ES2713162T3

ES2713162T3 - Métodos para la determinación del grupo sanguíneo Vel

Info

Publication number: ES2713162T3
Application number: ES13773677T
Authority: ES
Inventors: Jill R Storry; Magnus Jöud; Björn Nilsson; Martin L Olsson
Original assignee: LU LICENSE AB
Current assignee: LU LICENSE AB
Priority date: 2012-10-01
Filing date: 2013-10-01
Publication date: 2019-05-20
Anticipated expiration: 2033-10-01

Abstract

Un método de identificar el fenotipo Vel de un individuo, dicho método comprende distinguir entre fenotipos Vel positivo y Vel negativo analizando en una muestra biológica de dicho individuo la composición del gen SMIM1, en donde al menos un gen SMIM1 intacto es indicativo de un fenotipo Vel positivo, y en donde un gen SMIM1 que comprende una mutación que produce expresión abolida de una proteína Vel es indicativo de un fenotipo Vel negativo.

Description

DESCRIPCION

Métodos para la determinacion del grupo sangumeo Vel

Campo tecnico

La presente invencion se refiere al campo tecnico de la determinacion del grupo sangumeo, en particular a la determinacion del grupo sangumeo Vel y espedficamente a herramientas y metodos para distinguir entre individuos Vel positivos y Vel negativos.

Antecedentes

Ademas de los sistemas de grupos sangumeos humanos, existen antigenos de eritrocitos que no cumplen aun la definicion de un sistema de grupo sangumeo. La mayona de estos antfgenos o bien son casi universales en sangre humana (antfgenos de alta prevalencia) o extremadamente raros (antfgenos de baja prevalencia). Los reactivos para ensayar para estos antfgenos son diffciles de encontrar y muchos no se pueden comprar comercialmente hasta la fecha.

La identidad genetica molecular de muchos antfgenos de grupo sangumeo esta bien establecida y existen una variedad de tecnicas basadas en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) para su deteccion. Muchos laboratorios han desarrollado protocolos internos o adoptado los sistemas de prueba de otros para predecir antfgenos de grupo sangumeo por determinacion de acido desoxirribonucleico (ADN) en una base rutinaria.

Los ensayos basados en ADN pueden determinar facilmente la homocigosidad y heterocigosidad, y en algunos casos, la hemicigosidad de un alelo de grupo sangumeo, que esta mas alla de la capacidad de la serologfa convencional. Otro beneficio anadido de la determinacion de grupo sangumeo basado en ADN mas alla de las capacidades de la serologfa tradicional es la posibilidad de determinar el grupo sangumeo fetal ensayando ADN derivado de celulas fetales en lfquido amniotico o biopsias de vellosidades corionicas, o crecientemente comun incluso de ADN fetal sin celulas en plasma materno.

Es una gran frustracion para usuarios finales y fabricantes por igual que el factor limitante en proporcionar informacion sobre el fenotipo en pacientes, donantes de sangre y globulos rojos (GR) reactivos sea la disponibilidad de antisueros fiables.

Hay anticuerpos monoclonales hacia muchos antfgenos de grupo sangumeo y por tanto el suministro esta de alguna manera asegurado. Sin embargo, para especificidades para las que no se han generado anticuerpos monoclonales, los fabricantes aun tienen que confiar en anticuerpos policlonales humanos como reactivos de determinacion. Muchos de estos escasean cada vez mas, con frecuencia son solo debilmente y/o variablemente reactivos, y son costosos de producir. Para algunos grupos sangumeos, se han inmunizado voluntarios contra cierto antfgeno de grupo sangumeo para uso reactivo o medico, pero generar anticuerpos contra un antfgeno de alta prevalencia, por ejemplo, Vel como se describe en Issit et al (1968) Vox Sang. 15: 125-132, no es una opcion en voluntarios humanos porque las unidades de sangre que carecen del antfgeno correspondiente son raras y el procedimiento podna, por tanto, constituir una amenaza de seguridad.

El antfgeno del grupo sangumeo Vel, primero descrito por Sussman y Miller (Rev. Hematol. 1952;7:368-71), se expresa en GR y es uno de los varios denominados antfgenos de grupo sangumeo huerfanos para los que la base molecular es desconocida.

Entre los grupos sangumeos huerfanos, Vel se considera uno de los mas relevantes clmicamente, ya que los pacientes Vel negativos, que han sido inmunizado despues de una transfusion o embarazo, y posteriormente son transfundidos con globulos rojos de donantes Vel positivos estan en riesgo de efectos secundarios graves incluyendo hemolisis intravascular aguda. Tal caso se describe, por ejemplo, en Storry y Mallory (1994) [6] y en Sandler et al. (1979) [].

Actualmente hay una falta global de donantes de sangre Vel negativos disponibles para fines de medicina de transfusion. Segun esto es deseable proporcionar una prueba que pueda seleccionar de forma rapida y eficaz donantes Vel negativos.

El contexto molecular de Vel hasta la fecha ha sido desconocido y por tanto la unica posibilidad para identificar donantes de sangre que carecen de Vel ha sido a traves de fenotipado usando antisueros de pacientes inmunizados, un enfoque suboptimo desde una perspectiva etica, de seguridad y calidad. Las herramientas para el cribado genetico son deseables ya que facilitan el cribado a gran escala, rentable de donantes de sangre para la ausencia de Vel, para aumentar la disponibilidad de sangre Vel negativa.

La identificacion de un gen del que es dependiente la expresion del grupo sangumeo Vel permitina el posible desarrollo de un ensayo de cribado que podna identificar donantes de sangre Vel negativa, y tambien significa determinar pacientes en riesgo de producir un anticuerpo indeseado contra el antigeno Vel, o sospechosos de haber fabricado tales anticuerpos.

Compendio

Casi todos los seres humanos portan el antigeno de grupo sangumeo Vel en la superficie de sus globulos rojos (GR). Los individuos que carecen de Vel pueden formar anticuerpos anti-Vel que pueden producir reacciones hemolfticas graves tras transfusion sangumea, y tambien producen enfermedad hemolttica del feto y recien nacido en embarazos raros.

Segun esto, es esencial identificar individuos Vel negativos antes de la transfusion sangumea para evitar dichas reacciones graves. Como se ha discutido en el presente documento anteriormente, para algunos grupos sangumeos, se han inmunizado voluntarios contra un cierto antfgeno de grupo sangumeo para uso reactivo o medico. Sin embargo, generar anticuerpos contra un antfgeno de alta prevalencia no es una opcion en voluntarios humanos porque las unidades de sangre que carecen del antfgeno correspondiente son raras y el procedimiento podna, por tanto, constituir una amenaza de seguridad. Los presentes inventores han abordado el problema aplicando ensayos basados en ADN al grupo sangumeo Vel, para llenar los huecos dejados por la no disponibilidad de antisueros reactivos apropiados.

Los presentes inventores han descubierto la base genetica de Vel y han encontrado una mutacion (espedficamente, una delecion de 17 pares de bases) en un gen previamente no caracterizado (protema integral de membrana pequena 1; Sfmbolo genico oficial SMIM1, previamente LOC388588; Entrez Gene ID 388588), para la que todos los individuos Vel negativo ensayados eran homocigotos, verificado por controles genealogicos Vel negativo y Vel positivo. La expresion del antfgeno de grupo sangumeo Vel en GR depende de la expresion del gen SMIM1, cuyo ARNm codifica una protema transmembrana de tipo 1. El fenotipo Vel negativo se produce cuando esta protema no se puede expresar. Estos resultados revelan el mecanismo molecular previamente desconocido por el que el antfgeno del grupo sangumeo Vel se expresa.

Los presentes resultados demuestran que el grupo sangumeo Vel de un individuo esta determinado por SMIM1, localizado en un bloque haplotipo de 97 kb en el cromosoma 1p36.32.

Este gen codifica una protema de membrana evolutivamente conservada de tipo 1 que se coexpresa con genes conocidos de GR y contiene sitios de union para factores de transcripcion unidos con desarrollo eritroide.

Todos los individuos Vel negativos examinados (n=36) en el estudio eran homocigotos para una delecion de 17 pares de bases en el exon 3 que cambia el marco de lectura 5' de la region que codifica el dominio transmembrana, lo que produce un fenotipo nulo donde los antfgenos Vel no se expresan.

La ausencia de un producto proteico de SMIM1 en membranas de GR de portadores homocigotos de la delecion se confirmo usando inmunotransferencia usando anticuerpos generados contra el dominio N-terminal de la protema.

La sobreexpresion de SMIM1 de tipo salvaje despues de la transfeccion de celulas hematopoyeticas aumento la reactividad con sueros que contienen anti-Vel, mientras que el alelo mutante no.

El cribado genetico molecular para la delecion entre donantes de sangre del sur de Suecia revelo que 1/17 son potadores heterocigotos, correspondiente a una frecuencia de homocigotos de aproximadamente 1/1150.

En un aspecto principal la presente divulgacion se refiere a un metodo de identificar el fenotipo Vel de un individuo, dicho metodo comprende distinguir entre fenotipos Vel positivo y Vel negativo por analisis en una muestra biologica de dicho individuo la composicion del gen SMIM1, en donde al menos un gen SMIM1 intacto es indicativo de un fenotipo Vel positivo, y en donde un gen SMIM1 que comprende una mutacion resultante en expresion de protema abolida, o en expresion de una protema no funcional, es indicativo de un fenotipo Vel negativo.

El gen SMIM1 tfpicamente se define por una secuencia polinucleotidica que comprende SEQ ID NO. 1, o una variante de secuencia de la misma. El concepto gen SMIM1 puede, sin embargo, comprender tambien elementos reguladores naturales tal como, pero no limitados a, promotores y potenciadores.

En un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo de deteccion y/o cuantificacion de una variante de ayuste de SMIM1 en una muestra, el metodo comprende hacer ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero (ARNm) en la muestra, amplificar el ADNc entero o las partes correspondientes al gen SMIM1, tal como SEQ iD NO. 3, 4, 35 o 36, o partes de las mismas y detectar y cuantificar el ADNc amplificado para detectar o cuantificar la variante de ayuste.

En un aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo de identificar un individuo Vel positivo, que comprende las etapas: a) realizar la amplificacion de un polinucleotido del sujeto poniendo en contacto un polinucleotido de una celula del sujeto con un cebador oligonucleotidico que tiene una secuencia que es complementaria a al menos 10 nucleotidos consecutivos de un polinucleotido que codifica el antigeno Vel;

b) detectar un amplicon de la etapa (a), mediante lo cual la deteccion del amplicon identifica el sujeto como un individuo Vel positivo.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo de identificar un individuo Vel negativo, que comprende las etapas:

a) realizar la amplificacion de un polinucleotido del sujeto poniendo en contacto un polinucleotido de una celula del sujeto con un cebador oligonucleotidico que tiene una secuencia que es complementaria a al menos 10 nucleotidos consecutivos de un polinucleotido que codifica el antigeno Vel;

b) detectar un amplicon de la etapa (a), mediante lo cual la deteccion del amplicon identifica el sujeto como un individuo Vel negativo.

En otro aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de detectar en una muestra, una celula que expresa un antigeno Vel que comprende detectar en la muestra un polinucleotido que codifica un antfgeno Vel.

El gen SMIM1 que tfpicamente comprende SEQ ID NO. 1 o una variante de secuencia de la misma codifica un polipéptido que se asocia con el antigeno Vel.

La expresion del antigeno del grupo sangumeo Vel en GR depende de la expresion del gen SMIM1, cuyo ARNm codifica una protema transmembrana de tipo 1. El fenotipo Vel negativo se produce cuando esta protema no se puede expresar, por ejemplo, debido a la delecion de 17 pares de bases.

Hasta ahora, la unica manera de identificar individuos Vel negativo ha sido por ensayos de fenotipado celulares que implican antisuero de pacientes inmunizados, cuyo suministro esta severamente limitado. En contraste, el ensayo genetico del presente metodo se puede realizar en numeros virtualmente ilimitados de individuos a bajo coste, lo que permite el cribado de grandes poblaciones de donantes de sangre para identificar mas donantes Vel negativos y facilitar la obtencion de unidades de sangre Vel negativas para pacientes en necesidad.

Por tanto, en un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo para transfusion sangumea que comprende las etapas:

a) aplicar el metodo de distincion entre pacientes Vel negativos y Vel positivos definido en el presente documento; b) elegir de un banco de donantes o sangre i) sangre Vel positiva si el metodo de a) determina que el paciente es Vel positivo, o ii) sangre Vel negativa si el metodo de a) determina que el paciente es Vel negativo;

c) transfundir el paciente con la sangre elegida en b).

En un aspecto de la presente divulgacion, el metodo para la transfusion de sangre es aplicable a un metodo de tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con eritrocitos, tal como, pero no limitado a anemia.

Las mujeres embarazas Vel negativas (madres) pueden portar fetos Vel positivos. Cuando eritrocitos del feto Vel positivo se transfieren a la madre Vel negativa, esto puede producir una respuesta inmunitaria de la madre, generando de esta manera anticuerpos anti-Vel contra los eritrocitos Vel positivos. Esto es potencialmente letal para el feto, especialmente durante un segundo o posterior embarazo de la mujer Vel negativa. Segun esto, en un aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de tratamiento profilactico de una mujer embarazada Vel negativa que comprende:

a) identificar un individuo Vel negativo aplicando el metodo definido en el presente documento anteriormente, y b) administrar a dicha mujer embarazada Vel negativa una cantidad terapeuticamente eficaz de un anticuerpo anti-Vel, neutralizando de esta manera los eritrocitos Vel positivos originarios del feto Vel positivo portado por dicha mujer embarazada Vel negativa.

La base para el metodo de la presente divulgacion es el descubrimiento por los presentes inventores de la base molecular que distingue individuos Vel negativos y Vel positivos, respectivamente. Segun esto, en un aspecto importante, la presente divulgacion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de SEQ ID NO. 1, o un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de una secuencia que es complementaria a dicha SEQ ID NO. 1, en donde la variante de secuencia comprende al menos una mutacion o polimorfismo, y en donde la mutacion o polimorfismo produce transcripcion y/o traduccion de protema abolida y/o ausencia de la protema en la superficie celular.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de SEQ ID NO. 1, o un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de una secuencia que es complementaria a dicha SEQ ID NO. 1, en donde la variante de secuencia comprende al menos una mutacion o polimorfismo, en donde la mutacion o polimorfismo produce traduccion de un antigeno Vel que tiene un epftopo alterado, en donde el epftopo alterado no es reconocido por anticuerpos anti-Vel.

Los presentes inventores han desarrollado herramientas para realizar los analisis necesarios para distinguir de forma apropiada entre muestras Vel positivas y Vel negativas. Una de tales herramientas importantes incluye cebadores oligonucleotfdicos para la produccion de un amplicon que se puede detectar, por ejemplo, mediante electroforesis en gel. En un aspecto semejante, la presente divulgacion se refiere a un oligonucleotido aislado que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23, asf como el uso de dicho oligonucleotido aislado en el metodo definido en el presente documento.

Los inventores han identificado que el antigeno Vel es dependiente de y, por tanto, esta representado por el polipéptido que tiene SEQ ID NO. 5 o una variante de secuencia o un fragmento de la misma. El polipéptido es una herramienta util en los metodos de la presente divulgacion. Segun esto, en un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un polipéptido aislado que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 5, o un fragmento o una variante de la misma, en donde dicho fragmento comprende al menos 20 residuos de aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO. 5, y en donde dicha variante es al menos el 80% identica a SEQ ID NO. 5, y en donde dicha variante comprende al menos un residuo de serina y/o treonina, y en donde al menos un residuo de serina y/o treonina de dicha SEQ ID NO. 5 o dicho fragmento o variante de la misma, esta O-glucosilado.

Fragmentos polipeptfdicos importantes que definen el antfgeno Vel son fragmentos de SEQ ID NO. 5. Por tanto, en un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un péptido aislado que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 y 10.

Un polinucleotido aislado, que codifica tras la expresion un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 y 10 tambien es un aspecto de la presente divulgacion.

Los presentes inventores han generado anticuerpos capaces de reconocer los fragmentos peptfdicos definidos anteriormente. Segun esto, en un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo capaz de reconocer un epftopo de un antfgeno Vel, en donde el epftopo se define por una secuencia peptfdica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 y 10, o una secuencia peptfdica O-glucosilada seleccionada de SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 y 10.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un anticuerpo capaz de reconocer un epftopo de un antfgeno Vel, en donde el epftopo se define por un péptido que tiene la SEQ ID NO. 5, o un fragmento o variante de la misma, en donde la variante es al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 85%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 98%, tal como al menos el 99% identica a dicha SEQ ID NO. 5, o una variante O-glucosilada de SEQ ID NO. 5, tal como al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 85%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 98%, tal como al menos el 99% identica a una variante O-glucosilada de SEQ ID NO. 5.

Ademas, la presente divulgacion tambien se refiere a un metodo de hacer un anticuerpo policlonal, el metodo comprende:

a) inmunizar un mamfero con el polipéptido o péptido como se ha definido en el presente documento anteriormente, en condiciones para provocar una respuesta de anticuerpos;

b) aislar anticuerpos de dicho mairftfero;

c) cribar los anticuerpos aislados con el polipéptido o fragmento polipeptfdico identificando de esta manera un anticuerpo policlonal que se une espedficamente al polipéptido o fragmento polipeptfdico de la etapa a).

En un aspecto adicional la divulgacion se refiere a un metodo de hacer un anticuerpo monoclonal, el metodo comprende:

b) i) aislar celulas que producen anticuerpos del mairftfero, o ii) clonar la secuencia codificante del anticuerpo y expresarla en otras celulas haciendolas celulas productoras de anticuerpo;

c) fusionar las celulas productoras de anticuerpo con celulas inmortalizadas en cultivo para formar celulas de hibridoma productoras de anticuerpo monoclonal;

d) cultivar las celulas de hibridoma;

e) aislar del cultivo anticuerpos monoclonales que se unen espedficamente al polipéptido o fragmento polipeptfdico de la etapa a).

Esta dentro del ambito de la presente divulgacion proporcionar herramientas faciles de usar tal como kits, adecuadas para distinguir entre muestras de individuos Vel negativos y Vel positivos.

En otro aspecto semejante la divulgacion se refiere a un kit para detectar un antigeno Vel y/o distinguir entre muestras de individuos Vel negativos y Vel positivos, dicho kit comprende al menos dos cebadores oligonucleotfdicos aislados seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23.

En una forma de realizacion la presente divulgacion se refiere a un oligonucleotido que es complementary a los cebadores oligonucleotidicos definidos anteriormente en el presente documento, en donde dicho cebador oligonucleotidico es un cebador oligonucleotidico que es complementary a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, el cebador oligonucleotidico es un cebador directo de un cebador oligonucleotfdico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23.

En otra forma de realizacion de la presente divulgacion, el cebador oligonucleotfdico es un cebador inverso de un cebador oligonucleotfdico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23.

En otra forma de realizacion de la presente divulgacion, el cebador oligonucleotfdico es un cebador sentido de un cebador oligonucleotfdico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23.

En otra forma de realizacion de la presente divulgacion, el cebador oligonucleotfdico es un cebador antisentido de un cebador oligonucleotfdico seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23.

La presente divulgacion es adecuada para adaptacion a escala de alto rendimiento aplicando oligonucleotidos, péptidos o anticuerpos a una superficie, formando de esta manera un dispositivo para detectar antfgenos Vel o moleculas asociadas a antfgenos Vel.

En un aspecto semejante la presente divulgacion se refiere a un kit que comprende una matriz de microchip que comprende uno o mas polinucleotidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 32, 33, 34, 35 y 36 o uno o mas fragmentos de dicho polinucleotido.

En otro aspecto semejante la divulgacion se refiere a un kit que comprende una matriz de microchip que comprende uno o mas péptidos o polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO. 5, 6, 7, 8, 9 y 10, o uno o mas fragmentos de dicho péptido o polipéptido en donde dicho fragmento comprende al menos 5 aminoacidos consecutivos de dicha SEQ ID NO. 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

Para ciertos fines, tal como aplicaciones de citologfa incluyendo, pero no limitadas a inmunohematology y deteccion de anticuerpos, puede ser util proporcionar celulas que presenten un antfgeno Vel. Por tanto, en un aspecto, la divulgacion se refiere a un kit que comprende celulas que presentan un antfgeno Vel.

En un aspecto adicional, la presente divulgacion se refiere al uso de un polinucleotido aislado, que tras expresion codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 5, o un fragmento o variante de la misma, como un medicamento o como un marcador diagnostico.

Descripcion de los dibujos

Figura 1: Organizacion genomica de SMIM1. Los exones se muestran como cajas mientras que la secuencia intronica se representa como una lmea. El gris oscuro representa exones no codificantes, excepto para el exon alternativo 1 (marcado exon 1a en la figura) que esta en gris claro; el negro representa el marco abierto de lectura. Las posiciones de los cebadores de amplificacion del ADN genomico se muestran mediante las flechas.

Figura 2. PCR-RFLP del exon 3 de SMIM1 usando StyI. El amplicon de tipo salvaje se digiere en dos fragmentos; mientras que el amplicon mutado no es digerido por la enzima. Ademas, este amplicon se puede distinguir en el gel por tamano, basado en la diferencia de 17 pb.

Figura 3. PCR espedfica de alelo (ASP) de ADN genomico de individuos determinados por secuenciacion que son w/w, w/m o m/m. La banda control se genera por amplificacion de una region de SMIM1 que abarca la delecion de 17 pb en ausencia de amplificacion espedfica de alelo.

Figura 4. PCR espedfica de gen (GSP). La amplificacion de la region que rodea la delecion de 17 pb permite la determinacion de muestras w/w, w/m y m/m en gel de agarosa al 3% basado solamente en el tamano de la banda.

Figura 5. Cribado de medio rendimiento. Se desarrollo un ensayo para detectar seis polimorfismos de grupo sangumeo clmicamente relevantes para amplificar ADN directamente de sangre completa. Estos alelos se diferencian por el tamano del amplicon y se pueden identificar facilmente mediante electroforesis en gel (mostrado aqm) o por analisis de fragmentos usando sondas marcadas (datos no mostrados). Los cebadores que amplifican SMlMl de tipo salvaje se han incorporado en el ensayo y el ADN de individuos Vel- no es amplificado por los cebadores de SMIM1 como se indica en el carril 4.

Figura 6. El panel A es una inmunotransferencia que muestra la capacidad de distinguir el antigeno Vel muy espedfica del anti-péptido 1 de conejo (péptido 1 = SEQ ID NO. 6). El panel B muestra la misma membrana lavada y vuelta a ensayar con anti-GAPDH como un control de carga. Las muestras Vel positivas son homocigotos genotipicamente de tipo salvaje; las muestras Vel negativas con homocigotos genotfpicamente mutantes. La muestra Vel debilmente positiva (W) era un heterocigoto de tipo salvaje/mutante genotipicamente determinado que expresa SMIM1 debilmente.

Figura 7. Analisis de citometna de flujo del antfgeno Vel con anti-Vel policlonal humano. 7a: Histograma que muestra la variacion natural en la expresion del antfgeno Vel en GR normales homocigotos para SMIM1 de tipo salvaje. Las lmeas negras representan diferentes ejemplos de GR Vel positivos (marcados AK1, AK8, AK10, A K il) , ensayados con anti-Vel, seguido por un anti-IgG humana marcado con FITC (2° anticuerpo). Los histogramas sombreados indican reactividad de los GR AK1 ensayados con anti-IgG humana solo (izquierda), y con anti-Vel (derecha). 7b: Figura para mostrar la influencia de la cigosidad de SMIM1 en la expresion del antfgeno Vel. 7c: La sobreexpresion de SMIM1 (denominado LOC aqm) en celulas K562 demostro fuerte expresion de antfgeno Vel comparada con las construcciones transfectadas vacfa (control) y mutante (Vel negativo). El eje y muestra el numero relativo de celulas Vel positivas, donde el porcentaje de celulas positivas en el control se ajusto a 1.

Figura 8. Vision general de sangre negativa para antfgeno de alta incidencia solicitada durante el periodo de 2005 a 2010 del Programa Americano de Donantes Raros. La barra de sangre Vel negativa esta encerrada por claridad. La sangre Vel negativa es el tipo de sangre mas frecuentemente solicitado negativo para un grupo sangumeo huerfano, es decir, donde la determinacion, seleccion y confirmacion no se puede hacer por metodos basados en acidos nucleicos.

Figura 9. Resultados de la atenuacion genica de SMIM1 en la lmea celular HEL que expresa establemente SMIM1.

9a muestra la expresion relativa de ARNm despues de la transduccion de celulas HEL con controles de transduccion (HEL wt y -ve) y con el ARNhc clon G a una MOI (multiplicidad de infeccion) de 0,5 U (G0,5-M). La figura 9b muestra la inmunotransferencia con el anti-SMIM1 de conejo policlonal de celulas HEL despues de la transduccion con un control de transduccion (HEL wt), y con ARNhc clon G a una MOI de 0,5 U, 1,0 U, 2,0 U, 3,0 U, 4,0 U. La atenuacion tanto del transcrito de ARNm como de protema se demuestra claramente.

Descripcion detallada

La invencion se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier forma de realizacion que no este en el ambito de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invencion.

Gen SMIM1

El antfgeno del grupo sangumeo Vel esta localizado en los globulos rojos (GR) y es uno de los varios denominados antfgenos de grupo sangumeo huerfanos para los que la base molecular es desconocida. Es clmicamente importante y por tanto la identificacion de la molecula portadora permitina el desarrollo de un ensayo de cribado para identificar donantes de sangre apropiados para la donacion para pacientes Vel negativo/negativo inmunizados, y tambien para pacientes en riesgo de producir un anticuerpo indeseado.

Los presentes inventores proporcionaron entendimiento de la base molecular y genetica del antfgeno del grupo sangumeo Vel. Esto se ha alcanzado mediante una gama de investigaciones serologicas y bioqmmicas, incluyendo investigaciones de genes candidatos. Estas investigaciones produjeron estimaciones del tamano de la protema del globulo rojo que lleva el antfgeno Vel y una posible configuracion de homodfmero.

Una hipotesis de que el gen que codifica el antfgeno del grupo sangumeo Vel podna potencialmente triangularse a traves cribado genomico del genoma entero usando micromatrices de polimorfismo de nucleotido unico (SNP) se baso en tres observaciones:

(a) se cree que el genotipo Vel negativo es mas comun en Suecia (1:1700, comparado con aprox. 1:4000 en otras poblaciones),

(b) el fenotipo Vel negativo se hereda de una manera aparentemente autosomica recesiva, y

(c) el gen que codifica el antfgeno Vel, como varios otros genes de grupos sangumeos, se podna expresar preferentemente en eritrocitos.

En conjunto, estas observaciones hicieron a los inventores sugerir que el fenotipo Vel negativo podna estar causado por una unica mutacion fundadora en la poblacion sueca, en cuyo caso un cribado genetico de todo el genoma podna tener exito a pesar del numero relativamente limitado de muestras de ADN de individuos Vel negativos disponibles.

Segun esto, se recogieron perfiles SNP en todo el genoma de donantes Vel negativos usando micromatrices Illumina Human Omni 2.5M-Quad. Usando una estrategia computacional concebida y ejecutada en colaboracion por los presentes inventores, se identifico una region en el cromosoma 1 que contiene 5 genes.

Despues de la revision de las caractensticas de estos genes, se determino que SMIM1 era el mas prometedor porque:

(a) su estructura predicha correspondfa a una protema transmembrana,

(b) su tamano predicho coincid^a con las estimaciones de tamano de los estudios bioqmmicos anteriores del inventor, y

(c) los analisis de datos de micromatrices de expresion genica preexistentes recuperados de bases de datos publicas indicaban que se expresaba preferentemente en precursores de globulos rojos.

Con esta informacion en mano, los inventores determinaron la secuencia de ADN de SMIM1 en donantes Vel negativos y encontraron una delecion de 17 pares de bases que se predice que destruye el dominio transmembrana de la protema, proporcionando suficiente explicacion para un denominado fenotipo nulo o inactivado.

Estudios geneticos posteriores han identificado la misma delecion exacta de 17 pares de bases en todos los 36 mutantes Vel negativos de Suecia, RU y los EE UU ensayados hasta la fecha, lo que sugiere que es en efecto la causa predominante del fenotipo Vel negativo. Esto ha sentado las bases para la identificacion de donantes de sangre Vel negativos por ensayo genetico.

La base para el metodo de la presente divulgacion es el descubrimiento por los presentes inventores de la base molecular que distingue individuos Vel negativos y Vel positivos, respectivamente. Segun esto, en un aspecto importante, la presente divulgacion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de SEQ ID NO. 1, o un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de una secuencia que es complementaria a dicha SEQ ID NO. 1, en donde la variante de secuencia comprende al menos una mutacion sin sentido, y en donde la mutacion sin sentido produce transcripcion y/o traduccion de protema abolida, lo que produce de esta manera la ausencia de la protema en la superficie celular.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion la mutacion sin sentido es una delecion, tal como una delecion de entre 1 y 100 nucleotidos, tal como entre 2 y 90 nucleotidos, tal como entre 3 y 80 nucleotidos, tal como entre 4 y 70 nucleotidos, tal como entre 5 y 60 nucleotidos, tal como entre 6 y 50 nucleotidos, tal como entre 7 y 40 nucleotidos, tal como entre 8 y 30 nucleotidos, tal como entre 9 y 25 nucleotidos, tal como entre 10 y 20 nucleotidos, tal como entre 15 y 19 nucleotidos, tal como entre 16 y 18 nucleotidos, tal como 17 nucleotidos.

En una forma de realizacion importante de la presente divulgacion, la delecion es una delecion de 17 nucleotidos.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, la variante de secuencia del nucleotido anteriormente definido es entre el 60% y el 99,9% identica, tal como entre el 70% y el 99,8% identica, tal como entre el 80% y el 99,7% identica, tal como entre el 90% y el 99,8% identica, tal como entre el 95% y el 99,56% identica, tal como entre el 96% y el 99,55% identica, tal como entre el 97% y el 99,54% identica, tal como entre el 98% y el 99,9% identica, tal como al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 96%, tal como al menos el 97%, tal como al menos el 98%, tal como al menos el 99%, tal como al menos el 99,1, al menos el 99,9%, tal como el 100% identica a SEQ ID NO. 1 o una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO. 1 o una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO. 1.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, la variante de secuencia del polinucleotido aislado anterior tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 2 y 4 o una secuencia que es complementaria a SEQ ID No. 2 o 4.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, el polinucleotido aislado tiene la secuencia de SEQ ID NO.

31, y en otra forma de realizacion de la presente divulgacion el polinucleotido aislado comprende la secuencia de SEQ ID NO. 31.

Herramientas para amplificar SMIM1

Los presentes inventores han desarrollado herramientas para realizar los analisis necesarios para distinguir de forma apropiada entre muestras Vel positivas y Vel negativas, metodos que se describen a continuacion en el presente documento. Una herramienta importante util en dichos metodos incluye cebadores oligonucleotidicos para la produccion de un amplicon (una secuencia polinucleotidica amplificada) que se puede detectar por metodos convencionales, por ejemplo, electroforesis en gel. En un aspecto semejante, la presente divulgacion se refiere a un oligonucleotido aislado que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23, asf como el uso de dicho oligonucleotido aislado en el metodo definido en el presente documento.

Métodos para la distincion Vel negativo/Vel positivo

El descubrimiento de la delecion de 17 pb descrita en el presente documento anteriormente es clmicamente muy importante ya que la unica manera para identificar donantes de sangre Vel negativos antes de la fecha de prioridad de la presente solicitud han sido ensayos de fenotipado celulares basados en suero o plasma de pacientes inmunizados, cuyo suministro y calidad estan gravemente limitados.

En contraste, el ensayo genetico se puede realizar en numeros virtualmente ilimitados de pacientes a bajo coste, lo que permite el cribado de grandes poblaciones de donantes de sangre para identificar mas donantes Vel negativos y facilitar la obtencion de unidades de sangre Vel negativa para pacientes en necesidad.

Es un objeto global de la presente divulgacion proporcionar un metodo que comprende:

a) detectar un alelo que comprende una variacion en el gen SMIM1;

b) determinar si la variacion de a) es homocigota o heterocigota;

c) determinar si la variacion de a) y b) es Vel negativa o Vel positiva.

El analisis se puede realizar usando cualquier metodo adecuado conocido por los expertos en la materia. Los ejemplos no limitantes de metodos adecuados incluyen electroforesis en gel, PCR en tiempo real, espectrometna de masas (por ejemplo, MALDI-TOF), extension de oligonucleotido marcado con fluorocromo, amplificacion especifica de secuencia marcada con fluorocromo (por ejemplo, tecnologfa xMAP), secuenciacion incluyendo secuenciacion con terminacion de colorante, y otras tecnicas de secuenciacion de siguiente generacion que incluyen, pero no estan limitadas a, pirosecuenciacion, secuenciacion por ligacion (SOLiD) y secuenciacion de semiconductor Ion Torrent.

Un individuo Vel negativo segun la presente divulgacion tiene un fenotipo Vel negativo. Un individuo Vel positivo segun la presente divulgacion tiene un fenotipo Vel positivo. Segun esto las expresiones individuo Vel negativo y fenotipo Vel negativo se usan de forma intercambiable en el presente documento, cuyo significado es bien conocido para el experto en la materia.

Los metodos proporcionados en la presente divulgacion tienen el fin de caracterizar el fenotipo del antfgeno Vel de un individuo tal como donante de sangre o receptor de sangre (paciente que recibe sangre, por ejemplo, a traves de transfusion). Un fenotipo de antfgeno de grupo sangumeo se define por la presencia o ausencia de antfgenos de grupo sangumeo en la superficie del eritrocito. Los antfgenos de grupo sangumeo son diferencias estructurales unicas, heredadas, encontradas en las protemas, glucoprotemas y glucolfpidos que forman la superficie externa del eritrocito. Todos los antfgenos de grupo sangumeo se han identificado por anticuerpos espedficos presentes en el plasma de diferentes individuos. Con la excepcion de algunos anticuerpos “naturales”, la mayona de los anticuerpos hacia antfgenos de grupo sangumeo se han hecho como respuesta a la introduccion, por ejemplo, mediante transfusion o embarazo, de eritrocitos que portan un antfgeno de grupo sangumeo que esta ausente de los eritrocitos del paciente. Estos anticuerpos persisten en la circulacion y pueden producir secuelas clmicas tal como reaccion a transfusion, o enfermedad hemolftica del recien nacido. Sin embargo, mientras que muchos anticuerpos hacia antfgenos de grupo sangumeo tienen el potencial para producir supervivencia acelerada de eritrocitos y hemolisis, muy pocos anticuerpos hacia antfgenos de grupo sangumeo se encuentran en el marco de transfusion rutinaria.

Se han identificado mas de 300 antfgenos de grupo sangumeo. La mayona de estos se catalogan en uno de los 33 sistemas de grupo sangumeo, segun el componente de membrana del GR en que reside el antfgeno. Los antfgenos que no pertenecen a un sistema de grupo sangumeo se asignan a una de seis colecciones de grupo sangumeo (201 series) o a cualquiera de las 700 series (antfgenos de baja frecuencia) o de las 901 series (antigenos de alta frecuencia) definidas por el Partido de Trabajo en Inmunogenetica de Globulos Rojos y Terminologfa de Grupos Sangumeos de la Sociedad Internacional Para la Transfusion de Sangre (ISTB).

Por tanto, si un individuo se describe como que porta el fenotipo Vel negativo, esto significa que los eritrocitos del individuo carecen del antfgeno del grupo sangumeo Vel. Tambien se puede usar fenotipo para resumir los antfgenos conocidos en los eritrocitos de una persona, por ejemplo, el fenotipo del paciente A era D+C-E+c+e+, K-, Fy(a+b+). Esto significa que los eritrocitos del paciente A expresaban los antfgenos de grupo sangumeo E, c, e, Fya y Fyb, pero no expresaban los antfgenos C o K.

En un aspecto principal, la presente divulgacion se refiere por tanto a un metodo de identificar el fenotipo Vel de un individuo, dicho metodo comprende distinguir entre fenotipos Vel positivo y Vel negativo analizando en una muestra biologica de dicho individuo la composicion del gen SMIM1, en donde al menos un gen SMIM1 intacto es indicativo de un fenotipo Vel positivo, y en donde un gen SMIM1 que comprende una mutacion que produce expresion de protema abolida, o expresion de una protema no funcional, es indicativo de un fenotipo Vel negativo.

La mutacion descrita en el presente documento anteriormente puede ser cualquier mutacion, sin embargo, en una forma de realizacion preferida de la presente divulgacion la mutacion es una delecion, tal como una delecion de SEQ ID NO: 31 del gen SMIM1 de tipo salvaje. La mutacion tambien puede ser un fragmento o variante de dicha SEQ ID NO: 31, en donde dicho fragmento comprende al menos 12 nucleotidos consecutivos de dicha SEQ ID NO: 31, y en donde en dicha variante, no mas de 5 nucleotidos se han alterado a 5 nucleotidos diferentes.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, la mutacion es un SNP, tal como un intercambio de dinucleotido 2907t>c y 2908g>a de SEQ ID NO: 1.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el gen SMIM1 comprende multiples mutaciones tal como una combinacion de dicha delecion y dichos SNP.

Una alteracion heterocigota del SMIM1 produce un fenotipo Vel positivo, aunque ese individuo solo tendna expresion debil de SMIM1. Los fenotipos Vel negativos son por tanto homocigotos para una alteracion en el gen SMIM1.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo segun la presente divulgacion comprende las etapas:

a) proporcionar una muestra,

b) detectar en la muestra un alelo que comprende SMIM1,

c) determinar si la muestra es de un sujeto homocigoto o heterocigoto,

d) determinar si la muestra es de un sujeto con un fenotipo Vel positivo o Vel negativo.

En un aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de determinar el fenotipo del grupo sangumeo Vel de un individuo, dicho metodo comprende distinguir ente fenotipos Vel positivo y Vel negativo analizando en una muestra biologica la composicion de:

a) un gen SMIM1, y/o

b) un transcrito de un gen SMIM1, y/o

c) un polipéptido codificado por un gen SMIM1.

En una forma de realizacion la presente divulgacion se refiere a un metodo de identificar un fenotipo Vel negativo dicho metodo comprende distinguir entre fenotipos Vel positivo y Vel negativo analizando en una muestra biologica la composicion de:

a) un gen SMIM1, y/o

b) un transcrito de un gen SMIM1, y/o

c) un polipéptido codificado por un gen SMIM1.

En otra forma de realizacion la presente divulgacion se refiere a un metodo de identificar un fenotipo Vel positivo dicho metodo comprende distinguir entre fenotipos Vel positivo y Vel negativo analizando en una muestra biologica la composicion de:

a) un gen SMIM1, y/o

b) un transcrito de un gen SMIM1, y/o

c) un polipéptido codificado por un gen SMIM1.

SMIM1 se define tfpicamente por una secuencia polinucleotfdica que comprende SEQ ID NO. 1 o una variante de secuencia de la misma. El concepto gen SMIM1 puede, sin embargo, comprender elementos reguladores naturales tal como, pero no limitados a, promotores y potenciadores.

En un aspecto la presente divulgacion comprende detectar marcadores geneticos asociados a SMIM1 localizados antes o despues de SEQ ID NO. 1 en el genoma. Esto se puede realizar aplicando cualquiera de los metodos de la presente divulgacion donde el metodo de amplificacion se puede realizar:

i) proporcionando una muestra biologica que comprende ADN genomico,

ii) poniendo en contacto la muestra que comprende ADN genomico con un primer y un segundo cebador oligonucleotidico de PCR,

en donde dicho primer cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos localizados antes (5') de la posicion 1 de nucleotido de SEQ ID NO. 1, y

en donde dicho segundo cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos localizados despues (3') de la posicion 3195 de nucleotido de SEQ ID NO. 1,

con la condicion de que dicho primer y dicho segundo cebador no se seleccionen ambos de una secuencia que sea complementaria a SEQ ID NO. 31;

iii) obtener un amplicon;

iv) realizar analisis cualitativo y/o cuantitativo del amplicon de la etapa iii);

comparando la longitud del amplicon, con al menos un control Vel positivo, en donde una longitud que se diferencia del control Vel positivo indica que la muestra es Vel negativa.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el gen SMIM1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una variante de secuencia de la misma en donde la variante de secuencia es entre al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 96%, tal como al menos el 97%, tal como al menos el 98%, tal como al menos el 99%, tal como entre el 99,1 y el 99,9%, tal como entre el 99,4 y el 99,6%, tal como el 100% identica a SEQ ID NO. 1 o una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO. 1.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el gen SMIM1 comprende la secuencia que es complementaria a SEQ ID NO: 1 o una variante de secuencia de la misma en donde la variante de secuencia es entre al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 96%, tal como al menos el 97%, tal como al menos el 98%, tal como al menos el 99%, tal como entre el 99,1 y el 99,9%, tal como entre el 99,4 y el 99,6%, tal como el 100% identica a la secuencia que es complementaria a SEQ ID NO. 1.

El metodo de la presente divulgacion se puede aplicar en principio a cualquier material genetico que se origina de cualquier organismo, sin embargo, la presente divulgacion es particularmente util para detectar sangre Vel negativa. Por tanto, en una forma de realizacion el metodo de la presente divulgacion es para la deteccion de sangre Vel negativa.

En una forma de realizacion el metodo de la presente divulgacion es para la deteccion o identificacion de un sujeto Vel negativo tal como un ser humano.

La delecion de 17 pb en el exon 3 de SMIM1 produce que la mayona de los individuos Vel negativos porten un gen SMIM1 que comprende SEQ ID NO. 2 mas que SEQ ID No . 1 que es el caso para individuos Vel positivos ensayados.

Por tanto, en una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo para distinguir entre muestras, o individuos, Vel negativas y Vel positivas, analizando la composicion de SMIM1 comprende identificar sujetos cuyo genoma comprende SEQ ID NO. 1, dichos sujetos son Vel positivos, y sujetos cuyo genoma comprende SEQ ID NO. 2, o un fragmento o variante de la misma, en donde la variante es al menos el 90% identica a dicha SEQ ID NO. 2, dichos sujetos son Vel negativos.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo para distinguir entre muestras, o individuos, Vel negativas y Vel positivas, analizando la composicion de SMIM1 comprende identificar sujetos cuyo genoma comprende SEQ ID NO. 1, 3 o 35, dichos sujetos son Vel positivos, y sujetos cuyo genoma comprende SEQ ID NO. 2, 32, 33, 34 o 36, o un fragmento o variante de las mismas, en donde la variante es al menos el 90% identica a dicha SEQ ID NO.

2, 32, 33, 34 o 36, dichos sujetos son Vel negativos.

Antes de la fecha de prioridad de la presente solicitud, la unica manera conocida para identificar donantes de sangre Vel negativa era por ensayos de fenotipado celulares basados en suero o plasma de pacientes inmunizados, cuyo suministro esta gravemente limitado. Por contraste, el ensayo genetico del presente metodo se puede realizar en numeros virtualmente ilimitados de individuos a bajo coste, lo que permite el cribado de grandes poblaciones de donantes de sangre para identificar mas donantes Vel negativos y facilitar la obtencion de unidades de sangre Vel negativa a pacientes en necesidad.

Los metodos de la presente divulgacion se basan en el descubrimiento de los presente inventores de la base molecular para la negatividad de Vel. En principio, cualquier metodo que utilice las diferencias en el codigo de ADN del gen SMIM1 se pueden aplicar a distinguir entre individuos Vel negativos y Vel positivos. Esto tambien incluye preprocesar el ADN genomico (ADNg) antes de realizar el analisis, asf como preparar ADNc a partir de ARNm transcrito.

Segun esto, en una forma de realizacion el metodo de la presente divulgacion que comprende distincion por analisis de la composicion de SMIM1 comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra;

b) preparar ADNc;

c) identificar muestras en donde el ADNc tiene la secuencia de SEQ ID NO. 3 o 35, o un fragmento de las mismas, en donde el fragmento comprende al menos el polinucleotido que tiene la secuencia de SEQ ID NO.31; d) identificar las muestras en donde el ADNc se diferencia del ADNc de SEQ ID NO. 3 o 35 en al menos un nucleotido; e) comparar c) y d),

en donde la muestra de c) es de un sujeto Vel positivo, y

en donde la muestra de d) es de un sujeto Vel negativo.

En otra forma de realizacion el metodo de la presente divulgacion comprende:

a) proporcionar una muestra biologica que comprende un polinucleotido de SMIM1,

b) amplificar al menos un fragmento del polinucleotido de SMIM1, en donde el polinucleotido de SMIM1 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, y 36 o un fragmento o variante de las mismas en donde la variante es al menos el 90% identica a dicha secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, y 36,

c) obtener un amplicon,

d) analizar la longitud de amplicon, y

e) distinguir entre fragmentos de polinucleotidos Vel negativos y Vel positivos amplificados basado en la longitud del polinucleotido.

Esta dentro del ambito de la presente divulgacion aplicar los metodos anteriormente mencionados a cualquier polinucleotido de SMIM1 o relacionado con SMIM1 tal como un polinucleotido que es al menos el 50% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 55% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, y 36, por ejemplo, al menos el 60% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 65% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 70% identico a dicha SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 75% identico a dicha SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 80% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 81% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 82% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 83% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 84% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 85% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 86% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 87% identico a dicha SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 88% identico a dicha SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 89% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 90% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 91% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 92% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 93% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 94% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 95% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 96% identico a dicha SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 97% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 98% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, al menos el 99% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, tal como el 100% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36.

Tambien esta dentro del ambito de la presente divulgacion aplicar los metodos anteriores a cualquier polinucleotido que sea complementario a un polinucleotido de SMIM1 o relacionado con SMIM1 tal como un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 50% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 55% identico a dicha SEQ ID No .1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, y 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 60% identico a dicha SEQ ID n O. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 65% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 70% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 75% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 80% identico a dicha s Eq ID n O. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 81% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 82% identico a dicha SEQ ID No . 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 83% identico a dicha SEQ ID No .1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 84% identico a dicha SEQ ID n O. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 85% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 86% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 87% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 88% identico a dicha s Eq ID n O. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 89% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 90% identico a dicha SEQ ID No . 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 91% identico a dicha SEQ ID No .1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 92% identico a dicha SEQ ID n O. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 93% identico a dicha SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 94% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 95% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementary a un polinucleotido que es al menos el 96% identico a dicha s Eq ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que es al menos el 97% identico a dicha SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementary a un polinucleotido que es al menos el 98% identico a dicha SEQ ID No . 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementary a un polinucleotido que es al menos el 99% identico a dicha SEQ ID No . 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, o 36, por ejemplo, un polinucleotido que es complementario a un polinucleotido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35, y 36.

El metodo de distinguir entre individuos Vel negativos y Vel positivos como se ha esbozado anteriormente puede utilizar cualquier herramienta adecuada o metodo conocido en la tecnica, herramienta o metodo que sea adecuado para analizar biomoleculas tal como ADN, ARN y protemas. En una forma de realizacion de la presente divulgacion, el metodo usado para analizar la composicion de SMIM1 de un individuo o una muestra se lleva a cabo mediante un proceso que se puede seleccionar del grupo que consiste en: PCR espedfica de gen, PCR espedfica de alelo, PCR-RFLP, hibridacion de sonda espedfica de alelo, extension de cebador espedfico de alelo, amplificacion espedfica de alelo, secuenciacion, digestion con 5' nucleasa, ensayo de balizas moleculares, ensayo de ligacion de oligonucleotidos, analisis de tamano, y polimorfismo de conformacion de cadena sencilla.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo para distinguir muestras o individuos Vel positivos y Vel negativos es PCR espedfica de gen.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo de PCR espedfica de gen comprende las etapas de:

i) proporcionar una muestra biologica,

ii) amplificar un polinucleotido de SMIM1 aplicando un primer y un segundo cebador oligonucleotidico, obteniendo asf un amplicon,

iii) realizar analisis cualitativo y/o cuantitativo del amplicon de SMIM1 obtenido en la etapa ii), y

iv) comparar la longitud del amplicon, con al menos un control Vel positivo, en donde una longitud que se diferencia del control Vel positivo indica que la muestra es de un sujeto Vel negativo.

Cualquier par de cebadores oligonucleotidicos adecuados capaces de hibridar con el polinucleotido diana estan dentro del ambito de la presente divulgacion.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, el primer cebador oligonucleotidico es al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, mas preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 96%, mas preferiblemente al menos el 97% identico, mas preferiblemente al menos el 98% identico, mas preferiblemente al menos el 99%, mas preferiblemente el menos el 100% identico a SEQ ID NO: 22 (LOCex3f_screen),

y el segundo cebador oligonucleotidico es al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, mas preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 96%, mas preferiblemente al menos el 97% identico, mas preferiblemente al menos el 98% identico, mas preferiblemente al menos el 99%, mas preferiblemente el menos el 100% identico a SEQ ID NO: 23 (LOCex3r_screen). En condiciones de hibridacion muy rigurosas, dicho primer y dicho segundo cebador oligonucleotidico son capaces de hibridar con dicho polinucleotido de SMIM1.

En otra forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo para distinguir muestras o individuos Vel positivos y Vel negativos es por PCR espedfica de alelo.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo de PCR espedfica de alelo comprende las etapas de:

i) proporcionar una muestra biologica,

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, los cebadores oligonucleotidicos del anterior metodo de PCR espedfica de alelo, se seleccionan del grupo que consiste en cebadores oligonucleotidicos que son al menos el 80%, preferiblemente el menos el 90%, mas preferiblemente el menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 96%, mas preferiblemente al menos el 97% identicos, mas preferiblemente al menos el 98% identicos, mas preferiblemente al menos el 99%, mas preferiblemente al menos el 100% identicos a SEQ ID NO: 15 (388588int2f), SEQ ID NO: 19 (388588int3R2), SEQ ID NO. 20 (388588wtex3f), y SEQ ID NO. 21 (388588mutex3f), en donde, en condiciones de hibridacion muy rigurosas, dichos cebadores oligonucleotidicos son capaces de hibridar con dicho polinucleotido de SMIM1.

En otra forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo para distinguir muestras o individuos Vel positivos y Vel negativos es por PCR-RFLP de alelo.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo de PCR-RFLP espedfica de gen comprende las etapas de:

i) amplificar un polinucleotido de SMIM1 aplicando al menos dos cebadores oligonucleotfdicos,

ii) digerir el amplicon de la etapa i) mediante una enzima de restriccion,

iii) realizar analisis cualitativo y/o cuantitativo del amplicon digerido de la etapa ii), y

iv) comparar la longitud del amplicon(es) digerido(s), con al menos un control Vel positivo, en donde una longitud que se diferencia del control Vel positivo indica que la muestra es de un sujeto Vel negativo.

Se puede usar cualquier restriccion adecuada. En una forma de realizacion de la presente divulgacion la enzima de restriccion es Styl.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, los cebadores oligonucleotfdicos del anterior metodo de PCR-RFLP, el primer cebador oligonucleotfdico es al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, mas preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 96%, mas preferiblemente al menos el 97% identico, mas preferiblemente al menos el 98% identico, mas preferiblemente al menos el 99%, mas preferiblemente el menos el 100% identico a SEQ ID NO: 15 (388588int2f), y el segundo cebador oligonucleotfdico es al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90%, mas preferiblemente al menos el 95%, mas preferiblemente al menos el 96%, mas preferiblemente al menos el 97% identico, mas preferiblemente al menos el 98% identico, mas preferiblemente al menos el 99%, mas preferiblemente el menos el 100% identico a SEQ ID NO: 19 (388588int3R2). En condiciones de hibridacion muy rigurosas, dicho primer y dicho segundo cebador oligonucleotfdico son capaces de hibridar con dicho polinucleotido de SMIM1.

Como se ha mencionado en el presente documento anteriormente, el metodo de la presente divulgacion se basa en la distincion molecular entre individuos Vel negativos y Vel positivos o muestras de tales individuos. Por tanto, en una forma de realizacion el metodo de la presente divulgacion comprende las etapas:

i) proporcionar una muestra biologica que comprende ADN genomico,

ii) poner en contacto la muestra que comprende ADN genomico con un primer y un segundo cebador oligonucleotidico de PCR,

en donde dicho primer cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia identificada como SEQ ID NO. 1 y localizados antes (5') del nucleotido en posicion 2667 de SEQ ID NO. 1, y

en donde dicho segundo cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia identificada como SEQ ID No .1 y localizados despues (3') del nucleotido en posicion 2649 de SEQ ID NO. 1,

iii) obtener un amplicon;

v) comparar la longitud del amplicon, con al menos un control Vel positivo, en donde una longitud que se diferencia del control Vel positivo indica que la muestra es Vel negativa.

El analisis cualitativo y/o cuantitativo realizado en el metodo de la presente divulgacion se puede hacer por cualquier herramienta adecuada o metodo conocido por los expertos en la materia.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el analisis cualitativo y/o cuantitativo se realiza por electroforesis en gel.

El control de referencia usado en el metodo de la presente divulgacion puede ser cualquier marcador molecular adecuado, tal como un marcador molecular basado en Mw. En una forma de realizacion de la presente divulgacion, el control de referencia es una composicion de referencia de polinucleotido que comprende uno o mas polinucleotidos seleccionados de polinucleotidos que consisten en 161 y 178 nucleotidos. En una forma de realizacion de la presente divulgacion el control Vel positivo es un polinucleotido que comprende el exon 3 (SEQ ID NO. 30) de SMIM1.

Es un objeto de la presente divulgacion amplificar parte del gen SMIM1 de un individuo Vel negativo, parte que comprende una mutacion sin sentido que produce un antfgeno Vel no funcional. Esto significa que el tamano del amplicon puede variar dependiendo de como se seleccionan los cebadores oligonucleotidicos. En una forma de realizacion de la presente divulgacion el material genetico amplificado (amplicon) tiene entre aproximadamente 5 y aproximadamente 4000 nucleotidos de longitud, tal como entre 10 y 100 nucleotidos de longitud, por ejemplo, 17 nucleotidos de longitud.

En un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo de deteccion y/o cuantificacion de una variante de ayuste de SMIM1 en una muestra, el metodo comprende hacer ADN complementary (ADNc) a partir de ARN mensajero (ARNm) en la muestra, amplificar el ADNc entero o porciones correspondientes al gen sM lM I, tal como SEQ iD NO. 3 o 4, o partes del mismo y detectar y cuantificar el ADNc amplificado para detectar o cuantificar la variante de ayuste.

En un aspecto, la divulgacion se refiere a un metodo de identificar un sujeto que presenta un antigeno Vel, que comprende las etapas:

a) realizar amplificacion de un polinucleotido del sujeto poniendo en contacto un polinucleotido de una celula del sujeto con un cebador oligonucleotidico que tiene una secuencia que es complementaria a al menos 10 nucleotidos consecutivos de un polinucleotido que codifica el antfgeno Vel;

b) detectar el amplicon de la etapa (a), mediante lo cual la deteccion de un amplicon identifica el sujeto como un antfgeno Vel.

En otro aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de detectar en una muestra una celula que expresa un antfgeno Vel, que comprende la deteccion en la muestra de un polinucleotido que codifica un antfgeno Vel.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el metodo de deteccion y/o cuantificacion de una variante de ayuste de SMIM1 en una muestra, comprende hacer ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero (ARNm) en la muestra, amplificar porciones del ADNc correspondientes al gen SMIM1 o partes del mismo y detectar y cuantificar el ADNc amplificado para detectar o cuantificar la variante de ayuste.

Los presentes inventores han generado datos que caracterizan adicionalmente la protema codificada por el gen SMIM1 (LOC388588) asf como la distribucion demografica de la mutacion que produce el fenotipo Vel negativo. Hasta ahora, no se han encontrado homologos genicos a la protema Vel humana. Sin embargo, el gen parece estar evolutivamente conservado ya que tiene homologos ortologos en otras especies, de primates a pez cebra.

El gen SMIM1 que tfpicamente comprende SEQ ID NO. 1 o un fragmento o variante de secuencia de la misma, codifica un polipéptido que se asocia con el antfgeno Vel. La expresion del antfgeno del grupo sangumeo Vel en globulos rojos depende de la expresion del gen SMIM1, cuyo ARNm codifica una protema transmembrana de tipo 1. El fenotipo Vel negativo se produce cuando esta protema no se puede expresar, por ejemplo, debido a la delecion de 17 pb. Mientras que un aspecto principal de la presente divulgacion es evitar metodos serologicos tradicionales laboriosos y caros para identificar muestras o individuos Vel negativos, el descubrimiento de los presentes inventores de la relacion entre SMIM1 y el antfgeno Vel proporciona un numero de aplicaciones de anticuerpos y celulares que son utiles para, por ejemplo, fines de ensayos in vitro.

El metodo segun la presente divulgacion se puede, en principio, aplicar a cualquier muestra biologica que comprenda material genetico. Por tanto, la muestra puede ser de raspados celulares, un tejido de biopsia o un fluido corporal tal como, pero no limitado a, sangre, medula osea, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, saliva, semen, esputo, orina y heces.

Anti'geno Vel y anticuerpos anti-Vel

Los presentes inventores han proporcionado el nexo molecular entre el gen SMIM1 y el antfgeno Vel.

Despues de este descubrimiento, los inventores tambien han disenado y ensayado péptidos correspondientes a la protema putativa y ensayado GR Vel positivos y Vel negativos con anticuerpos de conejo generados hacia estos péptidos. Uno de tal anticuerpo demuestra especificidad exquisita para GR Vel positivos por la tecnica de inmunotransferencia.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion, el anticuerpo que se detecta por dicho metodo es anti-Vel, y el antfgeno es un péptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 5, 6, 7, 8, 9 y 10.

El antfgeno Vel identificado por los presentes inventores esta representado por el polipéptido que tiene SEQ ID NO.

5, o una variante de secuencia o fragmento de la misma. El antfgeno es una herramienta util en los metodos de la presente divulgacion. Segun esto, en un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un polipéptido aislado que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 5, o un fragmento o una variante de la misma, en donde dicho fragmento comprende al menos 20, tal como al menos 25, tal como al menos 30, tal como al menos 35, tal como al menos 40, tal como al menos 45, tal como al menos 50, tal como al menos 55, tal como al menos 60, tal como menos 65, tal como al menos 70, tal como al menos 75 residuos de aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO. 5, y en donde dicha variante es al menos el 80% identica a SEQ ID NO. 5, y en donde dicha variante comprende al menos un residuo de serina y/o treonina, y en donde al menos un residuo de serina y/o treonina de dicha SEQ ID NO. 5 o dicho fragmento o variante de la misma, esta O-glucosilado.

La expresion del antfgeno del grupo sangumeo Vel en globulos rojos depende de la expresion del gen SMIM1, cuyo ARNm codifica una protema transmembrana de tipo 1. El fenotipo Vel negativo se produce cuando esta protema no se puede expresar, por ejemplo, debido a la delecion de 17 pb como se ha discutido anteriormente en el presente documento. Fragmentos polipeptidicos importantes asociado con el antigeno Vel incluyen fragmentos de SEQ ID NO.

5. Por tanto, en un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un péptido aislado que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 y 10, o un fragmento o variante de las mismas, en donde la variante es al menos el 50%, preferiblemente al menos el 55%, preferiblemente al menos el 60%, preferiblemente al menos el 65%, preferiblemente al menos el 70%, preferiblemente al menos el 75%, preferiblemente al menos el 80%, preferiblemente al menos el 81%, preferiblemente al menos el 82%, preferiblemente al menos el 83%, preferiblemente al menos el 84%, preferiblemente al menos el 85%, preferiblemente al menos el 86%, preferiblemente al menos el 87%, preferiblemente al menos el 88%, preferiblemente al menos el 89%, preferiblemente al menos el 90%, preferiblemente al menos el 91%, preferiblemente al menos el 92%, preferiblemente al menos el 93%, preferiblemente al menos el 94%, preferiblemente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 96%, preferiblemente al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, preferiblemente al menos el 99% identica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 y 10.

En un aspecto la presente divulgacion se refiere a un homodfmero que comprende dos cadenas polipeptfdicas identicas, cada una tiene la secuencia de SEQ ID NO. 5, o un fragmento o una variante de la misma, en donde dicho fragmento comprende al menos 20 residuos de aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO. 5, y en donde dicha variante el al menos el 80%, preferiblemente al menos el 81%, preferiblemente al menos el 82%, preferiblemente al menos el 83%, preferiblemente al menos el 84%, preferiblemente al menos el 85%, preferiblemente al menos el 86%, preferiblemente al menos el 87%, preferiblemente al menos el 88%, preferiblemente al menos el 89%, preferiblemente al menos el 90%, preferiblemente al menos el 91%, preferiblemente al menos el 92%, preferiblemente al menos el 93%, preferiblemente al menos el 94%, preferiblemente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 96%, preferiblemente al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, preferiblemente al menos el 99% identica a SEQ ID NO. 5.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el fragmento polipeptfdico que define el antfgeno Vel es un polinucleotido aislado, que codifica tras la expresion un péptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 6, 7, 8, 9 y 10 es tambien un aspecto de la presente divulgacion.

El antfgeno puede en ciertas circunstancias estar glucosilado, tfpicamente O-glucosilado en un residuo de serina o treonina. Por tanto, en un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un polipéptido aislado que tiene la secuencia de SEQ ID NO. 5, o un fragmento o variante de la misma, en donde dicho fragmento comprende al menos 20 residuos de aminoacidos consecutivos de SEQ ID NO. 5, y en donde dicha variante el al menos el 80%, preferiblemente al menos el 81%, preferiblemente al menos el 82%, preferiblemente al menos el 83%, preferiblemente al menos el 84%, preferiblemente al menos el 85%, preferiblemente al menos el 86%, preferiblemente al menos el 87%, preferiblemente al menos el 88%, preferiblemente al menos el 89%, preferiblemente al menos el 90%, preferiblemente al menos el 91%, preferiblemente al menos el 92%, preferiblemente al menos el 93%, preferiblemente al menos el 94%, preferiblemente al menos el 95%, preferiblemente al menos el 96%, preferiblemente al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, preferiblemente al menos el 99% identica a SEQ ID NO. 5, y en donde dicha variante comprende al menos un residuo de serina y/o treonina, y en donde al menos un residuo de serina y/o treonina de dicha SEQ ID NO.

5 o dicho fragmento o variante de la misma, esta O-glucosilado.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion al menos un residuo de serina y/o treonina del polipéptido anterior esta O-glucosilado.

En una forma de realizacion adicional de la presente divulgacion la O-glucosilacion del al menos un residuo de serina y/o treonina se selecciona individual e independientemente del grupo que consiste en:

antfgeno Tn (GalNAcaSer/Thr),

antfgeno sialil-Tn (Siaa2-6GaINAcaSer/Thr),

STn/sialil-Tn (Neu5Aca2-6GaINAc-a-Ser/Thr),

ST/sialil-T (Neu5Aca2-3Galp3GaINAc-Ser/Thr),

Core 1 o antfgeno T (GaIp1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 2 (GIcNAcp1-6(Galp1-3)GaINAcaSer/Thr),

Core 3 (GIcNAcp1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 4 (GIcNAcp1-6(GIcNAcp1-3)GaINAcaSer/Thr),

Core 5 (GaINAca1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 6 (GIcNAcp1-6GaINAcaSer/Thr),

Core 7 (GaINAca1-6GaINAcaSer/Thr), y

Core 8 (Gala1-3GaINAcaSer/Thr).

Como se ha mencionado en el presente documento anteriormente, es un aspecto principal de la presente divulgacion proporcionar herramientas y metodos para la determinacion de grupo sangumeo geneticamente basado del grupo sangumeo Vel. Las herramientas para tales fines incluyen anticuerpos, antigenos y fragmentos de antigenos, asf como celulas presentadoras de dichos antigenos o fragmentos de antigenos.

Segun esto, en un aspecto semejante, la presente divulgacion se refiere a un metodo de detectar en una muestra un anticuerpo dirigido contra un antfgeno Vel, que comprende las etapas:

a) poner en contacto globulos rojos que tienen antfgeno Vel con la muestra;

b) detectar aglutinacion de los globulos rojos, por lo cual la aglutinacion de los globulos rojos indica la presencia en la muestra de un anticuerpo hacia el antfgeno Vel.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo de detectar en una muestra un anticuerpo dirigido hacia un antfgeno Vel, que comprende las etapas:

a) poner en contacto la muestra con un péptido o polipéptido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO.

5, 6, 7, 8, 9 y 10, o una secuencia peptfdica O-glucosilada seleccionada de SEQ ID No .5, 6, 7, 8, 9 y 10; b) detectar la interaccion entre i) dicho polipéptido o péptido y ii) un anticuerpo anti-Vel, mediante lo cual la interaccion indica la presencia en la muestra de un anticuerpo hacia un antfgeno Vel.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion la interaccion se detecta estudiando la aglutinacion. En otra forma de realizacion de la presente divulgacion la interaccion se detecta por BIACORE. En otra forma de realizacion de la presente divulgacion la interaccion se detecta por metodos basados en ELISA. Todos los metodos anteriores de detectar la interaccion los conocen bien los expertos en la materia.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un metodo de detectar un antfgeno Vel en globulos rojos, que comprende las etapas:

a) poner en contacto los globulos rojos con un anticuerpo dirigido contra el antfgeno Vel;

b) detectar aglutinacion de los globulos rojos, por lo cual la aglutinacion de los globulos rojos indica la presencia del antfgeno Vel.

En otro aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de detectar en una muestra un antfgeno Vel, que comprende las etapas:

a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo dirigido contra el antfgeno Vel;

b) detectar un complejo antfgeno/anticuerpo, mediante lo cual la deteccion del complejo antfgeno/anticuerpo indica la presencia del antfgeno Vel en la muestra.

En otro aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de identificar un sujeto que presenta un antfgeno Vel, que comprende las etapas:

a) realizar la amplificacion de un polinucleotido del sujeto poniendo en contacto un polinucleotido de una celula del sujeto con un cebador oligonucleotidico que tiene una secuencia que es complementaria a al menos 10 nucleotidos consecutivos de un polinucleotido que codifica el antfgeno Vel;

En aun otro aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de detectar en una muestra una celula que expresa un antfgeno Vel que comprende detectar en la muestra un polinucleotido que codifica un antfgeno Vel.

Tambien esta dentro del ambito de la presente divulgacion proporcionar anticuerpos para ensayos in vitro, asf como la verificacion de los metodos geneticos esbozados anteriormente. Por tanto, en un aspecto la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo capaz de reconocer un epftopo de un antfgeno Vel, en donde el epftopo se define por una secuencia peptfdica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 y 10, o una secuencia peptfdica O-glucosilada seleccionada de SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 y 10.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion el anticuerpo es capaz de reconocer una secuencia peptfdica O-glucosilada seleccionada de SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9 y 10 que comprende al menos un residuo de serina y/o treonina en donde el al menos un residuo de serina y/o treonina individual e independientemente esta O-glucosilado con un glicano seleccionado del grupo que consiste en:

antfgeno Tn (GalNAcaSer/Thr),

antfgeno sialil-Tn (Siaa2-6GaINAcaSer/Thr),

STn/sialil-Tn (Neu5Aca2-6GaINAc-a-Ser/Thr),

ST/sialil-T (Neu5Aca2-3Galp3GaINAc-Ser/Thr),

Core 1 o antfgeno T (GaIp1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 2 (GIcNAcpi-6(Galpi-3)GaINAcaSer/Thr),

Core 3 (GIcNAcp1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 4 (GIcNAcpi-6(GIcNAcpi-3)GaINAcaSer/Thr),

Core 5 (GaINAca1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 6 (GIcNAcp1-6GaINAcaSer/Thr),

Core 7 (GaINAca1-6GaINAcaSer/Thr), y

Core 8 (Gala1-3GaINAcaSer/Thr).

El anticuerpo es monoclonal o policlonal.

La presente divulgacion tambien se refiere a un metodo de hacer un anticuerpo policlonal, el metodo comprende:

a) inmunizar un mamnfero con el polipéptido o péptido como se ha definido en el presente documento anteriormente, en condiciones para provocar una respuesta de anticuerpos;

b) aislar anticuerpos de mairnfero;

La presente divulgacion tambien se refiere a un metodo de hacer un anticuerpo monoclonal, el metodo comprende:

b) aislar las celulas productoras de anticuerpo del mamffero;

c) fusionar las celulas productoras de anticuerpo con celulas inmortalizadas en cultivo para formar celulas de hibridoma que producen anticuerpo monoclonal;

d) cultivar las celulas de hibridoma;

Transfusion de sangre

El metodo de la presente divulgacion es particularmente util en un marco clmico que implica transfusiones de sangre. Por tanto, en una forma de realizacion de la presente divulgacion los metodos anteriores comprenden ademas las etapas de:

a) elegir de un banco de donantes o sangre i) sangre Vel positiva si el metodo de a) determina que el paciente es Vel positivo, o ii) sangre Vel negativa si el metodo como se ha definido en el presente documento anteriormente determina que el paciente es Vel negativo;

b) transfundir el paciente con la sangre elegida en a).

En un aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de transfusion de sangre que comprende las etapas:

a) aplicar el metodo como se ha definido en el presente documento anteriormente a un paciente;

b) elegir de un banco de donantes o sangre i) sangre Vel positiva si el metodo de a) determina que el paciente es Vel positivo, o ii) sangre Vel negativa so el metodo como se ha definido en el presente documento anteriormente determina que el paciente es Vel negativo;

c) transfundir el paciente con la sangre elegida en b).

Las transfusiones de sangre son utiles en el tratamiento de trastornos sangumeos. La presente divulgacion es particularmente util durante la terapia en relacion al tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con eritrocitos en donde la divulgacion se refiere a un metodo que comprende las etapas:

a) aplicar el metodo de deteccion/identificacion definido en el presente documento anteriormente a un paciente; b) elegir de un banco de donantes o sangre i) sangre Vel positiva si el metodo de a) determina que el paciente es Vel positivo, o ii) sangre Vel negativa so el metodo como se ha definido en el presente documento anteriormente determina que el paciente es Vel negativo;

c) transfundir el paciente con la sangre elegida en b).

Tratamiento profilactico de mujeres embarazadas

Las mujeres embarazadas Vel negativas (madres) pueden portar fetos Vel positivos. Si eritrocitos del feto Vel positivo se transfieren a la madre Vel negativa, esto puede producir una respuesta inmunitaria de la madre, generando de esta manera anticuerpos anti-Vel contra los eritrocitos Vel positivos. Esto es potencialmente letal para el feto, especialmente durante un segundo o posterior embarazo de la mujer Vel negativa.

Segun esto, en un aspecto la presente divulgacion se refiere a un metodo de tratamiento profilactico de una mujer embarazada Vel negativa que comprende:

De forma similar, la presente divulgacion tambien se refiere a un anticuerpo anti-Vel para uso en un metodo de tratamiento profilactico de una mujer embarazada Vel negativa que comprende:

Plataformas de cribado

El uso principal de la presente divulgacion es en campo de la medicina de transfusion donde la delecion de nucleotidos descrita se usara como una base para el cribado de donantes de sangre para identificar sangre compatible para pacientes que han desarrollado anticuerpos hacia el antfgeno Vel. Existen plataformas de genotipado de alto rendimiento para ensayo de donantes en el laboratorio rutinario hoy y, por tanto, en una forma de realizacion la presente divulgacion se incorpora en estas plataformas.

Segun esto, en un aspecto la presente divulgacion se refiere a un kit para detectar un antfgeno Vel, o distinguir entre muestras Vel negativas y Vel positivas, en donde dicho kit comprende el anticuerpo como se ha definido en el presente documento anteriormente. El kit tfpicamente comprende una matriz de microchip en donde los anticuerpos definidos anteriormente estan conjugados a la matriz de microchip.

En un aspecto la presente divulgacion se refiere a un kit para detectar un antfgeno Vel y/o distinguir entre muestras de individuos Vel negativos y Vel positivos, dicho kit comprende al menos dos cebadores oligonucleotfdicos aislados seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23.

En otro aspecto la divulgacion se refiere a un kit que comprende una matriz de microchip que comprende uno o mas polinucleotidos seleccionados del grupo que consiste en Se Q ID NO. 1, 2, 3, 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 32, 33, 34, 35 y 36 o uno o mas fragmentos de dicho polinucleotido.

El kit incluyendo o excluyendo la matriz de microchip puede incluir una combinacion de uno o mas polinucleotidos, oligonucleotidos, péptidos y polipéptidos definidos en el presente documento.

En un aspecto, la presente divulgacion se refiere a un kit que comprende una matriz de microchip que comprende uno o mas péptidos o polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO. 5, 6, 7, 8, 9, y 10, o uno o mas fragmentos de dicho péptido o polipéptido en donde dicho fragmento comprende al menos 5 aminoacidos consecutivos de dicha SEQ ID NO. 5, 6, 7, 8, 9, y 10.

En una forma de realizacion de la presente divulgacion del kit definido en el presente documento anteriormente al menos un residuo de serina y/o treonina de dicho péptido en dicho kit esta O-glucosilado, tal en donde al menos uno de dichos residuos de serina y/o treonina esta independiente y opcionalmente O-glucosilado por un glicano seleccionado del grupo que consiste en:

antfgeno Tn (GalNAcaSer/Thr),

antfgeno sialil-Tn (Siaa2-6GaINAcaSer/Thr),

STn/sialil-Tn (Neu5Aca2-6GaINAc-a-Ser/Thr),

ST/sialil-T (Neu5Aca2-3Galp3GaINAc-Ser/Thr),

Core 1 o antfgeno T (GaIp1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 2 (GIcNAcp1-6(Galp1-3)GaINAcaSer/Thr),

Core 3 (GIcNAcp1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 4 (GIcNAcp1-6(GIcNAcp1-3)GaINAcaSer/Thr),

Core 5 (GaINAca1-3GaINAcaSer/Thr),

Core 6 (GIcNAcp1-6GaINAcaSer/Thr),

Core 7 (GaINAca1-6GaINAcaSer/Thr), y

Core 8 (Gala1-3GaINAcaSer/Thr).

En un aspecto de la presente divulgacion, el kit descrito en el presente documento anteriormente comprende globulos rojos que presentan un antfgeno Vel.

En ciertos aspectos la divulgacion se refiere a las siguientes formas de realizacion.

Forma de realizacion 1: Un metodo de determinar el fenotipo Vel de un individuo, dicho metodo comprende distinguir entre fenotipos Vel positivo y Vel negativo analizando en una muestra biologica la composicion de:

a) un gen SMIM1, y/o,

b) un transcrito de un gen SMIM1, y/o

c) un polipéptido codificado por un gen SMIM1.

Forma de realizacion 2: El metodo segun la forma de realizacion 1 de la presente divulgacion, en donde el gen SMIM1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o una variante de secuencia de la misma en donde la variante de secuencia es entre al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 96%, tal como al menos el 97%, tal como al menos el 98%, tal como al menos el 99%, tal como entre el 99,1 y el 99,9%, entre el 99,4 y el 99,6%, tal como el 100% identica a i) SEQ ID NO. 1 o ii) una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO. 1.

Forma de realizacion 3: El metodo segun cualquiera de las formas de realizacion precedentes de la presente divulgacion, en donde la distincion analizando la composicion de SMIM1 comprende identificar:

sujetos cuyo genoma comprende SEQ ID NO. 1, dichos sujetos son Vel positivos,

y

sujetos cuyo genoma comprende SEQ ID NO. 2,

o un fragmento o variante de la misma,

en donde la variante es al menos el 90% identica a dicha SEQ ID NO. 2, dichos sujetos son Vel negativos.

Forma de realizacion 4: El metodo segun la forma de realizacion 1 de la presente divulgacion, en donde el metodo comprende:

b) amplificar al menos un fragmento del polinucleotido de SMIM1, en donde el polinucleotido de SMIM1 tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35 y 36 o un fragmento o variante de la misma en donde la variante es al menos el 90% identica a dicha secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 32, 33, 34, 35 y 36;

c) obtener un amplicon,

d) analizar la longitud del amplicon, y

Forma de realizacion 5: El metodo segun la forma de realizacion 1 de la presente divulgacion que comprende las etapas:

i) proporcionar una muestra biologica que comprende ADN genomico,

en donde dicho primer cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia identificada como SEQ ID No . 1 y localizados antes (5') de la posicion de nucleotido 2667 de SEQ ID NO. 1, y

en donde dicho segundo cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia identificada como SEQ ID NO. 1 y localizados despues (3') de la posicion de nucleotido 2649 de SEQ ID NO. 1,

iii) obtener un amplicon;

iv) realizar analisis cualitativo y/o cuantitativo del amplicon de la etapa iii).

Forma de realizacion 6: Un metodo de deteccion y/o cuantificacion de una variante de ayuste de SMIM1 en una muestra, el metodo comprende hacer ADN complementario (ADNc) a partir de ARN mensajero (ARNm) en la muestra, amplificar porciones del ADNc correspondientes al gen SMIM1 o partes del mismo y detectar y cuantificar el ADNc amplificado para detectar o cuantificar la variante de ayuste.

Forma de realizacion 7: Un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de SEQ ID NO. 1, o un polinucleotido aislado que comprende una variante de secuencia de una secuencia que es complementaria a dicha

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de identificar el fenotipo Vel de un individuo, dicho metodo comprende distinguir entre fenotipos Vel positivo y Vel negativo analizando en una muestra biologica de dicho individuo la composicion del gen SMIM1,

en donde al menos un gen SMIM1 intacto es indicativo de un fenotipo Vel positivo, y

en donde un gen SMIM1 que comprende una mutacion que produce expresion abolida de una protema Vel es indicativo de un fenotipo Vel negativo.

2. El metodo segun la reivindicacion 1, en donde la mutacion es una delecion.

3. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la mutacion es una delecion de SEQ ID NO: 31, o un fragmento o variante de la misma en donde dicho fragmento comprende al menos 12 nucleotidos consecutivos de dicha SEQ ID NO: 31, y en donde en dicha variante, no mas de 5 nucleotidos se han alterado a 5 nucleotidos diferentes.

4. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composicion del gen SMIM1 se determina analizando al menos un fragmento de:

a) un gen SMIM1, y/o

b) un transcrito de un gen SMIM1, y/o

c) un ADNc derivado de un gen SMlM1, y/o

d) un polinucleotido que es complementario a cualquiera de a) a c).

5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende las etapas de:

a) una muestra biologica que se ha proporcionado

b) amplificar al menos un fragmento de:

(i) un gen SMIM1, con la condicion de que un fragmento comprenda al menos los residuos de nucleotidos 2658 a 2667 (ggacggagtc) y los residuos de nucleotidos 2685 a 2694 (cagcacagaa) de SEQ ID NO: 1 de un gen SMIM1

(ii) un transcrito de un gen SMIM1, con la condicion de que un fragmento comprenda al menos los residuos de nucleotidos del trasncrito de gen correspondiente a los residuos de nucleotidos 2658 a 2667 (ggacggagtc) y los residuos de nucleotidos 2685 a 2694 (cagcacagaa) de SEQ ID NO: 1 del que deriva el transcrito del gen, o

(iii) un ADNc derivado de un gen SMIM1, con la condicion de que un fragmento comprenda al menos los residuos de nucleotidos del ADNc correspondientes a los residuos de nucleotidos 2658 a 2667 (ggacggagtc) y los residuos de nucleotidos 2685 a 2694 (cagcacagaa) de SEQ ID NO: 1 del que deriva el ADNc, o

(iv) un polinucleotido que es complementario a cualquiera de (i) a (iii),

c) obtener un amplicon,

d) analizar la longitud del amplicon, y

e) distinguir entre amplicones que se diferencian en longitud en aproximadamente 17 pb,

en donde amplicones que son aproximadamente 17 pb mas cortos que un control Vel positivo es indicativo de un fenotipo Vel negativo, y

en donde amplicones que son aproximadamente 17 pb mas largos que un control Vel negativo es indicativo de un fenotipo Vel positivo.

6. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el gen SMIM1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1, o una variante de secuencia de la misma en donde la variante de secuencia es al menos el 60%, tal como al menos el 70%, tal como al menos el 80%, tal como al menos el 90%, tal como al menos el 95%, tal como al menos el 96%, tal como al menos el 97%, tal como al menos el 98%, tal como al menos el 99%, tal como al menos el 99,1, al menos el 99,9%, tal como al menos el 100% identica a SEQ ID NO. 1 o una secuencia que es complementaria a SEQ ID NO. 1.

7. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho metodo es para la identificacion de sangre Vel negativa y/o Vel positiva.

8. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende las etapas de:

a) una muestra biologica que se ha proporcionado

b) amplificar un polinucleotido de SMIM1 aplicando un primer y un segundo cebador oligonucleotfdico, obteniendo de esta manera un amplicon,

c) realizar analisis cualitativo y/o cuantitativo del amplicon de SMIM1 obtenido en la etapa b), y

d) comparar la longitud del amplicon, a al menos un control Vel positivo, en donde una longitud que se diferencia del control Vel positivo indica que la muestra es un sujeto Vel negativo.

9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende las etapas de:

a) una muestra biologica que se ha proporcionado y que contiene ADN genomico,

b) poner en contacto la muestra que comprende ADN genomico con un primer y un segundo cebador oligonucleotfdico,

en donde dicho primer cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia identificada como SEQ ID NO. 1 y localizados antes (5') de la posicion del nucleotido 2667 de SEQ ID NO. 1, y

en donde dicho segundo cebador comprende al menos 10 nucleotidos que son complementarios a al menos 10 nucleotidos consecutivos seleccionados de la secuencia identificada como SEQ ID NO: 1 y localizados despues (3') de la posicion del nucleotido 2649 de SEQ ID NO. 1,

c) obtener un amplicon;

d) realizar analisis cualitativo y/o cuantitativo del amplicon de la etapa iii).

10. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la muestra se selecciona del grupo que consiste en raspados celulares, un tejido de biopsia o un fluido corporal.

11. El metodo segun la reivindicacion 10, en donde el fluido corporal se selecciona de sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, saliva, semen, esputo, orina y heces.

12. Uso de un oligonucleotido aislado seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 y 23, en el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes.