ES2712799T3 - Microscopio láser de barrido no lineal flexible para la detección tridimensional no invasiva - Google Patents

Abstract

Microscopio láser de barrido no lineal flexible para la detección tridimensional no invasiva, que contiene al menos una fuente de radiación que genera al menos un haz de excitación de radiación láser pulsada para la activación de una radiación secundaria emitida por átomos y moléculas, una óptica de transmisión flexible para la transmisión de la radiación a un cabezal de medición con una óptica de enfoque con la que se enfoca la radiación en un objeto de medición y se devuelve la radiación secundaria emitida y se dirige a al menos un sistema de detector, estando unido el cabezal de medición (4), de forma que se puede pivotar y girar libremente en el espacio y colocar de forma flexible, a la al menos una fuente de radiación (1; 71; 74), de tal manera que se puede realizar microscopía vertical, invertida así como microscopía en ángulos discrecionales del espacio, caracterizado por que - hay dispuesto al menos un espejo orientable (2), controlable para la desviación y alineación del al menos un haz de excitación (11; 12) de radiación láser pulsada de la al menos una fuente de radiación, de tal manera que se dirige el al menos un haz de excitación (11; 12) a través de la óptica de transmisión (13) al cabezal de medición (4) de modo que el al menos un haz de excitación (11; 12) está dispuesto en cualquier posición del cabezal de medición (4) de forma concéntrica con respecto a un elemento óptico de apertura limitada del cabezal de medición (44), - hay dispuesto un divisor de haz (42) para el desacoplamiento de una parte pequeña del al menos un haz de excitación (11; 12) en el cabezal de medición (4) delante de la óptica de enfoque (44) para generar un haz de ensayo (43), - hay dispuesto un fotodiodo (5) en un plano conjugado con el plano diana (41) en el haz de ensayo (43), correspondiéndose una alineación media del haz de ensayo (43) en el fotodiodo (5) con la alineación normal del haz de excitación (11, 12) en el plano diana y - mediante desviación del haz de excitación en direcciones X e Y sucesivamente se generan en cada caso componentes de señal X e Y (52, 53) dependientes de la posición, correspondiéndose el respectivo máximo (521, 531) de las componentes de señal X e Y dependientes de la posición con la alineación media del haz de ensayo (43) en el fotodiodo (5) y - está presente una unidad de control (6) para el control del espejo orientable controlable (2) que, con ayuda de las componentes de señal X e Y dependientes de la posición, alinea el espejo orientable controlable de tal manera que el haz de ensayo es dirigido de forma central sobre el fotodiodo, de tal manera que se consigue una estabilización de dirección del al menos un haz de excitación independientemente de la magnitud de la alteración debida a la posición de la óptica de transmisión (3).

Description

DESCRIPCION

Microscopio laser de barrido no lineal flexible para la deteccion tridimensional no invasiva

La invencion se refiere a un microscopio laser de barrido no lineal para la deteccion tridimensional no invasiva flexible, en particular en materia animada (in vivo), preferentemente en la piel de animales, en plantas y en cultivos celulares, as! como en materia inanimada, tal como por ejemplo minerales, materiales textiles y obras de arte. Por un microscopio laser de barrido no lineal o microscopio de excitacion multifotonica (MP) se ha de entender en lo sucesivo siempre un microscopio con excitacion de dos o mas fotones.

Se conocen microscopios de dos fotones y tomografos multifotonicos (MPT), en los que se excitan senales de fluorescencia y SHG (generacion de segundo armonico, Second Harmonic Generation) en moleculas biologicas in vivo mediante radiacion laser pulsada en el intervalo infrarrojo cercano y se detectan mediante receptores altamente sensibles y rapidos adecuados (por ejemplo, documentos US 50346 l3 A, DE 201 17294 U1; DE 20306 122 U1). Ademas se pueden representar componentes no fluorescentes y sin actividad de SHG, tales como agua y llpidos, mediante microscopios CARS y tomografos CARS (CARS - Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, Dispersion Raman Anti-Stokes Coherente) (vease, por ejemplo, el documento DE 10 2010 047 578 A1 no publicado previamente).

Con estos tomografos y microscopios opticos no lineales se consiguen resoluciones horizontales en el intervalo submicrometrico y areas de barrido (areas de objeto) de algunos cientos de micrometres en tres dimensiones. Tales tomografos y microscopios no lineales se basan en el uso de estructuras rlgidas y disposiciones de mesa opticas con amortiguacion de vibraciones. Se pueden hacer funcionar como disposiciones de microscopio optico vertical o invertido. Sin embargo, no se conoce ningun sistema de formacion de imagenes de alta resolucion (con resolution lateral alrededor de 1 pm y por debajo) para la tomografla o microscopla no lineal, que con la resolucion lateral y axial requerida en el intervalo submicrometrico permita una colocation libre del cabezal de medicion.

Una transmision de haz requerida para ello se puede realizar mediante sistemas de fibra optica o como sistema de transmision de haz libre. La precision de sistemas de transmision de laser de haz libre, tal como se conocen por ejemplo en forma de brazos articulados de espejo, se ve influida por desviaciones mecanicas, tensiones mecanicas y variation de temperatura dentro de la estructura de jaula mecanica de estos brazos. La influencia sobre el eje mecanico del brazo articulado de espejo (por ejemplo, por variacion de la temperatura) conduce, con diferentes constelaciones del brazo articulado, a una desviacion de la position de la radiacion laser en la salida del brazo articulado con respecto a la posicion diana o eje mecanico, de tal manera que un barrido fiable de un objeto de medicion mediante optica de enfoque de alta resolucion con diferentes alineaciones del cabezal de medicion es posible solo de manera limitada. Las variaciones de la posicion de la radiacion laser en la salida del brazo articulado optico se pueden resumir con la expresion “precision del sistema de transmision”.

Ademas, la precision de la transmision del haz laserico se ve influida por la longitud dada de la trayectoria del haz optico de un brazo articulado y la estabilidad de la posicion del haz (ingles pointing stability, estabilidad de punterla) del laser.

En este caso se ha de denominar estabilidad de punterla el cambio de la estabilidad de direction de la radiacion laser en la salida directa del laser, que resulta por la influencia de causa termica de la configuration de resonador del laser.

El acoplamiento de la radiacion laser en un brazo articulado de espejo es particularmente crltico. Se da un acoplamiento optimo cuando el eje optico de la radiacion laser coincide con el eje (de entrada) mecanico del brazo articulado (colinealidad). Las desviaciones que aparecen en este caso influyen en la precision ademas de las desviaciones de causa mecanica y termica que se han mencionado anteriormente del propio brazo articulado.

En el caso del uso de opticas de transmision de fibra se reducen las desviaciones que se deben compensar en la conduction del haz ciertamente en exclusiva al acoplamiento y desacoplamiento del haz, sin embargo, sigue existiendo el problema fundamental de la desviacion indeseada del haz laserico en el lugar diana. En particular, tambien existe el riesgo de un acoplamiento indeseado en la cubierta de fibra (“cladding", recubrimiento).

Por el documento US 5.463.215 A se conoce un dispositivo para la alineacion de un haz de luz con el fin de su acoplamiento en una fibra optica, en el que una parte del haz laserico que no se acopla en el diametro de fibra se desacopla a traves de dos espejos conicos anulares, que estan dispuestos como retrorreflectores, as! como un espejo que rota con 45° sobre un anillo, a un equipo de detector. Mediante sincronizacion del detector con la posicion del espejo giratorio se puede detectar entonces una desviacion de la colinealidad del eje de laser y de fibra as! como un desenfoque. Ademas se requiere una iluminacion cubriente de la entrada de fibra (es decir, diametro de haz mayor que diametro de fibra) y, por tanto, es inevitable ya desde el principio una perdida de intensidad.

Por el documento DE 202010009249 U1 se conoce una disposition para la formacion de imagenes de MPT que, a traves de un brazo articulado optico flexible, garantiza una libre colocacion en el espacio de un cabezal de medicion, conteniendo el cabezal de medicion la optica para la guia del haz y la deteccion de fotones. Mediante un ajuste activo de haz con control en linea se debe poder conseguir una calidad optima de la imagen en cualquier posicion del cabezal de medicion. Acerca del tipo y la forma del ajuste del haz, no obstante, no se realiza ningun tipo de indicacion, de tal manera que no esta disponible un sistema de medicion automatica para la estabilizacion del haz. Por tanto, por el estado de la tecnica se desprenden las siguientes desventajas:

- para la implementacion de un microscopio flexible, la estabilizacion del haz debido a las tolerancias mecanicas de los sistemas de guia de haz es demasiado grande para garantizar la suficiente constancia de la iluminacion de un punto de medicion para la irradiacion reproducible del area de barrido para una resolucion submicrometrica mediante observation visual y reajuste en linea y

- en la microscopia multifotonica, la limitation de la formation de imagenes a la deteccion de la autofluorescencia de sustancias del propio cuerpo y la multiplication de frecuencia no lineal de determinadas moleculas no es suficiente, habiendose podido realizar la combination deseable con sistemas CARS debido a las altas exigencias a la colinealidad hasta la fecha solo en sistemas rigidos.

Por tanto, la invention se basa en el objetivo de hallar una realization para microscopio laser de barrido no lineal, que se pueda utilizar de forma flexible, movil, para la deteccion tridimensional no invasiva para examenes no lineales de alta resolucion multivalentes, en particular de piel, tejidos en la region urogenital, en la cavidad oral y en la zona ocular del cuerpo humano, pero tambien en plantas, animales, en cultivos celulares y en materia inanimada, que permita una iluminacion reproducible automatica de la optica de enfoque con flexibilidad ilimitada del cabezal de medicion. Como un planteamiento de objetivos ampliado se debe poder realizar una aplicacion simultanea coincidente reproducible de dos trayectorias de haz con el fin de la combinacion de diferentes procedimientos de medicion, preferentemente de tomografia MP y CARS, en un cabezal de medicion flexible comun.

De acuerdo con la invencion se resuelve el objetivo mediante un microscopio laser de barrido no lineal flexible de acuerdo con la revindication 1.

Ventajosamente, el al menos un espejo orientable controlable es accionado mediante al menos un soporte de espejo a base de un principio de accionamiento del grupo de reguladores capacitivos, inductivos o piezoelectricos, motor paso a paso o motor de corriente continua.

A este respecto, el al menos un espejo orientable controlable se puede realizar de forma apropiada mediante un soporte de espejo de dos ejes o mediante dos de un eje.

Como posicion diana para la alineacion estabilizada de al menos un haz de excitation se selecciona ventajosamente la pupila de entrada de la optica de enfoque o de otro elemento optico de apertura limitada.

Resulta apropiado que el divisor de haz para la generation del haz de ensayo en funcion de la guia de haz del al menos un haz de excitacion en el cabezal de medicion este configurado como divisor de haz de reflexion o de transmision. El divisor de haz para el desacoplamiento del haz de ensayo puede estar configurado ventajosamente al mismo tiempo como espejo dicroico para el acoplamiento colineal de dos haces de excitacion diferentes.

El fotodiodo para la deteccion del haz de ensayo como equivalente del haz de excitacion en la posicion diana es preferentemente un fotodiodo circular. Sin embargo, como alternativa se pueden emplear tambien formas de detector rectangulares u otras. Ventajosamente, con el fotodiodo al mismo tiempo que una regulation de la estabilidad del haz en la optica de transmision se puede determinar y corregir la estabilidad de punteria del laser. El sistema de detector para la radiation secundaria emitida del objeto de medicion esta configurado preferentemente con un detector para la formacion de imagenes por MPT o SHG, de tal manera que existe un sistema de diagnostico flexible para sustancias fluorescentes, que a traves de un brazo articulado optico flexible de escasa precision mecanica permite una colocacion a libre discretion del cabezal de medicion en el espacio y garantiza una formacion de imagenes por MPT reproducible.

El sistema de detector para la radiacion secundaria puede estar configurado de forma particularmente ventajosa con varios detectores para la formacion de imagenes por MPT, SHG y para CARS, de tal manera que existe un sistema de diagnostico flexible para sustancias fluorescentes y no fluorescentes en materia animada que, a traves de un brazo articulado optico flexible comun, permite una colocacion a libre discrecion del cabezal de medicion empleado en comun en el espacio y genera una formacion de imagenes simultanea y en el mismo lugar a partir de senales de MPT, SHG y CARS. A este respecto, el sistema de diagnostico combinado de este modo para sustancias fluorescentes y no fluorescentes puede permitir tambien, de forma apropiada, a traves de un brazo articulado optico flexible y una fibra optica independiente la colocacion a libre discrecion del cabezal de medicion empleado en comun en el espacio. Ademas es posible realizar en el sistema del diagnostico combinado flexible a traves de dos fibras opticas independientes una colocacion a libre discrecion del cabezal de medicion comun para la formacion de imagenes simultanea y en el mismo lugar.

Ademas, el sistema de detector para la radiacion secundaria en una variante compacta puede presentar un detector de medicion comun para la formation de imagenes por MPT y para la formation de imagenes por CARS, estando previstos medios para la interruption temporal de la excitation CARS, que permiten una separation de la formacion de imagenes por MPT con respecto a una representation de senal combinada.

Preferentemente, el sistema de detector para un recuento de foton individual con correlation temporal presenta detectores TCSPC para la formacion de imagenes por MPT. A este respecto, el sistema de detector esta equipado de forma apropiada con un diodo de disparo adicional, que aprovecha un reflejo de lado posterior de un divisor de haz previsto para el desacoplamiento de senal de medicion en el cabezal de medicion.

En una realization ventajosa del microscopio laser de barrido flexible, el cabezal de medicion esta apoyado mecanicamente por un brazo de apoyo flexible, que se puede bloquear en una position discrecional, en un aparato de base movil, que lleva consigo de forma obligada la optica de transmision, estando presentes en el aparato de base al menos una fuente de radiacion para la generation de una radiacion de excitacion pulsada, una unidad optica para la sincronizacion de la radiacion de excitacion pulsada y alineacion con al menos una optica de transmision al cabezal de medicion as! como la unidad de control para la estabilizacion de direction de la radiacion de excitacion en el cabezal de medicion y una unidad de evaluation para el procesamiento de las senales transmitidas por el sistema de detector del cabezal de medicion para la representacion de formacion de imagenes con una unidad de visualization.

La invention se basa en la consideration de que en general existen dos posibilidades para conseguir la precision de una transmision de haz flexible en brazos articulados de espejo, en concreto mediante el uso de sistemas de jaula optomecanicos la mayorla de las veces de gran volumen, pesados y caros o mediante el uso de una estabilizacion de direccion exigente de la radiacion laser.

La invencion resuelve estos requisitos divergentes con una estabilizacion de direccion tecnologicamente sencilla, con eficiencia en cuanto a costes y de volumen pequeno para radiacion laser (o incluso radiacion incoherente), que para la minimization de la desviacion presenta un detector, una unidad de control y un accionador. En funcion de la desviacion detectada en un plano diana conjugado en el interior de un cabezal de medicion flexible de manera ilimitada mediante la unidad de control (circuito logico sencillo) se efectua una correction de la direccion de haz del haz laserico, antes de que el mismo se acople en el sistema de iluminacion y registro (optica de enfoque) del cabezal de medicion. Al mismo tiempo, mediante esta estabilizacion de haz se asegura tambien la colinealidad de la radiacion de medicion cuando se usan varios haces de excitacion.

Por ello se reducen las exigencias planteadas a una estructura de jaula mecanica de un brazo articulado de espejo con respecto a la precision necesaria de la gula de haz y los ahorros resultantes en volumen y peso facilitan la flexibilidad y movilidad del sistema de medicion microscopico (por ejemplo, de un tomografo). Las ventajas de la estabilizacion de direccion, tales como por ejemplo forma constructiva compacta y de volumen pequeno y eficiencia en cuanto a costes, se pueden ver en particular en el acoplamiento de fibra en sistemas de transmision de fibra. La solution de acuerdo con la invencion ademas se caracteriza por que se puede examinar un punto de objeto que se debe examinar por un sistema de formacion de imagenes microscopico con cabezal de medicion flexible mediante diferentes procedimientos de medicion al mismo tiempo, tales como por ejemplo mediante microscopla CARS, microscopla SHG y/o microscopla de fluorescencia multifotonica de alta resolution. A este respecto, los diferentes rayos de excitacion de uno o varios laseres de impulso corto se pueden transmitir a traves del mismo brazo articulado optico flexible o un brazo articulado optico flexible y una fibra optica adicional o a traves de dos fibras opticas y se pueden acoplar y regular con el mismo equipo para la estabilizacion del haz.

Con la invencion es posible realizar un microscopio laser de barrido no lineal flexible compacto para la detection tridimensional no invasiva para examenes de formacion de imagenes con resolucion micrometrica que permite una iluminacion reproducible del objeto de medicion con flexibilidad ilimitada del cabezal de medicion. Ademas se pueden combinar trayectorias de haz de diferentes procedimientos de medicion, preferentemente de microscopla CARS, microscopla SHG y/o microscopla de fluorescencia multifotonica en un cabezal de medicion flexible comun y a este respecto se puede realizar la misma iluminacion reproducible y barrido con precision de punto (con precision de celda).

A continuation se va a explicar con mas detalle la invencion mediante ejemplos de realizacion. Para esto, los dibujos muestran:

la Fig. 1: una representacion del principio de la invencion para la alineacion de un haz laserico a un punto diana en un cabezal de medicion mediante el uso de un brazo articulado de espejo como sistema de conduction de haz;

la Fig. 2: una representacion del principio de deteccion para la desviacion de haz en un plano diana conjugado mediante el uso de un fotodiodo circular;

la Fig. 3: una representacion tridimensional de la realizacion de la invencion como microscopio laser de barrido que se puede emplear de forma multivalente, movil, con cabezal de medicion que se puede colocar libremente en el espacio para examenes por tomografla en piel humana;

la Fig. 4: una representacion esquematica de una realizacion de la invencion en un microscopio laser de barrido flexible con dos sistemas de deteccion mediante el uso de un brazo articulado de espejo empleado de forma comun como sistema de conduccion de haz al cabezal de medicion, que esta alineado para examenes en un objeto de medicion vertical (posicion 90°), tal como por ejemplo sustancias inanimadas en un cuadro;

la Fig. 5: una representacion esquematica de una realizacion de la invencion en un microscopio laser de barrido flexible con dos sistemas de deteccion mediante el uso de un brazo articulado de espejo y una fibra optica como sistemas de conduccion de haz al cabezal de medicion comun, que esta orientado para examinar tejido vivo de animales, por ejemplo de un raton, en posicion normal (0°),

la Fig. 6: una representacion esquematica de una realizacion de la invencion en un tomografo con dos sistemas de deteccion mediante el uso de dos fibras opticas como sistemas de conduccion de haz para el cabezal de medicion comun que esta orientado para examinar sustancias discrecionales, por ejemplo en solucion llquida en una placa de Petri como microscopio invertido (posicion 180°).

La Fig. 1 muestra la estructura basica del sistema. Un laser 1, preferentemente un laser de modo unico (modo transversal) con un perfil de haz circular (o incluso un perfil de haz divergente, tal como por ejemplo haces lasericos ellpticos o multimodales), envla un haz laserico 11 a un espejo orientable 2 ajustable, con el que se acopla el haz laserico 11 en una optica de transmision 3 y se conduce a una posicion diana 41 en el interior de un cabezal de medicion 4. Del haz laserico 11 mediante un divisor de haz 42 dispuesto en el cabezal de medicion 4 se desacopla una pequena parte (por ejemplo < 10 %) como haz de ensayo 43 a un fotodetector de resolucion espacial 5. La posicion del fotodetector de resolucion espacial 5 esta dispuesta de forma conjugada con una posicion diana 41, de tal manera que el fotodetector 5 es sensible a desviaciones de la ubicacion del perfil de haz 13 (solo mostrado en la Fig. 2) del haz laserico 11 (o del haz de ensayo 43 desacoplado del mismo) de una ubicacion normal o media. Esto significa que el haz de ensayo 43 con respecto al haz laserico 11 presenta un eje optico divergente (por ejemplo con el angulo de 90°).

Una unidad de control 6 (que se puede realizar como una unidad logica sencilla) evalua la senal de salida del fotodetector 5 y controla, en funcion de la desviacion del haz de ensayo 43 (centro o punto central de potencia del perfil de haz 13, tal como se representa en la Fig. 2) de la posicion media del fotodetector, 5 la alineacion angular del espejo orientable 2 ajustable a una maximizacion de la senal del fotodetector.

En la Fig. 2 esta representado el fotodetector de resolucion espacial 5 como un unico fotodiodo circular 51 de gran superficie dentro de un cuadrado sombreado. Sin embargo, existe una pluralidad de posibilidades adicionales para la deteccion de desviaciones de ubicacion del perfil de haz 13 del haz laserico 11. Esto se puede realizar mediante detectores de medicion con resolucion espacial, tal como un fotodiodo de cuadrante, mediante dos diodos de efecto lateral dispuestos de forma ortogonal (ingles position sensitive device - PSD), llneas de detector dispuestas de forma cruzada (CCD - ingles charge-coupled device o CMOS - ingles complementary metal oxid semiconductor), una matriz CCD o CMOS, estando realizadas las matrices de sensor bidimensionales con elementos de superficie interconectados (binning) de forma circular o se produce un alojamiento de forma integrada con interaccion con una fibra guiaondas. Ademas, se pueden emplear sistemas de detector mas bien poco frecuentes con una hendidura movida (ingles scanning slit detector).

En el caso del cambio de la posicion angular del espejo orientable 2 ajustable (segun la Fig. 1) se desvla el perfil de haz 13 (en el presente documento supuestamente circular) del haz laserico 11 en el interior del cuadrado sombreado. Con una superposicion parcial de las areas del perfil de haz 13 y del fotodetector 5, que deberla estar configurada ventajosamente de manera correspondiente al perfil de haz 13 circular como fotodiodo circular 51, se genera una senal de salida que se basa en la corriente fotoelectrica generada por la radiacion laser incidente del fotodetector 5.

El objetivo de la disposition de acuerdo con la Fig. 1 es un centrado permanente del perfil de haz 13 en el centro del fotodetector 5. La posicion del perfil de haz 13 esta definida en este caso por las coordenadas X e Y dentro de un sistema de coordenadas cartesiano, que esta asignado a la posicion ideal del haz laserico 11 en la posicion diana 41 del cabezal de medicion 4. El mismo sistema de coordenadas esta asignado a la posicion conjugada en la que esta dispuesto el fotodetector 5 y representa la base de la deteccion de la desviacion del haz. El origen del sistema de coordenadas cartesiano de la posicion diana 41 en la Fig. 1 se correlaciona con el centro del fotodiodo circular 51, ya que el mismo esta dispuesto en un plano conjugado con respecto a la posicion diana 41.

La senal de salida del fotodetector 5 se produce por una superposicion dependiente de la posicion o plegado de la distribucion de sensibilidad del fotodiodo circular 51 con la funcion de intensidad del perfil de haz 13, tal como se representa en la Fig. 2 por ejemplo como distribution gaussiana aproximada para la componente de senal 52 en la coordenada X y como componente de senal 53 cualitativamente del mismo tipo en la coordenada Y dentro del cuadrado sombreado (sistema de coordenadas supuesto). Como consecuencia de la division de la senal de salida en componentes X e Y, la posicion del perfil de haz 13 se puede modificar mediante la desviacion angular del espejo orientable 2 ajustable y se puede ajustar paso a paso (por ejemplo, en primer lugar para la coordenada X y despues para la Y para la maximizacion de la senal de fotodiodo).

Una desviacion del perfil de haz 13 en direccion X de un sistema de coordenadas cartesiano genera una componente de senal 52 dependiente de la posicion con un maximo 521 global. La amplitud de la componente de senal 52 depende de la superposicion del perfil de haz 13 (circular) y del fotodiodo circular 51 o, dicho de forma mas exacta, del plegado de la funcion de intensidad del haz laserico 11 con la funcion de sensibilidad del fotodiodo 51. El angulo de desviacion perteneciente al maximo 521 del haz laserico 11 representa la coordenada buscada en direccion X. Con ello queda establecida y alineada la posicion de correccion buscada del eje X del espejo orientable 2. Partiendo de esta coordenada X, una desviacion en direccion ortogonal (del eje Y del sistema de coordenadas) conduce a una segunda componente de senal 53 del fotodiodo circular 51, cuyo maximo 531 se correlaciona con la coordenada buscada en direccion Y. La posicion de correccion buscada del eje Y del espejo orientable 2 se establece de este modo y se puede alinear correspondientemente el espejo orientable 2. La amplitud de la componente de senal 53 como consecuencia del primer movimiento de seguimiento por la superposicion ampliada de perfil de haz 13 y area de fotodiodo 51 con respecto a la componente de senal 52 queda ampliada o maximizada. Para un perfil de haz 13 gaussiano circular ideal y un fotodiodo circular 51 ideal es suficiente un unico establecimiento de las coordenadas. En este caso, despues de la aproximacion a las coordenadas en direccion X e Y, el origen del sistema de coordenadas cartesiano de la posicion diana 41 se correlaciona con el centro o el punto central del perfil de haz 13.

Para un perfil de haz 13 no ideal (divergente de gaussiano circular) o un fotodetector 51 no circular se tiene que repetir varias veces el proceso del hallazgo de coordenadas en direccion X e Y. Entonces, el resultado de la primera alineacion se puede comprobar de nuevo en el haz de ensayo 43 y dado el caso se puede reajustar de nuevo el espejo orientable 2.

Mediante una aplicacion multiple del proceso de centrado, por consiguiente, aparte de los perfiles de haz circulares (modo unico) se pueden centrar tambien los denominados perfiles de haz 13 multimodales o incluso no simetricos a la posicion diana 41 (aproximacion iterativa). En este caso no se alinea el centro de un perfil de haz 13 circular ideal, sino el punto central de intensidad del perfil de haz 13. Con ayuda de la informacion de las dos componentes de senal 52 y 53 del fotodiodo circular 51 en las coordenadas X e Y, mediante la unidad de control 6 se alinea el espejo orientable 2 ajustable de tal modo que la senal del fotodiodo 51 aumenta y, por tanto, el perfil de haz 13 (o su punto central de intensidad) se desplaza al centro del plano diana 41.

Para precisiones maximas de este principio de regulacion, las componentes de senal 52 y 53 deben presentar un maximo 521 o 531 sin meseta.

Esto se puede realizar mediante el cotejo del diametro del fotodiodo circular 51 con el diametro del perfil de haz 13, debiendo ser el diametro del fotodiodo 51 el doble del radio de haz con 1/e2 de la intensidad del haz laserico 1. Otra posibilidad de establecer con la mayor precision posible el maximo 521 o 531 de la componente de senal 52 o 53 es un procesamiento de senal posterior (por ejemplo, adaptation gaussiana o filtrado por paso bajo). Esto permite el funcionamiento del sistema incluso con fuentes de radiation laser de coherencia larga, en las que la senal mediante reflejo multiple en divisores de haz presenta interfere ncias.

El intervalo dinamico de las componentes de senal 52 y 53 se puede aumentar mediante el uso de amplificadores logarltmicos (no dibujados), lo que garantiza la funcion de la estabilizacion de direccion incluso en el caso de laseres con potencia de salida variable.

Para la generation del haz de ensayo 43 se puede aprovechar la reflexion (tal como se muestra en la Fig. 1) o la transmision del haz laserico 11 en el divisor de haz 42 (como se dibuja en la Fig. 4) en funcion de la direccion en la que se debe conducir posteriormente el haz laserico 11 en el cabezal de medicion 4.

En el caso del uso de opticas de transmision de fibra (tal como existen en la Fig. 5) se ve influido el acoplamiento del haz laserico 11 y, por consiguiente, la transmision del sistema por variation termica y tensiones mecanicas dentro de la unidad optica 72. Si se usan fibras monomodales, cuyo diametro de nucleo es muy pequeno, la transmision en el intervalo de solo unos pocos minutos puede disminuir varias decenas en porcentaje. En este caso se puede producir aparte de una potencia de laser insuficiente en el cabezal de medicion 4 una destruction del sistema de transmision de fibra por interacciones termicas en el interior de la fibra, que se deben evitar necesariamente.

El principio de action de la correccion del haz laserico 11 o de su centrado en el nucleo de una optica de transmision de fibra se realiza de forma analoga a la representation de la Fig. 1, pudiendo estar representada la funcion del fotodiodo circular 51 descrito en la Fig. 2 por el diametro de nucleo circular de la optica de transmision 3 configurada como fibra y un fotodetector 5 conectado por detras, que integra toda la luz transmitida. La fibra guiaondas 32 imita a este respecto junto con un fotodetector 5 colocado por detras de forma discrecional una funcion descrita para la regulacion con el fotodiodo circular 51 de acuerdo con la Fig. 1 y la Fig. 2 de forma equivalente.

Ejemplo de realizacion 1

Tal como se representa en la Fig. 3, el sistema de medicion como microscopio de barrido no lineal flexible movil esta compuesto por un aparato de base movil sobre ruedas 7 para la colocacion de libre eleccion. A este aparato de base esta fijado, a traves de un brazo de apoyo 8, un cabezal de medicion 4 que se puede mover libremente en el espacio. Adicionalmente estan colocados para la conduccion de haz optico de la radiacion laser necesaria para el barrido con laser con formacion de imagenes dos opticas de transmision optica 3 diferentes, un brazo articulado de espejo 31 y una fibra optica 32, entre el aparato de base 7 y el cabezal de medicion 4. Estos estan previstos para la transmision de la radiacion de excitacion para diferentes procedimientos de deteccion, por ejemplo, sin perdida de la generalidad, para tomografla multifotonica y CARS, superponiendose de forma colineal los diferentes haces de excitacion en el cabezal de medicion 4. Para esto, en el cabezal de medicion 4 se emplea el sistema mostrado en principio en la Fig. 1 de la estabilizacion de haz con fotodetector 5 sensible a posicion, unidad de control 6 y espejo orientable controlable 2. Por ello es posible la alineacion libre mostrada en la Fig. 3 del cabezal de medicion 4 a una seccion situada de forma discrecional en espacio de piel 91 humana como objeto de medicion 9 (ser humano), sin que se produzca cambio alguno (empeoramiento) de las condiciones de excitacion como consecuencia de las diversas posibilidades de pivotado del cabezal de medicion 4.

Otras configuraciones tecnicas distintas del microscopio de barrido de acuerdo con la invencion inclusive algunas de las diversas posibilidades de aplicacion se explican con detalle en los siguientes ejemplos.

Ejemplo de realizacion 2

El microscopio de acuerdo con la invencion de la Fig. 4, tal como se ha descrito anteriormente en la Fig. 3, esta compuesto por un aparato de base movil sobre ruedas 7 para la colocacion de libre eleccion.

Para la formacion de imagenes multifotonica existe en el aparato de base 7 un sistema del laser de impulso corto 71 (5 fs-500 ps; con perfil de haz gaussiano, por ejemplo un laser de titanio : zafiro) as! como una unidad optica 72 en la que el espejo orientable controlable 2 como espejo orientable de dos ejes 21 acopla el haz laserico 11 procedente del sistema de laser de impulso corto 71 en una optica de transmision 3 flexible en forma de un brazo articulado de espejo 31. En este primer ejemplo, el haz laserico 11 se conduce a traves del brazo articulado de espejo 31 flexible al cabezal de medicion 4 optico. Un brazo de apoyo 8 de varios miembros movil y que se puede bloquear en cualquier posicion posibilita la libre colocacion del cabezal de medicion 4 optico, de tal manera que se arrastra de forma obligada correspondientemente el brazo articulado de espejo 31. Por tanto, el cabezal de medicion 4 se puede colocar con su optica de enfoque 44 en una alineacion discrecional sobre el objeto de medicion 9, en el caso de una posicion de 90° a un objeto de medicion 9 con superficie vertical, en este ejemplo un cuadro 92 colgado cuya composicion (material o estructura de capas) se debe examinar. A este respecto, a causa del control constante y el reajuste de la direccion de eje de haz laserico 11, el plano diana 41 esta iluminado siempre de forma constante, de tal manera que se evitan errores de medicion que resultan de una radiacion de excitacion variable.

La segunda fuente de radiacion requerida para la formacion de imagenes por CARS (adicionalmente a la formacion de imagenes por MPT) con una longitud de onda que difiere del laser de impulso corto 71 se genera a partir del laser de impulso corto 71 al desacoplarse a traves de un divisor de haz 725 una parte de radiacion de aproximadamente la mitad del haz laserico 11 y suministrandose como haz laserico 11' a un desplazador de frecuencia 73. El haz laserico 12 emitido a partir de esto con longitud de onda divergente se acopla asimismo en la unidad optica 72, conduciendose el haz laserico 12 a traves de un segundo espejo orientable de dos ejes 22 controlable (con la misma funcion que el espejo orientable de dos ejes 21) adicionalmente por un sistema de telescopio 722 con separacion de lente variable y un tramo de retraso optico variable 723 y despues de atravesar una disposicion de espejos 724 ajustable y un espejo dicroico 726 esta alineado con el haz laserico 11 del laser de impulso corto 71 de forma colineal (superposicion espacial de las dos partes del haz a lo largo del mismo eje). Los dos haces lasericos 11 y 12 se acoplan detras del espejo dicroico 726 de forma colineal en el brazo articulado de espejo 31 y se transmiten al cabezal de medicion 4. La coincidencia de ejes de los dos haces lasericos 11 y 12 se supervisa entonces permanentemente en el cabezal de medicion 4 al comprobarse la iluminacion media del fotodiodo 51 sensible a posicion en el haz de ensayo 43 desacoplado de la trayectoria de haz a la optica de enfoque 44 a traves del divisor de haz 43 y al corregirse mediante la unidad de control 6 la divergencia constatada a traves de los espejos orientables de dos ejes 21 y 22 controlables de la unidad optica 72 para cada uno de los haces lasericos 11 y 12. Por ello, con cada alineacion discrecional del brazo articulado de espejo 31 se garantiza que este iluminada homogeneamente la pupila de entrada de la optica de enfoque 44 (plano diana 41). En lugar de la pupila de entrada de la optica de enfoque 44 se puede usar tambien una limitacion de apertura de otro elemento optico usado en el cabezal de medicion 4.

La superposicion temporal de los impulsos de laser individuales de los dos haces lasericos 11 y 12 se realiza mediante graduacion manual o a motor del tramo de retraso optico variable 723. Las posiciones de foco separadas una de otra detras de la optica de enfoque 44 por dispersion de los haces lasericos 11 y 12 diferentes en la longitud de onda se pueden superponer por el sistema de telescopio 722 dentro del objeto de medicion 9 (en el presente ejemplo, de un cuadro 92).

Dentro del cabezal de medicion 4 se conduce la parte principal de la radiacion laser de los dos haces lasericos 11 y 12 a traves del divisor de haz 42 a una unidad de barrido 46 prevista para un barrido bidimensional. Detras de la unidad de barrido 46, la radiacion laser se conduce a traves de un sistema de telescopio 47 a la pupila de entrada de la optica de enfoque 44 y se enfoca con la optica de enfoque 44 en el cuadro 92 que se va a examinar.

La unidad de barrido 46 permite una desviacion bidimensional de los haces lasericos 11 y 12 dentro del plano focal de la optica de enfoque 44, de tal manera que se puede realizar un barrido o excitacion bidimensional en forma de reticula del cuadro 92.

La representation tridimensional tomografica del objeto de medicion 9 (como toma apilada a traves de distintas capas del cuadro 92) se posibilita por la graduation sistematica de la optica de enfoque 44 a traves de un posicionador de eje Z 48.

Las senales generadas en el plano focal de la optica de enfoque 44 en el cuadro 92 en cada caso de los diferentes haces de excitacion (haces lasericos 11 y 12 con distinta longitud de onda y secuencia de impulsos) se reciben de forma integradora por la optica de enfoque 44 del cabezal de medicion 4 y se separan mediante dos divisores de haz dicroicos 451 y 452 para el desacoplamiento de las senales de medicion, por ejemplo, senales de autofluorescencia y SHG, de la radiacion de excitacion reflejada y se conducen a dos detectores de medicion, detector MP 54 y detector CARS 55. La evaluation de las senales MP y CARS se realiza en el aparato de base 7 en una unidad de evaluation 61 y se puede representar en una unidad de visualization 62 como distribution del valor de gris multidimensional como una imagen.

Para una toma de imagen basada en recuento de foton individual con correlation temporal (ingles Time Correlated Single Photon Counting - TCSPC) con el fin de especificar atomos y moleculas y su entorno mediante medicion de los tiempos de decaimiento de las vibraciones atomicas y moleculares, los detectores de medicion 54 y 55 se pueden sustituir por detectores de alta resolution temporal y se pueden procesar sus senales en la unidad de evaluacion 61. Para el disparo requerido en mediciones de TCSPC esta previsto un diodo de disparo 56 que aprovecha un reflejo de lado posterior parasitario de uno de los divisores de haz 451 o 452. En este ejemplo se usa el reflejo de lado posterior del divisor de haz 451.

Opcionalmente se puede aprovechar tambien para el fotodiodo 51 sensible a position, con cuya senal de salida la unidad de control 6 a traves de los espejos orientables de dos ejes 21 y 22 controla la posicion estable de los haces lasericos 11 y 12 con respecto al plano diana 41 definido en el cabezal de medicion 4, un reflejo de lado posterior parasitario de uno de los divisores de haz 451 o 452. Para esto, en la Fig. 4 esta posicion alternativa con respecto al fotodiodo 51 esta dibujada con llneas discontinuas y se denomina fotodiodo 51', aprovechandose el reflejo de lado posterior parasitario del divisor de haz 452. Este fotodiodo 51' alternativo, ya que se encuentra mas proximo al plano diana 41 (pupila de entrada de la optica de enfoque 44), se puede preferir y entonces sobra el fotodiodo 51 dispuesto en el haz de ensayo 43. El divisor de haz 42 en este caso se puede sustituir por un espejo completo (no dibujado).

Con esta excitacion con estabilizacion de haz laserico del cuadro 92 que se va a medir se mejora la estabilidad de direction en un factor 10-20. Una mejora de este tipo asegura una iluminacion homogenea del campo de la imagen en todas las posiciones del cabezal de medicion 4 y, por consiguiente, resultados de medicion comparables reproducibles.

Ejemplo de realization 3

La Fig. 5 muestra el sistema de medicion mediante el uso de un brazo articulado de espejo 31 y una fibra optica 32 como dos sistemas de transmision 3 opticos de conduction de haz independientes.

El laser de impulso corto 71 se acopla del mismo modo, tal como en el segundo ejemplo, con la unidad optica 72 a traves del espejo orientable de dos ejes 21 en el brazo articulado de espejo 31 flexible y se conduce al cabezal de medicion 4 optico.

Los desplazadores de frecuencia 73 usados para la generation de la formation de imagenes por CARS adicional se alimentan mediante el haz laserico 11' desacoplado del divisor de haz 725 a traves de un espejo de desviacion 721 con la longitud de onda de salida generada por el laser de impulso corto 71 y envla un haz laserico 12 con longitud de onda diferente del laser de impulso corto 71. Entonces, a diferencia del anterior ejemplo, el haz laserico 12, despues de que haya atravesado en primer lugar el sistema de telescopio 722, se alinea mediante un primer espejo orientable de un eje 23 y un segundo espejo orientable de un eje 24, dispuesto en ortogonal con respecto a esto, delante del tramo de retraso optico 723 en dos direcciones de coordenadas por separado. Por lo demas, tal como se describe en la Fig. 4, atraviesa el tramo de retraso 723 y la disposition de espejos 724. Despues, el haz laserico 12, asimismo de forma diferente a la estructura de la Fig. 4, no atraviesa ningun divisor de haz dicroico 726 para el agrupamiento con el haz laserico 11, sino que se acopla por separado en una fibra guiaonda 32 y se conduce a traves de la misma al cabezal de medicion 4.

En el cabezal de medicion 4, el haz laserico 12 a traves de un divisor dicroico 421 adecuado, que asume al mismo tiempo para el haz laserico 11 la funcion de desviacion as! como la funcion de divisor para el desacoplamiento del haz de ensayo 43 al fotodiodo 51, se superpone de forma colineal con el haz laserico 11 suministrado al brazo articulado de espejo 31 y se enfoca al tejido de un raton 93 (como objeto de medicion 9 concreto).

La deteccion y el procesamiento adicionales de las senales que retornan del tejido de un raton 93 se realizan en este ejemplo de forma desacoplada a traves del divisor de haz 421 mediante un detector 57 comun para las senales MP y CARS generadas, pudiendo discriminarse por el bloqueo de uno de los haces lasericos 11 o 12 o, como alternativa, mediante cambio de la posicion de fase (relacion temporal) de los dos haces lasericos 11 y 12 entre si mediante el grupo de retraso 723 las senales CARS de las senales MP, por lo que el detector 57 recibe solo senales MP. Ademas, mediante excitacion con correccion de fase de los dos haces lasericos 11 y 12 se pueden detectar las senales CARS y MP del tejido de raton 93 juntas (superpuestas).

Ejemplo de realizacion 4

En la Fig. 6 se representa otra configuracion ventajosa del microscopio laser de barrido, usandose dos fibras opticas 32 y 33 como sistemas de transmision 3 opticos de conduccion de haz.

Los dos haces lasericos 11 y 12 con diferente longitud de onda se conducen en la unidad optica 72 como en el tercer ejemplo, se alinean y se ajustan entre si sin superponerse uno con otro. Sin embargo, el haz laserico 12 a diferencia de los anteriores ejemplos se genera en una segunda fuente de laser 74 y se acopla despues de una sincronizacion de fases ligeramente mas compleja en el grupo de retraso 723 y la posterior disposicion de espejos 724 en la fibra guiaondas 32 (como en el tercer ejemplo de acuerdo con la Fig. 5). En este caso, el haz laserico 11 se acopla en la segunda fibra, preferentemente una fibra monomodal 33. Las dos fibras 32 y 33 se superponen entonces de forma colineal en el cabezal de medicion 4, de forma analoga al tercer ejemplo, mediante un divisor dicroico 421. La alineacion colineal estabilizada de los haces lasericos 11 y 12 as! como la deteccion de las senales excitadas con ello suceden del mismo como se describe en el segundo ejemplo de realizacion.

Como objeto de medicion 9 pueda estar fijada una placa de Petri 94 llena con sustancias llquidas o solidas de forma rlgida en el cabezal de medicion 4 (en el caso mas sencillo por ejemplo con cinta adhesiva de doble cara) o se puede acoplar de forma movil con una mesa de posicionamiento (por ejemplo, mesa en cruz de dos o tres ejes, no mostrada). Esto posibilita una formacion de imagenes microscopica con una complejidad tecnica muy reducida. En lugar de una placa de Petri 94 se pueden examinar tambien placas de microtitulacion del mismo modo con respecto a sus sustancias. La disposicion de microscopio invertido mostrada de forma estilizada en la Fig. 6 permite por tanto examinar muestras discrecionales, tales como por ejemplo muestras incluidas en soluciones nutrientes, sustancias solidas pulverizadas o granuladas o incluso cuerpos solidos (zonas proximas a la superficie).

Las ventajas del sistema MPT descrito con deteccion CARS radican, con respecto a sistemas convencionales e inflexibles, en el cabezal de medicion 4 que se puede colocar libremente en el espacio por el brazo articulado optico 31 y/o fibras guiaondas 32, 33, con peso reducido y el aparato de base movil 7. Una disposicion de este tipo permite al usuario poder realizar de forma reproducible en un tiempo corto mediciones combinadas de alta resolucion (ahorro de tiempo y costes) y disponer, a este respecto, de una disposicion de medicion microscopica que puede llevar a cabo para superficies de objeto de alineacion discrecional de forma completamente equivalente (compatible) y sin movimiento de objeto de medicion (por ejemplo, traslados de pacientes) o toma de muestras del objeto de medicion 9 una pluralidad de mediciones en partes distintas del objeto de medicion 9 (en particular del cuerpo humano o animal).

Ademas, la colocacion flexible del cabezal de medicion 4 permite una denominada formacion de imagenes inversa, tal como se emplea con preferencia en la microscopla convencional.

A diferencia de los sistemas de microscopio convencionales, que estan disponibles solo como microscopio vertical (0°) o como microscopio invertido (180°), la presente invencion con el cabezal de medicion 4 de movilidad ilimitada permite tambien la disposicion en posicion 90° y una desviacion discrecional de esto. Por ello son posibles tambien mediciones en objetos en vertical, tales como por ejemplo examenes de cultivos de mohos en paredes, de partes vegetales dentro de una plantacion, analisis de material (vease la Fig. 4), examenes en animales (vease la Fig. 5) y examenes de piel en el ser humano (Fig. 3) as! como examenes criminallsticos del tipo mas diverso, al igual que el aprovechamiento como microscopio laser de barrido inverso para el examen de sustancias llquidas o solidas discrecionales (Fig. 6).

Con una pieza anadida (no dibujada) adaptada correspondientemente en el cabezal de medicion 4 ademas es posible usar una mesa de posicionamiento (mesa en cruz) en el cabezal de medicion 4 para ofrecer un rendimiento convencional de microscopio que, a causa de la movilidad del microscopio de barrido (aparato de base 7), permite en cualquier lugar discrecional examenes de alta resolucion sobre zonas de muestra macroscopicas.

Las ventajas del acoplamiento de sistemas de diagnostico de formacion de imageries de la microscopla CARS, microscopla SHG y/o microscopla de fluorescencia multifotonica con respecto a sistemas de diagnostico independientes en cada caso radican en la combinacion de los procedimientos de la excitacion y formacion de imagenes por CARS, SHG y multifotonica en un aparato de base movil 7 compacto con cabezal de medicion 4 flexible. La disposicion propuesta con brazo articulado 31 flexible o fibra optica 32, 33 permite una colocacion libre de un cabezal de medicion 4 sin limitaciones de la resolucion y sin falseamientos de la senal como consecuencia del ajuste erroneo de la radiacion de excitacion, al registrarse la ultima de forma fiable de manera sencilla y robusta y corrigiendose y quedando garantizada por tanto una formacion de imagenes y evaluacion con minimizacion de errores.

Lista de referencias

1 laser

11 haz laserico (haz de excitacion)

12 haz laserico (segundo haz de excitacion)

13 perfil de haz

2 espejo orientable (controlable)

21, 22 espejo orientable de dos ejes

23, 24 espejo orientable de un eje

3 optica de transmision

31 optica articulada de espejo

32 fibra guiaondas

33 fibra monomodal

4 cabezal de medicion

41 posicion diana

42 divisor de haz

421 divisor dicroico

43 haz de ensayo

44 optica de enfoque

45 divisor de desacoplamiento de senal

451 divisor de haz dicroico

452 divisor de haz dicroico

46 unidad de barrido

47 sistema de telescopio

48 posicionamiento de eje Z

5 fotodetector (sensible a posicion)

51 fotodiodo (circular)

52, 53 componente de senal (en direccion X, Y)

521, 531 maximo

54 detector (MP)

55 detector (c a Rs )

56 diodo de disparo

57 detector comun

6 unidad de control

61 unidad de evaluacion

62 unidad de visualizacion

7 aparato de base (movil)

71 laser de impulso corto

72 unidad optica

721 espejo de desviacion

722 sistema telescopico

723 grupo de retraso

724 disposicion de espejos

725 divisor de haz

726 espejo dicroico

73 desplazador de frecuencia

74 segunda fuente de laser

8 brazo de apoyo

objeto de medicion

piel humana

pintura

tejido de un raton

placa de Petri (con sustancia llquida)

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Microscopio laser de barrido no lineal flexible para la detection tridimensional no invasiva, que contiene al menos una fuente de radiation que genera al menos un haz de excitation de radiation laser pulsada para la activation de una radiacion secundaria emitida por atomos y moleculas, una optica de transmision flexible para la transmision de la radiacion a un cabezal de medicion con una optica de enfoque con la que se enfoca la radiacion en un objeto de medicion y se devuelve la radiacion secundaria emitida y se dirige a al menos un sistema de detector, estando unido el cabezal de medicion (4), de forma que se puede pivotar y girar libremente en el espacio y colocar de forma flexible, a la al menos una fuente de radiacion (1; 71; 74), de tal manera que se puede realizar microscopla vertical, invertida as! como microscopla en angulos discrecionales del espacio, caracterizado por que

- hay dispuesto al menos un espejo orientable (2), controlable para la desviacion y alineacion del al menos un haz de excitacion (11; 12) de radiacion laser pulsada de la al menos una fuente de radiacion, de tal manera que se dirige el al menos un haz de excitacion (11; 12) a traves de la optica de transmision (13) al cabezal de medicion (4) de modo que el al menos un haz de excitacion (11; 12) esta dispuesto en cualquier position del cabezal de medicion (4) de forma concentrica con respecto a un elemento optico de apertura limitada del cabezal de medicion (44),

- hay dispuesto un divisor de haz (42) para el desacoplamiento de una parte pequena del al menos un haz de excitacion (11; 12) en el cabezal de medicion (4) delante de la optica de enfoque (44) para generar un haz de ensayo (43),

- hay dispuesto un fotodiodo (5) en un plano conjugado con el plano diana (41) en el haz de ensayo (43), correspondiendose una alineacion media del haz de ensayo (43) en el fotodiodo (5) con la alineacion normal del haz de excitacion (11, 12) en el plano diana y

- mediante desviacion del haz de excitacion en direcciones X e Y sucesivamente se generan en cada caso componentes de senal X e Y (52, 53) dependientes de la posicion, correspondiendose el respectivo maximo (521, 531) de las componentes de senal X e Y dependientes de la posicion con la alineacion media del haz de ensayo (43) en el fotodiodo (5) y

- esta presente una unidad de control (6) para el control del espejo orientable controlable (2) que, con ayuda de las componentes de senal X e Y dependientes de la posicion, alinea el espejo orientable controlable de tal manera que el haz de ensayo es dirigido de forma central sobre el fotodiodo, de tal manera que se consigue una estabilizacion de direction del al menos un haz de excitacion independientemente de la magnitud de la alteration debida a la posicion de la optica de transmision (3).

2. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el al menos un espejo orientable controlable (2) es accionado mediante al menos un soporte de espejo controlable sobre la base de un principio de accionamiento del grupo de reguladores capacitivos, inductivos o piezoelectricos, motores paso a paso o motores de corriente continua.

3. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el al menos un espejo orientable controlable (2) esta realizado mediante un soporte de espejo de dos ejes (21; 22) o dos soportes de espejo de un eje (23; 23).

4. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que como plano diana (41) del al menos un haz de excitacion (11; 12) esta seleccionada la pupila de entrada de la optica de enfoque (44) o de otro elemento optico de apertura limitada.

5. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que para la generation del haz de ensayo (43) en funcion de la conduction del haz del al menos un haz de excitacion (11; 12) en el cabezal de medicion (4), el divisor de haz (42) esta configurado como divisor de haz de reflexion o de transmision.

6. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el divisor de haz (42) esta configurado para el desacoplamiento del haz de ensayo (43) al mismo tiempo como espejo dicroico para el acoplamiento colineal de dos haces de excitacion (11; 12) diferentes.

7. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el fotodiodo (5) es un fotodiodo circular (51).

8. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que adicionalmente a la regulation de la estabilidad del haz en la optica de transmision (3) se puede determinar y corregir la estabilidad de punterla del laser.

9. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el sistema de detector para la radiacion secundaria esta configurado con un detector (54) para la formation de imagenes por MPT o SHG, de tal manera que existe un sistema de diagnostico flexible para sustancias fluorescentes que permite, a traves de un brazo articulado optico flexible (31) de escasa precision mecanica, una colocation a libre discretion del cabezal de medicion (4) en el espacio y garantiza una formacion de imagenes por MPT reproducible.

10. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que estan acoplados dos haces lasericos (11, 12) de diferente longitud de onda en un brazo articulado optico flexible (31) y el sistema de detector para las radiaciones secundarias esta equipado con detectores (54; 55) para la formacion de imagenes por MPT y para la formacion de imagenes por CARS, de tal manera que existe un sistema de diagnostico flexible para sustancias fluorescentes y no fluorescentes en materia animada que permite a traves de un brazo articulado optico flexible (31) comun una colocacion a libre discrecion en el espacio del cabezal de medicion (4) usado en comun y genera una formacion de imagenes simultanea y en el mismo lugar a partir de senales MPT y CARS.

11. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que estan acoplados dos haces lasericos (11, 12) de diferente longitud de onda en un brazo articulado optico flexible (31) y una fibra optica (32) independiente y el sistema de detector esta equipado con un detector (57) comun para las radiaciones secundarias para la formacion de imagenes por MPT y para la formacion de imagenes por CARS, de tal manera que existe un sistema de diagnostico flexible para sustancias fluorescentes y no fluorescentes en materia animada que permite a traves de un brazo articulado optico flexible (31) y una fibra optica (32) independiente una colocacion a libre discrecion en el espacio del cabezal de medicion (4) usado en comun y genera una formacion de imagenes simultanea y en el mismo lugar a partir de senales MPT y CARS.

12. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que estan acoplados dos haces lasericos (11, 12) de diferente longitud de onda en dos fibras opticas (32; 33) independientes y el sistema de detector para las radiaciones secundarias esta equipado con detectores (54; 55) para la formacion de imagenes por MPT y para la formacion de imagenes por CARS, de tal manera que existe un sistema de diagnostico flexible para sustancias fluorescentes y no fluorescentes en materia animada que permite a traves de dos fibras opticas (32; 33) independientes una colocacion a libre discrecion en el espacio del cabezal de medicion (4) usado en comun y genera una formacion de imagenes simultanea y en el mismo lugar a partir de senales MPT y CARS.

13. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el sistema de detector para la radiacion secundaria presenta un detector de medicion (57) comun para la formacion de imagenes por MPT y para la formacion de imagenes por CARS, estando previstos medios para la interrupcion temporal de la excitacion CARS que permiten una separacion de la formacion de imagenes por MPT con respecto a una representacion de senal combinada.

14. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el sistema de detector para la radiacion secundaria presenta detectores TCSPC para la formacion de imagenes por MPT y adicionalmente un diodo de disparo (56) que aprovecha un reflejo del lado posterior de un divisor de haz (451) previsto para el desacoplamiento de la senal de medicion.

15. Microscopio laser de barrido de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado por que el cabezal de medicion (4) esta apoyado mecanicamente mediante un brazo de apoyo optico flexible (31), que se puede bloquear en posiciones discrecionales, en un aparato de base movil (7) y se arrastra de forma obligada la optica de transmision (3), estando presentes en el aparato de base (7) al menos una fuente de radiacion (71) para la generacion de radiacion de excitacion (11; 12) pulsada, una unidad optica (72) para la sincronizacion de la radiacion de excitacion (11; 12) pulsada y alineacion con al menos una optica de transmision (31; 32; 33) al cabezal de medicion (4) as! como la unidad de control (61) para la estabilizacion de la direccion de la radiacion de excitacion (11; 12) en el cabezal de medicion (4) y una unidad de evaluacion (6) para el procesamiento de las senales transmitidas por el sistema de detector (54, 55) del cabezal de medicion (4) para la representacion con formacion de imagenes con una unidad de visualizacion (62).