ES2713243T3 - Modificación y regulación del genoma basada en CRISPR - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para modificar una secuencia cromosómica en una célula eucariota, comprendiendo el procedimiento: a) Introducir en la célula eucariota dos sistemas de nickasa guiados por ARN o ácido nucleico que codifica dichos sistemas, y, opcionalmente, un polinucleótido donador, en el que cada sistema de nickasa guiado por ARN comprende (i) Una endonucleasa guiada por ARN que se modifica para escindir una cadena de una secuencia de cadena doble; y (ii) Un ARN guía que comprende una primera región que tiene complementariedad con un sitio diana en la secuencia cromosómica y una segunda región que interactúa con la endonucleasa guiada por ARN, en la que cada sitio diana está seguido inmediatamene por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), y los sitios diana de las dos endonucleasas guiadas por ARN están en cadenas opuestas de la secuencia cromosómica; y b) Cultivar la célula eucariótica de manera que las dos endonucleasas guiadas por ARN escinden cadenas opuestas de la secuencia cromosómica en estrecha cercanía, lo suficiente como para introducir una rotura de cadena doble en la secuencia cromosómica, y reparar la rotura de cadena doble mediante un proceso de reparación de ADN que lleva a la modificación de la secuencia cromosómica, en la que el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano y, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
Description
d e s c r ip c io n
Modificacion y regulaeion del genoma basada en CRISPR
Campo de la invencion
La presente divulgacion se refiere a una modificacion dirigida del genoma. En particular, la divulgacion se refiere a endonucleasas guiadas por ARN que comprenden la protema de tipo CRISpR/Cas y procedimientos para usar dichas protemas para modificar y regular secuencias cromosomicas dirigidas.
Antecedentes de la invencion
La modificacion genomica dirigida es una herramienta poderosa para la manipulaeion genetica de las eelulas eucariotas, de embriones y de animales. Por ejemplo, las secuencias exogenas se pueden integrar en localizaciones genomieas dirigidas y/o las secuencias cromosomicas endogenas espedfieas se pueden eliminar, desactivar o modificar. Los procedimientos actuales se basan en el uso de enzimas nucleasas disenadas genetieamente, tales como, por ejemplo, las nucleasas de dedos de cine (ZFN, del ingles zinc finger nucleases) o nucleasas de tipo activadores de transeripeion (TALEN, del ingles transcription activator-like effector nucleases). Estas nucleasas quimerieas eontienen modulos de union a ADN programables y espedficos de seeueneia unidos a un dominio de eseision de ADN no espedfico. Cada nueva diana genomica, sin embargo, requiere el diseno de una nueva ZFN o TALEN que eomprende un nuevo modulo de union a ADN espedfico de seeueneia. Por lo tanto, estas nucleasas disenadas a medida tienden a ser eostosas y requieren mueho tiempo para prepararse. Por otra parte, las espeeifieidades de ZFN y TALEN son tales que pueden mediar en escisiones fuera de la diana.
Por lo tanto, existe una neeesidad de una tecnologfa de modificacion de genoma dirigida que no requiera el diseno de una nueva nueleasa para cada nueva loealizaeion genomica dirigida. Ademas, existe una neeesidad de una tecnologfa eon espeeifieidad aumentada eon poeos o sin efeetos fuera de la diana.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un proeedimiento para modificar una seeueneia eromosomiea en una eelula eueariota, eomprendiendo el proeedimiento introdueir en la eelula eueariota dos sistemas de niekasa guiados por ARN o aeido nueleieo que eodifiea diehos sistemas y, opeionalmente un polinueleotido donador en el que eada sistema de niekasa guiado por ARN eomprende (i) una endonueleasa guiada por ARN que se modifiea para eseindir una eadena de una seeueneia de eadena doble y (ii) un ARN gma que eomprende una primera region que tiene eomplementariedad eon un sitio diana en la seeueneia eromosomiea y una segunda region que interaeeiona eon la endonueleasa guiada por ARN, en la que eada sitio diana esta seguido inmediatamente por un motivo adyaeente de protoespaeiador (PAM), y los sitios diana de las dos endonucleasas guiadas por ARN estan en eadenas opuestas de la seeueneia eromosomiea; y eultivar la eelula eueariota, de manera que las dos endonucleasas guiadas por ARN eseindan eadenas opuestas de la seeueneia eromosomiea en estreeha proximidad, lo sufieiente como para introdueir una rotura de doble eadena en la seeueneia eromosomiea, y reparar la rotura de eadena doble mediante un proeeso de reparaeion de ADN que lleva a la modificacion de la seeueneia eromosomiea, en la que el proeedimiento no eomprende un proeeso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano y, en el que el proeedimiento no eomprende un proeedimiento para el tratamiento del euerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia.
La presente invencion tambien proporciona un proeedimiento ex vivo o in vitro para modificar una seeueneia eromosomiea de una eelula eueariota, eomprendiendo el proeedimiento:
a) introdueir en la eelula eueariota dos sistemas de niekasa guiados por ARN o aeido nueleieo que eodifiea diehos sistemas y, opeionalmente, un polinueleotido donador en el que eada sistema de niekasa guiado por ARN eomprende
(i) Una endonueleasa guiada por ARN que se modifiea para eseindir una eadena de una seeueneia de eadena doble; y
(ii) Un Ar N gma que eomprende una primera region que tiene eomplementariedad eon un sitio diana en la seeueneia eromosomiea y una segunda region que interaeeiona eon la endonueleasa guiada por ARN, en la que eada sitio diana esta seguida inmediatamente por un motivo adyaeente de protoespaeiador (PAM) y los sitios diana de las dos endonucleasas guiadas por ARN estan en eadenas opuestas de la seeueneia eromosomiea; y
b) Cultivar la eelula eueariota de tal manera que las dos endonucleasas guiadas por ARN eseindan eadenas opuestas de la seeueneia eromosomiea en estreeha proximidad, lo sufieiente como para introdueir una rotura de doble eadena en la seeueneia eromosomiea, y reparar la rotura de doble eadena mediante un proeeso de reparaeion de ADN que lleva a la modificacion de la seeueneia eromosomiea, en la que el proeedimiento no eomprende un proeeso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
En una realizacion, la endonucleasa guiada por ARN puede derivar de una protema Cas9. En otra realizacion, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN introducida en la celula o embrion puede ser ARNm. En una realizacion adicional, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN introducida en la celula puede ser ADN. En una realizacion adicional, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede ser parte de un vector que comprende adicionalmente una secuencia que codifica el ARN gma. En determinadas realizaciones, la celula eucariota puede ser una celula humana, una celula de mairnfero no humano, una celula madre, una celula de vertebrado no marnfero, una celula de invertebrado, una celula vegetal, o un organismo eucariota unicelular. En otras determinadas realizaciones, la celula eucariota es un embrion unicelular de animal no humano.
Otros aspectos y repeticiones de la divulgacion se detallan a continuacion.
Breve descripcion de Ios dibuios
La FIG. 1 representa el grafico de la modificacion del genoma usando dos endonucleasas guiadas por ARN, en la que una rotura de doble cadena se genera mediante dos endonucleasas guiadas por ARN que se han convertido en nickasas.
La FIG. 2 el clasificador de celulas activadas por fluorescencia (FACs ) de celulas K562 humanas transfectadas con acido nucleico de Cas9, ARN que gma Cas9 y donador de ADN AAVS1-GFP. El eje Y representa la intensidad de auto fluorescencia en un canal rojo, y el eje X representa la intensidad de fluorescencia verde. (A) celulas K562 transfectadas con 10 |jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de doble cadena de ARNcr-ARNtracr prealineada, y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GfP; (B) celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP; (C) celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 con casquete mediante la reaccion de postranscripcion de casquete, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVS1-GFP; (D) celulas K562 transfectadas con lO jg de ADN del plasmido de Cas9, 5 jg de ADN del plasmido de ARN quimerico con U6, y 10 jg de ADN del plasmido AAVS1-GFP; (E) celulas K562 transfectadas con 10 jg de ADN del plasmido AAVSl-GFP; (F) celulas K562 transfectadas solo con reactivos de transfeccion.
La FIG. 3 presenta un analisis de PCR de union que documenta la integracion dirigida de GFP en el locus AAVS1 en celulas humanas. Carril M: marcadores moleculares de ADN de 1 kb; Carril A: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de doble cadena de ARNcr-ARNtracr prealineada, y 10 jg ADN del plasmido AAv Si -GFP; Carril B: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVSI-GFP; Carril C: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ARNm de Cas9 con casquete mediante la reaccion de postranscripcion de casquete, 0,3 nmol de ARN quimerico y 10 jg ADN del plasmido AAVSI-GFP; Carril D: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ADN del plasmido de Cas9, 5 jg de ADN del plasmido de ARN quimerico con U6, y 10 jg de ADN del plasmido AAVSI-GFP; Carril E: celulas K562 transfectadas con 10 jg de ADN del plasmido AAVSI-GFP; Carril F: celulas K562 transfectadas solo con reactivos de transfeccion.
Descripcion detallada de la invencion
En el presente documento se desvelan endonucleasas guiadas por ARN, que comprenden al menos una senal de localizacion nuclear, al menos un dominio nucleasa, y al menos un dominio que interacciona con un ARN gma para dirigir la endonucleasa a una secuencia de nucleotidos espedfica para la escision. Tambien se desvelan acidos nucleicos que codifican las endonucleasas guiadas por ARN, as ^como procedimientos para usar las endonucleasas guiadas por ARN para modificar las secuencias cromosomicas de celulas eucariotas o embriones. La endonucleasa guiada por ARN interacciona con Ios ARN gma espedficos, cada uno de Ios cuales dirige la endonucleasa a un sitio espedfico dirigido, en cuyo sitio la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena que se puede reparar mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifica. Dado que la especificidad la proporciona el ARN gma, la endonucleasa basada en ARN es universal y se puede usar con diferentes ARN gmas para dirigirse a diferentes secuencias genomicas. Los procedimientos desvelados en el presente documento se pueden usar para dirigirse y modificar secuencias cromosomicas espedficas y/o introducir secuencias exogenas en localizaciones diana en el genoma de celulas o embriones. Se excluyen Ios procedimientos que comprenden un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano. Por otro lado, el direccionamiento es espedfico con efectos limitados fuera de la diana.
(I) Endonucleasas guiadas por ARN
Un aspecto de la presente divulgacion proporciona endonucleasas guiadas por ARN que comprenden al menos una senal de localizacion nuclear, que permite la entrada de la endonucleasa en el nucleo de celulas eucariotas y embriones tales como, por ejemplo, embriones unicelulares no humanos. Las endonucleasas guiadas por ARN tambien comprenden al menos un dominio nucleasa y al menos un dominio que interacciona con un ARN gma. Una endonucleasa guiada por ARN se dirige a una secuencia espedfica de acido nucleico (o sitio diana) mediante un ARN gma. El ARN gma interacciona con la endonucleasa guiada por ARN asf como con el sitio diana de manera que, una vez dirigida al sitio diana, la endonucleasa guiada por ARN es capaz de introducir una rotura de doble
cadena en el sitio diana de la secuencla de acido nuclelco. Dado que el ARN gma proporclona la especlflcldad para la escision dirigida, la endonucleasa de la endonucleasa guiada por ARN es universal y se puede usar con diferentes ARN gma para escindir diferentes secuencias diana de acido nucleico. En el presente documento se desvelan endonucleasas guiadas por ARN, acidos nucleicos aislados (es decir, ARN y ADN) que codifica las endonucleasas guiadas por ARN, Ios vectores que comprenden acidos nucleicos que codifican las endonucleasas guiadas por ARN y Ios complejos de protema-ARN que comprenden la endonucleasa guiada por ARN mas un ARN gma.
La endonucleasa guiada por ARN puede provenir de un sistema de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR)/(Cas) asociado a CRISPR. El sistema CRISPR/Cas puede ser un sistema de tipo I, de tipo II o de tipo Ill. Los ejemplos no limitantes de protemas CRISPR/Cas incluyen Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (o CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Casio, CaslOd, CasF, CasG, CasH, Csyl, Csy2, Csy3, Csel (o CasA), Cse2 (o CasB), Cse3 (o CasE), Cse4 (o CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csz1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4 y Cu1966.
En una realizacion, la endonucleasa guiada por ARN proviene de un sistema CRISPR/Cas de tipo ll. En realizaciones espedficas, la endonucleasa guiada por ARN deriva de una protema Cas9. La protema Cas9 puede ser de Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, o Acaryochloris marina.
En general, las protemas CRISPR/cas comprenden al menos un dominio de reconocimiento de ARN y/o un dominio de union a ARN. Los dominios de reconocimiento de ARN y/o de union a ARN interaccionan con Ios ARN gma. Las protemas CRISPR/Cas tambien pueden comprender dominios nucleasa (es decir, dominios DNasa o RNasa), dominios de union a ADN, dominios helicasa, dominios RNAsa, dominios de interaccion protema-protema, dominios de dimerizacion, asf como otros dominios.
La protema de tipo CRISPR/Cas puede ser una protema CRISPR/Cas de tipo silvestre, una protema CRISPR/Cas modificada, o un fragmento de una protema CRISPR/Cas de tipo silvestre o modificada. La protema de tipo CRISPR/Cas se puede modificar para aumentar la afinidad y/o especificidad de union a acido nucleico, alterar una actividad enzimatica y/o cambiar otra propiedad de la protema. Por ejemplo, Ios dominios nucleasa (es decir, DNasa, RNasa) de la protema de tipo CRISPR/Cas se pueden modificar, eliminar o desactivar. Como alternativa, se puede truncar la protema de tipo CRISPR/Cas para retirar dominios que no son esenciales para la funcion de la protema de fusion. La protema de tipo CRISPR/Cas tambien se puede truncar o modificar para optimizar la actividad del dominio efector de la protema de fusion.
En algunas realizaciones, la protema de tipo CRISPR/Cas puede provenir de una protema Cas9 de tipo silvestre o de un fragmento de la misma. En otras realizaciones, la protema de tipo CRISPR/Cas puede provenir de una protema Cas9 modificada. Por ejemplo, la secuencia de aminoacidos de la protema Cas9 se puede modificar para alterar una o mas propiedades (por ejemplo, actividad, afinidad, estabilidad de nucleasa, etc.) de la protema. Como alternativa, Ios dominios de la protema Cas9 no implicados en la escision guiada por ARN se pueden eliminar de la protema, de manera que la protema Cas9 modificada es mas pequena que la protema Cas9 de tipo silvestre.
En general, una protema Cas9 comprende al menos dos dominios de nucleasa (es decir, DNasa). Por ejemplo, una protema Cas9 puede comprender un dominio de nucleasa de tipo RuvC y un dominio de nucleasa de tipo HNH. Los dominios RuvC y HNH funcionan juntos para cortar cadenas simples para generar una rotura de cadena doble en el ADN (Jinek y coI., Science, 337: 8l6-82l). En la presente invencion, la protema derivada de Cas-9 se modifica para que contenga solo un dominio de nucleasa funcional (bien un dominio de nulcleasa de tipo RuvC o de tipo HNH). Por ejemplo, la protema derivada de Cas9 se puede modificar, de manera que uno de Ios dominios de nucleasa se deleciona o se muta, de manera que ya no sea funcioal (es decir, la actividad nucleasa esta ausente). En la presente invencion, la protema derivada de Cas9 es capaz de introducir una incision en un acido nucleico de cadena doble (tal protema se denomina “nickasa” (del ingles nick, incision)), pero no escinde el ADN de cadena doble. Por ejemplo, una conversion de aspartato a alanina (D1OA) en un dominio de tipo Ruv convierte la protema derivada de Cas9 en una nickasa. Del mismo modo, una conversion de histidina a alanina (H84OA o H839A) en un dominio HNH convierte la protema derivada de Cas9 en una nickasa. Cada dominio de nucleasa se puede modificar usando procedimientos bien conocidos, tal como la mutagenesis de sitio dirigido, la mutagenesis mediada por PCR y la síntesis genica total, as ^como otros procedimientos conocidos en la materia.
La endonucleasa guiada por ARN desvelada en el presente documento comprende al menos una senal de localizacion nuclear. En general, una SLN comprende un tramo de aminoacidos basicos. Las senales de localizacion nuclear se conocen en la materia (vease, por ejemplo, Lange y coI., J. Biol. Chem., 2007, 282:5101-5105). Por ejemplo, en una realizacion, la SLN puede ser una secuencia monopartita, tal como PKKKRKV (SEQ ID NO:1) o PKKKRRV (SEQ ID NO:2). En otra realizacion, la SLN puede ser una secuencia bipartita. En otra realizacion mas, la SLN puede ser KRPAAt KkAGQAKKKK (SEQ ID NO:3). La SLN se puede localizar en el extremo N-terminal, en el C-terminal o en una localizacion interna de la endonucleasa guiada por ARN.
La endonucleasa guiada por ARN puede comprender adicionalmente al menos un dominio de penetracion celular. El dominio de penetracion celular puede ser una secuencia de péptido de penetracion celular que proviene de la protema TAT del VIH-1. A modo de ejemplo, la secuencia de penetracion celular de tAt puede ser GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV (SEQ ID NO:4). Como alternativa, el dominio de penetracion celular puede ser TLM (PLSSIFSRIGDPPKKKRKV; SEQ ID NO:5, una secuencia de péptido de penetracion celular que proviene del virus de la hepatitis B. En otra realizacion alternativa, el dominio de penetracion celular puede ser MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV; SEQ ID NO:6 o GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV; SEQ ID NO:7). En una alternativa adicional, el dominio de penetracion celular puede ser Pep-1 (KETWWETWWTEWSQPKKk RkV; SEQ ID NO:8), VP22, un péptido de penetracion celular del virus Herpes simplex, o una secuencia de péptido de poliarginina. El dominio de penetracion celular se puede localizar en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal o en una localizacion interna de la protema.
La endonucleasa guiada por ARN tambien puede comprender adicionalmente al menos un dominio marcador. Los ejemplos no limitantes de dominios marcadores incluyen protemas fluorescentes, etiquetas de purificacion y etiquetas de epftopo. En algunas realizaciones, el dominio marcador puede ser una protema fluorescente. Los ejemplos no limitantes de protemas fluorescentes adecuadas incluyen protemas verdes fluorescentes (por ejemplo, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopgFp , AceGFP, ZsGreen1), protemas amarillas fluorescentes (por ejemplo, YFP, EYFP, Citrina, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1,), protemas azules fluorescentes (por ejemplo EBFp, EBFP2, Azurita, mKalama1, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), protemas cyan fluorescentes (por ejemplo ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), protemas rojas fluorescentes (mKate, mKate2, mPlum, monomero DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomero, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), y protemas naranjas fluorescentes (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Kusabira-Orange monomerica, mTangerine, tdTomato) o cualquier otra protema fluorescente adecuada. En otros ejemplos, el dominio marcador puede ser una etiqueta de purificacion y/o una etiqueta de epftopo. Las etiquetas ejemplares incluyen, aunque no de forma limitativa, glutation-S-transferasa (GST), protema de union a quitina (Cb P), protema de union a maltosa, tiorredoxina (TRX), poli(NANP), etiqueta de purificacion por afinidad en tandem (TAp ), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, GIu-GIu, HSV, KT3, S, s 1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, protema transportadora de carboxil biotina (BCCP) y calmodulina.
En determinados ejemplos, la endonucleasa guiada por ARN puede ser parte de un complejo protema-ARN que comprende un ARN gma. El ARN gma interacciona con la endonucleasa guiada por ARN para dirigir la endonucleasa a un sitio diana espedfico, en el que el extremo 5' del ARN gma alinea sus bases con una secuencia de protoespaciador espedfica.
(II) Acidos nucleicos que codifican endonucleasas guiadas por ARN o protem as de fusion
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona acidos nucleicos que codifican cualquiera de las endonucleasas guiadas por ARN descritas anteriormente en la seccion (I). El acido nucleico puede ser ARN o ADN. En un ejemplo, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion es ARNm. El ARNm puede tener casquete en 5' y/o estar poliadenilado en 3'. En otra realizacion, el acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion es ADN. El ADN puede estar presente en un vector (vease a continuacion). El acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion puede tener un codon optimizado para una traduccion eficaz a protema en la celula eucariota o animal de interes. Por ejemplo, se pueden optimizar codones para la expresion en seres humanos, ratones, ratas, hamsteres, vacas, cerdos, gatos, perros, peces, anfibios, plantas, levadura, insectos, etcetera (vease la base de datos del uso de codones en www.kazusa.or.jp/codon/). Los programas para la optimizacion de codones estan disponibles como programas de dominio publico (por ejemplo, OPTIMIZER en genomes.urv.es/OPTIMIZER; OptimumGene™ de GenScript en www.genscript.com/codon_opt.html). Los programas comerciales de optimizacion de codones tambien estan disponibles.
El ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN se puede enlazar de manera operativa con al menos una secuencia de control del promotor. En algunas repeticiones, la secuencia codificante de ADN se puede unir de manera operativa a una secuencia de control del promotor para la expresion en la celula eucariota o animal de interes. La secuencia de control del promotor puede ser constitutiva, regulada o espedfica de tejido. Las secuencias de control del promotor constitutivas adecuadas incluyen, pero sin limitacion, el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del simio (SV40), el promotor tardm principal de adenovirus, el promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR), el promotor del virus del tumor mamario del raton (MMTV), el promotor de la
fosfoglicerato cinasa (PGK), el promotor del factor de elongacion (EDI)-alfa, Ios promotores de ubiquitina, Ios promotores de actina, Ios promotores de tubulina, Ios promotores de inmunoglobulina, fragmentos de Ios mismos o combinaciones de cualquiera de Ios anteriores. Los ejemplos de secuencias de control del promotor reguladas incluyen sin limitacion aquellas reguladas por choque termico, metales, esteroides, antibioticos o alcohol. Los ejemplos no limitantes de promotores espedficos de tejido incluyen el promotor B29, el promotor de CD14, el promotor de CD43, el promotor de CD45, el promotor de CD68, el promotor de desmina, el promotor de elastasa-1, el promotor de endoglina, el promotor de fibronectina, el promotor de Flt-1, el promotor de GFAP, el promotor de GPIIb, el promotor de ICAM-2, el promotor de lNF-p, el promotor de Mb, el promotor Nphsl, el promotor de OG-2, el promotor de SP-B, el promotor de SYN1 y el promotor de WASP. La secuencia del promotor puede ser de tipo silvestre o se puede modificar para una expresion mas eficiente o eficaz. En un ejemplo, el ADN codificante puede unirse de manera operativa a un promotor de CMV para la expresion constitutiva en celulas de mairnfero.
La secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede estar unida de manera operativa a una secuencia de promotor que es reconocida por una ARN polimerasa del fago para la síntesis in vitro de ARNm. En tal ejemplo, el ARN transcrito in vitro se puede purificar para su uso en Ios procedimientos detallados anteriormente en las secciones (Ill) y (IV). Por ejemplo, la secuencia del promotor puede ser una secuencia del promotor T7, T3 o SP6 o una variacion de la secuencia del promotor T7, T3 o SP6. En una realizacion a modo de ejemplo, el ADN que codifica la protema esta unido de manera operativa a un promotor T7 para la síntesis in vitro de ARNm usando una ARN polimerasa de T7.
En una alternativa, la secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede estar unida de manera operativa a una secuencia del promotor para la expresion in vitro de la endonucleasa guiada por ARN en celulas bacterianas o eucariotas. En esos casos, la protema expresada se puede purificar para su uso en Ios procedimientos detallados a continuacion en las secciones (Ill) y (IV). Los promotores bacterianos adecuados incluyen, sin Ifmite, promotores T7, promotores del operon lac, promotores trp, variaciones de Ios mismos, y combinaciones de Ios mismos. Un promotor bacteriano ejemplar es tac, que es un Idbrido de Ios promotores trp y lac. Los ejemplos no limitantes de Ios promotores eucarioticos se enumeran anteriormente.
En aspectos adicionales, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion tambien puede estar unida a una senal de poliadenilacion (por ejemplo, senal poliA del SV40, senal poliA de la hormona de crecimiento bovina (BGH), etc.) y/o al menos una secuencia de terminacion transcripcional. Ademas, la secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion tambien puede estar unida a la secuencia que codifica al menos una senal de localizacion nuclear, al menos un dominio de penetracion celular y/o al menos un dominio marcador, que se detallan anteriormente en la seccion (l).
En diversas realizaciones, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion puede estar presente en un vector. Los vectores adecuados incluyen vectores de plasmidos, fagemidos, cosmidos, minicromosomas artificiales, transposones y vectores vmcos (por ejemplo, vectores lentivmcos, vectores vmcos adenoasociados, etc.). En un ejemplo, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion esta presente en un vector de plasmido. Los ejemplos no limitantes de vectores de plasmidos adecuados incluyen pUC, pBR322, pET, pBluescript, y variantes de Ios mismos. El vector puede comprender secuencias adicionales de control de la expresion (por ejemplo, secuencias potenciadoras, secuencias de Kozak, secuencias de poliadenilacion, secuencias de terminacion transcripcional, etc.), secuencias de marcador seleccionable (por ejemplo, genes de resistencia a antibioticos), ongenes de replicacion y similares. La informacion adicional se puede encontrar en Current Protocols in Molecular Biology" de Ausubel y coI., John Wiley & Sons, Nueva York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" de Sambrook y Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3a edicion, 2001.
En algunos ejemplos, el vector de expresion que comprende la secuencia que codifica la endonucleasa guiada por ARN o la protema de fusion puede comprender adicionalmente la secuencia que codifica un ARN gma. La secuencia que codifica el ARN gma generalmente esta unido de manera operativa a al menos una secuencia de control de la transcripcion para la expresion del ARN gma en la celula o embrion de interes. Por ejemplo, el ADN que codifica el ARN gma se puede unir de manera operativa a una secuencia del promotor que se reconoce mediante la ARN polimerasa Ill (PoI Ill). Los ejemplos de promotores de PoI Ill incluyen, pero sin limitacion, Ios promotores de ARN U6, U3, HI y 7SL de mairnfero.
(Ill) Procedimiento para modificar una secuencia cromosomica usando una endonucleasa guiada por ARN Como se ha indicado anteriormente, la presente invencion abarca un procedimiento para modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota, comprendiendo el procedimiento introducir en la celula eucariota dos sistemas de nickasa guiados por ARN o acido nucleico que codifica dichos sistemas y, opcionalmente, un polinucleotido donador, en el que cada sistema de nickasa guiado por ARN comprende (i) una endonucleasa guiada por ARN que esta modificada para escindir una cadena de una secuencia de cadena doble y (ii) un ARN gma que comprende una primera region que tiene complementariedad con un sitio diana en la secuencia cromosomica y una segunda region que interacciona con la endonucleasa guiada por ARN, en la que cada sitio diana esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), y Ios sitios de diana de las dos endonucleasas guiadas por ARN estan en cadenas opuestas de la secuencia cromosomica; y cultivar la celula eucariota de manera que las dos
endonucleasas guiadas por ARN escinden cadenas opuestas de la secuencia cromosomica en estrecha cercama, Io suficiente como para inducir una rotura de cadena doble en la secuencia cromosomica, y reparar la rotura de cadena doble mediante un proceso de reparacion de ADN que lleva a la modificacion de la secuencia cromosomica, en el que el procedimiento no comprende un proceso de modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano y, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirug^a o terapia.
La invencion tambien proporciona un procedimiento ex vivo o in vitro de modificar una secuencia exogena en una secuencia cromosomica en una celula eucariota, comprendiendo el procedimiento:
(a) introducir en la celula eucariota dos sistemas de nickasa guiados por ARN o acido nucleico que codifica dichos sistemas y, opcionalmente, un polinucleotido donador, en Ios que Ios sistemas de nickasa guiados por ARN comprenden
(i) una nucleasa guiada por ARN que esta modificada para escidnidr una cadena de una secuencia de cadena doble; y
(ii) un ARN gma que comprende una primera region que tiene complementariedad con un sitio diana en la secuencia cromosomica y una segunda region que interacciona con la endonucleasa guiada por ARN, en la que cada sitio diana esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) y Ios sitios diana de las dos endonucleasas guiadas por ARN estan en cadenas opuestas de la secuencia cromosomica; y
b) cultivar la celula eucariota de tal manera que las dos endonucleasas guiadas por ARN escinden cadenas opuestas de la secuencia cromosomica en estrecha cercama, Io suficiente para introducir una rotura de cadena doble en la secuencia cromosomica,
y reparar la rotura de cadena doble por un proceso de reparacion de ADN que lleva a una modificacion de la secuencia cromosomica, en la que el procedimiento no comprende un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
En algunas realizaciones, el procedimiento puede comprender introducir una endonucleasa guiada por ARN modificada para escindir una cadena de una secuencia de cadena doble (o acido nucleico codificante) y dos ARN gma (o ADN codificante) en una celula o embrion, en la que cada ARN gma dirige la endonucleasa guiada por ARN hacia un sitio diana espedfico, el sitio en el que la endonucleasa modificada escinde una cadena (es decir, hace una incision) de la secuencia cromosomica de cadena doble, y en la que las dos incisiones estan en cadenas opuestas y en estrecha cercama, Io suficiente para constituir una rotura de cadena doble. Vease la FIG. 1. En realizaciones en las que el polinucleotido donador opcional no esta presente, la rotura de cadena doble se puede reparar por un proceso de reparacion no homologa de manera que se puedan dar durante el proceso de reparacion de la rotura deleciones de al menos un nucleotido, inserciones de al menos un nucleotido, sustituciones de al menos un nucleotido o combinaciones de las mimas. En realizaciones en las que el polinucleotido donador opcional esta presente, la secuencia donadora en el polinucleotido donador se puede intercambiar con o integrar en la secuencia cromosomica durante la reparacion de las roturas de doble cadena bien mediante un proceso de reparacion basado en homologfa (por ejemplo, en realizaciones en las que la secuencia donadora esta flanqueada aguas arriba y aguas abajo por secuencias que tienen una identidad de secuencia sustancial con las secuencias de aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, de Ios sitios dirigidos en la secuencia cromosomica) o bien un proceso de reparacion no homologa (por ejemplo, en realizaciones en las que la secuencia donadora esta flanqueada por proyecciones compatibles).
(a) Endonucleasa guiada por ARN
El procedimiento comprende introducir en una celula al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una sena de localizacion nuclear o acido nucleico que codifica al menos una endonucleasa guiada por ARN que comprende al menos una senal de localizacion nuclear. Tales endonucleasas guiadas por ARN y acidos nucleicos que codifican las endonucleasas guiadas por ARN se describen anteriormente en las secciones (I) y (II), respectivamente. Sin embargo, Ios procedimientos excluyen Ios que comprenden un proceso para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
En algunas realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN se puede introducir en la celula o embrion como una protema aislada. En dichas realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN puede comprender adicionalmente al menos un dominio de penetracion celular, que facilita la captacion celular de la protema. En otras realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ARNm. Aun en otras realizaciones, la endonucleasa guiada por ARN se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ADN. En general, la secuencia de ADN que codifica la protema de fusion esta unida de manera operativa a una secuencia del promotor que funcionara en la celula o embrion de interes. La secuencia de ADN puede ser lineal, o la secuencia de ADN puede ser parte de un vector. Aun en otras realizaciones, se puede introducir la protema de fusion en la celula o embrion como un complejo ARN-protema que comprende la protema de fusion y el ARN gma. En realizaciones alternativas, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN puede comprender
adicionalmente la secuencia que codifica un ARN grna. En general, cada una de las secuenclas que codlflcan la endonucleasa guiada por ARN y el ARN grna estan unidas de manera operativa la secuencia de control del promotor apropiada que permite la expresion de la endonucleasa guiada por ARN y el ARN grna, respectivamente, en la celula o embrion. La secuencia de ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN y el ARN grna puede comprender ademas secuencia(s) de control de la expresion, reguladoras y/o de procesamiento. La secuencia de ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN y el ARN grna puede ser lineal o puede ser parte de un vector.
(b) ARN grna
El procedimiento tambien comprende la introduccion en una celula de al menos un ARN grna o ADN que codifica al menos un ARN grna. Un ARN grna interacciona con la endonucleasa guiada por ARN para dirigir la endonucleasa a un sitio diana espedfico, en cuyo sitio, el extremo 5' del ARN grna alinea sus bases con una secuencia de protoespaciador espedfica en la secuencia cromosomica.
Cada ARN grna comprende tres regiones: una primera region en el extremo 5' que es complementaria con el sitio diana en la secuencia cromosomica, una segunda region interna que forma una estructura en tallo-bucle, y una tercera region 3' que esencialmente permanece monocatenaria. La primera region de cada ARN grna es diferente, de manera que cada ARN grna a una protema de fusion hacia un sitio diana espedfico. La segunda y tercera regiones de cada ARN grna pueden ser las mismas en todos los ARN grna.
La primera region del ARN grna es complementaria con la secuencia (es decir, la secuencia del protoespaciador) en el sitio diana en la secuencia cromosomica de manera que la primera region del ARN grna puede alinear sus bases con el sitio dirigido. En diversas realizaciones, la primera region del ARN grna puede comprender desde aproximadamente 10 nucleotidos a mas de aproximadamente 25 nucleotidos. Por ejemplo, la region del alineamiento de bases entre la primera region del ARN grna y el sitio diana en la secuencia cromosomica puede ser de aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25 o mas de 25 nucleotidos de longitud. En una realizacion a modo de ejemplo, la primera region de ARN grna es de aproximadamente 19, 20 o 21 nucleotidos de longitud.
El ARN grna tambien comprende una segunda region que forma una estructura secundaria. En algunas realizaciones, la estructura secundaria comprende un tallo (u horquilla) y un bucle. La longitud del bucle y del tallo puede variar. Por ejemplo, el bucle puede variar desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 nucleotidos de longitud, y el tallo puede variar desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 20 pares de bases de longitud. El tallo puede comprender una o mas protuberancias de 1 a aproximadamente 10 nucleotidos. De este modo, la longitud global de la segunda region puede variar desde aproximadamente 16 hasta aproximadamente 60 nucleotidos de longitud. En una realizacion ejemplar, el bucle es de aproximadamente 4 nucleotidos de longitud y el tallo comprende aproximadamente 12 pares de bases.
El ARN grna tambien comprende una tercera region en el extremo 3' que permanece esencialmente monocatenario. De este modo, la tercera region no tiene complementariedad con ninguna secuencia cromosomica en la celula de interes y no tiene complementariedad con el resto del ARN grna. La longitud de la tercera region puede variar. En general, la tercera region es mas de aproximadamente 4 nucleotidos de longitud. Por ejemplo, la longitud de la tercera region puede variar desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 60 nucleotidos de longitud.
La longitud combinada de la segunda y tercera region (tambien llamada la region universal o estructural) del ARN grna puede variar desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 120 nucleotidos de longitud. En un aspecto, la longitud combinada de la segunda y tercera region del ARN grna vana desde aproximadamente 70 hasta aproximadamente 100 nucleotidos de longitud.
En algunas realizaciones, el ARN grna comprende una unica molecula que comprende las tres regiones. En otras realizaciones, el ARN grna puede comprender dos moleculas separadas. La primera molecula de ARN puede comprender la primera region del ARN grna y una mitad del "tallo" de la segunda region del ARN grna. La segunda molecula de a Rn puede comprender la otra mitad del "tallo" de la segunda region del ARN grna y la tercera region del ARN grna. De este modo, en esta realizacion, la primera y segunda molecula de ARN contiene cada una una secuencia de nucleotidos que son complementarias entre sl Por ejemplo, en una realizacion, la primera y segunda molecula de ARN comprende cada una una secuencia (de aproximadamente 6 a aproximadamente 20 nucleotidos) que alinea sus bases con la otra secuencia para formar un a Rn grna funcional.
En algunas realizaciones, el ARN grna se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ARN. La molecula de ARN se puede transcribir in vitro. Como alternativa, la molecula de ARN se puede sintetizar qmmicamente.
En otras realizaciones, el ARN grna se puede introducir en la celula o embrion como una molecula de ADN. En esos casos, el ADN que codifica el ARN grna se puede unir de manera operativa a la secuencia de control del promotor para la expresion del ARN grna en la celula o embrion de interes. Por ejemplo, la secuencia codificante de ARN se puede unir de manera operativa a una secuencia del promotor que se reconoce mediante la ARN polimerasa Ill (PoI Ill). Los ejemplos de promotores de PoI Ill incluyen, pero sin limitacion, promotores U6 o HI de mairnfero. En una realizacion ejemplar, la secuencia codificante de ARN se enlaza a un promotor U6 humano o de raton. En otras
realizaciones ejemplares, la secuencia codificante de ARN se enlaza a un promotor HI humano o de raton.
La molecula de ADN que codifica el ARN grna puede ser lineal o circular. En algunas realizaciones, la secuencia de ADN que codifica el ARN grna puede ser parte de un vector. Los vectores adecuados incluyen vectores de plasmidos, fagemidos, cosmidos, minicromosomas artificiales, transposones y vectores vmicos. En una realizacion a modo de ejemplo, el ADN que codifica la endonucleasa guiada por ARN esta presente en un vector de plasmido. Los ejemplos no limitantes de vectores de plasmidos adecuados incluyen pUC, pBR322, pET, pBluescript, y variantes de los mismos. El vector puede comprender secuencias adicionales de control de la expresion (por ejemplo, secuencias potenciadoras, secuencias de Kozak, secuencias de poliadenilacion, secuencias de terminacion transcripcional, etc.), secuencias de marcador seleccionable (por ejemplo, genes de resistencia a antibioticos), ongenes de replicacion y similares.
En realizaciones en las que tanto la endonucleasa guiada por ARN como el ARN grna se introducen en la celula como moleculas de ADN, cada una puede ser parte de una molecula separada (por ejemplo, un vector que contiene secuencia codificante de protema y un segundo vector que contiene la secuencia codificante de ARN grna) o ambas pueden ser parte de la misma molecula (por ejemplo, un vector que contiene la secuencia codificante (y reguladora) tanto para la protema como para el ARN grna).
(c) Sitio diana
Una endonucleasa guiada por ARN junto con un ARN grna se dirige a un sitio diana en la secuencia cromosomica, en la que la endonucleasa guiada por ARN introduce una rotura de doble cadena en la secuencia cromosomica. El sitio diana no tiene limitacion de secuencia excepto en que la misma secuencia va seguida de manera inmediata (aguas abajo) de una secuencia consenso. Esta secuencia consenso tambien se conoce como motivo adyacente al protoespaciador (PAM, del ingles protospacer adjacent motif). Los ejemplos de PAM incluyen, pero sin limitacion, NGG, NGGNG y NNAGAAW (en los que N se define como cualquier nucleotido y W se define bien como A o como T). Tal como se detalla anteriormente en la seccion (IV)(b), la primera region (en el extremo 5') del ARN grna es complementaria con el protoespaciador de la secuencia diana. Normalmente, la primera region del ARN grna es de aproximadamente 19 a 21 nucleotidos de longitud. De este modo, en determinados aspectos, la secuencia del sitio diana en la secuencia cromosomica es 5’-Nig-2i-A/GG-3’. El PAM esta en letras cursivas.
El sitio diana puede estar en la region codificante de un gen, en un intron de un gen, en una region de control de un gen, en una region no codificante entre genes, etc. El gen puede ser un gen codificante de protema o un gen codificante de ARN. El gen puede ser cualquier gen de interes.
(d) Polinucleotido donador opcional
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende adicionalmente introducir al menos un polinucleotido donador en la celula. Un polinucleotido donador comprende al menos una secuencia donadora. En algunos aspectos, una secuencia del polinucleotido donador se corresponde con la secuencia cromosomica natural. Por ejemplo, la secuencia donadora puede ser esencialmente identica a una parte de la secuencia cromosomica en o cerca del sitio direccionado, pero que comprende al menos un cambio de nucleotido. De este modo, la secuencia donadora puede comprender una version modificada de la secuencia de tipo silvestre en el sitio direccionado de manera que, tras la integracion o intercambio con la secuencia natural, la secuencia en la localizacion cromosomica direccionada comprende al menos un cambio de nucleotido. Por ejemplo, el cambio puede ser una insercion de uno o mas nucleotidos, una delecion de uno o mas nucleotidos, una sustitucion de uno o mas nucleotidos, o combinaciones de los mismos. Como consecuencia de la integracion de la secuencia modificada, la celula o el embrion/animal puede producir un producto genico modificado de la secuencia cromosomica direccionada.
En otros aspectos, la secuencia donadora del polinucleotido donador se corresponde con una secuencia exogena. Tal como se usa en el presente documento, una secuencia "exogena" se refiere a una secuencia que no es natural para la celula o embrion, o una secuencia cuya localizacion natural en el genoma de la celula o embrion esta en una localizacion diferente. Por ejemplo, la secuencia exogena puede comprender secuencia codificante de protema, que puede estar unida de manera operativa a una secuencia de control del promotor de manera que, tras la integracion en el genoma, la celula o el embrion animal es capaz de expresar la protema codificada por la secuencia integrada. Como alternativa, la secuencia exogena se puede integrar en la secuencia cromosomica de manera que su expresion se regule mediante una secuencia de control del promotor endogena. En otras repeticiones, la secuencia exogena puede ser una secuencia de control transcripcional, otra secuencia de control de la expresion, una secuencia codificante de ARN, etcetera. La integracion de una secuencia exogena en una secuencia cromosomica se denomina "insercion".
Como se apreciara por los expertos en la materia, la longitud de la secuencia donadora puede variar y lo hara. Por ejemplo, la secuencia donadora puede variar en longitud desde varios nucleotidos hasta cientos de nucleotidos hasta cientos de miles de nucleotidos.
Polinucleotido donador que comprende secuencias aguas arriba y aguas abajo. En algunas realizaciones, la secuencia donadora en el polinucleotido donador esta flanqueado por una secuencia aguas arriba y una secuencia
aguas abajo, que tiene identidad de secuencia sustancial con secuencias localizadas aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, del sitio dirigido en la secuencia cromosomica. Debido a estas similitudes de secuencia, las secuencias aguas arriba y aguas abajo del polinucleotido donador permiten la recombinacion homologa entre el polinucleotido donador y la secuencia cromosomica dirigida de manera que la secuencia del donador se puede integrar en (o intercambiar con) la secuencia cromosomica.
La secuencia aguas arriba, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de acido nucleico que comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica aguas arriba del sitio dirigido. De forma analoga, la secuencia aguas abajo se refiere a una secuencia de acido nucleico que comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica aguas abajo del sitio dirigido. Tal como se usa en el presente documento, la frase "identidad de secuencia sustancial" se refiere a secuencias que tienen al menos aproximadamente el 75 % de identidad de secuencia. De este modo, las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el polinucleotido donador pueden tener aproximadamente el 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con la secuencia aguas arriba o aguas abajo del sitio dirigido. En una realizacion ejemplar, las secuencias aguas arriba y aguas abajo en el polinucleotido donador pueden tener aproximadamente el 95 % o el 100 % de identidad de secuencia con las secuencias cromosomicas aguas arriba o aguas abajo del sitio dirigido. En una realizacion, la secuencia aguas arriba comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica localizada inmediatamente aguas arriba del sitio dirigido (es decir, adyacente al sitio dirigido). En otras realizaciones, la secuencia aguas arriba comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localizan en aproximadamente cien (100) nucleotidos aguas arriba del sitio dirigido. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia de aguas arriba puede compartir identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localiza de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 21 a aproximadamente 40, de aproximadamente 41 a aproximadamente 6o, de aproximadamente 61 a aproximadamente 80, o de aproximadamente 81 a aproximadamente 100 nucleotidos aguas arriba desde el sitio dirigido. En una realizacion, la secuencia aguas abajo comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica localizada inmediatamente aguas abajo del sitio dirigido (es decir, adyacente al sitio dirigido). En otras realizaciones, la secuencia aguas abajo comparte la identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localizan en aproximadamente cien (100) nucleotidos aguas abajo del sitio dirigido. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia de aguas abajo puede compartir identidad de secuencia sustancial con una secuencia cromosomica que se localiza de aproximadamente 1 a aproximadamente 20, de aproximadamente 21 a aproximadamente 40, de aproximadamente 41 a aproximadamente 60, de aproximadamente 61 a aproximadamente 80, o de aproximadamente 81 a aproximadamente 100 nucleotidos aguas abajo desde el sitio dirigido.
Cada secuencia aguas arriba o aguas abajo puede variar en longitud desde aproximadamente 20 nucleotidos a aproximadamente 5000 nucleotidos. En algunas realizaciones, las secuencias aguas arriba y aguas abajo pueden comprender aproximadamente 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, IlOo, 1200, 1300, 1400, 15OO, 16OO, 17OO, 18OO, 19OO, 2OOO, 21OO, 22OO, 23OO, 24OO, 25OO, 26OO, 28OO, 3OOO, 32OO, 34OO, 36OO, 38OO, 4OOO, 42OO, 44OO, 46OO, 48OO, o 5OOO nucleotidos. En una realizacion ejemplar, las secuencias aguas arriba o aguas abajo pueden variar en longitud desde aproximadamente 50 a aproximadamente 15OO nucleotidos.
Los polinucleotidos donadores que comprenden las secuencias aguas arriba y aguas abajo con similitud de secuencia con la secuencia cromosomica dirigida pueden ser lineales o circulares. En realizaciones en las que el polinucleotido donador es circular, puede ser parte de un vector. Por ejemplo, el vector puede ser un vector de plasmido.
Polinucleotidos donadores que comprenden sitio(s) de escision dirigido(s). En otras realizaciones, el polinucleotido donador puede comprender adicionalmente al menos un sitio de escision dirigido que se reconoce mediante la endonucleasa guiada por ARN. El sitio de escision dirigido anadido al polinucleotido donador se puede colocar aguas arriba o aguas abajo o ambos, aguas arriba y aguas abajo de la secuencia donadora. Por ejemplo, la secuencia donadora puede estar flanqueada mediante sitios de escision dirigidos de manera que, tras la escision por la endonucleasa guiada por ARN, la secuencia donadora esta flanqueada por proyecciones que son compatibles con las de la secuencia cromosomica generadas tras la escision mediante la endonucleasa guiada por ARN. Por consiguiente, la secuencia donadora se puede unir con la secuencia cromosomica escindida durante la reparacion de la rotura de doble cadena mediante un proceso de reparacion no homologa. Generalmente, los polinucleotidos donadores que comprenden el(los) sitio(s) de escision seran circulares (por ejemplo, pueden ser parte de un vector de plasmido).
Polinucleotido donador que comprende una secuencia donadora corta con proyecciones opcionales. En mas realizaciones alternativas, el polinucleotido donador puede ser una molecula lineal que comprende una secuencia donadora corta con proyecciones cortas opcionales que son compatibles con las proyecciones generadas mediante la endonucleasa guiada por ARN. En dichas realizaciones, la secuencia donadora se puede unir directamente con la secuencia cromosomica escindida durante la reparacion de la rotura de doble cadena. En algunos casos, la secuencia donadora puede ser menor de aproximadamente 1.OOO, menor de aproximadamente 5OO, menor de aproximadamente 250, o menor de aproximadamente 1OO nucleotidos. En determinados casos, el polinucleotido donador puede ser una molecula lineal que comprende una secuencia donadora corta con extremos romos. En otras repeticiones, el polinucleotido donador puede ser una molecula lineal que comprende una secuencia donadora corta
con proyecciones en 5' y/o 3'. Las proyecciones pueden comprender 1,2, 3, 4 o 5 nucleotidos.
Normalmente, el polinucleotido donador sera ADN. El ADN puede ser monocatenario o bicatenario y/o lineal o circular. El polinucleotido donador puede ser un plasmido de ADN, un cromosoma artificial bacteriano (BAC, del ingles bacterial artificial chromosome), un cromosoma artificial de levadura (YAC, del ingles yeast artificial chromosome), un vector vmco, una parte lineal de ADN, un fragmento de PCR, un acido nucleico desnudo, o un acido nucleico que forma complejo con un vehfculo de administracion tal como un liposoma o un poloxamero. En determinadas realizaciones, el polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora puede ser parte de un vector de plasmido. En cualquiera de estas situaciones, el polinucleotido donador que comprende la secuencia donadora puede comprender adicionalmente al menos una secuencia adicional.
(e) Introduccion en la celula
La(s) endonucleasa(s) dirigida(s) por ARN (o el acido nucleico codificante), el(los) ARN gma(s) (o ADN codificante) y el(los) polinucleotido(s) donador(es) opcional(es) se pueden introducir en una celula mediante una variedad de medios. En algunas realizaciones, se transfecta la celula. Los procedimientos de transfeccion adecuados incluyen la transfeccion mediada por fosfato calcico, la nucleofeccion (o electroporacion), la transfeccion por polfmeros cationicos (por ejemplo, DEAE-dextrano o polietilenimina), la transduccion vmca, la transfeccion por virosoma, la transfeccion por virion, la transfeccion por liposoma, la transfeccion por liposoma cationico, la transfeccion por inmunoliposoma, la tranfeccion por Ifpido no liposoma, la transfeccion por dendnmero, la transfeccion por choque termico, la magnetofeccion, la lipofeccion, la biobakstica, la impalefeccion, la sonoporacion, la transfeccion optica y la captacion de acidos nucleicos potenciada por un agente patentado. Los procedimientos de transfeccion son bien conocidos en la materia (vease, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel y coI., John Wiley & Sons, Nueva York, 2003 o "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" de Sarnbrook y Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3a Edicion, (2001). En otras realizaciones, las moleculas se introducen en la celula mediante microinyeccion. Normalmente, cuando la celula es una celula celula embrionaria de animal no humano, el embrion es un embrion de etapa unicelular fecundado de la especie de interes. Por ejemplo, las moleculas se pueden inyectar en los pronucleos de embriones unicelulares.
La(s) endonucleasa(s) dirigida(s) por ARN (o el acido nucleico codificante), el(los) ARN gma(s) (o Ios ADN que codifican el ARN gma) y el(los) polinucleotido(s) donador(es) opcional(es) se pueden introducir en la celula de manera simultanea o de manera secuencial. La proporcion de endonucleasa(s) dirigida(s) por ARN (o acido nucleico codificante) frente al(los) ARN gma (o ADN codificante), generalmente sera de aproximadamente una estequiometna tal que puedan formar un complejo ARN-protema. En una realizacion, el ADN que codifica una endonucleasa dirigida por ARN y el ADN que codifica un ARN gma se administran juntos en el vector de plasmido.
(f) Cultivo de la celula
El procedimiento ademas comprende el mantenimiento de la celula o embrion en condiciones apropiadas, de manera que el(los) ARN gma dirija a la(s) endonucleasa(s) guiada(s) por ARN al(los) sitios dirigido(s) en la secuencia cromosomica, y la(s) endonucleasa(s) guiada por ARN introduzca(n) al menos una rotura de doble cadena en la secuencia cromosomica. Una rotura de doble cadena se puede reparar mediante un proceso de reparacion de ADN de manera que la secuencia cromosomica se modifique mediante una delecion de al menos un nucleotido, una insercion de al menos un nucleotido, una sustitucion de al menos un nucleotido o una combinacion de las mismas.
En realizaciones en las que no se introducen polinucleotidos donadores en la celula o embrion, la rotura de doble cadena podna repararse mediante un proceso de reparacion por union de extremos no homologos (NHEJ, del ingles non-homologous end-joining). Dado que la NHEJ es propensa a errores, las deleciones de al menos un nucleotido, las inserciones de al menos un nucleotido, las sustituciones de al menos un nucleotido o las combinaciones de las mismas pueden tener lugar durante la reparacion de la rotura. Por consiguiente, la secuencia en la secuencia cromosomica se puede modificar de manera que el marco de lectura de una region codificante se pueda desplazar y la secuencia cromosomica se inactive o se "suprima". Una secuencia cromosomica inactivada que codifica una protema no produce la protema codificada por la secuencia cromosomica de tipo silvestre.
En realizaciones en las que un polinucleotido donador que comprende secuencias aguas arriba y aguas abajo se introduce en la celula o embrion, la rotura de doble cadena se puede reparar mediante un proceso de reparacion dirigida por homologfa (HDR, del ingles homology-directed repair) de manera que la secuencia donadora se integra en la secuencia cromosomica. Por consiguiente, se puede integrar una secuencia exogena en el genoma de la celula o embrion, o la secuencia cromosomica dirigida se puede modificar mediante el intercambio de una secuencia modificada por la secuencia cromosomica de tipo silvestre.
En realizaciones en las que un polinucleotido donador que comprende el sitio de escision se introduce en la celula o embrion, la endonucleasa guiada por ARN puede escindir tanto la secuencia cromosomica dirigida como el polinucleotido donador. El polinucleotido donador linealizado se puede integrar en la secuencia cromosomica en el sitio de la rotura de doble cadena mediante union entre el polinucleotido donador y la secuencia cromosomica escindida mediante un proceso de NHEJ.
En realizaciones en las que un polinucleotido donador lineal que comprende una secuencla donadora corta se Introduce en la celula o embrion, la secuencia donadora corta se puede integrar en la secuencia cromosomica en el sitio de la rotura de doble cadena mediante un proceso de NHEJ. La integracion puede tener lugar mediante la union de extremos romos entre la secuencia donadora corta y la secuencia cromosomica en el sitio de la rotura de doble cadena. Como alternativa, la integracion puede tener lugar mediante la union de los extremos cohesivos (es decir, que tienen proyecciones en 5' o en 3') entre una secuencia donadora corta que esta flanqueada por proyecciones que son compatibles con las generadas mediante la endonucleasa de direccionamiento de ARN en la secuencia cromosomica escindida.
En general, la celula se mantiene en condiciones apropiadas para el crecimiento celular y/o su conservacion. Las condiciones adecuadas de cultivo celular son bien conocidas en la materia y se describen, por ejemplo, en Santiago y col. (2008) PNAS 105:5809-5814; Moehle y col. (2007) PNAS 104:3055-3060; Urnov y col. (2005) Nature 435:646 651; y Lombardo y col. (2007) Nat. Biotechnology 25:1298-1306. Los expertos en la materia aprecian que los procedimientos para el cultivo de celulas son conocidos en la materia y pueden variar y lo haran dependiendo del tipo celular. Se puede usar la optimizacion habitual, en todos los casos, para determinar las mejores tecnicas para un tipo celular en particular.
Se puede cultivar un embrion in vitro (por ejemplo, en cultivo celular). Normalmente, el embrion se cultiva a una temperatura apropiada y en medios apropiados con la proporcion de O2/CO2 necesaria como para permitir la expresion de la endonucleasa guiada por ARN y del ARN gma, si fuese necesario. Los ejemplos no limitantes adecuados de medios incluyen los medios M2, m 16, KSOM, BMOC y HTF. Un experto en la materia apreciara que las condiciones del cultivo pueden variar y lo haran dependiendo de la especie del embrion. Se puede usar la optimizacion habitual, en todos los casos, para determinar las mejores condiciones de cultivo para una especie particular de embrion. En algunos casos, una lmea celular puede provenir de un embrion cultivado in vitro (por ejemplo, una lmea de celulas madre embrionarias).
Como alternativa, se puede cultivar un embrion in vivo transfiriendo el embrion al utero de un hospedador femenino. Hablando de manera general, el hospedador femenino es de la misma especie 0 similar que la del embrion. Preferentemente, el hospedador femenino esta pseudoembarazado. Los procedimientos para preparar hospedadores femeninos pseudoembarazados se conocen en la materia. Ademas, los procedimientos para transferir un embrion en un hospedador femenino son conocidos. El cultivo de un embrion in viva permite el desarrollo del embrion y pueden dar como resultado un nacimiento vivo de un animal que proviene del embrion. Tal animal comprendena la secuencia cromosomica modificada en cada celula del cuerpo. Se excluyen se manera espedfica del ambito de la invencion los procedimientos que comprenden modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
(g) Tipos de celulas y embriones
Una variedad de celulas eucariotas y embriones son adecuados para su uso en el procedimiento. Por ejemplo, la celula puede ser una celula humana, una celula de mairnfero no humano, una celula de vertebrado no mamffero, una celula de invertebrado, una celula de insecto, una celula vegetal, una levadura, 0 un organismo eucariota unicelular. En general, el embrion es un embrion de mamffero no humano. En realizaciones espedficas, los embriones pueden ser un embrion unicelular de mamffero no humano. Los embriones ejemplares, incluyendo los embriones unicelulares, incluyen sin limitacion los embriones de raton, de rata, de hamster, de roedor, de conejo, de gato, de perro, de oveja, de cerdo, de vaca, de caballo y de primate. Aun en otras realizaciones, la celula puede ser una celula madre. Las celulas madre adecuadas incluyen sin limitacion las celulas madre embrionarias, las celulas madre de tipo ES, celulas madre fetales, celulas madre de adulto, celulas madre pluripotenciales, celulas madre de pluripotencialidad inducida, celulas madre multipotentes, celulas madre oligopotentes, celulas madre unipotentes y otras. En realizaciones ejemplares, la celula es una celula de marnfero.
Los ejemplos no limitantes de celulas de marnfero adecuadas incluyen las celulas de ovario de hamster chino (CHO), las celulas renales de cna de hamster (BHK); las celulas nSo de mieloma de raton, las celulas 3T3 de fibroblasto embrionario de raton (NIH3T3), las celulas A20 de linfoma de linfocitos B de raton; las celulas B16 de melanoma de raton; las celulas C2C12 de mioblasto de raton; las celulas SP2/0 de mieloma de raton; las celulas C3H-10T1/2 mesenquimales embrionarias de raton; las celulas CT26 de carcinoma de raton, las celulas DuCuP de prostata de raton; las celulas EMT6 de mama de raton; las celulas Hepa1c1c7 de hepatoma de raton; las celulas J5582 de mieloma de raton; las celulas MTD-1A epiteliales de raton; las celulas MyEnd de miocardio de raton; las celulas RenCa renales de raton; las celulas RIN-5F pancreaticas de raton; las celulas X64 de melanoma de raton; las celulas YAC-1 de linfoma de raton; las celulas 9L de glioblastoma de rata; las celulas RBL de linfoma de linfocitos B de rata; las celulas B35 de neuroblastoma de rata; las celulas de hepatoma de rata (HTC); las celulas BRL 3A de hfgado de rata; las celulas renales caninas (MDCK); las celulas (CMT) mamarias caninas; las celulas D17 de osteosarcoma de rata; las celulas DH82 de monocito/macrofago de rata; las celulas (COS7) de fibroblastos de rinon de mono transformados por el virus SV-40; las celulas CVI-76 de rinon de mono; celulas (VERO-76) de rinon de mono verde africano; celulas (HEK293, HEK293T) de rinon embrionario humano; celulas (HELA) de carcinoma de cuello uterino humano; celulas (W138) de pulmon humano; celulas (Hep G2) de hfgado humano; celulas de osteosarcoma U2-OS humano, celulas A549 humanas, celulas A-431 humanas, y celulas K562 humanas. Se puede encontrar una lista extensa de Imeas celulares de marnferos en el catalogo de la American Type Culture Collection
(ATCC, Manassas, VA).
(IV) Celulas y animates modifioados geneticamente
La presente divulgacion abarca celulas embrlones no humanos y anlmales no humanos modlflcados geneticamente, que comprenden al menos una secuencia cromosomica que se ha modificado usando el proceso mediado por endonucleasa guiada por ARN, usando los procedimientos descritos en el presente documento. La divulgacion proporciona celulas que comprenden al menos una molecula de ADN o de Ar N que codifica una endonucleasa guiada por ARN dirigida hacia una secuencia cromosomica de interes, al menos un ARN gma y, opcionalmente, uno o mas polinucleotidos donadores. La divulgacion tambien proporciona embriones no humanos que comprenden al menos una molecula de ADN o de ARN que codifica una endonucleasa guiada por ARN o protema de fusion dirigida hacia una secuencia cromosomica de interes, al menos un ARN gma y opcionalmente uno o mas polinucleotidos donadores.
La presente divulgacion proporciona animales no humanos, embriones no humanos o celulas animales modificados geneticamente que comprenden al menos una secuencia cromosomica modificada. La secuencia cromosomica modificada se puede modificar de manera que (1) sea inactiva, (2) tenga una expresion alterada o produzca un producto de protema alterada o (3) comprenda una secuencia integrada. La secuencia cromosomica se modifica con un proceso mediado por endonucleasa guiada por ARN, usando los procedimientos descritos en el presente documento.
Tal como se ha tratado, un aspecto de la presente divulgacion proporciona un animal modificado geneticamente en el que se ha modificado al menos una secuencia cromosomica. En una realizacion, el animal modificado geneticamente comprende al menos una secuencia cromosomica inactivada. La secuencia cromosomica modificada se puede inactivar de manera que la secuencia no se transcriba y/o no se produzca una protema funcional. Por lo tanto, un animal modificado geneticamente que comprende una secuencia cromosomica inactivada puede denominarse un "animal genomanipulado por supresion genica" o un "animal genomanipulado secundariamente por supresion genica". La secuencia cromosomica inactivada puede incluir una mutacion de delecion (es decir, delecion de uno o mas nucleotidos), una mutacion de insercion (es decir, insercion de uno o mas nucleotidos), o una mutacion interruptora (es decir, sustitucion de un unico nucleotido por otro nucleotido de manera que se introduzca un codon de parada). Como consecuencia de la mutacion, la secuencia cromosomica dirigida se inactiva y no se produce una protema funcional. La secuencia cromosomica inactivada no comprende una secuencia introducida de manera exogena. Tambien se incluyen en el presente documento animales modificados geneticamente en los que dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o mas secuencias cromosomicas estan inactivadas.
En otra realizacion, la secuencia cromosomica modificada se puede alterar de manera que codifique un producto variante de protema. Por ejemplo, un animal modificado geneticamente que comprende una secuencia cromosomica modificada puede comprender una(s) mutacion(es) puntual(es) dirigidas u otra modificacion de manera que se produzca un producto de protema alterada. En una realizacion, la secuencia cromosomica se puede modificar de manera que al menos un nucleotido se cambie y la protema expresada comprenda un resto de aminoacido cambiado (mutacion de aminoacido). En otra realizacion, la secuencia cromosomica se puede modificar para que comprenda mas de una mutacion de aminoacido de manera que se cambie mas de un aminoacido. Ademas, la secuencia cromosomica se puede modificar para que tenga una delecion o insercion de tres nucleotidos de manera que la protema expresada comprenda una unica delecion o insercion de aminoacido. La protema variante o alterada puede tener propiedades o actividades alteradas en comparacion con la protema de tipo silvestre, tal como una especificidad por el sustrato alterada, una actividad enzimatica alterada, unas tasas cineticas alteradas, etc.
En otra realizacion, el animal modificado geneticamente puede comprender al menos una secuencia integrada en el cromosoma. Un animal modificado geneticamente que comprende una secuencia integrada puede denominarse un "animal genomanipulado por insercion genica" o un "animal genomanipulado secundariamente por insercion genica". La secuencia integrada en el cromosoma puede, por ejemplo, codificar una protema ortologa, una protema endogena o combinaciones de ambas. En una realizacion, una secuencia que codifica una protema ortologa o una protema endogena se puede integrar en una secuencia cromosomica que codifica una protema de manera que la secuencia cromosomica se inactiva, pero la secuencia exogena se expresa. En tal caso, la secuencia que codifica la protema ortologa o la protema endogena puede estar unida de manera operativa a una secuencia de control del promotor. Como alternativa, una secuencia que codifica una protema ortologa o una protema endogena se puede integrar en una secuencia cromosomica sin afectar a la expresion de una secuencia cromosomica. Por ejemplo, una secuencia que codifica una protema se puede integrar en un locus "de sitio seguro", tal como el locus Rosa26, el Iocus HPRT, o el locus AAV. La presente divulgacion tambien abarca animales modificados geneticamente en los que dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez o mas secuencias, incluyendo secuencias que codifican protema(s), se integran en el genoma.
La secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema puede codificar la forma de tipo silvestre de una protema de interes o puede codificar una protema que comprende al menos una modificacion de manera que se produce una version alterada de la protema. Por ejemplo, una secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema relacionada con una enfermedad o trastorno puede comprender al menos una modificacion de manera que la version alterada de la protema producida provoque o potencie el trastorno asociado. Como alternativa, la
secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema relacionada con una enfermedad o trastorno puede comprender al menos una modificacion de manera que la version alterada de la protema proteja frente al desarrollo del trastorno asociado.
En un ejemplo adicional, el animal modificado geneticamente puede ser un animal "humanizado" que comprende al menos una secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema humana funcional. La protema humana funcional puede no tener el correspondiente ortologo en el animal modificado geneticamente. Como alternativa, el animal de tipo silvestre del que proviene el animal modificado geneticamente puede comprender un ortologo correspondiente con la protema humana funcional. En este caso, la secuencia ortologa en el animal "humanizado" esta inactivada de manera que no se crean protemas funcionales y el animal "humanizado" comprende al menos una secuencia integrada en el cromosoma que codifica la protema humana.
En otro ejemplo mas, el animal modificado geneticamente puede comprender al menos una secuencia cromosomica modificada que codifica una protema de manera que el patron de expresion de la protema esta alterado. Por ejemplo, las regiones reguladoras que controlan la expresion de la protema, tal como un promotor o un sitio de union a factor de transcripcion, se pueden alterar de manera que la protema se sobreproduce, o se modifique la expresion temporal o espedfica de tejido de la protema, o una combinacion de los mismos. Como alternativa, el patron de expresion de la protema se puede alterar usando un sistema de animal genomodificado secundariamente por supresion genica. Un ejemplo no limitante de un sistema de animal genomodificado secundariamente por supresion genica incluye un sistema de recombinacion Cre-lox. Un sistema de recombinacion Cre-lox comprende una enzima recombinasa Cre, una ADN recombinasa espedfica de sitio que puede catalizar la recombinacion de una secuencia de acido nucleico entre sitios espedficos (sitios Iox) en una molecula de acido nucleico. Los procedimientos para usar este sistema para producir expresion temporal y espedfica de tejido son conocidos en la materia. En general, un animal modificado geneticamente se genera con sitios Iox que flanquean una secuencia cromosomica. En animal modificado geneticamente que comprende una secuencia cromosomica flanqueada por Iox se puede cruzar entonces con otro animal modificado geneticamente que exprese la recombinasa Cre. Los animales de la progenie que comprende la secuencia cromosomica flanqueada por Iox y la Cre recombinasa se producen entonces, y la secuencia cromosomica flanqueada por Iox se recombina, llevando a una delecion o inversion de la secuencia cromosomica que codifica la protema. La expresion de la recombinasa Cre se puede regular de manera temporal y secundaria para efectuar una recombinacion regulada de manera temporal y secundaria de la secuencia cromosomica.
En cualquiera de estas realizaciones, el animal modificado geneticamente desvelado en el presente documento puede ser heterocigotico para la secuencia cromosomica modificada. Como alternativa, el animal modificado geneticamente puede ser homocigotico para la secuencia cromosomica modificada.
Los animales modificados geneticamente desvelados en el presente documento se pueden cruzarse para crear animales que comprendan mas de una secuencia cromosomica modificada o para crear animales que sean homocigoticos para una o mas secuencias cromosomicas modificadas. Por ejemplo, dos animales que comprenden la misma secuencia cromosomica modificada se pueden cruzar para crear un animal homocigotico para la secuencia cromosomica modificada. Como alternativa, los animales con diferentes secuencias cromosomicas modificadas se pueden cruzar para crear un animal que comprenda ambas secuencias cromosomicas modificadas.
Por ejemplo, un primer animal que comprende un gen "x" de una secuencia cromosomica inactivada se puede cruzar con un segundo animal que comprende que comprende una secuencia integrada en el cromosoma que codifica una protema "X" de gen humano para dar lugar a una descendencia "X" de genes "humanizados" que comprende tanto la secuencia cromosomica del gen inactivado "x" como la secuencia "X" del gen humano integrado en el cromosoma. Asimismo, un animal con gen "X" humanizado se puede cruzar con un animal con gen "Y" humanizado para crear una descendencia con genes X/Y humanizados. Los expertos en la materia apreciaran que son posibles muchas combinaciones.
En otras realizaciones, un animal que comprende una secuencia cromosomica modificada se puede cruzar para combinar la secuencia cromosomica modificada con otros acervos geneticos. A modo de ejemplo no limitante, otros acervos geneticos pueden incluir los acervos geneticos de tipo silvestre, los acervos geneticos con mutaciones de delecion, los acervos geneticos con otra integracion dirigida y los acervos geneticos con integraciones no dirigidas. El termino "animal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a un animal no humano. El animal puede ser un embrion, un juvenil o un adulto. Los animales adecuados incluyen vertebrados tales como mairnferos, aves, reptiles, anfibios, moluscos y peces. Los ejemplos de marnferos adecuados incluyen, sin limitacion, roedores, animales de cornparMa, ganado y primates. Los ejemplos no limitantes de roedores incluyen ratones, ratas, hamsteres, jerbos y cobayas. Los animales de compare adecuados incluyen, pero sin limitacion, gatos, perros, conejos, erizos y hurones. Los ejemplos no limitantes de ganado incluyen caballos, cabras, ovejas, cerdos, vacas, llamas y alpacas. Los primates adecuados incluyen, pero sin limitacion, monos capuchinos, chimpances, lemures, macacos, titfes, tamarinos, monos arana, monos ardilla y monos de Vervet. Los ejemplos no limitantes de aves incluyen gallinas, pavos, patos y gansos. Como alternativa, el animal puede ser un invertebrado tal como un insecto, un nematodo y similares. Los ejemplos no limitantes de insectos incluyen Drosohila y mosquitos. Un animal ejemplar es una rata. Los ejemplos no limitantes de las cepas de rata incluyen Dahl Salt-Sensitive, Fischer 344, Lewis, Long
Evans Hooded, Sprague-Dawley y Wistar. En una realizacion, el animal no es un raton modificado geneticamente. En cada una de las repeticiones precedentes de animales adecuados para la invencion, el animal no incluye secuencias de transposones introducidas de forma exogena e integradas de manera aleatorizada.
Un aspecto adicional de la presente divulgacion proporciona celulas o Imeas celulares modificadas geneticamente que comprenden al menos una secuencia cromosomica modificada. La celula o lmea celular modificada geneticamente puede provenir de cualquiera de los animales modificados geneticamente desvelados en el presente documento. Como alternativa, la secuencia cromosomica se puede modificar en una celula tal como se describe anteriormente en el presente documento (en los parrafos que describen las modificaciones de secuencias cromosomicas en animales) usando los procedimientos descritos en el presente documento. La divulgacion tambien abarca un lisado de dichas celulas o Imeas celulares.
Las celulas son celulas eucariotas. Las celulas hospedadoras adecuadas incluyen hongos o levaduras, tales como Pichia, Saccharomyces, o Schizosaccharomyces; celulas de insecto, tales como celulas SF9 Spodoptera frugiperda o celulas S2 de Drosophila melanogaster; y celulas de animales, tales como raton, rata, hamster, primate no humano o celulas humanas. Las celulas ejemplares son de marnfero. Las celulas de marnfero pueden ser celulas primarias. En general, se puede usar cualquier celula primaria que sea sensible a las roturas de doble cadena. Las celulas pueden ser de una variedad de tipos celulares, por ejemplo, fibroblastos, mioblastos, linfocitos T o B, macrofagos, celulas epiteliales, etcetera.
Cuando se usan Imeas celulares de marnfero, la lmea celular puede ser cualquier lmea celular establecida o una lmea de celulas primarias que no se haya descrito aun. La lmea celular puede ser adherente o no adherente o la lmea celular puede crecer en condiciones que estimulen el crecimiento adherente, no adherente u organotipico usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. Los ejemplos no limitantes de celulas y Imeas celulares de marnfero se proporcionan en el presente documento en la seccion (IV)(g). Aun en otras realizaciones, la celula puede ser una celula madre. Los ejemplos no limitantes de celulas madre adecuadas se proporcionan en la seccion (IV)(g).
La presente divulgacion tambien proporciona un embrion no humano modificado geneticamente que comprende al menos una secuencia cromosomica modificada. La secuencia cromosomica se puede modificar en un embrion tal como se describe anteriormente en el presente documento (en los parrafos que describen las modificaciones de secuencias cromosomicas en animales) usando los procedimientos descritos en el presente documento. En una realizacion, el embrion en un embrion no humano de etapa unicelular fecundado de la especie animal de interes. Los embriones ejemplares, incluyendo los embriones unicelulares, incluyen sin limitacion, de raton, de rata, de hamster, de roedor, de conejo, de gato, de perro, de oveja, de cerdo, de vaca, de caballo y embriones de primates.
Pefiniciones
Salvo que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el significado comunmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invencion. Las siguientes referencias a un experto en la materia una definicion general de muchos de los terminos usados en la presente invencion: Singleton y coI., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger y coI. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Tal como se usa en el presente documento, Ios siguientes terminos tienen Ios significados que se les atribuyen a menos que se especifique Io contrario.
Cuando se introducen elementos de la presente divulgacion o de la(s) realizacion(es) preferida(s) de la(s) misma(s), Ios artmulos "un", "una", "el", "la" y "dicho" pretenden significar que son uno o mas de Ios elementos. Las expresiones "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pretenden ser inclusivas y significar que pueden ser elementos adicionales que no sean Ios elementos enumerados.
Tal como se usa en el presente documento, la expresion "secuencia endogena" se refiere a una secuencia cromosomica que es natural para la celula.
El termino "exogena", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia se refiere a una secuencia que no es natural para la celula, o una secuencia cuya localizacion natural en el genoma de la celula esta en una localizacion cromosomica diferente.
Un "gen", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una region de ADN (incluyendo exones e intrones) que codifica un producto genico, asf como a todas las regiones de ADN que regulan la produccion del producto genico, tanto si tales secuencias reguladoras son adyacentes o no a secuencias codificantes y/o transcritas. En consecuencia, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traduccion tales como sitios de union a ribosomas y sitios de entrada interna en ribosomas, potenciadores, silenciadores, aislantes, elementos limitantes, ongenes de replicacion, sitios de union a matriz y regiones de control de Iocus.
El termino "heterologo" se refiere a una entidad que no es endogena o natural para la celula de interes. Por ejemplo,
una protema heterologa se refiere a una protema que proviene de o que originalmente proviene de una fuente exogena, tal como una secuencia de acido nucleico introducida de manera exogena. En algunos casos, la protema heterologa no se produce normalmente por la celula de interes.
Las expresiones "acido nucleico" y "polinucleotido" se refieren a un pokmero de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, de conformacion lineal o circular y en forma monocatenaria o bicatenaria. Para los fines de la presente divulgacion, estos terminos no deben interpretarse como limitantes con respecto a la longitud de un pokmero. Estos terminos pueden abarcar los analogos conocidos de los nucleotidos naturales, asf como nucleotidos que se modifican en la base, restos de azucar y/o fosfatos (por ejemplo, estructuras principales de fosforotioatos). En general, un analogo de un nucleotido particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases; es decir, un analogo de A emparejara su base con T.
El termino "nucleotido" se refiere a desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos. Los nucleotidos pueden ser nucleotidos covencionales (es decir, adenosina, guanosina, citidina, timidina y uridina) o analogos de nucleotido. Un analogo de nucleotido se refiere a un nucleotido que tiene una base de purina o de pirimidina modificada o un resto de ribosa modificado. Un analogo de nucleotido puede ser un nucleotido de origen natural (por ejemplo, inosina) o un nucleotido de origen no natural. Los ejemplos no limitantes de modificaciones en los restos de azucar o de base de un nucleotido incluyen la adicion (o eliminacion) de grupos acetilo, grupos amino, grupos carboxilo, grupos carboximetilo, gupos hidroxilo, grupos metilo, grupos fosforilo y grupos tiol, asf como la sustitucion de los atomos de carbono y nitrogeno de las bases por otros atomos (por ejemplo, 7-deaza purinas). Los analogos de nucleotidos tambien incluyen didesoxinucleotidos, 2'-0-metil nucleotidos, acidos nucleicos bloqueados (LNA), acidos péptidonucleicos (PNA) y morfolinos.
Los terminos "polipéptido" y "protema" se usan de manera intercambiable para referirse a un pokmero de restos de aminoacidos.
Las tecnicas para determinar la identidad de secuencia de acido nucleico y de aminoacidos se conocen en la materia. Normalmente, tales tecnicas incluyen la determinacion de la secuencia de nucleotidos de un ARNm para un gen y/o la determinacion de la secuencia de aminoacidos codificada por la misma, y la comparacion de estas secuencias con una segunda secuencia de nucleotidos o de aminoacidos. Las secuencias genomicas tambien se pueden determinar y comparar de esta manera. En general, identidad se refiere a una correspondencia exacta nucleotido a nucleotido o aminoacido a aminoacido de dos polinucleotidos o secuencias polipeptidicas, respectivamente. Dos o mas secuencias (de polinucleotidos o aminoacidos) se pueden comparar determinando su porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad de dos secuencias, sean secuencias de acido nucleico o de aminoacidos, es el numero de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de las secuencias mas cortas y multiplicado por 100. Un alineamiento aproximado para las secuencias de acido nucleico se proporciona mediante el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo se puede aplicar a las secuencias de aminoacidos usando la matriz de puntuacion desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EEUU, y normalizada por Gribskov, NucI. Acids Res.
14(6):6745-6763 (1986). Una implementacion ejemplar de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia se proporciona por el Genetics Computer Group (Madison, Wis.) en la aplicacion de utilidad "BestFit". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o la similitud entre secuencias son generalmente conocidos en la materia, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parametros por defecto. Por ejemplo, se pueden usar BLASTN y BLASTP usando Ios siguientes parametros por defecto: genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Los detalles de estos programas se pueden encontrar en la pagina web de GenBank.
Como se pueden hacer diversos cambios en las celulas mencionadas y procedimientos sin apartarse del ambito de la invencion, se pretende que toda la materia contenida en la descripcion anterior y en Ios ejemplos que figuran a continuacion, se puedan interpretar como ilustrativos y no en un sentido limitante.
Ejemplos ilustrativos
Los siguientes ejemplos ilustran determinados aspectos de la divulgacion.
Ejemplo ilustrativo 1: Modifioaoion del gen Cas9 para la expresion en mam^feros
Un gen Cas9 de la cepa MGAS15252 de Streptococcus pyogenes (Numero de referenda YP_005388840.1) se optimizo con el codon de Homo sapiens de preferencia para potenciar su traduccion en celulas de mairnfero. El gen Cas9 tambien se modifico anadiendo una senal de localizacion PKKKRKV (SEQ ID NO:1) en el extremo C-terminal para dirigir la protema a Ios nucleos de las celulas de marnfero. La Tabla 1 presenta la secuencia de aminoacidos de Cas9 modificada, con la secuencia de localizacion nuclear subrayada. La Tabla 2 presenta la secuencia de ADN de Cas9 modificada y optimizada con codon.
continuacion
(continuacion)
( )______________________________________________________________
La secuencia de ADN de Cas9 modificada se coloco en el control del promotor de citomegalovirus (CMV) para la expresion constituyente en celulas de marnfero. La secuencia de ADN de CAs9 modificada tambien se coloco en el promotor de control T7 para la síntesis in vitro de ARNm con la ARN polimerasa T7. La transcripcion in vitro de ARN se realizo usando el kit MessageMAX T7 ARCA-Capped Message Transcription y el sistema de produccion de ARNm T7 mScript Standard (Cellscript).
Ejemplo ilustrativo 2: Cas9 de direccionamiento
El locus del sitio de integracion 1 del virus adenoasociado (AAVS1) se uso como una diana para la modificacion del genoma humano mediada por Cas9. El locus AAVS1 humano se localiza en el intron 1 (4427 pb) de la protema fosfatasa 1, subunidad reguladora 12C (PPP1 R12C). La Tabla 3 presenta el primer exon (sombreado en gris) y el primer intron de PPP1 R12C. La secuencia subrayada en el intron es el sitio de modificacion dirigida (es decir, el locus AAVS1).
continuacion
________________________________________(continuacion)_______________________________________
Los ARN gmas de Cas9 se disenaron para el direccionamiento del locus humano AAVS1. Un ARN de 42 nucleotidos (denominado en el presente documento como una secuencia "ARNcr") que comprende (de 5' a 3') una secuencia de reconocimiento diana (es decir, una secuencia complementaria con la hebra no codificante de la secuencia diana) y secuencia de protoespaciador; un ARN de 85 nucleotidos (denominado en el presente documento como una secuencia de "ARNtracr") que comprende la secuencia 5' con complementariedad con la secuencia 3' del ARNcr y una secuencia de horquilla adicional; y un ARN quimerico que comprende los nucleotidos 1-32 del ARNcr, un bucle GAAA y los nucleotidos 19-45 del ARNtracr se preparo. El ARNcr se sintetizo qmmicamente por Sigma-Aldrich. El ARNtracr y el ARN quimerico se sintetizo mediante transcripcion in vitro con a Rn polimerasa T7 usando el kit T7-Scribe Standard RNA IVT (Cellscript). La secuencia codificante de ARN quimerico tambien se coloco en el control del promotor humano U6 para la transcripcion in vivo en celulas humanas. La Tabla 4 presenta las secuencias de los Ar N gmas.
Ejemplo ilustrativo 3: Preparacion del polinucleotido donador para controlar la modificacion del genoma
Se uso la integration dirigida de una protema GFP en el extremo N-terminal de PPP1 R12C para controlar la modification del genoma mediada por Cas9. Para mediar la integration mediante recombination homologa se preparo un polinucleotido donador. El donador de ADN de AAVS1-GFP contema en 5’ un brazo homologo del locus AAVS1 (1185 pb), un receptor de corte y empalme de ARN, una secuencia codificante de turbo GFP, un finalizador de transcription en 3’, y un brazo homologo del locus AAVS1 en 3’ (1217 pb). La Tabla 5 presenta las secuencias del receptor de corte y empalme de ARN y la secuencia codificante de GFP seguida por el finalizador de transcription en 3’. El ADN del plasmido se preparo usando el kit GenElute Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep (Sigma).
La integration de genes dirigida dara como resultado una protema de fusion entre los primeros 107 aminoacidos de la PPP1 R12C y la turbo GFP. La protema de fusion esperada contiene los primeros 107 restos de aminoacidos de
PPP1R12C (resaltado en gris) de corte y empalme de ARN entre el primer exon de PPP1 R12C y el receptor de corte y empalme disenado por ingeniena genetica (vease la Tabla 6).
Ejemplo ilustrativo 4: Integration dirigida mediada por Cas9
La transfeccion se realizo en celulas K562 humanas. La lmea celular K562 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivo en medio de Dulbecco modificado por Iscove, suplementado con FBS al 10 % y L-glutamina 2 mM. Todos los medios y suplementos se obtuvieron de Sigma-Aldrich. Los cultivos se dividieron un d^ a antes de la transfeccion (a aproximadamente 0,5 millones de celulas por ml antes de la transfeccion). Las celulas se transfectaron con Solucion V de Nucleofector (Lonza) en un Nucleofector (Lonza) con el programa T-016. Cada nucleofeccion contema aproximadamente 0,6 millones de celulas. Los tratamientos de transfeccion se detallan en la Tabla 7. Las celulas se cultivaron a 37 °C y CO2 al 5 % inmediatamente tras la nucleofeccion.
La clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACs ) se realizo 4 dfas tras la transfeccion. Los datos de FACS se presentan en la FIG. 2. El porcentaje de GFP detectada en cada uno de los cuatro tratamientos experimentales (A-D) fue mayor que en los tratamientos de control (E, F), confirmando la integracion de la secuencia donadora y la expresion de la protema de fusion.
Ejemplo ilustrativo 5: Confirmation por PCR de la integration dirigida
El ADN genomico se extrajo de las celulas transfectadas con el kit GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep (Sigma) 12 dfas despues de la transfeccion. El ADN genomico se amplifico entonces por PCR con un cebador hacia delante localizado fuera del brazo homologo en 5' del donador del plasmido AAVSl-GFP y un cebador inverso localizado en la region 5' de la GFP. El cebador hacia delante fue 5'-CCACTCTGTGCTGa CcACTCT-3' (SEQ ID NO:18) y el cebador inverso fue 5'-GCGGCACTCGATCTCCA-3' (SEQ ID NO:19). El tamano del fragmento esperado de la PCR de union fue de 1388 pb. La amplificacion se llevo a cabo con JumpStart Taq ReadyMix (Sigma), usando las siguientes condiciones de ciclacion: 98 °C durante 2 minutos para la desnaturalizacion inicial; 35 ciclos de 98 °C durante 15 segundos, 62 °C durante 30 segundos, y 72 °C durante 1 minuto y 30 segundos; y una extension final a 72 °C durante 5 minutos. Los productos de PCR se resolvieron en gel de agarosa al 1 %.
Las celulas transfectadas con 10 |jg de ARNm de Cas9 transcrito con un analogo de casquete anti-inverso, 0,3 nmol de doble cadena de ARNct-ARNtracr prealineada, y 10 jg ADN del plasmido AAVSl-GFP presentaron un producto de PCR del tamano esperado (vease el carril A, FIG. 3).
Ejemplo ilustrativo 6: Modificacion de genoma en embriones de raton basada en Cas9
El Iocus Rosa26 de raton se puede dirigir para modificaciones genomicas. La Tabla 8 presenta una porcion de la secuencia de Rosa26 de raton en la que Ios posibles sitios diana se muestran en negrita. Cada sitio diana comprende un protoespaciador.
Los ARN gmas se disenaron para direccionar cada uno de Ios sitios diana en el Iocus Rosa26 de raton. Estas secuencias se muestran en la Tabla 9, cada una es de 42 nucleotidos de longitud y la region 5' es complementaria a la hebra que no se presenta en la Tabla 8 (es decir, la hebra que es complementaria a la hebra mostrada en la Tabla 8).
Los ARNcr se sintetizaron qmmicamente y se prealinearon con el ARNtracr (SEQ ID NO:13; vease el Ejemplo 2). El ARNcr / ARNtracr prealineado y el ARNm transcrito in vitro que codifica la protema Cas9 modificada (s Eq ID NO. 9; vease el Ejemplo 1) se pueden microinyectar en Ios pronucleos de embriones de raton fecundados. Tras la gma hacia la diana establecida por el ARNcr, la protema Cas9 escinde el sitio diana, y la rotura de doble cadena resultante se puede reparar mediante un proceso de reparacion por union de extremos no homologos (NHEJ). Los embriones inyectados se pueden incubar bien a 37 °C, con CO2 al 5 % durante la noche 0 durante hasta 4 dfas, seguido por el analisis de genotipado, 0 Ios embriones inyectados se pueden implantar en Ios ratones hembra receptores de manera que se puedan genotipar Ios animales nacidos vivos. Los embriones incubados in vitro 0 Ios tejidos de Ios animales nacidos vivos se pueden explorar para la presencia de una mutacion inducida por Cas9 en el Iocus Rosa usando Ios procedimientos convencionales. Por ejemplo, Ios embriones 0 tejidos de fetos 0 animales nacidos vivos se pueden recolectar para la extraccion y el analisis de ADN. El ADN se puede aislar usando procedimientos convencionales. La region dirigida del Iocus Rosa26 se puede amplificar por PCR usando cebadores apropiados. Dado que la NHEJ es propensa a errores, las deleciones de al menos un nucleotido, las inserciones de al menos un nucleotido, las sustituciones de al menos un nucleotido 0 las combinaciones de las mismas pueden tener lugar durante la reparacion de la rotura. Las mutaciones se pueden detectar usando procedimientos de genotipado basados en PCR, tales como Ios ensayos de emparejamiento incorrecto Cel-l y de secuenciacion de a d n .
Ejemplo ilustrativo 7: Modificacion de genoma en embriones de raton basada en Cas9
El Iocus Rosa26 se puede modificar en embriones de raton mediante coinyeccion de un polinucleotido donador, tal como se detalla anteriormente en la seccion (lll)(d), Junto con el ARNcr / ARNtracr prealineado y el ARNm que codifica la Cas9 modificada tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 6. Los embriones incubados in vitro o Ios tejidos de animales nacidos vivos (tal como se describe en el Ejemplo 6) se pueden explorar para un Iocus Rosa26 usando procedimientos de genotipado basados en PCR, tales como Ios ensayos RFLp , PCR de union, y secuenciacion de ADN.
Ejemplo ilustrativo 8: Modificacion de genoma en embriones de rata basada en Cas9
El Iocus Rosa26 de rata se puede dirigir para modificaciones genomicas. La Tabla 10 presenta una porcion de la secuencia de rata en la que Ios posibles sitios diana se muestran en negrita. Cada sitio diana comprende un protoespaciador.
Los ARN gmas se disenaron para direccionar cada uno de Ios sitios diana en el Iocus Rosa26 de rata. Estas secuencias se muestran en la Tabla 11, cada una es de 42 nucleotidos de longitud y la region 5' es complementaria a la hebra que no se presenta en la Tabla 10 (es decir, la hebra que es complementaria a la hebra mostrada en la Tabla 10).
Los ARNcr se sintetizaron qmmicamente y se prealinearon con el ARNtracr (SEQ ID NO:13; vease el Ejemplo 2). El ARNcr / ARNtracr prealineado y el ARNm transcrito in vitro que codifica la protema Cas9 modificada (s Eq ID NO. 9; vease el Ejemplo 1) se pueden microinyectar en Ios pronucleos de embriones de rata fecundados. Tras la gma hacia el sitio diana por el ARNcr, la protema Cas9 escinde el sitio diana, y la rotura de doble cadena resultante se puede reparar mediante un proceso de reparacion por union de extremos no homologos (NHEJ). Los embriones inyectados se pueden incubar bien a 37 °C, con CO2 al 5 % durante la noche 0 durante hasta 4 dfas, seguido por el analisis de genotipado, 0 Ios embriones inyectados se pueden implantar en Ios ratones hembra receptores de manera que se puedan genotipar Ios animales nacidos vivos. Los embriones incubados in vitro 0 Ios tejidos de Ios animales nacidos vivos se pueden explorar para la presencia de una mutacion inducida por Cas9 en el Iocus Rosa usando Ios procedimientos convencionales. Por ejemplo, Ios embriones 0 tejidos de fetos 0 animales nacidos vivos se pueden recolectar para la extraccion y el analisis de ADN. El ADN se puede aislar usando procedimientos convencionales. La region dirigida del Iocus Rosa26 se puede amplificar por PCR usando cebadores apropiados. Dado que la NHEJ
Claims (46)
1. Un procedimiento para modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota, comprendiendo el procedimiento:
a) Introducir en la celula eucariota dos sistemas de nickasa guiados por ARN o acido nucleico que codifica dichos sistemas, y, opcionalmente, un polinucleotido donador, en el que cada sistema de nickasa guiado por ARN comprende
(i) Una endonucleasa guiada por ARN que se modifica para escindir una cadena de una secuencia de cadena doble; y
(ii) Un ARN gma que comprende una primera region que tiene complementariedad con un sitio diana en la secuencia cromosomica y una segunda region que interactua con la endonucleasa guiada por ARN, en la que cada sitio diana esta seguido inmediatamene por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), y los sitios diana de las dos endonucleasas guiadas por ARN estan en cadenas opuestas de la secuencia cromosomica; y
b) Cultivar la celula eucariotica de manera que las dos endonucleasas guiadas por ARN escinden cadenas opuestas de la secuencia cromosomica en estrecha cercama, lo suficiente como para introducir una rotura de cadena doble en la secuencia cromosomica, y reparar la rotura de cadena doble mediante un proceso de reparacion de ADN que lleva a la modificacion de la secuencia cromosomica, en la que
el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano y, en el que el procedimiento no comprende un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia.
2. Un procedimiento ex vivo o in vitro para modificar una secuencia cromosomica en una celula eucariota, comprendiendo el procedimiento:
a) introducir en la celula eucariota dos sistemas de nickasa guiados por ARN o acido nucleico que codifica dichos sistemas, y, opcionalmente, un polinucleotido donador, en el que cada sistema de nickasa guiado por ARN comprende
(i) una endonucleasa guiada por ARN que se modifica para escindir una cadena de una secuencia de cadena doble; y
(ii) un ARN gma que comprende una primera region que tiene complementariedad con un sitio diana en la secuencia cromosomica y una segunda region que interacciona con la endonucleasa guiada por ARN, en el que cada sitio diana esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) y los sitios diana de las dos endonucleasas guiadas por ARN estan en cadenas opuestas de la secuencia cromosomica; y
b) cultivar la celula eucariota, de manera que las dos endonucleasas guiadas por ARN escindan cadenas opuestas de la secuencia cromosomica en estrecha cercama, lo suficiente como para introducir una rotura de cadena doble en la secuencia cromosomica, y reparar la rotura de cadena doble mediante un proceso de reparacion de ADN que lleva a la modificacion de la secuencia cromosomica, en el que
el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genetica de la lmea germinal de un ser humano.
3. El procedimiento de la reivindicacion 1 o de la reivindicacion 2, en el que cada endonucleasa guiada por ARN deriva de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y espaciadas de forma regular (CRISPR)/sistema proteico de (Cas) asociado a CRISPR (CRISPR/Cas) de tipo II.
4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que la protema del sistema CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9.
5. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que la protema Cas9 comprende una mutacion en el dominio RuvC o h n h .
6. El procedimiento de cualquier reivindicacion previa, en el que cada endonucleasa guiada por ARN comprende adicionalmente al menos un dominio adicional elegido de una senal de localizacion nuclear, un dominio de penetracion celular, o un dominio marcador.
7. El procedimiento de cualquier reivindicacion previa, en el que el sitio diana es un locus Rosa26, un locus HPRT o un Iocus AAVS1.
8. El procedimiento de cualquier reivindicacion previa, en el que el polinucleotido donador comprende una secuencia donadora que tiene al menos un cambio de nucleotido en relacion con la secuencia cromosomica cerca de Ios sitios diana en la secuencia cromosomica.
9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que la secuencla donadora esta flanqueada por secuenclas que tlenen identidad de secuencia sustancial con secuencias localizadas agua arriba y aguas debajo del sitio diana en la secuencia cromosomica.
10. El procedimiento de la reivindicacion 8 o de la reivindicacion 9, en el que la secuencia donadora esta flanqueada por proyecciones cortas que son compatibles con proyecciones generadas por la endonucleasa guiada por ARN.
11. El procedimiento de cualquier reivindicacion previa, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN es ARNm y el acido nucleico que codifica cada ARN gma es ADN.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN es ADN y el acido nucleico que codifica cada ARN gma es ADN.
13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que el ADN es parte de un vector que comprende adicionalmente una secuencia de control del promotor que esta operativamente unida al acido nucleico que codifica la endonucleasa guiada por ARN y una secuencia de control del promotor que esta operativamente unida al acido nucleico que codifica el ARN gma.
14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la celula eucariota es una celula humana, una celula de mairnfero no humano, o un embrion de marnfero no humano.
15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la celula eucariota es una celula de invertebrado, una celula de insecto, una celula de planta, una celula de levadura o un organismo eucariota unicelular.
16. El procedimiento de la reivindicacion 15, en el que la celula eucariota es una celula de planta.
17. El procedimiento de la reivindicacion 14, en el que la celula humana o la celula de marnfero no humano es un linfocito T.
18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que la celula eucariota esta in vitro.
19. El procedimiento de cualquier reivindicacion previa, en el que el polinucleotido donador no se introduce en la celula eucariota, y la reparacion de la rotura de cadena doble mediante un proceso de reparacion de union de extremos no homologos da como resultado la inactivacion de la secuencia cromosomica.
20. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que el polinucleotido donador se introduce en la celula eucariota, y la reparacion de la rotura de cadena doble da como resultado un cambio de al menos un nucleotido en la secuencia cromosomica.
21. El procedimiento de la reivindicacion 20, en el que el cambio comprende una integracion de una secuencia exogena.
22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o 14-21, en el que el al menos uno ARN gma se sintetiza qmmicamente.
23. Una composicion que comprende al menos dos sistemas de nickasa guiados por ARN, comprendiendo cada sistema de nickasa guiado por ARN (i) una endonucleasa guiada por ARN que se modifica para escindir una cadena de una secuencia de cadena doble, y (ii) un ARN gma que comprende una primera region que tiene complementariedad con un sitio diana en una secuencia cromosomica y una segunda region que interactua con la endonucleasa guiada por ARN, en la que cada sitio diana esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM), y los sitios diana de dos endonucleasas guiadas por ARN estan en cadenas opuestas de la secuencia cromosomica y en estrecha cercama, lo suficiente como para introducir una rotura de cadena doble en la secuencia cromosomica.
24. La composicion de la reivindicacion 23, en la que cada endonucleasa guiada por ARN deriva de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y espaciadas de forma regular (CRISPR)/sistema proteico de (Cas) asociado a CRISPR (CRISPR/Cas) de tipo II.
25. La composicion de la reivindicacion 24, en la que la protema del sistema CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9.
26. La composicion de la reivindicacion 25, en la que la protema Cas9 comprende una mutacion en el dominio RuvC o HNH.
27. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 23-26, en la que cada endonucleasa guiada por ARN comprende adicionalmente al menos un dominio adicional elegido de una senal de localizacion nuclear, un dominio de penetracion celular, o un dominio marcador.
28. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 23-27, en la que el sitio dlana es un Iocus Rosa26, un Iocus HPRT, o un Iocus AAVS1.
29. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 23-28, en la que el al menos uno ARN gma se sintetiza qmmicamente.
30. Un acido nucleico que codifica la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 23-28.
31. El acido nucleico de la reivindicacion 30, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN es ARNm y el acido nucleico que codifica cada ARN gma es ADN.
32. El acido nucleico de la reivindicacion 30, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN es ADN y el acido nucleico que codifica cada ARN gma es ADN.
33. Un vector que comprende el acido nucleico de la reivindicacion 32, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN esta unido de manera operativa a una secuencia de control del promotor para la expresion en una celula eucariota, y el acido nucleico que codifica cada ARN gma esta unido de forma operativa a una secuencia de control del promotor para la expresion en una celula eucariota.
34. Un kit que comprende al menos dos sistemas de nickasa guiados por ARN o acido nucleico que codifica dichos sistemas, comprendiendo cada sistema de nickasa guiado por ARN (i) una endonucleasa guiada por ARN que se modifica para escindir una cadena de una secuencia de cadena doble y (ii) un ARN gma que comprende una primera region que tiene complementariedad con un sitio diana en una secuencia cromosomica y una segunda region que interacciona con la endonucleasa guiada por ARN, en la que cada sitio diana esta seguido inmediatamente por un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) y Ios sitios diana de dos endonucleasas guiadas por ARN estan en cadenas opuestas de la secuencia cromosomica y en estrecha cercama, Io suficiente como para introducir una rotura de cadena doble en la secuencia cromosomica.
35. El kit de la reivindicacion 34, que comprende adicionalmente al menos un polinucleotido donador.
36. El kit de la reivindicacion 34 o la reivindicacion 35, en la que cada endonucleasa guiada por ARN deriva de repeticiones palindromicas cortas agrupadas y espaciadas de forma regular (CRISPR)/sistema proteico de (Cas) asociado a CRISPR (CRISPR/Cas) de tipo II.
37. El kit de la reivindicacion 36, en el que la protema del sistema CRISPR/Cas de tipo II es una protema Cas9.
38. El kit de la reivindicacion 37, en el que la protema Cas9 comprende una mutacion en el dominio RvC o HNH.
39. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 34-38, en el que cada endonucleasa guiada por ARN comprende adicionalmente al menos un dominio adicional elegido de una senal de localizacion nuclear, un dominio de penetracion celular, o un dominio marcador.
40. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 34-39, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN es ARNm y el acido nucleico que codifica cada ARN gma es ADN.
41. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 34-39, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN es ADN y el acido nucleico que codifica cada ARN gma es ADN.
42. El kit de la reivindicacion 41, en el que el acido nucleico que codifica cada endonucleasa guiada por ARN esta unido de manera operativa a una secuencia de control de promotor para la expresion en una celula eucariota, y el acido nucleico que codifica cada ARN gma esta unido de manera operativa a una secuencia de control del promotor para la expresion en una celula eucariota.
43. El kit de la reivindicacion 35, en el que el polinucleotido donador comprende una secuencia donadora.
44. El kit de la reivindicacion 43, en el que la secuencia donadora esta flanqueada por secuencias que tienen identidad de secuencia sustancial con secuencias en cualquiera de Ios lados de Ios sitios diana en la secuencia cromosomica.
45. El kit de la reivindicacion 43, en el que la secuencia donadora esta flanqueada por proyecciones cortas que son compatibles con proyecciones generadas por la endonucleasa guiada por a Rn .
46. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 34-39 o 43-45, en el que el al menos uno ARN gma se sintetiza qmmicamente.
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| EP2861737B1 (en) | 2012-06-19 | 2019-04-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Gene targeting in plants using dna viruses |
| AU2013280661A1 (en) | 2012-06-25 | 2015-01-22 | Gen9, Inc. | Methods for nucleic acid assembly and high throughput sequencing |
| KR102530118B1 (ko) * | 2012-07-25 | 2023-05-08 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 유도 ｄｎａ 결합 단백질 및 게놈 교란 도구 및 이의 적용 |
| EP4357457B1 (en) * | 2012-10-23 | 2024-10-16 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof |
| ES2778033T3 (es) | 2012-11-16 | 2020-08-07 | Poseida Therapeutics Inc | Enzimas específicas de sitio y métodos de uso |
| EP3363902B1 (en) | 2012-12-06 | 2019-11-27 | Sigma Aldrich Co. LLC | Crispr-based genome modification and regulation |
| AU2013359262C1 (en) * | 2012-12-12 | 2021-05-13 | Massachusetts Institute Of Technology | CRISPR-Cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| DK2931897T3 (en) | 2012-12-12 | 2018-02-05 | Broad Inst Inc | CONSTRUCTION, MODIFICATION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTICAL APPLICATIONS |
| WO2014093709A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| DK2931898T3 (en) | 2012-12-12 | 2016-06-20 | Massachusetts Inst Technology | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS |
| WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| CA2894684A1 (en) * | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering and optimization of improved crispr-cas systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| CN105121648B (zh) * | 2012-12-12 | 2021-05-07 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化 |
| WO2014093718A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| CA2895155C (en) * | 2012-12-17 | 2021-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided human genome engineering |
| WO2014131833A1 (en) | 2013-02-27 | 2014-09-04 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases |
| EP3578666A1 (en) | 2013-03-12 | 2019-12-11 | President and Fellows of Harvard College | Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix |
| MX374090B (es) | 2013-03-14 | 2025-03-05 | Caribou Biosciences Inc | Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos al ácido nucleico. |
| WO2014204578A1 (en) | 2013-06-21 | 2014-12-24 | The General Hospital Corporation | Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing |
| US20140273230A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
| AU2014227653B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-04-20 | The General Hospital Corporation | Using RNA-guided foki nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing |
| US20140273235A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Regents Of The University Of Minnesota | ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| US9828582B2 (en) | 2013-03-19 | 2017-11-28 | Duke University | Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression |
| US20160186208A1 (en) * | 2013-04-16 | 2016-06-30 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods of Mutating, Modifying or Modulating Nucleic Acid in a Cell or Nonhuman Mammal |
| SI2986729T1 (sl) | 2013-04-16 | 2019-02-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ciljana sprememba genoma podgane |
| CN105683376A (zh) * | 2013-05-15 | 2016-06-15 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于治疗遗传病状的方法和组合物 |
| US20160122774A1 (en) * | 2013-05-29 | 2016-05-05 | Cellectis | A method for producing precise dna cleavage using cas9 nickase activity |
| EP4596565A3 (en) | 2013-06-04 | 2025-11-05 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided transcriptional regulation |
| US20140356956A1 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-04 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-Guided Transcriptional Regulation |
| EP3004370B1 (en) * | 2013-06-05 | 2024-08-21 | Duke University | Rna-guided gene editing and gene regulation |
| CN105531372A (zh) | 2013-06-14 | 2016-04-27 | 塞尔克蒂斯股份有限公司 | 植物中非转基因基因组编辑方法 |
| EP3725885A1 (en) | 2013-06-17 | 2020-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof |
| MX2015017312A (es) * | 2013-06-17 | 2017-04-10 | Broad Inst Inc | Suministro y uso de composiciones, vectores y sistemas crispr-cas para la modificación dirigida y terapia hepáticas. |
| KR20160019553A (ko) * | 2013-06-17 | 2016-02-19 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 유사분열 후 세포의 질병 및 장애를 표적화하고 모델링하기 위한 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 유전자 조작 및 최적화 |
| EP3011030B1 (en) * | 2013-06-17 | 2023-11-08 | The Broad Institute, Inc. | Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| KR20250012194A (ko) * | 2013-06-17 | 2025-01-23 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용 |
| WO2014204724A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | The Broad Institute Inc. | Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| WO2015006294A2 (en) * | 2013-07-10 | 2015-01-15 | President And Fellows Of Harvard College | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing |
| US10563225B2 (en) * | 2013-07-26 | 2020-02-18 | President And Fellows Of Harvard College | Genome engineering |
| US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
| CA3109801C (en) | 2013-08-22 | 2024-01-09 | Andrew Cigan | Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use |
| US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
| US9340799B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | MRNA-sensing switchable gRNAs |
| US9526784B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-12-27 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery system for functional nucleases |
| US9388430B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-07-12 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| EP3418379B1 (en) | 2013-09-18 | 2020-12-09 | Kymab Limited | Methods, cells & organisms |
| WO2015065964A1 (en) | 2013-10-28 | 2015-05-07 | The Broad Institute Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, screens and applications thereof |
| WO2015066119A1 (en) | 2013-10-30 | 2015-05-07 | North Carolina State University | Compositions and methods related to a type-ii crispr-cas system in lactobacillus buchneri |
| AU2014346559B2 (en) | 2013-11-07 | 2020-07-09 | Editas Medicine,Inc. | CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAs |
| US9546384B2 (en) | 2013-12-11 | 2017-01-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome |
| SMT201800653T1 (it) | 2013-12-11 | 2019-01-11 | Regeneron Pharma | Metodi e composizioni per la modificazione indirizzata a bersaglio di un genoma |
| JP6793547B2 (ja) | 2013-12-12 | 2020-12-02 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | 最適化機能ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系による配列操作のための系、方法および組成物 |
| EP3080259B1 (en) | 2013-12-12 | 2023-02-01 | The Broad Institute, Inc. | Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation |
| US20150165054A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
| MX2016007325A (es) | 2013-12-12 | 2017-07-19 | Broad Inst Inc | Composiciones y metodos de uso de sistemas crispr-cas en desordenes debidos a repeticion de nucleotidos. |
| WO2015089364A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | The Broad Institute Inc. | Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof |
| AU2014361834B2 (en) | 2013-12-12 | 2020-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular Cas enzymes |
| BR112016013207A2 (pt) | 2013-12-12 | 2017-09-26 | Massachusetts Inst Technology | administração, uso e aplicações terapêuticas dos sistemas crispr-cas e composições para o hbv e distúrbios e doenças virais |
| AU2014361781B2 (en) | 2013-12-12 | 2021-04-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing |
| US10787654B2 (en) * | 2014-01-24 | 2020-09-29 | North Carolina State University | Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting |
| EP4063503A1 (en) | 2014-02-11 | 2022-09-28 | The Regents of the University of Colorado, a body corporate | Crispr enabled multiplexed genome engineering |
| JP2017506893A (ja) | 2014-02-18 | 2017-03-16 | デューク ユニバーシティ | ウイルス複製不活化組成物並びにその製造方法及び使用 |
| WO2015134812A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating usher syndrome and retinitis pigmentosa |
| US11339437B2 (en) | 2014-03-10 | 2022-05-24 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| WO2015138510A1 (en) | 2014-03-10 | 2015-09-17 | Editas Medicine., Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating leber's congenital amaurosis 10 (lca10) |
| US11141493B2 (en) | 2014-03-10 | 2021-10-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating CEP290-associated disease |
| CA2943622A1 (en) * | 2014-03-25 | 2015-10-01 | Editas Medicine Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids |
| US11242525B2 (en) | 2014-03-26 | 2022-02-08 | Editas Medicine, Inc. | CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating sickle cell disease |
| US12460231B2 (en) | 2014-04-02 | 2025-11-04 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/CAS-related methods and compositions for treating primary open angle glaucoma |
| US11439712B2 (en) | 2014-04-08 | 2022-09-13 | North Carolina State University | Methods and compositions for RNA-directed repression of transcription using CRISPR-associated genes |
| WO2015168125A1 (en) | 2014-04-28 | 2015-11-05 | Recombinetics, Inc. | Multiplex gene editing in swine |
| EP3152319A4 (en) * | 2014-06-05 | 2017-12-27 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for nuclease design |
| RS60359B1 (sr) | 2014-06-06 | 2020-07-31 | Regeneron Pharma | Postupci i kompozicije za modifikovanje ciljanog lokusa |
| DK3155101T3 (da) | 2014-06-16 | 2020-05-04 | Univ Johns Hopkins | Sammensætninger og fremgangsmåder til ekspression af CRISPR-leder-RNA´er under anvendelse af H1-promotoren |
| EP3157328B1 (en) * | 2014-06-17 | 2021-08-04 | Poseida Therapeutics, Inc. | A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof |
| HUE049405T2 (hu) * | 2014-06-23 | 2020-09-28 | Regeneron Pharma | Nukleáz-közvetített DNS-összeállítás |
| KR102386101B1 (ko) | 2014-06-26 | 2022-04-14 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 그 조성물, 및 사용 방법 |
| WO2016007604A1 (en) * | 2014-07-09 | 2016-01-14 | Gen9, Inc. | Compositions and methods for site-directed dna nicking and cleaving |
| WO2016007839A1 (en) | 2014-07-11 | 2016-01-14 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for high-throughput labelling and detection of biological features in situ using microscopy |
| ES3047792T3 (en) * | 2014-07-14 | 2025-12-04 | Univ California | Crispr/cas transcriptional modulation |
| WO2016022363A2 (en) | 2014-07-30 | 2016-02-11 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9 proteins including ligand-dependent inteins |
| CN106922154B (zh) | 2014-08-06 | 2022-01-07 | 基因工具股份有限公司 | 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑 |
| EP3633032A3 (en) | 2014-08-28 | 2020-07-29 | North Carolina State University | Novel cas9 proteins and guiding features for dna targeting and genome editing |
| WO2016036754A1 (en) | 2014-09-02 | 2016-03-10 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification |
| CN108064129A (zh) | 2014-09-12 | 2018-05-22 | 纳幕尔杜邦公司 | 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法 |
| WO2016057951A2 (en) * | 2014-10-09 | 2016-04-14 | Life Technologies Corporation | Crispr oligonucleotides and gene editing |
| DK3204399T3 (da) * | 2014-10-09 | 2025-02-24 | Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst | Lange poly (a)-plasmider og fremgangsmåder til indføring af lange poly (a)-sekvenser i plasmidet |
| EP3204496A1 (en) | 2014-10-10 | 2017-08-16 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for promoting homology directed repair |
| DK3207124T3 (da) | 2014-10-15 | 2019-08-12 | Regeneron Pharma | Fremgangsmåder og sammensætninger til generering eller bevaring af pluripotente celler |
| GB201418965D0 (es) | 2014-10-24 | 2014-12-10 | Ospedale San Raffaele And Fond Telethon | |
| US20170306306A1 (en) * | 2014-10-24 | 2017-10-26 | Life Technologies Corporation | Compositions and Methods for Enhancing Homologous Recombination |
| CN107429246B (zh) * | 2014-10-31 | 2021-06-01 | 麻省理工学院 | 用于crispr的大规模并行组合遗传学 |
| CN107406838A (zh) * | 2014-11-06 | 2017-11-28 | 纳幕尔杜邦公司 | Rna引导的内切核酸酶向细胞中的肽介导的递送 |
| CA2963820A1 (en) | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Editas Medicine, Inc. | Methods for improving crispr/cas-mediated genome-editing |
| CN107532142A (zh) * | 2014-11-11 | 2018-01-02 | 应用干细胞有限公司 | 使用同源重组改造间充质干细胞 |
| US10858662B2 (en) | 2014-11-19 | 2020-12-08 | Institute For Basic Science | Genome editing with split Cas9 expressed from two vectors |
| ES2731437T3 (es) | 2014-11-21 | 2019-11-15 | Regeneron Pharma | Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida mediante el uso de pares de ARN guías |
| GB201421096D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Imp Innovations Ltd | Genome editing methods |
| US10900034B2 (en) | 2014-12-03 | 2021-01-26 | Agilent Technologies, Inc. | Guide RNA with chemical modifications |
| AU2015360502A1 (en) | 2014-12-10 | 2017-06-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease |
| EP3889260A1 (en) | 2014-12-12 | 2021-10-06 | The Broad Institute, Inc. | Protected guide rnas (pgrnas) |
| CN112877327B (zh) * | 2014-12-18 | 2024-11-22 | 综合基因技术公司 | 基于crispr的组合物和使用方法 |
| WO2016100857A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Stem cells for modeling type 2 diabetes |
| KR102530821B1 (ko) | 2014-12-19 | 2023-05-10 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 단일 단계 다중 표적화를 통한 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물 |
| WO2016106244A1 (en) | 2014-12-24 | 2016-06-30 | The Broad Institute Inc. | Crispr having or associated with destabilization domains |
| US11248240B2 (en) | 2015-01-29 | 2022-02-15 | Meiogenix | Method for inducing targeted meiotic recombinations |
| US10676726B2 (en) | 2015-02-09 | 2020-06-09 | Duke University | Compositions and methods for epigenome editing |
| EP3280803B1 (en) | 2015-04-06 | 2021-05-26 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation |
| CA2982966C (en) | 2015-04-24 | 2024-02-20 | Editas Medicine, Inc. | Evaluation of cas9 molecule/guide rna molecule complexes |
| WO2016176617A2 (en) | 2015-04-29 | 2016-11-03 | New York University | Method for treating high-grade gliomas |
| EP3292219B9 (en) | 2015-05-04 | 2022-05-18 | Ramot at Tel-Aviv University Ltd. | Methods and kits for fragmenting dna |
| AU2016261358B2 (en) | 2015-05-11 | 2021-09-16 | Editas Medicine, Inc. | Optimized CRISPR/Cas9 systems and methods for gene editing in stem cells |
| MX382223B (es) * | 2015-05-12 | 2025-03-13 | Sangamo Therapeutics Inc | Regulacion de expresion genica mediada por nucleasa. |
| KR20220139447A (ko) | 2015-05-29 | 2022-10-14 | 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티 | 크리스퍼 핵산을 사용하여 박테리아, 고세균, 조류 및 효모를 스크리닝하는 방법 |
| WO2016196887A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Dna editing using single-stranded dna |
| EP3307887A1 (en) | 2015-06-09 | 2018-04-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation |
| KR102468240B1 (ko) | 2015-06-15 | 2022-11-17 | 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티 | 핵산 및 rna-기반 항미생물제를 효율적으로 전달하기 위한 방법 및 조성물 |
| EP3929286A1 (en) * | 2015-06-17 | 2021-12-29 | Poseida Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome |
| TWI813532B (zh) | 2015-06-18 | 2023-09-01 | 美商博得學院股份有限公司 | 降低脱靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變 |
| WO2016205759A1 (en) | 2015-06-18 | 2016-12-22 | The Broad Institute Inc. | Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation |
| WO2016210271A1 (en) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Cell cycle dependent genome regulation and modification |
| GB2592821B (en) | 2015-07-31 | 2022-01-12 | Univ Minnesota | Modified cells and methods of therapy |
| CA3033909A1 (en) | 2015-08-14 | 2017-02-23 | The University Of Sydney | Connexin 45 inhibition for therapy |
| EP3341727B1 (en) | 2015-08-25 | 2022-08-10 | Duke University | Compositions and methods of improving specificity in genomic engineering using rna-guided endonucleases |
| US9512446B1 (en) | 2015-08-28 | 2016-12-06 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| US9926546B2 (en) | 2015-08-28 | 2018-03-27 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| AU2016316845B2 (en) | 2015-08-28 | 2022-03-10 | The General Hospital Corporation | Engineered CRISPR-Cas9 nucleases |
| AU2016326711B2 (en) | 2015-09-24 | 2022-11-03 | Editas Medicine, Inc. | Use of exonucleases to improve CRISPR/Cas-mediated genome editing |
| KR101745863B1 (ko) | 2015-09-25 | 2017-06-12 | 전남대학교산학협력단 | Crispr/cas9 시스템을 이용한 프로히비틴2 유전자 제거용 시발체 |
| KR101795999B1 (ko) | 2015-09-25 | 2017-11-09 | 전남대학교산학협력단 | Crispr/cas9 시스템을 이용한 베타2-마이크로글로불린 유전자 제거용 시발체 |
| WO2017058751A1 (en) | 2015-09-28 | 2017-04-06 | North Carolina State University | Methods and compositions for sequence specific antimicrobials |
| EP4089175A1 (en) * | 2015-10-13 | 2022-11-16 | Duke University | Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells |
| JP2018537891A (ja) | 2015-10-22 | 2018-12-20 | テレフオンアクチーボラゲット エルエム エリクソン（パブル） | 無線信号の選択的な強化に関する方法および装置 |
| JP7109784B2 (ja) * | 2015-10-23 | 2022-08-01 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 遺伝子編集のための進化したＣａｓ９蛋白質 |
| US20180230489A1 (en) | 2015-10-28 | 2018-08-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Regulatable expression using adeno-associated virus (aav) |
| JP6882282B2 (ja) | 2015-11-03 | 2021-06-02 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 三次元核酸含有マトリックスの立体撮像のための方法と装置 |
| CN106893739A (zh) | 2015-11-17 | 2017-06-27 | 香港中文大学 | 用于靶向基因操作的新方法和系统 |
| US10240145B2 (en) * | 2015-11-25 | 2019-03-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | CRISPR/Cas-mediated genome editing to treat EGFR-mutant lung cancer |
| EA201891317A3 (ru) | 2015-11-30 | 2019-04-30 | Дьюк Юниверсити | Терапевтические мишени для коррекции гена дистрофина человека с помощью редактирования генов и способы их применения |
| US11542466B2 (en) | 2015-12-22 | 2023-01-03 | North Carolina State University | Methods and compositions for delivery of CRISPR based antimicrobials |
| WO2017123559A2 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric proteins and methods of regulating gene expression |
| ES2875747T3 (es) | 2016-01-11 | 2021-11-11 | Univ Leland Stanford Junior | Proteínas quiméricas y métodos de inmunoterapia |
| EP3219799A1 (en) | 2016-03-17 | 2017-09-20 | IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH | Conditional crispr sgrna expression |
| WO2017165862A1 (en) | 2016-03-25 | 2017-09-28 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for treating alpha 1-antitrypsin (a1at) deficiency |
| EP3433363A1 (en) | 2016-03-25 | 2019-01-30 | Editas Medicine, Inc. | Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use |
| US20190127713A1 (en) | 2016-04-13 | 2019-05-02 | Duke University | Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use |
| WO2017180694A1 (en) | 2016-04-13 | 2017-10-19 | Editas Medicine, Inc. | Cas9 fusion molecules gene editing systems, and methods of use thereof |
| WO2017180926A1 (en) * | 2016-04-14 | 2017-10-19 | Boco Silicon Valley. Inc. | Genome editing of human neural stem cells using nucleases |
| US11499168B2 (en) * | 2016-04-25 | 2022-11-15 | Universitat Basel | Allele editing and applications thereof |
| CN109415761B (zh) | 2016-04-25 | 2022-09-20 | 哈佛学院董事及会员团体 | 用于原位分子检测的杂交链反应方法 |
| CN116850305A (zh) * | 2016-05-06 | 2023-10-10 | 朱诺治疗学股份有限公司 | 基因工程化细胞及其制备方法 |
| IL323024A (en) | 2016-05-20 | 2025-10-01 | Regeneron Pharma | Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide RNAs |
| LT3604527T (lt) * | 2016-06-02 | 2021-06-25 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Programuojamų, dnr surišančių baltymų panaudojimas tiksliniam genomo modifikavimui pagerinti |
| CA3026332A1 (en) * | 2016-06-03 | 2017-12-14 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Negative feedback regulation of hiv-1 by gene editing strategy |
| CN116064534A (zh) * | 2016-06-03 | 2023-05-05 | 国家医疗保健研究所 | 编码Cas9核酸酶的核酸的饮食控制的表达及其用途 |
| US10767175B2 (en) | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
| US10337051B2 (en) | 2016-06-16 | 2019-07-02 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for detecting a target RNA |
| US11293021B1 (en) | 2016-06-23 | 2022-04-05 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems |
| US10017760B2 (en) | 2016-06-24 | 2018-07-10 | Inscripta, Inc. | Methods for generating barcoded combinatorial libraries |
| US11603533B2 (en) | 2016-07-12 | 2023-03-14 | Washington University | Incorporation of internal polya-encoded poly-lysine sequence tags and their variations for the tunable control of protein synthesis in bacterial and eukaryotic cells |
| WO2018017754A1 (en) | 2016-07-19 | 2018-01-25 | Duke University | Therapeutic applications of cpf1-based genome editing |
| JP7556688B2 (ja) | 2016-07-28 | 2024-09-26 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｇｐｒ１５６変異体及びその使用 |
| JP2019523009A (ja) | 2016-07-29 | 2019-08-22 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | Ｃ末端切断型フィブリリン−１の発現をもたらす変異を有するマウス |
| WO2018026976A1 (en) | 2016-08-02 | 2018-02-08 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating cep290 associated disease |
| KR102547316B1 (ko) | 2016-08-03 | 2023-06-23 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도 |
| US11078481B1 (en) | 2016-08-03 | 2021-08-03 | KSQ Therapeutics, Inc. | Methods for screening for cancer targets |
| US11661590B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-05-30 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| JP2019524149A (ja) * | 2016-08-20 | 2019-09-05 | アベリノ ラボ ユーエスエー インコーポレイテッドＡｖｅｌｌｉｎｏ Ｌａｂ ＵＳＡ， Ｉｎｃ． | 一本鎖ガイドＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、及びそれらの使用方法 |
| US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| CN109923216B (zh) | 2016-08-31 | 2024-08-02 | 哈佛学院董事及会员团体 | 将生物分子的检测组合到使用荧光原位测序的单个试验的方法 |
| US11078483B1 (en) | 2016-09-02 | 2021-08-03 | KSQ Therapeutics, Inc. | Methods for measuring and improving CRISPR reagent function |
| WO2018048827A1 (en) * | 2016-09-07 | 2018-03-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Rna-guided endonuclease-based dna assembly |
| CN106636197B (zh) * | 2016-09-22 | 2019-09-03 | 南京市妇幼保健院 | 一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法 |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| JP7306696B2 (ja) | 2016-09-30 | 2023-07-11 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | Ｒｎａ誘導型核酸修飾酵素及びその使用方法 |
| CA3038960A1 (en) | 2016-09-30 | 2018-04-05 | The Regents Of The University Of California | Rna-guided nucleic acid modifying enzymes and methods of use thereof |
| EP3525831A4 (en) * | 2016-10-11 | 2020-06-03 | Stemgenics, Inc. | NANOPARTICLES FUNCTIONALIZED WITH GENE EDITING TOOLS AND RELATED METHODS |
| AU2017341926B2 (en) | 2016-10-14 | 2022-06-30 | The General Hospital Corporation | Epigenetically regulated site-specific nucleases |
| EP3526320A1 (en) | 2016-10-14 | 2019-08-21 | President and Fellows of Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
| GB201617559D0 (en) | 2016-10-17 | 2016-11-30 | University Court Of The University Of Edinburgh The | Swine comprising modified cd163 and associated methods |
| JP7181862B2 (ja) | 2016-10-18 | 2022-12-01 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 腫瘍浸潤リンパ球および治療の方法 |
| AU2017355218B2 (en) * | 2016-11-02 | 2024-02-22 | Universität Basel | Immunologically discernible cell surface variants for use in cell therapy |
| WO2018119010A1 (en) | 2016-12-19 | 2018-06-28 | Editas Medicine, Inc. | Assessing nuclease cleavage |
| AU2017379073B2 (en) * | 2016-12-22 | 2023-12-14 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency |
| WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
| KR102151065B1 (ko) * | 2016-12-23 | 2020-09-02 | 기초과학연구원 | 동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법 |
| US11859219B1 (en) | 2016-12-30 | 2024-01-02 | Flagship Pioneering Innovations V, Inc. | Methods of altering a target nucleotide sequence with an RNA-guided nuclease and a single guide RNA |
| EP3565907B1 (en) | 2017-01-06 | 2022-05-04 | Editas Medicine, Inc. | Methods of assessing nuclease cleavage |
| IL314915B1 (en) | 2017-01-23 | 2026-02-01 | Regeneron Pharma | Variants of 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase and their uses |
| WO2018140497A1 (en) | 2017-01-25 | 2018-08-02 | Efimov Igor R | Apparatus and methods for in vitro preclinical human trials |
| TW201839136A (zh) | 2017-02-06 | 2018-11-01 | 瑞士商諾華公司 | 治療血色素異常症之組合物及方法 |
| CN106978438B (zh) * | 2017-02-27 | 2020-08-28 | 北京大北农生物技术有限公司 | 提高同源重组效率的方法 |
| JP2020510038A (ja) | 2017-03-09 | 2020-04-02 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | がんワクチン |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| JP2020510439A (ja) | 2017-03-10 | 2020-04-09 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | シトシンからグアニンへの塩基編集因子 |
| EP3596217A1 (en) | 2017-03-14 | 2020-01-22 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| CA3057192A1 (en) | 2017-03-23 | 2018-09-27 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
| US11913015B2 (en) | 2017-04-17 | 2024-02-27 | University Of Maryland, College Park | Embryonic cell cultures and methods of using the same |
| US11834670B2 (en) | 2017-04-19 | 2023-12-05 | Global Life Sciences Solutions Usa Llc | Site-specific DNA modification using a donor DNA repair template having tandem repeat sequences |
| WO2018195402A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Egenesis, Inc. | Methods for generating genetically modified animals |
| WO2018195545A2 (en) | 2017-04-21 | 2018-10-25 | The General Hospital Corporation | Variants of cpf1 (cas12a) with altered pam specificity |
| US11499151B2 (en) | 2017-04-28 | 2022-11-15 | Editas Medicine, Inc. | Methods and systems for analyzing guide RNA molecules |
| EP3622070A2 (en) | 2017-05-10 | 2020-03-18 | Editas Medicine, Inc. | Crispr/rna-guided nuclease systems and methods |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US20200172895A1 (en) | 2017-05-25 | 2020-06-04 | The General Hospital Corporation | Using split deaminases to limit unwanted off-target base editor deamination |
| MX2019014661A (es) | 2017-06-05 | 2020-07-29 | Regeneron Pharma | Variantes de b4galt1 y usos de estas. |
| WO2018227114A1 (en) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | Editas Medicine, Inc. | Engineered cas9 nucleases |
| CA3067382A1 (en) | 2017-06-15 | 2018-12-20 | The Regents Of The University Of California | Targeted non-viral dna insertions |
| US9982279B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-05-29 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| US10011849B1 (en) | 2017-06-23 | 2018-07-03 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| EP4484562A3 (en) | 2017-06-27 | 2025-03-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized asgr1 locus |
| MX2019015505A (es) | 2017-06-30 | 2020-07-28 | Inscripta Inc | Metodos, modulos, instrumentos y sistemas de procesamiento de celulas automatizados. |
| WO2019006418A2 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Intima Bioscience, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY |
| KR102523217B1 (ko) | 2017-07-11 | 2023-04-20 | 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 | 표적된 게놈 변형을 개선하기 위한 뉴클레오솜 상호작용 단백질 도메인 사용 |
| US11866726B2 (en) | 2017-07-14 | 2024-01-09 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
| WO2019023680A1 (en) | 2017-07-28 | 2019-01-31 | President And Fellows Of Harvard College | METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE) |
| BR112019028146A2 (pt) * | 2017-07-31 | 2020-07-07 | Sigma-Aldrich Co. Llc | rna guia sintético para sistemas ativadores de crispr/cas |
| WO2019028032A1 (en) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | EMBRYONIC STEM CELLS OF TRANSGENIC MOUSE CASES AND MICE AND USES THEREOF |
| CN111182790A (zh) | 2017-07-31 | 2020-05-19 | 瑞泽恩制药公司 | Crispr报告体非人类动物及其用途 |
| CN110891419A (zh) | 2017-07-31 | 2020-03-17 | 瑞泽恩制药公司 | 评价crispr/cas-诱导的与外源供体核酸的体内重组 |
| JP7355730B2 (ja) * | 2017-08-09 | 2023-10-03 | ベンソン ヒル，インコーポレイティド | ゲノムを修飾するための組成物及び方法 |
| US10738327B2 (en) | 2017-08-28 | 2020-08-11 | Inscripta, Inc. | Electroporation cuvettes for automation |
| EP3676376B1 (en) | 2017-08-30 | 2025-01-15 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| WO2019050948A1 (en) * | 2017-09-05 | 2019-03-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | ADMINISTRATION OF A GENE EDITION SYSTEM HAVING ONLY ONE RETROVIRAL PARTICLE AND METHODS OF GENERATING AND USING |
| CA3074652A1 (en) | 2017-09-06 | 2019-03-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Single immunoglobulin interleukin-1 receptor related (sigirr) variants and uses thereof |
| JP2020536500A (ja) | 2017-09-07 | 2020-12-17 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． | 溶質キャリアファミリー１４メンバー１（ｓｌｃ１４ａ１）の変異型及びその使用 |
| MX394999B (es) | 2017-09-29 | 2025-03-24 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que comprenden un locus ttr humanizado y metodos de uso |
| EP3687621A4 (en) | 2017-09-30 | 2021-08-11 | Inscripta, Inc. | Flow through electroporation instrumentation |
| EP3697807A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cornulin (crnn) variants and uses thereof |
| KR20250107288A (ko) | 2017-10-16 | 2025-07-11 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 아데노신 염기 편집제의 용도 |
| US11634716B2 (en) | 2017-10-16 | 2023-04-25 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Genetically modified mesenchymal stem cells for use in cardiovascular prosthetics |
| KR102503130B1 (ko) | 2017-10-27 | 2023-02-24 | 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | 내인성 t 세포 수용체의 표적화된 대체 |
| WO2019089804A1 (en) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | The Regents Of The University Of California | Casy compositions and methods of use |
| JP2021503278A (ja) | 2017-11-01 | 2021-02-12 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | ＣａｓＺ組成物及び使用方法 |
| WO2019089808A1 (en) | 2017-11-01 | 2019-05-09 | The Regents Of The University Of California | Class 2 crispr/cas compositions and methods of use |
| WO2019090261A1 (en) | 2017-11-03 | 2019-05-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Methods and compositions for plant pathogen resistance in plants |
| ES2911249T3 (es) | 2017-11-10 | 2022-05-18 | Regeneron Pharma | Animales no humanos que comprenden una mutación de slc30a8 y métodos de uso |
| CN111448313A (zh) * | 2017-11-16 | 2020-07-24 | 阿斯利康(瑞典)有限公司 | 用于改善基于Cas9的敲入策略的有效性的组合物和方法 |
| IL310006A (en) | 2017-11-30 | 2024-03-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals containing a humanized TRKB locus |
| WO2019118949A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-20 | The Broad Institute, Inc. | Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering |
| WO2019126578A1 (en) * | 2017-12-20 | 2019-06-27 | Poseida Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for directing proteins to specific loci in the genome |
| KR20210152597A (ko) | 2017-12-22 | 2021-12-15 | (주)지플러스생명과학 | 키메라 게놈 조작 분자 및 방법 |
| CA3086620A1 (en) | 2018-01-12 | 2019-07-18 | Basf Se | Gene underlying the number of spikelets per spike qtl in wheat on chromosome 7a |
| WO2019144061A1 (en) | 2018-01-19 | 2019-07-25 | Duke University | Genome engineering with crispr-cas systems in eukaryotes |
| US12098363B2 (en) * | 2018-01-26 | 2024-09-24 | The Children's Medical Center Corporation | Targeting BCL11A distal regulatory elements with a CAS9-CAS9 fusion for fetal hemoglobin reinduction |
| CN111902536B (zh) * | 2018-02-15 | 2024-07-30 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 用于真核基因组修饰的改造的cas9系统 |
| KR20200124702A (ko) | 2018-02-23 | 2020-11-03 | 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 | 신규한 cas9 오르소로그 |
| WO2019178426A1 (en) | 2018-03-14 | 2019-09-19 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies |
| CN111885915B (zh) | 2018-03-19 | 2023-04-28 | 瑞泽恩制药公司 | 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制 |
| WO2019190874A1 (en) | 2018-03-29 | 2019-10-03 | Inscripta, Inc. | Automated control of cell growth rates for induction and transformation |
| US10376889B1 (en) | 2018-04-13 | 2019-08-13 | Inscripta, Inc. | Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges |
| JP7555822B2 (ja) | 2018-04-19 | 2024-09-25 | ザ・リージエンツ・オブ・ザ・ユニバーシテイー・オブ・カリフオルニア | ゲノム編集のための組成物および方法 |
| US10858761B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-12-08 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells |
| US10526598B2 (en) | 2018-04-24 | 2020-01-07 | Inscripta, Inc. | Methods for identifying T-cell receptor antigens |
| US10508273B2 (en) | 2018-04-24 | 2019-12-17 | Inscripta, Inc. | Methods for identifying selective binding pairs |
| US20210324381A1 (en) * | 2018-04-27 | 2021-10-21 | Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) | Therapeutic genome editing in x-linked hyper igm syndrome |
| WO2019213430A1 (en) * | 2018-05-03 | 2019-11-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for nicking target dna sequences |
| WO2019217803A1 (en) | 2018-05-10 | 2019-11-14 | Auxolytic Ltd. | Gene therapy methods and compositions using auxotrophic regulatable cells |
| CN112105732A (zh) * | 2018-05-10 | 2020-12-18 | 先正达参股股份有限公司 | 用于多核苷酸的靶向编辑的方法和组合物 |
| CN121555430A (zh) | 2018-05-11 | 2026-02-24 | 比姆医疗股份有限公司 | 使用可编程碱基编辑器系统取代病原性氨基酸的方法 |
| CN108624622A (zh) * | 2018-05-16 | 2018-10-09 | 湖南艾佳生物科技股份有限公司 | 一种基于CRISPR-Cas9系统构建的能分泌小鼠白细胞介素-6的基因工程细胞株 |
| KR20210045360A (ko) | 2018-05-16 | 2021-04-26 | 신테고 코포레이션 | 가이드 rna 설계 및 사용을 위한 방법 및 시스템 |
| EP3797160A1 (en) | 2018-05-23 | 2021-03-31 | The Broad Institute Inc. | Base editors and uses thereof |
| EP3575402A1 (en) * | 2018-06-01 | 2019-12-04 | Algentech SAS | Gene targeting |
| EP3800998A1 (en) | 2018-06-07 | 2021-04-14 | The State of Israel, Ministry of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (ARO) (Volcani Center) | Methods of regenerating and transforming cannabis |
| EP3802839A1 (en) | 2018-06-07 | 2021-04-14 | The State of Israel, Ministry of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (ARO) (Volcani Center) | Nucleic acid constructs and methods of using same |
| EP4159872B1 (en) * | 2018-06-25 | 2024-09-11 | Bionano Genomics, Inc. | Labeling of dna |
| EP3823633A4 (en) | 2018-06-29 | 2023-05-03 | Editas Medicine, Inc. | SYNTHETIC LEAD MOLECULES, COMPOSITIONS AND METHODS RELATED THERETO |
| AU2019292919A1 (en) | 2018-06-30 | 2021-03-11 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| US12522807B2 (en) | 2018-07-09 | 2026-01-13 | The Broad Institute, Inc. | RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof |
| AU2019316094B2 (en) * | 2018-08-03 | 2026-02-19 | Beam Therapeutics Inc. | Multi-effector nucleobase editors and methods of using same to modify a nucleic acid target sequence |
| GB201813011D0 (en) | 2018-08-10 | 2018-09-26 | Vib Vzw | Means and methods for drought tolerance in crops |
| US10532324B1 (en) | 2018-08-14 | 2020-01-14 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| US11142740B2 (en) | 2018-08-14 | 2021-10-12 | Inscripta, Inc. | Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
| US10752874B2 (en) | 2018-08-14 | 2020-08-25 | Inscripta, Inc. | Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells |
| KR102103103B1 (ko) | 2018-08-16 | 2020-04-21 | (주)라트바이오 | 인위적 뉴클레아제를 생산하는 형질전환 동물 및 형질전환 배아 |
| US20210246472A1 (en) * | 2018-08-21 | 2021-08-12 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Down-regulation of the cytosolic dna sensor pathway |
| US11965154B2 (en) | 2018-08-30 | 2024-04-23 | Inscripta, Inc. | Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments |
| EP3850088A4 (en) | 2018-09-07 | 2023-07-19 | Beam Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for improving base editing |
| KR20210055733A (ko) | 2018-09-07 | 2021-05-17 | 빔 테라퓨틱스, 인크. | 핵염기 편집 시스템을 전달하기 위한 조성물 및 방법 |
| CN109055379B (zh) * | 2018-09-10 | 2022-04-15 | 石铭 | 一种转基因鸡输卵管生物反应器的制备方法 |
| KR102121817B1 (ko) * | 2018-09-12 | 2020-06-26 | 한국화학연구원 | Crispr 편집 기술을 이용한 재조합 항원을 발현시키는 벡터 및 이를 동시에 다중 삽입시키는 방법 |
| JP7222075B2 (ja) | 2018-09-13 | 2023-02-14 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｃ３糸球体症のモデルとしての補体因子ｈ遺伝子ノックアウトラット |
| WO2020072248A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | North Carolina State University | Recombinant type i crispr-cas system |
| WO2020072250A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | North Carolina State University | Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for genome modification and alteration of expression |
| US12264330B2 (en) | 2018-10-01 | 2025-04-01 | North Carolina State University | Recombinant type I CRISPR-Cas system and uses thereof for killing target cells |
| WO2020072253A1 (en) | 2018-10-01 | 2020-04-09 | North Carolina State University | Recombinant type i crispr-cas system and uses thereof for screening for variant cells |
| WO2020076976A1 (en) | 2018-10-10 | 2020-04-16 | Readcoor, Inc. | Three-dimensional spatial molecular indexing |
| JP7460643B2 (ja) | 2018-10-16 | 2024-04-02 | ブルーアレル， エルエルシー | 遺伝子へのｄｎａの標的化挿入のための方法 |
| JP7578590B2 (ja) | 2018-10-18 | 2024-11-06 | インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド | 第ｉｘ因子を発現するための組成物及び方法 |
| AU2019368215B2 (en) | 2018-10-22 | 2023-05-18 | Inscripta, Inc. | Engineered enzymes |
| US11214781B2 (en) | 2018-10-22 | 2022-01-04 | Inscripta, Inc. | Engineered enzyme |
| WO2020086908A1 (en) * | 2018-10-24 | 2020-04-30 | The Broad Institute, Inc. | Constructs for improved hdr-dependent genomic editing |
| WO2020092453A1 (en) | 2018-10-29 | 2020-05-07 | The Broad Institute, Inc. | Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof |
| KR20200071198A (ko) | 2018-12-10 | 2020-06-19 | 네오이뮨텍, 인코퍼레이티드 | Nrf2 발현 조절 기반 T 세포 항암면역치료법 |
| US12365888B2 (en) | 2018-12-14 | 2025-07-22 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | CRISPR-Cas systems for genome editing |
| WO2020128478A1 (en) | 2018-12-19 | 2020-06-25 | King's College London | Immunotherapeutic methods and compositions |
| CA3120799A1 (en) | 2018-12-20 | 2020-06-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated repeat expansion |
| WO2020142676A1 (en) * | 2019-01-04 | 2020-07-09 | The University Of Chicago | Systems and methods for modulating rna |
| WO2020146899A1 (en) * | 2019-01-11 | 2020-07-16 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Targeted in vivo genome modification |
| US12351837B2 (en) | 2019-01-23 | 2025-07-08 | The Broad Institute, Inc. | Supernegatively charged proteins and uses thereof |
| US11946040B2 (en) | 2019-02-04 | 2024-04-02 | The General Hospital Corporation | Adenine DNA base editor variants with reduced off-target RNA editing |
| WO2020168122A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Beam Therapeutics Inc. | Modified immune cells having adenosine deaminase base editors for modifying a nucleobase in a target sequence |
| US20220298494A1 (en) * | 2019-02-14 | 2022-09-22 | Metagenomi Ip Technologies, Llc | Enzymes with ruvc domains |
| US10913941B2 (en) | 2019-02-14 | 2021-02-09 | Metagenomi Ip Technologies, Llc | Enzymes with RuvC domains |
| CA3129835A1 (en) * | 2019-02-15 | 2020-08-20 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Crispr/cas fusion proteins and systems |
| GB201902277D0 (en) | 2019-02-19 | 2019-04-03 | King S College London | Therapeutic agents |
| CA3130789A1 (en) | 2019-03-07 | 2020-09-10 | The Regents Of The University Of California | Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof |
| EP3768826B1 (en) | 2019-03-18 | 2023-12-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas screening platform to identify genetic modifiers of tau seeding or aggregation |
| CA3127814C (en) | 2019-03-18 | 2024-05-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas dropout screening platform to reveal genetic vulnerabilities associated with tau aggregation |
| JP7657726B2 (ja) | 2019-03-19 | 2025-04-07 | ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド | 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物 |
| US11001831B2 (en) | 2019-03-25 | 2021-05-11 | Inscripta, Inc. | Simultaneous multiplex genome editing in yeast |
| CN113631713A (zh) | 2019-03-25 | 2021-11-09 | 因思科瑞普特公司 | 酵母中的同时多重基因组编辑 |
| WO2020206162A1 (en) | 2019-04-03 | 2020-10-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus |
| ES2966625T3 (es) | 2019-04-04 | 2024-04-23 | Regeneron Pharma | Roedores que comprenden un locus del factor de coagulación 12 humanizado |
| WO2020206134A1 (en) | 2019-04-04 | 2020-10-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors |
| GB201905360D0 (en) | 2019-04-16 | 2019-05-29 | Univ Nottingham | Fungal strains, production and uses thereof |
| US12473543B2 (en) | 2019-04-17 | 2025-11-18 | The Broad Institute, Inc. | Adenine base editors with reduced off-target effects |
| CN113825838A (zh) | 2019-05-10 | 2021-12-21 | 巴斯夫欧洲公司 | 增强植物中基因表达的调节性核酸分子 |
| US11891618B2 (en) | 2019-06-04 | 2024-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use |
| AU2020288623A1 (en) | 2019-06-06 | 2022-01-06 | Inscripta, Inc. | Curing for recursive nucleic acid-guided cell editing |
| US11622547B2 (en) | 2019-06-07 | 2023-04-11 | Regeneran Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified mouse that expresses human albumin |
| US11845957B2 (en) | 2019-06-14 | 2023-12-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Models of tauopathy |
| US10907125B2 (en) | 2019-06-20 | 2021-02-02 | Inscripta, Inc. | Flow through electroporation modules and instrumentation |
| US10920189B2 (en) | 2019-06-21 | 2021-02-16 | Inscripta, Inc. | Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced lysine production in E. coli |
| US10927385B2 (en) | 2019-06-25 | 2021-02-23 | Inscripta, Inc. | Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast |
| EP3783104A1 (en) * | 2019-08-20 | 2021-02-24 | Kemijski Institut | Coiled-coil mediated tethering of crispr-cas and exonucleases for enhanced genome editing |
| WO2021050398A1 (en) * | 2019-09-10 | 2021-03-18 | The Regents Of The University Of California | Synthetic lethality screening platform for cells undergoing alt |
| WO2021048316A1 (en) | 2019-09-12 | 2021-03-18 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
| CN114616002A (zh) | 2019-09-13 | 2022-06-10 | 瑞泽恩制药公司 | 使用由脂质纳米颗粒递送的crispr/cas系统在动物中进行的转录调控 |
| EP4034138A4 (en) | 2019-09-27 | 2024-07-31 | Beam Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF LIQUID CANCERS |
| WO2021069387A1 (en) | 2019-10-07 | 2021-04-15 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
| US12435330B2 (en) | 2019-10-10 | 2025-10-07 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for prime editing RNA |
| CN110628825A (zh) * | 2019-10-14 | 2019-12-31 | 上海捷易生物科技有限公司 | 一种依赖nhej的报告基因敲入组合物及其使用方法 |
| US12521451B2 (en) | 2019-11-08 | 2026-01-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | CRISPR and AAV strategies for x-linked juvenile retinoschisis therapy |
| US11203762B2 (en) | 2019-11-19 | 2021-12-21 | Inscripta, Inc. | Methods for increasing observed editing in bacteria |
| WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
| CN114787365A (zh) | 2019-12-03 | 2022-07-22 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于在植物中增强基因表达的调节性核酸分子 |
| KR102776469B1 (ko) | 2019-12-10 | 2025-03-05 | 인스크립타 인코포레이티드 | 신규 mad 뉴클레아제 |
| US10704033B1 (en) | 2019-12-13 | 2020-07-07 | Inscripta, Inc. | Nucleic acid-guided nucleases |
| KR20220116485A (ko) | 2019-12-16 | 2022-08-23 | 바스프 아그리컬쳐럴 솔루션즈 시드 유에스 엘엘씨 | 쌍을 형성한 닉카제를 이용하는 개선된 게놈 편집 |
| EP4069851A4 (en) | 2019-12-18 | 2023-11-22 | Inscripta, Inc. | Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells |
| WO2021141890A1 (en) * | 2020-01-09 | 2021-07-15 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Two-step gene swap |
| US10689669B1 (en) | 2020-01-11 | 2020-06-23 | Inscripta, Inc. | Automated multi-module cell processing methods, instruments, and systems |
| AU2021213705A1 (en) | 2020-01-27 | 2022-06-16 | Inscripta, Inc. | Electroporation modules and instrumentation |
| EP4096396A1 (en) | 2020-01-28 | 2022-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use |
| WO2021155063A1 (en) | 2020-01-29 | 2021-08-05 | Readcoor, Llc | Compositions and methods for analyte detection |
| EP4099821A1 (en) | 2020-02-07 | 2022-12-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | <smallcaps/>? ? ?klkb1? ? ? ? ?non-human animals comprising a humanizedlocus and methods of use |
| CN115485385A (zh) | 2020-03-04 | 2022-12-16 | 瑞泽恩制药公司 | 用于使肿瘤细胞对免疫疗法敏感的方法和组合物 |
| EP4114952A4 (en) * | 2020-03-05 | 2024-05-08 | Board of Regents of the University of Nebraska | Crispr/cas9 system for multistrain hiv-1 treatment |
| WO2021195079A1 (en) | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
| GB2608292B (en) | 2020-03-31 | 2024-02-14 | Metagenomi Inc | Class II, type II CRISPR systems |
| WO2021202938A1 (en) | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Creyon Bio, Inc. | Oligonucleotide-based machine learning |
| US20210332388A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Inscripta, Inc. | Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells |
| DE112021002672T5 (de) | 2020-05-08 | 2023-04-13 | President And Fellows Of Harvard College | Vefahren und zusammensetzungen zum gleichzeitigen editieren beider stränge einer doppelsträngigen nukleotid-zielsequenz |
| US11787841B2 (en) | 2020-05-19 | 2023-10-17 | Inscripta, Inc. | Rationally-designed mutations to the thrA gene for enhanced lysine production in E. coli |
| US20230232796A1 (en) | 2020-06-26 | 2023-07-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ace2 locus |
| CN111849986A (zh) * | 2020-07-24 | 2020-10-30 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种减少CRISPR-Cas9基因编辑中双链DNA片段串联的方法及其应用 |
| US20220049303A1 (en) | 2020-08-17 | 2022-02-17 | Readcoor, Llc | Methods and systems for spatial mapping of genetic variants |
| WO2022060749A1 (en) | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Inscripta, Inc. | Crispr editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells |
| AU2021347359A1 (en) | 2020-09-25 | 2023-05-18 | Beam Therapeutics Inc. | Fratricide resistant modified immune cells and methods of using the same |
| US11512297B2 (en) | 2020-11-09 | 2022-11-29 | Inscripta, Inc. | Affinity tag for recombination protein recruitment |
| US20240002839A1 (en) | 2020-12-02 | 2024-01-04 | Decibel Therapeutics, Inc. | Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof |
| US20240058390A1 (en) * | 2020-12-16 | 2024-02-22 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Wnt+ adipocytes, exosomes from wnt+ adipocytes, and methods of making and using them |
| AU2021415461A1 (en) | 2021-01-04 | 2023-08-17 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| US20240376451A1 (en) | 2021-01-07 | 2024-11-14 | Inscripta, Inc. | Mad nucleases |
| BR112023014719A2 (pt) * | 2021-01-22 | 2023-12-05 | Metagenomi Inc | Novas nucleases quiméricas e manipuladas |
| EP4288541A1 (en) | 2021-02-05 | 2023-12-13 | Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. | Methods of and compositions for reducing gene expression and/or activity |
| US11884924B2 (en) | 2021-02-16 | 2024-01-30 | Inscripta, Inc. | Dual strand nucleic acid-guided nickase editing |
| GB202103131D0 (en) | 2021-03-05 | 2021-04-21 | Biosystems Tech Limited | Method for preparation of research organisms |
| WO2022240846A1 (en) | 2021-05-10 | 2022-11-17 | Sqz Biotechnologies Company | Methods for delivering genome editing molecules to the nucleus or cytosol of a cell and uses thereof |
| WO2022251644A1 (en) | 2021-05-28 | 2022-12-01 | Lyell Immunopharma, Inc. | Nr4a3-deficient immune cells and uses thereof |
| KR20240027676A (ko) | 2021-06-02 | 2024-03-04 | 라이엘 이뮤노파마, 인크. | Nr4a3-결핍 면역 세포 및 이의 용도 |
| CA3225082A1 (en) | 2021-08-27 | 2023-03-02 | Brian C. Thomas | Enzymes with ruvc domains |
| JP2024534945A (ja) | 2021-09-10 | 2024-09-26 | アジレント・テクノロジーズ・インク | 化学修飾を有するプライム編集のためのガイドｒｎａ |
| AU2022366987A1 (en) | 2021-10-14 | 2024-05-16 | Arsenal Biosciences, Inc. | Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems |
| US20240336896A1 (en) | 2021-10-14 | 2024-10-10 | Lonza Sales Ag | Modified producer cells for extracellular vesicle production |
| EP4423271A2 (en) | 2021-10-28 | 2024-09-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5 |
| KR20240099393A (ko) | 2021-11-01 | 2024-06-28 | 톰 바이오사이언시스, 인코포레이티드 | 유전자 편집 기구와 핵산 카고의 동시 전달을 위한 단일 작제물 플랫폼 |
| CN118488784A (zh) | 2021-11-04 | 2024-08-13 | 瑞泽恩制药公司 | 包含经修饰的cacng1基因座的非人动物 |
| MX2024006257A (es) | 2021-11-24 | 2024-07-29 | Metagenomi Inc | Sistemas de endonucleasas. |
| CN118632622A (zh) | 2021-12-08 | 2024-09-10 | 瑞泽恩制药公司 | 突变型肌纤蛋白疾病模型及其用途 |
| GB202118058D0 (en) | 2021-12-14 | 2022-01-26 | Univ Warwick | Methods to increase yields in crops |
| US20230279442A1 (en) | 2021-12-15 | 2023-09-07 | Versitech Limited | Engineered cas9-nucleases and method of use thereof |
| WO2023122506A1 (en) | 2021-12-20 | 2023-06-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci |
| WO2023122764A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Tome Biosciences, Inc. | Co-delivery of a gene editor construct and a donor template |
| KR20240128067A (ko) | 2021-12-29 | 2024-08-23 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 랜딩 패드 세포주의 생성 |
| WO2023150181A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for treating cancer |
| EP4473103A2 (en) | 2022-02-02 | 2024-12-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertions for treatment of pompe disease |
| US20250194571A1 (en) | 2022-02-07 | 2025-06-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease |
| WO2023205744A1 (en) | 2022-04-20 | 2023-10-26 | Tome Biosciences, Inc. | Programmable gene insertion compositions |
| WO2023212677A2 (en) | 2022-04-29 | 2023-11-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches |
| WO2023215831A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Tome Biosciences, Inc. | Guide rna compositions for programmable gene insertion |
| US20250302998A1 (en) | 2022-05-09 | 2025-10-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vectors and methods for in vivo antibody production |
| KR20250027283A (ko) | 2022-05-19 | 2025-02-25 | 라이엘 이뮤노파마, 인크. | nr4a3을 표적하는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도 |
| WO2023225670A2 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-23 | Tome Biosciences, Inc. | Ex vivo programmable gene insertion |
| CN119421951A (zh) | 2022-05-31 | 2025-02-11 | 瑞泽恩制药公司 | 用于c9orf72重复序列扩增疾病的crispr干扰疗法 |
| WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
| WO2023250384A2 (en) * | 2022-06-22 | 2023-12-28 | The Regents Of The University Of California | Crispr-cas effector polypeptides and methods of use thereof |
| IL317874A (en) | 2022-06-24 | 2025-02-01 | Tune Therapeutics Inc | Compounds, systems and methods for reducing low density lipoproteins through targeted gene suppression |
| GB2621813A (en) | 2022-06-30 | 2024-02-28 | Univ Newcastle | Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy |
| WO2024020587A2 (en) | 2022-07-22 | 2024-01-25 | Tome Biosciences, Inc. | Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion |
| IL318625A (en) | 2022-07-29 | 2025-03-01 | Regeneron Pharma | Compositions and methods for transferrin receptor (TFR)-mediated delivery to brain and muscle |
| AU2023316646A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-12-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus |
| IL318553A (en) | 2022-08-05 | 2025-03-01 | Regeneron Pharma | Aggregation-resistant TDP-43 variants |
| WO2024064952A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells overexpressing c-jun |
| WO2024064958A1 (en) | 2022-09-23 | 2024-03-28 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells |
| CN120265314A (zh) | 2022-09-28 | 2025-07-04 | 瑞泽恩制药公司 | 抗体抗性修饰受体以增强基于细胞的疗法 |
| WO2024077174A1 (en) | 2022-10-05 | 2024-04-11 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing nr4a-deficient cells |
| WO2024083579A1 (en) | 2022-10-20 | 2024-04-25 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
| IL320016A (en) | 2022-11-04 | 2025-06-01 | Regeneron Pharma | Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle |
| AU2023379457A1 (en) | 2022-11-14 | 2025-05-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes |
| EP4619420A1 (en) | 2022-11-16 | 2025-09-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric proteins comprising membrane bound il-12 with protease cleavable linkers |
| US12415172B2 (en) | 2022-12-22 | 2025-09-16 | Synthego Corporation | Systems and method for automated oligonucleotide synthesis |
| WO2024138194A1 (en) | 2022-12-22 | 2024-06-27 | Tome Biosciences, Inc. | Platforms, compositions, and methods for in vivo programmable gene insertion |
| EP4654982A1 (en) | 2023-01-27 | 2025-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified rhabdovirus glycoproteins and uses thereof |
| WO2024234006A1 (en) | 2023-05-11 | 2024-11-14 | Tome Biosciences, Inc. | Systems, compositions, and methods for targeting liver sinusodial endothelial cells (lsecs) |
| CN121568725A (zh) | 2023-06-15 | 2026-02-24 | 里珍纳龙药品有限公司 | 用于听力病症的基因疗法 |
| AU2024309884A1 (en) | 2023-06-30 | 2025-12-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for increasing homology-directed repair |
| AU2024315073A1 (en) | 2023-07-28 | 2026-01-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of bgh-sv40l tandem polya to enhance transgene expression during unidirectional gene insertion |
| AU2024317483A1 (en) | 2023-07-28 | 2026-01-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertion for treatment of pompe disease |
| US20250049896A1 (en) | 2023-07-28 | 2025-02-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-tfr:acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency |
| WO2025038750A2 (en) | 2023-08-14 | 2025-02-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for treating cancer |
| WO2025049524A1 (en) | 2023-08-28 | 2025-03-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cxcr4 antibody-resistant modified receptors |
| WO2025050069A1 (en) | 2023-09-01 | 2025-03-06 | Tome Biosciences, Inc. | Programmable gene insertion using engineered integration enzymes |
| GB202314578D0 (en) | 2023-09-22 | 2023-11-08 | Univ Manchester | Methods of producing homoplasmic modified plants or parts thereof |
| WO2025122754A1 (en) | 2023-12-07 | 2025-06-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Gaa knockout non-human animals |
| WO2025184567A1 (en) | 2024-03-01 | 2025-09-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response |
| WO2025217398A1 (en) | 2024-04-10 | 2025-10-16 | Lyell Immunopharma, Inc. | Methods for culturing cells with improved culture medium |
| EP4677108A1 (en) | 2024-04-22 | 2026-01-14 | Basecamp Research Ltd | Method and compositions for detecting off-target editing |
| WO2025224182A2 (en) | 2024-04-23 | 2025-10-30 | Basecamp Research Ltd | Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo |
| WO2025235388A1 (en) | 2024-05-06 | 2025-11-13 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transgene genomic identification by nuclease-mediated long read sequencing |
| WO2025259669A1 (en) | 2024-06-10 | 2025-12-18 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for characterizing modified oligonucleotides |
| WO2025265017A1 (en) | 2024-06-20 | 2025-12-26 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ass1 gene insertion for the treatment of citrullinemia type i |
| WO2026006542A2 (en) | 2024-06-26 | 2026-01-02 | Yale University | Compositions and methods for crispr/cas9 based reactivation of human angelman syndrome |
| WO2026064425A2 (en) | 2024-09-17 | 2026-03-26 | Dxome Co., Ltd. | Mirror image crispr-cas compositions |
| WO2026072529A1 (en) | 2024-09-24 | 2026-04-02 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Mettl7a for improved embryo competence |
| WO2026080515A2 (en) | 2024-10-08 | 2026-04-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr sam biosensor cells and cell lines and methods of use thereof |
Family Cites Families (168)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4952496A (en) | 1984-03-30 | 1990-08-28 | Associated Universities, Inc. | Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase |
| WO1988008450A1 (en) | 1987-05-01 | 1988-11-03 | Birdwell Finlayson | Gene therapy for metabolite disorders |
| US5350689A (en) | 1987-05-20 | 1994-09-27 | Ciba-Geigy Corporation | Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells |
| US5767367A (en) | 1990-06-23 | 1998-06-16 | Hoechst Aktiengesellschaft | Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize plants having a heterologous gene, and their preparation |
| US7150982B2 (en) | 1991-09-09 | 2006-12-19 | Third Wave Technologies, Inc. | RNA detection assays |
| FR2763797B1 (fr) * | 1997-05-30 | 1999-07-16 | Tabacs & Allumettes Ind | Cigarette a tres faible taux de goudron presentant un gout de tabac comparable a celui d'une cigarette classique a plus fort taux de goudron |
| US20040186071A1 (en) | 1998-04-13 | 2004-09-23 | Bennett C. Frank | Antisense modulation of CD40 expression |
| US20020182673A1 (en) | 1998-05-15 | 2002-12-05 | Genentech, Inc. | IL-17 homologous polypedies and therapeutic uses thereof |
| WO2000046386A2 (en) | 1999-02-03 | 2000-08-10 | The Children's Medical Center Corporation | Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site |
| US8183339B1 (en) * | 1999-10-12 | 2012-05-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
| WO2002026967A2 (en) | 2000-09-25 | 2002-04-04 | Thomas Jefferson University | Targeted gene correction by single-stranded oligodeoxynucleotides |
| DK1328543T3 (da) | 2000-10-27 | 2009-11-23 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Nukleinsyrer og proteiner fra streptococcus-gruppe A & B |
| US7033744B2 (en) * | 2001-03-16 | 2006-04-25 | Naoya Kobayashi | Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof |
| EP2345720A3 (en) | 2001-07-12 | 2012-01-25 | University of Massachusetts | In vivo production of small interfering RNAs that mediate gene silencing |
| US20060253913A1 (en) | 2001-12-21 | 2006-11-09 | Yue-Jin Huang | Production of hSA-linked butyrylcholinesterases in transgenic mammals |
| EP1476547B1 (en) * | 2002-01-23 | 2006-12-06 | The University of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
| US20030232410A1 (en) | 2002-03-21 | 2003-12-18 | Monika Liljedahl | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
| AU2003224897A1 (en) | 2002-04-09 | 2003-10-27 | Kenneth L. Beattie | Oligonucleotide probes for genosensor chips |
| WO2003104451A2 (en) * | 2002-06-06 | 2003-12-18 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Modifying dna recombination and repair |
| EP2806025B1 (en) | 2002-09-05 | 2019-04-03 | California Institute of Technology | Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting |
| DE10260805A1 (de) * | 2002-12-23 | 2004-07-22 | Geneart Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zum Optimieren einer Nucleotidsequenz zur Expression eines Proteins |
| JP4555292B2 (ja) * | 2003-08-08 | 2010-09-29 | サンガモ バイオサイエンシズ インコーポレイテッド | 標的化された切断及び組換えの方法及び組成物 |
| WO2005070948A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-04 | Intronn, Inc. | Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated rna trans splicing |
| US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
| US20050220796A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Dynan William S | Compositions and methods for modulating DNA repair |
| US7919277B2 (en) | 2004-04-28 | 2011-04-05 | Danisco A/S | Detection and typing of bacterial strains |
| EP2316942B1 (en) * | 2004-12-22 | 2021-04-21 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing |
| US7892224B2 (en) | 2005-06-01 | 2011-02-22 | Brainlab Ag | Inverse catheter planning |
| US7534819B2 (en) | 2005-06-10 | 2009-05-19 | University Of Washington | Compositions and methods for intracellular delivery of biotinylated cargo |
| US20060282289A1 (en) | 2005-06-14 | 2006-12-14 | Healthmatch Solutions, Llc | System and method for health care financing |
| WO2007014181A2 (en) * | 2005-07-25 | 2007-02-01 | Johns Hopkins University | Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases |
| AU2006272634B2 (en) | 2005-07-26 | 2013-01-24 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences |
| US10022457B2 (en) | 2005-08-05 | 2018-07-17 | Gholam A. Peyman | Methods to regulate polarization and enhance function of cells |
| ES2398918T3 (es) | 2005-08-26 | 2013-03-22 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Un método y una ordenación para soportar verticalmente elementos de resistencia eléctrica pendientes |
| KR100877824B1 (ko) * | 2005-11-11 | 2009-01-12 | 한국생명공학연구원 | Ｅ2ｅｐｆ ｕｃｐ-ｖｈｌ 상호작용 및 그 용도 |
| ES2448491T3 (es) * | 2006-03-02 | 2014-03-14 | The Ohio State University Research Foundation | Perfil de expresión de microARN asociado con cáncer de páncreas |
| WO2007106690A2 (en) | 2006-03-15 | 2007-09-20 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Degenerate nucleobase analogs |
| JP2009531444A (ja) * | 2006-03-28 | 2009-09-03 | ノバルティス アーゲー | ＨＩＶＴＡＴタンパク質およびＥｎｖタンパク質の共有結合的に連結された複合体 |
| WO2007128338A1 (en) | 2006-05-10 | 2007-11-15 | Deinove | Process for chromosomal engineering using a novel dna repair system |
| PL2018441T3 (pl) | 2006-05-19 | 2012-03-30 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Mikroorganizmy znakowane i sposoby znakowania |
| ES2465996T3 (es) | 2006-05-25 | 2014-06-09 | Sangamo Biosciences, Inc. | Métodos y composiciones para la inactivación genética |
| DK2034848T3 (en) | 2006-06-16 | 2017-02-06 | Dupont Nutrition Biosci Aps | STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS BACTERIA |
| WO2008019123A2 (en) * | 2006-08-04 | 2008-02-14 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Enzyme sensors, methods for preparing and using such sensors, and methods of detecting protease activity |
| AU2008223544B2 (en) | 2007-03-02 | 2014-06-05 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Cultures with improved phage resistance |
| GB0806086D0 (en) | 2008-04-04 | 2008-05-14 | Ulive Entpr Ltd | Dendrimer polymer hybrids |
| WO2010011961A2 (en) | 2008-07-25 | 2010-01-28 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Prokaryotic rnai-like system and methods of use |
| SG191561A1 (en) | 2008-08-22 | 2013-07-31 | Sangamo Biosciences Inc | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
| EP2334794B8 (en) | 2008-09-15 | 2017-04-19 | The Children's Medical Center Corporation | Modulation of bcl11a for treatment of hemoglobinopathies |
| US20100076057A1 (en) * | 2008-09-23 | 2010-03-25 | Northwestern University | TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA |
| WO2010054108A2 (en) | 2008-11-06 | 2010-05-14 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Cas6 polypeptides and methods of use |
| MX337838B (es) | 2008-11-07 | 2016-03-22 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Secuencias de repetidos palindromicos cortos regularmente intercalados agrupados de bifidobacterias. |
| DK2367938T3 (da) | 2008-12-12 | 2014-08-25 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Genetisk cluster af stammer af streptococcus thermophilus med unikke rheologiske egenskaber til mælkefermentering |
| WO2010075424A2 (en) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | The Regents Of University Of California | Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes |
| GB0823658D0 (en) | 2008-12-30 | 2009-02-04 | Angiomed Ag | Stent delivery device |
| US8392349B2 (en) | 2009-02-23 | 2013-03-05 | Shalini Vajjhala | Global adaptation atlas and method of creating same |
| AU2010235161B2 (en) | 2009-04-09 | 2015-01-22 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted integration into stem cells |
| LT2424571T (lt) | 2009-04-30 | 2020-08-10 | Ospedale San Raffaele S.R.L. | Genų vektorius |
| WO2011011767A1 (en) | 2009-07-24 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Method for genome editing |
| US20120192298A1 (en) * | 2009-07-24 | 2012-07-26 | Sigma Aldrich Co. Llc | Method for genome editing |
| JP5866283B2 (ja) | 2009-07-28 | 2016-02-17 | サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | トリヌクレオチド反復疾患を治療するための方法および組成物 |
| KR101418355B1 (ko) | 2009-10-23 | 2014-07-11 | (주)바이오니아 | 고밀도 유전자 합성기 |
| DE102009052674B4 (de) | 2009-11-12 | 2012-10-18 | Karl Weinhold | Verfahren und Vorrichtung zum Verbinden von Doppelmantelrohren |
| US20110294114A1 (en) | 2009-12-04 | 2011-12-01 | Cincinnati Children's Hospital Medical Center | Optimization of determinants for successful genetic correction of diseases, mediated by hematopoietic stem cells |
| HUE041436T2 (hu) | 2009-12-10 | 2019-05-28 | Univ Minnesota | Tal-effektor-közvetített DNS-módosítás |
| EP2534163B1 (en) | 2010-02-09 | 2015-11-04 | Sangamo BioSciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
| US10087431B2 (en) | 2010-03-10 | 2018-10-02 | The Regents Of The University Of California | Methods of generating nucleic acid fragments |
| SG185481A1 (en) | 2010-05-10 | 2012-12-28 | Univ California | Endoribonuclease compositions and methods of use thereof |
| JP6208580B2 (ja) * | 2010-05-17 | 2017-10-04 | サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド | 新規のｄｎａ結合タンパク質及びその使用 |
| EP2392208B1 (en) * | 2010-06-07 | 2016-05-04 | Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) | Fusion proteins comprising a DNA-binding domain of a Tal effector protein and a non-specific cleavage domain of a restriction nuclease and their use |
| US20140148361A1 (en) | 2010-06-07 | 2014-05-29 | Barry L. Stoddard | Generation and Expression of Engineered I-ONUI Endonuclease and Its Homologues and Uses Thereof |
| AU2011265733B2 (en) | 2010-06-14 | 2014-04-17 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Nuclease activity of TAL effector and Foki fusion protein |
| WO2012012738A1 (en) * | 2010-07-23 | 2012-01-26 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids |
| US9081737B2 (en) | 2010-08-02 | 2015-07-14 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods for predicting stability and melting temperatures of nucleic acid duplexes |
| CN103261213A (zh) | 2010-10-20 | 2013-08-21 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 乳球菌CRISPR-Cas序列 |
| WO2012069657A1 (en) * | 2010-11-26 | 2012-05-31 | Institut Pasteur | Identification of a human gyrovirus and applications. |
| US20120214241A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-08-23 | Josee Laganiere | Zinc finger nuclease modification of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2) mutant fibroblasts and ipscs |
| KR20120096395A (ko) | 2011-02-22 | 2012-08-30 | 주식회사 툴젠 | 뉴클레아제에 의해 유전자 변형된 세포를 농축시키는 방법 |
| WO2012164565A1 (en) | 2011-06-01 | 2012-12-06 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes |
| AU2012312260B2 (en) | 2011-09-21 | 2017-08-31 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for regulation of transgene expression |
| AU2012340213B2 (en) * | 2011-11-16 | 2017-12-07 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modified DNA-binding proteins and uses thereof |
| US8450107B1 (en) | 2011-11-30 | 2013-05-28 | The Broad Institute Inc. | Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors |
| GB201122458D0 (en) | 2011-12-30 | 2012-02-08 | Univ Wageningen | Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof |
| RU2650811C2 (ru) | 2012-02-24 | 2018-04-17 | Фред Хатчинсон Кэнсер Рисерч Сентер | Композиции и способы лечения гемоглобинопатии |
| CN108285491B (zh) | 2012-02-29 | 2021-08-10 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 治疗亨廷顿氏病的方法和组合物 |
| WO2013141680A1 (en) | 2012-03-20 | 2013-09-26 | Vilnius University | RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX |
| US9637739B2 (en) | 2012-03-20 | 2017-05-02 | Vilnius University | RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex |
| AU2013204327B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-09-01 | Aviagen | Cell transfection method |
| AU2013254857B2 (en) | 2012-04-23 | 2018-04-26 | Bayer Cropscience Nv | Targeted genome engineering in plants |
| IN2014DN09261A (es) | 2012-04-25 | 2015-07-10 | Regeneron Pharma | |
| CA2872124C (en) | 2012-05-02 | 2022-05-03 | Dow Agrosciences Llc | Plant with targeted modification of the endogenous malate dehydrogenase gene |
| AU2013259647B2 (en) * | 2012-05-07 | 2018-11-08 | Corteva Agriscience Llc | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes |
| US11120889B2 (en) | 2012-05-09 | 2021-09-14 | Georgia Tech Research Corporation | Method for synthesizing a nuclease with reduced off-site cleavage |
| EP3241902B1 (en) * | 2012-05-25 | 2018-02-28 | The Regents of The University of California | Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription |
| US20140056868A1 (en) | 2012-05-30 | 2014-02-27 | University of Washington Center for Commercialization | Supercoiled MiniVectors as a Tool for DNA Repair, Alteration and Replacement |
| US9102936B2 (en) | 2012-06-11 | 2015-08-11 | Agilent Technologies, Inc. | Method of adaptor-dimer subtraction using a CRISPR CAS6 protein |
| CN104540382A (zh) | 2012-06-12 | 2015-04-22 | 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 | 用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物 |
| EP2674501A1 (en) | 2012-06-14 | 2013-12-18 | Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation,de l'environnement et du travail | Method for detecting and identifying enterohemorrhagic Escherichia coli |
| WO2013188638A2 (en) | 2012-06-15 | 2013-12-19 | The Regents Of The University Of California | Endoribonucleases and methods of use thereof |
| EP2861737B1 (en) | 2012-06-19 | 2019-04-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Gene targeting in plants using dna viruses |
| WO2014011901A2 (en) | 2012-07-11 | 2014-01-16 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for delivery of biologics |
| DK3444342T3 (da) | 2012-07-11 | 2020-08-24 | Sangamo Therapeutics Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til behandlingen af lysosomale aflejringssygdomme |
| KR102530118B1 (ko) | 2012-07-25 | 2023-05-08 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 유도 ｄｎａ 결합 단백질 및 게놈 교란 도구 및 이의 적용 |
| HK1207111A1 (en) | 2012-08-03 | 2016-01-22 | 加利福尼亚大学董事会 | Methods and compositions for controlling gene expression by rna processing |
| SI2890780T1 (sl) | 2012-08-29 | 2020-11-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Postopki in sestavki za zdravljenje genetskega stanja |
| UA118090C2 (uk) | 2012-09-07 | 2018-11-26 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив |
| UA119135C2 (uk) | 2012-09-07 | 2019-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб отримання трансгенної рослини |
| CA2884162C (en) | 2012-09-07 | 2020-12-29 | Dow Agrosciences Llc | Fad3 performance loci and corresponding target site specific binding proteins capable of inducing targeted breaks |
| EP3789405A1 (en) | 2012-10-12 | 2021-03-10 | The General Hospital Corporation | Transcription activator-like effector (tale) - lysine-specific demethylase 1 (lsd1) fusion proteins |
| EP4357457B1 (en) | 2012-10-23 | 2024-10-16 | Toolgen Incorporated | Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof |
| CA2889502A1 (en) | 2012-10-30 | 2014-05-08 | Recombinetics, Inc. | Control of sexual maturation in animals |
| CA2890160A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | Cellectis | Coupling herbicide resistance with targeted insertion of transgenes in plants |
| US20140127752A1 (en) | 2012-11-07 | 2014-05-08 | Zhaohui Zhou | Method, composition, and reagent kit for targeted genomic enrichment |
| EP3363902B1 (en) | 2012-12-06 | 2019-11-27 | Sigma Aldrich Co. LLC | Crispr-based genome modification and regulation |
| WO2014093479A1 (en) | 2012-12-11 | 2014-06-19 | Montana State University | Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation |
| DK2931898T3 (en) * | 2012-12-12 | 2016-06-20 | Massachusetts Inst Technology | CONSTRUCTION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH FUNCTIONAL DOMAINS |
| CN105121648B (zh) | 2012-12-12 | 2021-05-07 | 布罗德研究所有限公司 | 用于序列操纵的系统、方法和优化的指导组合物的工程化 |
| DK2931897T3 (en) | 2012-12-12 | 2018-02-05 | Broad Inst Inc | CONSTRUCTION, MODIFICATION AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, PROCEDURES AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTICAL APPLICATIONS |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| AU2013359262C1 (en) | 2012-12-12 | 2021-05-13 | Massachusetts Institute Of Technology | CRISPR-Cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| EP2931899A1 (en) | 2012-12-12 | 2015-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof |
| CA2894684A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Engineering and optimization of improved crispr-cas systems, methods and enzyme compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| WO2014093718A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Methods, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| WO2014093709A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof |
| KR102240135B1 (ko) | 2012-12-13 | 2021-04-14 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 부위 특이적 뉴클레아제 활성에 대한 dna 검출 방법 |
| CA2895155C (en) * | 2012-12-17 | 2021-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Rna-guided human genome engineering |
| ES2953523T3 (es) | 2012-12-27 | 2023-11-14 | Keygene Nv | Método para inducir una translocación dirigida en una planta |
| EP3919505B1 (en) | 2013-01-16 | 2023-08-30 | Emory University | Uses of cas9-nucleic acid complexes |
| CN103233028B (zh) | 2013-01-25 | 2015-05-13 | 南京徇齐生物技术有限公司 | 一种无物种限制无生物安全性问题的真核生物基因打靶方法及螺旋结构dna序列 |
| WO2014127287A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for in vivo tergated mutagenesis |
| MX2015010841A (es) | 2013-02-20 | 2016-05-09 | Regeneron Pharma | Modificacion genetica de ratas. |
| US10227610B2 (en) | 2013-02-25 | 2019-03-12 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption |
| MX374090B (es) | 2013-03-14 | 2025-03-05 | Caribou Biosciences Inc | Composiciones y métodos de ácidos nucleicos dirigidos al ácido nucleico. |
| US11332719B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-05-17 | The Broad Institute, Inc. | Recombinant virus and preparations thereof |
| US20140364333A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-12-11 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for Live Imaging of Cells |
| US10760064B2 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-01 | The General Hospital Corporation | RNA-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| US20140273235A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Regents Of The University Of Minnesota | ENGINEERING PLANT GENOMES USING CRISPR/Cas SYSTEMS |
| AU2014227653B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-04-20 | The General Hospital Corporation | Using RNA-guided foki nucleases (RFNs) to increase specificity for RNA-guided genome editing |
| US20140273230A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Sigma-Aldrich Co., Llc | Crispr-based genome modification and regulation |
| US9234213B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-01-12 | System Biosciences, Llc | Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems |
| JP2016522679A (ja) | 2013-04-04 | 2016-08-04 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用 |
| EP2981166B1 (en) | 2013-04-05 | 2020-09-09 | Dow AgroSciences LLC | Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants |
| SI2986729T1 (sl) | 2013-04-16 | 2019-02-28 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Ciljana sprememba genoma podgane |
| CN103224947B (zh) | 2013-04-28 | 2015-06-10 | 陕西师范大学 | 一种基因打靶系统 |
| US10604771B2 (en) | 2013-05-10 | 2020-03-31 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
| EP3778899A1 (en) | 2013-05-22 | 2021-02-17 | Northwestern University | Rna-directed dna cleavage and gene editing by cas9 enzyme from neisseria meningitidis |
| US11414695B2 (en) | 2013-05-29 | 2022-08-16 | Agilent Technologies, Inc. | Nucleic acid enrichment using Cas9 |
| US20140356956A1 (en) | 2013-06-04 | 2014-12-04 | President And Fellows Of Harvard College | RNA-Guided Transcriptional Regulation |
| MX2015017312A (es) | 2013-06-17 | 2017-04-10 | Broad Inst Inc | Suministro y uso de composiciones, vectores y sistemas crispr-cas para la modificación dirigida y terapia hepáticas. |
| KR20250012194A (ko) | 2013-06-17 | 2025-01-23 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 바이러스 구성성분을 사용하여 장애 및 질환을 표적화하기 위한 crispr-cas 시스템 및 조성물의 전달, 용도 및 치료 적용 |
| KR20160019553A (ko) | 2013-06-17 | 2016-02-19 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 유사분열 후 세포의 질병 및 장애를 표적화하고 모델링하기 위한 시스템, 방법 및 조성물의 전달, 유전자 조작 및 최적화 |
| EP3011030B1 (en) | 2013-06-17 | 2023-11-08 | The Broad Institute, Inc. | Optimized crispr-cas double nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation |
| EP3725885A1 (en) | 2013-06-17 | 2020-10-21 | The Broad Institute, Inc. | Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof |
| CN103382468B (zh) * | 2013-07-04 | 2015-04-29 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种水稻基因组定点改造方法 |
| CN103343120B (zh) | 2013-07-04 | 2015-03-04 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种小麦基因组定点改造方法 |
| WO2015006294A2 (en) | 2013-07-10 | 2015-01-15 | President And Fellows Of Harvard College | Orthogonal cas9 proteins for rna-guided gene regulation and editing |
| CN103388006B (zh) | 2013-07-26 | 2015-10-28 | 华东师范大学 | 一种基因定点突变的构建方法 |
| US10421957B2 (en) | 2013-07-29 | 2019-09-24 | Agilent Technologies, Inc. | DNA assembly using an RNA-programmable nickase |
| UY35814A (es) | 2013-11-04 | 2015-05-29 | Dow Agrosciences Llc | ?lugares óptimos para la soja?. |
| MX358066B (es) | 2013-11-04 | 2018-08-03 | Dow Agrosciences Llc | Óptimos loci de soya. |
| KR102269769B1 (ko) | 2013-11-04 | 2021-06-28 | 코르테바 애그리사이언스 엘엘씨 | 최적 메이즈 유전자좌 |
| AU2014346559B2 (en) | 2013-11-07 | 2020-07-09 | Editas Medicine,Inc. | CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAs |
| US9546384B2 (en) | 2013-12-11 | 2017-01-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome |
| WO2015116686A1 (en) | 2014-01-29 | 2015-08-06 | Agilent Technologies, Inc. | Cas9-based isothermal method of detection of specific dna sequence |
| US20150291969A1 (en) | 2014-01-30 | 2015-10-15 | Chromatin, Inc. | Compositions for reduced lignin content in sorghum and improving cell wall digestibility, and methods of making the same |
| US20150225801A1 (en) | 2014-02-11 | 2015-08-13 | California Institute Of Technology | Recording and mapping lineage information and molecular events in individual cells |
| AU2015218576B2 (en) | 2014-02-24 | 2020-02-27 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration |
| CN106459894B (zh) | 2014-03-18 | 2020-02-18 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于调控锌指蛋白表达的方法和组合物 |
-
2013
- 2013-12-05 EP EP18160519.7A patent/EP3363902B1/en not_active Revoked
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