ES2711402T3 - Ensayo multiplex para Hepatitis B - Google Patents
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Abstract
Un kit que comprende: (a) un primer receptáculo que comprende: (i) perlas que se conjugan con antígeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg) de humano y marcador detectable (i), (ii) perlas que se conjugan con antígeno de núcleo de Hepatitis B (HBcAg) de humano y marcador detectable (ii), y (iii) perlas que se conjugan con un anticuerpo específico para IgM (anti-IgM) de humano y marcador detectable (iii); (b) un segundo receptáculo que comprende (i) HBsAg biotinilado, y (ii) HBcAg biotinilado; y (c) un tercer receptáculo que comprende estreptavidina que se conjuga con un marcador detectable (iv).
Description
DESCRIPCION
Ensayo multiplex para Hepatitis B
Antecedentes de la invencion
El virus de la Hepatitis B causa enfermedad hepatica. Una cantidad significativa de pacientes infectados desarrollan hepatitis cronica que conduce a dano hepatico y hepatocarcinoma posterior. La infeccion por hepatitis B se caracteriza por varias respuestas serologicas e inmunologicas distintivas. Los perfiles de infeccion temporales pueden servir como una gma util para monitorear el curso de la enfermedad y proporcionar, ademas, correlacion serologica con el progreso de la enfermedad (vease, por ejemplo, Elgouhari (2008) Cleveland Clinic J. Med. 75:881 y Juszczyk (2010) Vaccine 18:S23). El documento US2013/085075 describe un procedimiento de monitoreo de salud hepatica en un paciente mediante la medicion de (a) un marcador biologico o panel de marcadores biologicos de salud hepatica y (b) un nivel de un marcador biologico de uno de los principales virus de hepatitis A, B, C, D y E, cuyas mediciones se comparan luego con una muestra de control para diagnosticar la presencia o ausencia de un desorden hepatico.
El virus de la Hepatitis B contiene dos protemas virales principales, el antfgeno de superficie (HBsAg) y los antfgenos de nucleo (HBcAg). Al infectarse, el HBsAg se vuelve detectable en primer lugar, lo que continua con la aparicion de anti-HBc IgM generados por el huesped. Los anticuerpos anti-HBs aparecen meses despues de la desaparicion de HBsAg, y permanecen detectables indefinidamente. Durante el “penodo de ventana” (cuando existe un intervalo de 16-32 semanas entre la aparicion de HBsAg y la aparicion de anti-HBs), la presencia de anti-HBc proporciona evidencia serologica de la infeccion por HBV actual o reciente. Sin embargo, la presencia de anti-HBc IgM y anti-HBc (IgM e IgG) no indica la resolucion de la infeccion ni la inmunidad protectora. Ademas, la presencia de anti-HBs en la ausencia de HBsAg y anti-HBc indica que una persona que se ha vacunado exitosamente.
La prueba serologica de la hepatitis B incluye mediciones de varios antfgenos y anticuerpos espedficos para el virus de la hepatitis B. La capacidad de seguir el curso de la infeccion por HBV y diferenciar entre, por ejemplo, infeccion, exposicion, y resolucion, resulta importante para la gestion clmica. Todos los kits de prueba de anticuerpos para Hepatitis B que se disponen comercialmente realizan una prueba por vez por recipiente de reaccion. El resultado de una cualquiera de las pruebas dadas no puede predecir el curso o etapa de la infeccion por Hepatitis B o resolucion, de manera tal que deben realizarse multiples pruebas, que consumen tiempo, muestra, y reactivos. Ademas, un proveedor medico puede que no ordene probar todos los marcadores de HBV relevantes al mismo tiempo, de manera tal que se puede llamar a un sujeto para prueba en multiples ocasiones. Las repetidas extracciones de sangre resultan estresantes y costosas, y pueden dar como resultado incumplimiento y tratamiento menos que optimo. Vease, por ejemplo, Stramer et al. (2012) Transfusion 52:440. El documento WO94/24560 describe un inmunoensayo para medir dos o mas patogenos diferentes en una muestra lfquida para prueba mediante el contacto de la muestra con una fase solida en la que los anticuerpos se inmovilizan y la fase solida se contacta posteriormente con dos o mas antfgenos diferentes. El documento US2009/029348 describe un kit para ensayo sandwich de doble antfgeno para anticuerpos de Hepatitis C, en el que un antfgeno primario captura el anticuerpo y el mismo anticuerpo captura el antfgeno secundario. El documento GB 2051 357 describe un procedimiento para detectar de manera simultanea en una muestra, al menos, dos marcadores diferentes, en el que el procedimiento comprende el contacto de la muestra con un solo reactivo de fase solida que se recubre con, al menos, dos inmunoreactivos diferentes no complementarios.
Breve sumario de la invencion
En la presente se proporcionan kits para deteccion simultanea de multiples anticuerpos contra el virus de la Hepatitis B (HBV) en una muestra de sujeto de manera tal que el estado de HBV del sujeto puede determinarse. El kit que se describe en el presente proporciona un ensayo rapido, eficiente para determinar si un sujeto se ha expuesto a HBV, sufre de infeccion por HBV, ha sufrido de infeccion por HBV en el pasado, o se ha inmunizado contra el HBV. Tales kits comprenden (a) un primer receptaculo que comprende (i) perlas que se conjugan con antfgeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg) de humano y marcador detectable (i), (ii) perlas que se conjugan con antfgeno de nucleo de Hepatitis B (HBcAg) de humano y marcador detectable (ii), y (iii) perlas que se conjugan con un anticuerpo espedfico para IgM (anti-IgM) de humano y marcador detectable (iii); (b) un segundo receptaculo que comprende (i) HBsAg biotinilado, y (ii) HBcAg biotinilado; y (c) un tercer receptaculo que comprende estreptavidina que se conjuga con un marcador detectable (iv). En algunas realizaciones, los marcadores detectables son una combinacion distintiva de fluorofonos. En algunas realizaciones, las perlas responden magneticamente.
En algunas realizaciones, el marcador detectable (iv) se selecciona a partir de ficoeritrina (PE) o isotiocianato de fluorescema (FITC).
En algunas realizaciones, el kit comprende, ademas, reactivos de lavado (por ejemplo, listo para usar, una solucion madre concentrada, o polvo). El kit puede comprender, ademas, un recipiente que comprende materiales o reactivos para citometna de flujo, por ejemplo, soluciones madre reguladoras o polvos y tubos adecuados. En algunas realizaciones, el kit comprende ademas un receptaculo que comprende un control de calibracion, por ejemplo, para
configurar el nivel de senal para considerarse positiva. El kit puede incluir controles de calibracion para mas de un marcador detectable. En tales casos, los controles de calibracion pueden encontrarse en un receptaculo o mas de un receptaculo. El kit puede incluir controles de calibracion en mas de un nivel para, al menos, un marcador detectable. El kit puede comprender, al menos, un receptaculo que comprende un control negativo, por ejemplo, con perlas no marcadas.
Se proporcionan ademas ensayos multiplex para procesamiento de una muestra biologica a partir de un sujeto humano y/o determinacion del estado de infeccion por HBV del sujeto. De acuerdo con esto, se proporcionan ensayos para procesamiento de una muestra biologica a partir de un sujeto humano que comprenden (a) poner en contacto la muestra biologica con una mezcla de perlas en un receptaculo, en los que la mezcla de perlas comprende (i) perlas que se conjugan con HBsAg y marcador detectable (i), (ii) perlas que se conjugan con HBcAg y marcador detectable (ii), y (iii) perlas que se conjugan con anti-IgM (por ejemplo, anti-IgM de humano) y marcador detectable (iii); (b) retirar componentes que no se unen a perlas; (c) poner en contacto la mezcla de perlas con reactivo conjugado 1 en los que el reactivo conjugado 1 comprende (i) HBsAg biotinilado, y (ii) HBcAg biotinilado; (d) retirar componentes que no se unen a perlas; (e) poner en contacto la mezcla de perlas con reactivo conjugado 2 en los que el reactivo conjugado 2 comprende estreptavidina que se conjuga con marcador detectable (iv); (f) retirar componentes que no se unen a perlas; y (g) determinar mediante citometna de flujo un resultado positivo o negativo para el marcador detectable (iv) en perlas que son tambien positivas para cada uno de los marcadores detectables (i), (ii), o (iii), procesando asf la muestra biologica a partir del sujeto humano y/o determinando el estado de infeccion por Hepatitis B del sujeto.
En algunas realizaciones, los marcadores detectables son una combinacion distintiva de fluorofonos. En algunas realizaciones, las perlas responden magneticamente.
En algunas realizaciones, una, dos o todas las etapas (b), (d), y (f) comprenden lavado de las perlas. En algunas realizaciones, la muestra biologica se selecciona a partir de sangre, componentes de la sangre (por ejemplo, suero o plasma), o sangre procesada.
En algunas realizaciones del ensayo, el positivo y negativo se determinan mediante comparacion con respecto a un control de calibracion. El positivo se define como mas alto con respecto al control de calibracion, y el negativo se define como mas bajo con respecto al control de calibracion.
En algunas realizaciones, el ensayo comprende ademas determinar que el sujeto sufre de infeccion aguda por Hepatitis B cuando el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (iii). En algunas realizaciones el ensayo comprende ademas determinar que el sujeto ha sido inmunizado contra la infeccion por Hepatitis B cuando el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (i), pero no en perlas (ii) o (iii). En algunas realizaciones, el ensayo comprende ademas determinar que el sujeto ha si expuesto a Hepatitis B cuanto el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (ii) pero no en perlas (i) o (iii). En algunas realizaciones, el ensayo comprende ademas determinar que el sujeto ha tenido una infeccion por Hepatitis B en el pasado cuando el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (i) y (ii) pero no en perlas (iii).
En algunas realizaciones, los marcadores detectables (i), (ii), y (iii) son combinaciones distintivas de fluorofonos. En algunas realizaciones, el marcador detectable (iv) se selecciona a partir de PE y FITC.
En algunas realizaciones, las perlas (i), (ii), y (iii) responden magneticamente. En algunas realizaciones, una, dos, o todas las etapas (b), (d), y (f) comprenden lavado de perlas. En algunas realizaciones, la muestra biologica se selecciona a partir de sangre, componentes de la sangre (por ejemplo, suero o plasma), o sangre procesada.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra una realizacion del ensayo multiplex para HBV que se describe en el presente.
Descripcion detallada de la invencion
A. Introduccion
En la presente se describen kits, composiciones, y procedimientos para deteccion simultanea de una infeccion con un microorganismo y/o la respuesta a la vacunacion contra la misma infeccion. El procedimiento incluye la deteccion de anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) contra el antfgeno de superficie de Hepatitis B de humano (anticuerpos anti HBsAg) en combinacion con inmunoglobulinas totales (anticuerpos HBc totales) e inmunoglobulinas M (anticuerpos anti-HBc IgM) que se dirigen contra el antfgeno de nucleo de Hepatitis B de humano. La presencia y cantidad de cada uno de los anticuerpos se mide en el mismo recipiente unico (tubo, pozo, cubeta) en la presencia de perlas. Cada perla lleva un parametro ffsico espedfico detectable (por ejemplo, marca de colorante), y (1) anti-IgM, (2) HBcAg, o (3) HBsAg. De este modo, tres tipos de perlas detectables de manera clara se incluyen en un recipiente unico para llevar a cabo un ensayo, segun se muestra en la Figura 1. La Figura 1 indica que las perlas de
HBsAg se recubrieron con los dos subtipos predominates de HBsAg, Ad y Ay. Existen subtipos adicionales, por ejemplo, Aw y Ar (vease, por ejemplo, Valet et al. (1975) CMA J. 112:1179).
Los ensayos que se describen en el presente ofrecen deteccion en, al menos, dos dimensiones, por ejemplo, la identidad de la perla inmovilizada (por ejemplo, HBsAg, HBcAg, o anti-IgM), y la presencia y cantidad de union de anticuerpo (anti-HBs o anti-HBc). Este aspecto multidimensional permite un formato multiplex, de manera tal que mas de un analito puede detectarse en un solo ensayo. Ademas, segun se describe a continuacion, los inventores han mostrado que el ensayo multiplex que se describe en el presente resulta correlacionado de manera exitosa con el estado de infeccion de muestras de pacientes conocidas.
Los inventores han disenado un ensayo simple, que se describe brevemente aqrn, para detectar multiples anticuerpos en una muestra de paciente que son indicadores de la presencia de una infeccion por HBV, etapa de infeccion por HBV, y estado de la vacunacion contra HBV del paciente. En la primera etapa, la muestra del paciente, normalmente sangre o un componente de la sangre, se pone en contacto con tres tipos de soporte solido:
ss1) que se conjuga con un marcador detectable (por ejemplo, fluorofono) 1 y anti-IgM;
ss2) que se conjuga con un marcador detectable 2 y HBcAg; y
ss3) que se conjuga con un marcador detectable 3 y HBsAg.
Ss1 se unira a todos los anticuerpos IgM en la muestra de paciente, independientemente de la especificidad. Ss2 se unira a anticuerpos en la muestra de paciente que son espedficos para HBcAg, tanto IgM y IgG. Ss3 se unira a anticuerpos en la muestra de paciente que son espedficos para HBsAg, predominantemente IgG.
Despues de retirar el material no unido, se agregan HBcAg y HBsAg marcados. En el ejemplo que se muestra en la Figura 1, el marcador es biotina, pero una persona experta comprendera que un marcador detectable puede usarse directamente en el HBcAg y HBsAg para dar como resultado una senal positiva o negativa.
En el presente ejemplo, despues de retirar el material no unido, se agrega estreptavidina marcada para ser detectada, se une a HBcAg y HBsAg biotinilados, y da como resultado una senal positiva o negativa, asf como tambien cuantitativa. Los soportes solidos 1, 2, 3 (que se correlacionan con marcadores 1, 2, y 3 detectables), y la presencia, ausencia, y nivel cuantitativo de senal en cada uno, se detectan mediante citometna de flujo. La siguiente Tabla muestra como se pueden usar los resultados para diagnosticar el estado de HBV del paciente.
B. Definiciones
A menos que se especifique lo contrario, los terminos tecnicos y cientfficos que se usan en la presente tienen el mismo significado segun se comprende comunmente por una persona de capacidad ordinaria en el estado de la tecnica. Vease, por ejemplo, Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4th ed. 2007); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). La presente divulgacion se refiere a items tales como marcadores, soportes solidos, perlas y analitos de acuerdo con un numero o letra (por ejemplo, Marcador detectable 1 o perla (ii)). Estos numeros y letras se dirigen a distinguir el item con respecto a otros items del mismo tipo (por ejemplo, perla (i) vs. perla (ii)), y no se dirigen a asociar una propiedad especifica al numero o letra.
Los ensayos multiplex son analisis que miden de manera simultanea los niveles de mas de un analito en una muestra unica. Procedimientos de ensayos multiplex y reactivos se describen en, por ejemplo, la patente US 6,773,578 y WO2008148883.
El termino “soporte solido” se usa en la presente para indicar una superficie o cuerpo inerte solido en que un agente, tal como un anticuerpo o un antfgeno puede encontrarse inmovilizado. El termino “inmovilizado” segun se usa en la presente indica un acoplamiento que se basa en moleculas que no se desacopla significativamente en condiciones que se imponen durante las etapas de los ensayos que se describen en la presente. Tal inmovilizacion puede lograrse a traves de un enlace covalente, un enlace ionico, un enlace de tipo afinidad, o cualquiera de los otros enlaces qmmicos.
El termino “partfcula” se usa en la presente para referirse a un cuerpo solido o semisolido, frecuentemente con dimensiones lineales en la escala de micron (a saber, menos que 100 pm), de cualquier forma o textura superficial. Excepto por lo senalado, el termino se usa de manera indistinta con “micropartfcula”, que se refiere a una partfcula en escala de micron, y “perla”, que se refiere a partfculas que son de forma esferica o casi esfericas, frecuentemente polimericas en composicion.
Los terminos “receptaculo”, “recipiente”, “tubo” y “pozo” se refieren a un recipiente que puede mantener reactivos o un ensayo. Si el receptaculo es un kit y mantiene reactivos, se cerrara o sellara normalmente. Si el receptaculo se usa para un ensayo, se abrira o se volvera accesible normalmente durante las etapas del ensayo.
El termino “muestra biologica” abarca una variedad de tipos de muestras que se obtienen a partir de un organismo. El termino abarca fluidos corporales tales como sangre, componentes de la sangre, saliva, suero, plasma, orina y otras muestras lfquidas de origen biologico, biopsia de tejido solido, cultivos de tejido, o sobrenadantes que se toman a partir de celulas de paciente cultivadas. En el contexto de la presente divulgacion, la muestra biologica es normalmente un fluido corporal con cantidades detectables de anticuerpos, por ejemplo, sangre o un componente de la sangre. La muestra biologica puede procesarse antes del ensayo, por ejemplo, para retirar celulas o desechos celulares. El termino abarca muestras que se han manipulado despues de su procuracion, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilizacion, sedimentacion o enriquecimiento de ciertos componentes.
El termino “anticuerpo” segun se usa en la presente se refiere a un polipeptido que se codifica mediante un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de estos, que se unen espedficamente y reconocen un analito (antfgeno). Las cadenas ligeras de inmunoglobulina que se reconocen se clasifican en ya sea kappa o lambda. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina se clasifican en gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, que definen, a su vez, las clases de inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Un ejemplo de una unidad estructural de inmunoglobulina G (anticuerpo IgG) es un tetramero. Cada tetramero como tal se compone de dos pares identicos de cadenas de polipeptidos, teniendo cada para una cadena “ligera” (de alrededor de 25kD) y una cadena “pesada” (de alrededor de 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una region variable de 100 a 110 o mas aminoacidos responsables principalmente del reconocimiento de antfgeno. Los terminos “cadena ligera variable” (VL) y “cadena pesada variable” (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente.
Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como fragmentos bien caracterizados que se producen mediante digestion de inmunoglobulinas intactas con diversas peptidasas. De este modo, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo cerca de las uniones de disulfuro en la region bisagra para producir F(ab')2, un dfmero de Fab que por sf mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El dfmero F(ab')2 puede reducirse en condiciones leves para romper la union de disulfuro en la region bisagra, convirtiendo asf el dfmero F(ab')2 en dos monomeros Fab'. El monomero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra (vease Paul (Ed.), Fundamental Immunology, Third Edition, Raven Press, NY (1993)). Mientras diversos fragmentos de anticuerpos se definen en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, una persona experta apreciara que tales fragmentos pueden sintetizarse de novo ya sea qmmicamente o mediante la utilizacion de metodologfa de ADN recombinante. De este modo, el termino “anticuerpo”, segun se usa en la presente, incluye ademas fragmentos de anticuerpos que se producen ya sea mediante la modificacion de anticuerpos enteros o mediante smtesis de novo usando metodologfas de ADN recombinante tal como cadena unica de Fv.
Los anticuerpos se refieren comunmente de acuerdo con sus objetivos. Mientras que la nomenclatura vana, una persona experta en la tecnica estara familiarizada y comprendera que varios nombres pueden aplicarse al mismo anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo espedfico para IgM puede denominarse “anti-IgM”, “anticuerpo IgM”, o “anticuerpo anti-IgM”.
Los terminos “antigeno”, “inmunogeno”, “objetivo de anticuerpo” y “analito objetivo” se usan en la presente para referirse a una molecula, compuesto, o complejo que se reconoce mediante un anticuerpo, a saber, puede unirse espedficamente mediante el anticuerpo. El termino puede referirse a cualquier molecula que puede reconocerse espedficamente mediante un anticuerpo, por ejemplo, un polipeptido, polinucleotido, carbohidrato, lfpido, molecula qrnmica, o combinaciones de estos (por ejemplo, polipeptidos fosforilados o glucosilados). Una persona experta comprendera que el termino no indica que la molecula es inmunogenica en todo contexto, sino que indica simplemente que puede ser objetivo de un anticuerpo.
Los anticuerpos se unen a un “epftopo” en un antigeno. El epftopo es el sitio que se localiza en el antigeno que se reconoce y se une mediante el anticuerpo. Los epftopos pueden incluir unos pocos aminoacidos o porciones de unos pocos aminoacidos, por ejemplo, 5 o 6, o mas, por ejemplo, 20 o mas aminoacidos, o porciones de aquellos aminoacidos. En algunos casos, el epftopo incluye componentes no protemicos, por ejemplo, a partir de un carbohidrato, acido nucleico, o ftpido. En algunos casos, el epftopo es una molecula tridimensional. De este modo, cuando el objetivo es una protema, el epftopo puede comprender aminoacidos consecutivos, o aminoacidos de diferentes partes de la protema que se aproximan mediante plegamiento de protema (por ejemplo, un epftopo discontinuo). Lo mismo resulta verdadero para otros tipos de moleculas objetivo que forman estructuras tridimensionales. Un epftopo incluye normalmente, al menos, 3, y mas comunmente, al menos, 5 u 8-10 aminoacidos en una conformacion espacial unica. Entre los procedimientos para determinar la conformacion espacial de epftopos se incluyen, por ejemplo, cristalograffa por rayos X y resonancia magnetica nuclear bidimensional. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996).
Los terminos “espedfico para” y “se une espedficamente a” se refieren a una molecula (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) que se une a su objetivo con, al menos, afinidad mayor que 2-pliegues en comparacion con los compuestos no objetivos, por ejemplo, al menos, cualquiera de afinidad mayor que 4-pliegues, 5-pliegues, 6-pliegues, 7-pliegues, 8-pliegues, 9-pliegues, 10-pliegues, 20-pliegues, 25-pliegues, 50-pliegues, o 100-pliegues. Por ejemplo, un anticuerpo que se une espedficamente a un objetivo de anticuerpo dado unira normalmente el objetivo de anticuerpo con al menos una afinidad mayor que 2-pliegues en comparacion con un no objetivo de anticuerpo. Espedficamente puede determinarse usando procedimientos estandares, por ejemplo, inmunoensayos ELISA de fase solida (vease, por ejemplo, Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) para una descripcion de formatos de inmunoensayos y condiciones que pueden usarse para determinar inmunoreactividad espedfica).
El termino “se une” con respecto a un objetivo de anticuerpo (por ejemplo, antfgeno, analito) indica normalmente que un anticuerpo se une a una mayor parte de los objetivos de anticuerpo en una poblacion pura (asumiendo proporciones molares adecuadas). Por ejemplo, un anticuerpo que se une a un objetivo de anticuerpo dado se une normalmente a, al menos, 2/3 de los objetivos de anticuerpo en una solucion (por ejemplo, al menos, cualquiera del 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 %). Una persona experta reconocera que alguna variabilidad surgira dependiendo del procedimiento y/o umbral de la union determinante.
Los terminos “marcador”, “marcador detectable” y “molecula detectable” se refieren a una composicion detectable mediante espectroscopia, medios fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, qmmicos u otros medios ffsicos. Por ejemplo, los marcadores utiles incluyen colorantes fluorescentes (fluorofonos), agentes luminiscentes, reactivos electron-densos, enzimas (por ejemplo, segun se usan normalmente en ELISA), biotina, digoxigenina, 32P y otros isotopos, haptenos, y protemas que pueden volverse detectables, por ejemplo, mediante la incorporacion de un radiomarcador en el peptido o se usan para detectar anticuerpos que reaccionan espedficamente con el peptido. El termino incluye combinaciones de agentes marcadores unicos, por ejemplo, una combinacion de fluorofonos que proporcionan una marca detectable unica, por ejemplo, en una longitud de onda en particular o combinacion de longitudes de onda. Puede usarse cualquier procedimiento conocido en el estado de la tecnica para conjugar un marcador con respecto a un agente conveniente usando, por ejemplo, procedimientos que se describen en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.
El termino “positivo” cuando se refiere a un resultado o senal, indica la presencia de un analito o item que se detecta en una muestra. El termino “negativo” cuando se refiere a un resultado o senal, indica la ausencia de un analito o item que se detecta en una muestra. Positivo y negativo se determinan normalmente mediante comparacion de, al menos, un control, por ejemplo, un nivel de umbral que se requiere para que una muestra se determine como un control positivo o negativo (por ejemplo, un blanco conocido).
Una muestra de “control” o valor se refiere a una muestra que sirve como una referencia, comunmente una referencia conocida, para comparacion con respecto a una muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de prueba puede tomarse a partir de una condicion de prueba, por ejemplo, en la presencia de un compuesto de prueba, y compararse con muestras a partir de condiciones conocidas, por ejemplo, en la ausencia del compuesto de prueba (control negativo), o en la presencia de un compuesto conocido (control positivo). Un control puede representar ademas un valor promedio que se recolecta a partir de un numero de pruebas o resultados. Una persona experta en la tecnica reconocera que los controles son valiosos en una situacion dada y pueden analizar datos sobre la base de comparaciones con respecto a valores de control. Los controles son valiosos ademas para determinar los significados de datos. Por ejemplo, si los valores para un parametro dado son variables en los controles, la variacion en muestras de prueba no se considerara como significativa.
Un “control de calibracion” resulta similar con respecto a un control positivo, en cuanto a que incluye una cantidad conocida de un analito conocido. En el caso de un ensayo multiplex, el control de calibracion puede disenarse para incluir cantidades conocidas de multiples analitos conocidos. La cantidad de analito(s) en el control de calibracion puede configurarse a una cantidad de corte minima, por ejemplo, de manera tal que una cantidad mayor se considerara “positivo” para el analito(s), mientras que una cantidad menor se considerara “negativo” para el analito(s). En algunos casos, pueden usarse los controles de calibracion de multiples niveles, de manera tal que un rango de cantidades de analito puede determinarse mas precisamente. Por ejemplo, un ensayo puede incluir
controles de calibracion en cantidades bajas y altas conocidas, o cantidades maximas, intermedias, y mmimas conocidas.
El termino “diagnostico” se refiere a una probabilidad relativa de que un sujeto sufre de una infeccion, desorden o enfermedad. De manera similar, el termino “pronostico” se refiere a una probabilidad relativa con respecto a que puede ocurrir un cierto resultado futuro en el sujeto. Por ejemplo, en el contexto de la presente divulgacion, el pronostico puede referirse a la probabilidad de que una persona se infectara en el futuro (por ejemplo, no probable si se inmunizo). Los terminos no pretenden ser absolutos, segun se apreciara por cualquier persona experta en el campo de diagnosticos medicos.
“Sujeto”, “paciente”, y “persona” se usan de manera indistinta y se refieren a, a excepcion de cuando se indica, mairnferos, tales como primates humanos y no humanos, asf como tambien conejos, ratas, ratones, cabras, cerdos, y otras especies de mamnferos. El termino no indica necesariamente que el sujeto se ha diagnosticado con una enfermedad en particular, pero se refiere normalmente a una persona bajo supervision medica. Un paciente puede ser una persona en busca de tratamiento, monitoreo, ajuste o modificacion de un regimen terapeutico existente. C. Ensayos multiplex
Los ensayos que se describen en el presente incluyen deteccion de mas de un analito en un unico ensayo, y se describen, de este modo, como ensayos multiplex. Los ensayos que se describen en el presente incluyen componentes para inmovilizar multiples analitos en soportes solidos distinguibles de manera tal que cada uno de los multiples analitos puede identificarse y cuantificarse mediante citometna de flujo. Los componentes de ensayo y consideraciones incluyen los soportes solidos y como distinguir los diferentes tipos de soportes solidos unos con respecto a los otros (por ejemplo, marcadores u otros parametros de diferenciacion), componentes para inmovilizar los analitos convenientes de manera espedfica y retirar otros materiales de muestra, y marcadores para detectar y cuantificar los analitos convenientes.
Los ensayos multiplex que se describen en el presente incluyen el uso de un soporte solido, normalmente partfculas (a las que se hace referencia ademas, como micropartfculas o perlas). Para deteccion mediante citometna de flujo, las partfculas que emiten autofluorescencia debenan evitarse debido a que incrementaran senales de fondo y las representaran de manera no adecuada. Las partfculas que se crean mediante polimerizacion en emulsion estandar a partir de una variedad de monomeros de partida exhiben, de manera general, baja autofluorescencia, mientras que aquellas que han sido modificadas para aumentar la porosidad (partfculas “macroporosas”) exhiben alta autofluorescencia. La autofluorescencia en tales partfculas aumenta ademas con el aumento de tamano y el aumento de porcentaje del monomero divinilbenceno.
Dentro de estas limitaciones, el rango de tamano de las micropartfculas puede variar y los rangos de tamano en particular no son cnticos. En la mayona de los casos, el rango de tamano agregado de las micropartfculas yace dentro del rango de 0,3 pm a 100 pm en diametro de partfculas, por ejemplo, dentro del rango de 0,5 pm a 40 pm. Las partfculas magneticas se usan comunmente en el estado de la tecnica y pueden hacer que las etapas de separacion y lavado resulten mas convenientes para los ensayos que se describen en el presente. “Partfculas magneticas”, “material que responde magneticamente” y “perlas magneticas” indican un material que responde a un campo magnetico. Materiales que responden magneticamente incluyen materiales paramagneticos (por ejemplo, hierro, mquel, y cobalto, asf como tambien, oxidos de metal tales como Fe3 O4 , BaFe-^O-ig, CoO, NiO, Mn2O3 , Cr2O3 , y CoMnP), materiales ferromagneticos, materiales ferrimagneticos, y materiales metamagneticos. En lugar de constituir la micropartfcula entera, el material que responde magneticamente constituye normalmente un componente de la micropartfcula, mientras que el resto consiste de un material polimerico que puede derivatizarse qmmicamente para permitir la fijacion de un reactivo de ensayo (por ejemplo, antfgeno o anticuerpo).
Procedimientos de, e instrumentacion para, aplicacion y retiro de un campo magnetico como parte de un ensayo se conocen para aquellos capacitados en el estado de la tecnica y se informan en la literatura. Ejemplos de informes de literatura son Forrest et al., US 4,141,687; Ithakissios, US 4,115,534; Vlieger et al., Analytical Biochemistry 205:1-7 (1992); Dudley, Journal of Clinical Immunoassay 14:77-82 (1991); and Smart, Journal of Clinical Immunoassay 15:246-251 (1992).
La matriz polimerica que forma la micropartfcula puede ser cualquier material que es compatible con los ensayos que se describen en el presente. La matriz debena ser inerte con respecto a los componentes de la muestra biologica y a los reactivos de ensayo, tener autofluorescencia multiple, ser solida e insoluble en la muestra y en cualquiera de los otros reactivos o lavados que se usan en el ensayo, y ser capaz de fijar un reactivo de ensayo a la micropartfcula. Ejemplos, de polfmeros adecuados son poliesteres, polieteres, poliolefinas, oxidos de polialquilenos, poliamidas, poliuretanos, polisacaridos, celulosas, y poliisoprenos. El entrecruzamiento resulta util en muchos polfmeros para impartir integridad estructural y rigidez a la micropartfcula.
Los grupos funcionales para fijacion del reactivo de ensayo (por ejemplo, antfgeno o anticuerpo) pueden incorporarse en la estructura de polfmero mediante medios convencionales. Ejemplos de grupos funcionales
adecuados son grupos amino, grupos amonio, grupos hidroxilos, grupos de acido carbox^lico, y grupos isocianatos. El reactivo de ensayo se une normalmente de manera covalente a la superficie de fase solida, ya sea de manera directa o indirecta, por ejemplo, con un grupo de union. Los grupos de union pueden usarse como un medio para aumentar la densidad de grupos reactivos en la superficie de fase solida y reducir el obstaculo esterico para aumentar el rango y sensibilidad del ensayo, o como un medio para agregar tipos espedficos de grupos reactivos a la superficie de fase solida para ampliar el rango de tipos de reactivos de ensayo que pueden fijarse a la fase solida. Ejemplos de grupos de union utiles adecuados comprenden acido poliaspartico, acido poliglutamico y poliarginina. Las micropartfculas de diferentes tipos en un ensayo multiplex pueden distinguirse unas con respecto a las otras, por ejemplo, por tamano, peso, difusion de luz o absorbancia, o por marcador, por ejemplo, marcador fluorescente. Cuando el tamano de micropartfcula de usa como un factor de diferenciacion (caractenstica distintiva), los anchos del tamano subvanan y el espacio entre el diametro medio de subrangos adyacentes se seleccionan para permitir la diferenciacion de diferentes tipos de micropartfculas mediante citometna de flujo, segun sera aparente para aquellos capacitados en el uso e instrumentacion para citometna de flujo. Normalmente, un subrango para un diametro medio dado es de alrededor del ± 5 % CV o menos del diametro medio, donde CV es el coeficiente de variacion y se define como la desviacion estandar del diametro de partfcula dividida por el diametro medio de partfcula por 100 por ciento. Los diametros medios de subrangos para diferentes tipos de partfculas se separan de manera general por, al menos, alrededor del 6 % del diametro medio de uno de los subrangos, por ejemplo, al menos, alrededor del 8 % o del 10 % del diametro medio de uno de los subrangos.
La difusion de luz puede usarse, ademas, para distinguir diferentes tipos de micropartfculas. La difusion de luz de angulo lateral vana con el tamano de partfcula, granularidad, absorbancia y rugosidad superficial, mientras que la difusion de luz de angulo frontal se ve ligeramente afectada por el tamano e mdice de refraccion. La variacion de cualquiera de estas cualidades puede dar como resultado diferencias de difusion de luz que pueden servir como un medio para distinguir los diversos grupos.
Incluso otro ejemplo de un parametro de diferenciacion lo constituye la absorbancia. Cuando se aplica luz a las partfculas, la absorbancia de la luz por las partfculas se indica en mayor parte por un cambio en la fuerza de la luz de difusion lateral (angulo lateral) mientras que la fuerza de la luz difundida de manera frontal no se afecta relativamente. Por consiguiente, la diferencia en la absorbancia entre los diversos colorantes de color que se asocian a las partfculas se determina por diferencia de observacion en la fuerza de la luz que se difunde lateralmente.
Un amplio conjunto de parametros y caractensticas puede usarse como parametros de diferenciacion para distinguir las partfculas de un grupo con respecto a aquellas de otro. Los parametros de diferenciacion pueden surgir a partir del tamano de partfcula, composicion, caractensticas ffsicas que afectan la difusion de luz, colorantes fluorescentes que se excitan o colorantes de color que imparten diferentes espectros de emision y/o caractensticas de difusion de las partfculas, o a partir de concentraciones diferentes de uno o mas colorantes fluorescentes.
Cuando la caractenstica distinguible es un colorante fluorescente o color, puede recubrirse en la superficie de la micropartfcula, integrarse en la micropartfcula, o unirse con respecto a las moleculas del material de micropartfcula. De este modo, las micropartfculas fluorescentes pueden fabricarse mediante la combinacion del material de polfmero con el colorante fluorescente, o mediante impregnacion de la micropartfcula con el colorante. Las micropartfculas con colorantes ya incorporados y adecuados asf para uso en la presente invencion se disponen comercialmente a partir de proveedores tales como Spherotech, Inc. (Libertyville, Ill., USA) y Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg., USA). Una lista de proveedores de productos de citometna de flujo puede encontrarse en, por ejemplo, el sitio web de molbio.princeton.edu/facs/FCMsites.html.
Los marcadores pueden ser cualquier sustancia o componente que emite o genera de manera directa o indirecta una senal detectable. En algunas realizaciones, los marcadores son fluorofonos, muchos de los que se informan en la literatura y, de este modo, se conocen por aquellos capacitados en el estado de la tecnica, y muchos de los que se disponen comercialmente de manera sencilla. Las fuentes de literatura para fluorofonos incluyen Cardullo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794 (1988); Dexter, J. of Chemical Physics 21: 836- 850 (1953); Hochstrasser et al., Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992); Selvin, Methods in Enzymology 246: 300-334 (1995); Steinberg, Ann. Rev. Biochem., 40: 83- 114 (1971); Stryer, Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846 (1978); Wang et al., Tetrahedron Letters 31: 6493-6496 (1990); y Wang et al., Anal. Chem. 67: 1197-1203 (1995).
Los siguientes son ejemplos de fluorofonos que pueden usarse como marcadores:
acido 4-acetamido-4'isotiocianatostilbeno-2,2' disulfonico
acridina
isotiocianato de acridina
acido 5-(2’aminoetil)aminonaftaleno-1-suf6nico (EDANS)
4-amino-N- [3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato
N-(4-anilino-1-naftil)maleimida
antranilamida
BODIPY
Amarillo Brillante
cumarina
7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120)
7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarina 151)
colorantes de cianina
cianosina
4', 6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI)
5' 5’’-dibromopirogalol-sulfonaftalema (Rojo de Bromopirogalol)
7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)- 4-metilcumarina
pentaacetato de dietilentriamina
acido 4,4’-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2’-disulf6nico
acido 4,4’-diisotiocianatoestilbeno-2,2’-disulf6nico
cloruro de 5-[dimetilamino]-naftalen-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo) acido 4-(4'-dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL)
4- dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC)
eosina
isotiocianato de eosina
eritrosina B
isotiocianato de eritrosina
etidio
5- carboxifluorescema (FAM)
5-(4,6-diclorotriazin-2-il)amino-fluorescema (DTAF)
2’,7’dimetoxi-4’5’-dicloro-6-carboxifluorescema (JOE)
fluorescema
isotiocianato de fluorescema
fluorescamina
IR144
IR1446
isotiocianato de Verde de Malaquita
4-metilumbeliferona
orto cresol-ftalema
nitrotirosina
pararosanilina
Rojo Fenol
ficoeritrina (incluyendo pero sin limitacion a tipos B y R)
o-ftaldialdehndo
pireno
butirato de pireno
succinimidilo 1-pireno butirato
puntos cuanticos
Rojo Reactivo 4 (Cibacron™ Rojo Brillante 3B-A)
6-carboxi-X-rodamina (ROX)
6-carboxirrodamina (R6G)
cloruro de sulfonilo de lisamina y rodamina B rodamina
rodamina B
rodamina 123
isotiocianato de rodamina X
sulforodamina B
sulforrodamina 101
derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (Texas Red)
N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA)
tetrametil rodamina
isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC)
riboflavina
acido rosolico
derivados de quelatos de lantanido
Un grupo prominente de fluorofonos para inmunoensayos son fluorescema, isotiocianato de fluorescema, ficoeritrina, rodamina B y Texas Red (derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101). Cualquiera de los fluorofonos en la lista que precede a este parrafo puede usarse en los ensayos que se describen en el presente, ya sea para marcar la micropartmula, o para marcar un agente de union (por ejemplo, un anticuerpo o estreptavidina). Los fluorocromos pueden fijarse mediante enlace covalente convencional, usando grupos funcionales adecuados en los fluorofonos y en la micropartfcula o agente de union. El reconocimiento de tales grupos y las reacciones para formar las uniones seran aparentes de manera sencilla a aquellos capacitados en el estado de la tecnica.
Otros marcadores que pueden usarse en lugar de los fluorofonos son marcadores radioactivos y marcadores enzimaticos. Estos se conocen asimismo en el estado de la tecnica.
Los procedimientos de citometna de flujo e instrumentacion se conocen en el estado de la tecnica. Las descripciones de la instrumentacion y procedimientos pueden encontrarse en, por ejemplo, Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide (2000) Becton, Dickinson, and Company; McHugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Methods in Cell Biology 42, Part B (Academic Press, 1994).
D. Ejemplos
Este ejemplo ilustra el rendimiento del ensayo multiplex para HBV que se describe en el presente en un conjunto de 46 muestras de plasma a partir de sujetos humanos. Nueve muestras se tomaron a partir de pacientes vacunados contra el HBV, y 37 muestras se tomaron a partir de pacientes que mostraban smtomas de infeccion por HBV. Las muestras de pacientes se probaron para detectar la presencia de anti-HBs, anti-HBc (total), y anti-HBc (IgM) usando el ensayo BioPlex 2200. Las lecturas se obtuvieron mediante citometna de flujo, que resulta capaz de detectar cada perla de acuerdo con su marca de colorante fluorescente, asf como tambien la presencia de anticuerpo unido a cada perla. Las perlas de HBsAg se unen a todos los anticuerpos (principalmente IgG) que une HBsAg. Las perlas HBcAg unen todos los anticuerpos (principalmente IgG e IgM) que une HBcAg. Las perlas anti-IgM unen todos los anticuerpos de IgM, incluyendo aquellos espedficos para HBcAg. Todas las perlas son magneticas. Se prepararon reactivos de perlas a partir de 8 pL de cada uno de: perlas recubiertas de (HBsAg) BioSpacific Ad/Ay (l0 mg/ml de material); perlas recubiertas de Steenvoorde HBc 309 (10 mg/ml de material); y perlas recubiertas de Medix anti-mu (10 mg/ml de material) 2 ml de diluyente de partfcula. De manera adicional, 2 perlas de control se incluyeron con cada ensayo: Internal Standard Bead (ISB) (l0 mg/ml de material) y Serum Verification Bead (SVB) (10 mg/ml de material). El ISB se disena para identificar detector de fluctuacion(es), y se recubre con un colorante fluorescente unico, en este caso, se denomina cadaverina de metilrodamina (TMRc ). El SVB se designa para confirmar la presencia de suero o plasma en la muestra y se recubre con anti-FXIII (factor de coagulacion XIII).
Cada muestra se incubo con reactivo de perla, se retiraron componentes de muestra que no se unen, y las perlas ahora acopladas se lavaron. Se agrego el Reactivo Conjugado 1, que comprende antfgenos reporteros biotinilados y anticuerpo reportero biotinilado. Los antfgenos reporteros incluyen un dominio para reconocimiento y union a los anticuerpos de union a perlas y una molecula detectable, para ya sea deteccion directa o indirecta. En este caso, los antfgenos y anticuerpo reporteros fueron HBs Ad biotinilado (0,6 mg/ml de material), HBs Ay biotinilado (0,58 mg/ml de material), HBc307 biotinilado (0,55 mg/ml de material), y anti-FXIII biotinilado (1,17 mg/ml de material). Las concentraciones en el Reactivo Conjugado 1 fueron 1,25 pg/ml, 1,25 pg/ml, y 0,2 pg/ml, y 0,1 pg/ml, respectivamente. De nuevo, se retiraron los reactivos que no se unen, se lavaron las perlas acopladas, y se agrego el Reactivo Conjugado 2. El Reactivo Conjugado 2 incluyo estreptavidina-PE (1,0 mg/ml de material) a una concentracion de 6,0 pg/ml. En este caso, los Reactivos Conjugados incluyeron 1 % de trehalosa y 0,5 % de CHPAS, como reactivos reguladores y de control de fondo. Despues del lavado, las muestras se resuspendieron y se detecto la senal mediante citometna de flujo.
Los valores de control y calibracion se establecieron segun se muestra en la Tabla 1.
T l 1. L r li r r nr l r r n m li l x r HBV
(continuacion)
Una vez que se configuraron los valores de calibracion, las muestras de pacientes se probaron. Antes de la muestra, los pacientes se categorizaron como (i) infeccion aguda; (ii) expuestos a HBV, (iii) susceptibles, (iv) infeccion pasada, y (v) inmunizados.
T l 2. D r in r n m li lx r HBV
(continuacion)
(continuacion)
Para la interpretacion de datos, el “reactivo” (positivo) se configuro en una senal de calibrador de senal/corte de muestra (S/CO) de >1,0, mientras que el “no reactivo” (negativo) se configuro a una senal de calibrador S/CO de muestra de < 1,0. La tabla 3 muestra la interpretacion de los resultados brutos usando los puntajes S/CO anteriores.
T l . R l r r n mlil x r HBV
(continuacion)
Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invencion.
Claims (13)
1. Un kit que comprende:
(a) un primer receptaculo que comprende:
(i) perlas que se conjugan con antigeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg) de humano y marcador detectable (i),
(ii) perlas que se conjugan con antigeno de nucleo de Hepatitis B (HBcAg) de humano y marcador detectable (ii), y
(iii) perlas que se conjugan con un anticuerpo espedfico para IgM (anti-IgM) de humano y marcador detectable (iii);
(b) un segundo receptaculo que comprende
(i) HBsAg biotinilado, y
(ii) HBcAg biotinilado; y
(c) un tercer receptaculo que comprende estreptavidina que se conjuga con un marcador detectable (iv).
2. El kit de la reivindicacion 1, que comprende ademas
(i) reactivo de lavado; y/o
(ii) un receptaculo que comprende un control de calibracion.
3. El kit de las reivindicaciones 1 o 2, en el que los marcadores detectables (i), (ii), y (iii) son combinaciones distintivas de fluorofonos.
4. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el marcador detectable (iv) se selecciona a partir de ficoeritrina e isotiocianato de fluorescema.
5. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que las perlas (i), (ii), y (iii) responden magneticamente.
6. Un ensayo multiplex para procesamiento de una muestra biologica a partir de un sujeto humano y/o determinacion del estado de infeccion por Hepatitis B del sujeto, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto la muestra biologica con una mezcla de perlas en un receptaculo, en el que la mezcla de perlas comprende:
(i) perlas que se conjugan con antfgeno de superficie de Hepatitis B (HBsAg) de humano y marcador detectable (i),
(ii) perlas que se conjugan con antfgeno de nucleo de Hepatitis B (HBcAg) de humano y marcador detectable (ii), y
(iii) perlas que se conjugan con un anticuerpo espedfico para IgM (anti-IgM) de humano y marcador detectable (iii);
(b) retirar componentes que no se unen a perlas a partir del receptaculo;
(c) poner en contacto la mezcla de perlas con reactivo conjugado 1, en el que el reactivo conjugado 1 comprende:
(i) HBsAg biotinilado, y
(ii) HBcAg biotinilado;
(d) retirar componentes que no se unen a perlas;
(e) poner en contacto la mezcla de perlas con reactivo conjugado 2, en el que el reactivo conjugado 2 comprende estreptavidina que se conjuga con el marcador detectable (iv);
(f) retirar componentes que no se unen a perlas; y
(g) determinar mediante citometna de flujo un resultado positivo o negativo para marcador detectable (iv) en perlas que son tambien positivas para cada uno de los marcadores detectables (i), (ii), o (iii), procesando asf la muestra biologica a partir del sujeto humano y/o determinando el estado de infeccion por Hepatitis B del sujeto.
7. El ensayo de la reivindicacion 6, en el que el positivo y negativo se determinan mediante comparacion con respecto a un control de calibracion, positivo se define como mas alto con respecto al control de calibracion, y negativo se define como mas bajo con respecto al control de calibracion.
8. El ensayo de la reivindicacion 6 o 7, que comprende ademas
(a) determinar que el sujeto sufre de infeccion aguda por Hepatitis B cuando el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (iii); y/o
(b) determinar que el sujeto ha sido inmunizado contra la infeccion por Hepatitis B cuando el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (i), pero no en perlas (ii) o (iii); y/o
(c) determinar que el sujeto ha si expuesto a Hepatitis B cuanto el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (ii) pero no en perlas (i) o (iii).
(d) determinar que el sujeto ha tenido una infeccion por Hepatitis B en el pasado cuando el marcador detectable (iv) resulta positivo en perlas (i) y (ii) pero no en perlas (iii).
9. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que los marcadores detectables (i), (ii), y (iii) son combinaciones distintivas de fluorofonos.
10. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en el que el marcador detectable (iv) se selecciona a partir de ficoeritrina e isotiocianato de fluorescema.
11. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que las perlas (i), (ii), y (iii) responden magneticamente.
12. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-11, en el que la etapa (b) comprende lavar las perlas.
13. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-12, en el que la etapa (d) comprende lavar las perlas 14. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-13, en el que la etapa (f) comprende lavar las perlas 15. El ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 6-14, en el que la muestra biologica es sangre, un componente de la sangre, o sangre procesada.
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