecciona del grupo que consiste en mafz, soja y algodon.

7. La planta de la reivindicación 6, en donde dicha planta es una planta de mafz.

8. Una celula de planta de una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha celula de planta comprende dicho ADN que codifica dicha protema insecticida Cry1Ca y dicho ADN que codifica dicha protema insecticida Cry1Da, en donde dicha protema insecticidaCry1Ca es al menos 99% identica con SEQ ID NO: 1 y dicha protema insecticida Cry1Da es al menos 99% identica con SEQ ID NO: 2.

9. Una planta de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha protema insecticida Cry1Ca comprende SEQ ID NO: 1, y dicha protema insecticida Cry1Da comprende SEQ ID NO: 2.

10. Un metodo para producir la celula de planta de la reivindicación 8, en donde dicho metodo no es esencialmente un proceso biologico para la produccion de plantas.

11. Un metodo para controlar un insecto cogollero del mafz poniendo en contacto dicho insecto una protema insecticida Cry1Ca y una protema insecticida Cry1Da usando una planta o una celula de planta de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.