ES2711800T3 - Implante anisotrópico y su método de producción - Google Patents

Abstract

Un método de fabricación de la matriz acelular, estéril, sustancialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada obtenida a partir de tejido animal y que contiene predominantemente colágeno, cuyas fibrillas están en una disposición estructural similar a como estaban en el tejido original, y concebida como un implante temporal en medicina humana o veterinaria, caracterizada por procesar el tejido animal usando un método que comprende las siguientes etapas: a. eliminación de células por la acción de enzimas, surfactantes, ácidos, álcalis, soluciones acuosas hipotónicas o sus combinaciones; b. deshidratación de la matriz acelular mediante eliminación de una cantidad significativa de agua, durante la cual la matriz se mantiene bajo tensión mecánica en una o más direcciones seleccionadas; c. desnaturalización parcial de las estructuras de colágeno en la matriz acelular mediante la acción de un aumento de temperatura, compuestos orgánicos, cationes polivalentes o una combinación de dichas acciones, mientras que la matriz se mantiene bajo tensión mecánica en una o más direcciones seleccionadas; o las dimensiones de la matriz en las direcciones seleccionadas se mantienen para ser esencialmente constantes; d. esterilización de la matriz esencialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada usando radiación ionizante.

Description

DESCRIPCION

Implante anisotropico y su metodo de produccion

Campo de la invencion

La invencion se refiere a un metodo de produccion de un implante acelular deshidratado esteril (trasplante) que, durante su rehidratacion por medio de agua o fluidos corporales, exhibe expansion anisotropica. Un producto de este tipo puede denominarse o bien un implante o bien un trasplante, dependiendo del contexto y de la costumbre en diversas areas de especializacion. En la presente solicitud, se usan ambos terminos segun el contexto; sin embargo, es importante tener en cuenta que son mutuamente intercambiables. Se esteriliza el implante usando radiacion mientras esta en un estado esencialmente deshidratado, preferiblemente usando electrones acelerados. El implante puede derivar de diversos tejidos animales, especialmente de tejidos de mairnferos, tales como, por ejemplo, tejidos humanos o porcinos, tales como, por ejemplo, piel, placenta, pericardio, peritoneo, pared intestinal, tendon, vaso sangumeo, etc. El implante, tal como se produce con el metodo segun la invencion, es adecuado para uso en medicina humana y veterinaria, por ejemplo como vendaje temporal de heridas y quemaduras, para la reparacion, sustitucion o regeneracion de tejidos y como sustrato para cultivo celular en laboratorio.

Antecedentes de la invencion

Desde hace mucho tiempo, ha sido habitual el trasplante de tejidos y organos para una serie de indicaciones. Una de las tecnicas bien establecidas es el autotrasplante, donde se usa el propio tejido del paciente (p. ej., piel, hueso, vena o tejido graso) de una localizacion para reemplazar el tejido en otro lugar. No siempre es esto posible; sin embargo, y en una serie de situaciones, el paciente necesita recibir un trasplante (p. ej., corazon, rinon, retina y otros) de un donante adecuado. Los principales problemas de estos asf llamados alotrasplantes son el rechazo de tejidos y, cada vez mas, la falta de donantes debido a la altamente creciente demanda. Por lo tanto, se hace un esfuerzo por sustituir los alotrasplantes naturales de diversas formas. Por ejemplo, es posible cultivar autotrasplantes de las celulas del paciente usando ingenieffa de tejidos. Estos autotrasplantes superan facilmente la barrera de la inmunidad; sin embargo, tienen ciertos inconvenientes: la necesidad de recoger tejido del paciente (biopsia), cultivo laborioso y caro y un prolongado intervalo de tiempo entre la biopsia y la aplicacion del trasplante. Se usa habitualmente esta tecnica cuando se reemplaza piel en el caso de quemaduras de tercer grado, mientras que, en el caso de otros tejidos y organos, esta tecnica es, en este punto, experimental. Por ejemplo, las Patentes Estadounidenses 6.878.383, 6.432.710, 5.858.390, 5.665.372 y 5.660.850 (Boss, Jr. et al.) describen tecnicas y medios para la implantacion de fibroblastos autologos con objeto de producir hiperplasia del tejido del paciente.

Se ha usado autotrasplante usando una capa de piel epidermica creada artificialmente en pacientes con quemaduras durante una serie de anos. En el ano 1979, Rheinwald y Green (Green H. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979; 76: 5665-8.) desarrollaron un metodo para el cultivo seriado de queratinocitos humanos para autotrasplante. Desde 1981, se han usado injertos epidermicos cultivados autologos en los EE.UU. para la curacion de quemaduras extensas (O'Connor NE. et al., Lancet 1981; 1: 75-8). El inconveniente del metodo es el prolongado intervalo de tiempo necesario para el cultivo de queratinocitos autologos, ademas de la fragilidad del material cultivado, la diffcil manipulacion, la elevada sensibilidad a los antibioticos, a la infeccion y a otros factores de estres y la diffcil evaluacion de la asimilacion del injerto (Navsaria HA. et al., Trends in Biotechnology 1995; 15: 91-100). Se describen, por lo tanto, diversas mejoras del metodo, tales como:

La Patente US 4.299.816 (M.G. Eisinger) describe la curacion modificada de quemaduras usando injertos de celulas epidermicas artificialmente cultivadas. La Patente US 5.716.411 (Orgill et al.) describe un metodo de curacion que lleva a regeneracion de la piel para quemaduras y heridas, usando una cubierta biosintetica consistente en una matriz de colageno y glicoaminoglicanos, que permite la penetracion de celulas y vasos sangumeos del tejido en curacion, por una parte, y la aplicacion de laminas de queratinocitos autologos, por otra. WO 2006/107188 A1 (L. Lurvink et al.) describe una pelfcuia polipepffdica no porosa adecuada para cultivo celular y su posterior uso para la curacion de heridas y quemaduras. Se puede encontrar una revision reciente de estos metodos en TISSUE ENGINEERING Vol.

12, N° 9, 2006 Update on Tissue-Engineered Biological Dressings, M. Ehrenreich y Z. Ruszczak.

No solo los injertos epidermicos cultivados autologos, sino tambien los alogenicos, tienen un elevado efecto curativo en quemaduras dermicas profundas, sitios de biopsia, ulceras crurales y otros defectos de la piel (Bolivar-Flores J. et al., Burns 1990; 16: 3-8.; Matouskova E. et al., Burns 1993; 19: 118-23.4,5).

El exito del procedimiento depende tambien de la seleccion de celulas donantes. P. Brychta et al. describen en la Patente checa N° CZ 282711 un alotrasplante epidermico cultivado procedente de celulas embrionarias o fetales para la curacion de defectos y heridas de la piel, esencialmente segun el procedimiento de Reinwald y Green, pero usando celulas alogenicas, que son bien recibidas por el paciente.

Tambien se realiza un esfuerzo para aumentar la resistencia mecanica y la viabilidad de los queratinocitos (p. ej., por cultivo sobre un sustrato sintetico) y para desarrollar tecnicas que permitan la asimilacion permanente del tejido cultivado en quemaduras de tercer grado. Un ejemplo de sustrato usado para el cultivo de queratinocitos es una membrana basada en acido hialuronico (Laser skin, FIBIA, Italia), diversos tipos de matrices de colageno combinadas con fibroblastos o tambien diversos sustratos hechos de polfmeros sinteticos (p. ej., pHEMA experimental en la Clinic of Burn Medicine, FNKV en Praga 10). Para rellenar quemaduras profundas, se desarrollan sustitutos dermicos, tales como Integra (colageno combinado con glucosa aminoglicano condroitin-6-sulfato y fibroblastos alogenicos; Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, New Jersey, EE.UU.), Dermagraft (poligalactina sembrada con fibroblastos alogenicos dermicos; Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA, EE.UU.), o la ya mencionada AlloDerm - dermis alogenica congelada (LifeCell Corporation, The Woodlands, TX, EE.UU.). Sin embargo, todos estos sustitutos dermicos deben estar cubiertos por un delgado injerto dermoepidermico autologo durante la segunda etapa (despues de 2-3 semanas de vascularizacion); el cubrimiento de quemaduras de tercer grado usando alogenico cultivado no ha tenido exito hasta la fecha.

Otra solucion a los problemas de alotrasplante es el uso de tejidos u organos de otras especies diferentes a la humana, el asf llamado xenotrasplante. En este caso, es tambien necesario vencer el rechazo de tejido extrano por el sistema inmunitario, y es tambien necesario prevenir la posibilidad de contaminacion por microbios, germenes y virus causantes de enfermedad del donante al paciente. Se dirige una gran cantidad de atencion a prevenir la posibilidad de transmision de priones de los animales al hombre (p. ej., la famosa “enfermedad de las vacas locas”). Por otro lado, la ventaja reside en el hecho de que los tejidos y organos animales son mucho mas accesibles que los humanos.

Un ejemplo bien conocido de xenotrasplante son las valvulas cardfacas porcinas, usadas para reemplazar valvulas cardfacas humanas. Se entrecruzan las valvulas porcinas usando glutaraldetudo (p. ej., Patente US 4.076.468, Liotta et al.; Patente US 4.247.292, W.A. Angell), que lleva a varios resultados deseables: se suprime la reaccion de rechazo del organismo, aumenta la estabilidad hidrolttica y enzimatica del xenotrasplante y, ademas, el glutaraldehfdo actua como agente esterilizante qrnmico.

Uno de los inconvenientes de este metodo es el cambio de las propiedades mecanicas del tejido y, en algunos casos, incluso una liberacion a largo plazo de glutaraldehfdo toxico por los polialdehfdos insolubles, que pueden formarse durante el proceso y no pueden eliminarse por simple extraccion.

Se usa una porcion significativa de trasplantes en forma de asf llamadas "cubiertas biologicas" para el vendaje de heridas y el soporte curativo resultante. Dependiendo de la naturaleza de la herida y de otras circunstancias, se usan cubiertas biologicas, sinteticas y semisinteticas. Se considera generalmente que las cubiertas biologicas son las mas efectivas. Una cubierta biologica tfpica para la curacion de, por ejemplo, quemaduras es la piel de mairnferos, pero especialmente la piel humana (alotrasplante) o la piel de cerdo (xenotrasplante) en diversos grosores, recogida de individuos muertos y guardada fresca a temperaturas fnas durante un corto penodo de tiempo, o durante incluso un penodo de tiempo mayor cuando se congela. Se obtuvo mucha experiencia gracias a los xenotrasplantes de piel de cerdo.

Los vendajes de heridas "vivos" (es decir, alotrasplantes o xenotrasplantes no procesados que contienen todos los componentes de la piel viva) son muy efectivos, pero su inconveniente reside en su limitada vida util y en la posibilidad de transferencia de infeccion. Se sugirieron determinadas soluciones en una serie de patentes, p. ej., los productos AlloDerm y XenoDerm de la LifeCell Corp., Texas, EE.UU., basadas en un metodo de criopreservacion segun la patente US 4.865.871 (S. Livesey et al.). Este metodo permite congelar y posiblemente liofilizar tejidos y celulas sin danar su estructura o su funcion.

Otro metodo es el almacenamiento de piel de cerdo en glicerina en presencia de nitrato de plata a temperatura ambiente, como se describe en la solicitud de patente CN 19951010722 (Kai Cao).

Se describe la esterilizacion de piel de cerdo (despues de limpiarla y procesarla usando hidrocarburos) en una solucion de perclorato de sodio o peroxido de hidrogeno usando radiacion gamma de una fuente de Co60 en una solicitud de patente, TW 199001117733 (Chang Hong Chi et al.).

Se describen otros metodos para la esterilizacion de piel de cerdo para uso medico en la solicitud de patente CN 19921005926 (Guohui Li et al.), que describe la esterilizacion en estado humedo usando una fuente de radiacion de cobalto, con posterior almacenamiento a temperatura fna, o la liofilizacion con posterior almacenamiento en glicerina a temperatura ambiente.

Tambien se recomienda la conservacion usando glicerina para la placenta humana (amnios) usada para alotrasplantes ^{por el Deutches Institut fur Zell- und Gewebeersatz gGmbH (Delitzcher St 141, 04129 Leipzig,} SrN).

El Documento UA 12391U (E.Y.Fistal et al.) describe la curacion de heridas necroticas tras quemaduras profundas usando piel de cerdo liofilizada.

Tambien se describen vendajes biologicos de heridas basados en colageno para la curacion de heridas, incluyendo quemaduras, en los documentos RU 2185179 y RU 2124354.

Se puede atenuar el problema de la esterilidad y de la vida util mediante la eliminacion de celulas del trasplante, que, por lo tanto, se volvera parcial o totalmente acelular. Se puede encontrar un esfuerzo por resolver este problema en el documento de patente N° CN 20031124306 (Hu Jie), que describe el xenotrasplante como un vendaje biologico para heridas y quemaduras. Se puede desproveer parcialmente al tejido animal, tal como piel, pared del intestino delgado o placenta, de celulas segun la invencion anterior usando agua y una solucion de detergente, y se hace esto sobre la superficie que estara en contacto con la herida. La estructura celular de otras partes, tales como la epidermis, permanecera preservada. Se entrecruzara luego el tejido usando un agente apropiado, tal como glutaraldetudo, se lavara y se almacenara en estado humedo a una temperatura inferior a 4°C.

Otro documento, CN 20051126108 (Dong Qun Lin), describe el modo de eliminacion de celulas de la piel de mairnferos por la accion repetida de una solucion de NaOH 2N a 5N, seguido de lavado en una solucion detergente y en agua.

Otro documento, CN20041022506 (Dai Weihua et al.), describe el modo de preparacion de una dermis acelular biodegradable usando la accion combinada de enzimas, alcalis y otros agentes qmmicos.

La solicitud publicada US 20050186286 (Yoshihiro Takami) describe el metodo de eliminacion de celulas de piel de marnffero (p. ej., humana o de cerdo) usando una accion combinada de enzimas proteoltticas y detergentes, mientras que se designa la piel asf preparada para uso como alotrasplante o xenotrasplante para la curacion de quemaduras. Se realiza la esterilizacion por inmersion posterior de la dermis acelular en una solucion de azida.

Una matriz xenodermica acelular similar es OASIS, producida por AelsLife, que proporciona un marco para una migracion tridimensional de celulas. Esta cubierta biologica de heridas, que segun el fabricante contiene importantes compuestos no celulares y estructuras presentes en la piel viva, se produce por liofilizacion de dermis porcina despues de eliminar las celulas usando enzimas y detergentes.

El vendaje biosintetico E*Z DERM, del fabricante Brennen Medical Inc., usa un xenoinjerto de dermis porcina tratado por entrecruzamiento de colageno usando aldetudos.

El documento de patente JP19900247300 (Koide Mikio) describe una cubierta biologica que utiliza una matriz de colageno desnaturalizada, formada a partir de dermis bovina acelular por entrecruzamiento y desnaturalizacion inducida por calor de las estructuras de colageno. Esta estructura es, segun la citada invencion, apropiada para siembra usando queratinocitos autologos para una superior eficacia de curacion.

Otros esfuerzos para resolver el problema fueron diversos sustitutos de piel semisinteticos, por ejemplo, un armazon procedente de un colageno bovino reconstituido, sembrado con fibroblastos humanos (es decir, el vendaje INTEGRA antes mencionado).

Otro ejemplo de un trasplante combinado es la "piel recombinada: (RK) segun la Patente CZ N° 281176. Se prepara RK usando cultivo de queratinocitos humanos sobre una dermis porcina libre de celulas. Burns 1993; 19: 118-23). Se usa la dermis desecada para el cultivo de queratinocitos humanos y, despues del cultivo, la dermis, con una capa de queratinocitos (o RK), se desprende de la placa de Petri y se aplica a la herida. Se aplica RK con los queratinocitos en contacto con la herida y la dermis en la parte exterior ("boca abajo"). En comparacion con injertos epidermicos simples, la RK muestra la ventaja de una durabilidad superior, del desprendimiento de la placa de Petri sin accion enzimatica y de una facil manipulacion. Una ventaja en comparacion con los cultivos de queratinocitos sobre sustratos sinteticos y geles basados en colageno es que la consistencia de la RK es similar a la de la piel, y esto da como resultado una excelente adhesion a la herida y un efecto hemostatico. Es posible producir RK usando queratinocitos tanto autologos como alogenicos. Se cultivan los queratinocitos sobre el lado epidermico de la epidermis, es decir, donde la membrana basal divide la dermis de la epidermis. El inventor de la invencion antes citada menciona que se puede esterilizar la dermis libre de celulas usando radiacion gamma para una mejor vida util a temperatura ambiente y una superior seguridad. Un inconveniente de la dermis asf esterilizada con radiacion gamma es, sin embargo, su degradacion parcial y perdida de durabilidad en estado humedo.

Se describe un vendaje biologico combinado para quemaduras similar en la solicitud de patente TW20000118374 (Yang Mei-Ru et al.), donde se combinan fibroblastos humanos vivos en una dermis porcina acelular con queratinocitos humanos cultivados sobre el lado de la membrana basal de una matriz acelular.

Un problema general, que evita una aceptacion significativa del uso de estos materiales biologicos, es el hecho de que es imposible usar un procedimiento de esterilizacion rutinario y fiable. Otro problema espedfico que evita un uso mas amplio de los materiales antes mencionados es su limitada o exigente vida util, y finalmente, pero no menos importante, su coste de fabricacion. Tambien exhiben un problema diffcil los materiales deshidratados que se hinchan isotropicamente durante la rehidratacion, es decir, el aumento (relativamente) igual de todas las dimensiones del trasplante tras la rehidratacion. La presente invencion aporta una solucion a estos problemas.

Compendio de la invencion

La materia objeto de la invencion es un metodo de fabricacion de una matriz acelular, esteril, sustancialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada, definiendose dicho metodo en las Reivindicaciones 1-3.

Los inventores vieron que la presencia de celulas alogenicas o autogenicas trasplantadas no siempre es necesaria para la curacion de heridas y la regeneracion de tejidos, en la medida en que este presente un material apropiado que estimule, soporte y dirija la replicacion, diferenciacion y migracion de las propias celulas del paciente. Este material es una matriz de colageno acelular especialmente procesada obtenida a partir de un material biologico autologo, alogenico o incluso xenogenico. La matriz consiste mayoritariamente en colageno y protemas relacionadas, tales como elastina, fibrina o queratina. Estos componentes de la matriz y sus concentraciones cambian dependiendo del origen del tejido y de su metodo de procesamiento, y por razones de simplicidad se les denominara "colageno", ya que en todos los casos el colageno es el principal componente de la matriz. Ademas de protemas ("colageno"), la matriz tambien contiene un cierto nivel de lfpidos y lipoprotemas (hasta un 20% en peso), una cierta cantidad de componentes azucarados (polisacaridos, glicoprotemas y glicoproteoglicanos) y sal. El contenido en protemas es tipicamente de entre el 70% (en peso) y el 95% (en peso), preferiblemente de entre el 80% y el 90% (en peso).

La matriz acelular se caracteriza, a saber, por estar esencialmente deshidratada y consistir principalmente en colageno, cuyas fibrillas exhiben una organizacion estructural similar a la forma en que estaban en el tejido original, pero ademas tambien estan parcialmente desnaturalizadas y, al menos en estado deshidratado, se orientan preferentemente en una cierta direccion o direcciones seleccionadas. La desnaturalizacion parcial es beneficiosa, ya que aumenta la resistencia a la biodegradacion, de tal forma que las fibrillas proporcionan mas tiempo para la migracion y union de las celulas del huesped durante la curacion. Una degradacion del implante excesivamente rapida puede dejar atras un foco inflamatorio, que curara con dificultad y puede llevar a cicatrizacion. La desnaturalizacion parcial de las fibrillas de colageno tambien aumenta la resistencia mecanica en estado humedo.

La orientacion de las fibrillas de colageno tambien da al implante mayor resistencia en la direccion escogida y dirige la migracion y diseminacion de celulas a lo largo de la superficie del implante, mas que su penetracion en el implante. Esto esta ademas respaldado por el hecho de que la matriz acelular, segun esta invencion, tiene una baja porosidad en estado deshidratado en comparacion con las cubiertas biologicas de heridas liofilizadas, cuya porosidad es normalmente superior al 75% (en volumen). Segun la invencion, la porosidad del implante es inferior al 70% (en volumen), preferiblemente inferior al 60% (en volumen), e incluso mas preferiblemente inferior al 50% (en volumen). Una baja porosidad y una ventajosa orientacion de fibrillas son importantes especialmente para implantes usados como cubiertas biologicas de heridas, por ejemplo, quemaduras, que se supone que se separan espontaneamente una vez se ha completado la curacion. La regeneracion de la capa epidermica requiere la migracion de queratinocitos desde el borde de la herida hasta las areas de curacion, siendo estas la interfaz entre la herida y la superficie del implante. La infiltracion de celulas en la estructura del implante no sena ventajosa, ya que podna dar lugar a la union de nuevo del trasplante a la herida. Cuando el trasplante es subcutaneo, por ejemplo, la migracion de celulas a lo largo de su superficie dara como resultado la formacion de un fino quiste fibroso, lo cual es indeseable en muchos casos.

La conservacion de la orientacion del colageno en estado deshidratado tambien disminuye la rigidez tangencial del implante (tangencial a la orientacion de las fibrillas); por lo tanto, incluso un implante deshidratado es mas facil de doblar y menos fragil que uno anisotropico similar. Esto tiene una importancia practica significativa, ya que el implante deshidratado no necesita ablandadores, y no se forman en el grietas y microrrupturas, que podnan dar como resultado una infiltracion incontrolada de celulas en el implante, su desintegracion y posible calcificacion.

Otro importante resultado de la organizacion anisotropica de las fibrillas de colageno es el hinchamiento anisotropico durante la rehidratacion del implante. Segun la invencion, el implante se expande a diversas velocidades en diversas direcciones durante la rehidratacion. Por ejemplo, si las estructuras del colageno se orientan preferentemente en la direccion mas larga (p. ej., cuando se usa un tendon), entonces la mayona de la expansion por hidratacion se exhibira como un aumento del diametro del implante, mientras que la longitud cambiara solo un poco, o puede permanecer igual, aumentar ligeramente o incluso disminuir, segun la relacion entre anisotropfa estructural e hinchamiento. En caso de un implante superficial, tal como una cubierta de herida por quemadura, se puede seleccionar la orientacion de las fibrillas para que discurran preferiblemente en una direccion perpendicular a la superficie del plano principal del implante. En este caso, la expansion por hidratacion se expresara especialmente o solo como el aumento de grosor, mientras que la impronta permanecera esencialmente inalterada. La anisotropfa del hinchamiento tiene, aparte de las ventajas antes mencionadas, otra ventaja practica: el cirujano puede ajustar mejor la forma y el tamano del implante a los requerimientos del paciente individual. Por ejemplo, si se ha de cubrir una herida de una forma particular, se puede recortar simplemente un implante de un tamano y una forma correspondientes del implante deshidratado, y permanecera inalterado tras la hidratacion. En caso de implantes deshidratados isotropicos, las dimensiones deshidratadas debenan ser relativamente menores con objeto de compensar el efecto de la expansion por hidratacion. Otra ventaja puede ser tambien el modo en que el implante deshidratado, fijado al tejido, mantiene su forma tras la hidratacion y, por lo tanto, el tejido circundante retiene la tension que selecciono el cirujano durante la cirugfa. En caso de un implante isotropico, el tejido circundante perdena su tension original como resultado de la expansion por hidratacion del implante.

Significativo es tambien el hecho de que la anisotropfa de la expansion permita una diferenciacion simple del implante segun esta invencion con respecto a otros implantes de similar origen y proposito.

Se puede expresar la anisotropfa del hinchamiento como una razon entre coeficientes de expansion lineal en tres dimensiones seleccionadas. Por ejemplo, una direccion seleccionada a lo largo del eje "z" puede ser el grosor t y su coeficiente de expansion lineal Cz = (thidrat.)/(tdeshidrat.). De forma similar, podemos seleccionar la longitud como J como la dimension en la direccion del eje "x" y definir el coeficiente de expansion lineal como Cx = (lhidrat.)/Qdeshidrat.u). Y finalmente, como dimension en la direccion del eje "y" podemos seleccionar la anchura w y definir el coeficiente de expansion lineal Cy = (whidrat.)/(wdeshidrat ), donde el subrndice "hidrat." significa el tamano (dimension) tras la hidratacion y el subrndice "deshidrat." significa el tamano (dimension) en el estado deshidratado original. En caso de un material deshidratado isotropico, encontraremos siempre que Cz /Cy = Cx/ Cz = Cy/Cz = 1, sin importar cuales sean los valores de Cx, Cy y Cz. La expansion anisotropica durante la hidratacion se distingue por el hecho de que al menos una de las razones Cx, Cy y Cz tiene un valor diferente de 1, y al menos uno de los coeficientes de expansion lineal Cx, Cy y Cz tiene un valor inferior a los otros y su valor puede incluso ser inferior a 1. Al menos uno de los coeficientes de expansion lineal Cx, Cy y Cz tiene, por el contrario, un valor significativamente superior a los otros, normalmente en al menos un 10%, preferiblemente en mas de un 30%. Por ejemplo, los coeficientes de expansion lineal Cx y Cy pueden tener un valor inferior a 1, mientras que Cz tiene un valor superior a 1,2 y preferiblemente superior a 1,5.

Las fibrillas de colageno de los implantes deshidratados anisotropicos se orientan preferentemente en la direccion del coeficiente de expansion lineal mas bajo, o, segun sea el caso, en un plano perpendicular a la direccion, en donde el valor del coeficiente de expansion es el mas alto.

Las fibrillas de colageno pueden estar preferentemente orientadas en una cierta direccion incluso en un estado totalmente hidratado. Se puede conseguir esta orientacion por desnaturalizacion parcial del colageno en estado orientado, o por entrecruzamiento del colageno (que es tambien una forma de desnaturalizacion). La orientacion de las fibrillas del colageno permanecera entonces esencialmente mantenida incluso tras la hidratacion del implante. Se puede usar esta orientacion con ventaja para la direccion de la migracion y de la proliferacion de celulas en una cierta direccion, lo cual es ventajoso especialmente en la curacion de quemaduras.

Se puede conseguir el entrecruzamiento del colageno usando diversos metodos bien conocidos, por ejemplo, la accion de aldehndos, tales como, por ejemplo, formaldehndo o glutaraldehndo, o cationes polivalentes, tales como, por ejemplo, Ca2+, Mg2+, Al3+ o Cr3+. El entrecruzamiento reducira aun mas el hinchamiento y aumentara la fuerza y la resistencia hidrolftica de la matriz de colageno. Este entrecruzamiento ionico es, en el estado implantado, frecuentemente inestable y la reduccion gradual de la densidad de entrecruzamiento dara entonces lugar a un aumento gradual en el hinchamiento y al cambio de los factores de expansion lineal y sus mutuas proporciones. La cinetica de estos procesos es controlable y, por lo tanto, se pueden usar estos procesos, por ejemplo, para producir presion dirigida o tension sobre los tejidos en curacion. Las matrices acelulares son fuertemente hidrofflicas y su volumen aumentara con la hidratacion. Se define mas frecuentemente la hidratacion como una fraccion de peso de agua en estado hidratado, o como contenido en agua en % en peso. El contenido en agua en el implante totalmente hidratado es superior al 33% (en peso) y preferiblemente superior al 50% (en peso). Se define el coeficiente de expansion de volumen como: Cv = Cx * Cy* Cz = (volumen hidratado)/(volumen deshidratado) > 1.

Las matrices acelulares tienen Cv > 1,1, preferiblemente Cv > 1,5. En esto difieren, en principio, de estructuras porosas sustancialmente hidrofobicas, que pueden formarse, por ejemplo, por entrecruzamiento covalente de tejidos con la ayuda de, por ejemplo, aldehndos, o pueden formarse a partir de polfmeros sinteticos, tales como, por ejemplo, poliuretanos. En ese caso, durante la hidratacion, el agua llena los poros y aumenta la masa del implante, pero su volumen no aumenta apreciablemente y su Cv esta proximo o es esencialmente igual a 1.

Por la informacion anteriormente expuesta, se puede concluir que la materia objeto de la invencion es mas especialmente un metodo de produccion de una matriz acelular, esteril, esencialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada, obtenida a partir de un tejido animal y que contiene mayormente colageno, cuyas fibrillas estan en una disposicion estructural similar a como estaban en el tejido original, concebida como un implante temporal en medicina humana o veterinaria, y cuya matriz exhibe cambios anisotropicos de sus dimensiones durante la hidratacion.

Durante la hidratacion de la matriz acelular, cuando se producen los cambios anisotropicos de las dimensiones de la matriz, las dos dimensiones mayores permanecen esencialmente constantes o se hacen mas pequenas, mientras que la dimension mas pequena aumenta junto con el aumento de volumen de la matriz.

El implante temporal tiene ventajosamente una forma esencialmente plana, cuya impronta se define por sus dos dimensiones mayores, mientras que su grosor se define por su dimension mas pequena.

Sus dos dimensiones mas pequenas aumentaran ventajosamente, mientras que su dimension mayor permanece esencialmente constante o disminuye de tamano.

El implante temporal tiene ventajosamente una forma esencialmente larga, tal como un prisma o un cilindro, cuyo diametro se define por sus dos dimensiones mas pequenas, tales como, por ejemplo, su diametro, mientras que su longitud o su altura se definen por su dimension mayor.

Una matriz ventajosa en un estado deshidratado tiene una porosidad inferior al 70% (en volumen), ventajosamente inferior al 60% (en volumen) y lo mas ventajosamente inferior al 50% (en volumen).

La matriz acelular ventajosamente consiste en fibrillas de colageno que estan, al menos en estado deshidratado, preferentemente orientadas en las direcciones en las que el coeficiente de expansion lineal de hidratacion tiene el valor mas bajo, y basicamente perpendicularmente a la direccion en la que el coeficiente de expansion lineal tiene el valor mas alto.

La matriz acelular, en un estado deshidratado, tiene ventajosamente un contenido acuoso inferior al 20% (en peso), mas ventajosamente inferior al 10% (en peso) y lo mas ventajosamente inferior al 5% (en peso).

En ciertas realizaciones ventajosas, la matriz puede contener tambien aditivos ablandadores, conservantes o bactericidas. Los aditivos bactericidas ventajosos contienen plata, preferiblemente en estado coloidal e incluso mas preferiblemente como un complejo de plata-protema. Los aditivos ablandadores o conservantes ventajosos contienen compuestos miscibles con agua, tales como DMSO o compuestos polihidroxi seleccionados de las familias del glicol o la glicerina o sus derivados, trietanolamina y sacaridos.

Una matriz acelular ventajosa es capaz de expandir su volumen en contacto con lfquidos acuosos, con un factor de expansion de volumen mayor de 1,1, preferiblemente mayor de 1,5. Ademas, una matriz acelular ventajosa, una vez expuesta a soluciones acuosas adecuadas, es capaz de asumir una forma en la que contiene mas de un 33% de agua (en peso), preferiblemente mas de un 50% de agua (en peso).

Una matriz acelular ventajosa tiene el coeficiente de expansion lineal mas alto un 10% superior, preferiblemente un 30% superior, al coeficiente de expansion lineal mas bajo. Son preferibles las matrices acelulares cuyo coeficiente de expansion lineal mas alto tiene un valor mayor de 1,2, preferiblemente mayor de 1,5, mientras que el coeficiente de expansion lineal mas bajo tiene un valor menor de 1,1, preferiblemente menor de 1,05.

Los solidos (materia seca) de la matriz acelular consisten predominantemente en protemas, donde la protema preferida ventajosamente contiene predominantemente colageno. Incluso mas preferiblemente, los solidos (materia seca) de una matriz acelular contienen de un 70% (en peso) a un 95% (en peso), ventajosamente de un 80% (en peso) a un 90% (en peso) de protemas de tipo colageno. Ventajosamente, los solidos (materia seca) de la matriz contienen, aparte de protemas, una fraccion menor de compuestos lipfdicos, incluyendo lipoprotemas y fosfolfpidos.

La matriz acelular es ventajosa cuando su fraccion de protema esta al menos parcialmente desnaturalizada. Al menos la fraccion de protema de la matriz acelular esta entrecruzada como resultado de una reaccion con aldehfdos o cationes polivalentes.

Una matriz acelular ventajosa deriva de un mairnfero, preferiblemente de un cerdo.

Un tejido animal ventajoso para la matriz acelular es la piel, la placenta, el pericardio, la duramadre, el intestino, el tendon o el cartflago.

Se usa ventajosamente el implante temporal formado por la matriz acelular producida en la presente invencion como cubierta de heridas, lo mas ventajosamente como cubierta de quemaduras.

Otra realizacion ventajosa de la matriz acelular es una que tambien contiene celulas de mamffero cultivadas. Preferiblemente, el mam^era es un cerdo y las celulas de mamffero cultivadas son queratinocitos humanos autologos o alogenicos.

Otra realizacion ventajosa de la matriz acelular es una que se biodegradara espontaneamente despues de cumplir su funcion.

El metodo de fabricacion segun la invencion, tal como se ha descrito anteriormente, incluye varias etapas basicas:

1) Recogida del implante, tal como de piel porcina o de tendon humano. Se realiza esta etapa basicamente del mismo modo que en el caso de otras, hasta ahora habituales, recogidas, pero con la importante ventaja de que, segun la invencion, la recogida del implante no es tan exigente en cuanto a las condiciones de transporte y posterior procesamiento rapido como sena en el caso de implantes que contienen celulas. Las estructuras de colageno, que se convertiran en el implante final, son mas estables que las estructuras celulares.

2) Eliminacion de celulas. Segun la invencion, se pueden usar diversos metodos de eliminacion de celulas para este implante, incluyendo metodos descritos en el estado actual de la tecnologfa. Estos incluyen la eliminacion de celulas mediante surfactantes, tales como detergentes, compuestos qmmicos tales como acidos y alcalis, o enzimas, como se describe en posteriores solicitudes de patente y documentos, que se incluyen en la presente solicitud: CN200310124306 (Hu Jie), CN20051126108 (Dong Qun Lin), CN20041022506 20040512 (Dai Weihua et al.), US 2005 0186286 A1 (Yoshihiro Takami), JP19900247300 (Koide Mikio) y Patente CZ N° 281176 (E. Matouskova).

Segun la invencion, es ventajoso un metodo en dos etapas, donde, en la primera etapa, se expone el tejido recogido a una enzima proteolttica adecuada, tal como tripsina o papama, y, en la segunda etapa, se expone el tejido, incluyendo potenciales restos de celulas, a una solucion hipotonica fuerte, preferentemente a un exceso de agua destilada o desionizada. El agua desionizada eliminara el resto de celulas exponiendolas a choque osmotico, que provocara una ruptura de sus membranas. Esta segunda etapa de eliminacion de celulas se produce junto con una extraccion en multiples etapas del resto de enzima (tal como tripsina) y otros compuestos. Junto con la eliminacion del resto de enzima, tambien se eliminan los peptidos solubles, asf como polisacaridos, glicoprotemas y otros compuestos con supuesta actividad biologica. La eliminacion de compuestos hidrosolubles es incluso mas efectiva, ya que la solucion hipotonica causa un gran hinchamiento del tejido, mejorando asf la difusion de los extractos. Encontramos, sin embargo, que incluso una extraccion exhaustiva no elimina estos compuestos hidrosolubles por completo, y se pueden detectar nuevos compuestos organicos usando espectroscopia UV al final de cada etapa. Esto muestra que se siguen liberando nuevos compuestos, tales como polipeptidos y glicoprotemas, desde la estructura del colageno; por lo tanto, se sigue preservando un cierto nivel de actividad biologica.

3. Deshidratacion. Se realiza la deshidratacion por eliminacion de al menos la fraccion sustancial de agua, o bien usando evaporacion del agua presente en la estructura acelular, o bien mediante su extraccion usando un solvente adecuado, tal como etanol. "Fraccion sustancial de agua" significa aqu la asf llamada "agua libre", que es la fraccion de agua cuya estructura y propiedades termodinamicas son enteramente como las del agua lfquida (por ejemplo, punto de fusion, presion de vapor o capacidad termica). Esta es normalmente la mayor parte del agua en el tejido, excepto por el ultimo 20% mas o menos en peso, que consiste en agua mas o menos unida a la matriz de colageno o a otros componentes hidrofflicos del implante. Esta asf llamada "agua unida" tiene otras propiedades termodinamicas distintas a las del agua libre y funciona como plastificante del colageno. Es diffcil eliminar por completo el agua unida. El "implante deshidratado" pretende ser un implante que no contiene agua libre, y que tiene un contenido restante en humedad por debajo del 20% (en peso), preferiblemente por debajo del 10% (en peso). Para una mayor vida util del producto, es especialmente ventajoso mantener el contenido en humedad del producto por debajo del 5% (en peso). Si se realiza una extraccion usando un solvente miscible en agua, esta etapa ya conduce a una desnaturalizacion parcial simultanea del colageno. Con objeto de que la desnaturalizacion parcial sea efectiva, hacia el final de la extraccion del agua el solvente debena contener mas del 50% del compuesto organico en peso, preferiblemente mas del 70% en peso. Se puede realizar la extraccion de agua en varias etapas, con una concentracion gradualmente creciente del solvente organico. Son solventes adecuados los alcoholes alifaticos inferiores Ci a C4, las cetonas alifaticas inferiores tales como acetona, eteres tales como eter dimetflico, eter dietflico, dioxano o tetrahidrofurano, glicoles tales como etilenglicol, 1,2-propilenglicol, dietilenglicol o trietilenglicol, etc. El mas adecuado es el alcohol etflico, que no solo es un agente desnaturalizante efectivo para el colageno y otras protemas, sino que tambien es un conservante y un agente esterilizante, efectivo incluso contra, por ejemplo, retrovirus. Su ventaja es tambien su relativamente baja toxicidad, su disponibilidad y la posibilidad de eliminar por completo sus restos usando evaporacion. Si el solvente elegido no es volatil, se eliminara usando extraccion mediante un solvente volatil, tal como metanol, etanol, acetona o agua.

4. Desnaturalizacion parcial del colageno. Se realiza la desnaturalizacion o bien usando calor o bien a traves de agentes organicos adecuados, tales como, por ejemplo, alcoholes, aldehfdos, cetonas o su combinacion adecuada. Es tambien posible inducir desnaturalizacion a traves de entrecruzamiento parcial del colageno, tal como usando cationes polivalentes, tales como Ca2+, Mg2+, Al3+ o Cr3+. El entrecruzamiento puede mejorar la resistencia contra la biodegradacion y, por lo tanto, puede prolongar el uso efectivo del implante.

Se describe la desnaturalizacion parcial de cubiertas biologicas por tratamiento con calor, entrecruzamiento o su combinacion en los siguientes documentos, que se incluyen en la presente solicitud: JP19900247300 (Koide Mikio) y US 4.076.468 (Loiotta et al.); US 4.247.292 (W.A. Angell). Se puede realizar ventajosamente la desnaturalizacion del colageno en combinacion con deshidratacion; sin embargo, tambien se pueden realizar ambas etapas por separado en cualquier orden. Un metodo ventajoso es la deshidratacion por evaporacion de agua con una posterior desnaturalizacion en estado deshidratado, por ejemplo usando tratamiento con calor. Se puede realizar una desnaturalizacion por solvente organico incluso rociando o pulverizando un agente organico adecuado sobre el implante deshidratado. Se puede combinar la desnaturalizacion por solventes incluso con desnaturalizacion por calor mediante calentamiento controlado del implante, por ejemplo, mientras se evapora el agua o los solventes.

Es importante realizar la deshidratacion y la desnaturalizacion de la matriz acelular bajo tension mecanica en una o dos direcciones escogidas, normalmente en la direccion de las dimensiones mayores. Se puede conseguir tension durante la deshidratacion y la desnaturalizacion manteniendo una dimension constante en direcciones deseables. Se puede conseguir esto, por ejemplo, fijando la matriz acelular con pinzas, estirandola usando uniones elasticas o rodillos, por union a un marco adecuado, por presion sobre un sustrato adhesivo o usando succion para unir a un sustrato usando vacfo, etc. La deshidratacion y la desnaturalizacion en un estado estirado provocara la orientacion de las estructuras de colageno en la direccion en la que se estira la matriz de colageno acelular (o en la que se evita su contraccion al menos durante la deshidratacion y la desnaturalizacion).

Si se realiza la desnaturalizacion sobre una matriz anisotropica ya deshidratada, entonces normalmente ya no es necesario mantenerla bajo tension; por lo tanto, la matriz deshidratada esta estabilizada dimensionalmente hasta una cierta temperatura, que no se puede exceder durante la fabricacion o el almacenamiento. Este lfmite de temperatura es primariamente dependiente del contenido en agua que queda en la matriz, que no debena exceder del 20% (en peso), preferiblemente del 10% (en peso) y lo mas preferiblemente del 5% (en peso), en relacion a la masa global de la matriz. Se realiza la desnaturalizacion entre las temperaturas de 15°C y 90°C, preferiblemente entre 30°C y 70°C.

5) Esterilizacion por radiacion ionizante. Si se realiza la desnaturalizacion en la etapa 4 usando solventes adecuados, tales como etanol, tenemos dos niveles de esterilizacion. El primer nivel de esterilizacion durante el proceso de produccion primeramente reducira la carga microbiana para la esterilizacion final, y en segundo lugar eliminara incluso esos germenes, contra los cuales el segundo nivel de esterilizacion puede no ser efectivo (p. ej., retrovirus).

Se realiza el nivel de esterilizacion final empaquetando en un envoltorio impermeable a microorganismos y virus, usando radiacion. Ventajosamente, se usa un nivel mmimo de radiacion ionizante para una carga microbiana dada, que reducira la degradacion del producto. El nivel recomendado es inferior a 50 kGray, preferiblemente inferior a 30 kGray. Esto es importante especialmente en caso de radiacion gamma. Se da preferencia generalmente a la esterilizacion por electrones acelerados (haz de electrones, radiacion beta), que es mas suave para el material del implante y se puede dosificar con mas precision. Es importante reconocer las diferencias en el mecanismo de degradacion para la radiacion gamma y para los electrones acelerados. Los creadores de la presente invencion se sorprendieron al descubrir que los implantes esterilizados por una combinacion de radiacion ionizante, especialmente por electrones acelerados, junto con agentes esterilizantes qmmicos que simultaneamente causan desnaturalizacion, especialmente etanol, mantienen sus excelentes propiedades mecanicas cuando se humedecen y no son citotoxicos incluso cuando estan en contacto con las celulas del paciente o con celulas cultivadas sobre el implante en el laboratorio. Sin atender a diversas teonas, los inventores asumen que el efecto beneficioso de la radiacion ionizante, tal como electrones acelerados, esta causado primariamente por la liberacion de fragmentos hidrosolubles de peptidos y proteoglicanos de la matriz por lo demas insoluble, lo que permite su mayor actividad biologica.

Tambien se puede combinar el implante con agentes bactericidas o bacteriostaticos conocidos, tales como sulfonamidas, antibioticos, complejos de protema-plata o plata coloidal extendidos por la matriz de colageno. Esto es ventajoso especialmente durante la implantacion en heridas infectadas o necroticas. Algunos aditivos actuan simultaneamente como ablandadores, tales como la glicerina y su diacetato o formaldehndo, 1,2-propilenglicol, dietilenglicol, glucosa, trietanolamina o sulfoxido de dimetilo (DMSO). Estos pueden actuar simultaneamente como conservantes suaves, ablandadores y agentes desnaturalizantes debiles. Su contenido puede ser de hasta el 50% (en peso), preferiblemente inferior al 30% (en peso). Estos aditivos ablandadores son miscibles con agua, y preferiblemente seran compuestos polihidroxi, lo mas preferiblemente glicerina o sus derivados. Pueden incluso ser usados en combinacion con compuestos de plata, como se describe, por ejemplo, en la solicitud CN199551010722 (Kai Cao), que se incluye en esta solicitud.

La materia objeto de la invencion presentada es, por lo tanto, el metodo de fabricacion de una matriz acelular, esteril, esencialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada obtenida a partir de tejido animal y que contiene predominantemente estructuras de colageno, que ya se definio anteriormente, que se basa en el procesamiento del tejido animal usando un metodo que comprende las siguientes etapas:

a) recogida de tejido;

b) eliminacion de celulas por accion enzimatica, surfactantes, acidos, alcalis, soluciones acuosas hipotonicas o sus combinaciones, durante la formacion de la matriz acelular;

c) deshidratacion de la matriz acelular por eliminacion de una porcion sustancial de agua, mientras que se mantiene la matriz bajo tension mecanica en una o mas direcciones seleccionadas;

d) desnaturalizacion parcial de las estructuras de colageno en la matriz acelular por la accion de un aumento de temperatura, de compuestos organicos, de cationes polivalentes o de sus combinaciones, mientras que se mantiene la matriz bajo tension mecanica en una o mas direcciones seleccionadas; o se mantienen las dimensiones de la matriz esencialmente constantes;

e) esterilizacion de la matriz esencialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada por radiacion ionizante.

Segun la invencion, un metodo ventajoso de fabricacion de la matriz acelular esteril es uno en el que se realiza la desnaturalizacion parcial de las estructuras de colageno de la matriz usando compuestos organicos miscibles con agua, seleccionados del grupo que incluye alcoholes alifaticos Ci a C4, aldehndos alifaticos, incluyendo formaldetndo y glutaraldehndo, cetonas alifaticas, incluyendo acetona, y eteres, incluyendo eter dimetflico, eter dietflico, dioxano y tetrahidrofurano.

Segun la invencion, un modo ventajoso de llevar a cabo la desnaturalizacion parcial de las estructuras de colageno es bajo temperaturas de 15°C a 90°C, preferiblemente bajo 30°C a 70°C.

Los inventores encontraron y verificaron que el implante producido segun la invencion puede ser ventajosamente usado como cubierta biologica para quemaduras, ulceras crurales, areas de recogida y otros defectos de la piel. Se puede poner el implante deshidratado directamente sobre la herida sangrante o rezumante, que hidratara el implante in situ sin un aumento significativo del area de cubierta de la herida y contribuira a la reduccion del sangrado y rezumado de la herida. Para este uso son especialmente adecuados implantes ablandados por aditivos adecuados, tales como glicerina. Tambien se puede hidratar el implante esteril antes de su uso en una solucion fisiologica esteril, posiblemente con la adicion de agentes bactericidas apropiados (tales como furantoma, solucion de acido borico o una solucion de plata proteica en agua (un complejo de plata-protema)), y ponerlo sobre la herida. Su gran ventaja es su capacidad para cubrir estrechamente los rasgos topograficos de la superficie herida, la reduccion del dolor de la herida y tener un efecto hemostatico. Otra gran ventaja es el hecho de que la curacion de todo el area se produce sin ningun cambio de vendajes de la herida, lo cual es necesario en caso de otros vendajes de heridas, es frecuentemente caro y es especialmente traumatico para el paciente (en caso de quemaduras severas incluso hay que hacerlo bajo anestesia total). Otra ventaja en comparacion con otras cubiertas biologicas es el hecho de que no importa que lado esta en contacto con la herida. La cubierta dermica acelular protege la herida y acelera la curacion apoyando la actividad biologica conectada con la curacion, tal como la migracion y proliferacion de queratinocitos del paciente. Los queratinocitos nativos se adheriran a la superficie interna del implante (posiblemente a la fibrina creada sobre el implante tras el contacto con la sangre o el plasma del paciente) y migran sobre su superficie, de tal modo que el implante se vuelve parte de la piel durante el penodo de tiempo en que esta teniendo lugar la curacion activa. Tan pronto como se ha completado la curacion y se ha renovado la capa cutanea epidermica del paciente, el implante se secara y se desprendera espontaneamente, sin necesidad alguna de retirada quirurgica, la cual es necesaria para algunas otras cubiertas biologicas y que tambien es traumatica para el paciente.

Otra ventaja del implante acelular esteril, tal como se produce segun la invencion, es su idoneidad como excelente sustrato para el cultivo celular, ya sea autologo o alogenico. Se puede usar, por lo tanto, su superficie para cultivar celulas adecuadas, tales como queratinocitos, que formaran una cubierta biologica celular conocida como "piel recombinada" (RK), que se puede aplicar a quemaduras y otras areas heridas. La principal ventaja de esta cubierta biologica celular es su capacidad para combinar el efecto estimulante de los queratinocitos cultivados con las propiedades del sustrato de membrana, siendo ese el implante segun la invencion. Si la prevencion de la profundizacion de quemaduras dermicas profundas tiene exito aplicando RK en el plazo de 10 dfas tras la lesion, no es necesario un trasplante, se acelerara significativamente la curacion y se ahorraran las areas de recogida y la repeticion de la cirugfa. La RK, junto con queratinocitos alogenicos trasplantados, se adherira temporalmente durante la curacion, se incorporaran queratinocitos a la epidermis en regeneracion, proliferaran, migraran, cerraran la herida y estimularan la curacion produciendo diversos factores de crecimiento. La xenodermis protegera la herida y proporcionara un sustrato natural para la migracion de queratinocitos autologos. En el curso de una semana, los queratinocitos alogenicos fueron reemplazados por los propios queratinocitos. Se explicara ademas la presente invencion mediante los siguientes ejemplos y figuras adjuntas. Estos ejemplos sirven como demostracion de ciertas realizaciones ventajosas de la invencion, y el experto en la tecnica ciertamente vera que el alcance de las reivindicaciones de patente adjuntas no se limita por la inclusion de estos ejemplos a estos ejemplos unicamente.

Breve descripcion de las figuras

La Fig. 1 es una micrograffa que muestra una seccion histologica a traves de la epidermis porcina con un nivel de corion papilar.

La Fig. 2 es una micrograffa de una seccion histologica del implante tras la eliminacion de celulas.

La Fig. 3 es una micrograffa que muestra una seccion histologica de un implante esteril orientado en plano tras deshidratacion.

La Fig. 4 es una micrograffa que muestra la tincion de estructuras de colageno segun Van Gieson en una seccion histologica de un implante rehidratado esteril producido segun la invencion, aumento 400x.

La Fig. 5 muestra un implante esteril rehidratado preparado para uso como cubierta de quemaduras.

La Fig. 6 demuestra la aplicacion del implante producido segun la invencion en una quemadura de 2° grado: Foto izquierda: conformacion y adhesion de la cubierta a la herida sin vendajes externos

Foto derecha: quemadura de 2° grado tras curacion y el autodesprendimiento de la cubierta.

La Fig. 7 es una micrograffa que muestra una seccion histologica de las muestras de tejido recien formado sobre una quemadura de 3° grado no necrotica bajo la cubierta hecha del implante producido segun la invencion (9 dfas despues de la aplicacion).

La Fig. 8 demuestra micrograffas de preparaciones histologicas de piel recombinada (RK) formada por queratinocitos humanos cultivados en laboratorio sobre el implante producido segun la invencion.

Foto izquierda: Piel recombinada con queratinocitos humanos cultivados en inmersion sobre una matriz acelular porcina producida segun la invencion

Foto derecha: Piel recombinada con queratinocitos humanos cultivados sobre la interfaz de aire y matriz acelular porcina producida segun la invencion.

Ejemplos

Ejemplo 1

Piel porcina como xenotransplante

Usando un dermatomo, se corto una capa de 300-400 micras de grosor de una epidermis porcina afeitada y limpia que inclma la capa del corion papilar. El histograma de la piel retirada esta en la Fig. 1. Se sumergio la tira retirada de piel porcina 3 veces durante 20 minutos a 37°C y durante 12 horas a 4°C en una solucion de tripsina al 0,25%, que elimino la mayona de las celulas dermicas y separo la epidermis. Se lavo la epidermis obtenida 6 veces en agua desmineralizada (3x durante 1 hora, 1x durante 12 horas, 2x durante 0,5 horas) para eliminar el resto de celulas y la tripsina. El histograma de la Fig. 2 muestra que se conservaba la estructura no celular. Se unio entonces la tira de dermis con un adhesivo a una placa de Petri de vidrio y se seco a temperatura ambiente hasta peso constante. En este estado, la dermis contema aproximadamente un 18% de agua. La dermis acelular asf secada tema la misma area de impronta que la dermis hidratada original, pero su grosor era menos de la mitad. Se sumergio entonces la dermis acelular estirada en etanol al 96% a 15°C durante un penodo de 24 horas. Se decanto luego el etanol y se desprendio la dermis de su sustrato de vidrio, se unio con pinzas desde dos direcciones opuestas y se seco a una temperatura de 50°C durante 1 hora.

Se puso entonces el xenotrasplante acelular deshidratado, que contema un resto de un 9,5% de agua en peso, en una bolsa de esterilizacion aprobada para esterilizacion por radiacion, se sello con calor en su interior y se expuso a una dosis de 25 kGy de radiacion gamma. Se confirmo la esterilidad usando una prueba de esterilidad estandar. Tras la rehidratacion, se recogio una seccion histologica. La Fig. 3 muestra que se conserva la estructura fibrosa del tejido conectivo, pero es mas compacta y las fibras se orientan en un plano. La tincion de Van Gieson en la Fig. 4 muestra que el implante consiste mayormente en polfmeros de tipo colageno, tales como colageno y elastina. El analisis mostro que el implante contiene una mezcla aproximadamente al 85% (en peso) de mayormente colageno con una cantidad menor de elastina y fibrina, donde el resto esta compuesto por lfpidos, polisacaridos y glicoprotemas.

La porosidad del implante esteril era de alrededor de un 55% en volumen, calculado usando la densidad en estado deshidratado. Se rehidrato el implante a 35°C en una solucion isotonica de NaCl. Tras rehidratacion hasta masa constante, el contenido en agua era del 62% (en peso). Se tomaron mediciones repetidas de las dimensiones en estado tanto deshidratado como hidratado con una precision de hasta 0,01 mm, y se encontraron los siguientes coeficientes de expansion lineal:

Longitud: Cx = 1,02 0,01

Anchura: Cy = 1,03 0,03

Grosor: Cz = 1,54 0,29

Coeficiente de expansion planar: Ca = 1,05 0,03

Coeficiente de expansion en volumen: Cv = 1,63 0,20

Las diferencias obvias en los coeficientes de expansion prueban claramente la expansion anisotropica durante la rehidratacion del implante. Se puede demostrar ademas esta anisotropfa por los valores de las razones de los coeficientes de expansion lineal:

Cx/Cy 0,98

Cz/Cx 1,52

Cz/Cy 1,49

Despues de un cierto penodo de almacenamiento, se uso el xenotrasplante como cubierta para una quemadura profunda de 2° grado en la cara. Se sumergio brevemente el implante en una solucion fisiologica esteril, como se demuestra en la Fig. 5, despues de lo cual se ablando y se volvio flexible sin cambio alguno del area de impronta. Se puso entonces sobre la quemadura, a la que se adhirio bien, como es evidente en la parte izquierda de la Fig, 6. Durante la curacion de la quemadura, el implante permanecio en su sitio original segun la invencion, comenzo a secarse gradualmente y, despues de casi una semana, empezo a desprenderse del tejido curado. Despues de 11 dfas, la herida se habfa curado y la cubierta se habfa desprendido por completo, como se demuestra en el lado derecho de la Fig, 6.

Ejemplo 2

Se uso el implante preparado segun el Ejemplo 1 sobre una quemadura de 3° grado.

Se corto cuidadosamente el tejido danado. Se extrajo el trasplante deshidratado de su envase esteril, se ajusto al tamano y la forma del area tratada usando tijeras, se puso sobre el area herida sangrante y se pulverizo con una solucion antibiotica esteril. El xenotransplante se ablando rapidamente y se adhirio a la superficie del area herida, que dejo de sangrar. El implante retuvo su impronta de estado deshidratado, pero su grosor aumento con la hidratacion. Esto causo una perfecta conformacion a la herida. Se cubrio el implante con una capa protectora de vendaje de tul graso durante los 3 primeros dfas. Despues de 8 dfas, el implante se seco hasta tener una consistencia de tipo costra y comenzo a separarse de la piel recien formada bajo la cubierta. Comenzo a formarse lentamente nueva epidermis bajo el implante, como se muestra en la Fig. 7. Despues de completarse la curacion, se formo piel sana y naturalmente estructurada, incluyendo una pigmentacion natural, y libre de cicatrizacion.

Ejemplo 3

Carfflago humano como alotrasplante

Se libero de celulas cartflago recogido de una articulacion de la cadera de un donante fallecido empapando repetidamente en una solucion de tripsina y en agua destilada, y se unio luego, usando vado, con su lado concavo sobre el lado convexo de un sustrato poroso de forma adecuada hecho de vidrio fritado. Mientras estaba sobre este sustrato, se puso en un exceso de una solucion de 20 partes (en peso) de metanol y 5 partes (en peso) de sulfoxido de dimetilo (DMSO) a 35°C durante un penodo de 48 horas. Se deshidrato asf el implante acelular, y al mismo tiempo se desnaturalizo parcialmente el colageno en el contenido en un estado orientado en plano. Despues de este penodo, se retiro el alotrasplante acelular de la solucion y se evaporo el metanol a temperatura ambiente usando una corriente de aire. Al final de esta etapa, el trasplante contema aproximadamente un 13% (en peso) de DMSO, aproximadamente un 4% (en peso) de agua y menos de un 0,5% (en peso) de metanol. Despues de retirarlo del sustrato poroso, se puso el trasplante en un saco de esterilizacion estanco al agua y se esterilizo usando una dosis de radiacion beta de 45 kGy procedente de un acelerador de electrones. Se determino la esterilidad usando una prueba de esterilidad estandar.

El implante asf preparado es adecuado como sustituto experimental del cartflago de la articulacion de la cadera en perros, donde se desliza sobre el cartflago danado y se une usando una ligadura de material de sutura quirurgico alrededor del cuello de la cabeza. El implante se hidratara in situ sin ningun cambio de su impronta, por lo que permanece durante todo el penodo en una posicion estable con respecto a la articulacion del paciente. El implante protege el cartflago contra la fusion y, por lo tanto, contra la perdida permanente de movilidad. Ademas, el implante soporta y acelera la curacion del cartflago. Cuando ha acabado la curacion, el implante se degrada gradualmente y se reabsorbe, hasta que se ha curado el cartflago natural y se renueva la funcion de la articulacion.

Ejemplo 4

Piel porcina como matriz para el cultivo de queratinocitos (para la preparacion de piel recombinada)

Se retiro la matriz acelular esteril del Ejemplo 1 de su envoltorio esteril, se puso sobre una placa de Petri usada para cultivo celular y se inundo cuidadosamente con un pequeno exceso de agua destilada. La xenodermis acelular se hidrato sin ningun cambio de su impronta, solo su grosor aumento a aproximadamente el doble como resultado de la hidratacion. Se aspiro luego cuidadosamente el exceso de agua para prevenir cualquier deformacion de la dermis hidratada, y se dejo que el resto del agua se evaporara en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente. Se uso entonces la xenodermis acelular seca para el cultivo de queratinocitos humanos sobre fibroblastos 3T3 letalmente irradiados (no se replican, pero metabolizan y producen importantes factores de crecimiento), que crearon la asf llamada piel recombinada (Rk ), que contiene queratinocitos alogenicos cultivados sobre dermis acelular xenogenica segun la invencion. Se determino la estructura de la capa de queratinocitos por las condiciones de cultivo, como puede verse por la Fig. 8. Cuando se hizo el cultivo sobre la superficie del implante bajo inmersion, se obtuvo como resultado una capa de queratinocitos regular y lisa. Cuando se hizo el cultivo sobre una interfaz implante/aire, la capa de queratinocitos se autoestructuro en una forma similar a la epidermis natural, incluyendo la capa cornea, stratum corneum, y la membrana basal, stratum basale. Se puede usar la RK asf preparada para la curacion de quemaduras, ulceras crurales y otros defectos de la piel diffciles de curar.

Se aplica la RK con los queratinocitos mirando hacia la herida y la dermis hacia afuera ("boca abajo"). Segun la invencion, la xenodermis, que sirve como sustrato de cultivo durante la fase de cultivo, sirve como una estructura de soporte para la transferencia de queratinocitos durante la aplicacion del injerto; protege la herida de la infeccion, de la desecacion y de los danos mecanicos. La ventaja en comparacion con injertos cultivados simples es una mayor resistencia, una liberacion de la placa de Petri sin accion enzimatica (usando solo 2 pinzas) y una facil manipulacion. Una ventaja en comparacion con los cultivos de queratinocitos sobre geles basados en colageno es la consistencia de la RK, que es similar a la piel ordinaria, y la resultante excelente adhesion a la herida, y tambien un efecto hemostatico. Cuando se libera de la placa de Petri, el injerto no se contrae, los queratinocitos sobre el sustrato no se afectan durante la liberacion como lo senan por enzimas. La RK con queratinocitos alogenicos tiene efectos estimulantes sobre la curacion de las areas de recogida de injertos y para la curacion de quemaduras dermicas profundas (2° grado).

La principal ventaja de esta cubierta biologica celular es su combinacion de efectos estimulantes de los queratinocitos cultivados con las caractensticas de las membranas biologicas. En casos en donde es posible prevenir la profundizacion de quemaduras dermicas profundas aplicando RK en el plazo de 10 dfas desde la lesion, no es necesario trasplantar, la curacion se acelera sustancialmente y se ahorraran areas de recogida, y se evitaran cirugfas repetidas. La Rk con queratinocitos alogenicos trasplantados se adherira temporalmente a traves de la curacion; los queratinocitos se incorporaran ellos mismos a la epidermis en regeneracion, proliferaran, migraran, cerraran la herida y estimularan la curacion produciendo diversos factores de crecimiento. La xenodermis protegera la herida y proporciona un sustrato natural para la migracion de queratinocitos autologos. En una semana, los queratinocitos alogenicos son reemplazados por los propios queratinocitos del paciente.

Ejemplo 5

Tendon de pavo

Se libero de celulas un tendon, recogido de la pata de un pavo, usando el metodo del Ejemplo 1, y luego se fijo en un aparato colocado en un recipiente, en donde se estiro sobre un rodillo y se tracciono mediante una lmea, a la que se unio un peso de 12 kg. Se sumergio en una solucion al 1% de cloruro de aluminio en este estado, y se dejo a 37°C durante 16 horas. Se cambio luego la solucion 3 veces usando agua apirogenica y luego con una mezcla de 20 partes (en peso) de acetona y 10 partes (en peso) de glicerina y 0,05 partes (en peso) de cloruro de sodio, y se dejo la estructura en esta solucion durante 25 horas bajo la tension creada por el peso de 12 kg y el aparato de estiramiento. Se seco despues la estructura y, junto con el aparato de estiramiento, se traslado a una camara de desecacion a vado, precalentada a 70°C, donde se libero del resto de solvente en un penodo de dos horas, y ademas se produjo una desnaturalizacion parcial inducida por calor del colageno. Se completo el proceso de desnaturalizacion calentando hasta 88°C durante un penodo de 10 minutos, aun bajo tension mecanica bajo nitrogeno. Se introdujo el implante acelular seco, con un resto de contenido en agua del 3% (en peso) en un envase de esterilizacion de plastico y se esterilizo usando 15 kGy de radiacion beta utilizando un acelerador de electrones. Se aseguro la esterilidad usando una prueba de esterilidad estandar.

El implante acelular permanecio resistente durante la rehidratacion y su diametro aumento, mientras que su longitud se habfa contrafdo. Tras la implantacion, se hidrato aun mas debido a una disminucion de la densidad de entrecruzamiento, que puede definirse, por ejemplo, como una fraccion molar de grupos que conectan dos cadenas en un polfmero. Esto tambien dio como resultado una contraccion gradual de la longitud y el aumento de traccion sobre los tejidos circundantes, lo que puede ser usado ventajosamente, por ejemplo, en cirugfa reconstructiva u ortopedica.

Ejemplo 6

Intestino delgado porcino

Se recogio un intestino delgado de un cerdo joven recien sacrificado, se lavo con agua, se volvio del reves y se empapo repetidamente en un exceso de una solucion al 3% de dodecilsulfonato de sodio a 45°C. Despues de esta etapa, se cerro un extremo del intestino con una pinza y se conecto el otro extremo a una fuente de agua desmineralizada presurizada a 30 mm Hg (4 kPa). Se mantuvo la sobrepresion en un bano de agua desmineralizada a 40°C durante 24 horas. Se cambio entonces el agua desmineralizada por una solucion de alcohol isopropflico y alcohol terc-butflico (1:1, en peso) y se mantuvo a 70°C bajo una sobrepresion interna de la solucion alcoholica durante otras 6 horas. Finalmente, se cambio la mezcla de alcoholes por metanol tres veces a temperatura ambiente. Se inflo entonces la membrana orientada acelular y deshidratada con nitrogeno y se seco su exterior usando una corriente de aire limpio bajo una campana laminar, despues de lo cual se plego hasta dejarla plana entre dos placas de polipropileno y se introdujo en un saco de esterilizacion estanco al agua. Se esterilizo entonces en dos fases: en la primera fase, se esterilizo usando 5 kGy de radiacion gamma, luego con una dosis de 15 kGy de electrones acelerados. La membrana acelular esteril esta concebida para llenarla con una suspension de fibroblastos alogenicos e implantarla en el paciente subcutaneamente con el fin de regenerar el tejido conectivo subcutaneo del paciente.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de fabricacion de la matriz acelular, esteril, sustancialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada obtenida a partir de tejido animal y que contiene predominantemente colageno, cuyas fibrillas estan en una disposicion estructural similar a como estaban en el tejido original, y concebida como un implante temporal en medicina humana o veterinaria, caracterizada por procesar el tejido animal usando un metodo que comprende las siguientes etapas:

a. eliminacion de celulas por la accion de enzimas, surfactantes, acidos, alcalis, soluciones acuosas hipotonicas o sus combinaciones;

b. deshidratacion de la matriz acelular mediante eliminacion de una cantidad significativa de agua, durante la cual la matriz se mantiene bajo tension mecanica en una o mas direcciones seleccionadas;

c. desnaturalizacion parcial de las estructuras de colageno en la matriz acelular mediante la accion de un aumento de temperatura, compuestos organicos, cationes polivalentes o una combinacion de dichas acciones, mientras que la matriz se mantiene bajo tension mecanica en una o mas direcciones seleccionadas; o las dimensiones de la matriz en las direcciones seleccionadas se mantienen para ser esencialmente constantes;

d. esterilizacion de la matriz esencialmente deshidratada y al menos parcialmente desnaturalizada usando radiacion ionizante.

2. Un metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado por realizar la desnaturalizacion parcial de las estructuras de colageno con ayuda de compuestos organicos miscibles con agua, seleccionados del grupo consistente en alcoholes alifaticos C1 a C4, aldehfdos alifaticos, incluyendo formaldehudo y glutaraldehfdo, cetonas alifaticas, incluyendo acetona, y eteres, incluyendo eter dimetflico, eter dietflico, dioxano y tetrahidrofurano.

3. Un metodo segun la reivindicacion 1, caracterizado por llevar a cabo la desnaturalizacion parcial de las estructuras de colageno a temperaturas de 15°C a 90°C, preferiblemente de 30°C a 60°C.