ES2713404T3 - Métodos para prevenir y tratar la enfermedad renal crónica (CKD) - Google Patents

Abstract

Un inhibidor de la expresión del gen de periostina o del mRNA de periostina para uso en el tratamiento por terapia de la enfermedad renal crónica (CKD) en un sujeto que lo necesite, en el que dicho inhibidor de la expresión del gen de periostina o del mRNA de periostina es un pequeño RNA inhibidor (siRNA) de periostina, una ribozima de periostina o un oligonucleótido antisentido anti-periostina.

Description

DESCRIPCION

Metodos para prevenir y tratar la enfermedad renal cronica (CKD)

Campo de la invencion:

La presente invencion describe metodos para prevenir y tratar la enfermedad renal cronica (CKD, por sus siglas en ingles Chronic Kidney Disease).

Antecedentes de la invencion:

La enfermedad renal cronica (CKD) puede deberse a diferentes causas, pero la via final sigue siendo la fibrosis renal caracterizada por una inflamacion cronica que conduce a una acumulacion anomala de matriz extracelular (ECM). Este proceso fibrotico que conduce a una disminucion en el numero de nefronas en funcionamiento aun no esta claro y constituye la clave de la progresion de la CKD. Asf, nuevos conocimientos sobre los mecanismos patofisiologicos de la fibrogenesis renal nos guiaran a una terapia mas eficaz. La cantidad de ECM es regulada por el equilibrio entre la smtesis y la degradacion de las protemas y es particularmente importante durante el desarrollo embrionario y los estados patologicos. Aunque los mecanismos de fibrogenesis han sido objeto de estudios en curso, la atencion se ha centrado en las protemas de la ECM, debido a su importancia no solo como componentes de la fibrosis, sino tambien como reguladores activos de la remodelacion tisular por medio de la senalizacion celulas-matriz. A la vista de lo anterior, existe la necesidad en la tecnica de identificar un factor que pueda ser responsable de la progresion de la fibrosis renal y por tanto de la progresion de la CKD, con el objetivo de considerar nuevas herramientas para el tratamiento de dicha enfermedad.

La periostina (POSTN) tambien denominada factor espedfico de osteoblastos 2 (OSF-2) es una protema extracelular de 90 kDa expresada durante el desarrollo y en el tejido posnatal muy temprano; su expresion en tejidos adultos sanos es muy baja, pero aumenta considerablemente despues de una lesion.

Se ha indicado previamente que la expresion de la periostina es aumentada significativamente tanto por el factor de crecimiento transformante beta-1 (TGFbetal) como por la protema morfogenetica osea (BMP-2). Muchos estudios en el corazon mostraron que la periostina es segregada por los fibroblastos y regula la deposicion de colageno, alterando con ello las propiedades mecanicas de los tejidos conjuntivos. Cuando se desactivo la periostina, los animales mostraron una fibrosis reducida despues del infarto de miocardio. Esta protema matricelular tiene tambien la capacidad de asociarse a otros componentes de la ECM, como tenascina, fibronectina, e interaccionar con integrinas tales como avb3 avbv, dando como resultado la activacion de las vfas de la quinasa Akt o PI3. Recientemente, la periostina se describio para una amplia gama de patologfas (canceres, asma...), pero se sabe poco sobre la periostina en el rinon y su potencial funcion en la progresion de la enfermedad renal cronica. Hasta la fecha, la periostina se describio en el rinon poliqrnstico autosomico dominante humano y se demostro que se expresaba de novo en las celulas epiteliales de los quistes (Wallace et al. 2008). Otro estudio describio los perfiles de expresion genica de diversas protemas matricelulares en biopsias de pacientes con glomerulopatias y disfuncion renal; mostro que la periostina era altamente inducida en los compartimentos tubulointersticiales y fibroticos y estaba correlacionada negativamente con la funcion renal. Recientemente, la periostina se identifico en la nefropatfa hipertensiva inducida por L-NAME como un indicador de la progresion y regresion de la CKD (Guerrot et al. 2012). Se demostro en realidad que la expresion de periostina se correlaciona con los marcadores funcionales de la enfermedad renal (creatinina plasmatica, proteinuria, flujo sangumeo renal) y que su localizacion estaba asociada a las areas fibroticas perivasculares, caractenstica de la nefropatia hipertensiva experimental. Curiosamente, la periostina estaba sobre-expresada en la enfermedad renal humana y se encontraba en las regiones tubulointersticiales fibroticas lesionadas de la nefropatfa cronica por aloinjerto. En resumen, estos resultados indican que la periostina es un buen marcador de la progresion y probablemente regresion de la fibrosis renal. Sin embargo, estos estudios no abordaron la cuestion de si la periostina participa o no en el desarrollo de la fibrosis renal y de la CKD.

Sumario de la invencion:

La presente invencion se refiere a un inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina para uso en el tratamiento de una CKD en un sujeto que lo necesite, en el que dicho inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina es un pequeno RNA inhibidor (siRNA) de la periostina, una ribozima de la periostina o un oligonucleotido antisentido anti-periostina.

El inhibidor para uso de acuerdo con la invencion, en el que el sujeto que lo necesita padece nefropatfa hipertensiva.

El inhibidor para uso de acuerdo con la invencion, en el que el sujeto que lo necesita padece glomerulonefritis.

El inhibidor para uso de acuerdo con la invencion, en el que el sujeto que lo necesita padece nefropatfa diabetica.

Descripcion detallada de la invencion:

Los inventores se centraron en la implicacion de la periostina en el establecimiento de la fibrosis renal. Para este fin, investigaron su funcion y mecanismos en la nefropatfa tubulointersticial experimental; por tanto, desarrollaron un modelo de obstruccion ureteral unilateral (UUO) en ratones de tipo natural (WT, por sus siglas en ingles Wild-Type) y con la periostina eliminada (KO, por sus siglas en ingles Knock-Out) y mostraron que los ratones que carecen de periostina estan protegidos contra el desarrollo de fibrosis renal y enfermedad renal.

A continuacion, los inventores mostraron que la administracion de un inhibidor del inhibidor del gen de periostina (es decir, un oligonucleotido antisentido) en un modelo de rata con nefropatia hipertensiva (ratas tratadas con L-NAME) es tambien util para protegerlas contra el desarrollo de fibrosis renal y enfermedad renal. En resumen, estos datos proporcionan una evidencia inicial de que la periostina puede ser una diana prometedora contra la progresion de la CKD.

Por consiguiente, en un primer objeto, la presente descripcion detalla un agente que se une a la periostina seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptameros, moleculas organicas pequenas y polipeptidos para uso en la prevencion o el tratamiento de la enfermedad renal cronica (CKD) en un sujeto que lo necesite.

Como se usa en la presente memoria, el termino “periostina” pretende abarcar todos los sinonimos que incluyen, aunque sin limitacion, “factor espedfico de osteoblastos 2”, “OSF-2” o “POSTN”, incluyendo la periostina que existe de forma natural, asf como sus variantes.

El termino “protema periostina” se refiere a la protema periostina de 834 aminoacidos proporcionada en la base de datos GenPept con el numero de acceso NP_006466.

Como se usa en la presente memoria, el termino “prevencion” se refiere a prevenir la aparicion de la enfermedad o afeccion en un sujeto al que todavfa no se le ha diagnosticado.

Como se usa en la presente memoria, el termino “tratamiento” se refiere a inhibir la enfermedad o afeccion, es decir, detener su desarrollo; aliviar la enfermedad o afeccion, es decir, provocar la regresion de la afeccion; o aliviar las afecciones causadas por la enfermedad, es decir, los smtomas de la enfermedad.

Como se usa en la presente memoria, el termino “enfermedad renal cronica” (CKD) se refiere a una perdida progresiva de la funcion renal durante un penodo de meses o anos. La CKD tiene su significado general en la tecnica y se usa para clasificar numerosas afecciones que afectan al rinon, la destruccion del parenquima renal y la perdida de nefronas o glomerulos funcionales. Ademas, se debe observar que la CKD puede deberse a diferentes causas, pero la via final sigue siendo la fibrosis renal. Los ejemplos de etiologfa de la CKD incluyen, aunque sin limitacion, enfermedades cardiovasculares, hipertension, diabetes, glomerulonefritis, enfermedades renales poliqrnsticas y rechazo de injerto renal.

Como se usa en la presente memoria, los terminos “fibrosis renal” o “fibrogenesis renal” se refieren a un mecanismo patologico caracterizado por una inflamacion cronica que conduce a una acumulacion anomala de la matriz extracelular (ECM), por ejemplo, cambios cualitativos y cuantitativos de la composicion de las membranas del basamento tubular (TBM), matriz intersticial, atrofia tubular y acumulacion de miofibroblastos. Este proceso fibrotico que conduce a una disminucion del numero de nefronas en funcionamiento aun no esta claro y constituye la clave de la progresion de la CKD.

Mas precisamente, el consorcio Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) desarrollo y publico por primera vez un sistema para la definicion y clasificacion de estadios de la CKD. Por tanto, la CKD se ha definido segun los criterios enumerados de acuerdo con la Tabla 11 de la clasificacion KDOQI CKD (sobre la base de la reduccion de la tasa de filtracion glomerular (GFR) en combinacion con signos de lesion renal) como se reproduce en la Tabla 1 siguiente:

Tabla 1. Definicion de criterios de la enfermedad renal cronica

1. Lesion renal durante > 3 meses, definida por anomalfas estructurales o funcionales del rinon, con o sin disminucion de la GFR, que se manifiesta por:

- Anomalfas patologicas; o

- Marcadores de la lesion renal, incluyendo anomalfas en la composicion de la sangre u orina, o anomalfas en las pruebas de imagen

2. GFR < 60 mL/min/1,73 m2 durante > 3 meses, con o sin lesion renal

Los metodos para estimar la GFR se describen en la Grna 4.

Los marcadores de la lesion renal se describen en las Grnas 5-6.

Un “sujeto” en el contexto de la presente invencion es un ser humano (hombre o mujer). Tfpicamente, dicho sujeto ha sido diagnosticado previamente con una enfermedad que conduce a la CKD.

La descripcion detalla que el paciente que lo necesita padece una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en nefropatfa (por ejemplo, nefropatfa membranosa (MN), nefropatfa diabetica y nefropatfa hipertensiva), glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis membranosa y glomerulonefritis membranoproliferante (MPGN), tal como glomerulonefritis rapidamente progresiva (RPGN), nefritis intersticial, nefritis lupica, smdrome nefrotico idiopatico (INS) (por ejemplo, smdrome nefrotico por cambios mmimos (MCNS) y glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS)), uropatia obstructiva, enfermedad renal poliqmstica (por ejemplo, enfermedad renal poliqmstica autosomica dominante (ADPKD) y enfermedad renal poliqmstica autosomica recesiva (ARPKD), enfermedades cardiovasculares, hipertension, diabetes y rechazo de injerto renal (por ejemplo, rechazo renal agudo y cronico).

La descripcion detalla que el agente es un anticuerpo o una de sus porciones. La invencion describe respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que el anticuerpo es un anticuerpo quimerico. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende una cadena ligera del anticuerpo. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende una cadena pesada del anticuerpo. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende una porcion Fab del anticuerpo. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende una porcion F(ab')2 del anticuerpo. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende una porcion Fc del anticuerpo. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende una porcion Fv del anticuerpo. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende un dominio variable del anticuerpo. La descripcion detalla respecto a los anticuerpos o sus porciones descritos en la presente memoria, que la porcion del anticuerpo comprende uno o mas dominios de CDR del anticuerpo.

Como se usa en la presente memoria, “anticuerpo” incluye tanto anticuerpos naturales como no naturales. Espedficamente, “anticuerpo” incluye anticuerpos policlonales y monoclonales y sus fragmentos monovalentes y divalentes. Ademas, “anticuerpo” incluye anticuerpos quimericos, anticuerpos totalmente sinteticos, anticuerpos de una sola cadena y sus fragmentos. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o no humano. Un anticuerpo no humano puede ser humanizado por metodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre.

Los anticuerpos se preparan de acuerdo con la metodologfa convencional. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar utilizando el metodo de Kohler and Milstein (Nature, 256:495, 1975). Para preparar anticuerpos monoclonales utiles en la invencion, se inmuniza un raton u otro animal hospedante apropiado a intervalos adecuados (por ejemplo, dos veces por semana, semanalmente, dos veces al mes o mensualmente) con formas antigenicas de periostina. Al animal se le puede administrar un “refuerzo” final de antfgeno antes de una semana del sacrificio. Con frecuencia es deseable usar durante la inmunizacion un adyuvante inmunologico. Los adyuvantes inmunologicos adecuados incluyen adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, alumbre, adyuvante de Ribi, Titermax de Hunter, adyuvantes de saponina, tales como QS21 o Quil A, u oligonucleotidos inmunoestimulantes que contienen CpG. Otros adyuvantes adecuados son bien conocidos en la tecnica. Los animales pueden ser inmunizados por vfas subcutanea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intranasal u otras. Un animal dado puede ser inmunizado con multiples formas del antfgeno por multiples vfas.

En resumen, la periostina recombinante se puede proporcionar por expresion con lmeas celulares recombinantes. La forma recombinante de periostina se puede proporcionar utilizando cualquier metodo descrito previamente. Despues del regimen de inmunizacion, los linfocitos se afslan del bazo, ganglio linfatico u otro organo del animal y se fusionan con una lmea celular de mieloma adecuada utilizando un agente, tal como polietilenglicol, para formar un hibridoma. Despues de la fusion, las celulas se colocan en medios que permitan el crecimiento de hibridomas, pero no los socios de fusion, utilizando metodos estandares, como se ha descrito (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 3rd edition, Academic Press, New York, 1996). Despues del cultivo de los hibridomas, se analizan los lfquidos sobrenadantes celulares para determinar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, es decir, que se unan selectivamente al antfgeno. Las tecnicas analfticas adecuadas incluyen ELISA, citometna de flujo, inmunoprecipitacion y transferencia de Western. Otros metodos de cribado son bien conocidos en la tecnica. Las tecnicas preferidas son las que confirman la union de anticuerpos al antfgeno plegado de forma natural y conformacionalmente intactos, tales como ELISA no desnaturalizante, citometna de flujo e inmunoprecipitacion.

Significativamente, como es bien sabido en la tecnica, solo una pequena porcion de una molecula de anticuerpo, el paratopo, esta implicada en la union del anticuerpo a su epftopo (vease, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones Fc' y Fc, por ejemplo, son efectoras de la cascada del complemento, pero no estan implicadas en la union al antfgeno. Un anticuerpo a partir del cual la region pFc' ha sido escindida enzimaticamente, o que ha sido producida sin la region pFc', denominado un fragmento F(ab')2, retiene ambos sitios de union al antfgeno de un anticuerpo intacto. De manera similar, un anticuerpo a partir del cual la region Fc ha sido escindida enzimaticamente, o que ha sido producida sin la region Fc, denominada fragmento Fab, retiene uno de los sitios de union al anfrgeno de una molecula de anticuerpo intacto. Continuando, los fragmented Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida covalentemente y una porcion de la cadena pesada del anticuerpo denominada Fd. Los fragmented Fd son el principal determinante de la especificidad del anticuerpo (un solo fragmento Fd se puede asociar con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmented Fd retienen la capacidad de union al epftopo de manera aislada.

Dentro de la porcion de union a anfrgeno de un anticuerpo, como es bien conocido en la tecnica, existen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que interaccionan directamente con el epftopo del anfrgeno, y regiones marco (FR), que mantienen la estructura terciaria del paratopo (vease, en general, Clark, 1986; Roitt, 1991). Tanto en el fragmento Fd de la cadena pesada como en la cadena ligera de las inmunoglobulinas IgG, hay cuatro regiones marco (FR1 a FR4) separadas respectivamente por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1 a CDRS). Las CDR, y en particular las regiones CDRS, y mas particularmente las CDRS de cadena pesada, son en gran parte responsables de la especificidad del anticuerpo.

Ahora esta bien establecido en la tecnica que las regiones no CDR de un anticuerpo de mairftfero se pueden sustituir por regiones similares de anticuerpos coespedficos o heteroespedficos manteniendo mientras la especificidad epitopica del anticuerpo original. Esto se manifiesta mas claramente en el desarrollo y uso de anticuerpos "humanizados" en los que las CDR no humanas se unen covalentemente a las regiones f R y/o Fc/pFc' humanas para producir un anticuerpo funcional.

Esta descripcion detalla composiciones y metodos que incluyen formas humanizadas de anticuerpos. Como se usa en la presente memoria, "humanizados" describe anticuerpos en los que alguno, la mayona o todos los aminoacidos fuera de las regiones CDR estan sustituidos por aminoacidos correspondientes procedentes de moleculas de inmunoglobulina humana. Los metodos de humanizacion incluyen, aunque sin limitacion, los descritos en las patentes de EE.UU. n.os 4.816.567, 5.225.539, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 y 5.859.205, que se incorporan aqrn como referencia. Las patentes de EE.UU. n.os 5.585.089 y 5.693.761 anteriores y el documento WO 90/07861 proponen tambien cuatro criterios posibles que se pueden usar en el diseno de los anticuerpos humanizados. La primera propuesta fue que, para un aceptor, se use un marco de una inmunoglobulina humana particular que sea inusualmente homologa a la inmunoglobulina del donante que se ha de humanizar, o se use un marco de consenso de muchos anticuerpos humanos. La segunda propuesta fue que, si un aminoacido en el marco de la inmunoglobulina humana es inusual y el aminoacido donante en dicha posicion es tfpico de las secuencias humanas, entonces se puede seleccionar el aminoacido donante en lugar del aceptor. La tercera propuesta fue que en las posiciones inmediatamente adyacentes a las 3 CDR en la cadena de inmunoglobulina humanizada, se puede seleccionar el aminoacido donante en lugar del aminoacido aceptor. La cuarta propuesta fue utilizar el aminoacido donante que reside en las posiciones marco en las que se predice que el aminoacido tendra un atomo de cadena lateral dentro de 3A de las CDR en un modelo tridimensional del anticuerpo y se predice que puede ser capaz de interaccionar con las CDR. Los metodos anteriores son simplemente ilustrativos de algunos de los metodos que un experto en la tecnica podna emplear para preparar anticuerpos humanizados. Un experto en la tecnica estara familiarizado con otros metodos para la humanizacion de anticuerpos.

La descripcion detalla que, en las formas humanizadas de los anticuerpos, alguno, la mayona o todos los aminoacidos fuera de las regiones CDR han sido sustituidos por aminoacidos de moleculas de inmunoglobulina humana pero donde alguno, la mayona o todos los aminoacidos dentro de una o mas regiones CDR estan inalterados. Son aceptables pequenas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoacidos, siempre que no anulen la capacidad del anticuerpo para unirse a un antfgeno dado. Las moleculas de inmunoglobulina humana adecuadas incluinan moleculas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo “humanizado” retiene una especificidad antigenica similar a la del anticuerpo original. Sin embargo, usando ciertos metodos de humanizacion, la afinidad y/o especificidad de union del anticuerpo se puede aumentar usando metodos de “evolucion dirigida”, como ha sido descrito por Wu et al., J. Mol. Biol. 294:151, 1999, cuyos contenidos se incorporan aqrn como referencia.

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos se pueden preparar tambien inmunizando ratones transgenicos para grandes porciones de locus de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas humanas. Veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.os 5.591.669, 5.598.369, 5.545.806, 5.545.807, 6.150.584, y las referencias citadas en ellas, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia. Estos animales han sido modificados geneticamente de tal manera que haya una delecion funcional en la produccion de anticuerpos endogenos (por ejemplo, muridos). Los animales se modifican adicionalmente para que contengan toda o una porcion del locus del gen de la inmunoglobulina de la ftnea germinal humana, de modo que la inmunizacion de estos animales dara como resultado la produccion de anticuerpos completamente humanos frente al antfgeno de interes. Despues de la inmunizacion de estos ratones (por ejemplo, XenoMouse (Abgenix), ratones HuMAb (Medarex/GenPharm)), se pueden preparar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la tecnologfa del hibridoma estandar. Estos anticuerpos monoclonales tendran secuencias de aminoacidos de inmunoglobulina humana y por tanto no provocaran respuestas de anticuerpos anti-raton humanos (KAMA) cuando se administren a seres humanos.

Existen tambien metodos in vitro para producir anticuerpos humanos. Estos incluyen la tecnologfa de presentacion de fagos (Patentes de EE.UU. n.os 5.565.332 y 5.573.905) y la estimulacion in vitro de linfocitos B humanos (Patentes de EE.UU. n.os 5.229.275 y 5.567.610). Los contenidos de estas patentes se incorporan en la presente memoria como referencia.

Por tanto, como sera evidente para un experto en la tecnica, la presente descripcion tambien proporciona los fragmentos F(ab')2, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quimericos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido sustituidas por secuencias homologas humanas o no humanas; anticuerpos quimericos del fragmento F(ab')2 en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido sustituidos por secuencias homologas humanas o no humanas; anticuerpos quimericos del fragmento Fab en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido sustituidos por secuencias homologas humanas o no humanas; y anticuerpos quimericos del fragmento Fd en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 han sido sustituidos por secuencias homologas humanas o no humanas. La presente invencion incluye tambien los denominados anticuerpos de una sola cadena.

Las diversas moleculas y fragmentos de anticuerpos pueden proceder de cualquiera de las clases de inmunoglobulinas comunmente conocidas, incluyendo, aunque sin limitacion, IgA, IgA secretora, IgE, IgG e IgM. Tambien son muy conocidas por los expertos en la tecnica las subclases de IgG e incluyen, aunque sin limitacion, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.

En la descripcion se detalla que el anticuerpo de acuerdo con la invencion es un anticuerpo de un solo dominio. El termino “anticuerpo de un solo dominio” (sdAb) o “VHH” se refiere al unico dominio variable de cadena pesada de anticuerpos del tipo que se pueden encontrar en mairnferos camelidos que estan desprovistos de forma natural de cadenas ligeras. Dichos VHH se denominan tambien “nanobody®”. De acuerdo con la descripcion, sdAb puede ser particularmente sdAb de llama.

A continuacion, para esta descripcion, una vez que se han obtenido los anticuerpos que se unen a la periostina, se seleccionan los anticuerpos neutralizantes de la periostina. Por consiguiente, la descripcion detalla que el anticuerpo que se une a la periostina es un anticuerpo anti-periostina neutralizante (es decir, un anticuerpo que bloquea la actividad de la periostina conduciendo a la prevencion de la fibrosis renal y a la acumulacion excesiva de matriz extracelular (ECM) en el rinon).

Un ejemplo de anticuerpo neutralizante (MZ-1) ha sido descrito por Zhu et al., 2011, que se incorpora en la presente memoria como referencia.

Los metodos para obtener anticuerpos anti-periostina neutralizantes son muy conocidos por los expertos en la tecnica, como los descritos en la solicitud de patente EP1978034.

La descripcion detalla que el agente es un aptamero. Los aptameros son una clase de molecula que representa una alternativa a los anticuerpos en terminos de reconocimiento molecular. Los aptameros son secuencias de oligonucleotidos u oligopeptidos con capacidad para reconocer virtualmente cualquier clase de moleculas diana con alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos se pueden aislar por medio de enriquecimiento por Systematic Evolution of Ligands by Exponential (SELEX) de una coleccion de secuencias aleatorias, como ha sido descrito por Tuerk C. and Gold L., 1990. La coleccion de secuencias aleatorias se puede obtener por smtesis qmmica combinatoria de DNA. En esta coleccion, cada miembro es un oligomero lineal, finalmente modificado qmmicamente, de una sola secuencia. Las posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moleculas han sido revisados por Jayasena S.D, 1999. Los aptameros peptfdicos consisten en una region variable de anticuerpo conformacionalmente restringida presentada por una protema de plataforma, tal como la tiorredoxina A de E. coli, que se seleccionan de colecciones combinatorias por dos metodos hteridos (Colas et al., 1996).

A continuacion, en esta descripcion, se seleccionan los aptameros neutralizantes de la periostina.

La descripcion detalla que el agente es un polipeptido. En una realizacion particular, el polipeptido es un equivalente funcional de una protema de la matriz extracelular o un receptor de adhesion que es capaz de unirse a la periostina. Como se usa en la presente memoria, “una protema de la matriz extracelular” es una protema seleccionada del grupo que consiste en fibronectina, tenascina-C, colagenos (por ejemplo, colageno de tipo I y V). Como se usa en la presente memoria, “un receptor de adhesion” es un receptor seleccionado del grupo que consiste en integrinas (por ejemplo, avp3, avp5 y a6p4).

Como se usa en la presente memoria, un “equivalente funcional de una protema de la matriz extracelular o un receptor de adhesion” es un compuesto que es capaz de unirse a la periostina. El termino “equivalente funcional” incluye fragmentos, mutantes y mutemas de una protema de la matriz extracelular o un receptor de adhesion. El termino “funcionalmente equivalente” incluye por tanto cualquier equivalente de una protema de la matriz extracelular o un receptor de adhesion obtenido alterando la secuencia de aminoacidos, por ejemplo, por una o mas deleciones, sustituciones o adiciones de aminoacidos de manera que el analogo de la protema retenga la capacidad de union a la periostina. Se pueden hacer sustituciones de aminoacidos, por ejemplo, por mutacion puntual del DNA que codifica la secuencia de aminoacidos. Preferiblemente, el equivalente funcional es al menos 80% homologo a la protema correspondiente. En una realizacion preferida, el equivalente funcional es al menos 90% homologo evaluado por cualquier algoritmo de analisis convencional, tal como, por ejemplo, el programa informatico de analisis de secuencias Pileup (Program Manual for the Wisconsin Package, 1996). Se considera que dichas moleculas seran utiles para la prevencion o el tratamiento de la CKD, puesto que estas moleculas se uniran espedficamente a la periostina y por tanto evitaran la fibrosis renal inducida por la periostina y finalmente evitaran o trataran la CKD. Como se usa en la presente memoria, “uniendose espedficamente” significa que el analogo funcionalmente equivalente tiene una alta afinidad por la periostina, pero no por las protemas de control. La union espedfica se puede medir por una serie de tecnicas, tales como ELISA, citometna de flujo, transferencia de Western o inmunoprecipitacion. Preferiblemente, el analogo funcionalmente equivalente se une espedficamente a la periostina a niveles nanomolares o picomolares.

Los polipeptidos de la descripcion se pueden producir por cualquier medio adecuado, como sera evidente para los expertos en la tecnica. Con el fin de producir cantidades suficientes de una protema de la matriz extracelular, de un receptor de adhesion o de sus equivalentes funcionales para uso de acuerdo con la presente descripcion, la expresion se puede lograr convenientemente cultivando en condiciones apropiadas celulas hospedantes recombinantes que contengan el polipeptido de la invencion. Preferiblemente, el polipeptido se produce por medios recombinantes, por expresion a partir de una molecula de acido nucleico codificante. Los sistemas para la clonacion y expresion de un polipeptido en una variedad de diferentes celulas hospedantes son bien conocidos.

Cuando se expresa en forma recombinante, el polipeptido se genera preferiblemente por expresion a partir de un acido nucleico codificante en una celula hospedante. Se puede usar cualquier celula hospedante, dependiendo de los requisitos individuales de un sistema en particular. Las celulas hospedantes adecuadas incluyen bacterias, celulas de mamfferos, celulas de plantas, levaduras y sistemas de baculovirus. Las lmeas celulares de marnffero disponibles en la tecnica para la expresion de un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino, celulas HeLa, celulas de rinon de cna de hamster y muchas otras. Las bacterias son tambien hospedantes preferidos para la produccion de protema recombinante, debido a la facilidad con la que las bacterias se pueden manipular y cultivar. Un hospedante bacteriano preferido es E. coli.

La descripcion detalla que se considera que los polipeptidos usados en los metodos terapeuticos de la presente descripcion pueden ser modificados con el fin de mejorar su eficacia terapeutica. Dicha modificacion de los compuestos terapeuticos se puede usar para disminuir la toxicidad, aumentar el tiempo circulatorio o modificar la biodistribucion. Por ejemplo, la toxicidad de compuestos terapeuticos potencialmente importantes se puede disminuir significativamente por combinacion con una variedad de veldculos portadores de farmacos que modifican la biodistribucion. Por ejemplo, la adicion de dipeptidos puede mejorar la penetracion de un agente circulante en el ojo a traves de la barrera hematoretiniana utilizando transportadores endogenos.

Una estrategia para mejorar la viabilidad del farmaco es la utilizacion de polfmeros solubles en agua. Se ha demostrado que varios polfmeros solubles en agua modifican la biodistribucion, mejoran el modo de captacion celular, cambian la permeabilidad a traves de barreras fisiologicas; y modifican la velocidad de eliminacion por el cuerpo. Para lograr un efecto de direccionamiento o de liberacion prolongada, se han sintetizado polfmeros solubles en agua que contienen restos de farmacos como grupos terminales, como parte de la cadena principal, o como grupos colgantes en la cadena del polfmero.

El polietilenglicol (PEG) ha sido utilizado ampliamente como vedculo de farmacos, dado su alto grado de biocompatibilidad y facilidad de modificacion. Se ha demostrado que la union a varios farmacos, protemas y liposomas mejora el tiempo de permanencia y disminuye la toxicidad. El PEG se puede acoplar a agentes activos a traves de los grupos hidroxilo en los extremos de la cadena y por medio de otros metodos qmmicos; sin embargo, el PEG propiamente dicho se limita como sumo a dos agentes activos por molecula. En un planteamiento diferente, se exploraron los copolfmeros de PEG y aminoacidos como nuevos biomateriales que retendnan las propiedades de biocompatibilidad del PEG, pero que tendnan la ventaja anadida de numerosos puntos de union por molecula (proporcionando una mayor carga de farmaco), y que podnan ser disenados sinteticamente para adaptarse a una variedad de aplicaciones.

Los expertos en la tecnica conocen los metodos de PEGilacion para la modificacion eficaz de farmacos. Por ejemplo, VectraMed (Plainsboro, N.J.) ha utilizado polfmeros para suministro de farmacos que consisten en polfmeros alternativos al PEG y monomeros trifuncionales, tal como la lisina. Las cadenas del PEG (tfpicamente 2000 daltones o menos) estan unidas a los grupos a- y e-aminos de la lisina por medio de enlaces de uretano estables. Dichos copolfmeros retienen las propiedades deseables del PEG, proporcionando mientras grupos colgantes reactivos (los grupos de acido carboxflico de la lisina) a intervalos estrictamente controlados y predeterminados a lo largo de la cadena del polfmero. Los grupos colgantes reactivos se pueden utilizar para la derivatizacion, reticulacion o conjugacion con otras moleculas. Estos polfmeros son utiles para producir profarmacos estables de larga circulacion variando el peso molecular del polfmero, el peso molecular de los segmentos de PEG y el enlace escindible entre el farmaco y el polfmero. El peso molecular de los segmentos del PEG afecta al espaciamiento del complejo farmaco/grupo de enlace y a la cantidad de farmaco por peso molecular del conjugado (los segmentos de PEG mas pequenos proporcionan mayor carga de farmaco). En general, el aumento del peso molecular total del conjugado de copolfmeros de bloque aumentara la semivida circulatoria del conjugado. Sin embargo, el conjugado debe ser facilmente degradable o tener un peso molecular por debajo del de la filtracion glomerular que limita el umbral (por ejemplo, menor que 60 kDa).

Ademas de que la cadena principal del polfmero es importante para mantener la semivida circulatoria, y la biodistribucion, se pueden usar enlazadores para mantener el agente terapeutico en una forma profarmaco hasta que sea liberado de la cadena principal del poKmero por un desencadenador espedfico, tipicamente la actividad enzimatica en el tejido al que ha sido dirigido Por ejemplo, este tipo de suministro de farmaco activado por tejido es particularmente util cuando se requiere el suministro a un sitio espedfico de biodistribucion y el agente terapeutico es liberado en el sitio de la patologfa o cerca de el. Las colecciones de grupos de enlace para uso en el suministro de farmacos activados son conocidas por los expertos en la tecnica y se pueden basar en la cinetica de enzimas, la prevalencia de la enzima activa y la especificidad de escision de las enzimas espedficas de la enfermedad seleccionadas. Dichos enlazadores se pueden usar para modificar la protema o el fragmento de protema descrita en la presente memoria para la administracion terapeutica.

La presente descripcion detalla ademas un agente que se une a la periostina seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptameros, pequenas moleculas organicas y polipeptidos para prevenir o reducir la fibrosis renal.

En otro objeto, la presente invencion se refiere a un inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina para uso en el tratamiento de una CKD en un sujeto que lo necesite, en el que dicho inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina es un pequeno RNA inhibidor (siRNA), una ribozima de la periostina o un oligonucleotido antisentido anti-periostina.

El inhibidor para uso de acuerdo con la invencion, en el que el sujeto que lo necesita padece nefropatfa hipertensiva.

El inhibidor para uso de acuerdo con la invencion, en el que el sujeto que lo necesita padece glomerulonefritis.

El inhibidor para uso de acuerdo con la invencion, en el que el sujeto que lo necesita padece nefropatfa diabetica.

Un “ inhibidor de expresion” se refiere a un compuesto natural o sintetico que tiene un efecto biologico para inhibir la expresion de un gen. Por tanto, un “inhibidor de la expresion del gen de periostina” significa un compuesto natural o sintetico que tiene un efecto biologico para inhibir la expresion del gen de periostina.

La invencion describe que dicho inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina es un siRNA de periostina, un oligonucleotido antisentido anti-periostina o una ribozima de periostina.

Los inhibidores de la expresion del gen de periostina para uso en la presente invencion se pueden basar en construcciones de oligonucleotidos antisentido. Los oligonucleotidos antisentido, incluyendo las moleculas de RNA antisentido y las moleculas de DNA antisentido, actuaran para bloquear directamente la traduccion del mRNA de periostina uniendose a el y evitando asf la traduccion de la protema o aumentando la degradacion del mRNA, disminuyendo por tanto el nivel de periostina, y por tanto la actividad, en una celula. Por ejemplo, se pueden sintetizar oligonucleotidos antisentido de al menos aproximadamente 15 bases y complementarios a regiones unicas de la secuencia transcrita del mRNA que codifica la periostina, por ejemplo, por tecnicas de fosfodiester convencionales y ser administradas, por ejemplo, por inyeccion o infusion intravenosa. Los metodos para usar tecnicas antisentido para inhibir espedficamente la expresion genica de genes cuya secuencia es conocida son muy conocidos en la tecnica (por ejemplo, veanse las patentes de EE. UU. n.os 6.566.135; 6.566.131; 6.365.354; 6.410.323; 6.107.091; 6.046.321 y 5.981.732).

Se debe observar ademas que los oligonucleotidos antisentido pueden ser modificados con fosforotioato para evitar su hidrolisis in vivo por nucleasas. Dichas modificaciones son muy conocidas por los expertos en la tecnica.

La invencion describe que la secuencia del oligonucleotido antisentido que se dirige a la periostina esta representada por la SEQ ID NO: 1.

La invencion describe que la secuencia del oligonucleotido antisentido que se dirige a la periostina esta representada por la SEQ ID NO: 2.

Los RNA inhibidores pequenos (siRNA) tambien pueden actuar como inhibidores de la expresion del gen de periostina para su uso en la presente invencion. La expresion del gen de periostina se puede reducir poniendo en contacto el tumor, el sujeto o la celula, con un RNA bicatenario pequeno (dsRNA) o un vector o construccion que provoque la produccion de un RNA bicatenario pequeno, de manera que se inhiba espedficamente la expresion del gen de periostina (es decir, RNA de interferencia o RNAi). Los metodos para seleccionar un dsRNA apropiado o un vector que codifica dsRNA son muy conocidos en la tecnica para genes cuya secuencia se conoce (por ejemplo, veanse Tuschi, T. et al. (1999); Elbashir, S.M. et al. (2001); Hannon, GJ (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); Patentes de EE.UU. n.os 6.573.099 y 6.506.559 y publicaciones de patentes internacionales n.osWO 01/36646, WO 99/32619 y WO 01/68836).

Las ribozimas tambien pueden actuar como inhibidores de la expresion del gen de periostina para su uso en la presente invencion. Las ribozimas son moleculas de RNA enzimaticas capaces de catalizar la escision espedfica del RNA. El mecanismo de la accion de la ribozima implica la hibridacion espedfica de una secuencia de la molecula de ribozima al RNA diana complementario, seguido por la escision endonucleolttica. Las moleculas de ribozima con restos en horquilla o en cabeza de martillo modificadas geneticamente que catalizan espedfica y eficazmente la escision endonucleolftica de las secuencias del mRNA de periostina son por tanto utiles dentro del alcance de la presente invencion. Los sitios espedficos de escision de las ribozimas dentro de cualquier diana potencial de RNA se identifican inicialmente explorando la molecula diana en busca de sitios de escision por la ribozima, que incluyen normalmente las siguientes secuencias, GUA, GUU y GUC. Una vez identificadas, se pueden evaluar las secuencias cortas de RNA de entre aproximadamente 15 y 20 ribonucleotidos correspondientes a la region del gen diana que contiene el sitio de escision para determinar las caractensticas estructurales predichas, tal como la estructura secundaria, que pueden hacer que la secuencia de oligonucleotidos sea inapropiada. La idoneidad de las dianas candidatas tambien se puede evaluar analizando su accesibilidad a la hibridacion con oligonucleotidos complementarios, utilizando, por ejemplo, ensayos de proteccion con ribonucleasas.

Tanto los oligonucleotidos antisentido como las ribozimas utiles como inhibidores de la expresion del gen de periostina se pueden preparar por metodos conocidos. Estos incluyen tecnicas para la smtesis qmmica tal como, por ejemplo, por smtesis qmmica con fosforamidita en fase solida. Alternativamente, las moleculas de RNA antisentido pueden ser generadas por transcripcion in vitro o in vivo de secuencias de DNA que codifican la molecula de RNA. Dichas secuencias de DNA se pueden incorporar en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de RNA polimerasa adecuados, tales como los promotores T7 o SP6 de la polimerasa. Se pueden introducir diversas modificaciones en los oligonucleotidos de la invencion como medio para aumentar la estabilidad intracelular y la semivida. Las posibles modificaciones incluyen, aunque sin limitacion, la adicion de secuencias flanqueantes de ribonucleotidos o desoxirribonucleotidos a los extremos 5' y/o 3' de la molecula, o el uso de fosforotioato o 2'-O-metilo en lugar de enlaces de fosfodiesterasa dentro de la cadena principal del oligonucleotido.

Los siRNA de oligonucleotidos antisentido y las ribozimas de la invencion se pueden suministrar in vivo solos o en asociacion con un vector. En su sentido mas amplio, un “vector” es cualquier vehmulo capaz de facilitar la transferencia del siRNA del oligonucleotido antisentido o del acido nucleico de la ribozima a las celulas y preferiblemente a las celulas que expresan la periostina. Preferiblemente, el vector transporta el acido nucleico a las celulas con una degradacion reducida con relacion al grado de degradacion que resultana de la ausencia del vector. En general, los vectores utiles en la invencion incluyen, aunque sin limitacion, plasmidos, fagemidos, virus, otros vehmulos derivados de fuentes virales o bacterianas que han sido manipulados por la insercion o incorporacion de las secuencias de siRNA del oligonucleotido antisentido o del acido nucleico de las ribozimas. Un tipo preferido de vector son los vectores virales e incluyen, aunque sin limitacion, secuencias de acidos nucleicos procedentes de los siguientes virus: retrovirus, tal como el virus de la leucemia de muridos de Moloney, el virus del sarcoma de muridos de Harvey, el virus del tumor mamario de muridos y el virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adenoasociados; virus de tipo SV40; virus de polioma; virus de Epstein-Barr; virus de papiloma; herpesvirus; virus de la viruela vacuna; poliovirus; y virus de RNA, tal como un retrovirus. Se pueden emplear facilmente otros vectores no nombrados pero conocidos en la tecnica.

Los vectores virales preferidos se basan en virus eucariotas no citopaticos en los que los genes no esenciales han sido sustituidos por el gen de interes. Los virus no citopaticos incluyen retrovirus (por ejemplo, lentivirus), cuyo ciclo vital implica la transcripcion inversa del RNA viral genomico en d Na con la integracion proviral subsiguiente en el DNA celular hospedante. Los retrovirus han sido aprobados para ensayos de terapia genica en seres humanos. Los mas utiles son los retrovirus que tienen una replicacion deficiente (es decir, capaces de dirigir la smtesis de las protemas deseadas, pero incapaces de fabricar una partmula infecciosa). Dichos vectores de expresion retrovirales geneticamente alterados tienen una utilidad general para la transduccion in vivo de alta eficacia de genes. Se proporcionan protocolos estandares para producir retrovirus con replicacion deficiente (incluyendo las etapas de incorporacion de material genetico exogeno en un plasmido, transfeccion de una celula empaquetadora revestida con plasmido, produccion de retrovirus recombinantes por la lmea de celulas empaquetadoras, recogida de partmulas virales de medios de cultivo de tejidos e infeccion de las celulas diana con partmulas virales) en KRIEGLER (“A Laboratorio Manual’, W.H. Freeman C.O., New York, 1990) y en MURRY (“Methods in Molecular Biology’, vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991).

Los virus preferidos para ciertas aplicaciones son los adenovirus y los virus adeno-asociados, que son virus de DNA bicatenario que ya han sido aprobados para uso humano en terapia genica. El virus adeno-asociado puede estar modificado geneticamente para tener una replicacion deficiente y ser capaz de infectar una amplia gama de tipos de celulas y especies. Ademas, tiene ventajas, tales como estabilidad al calor y en disolventes lipfdicos; altas frecuencias de transduccion en celulas de diversos linajes, incluyendo las celulas hemopoyeticas; y falta de inhibicion de la superinfeccion permitiendo asf multiples series de transducciones. Segun se informa, el virus adenoasociado se puede integrar en el DNA celular humano de una manera espedfica del sitio, minimizando con ello la posibilidad de mutagenesis por insercion y la variabilidad de la expresion genica insertada caractenstica de la infeccion retroviral. Ademas, las infecciones por virus adeno-asociados de tipo natural se han seguido en el cultivo de tejidos durante mas de 100 pases en ausencia de presion selectiva, lo que implica que la integracion genomica del virus adeno-asociado es un episodio relativamente estable. El virus adeno-asociado tambien puede actuar de manera extracromosomica.

Otros vectores incluyen vectores plasmfdicos. Los vectores plasirndicos han sido descritos ampliamente en la tecnica y son muy conocidos por los expertos en la materia. Vease, por ejemplo, SANBROOK et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los ultimos anos, los vectores plasirndicos se han utilizado como vacunas de DNA para suministrar in vivo a las celulas genes que codifican antfgenos. Son particularmente ventajosos para este fin debido a que no se tienen las mismas precauciones de seguridad que con muchos de los vectores virales. Estos plasmidos, sin embargo, que tienen un promotor compatible con la celula hospedante, pueden expresar un peptido de un gen codificado operativamente dentro del plasmido. Algunos plasmidos usados comunmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 y pBlueScript. Otros plasmidos son muy conocidos por los expertos en la tecnica. Ademas, los plasmidos pueden disenarse a medida utilizando enzimas de restriccion y reacciones de ligacion para retirar y anadir fragmentos espedficos de DNA. Los plasmidos pueden ser suministrados por una variedad de vfas parenteral, mucosal y topica. Por ejemplo, el DNA plasmfdico se puede inyectar por vfas intramuscular, intradermica, subcutanea u otras v^as. Tambien se puede administrar por pulverizaciones o gotas intranasales, supositorio rectal y por via oral. Tambien se pueden administrar en la epidermis o en una superficie de la mucosa usando una pistola de genes. Los plasmidos se pueden administrar en una solucion acuosa, secados sobre partículas de oro o en asociacion con otro sistema de administracion de DNA incluyendo, aunque sin limitacion, liposomas, dendnmeros, cocleato y microencapsulacion.

La presente invencion describe ademas un inhibidor de la expresion del gen de periostina para prevenir o reducir la fibrosis renal.

Otro objeto de la descripcion se refiere a un metodo para la prevencion o el tratamiento de la CKD que comprende una etapa de administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente que se une a la periostina seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptameros, pequenas moleculas organicas y polipeptidos o un inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina a un sujeto que lo necesite.

La descripcion detalla un metodo para prevenir o reducir la fibrosis renal que comprende una etapa de administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de al menos un agente que se une a la periostina seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptameros, pequenas moleculas organicas y polipeptidos o un inhibidor de la expresion del gen de periostina a un sujeto que lo necesite.

Por una “cantidad terapeuticamente eficaz” del agente o inhibidor de la expresion del gen de periostina, como se ha descrito anteriormente, se entiende una cantidad suficiente del agente o inhibidor para prevenir o tratar la CKD. Se entendera, sin embargo, que el uso diario total de los compuestos y composiciones de la presente invencion sera decidido por el medico responsable dentro del alcance de un buen juicio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz espedfico para cualquier sujeto particular dependera de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se esta tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, el peso, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el tiempo de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos utilizados en combinacion o coincidentes con el polipeptido espedfico empleado; y factores similares muy conocidos en las tecnicas medicas. Por ejemplo, esta dentro de la experiencia de la tecnica iniciar dosis del compuesto a niveles menores que los requeridos para lograr el efecto terapeutico deseado e ir aumentando gradualmente la dosificacion hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosificacion diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo desde 0,01 hasta 1000 mg por adulto al dfa. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomatico de la dosificacion al sujeto que se ha de tratar. Un medicamento contiene tfpicamente desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Generalmente se suministra una cantidad eficaz del farmaco a un nivel de dosificacion desde 0,0002 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso al dfa, especialmente desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 7 mg/kg de peso al dfa.

El agente que se une a la periostina o inhibidor de la expresion del gen de periostina de la descripcion se puede combinar con excipientes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberacion prolongada, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.

Por tanto, la presente invencion describe una composicion farmaceutica para uso en la prevencion o tratamiento de la CKD que comprende un agente o un inhibidor de acuerdo con la invencion y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

La presente invencion tambien describe una composicion farmaceutica para prevenir o reducir la fibrosis renal que comprende un agente o un inhibidor de acuerdo con la invencion y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

’’Farmaceuticamente” o “farmaceuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra reaccion inapropiada cuando se administran a un mairnfero, especialmente a un ser humano, segun proceda. Un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a una carga solida, semisolida o lfquida no toxica, un diluyente, un material encapsulante o un auxiliar de formulacion de cualquier tipo.

En las composiciones farmaceuticas de la presente invencion para administracion oral, sublingual, subcutanea, intramuscular, intravenosa, transdermica, local o rectal, el principio activo, solo o en combinacion con otro principio activo, se puede administrar en una forma de administracion unitaria, como una mezcla con soportes farmaceuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administracion unitaria adecuadas comprenden formas para via oral, tales como comprimidos, capsulas de gelatina, polvos, granulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administracion sublingual y bucal, aerosoles, implantes, formas de administracion subcutanea, transdermica, topica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdermica, transdermica, intratecal e intranasal y formas de administracion rectal.

Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas contienen vetnculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion capaz de ser inyectada. Estas pueden ser en particular soluciones salinas esteriles e isotonicas (fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de dichas sales) o composiciones secas, especialmente liofilizadas que por adicion de, dependiendo del caso, agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permite la reconstitucion de soluciones inyectables.

Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida para que sea facilmente inyectable. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y se debe conservar contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones que comprenden compuestos de la invencion en forma de base libre o sales farmacologicamente aceptables se pueden preparar en agua mezcladas adecuadamente con un agente tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles lfquidos y sus mezclas y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

El inhibidor de la expresion del gen de periostina de la invencion se puede formular en una composicion en forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos, tales como, por ejemplo, acidos clortndrico o fosforico, o acidos organicos, tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Tambien se pueden obtener sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorganicas, tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferricos, y bases organicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.

El vehfculo puede ser tambien un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), sus mezclas adecuadas y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partículas requerido en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de los microorganismos puede ser realizada por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr por el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los polipeptidos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, segun sea necesario, seguido por esterilizacion por filtracion. En general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehfculo esteril que contenga el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de secado al vacfo y liofilizacion que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una de sus soluciones previamente filtradas esteriles.

En la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad tal que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero tambien se pueden emplear capsulas de liberacion del farmaco y similares.

Para administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion debe ser tamponada adecuadamente si es necesario y el diluyente lfquido debe hacerse primero isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos esteriles que se pueden emplear seran muy conocidos por los expertos en la tecnica gracias a la presente descripcion. Por ejemplo, una dosis podna disolverse en 1 mL de solucion isotonica de NaCl y anadirse hasta 1000 mL de fluido para hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto para la infusion. Se producira necesariamente alguna variacion en la dosificacion dependiendo del estado del sujeto que se esta tratando. En cualquier caso, la persona responsable de la administracion determinara la dosis adecuada para el sujeto individual.

El agente que se une a la periostina o al inhibidor de la expresion del gen de periostina de la invencion se puede formular dentro de una mezcla terapeutica que comprenda de aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o de aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos, o de aproximadamente 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis. Tambien se pueden administrar dosis multiples.

Ademas de los compuestos de la invencion formulados para administracion parenteral, tales como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para administracion oral; formulaciones liposomicas; capsulas de liberacion prolongada; y cualquier otra forma actualmente utilizada.

La invencion sera ilustrada adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ningun modo como limitantes del alcance de la presente invencion.

Figuras:

Figura 1: La expresion de periostina es altamente inducida en la corteza renal de ratones despues de la obstruccion ureteral unilateral (UUO). A. mRNA de periostina; B. Protema periostina.

Figura 2: Los ratones que carecen de expresion de periostina estan protegidos contra las alteraciones estructurales tfpicas inducidas por la UUO. A. Dilatacion tubular; B. Fibrosis; C. Acumulacion de colageno fibrilar (tincion con rojo sirio) y D. Expresion de mRNA de colageno III.

Figura 3: Los ratones que carecen de expresion de periostina presentan un mejor grado de conservacion del parenquima renal despues de la UUO. A. Conservacion tubular (expresion de RNA de vimentina); B. Proliferacion celular (inmunotincion con Ki 67); C. Apoptosis

Figura 4: Los ratones que carecen de expresion de periostina tienen una respuesta inflamatoria suave despues de la UUO. A. Expresion de RNA de MCP-1; B. Expresion de RNA de IL-17; C. Expresion de RNA de Foxp3; D. Expresion de RNA de ROR6T.

Figura 5: El suministro de ODN antisentido espedfico in vivo disminuye la expresion de periostina en los rinones de ratas hipertensas (modelo L-NAME).

Figura 6: La administracion in vivo de ODN antisentido de periostina espedfico atenuo las alteraciones estructurales tfpicas observadas en la nefropatfa hipertensiva en ratas. A. Dilatacion tubular; B. Glomeruloesclerosis; C. Hipertrofia vascular; D. Fibrosis.

Figura 7: Administracion de ODN antisentido de periostina espedfico a ratas hipertensas en las que la proteinuria supero en 2 gramos las tasas de mortalidad sustancialmente reducidas.

Ejemplos: Periostina, una protema extracelular implicada en el desarrollo de la CKD

Ejemplo 1: Los ratones con la periostina desactivada (KO) estan protegidos contra el desarrollo de la CKD en una nefropatfa tubulointersticial experimental (modelo UUO).

Material y Metodos

Animales: Los experimentos se realizaron en ratones de tipo natural y periostina anulada (POSTN KO) donados amablemente por S.J. Conway (Indianapolis, Indiana). Estos ratones se caracterizan por la falta del gen de periostina y la sustitucion del sitio de iniciacion de la traduccion y el primer exon por un gen informador lacZ (ref). Se usaron ratones hembras C57BL/6 WT y POSTN KO de 4 a 6 meses (n = 9). El modelo de nefropatfa tubulointersticial fue inducido por la obstruccion ureteral unilateral (UUO). Despues de una anestesia general (inyeccion intraperitoneal de pentobarbital 50 mg/kg), los ratones POSTN KO y sus homologos WT se sometieron a una incision en el flanco izquierdo. La UUO se realizo por ligacion completa del ureter izquierdo a la union ureteropelvica, utilizando dobles suturas de seda. Se utilizaron como controles los rinones contralaterales. Los ratones fueron sacrificados el dfa 15.

Los animales se mantuvieron con acceso libre a la comida estandar y al agua del grifo durante los protocolos. Se sacrificaron bajo anestesia general (pentobarbital 150 mg/kg). Se extrajeron los rinones y se dividieron en cuatro partes iguales (para RNA, protemas, criocortes y cortes en parafina). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Directrices de la Union Europea para el cuidado y el uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el comite de etica local.

Histolog â renal: Los rinones se sumergieron 24 h en alcohol-formaldetndo-acido acetico (AFA) y luego se incrustaron en cera de parafina antes del corte. Los tejidos se cortaron en secciones de 4 pm y se tineron con tricromo de Masson. Los portaobjetos se examinaron independientemente a ciegas para determinar el nivel de dilatacion tubular, la fibrosis perivascular (para ratones y ratas), la glomeruloesclerosis y la hipertrofia vascular (para ratas), utilizando una escala de lesiones de 0 a 4 como se ha descrito anteriormente. El valor medio se utilizo para comparar los grupos de animales.

Rojo sirio: La fibrosis intersticial se evaluo en cortes de parafina tenidos con rojo sirio de 4 pm de espesor a 40 aumentos, bajo luz polarizada. Se seleccionaron aleatoriamente cinco campos corticales excluyendo las arterias interlobulares de cada rinon y se cuantifico el area tenida de rojo por area total, que refleja la fibrosis intersticial, utilizando un programa de analisis morfometrico informatico (Axionplan, Axiophot2, Zeiss, Alemania). La puntuacion se realizo de forma ciega en diapositivas codificadas. Los datos se expresan como el valor medio del porcentaje de area positiva examinada.

IHC: La tincion para determinar la periostina se realizo en cortes congelados de 5 pm. Los cortes se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-periostina de raton de rata (R&D Systems, 1/1000), durante una hora a 37°C. Para la tincion de linfocitos T y macrofagos en proliferacion, se desparafinaron cortes de 5 pm de rinones incrustados en parafina, se calentaron en solucion de acido cftrico (pH 6) a 98°C durante 30 minutos, y se incubaron respectivamente con: Ki 67 (conejo policlonal, Abcam, 1/1000), CD3 (anti-humano de raton, Dako 1/200), F4/80 (anti-raton de rata monoclonal, AbD Serotec, 1/200).

Los anticuerpos secundarios proceden del kit N-Histofine (Nichirei Biochemicals, Japon). Se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La tincion se revelo aplicando AEC (Dako), se contratino con hematoxilina QS (Vector, Burlingame, CA) y se finalizo con medios de montaje acuosos permanentes (Innovex).

Tincion de (3-gal: La tincion de (3-gal ha sido descrita por JS. Duffield et al. Los tejidos se fijaron con PFA al 4% a 4°C durante una hora, se transfirieron a PBS que contema sacarosa al 18% durante una noche (4°C) y luego se almacenaron a -80°C. Se realizaron cortes de 5 pm, se lavaron en PBS durante 10 minutos, se incubaron en un tampon de bloqueo (MgCh 1 mM, desoxicolato de Na al 0,01%, IGEPAL-CA630 al 0,02% y EGTA 5 mM en PBS) durante 20 minutos a temperatura ambiente, y se incubaron en la mezcla X-gal [MgCh 1 mM, desoxicolato de Na al 0,01%, IGEPAL-CA630 al 0,02%, EGTA 5 mM, KaFe(CN)a 5 mM, K4Fe(CN)6.3 H₂O 5 mM y 1 pg de X-gal; todos de Invivogen)]; se tuvo cuidado de realizar la tincion de X-gal a pH neutro y la incubacion se llevo a cabo durante 16 horas a 37°C. Despues de 5 min de lavado con PBS, los cortes se contratineron con eosina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se montaron.

Marcaje final in situ para la deteccion de las celulas apoptosicas: Para detectar las celulas apoptosicas, se tineron cortes de tejido de 5 pm fijados en AFA e incrustados en parafina por el ensayo TUNEL, utilizando el kit de peroxidasa ApopTag Plus (Qbiogen, Francia S7101-KIT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada corte de rinon, se analizo el area cortical completa con 40 aumentos. Se conto manualmente el numero de celulas apoptosicas tenidas por campo de potencia y se uso el valor medio para comparar los animales.

PCR: Los inventores extrajeron el RNA de la corteza renal utilizando una solucion de TRIzol (Life Technologies BRL, Gaithersburg, MD). La calidad del RNA se verifico midiendo la relacion de densidades opticas a 260 y 280 nm y se separo el DNA genomico residual por tratamiento con DNasa I durante 30 minutos a 37°C (Fermentas). Los inventores utilizaron transcripcion inversa con el kit de smtesis de la primera cadena de DNA Revert Aid H minus (Fermentas) para convertir 1 pg de RNA en cDNA. Los analisis transcriptomicos se realizaron con RT2Profiler PCR Array (Superarray, Bioscience Corp, Tebu Bio, Le Perray en Yvelines, Francia). El cDNA se amplifico por PCR utilizando un LightCycler 480 (Roche Diagnostic) que usa SYBR Green (Fast Start DNA Master SYBR Green I; Roche Applied Science, Roche Diagnostic), cebadores espedficos para el mRNA seleccionado y el gen de mantenimiento de protemas ribosomica L32 (RPL32) de 60S bajo las siguientes condiciones: 95°C durante 5 min y 45 ciclos a 95°C durante 15 segundos y 60°C durante 15 segundos, luego 72°C durante 15 segundos. Los cebadores espedficos fueron disenados por el sistema Universal Probe Library (UPL, Roche Applied Science). Para normalizar los resultados de qRT-PCR, los inventores utilizaron el programa informatico Roche LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics). Los inventores expresaron los resultados como 2-ACp, donde Cp es el numero de umbrales del ciclo. Analizaron las curvas de disociacion despues de cada experimento para cada amplicon para evaluar la especificidad de la cuantificacion cuando se usa SYBR Green.

Analisis por transferencia de Western: Las protemas se extrajeron de la corteza renal utilizando un tampon RIPA suplementado con un coctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich). Se calentaron 20 pg de protemas diluidas en tampon de muestra de SDS a 70°C durante 10 minutos, se separaron en un gel de Tris-HCl al 4-15% y luego se transfirieron a una membrana de PVDF (Thermo Scientific). Despues de bloquear en PBS 1x, leche al 5% (Thermoscientific) durante 2 horas a temperatura ambiente, se incubo la membrana con los anticuerpos primarios (periostina, E-cadherina) durante una noche a 4°C, se lavo y se incubo con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano silvestre (SouthernBiotech o Vector) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las bandas de protemas se visualizaron utilizando reactivos picoquimioluminescentes Supersignal® West potenciados de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Thermoscientific) y se cuantificaron utilizando densitometna (Chemicapt, Fisher Bioblock Scientific).

Estad^stica: Los analisis estadfsticos se realizaron utilizando ANOVA seguido por el ensayo Protected Least Significance. Difference Fisher (programa informatico Statview). Los resultados con p < 0,05 fueron considerados estadfsticamente significativos. Todos los valores son medias ± SEM.

Resultados

La expresion de periostina es inducida despues de UUO: El RNA mensajero de periostina (mRNA) examinado por RT-qPCR, muestra una expresion basal muy baja de periostina en los rinones de control. Esta expresion esta 50 veces sobrerregulada el dfa 15 despues de la obstruccion (Figura 1A). Este hallazgo es confirmado por inmunotransferencia que no muestra periostina en los rinones de control y una induccion significativa de periostina renal el dfa 5 y el dfa 15 despues de la UUO (Figura 1B). Con el fin seguir la aparicion y la localizacion de la periostina, los inventores realizaron una tincion de p-galactosidasa en ratones KO y una inmunotincion en ratones WT correspondientes 2 dfas, 5 dfas y 15 d^as despues de la UUO. La tincion de p-galactosidasa y periostina no se detecto en los rinones de control. Despues de la UUO, la p-galactosidasa muestra que comienza la expresion de periostina en las celulas epiteliales del conducto colector (dfa 2), luego en celulas epiteliales tubulares (dfa 5, d^a 15) y en las celulas intersticiales (dfa 15). La inmunohistoqmmica muestra una tincion intersticial para la periostina que comienza en la medula (dfa 2) y se expande a la corteza (dfa 5, dfa 15). En conjunto, estos datos demuestran que la expresion de periostina es inducida por UUO y esta correlacionada con la progresion de la lesion.

Los ratones con periostina anulada estan protegidos de la dilatacion tubular y la fibrosis inducidas por UUO: La evaluacion de la histologfa renal se realizo por tincion tricromica de Masson en rinones normales y obstruidos. 15 dfas despues de la UUO, los ratones KO muestran menos dilatacion tubular (Figura 2A) y menos fibrosis (Figura 2B). Para resaltar la acumulacion de colageno fibrilar, los cortes renales se tineron con rojo sirio y el analisis morfometrico demostro que los ratones KO ternan menos colageno fibrilar en comparacion con los WT (Figura 2C). Este dato fue confirmado por la expresion de mRNA de colageno III evaluada por RT-qPCR (Figura 2D).

Los ratones con periostina anulada presentan una mejor conservacion de las celulas tubulares epiteliales: Para aclarar la diferencia observada entre los ratones WT y KO en terminos de dilatacion tubular, los inventores examinaron la proliferacion celular (Figura 3B), la conservacion tubular (Figura 3A) y la apoptosis (Figura 3C). La proliferacion se evaluo por inmunotincion con Ki 67 (marcador de celulas proliferantes); la conservacion tubular se demostro por la expresion del RNA de vimentina (marcador de celulas mensenquimales) y el nivel de protema E-cadherina (molecula de adhesion de celulas epiteliales). La apoptosis fue evaluada por TUNEL. El dfa 15, las celulas tubulares epiteliales proliferaron mas en el rinon obstruido de ratones KO en comparacion con el de ratones WT. El aumento del nivel del RNA de vimentina fue simultaneo a la perdida de E-cadherina para los ratones WT, mientras que los ratones KO mostraron menos aumento de vimentina y mantenimiento de E-cadherina. Por el contrario, las celulas apoptosicas aumentaron de manera similar en ratones WT y KO despues de la UUO.

Periostina e inflamacion: La nefropatfa obstructiva se caracteriza por una respuesta inflamatoria en el rinon que contribuye a la atrofia tubular y la fibrosis intersticial. Puesto que los ratones POSTN KO estaban protegidos en cuanto a la fibrosis y la lesion tubular, los inventores investigaron la inflamacion. Curiosamente, despues de la UUO, la RT-qPCR mostro que la sobrerregulacion de la protema quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) estaba significativamente atenuada en ratones POSTN KO (Figura 4A). Sin embargo, no habfa diferencias significativas entre los ratones POSTN KO y WT para IL-17 (Figura 4B) o para la expresion de ROR8T/Foxp3 (Figuras 4C y 4D). La infiltracion de los macrofagos fue evaluada por IHC, no observandose diferencias en las celulas F4/80+, 15 dfas despues de la UUO.

Ejemplo 2: Los oligonucleotidos antisentido de la periostina protegen frente al desarrollo de nefropatfa hipertensiva en un modelo de rata (ratas tratadas con L-NAME).

Material y Metodos

Animales: Ratas Sprague-Dawley machos, que pesaban 250 g, se mantuvieron a una dieta con sal normal y con acceso libre a comida y agua. Para inducir un modelo de nefropatfa hipertensiva, L-NAME, un inhibidor de la smtesis de NO, se administro en el agua de beber a la dosis de 30 mg/kg/dfa. Con el fin de investigar el papel de la periostina, los inventores utilizaron un metodo antisentido para sub-regular su expresion.

Administracion de ODN antisentido (AS) contra periostina: Para bloquear la expresion de periostina, los inventores utilizaron oligodesoxinucleotidos (ODN) AS espedficos modificados con fosforotioato para evitar su hidrolisis in vivo por nucleasas. Los ODN AS o de control desordenados se administraron por via intraperitoneal (IP, 1 pM) bien de forma preventiva o curativa. En el protocolo preventivo, la inyeccion de ODN antisentido comenzo con la administracion de L-NAME y las ratas se sacrificaron el dfa 19. Sin embargo, en el protocolo curativo, la inyeccion de ODN antisentido comenzo despues de la administracion de L-NAME, cuando las ratas habfan alcanzado una proteinuria de 1 g/mmol. L-NAME se mantuvo, pero la dosis se redujo hasta 15 mg/kg/dfa y las ratas se sacrificaron una semana despues del tratamiento con ODN antisentido.

Resultados

Como se muestra en la Figura 5, la administracion in vivo de ODN antisentido espedfico disminuye la expresion de periostina en los rinones de ratas hipertensas (modelo L-NAME). Como se muestra en la Figura 6, la administracion in vivo de ODN antisentido de periostina espedfico atenuo las alteraciones estructurales tfpicas observadas en la nefropatfa hipertensiva en ratas (es decir, dilatacion tubular, glomeruloesclerosis, hipertrofia vascular y fibrosis). Ademas, como se muestra en la Figura 7, la administracion de ODN antisentido de periostina espedfico a ratas hipertensas en las que la proteinuria superaba 2 gramos disminuyo sustancialmente las tasas de mortalidad demostrando el interes de incidir en la periostina (por ejemplo, por el inhibidor de la expresion del gen de periostina o por un anticuerpo o aptamero neutralizante anti-periostina) para prevenir y tambien para tratar la CKD.

Conclusion:

Los inventores han demostrado que la periostina esta implicada en el desarrollo de la CKD promoviendo la fibrosis

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina para uso en el tratamiento por terapia de la enfermedad renal cronica (CKD) en un sujeto que lo necesite, en el que dicho inhibidor de la expresion del gen de periostina o del mRNA de periostina es un pequeno RNA inhibidor (siRNA) de periostina, una ribozima de periostina o un oligonucleotido antisentido anti-periostina.

2. El inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el sujeto que lo necesita padece nefropatfa hipertensiva.

3. El inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el sujeto que lo necesita padece glomerulonefritis.

4. El inhibidor para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el sujeto que lo necesita padece nefropatfa diabetica.