ES2711882T3

ES2711882T3 - Método de tratamiento de la nefropatía diabética

Info

Publication number: ES2711882T3
Application number: ES14865202T
Authority: ES
Inventors: Ulf Eriksson; Annelie Falkevall; Annika Mehlem
Original assignee: CSL Ltd; B Creative Sweden AB
Current assignee: CSL Ltd; B Creative Sweden AB
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2019-05-08
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: KR102339724B1; JP2020029459A; EP3074038A1; RU2016125513A; US9803008B2; CN105873608A; US20200010541A1; BR112016012248A2; RU2718054C2; AU2014354588B2; JP2016540047A; PL3074038T3; KR20160083121A; US11261243B2; EP3074038B1; JP6802342B2; EP3530286A1; US20180086824A1; JP6612246B2; EP3074038A4

Abstract

Un compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B para su uso en el tratamiento de la nefropatía diabética en un sujeto que padece de nefropatía diabética, en donde el compuesto que inhibe la señalización de VEGF-B es: (i) una proteína que comprende una región variable de anticuerpo que se une o se une específicamente a VEGF-B y neutraliza la señalización de VEGF-B; o (ii) un ácido nucleico que inhibe o evita la expresión de VEGF-B.

Description

DESCRIPCION

Metodo de tratamiento de la nefropatia diabetica

CAMPO

La presente invencion se refiere al tratamiento o prevencion de la nefropatia diabetica.

INTRODUCCION

Nefropatia

La nefropatia es una clase de trastornos caracterizados por dano a un rinon y abarca la nefritis (enfermedad renal inflamatoria) y la nefrosis (enfermedad renal no inflamatoria). Las causas de la nefropatia incluyen afecciones cronicas (incluyendo lupus eritematoso sistemico, diabetes mellitus y presion arterial alta (hipertension), depositos de anticuerpos IgA en el glomerulo, administracion de analgesicos, deficiencia de xantina oxidasa, toxicidad de agentes quimioterapeuticos y exposicion prolongada a plomo o sus sales.

La nefropatia asociada con la diabetes (es decir, la "nefropatia diabetica") es la causa mas comun de enfermedad renal en etapa terminal en los Estados Unidos y en varios otros pafses desarrollados. Por ejemplo, la nefropatia diabetica representa casi el 35% de la enfermedad renal terminal en los Estados Unidos hoy en dfa y cuesta aproximadamente de 50.000$-65.000$ por paciente al ano, superando los 2 billones $ al ano para todos los pacientes de los Estados Unidos. Aproximadamente el 40% de los pacientes con diabetes tipo 1 y el 5-15% de los pacientes con diabetes tipo 2 desarrollan eventualmente enfermedad renal en etapa terminal.

Los mecanismos fisiopatologicos de la nefropatia diabetica no se entienden completamente. Las anomalfas demostrables mas tempranas incluyen hipertension intrarrenal, hiperfiltracion (aumento de la tasa de filtracion glomerular) y microalbuminuria. Clmicamente, la herramienta de deteccion mas importante para identificar la nefropatia temprana es la deteccion de la microalbuminuria. Los factores de riesgo para el desarrollo de la nefropatia diabetica incluyen hiperglucemia, hipertension, historial familiar positivo de nefropatia y tabaquismo. La nefropatia diabetica se considera generalmente un resultado de la hipertension y la hiperglucemia en la diabetes, y muchos investigadores consideran que la hiperglucemia es un factor significativo que contribuye al desarrollo de esta enfermedad.

Las intervenciones medicas hasta ahora no son lo suficientemente eficaces para tratar o prevenir la progresion de la nefropatia diabetica y el desarrollo de enfermedad renal en etapa terminal. A este respecto, los tratamientos actuales estan dirigidos principalmente a mejorar las complicaciones de las enfermedades de la siguiente manera: 1) controlar la presion arterial (inhibidores de inhibidores de ECA o bloqueadores de los receptores de la angiotensina (ARB); 2) controlar los valores glucemicos; y 3) modificaciones en la dieta lipoproteica, ejercicio u otros estilos de vida. Sin embargo, el tratamiento actual tiene un impacto limitado en la disminucion progresiva de la funcion renal y los pacientes aun progresan a la terapia de reemplazo renal, ya sea dialisis o trasplante renal.

Otras estrategias de tratamiento se han centrado en uno o mas factores de crecimiento como objetivos terapeuticos, a menudo aquellos identificados como regulados por incremento en los modelos de nefropatia. Por ejemplo, se han examinado terapias dirigidas a inhibir el TGFp, ya sea solo o en combinacion con inhibidores de ACE. Tambien se han estudiado el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) y otros factores implicados en la angiogenesis como objetivos en el tratamiento de la nefropatia. Sung et al. (2006) JAMSN. 17:3093-3104 trata el bloqueo de VEGFR para mejorar la albuminuria diabetica en ratones. La WO 2013/101954 trata el uso de los inhibidores de la protema tirosina quinasa en el tratamiento de trastornos multiples, incluyendo la nefropatia diabetica. La WO 2005/077413 trata metodos y compuestos para tratar aspectos de la etapa temprana y aspectos de la etapa final espedficos de la nefropatia diabetica dirigiendose a CTGF. Hagberg et al. (2012) Nature 490: 426-430 trata el objetivo VEGF-B en el tratamiento de la diabetes tipo 2.

VEGF y nefropatia

La familia de factores de crecimiento VEGF incorpora cinco ligandos (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y el factor de crecimiento de la placenta (PIGF)) que pueden unirse diferencialmente a tres tirosina quinasas receptoras (VEGFR-1, -2, y -3) y los receptores de semoforinas (neuropilina 1 y 2). La familia VEGF de factores de crecimiento esta implicada en la angiogenesis y la linfangiogenisis normales y patologicas. El VEGF-A se une a VEGFR-1, VEGFR-2, NP-1 y NP-2; el VEGF-B se une a VEGFR-1 y NP-1. El VEGF-C y la VEGF-D estan implicados principalmente en la linfangiogenesis y se unen a VEGFR-2, VEGFR-3 y NP-2.

El VEGF-A es el miembro mejor estudiado de la familia VEGF, y el papel del VEGF-A y las investigaciones de la inhibicion del VEGF-A en relacion con el rinon y la nefropatia han proporcionado resultados mixtos, que a menudo dan como resultado efectos perjudiciales en el rinon. Algunos de estos estudios han implicado la administracion del receptor 1 de VEGF soluble (tambien conocido como sFlt-1), que puede actuar como un antagonista de VEGF-A pero tambien de VEGF-B y PlGF, y han llevado a proteinurea e hipertension (Nakagawa et al, Diabetes, 58, p1471 -8, 2009). Kosugi et al (Am J Physiol Renal Physiol 298: F609-F616, 2010) concluyeron que es poco probable que el tratamiento con sFlt-1 sea beneficioso en la nefropatía diabetica y que se necesitan enfoques alternativos para tratar la enfermedad renal diabetica. Un estudio reciente que implico un antagonista de VEg Fr-1 (Yang et al, PLOS ONE, 9(4), e94540, 2014) en ratones db/db concluyo que la inhibicion de VEGFR-1 agrava la nefropatía diabetica, y sugirio realmente que la activacion de VEGFR-1 puede proporcionar una modalidad terapeutica en la nefropatía diabetica tipo 2. Como se ha tratado anteriormente, el VEGF-B es uno de los ligandos que senalizan a traves de VEGFR-1, y estos estudios que implican a sFlt-1 o el antagonista de VEGFR-1 habnan bloqueado la senalizacion de VEGF-B, aunque de una manera no espedfica.

SUMARIO

La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.

Al producir la presente invencion, los inventores procedieron en contra del conocimiento en la tecnica en relacion con la senalizacion de VEGF en la nefropatía y estudiaron los efectos de inhibir la senalizacion de VEGF-B en modelos de nefropatía de raton aceptados, por ejemplo, ratones alimentados con alto contenido de grasa y modelos de diabeticos nefropatia, incluyendo la nefropatia asociada a diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2. Los inventores estudiaron el efecto de este factor de crecimiento previniendo la expresion de VEGF-B (por ejemplo, usando ratones geneticamente modificados en los que la expresion de VEGF-B se reduce o evita) o administrando un antagonista de VEGF-B (por ejemplo, un anticuerpo antagonista). Los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, la inhibicion de la senalizacion de VEGF-B tiene un efecto beneficioso en una variedad de modelos animales de nefropatía. Por ejemplo, los inventores fueron capaces de evitar el desarrollo de la nefropatía, por ejemplo, nefropatía diabetica, y tratar (por ejemplo, retrasar la progresion) la nefropatía, por ejemplo, nefropatía diabetica dependiendo del regimen de tratamiento usado.

Los inventores descubrieron que el antagonismo de la senalizacion de VEGF-B disminuye o previene por lo menos la expansion mesangial glomerular, la esclerosis glomerular y tubular, el deposito de matriz extracelular mesangial, el engrosamiento anormal de la membrana basal glomerular y la acumulacion de lfpidos renales, por ejemplo, en glomerulos renales, perdida de podocito, hipertension, reorganizaciones vasculares glomerulares y preserva la estructura de los podocitos en sujetos diabeticos. En algunos casos (por ejemplo, en un experimento descrito en la presente), los cambios en el rinon tuvieron lugar a pesar de un efecto moderado en los niveles de glucosa en sangre en sujetos diabeticos, lo que indica que la inhibicion de VEGF-B proporciona un beneficio terapeutico/profilactico en la nefropatía a traves de una via adicional al o aparte del control glucemico.

Los descubrimientos de los inventores proporcionan la base para los metodos para tratar o prevenir la nefropatía en un sujeto inhibiendo la senalizacion de VEGF-B. Por ejemplo, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar o prevenir la nefropatía en un sujeto, el metodo comprendiendo administrar al sujeto un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B.

En un ejemplo, la nefropatía es nefritis, es decir, enfermedad renal inflamatoria. Por ejemplo, la nefropatía es nefropatía por IgA o esta provocada por el uso de farmacos (por ejemplo, analgesicos o quimioterapia), deficiencia de xantina oxidasa, enfermedad poliqrnstica del rinon o esta provocada por una enfermedad cronica, por ejemplo, una enfermedad inflamatoria o autoinmune o diabetes.

Por ejemplo, la nefropatía es glomerulonefritis y/o glomeruloesclerosis. Por ejemplo, la glomerulonefritis y/o glomeruloesclerosis es una glomerulonefritis y/o glomeruloesclerosis proliferativa.

En un ejemplo, la nefropatía o nefritis esta asociada o provocada por otra enfermedad. Por ejemplo, la nefropatía esta provocada por una enfermedad inflamatoria o autoinmune (por ejemplo, crispematosis de lupus sistemico, smdrome de Goodpasture), vasculitis (por ejemplo, granulomatoso de Wegener o poliangitis microscopica) o diabetes.

En un ejemplo, la nefropatía o nefritis esta asociada o provocada por prediabetes. En un ejemplo, la nefropatía o nefritis esta asociada o provocada por diabetes tipo 1. En un ejemplo, la nefropatía o nefritis esta asociada o provocada por diabetes tipo 2. Por ejemplo, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar o prevenir la nefropatía diabetica en un sujeto que padece de diabetes, el metodo comprendiendo administrar al sujeto un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B.

Como se ejemplifica en la presente, los presentes inventores han mostrado que la administracion de un inhibidor de la senalizacion de VEGF-B a un sujeto que padece de nefropatía diabetica es eficaz en el tratamiento de esta afeccion. Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona adicionalmente un metodo para tratar la nefropatía diabetica, el metodo comprendiendo administrar a un sujeto que padece de nefropatía diabetica un inhibidor de la senalizacion de VEGF-B.

En un ejemplo, el sujeto esta en riesgo de desarrollar nefropatía o esta desarrollando nefropatía (por ejemplo, nefropatía diabetica). Por ejemplo, el sujeto padece de microalbuminuria o macroalbuminuria. En otro ejemplo, el sujeto padece de hipertension.

En un ejemplo, la presente divulgacion proporciona un metodo para prevenir o retrasar el desarrollo de nefropatía (por ejemplo, nefropatía diabetica), el metodo comprendiendo administrar a un sujeto que padece de microalbuminuria o macroalbuminuria (por ejemplo, un sujeto que padece de diabetes y microalbuminuria o macroalbuminuria) un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B. En un ejemplo, el sujeto padece de microalbuminuria.

En un ejemplo, la presente divulgacion proporciona un metodo para prevenir o retrasar el desarrollo de nefropatía (por ejemplo, nefropatía diabetica), el metodo comprendiendo administrar a un sujeto que padece de hipertension (por ejemplo, un sujeto que padece de diabetes e hipertension) un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF -B.

En un ejemplo, el compuesto se administra en una cantidad eficaz para tener uno o mas de los siguientes efectos:

• Reducir o prevenir la hipertension;

• Reducir o prevenir la esclerosis glomerular y/o tubular;

• Reducir o prevenir el deposito de matriz extracelular mesangial y/o el engrosamiento anormal de la membrana basal glomerular;

• Reducir o prevenir la expansion mesangial glomerular;

• Reducir o prevenir los reordenamientos vasculares glomerulares;

• Reducir o prevenir la acumulacion de lfpidos renales;

• Reducir o prevenir la acumulacion de lfpidos glomerulares;

• Reducir o prevenir los depositos de colageno glomerular y/o hialiosis arteriolar; y/o

• Reducir o prevenir la macroalbuminuria.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B inhibe espedficamente la senalizacion de VEGF-B. Esto no significa que un metodo de la presente divulgacion no abarque la inhibicion de la senalizacion de multiples protemas de VEGF, solo que el compuesto (o parte del mismo) que inhibe la senalizacion de VEGF-B es espedfico para VEGF-B, por ejemplo, no es un inhibidor general de protemas de VEGF. Este termino tampoco excluye, por ejemplo, un anticuerpo o protema biespedfica que comprende los dominios de union de la misma, que puede inhibir espedficamente la senalizacion de VEGF-B con uno (o mas) dominios de union y puede inhibir espedficamente la senalizacion de otra protema con otro dominio de union.

En un ejemplo, un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B se une a VEGF-B. Por ejemplo, el compuesto es una protema que comprende una region variable de anticuerpo que se une a o se une espedficamente a VEGF-B y neutraliza la senalizacion de VEGF-B.

En un ejemplo, el compuesto es un anticuerpo mimetico. Por ejemplo, el compuesto es una protema que comprende un dominio de union a antfgeno de una inmunoglobulina, por ejemplo, una IgNAR, un anticuerpo camelido o un receptor de celulas T.

En un ejemplo, un compuesto es un anticuerpo de dominio (por ejemplo, que comprende solo una region variable de la cadena pesada o solo una region variable de la cadena ligera que se une a VEGF-B) o un anticuerpo solo de cadena pesada (por ejemplo, un anticuerpo camelido o una IgNAR) o region variable del mismo.

En un ejemplo, un compuesto es una protema que comprende un Fv. Por ejemplo, la protema se selecciona del grupo que consiste de:

(i) un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv);

(ii) un scFv dimerico (di-scFv); o

(iv) un diacuerpo;

(v) un triacuerpo;

(vi) un tetracuerpo;

(vii) un Fab;

(viii) un F(ab')²;

(ix) un Fv; o

(x) uno de (i) a (ix) ligado a una region constante de un anticuerpo. Fc o un dominio constante de cadena pesada (Ch)2 y/o Ch3.

En otro ejemplo, un compuesto es un anticuerpo. Los anticuerpos ejemplares son anticuerpos de longitud completa y/o desnudos.

En un ejemplo, el compuesto es una protema que es recombinante, quimerica, CDR injertada, humanizada, sinhumanizada, primatizada, desinmunizada o humana.

En un ejemplo, el compuesto es una protema que comprende una region variable de anticuerpo que inhibe competitivamente la union del anticuerpo 2H10 para VEGF-B, En un ejemplo, la protema comprende una region variable de la cadena pesada (V^h) que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3 y una region variable de la cadena ligera (Vl) que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4.

En un ejemplo, el compuesto es una protema que comprende una region variable humanizada del anticuerpo 2H10. Por ejemplo, la protema comprende una region variable que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la Vh y/o la Vl del anticuerpo 2H10. Por ejemplo, la protema comprende:

(i) una VH que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 25-34 de la SEQ ID NO: 3;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 49-65 de la SEQ ID NO: 3; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 98-108 de la SEQ ID NO: 3;

y/o

(ii) una V^lque comprende;

(a) una CDR1 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 23-33 de la SEQ ID NO: 4;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 49-55 de la SEQ ID NO: 4; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 88-96 de la SEQ ID NO: 4.

En un ejemplo, el compuesto es una protema que comprende una Vh y una Vl, siendo Vh y Vl regiones variables humanizadas del anticuerpo 2H10. Por ejemplo, la protema comprende:

(i) una VH que comprende:

(c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 98-108 de la SEQ ID NO: 3; y

(ii) una VLque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 23-33 de la SEQ ID NO: 4 (b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 49-55 de la SEQ ID NO: 4 (c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 88-96 de la SEQ ID NO: 4 En un ejemplo, la region variable o V^hen cualquiera de los parrafos anteriores comprende una secuencia expuesta en la SEQ Id NO: 5.

En un ejemplo, la region variable o Vl en cualquiera de los parrafos anteriores comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

En un ejemplo, el compuesto es un anticuerpo.

En un ejemplo, el compuesto es un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia expuesta en la s Eq ID NO: 5 y una Vl que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

En un ejemplo, la protema o anticuerpo es cualquier forma de la protema o anticuerpo codificado por un acido nucleico que codifica cualquiera de las protemas o anticuerpos anteriores.

En un ejemplo, la protema o anticuerpo comprende:

(i) una VHque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 11 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 17;

(b) una c DR2 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 12 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 18; y

(c) una ^cDR3 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 13 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 19; y/o

(ii) una VLque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 14 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20;

(b) una c DR2 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 15 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 21; y

(c) una c DR3 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 16 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 22.

En un ejemplo, la protema o anticuerpo comprende:

(i) una VHque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 23 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 29;

(b) una c DR2 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 24 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 30; y

(c) una c DR3 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 25 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 31; y/o

(ii) una VLque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 26 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 32;

(b) una c DR2 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 27 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 33; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 28 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 34.

En un ejemplo, la protema o anticuerpo comprende:

(i) una VH que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 35 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 41;

(b) una ^cDR2 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 36 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 42; y

(c) una ^cDR3 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 37 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 43; y/o

(ii) una VLque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 38 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 44;

(b) una c DR2 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 39 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 45; y

(c) una ^cDR3 que comprende una secuencia codificada por un acido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 40 o que comprende una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 46.

En un ejemplo, el compuesto esta dentro de una composicion. Por ejemplo, la composicion comprende una protema que comprende una region variable del anticuerpo o una Vh o una Vlo un anticuerpo como se describe en la presente. En un ejemplo, la composicion comprende adicionalmente una o mas variantes de la protema o anticuerpo. Por ejemplo, que comprende una variante que carece de un residuo de lisina C-terminal codificado, una variante desamidada y/o una variante glicosilada y/o una variante que comprende un piroglutamato, por ejemplo, en el extremo N terminal de una protema y/o un vanante que carece de un residuo N-terminal, por ejemplo, una glutamina N-terminal en un anticuerpo o region V y/o una variante que comprende toda o parte de una senal de secrecion. Las variantes desamidadas de los residuos de asparigina codificados pueden dar como resultado isoaspartico, y se generan isoformas de acido aspartico o incluso una succinamida que implica un residuo de aminoacido adyacente. Las variantes desamidadas de los residuos de glutamina codificados pueden dar como resultado acido glutamico. Se pretende que las composiciones que comprenden una mezcla heterogenea de tales secuencias y variantes esten incluidas cuando se hace referencia a una secuencia de aminoacidos particular.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B inhibe o evita la expresion de VEGF-B. Por ejemplo, el compuesto se selecciona del grupo un antisentido, un ARNip, un ARNi, una ribozima y una ADNzima.

En un ejemplo, el VEGF-B es VEGF-B de mairnfero, por ejemplo, VEGF-B humano.

En un ejemplo, el sujeto es un mamffero, por ejemplo, un primate, como un humano.

Los metodos de tratamiento descritos en la presente pueden comprender adicionalmente administrar un compuesto adicional para tratar o prevenir la nefropatía.

Los metodos de tratamiento de la nefropatía diabetica descritos en la presente pueden comprender adicionalmente administrar un compuesto adicional para tratar o prevenir (o retrasar la progresion de) la diabetes. En la presente se describen compuestos ejemplares.

La presente divulgacion tambien proporciona un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B para su uso en el tratamiento o prevencion de la nefropatia.

La presente divulgacion tambien proporciona el uso de un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B en la fabricacion de un medicamento para tratar o prevenir la nefropatía.

La presente divulgacion tambien proporciona un kit que comprende un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B envasado con instrucciones para su uso en el tratamiento o prevencion de la nefropatia.

En la presente se describen nefropatías y compuestos ejemplares y deben tomarse para aplicarse mutatis mutandis a los ejemplos de la divulgacion establecidos en los tres parrafos anteriores.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1A comprende dos representaciones graficas que muestran la proporcion de albumina/creatinina en orina (ACR) medida por ELISA para ratones db/db, db/db//Vegfb+l' y db/db//Vegfb-/- (n=5 grupo, grafico de la izquierda) y ratones magros de tipo salvaje (wt) y magros Vegfb'1- (n=4-6/grupo, grafico de la derecha). Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 1B es una representacion grafica que muestra la presion arterial del manguito de la cola (presion arterial sistolica y diastolica; como se indica) en ratones db/db y db/db//Vegfb+l' (n=5/grupo). Los valores son medias ±s.e.m. *P<0,05, **P<D-01 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 2A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de las anomalfas en los compartimentos de los tubulos medidos como engrosamiento de la membrana basal (BM) de los tubulos en las secciones renales de ratones db/db, db/db//Vegfb+l' y db/db//Vegfb-/-. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con los controles db/db. ## P<0,01 en comparacion con los ratones de tipo salvaje magros de 28 semanas de edad.

La Figura 2B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la esclerosis glomerular medida como la expansion mesangial en secciones de rinon de ratones db/db, db/db//Vegfb*1' y db/db//Vegfb-/-. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 2C es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la apoptosis glomerular medida como glomerulos apoptoticos por cuadro (n=4/grupo) en secciones de rinon de ratones db/db, db/db//Vegfb+l~ y db/db//Vegfb'1'. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 3A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del grosor de la membrana basal glomerular medido usando analisis de microscopfa electronica de transmision (TEM) de las secciones del rinon de animales wt, db/db, db/db//Vegfb+/- y db/db//Vegfb':' magros (como se indica). n=3-4/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. ###P<0,001 en comparacion con los controles db+ magro y **P<0,01 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 3B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del numero de cortes medida usando analisis de microscopfa electronica de transmision (TEM) de las secciones de rinon de animales wt, db/db, db/db//Vegfb+l' y db/db//Vegfb'1' magros (como se indica). n=3-4/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. ###P<0,001 en comparacion con los controles db+ magro y **P<0,01 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 4A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del analisis de aceite rojo O (ORO) de secciones del rinon de animales db/db, db/db//Vegfb+/- y db/dM/Vegfb'1'. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 4B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con aceite rojo O en glomerulos y compartimentos tubulares (como se indica). Animales db/db, db/db//Vegfb+l~, db/dM/Vegfb'1' y de tipo salvaje. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05 y ###P<0,001 en comparacion con los controles magros. ***P<0,001 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 5A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con sinaptopodina en glomerulos de db/db, db/db//Vegfb+l'y db/db//Vegfb-/~. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0,.001 en comparacion con los controles dh/db.

La Figura 5B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con pccam en glomerulos de db/db, db/db//Vegfb*1' y db/db// Vegfb~'~. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 6A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con colageno IV en glomerulos en secciones de rinon de ratones db/db, db/db//Vegfb+l' y db/db//Vegfb':'. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 6B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con a-SMA en glomerulos en secciones de rinon de ratones db/db, db/db//Vegfb+l' y db/db//Vegfb':'. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 6C es una representacion grafica que muestra el grosor arteriolar en secciones de rinon de ratones db/db, db/db//Vegfb+l' y db/db//Vegfb':'. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0.,5 en comparacion con los controles db/db.

La Figura 7es una representacion grafica que muestra los resultados de la cuantificacion de la tincion con ORO tanto en los glomerulos como en el compartimento tubular de los ratones de tipo salvaje, db/db//BKS de 6 semanas y db/db//BKS de 21 semanas magros. n=5-7. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05 y ##P<0,01, tubulos comparados con los glomerulos. *P<0,05 glomerulos de db/db//BKS de 6 semanas en comparacion con glomerulos de db/db//BKS de 21 semanas.

La Figura 8 incluye dos representaciones graficas que muestran que la acumulacion de lfpidos glomerulares se correlaciona con la perdida de podocitos en la progresion de DN en ratones db/db//BKS. El grafico de la izquierda muestra la cuantificacion de la tincion con adipofilina y el grafico de la derecha muestra la cuantificacion de la tincion con sinaptopodina. n=3-5/grupo Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ##P<0,01, en comparacion con los controles db+ magros. *P<0,05 db/db//BKS de 6 semanas en comparacion con los glomerulos de db/db//BKS de 21 semanas.

La Figura 9 es una representacion grafica que muestra la expresion de ARNm renal relativa de Vegfb, VEGFR1, Fatp4 y Fatp3 en db *, y db/db//BKS de 6, 12 y 21 semanas de edad (como se indica)magros. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,1, en comparacion con los animales de control magros. Vegfb, factor de crecimiento endotelial vascular B; Vegfrl, receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular; Fatp3, transportador de acidos grasos 3; Fatp4, transportador de acidos grasos 4.

La Figura 10^aes una representacion grafica que muestra el analisis de la proporcion de albumina/creatinina en la orina en WT alimentados con una dieta alta en grasas (HFD). Ratones Vegfb*1' alimentados con HFD, Vegfb'1' alimentados con HFD y animales de control magro. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ##P<0,01, ### P<0,001 en comparacion con los animales magros de control. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con wt alimentados con HFD.

La Figura 10B es una representacion grafica que muestra el analisis de la albumina en orina en ratones WT alimentados con HFD, Vegfb*1' alimentados con HFD, ratones Vegfb'1' alimentados con HFD y animales de control magro. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ## P<0,01, ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magros. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con wt alimentados con HFD.

La Figura 11A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la expansion mesangial glomerular en ratones Vegf-b*1' y Vegf-b-/- alimentados con HFD. Analisis de ratones WT, Vegfb*1', Vegfb-/-alimentados con HFD y animales de control magro. n=5-10/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. barras de escala, 50 mm. #P<0,05, ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magro. **P<0,01 en comparacion con wt alimentado alimentados con HFD.

La Figura 11B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del area glomerular en ratones Vegf-b*1' y Vegf-b-/- alimentados con HFD. Analisis de ratones WT. Vegfb*1', Vegfb'1' alimentados con HFD y animales magros de control. n=5'10/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. barras de escala, 50 mm. #P<0,05, ###P<0,001 en comparacion con los animales de control magro. **P<0,01 en comparacion con wt alimentados con HFD.

La Figura 12 es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con ORO de secciones de rinon de ratones WT alimentados con HFD, Vegfb*1' alimentados con HFD, Vegfb'1' alimentados con HFD y animales de control magro. n=5'10/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0,01 en comparacion con los animales de control magros. *P<0.5 en comparacion con wt alimentados con HFD.

La Figura 13 es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con adipofilina en glomerulos de secciones de rinon de ratones WT alimentados con HFD, Vegfb*1' alimentados con HFD, Vegfb-/- alimentados con HFD y animales de control magros. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05 en comparacion con los animales de control magros. *P<0,.05 en comparacion con wt alimentados con HFD. La Figura 14A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con colageno IV en secciones de rinon de ratones WT alimentados con HFD, Vegfb*1' alimentados con HFD, Vegfb'1' alimentados con HFD y animales de control magros. n=5'10/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ##P<0,01 en comparacion con los animales de control magros. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con wt alimentados con HFD.

La Figura 14B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del grosor arteriolar en secciones de rinon de ratones WT alimentados con HFD, Vegfb+/, alimentados con HFD, Vegfb-1- alimentados con HFD y animales de control magros. n=5-10/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ##P<0,01 en comparacion con los animales de control magros. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con wt alimentados con HFD.

Las Figuras 15A-F son representaciones graficas que muestran el analisis de ratones db/db//BKS que fueron tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control (marcado como "C") durante 8 semanas. La Figura 15A muestra los niveles de glucosa en sangre posprandiales en animales no tratados. Las flechas indican los niveles de glucosa al inicio del ensayo profilactico o terapeutico. La Figura 15B muestra ACR en animales db/db//BKS no tratados. Las flechas indican ACR al inicio del ensayo profilactico o terapeutico. Las Figuras 15C y 15D muestran los niveles de glucosa en sangre posprandiales del tratamiento anti-VEGF-B preventivo en db/db//BKS mostrados por separado para ratones macho (6C n=5/grupo) y hembra (6D, n=5-6/grupo). Las Figuras 15E y 15F muestran los niveles de glucosa en sangre posprandiales del tratamiento anti-VEGF-B terapeutico en ratones dh/db//BKS mostrados por separado para ratones macho (15E, n=5/grupo) y hembra (15F, n=5-6/grupo). El penodo de administracion del tratamiento anti-VEGF-B (2H10) se indica en los graficos respectivos.

La Figura 16A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la esclerosis glomerular medida por la expansion mesangial en la seccion de rinon de los ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas (como se indica). Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con los ratones db/db//BKS tratados con control.

La Figura 16B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la esclerosis tubular medida por el tamano de los glomerulos en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas (como se indica) de una manera profilactica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con los ratones db/db//BKS tratados con control.

La Figura 17A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con podocina glomerular en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de manera profilactica o ratones de control db+. Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0,01, en comparacion con los controles db+ magros. **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con el control de db/db tratado. n=3-7/grupo.

La Figura 17B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con pecam glomerular en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de manera profilactica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con los controles. La Figura 18A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con adipofilina glomerular en cortes de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de manera profilactica. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, en comparacion con los controles db+ magros. (n=3-7/grupo).

La Figura 18B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con sinaptopodina glomerular en cortes de rinon de ratones db/dh//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de manera profilactica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05. **P<0,01 en comparacion con los controles. (n=3-5/grupo).

La Figura 19es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con colageno IV glomerular en cortes de rinon de ratones b Ks dh/db//tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de manera profilactica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05. **P<0,01 en comparacion con los controles. (n=3-5/grupo).

Las Figuras 20A-C son una serie de representaciones graficas que muestran la inhibicion farmacologica de VEGF-B, usando 2H10 de manera profilactica, mejora el perfil de lfpidos en plasma en ratones db/db//BKS diabeticos. Analisis de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control (n=8/grupo) y animales db/+ magros (n=3). Los graficos representan niveles plasmaticos de la (Figura 11A) HDL-c y LDL-c, (Figura 11B) FA esterificados (NEFA) y (Figura 11B) cetonas. #/*P<0,05. ##/**P<0,01, en comparacion con db+ magros o en comparacion con control de db/db tratado. Los valores son medias ± s.e.m.

La Figura 21A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del grosor de GBM en secciones de rinon de ratones db+ y db/dh//BKS magros tratados profilacticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control. n=3-4/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0,01 en comparacion con los controles db+ magros y **P<0,01 en comparacion con el control dh/db tratado.

La Figura 21B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del numero de cortes en secciones de rinon de ratones db+ y db/db//BKS tratados profilacticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control. n=3-4/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0,01 en comparacion con los controles db+ magros y **P<0,01 en comparacion con el control de db/db tratado.

La Figura 22 es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con aceite rojo O tanto en glomerulos como en el compartimento tubular en las secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control y animales db/+ magros. n=3-7/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. ###P<0,001, en comparacion con los controles Db+ magros. **P<0,01 en comparacion con el control de db/db tratado.

La Figura 23A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la esclerosis glomerular medida por la expansion mesangial en secciones de rinon de ratones db/db//BKS hembra tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas (segun se indique) de manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los controles.

La Figura 23B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la esclerosis glomerular medida por la expansion mesangial en secciones de rinon de ratones db/db//BKS macho tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas (segun se indique) de manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m.

La Figura 24 es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con aceite rojo O en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas (segun se indique) de manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los controles.

La Figura 25A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con pecam glomerular en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con los controles. La Figura 25B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con sinaptopodina glomerular en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de una manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con los controles. (n=4-5/grupo).

La Figura 26A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con colageno IV glomerular en secciones de rinon de ratones db/ db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de una manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05 en comparacion con los controles.

La Figura 26B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con a-SMA glomerular en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2S10) o de control de una manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01 en comparacion con los controles. (n=4-5/grupo).

La Figura 26C es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del grosor arteriolar glomerular en secciones de rinon de ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control de manera terapeutica. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05. **P<0,01 en comparacion con los controles. (n=4-5/grupo).

La Figura 27A es una representacion grafica que muestra la ACR de la orina medida por ELISA en ratones db/dh//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas o animales magros (n=grupo 3-7). Los valores son medias ± s.e.m. El punto de inicio y el punto final muestran la ACR antes y despues del penodo de tratamiento, respectivamente. *P<0,05, **P<0,0l en comparacion con los animales tratados control.

La Figura 27B es una representacion grafica que muestra la tasa de filtracion glomerular medida como la depuracion de creatinina en ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas o animales magros (n=grupo 3-7). Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los animales tratados con control db/db.

La Figura 27C es una representacion grafica que muestra la presion arterial del manguito de la cola (presion arterial sistolica y diastolica) en ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas o animales magros (n=3-7 grupo). Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los animales tratados con control db/db.

La Figura 27D es una serie de tres representaciones graficas que muestran el peso corporal (grafico de la izquierda), el peso de los rinones (grafico del centro) y la relacion entre el peso corporal y el peso de los rinones (grafico de la derecha) en ratones db/dh//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 8 semanas o animales magros (n=grupo 4). Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en comparacion con los animales tratados con control db/db.

La Figura 28 es una representacion grafica que muestra los niveles de glucosa en sangre en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control, y animales de control magros. Niveles de glucosa en sangre posprandiales al final del penodo de tratamiento. Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0,01 en comparacion con los animales de control magros.

La Figura 29A es una representacion grafica que muestra los niveles de albumina en orina en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control, y animales de control magros (n=5-10/grupo). ACR, proporcion albumina/creatinina. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magros. ***P<0,001 en comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 29B es una representacion grafica que muestra la proporcion de albumina/creatinina en la orina medida por ELISA en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control, y animales de control magros (n=5-10/grupo). Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magros. ***P<0,001 en comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 30A es una representacion grafica que muestra los niveles en plasma de trigliceridos en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpos anti-VEGF-B (2H10) o de control y animales de peso magros (n=5-10/grupo). #P<0,05, ## P<0,01, en comparacion con los animales de control magros. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05. En comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 30B es una representacion grafica que muestra los niveles en plasma de FA no esterificados (NFFA) en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control y animales de peso magros (n=5-10/grupo). #P<0,05, ## P<0,01, en comparacion con los animales de control magros. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0.05, en comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 30Ces una representacion grafica que muestra los niveles en plasma de cetonas en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control y animales wt magros (n=5-10/grupo). #P<0,05, ## P<0,01, en comparacion con los animales de control magros. Los valores son medias ± s.e.m. *P<0,05, en comparacion con el control tratado alimentado con HFD

La Figura 31A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la expansion mesangial glomerular en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control y animales wt magros. n=5-10/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magros. ***P<0,001 en comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 31B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del area de glomerulos en ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control y animales wt magros. n=5-10/grupo. Los valores son medias ± s.e.m. #P<0,05, ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magros. ***P<0,001 en comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 32 es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con aceite rojo O de glomerulos de secciones de rinon de ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control, y animales de control magros. ##P<0,01 en comparacion con el control magro y **P<0,01 en comparacion con los animales tratados de control con HFD.

La Figura 33A es una representacion grafica que muestra la cuantificacion de la tincion con colageno IV de secciones de rinon de ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control, y animales de control magros. #P<0,05 en comparacion con los animales de control magros. *P<0,05 en comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 33B es una representacion grafica que muestra la cuantificacion del grosor arteriolar en secciones de rinon de ratones alimentados con HFD tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control, y animales de control magros. #P<0,05 en comparacion con los animales de control magros. *P<0,05 en comparacion con el control tratado alimentado con HFD.

La Figura 34A es una representacion grafica que muestra los niveles de glucosa en la sangre antes y despues de las inyecciones de estreptozotocina (STL). Los animales de control magros no fueron inyectados con STZ. Despues de las inyecciones de STZ. a los animales con hiperglucemia establecida (niveles de glucosa en sangre por encima de 12 mM) se les dosifico anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control. (n=3-7/grupo). Los valores son medias ± s.e.m. ## P<0,01. ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magros. STZ, estreptozotocina

La Figura 34B es una representacion grafica que muestra los niveles de glucosa en sangre en ratones tratados con STZ (que no sean animales de control magros) y tratados con anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o anticuerpo de control, y animales de control magros. A los animales de control magro no se les inyecto STZ. (n=3-7/grupo). Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0,01, ### P<0,001 en comparacion con los animales de control magros. STZ, estreptozotocina

La Figura 35A es una representacion grafica que muestra la proporcion de albumina/creatinina (ACR) en ratones antes de la administracion de STZ y despues de la administracion de STZ con dosificacion de anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 1 semana. A los animales de control magros y los animales db/db no se les inyecto STZ. La proporcion de albumina/creatinina en orina se midio mediante ELISA (n=3-6/grupo). ACR, proporcion albumina/creatinina. Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0.01 en comparacion con animales pre STZ. *P<0,05 en comparacion con los animales tratados con control STZ. STZ, estreptozotocina.

La Figura 35B es una representacion grafica que muestra los niveles de albumina en ratones antes de la administracion de STZ y despues de la administracion de STZ con dosificacion de anticuerpo anti-VEGF-B (2H10) o de control durante 1 semana. A los animales de control magro no se les inyecto STZ. Los niveles de albumina en orina se midieron por ELISA (n=3-6/grupo). Los valores son medias ± s.e.m. ##P<0,01 en comparacion con animales pre STZ. *P<0,05 en comparacion con los animales tratados con control STZ. STZ, estreptozotocina.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de aminoacidos de una isoforma de VEGF-B¹⁸⁶humana que contiene una secuencia de senal N-terminal de 21 aminoacidos

La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de aminoacidos de una isoforma de VEGF-Bw humana que contiene una secuencia de senal N-terminal de 21 aminoacidos

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de aminoacidos de una V^hdel anticuerpo 2H10.

La SEQ ID NO; 4 es una secuencia de aminoacidos de una V^ldel anticuerpo 2H10.

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia de aminoacidos de una Vh de una forma humanizada del anticuerpo 2H10.

La SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoacidos de una Vl de una forma humanizada del anticuerpo 2H10.

La SEQ ID NO 7 es una secuencia de aminoacidos de una Va del anticuerpo 4E12.

La SEQ ID NO 8 es una secuencia de aminoacidos de una Vl del anticuerpo 4E12.

La SEQ ID NO 9 es una secuencia de aminoacidos de una Vh del anticuerpo 2F5.

La SEQ ID NO 10 es una secuencia de aminoacidos de una Vl del anticuerpo 2F5.

La SEQ ID NO 11 es una secuencia de nucleotidos de una CDR1 de V^ldel anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 12 es una secuencia de nucleotidos de una CDR2 de Vl del anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 13 es una secuencia de nucleotidos de una CDR3 de Vl del anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 14 es una secuencia de nucleotidos de una CDR1 de V^hdel anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 15 es una secuencia de nucleotidos de una CDR2 de Vh del anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 16 es una secuencia de nucleotidos de una CDR3 de Vh del anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 17 es una secuencia de aminoacidos de una CDR1 de V^ldel anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 18 es una secuencia de aminoacidos de una CDR2 de V^ldel anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 19 es una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de Vl del anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 20 es una secuencia de aminoacidos de una CDR1 de Vh del anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 21 es una secuencia de aminoacidos de una CDR2 de V^hdel anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 22 es una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de Vh del anticuerpo 2H10

La SEQ ID NO 23 es una secuencia de nucleotidos de una CDR1 de Vl del anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 24 es una secuencia de nucleotidos de una CDR2 de Vl de anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 25 es una secuencia de nucleotidos de una CDR3 de Vl del anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 26 es una secuencia de nucleotidos de una CDR1 de Vh del anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 27 es una secuencia de nucleotidos de una CDR2 de Vh del anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 28 es una secuencia de nucleotidos de una CDR3 de V^hdel anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 29 es una secuencia de aminoacidos de una CDR1 de Vl del anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 30 es una secuencia de aminoacidos de una CDR2 de V^ldel anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 31 es una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de Vl del anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 32 es una secuencia de aminoacidos de una CDR1 de V^hdel anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 33 es una secuencia de aminoacidos de una CDR2 de Vh del anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 34 es una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de V^hdel anticuerpo 2F5

La SEQ ID NO 35 es una secuencia de nucleotidos de una CDR1 de Vl del anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 36 es una secuencia de nucleotidos de una CDR2 de Vl del anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 37 es una secuencia de nucleotidos de una CDR3 de Vl del anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 38 es una secuencia de nucleotidos de una CDR1 de Vh del anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 39 es una secuencia de nucleotidos de una CDR2 de V^hdel anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 40 es una secuencia de nucleotidos de una CDR3 de Vh del anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 41 es una secuencia de aminoacidos de una CDR1 de V^ldel anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 42 es una secuencia de aminoacidos de una CDR2 de Vl del anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 43 es una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de V^ldel anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 44 es una secuencia de aminoacidos de una CDR1 de Vh del anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 45 es una secuencia de aminoacidos de una CDR2 de V^hdel anticuerpo 4E12

La SEQ ID NO 46 es una secuencia de aminoacidos de una CDR3 de V^hdel anticuerpo 4E12

DESCRIPCION DETALLADA

General

A lo largo de esta especificacion, a menos que se afirme espedficamente lo contrario o que el contexto requiera lo contrario, se debe considerar que la referencia a un solo paso, la composicion de la materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de la materia engloban uno y una pluralidad (es decir, uno o mas) de esos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupos de composiciones de materia.

Los expertos en la tecnica apreciaran que la presente divulgacion es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas espedficamente. Debe entenderse que la divulgacion incluye todas estas variaciones y modificaciones. La divulgacion tambien incluye todos los pasos, caractensticas, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta especificacion, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o dos cualquiera o mas de dichos pasos o caractensticas.

La presente divulgacion no debe estar limitada en su alcance por los ejemplos espedficos descritos en la presente, que se pretende sean unicamente con fines de ejemplificacion. Los productos, composiciones y metodos funcionalmente equivalentes estan claramente dentro del alcance de la presente divulgacion.

Se entendera que cualquier ejemplo de la presente divulgacion se aplicara mutatis mutandis a cualquier otro ejemplo de la divulgacion, a menos que se indique espedficamente lo contrario.

Se entendera que cualquier ejemplo de la presente divulgacion en relacion con el tratamiento o la prevencion de una nefropatía se aplicara mutatis mutandis a la inhibicion o prevencion de una respuesta inmune innata (por ejemplo, una respuesta inmune innata en el sistema digestivo y/o una respuesta inmune innata sistemica) En un sujeto que padece una nefropatía.

A menos que se defina espedficamente lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente deben entenderse con el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica (por ejemplo, en cultivo celular, genetica molecular, inmunologfa, inmunohistoqmmica, qmmica de protemas y bioqmmica).

A menos que se indique lo contrario, la protema recombinante, el cultivo celular y las tecnicas inmunologicas usadas en la presente divulgacion son procedimientos estandar, bien conocidos por los expertos en la materia. Tales tecnicas se describen y explican a lo largo de la bibliograffa en fuentes tales como, J. Pcrhal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984). J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumenes 1-4. IRL Press (1995 y 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora).

La descripcion y definiciones de las regiones variables y partes de las mismas, las inmunoglobulinas, anticuerpos y fragmentos de los mismos en la presente pueden aclararse aun mas por la exposicion en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health. Bethesda, Md., 1987 y 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia y Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et at Nature 342, 877 883, 1989 y/o Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948.1997..

Se entendera que cualquier exposicion de una protema o anticuerpo en la presente incluye cualquier variante de la protema o anticuerpo producida durante la fabricacion y/o el almacenamiento. Por ejemplo, durante la fabricacion o el almacenamiento, un anticuerpo puede desaminarse (por ejemplo, en un residuo de asparagina o de glutamina) y/o puede tener glicosilacion alterada y/o tener un residuo de glutamina convertido en piroglutamina y/o tener residuo N-terminal o C-terminal eliminado o "recortado" y/o tener parte o la totalidad de una secuencia de senal procesada incompletamente y, como consecuencia, permanecer en el extremo terminal del anticuerpo. Se entiende que una composicion que comprende una secuencia de aminoacidos particular puede ser una mezcla heterogenea de la secuencia expuesta o codificada y/o variantes de la secuencia expuesta o codificada.

El termino "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" se entendera que significa "X e Y" o "X o Y" y se entendera para proporcionar soporte explfcito para ambos significados o para cualquiera de ambos significados.

A lo largo de esta especificacion, se entendera que la palabra "comprender", o variaciones como "comprende" o "comprendiendo", implican la inclusion de un elemento, entero o paso expuesto, o grupo de elementos, enteros o pasos, pero no la exclusion de cualquier otro elemento, entero o paso, o grupo de elementos, enteros o pasos.

Como se usa en la presente, el termino "derivado de" se entendera que indica que un entero especificado puede obtenerse de una fuente particular, aunque no necesariamente de esa fuente.

Definiciones Seleccionadas

Se sabe que VEGF-B existe en dos isoformas principales, denominadas VEGF-B¹⁸⁶y VEGF-Bw. Para propositos de nomenclatura solamente y no de limitacion, las secuencias ejemplares de VEGF-B¹⁸⁶humano se establecen en la Secuencia de Referencia NCBI: NP_003368.1, en los numeros de acceso de protemas NCBI NP_003368, P49765 y AAL79001 y en la SEQ ID NO: 1. En el contexto de la presente divulgacion, la secuencia de VEGF-B¹⁸⁶puede carecer de la secuencia de senal N-terminal de 21 aminoacidos (por ejemplo, como se expone en los aminoacidos 1 a 21 de la SEQ ID NO: 1. Para propositos de nomenclatura solamente y no de limitacion de secuencias ejemplares de VEGF-Bw humano se establecen en la Secuencia de Referencia NCBI: NP_001230662.1, en los numeros de acceso de protemas NCBI AAL79000 y AAB06274 y en la SEQ ID NO: 2. En el contexto de la presente descripcion, la secuencia de VEGF-Bw puede carecer de la secuencia de senal N-terminal de 21 aminoacidos (por ejemplo, como se expone en los aminoacidos 1 a 21 de la SEQ ID NO: 2. La secuencia adicional de VEGF-B puede determinarse usando las secuencias proporcionadas en la presente y/o en bases de datos disponibles al publico y/o determinarse usando tecnicas estandar (por ejemplo, como se describe en Ausubel et al., (editores). Current Protocols in Molecular Biology. Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988. incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora) o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La referencia a VEGF-B humano puede abreviarse a hVEGF-B. En un ejemplo, la referencia en la presente a VEGF-B es a la isoforma VEGF-Bw.

La referencia en la presente a VEGF-B tambien abarca el peptido VEGF-B^10-108como se describe en la WO2006/012688.

El termino "nefropatía" debe entenderse como dano o enfermedad de un rinon. Este termino abarca todos los cambios clmico-patologicos que afectan al rinon que pueden dar como resultado fibrosis renal y/o enfermedades glomerulares (por ejemplo, glomeruloselerosis, glomerulonefritis) y/o insuficiencia renal cronica, y pueden provocar enfermedad renal en etapa terminal y/o insuficiencia renal. Las nefropatías ejemplares incluyen nefropatía hipertensiva, nefropatía diabetica y otros tipos de nefropatía como nefropatía analgesica, glomerulopatias mediadas por el sistema inmune (por ejemplo, nefropatía por IgA o enfermedad de Berger, nefritis por lupus), nefropatía isquemica, nefropatía asociada al VIH, nefropatía membranosa, glomerulonefritis, glomeruloesclerosis, nefropatía inducida por medio de radiocontraste, nefropatía toxica, nefrotoxicidad inducida por analgesicos, nefropatía por cisplatino, nefropatía por trasplante y otras formas de anomalfas lesion glomerular: lesion capilar glomerular (fibrosis tubular). En algunos ejemplos. los terminos "nefropatía" o "nefropatías" se refieren espedficamente a un trastorno o enfermedad en la que hay presencia de protemas (es decir, proteinuria), como la albumina, en la orina de un sujeto y/o la presencia de insuficiencia renal. La nefropatía se diagnostica a menudo en base a la presencia de albumina en la orina (microalbuminuria o macroalbuminuria), niveles de nitrogeno ureico en sangre aumentados (por ejemplo, niveles por encima de 20 mg/dl) y/o niveles de creatinina en suero aumentados (por ejemplo, niveles por encima de 1,3 mg/dl para machos y 1,1mg/dl para hembras).

El termino "fibrosis" se refiere al procesamiento anormal de tejido fibroso, o degeneracion fibroide o fibrosa. La fibrosis puede ser el resultado de varias lesiones o enfermedades. La fibrosis implica tfpicamente la produccion, acumulacion o deposito anormal de componentes de la matriz extracelular, incluyendo la sobreproduccion y el deposito aumentado, por ejemplo, de colageno y fibronoctina. Como se usa en la presente, los terminos "fibrosis de rinon" o "fibrosis renal" o "fibrosis del rinon" se refieren a enfermedades o trastornos asociados con la sobreproduccion o deposito anormal de componentes de la matriz extracelular, particularmente colageno, que lleva a la degradacion o deterioro de la funcion del rinon.

El termino "nefritis" se entendera que significa la inflamacion de un rinon. En el contexto de la presente divulgacion, la nefritis abarca un subconjunto de nefropatía caracterizada por inflamacion en un rinon. La inflamacion puede involucrar glomerulos, tubulos o tejido intersticial que rodea los glomerulos y tubulos. Generalmente, la nefritis es o una glomerulonefritis (es decir, inflamacion de los glomerulos) o nefritis intersticial (es decir, inflamacion de los espacios intersticiales entre los tubulos renales).

El termino "glomerulonefritis" abarca una clase de enfermedades renales, que pueden dividirse en las subclases de enfermedades proliferativas y enfermedades no proliferativas. Como lo sugieren los nombres, las enfermedades "proliferativas" incluyen formas de glomerulonefritis en las que hay un aumento significativo en el numero de celulas en el glomerulo, mientras que las enfermedades "no proliferativas" incluyen formas de glomerulonefritis en las que no hay tal aumento en el numero de celulas. Las enfermedades proliferativas ejemplares incluyen nefropatía por TgA, glomerulonefritis postinfecciosa, glomerulonefritis membranoproliferativa y glomerulonefritis rapidamente progresiva. Las enfermedades no proliferativas ejemplares incluyen enfermedad de cambio mmimo, glomeruloesclerosis del segmento focal, enfermedad de la membrana basal delgada y glomerulonefitis membranosa.

La "nefropatía diabetica" es una patologfa clmicamente bien definida caracterizada por proteinuria, hipertension, edema e insuficiencia renal. Los aspectos caractensticos de la nefropatía diabetica incluyen glomeruloesclerosis, modificacion de la estructura vascular, y enfermedad tubulointersticial. La primera evidencia clmica de nefropatía diabetica es a menudo la presencia de albuminuria en la orina, por ejemplo, microalbuminuria o microalbuminuria. La nefropatía diabetica se caracteriza tfpicamente por lo siguiente: 1) glomeruloesclerosis). 2) modificacion de la estructura vascular, principalmente en las arteriolas pequenas y 3) enfermedad tubulointersticial. El aspecto mas caractenstico de la nefropatía diabetica es la lesion glomerular, detectable por el agrandamiento del mesangio y por el engrosamiento de la membrana basal. que a menudo parece una cicatrizacion difusa de toda la glomerula. La primera evidencia clmica de nefropatía diabetica es la presencia de albuminuria o proteinuria.

Por "microalbuminuria" se entiende la presencia de 30-300 mg de albumina por 24 horas de recoleccion de orina y/o 30-300 mg/l de albumina en una sola muestra. Generalmente, ambos de los anteriores deben medirse en por lo menos dos de las tres muestras durante un penodo de dos a tres meses. La microalbuminuria tambien puede definirse por una proporcion de albumina a creatinina (ACR) de >3,5 mg/mmol para mujeres o >2,5 mg/mmol para hombres o entre 30-300 |jg de albumina/mg de creatinina. Los niveles de albumina pueden evaluarse usando, por ejemplo, tiras reactivas comercialmente disponibles (por ejemplo, que comprenden azul de bromofenol como indicador).

El termino "macroalbuminuria" significa la presencia de cantidades de albumina mas altas (o ACR mas alta) que las observadas en la microalbuminuria.

El termino "proteiniria" significa que la cantidad de protema total en la orina es de aproximadamente >30 mg/dl o una proporcion de protema/creatinina superior a 45 mg/mmol.

"Hipertension" se refiere a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) que tiene una presion sistolica de 140 mm Hg o mas y/o una presion diastolica de 90 mm Hg o mas. En algunos ejemplos de un metodo o uso descrito en la presente, un sujeto es prehipertensivo, por ejemplo, tiene una presion sistolica de aproximadamente 120-139 mm Hg o mas y/o una presion diastolica de 80-89 mm Hg o mas.

Se entendera que el termino "recombinante" significa el producto de la recombinacion genetica artificial. Por consiguiente, en el contexto de una protema recombinante que comprende una region variable de anticuerpo, este termino no abarca un anticuerpo de origen natural dentro del cuerpo de un sujeto que es el producto de la recombinacion natural que tiene lugar durante la maduracion de las celulas B. Sin embargo, si tal anticuerpo esta aislado, debe considerarse una protema aislada que comprende una region variable de anticuerpo. De manera similar, si el acido nucleico que codifica la protema esta asilado y se expresa usando medios recombinantes, la protema resultante es una protema recombinante que comprende una region variable de anticuerpo. Una protema recombinante tambien abarca una protema expresada por medios recombinantes artificiales cuando esta dentro de una celula, tejido o sujeto, por ejemplo, en el que se expresa.

Se entendera que el termino "protema" incluye una cadena polipeptfdica sencilla, es decir, una serie de aminoacidos contiguos ligados por enlaces peptfdicos o una serie de cadenas polipeptfdicas unidas entre sf covalente o no covalentemente (es decir, un complejo de polipeptidos). Por ejemplo, la serie de cadenas polipeptfdicas puede ligarse covalentemente usando un enlace qrnmico o disulfuro adecuado. Ejemplos de enlaces no covalentes incluyen enlaces de hidrogeno, enlaces ionicos, fuerzas de Van der Waals, e interacciones hidrofobas.

A partir del parrafo anterior se entendera que el termino "polipeptido" o "cadena polipeptfdica" significa una serie de aminoacidos contiguos unidos por enlaces peptfdicos.

El experto en la tecnica sabra que un "anticuerpo" se considera generalmente como una protema que comprende una region variable compuesta por una pluralidad de cadenas polipeptfdicas, por ejemplo, un polipeptido que comprende una region variable de la cadena ligera (V^l) y un polipeptido que comprende una region variable de la cadena pesada (Vh). Un anticuerpo tambien comprende generalmente dominios constantes, algunos de los cuales pueden estar dispuestos en una region constante, que incluye un fragmento constante o fragmento cristalizable (Fc). En el caso de una cadena pesada, una Vh y una Vl interactuan para formar un Fv que comprende una region de union al antfgeno que es capaz de unirse espedficamente a uno o unos pocos antfgenos estrechamente relacionados. Generalmente, una cadena ligera de marnfferos es uno a cadena ligera k o una cadena ligera A y una cadena pesada de mamffero es a, 5, £, y o p. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgGi, IgG², IgG³, IgG⁴, IgAi e IgA²) o subclase. El termino "anticuerpo" tambien abarca anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos humanos, anticuerpos deshumanizados y anticuerpos quimericos.

Los terminos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completo" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, a diferencia de un fragmento de union a antfgeno de un anticuerpo. Espedficamente, los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadenas pesadas y ligeras que incluyen una region Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia de tipo salvaje (por ejemplo, dominios constantes de secuencia de tipo salvaje humanos) o variantes de secuencia de aminoacidos de los mismos.

Como se usa en la presente, "region variable" se refiere a las porciones de las cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo como se define en la presente que es capaz de unirse espedficamente a un antfgeno e incluye secuencias de aminoacidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR); es decir, CDR1, CDR2 y CDR3, y regiones de marco (FR). Las regiones variables ejemplares comprenden tres o cuatro FR (por ejemplo, FR1, fR2, FR3 y opcionalmente FR4) junto con tres CDR. En el caso de una protema derivada de un IgNAR, la protema puede carecer de una CDR2. V^hse refiere a la region variable de la cadena pesada. V^lse refiere a la region variable de la cadena ligera.

□ [0084]

Como se usa en la presente, el termino "regiones determinantes de la complementariedad" (sin, CDR; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los residuos de aminoacidos de un dominio variable de anticuerpo, cuya presencia es necesaria para la union al antfgeno. Cada dominio variable tiene tfpicamente tres regiones ^cD^ridentificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Las posiciones de aminoacidos asignadas a las CDR y las FR pueden definirse de acuerdo con Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health. Bethesda, Md., 1987 y 1991 u otros sistemas de numeracion en el desempeno de esta divulgacion, por ejemplo, el sistema de numeracion canonico de Chothia y Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877 883, 1989; y/o Al-Lazikani et al.. J Mol Biol 273: 927-948, 1997; el sistema de numeracion IMGT de Lefranc et al., Devel. y Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003; o el sistema de numeracion AHO de Honnegher y Plukthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001..

Las "regiones marco" (FR) son aquellos residuos del dominio variable distintos de los residuos de CDR. Como se usa en la presente, el termino "Fv" debe entenderse como cualquier protema, ya sea compuesta de multiples polipeptidos o un unico polipeptido, en el que una V^ly una V^hse asocian y forman un complejo que tiene un sitio de union al antigeno, es decir, capaz de unirse espedficamente a un antigeno. La V^hy la V^lque forman el sitio de union al antigeno pueden estar en una unica cadena polipeptfdica o en diferentes cadenas polipeptfdicas. Ademas, un Fv de la divulgacion (asf como cualquier protema de la divulgacion) puede tener multiples sitios de union al antfgeno que pueden o no unirse al mismo antigeno. Se entendera que este termino abarca fragmentos derivados directamente de un anticuerpo asf como protemas correspondientes a dicho fragmento producido usando medios recombinantes. En algunos ejemplos, la Vh no esta ligada a un dominio constante de la cadena pesada (C^h) 1 y/o la V^lno esta ligada a un dominio constante de la cadena ligera (C^l). Los polipeptidos o protemas que contienen Fv ejemplares incluyen un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab'), un scFv. un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o un complejo de orden superior, o cualquiera de los anteriores ligados a una region constante o dominio de la misma, por ejemplo, dominio C^h2 o C^h3, por ejemplo, un minicuerpo. Un "fragmento Fab" consiste de un fragmento de union al antfgeno monovalente de un anticuerpo, y puede producirse por digestion de un anticuerpo completo con la enzima papama, para producir un fragmento que consiste de una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada o puede producirse usando medios recombinantes. Un fragmento "Fab" puede obtenerse de un anticuerpo tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido de reduccion, para producir una molecula que consiste de una cadena ligera intacta y una porcion de una cadena pesada que comprende una V^hy un unico dominio constante. Se obtienen dos fragmentos Fab' por anticuerpo tratado de esta manera. Un fragmento Fab' tambien puede producirse por medios recombinantes. Un "fragmento F(ab')2 de un anticuerpo consiste de un dfmero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos por dos enlaces disulfuro, y se obtiene tratando una molecula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reduccion posterior. Un fragmento "Fab²" es un fragmento recombinante que comprende dos fragmentos Fab ligados usando, por ejemplo, una cremallera de leucina o un dominio C^h3. Un "Fv de cadena sencilla" o "scFv" es una molecula recombinante que contiene el fragmento de la region variable (Fv) de un anticuerpo en el que la region variable de la cadena ligera y la region variable de la cadena pesada estan enlazados covalentemente por un conector polipeptfdico flexible adecuado.

Como se usa en la presente, el termino "se une" en referencia a la interaccion de una protema o un sitio de union al antfgeno del mismo con un antfgeno significa que la interaccion depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigenico o epttopo) en el antfgeno. Por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de protema espedfica en lugar de a protemas en general. Si un anticuerpo se une al epftopo "A", la presencia de una molecula que contenga el epftopo "A" (o "A" libre, no marcado), en una reaccion que contenga "A" marcado y la protema, reducira la cantidad de "A" marcado unido al anticuerpo.

Como se usa en la presente, debe entenderse que el termino "se une espedficamente" o "espedficamente se une" significa que una protema de la divulgacion reacciona o se asocia mas frecuentemente, mas rapidamente, con mayor duracion y/o con mayor afinidad con un antfgeno o celula particular que expresa el mismo que lo que hace con antfgenos o celulas alternativas. Por ejemplo, una protema se une a VEGF-B con una afinidad materialmente mayor (por ejemplo, 20 veces o 40 veces o 60 veces o 80 veces a 100 veces o 150 veces o 200 veces) que a otro factor de crecimiento (por ejemplo, VEGF-A) o a antfgenos comunmente reconocidos por anticuerpos naturales reactivos polirreactivos (es decir, por anticuerpos de origen natural que se sabe que se unen a una variedad de antfgenos que se encuentran de manera natural en humanos). Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la union significa union espedfica, y debe entenderse que cada termino proporciona un soporte espedfico al otro termino.

Como se usa en la presente, debe entenderse que el termino "neutralizar" significa que una protema es capaz de bloquear, reducir o prevenir la senalizacion de v Eg F-B en una celula a traves del VEGF-R1. Los metodos para determinar la neutralizacion son conocidos en la tecnica y/o se describen en la presente.

Como se usa en la presente, se entendera que el termino "inhibe espedficamente la senalizacion de VEGF-B" significa que el compuesto inhibe la senalizacion de VEGF-B y no inhibe de manera significativa o detectable la senalizacion por una o mas protemas de VEGF, por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B. VEGF-C, VEGF-D y/o PIGF.

Como se usa en la presente, debe entenderse que el termino "no inhibe significativamente" significa que el nivel de inhibicion de la senalizacion por una protema de VEGF distinta de VEGF-B (por ejemplo, la senalizacion por VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y/o PIGF) en presencia de un compuesto descrito en la presente no es estadfsticamente significativamente mas bajo que en ausencia del compuesto descrito en la presente (por ejemplo, en un ensayo de control que puede realizarse en presencia de un anticuerpo de control de isotipo).

Como se usa en la presente, se entendera que el termino "no inhibe de manera detectable" significa que un compuesto como se describe en la presente inhibe la senalizacion de una protema de VEGF distinta de VEGF-B (por ejemplo, la senalizacion por VEg F-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y/o PIGF) en no mas del 10% o 8% o 6% o 5% o 4% o 3% o 2% o 1% del nivel de senalizacion detectado en ausencia del compuesto descrito en la presente (por ejemplo, en un ensayo de control que puede realizarse en presencia de un anticuerpo de control de isotipo).

Como se usa en la presente, los terminos "previniendo", "prevenir" o "prevencion" incluyen administrar un compuesto de la divulgacion para detener u obstaculizar de este modo el desarrollo de por lo menos un smtoma de una afeccion.

Como se usa en la presente, los terminos "tratando", "tratar" o "tratamiento" incluyen administrar una protema descrita en la presente para reducir o eliminar de este modo por lo menos un smtoma de una enfermedad o afeccion espedfica o para ralentizar la progresion de la enfermedad o afeccion.

Como se usa en la presente, debe entenderse que el termino "sujeto" significa cualquier animal, incluyendo los humanos, por ejemplo un mairnfero. Los sujetos ejemplares incluyen, pero no estan limitados a humanos y primates no humanos. Por ejemplo, el sujeto es un humano.

Tratamiento de la nefropatia.

La divulgacion en la presente proporciona, por ejemplo, un metodo para tratar o prevenir la nefropatia en un sujeto que comprende administrar al sujeto un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B.

En un ejemplo, el sujeto padece de diabetes. Por ejemplo, un sujeto que padece de diabetes tiene un marcador de diabetes clmicamente aceptado, como:

• Glucosa en plasma en ayunas mayor o igual a 7 nmol/l o 126 mg/dl;

• Glucosa en plasma ocasional (tomada en cualquier momento del dfa) mayor o igual a 11,1 nmol/l o 200 mg/dl con los smtomas de la diabetes.

• Valor de prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) mayor o igual a 11,1 nmol/l o 200 mg/dl medido en un intervalo de dos horas. La OGTT se administra durante un lapso de tiempo de dos o tres horas.

En un ejemplo, el sujeto padece de diabetes tipo 1.

En un ejemplo, el sujeto padece de diabetes tipo 2.

En un ejemplo, el sujeto padece de nefropatia diabetica. Por ejemplo, el sujeto padece de nefropatia asociada con diabetes tipo 1. Por ejemplo, el sujeto padece de nefropatia asociada con diabetes tipo 2.

En un ejemplo, el sujeto esta en riesgo de desarrollar nefropatia diabetica. Por ejemplo, el sujeto esta en riesgo de desarrollar nefropatia asociada con diabetes tipo 1. Por ejemplo, el sujeto esta en riesgo de desarrollar nefropatia asociada con diabetes tipo 2.

En un ejemplo, el sujeto padece de microalbuminuria. De acuerdo con este ejemplo, el tratamiento de acuerdo con la presente divulgacion puede reducir la microalbuminuria (por ejemplo, a menos de aproximadamente 30 mg de albumina por 24 horas de recoleccion de orina y/o 30 mg/l de albumina en una unica muestra y/o una ACR de menos de 3,5 mg/mmol para mujeres o menos de 2,5 mg/mmol para hombres o menos de aproximadamente 30 |jg de albumina/mg de creatinina.

En otro ejemplo, el tratamiento de acuerdo con la presente divulgacion previene o ralentiza la progresion de la microalbuminuria a macroalbuminuria.

En un ejemplo, el sujeto padece de tasa de filtracion glomerular reducida, por ejemplo, como se mide por la tasa de depuracion de creatinina reducida (por ejemplo, por debajo de 90 ml/min/1,73 m2). En un ejemplo, un metodo de la divulgacion mejora la tasa de filtracion glomerular.

En un ejemplo adicional, el sujeto padece de hipertension o prehipertension. En un ejemplo, un metodo de la divulgacion es eficaz para disminuir la presion sangumea sistolica y/o diastolica de un sujeto por lo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10 mm Hg o mas.

En un ejemplo, la realizacion de un metodo descrito en la presente de acuerdo con cualquier ejemplo de la divulgacion da como resultado la mejora de una respuesta clmica y/o una progresion de la enfermedad retardada.

Por "respuesta clmica" se entiende una mejora en los smtomas de la enfermedad. La respuesta clmica puede lograrse dentro de un cierto marco temporal, por ejemplo, dentro de o aproximadamente 8 semanas desde el comienzo del tratamiento con, o desde la administracion inicial. La respuesta clmica tambien puede mantenerse durante un penodo de tiempo, por ejemplo, durante >24 semanas, o >48 semanas.

La evaluacion cuantitativa de la funcion renal y los parametros de la disfuncion renal son bien conocidos en la tecnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en Levey (Am J Kidney Dis. 22(1):207-214, 1993). Ejemplos de ensayos para la determinacion de la funcion/disfuncion renal son: nivel de creatinina en suero; tasa de depuracion de creatinina; tasa de depuracion de cistatina C, depuracion de creatinina en orina en 24 horas, secrecion de protemas en orina en 24 horas; tasa de filtracion glomerular (GFR); proporcion de albumina creatinina en orina (ACR); tasa de excrecion de albumina (AER); y biopsia renal.

Inhibidores de la Senalizacion de VEGF-B

Protemas que Comprenden Regiones Variables de Anticuerpos

Un ejemplo de inhibidor de la senalizacion de VEGF-B comprende una region variable del anticuerpo, por ejemplo, es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que se une a VEGF-B y neutraliza la senalizacion de VEGF-B.

En un ejemplo, la region variable del anticuerpo se une espedficamente a VEGF-B.

Los anticuerpos y protemas adecuados que comprenden regiones variables de los mismos son conocidos en la tecnica.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF-B y fragmentos de los mismos se describen en la WO20061012688.

En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es un anticuerpo que inhibe competitivamente la union de 2H10 a VEGF-B o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es el anticuerpo 2H10 o una version quimerica, CDR injertada o humanizada del mismo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. A este respecto, el anticuerpo 2H10 comprende una Vh que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3 y una Vl que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4. Las versiones quimericas y humanizadas ejemplares de este anticuerpo se describen en la WO2006/012688.

En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo comprende una V^hque comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 y una V^lque comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es un anticuerpo que inhibe competitivamente la union de 4E12 a VEGF-B o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es el anticuerpo 4E12 o una version quimerica, CDR injertada o humanizada del mismo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. A este respecto, el anticuerpo 4E12 comprende una V^hque comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 7 y una V^lque comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 8.

En un ejemplo, el compuesto es una protema que comprende una region variable humanizada del anticuerpo 4E12. Por ejemplo, la protema comprende una region variable que comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la Vh y/o la Vl del anticuerpo 4E12. Por ejemplo, la protema comprende:

(i) una VHque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 25-34 de la SEQ ID NO: 7; (b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 49-65 de la SEQ ID NO: 7; y (c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 98-105 de la SEQ ID NO: 7; y/o

(ii) una VLque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 24-34 de la SEQ ID NO: 8: (b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 50-56 de la SEQ ID NO: 8; y (c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 89-97 de la SEQ ID NO: 8. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es un anticuerpo que inhibe competitivamente la union de 2F5 a VEGF-B o un fragmento de union al antfgeno del mismo. En un ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF-B o fragmento del mismo es el anticuerpo 2F5 o una version quimerica, CDR injertada o

humanizada del mismo o un fragmento de union al antfgeno del mismo. A este respecto, el anticuerpo 2E5

comprende una Vh que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9 y una Vl que comprende una

secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 10.

En un ejemplo, el compuesto es una protema que comprende una region variable humanizada del

anticuerpo 2F5. Por ejemplo, la protema comprende una region variable que comprende las regiones determinantes

de la complementariedad (CDR) de la Vh y/o la Vl del anticuerpo 2F5. Por ejemplo, la protema comprende:

(i) una H que comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 25-34 de la SEQ ID NO: 9;

(b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 49-65 de la SEQ ID NO: 9; y

(c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 98-107 de la SEQ ID NO: 9;

y/o

(ii) una V Lque comprende:

(a) una CDR1 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 24-34 de la SEQ ID NO (b) una CDR2 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 50-56 de la SEQ ID NO (c) una CDR3 que comprende una secuencia expuesta en los aminoacidos 89-96 de la SEQ ID NO En otro ejemplo, un anticuerpo o protema que comprende una region variable del mismo se produce

usando un metodo estandar, por ejemplo, como se conoce en la tecnica o se describe brevemente en la presente.

Metodos basados en la inmunizacion

Para generar anticuerpos, el VEGF-B o un fragmento portador de epftopo o una porcion del mismo o una

forma modificada del mismo o un acido nucleico que lo codifique (un "inmunogeno"), opcionalmente formulado con

cualquier adyuvante adecuado o deseado y/o portador farmaceuticamente aceptable, se administra a un sujeto (por

ejemplo, un sujeto animal no humano, como un raton, una rata, un pollo, etc.) en forma de composicion inyectable.

Los animales no humanos ejemplares son mairnferos, como animales murinos (por ejemplo, ratas o ratones). La

inyeccion puede ser intranasal, intramuscular, subcutanea, intravenosa, intradermica, intraperitoneal o por otra via

conocida. Opcionalmente, el inmunogeno se administra numerosas veces. Los medios para preparar y caracterizar

anticuerpos son conocidos en la tecnica (Ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory, 1988). Los metodos para producir anticuerpos anti-VEGF-B en ratones se describen en la

WO2006/012688.

La produccion de anticuerpos policlonales puede monitorizarse muestreando de sangre del animal

inmunizado en varios puntos despues de la inmunizacion. Se puede administrar una segunda inyeccion de refuerzo,

si se requiere, para lograr un tftulo de anticuerpo deseado. El proceso de refuerzo y titulacion se repite hasta lograr

un tftulo adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, se extrae una muestra de sangre del

animal inmunizado el suero se afsla y almacena, y/o el animal se utiliza para generar anticuerpos monoclonales

(mAbs).

Los anticuerpos monoclonales son anticuerpos ejemplares contemplados por la presente divulgacion.

Generalmente, la produccion de anticuerpos monoclonales implica, inmunizar un sujeto (por ejemplo, un roedor, por

ejemplo, un raton o una rata) con el inmunogeno bajo condiciones suficientes para estimular las celulas productoras

de anticuerpos. En algunos ejemplos, un raton disenado geneticamente para expresar anticuerpos humanos y no

expresar protemas de anticuerpos murinos, se inmuniza para producir un anticuerpo (por ejemplo, como se describe

en el PCT/US2007/008231 y/o Lonberg et al., Nature 368 (1994):856-859). Despues de la inmunizacion, las celulas

somaticas productoras de anticuerpos (por ejemplo, linfocitos B) se fusionan con celulas inmortales, por ejemplo,

celulas de mieloma inmortales. Varios metodos para producir tales celulas fusionadas (hibridomas) son conocidos en

la tecnica y se describen, por ejemplo, en Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497, 1975. Las celulas del hibridoma se

pueden cultivar luego bajo condiciones suficientes para la produccion de anticuerpos.

La presente divulgacion contempla otros metodos para producir anticuerpos, por ejemplo, tecnologfa ABL-MYC (como se describe, por ejemplo, en Largaespada et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 166. 91-96. 1990).

Metodos basados en Bibliotecas

La presente divulgacion tambien abarca la seleccion de bibliotecas de anticuerpos o protemas que

comprenden dominios de union al antfgeno de los mismos (por ejemplo, que comprenden regiones variables de los

mismos) para identificar un anticuerpo o protema de union a v Eg F-B que comprende una region variable de los

mismos.

Los ejemplos de bibliotecas contempladas por esta divulgacion incluyen bibliotecas sin tratamiento previo (de sujetos no expuestos), bibliotecas inmunizadas (de sujetos inmunizados con un antigeno) o bibliotecas sinteticas. Los acidos nucleicos que codifican anticuerpos o regiones de los mismos (por ejemplo, regiones variables) se clonan mediante tecnicas convencionales (por ejemplo, como se describe en Sambrook y Russell, eds, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed, vols. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) y se usan para codificar y mostrar protemas usando un metodo conocido en la tecnica. Otras tecnicas para producir bibliotecas de protemas se describen en, por ejemplo, la US6300064 (por ejemplo, una biblioteca HuCAl de Morphosys AG); la US5885793; US6204023; US6291158; o US6248516.

Las protemas de acuerdo con la divulgacion pueden ser protemas secretadas solubles o pueden presentarse como una protema de fusion en la superficie de una celula, o partmula (por ejemplo, un fago u otro virus, un ribosoma o una espora). En la tecnica se conocen varios formatos de biblioteca de presentacion. Por ejemplo, la biblioteca es una biblioteca de presentacion in vitro (por ejemplo, una biblioteca de presentacion de ribosomas, una biblioteca de presentacion covalente o una biblioteca de presentacion de ARNm, por ejemplo, como se describe en la US7270969). En otro ejemplo mas, la biblioteca de presentacion es una biblioteca de presentacion de fagos en la que las protemas que comprenden dominios de union a antfgeno de anticuerpos se expresan en fagos, por ejemplo, como se describe en la US6300064; US5885793; US6204023; US6291158; o US6248516. Otros metodos de presentacion de fagos son conocidos en la tecnica y se contemplan en la presente divulgacion. De manera similar, los metodos de presentacion celular se contemplan por la divulgacion, por ejemplo, bibliotecas de presentacion bacteriana, por ejemplo, como se describe en la US5516637; bibliotecas de presentacion de levadura, por ejemplo, como se describe en la US6423538 o una biblioteca de presentacion de mairnferos.

Los metodos para seleccionar bibliotecas de presentacion son conocidos en la tecnica. En un ejemplo, una biblioteca de presentacion de la presente divulgacion se selecciona usando purificacion por afinidad, por ejemplo, como se describe en Scopes (en: Protein purification: principles and practice, Tercera edicion. Springer Verlag, 1994). Los metodos de purificacion por afinidad tfpicamente implican poner en contacto protemas que comprenden dominios de union al antfgeno presentados por la biblioteca con un antfgeno objetivo (por ejemplo, VEGF-B) y, despues del lavado, agrupar aquellos dominios que permanecen unidos al antfgeno.

Cualquier region variable o scFv identificados por seleccion se modifican facilmente en un anticuerpo completo, si se desea. Los metodos ejemplares para modificar o reformatear regiones variables o scFv en un anticuerpo completo se describen, por ejemplo, en Jones et al., J. Immunol Methods. 354:85-90, 2010; o Jostock et al., J. Immunol Methods, 289: 65-80. 2004. Alternativamente, o adicionalmente, se usan metodos de clonacion estandar, por ejemplo, como se describe en Ausubel et al (En: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, I^sBⁿ047150338, 1987), y/o (Sambrook et al (En: Molecular Cloning : Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Tercera edicion 2001).

Protemas desinmunizadas, quimericas, humanizadas, sinhumanizadas, primatizadas y humanas

Las protemas de la presente divulgacion pueden ser una protema humanizada.

Se entendera que el termino "protema humanizada" se refiere a una protema que comprende una region variable de tipo humano, que incluye c Dr de un anticuerpo de una especie no humana (por ejemplo, raton o rata o primate no humano) injertadas o insertadas en FR de un anticuerpo humano (este tipo de anticuerpo tambien se refiere a un "anticuerpo injertado en CDR"). Las protemas humanizadas tambien incluyen protemas en las que uno o mas residuos de la protema humana estan modificados por una o mas sustituciones de aminoacidos y/o uno o mas residuos de FR de la protema humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Las protemas humanizadas tambien pueden comprender residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo humano ni en el anticuerpo no humano. Cualquier region adicional de la protema (por ejemplo, region Fc) es generalmente humana. La humanizacion puede realizarse usando un metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, US5225539, US6054297, US7566771 o US5585089. El termino "protema humanizada" tambien abarca una protema super-humanizada, por ejemplo, como se describe en la US7732578.

Las protemas de la presente divulgacion pueden ser protemas humanas. El termino "protema humana", como se usa en la presente, se refiere a protemas que tienen regiones de anticuerpos variables y, opcionalmente, constantes encontradas en humanos, por ejemplo, en la lmea germinal humana o en celulas somaticas o de bibliotecas producidas usando tales regiones. Los anticuerpos "humanos" pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias humanas, por ejemplo, mutaciones introducidas por mutaciones aleatorias o dirigidas al sitio in vitro (en particular, mutaciones que implican sustituciones conservadoras o mutaciones en un pequeno numero de residuos de la protema, por ejemplo, en 1, 2, 3, 4 o 5 de los residuos de la protema). Estos "anticuerpos humanos" no necesariamente necesitan ser generados como resultado de una respuesta inmune de un humano, sino que pueden generarse usando medios recombinantes (por ejemplo, seleccionando una biblioteca de presentacion de fagos) y/o por un animal transgenico (por ejemplo, un raton) que comprende acido nucleico que codifica regiones constantes y/o variables de anticuerpos humanos y/o que usa seleccion guiada (por ejemplo, como se describe en la US5565332). Este termino tambien abarca formas maduradas por afinidad de tales anticuerpos. Para los propositos de la presente divulgacion, tambien se considerara que una protema humana incluye una protema que comprende las FR de un anticuerpo humano o FR que comprenden secuencias de una secuencia de consenso de FR humanas y en la que una o mas de las CDR son aleatorias o semi-aleatorias, por ejemplo, como se describe en la US6300064 y/o la US6248516.

Las protemas de la presente divulgacion pueden ser protemas sinhumanizadas. El termino "protema sinhumanizada" se refiere a una protema preparada por un metodo descrito en la WO2007/019620. Una protema sinhumanizada incluye una region variable de un anticuerpo, en donde la region variable comprende FR de una region variable de anticuerpo de primate del Nuevo Mundo y CDR de una region variable de anticuerpo de primate no del Nuevo Mundo. Por ejemplo, una protema sinhumanizada incluye una region variable de un anticuerpo, en donde la region variable comprende FR de una region variable de anticuerpo de primate del Nuevo Mundo y CDR de un anticuerpo de raton o rata.

Las protemas de la presente divulgacion pueden ser protemas primatizadas. Una "protema primatizada" comprende region(es) de un anticuerpo generada despues de la inmunizacion de un primate no humano (por ejemplo, un macaco cynomolgus). Opcionalmente, las regiones variables del anticuerpo de primate no humano se enlazan a regiones constantes humanas para producir un anticuerpo primatizado. Los metodos ejemplares para producir anticuerpos primatizados se describen en la US6113898.

En un ejemplo, una protema de la divulgacion es una protema quimerica. El termino "protemas quimericas" se refiere a protemas en las que un dominio de union al antfgeno es de una especie particular (por ejemplo, murina, como de raton o rata) o pertenece a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la protema es de protema derivada de otra especie (como, por ejemplo, primate humano o no humano) o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos. En un ejemplo, una protema quimerica es un anticuerpo quimerico que comprende una V^hy/o una V^lde un anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo murino) y las regiones restantes del anticuerpo son de un anticuerpo humano. La produccion de tales protemas quimericas es conocida en la tecnica, y puede lograrse por medios estandar (como se describe, por ejemplo, en la US6331415; US5807715; US4816567 y US4816397).

La presente descripcion tambien contempla una protema desinmunizada, por ejemplo, como se describe en la WO2000/34317 y la WO2004/108158. Los anticuerpos y protemas desinmunizados tienen uno o mas epftopos, por ejemplo, epftopos de celulas B o epftopos de celulas T eliminados (es decir, mutados) para reducir de este modo la probabilidad de que un sujeto genere una respuesta inmune contra el anticuerpo o la protema.

Otras protemas que comprenden regiones variables de anticuerpos

La presente divulgacion tambien contempla otras protemas que comprenden una region variable o un dominio de union al antfgeno de un anticuerpo, como:

(i) un anticuerpo de un solo dominio, que es una cadena polipeptfdica sencilla que comprende todo o una parte de la V^ho una V^lde un anticuerpo (ver, por ejemplo, la US6248516);

(ii) diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, por ejemplo, como se describe en la US5844094 y/o la US2008152586;

(iii) scFv, por ejemplo, como se describe en la US5260203;

(iv) minicuerpos, por ejemplo, como se describe en la US5837821;

(v) protemas biespedficas de "llave y agujero" como se describe en la US5731168 :

(vi) protemas heteroconjugadas, por ejemplo, como se describe en la US4676980;

(vii) protemas heteroconjugadas producidas usando un reticulador qmmico, por ejemplo, como se describe en la US4676980;

(viii) fragmentos Fab'-SH, por ejemplo. como se describe en Shalaby et al, J. Exp. Med., 175: 217-225, 1992; o

(ix) Fab³(por ejemplo, como se describe en la EP19930302894).

Fusiones de Dominio Constantes

La presente divulgacion abarca una protema que comprende una region variable de un anticuerpo y una region constante o Fc o un dominio del mismo, por ejemplo, el dominio Ch2 y/o Ch3. Las regiones y/o dominios constantes adecuados seran evidentes para el experto en la tecnica y/o las secuencias de tales polipeptidos estan facilmente disponibles en bases de datos publicamente disponibles. Kabat et al tambien proporcionan una descripcion de algunas regiones/dominios constantes adecuados.

Las regiones constantes y/o dominios de las mismas son utiles para proporcionar actividades biologicas como, dimerizacion, semivida serica prolongada, por ejemplo, mediante la union a FcRn (receptor de Fc neonatal), citotoxicidad celular dependiente de antfgeno (ADC^c), citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), fagocitosis celular dependiente del antigeno (ADCP).

La presente divulgacion tambien contempla protemas que comprenden regiones o dominios constantes mutantes, por ejemplo, como se describe en la US7217797; LTS72171Y8: o US20090041770 (teniendo vida media aumentada) o LTS2005037000 (ADCC aumentada).

Protemas Estabilizadas

Las protemas neutralizantes de la presente divulgacion pueden comprender una region constante de IgG4 o una region constante de IgG4 estabilizada. Se entendera que la expresion "region constante de IgG4 estabilizada" significa una region constante de IgG4 que se ha modificado para reducir el intercambio de brazos Fab o la propension a sufrir un intercambio de brazos Fab o la formacion de un medio-anticuerpo o una propension a formar un medio anticuerpo. "Intercambio de brazo Fab" se refiere a un tipo de modificacion de protemas para la IgG4 humana, en la que una cadena pesada de IgG4 y una cadena ligera unida (media-molecula) se intercambian por un par de cadenas pesada-ligera de otra molecula de IgG4. Por tanto, las moleculas de IgG4 pueden adquirir dos brazos Fab distintos que reconocen dos antfgenos distintos (dando como resultado moleculas biespedficas). El intercambio de brazos Fab tiene lugar naturalmente in vivo y puede inducirse in vitro por celulas sangumeas purificadas o agentes reductores como glutation reducido. Un "medio anticuerpo" se forma cuando un anticuerpo IgG4 se disocia para formar dos moleculas, cada una de las cuales contiene una unica cadena pesada y una unica cadena ligera.

En un ejemplo, una region constante de IgG4 estabilizada comprende una prolina en la posicion 241 de la region bisagra segun el sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services. 1987 y/o 1991). Esta posicion corresponde a la posicion 228 de la region bisagra de acuerdo con el sistema de numeracion de la UE (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad USA, 63, 78-85, 1969). En la IgG4 humana, este residuo es generalmente una serina. Despues de la sustitucion de la serina por prolina, la region bisagra de IgG4 comprende una secuencia CPPC. A este respecto, el experto en la tecnica sabra que la "region bisagra" es una porcion rica en prolina de una region constante de la cadena pesada del anticuerpo que une las regiones Fc y Fab que confiere movilidad en los dos brazos Fab de un anticuerpo. La region bisagra incluye residuos de cistema que estan implicados en enlaces disulfuro de cadena inter-pesada. Generalmente se define como el estiramiento de Glu226 a Pro243 de IgG1 humana de acuerdo con el sistema de numeracion de Kabat. Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG1 colocando el primer y el ultimo residuo de cistema que forman enlaces disulfuro de cadena inter-pesada (S-S) en las mismas posiciones (ver, por ejemplo la WO2010108O538).

Inhibidores de la Senalizacion de VEGF-B Basados en Protemas Adicionales

Otras proteinas que pueden interferir con la interaccion productiva de VEGF-B con su receptor incluyen proteinas VEGF-B mutantes.

En un ejemplo, el inhibidor es una protema soluble que comprende uno o mas dominios de un VEGF-R1 que se encuentran detras de VEGF-B (y, por ejemplo, no se unen sustancialmente a VEGF-A). En un ejemplo, la protema soluble comprende adicionalmente una region constante de un anticuerpo, tal como un anticuerpo IgG1. Por ejemplo, la protema soluble comprende adicionalmente una region Fc y, opcionalmente, una region bisagra de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG1.

En un ejemplo, el inhibidor de proteinas es un mimetico de anticuerpos, por ejemplo, un andamiaje de proteinas que comprende regiones variables que se unen a una protema objetivo de una manera analoga a un anticuerpo. A continuacion se proporciona una descripcion de mimeticos de anticuerpos ejemplares.

Inmunoglobulinas y Fragmentos de Inmunoglobulinas

Un ejemplo de un compuesto de la presente divulgacion es una protema que comprende una region variable de una inmunoglobulina, como un receptor de celulas T o una inmunoglobulina de cadena pesada (por ejemplo, una IgNAR, un anticuerpo camelido).

Inmunoglobulinas de Cadena Pesada

Las inmunoglobulinas de cadena pesada difieren estructuralmente de muchas otras formas de inmunoglobulina (por ejemplo, anticuerpos) en la medida en que comprenden una cadena pesada, pero no comprenden una cadena ligera. Por consiguiente, estas inmunoglobulinas tambien son referidas como "anticuerpos de cadena pesada solamente". Las inmunoglobulinas de cadena pesada se encuentran, por ejemplo, en camelidos y peces cartilaginosos (tambien denominadas IgNAR).

Las regiones variables presentes en inmunoglobulinas de cadena pesada de origen natural son referidas generalmente como " dominios Vhh" en Ig de camelidos y V-NAR en IgNAR, con el fin de distinguirlos de las regiones variables de cadena pesada que estan presentes en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que son referidos como " dominios V^h") y de las regiones variables de cadena ligera que estan presentes en los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que son referidos como " dominios V^l").

Las inmunoglobulinas de cadena pesada no requieren la presencia de cadenas ligeras para unirse con alta afinidad y con alta especificidad a un antfgeno relevante. Esto significa que los fragmentos de union a un unico dominio pueden derivarse de inmunoglobulinas de cadena pesada, que son faciles de expresar y son generalmente estables y solubles.

Una descripcion general de las inmunoglobulinas de cadena pesada de los camelidos y las regiones variables de las mismas y los metodos para su produccion y/o aislamiento y/o uso se encuentran, entre otros, en las referencias siguientes; WO94/04678, WO/49805 y WO 97/49805.

Una descripcion general de las inmunoglobulinas de cadena pesada de peces cartilaginosos y las regiones variables de las mismas y los metodos para su produccion y/o aislamiento y/o uso se encuentran, entre otros, en la WO2005/118629.

Protemas Tipo V

Un ejemplo de un compuesto de la divulgacion es un receptor de celulas T. Los receptores de celulas T tienen dos dominios V que se combinan en una estructura similar al modulo Fv de un anticuerpo. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991 describe como los dos dominios V del receptor de celulas T (denominados alfa y beta) pueden fusionarse y expresarse como un polipeptido de cadena sencilla y, ademas, como alterar los residuos de superficie para reducir la hidrofobicidad directamente analoga a un anticuerpo scFv. Otras publicaciones que describen la produccion de receptores de celulas T de cadena sencilla o receptores de celulas T multimericos que comprenden dos dominios V-alfa y V-beta incluyen la WO1999/045110 o la WO2011/107595.

Otras protemas no de anticuerpos que comprenden dominios de union a antfgeno incluyen protemas con dominios de tipo V, que son generalmente monomericas. Los ejemplos de protemas que comprenden dichos dominios tipo V incluyen CTLA-4, CD28 e ICOS. La divulgacion adicional de protemas que comprenden dichos dominios tipo V se incluye en la WO1999/045110.

Adnectinas

En un ejemplo, un compuesto de la divulgacion es una adnectina. Las adnectinas se basan en el decimo dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) de la fibronectina humana en la que las regiones de giro se alteran para conferir la union al antfgeno. Por ejemplo, se pueden disenar tres giros en un extremo del sandwich p del dominio 10Fn3 para permitir que una adnectina reconozca espedficamente un antfgeno. Para mas detalles ver la US20080139791 o la WO2005/056764.

Anticalinas

En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgacion es una anticalina. Las anticalinas se derivan de lipocalinas, que son una familia de protemas extracelulares que transportan moleculas hidrofobas pequenas como esteroides, bilinas, retinoides y lfpidos. Las lipocalinas tienen una estructura secundaria de lamina p ngida con una pluralidad de giros en el extremo abierto de la estructura conica que puede disenarse para unirse a un antfgeno. Estas lipocalinas disenadas son conocidas como anticalinas. Para una descripcion mas detallada de las anticalinas ver la US7250297B1 o la US20070224633.

Afficuerpos

En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgacion es un afficuerpo. Un afficuerpo es un andamiaje derivado del dominio Z (dominio de union al antfgeno) de la protema A de Staphylococcus aureus que puede disenarse para unirse al antfgeno. El dominio Z consiste de un haz de tres helices de aproximadamente 58 aminoacidos. Se han generado bibliotecas por aleatorizacion de residuos superficiales. Para mas detalles ver la EP1641818.

Av^meros

En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgacion es un Avfmero. Los avfmeros son protemas multidominio derivadas de la familia de andamiaje de dominio A. Los dominios nativos de aproximadamente 35 aminoacidos adoptan una estructura unida por disulfuro definida. La diversidad se genera transponiendo la variacion natural mostrada por la familia de dominios A. Para mas detalles ver la WO2002088171.

DARPins

En un ejemplo adicional, un compuesto de la descripcion es una protema de repeticion de anquirina disenada (DARPin). Las DARPins se derivan de la anquirina, que es una familia de protemas que median la union de protemas de membrana integrales al citoesqueleto. Una unica repeticion de anquirina es un motivo de 33 residuos que consiste de dos helices a y un giro p. Pueden disenarse para unirse a diferentes antigenos objetivo aleatorizando los residuos en la primera helice a y un giro p de cada repeticion. Su interfaz de union puede aumentarse aumentando el numero de modulos (un metodo de maduracion de afinidad). Para detalles adicionales ver la US20040132028.

Metodos para producir protemas

Expresion Recombinante

En el caso de una protema recombinante, los acidos nucleicos que codifican la misma se pueden clonar en vectores de expresion, que luego se transfectan en celulas huesped, como celulas de E. coli, celulas de levadura, celulas de insecto, o celulas de mairnferos, como celulas COS de simio, celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas de rinon embrionario humano (HEK) o celulas de mieloma que de otro modo no producen un anticuerpo. Las celulas ejemplares usadas para expresar una protema de la divulgacion son celulas CHO, celulas de mieloma o celulas HEK. Las tecnicas de clonacion molecular para lograr estos fines son conocidas en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora) o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Una amplia variedad de metodos de clonacion y amplificacion in vitro son adecuados para la construccion de acidos nucleicos recombinantes. Los metodos para producir anticuerpos recombinantes tambien se conocen en la tecnica. Ver la US4816567 o la US5530101.

Tras el aislamiento, el acido nucleico se inserta operativamente ligado a un promotor en un constructo de expresion o vector de expresion para clonacion adicional (amplificacion del ADN) o para la expresion en un sistema libre de celulas o en celulas.

Como se usa en la presente, el termino "promotor" debe tomarse en su contexto mas amplio e incluye las secuencias reguladoras transcripcionales de un gen genomico, incluyendo la caja TATA o el elemento iniciador, que se requiere para el inicio preciso de la transcripcion, con o sin elementos reguladores adicionales. (por ejemplo, secuencias activadoras en sentido ascendente, sitios de union al factor de transcripcion, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresion de un acido nucleico, por ejemplo, en respuesta a un estfmulo de desarrollo y/o externo, o de una manera espedfica del tejido. En el presente contexto, el termino "promotor" tambien se usa para describir un acido nucleico recombinante, sintetico o de fusion, o derivado que confiere, activa o mejora la expresion de un acido nucleico al que esta ligado operativamente. Los promotores ejemplares pueden contener copias adicionales de uno o mas elementos reguladores espedficos para mejorar aun mas la expresion y/o alterar la expresion espacial y/o la expresion temporal de dicho acido nucleico.

Como se usa en la presente, el termino "ligado operativamente a" significa posicionar un promotor en relacion a un acido nucleico de tal manera que la expresion del acido nucleico este controlada por el promotor.

Hay disponibles muchos vectores para la expresion en las celulas. Los componentes de vectores generalmente incluyen, pero no estan limitados a, uno o mas de los siguientes: una secuencia de senal, una secuencia que codifica un anticuerpo (por ejemplo, derivada de la informacion proporcionada en la presente), un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminacion de la transcripcion. El experto en la materia conocera secuencias adecuadas para la expresion de un anticuerpo. Las secuencias de senales ejemplares incluyen senales de secrecion procariota (por ejemplo, PelB, fosfatasa alcalina, penicilinasa. Ipp o enterotoxina II estable al calor), senales de secrecion de levadura (por ejemplo, lfder de invertasa, lfder de factor a, o lfder de fosfatasa acida) o senales de secrecion de marnfferos (por ejemplo, senal gD de herpes simplex).

Los promotores ejemplares activos en celulas de mamfferos incluyen promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE), promotor del factor de alargamiento humano 1-a (EF1), promotores de ARN nuclear pequenos (U 1a y U 1b), promotor de la cadena pesada de a-miosina, promotor de virus 40 de simio (SV40). promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor tardfo principal del adenovirus, promotor de p-actina, elemento regulador hfbrido que comprende un potenciador de CMV/promotor de p-actina o un promotor de inmunoglobulina o un fragmento activo del mismo. Ejemplos de lmeas celulares huesped mamfferas utiles son la lmea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de rinon embrionario humano (293 o celulas 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension; celulas de rinon de cna de hamster (BHK, ATCC CCL 10) o celulas de ovario de hamster chino (CHO).

Los promotores tfpicos adecuados para la expresion en celulas de levadura como, por ejemplo, una celula de levadura seleccionada del grupo que comprende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y S. pombe, incluyen, pero no estan limitados a, el promotor ADH1, el promotor GAL1, el promotor GAL4, el promotor CUP1, el promotor PHO5, el promotor nmt, el promotor RPR1, o el promotor TEF1.

Los medios para introducir el acido nucleico aislado o el constructo de expresion que comprende el mismo en una celula para la expresion son conocidos por los expertos en la tecnica. La tecnica usada para una celula dada depende de las tecnicas exitosas conocidas. Los medios para introducir ADN recombinante en las celulas incluyen la microinyeccion, la transfeccion mediada por DEAE-dextrano, la transfeccion mediada por liposomas como el uso de lipofectamina (Gibco, MD, USA) y/o la celfectina (Gibco, MD, USA), la captacion de ADN mediada por PEG, la electroporacion y bombardeo de micropartmulas, como el uso de partmulas de tungsteno u oro recubiertas con ADN (Agracetus Inc., WI, USA), entre otras.

Las celulas huesped usadas para producir el anticuerpo pueden cultivarse en una variedad de medios, dependiendo del tipo de celula usado. Los medios disponibles comercialmente como F10 de Ham (Sigma), Medio Esencial Mmimo((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ((Dm EM), Sigma) son adecuados para el cultivo de celulas de mairnferos. Los medios para cultivar otros tipos de celulas tratados en la presente son conocidos en la tecnica.

Purificacion De Protemas

Despues de la produccion/expresion, una protema de la divulgacion se purifica usando un metodo conocido en la tecnica. Dicha purificacion proporciona la protema de la divulgacion sustancialmente libre de protemas, acidos, lfpidos, carbohidratos y similares no espedficos. En un ejemplo, la protema estara en una preparacion en la que mas de aproximadamente el 90% (por ejemplo, 95%, 98% o 99%) de la protema en la preparacion es una protema de la divulgacion.

Se emplean metodos estandar de purificacion de peptidos para obtener una protema aislada de la divulgacion, incluyendo, pero no limitados a, varios protocolos de aislamiento de polipeptidos de cromatograffa lfquida (HPLC) y no HpLC de alta presion (o rendimiento), como cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de modo mixto, metodos de separacion de fases, separaciones electroforeticas, metodos de precipitacion, metodos de salado de entrada/salida, inmunocromatograffa y/o otros metodos.

En un ejemplo, la purificacion por afinidad es util para aislar una protema de fusion que comprende un marcador. Los metodos para aislar una protema mediante cromatograffa por afinidad son conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Scopes (en: Protein purification: principles and practice, Tercera edicion, Springer Verlag, 1994). Por ejemplo, un anticuerpo o compuesto que se une al marcador (en el caso de un marcador de polihistidina puede ser, por ejemplo, mquel-NTA) se inmoviliza sobre un soporte solido. Una muestra que comprende una protema se pone luego en contacto con el anticuerpo o compuesto inmovilizado durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para que se produzca la union. Despues del lavado, se eluye la protema para eliminar cualquier protema no unida o unida no espedficamente.

En el caso de una protema que comprende una region Fc de un anticuerpo, pueden usarse la protema A o protema G o formas modificadas de las mismas para purificacion por afinidad. La protema A es util para aislar protemas purificadas que comprenden una region Fc de cadena pesada ^y1, ^y2 o ^y4 humana. La protema G se recomienda para todos los isotipos de Fc de raton y para ^y3 humana.

Inhibidores de la Senalizacion de VEGF-B Basados en Acidos Nucleicos

En un ejemplo de la divulgacion, los metodos terapeuticos y/o profilacticos como se describen en la presente de acuerdo con cualquier ejemplo de la divulgacion implican reducir la expresion de VEGF-B. Por ejemplo, tal metodo implica administrar un compuesto que reduce la transcripcion y/o la traduccion del acido nucleico. En un ejemplo, el compuesto es un acido nucleico, por ejemplo, un polinucleotido antisentido, una ribozima, un PNA, un ARN interferente, un ARNip, un microARN

Acidos Nucleicos Antisentido

Se entendera que el termino "acido nucleico antisentido" significa un ADN o ARN o un derivado de los mismos (por ejemplo, lNa o PNA), o una combinacion de los mismos que sea complementaria a por lo menos una porcion de una molecula de ARNm espedfica que codifica un polipeptido como se describe en la presente en Cualquier ejemplo de la divulgacion y sea capaz de interferir con un evento pos-transcripcional como la traduccion de ARNm. El uso de metodos antisentido es conocido en la tecnica (ver, por ejemplo, Hartmann y Endres (editores). Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)).

Un acido nucleico antisentido de la divulgacion hibridara con un acido nucleico objetivo bajo condiciones fisiologicas. Los acidos nucleicos antisentido incluyen secuencias que corresponden a genes estructurales o regiones codificantes o secuencias que efectuan el control sobre la expresion o el corte y empalme de genes. Por ejemplo, el acido nucleico antisentido puede corresponder a la region codificante objetivo de un acido nucleico que codifica VEGF-B, o la region 5' no traducida (UTR) o la 3'-UTR o una combinacion de estas. Puede ser complementary en parte a las secuencias de intrones, que pueden cortarse y empalmarse durante o despues de la transcripcion, por ejemplo solo a las secuencias de exones del gen objetivo. La longitud de la secuencia antisentido debe ser por lo menos de 19 nucleotidos contiguos, por ejemplo, por lo menos 50 nucleotidos, como por lo menos 100, 200, 500 o 1000 nucleotidos de un acido nucleico que codifica VEGF-B. Se puede usar la secuencia de longitud completa complementaria a la transcripcion del gen completo. La longitud puede ser de 100-2000 nucleotidos. El grado de identidad de la secuencia antisentido para el transcrito objetivo debe ser por lo menos del 90%, por ejemplo, del 95-100%.

Los acidos nucleicos antisentido ejemplares contra VEGF-B se describen, por ejemplo, en la WO2003/105754.

Acido Nucleico Catalitico

El termino "acido nucleico catalttico" se refiere a una molecula de ADN o molecula que contiene ADN (tambien conocida en la tecnica como una "desoxirribozima" o "ADNzima") o un ARN o a molecula que contiene ARN (tambien conocida como una "ribozima" o "ARNzima") que reconoce espedficamente un sustrato distinto y cataliza la modificacion qmmica de este sustrato. Las bases de acido nucleico en el acido nucleico catalitico pueden ser bases A, C, G, T (y U para ARN).

Tfpicamente, el acido nucleico catalitico contiene una secuencia antisentido para el reconocimiento espedfico de un acido nucleico objetivo y una actividad enzimatica de escision del acido nucleico (tambien referida en la presente como el "dominio catalttico"). Los tipos de ribozimas que son utiles en esta divulgacion son una ribozima de cabeza de martillo y una ribozima de horquilla.

Interferencia de ARN

La interferencia de ARN (ARNi) es util para inhibir espedficamente la produccion de una protema particular. Sin querer estar limitados por la teona, esta tecnologfa se basa en la presencia de moleculas de ARNdc que contienen una secuencia que es esencialmente identica al ARNm del gen de interes o parte del mismo, en este caso un ARNm que codifica un VEGF-B. Convenientemente, el ARNdc puede producirse a partir de un unico promotor en una celula huesped de vector recombinante, donde las secuencias de sentido y antisentido estan flanqueadas por una secuencia no relacionada que permite que las secuencias de sentido y antisentido hibriden para formar la molecula de ARNdc con el secuencia no relacionada que forma una estructura de giro. El diseno y la produccion de moleculas de ARNdc adecuadas para la presente divulgacion estan dentro de la capacidad de un experto en la tecnica, considerando particularmente las WO99/32619, WO99/53050, WO99/49029 y WO01/34815.

La longitud de las secuencias de sentido y antisentido que hibridan debe ser cada una de por lo menos 19 nucleotidos contiguos, como por lo menos 30 o 50 nucleotidos, por ejemplo, por lo menos 100, 200, 500 o 1000 nucleotidos. Se puede usar la secuencia de longitud completa correspondiente a la transcripcion del gen completo. Las longitudes pueden ser de 100-2000 nucleotidos. El grado de identidad de las secuencias de sentido y antisentido para la transcripcion dirigida debe ser por lo menos del 85%, por ejemplo, por lo menos del 90%, tal como el 95 100%.

Las moleculas de ARN interferente pequenas ("ARNip") ejemplares comprenden una secuencia de nucleotidos que es identica a aproximadamente 19-21 nucleotidos contiguos del ARNm objetivo. Por ejemplo, la secuencia de ARNip comienza con el dinucleotido AA, comprende un contenido de GC de aproximadamente el 30 70% (por ejemplo, 30-60%, como 40-60% por ejemplo aproximadamente 45%-55%), y no tiene un alto porcentaje de identidad con ninguna secuencia de nucleotidos distinta del objetivo en el genoma del marnffero en el que se va a introducir, por ejemplo, segun lo determinado por la busqueda BLAST estandar. Un ARNip ejemplar que reduce la expresion de VEGF-B esta disponible comercialmente de Santa Cruz Biotechnology o Novus Biologicals.

El RNA de horquilla corta (ARNhc) que reduce la expresion de VEGF-B tambien se conoce en la tecnica y esta disponible comercialmente de Santa Cruz Biotechnology.

Ensayos de Seleccion

Los compuestos que inhiben la senalizacion de VEGF-B pueden identificarse usando tecnicas conocidas en la tecnica. por ejemplo, como se describe a continuacion. De manera similar, las cantidades de inhibidores de senalizacion de VEGF-B adecuados para su uso en un metodo descrito en la presente pueden determinarse o estimarse utilizando tecnicas conocidas en la tecnica, por ejemplo, como se describe a continuacion.

Ensayos de Neutralizacion

Para los compuestos que se unen a VEGF-B e inhiben la senalizacion, puede usarse un ensayo de neutralizacion.

En un ejemplo, un ensayo de neutralizacion implica poner en contacto VEGF-B con un compuesto en presencia o ausencia de VEGF-R1 soluble detectablemente marcado o poner en contacto VEGF-B soluble detectablemente marcado con un compuesto en presencia o ausencia de una celula que expresa VEGF-R1 o un VEGF-R1 soluble. Luego se evalua el nivel de VEGF-B unido a VEGF-R1. Un nivel reducido de VEGF-B unido en presencia del compuesto en comparacion con en ausencia del compuesto indica que el compuesto inhibe la union de VEGF-B a VEGF-R1 y, como consecuencia, la senalizacion de VEGF-B.

Otro ensayo de neutralizacion se describe en la WO2006/012688 e implica poner en contacto un fragmento de VEGF-R1 que comprende el segundo dominio tipo Ig inmovilizado en un soporte solido con una concentracion de subsaturacion de VEGF-B recombinante preincubado con un compuesto. Despues del lavado para eliminar la protema no unida, la protema inmovilizada se pone en contacto con el anticuerpo anti-VEGF-B y se determina la cantidad de anticuerpo unido (indicativo de VEGF-B inmovilizado). Un compuesto que reduce el nivel de anticuerpo unido en comparacion con el nivel en ausencia del compuesto se considera un inhibidor de la senalizacion de VEGF-B.

En otro ejemplo, un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B se identifica usando una celula dependiente de la senalizacion de VEGF-B para la proliferacion, por ejemplo, una celula BaF3 modificada como se describe en la WO2006/012688 para expresar un receptor quimerico que incorpora el dominio intracelular del receptor de eritropoyetina humana y el dominio extracelular de VEGF-R1. Las celulas se cultivan en presencia de VEGF-B y en presencia o ausencia de un compuesto. Luego se evalua la proliferacion celular usando metodos estandar, por ejemplo, ensayos de formacion de colonias, incorporacion de timidina o captacion de otro marcador adecuado de la proliferacion celular (por ejemplo, un ensayo de reduccion de colorante MTS). Un compuesto que reduce el nivel de proliferacion en presencia de VEGF-B se considera un inhibidor de la senalizacion de VEGF-B.

Los compuestos tambien pueden evaluarse por su capacidad para unirse a VEGF-B usando metodos estandar. Los metodos para evaluar la union a una protema son conocidos en la tecnica, por ejemplo, como se describe en Scopes (En: Protein purification: principles and practice, Tercera edicion, Springer Verlag, 1994). Dicho metodo generalmente implica marcar el compuesto y ponerlo en contacto con VEGF-B inmovilizado. Despues del lavado para eliminar el compuesto unido no espedfico, se detecta la cantidad de marcador y, como consecuencia, el compuesto unido. Por supuesto, el compuesto puede inmovilizarse y el VEGF-B puede marcarse. Tambien se pueden usar ensayos tipo adsorcion. Alternativa, o adicionalmente, pueden usarse ensayos de resonancia de plasmones de superficie.

Ensayos de Expresion

Un compuesto que reduce o evita la expresion de VEGF-B se identifica poniendo en contacto una celula con el compuesto y determinando el nivel de expresion de VEGF-B. Los metodos adecuados para determinar la expresion genica a nivel de acido nucleico son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, la reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) o ensayos de micromatrices. Los metodos adecuados para determinar la expresion a nivel de protema tambien se conocen en la tecnica e incluyen, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo inmunoabsorbente ligado a fluorescencia (ELlSA), inmunofluorescencia o transferencia Western.

Ensayos in vivo

Los compuestos descritos en la presente pueden probarse para determinar su actividad en modelos animales. Los ejemplos de modelos animales de diabetes tipo II y obesidad incluyen: el raton Ob/Ob (modelo monogenico de obesidad, deficiente de leptina), el raton db/db (modelo monogenico de obesidad, resistente a la leptina), la rata Zucker (fa/fa) (modelo monogenico de obesidad, resistente a la leptina), la rata Goto-Kakizaki, el raton KK, el raton NSY, la rata OLETF, la rata de la arena israelf, la rata tratada con estreptozotocina de alimentacion lejana, el raton CBA/Ca, la rata Torri diabetica, el raton obeso de Nueva Zelanda (ver Recs y Alcolado Diabet. Med. 22, 359-370. 2005).

Los modelos animales conocidos de nefropatía diabetica tipo 2 espontanea incluyen: la rata espontaneamente hipertensiva/NIH-corpulenta (SHR/N-cp) (modelo de obesidad, diabetes tipo 2 y nefropatía), la rata SHR/N-cp magra y la rata Wistar-Kyoto/NIH-corpulenta (WKY/N-cp). Ambos modelos permiten la evaluacion del papel de la hipertension y la obesidad en la patogenesis de la nefropatía diabetica: las ratas SHR/N-cp tienen una tolerancia a la glucosa anormal, hipertension y desarrollan una enfermedad renal reminiscente de la nefropatía diabetica humana, mientras que las ratas WKY/N-cp tambien son obesas y tienen hiperlipidemia, pero su control de la glucosa es menos controlado que el de la rata SHR/N-cp). Un modelo adicional es la rata LA/N-cp (tambien lleva el gen de la obesidad y muestra hiperlipidemia) (ver Kimmel et al. Acta Diabetologica, 29, 142-148, 1992). Como se ejemplifica en la presente, el raton db/db tambien es un modelo eficaz de la nefropatía diabetica.

Composiciones Farmaceuticas y Metodos de Tratamiento

Un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B (sin. ingrediente activo) es util para la administracion parenteral, topica, oral o local, la administracion en aerosol, o la administracion transdermica, para tratamiento profilactico o terapeutico. En un ejemplo, el compuesto se administra parenteralmente, como subcutanea o intravenosamente.

La formulacion de un compuesto a administrar variara de acuerdo con la via de administracion y formulacion (por ejemplo, solucion, emulsion, capsula) seleccionada. Una composicion farmaceutica apropiada que comprende el compuesto a administrar puede prepararse en un portador fisiologicamente aceptable. Para soluciones o emulsiones, los portadores adecuados incluyen, por ejemplo, soluciones acuosas o alcoholicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solucion salina y medios tamponados. Los vehmulos parenterales pueden incluir solucion de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado o aceites fijos. Los expertos en la materia conocen una variedad de portadores acuosos apropiados, incluyendo agua, agua tamponada, solucion salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol lfquido), solucion de dextrosa y glicina. Los vehmulos intravenosos pueden incluir varios aditivos, conservantes, o fluido, reponedores de nutrientes o electrolitos (ver, generalmente, Remington's Pharmaceutical Science. 16a edicion, Mack, Ed. 1980). Las composiciones pueden contener opcionalmente sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables segun se requiera para aproximarse a condiciones fisiologicas tales como agentes de ajuste de pH y de tamponamiento y agentes de ajuste de la toxicidad, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio. El compuesto puede liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso de acuerdo con las tecnicas de liofilizacion y reconstitucion conocidas en la tecnica.

La concentracion optima del ingrediente(s) activo en el medio elegido puede determinarse empmcamente, de acuerdo con procedimientos conocidos por el experto en la tecnica, y dependera de la formulacion farmaceutica final deseada.

Los intervalos de dosificacion para la administracion del compuesto de la divulgacion son lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado. Por ejemplo, la composicion comprende una cantidad terapeuticamente o profilacticamente eficaz del compuesto.

Como se usa en la presente, debe entenderse que el termino "cantidad eficaz" significa una cantidad suficiente del compuesto para inhibir/reducir/prevenir la senalizacion de VEGF-B en un sujeto. El experto en la tecnica sabra que dicha cantidad variara dependiendo de, por ejemplo, el compuesto y/o el sujeto particular y/o el tipo y/o la gravedad de la nefropatía que se esta tratando. Por consiguiente, no debe interpretarse que este termino limita la divulgacion a una cantidad espedfica, por ejemplo, peso o numero de compuestos.

Como se usa en la presente, debe entenderse que el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad suficiente de compuesto para reducir o inhibir uno o mas smtomas de la nefropatía.

Como se usa en la presente, debe entenderse que el termino "cantidad profilacticamente eficaz" significa una cantidad suficiente de compuesto para prevenir o inhibir o retrasar la aparicion de uno o mas smtomas detectables de la nefropatía.

• Reducir o prevenir la hipertension;

• Reducir o prevenir la esclerosis glomerular y/o tubular;

• Reducir o prevenir el deposito de la matriz extracelular mesangial y/o el engrosamiento anormal de la membrana basal glomerular;

• Reducir o prevenir la expansion mesangial glomerular;

• Reducir o prevenir los reordenamientos vasculares glomerulares;

• Reducir o prevenir la acumulacion de lfpidos renales;

• Reducir o prevenir la acumulacion de lfpidos glomerulares;

• Reducir o prevenir los depositos de colageno glomerular y/o la hialiosis arteriolar; y/o

• Reducir o prevenir la macroalbuminuria.

La dosis no debe ser tan grande como para provocar efectos secundarios adversos, como smdromes de hiper viscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardfaca congestiva, y similares. Generalmente, la dosificacion variara con la edad, la condicion, el sexo y la extension de la enfermedad en el paciente y puede determinarse por un experto en la tecnica. La dosis puede ajustarse por el medico individual en caso de cualquier complicacion.

La dosificacion puede variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, como, de aproximadamente 0,5 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, en uno o mas administraciones de dosis diarias, durante uno o varios dfas.

En algunos ejemplos, el compuesto se administra a una dosis inicial (o carga) que es mas alta que la posterior (dosis de mantenimiento). Por ejemplo, el compuesto se administra a una dosis inicial de entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg. El compuesto se administra luego a una dosis de mantenimiento de entre aproximadamente 0,0001 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. Las dosis de mantenimiento pueden administrarse cada 7-35 dfas, como cada 14 o 21 o 28 dfas.

En algunos ejemplos, se usa un regimen de incremento de dosis, en el que un compuesto se administra inicialmente a una dosis mas baja que la usada en dosis posteriores. Este regimen de dosificacion es util en el caso de que los sujetos sufran inicialmente eventos adversos.

En el caso de un sujeto que no este respondiendo adecuadamente al tratamiento, se pueden administrar multiples dosis en una semana. Alternativamente, o adicionalmente, pueden administrarse dosis crecientes.

Un sujeto puede volver a tratarse con el compuesto, dandole mas de una exposicion o un conjunto de dosis, como por lo menos aproximadamente dos exposiciones del compuesto, por ejemplo, de aproximadamente 2 a 60 exposiciones, y mas particularmente de aproximadamente 2 a 40 exposiciones, mas particularmente, de aproximadamente 2 a 20 exposiciones.

En un ejemplo, puede darse cualquier retratamiento cuando vuelven los signos o smtomas de la enfermedad, por ejemplo, cuando progresa la microalbuminuria.

En otro ejemplo, cualquier retratamiento puede darse a intervalos definidos. Por ejemplo, las exposiciones posteriores pueden administrarse a varios intervalos, como, por ejemplo, aproximadamente 24-28 semanas o 48-56 semanas o mas. Por ejemplo, tales exposiciones se administran a intervalos de aproximadamente 24-26 semanas o aproximadamente 38-42 semanas, o aproximadamente 50-54 semanas.

Un metodo de la presente divulgacion tambien puede incluir la co-administracion de por lo menos un compuesto de acuerdo con la divulgacion junto con la administracion de otro agente terapeuticamente eficaz para la prevencion o el tratamiento de un trastorno o complicacion renal, nefropatía (por ejemplo, nefropatía diabetica), diabetes, dislipidemia, hipertension y/o obesidad.

En un ejemplo, el compuesto(s) de la divulgacion se usa en combinacion con por lo menos un compuesto conocido adicional que se esta usando actualmente o esta en desarrollo para prevenir o tratar la diabetes. Ejemplos de tales compuestos conocidos incluyen, pero no estan limitados a, medicamentos antidiabeticos comunes, como las sulfonilureas (por ejemplo, glicazida, glipizida), metformina, glitazonas (por ejemplo, rosiglitazona, pioglitazona), agentes liberadores de glucosa prandial (por ejemplo, repaglinida, nateglinida), acarbosa e insulina (incluyendo todas las formas de insulina de origen natural, sinteticas y modificadas, como la insulina de origen humano, bovino o porcino; insulina suspendida en, por ejemplo, isofano o zinc y derivados como la insulina glulisina, insulina lispro, insulina lispro protamina, insulina glargina, insulina detemir o insulina aspart).

En un ejemplo, el compuesto(s) de la divulgacion se usa en combinacion con por lo menos un compuesto conocido adicional que se esta usando actualmente o esta en desarrollo para prevenir o tratar un trastorno renal como la nefropatía, o un trastorno o complicacion asociado. Los ejemplos de tales compuestos conocidos incluyen, pero no estan limitados a: farmacos inhibidores de ECA (por ejemplo, captopril (Capoten™), enalapril (Innovace™), fosinopril (Staril™), lisinopril (Zestril™), perindopril (Coversyl™), quinapril (Accupro)™), trandanalopril (Gopten™), lotensin, moexipril, ramipril); bloqueadores RAS; bloqueadores de los receptores de angiotensina (ARB) (por ejemplo, Olmesartan. Irbesartan, Losartan, Valsartan, candesartan, eprosartan, telmisartan, etc.); inhibidores de la protema quinasa C (PKC) (por ejemplo, ruboxistaurina); inhibidores de las vfas dependientes de AGE (por ejemplo, aminoguanidina, ALT-946, pirodoxamina (pirododorina), OPB-9295 alagebrio); agentes antiinflamatorios (por ejemplo, inhibidores de la ciclooxigenasa-2, micofenolato mofetil, mizoribina, pentoxifilina), GAG (por ejemplo, sulodexida (Patente de Estados Unidos N° 5.496.807)); piridoxamina Patente de Estados Unidos N° 7.030.146); antagonistas de la endotelina (por ejemplo, SPP 301), inhibidores de COX-2, antagonistas de PPAR-gamma y otros compuestos como la amifostina (usada para la nefropatía del cisplatino), captopril (usado para la nefropatía diabetica), ciclofosfamida (usada para la nefropatía idiopatica de la membrana), tiosulfato de sodio (usado para la nefropatía por cisplatino).

Adicionalmente, los metodos de la divulgacion tambien pueden incluir la co-administracion de por lo menos otro agente terapeutico para el tratamiento de otra enfermedad directa o indirectamente relacionada con la diabetes y/o la nefropatía, incluyendo, pero no limitados a, dislipidemia, hipertension, obesidad, neuropatfa y/o retinopatfa, etc. Ejemplos adicionales de agentes que pueden co-administrarse con el compuesto(s) de acuerdo con la invencion son los corticosteroides; medicamentos inmunosupresores: antibioticos; medicamentos antihipertensivos y diureticos (como inhibidores de ECA); agentes reductores de Kpidos como resinas secuestrantes biliares, colestiramina, colestipol, acido nicotmico y mas particularmente farmacos y medicamentos usados para reducir el colesterol y los trigliceridos (por ejemplo, fibratos (por ejemplo, Gemfibrozil™) e inhibidores de HMG-CoA como Lovastatin™, Atorvastatin™, Fluvastatin™, Lescol™), Lipitor™, Mevacor™), Pravachol™. Pravastatin™. Simvastatin™, Zocor™, Cerivastatin™), etc); compuestos que inhiben la absorcion intestinal de lfpidos (por ejemplo, ezetimiba); acido nicotmico; y vitamina D.

Como sera evidente a partir de lo anterior, la presente divulgacion proporciona metodos de tratamiento terapeutico concomitante de un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto con necesidad de ello una cantidad eficaz de un primer compuesto y un segundo compuesto, en donde dicho agente es un compuesto de la divulgacion. (es decir, un inhibidor de la senalizacion de VEGF-B), y el segundo agente es para la prevencion o el tratamiento de la nefropatía, la nefropatía diabetica, la diabetes, la hipertension, la hiperlipidemia o la obesidad.

Como se usa en la presente, el termino "concomitante" como en la frase "tratamiento terapeutico concomitante" incluye administrar un primer agente en presencia de un segundo agente. Un metodo de tratamiento terapeutico concomitante incluye metodos en los que se co-administran el primer, segundo, tercer o agentes adicionales. Un metodo de tratamiento terapeutico concomitante tambien incluye metodos en los que el primero o los agentes adicionales se administran en presencia de un segundo o agentes adicionales, en donde el segundo o agentes adicionales, por ejemplo, pueden haberse administrado anteriormente. Un metodo de tratamiento terapeutico concomitante puede ser ejecutado paso a paso por diferentes actores. Por ejemplo, un actor puede administrar a un sujeto un primer agente y como un segundo actor puede administrar al sujeto un segundo agente y los pasos de administracion pueden ejecutarse al mismo tiempo, o casi al mismo tiempo, o en momentos distantes, siempre y cuando el primer agente (y/o agentes adicionales) sean despues de la administracion en presencia del segundo agente (y/o agentes adicionales). El actor y el sujeto pueden ser la misma entidad (por ejemplo, un humano).

En un ejemplo, la divulgacion tambien proporciona un metodo para tratar o prevenir la nefropatía en un sujeto, el metodo comprendiendo administrar al sujeto una primera composicion farmaceutica que comprende por lo menos un compuesto de la divulgacion y una segunda composicion farmaceutica que comprende uno o mas compuestos adicionales.

En un ejemplo, un metodo de la divulgacion comprende administrar un inhibidor de la senalizacion de VEGF-B a un sujeto que padece de nefropatía (por ejemplo, nefropatía diabetica) y recibir otro tratamiento (por ejemplo, para la diabetes).

Kits

Otro ejemplo de la divulgacion proporciona kits que contienen compuestos utiles para el tratamiento de la nefropatía como se ha descrito anteriormente.

En un ejemplo, el kit comprende (a) un recipiente que comprende un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B como se describe en la presente, opcionalmente en un portador o diluyente farmaceuticamente aceptable: y (b) un prospecto con instrucciones para tratar la nefropatía en un sujeto.

De acuerdo con este ejemplo de la divulgacion, el prospecto esta en o esta asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas, etc. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plastico. El recipiente mantiene o contiene una composicion que es eficaz para tratar la nefropatía y puede tener un puerto de acceso esteril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solucion intravenosa o un vial que tiene un tapon perforable por una aguja de inyeccion hipodermica). Por lo menos un agente activo en la composicion es el compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B. La etiqueta o el prospecto indican que la composicion se usa para tratar a un sujeto elegible para el tratamiento, por ejemplo, uno que tiene o tiene predisposicion a la nefropatía, con una grna espedfica con respecto a las cantidades e intervalos de dosificacion del compuesto y cualquier otro medicamento que se proporcione. El kit puede comprender ademas un recipiente adicional que comprende un tampon diluyente farmaceuticamente aceptable, como agua bacteriostatica para inyeccion (BWFI), solucion salina tamponada con fosfato, solucion de Ringer y/o solucion de dextrosa. El kit puede incluir ademas otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

El kit comprende ademas opcionalmente un recipiente que comprende un segundo medicamento, en el que el compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B es un primer medicamento, y cuyo artmulo comprende ademas instrucciones en el prospecto para tratar al sujeto con el segundo medicamento, en una cantidad eficaz. El segundo medicamento puede ser cualquiera de los expuestos anteriormente.

La presente divulgacion incluye los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1: los ratones deficientes en VEGF-B son resistentes al desarrollo de nefropatia diabetica

Los ratones diabeticos deficientes en VEGF-B han mejorado la funcion renal y han reducido la hipertension

Se obtuvieron ratones C57BKS/Leprdb (db/db//BKS) de Jackson Laboratory (como modelo de diabetes y nefropatia diabetica) y se criaron con ratones C57BL/6-Vegfb'1'. Los ratones Db/db//Vegfb-1- se criaron apareando ratones db/+//Vegfb+/- heterocigotos entre sf, creando db/db, dh/db//Vegfb+l- y db/ db//Vgfb+. Se usaron db/db, db/db//Vegfb+/- y dhldbllVegfb-1- hembra de 42 semanas de edad en el estudio. La produccion de orina se midio fotografiando jaulas que albergan un animallgenotipo. Para medir la glucosuria y la proteinuria mediante analisis de tiras reactivas, los ratones se privaron de alimento durante 1 hora, luego se recolecto la orina y la concentracion de glucosa y protema se midio directamente usando tiras reactivas de acuerdo con los fabricantes (Uristix, Siemens). Para la deteccion de ACR, se recogieron de cada raton de 20 pl a 200 pl volumenes de orina. La albumina urinaria se detecto usando el kit Albuwell M, y la creatinina urinaria se midio usando el kit de ELISA murino de Creatinine Companion (Exocell, Filadelfia, PA). La presion sangumea sistolica y diastolica se midio mediante un metodo de manguito de la cola usando la configuracion CODA (Kent Scientific). Todos los animales se habituaron al dispositivo de medicion de la presion sangumea durante 2 semanas. Se sometieron todos a 1-2 ciclos de 20 mediciones reordenadas por dfa durante un mmimo de 3 dfas.

Estos analisis mostraron que la eliminacion de Vcgfb en ratones db/db BKS diabeticos mejora la fisiologfa renal y reduce la hipertension. Por ejemplo, los animales db/db/Vegfb-/- produjeron menos orina que los animales db/db, y db/db//Vegfb+/-. Los animales db/db//Vegfb-/- tambien teman menos glucosa y protemas en su orina que los animales db/db, y dbldhllVegfb+l-.

La Figura 1A muestra la proporcion de albumina/creatinina en la orina medida por ELISA para ratones db/db, db/db//Vegfb+/- y db/db//Vegfb-/- (n=5 grupo, grafico de la izquierda) y tipo salvaje magros y ratones Vegfb-/-magros (n=4-6/grupo, grafico de la derecha). Estos datos muestran que los animales db/db//Vegfb-1- tienen una proporcion de albumina/creatinina mejor en la orina en comparacion con los animales dbldbllVegfb+l-. Se observo un efecto similar en animales magros deficientes para Vegfb en comparacion con animales de tipo salvaje magros.

La Figura 1B muestra la presion sangumea del manguito de la cola (presion sangumea sistolica y diastolica) en ratones db/db y db/db//Vegfb+/- (n=5/grupo). Estos datos demuestran que los animales dbldbllVegfb-l- han reducido la presion sangumea sistolica y diasistolica en comparacion con los animales db/db.

Estos datos muestran que los ratones db/db diabeticos y los ratones magros con expresion reducida de VEGF-B tienen una funcion renal mejorada con mejor capacidad de filtracion medida mediante la concentracion reducida de albumina urinaria y la proporcion albumina/creatinina urinaria. La expresion reducida de VEGF-B tambien disminuyo tanto la presion sangumea sistolica como la diastolica en animales db/db.

La esclerosis glomerular y tubular disminuye tras la delecion de Vegfben ratones db/db BKS

Se sacrificaron ratones db/db, db/db//Vegfb+/- y db/dh//Vegfb-/- hembra de 42 semanas y se aislaron los rinones, se fijaron, se embebieron, se seccionaron y se tineron con acido periodico-Schiff (PAS) para evaluar la expansion mesangial glomerular y la esclerosis tubular de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma). Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos o tubulos por animal, se tineron por PAS dentro de cada seccion con microscopfa de campo claro (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 20x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa de asistente Axio Vision Run para i) tincion con PAS glomerular (pixel2/pm2) ii) nr de glomerulos apoptoticos por cuadro. Un glomerulo se designo como apoptotico tras la tincion intensa con PAS y un diametro inferior a 25 pm. Los tubulos se cuantificaron usando el programa de asistente Axio Vision Run para i) el grosor de la membrana basal tubular (pm2).

Como se muestra en la Figura 2A los ratones db/db desarrollaron esclerosis tubular, mientras que este defecto no se observo en los ratones db/db//Vegfb+l- y db/db//Vegfb-1-. Ademas, los ratones db/db desarrollaron esclerosis glomerular, mientras que los ratones db/db//Vegfb+l- y db/db//Vegfb-1- no lo hicieron (Figura 2B). Estos cambios en los ratones db/db se asociaron con niveles elevados de glomerulos apoptoticos en comparacion con los ratones db/db//Vegfb*1- y db/db//Vegfb-1- (Figura 2C).

Estos datos muestran que la esclerosis glomerular y tubular disminuyeron en los rinones de animales db/db diabeticos con una expresion reducida de VEGF-B en comparacion con los animales db/db.

El deposito de la matriz extracelular mesangial y engrosamiento anormal de la membrana basal glomerular (GBND) estan disminuidos en ratones db/db BKS Vegfb deficientes

Se usaron biopsias renales de ratones db/db, db/db//Vegfb+/- y db/db//Vegfb-1- de 42 semanas de edad hembra para el analisis de microscopfa electronica de transmision (TEM) de acuerdo con procedimientos estandar. Brevemente, los tejidos se fijaron en un tampon de solucion de fijacion (glutaraldehfdo al 2%, paraformaldehudo al 0,5%, cacodilato 0,1 M, sacarosa 0,1 M, CaCl²3 mM y se lavaron en tampon de cacodilato 0,1 M a pH 7,4 antes de tincion en OsO⁴al 2% en tampon de cacodilato durante 1 hora a temperatura ambiente, las muestras se deshidrataron y la tincion en bloque se realizo en acetato de uranilo al 2% en etanol absoluto durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se tomaron muestras a traves de una serie Epon 812/acetona y se embebieron a 60° C en Epon 812 puro. Se cortaron secciones finas de espesores de 70 nm en un ultratomo Leica EM UC6 y se montaron en rejillas de ranura de cobre revestidas con formvar. La tincion posterior se realizo con acetato acuoso al 2% pH 3.5 y citrato de plomo Venable y Cogglesall. Las rejillas se analizaron en un microscopio electronico FEI TECNAI.

El analisis de TEM de gran aumento mostro que las anomalfas renales asociadas con la nefropatía diabetica, como la expansion mesangial y el engrosamiento de GBM, se reducen en ratones db/db con expresion reducida de VEGF-B en comparacion con ratones db/db (Figura 3A). El engrosamiento de GBM es una caractenstica comun en la nefropatía diabetica. La Figura 3B muestra que la formacion de hendiduras se conserva en ratones db/db con expresion reducida de VEGF-B. Tambien se descubrio que la formacion de podocitos se conserva en ratones db/db con expresion reducida de VEGF-B.

La eliminacion de Vegfb reduce la acumulacion de lipidos renales en ratones db/db BKS

El analisis de aceite rojo O (ORO) se realizo usando rinones de ratones db/db, db/db//Vegfb+l~, db/db//Vegfb~ /- y de tipo salvaje magros hembra de 42 semanas de edad. Brevemente, los rinones se diseccionaron y se congelaron instantaneamente en hielo seco y se embebieron en Tissue-Tek® (Sakura) directamente en el molde del criostato. Las criosecciones (12 pm) se sumergieron 5-15 minutos en una solucion de trabajo ORO (2,5 g de aceite rojo O (Sigma-Aldrich), se disolvieron en 400 ml de isopropanol al 99%, se diluyeron adicionalmente 6:10 en H2O, se filtraron a traves de un filtro de 22 pm (Corning)) y enjuagaron 10 min con agua corriente del grifo antes de montarse. Las secciones tenidas se examinaron con microscopfa de campo brillante (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 20x y se capturo un mmimo de 10 cuadros por seccion. Para la cuantificacion de las gotitas de lfpidos, la cantidad de pfxeles rojos en cada cuadro se cuantifico usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion total con ORO (pixel, a.u.).

La acumulacion y estructura de las gotitas de lfpidos renales se mejoran en ratones db/db con expresion reducida de VEGF-B (Figura 4A). En particular, las gotitas de lfpidos son menores y mas pequenas en las secciones de rinon de ratones db/db deficientes en Vegfb. La Figura 4B muestra que reducir la expresion de VEGF-B en ratones db/db disminuye la acumulacion de lfpidos en los glomerulos y presenta gotitas de lfpidos menores y mas pequenas.

Los reordenamientos glomerulares se evitan en ratones db/db BKS deficientes en Vegfb

La morfologfa glomerular se evaluo en rinones de ratones db/db, db/db//Vegfbf l~ y db/db//Vegb~'~ hembra de 42 semanas de edad. Brevemente, se sacrificaron los animales y se recogieron los rinones, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y prepararon secciones de 3 pm y posteriormente se inmunotineron por sinaptopodina y/o pecam. La recuperacion del antfgeno se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antfgeno Ph6 (Dako) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 horas con anticuerpos primarios de conejo anti-sinaptopodina (Santa Cruz), cabra anti-pecam (Abcam). Se aplicaron anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia apropiados (Invitrogen. Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenidos por sinaptopodina y pecam dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente AXio Vision Run para i) tincion con sinaptopodina (pfxel2/pm) glomerular y ii) tincion con pecam (pixel 2/pm2) glomerular.

Las Figuras 5Ay SB muestran una expresion aumentada de sinaptopodina y pecam en glomerulos de ratones db/db//Vegfb*1' y db/dh//Neg-/-. Estos datos y analisis de glomerulos tenidos indican que la morfologfa global de los glomerulos se mejora en ratones db/db deficientes en Vegfb. La expresion y la estructura de los podocitos y las celulas endoteliales, es decir, los tipos celulares que son cruciales para el proceso de filtracion, se conservan en ratones db/db con una expresion reducida de VEGF-B.

Los depositos de colageno glomerular y la hialinosis arteriolar se reducen en ratones db/db BKS deficientes en Vegfb Los depositos de colageno glomerular y la hialinosis arteriolar se evaluaron en rinones de ratones db/db, db/db//Vegfb+l' y db/db//Vegfb-/- hembra de 42 semanas de edad. Brevemente, se sacrificaron los animales y se recogieron los rinones, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y se prepararon secciones de 3 pm y posteriormente se inmunotineron por colageno IV, pecam y/o a-SMA. Brevemente, la recuperacion de antfgenos se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antfgeno Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 horas con anticuerpos primarios de conejo anti-colageno IV (abcam), cabra anti-pecam (abeam) o a-SMA (Sigma). Se aplicaron los anticuerpos secundarios fluorescentemente marcados (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido por colageno IV, pecam o a-SMA dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para i) tincion con colageno IV (pfxel2/|jm2) glomerular ii) tincion con a-SMA ^ x e l2/jm 2) glomerular iii) grosor de las arteriolas glomerulares (jm 2).

La Figura 6 muestra que los niveles de colageno IV (Figura 6A) y a-SMA (Figura 6B) se redujeron en ratones db/db//Vegfb+l~ y db/db//Vegfb'1' en comparacion con los ratones db/db. Ademas, el grosor arteriolar se redujo en ratones db/db//Vegfb+I' y db/db//Vegfb':' en comparacion con los ratones db/db (Figura 6C). Estos datos indican que la formacion de depositos de colageno intra-glomerular patologica (tambien conocida como depositos de la matriz extracelular glomerular (ECM)) y la hialinosis arteriolar se reducen en ratones db/db con expresion reducida de VEGF-B. Estos datos muestran que las patologfas histologicas comunes de la nefropatía diabetica, como los depositos de ECM glomerulares y la hialinosis arteriolar se reducen en ratones db/db con una expresion reducida de VEGF-B.

Los lipidos se acumulan preferentemente en los glomerulos del rinon durante la progresion de la nefropatia diabetica en ratones db/db//BKS

Se usaron ratones db+ magros, db/db de 6 semanas de edad y db/db//BKS de 21 semanas de edad para el analisis de Aceite rojo O (ORO). Los rinones se diseccionaron y se congelaron instantaneamente en hielo seco y se embebieron en Tissue-Tek® (Sakura) directamente en el molde del criostato. Las criosecciones (12 jm ) se sumergieron 5-15 minutos en una solucion de trabajo de aceite rojo O (2,5 g de aceite rojo O (Sigma-Aldrich), se disolvieron en 400 ml de isopropanol al 99%, se diluyeron adicionalmente 6:10 en H²O, se filtro a traves de un filtro de 22 jm (Corning) y se enjuago 10 min con agua corriente del grifo antes de montarse. Las secciones tenidas se examinaron con microscopfa de campo brillante (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 20x y se capturaron un mmimo de 10 cuadros por seccion. Para la cuantificacion de las gotitas de lfpidos, la cantidad de pfxeles rojos en cada cuadro se cuantifico usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion total con ORO (pixel. a.u.).

La Figura 7muestra que a medida que la macroalbuminuria se desarrolla en ratones db/db//BKS, los lfpidos se acumulan preferentemente en los glomerulos.

La acumulacion de lipidos glomerulares se correlaciona con la perdida de podocitos en la progresion de la nefropatia diabetica en ratones db/db//BKS

Se usaron ratones db+ magros, db/db de 6 semanas de edad y db/db//BKS de 21 semanas de edad para el analisis. Los rinones se diseccionaron, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas y posteriormente se procesaron para embeber en parafina usando procedimientos estandar. Despues de embeber, se prepararon secciones de 3 jm y posteriormente se inmunotineron por sinaptopodina y/o pecam. Brevemente, la recuperacion de antigenos se realizo en secciones de 3 jm usando una solucion de recuperacion de antigenos de pH 6 (Dako) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 h con anticuerpos primarios de cobayas antiadipofilina (Fitzgerald) y anti-sinaptopodina de conejo (Santa Cruz). Se aplicaron anticuerpos secundarios fluorescentemente marcados apropiados (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon por microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenidos por adipofilina y sinaptopodina dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para i) tincion con adipofilina (pfxel2/jm 2) glomerular y ii) tincion con sinaptopodina (pfxel2/jm 2).

La Figura 8 muestra que durante el desarrollo de la nefropatia diabetica, los lipidos se acumulan en los glomerulos y el numero de podocitos disminuye en paralelo.

La via de senalizacion de Vegfb se regula por incremento durante la progresion de la nefropatia diabetica

Se diseccionaron rinones de ratones db+ magros, y db/db//BKS de 6, 12 y 21 semanas de edad y se congelaron instantaneamente en hielo seco. El ARN total se extrajo y se purifico de los rinones usando el kit RNeasy Mini (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La primera cadena de ADNc se sintetizo a partir de 0,5~1 jg de ARN total usando el kit de smtesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizo con el KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix (2x) Universal (^kA^pA Biosystems) en el termociclador de PCR en tiempo real Rotor-Gene Q (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresion se normalizaron a la expresion de L19 y p-2 microglobulina.

Como se muestra en la Figura 9, en la nefropatia diabetica, la expresion renal de Vegfb, los objetivos en sentido descendente de VEGF-B. Fatp3 y Fatp4, y el principal de VEGF-B receptor, Vegfrl estan regulados por incremento. Estos datos indican que la via de senalizacion del VEGF-B renal es un objetivo adecuado para tratar la nefropatía diabetica.

La funcion renal se mejora en ratones Veaf-b*1' alimentados con alto contenido en grasa y ratones Veaf-b'1'

Se alimentaron ratones Vegf +/- y Vegfb'1' del tipo salvaje macho mentaron con dieta alta en grasas (HFD) al 60% (Research Diets, USA) durante 30 semanas, comenzando a la edad de 5 semanas. El estudio incluyo tambien animales de control de tipo salvaje magros. Para la deteccion de ACR, se recogieron de cada raton de 20 pl a 200 pl de volumen de orina. La albumina urinaria se detecto con el kit Albuwell M, y la creatinina urinaria se midio usando el kit de ELISA murino de Creatinine Companion (Exocell, Filadelfia, PA).

La Figura 10 muestra que la perdida de protema urinaria mediada por HFD se redujo en ratones alimentados con HFD con expresion reducida de VEGF-B. Por tanto, se mejoro la capacidad de filtracion del rino, medida tanto por la excrecion de albumina (Figura 10B) como por ACR (Figura 10A).

La expansion y la hipertrofia mesangial glomerular se disminuyen en ratones Veaf-b*1' y Veaf-b'1' alimentados con HFD

Se alimento a ratones Vegf-l- y Vegfb-l- de tipo salvaje macho con HFD al 60% (Research Diets. USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a la edad de 5 semanas. El estudio tambien incluyo animales de control magros. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. Los rinones se diseccionaron, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas y posteriormente se procesaron para embeberlos en parafina usando procedimientos estandar. Despues de embeberlos, se prepararon secciones de 3 pm y se tineron con PAS (Sigma) de acuerdo con el fabricante. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido por PAS dentro de cada seccion con microscopfa de campo brillante (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para tincion glomerular con PAS (pfxel2/pm2).

La Figura 11 muestra que la expansion (Figura 11A) y la hipertrofia (Figura 11B) mesangial glomerular renal inducida por HFD se previenen en ratones alimentados con HFD con expresion reducida de VEGF-B.

La acumulacion de lipidos glomerular se reduce en ratones Veaf-b+l-y V e a f-b alimentados con HFD

Se alimentaron ratones, Veaf+l- y Veafb-/- de tipo salvaje macho con HFD al 60% (Research Diets. USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a la edad de 5 semanas. El estudio tambien incluyo animales de control de tipo salvaje magros. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. Los rinones se diseccionaron y se congelaron instantaneamente en hielo seco y se embebieron en Tissue-Tek® (Sakura) directamente en el molde del criostato. Las criosecciones (12 pm) se sumergieron 5-15 minutos en una solucion de trabajo de aceite rojo O (2,5 g de aceite rojo O (Sigma-Aldrich), se disolvieron en 400 ml de isopropanol al 99%, se diluyeron adicionalmente 6:10 en H²O, se filtraron a traves de un filtro de 22 pm (Corning) y se enjuagaron durante 10 minutos con agua corriente. Posteriormente las secciones se sumergieron durante 3 s en solucion de hematoxilina y se enjuagaron con agua corriente antes de montarlas. Las secciones tenidas se examinaron con microscopfa de campo brillante. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido por ORO y hematoxilina en cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion glomerular con ORO (pfxel2/pm2).

La Figura 12 y el analisis de las secciones de rinon tenidas muestra que la HFD aumenta la acumulacion de lfpidos renal mayoritariamente en los glomerulos. Sin embargo, esta acumulacion de lfpidos ectopica se reduce en ratones alimentados con HFD con expresion reducida de VEGF-B. Las gotitas de lfpidos se redujeron tanto en numero como en tamano.

La acumulacion de lipidos glomerular se reduce, y la integridad de podocitos se conserva en ratones Veaf-b+/~ y Veaf-b~/~ alimentados con HFD

Se alimentaron ratones, Veaf+l- y Veafb-/- de tipo salvaje macho con HFD al 60% (Research Diets. USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a la edad de 5 semanas. El estudio incluyo adicionalmente animales de control de tipo salvaje magros. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. Los rinones se diseccionaron, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas y posteriormente se procesaron para embeberlos en parafina usando procedimientos estandar. Despues de embeberlos, se prepararon secciones de 3 pm y, a continuacion, se inmunotineron por sinaptopodina y/o pccam. Brevemente, la recuperacion del antfgeno se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antfgeno Ph6 (Dako) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 h con anticuerpos primarios de cobaya anti-adipofilina (Fitzgerald) y antipodocina de conejo (Sigma). Se aplicaron anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia apropiados (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido por adipofilina y sinaptopodina dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para i) tincion con adipofilina (pfxel2/|jm3) glomerular y ii) tincion con podocina ^ x e l2/jm 2).

La Figura 13 y el analisis de las secciones tenidas muestra que la acumulacion de Kpidos renales ectopica impulsada por HFD se reduce en ratones con expresion reducida de VEGF-B. En paralelo, la integridad estructural y el numero de podocitos se aumentan.

Los depositos de ECM glomerularles y hialinosis arteriolar se reducen en ratones Vegf-b+/- y Vegf-b-/- alimentados con HFD

Se alimentaron ratones, Vegf+l- y Vegfb-/- de tipo salvaje macho con HFD al 60% (Research Diets. USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a la edad de 5 semanas. El estudio incluyo tambien animales de tipo salvaje de control magros. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. Los rinones se diseccionaron, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas y posteriormente se procesaron para embeberlos en parafina usando procedimientos estandar. Despues de embeberlos, se prepararon secciones de 3 jm y, a continuacion, se inmunizaron por colageno IV, pecam y/o a-SMA. Brevemente, la recuperacion de antfgenos se realizo en secciones de 3 jm usando solucion de recuperacion de antfgenos Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 h con anticuerpos primarios de conejo anti-colageno IV (abcam), de cabra anti-pccam (abcam) o a-SMA (sigma). Sea aplicaron anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente apropiados (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido por colageno IV, pecam o a-SMA en cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para i) tincion de colageno IV (pfxel2/jm 2) glomerular y ii) grosor de las arteriolas glomerulares (jm 2).

La Figura 14 y el analisis de las secciones tenidas muestra que las patologfas histologicas clave en la nefropatía diabetica como la acumulacion de ECM glomerular aumentada (Figura 14A) y la hialinosis arteriolar. (Figura 14B) se reducen en ratones alimentados con HFD con expresion reducida de VEGF-B.

Ejemplo 2: Un anticuerpo neutralizante anti-VEGF-B trata o previene la progresion de la nefropatia diabetica La inhibicion mediada por anticuerpos de VEGF-B influye moderadamente en los niveles de glucosa en sangre en ratones db/db//BKS diabeticos

Se adquirieron ratones C57BKS/Leprdb (db/db/BKS) de Jackson Laboratory y se inyectaron por via intraperitoneal dos veces por semana, comenzando a las 6 semanas (prueba preventiva) o 12 (prueba terapeutica) y continuaron durante 8 semanas con 400 jg de o 2H10 (anticuerpo anti-VEGF-B neutralizante) o anticuerpo de control emparejado de isotipo. En la prueba preventiva, los valores iniciales de ACR y glucosa en sangre fueron<50 jg de albumina/mg de creatinina y<15 mM, respectivamente. En la prueba terapeutica, los valores iniciales de ACR y glucosa en sangre fueron >150 jg de albumina/mg de creatinina y >15 mM, respectivamente. Los niveles de glucosa en sangre posprandiales de los ratones se monitorizaron dos veces por semana despues de la eliminacion del alimento durante 2 horas. Las mediciones de glucosa se realizaron en sangre extrafda de la vena de la cola usando un medidor de glucosa Bayer Contour. Para la deteccion de ACR, se recogieron de cada raton de 20 j l a 200 j l de volumen de orina. La albumina urinaria se detecto usando el kit Albuwell My la creatinina urinaria se midio usando el kit de ELISA murino Creatinine Companion (Exocell, Filadelfia, PA).

Las Figuras 15A y la C-F muestran los niveles de glucosa en sangre de ratones db/db/BKS tratados terapeuticamente o profilacticamente con el anticuerpo 2H10. Como se muestra, la administracion del anticuerpo despues de que la diabetes hubiera progresado en los experimentos descritos en la presente (como en los modelos agresivos de diabetes usados en la presente) no redujo sustancialmente los niveles de glucosa en sangre.

La Figura 15B muestra los niveles de ACR en ratones db/db/BKS tratados terapeuticamente o profilacticamente con el anticuerpo 2H10.

Estos datos muestran que los ratones db/db//BKS desarrollan microalbuminuria a las 6 semanas de edad y la macroalbuminiuria se establece a las 12 semanas. Ni la administracion de anticuerpos anti-VEGF-B preventiva ni la terapeutica a ratones db/db//BKS en estas pruebas disminuyo de forma detectable los niveles de glucosa en sangre.

El tratamiento profilactico anti-VEGF-B (usando 2H10) disminuye la esclerosis glomerular y tubular en ratones db/db//BKS

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 6-8 semanas de edad tratados con 2H10 o anticuerpo de control de emparejado con isotipo durante 8 semanas como se ha descrito anteriormente, se fijaron en PFA al 4% durante 48 h, se embebieron y se prepararon secciones de 3 pm y se tineron con PAS (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido por PAS dentro de cada seccion con microscopfa de campo brillante (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion con PAS glomerular (pfxel2/pm2).

Como se muestra en la Figuras 16A y 16B los ratones tratados con 2H10 muestran niveles reducidos de esclerosis glomerular y esclerosis tubular. Estos datos demuestran que el tratamiento anti-VEGF-B en ratones db/db//BKS reduce tanto la esclerosis glomerular como la esclerosis tubular, a pesar de no haber diferencias detectables en los niveles de glucosa en sangre.

El tratamiento anti-VEGF-B profilactico (usando 2H10) dificulta los reordenamientos vasculares en ratones db/db//BKS

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 6-8 semanas de edad tratados con 2H10 o anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas como se ha descrito anteriormente o animales db/+ magros emparejados por edad y sexo, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y se prepararon secciones de 3 pm y se inmunotineron por pecam o podocina. Brevemente, la recuperacion de antfgeno se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antfgeno Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 horas con anticuerpos primarios anti-pecam de cabra (abcam) y antipodocina de conejo (sigma). Se aplicaron anticuerpos secundarios fluorescentemente marcados apropiados (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido por pecam dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para i) pecam glomerular (pfxel2/pm2) y ii) tincion de podocina (pfxel2/pm2).

Como se muestra en la Figura 17A, el nivel de tincion con podocina se conservo en ratones tratados con 2H10. El nivel de tincion con pecam aumento en ratones tratados con 2H10 (Figura 17B). Estos datos y analisis de las secciones tenidas indican que la morfologfa de los vasos sangumeos en los glomerulos se mejora en ratones db/db//BKS tratados con anti-VEGF-B y que la inhibicion de VEGF-B conserva la densidad y la estructura vascular. Estos datos tambien muestran que la inhibicion de VEGF-B conserva la densidad y la estructura vascular. Por tanto, tanto la estructura como la integridad de los tipos de celulas que componen la barrera de filtracion glomerular, los podocitos y las celulas endoteliales se conservan en ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B. El tratamiento profilactico anti-VEGF-B (usando 2H10) conserva la estructura de los podocitos en ratones db/db//BKS

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 6-8 semanas de edad tratados con 2H10 o con anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas como se ha descrito anteriormente, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y se prepararon secciones de 3 pm y se inmunotineron para sinaptodina y/o pecam. Brevemente, la recuperacion de antfgeno se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antfgeno Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 horas con anticuerpos primarios de conejo anti-sinaptopodina (Santa Cruz). Se aplicaron anticuerpos secundarios fluorescentemente marcados apropiados (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para pecam dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run i) tincion con adipofilina (pfxel2/pm2) y ii) tincion con sinaptopodina (pfxel2/pm2).

Como se muestra en la Figura 18A, el nivel de tincion con adipofilina se redujo en ratones tratados con 2H10. La Figura 18B muestra que la tincion con sinaptopodina se aumento en ratones tratados con 2H10. Estos datos y analisis de las secciones tenidas indican que la estructura y la integridad de los tipos de celulas que componen la barrera de filtracion glomerular, los podocitos y las celulas endoteliales, se conservan en ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B. Estos datos tambien muestran que el tratamiento con anticuerpo anti-VEGF-B redujo drasticamente la acumulacion de lfpidos glomerulares ectopica y conserva la expresion y morfologfa de los podocitos.

El tratamiento profilactico anti-VEGF-B (usando 2H10) reduce la acumulacion de colageno glomerular (depositos de la matriz extracelular) en ratones db/db//BKS

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 6 semanas edad de tratados con 2H10 o con anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas como se ha descrito anteriormente, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y prepararon secciones de 3 pm y se inmunotineron para colageno glomerular IV.

Brevemente, la recuperacion de antfgenos se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antigeno Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutes. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 horas con anticuerpos primarios de conejo anti-sinaptopodina (Santa Cruz). Se aplicaron anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para pecam dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para tincion con colageno IV glomerular (pfxel2/pm2).

Como se muestra en la Figura 19, el nivel de tincion con colageno IV glomerular se incremento en ratones tratados con 2H10. Estos datos y analisis de las secciones tenidas indican que la inhibicion mediada por anticuerpos de VEGF-B reduce la acumulacion de colageno patologico intraglomerular (acumulacion de la matriz extracelular) en ratones db/db//BKS, una caractenstica histologica en la nefropatía diabetica.

El tratamiento profilactico anti-VEGF-B (usando 2H10) mejora el perfil de lteidos en plasma en ratones db/db//BKS Se extrajo sangre de ratones db/db/BKS de 6-8 semanas de edad hembra y db/+ magros de edad y sexo emparejados por puncion cardfaca que se hadan tratado anteriormente con 2H10 o anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas. La sangre se centrifugo a 14000 rpm, a 4° C durante 10 minutos, posteriormente se separo el plasma y se congelo en partes alteuotas a -80° C. Se usaron kits disponibles comercialmente para la determinacion enzimatica de NEFA (Wako Chemicals, Neuss, Alemania), betahidroxibutirato (Stanbio Laboratories, Boerne. TX, USA) y HDL-c y LDL-c (BioVision, Mountain View. CA. USA).

Como se muestra en la Figura 20, la administracion de 2H10 protegio a los ratones db/db/BKS contra niveles elevados de cetonas, un signo caractenstico clave de la diabetes tipo 2. El tratamiento anti-VEGF-B incremento los niveles de HDL-c en plasma, tambien conocido comunmente como el portador de colesterol "bueno". La reduccion de la senalizacion de VEGF-B en el 2S10 no tuvo efecto sobre los niveles en plasma de LDL-c o NEFA. El tratamiento profilactico anti-VEGF-B (usando 2H10) previene el engrosamiento de GBM y las anomalias de los podocitos.

Se recolectaron rinones de db/db/BKS de 6-8 semanas de edad hembra que se hadan tratado con 2H10 o un anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas y se usaron para el analisis de microscopfa electronica de transmision (TEM). La preparacion de las biopsias renales para TEM se realizo de acuerdo con los procedimientos estandar. Los tejidos se fijaron en el tampon de solucion de fijacion (glutaraldeddo al 2%, paraformaldeddo al 0,5%, cacodilato 0,1 M, sacarosa 0,1 M, CaCl²3 mM) y se lavaron en tampon de cacodilato 0,1 M a pH 7,4 antes de la tincion en OsO⁴al 2% en tampon de cacodilato durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras se deshidrataron y la tincion en bloque se realizo en acetato de uranilo al 2% en etanol absoluto durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se tomaron muestras a traves de una serie Epon 812/acetona y se embebieron a 60° C en Epon 812 puro. Se cortaron secciones finas de 70 nm de espesor en un ultratomo Leica EM UC6 y se montaron en rejillas de ranura de cobre revestidas con formvar. La tincion posterior se realizo con acetato acuoso al 2% pH 3,5 y citrato de plomo Venable y Cogglesall. Las rejillas se analizaron en un microscopio electronico FEI TECNAI.

El analisis de TEM de gran aumento mostro que el engrosamiento de GBM, la primera patologfa renal en ratones db/db, cuando se trata con 2H10, se disminuye (Figura 21A). Ademas, el tratamiento anti-VEGF-B en ratones db/db//BKS conserva la morfologfa de los podocitos, medida como el numero de formaciones de hendiduras (Figura 21B).

El tratamiento profilactico anti-VEGF-B (usando 2H10) reduce la acumulacion de lipidos glomerular en ratones db/db//BKS

Se recolecto sangre y rinones de ratones db/db/BKS de 6-8 semanas de edad tratados con 2H10 o anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas o ratones db/+ magros. Los rinones se diseccionaron y se congelaron instantaneamente en hielo seco y se embebieron en Tissue-Tek® (Sakura) directamente en el molde del criostato. Las criosecciones (12 pm) se sumergieron 5-15 minutos en una solucion de trabajo de aceite rojo O (2,5 g de aceite rojo O (Sigma-Aldrich), se disolvieron en 400 ml de isopropanol al 99%, se diluyeron adicionalmente 6:10 en H²O, se filtraron a traves de un filtro de 22 pm (Corning) y se enjuagaron durante 10 minutos con agua corriente. Posteriormente, las secciones se sumergieron durante 3 s en una solucion de hematoxilina y se enjuagaron con agua corriente antes de montarse. Las secciones tenidas se examinaron con microscopfa de campo brillante. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para ORO y hematoxilina en cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion glomerular de ORO (pfxel2/pm2).

Se detecto un aumento espedfico en la acumulacion de lipidos en los glomerulos de los animales diabeticos en comparacion con los animales no diabeticos magros (Figura 22). La inhibicion de VEGF-B en db/db//BKS redujo drasticamente esta acumulacion de Kpidos glomerulares ectopica. Las gotitas de Ifpidos se redujeron tanto en numero como en tamano. El analisis indico que las gotitas se acumularon predominantemente en las celulas endoteliales y en los podocitos.

El tratamiento terapeutico anti-VEGF-B (usando 2H10) disminuye la esclerosis glomerular y tubular en ratones db/db// BKS diabeticos graves

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 12 semanas de edad macho y hembra tratados con 2H10 o con anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y se prepararon secciones de 3 pm y se tineron con PAS (Sigma) segun las instrucciones del fabricante. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para PAS dentro de cada seccion con microscopfa de campo brillante (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion glomerular con PAS (pfxel2/pm2).

Los resultados mostrados en las Figuras 23A y 23By del analisis de las secciones tenidas indica que la inhibicion terapeutica de VEGF-B en ratones db/db//BKS reduce la esclerosis glomerular y tubular. El efecto solo se detecta en animales hembra, mas probablemente porque la enfermedad es mas agresiva en ratones db/db//BKS macho (un efecto observado comunmente).

El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico (usando 2H10) reduce la acumulacion de lipidos renal en ratones db/db//BKS diabeticos graves

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 12 semanas de edad macho y hembra tratados con 2H10 o con un anticuerpo control emparejado con isotipo durante 8 semanas y se congelaron instantaneamente en hielo seco y se embebieron en Tissue-Tek® (Sakura) directamente en el molde del criostato. Las criosecciones (12 pm) se sumergieron 5-15 minutos en una solucion de trabajo ORO (2,5 g ORO (Sigma-Aldrich), se disolvieron en 400 ml de isopropanol al 99%, se diluyeron adicionalmente 6:10 en H²O, se filtraron a traves de un filtro de 22 pm (Corning)) y se enjuagaron 10 min con agua corriente del grifo antes de montarse. Las secciones tenidas se examinaron con microscopfa de campo brillante (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 20x y se capturo un mmimo de 10 cuadros por seccion. Para la cuantificacion de las gotitas de lfpidos, la cantidad de pfxeles rojos en cada cuadro se cuantifico usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion total con ORO (pixel, a.u.).

Como se muestra en la Figura 24, la cantidad de tincion con ORO se redujo en ratones db/db//BKS hembra que habfan recibido tratamiento con anticuerpos. Estos datos y el analisis de las secciones tenidas indican que tanto el numero como el tamano de las gotitas de lfpidos se redujeron en ratones db/db//BKS hembra tratados con anticuerpo anti-VEGF-B. El tratamiento con anticuerpos anti-VEGF-B no redujo la acumulacion de lfpidos renal en ratones db/db//BKS macho, probablemente como resultado del desarrollo mas agresivo de la enfermedad en animales macho.

El tratamiento terapeutico anti-VEGF-B (usando 2H10) previene los reordenamientos glomerulares en ratones db/db// BKS diabeticos graves

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 12 semanas de edad hembra tratados con 2H10 o con anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y se prepararon secciones de 3 pm y se inmunotineron para sinaptodina o pecam. Brevemente, la recuperacion de antfgenos se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antfgeno Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 horas con anticuerpos primarios de raton anti-sinapsopodina (Santa Cruz). Se aplicaron anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para pecam dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando un programa asistente Axio Vision Run para tincion con sinaptopodina o pecam glomerular (pfxel2/pm2).

La Figura 25A y 25B muestran niveles aumentados de pecam y de sinaptopodina en glomerulos de ratones tratados terapeuticamente con anticuerpo anti-VEGF. Estos datos y el analisis de las secciones tenidas indican que la morfologfa de los glomerulos se mejora en db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B. La expresion y la estructura de podocitos y las celulas endoteliales, es decir, los tipos de celulas que son cruciales para el proceso de filtracion glomerular, se conservan en los ratones db/db//BKS tratados. Por tanto, estos datos tambien indican que el tratamiento terapeutico con un anticuerpo anti-VEGF tambien previene la perdida vascular y de podocitos de los ratones db/db//BKS.

El tratamiento terapeutico anti-VEGF-B (usando 2H10) reduce la acumulacion de colageno glomerular y la hialinosis arteriolar en ratones db/db//BKS diabeticos graves

Se recogieron rinones de db/db/BKS de 12 semanas de edad hembra tratados con 2H10 o con un anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 8 semanas, se fijaron en PFA al 4% durante 48 horas, se embebieron y se prepararon secciones de 3 pm y se inmunotineron para colageno IV, pecam y/o a-SMA. Brevemente, la recuperacion de antigeno se realizo en secciones de 3 pm usando la solucion de recuperacion de antigeno Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 horas con anticuerpos primarios de conejo anti-sinaptopodina (Santa Cruz). Se aplicaron anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para pccam dentro de cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando un programa asistente Axio Vision Run para tincion con colageno IV, pecam, y/o a-SMA (pfxel2/pm2).

Las Figuras 26A-C muestran niveles reducidos de colageno IV, a-SMA y grosor arteriolar en ratones db/db/BKS tratados con 2H10. Estos datos y analisis de las secciones tenidas muestran un deposito de colageno intra glomerular patologico (deposito de la matriz extracelular) y la hialinosis arteriolar se reduce en ratones db/db//BKS tratados con anticuerpo anti-VEGF-B.

El tratamiento terapeutico anti-VEGF-B (usando 2H10) previene el desarrollo de macroalbuminuria en ratones db/db//BKS diabeticos con microalbuminuria establecida

Se inyecto a ratones db/db/BKS i.p. dos veces por semana, comenzando a las 6-8 semanas de edad, y se continuo durante 8 semanas con 400 pg de o 2H10 o anticuerpo de control emparejado con isotipo. Para la deteccion de ACR, se recogieron de 20 pl a 200 pl de volumen de orina de cada raton. La albumina urinaria se detecto con el kit Albuwell M, y la creatinina urinaria se midio con el kit de ELISA murino de Creatinine Companion (Exocell, Filadelfia, PA). La presion sangumea sistolica y diastolica se midio usando un metodo de manguito de la cola usando la configuracion CODA (Kent Scientific). Todos los animales se habituaron al dispositivo de medicion de presion sangumea durante 2 semanas. Los animales se sometieron a 1-2 ciclos de 20 mediciones reordenadas por dfa durante un mmimo de 3 dfas. Para los estudios de la funcion renal, los ratones individuales se alojaron en jaulas metabolicas. Se monitorizaron el peso corporal y el volumen de orina en 24 h durante 2 dfas consecutivos. Se usaron muestras de orina de las ultimas 24 h para medir la creatinina en orina. Despues de alojarlos en jaulas metabolicas, los animales se sacrificaron con anestesia con isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca, y se uso para medir la creatina en plasma. Los rinones se disecaron y pesaron a microescala. La depuracion de creatinina se calculo mediante (orina [Cr] x volumen de orina)/(plasma [Cr] x 24 h).

La Figura 27A muestra que el tratamiento de ratones db/db/BKS con 2H10 evita la progresion de la microalbuminuria a la macroalbuminuria, en particular, la ACR no cambio significativamente durante el curso del estudio en ratones tratados. La Figura 27B muestra que la tasa de filtracion glomerular (medida como la depuracion de creatinina) tambien se redujo en los ratones db/db/BKS tratados con 2H10. La Figura 27C muestra que el desarrollo de la hipertension se evito mediante la inhibicion de VEGF-B. La Figura 27Dmuestra que reducir la expresion de VEGF-B no tuvo ningun efecto sobre el peso corporal o renal. Estos datos indican que los ratones db/db tratados con anticuerpo anti-VEGF-B tienen una funcion renal mejorada con mejor capacidad de filtracion medida por la concentracion reducida de albumina urinaria, la proporcion albumina/creatinina urinaria y la depuracion de creatinina.

El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico (usando 2H10) en ratones alimentados con HFD tiene un efecto menor sobre los niveles de glucosa en sangre

Los ratones se alimentaron con 60% de HFD (Research Diets, USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a las 5 semanas de edad. El tratamiento con anticuerpos comenzo en la semana 11 y los ratones se trataron con 2H10 o un anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 20 semanas. Los niveles de BG posprandiales de ratones se registraron al final del ensayo, despues de la eliminacion del alimento durante 2 h. Las mediciones de glucosa se realizaron en sangre extrafda de la vena de la cola usando un medidor de glucosa Bayer Contour.

La Figura 28 muestra que la HFD aumenta los niveles de glucosa en sangre; sin embargo, el tratamiento con anti-VEGF-B no previene el desarrollo de la hiperglucemia.

El tratamiento terapeutico con VEGF-B (usando 2H10) en ratones alimentados con HFD mejora la funcion renal sin disminuir los niveles de glucosa en sangre

Los ratones fueron se alimentaron con 60% de HFD (Research Diets, USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a las 5 semanas de edad. El estudio tambien incluyo animales de control de tipo salvaje magros. El tratamiento con anticuerpos comenzo en la semana 11 y los ratones se trataron con 2H10 o anticuerpo de control emparejados con isotipo durante 20 semanas. Para la deteccion de albumina y ACR se recogieron de 20 pl a 200 pl de volumen de orina de cada raton en el punto final del ensayo. La albumina urinaria se detecto usando el kit Albuwell M, y la creatinina urinaria se midio utilizando el kit ELISA murino de Creatinine Companion Murine (Exocell, Filadelfia, PA).

Aunque el tratamiento con anti-VEGF-B en ratones alimentados con HFD no redujo los niveles de glucosa en sangre, el tratamiento tuvo un impacto significativo en la fisiologfa renal diabetica (Figura 29). La capacidad de filtracion del rinon se mejoro segun lo medido por la excrecion de albumina reducida (Figura 29A). ACR (Figura 29B) y GFR, el tratamiento con Anti-VEGF-B en ratones alimentados con HFD no tuvo ningun efecto sobre el peso corporal o renal, en comparacion con los ratones tratados con control.

El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico (usando 2H10) en ratones alimentados con HFD mejora el perfil de lipidos en plasma

Se alimentaron ratones con 60% de HFD (Research Diets, USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a las 5 semanas de edad . El estudio tambien incluyo animales de control de tipo salvaje magros. El tratamiento con anticuerpos comenzo en la semana 11 y los ratones setrataron con 2H10 o un anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 20 semanas. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. La sangre se centrifugo a 14000 rpm, a 4° C durante 10 minutos, luego se separo el plasma y se congelo en alfcuotas a -80° C. Se usaron kits comercialmente disponibles para la determinacion enzimatica de NEFA (Wako Chemicals, Neuss, Alemania), beta-hidroxibutirato (Stanbio Laboratories. Boerne, TX, USA) y trigliceridos (Sigma-Aldrich).

La Figura 30 muestra que la administracion de 2H10 en ratones alimentados con HFD protegio contra niveles elevados de especies de lfpidos asociadas con T2D. Por ejemplo, el tratamiento con anticuerpos anti-VEGF-B disminuyo los niveles en plasma de trigliceridos (Figura 30A), NEFAo (Figura 30B) y cetonas (Figura 30C).

El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico (usando 2H10) en ratones alimentados con HFD previene la expansion mesangial glomerular y la esclerosis

Se alimentaron ratones con 60% de HFD (Research Diets, USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a las 5 semanas de edad. El estudio tambien incluyo animales de control de tipo salvaje magros. El tratamiento con anticuerpos comenzo en la semana 11 y los ratones setrataron con 2H10 o un anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 20 semanas. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. Los rinones se diseccionaron, se fijaron posteriormente en PFA al 4% durante 48 horas y posteriormente se procesaron para embeberlos en parafina usando procedimientos estandar. Despues de embeberlos, se prepararon secciones de 3 pm y se tineron con PAS (Sigma) de acuerdo con el fabricante. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para PAS dentro de cada seccion con microscopfa de campo brillante (microscopio Axio Vision, Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para tincion con PAS glomerular (pfxel2/pm2).

Los datos presentados en la Figura 31 y el analisis de las secciones tenidas muestra que la administracion de 2H10 en ratones alimentados con HFD protegio contra la expansion mesangial glomerular (Figura 31A) y la hipertrofia glomerular (Figura 31B).

El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico (usando 2H10) en ratones alimentados con HFD previene la acumulacion de lipidos glomerular

Se alimentaron ratones con 60% de HFD (Research Diets, USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a las 5 semanas de edad. El estudio tambien incluyo animales de control de tipo salvaje magros. El tratamiento con anticuerpos comenzo en la semana 11 y los ratones se trataron con 2H10 o anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 20 semanas. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. Los rinones se diseccionaron y se congelaron instantaneamente en hielo seco y se embebieron en Tissue-Tek® (Sakura) directamente en el molde del criostato. Las criosecciones (12 pm) se sumergieron 5-15 minutos en una solucion de trabajo de aceite rojo O (2,5 g de aceite rojo O (Sigma-Aldrich), se disolvieron en 400 ml de isopropanol al 99, se diluyeron adicionalmente 6:0 en H²O, Se filtraron a traves de un filtro de 22 pm (Venir) y se enjuagaron durante 10 minutos con agua corriente. Posteriormente, las secciones se sumergieron durante 3 s en una solucion de hematoxilina y se enjuagaron con agua corriente antes de montarlas. Las secciones tenidas se examinaron con microscopfa de campo brillante. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para ORO y hematoxilina dentro cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para la tincion glomerular con ORO (pfxel2/pm2).

Los datos presentados en Figura 32y el analisis de las secciones tenidas muestra que la administracion de 2H10 en ratones alimentados con HFD protege contra la acumulacion de lipidos renales ectopica. Las gotitas de lipidos se reducen tanto en numero como en tamano.

El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico (con 2H10) en ratones alimentados con HFD previene la acumulacion de lipidos glomerular y preserva la integridad de los podocitos

Se alimentaron ratones con 60% de HFD (Research Diets, USA) para HFD durante 30 semanas, comenzando a las 5 semanas de edad. El estudio tambien incluyo animales de control de tipo salvaje magros. El tratamiento con anticuerpos comenzo en la semana 11 y los ratones se trataron con 2H10 o anticuerpo de control emparejado con isotipo durante 20 semanas. Los animales se sacrificaron con anestesia de isofluorano y la sangre total se extrajo mediante puncion cardfaca. Los rinones se diseccionaron, se fijaron posteriormente en PFA al 4% durante 48 horas y posteriormente se procesaron para embeberlos en parafina usando procedimientos estandar. Despues de embeberlos, se prepararon secciones de 3 pm y, posteriormente se inmunotineron para colageno IV, pecam y/o a-SMA. Brevemente, la recuperacion de antfgenos se realizo en secciones de 3 pm usando solucion de recuperacion de antfgeno Ph6 (Dako N° S2367) y se calento a 98° C durante 10 minutos. Las secciones se incubaron a 4° C durante 12 h con anticuerpos primarios de conejo anti-colageno IV (abcam), anti-pecam de cabra (Abcam) o a-SMA (Sigma). Se aplicaron anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente (Invitrogen, Alexa fluor) y las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente, despues de lo cual se prepararon para microscopfa. Se fotografiaron por lo menos 10 glomerulos por animal tenido para colageno IV, pecam o a-SMA en cada seccion con un microscopio Axio Vision (Carl Zeiss) con un aumento de 40x. Los glomerulos se cuantificaron usando el programa asistente Axio Vision Run para i) tincion con colageno IV glomerular (pfxel2/pm2) y ii) grosor de las arteriolas glomerulares (pm2).

Los datos presentados en la Figura 33 y el analisis de las secciones tenidas muestra que la administracion de 2H10 en ratones alimentados con HFD protege contra patologfas histologicas asociadas con la nefropatía diabetica, como la acumulacion de ECM glomerular aumentada (Figura 33A) y la hialinosis arteriolar (Figura 33B). El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico (con 2H10) en animales inyectados con STZ no tiene efecto sobre los niveles de glucosa en sangre

Para la induccion de diabetes tipo I, se empleo un modelo de estreptozotozina (STZ). Los experimentos se realizaron con ratones B1/6 macho de Charles River. Los ratones se privaron de alimento durante 4 horas antes de las inyecciones de STZ, y recibieron 50 mg/kg de peso corporal de estreptozotocina (Sigma-Aldrich) en citrato de sodio 50 mM (pH 4.5) o tampon de citrato de sodio por via intraperitoneal los dfas 1,2, 3, 4 y 5. Los niveles de BG de los ratones se registraron antes y 1 semana despues de la administracion de STZ. Los animales con niveles de glucosa en sangre superiores a 12 mmol/l se consideraron hiperglucemicos. Los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos y se trataron con 2H10 o un anticuerpo de control emparejado con isotipo dos veces por semana. Los niveles de BG postprandiales de los ratones tratados con anti-VEGF-B (2H10) o anticuerpo de control, y los animales de control magros se registraron dos veces por semana despues de la eliminacion de los alimentos durante 2 h. Las mediciones de glucosa se realizaron en sangre extrafda de la vena de la cola usando un medidor de glucosa Bayer Contour.

Como se muestra en Figura la 34A, la inyeccion de STZ en ratones macho induce hiperglucemia. Sin embargo, el tratamiento anti-VEGF-B despues de las inyecciones de STZ no tiene un efecto importante en los niveles de glucosa en sangre (Figura 34B).

El tratamiento anti-VEGF-B terapeutico en animales inyectados con STZ, usando 2H10, mejora la funcion renal Para la induccion de diabetes tipo 1, se empleo el modelo de estreptozotozina (STZ). Los experimentos se realizaron con ratones B1/6 macho de Scanbur. Los ratones se privaron de alimento durante 4 horas antes de las inyecciones de STZ, y recibieron 50 mg/kg de peso corporal de STZ (Sigma-Aldrich) en tampon de citrato de sodio 50 mM (pH 4.5) por via intraperitoneal en el dfa 1-5. Los niveles de BG de los ratones se registraron antes y 1 semana despues de la administracion de STZ. Los animales con niveles de glucosa superiores a 12 mmol/l se consideraron hiperglucemicos. Los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos y se trataron con 2H10 o con un anticuerpo de control emparejado con isotipo dos veces por semana como antes. Para la deteccion de albumina y ACR, se recogieron de 20 pl a 200 pl de volumen de orina de cada raton en el punto final del ensayo (experimento en curso, solo informada 1 semana de tratamiento. La albumina urinaria se detecto usando el kit Albuwell M, y la creatinina urinaria se midio usando el kit ELISA murino Creatinine Companion (Exocell, Filadelfia, PA).

A pesar de efectos menores sobre los niveles de glucosa en sangre en los ratones dosificados con el anticuerpo anti-VEGF-B 2H10 despues de las inyecciones de STZ, la funcion renal de los ratones diabeticos mejoro significativamente con el tratamiento con anticuerpos. La capacidad de filtracion del rinon mejoro segun se midio por la excrecion de albumina reducida (Figura 35A) y ACR (Figura 35B).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B para su uso en el tratamiento de la nefropatía diabetica en un sujeto que padece de nefropatía diabetica, en donde el compuesto que inhibe la senalizacion de VEGF-B es:

(i) una protema que comprende una region variable de anticuerpo que se une o se une espedficamente a VEGF-B y neutraliza la senalizacion de VEGF-B; o

(ii) un acido nucleico que inhibe o evita la expresion de VEGF-B.

2. Un compuesto para el uso de la reivindicacion 1, en el que el sujeto padece de diabetes y microalbuminuria o macroalbuminuria.

3. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1 o 2, en donde el compuesto se administra en una cantidad eficaz para tener uno o mas de los efectos siguientes:

• Reducir o prevenir la hipertension;

• Reducir o prevenir la esclerosis glomerular y/o tubular;

• Reducir o prevenir la expansion mesangial glomerular;

• Reducir o prevenir los reordenamientos vasculares glomerulares;

• Reducir o prevenir la acumulacion de lfpidos renal;

• Reducir o prevenir la acumulacion de lfpidos glomerular;

• Reducir o prevenir la macroalbuminuria.

4. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto es una protema que comprende un Fv.

5. El compuesto para el uso de la reivindicacion 4, en el que la protema se selecciona del grupo que consiste de:

(i) un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv);

(ii) un scFv dimerico (di-scFv); o

(iii) un diacuerpo;

(iv) un triacuerpo;

(v) un tetracuerpo;

(vi) un Fab;

(vii) un F(ab')²;

(viii) un Fv;

(ix) uno de (i) a (viii) enlazado a una region constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (Ch) 2 y/o Ch3; o

(x) un anticuerpo.

6. El compuesto para el uso de la reivindicacion 1, en donde el compuesto es una protema que comprende una region variable de anticuerpo que inhibe competitivamente la union de un anticuerpo que comprende una region variable de la cadena pesada (Vh) que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 3 y una region variable de la cadena ligera (Vl) que comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 4 a VEGF-B.

7. El compuesto para el uso de la reivindicacion 6, en donde el compuesto es una protema que comprende una forma humanizada de la region V^hcomo se expone en SEQ ID NO: 3 o la region V^lcomo se expone en la SEQ ID NO: 4 o el compuesto es una forma humanizada de un anticuerpo que comprende la region Vh expuesta en la SEQ ID NO: 3 y la region V^lexpuesta en la SEQ ID NO: 4.

8. El compuesto para el uso de la reivindicacion 7, en donde el compuesto es un anticuerpo que comprende una V^hque comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 5 y una VLque comprende una secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 6.

9. El compuesto para el uso de las reivindicaciones 1-3, en donde el compuesto es un acido nucleico seleccionado del grupo de un antisentido, un ARNip, un ARNi, una ribozima y una ADNzima.

10. El compuesto para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que se formula para la administracion con un compuesto adicional, en el que el compuesto adicional trata o previene la nefropatía o trata, previene o retrasa la progresion de la diabetes.