ES2712060T3 - Métodos de diagnóstico para el glaucoma - Google Patents

Abstract

Un método para el diagnóstico del glaucoma que comprende las etapas de: (a) proporcionar al menos dos muestras que comprenden al menos un antígeno ocular purificado al menos parcialmente, proporcionando así conjuntamente al menos dos antígenos oculares purificados al menos parcialmente o proporcionar al menos una muestra que comprende al menos dos antígenos oculares purificados al menos parcialmente, en el que los al menos dos antígenos oculares purificados al menos parcialmente se seleccionan entre un Grupo 1 de antígenos oculares que comprende los siguientes antígenos oculares: actina, albúmina, alfa- 1-antitripsina, anexina l-IV, anexina V, receptor adrenérgico beta 2, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, alfa-A cristalina, alfa-B cristalina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma cristalina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, α-fodrina (= espectrina), proteína ácida fibrilar glial (GFAP), glutatión-Stransferasa, proteína de choque térmico HSP10 (= chaperonina), HSP27, HSP60, HSP70, insulina, jo-1, lisozima, proteína de unión a la mielina (MBP), glicoproteína de mielina de oligodendrocitos (MOG), mioglobina, enolasa especifica de neurona (NSE), neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutasa de superóxido, 3-fosfoserina, prealbúmina, inhibidor de la cinasa de proteína C, cinasa de proteína C, dismutasa de superóxido, alfa-sinucleína, gamma-sinucleína, tireoglobulina, transferrina, transtiretina, inhibidor de la topoisomerasa, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vimentina, (b) poner en contacto un líquido corporal con la muestra o las muestras proporcionadas en la etapa a) que comprenden al menos dos antígenos oculares purificados al menos parcialmente, (c) detectar y/o cuantificar las reacciones de la etapa b) entre los autoanticuerpos del líquido corporal y los al menos dos antígenos oculares purificados parcialmente en la muestra o las muestras para la determinación de un valor de la reactividad autoinmune, (d) comparar los valores medidos de la reactividad autoinmune con los datos convencionales obtenidos a partir de pacientes con glaucoma y opcionalmente adicionalmente de individuos sanos, para la determinación de una puntuación de glaucoma y (e) opcionalmente determinar un resultado del diagnóstico mediante la evaluación de la puntuación de glaucoma.

Description

DESCRIPCION

Metodos de diagnostico para el glaucoma

Campo de la invencion

La invencion esta en el campo del diagnostico medico y se refiere en particular a un metodo para el diagnostico del glaucoma basado en el analisis de la reactividad autoimmune. El metodo de diagnostico se basa en las reactividades autoinmunes en los ftquidos corporales de los pacientes con glaucoma. El metodo de diagnostico para el glaucoma se basa en el analisis de la reactividad autoimmune de los ftquidos corporales frente a antfgenos oculares que estan al menos parcialmente purificados.

Antecedentes de la invencion

El glaucoma es un grupo de trastornos oculares caracterizado por la perdida progresiva de las celulas ganglionares de la retina y sus axones, y por una perdida gradual del campo visual. Es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo. El glaucoma tiene una prevalencia de aproximadamente el 1 -2 % en la poblacion general en Europa. Hasta el 3-4 % de las personas mayores de 60 anos estan afectadas por la enfermedad. La forma mas habitual de glaucoma es el glaucoma primario de angulo abierto (POAG), con una prevalencia que vana entre el 1,1 % y el 2 %.

La patogenia del glaucoma solo se comprende parcialmente, y una elevada presion intraocular no es la unica responsable de la enfermedad. Todavfa se considera que un aumento en la presion intraocular es un factor de riesgo importante, pero es probable que otros factores patogenos, tales como procesos apoptoticos, unos elevados niveles de oxido nftrico o una implicacion del sistema inmunitario, sean relevantes.

Adicionalmente, una elevada presion intraocular es bastante prevalente (el 10 % de la poblacion en una edad de 40), sin embargo, unicamente algunos de estos desarrollan un glaucoma a lo largo de los anos. Hasta ahora no existen pruebas diagnosticas convencionales para la identificacion de que personas con una elevada presion intraocular desarrollan un glaucoma. Dado que un tratamiento temprano del glaucoma es crucial para prevenir la perdida de la vision, existe una necesidad de herramientas diagnosticas mejoradas que detecten el glaucoma en una fase temprana independiente de una elevada presion intraocular.

Se sabe que una elevada presion intraocular es una importante causa de muerte de las celulas de la retina y de desarrollo de la enfermedad de glaucoma. Una elevada presion como causa de muerte celular se ha reproducido in vitro. Agar et al. (Brain Res. 2006. 1086 (1): pags. 191-200) exponiendo cultivos in vitro de ftneas celulares ganglionares de la retina a una elevada presion hidrostatica e induciendo la muerte celular.

Sin embargo, tambien se sabe que aproximadamente el 30 % de los casos de glaucoma no estan acompanados por una elevada presion intraocular. Al menos algunas formas de la enfermedad de glaucoma se ajustan al patron de enfermedades neurodegenerativas, con una disfuncion progresiva de aspectos del sistema nervioso, junto con una atrofia progresiva de las estructuras afectadas del sistema nervioso periferico o central. Por lo tanto, se analizan algunas causas y mecanismos adicionales, que aparte de una elevada presion intraocular, estan dando lugar a la destruccion de las celulas ganglionares de la retina, tales como, por ejemplo, un elevado nivel de oxido nftrico o un proceso mediado por los linfocitos T o ataques autoinmunes.

Los metodos de deteccion temprana del glaucoma todavfa son limitados. La medicion de la presion intraocular puede detectar algunos de los pacientes, pero unos niveles fluctuantes en la presion tambien pueden dar lugar a un resultado falso negativo. En ese momento, cuando los propios pacientes reconocen una perdida en la funcion visual, en la mayona de los casos ya se ha producido un gran defecto irreversible de las celulas ganglionares de la retina.

Aproximadamente el 30 % de los casos de glaucoma que no estan acompanados por una elevada presion intraocular se denominan glaucoma de tension normal. El metodo de deteccion tradicional de medir una elevada presion intraocular fracasa con estos pacientes. Teniendo en consideracion la ausencia de un metodo de diagnostico para el de glaucoma tension normal, asf como la falta de un metodo de deteccion para el glaucoma de fase temprana, es necesario desarrollar metodos para la deteccion del glaucoma independientemente de la presion intraocular. La autoinmunidad como un factor importante en el glaucoma se ha demostrado mediante diversos estudios que muestran anticuerpos sericos contra los antfgenos oculares. Por ejemplo, las protemas de choque termico HSP27, HSP60, a-pcristalina, Y-enolasa, a-fodrina, glutation-S-transferasa y glicosoaminoglicanos, tienen diferentes niveles de reactividades de union en los pacientes con glaucoma en comparacion con los sujetos sanos (por ejemplo, Joachim, S. C., et al., Curr. Eye Res. 2007, 32 (6): pags. 501-9 o, por ejemplo, F. H. Grus, Klin Monatsbl Augenheilkd 2010: 227: 114-119.) De forma interesante, no solo unas elevadas reactividades de anticuerpo, que podnan tener un impacto autoagresivo, si no que ciertos antfgenos con unas reactividades autoinmunes disminuidas, son caractensticos en los ftquidos corporales de los pacientes con glaucoma. Adicionalmente, podna demostrarse que la aplicacion directa de anticuerpos anti-HSP da como resultado una apoptosis de las celulas ganglionares de la retina en una metodologfa de cultivo celular (Tezel G, et al. Invest Oftalmol. Vis. Sci. 1998; 39: 2277-2287). Previamente se han divulgado metodos de diagnostico basados en un patron espedfico de reactividad autoinmune de los pacientes con glaucoma.

Por ejemplo, el documento WO2004/036220 desvela metodos para el diagnostico del glaucoma mediante el analisis del complejo repertorio de anticuerpos en los lfquidos corporales tales como el suero, las lagrimas, el humor acuoso o la saliva, frente a antigenos oculares. Como fuente de los antigenos oculares se han usado mezclas en bruto de antigenos de la retina, de antigenos del nervio optico y otros, y se han medido los complejos patrones de reactividad autoinmune. Se ha utilizado una diversidad de tecnicas analtticas inmunologicas que incluyen ensayos de inmunotransferencia Western, ensayos de quimioluminiscencia, ELISA, radioinmunoensayos para la deteccion y la medicion de los patrones de reactividad autoinmune, al igual que se divulgaron metodos para la deteccion, el procesado y el analisis digital de imagenes, para la generacion y el analisis comparativo de los patrones de reactividad autoinmune de individuos de prueba, de individuos sanos y de pacientes con glaucoma. El documento WO2004/036220 ensena metodos de diagnostico para el glaucoma que se basan en los patrones de reactividad autoinmune frente a los antfgenos oculares, que no son aislados a partir de mezclas complejas de un gran numero de antfgenos oculares, y la mayona de los cuales no han sido identificados. La diferencia en los patrones de reactividad autoinmune de los lfquidos corporales entre los individuos de prueba, los individuos sanos y los pacientes con glaucoma produce entonces el resultado del diagnostico. Sin embargo, los estudios en el campo diagnostico relativos a otras enfermedades tales como el cancer han revelado que el diagnostico basado en una reactividad autoinmune frente a biomarcadores de identidad desconocida a menudo es poco fiable. Por lo tanto, existe la necesidad de unos metodos fiables de diagnostico del glaucoma, que sean independientes de una elevada presion intraocular.

Adicionalmente, el documento EP 18332600 desvela peptidos y los correspondientes acidos nucleicos para la interaccion de los epftopos con autoanticuerpos contra el receptor adrenergico beta 2. Estos autoanticuerpos estan asociados con el glaucoma. El documento WO 2009/145478 desvela un kit de diagnostico para el glaucoma que comprende el antfgeno que contiene la protema valosina, que interactua espedficamente con los anticuerpos asociados al glaucoma alfa enolasa o colageno de tipo VI.

Es un objeto de la actual invencion proporcionar metodos de diagnostico alternativos y mejorados y fiables para detectar el glaucoma independiente de una presion intraocular aumentada mediante el analisis de los lfquidos corporales. Es un objeto adicional de la invencion proporcionar metodos de diagnostico para la deteccion del glaucoma con unos grados de sensibilidad y de especificidad seleccionables usados tanto para una prueba rapida como para una prueba profesional de laboratorio. Algunos objetos adicionales de la invencion incluyen la provision de elementos portadores del antfgeno y de kits para el diagnostico del glaucoma, asf como antfgenos oculares recien identificados que sirven como biomarcadores para el diagnostico del glaucoma y como agentes bloqueantes en el tratamiento terapeutico del glaucoma.

Sumario de la invencion

La invencion concierne a un metodo de diagnostico para el glaucoma basado en un analisis de la reactividad autoinmune en un lfquido corporal frente a los antfgenos oculares purificados al menos parcialmente, en el que se miden las reactividades autoinmunes frente a dos o mas antfgenos oculares conocidos y se transforman en una puntuacion de glaucoma segun su contribucion preferentemente ponderada de las reactividades autoinmunes medidas hacia un resultado del diagnostico.

El metodo de diagnostico para el glaucoma comprende las etapas de (a) proporcionar al menos dos muestras que comprenden al menos un antfgeno ocular purificado al menos parcialmente, proporcionando asf conjuntamente al menos dos antfgenos oculares purificados al menos parcialmente o proporcionar al menos una muestra que comprende al menos dos antfgenos oculares purificados al menos parcialmente, (b) hacer reaccionar un lfquido corporal con la al menos una muestra de antfgeno ocular, (c) detectar y / o cuantificar las reacciones entre los autoanticuerpos del lfquido corporal y la al menos una muestra de antfgeno ocular de la etapa b para determinar un valor de reactividad autoinmune, d) comparar los valores medidos de la reactividad autoinmune con los datos convencionales obtenidos a partir de pacientes con glaucoma y/o de individuos sanos para determinar una puntuacion de glaucoma para la al menos una muestra de antfgeno y e) opcionalmente, determinar el resultado del diagnostico mediante la evaluacion de la al menos una puntuacion de glaucoma.

El termino lfquido corporal de individuos humanos o de animales, en el contexto de esta solicitud incluye, pero no se limita a, suero, lagrimas, saliva, orina, humor acuoso, cuerpo vttreo del ojo o lfquido cefalorraqrndeo, y fracciones de los mismos o un homogeneizado de espedmenes tisulares de individuos humanos o de animales y fracciones de los mismos. En las realizaciones preferidas del metodo para el diagnostico del glaucoma se usa suero sangumeo o lagrimas.

Antfgeno ocular se refiere a cualquier antfgeno que aparece tambien en el ojo, y obviamente algunos de estos antfgenos oculares mencionados explfcitamente a continuacion son ubicuos. Los antigenos oculares presentes en el ojo incluyen, en particular, antfgenos de la retina, antfgenos del nervio optico, antfgenos del nervio optico de la cabeza, antfgenos de la red trabecular, antfgenos uveales. Se sabe que los antfgenos relevantes del glaucoma no estan restringidos a las protemas presentes en las celulas ganglionares de la retina, sino que incluyen los antfgenos que son caractensticos de las celulas vecinas, tales como las celulas de la glfa o los componentes del citoesqueleto.

Adicionalmente, para esta solicitud, el termino antfgenos oculares - incluyendo todos los antfgenos oculares indicados espedficamente mencionados a continuacion - se aplica no solo a las formas fisiologicas naturales de las respectivas protemas, sino tambien a las formas modificadas post-traduccionalmente y a cualquier otro derivado natural o artificial tal como peptidos, y a las formas que estan etiquetadas, escindidas, modificadas qmmicamente que de otro modo incluyen combinaciones de las modificaciones mencionadas.

Los antfgenos oculares purificados al menos parcialmente se refieren a los antigenos oculares que se afslan a partir de la mezcla compleja de protemas de su entorno fisiologico mediante una purificacion al menos parcial de la protema con las tecnicas de purificacion de protemas convencionales. Los antigenos oculares con una pureza de calidad comercial disponibles tambien se consideran antigenos oculares purificados al menos parcialmente para su uso en un metodo de diagnostico para el glaucoma en el contexto de esta publicacion. Dicha purificacion parcial produce al menos un 70 % de uno o de mas antfgenos oculares deseados en peso de la protema total, preferentemente al menos un 80 % mas preferentemente al menos un 90 % y lo mas preferentemente al menos un 95 %.

El termino muestra de antigeno ocular se refiere a una muestra que comprende uno o mas antfgenos oculares purificados al menos parcialmente. En las realizaciones preferidas del metodo segun la invencion, la muestra de antigeno ocular comprende unicamente un antigeno ocular, y las puntuaciones de glaucoma se determinan individualmente para cada uno de los antigenos oculares parcialmente purificados por separado. En algunas realizaciones preferidas adicionales, se combinan dos o mas antigenos oculares parcialmente purificados en al menos una de las muestras de antigeno ocular. Para dichas muestras de antigenos oculares, las reactividades autoinmunes medidas se corresponden con la reaccion autoinmune frente a una combinacion de dos o mas antigenos oculares, que da lugar a continuacion a una puntuacion de glaucoma. En contraste con los antigenos no aislados a partir de su entorno fisiologico, tales como lisados de celulas oculares, las cantidades relativas de los componentes de la combinacion de antfgenos esta controlada. Dicha combinacion controlada de antfgenos puede dar lugar tambien a una ponderacion, es decir, el efecto de que un factor de ponderacion modula la contribucion de la reactividad autoinmune medida de ciertos antfgenos oculares en el resultado del diagnostico.

En esta publicacion, los terminos 'antfgenos oculares' o ’antfgenos’ se usan a menudo de forma intercambiable y en lugar de las expresiones mas bien largas ’antfgenos oculares purificados al menos parcialmente’ o 'muestras de antfgenos oculares purificados al menos parcialmente’.

La reactividad autoinmune o, de forma intercambiable, la inmunorreactividad, y la reactividad autoanticuerpo en el contexto de esta publicacion, se refieren a la actividad de union de los anticuerpos presentes en un lfquido corporal a un antfgeno ocular purificado al menos parcialmente, que es incubado con el lfquido corporal.

Los metodos para la deteccion y la medicion de la reactividad autoinmune incluyen las tecnicas analfticas inmunologicas convencionales tales como un analisis de inmunotransferencia Western, un ensayo de quimioluminiscencia, un ELISA, radioinmunoensayos, micromatrices y otros. Los antfgenos se aplican y se fijan a un elemento portador del antfgeno, y despues se incuban con el lfquido corporal que contiene los autoanticuerpos que se van a detectar. Posteriormente, los autoanticuerpos unidos son identificados para determinar las reactividades autoinmunes. Los metodos para la identificacion incluyen, por ejemplo, el pre-etiquetado de la muestra que se va a analizar, la adicion de un anticuerpo secundario, que se une a los autoanticuerpos unidos al antfgeno o a una etiqueta indirecta, por ejemplo, anti-inmunoglobulinas humanas de cabra etiquetadas, etc. Algunos metodos adicionales incluyen el analisis de elementos direccionables tales como microesferas, nanopartmulas, etiquetas, etc. Algunos metodos de deteccion tambien pueden incluir metodos que no requieren un etiquetado, por ejemplo, de tipo SELDI-TOF (espectrometna de masas con desorcion/ionizacion superficial mejorada por laser en tiempo de vuelo), MALDI (espectroscopfa de masas con desorcion/ionizacion mediante laser asistida por matriz u otras tecnicas de chip de anticuerpo.

El metodo para el diagnostico del glaucoma segun la invencion se basa en la diferencia en la reactividad autoinmune promedio en las personas sanas en comparacion con los pacientes con glaucoma frente a ciertos antfgenos oculares. Por lo tanto, se usan ciertos tftulos de autoanticuerpos frente a ciertos antfgenos oculares de un lfquido corporal como prueba diagnostica de la enfermedad de glaucoma.

Tambien se divulgan los recien identificados antfgenos oculares, a los que se unen diferencialmente los autoanticuerpos en los individuos sanos y en los pacientes con glaucoma, y que son utiles diagnosticos como marcadores (o biomarcadores) para la deteccion de la enfermedad de glaucoma.

Con objeto de extraer informacion a partir de las senales medidas de las reactividades autoinmunes frente a las muestras de antfgeno ocular, las senales o los valores medidos de la reactividad autoinmune se comparan con los datos convencionales, en las realizaciones preferidas, la comparacion de la etapa d) se lleva a cabo para cada muestra de antfgeno ocular, por separado. En las realizaciones preferidas, los datos convencionales incluyen los valores medios de la reactividad autoinmune medida frente a cada muestra de antfgeno ocular tanto para los controles sanos como para los pacientes con glaucoma. En otras realizaciones preferidas, los datos convencionales incluyen los valores medios de la reactividad autoinmune medida frente a cada muestra de antfgeno ocular caractenstica de ciertas fases de la enfermedad. Por lo tanto, el diagnostico de las diferentes fases de la enfermedad de glaucoma, y tambien la monitorizacion de la progresion de la enfermedad de glaucoma, estan en el metodo segun la invencion. En algunas realizaciones preferidas adicionales, los datos convencionales de las reactividades autoinmunes incluyen las reactividades autoinmunes caractensticas de los subtipos de las formas espedficas de la enfermedad de glaucoma.

Dichos datos convencionales pueden ser generados mediante reacciones de control de las etapas (a) - (c) del metodo para el diagnostico de glaucoma de los lfquidos corporales de los individuos sanos y de los pacientes con glaucoma que se realizan en paralelo con las muestras de prueba, o dichos datos convencionales pueden proceder de los datos almacenados de las reacciones de control llevadas a cabo en unas condiciones identicas en un momento diferente.

En las realizaciones preferidas, se deduce la puntuacion de glaucoma para cada muestra de antfgeno ocular a partir del valor medido de la reactividad autoinmune mediante la correlacion del valor medido de un individuo de prueba con los datos convencionales, y la transformacion del valor medido de la reactividad autoinmune en una puntuacion de glaucoma. En un ejemplo simplificado, se determina una puntuacion de glaucoma a partir de la reactividad autoinmune medida para cada muestra individual de antfgeno ocular en un escala de diagnostico del glaucoma de entre 0 y 100, en la que 0 se corresponde con el valor medio de la reactividad autoinmune medida frente a un antfgeno ocular en particular en personas sanas, y 100 se corresponde con el valor medio de la reactividad autoinmune medida frente a este antfgeno en pacientes con glaucoma.

En las realizaciones preferidas del metodo segun la invencion se usan algoritmos que usan metodos convencionales de tecnicas estadfsticas multivariantes, algoritmos ramificados o redes neurales artificiales para calcular la transformacion desde un valor de la reactividad autoinmune medida a la correspondiente puntuacion de glaucoma segun la etapa (d). De una forma analoga, en la etapa (e) se usan algoritmos en algunas realizaciones preferidas para el analisis de las puntuaciones de glaucoma determinadas para cada una de las muestras de antfgenos oculares, para determinar el resultado del diagnostico, y en algunas realizaciones preferidas adicionales, se usan algoritmos en ambas etapas. En algunas variantes adicionales mas, la al menos una puntuacion de glaucoma de la etapa (d) es la ultima etapa del metodo de diagnostico del glaucoma. Segun estas variantes, la etapa (e) no esta comprendida por el metodo de diagnostico para el glaucoma, pero es llevada a cabo por un profesional medico, quien deduce un resultado del diagnostico a partir de las puntuaciones de glaucoma.

Una importante ventaja del metodo de diagnostico para el glaucoma segun la invencion es que el resultado del diagnostico se basa en el analisis de las puntuaciones de glaucoma de los antfgenos purificados parcialmente de identidad conocida.

En las realizaciones preferidas se asigna un factor de ponderacion a al menos una de las muestras de antfgenos oculares. Dichos factores de ponderacion modulan la contribucion de la reactividad autoinmune frente a una muestra de antfgeno ocular en particular para el resultado del diagnostico. En las realizaciones preferidas, el factor de ponderacion es introducido calculadamente en la etapa (c) o (d) o (e) del metodo de diagnostico, sin embargo, en algunas realizaciones preferidas se introduce un factor de ponderacion en las etapas (a) o (b) y en algunas realizaciones adicionales mas, los factores de ponderacion se introducen en mas de una de las etapas (a) - (e). Los factores de ponderacion tienen el efecto de modular el resultado del diagnostico independientemente de la etapa en la que son introducidos. Una puntuacion ponderada de glaucoma es el resultado de un factor de ponderacion que ha sido introducido en una cualquiera o mas de una de las etapas (a) - (e).

Segun algunas realizaciones preferidas en las que el resultado del diagnostico se basa en una puntuacion ponderada de glaucoma, el factor de ponderacion espedfico es introducido en una etapa computacional cuando las senales desencadenadas a partir de los autoanticuerpos que se unen a los antfgenos individuales son detectadas y medidas con una herramienta de deteccion de senales, tal como un lector optico.

Segun algunas realizaciones preferidas adicionales, el factor de ponderacion es introducido mediante la ponderacion diferencial de la cantidad de antfgenos individuales expuesta a la reaccion con los anticuerpos autoinmunes y/o mediante la ponderacion de una o mas de las etapas analtticas para la deteccion y la medicion de la reactividad autoinmune contra los antfgenos individuales. Algunos ejemplos de dichas realizaciones incluyen la deteccion de la reactividad autoinmune con microesferas disenadas para que sean espedficas para diferentes antfgenos, y la ponderacion puede llevarse a cabo bien mediante una intensidad diferencial de la etiqueta de las microesferas espedficas del antfgeno, o bien mediante una sensibilidad con una graduacion diferencial de la herramienta de deteccion.

Las puntuaciones de glaucoma son ponderadas, por ejemplo, de forma que las puntuaciones de glaucoma para las muestras de antfgeno ocular con una elevada relevancia diagnostica contribuyan mas al resultado del diagnostico. En un ejemplo simplificado, una muestra de antfgeno ocular X, que desencadena reactividades autoinmunes, que difieren en un amplio valor significativo entre los pacientes con glaucoma y los individuos sanos, y con los datos convencionales de los valores para mediados con unas bajas desviaciones tfpicas, tienen generalmente una mayor relevancia diagnostica que una muestra de antfgeno ocular Y que desencadena unas reactividades autoinmunes que difieren unicamente ligeramente entre los pacientes con glaucoma y los individuos sanos y que tiene unos valores convencionales medios con una elevada desviacion tfpica. Correspondiente y particularmente, en una prueba de glaucoma que esta disenada para maximizar la especificidad, las puntuaciones de glaucoma para la muestra de antfgeno X senan ponderadas de una forma mas importante que las puntuaciones de glaucoma para la muestra de antigeno Y, para modular su respectiva contribucion al resultado del diagnostico.

Es una ventaja adicional del metodo de diagnostico que los antigenos oculares purificados parcialmente conocidos, que estan comprendidos en las muestras de antigenos oculares proporcionadas en la etapa a) y/o cualquier factor de ponderacion asignado, pueden elegirse, se seleccionan dependiendo del proposito de una prueba diagnostica en particular para el glaucoma. Por ejemplo, en una prueba de cribado disenada para el diagnostico del glaucoma en una fase temprana de la enfermedad, sena deseable maximizar la sensibilidad. Para dicha aplicacion de prueba diagnostica se considera aceptable un cierto numero de falsos positivos, pero debenan evitarse los falsos negativos.

Una ventaja adicional de las realizaciones preferidas del metodo de diagnostico es que, a partir del conocimiento del papel fisiologico de los antfgenos que produjeron una elevada puntuacion de glaucoma en un paciente en particular, puede extraerse una informacion diagnostica adicional, enriqueciendo asf el resultado del diagnostico.

Segun se va sabiendo mas sobre como la progresion de la enfermedad se correlaciona con la reactividad autoinmune frente a los antfgenos oculares, dichos antfgenos caractensticos de una fase espedfica, particularmente de una fase temprana, pueden usarse como biomarcadores para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad, incluyendo la monitorizacion de la eficacia de un tratamiento medico en la ralentizacion o la detencion de la progresion de la enfermedad. Clmicamente, es de gran importancia identificar, entre los individuos con una elevada presion intraocular, aquellos que desarrollan un glaucoma, con objeto de comenzar el tratamiento antes de la muerte irreversible de las celulas ganglionares de la retina.

En la etapa a) del metodo para el diagnostico de glaucoma, al menos 2 antfgenos oculares purificados parcialmente, o al menos 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8 o 9 antfgenos, o preferentemente al menos 2 y menos de 5 o de 10 antfgenos del grupo 1 que consisten en los siguientes 48 antfgenos oculares, estan comprendidos en una o mas muestras de antfgenos oculares purificados al menos parcialmente: actina, albumina, alfa-1-antitripsina, anexina l-IV, anexina V, receptor adrenergico beta 2, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, alfa-A cristalina, alfa-B cristalina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma-cristalina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, a-fodrina(= espectrina), protema acida fibrilar glial (GFAP), glutation-S-transferasa, protema de choque termico HSP10 (= chaperonina), HSP27, HSP60, HSP70, insulina, jo-1, lisozima, protema de union a la mielina (MBP), glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG), mioglobina, enolasa especifica de neurona (NSE), neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutasa de superoxido, 3-fosfoserina, prealbumina, inhibidor de la cinasa de protema C, cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, alfa-sinuclema, gamma-sinuclema, tireoglobulina, transferrina, transtiretina, inhibidor de la topoisomerasa, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vimentina.

El siguiente subgrupo de los antfgenos mencionados anteriormente, denominado Grupo 2, ha sido identificado como marcadores diagnosticos del glaucoma por primera vez. En algunas realizaciones preferidas adicionales de la etapa a) del metodo para el diagnostico del glaucoma, al menos 1 antfgeno ocular purificado parcialmente, o al menos 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u8 o 9 antfgenos, o preferentemente al menos 2 y menos de 5 o de 10 o de 20 antfgenos del siguiente Grupo 2 que consiste en antfgenos oculares, estan comprendidos en una o mas muestras de antfgenos oculares purificados al menos parcialmente: albumina, anexina l-IV, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, beta-S cristalina, gamma cristalina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, insulina, jo-1, lisozima, glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutasa de superoxido, 3-fosfoserina, prealbumina, inhibidor de la cinasa de protema C, cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, alfa-sinuclema, tireoglobulina, transferrina, transtiretina, inhibidor de la topoisomerasa, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

Para algunos de los antfgenos del anteriormente mencionado grupo 1 se sabfa previamente que las reactividades autoanticuerpo contra ellos eran diferentes en los pacientes con glaucoma y en los individuos sanos. Esto se ha confirmado (veanse los ejemplos y las figuras), y su reactividad autoanticuerpo tiene una relevancia diagnostica tambien para el glaucoma. Estos antfgenos oculares del grupo 3 son: actina, alfa-A cristalina, alfa-B cristalina, afodrina (= espectrina), protema acida fibrilar glial (GFAP), glutation-S-transferasa, HSP27, HSP60, HSP70, protema de union a la mielina (MBP), enolasa especifica de neurona (NSE), vimentina.

Los antfgenos del grupo 1 se han clasificado en tres subgrupos A, B y C. Mediante los metodos descritos en los ejemplos y en las figuras, en los que se miden las reactividades autoinmunes frente a los diferentes antfgenos oculares en los individuos sanos y en los pacientes con glaucoma, se ha evaluado la relevancia diagnostica o los antfgenos. Los antfgenos del grupo C o preferentemente los antfgenos del grupo B, o mas preferentemente los antfgenos del grupo A, estan comprendidos en la al menos una muestra de antfgenos oculares usada para el primer metodo de diagnostico para el glaucoma.

El siguiente grupo de antfgenos oculares purificados parcialmente ha sido identificado como marcadores diagnosticos muy altamente relevantes para el glaucoma y se ha clasificado como antfgenos del grupo A: actina, alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A-cristalina, alfa-B cristalina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma cristalina, a-fodrina (= espectrina), protema acida fibrilar glial (GFAP), glutation-S-transferasa, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, protema de union a la mielina (MBP), enolasa especifica de neurona (NSE), inhibidor de la cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, transferrina, transtiretina, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vimentina. En las realizaciones preferidas, la al menos una muestra de antfgenos oculares proporcionada en la etapa a) comprende al menos 2 antfgenos seleccionados entre el Grupo A de antigenos oculares.

El siguiente grupo de antigenos oculares purificados parcialmente ha sido identificado como marcadores diagnosticos muy altamente relevantes para el glaucoma y se ha clasificado como antigenos del grupo B: anexina l-IV, receptor adrenergico beta 2, calreticulina, protema de choque termico HSP10 (= chaperonina), insulina, dismutasa de superoxido, cinasa de protema C, alfa-sinuclema, gamma-sinuclema. En algunas realizaciones preferidas adicionales, la al menos una muestra de antfgenos oculares proporcionada en la etapa a) comprende al menos 2 antfgenos seleccionados entre el Grupo A y/o entre el Grupo B de antfgenos oculares:

Tambien, el siguiente grupo C de antfgenos oculares purificados parcialmente ha sido identificado como marcadores diagnosticos relevantes para el glaucoma: albumina, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), cardiolipina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, lisozima, glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, 3-fosfoserina, tireoglobulina, inhibidor de la topoisomerasa.

En algunas realizaciones preferidas adicionales, la al menos una muestra de antfgenos oculares purificados al menos parcialmente comprende al menos 1 antfgeno, o preferentemente al menos 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u8 o 9 antfgenos, o preferentemente al menos 1 y menos de 5 o de 10 antfgenos o preferentemente al menos 2 y menos de 20 o la totalidad de los antfgenos, que pertenecen al Grupo 2 o tanto a los Grupos 2 como al Grupo A, clasificados como el Grupo 2-A o que pertenecen al Grupo 2, y bien al Grupo A o al Grupo B, clasificados como el Grupo 2-AB.

Tambien se divulga un elemento portador del antfgeno que porta al menos una muestra que comprende al menos un antfgeno ocular purificado al menos parcialmente. Algunas realizaciones preferidas del elemento portador del antfgeno incluyen chips con micromatriz, tiras reactivas de flujo lateral y chips microfluidos. En algunas realizaciones preferidas, el elemento portador del antfgeno comprende una zona de antfgeno predeterminada que es un area superficial de la tira o del portaobjetos o de la placa y similares o una superficie predeterminada en un dispositivo sobre el que se van a aplicar o microaplicar las muestras de antfgeno ocular. En otras realizaciones preferidas mas, el elemento portador del antfgeno comprende adicionalmente una zona receptora del lfquido corporal. En algunas realizaciones preferidas adicionales, el elemento portador del antfgeno comprende microesferas u otro sustrato que es recubierto con las muestras de antfgenos oculares. En algunas realizaciones preferidas adicionales, el elemento portador del antfgeno porta unas cantidades ponderadas de las muestras de antfgenos oculares, y en algunas realizaciones adicionales mas, el elemento portador del antfgeno comprende antfgenos oculares seleccionados entre el Grupo 1 o el Grupo 2 o el Grupo A o el Grupo A y el B o el Grupo 2-A. Pueden usarse combinaciones de las caractensticas mencionadas anteriormente para el elemento portador del antfgeno.

En una realizacion preferida del metodo de diagnostico para el glaucoma, el elemento que porta la al menos una muestra de muestras de antfgenos oculares es un chip con micromatriz del antfgeno. La al menos una muestra de antfgenos oculares es aplicada en una matriz del antfgeno o en una micromatriz del antfgeno en una matriz de aplicaciones bidimensional o tridimensional en un elemento portador del antfgeno, que es, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio, una placa o un chip o un portaobjetos de nitrocelulosa o un portaobjetos de hidrogel, y similares. Las matrices de protemas se preparan aplicando al menos 2, preferentemente 3-5 o 3-9 o 3-12 muestras de los antfgenos oculares purificados al menos parcialmente, cuando sea aplicable, un grupo de antfgenos en particular descrito anteriormente sobre el elemento portador, tal como sobre portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa. Las matrices se incuban con las muestras de un lfquido corporal apropiadamente diluidas, tales como suero sangumeo, lagrimas o humor acuoso. La reactividad autoinmune se detecta, por ejemplo, mediante la visualizacion de las reacciones autoanticuerpo-antfgeno en las matrices segun las tecnicas establecidas conocidas en la materia tales como, por ejemplo, mediante un tratamiento con un anticuerpo anti IgG con una etiqueta fluorescente, seguido de un escaneo de la fluorescencia. Las senales emitidas por los anticuerpos secundarios son digitalizadas; las intensidades de las aplicaciones medidas y opcionalmente comparadas con los resultados de los lfquidos corporales de los individuos de control mediante el uso de tecnicas estadfsticas multivariantes. Algunas alternativas para deteccion de una reactividad autoanticuerpo incluyen una visualizacion mediante un anticuerpo anti-IgG humana acoplado a una enzima que reacciona con un componente anadido o presente en el elemento portador del antfgeno, que da como resultado la aparicion de un color o el cambio de un color. Dicho cambio de color, en algunas aplicaciones, puede ser visualizado directamente o mediante una herramienta de deteccion tal como un lector optico. En algunas realizaciones preferidas adicionales mas, las reactividades autoinmunes se miden con un ensayo de competicion, que es otra tecnica de inmunoensayo establecida: por ejemplo, anticuerpos monoclonales fluorescentes disponibles comercialmente espedficos para ciertos antfgenos oculares compiten con los autoanticuerpos, que estan presentes en el lfquido corporal de la etapa b) por reaccionar con los mmimos antfgenos oculares purificados parcialmente proporcionados en la etapa a). Una fuerte reactividad autoinmune en el lfquido corporal contra un antfgeno ocular en particular en dicho ensayo da como resultado una senal debil, debido a que a los anticuerpos comerciales con etiqueta fluorescente se les impide la union a los antfgenos por parte de los autoanticuerpos no etiquetados del lfquido corporal. Evidentemente, la invencion no esta limitada a estos ejemplos de ensayos inmunologicos convencionales conocidos en la materia, que se mencionan aqrn como meros ejemplos, sino que se extiende a cualquier ensayo inmunologico convencional conocido en la materia que sea aplicable para la determinacion de la reactividad autoinmune en lfquidos corporales frente a los antfgenos oculares purificados al menos parcialmente.

En algunas aplicaciones preferidas se introduce un factor de ponderacion asignado a los antigenos individuales para modular su contribucion al resultado del diagnostico, por ejemplo, mediante la aplicacion de diferentes cantidades del antigeno en la micromatriz, o mediante la ponderacion diferencial de las senales desencadenadas por los anticuerpos unidos a los antigenos individuales. En algunas realizaciones preferidas adicionales, las cantidades de antigeno aplicadas en la micromatriz se vanan con objeto de modular la intensidad de la senal esperada de reactividad autoinmune, de forma que este en un intervalo lineal de deteccion de la senal por parte de la herramienta de deteccion.

Como se presenta adicionalmente en el ejemplo 7, una prueba para el glaucoma con una seleccion unicamente con 5 antigenos purificados al menos parcialmente da como resultado una diferenciacion entre los pacientes con glaucoma y los individuos sanos con una especificidad y una sensibilidad de aproximadamente el 90 %. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas adicionales, el numero de muestras de antfgenos oculares esta limitado a un pequeno numero tal como 10 u8 o 6 o 5 o menos de 5, con objeto de proporcionar una prueba que sea simple en su analisis y que sea producible a un bajo coste, para el cribado en masa de grandes cantidades de individuos.

En una realizacion preferida adicional del metodo de diagnostico para el glaucoma, el elemento portador de en la al menos una muestra de muestras de antfgeno ocular es una tira reactiva de flujo lateral. En las variantes preferidas de estas realizaciones, el elemento portador del antfgeno comprende una zona portadora del antfgeno predeterminada y una zona receptora predeterminada para un lfquido corporal. En algunas variantes preferidas adicionales, la tira de flujo lateral comprende opcionalmente varias zonas que comprenden subzonas. Se aplica una seleccion de los antfgenos oculares purificados al menos parcialmente en la zona del antigeno. Las muestras de antfgenos oculares individuales pueden aplicarse, segun algunas variantes del metodo, en diferentes subzonas o mezclarse en una zona o en varias subzonas. En una etapa posterior, se aplica una muestra de lfquido corporal que opcionalmente esta apropiadamente pretratada y/o diluida, en la zona receptora de la tira reactiva. Pueden incluirse los reactivos apropiados para la visualizacion de los autoanticuerpos, que estan unidos a los antfgenos, en la zona del antfgeno o en la zona receptora, o en ambas. Alternativamente, la tira reactiva con los autoanticuerpos unidos puede incubarse posteriormente en la etapa de union con los reactivos para la visualizacion. Las etapas de deteccion, tales como la visualizacion, se miden con o sin herramientas analfticas tales como lector de imagenes que produce un resultado digitalizado. En algunas aplicaciones preferidas, un factor de ponderacion asignado a los antfgenos individuales para su contribucion al resultado del diagnostico es introducido, por ejemplo, mediante la aplicacion de diferentes cantidades de antfgeno a la zona del antfgeno de la tira reactiva o mediante la adicion diferencial de los reactivos qmmicos o mediante la ponderacion diferencial de las senales desencadenadas por los anticuerpos unidos a los antfgenos individuales. Obviamente, algunas de las caractensticas y de las combinaciones con caractensticas, que se describen mas arriba para las realizaciones del metodo que usa las micromatrices, tambien son igualmente aplicables a las realizaciones preferidas de las tiras reactivas de flujo lateral.

Algunas realizaciones preferidas adicionales de las tiras reactivas de flujo lateral estan disenadas para estar en contacto directamente con un paciente con la zona receptora de la tira reactiva, para recoger un lfquido corporal tal como lagrimas. Las zonas receptoras similares para la recoleccion de los lfquidos corporales tambien son parte de otras realizaciones del elemento portador del antfgeno, tal como los chips microfluidos o las columnas con microesferas portadoras del antfgeno que comprenden una zona receptora de un material adsorbente.

A partir del estado de la tecnica se sabe que la ausencia de reactividad autoinmune o que una reactividad autoinmune reducida frente a ciertos antfgenos tambien es indicativa de glaucoma. Por lo tanto, algunas realizaciones preferidas estan disenadas de forma que la ausencia o la union reducida de los anticuerpos autoinmunes frente a los antfgenos seleccionados esta contribuyendo al resultado del diagnostico o es la base de un resultado del diagnostico. Por ejemplo, en algunas realizaciones de las tiras reactivas de flujo lateral, en una o mas subzonas de antfgeno se aplican los antfgenos, en las que ninguna autoinmunorreactividad es indicativa de la enfermedad, mientras que en las subzonas en las que se han aplicado antfgenos que desencadenan una menor reactividad autoanticuerpo en pacientes con glaucoma que en los individuos sanos, y/o con antfgenos que desencadenan una mayor reactividad autoanticuerpo en pacientes con glaucoma que en los individuos sanos y/o con antfgenos, en las que ninguna autoinmunorreactividad es indicativa de la ausencia de glaucoma, y variaciones favorables de las combinaciones anteriores.

En una realizacion preferida adicional del metodo de diagnostico para el glaucoma, el elemento portador del antfgeno para la en la al menos una muestra de antfgenos es un chip microfluido o un dispositivo labochip, en el que los antfgenos individuales se proporcionan preferentemente en microcanales individuales. El lfquido corporal se carga en el chip microfluido, o es recibido en una zona receptora de un lfquido del chip. Posteriormente, el lfquido corporal se mueve hacia el sistema de microcanales del chip microfluido, por ejemplo, mediante una unidad de control de la presion. En las realizaciones preferidas, las reactividades autoinmunes son detectadas con anticuerpos secundarios etiquetados con fluorescencia y unos lectores opticos convencionales u ordenadores convencionales equipados con una camara, y posteriormente son cuantificados y transformados en una puntuacion de glaucoma, segun se describe. Las caractensticas mencionadas de otros elementos portadores del antfgeno, tales como chips con micromatriz y tiras reactivas de flujo lateral, pueden combinarse con las caractensticas de los chips microfluidos para realizaciones adicionales de los elementos portadores del antfgeno para los metodos y los dispositivos descritos en esta solicitud. Esto incluye chips microfluidos con subzonas para los antfgenos con una mayor, y otras subzonas para los antfgenos con una menor, reactividad autoinmune en los pacientes con glaucoma con respecto a los individuos sanos.

Tambien se divulgan kits de prueba para el metodo de diagnostico para el glaucoma y componentes de los kits de prueba que comprende un elemento que porta un en la al menos una muestra de muestras de antigenos oculares y opcionalmente material auxiliar. En algunas realizaciones segun este aspecto, dicho kit comprende elementos portadores del antigeno que portan diferentes variaciones de una en la al menos una muestra de muestras de antigenos oculares, dependiendo del proposito de la prueba de diagnostico. En algunas realizaciones preferidas del kit, el elemento portador del antigeno comprende antigenos oculares seleccionados entre el Grupo 1 o el Grupo 2 o el Grupo A o el Grupo A y el B o el Grupo 2-A, en los que, en algunas de estas realizaciones preferidas, las cantidades de antfgenos cargadas en el elemento portador del antfgeno esta ponderada. En algunas realizaciones preferidas del kit el elemento portador del antigeno, es o es parte de un portaobjetos de micromatriz, de una tira reactiva de flujo lateral o de un chip microfluido. En algunas formas de realizacion adicionales de dichos kits de prueba se incluyen materiales auxiliares tales como herramientas analfticas y o un programa informatico para herramientas analfticas tales como un lector de imagenes, y o se incluye un programa informatico para que un lector de imagenes produzca un resultado digitalizado de los resultados de la prueba del resultado de la prueba, en los que este programa informatico se usa para una o mas de las etapas de cuantificacion de la reactividad autoinmune medida, el calculo de la puntuacion de glaucoma o el resultado del diagnostico. En algunas realizaciones preferidas adicionales, se incluye el material auxiliar para recoger una muestra de ftquido corporal. Dicho material auxiliar es, por ejemplo, papel secante para recibir las lagrimas. Algunas realizaciones preferidas adicionales incluyen reactivos y/o recipientes de reaccion para la deteccion y la medicion de la reactividad autoinmune despues de la incubacion del elemento portador del antfgeno con un ftquido corporal o reactivos para el tratamiento de una muestra de un ftquido corporal antes de la incubacion con el elemento portador del antfgeno o para la elucion del ftquido corporal desde un material adsorbente sobre el que se recogio. Cualquier combinacion de las caractensticas descritas anteriormente en el contexto de los metodos para el diagnostico del glaucoma puede combinarse para algunas realizaciones preferidas adicionales de los kits para llevar a cabo el metodo para el diagnostico del glaucoma.

En algunas realizaciones preferidas adicionales del metodo de diagnostico para el glaucoma, en primer lugar se seca un especimen de ftquido corporal y despues se resolubiliza o se eluye antes de la reaccion con el en la al menos una muestra de muestras de antfgenos oculares. El especimen de ftquido corporal se recoge bien en un entorno profesional o bien en un entorno domestico. En algunas variantes, se recoge en un trozo de material adsorbente tal como una tira de papel o directamente en la zona receptora del elemento portador del antfgeno o en cualquier recipiente para la recepcion del ftquido corporal. El especimen de ftquido corporal se deja secar y se conserva, por ejemplo, a la temperatura ambiente. La experiencia demuestra que despues de su conservacion durante hasta una semana o incluso mas, particularmente a una temperatura menor o si se congela, los autoanticuerpos presentes en el especimen seco de ftquido corporal pueden ser reconstituidos y elrndos desde el material adsorbente, por ejemplo, con un tampon o una solucion salina fisiologica. Por lo tanto, es una ventaja de esta realizacion que el especimen recogido de ftquido corporal puede ser recogido, por ejemplo, por la propia paciente en casa y enviado por correo a un laboratorio para su analisis. En algunas realizaciones preferidas adicionales del metodo de diagnostico para el glaucoma, el ftquido corporal, que se seca y se reconstituye antes de su analisis, es lagrimas o suero sangumeo.

En las realizaciones preferidas del metodo de diagnostico para la medicion la reactividad autoinmune del glaucoma en lagrimas, las lagrimas se recogen con cualquier metodo convencional tal como con pipetas o con una tira de papel secante tal como una tira de papel Schirmer u otro material adsorbente adecuado. Opcionalmente, las lagrimas se secan y se conservan, por ejemplo, a la temperatura ambiente durante hasta una semana o mas a 0-5 °C o mas cuando se congelan. Posteriormente, los autoanticuerpos son elrndos a partir de la tira de papel seca o todavfa humeda con tampon, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato. En algunas realizaciones preferidas adicionales, las lagrimas se recogen directamente en una tira reactiva de flujo lateral, por ejemplo, mediante la exposicion de la zona receptora de la tira reactiva a las lagrimas del ojo. Obviamente, una ventaja de las realizaciones que usan lagrimas en lugar de, por ejemplo, suero sangumeo, es que las muestras de lagrimas pueden obtenerse de una forma no invasiva. Esta es una ventaja en particular para los entornos en los que no hay profesionales medicos apropiadamente capacitados disponibles, tal como en algunas cftnicas oftalmologicas y optometristas, asf como para las pruebas domesticas.

El metodo de diagnostico para el glaucoma se refiere a su uso como una prueba rapida en un cribado rutinario para la deteccion temprana del glaucoma antes de la perdida de vision. Algunas realizaciones preferidas son, por ejemplo, pruebas de diagnostico de bajo coste disenadas para que sean muy sensibles, de forma que en un cribado rutinario se minimice la probabilidad de falsos negativos. Consecuentemente, despues de un seguimiento, unas pruebas mas elaboradas se basan, por ejemplo, en un gran numero de antfgenos oculares y estan disenadas para identificar falsos positivos entre aquellos individuos con un resultado positivo en la prueba de la prueba rapida. Por ejemplo, podna usarse una tira reactiva de flujo lateral, un chip microfluido o un simple chip con micromatriz, segun se describe en varias de las realizaciones anteriores, para dicha prueba rapida

El metodo de diagnostico para el glaucoma se refiere a su aplicacion para la monitorizacion de la progresion de la enfermedad y para la monitorizacion del efecto del tratamiento medico. En las realizaciones preferidas de estos aspectos, la seleccion de los antfgenos y/o el factor de ponderacion asignado a los mismos estan disenados para monitorizar la reactividad autoinmune frente a los antfgenos caractensticos de una fase en particular de la enfermedad de glaucoma.

Se divulga un metodo de poner en contacto un paciente con una zona receptora de un elemento portador del antfgeno para la recoleccion de un Ifquido corporal del paciente, por ejemplo, de las lagrimas de los ojos del paciente: en las realizaciones preferidas, el paciente se pone en contacto con una zona receptora de un elemento portador del antigeno que comprende un material adsorbente en el que la propia zona receptora esta exenta del antigeno pero el lfquido corporal fluye hacia la zona portadora del antigeno. Por ejemplo, se toca una tira reactiva con una zona receptora que comprende papel adsorbente, como una tira reactiva de Schirmers con la zona receptora, con un ojo humano para recoger las lagrimas. Posteriormente, las lagrimas difunden en la zona del antfgeno, y por lo tanto estan comprometidas en la etapa b del metodo para el diagnostico de glaucoma.

El resultado del diagnostico obtenido mediante el metodo de diagnostico para el glaucoma en algunas realizaciones esta listo para ser comprendido por un paciente o en otras realizaciones, el resultado del diagnostico comprende uno o mas valores diagnosticos que van a ser interpretados por un profesional medico.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: aplicaciones replicadas de anti-IgG/A/M humana generadas mediante la impresion por contacto (A) y la tecnica de aplicacion con una base piezoelectrica (B).

Figura 2A: coeficientes de variabilidad (CV) detallados para los antfgenos oculares en las micromatrices de estudio.

Figura 2 B: desviaciones tfpicas (DT) detalladas para los diferentes antfgenos en las micromatrices de estudio. Figura 3: Comparacion de los datos obtenidos a partir del tratamiento de los diferentes datos de cuatro antfgenos diferentes. Se indican: los datos en bruto (A), los datos del AUC (B) y los datos de la puntuacion Z (C).

Figura 4: perfiles de las intensidades promediadas de los antfgenos para 20 antfgenos incubados con suero (A) y con humor acuoso (B) de los individuos de control (CTRL) y de pacientes con un glaucoma primario de angulo abierto (POAG).

Figura 5: diagrama de cajas para los anti IgG/A/M humanas de los individuos sanos de control (CTRL) y de los pacientes con glaucoma (POAG)

Figura 6: 6 A,B: diagramas de dispersion de las reactividades de los anticuerpos en suero y en humor acuoso.

6 C: caractensticas operativas del receptor para las muestras de suero prospectivas.

Figura 7: comparacion intraindividual de los valores de la inmunorreactividad en suero y en humor acuoso para el grupo de control y las muestras de los POAG.

Figura 8: los analisis de las funciones biologicas mediante anotaciones de la GO revelaron varios terminos sobrerrepresentados mediante el calculo a traves del modelo hipergeometrico para los antfgenos oculares que mostraban unas diferencias significativas entre los grupos del estudio en muestras de suero.

Figura 9: patron tfpico de anticuerpos de un paciente con glaucoma.

Figura 10: reproducibilidad de una semana a otra de los datos de la micromatriz

Descripcion detallada de la invencion

Ejemplo 1: micromatrices de antfgenos que comparan la autoinmunorreactividad en sueros y en humor acuoso, con unas diferencias caractensticas en los pacientes con glaucoma y en los individuos sanos:

Para el analisis de los anticuerpos se usaron los sueros y el humor acuoso de pacientes con un glaucoma primario de angulo abierto (POAG; n = 13) y de controles sanos (CTRL; n = 13). Las matrices de protema se prepararon mediante la aplicacion de 40-100 antfgenos purificados diferentes (biomarcadores conocidos) en portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa. Las matrices se incubaron con los sueros (1:250) y con el humor acuoso (1:20) respectivamente. Para la visualizacion de las matrices con las reacciones anticuerpo-antfgeno se trataron con un anticuerpo anti-IgG humana con una etiqueta de fluorescencia, seguido de un escaneo de la fluorescencia. Las senales emitidas por los anticuerpos secundarios se digitalizaron, y las intensidades de las aplicaciones se compararon mediante el uso de tecnicas estadfsticas multivariantes.

Resultados: la comparacion intraindividual revelo congruencias, pero tambien diferencias, entre los patrones de anticuerpos de los sueros y del humor acuoso. En ambos, el humor acuoso y el suero, los pacientes con POAG mostraron un aumento en las reactividades mayor de dos veces para la a-1-antitripsina y la anexina V en comparacion con los sujetos sanos (P < 0,001). Por el contrario, la p-L-cristalina mostro una reactividad media significativamente aumentada (ME) en el humor acuoso (POAG: ME = 5049; DT = 1638; CTRL: ME = 2119; DT = 673; P < 0,01) y una reactividad disminuida en los sueros (P < 0,01) de los pacientes con POAG. Para siete antigenos, ninguno de los sujetos incluidos en el estudio mostro inmunorreactividad en el humor acuoso. Mediante el uso de un conjunto de biomarcadores, a menudo anticuerpos/antigenos de cada lfquido corporal respectivamente, fuimos capaces de diferenciar entre POAG y CTRL con una especificidad y una sensibilidad de aproximadamente el 90 % (curva ROC; suero: r = 0,91; humor acuoso: r = 0,93) usando un algoritmo especial. Estos resultados confirman tanto las regulaciones por aumento como las regulaciones por diminucion de las reactividades del anticuerpo en los sueros y en el humor acuoso de los pacientes con glaucoma. Ademas, el aumento en las reactividades en el humor acuoso con respecto al suero sugiere una produccion local de anticuerpos en el ojo.

Ejemplo 2: obtencion de los sueros y de las muestras de humor acuoso

La obtencion de las muestras se llevo a cabo segun la Declaracion de Helsinki de investigacion biomedica que implica sujetos humanos. Se recogio sangre y humor acuoso de todos los voluntarios que proporcionaron su consentimiento informado. Las muestras de sangre se centrifugaron a 1.000 g y el suero se conservo a -80 °C para su analisis posterior. Las muestras de humor acuoso se conservaron a -80 °C directamente despues de la recogida. Todos los participates fueron sometidos a un examen oftalmologico completo, incluyendo un aplanamiento de Goldmann, una tonometna, una tomograffa de coherencia optica (OCT) y una tomograffa de la retina de Heidelberg (HRT), en el Departamento de Oftalmologfa (Universidad de Mainz, Alemania) y se clasificaron segun las directrices de la European Glaucoma Society. En este estudio se incluyeron 31 pacientes, que experimentan una cirugfa de cataratas, con una edad media de 73 (DT ± 10) y 37 pacientes con glaucoma primario de angulo abierto (POAG; edad media: 67, DT ± 10). Los pacientes con cataratas sin ningun signo clmico de glaucoma primario o secundario ni de otras patologfas oculares distintas a las cataratas, sirvieron como grupo de control (CTRL) segun otros estudios 42. Los pacientes con POAG teman una PIO > 21 mm de Hg sin medicacion (determinada mediante la tonometna de aplanamiento de Goldmann), los defectos de campo visual ffpicos (examinados mediante una perimetna, OCTOPUS 101 Perimeter; Haag-Streit, Wedel, Alemania) y una excavacion del nervio optico. Los pacientes con enfermedades autoinmunes o que padecfan enfermedades neurologicas, como la enfermedad de Parkinson, fueron excluidos de este estudio.

Ejemplo 3: preparacion de las micromatrices

Usamos protemas muy purificadas adquiridas en Sigma-Aldrich (Alemania) y en BioMol (Hamburg, Alemania), como anffgenos. Los anffgenos se diluyeron a 1 pg/pl con tampon de PBS que contiene un 1,5 % de trehalosa para unas condiciones de impresion optimas. La aplicacion de los anffgenos se llevo a cabo tanto con una tecnologfa de impresion sin contacto (sciFLEXARRAYER S3, Scienion, Berlin, Alemania), basada en una dispensacion piezoelectrica, como con la tecnica de impresion por contacto basada en pines usada habitualmente (OmniGrid100, Digilab Genomic Solutions, Ann Arbor, Estados Unidos). Los resultados se evaluaron comparativamente para analizar la morfologfa de las aplicaciones y la variabilidad entre las aplicaciones. Para la impresion de la totalidad del conjunto de las micromatrices de estudio se uso la tecnica de aplicacion con una base piezoelectrica. Cada anffgeno se aplico por triplicado en portaobjetos de nitrocelulosa (Oncyte, portaobjetos de nitrocelulosa con 16 multi-almohadillas, Grace Bio-Labs, Bend, Estados Unidos). Como control positivo y negativo usamos anti IgG/A/M humanas de raton (10 pg/pl) y tampon de aplicacion. El proceso de aplicacion se llevo a cabo a la TA y con una humedad del 30 %. Se aplico 1 nl de cada dilucion del anffgeno en la superficie de la nitrocelulosa mediante cuatro aplicaciones de 250 pl exactamente en la misma posicion. La precision del volumen de aplicacion y el correcto posicionamiento de las gotitas fueron monitorizados antes y despues del proceso de aplicacion de cada anffgeno usando el programa informatico sciDrop-VOLUME y de autodeteccion de las gotas (Scienion, Berlin, Alemania).

Las etapas de incubacion y de lavado se llevaron a cabo a 4 °C con un agitador orbital (Titramax 100, Heidolph, Schwabach, Alemania). Los portaobjetos se cubrieron con camaras de hibridacion con marco FAST de 16 almohadillas (Whatmann, Maidstone, Reino Unido) y se bloquearon con PBS que contiene BSA al 4 % durante una hora. A continuacion, los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS que contiene Tween al 0,5 % (PBS-T). Los sueros de los pacientes se diluyeron a 1:250 en PBS, y el humor acuoso en una proporcion de 1:10 en PBS. Se incubaron aleatoriamente 120 pl de estas diluciones en portaobjetos con anffgeno preparados durante una noche. Despues de varias etapas de lavado con PBS-T, los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario marcado con Cy-5 fluorescente (a 1:500 diluido en PBS-T, anti-IgG humana de cabra, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Estados Unidos) durante una hora en la oscuridad. Dos etapas de lavado con PBS-T fueron seguidas por dos etapas finales de lavado con agua de calidad HPLC. Todas las micromatrices se secaron al aire antes del escaneo, usando un escaner de micromatrices (Affymetrix 428 TM Array Scanner, High Wycombe, Reino Unido). Las imagenes TIFF (Tagged Information File Format) generadas de 16-bit de los portaobjetos se analizaron usando el programa informatico Spotfinder 3.1.1 (TM4, Dana-Faber Cancer Institute, Boston, Estados Unidos). La sustraccion del fondo se llevo a cabo segun la formula: intensidad de la aplicacion = intensidad media SP - ((sumbkg -.sumtop5bkg) / (numero de pixeISP - numero de pixelstop5bkg)), en la que SP representa cualquier aplicacion, bkg el correspondiente fondo y top5bkg el cinco por ciento superior del pixel de fondo. El coeficiente de varianza (CV) se calculo como sigue: CV = SDSP3/mediaSPX...SPn, en la que SDSP3 representa la desviacion ffpica en la totalidad de las tres replicas de las aplicaciones de un anffgeno de una muestra, y la media SPX... SPn, la media de todas las intensidades de las aplicaciones.

Ejemplo 4: analisis estad^stico de los datos

Para proporcionar una comparacion distorsionada de los resultados causados por los sesgos a traves de la normalizacion y el tratamiento de los datos, en primer lugar contrastamos dos tipos diferentes de transformacion de datos - el area bajo la curva (AUC) y la puntuacion de Z - con los datos brutos. Para el analisis de los datos del estudio aplicamos la transformacion de la puntuacion de Z, segun la formula: puntuacion de Z = (intensidad SP - intensidad media SPI ...SPX) / SDSPX...SPn, en la que SP representa la intensidad de cualquier aplicacion y SP1...SPX la intensidad global de todas las aplicaciones 46. La deteccion de los potenciales biomarcadores y la estimacion de los cambios significativos en la reactividad del anticuerpo se lleva a cabo mediante diversas tecnicas estadfsticas. Para la comparacion intergrupo usamos un ANOVA monofactorial y un analisis multivariante de la discriminancia (por ejemplo, distancias de Mahalanobis, rafces canonicas) para ambos materiales de la muestra por separado. En la segunda etapa, llevamos a cabo redes neurales artificiales (ANN) para la determinacion de la potencia de clasificacion de los patrones del autoanticuerpo de un conjunto espedfico de antigenos. Por lo tanto, los conjuntos de datos se dividieron aleatoriamente en dos partes con unas cantidades uniformes de pacientes por grupo. Una mitad se uso para el entrenamiento de las ANN y la segunda mitad para probar las ANN entrenadas con respecto a su potencia de clasificacion. Por lo tanto, no se uso ninguna muestra incluida en los datos de entrenamiento para propositos de clasificacion. Los resultados se visualizaron mediante la representacion grafica de la sensibilidad frente a la especificidad (curva ROC). Una descripcion detallada de los metodos aplicados para el analisis estadfstico podna encontrarse en publicaciones previas de nuestro grupo. Para la comparacion intraindividual, y con objeto de ejemplificar la proporcion de niveles de anticuerpos en el humor acuoso con respecto a las correspondientes muestras de sueros, calculamos la diferencia porcentual entre ambas sobre la base de los valores del suero para cada paciente individual, seguido del calculo del valor medio para todos los sujetos de los diferentes grupos de pacientes. Las diferencias entre los sueros y el humor acuoso mayores del 100 % se consideraban significativas. Adicionalmente, correlacionamos los datos medidos con todos los registros clmicos recogidos. Los analisis estadfsticos se llevaron a cabo usando Statistics 8.0 (StatSoft, Tulsa, AZ, Estados Unidos).

Ejemplo 5: analisis de la GO

Con objeto de obtener una percepcion mas profunda de los procesos biologicos de los antfgenos con diferencias significativas entre los grupos de pacientes, usamos Cytoscape 2.6.2 junto con el plugin 50 de Bingo 2.3. Para asignar las anotaciones de ontologfa genica (GO) a cada antfgeno, se utilizo la totalidad de la base de datos de anotaciones de la GO y como organismo/anotacion se eligio Homo sapiens. El modelo hipergeometrico y la correccion de Benjamini & Hochberg False Discovery Rate (P < 0,05) aseguro una significacion de las funciones proteicas sobrerrepresentadas.

Ejemplo 6: esquema de un ejemplo de metodo para la determinacion de las puntuaciones de glaucoma

En una primera etapa para la determinacion de las puntuaciones de glaucoma, se calcula la diferencia porcentual entre los valores normalizados de la intensidad de las reactividades autoanticuerpo de las muestras de prueba y de una muestra de referencia. Estas diferencias porcentuales se usan como entrada de datos para el analisis de la red neural para la determinacion de una puntuacion de glaucoma. Dependiendo de la sensibilidad y de la especificidad requeridas en el metodo para el diagnostico del glaucoma, los sueros de la etapa b) se han incubado con una de las tres opciones de ejemplos de muestras: 1) o 2) o 3) que fueron proporcionadas segun la etapa a) del metodo de diagnostico:

la muestra 1) comprende la totalidad de los 48 antfgenos oculares purificados al menos parcialmente del Grupo 1, la muestra 2) y la muestra 3) comprenden 12 y 5 antfgenos oculares purificados al menos parcialmente, respectivamente.

Como se esperaba, cuanto mayor es el numero de antfgenos oculares comprendido por la muestra segun la etapa a), mejor es el metodo de diagnostico con respecto a la sensibilidad y a la especificidad. En la muestra 3), unicamente con 5 antfgenos oculares, todavfa se obtuvo una sensibilidad y una especificidad de aproximadamente el 90 %.

Adicionalmente, a los antfgenos individuales comprendidos en las muestras 1, 2 y 3 se les asignaron diferentes factores de ponderacion para el calculo de la puntuacion de glaucoma, de forma que los antfgenos muy ponderados (por ejemplo, los antfgenos del grupo A) tengan un mayor impacto sobre la puntuacion de glaucoma.

Las puntuaciones de glaucoma que difieren de un valor de referencia definido - por ejemplo, que exceden un valor umbral definido - identifican aquellas muestras de prueba en las que el lfquido corporal se recogio de un paciente con glaucoma.

Valores de la intensidad normalizados a partir de las reactividades autoanticuerpo

Calculo de la diferencia porcentual en los valores de la intensidad de los valores de referencia mediante la formula:

(valor de la intensidad paciente ■ valor de la intensidad referenda) * 100

% de diferencia

| valor de la intensidad referenda |

Puntuacion de glaucoma

Evaluacion de una puntuacion de glaucoma usando un algoritmo de red neural con las diferencias porcentuales calculadas como entrada de datos:

1) Puntuacion basada en todos los antigenos probados

Sensibilidad: 96 %

Especificidad: 97 %

2) Puntuacion basada en un subconjunto de 12 antigenos probados que incluyen:

MBP, GST, HSP27, inhibidor de la cinasa de protema C, GFAP, Jo-1, ubiquitina, actina, beta-S cristalina, HSP70, dismutasa de superoxido, transtiretina

Sensibilidad: 92 %

Especificidad: 94 %

3) Puntuacion basada en un subconjunto de 5 antigenos probados que incluyen:

HSP70, actina, beta-S cristalina, HSP27, GFAP

Sensibilidad: 91 %

Especificidad: 88 %

Segun su impacto sobre el diagnostico del glaucoma, y teniendo en consideracion los datos del analisis estadistico, tales como la prueba post-hoc o el analisis de la discrim inancia, los antigenos se subdividen en tres grupos diferentes con diferentes ponderaciones para el calculo de la puntuacion de glaucoma. Los antigenos que muestran una diferencia muy importante entre los grupos son asignados al grupo A, los antigenos con una diferencia importante son asignados al grupo B y los antigenos con una diferencia notable entre los grupos son asignados al grupo C:

Grupo A (muy altamente relevantes):

actina, alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A cristalina, alfa-B cristalina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma cristalina, a-fodrina (= espectrina), protema acida fibrilar glial GFAP, glutation-S-transferasa, HSP27, HSP60, HSP70, Jo-1, protema de union a la mielina MBP, enolasa especifica de neurona NSE, inhibidor de la cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, transferrina, transtiretina, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vimentina

Grupo B (muy relevantes):

anexina l-IV, receptor adrenergico beta 2, calreticulina, protema de choque termico HSP10, insulina, dismutasa de superoxido, cinasa de protema C, alfa-sinuclema, gamma-sinuclema

Grupo C (antigenos relevantes):

albumina, factor neurotrofico derivado del cerebro BDNF, cardiolipina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, lisozima, glicoprotema de mielina de oligodendrocitos MOG, mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5,3-fosfoserina, tireoglobulina, inhibidor de la topoisomerasa

Los antigenos que revelan una relevancia muy alta para el d iagnostico del glaucoma tienen una ponderacion mayor que los antigenos del grupo B o C, lo que da como resultado un mayor impacto sobre la puntuacion de glaucoma. Los antigenos con una relevancia alta tienen una ponderacion mayor que los antigenos del grupo C, lo que da como resultado un impacto medio sobre la puntuacion de glaucoma. Los antigenos relevantes tienen el impacto mas pequeno sobre la puntuacion de glaucoma evaluada.

Los sujetos que superan un umbral definido son diagnosticados como pacientes con glaucoma

Figura 1: se muestran tres replicas de aplicaciones de anti-IgG/A/M humanas generadas mediante una impresion por contacto (A) y la tecnica de aplicacion con base piezoelectrica (B). Las cifras representan las respectivas intensidades medias de pixel por aplicacion. A: la intensidad media para todas las aplicaciones es de 7.173,32 /- 1.473,27 unidades. El coeficiente de variabilidad (CV) es de 0,21. B: La intensidad media es de 11.716 /- 374,78 unidades. El CV es de 0,03.

Se compararon dos tecnologfas de aplicacion diferentes con objeto de encontrar la mejor metodologfa para la aplicacion espedfica de protemas con diferentes caractensticas ffsicas de una forma reproducible. Un metodo usado habitualmente para describir la variacion en las intensidades de las aplicaciones entre todas las replicas de aplicaciones es la determinacion del coeficiente de varianza 45. Mediante el uso de la tecnologfa de impresion por contacto basada en pines, conseguimos un CV mediano de 0,32 en tres replicas de aplicaciones tecnicas para todos los antigenos. La morfologfa y la intensidad de la aplicacion vana entre las replicas de las aplicaciones, segun se muestra en la figura 1 A. Por el contrario, las micromatrices con las aplicaciones realizadas mediante la tecnica de aplicacion sin contacto con base piezoelectrica mostraron una variabilidad mas de 10 veces menor entre las aplicaciones (CV mediano = 0,029) y una constancia mucho mejor en la morfologfa de la aplicacion (figura 1 B). Estos hallazgos son coherentes con los datos obtenidos a partir del programa informatico sciDrop-VOLUME y de autodeteccion de las gotas. El programa informatico detecto una variacion en el volumen de la gota unicamente del 0,8 % (equivalente a 2 pl de una gotita de 250 pl) en todos los antfgenos. Consecuentemente, se eligio la tecnologfa de impresion sin contacto para la impresion de la totalidad del conjunto de los portaobjetos de micromatriz del estudio, con el fin de garantizar la aplicacion de unos volumenes exactamente iguales de las soluciones del antfgeno. De una forma similar a la estimacion del CV para la validacion de las tecnologfas de aplicacion, calculamos el coeficiente mediano de la varianza para las replicas de aplicaciones tecnicas de las micromatrices del estudio. Estas micromatrices mostraron un CV mediano de 0,031 con una desviacion tfpica de 0,061 (para la distribucion de los CV de los antfgenos individuales, vease la figura 2.A), mientras que la desviacion tfpica mediana de las intensidades medidas con las replicas de aplicaciones en todas las muestras vana entre 44 y 480, dependiendo del antfgeno y de sus intensidades medias de aplicacion (vease la figura 2.B).

Figura 2 A y Figura 2 B: la Fig. 2A representa los coeficientes de variabilidad (CV) de los datos en bruto, detallados para cada antfgeno de las micromatrices del estudio. El eje x representa los diferentes antfgenos, y el eje y los valores del CV. El CV mediano en todos los antfgenos es de 0,031 /- 0,061. La Fig. 2B muestra las desviaciones tfpicas (DT) de los datos en bruto, detalladas para los diferentes antfgenos de las micromatrices del estudio. El eje x representa los diferentes antfgenos, y el eje y los valores de las desviaciones tfpicas (DT).

Para la caracterizacion de los anticuerpos de los pacientes del estudio y de los individuos de prueba, la comparacion del diferente algoritmo de normalizacion de datos revela que la transformacion de la puntuacion de Z es mas aplicable a nuestra metodologfa debido a su bajo sesgo sobre las proporciones entre los grupos del estudio (figura 3) y la posibilidad de comparar las mediciones de una forma cuantitativa en todos los diferentes experimentos y pruebas de glaucoma.

Figura 3: comparacion de los datos obtenidos a partir de diferentes tratamientos de datos para cuatro antfgenos diferentes. Se indican: los datos en bruto (A), los datos del AUC (B) y los datos de la puntuacion Z (C).

Pudimos detectar complejos patrones de reactividad de anticuerpo en todos los pacientes del estudio, y multiples diferencias entre los pacientes con glaucoma y los sujetos de control, tanto en los sueros como en el humor acuoso (Fig. 4 A y B). No encontramos ninguna correlacion entre el nivel de IgG/A/M y la edad o el genero de los pacientes, y no hallamos diferencias significativas en los niveles de IgG/A/M de los grupos del estudio, ni en los sueros (P > 0,9, Fig. 5 A) ni en el humor acuoso (P > 0,6, Fig. 5 B).

Figura 4: perfiles de las intensidades medias de anticuerpo para el suero (A) y el humor acuoso (B). Se muestran las intensidades medias de los sujetos de control (CTRL) y de los pacientes con glaucoma primario de angulo abierto (POAG), para 20 antfgenos. El patron de lmea representa los grupos de pacientes (rojo = POAG, azul = CTRL), el eje X representa un subconjunto de 20 anticuerpos que mostro las diferencias mas importantes entre los grupos, y el eje Y representa el valor de las puntuaciones de Z computadas.

Figura 5: se muestran los valores determinados para las anti-IgG/A/M humanas en forma de un grafico de cajas. El eje X representa los diferentes grupos (grupo de control (CON); grupo con glaucoma (POAG)) y el eje y las intensidades medidas y normalizadas (puntuacion de Z). No pudo detectarse ninguna diferencia significativa entre ambos grupos (P > 0,05) ni en los sueros (5A) ni en el humor acuoso (5B).

En los sueros, los pacientes con POAG mostraron varias inmunorreactividades aumentadas en comparacion con los sujetos de CTRL, pero revelaron algunas reactividades disminuidas tambien (Fig. 4A). Como se muestra, la HSP27, la HSP70, la protema basica de mielina (MBP) o la anexina V mostraron unas elevadas reactividades de anticuerpo en los pacientes con POAG en comparacion con el grupo de control. Para otros antfgenos, tales como la protema acida fibrilar glial (GFAP) o la ubiquitina, los pacientes con POAG mostraron unas reactividades mas bajas de anticuerpo que los sujetos sanos. Se encontraron unas intensidades infrecuentes o muy pequenas, incluso no detectables, para la mioglobina, la glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG) y la topoisomerasa de ADN 1. El ANOVA monofactorial y el analisis multivariante de la discriminancia no solo revelo una diferencia significativa entre las reactividades de anticuerpo totales en los sueros de los pacientes con POAG y de los controles sanos (P < 0,002), sino tambien una diferencia estadfsticamente significativa para varios antigenos individuales. Por ejemplo, los pacientes con POAG mostraron una actividad significativamente aumentada frente a la MBP (P < 0,0028), la HSP27 (P < 0,019), la HSP70 (P < 0,0033) o la a-fodrina (P < 0,0027) (tabla 3.). Observamos unas reactividades del anticuerpo significativamente disminuidas para la GFAP (P < 0,001), la ubiquitina (P < 0,0038) y la p-L-cristalina (P < 0,03).

En el contexto de una potencial utilizacion de las reactividades autoanticuerpo como una herramienta diagnostica para el glaucoma, probamos su potencia de clasificacion mediante la aplicacion de redes neurales artificiales (ANN). El entrenamiento de la red se llevo a cabo usando un subconjunto de pacientes (CTRL N = 18, POAG N = 17), y los datos de las nueve reactividades sericas anticuerpo-antfgeno mas significativas (14-3-3, alfa-1-antitripsina, beta-L-cristalina, GFAP, HSP 27, HSP 70, MBP, alfa-fodrina, ubiquitina). Posteriormente, la red entrenada se aplico a muestras de suero desconocidas. Los valores de salida de las ANN personalizados para cada paciente, que muestran la clasificacion del grupo a traves de las ANN, se usaron como una puntuacion combinada de anticuerpo (CTRL > 0,5, POAG < 0,5). Las puntuaciones de anticuerpo calculadas a partir de las muestras de los conjuntos de datos de entrenamiento con suero revelaron una fuerte correlacion positiva con las puntuaciones computadas a partir de las muestras de humor acuoso de los mismos pacientes (R < 0,74, P < 0,001, Fig. 6A). Tambien, para las muestras prospectivas (CTRL N = 13, POAG N = 20; datos de la prueba), no incluidas en el conjunto de datos de entrenamiento, detectamos una correlacion entre las puntuaciones de anticuerpo en el suero y en el humor acuoso (R < 0,72, P < 0,001, Fig. 6B). Mediante el uso de las puntuaciones de anticuerpo calculadas para la clasificacion de los pacientes, unicamente un sujeto (CTRL) fue incorrectamente clasificado como sujeto con POAG por la puntuacion de anticuerpo en el suero y en el humor acuoso (Fig. 6B). La fuerte correlacion positiva de las puntuaciones calculadas a partir de ambos tipos de muestras subraya las diferencias menores entre las inmunorreactividades del suero y del humor acuoso detectadas a traves de la comparacion intraindividual. La sensibilidad y la especificidad para una discriminacion prospectiva del glaucoma y de los sujetos de control era del 93 % (Fig. 6C; AUC r = 0,93).

Figura 6: A, B: diagramas de dispersion de las reactividades de anticuerpo en el suero y en el humor acuoso. El eje X muestra los valores de las puntuaciones de anticuerpo en suero, en el eje Y los valores de las muestras de humor acuoso. Cada punto representa un paciente individual (puntos azules = POAG, puntos rojos = CTRL). A: diagrama de dispersion de las muestras incluidas en el conjunto de datos de entrenamiento (R = 0,74), B: diagrama de dispersion de todas las muestras del estudio (R = 0,72). C: caractensticas operativas del receptor para las muestras de suero prospectivas (eje X: 1-especificidad, eje Y: sensibilidad, r = 0,93).

El analisis de las muestras de humor acuoso mostro asimismo numerosas diferencias entre los grupos de estudio (Fig. 4B). Pero, al contrario que las muestras de suero, unicamente aparecieron unas pocas reactividades disminuidas. La mayona de los antfgenos, como la MBP, la HSP70, la anexina V o la glutation-S-transferasa, revelo un aumento en las reactividades para el grupo con POAG, y numerosas de estas son acordes con las muestras de suero. Para otras, como la cadena B de la insulina o la MOG, pudieron detectarse unas reactividades de anticuerpo infrecuentes en el humor acuoso, y parcialmente estos son los mismos antfgenos que mostraron unas raras reactividades en suero (por ejemplo, la MOG o la topoisomerasa de ADN 1, tabla 3.) Tambien, el analisis estadfstico fortalece el aspecto de las similitudes entre ambos tipos de muestras. Los datos asf obtenidos mostraron, por ejemplo, un P < 0,022 para la MBP y un P < 0,03 para la anexina V en el humor acuoso - ambos antfgenos muestran tambien unos valores significativamente aumentados en los sueros de los pacientes con POAG. Coincidiendo con el menor numero de diferencias estadfsticas significativas univariantes entre los sujetos con POAG y los de CTRL, la potencia de clasificacion determinada de las muestras de humor acuoso era menor (curva ROC; AUC r = 0,7) que la de una de las muestras de suero.

Figura 7: comparacion intraindividual entre las inmunorreactividades del suero y del humor acuoso. Los antfgenos estan indicados en el eje X. El eje Y representa la puntuacion medida de los valores de Z. Las barras por encima de la lmea cero representan las mayores inmunorreactividades en el humor acuoso, las barras por debajo de la lmea cero representan las mayores intensidades en el suero. Se muestran los resultados para las muestras del grupo de control y de POAG. Globalmente puede observarse que unicamente unos pocos antfgenos muestran unas diferencias en las inmunorreactividades mayores del 100 % (= aumento 2 de veces).

La comparacion intraindividual de las inmunorreactividades de las muestras de suero con las de las correspondientes muestras de humor acuoso revelo unicamente unas pocas diferencias significativas. Con respecto a los sujetos de CTRL pudieron observarse unos niveles significativamente mayores de reactividades de anticuerpo en suero (por ejemplo, la MBP, la HSP60, la GFAP), en comparacion con las correspondientes muestras de humor acuoso, asf como unas inmunorreactividades significativamente mayores en el humor acuoso (por ejemplo, la a-1-antitripsina). Pero en su totalidad, mas del 80 % de los antfgenos probados revelo unas inmunorreactividades practicamente similares en los sueros y en el humor acuoso de los sujetos de control. Los pacientes con POAG tambien revelaron algunas diferencias significativas entre los sueros y el humor acuoso. Por ejemplo, la albumina y la a-1-antitripsina mostraron unas inmunorreactividades mayores en las muestras de suero, y en el ultimo caso esto es contrario a las muestras de control, que mostraron una mayor inmunorreactividad para la a-1-antitripsina en el humor acuoso. Las muestras del humor acuoso del grupo con glaucoma revelaron asimismo unas reactividades de anticuerpo un poco mayores en comparacion con las correspondientes muestras de suero (por ejemplo, fibronectina, transtiretina). Pero, al igual que con el grupo de control, unicamente aparecieron unas pocas diferencias significativas entre las inmunorreactividades del suero y las del humor acuoso en el grupo con glaucoma, y mas del 80 % de los antigenos probados revelo unos patrones de anticuerpo practicamente congruentes.

Figura 8: los analisis de las funciones biologicas mediante anotaciones de la GO revelaron numerosos terminos sobrerrepresentados. El calculo a traves del modelo hipergeometrico para los antfgenos mostro unas diferencias significativas entre los grupos del estudio en las muestras de suero. En el eje x se muestran las cantidades de protemas atribuidas a los diferentes grupos funcionales. Los grupos funcionales estan indicados en el eje y. Las barras azules representan los antfgenos con una mayor inmunorreactividad en los sujetos con POAG, las barras rojas representan los antfgenos con una menor inmunorreactividad en los pacientes con glaucoma. Los asteriscos marcan los grupos funcionales, que tambien podfan encontrarse en el humor acuoso.

De forma interesante, los terminos como respuesta al estres, citoesqueleto, trafico de vesmulas y apoptosis estan significativamente sobrerrepresentados (figura 8). Los terminos como citoesqueleto o trafico de vesmulas estan fuertemente relacionados con los procesos neurologicos, y otros como la respuesta al estres o la apoptosis deben ser considerados junto con las enfermedades neurodegenerativas.

Figura 9: A: patron tfpico de un autoanticuerpo de un paciente con glaucoma. Las protemas de las lagrimas se eluyeron a partir de una tira de Schirmer seca fig. mediante el uso de solucion salina tamponada con fosfato, seguido de la incubacion de la muestra en una micromatriz de protema. B) Curva caractenstica de la operativa del receptor (curva ROC). Se usaron los patrones de autoanticuerpo de lagrima de los pacientes con glaucoma y de los sujetos sanos para el entrenamiento de una red neural artificial con respecto al reconocimiento del patron de los pacientes con glaucoma. El eje y representa la sensibilidad, y el eje x la 1-especificidad. Mediante el uso de estos patrones de autoanticuerpo, pudo conseguirse una especificidad y una sensibilidad > 90 % (area bajo la curva: r = 0,93).

Figura 10: variabilidad de una semana a otra de los datos de la micromatriz. Se incubo un suero convencional durante siete semanas consecutivas, seguido del calculo de los coeficientes de la varianza (CV). Se representa el CV para diversos antfgenos diferentes (barras negras), incluyendo la desviacion tfpica.

Mediante el uso de la metodologfa de la micromatriz de protema pudimos confirmar diferencias en las reactividades de anticuerpo en los sueros y en el humor acuoso de los pacientes con glaucoma, como se sabe en la materia. Adicionalmente, averiguamos que numerosos antfgenos nuevos, tales la a-1-antitripsina o la anexina V, tienen un impacto en el glaucoma. En comparacion con los sujetos de control, detectamos unas inmunorreactividades significativamente aumentadas en los sueros y en el humor acuoso de los pacientes con POAG, asf como unas reactividades significativamente disminuidas en los sueros de los sujetos con glaucoma. Para numerosos antfgenos, por ejemplo, la anexina V, la chaperonina, la HSP27, la HSP60, la HSP70 o la MBP, pudimos observar los mismos tipos de diferencias entre los grupos de pacientes en las muestras de humor acuoso y de suero de los pacientes con glaucoma - lo que proporciona una primera pista sobre las similitudes entre ambos tipos de muestras. En general, las diferencias entre los sujetos de control y los pacientes con glaucoma paredan ser menores en las muestras de humor acuoso, en las que unicamente pudieron detectarse ocho diferencias significativas univariantes entre ambos grupos, en contraste con las once diferencias significativas en las muestras de suero. La comparacion intraindividual del humor acuoso y de los sueros revelo que unicamente unos pocos antfgenos, por ejemplo, la MBP, la GFAP o la a-1-antitripsina, mostraban unas inmunorreactividades significativamente diferentes entre ambos tipos de muestras de los sujetos de control. Tambien, en las muestras de los sujetos con glaucoma, pocos antfgenos, por ejemplo, la albumina o la transtiretina, mostraron unas diferencias estadfsticas significativas entre los patrones de inmunorreactividad de ambos lfquidos corporales. En comparacion con las muestras de suero, la transtiretina mostro una mayor reactividad autoanticuerpo en el humor acuoso de los pacientes con POAG, un resultado que es muy interesante, teniendo en consideracion al hecho de que unas mayores cantidades de la propia transtiretina podfan encontrarse en el humor acuoso de los pacientes con POAG. En su totalidad, mas del 80 % de las reactividades antfgeno-anticuerpo revelaron ser congruentes en ambos lfquidos, tanto en los sujetos sanos como en los pacientes con POAG. Este resultado indica que las inmunorreactividades en un lfquido ocular como el humor acuoso, que esta en estrecho contacto con la retina - el lugar de la patogenia del glaucoma -, no son mucho mas diferentes de las inmunorreactividades sistemicas en los sueros, en terminos de anticuerpos. Por lo tanto, este hallazgo subraya la especificidad de los cambios detectados en los patrones de anticuerpos del suero de los pacientes con glaucoma, y puede ser importante tambien para otras enfermedades oculares.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para el diagnostico del glaucoma que comprende las etapas de:

(a) proporcionar al menos dos muestras que comprenden al menos un antigeno ocular purificado al menos parcialmente, proporcionando as ^ conjuntamente al menos dos antigenos oculares purificados al menos parcialmente

0 proporcionar al menos una muestra que comprende al menos dos antigenos oculares purificados al menos parcialmente, en el que los al menos dos antigenos oculares purificados al menos parcialmente se seleccionan entre un Grupo 1 de antigenos oculares que comprende los siguientes antigenos oculares: actina, albumina, alfa-1 -antitripsina, anexina l-IV, anexina V, receptor adrenergico beta 2, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, alfa-A cristalina, alfa-B cristalina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma cristalina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, a-fodrina (= espectrina), protema acida fibrilar glial (GFAP), glutation-S-transferasa, protema de choque termico HSP10 (= chaperonina), HSP27, HSP60, HSP70, insulina, jo-1, lisozima, protema de union a la mielina (MBP), glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG), mioglobina, enolasa especifica de neurona (NSE), neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutasa de superoxido, 3-fosfoserina, prealbumina, inhibidor de la cinasa de protema C, cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, alfa-sinuclema, gamma-sinuclema, tireoglobulina, transferrina, transtiretina, inhibidor de la topoisomerasa, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vimentina,

(b) poner en contacto un lfquido corporal con la muestra o las muestras proporcionadas en la etapa a) que comprenden al menos dos antfgenos oculares purificados al menos parcialmente,

(c) detectar y/o cuantificar las reacciones de la etapa b) entre los autoanticuerpos del lfquido corporal y los al menos dos antfgenos oculares purificados parcialmente en la muestra o las muestras para la determinacion de un valor de la reactividad autoinmune,

(d) comparar los valores medidos de la reactividad autoinmune con los datos convencionales obtenidos a partir de pacientes con glaucoma y opcionalmente adicionalmente de individuos sanos, para la determinacion de una puntuacion de glaucoma y

(e) opcionalmente determinar un resultado del diagnostico mediante la evaluacion de la puntuacion de glaucoma.

2. El metodo para el diagnostico del glaucoma segun la reivindicacion 1, en el que en al menos una de las etapas a) -e) se asigna un factor de ponderacion que modela la contribucion al resultado del diagnostico de la reactividad autoinmune frente a al menos uno de los antfgenos oculares, en el que en particular, el al menos un factor de ponderacion es asignado a al menos una de las muestras de antfgeno ocular mediante un algoritmo aplicado durante al menos una de las etapas (c), (d), (e) u / o en el que se introduce al menos un factor de ponderacion en las cantidades ponderadas de los antfgenos individuales oculares proporcionados para la reaccion con el lfquido corporal o se pondera la cantidad de lfquido corporal proporcionada para la reaccion.

3. El metodo para el diagnostico del glaucoma segun la reivindicacion 1 o 2, en el que un antfgeno ocular parcialmente purificado comprende dicho antfgeno ocular en una cantidad de al menos el 70 % por peso de la protema total.

4. El metodo para el diagnostico del glaucoma segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que al menos 2 antfgenos oculares se seleccionan entre el Grupo A de antfgenos oculares: actina, alfa-1-antitripsina, anexina V, alfa-A cristalina, alfa-B cristalina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma cristalina, a-fodrina (= espectrina), protema acida fibrilar glial (GFAP), glutation-S-transferasa, HSP27, HSP60, HSP70, jo-1, protema de union a la mielina (MBP), enolasa especifica de neurona (NSE), inhibidor de la cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, transferrina, transtiretina, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), vimentina, o en el que la al menos una muestra de antfgenos oculares comprende al menos dos antfgenos seleccionados entre el Grupo A y/o entre el Grupo B que comprende los siguientes 9 antfgenos oculares adicionales: anexina l-IV, receptor adrenergico beta 2, calreticulina, protema de choque termico HSP10 (= chaperonina), insulina, dismutasa de peroxido, cinasa de protema C, alfa-sinuclema, gamma-sinuclema.

5. El metodo para el diagnostico del glaucoma segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que al menos una muestra comprende al menos 1 antfgeno ocular al menos parcialmente purificado de los siguientes antfgenos oculares del Grupo 2: albumina, anexina I-IV, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, beta-S cristalina, gamma cristalina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, insulina, jo-1, lisozima, glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutasa de superoxido, 3-fosfoserina, prealbumina, inhibidor de la cinasa de protema C, cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, alfa-sinuclema, tireoglobulina, transferrina, transtiretina, inhibidor de la topoisomerasa, ubiquitina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).

6. El metodo para el diagnostico del glaucoma segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que al menos una muestra de antfgenos oculares purificados al menos parcialmente comprende al menos 1 de los siguientes antfgenos oculares albumina, alfa-1-antitripsina, anexina l-IV, anexina V, factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), calreticulina, cardiolipina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma cristalina, topoisomerasa de ADN 1, fibronectina, protema de choque termico HSP10 (= chaperonina), insulina, jo-1, lisozima, glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG), mioglobina, neurotrofina 3, neurotrofina 4, neurotrofina 5, dismutasa de superoxido, 3 fosfoserina, prealbumina, inhibidor de la cinasa de protema C, cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, alfasinuclema, tireoglobulina, transferrina, inhibidor de la topoisomerasa, ubiquitina.

7. El metodo para el diagnostico del glaucoma segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que las al menos dos muestras de antfgenos oculares purificados al menos parcialmente comprenden al menos 1 de los siguientes antigenos oculares: alfa-1-antitripsina, anexina l-IV, anexina V, calreticulina, beta-L cristalina, beta-S cristalina, gamma cristalina, protema de choque termico HSP10 (= chaperonina), insulina, jo-1, mielina, dismutasa de superoxido, prealbumina, inhibidor de la cinasa de protema C, cinasa de protema C, dismutasa de superoxido, alfasinuclema, transferrina, transtiretina, ubiquitina.

8. El metodo segun una cualquiera de la reivindicacion 1 a 7, en el que la muestra o las muestras que comprenden al menos dos antfgenos oculares purificados parcialmente estan portadas sobre un elemento portador del antfgeno, y en particular en el que el lfquido corporal se hace reaccionar con los antfgenos en un chip con micromatriz, en una tira reactiva de flujo lateral, en un chip microfluido o en otro ensayo basado en fluidos o en microesferas.

9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que se portan menos de 10 antfgenos oculares sobre un elemento portador del antfgeno.

10. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el lfquido corporal son lagrimas, y / o en el que el lfquido corporal se recoge, se seca y opcionalmente se conserva, y posteriormente se reconstituye para su uso en la etapa b.