ES2713455T3

ES2713455T3 - Un grupo novedoso de inhibidores de la ruta STAT3 e inhibidores de la ruta de células madre de cáncer

Info

Publication number: ES2713455T3
Application number: ES16156335T
Authority: ES
Inventors: Chiang Li; Zhiwei Jiang; Harry Rogoff; Youzhi Li; Jifeng Liu; Wei Li
Original assignee: Boston Biomedical Inc
Current assignee: Sumitomo Pharma Oncology Inc
Priority date: 2007-09-10
Filing date: 2008-09-10
Publication date: 2019-05-21
Anticipated expiration: 2028-09-10
Also published as: PT3067054T; LT3067054T; HRP20210496T1; HUE054409T2; ES2859699T3

Abstract

Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloronafto[ 2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoronafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2- etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)vinil] éster del ácido fosfórico, 1- (4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)vinil éster dimetil éster del ácido fosfórico, y una sal o solvato de los mismos farmacéuticamente aceptable, o una composición farmacéutica que comprende dicho compuesto, para uso en: (i) un método para tratar a un sujeto, comprendiendo el método las etapas de identificar a un sujeto por actividad aberrante de la ruta de Stat3 y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto; (ii) un método in vivo para inhibir una célula madre cancerosa para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar a una célula madre cancerosa una cantidad eficaz del compuesto; (iii) un método para tratar a un sujeto para cáncer refractario a una quimioterapia y/o radioterapia, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica; (iv) un método para tratar o prevenir la recaída del cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica; (v) un método para tratar o prevenir la metástasis del cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica; (vi) un método para inhibir una célula madre cancerosa para tratar el cáncer en un sujeto, en donde el método se dirige selectivamente a las células cancerosas en un sujeto, comprendiendo el método administrar a un sujeto una composición farmacéutica, de manera que la concentración del compuesto en el plasma del sujeto no se mantenga por encima de una concentración crítica durante más de 24 horas después de cada dosis, destruyendo de esa forma las células cancerosas de forma selectiva y al mismo tiempo protegiendo las células normales; (vii) un método para inhibir una célula madre de cáncer para tratar el cáncer en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica.

Description

DESCRIPCION

Un grupo novedoso de inhibidores de la ruta STAT3 e inhibidores de la ruta de celulas madre de cancer.

Campo de la invencion

La presente divulgacion se refiere en general al uso de inhibidores de la ruta de Stat3 para tratar afecciones. Mas especificamente, la divulgacion se refiere al uso de los inhibidores de la ruta STAT3 para atacar a celulas madre de cancer y para tratar otros trastornos. Aun mas especificamente, la divulgacion se relaciona con el uso de nafto[2,3-b]furan-4,9-diona y compuestos relacionados para inhibir Stat3, para atacar a las celulas madre de cancer y para tratar enfermedades malignas. La divulgacion tambien se refiere al tratamiento para canceres refractarios, recurrentes o metastasicos, y a procesos para preparar compuestos relevantes y sus intermedios, y a la composicion farmaceutica de compuestos relevantes.

Antecedentes de la invencion

Celulas madre de cancer (CSC).

En los ultimos anos, un nuevo modelo de tumorigenesis ha ganado una amplia aceptacion, donde se supone que solo una pequena fraccion de la masa tumoral total es responsable de las actividades tumorigenicas dentro del tumor, mientras que el modelo genetico antiguo o clonal postula que todas las celulas tumorales mutadas contribuyen igualmente a tales actividades tumorigenicas. Esta pequena fraccion de celulas tumorigenicas, segun el nuevo modelo, son celulas transformadas con cualidades similares a las de las celulas madre y se denominan "celulas madre cancerosas" (CSC). Bonnet and Dick demostraron por primera vez, in vivo, la presencia de CSC en la leucemia mieloide aguda (LMA) durante la decada de 1990. Sus datos mostraron que solo una pequena subpoblacion de celulas de AML humanas tenian la capacidad de transferir AML cuando se trasplantaban a ratones inmunodeficientes, mientras que otras celulas de AML eran incapaces de inducir leucemia. Mas tarde, se demostro que estas CSC tienen los mismos marcadores celulares, CD34+/CD38-, como celulas madre hematopoyeticas primitivas [1]. Desde entonces, los investigadores han encontrado CSC de manera concluyente en diversos tipos de tumores, incluidos los de cerebro, mamas, piel, prostata, etc.

El modelo CSC de tumorigenesis explicaria por que decenas o cientos de miles de celulas tumorales necesitan ser inyectadas en un animal experimental para establecer un trasplante de tumor. En la AML humana, la frecuencia de estas celulas es inferior a 1 en 10.000 [2]. Aunque es raro en una determinada poblacion de celulas tumorales, existe una creciente evidencia de que tales celulas existen en casi todos los tipos de tumores. Sin embargo, como las lineas celulares de cancer se seleccionan de una subpoblacion de celulas cancerosas que estan especificamente adaptadas para crecer en cultivos de tejidos, las propiedades biologicas y funcionales de las lineas de celulas cancerosas pueden sufrir cambios dramaticos. Por lo tanto, no todas las lineas celulares de cancer contienen CSC.

Las celulas madre de cancer comparten muchos rasgos similares con las celulas madre normales. Por ejemplo, las CSC tienen capacidad de autorrenovacion, es decir, la capacidad de dar lugar a celulas madre cancerigenas tumorigenicas adicionales, por lo general a un ritmo mas lento que otras celulas tumorales en division, en oposicion a un numero limitado de divisiones. Las CSC tambien tienen la capacidad de diferenciarse en multiples tipos de celulas, lo que explicaria la evidencia histologica de que no solo muchos tumores contienen multiples tipos de celulas nativas del organo huesped, sino tambien que la heterogeneidad se mantiene comunmente en las metastasis tumorales. Se ha demostrado que las CSC son fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la recurrencia del cancer. Las CSC tambien se denominan celulas iniciadoras de tumores, celulas similares a celulas madre cancerosas, celulas cancerosas similares a celulas madre, celulas altamente tumorigenicas, celulas madre tumorales, celulas madre tumorales solidas o celulas supermalignas.

La existencia de celulas madre cancerosas tiene implicaciones fundamentales para futuros tratamientos y terapias contra el cancer. Estas implicaciones se manifiestan en la identificacion de la enfermedad, la seleccion selectiva de farmacos, la prevencion de la metastasis y la recurrencia del cancer y el desarrollo de nuevas estrategias para combatir el cancer.

La eficacia de los tratamientos actuales contra el cancer se mide, en las etapas iniciales de la prueba, a menudo por el tamano de la contraccion del tumor, es decir, la cantidad de masa tumoral que se elimina. Dado que las CSC formarian una proporcion muy pequena del tumor y tendrian caracteristicas biologicas marcadamente diferentes de sus progenies mas diferenciadas, la medicion de la masa tumoral no necesariamente seleccionara los medicamentos que actuan especificamente en las celulas madre. De hecho, las celulas madre de cancer parecen ser resistentes a la radioterapia (XRT) y tambien son refractarias a los farmacos quimioterapeuticos y dirigidos [3-5]. Las celulas madre somaticas normales son naturalmente resistentes a los agentes quimioterapeuticos: tienen varias bombas (como la MDR) que bombean los farmacos y las proteinas de reparacion del ADN. Ademas, tambien tienen una velocidad lenta de recambio celular mientras que los agentes quimioterapeuticos se dirigen a las celulas que se replican rapidamente. Las celulas madre de cancer, que son las contrapartes mutadas de las celulas madre normales, tambien pueden tener mecanismos similares que les permitan sobrevivir a las terapias con medicamentos y al tratamiento de radiacion. En otras palabras, las quimioterapias y radioterapias convencionales matan las celulas diferenciadas o diferenciadoras, que forman la mayor parte del tumor que no pueden generar nuevas celulas madre cancerosas altamente tumorigenicas. La poblacion de celulas madre cancerosas que dieron origen a las celulas diferenciadas y diferenciadoras, por otro lado, podrfa permanecer intacta y provocar una recafda de la enfermedad. Un peligro adicional para la terapia anticancerfgena convencional es la posibilidad de que el tratamiento quimioterapeutico deje solo celulas madre cancerosas resistentes a la quimioterapia, y el tumor recurrente resultante probablemente tambien sea resistente a la quimioterapia.

Dado que las celulas madre cancerosas supervivientes pueden repoblar el tumor y causar una recafda, es imperativo que las terapias contra el cancer incluyan estrategias contra las CSC (vease la Figura 1). Esto es similar a eliminar las rafces para evitar que vuelvan a crecer los dientes de leon, incluso si se ha cortado la masa a nivel del suelo [6]. Al dirigirse selectivamente a las celulas madre de cancer, es posible tratar a pacientes con tumores agresivos no resecables y canceres refractarios o recurrentes, asf como prevenir la metastasis y la recurrencia del tumor. El desarrollo de terapias especfficas dirigidas a las celulas madre de cancer puede mejorar la supervivencia y la calidad de vida de los pacientes con cancer, especialmente para quienes padecen canceres metastasicos. La clave para desbloquear este potencial sin explotar es la identificacion y validacion de rutas que son selectivamente importantes para la autorrenovacion y supervivencia de las celulas madre de cancer. Desafortunadamente, aunque en el pasado se han dilucidado multiples rutas que subyacen a la tumorigenesis en el cancer o la autorrenovacion en celulas madre adultas y embrionarias, no se han identificado y validado rutas para la autorrenovacion y supervivencia de las celulas madre de cancer.

Tambien se ha investigado mucho sobre la identificacion y el aislamiento de celulas madre cancerosas. Los metodos utilizados explotan principalmente la capacidad de las CSC para el eflujo de medicamentos, o se basan en la expresion de marcadores de superficie asociados con las celulas madre de cancer.

Por ejemplo, dado que las CSC son resistentes a muchos agentes quimioterapeuticos, no es sorprendente que las CSC sobreexpresen de manera ubicua las bombas de eflujo de medicamentos, como ABCG2 (BCRP-1) [7-11], y otros miembros de la superfamilia de casetes de union a ATP (ABC) [12, 13]. En consecuencia, la tecnica de poblacion lateral (SP), originalmente utilizada para enriquecer celulas madre hematopoyeticas y leucemicas, tambien se empleo para identificar y aislar CSC [14]. Esta tecnica, descrita por primera vez por Goodell et al., aprovecha el eflujo diferencial dependiente del transportador ABC de los colorantes fluorescentes como Hoechst 33342 para definir y aislar una poblacion celular enriquecida en CSC [10, 15]. Especfficamente, el SP se revela mediante el bloqueo del eflujo de farmaco con el verapamilo, momento en el cual los colorantes ya no pueden extraerse del SP.

Los investigadores tambien se han centrado en encontrar marcadores especfficos que distinguen a las celulas madre de cancer de la mayor parte del tumor. Los marcadores de superficie mas comunmente expresados por las celulas madre de cancer incluyen CD44, CD133 y CD166 [16-22]. La clasificacion de las celulas tumorales basandose principalmente en la expresion diferencial de estos marcadores de superficie ha representado la mayorfa de las CSC altamente tumorigenicas descritas hasta la fecha. Por lo tanto, estos marcadores de superficie estan bien validados para la identificacion y el aislamiento de celulas madre cancerosas de las lfneas celulares de cancer y de la mayor parte de los tejidos tumorales.

Ruta Stat3

Hay muchos defectos geneticos diferentes en celulas cancerosas de mamfferos o humanos, y muchos se han estudiado en la busqueda para curar el cancer. Por ejemplo, se ha encontrado que el supresor de tumores p53 es defectuoso o esta completamente ausente en mas de la mitad de los canceres humanos. La familia de protefnas STAT (transductores de senal y activadores de la transcripcion) son factores de transcripcion latentes que se activan en respuesta a las citoquinas/factores de crecimiento para promover la proliferacion, la supervivencia y otros procesos biologicos. Entre ellos, Stat3 se activa mediante la fosforilacion de un residuo crftico de tirosina mediado por la tirosina quinasas receptoras del factor de crecimiento, las quinasas Janus o las quinasas de la familia Src, etc. Estas quinasas incluyen, entre otras, EGFR, JAKs, Abl, KDR, c-Met, Src, y Her2 [23]. Tras la fosforilacion de la tirosina, Stat3 forma homo-dfmeros, se traslada al nucleo, se une a elementos especfficos de respuesta al ADN en las regiones promotoras de los genes diana e induce la expresion genica [24].

En las celulas normales, la activacion de Stat3 es transitoria y esta bien regulada, con una duracion de 30 minutos a varias horas. Sin embargo, se encuentra que Stat3 es aberrantemente activo en una amplia variedad de canceres humanos, incluidos todos los carcinomas principales, asf como algunos tumores hematologicos. Stat3 desempena multiples funciones en la progresion del cancer. Como potente regulador de la transcripcion, se dirige a los genes implicados en muchas funciones celulares importantes, como Bcl-xl, c-Myc, ciclina D1, Vegf, MMP-2 y survivina [25 30]. Tambien es un regulador negativo clave de la vigilancia inmune de tumores y el reclutamiento de celulas inmunitarias [31-33].

La ablacion de la senalizacion de Stat3 mediante ARNsi antisentido, una forma dominante negativa de Stat3 y/o bloqueo de las tirosina quinasas inhibe ciertas lfneas celulares de cancer o tumores in vitro y/o in vivo [24, 26, 34, 35]. Pero no se ha establecido emprncamente un vrnculo claro entre Stat3 y la funcionalidad de las celulas madre de cancer. Los investigadores tampoco han encontrado un inhibidor eficaz de la ruta STAT3 para explorar posibles usos terapeuticos con respecto a los canceres que se ha encontrado que contienen celulas madre de cancer. Como se describio anteriormente, se ha demostrado recientemente que las celulas madre de cancer (CSC) son fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis y la recurrencia, y deben tenerse en cuenta al disenar cualquier terapia curativa que se dirija a un tumor que se sabe que tiene estas celulas, sin importar cuan pequena sea la fraccion de la masa tumoral que puedan constituir.

En enfermedades distintas del cancer, se ha demostrado una activacion excesiva de Stat3 por Interleuquina 6 (IL6) en varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias [36]. Recientemente, se ha revelado que la ruta Stat3 tambien promueve respuestas inmunes patologicas a traves de su papel esencial en la generacion de respuestas de celulas T TH17 [37]. Ademas, se ha encontrado que la inflamacion mediada por la via IL6-Stat3 es el origen causal comun de la aterosclerosis, la enfermedad vascular periferica, la enfermedad arterial coronaria, la hipertension, la osteroprorosis, la diabetes tipo 2 y la demencia.

Resumen

La presente invencion se define en y por las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgacion se basa, en parte, en la evidencia empirica proporcionada en el presente documento de que Stat3 desempena un papel clave tanto en la supervivencia como en la capacidad de autorrenovacion de las celulas madre de cancer (CSC) en un amplio espectro de canceres. Por consiguiente, un primer aspecto de la divulgacion esta dirigido a un metodo para inhibir una celula madre cancerosa en donde el metodo comprende inhibir al menos algo, la mayoria o sustancialmente todos (por ejemplo, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95%) de la actividad de la ruta Stat3 en las celulas madre de cancer a traves de un inhibidor de la ruta Stat3. El metodo inhibe a la CSC de la autorrenovacion o mata a la CSC. El metodo puede llevarse a cabo in vitro o in vivo para tratar un cancer, especialmente los canceres que tienen CSC y tienen actividades aberrantes, por ejemplo, hiperactivas de la ruta Stat3. Estos dos criterios pueden cumplirse en virtud del conocimiento institucional, es decir, el cancer del paciente es de un tipo conocido por tener CSC y actividades aberrantes de la ruta STAT3, o puede confirmarse por el paciente individual, por ejemplo, a traves de pruebas realizadas en una biopsia. En una realizacion preferida, se sabe o se confirma de otro modo que las CSC tienen actividades aberrantes de ruta Stat3.

Los canceres que actualmente se sabe tienen tanto CSC como actividades aberrantes de la ruta Stat3 incluyen y no se limitan a: cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, melanoma, sarcoma, cancer de higado, tumores cerebrales, mieloma multiple y leucemia. Tambien se ha encontrado que muchas de las formas metastasicas de estos canceres tienen tanto CSC como actividades aberrantes de la ruta Stat3, como el cancer de mama metastasico. En una caracteristica, los metodos de la presente divulgacion se pueden practicar para tratar un cancer seleccionado de este grupo. En una realizacion, los metodos de la divulgacion se pueden practicar para tratar un cancer seleccionado entre los siguientes: cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de cuello uterino, carcinoma colorrectal, cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico y cancer de prostata.

Ademas, como se ha demostrado que las CSC son fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la recurrencia del cancer, los metodos de la divulgacion se pueden practicar para tratar el cancer que es metastasico, refractario a una quimioterapia o radioterapia, inherentemente resistente a la quimioterapia o que haya causado recaida en el sujeto despues de un tratamiento inicial. En una realizacion, el inhibidor de la ruta de Stat3 se aisla, se purifica o se sintetiza, y se puede seleccionar del grupo que consiste en un inhibidor de Stat3 de molecula pequena, un agente IARN contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor peptidomimetico de Stat3 y un cuarteto G de oligodesoxinucleotido inhibidor de stat3. El mecanismo de inhibicion se puede seleccionar del grupo que consiste en inhibir sustancialmente la fosforilacion de la proteina Stat3, inhibiendo sustancialmente la dimerizacion de la proteina Stat3, inhibiendo sustancialmente la translocacion nuclear de la proteina Stat3, inhibiendo sustancialmente la actividad de union al ADN de la proteina Stat3, y sustancialmente la inhibicion de las actividades de transcripcion de la proteina Stat3.

En una realizacion, el inhibidor es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b] furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1 -(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[ 2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, un enantiomero, diastereomero, tautomero y una sal o solvato de los mismos (en adelante denominado "Compuesto de la divulgacion").

En un segundo aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para inhibir la actividad de la ruta de Stat3 celular en una celula. El metodo incluye administrar a la celula una cantidad efectiva del Compuesto de la Divulgacion de tal manera que al menos la actividad de la ruta Stat3 no deseada en la celula se reduzca, por ejemplo, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. En una realizacion, la celula es una CSC, o de otro modo cancerosa. El metodo puede inducir la muerte celular o inhibir la autorrenovacion en la celula. El metodo puede llevarse a cabo in vitro o in vivo.

En un tercer aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar o prevenir un trastorno asociado con la actividad aberrante de la ruta Stat3 en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion de manera que al menos la actividad aberrante de la ruta Stat3 se reduce. En una caracteristica, la actividad aberrante de la ruta Stat3 se puede identificar mediante la expresion de Stat3 fosforilada o un regulador sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3. El trastorno puede ser un cancer. En una realizacion, se sabe que el cancer tiene actividades aberrantes de la ruta STAT3 e incluye, entre otras, cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, melanoma, carcinomas hepatocelulares, cancer cervical, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, mieloma multiple, leucemia y linfomas. El trastorno tambien puede ser una afeccion no cancerosa que se sabe que esta asociada con una actividad aberrante de la ruta STAT3, y en una realizacion, se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis, trastorno de desmielinizacion autoinmune, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, lesion por isquemia por reperfusion y esclerosis multiple.

En un cuarto aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar a un paciente e incluye las etapas para identificar a un paciente mediante una actividad de ruta Stat3 aberrante y administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva del Compuesto de la Divulgacion. En una realizacion, la etapa de identificar al paciente mediante una actividad aberrante de la ruta Stat3 comprende probar la expresion de Stat3 fosforilada o de un regulador sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3. La etapa de identificar al paciente mediante una actividad aberrante de la ruta Stat3 puede comprender analizar tejido enfermo o fluido extraido del paciente, que puede ser parte de un tumor.

En un quinto aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar a un paciente e incluye las etapas de identificar a un paciente diagnosticado con un trastorno asociado con una actividad aberrante de la ruta Stat3 y administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva del Compuesto de la Divulgacion. En una realizacion, la etapa de identificar al paciente comprende probar al menos un biomarcador que indica el trastorno en el paciente.

En un sexto aspecto, la presente divulgacion proporciona un kit que incluye al menos un agente para diagnosticar un trastorno asociado con la actividad aberrante de la ruta Stat3, que puede estar probando un biomarcador que indica la presencia del trastorno, y una cantidad terapeuticamente efectiva del Compuesto de la Divulgacion.

En un septimo aspecto, la presente divulgacion proporciona un kit que incluye al menos un agente para diagnosticar la actividad aberrante de la ruta Stat3, y una cantidad terapeuticamente efectiva del Compuesto de la Divulgacion. En una realizacion, el agente prueba la expresion de Stat3 fosforilado o de un regulador sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3.

En un octavo aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para inhibir una o mas celulas madre cancerosas. El metodo incluye administrar a la celula madre de cancer una cantidad efectiva del Compuesto de la Divulgacion. El metodo puede llevarse a cabo in vitro o in vivo para tratar un cancer en un sujeto. En una realizacion, se sabe que el cancer tiene CSC e incluye, entre otros, cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, cancer de higado, melanoma, mieloma multiple, tumores cerebrales, sarcomas, meduloblastoma y leucemia. En una realizacion, el cancer es metastasico. En otra realizacion, el cancer es refractario a una quimioterapia o radioterapia. Por ejemplo, el cancer puede ser inherentemente resistente a la quimioterapia. En otra realizacion mas, el cancer ha causado recaida en el sujeto despues de un tratamiento inicial.

En un noveno aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para cribar un candidato a farmaco capaz de inhibir una celula madre cancerosa, comprendiendo el metodo cribar un candidato a farmaco que inhiba la actividad de la ruta Stat3. El candidato a farmaco, en una realizacion, es capaz de inducir la muerte celular en las celulas madre de cancer, y en otra realizacion, inhibir la autorrenovacion de la CSC. En diversas realizaciones, el farmaco candidato es un inhibidor de la molecula Stat3 pequena, un agente de IARN contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor peptidomimetico de Stat3 o un inhibidor de oligodesoxinucleotidos Stat3 del cuarteto G. El candidato a farmaco puede tener la capacidad seleccionada de entre las siguientes: inhibir sustancialmente la fosforilacion de la proteina Stat3, inhibir sustancialmente la dimerizacion de la proteina Stat3, inhibir sustancialmente la translocacion nuclear de la proteina Stat3, inhibir sustancialmente la actividad de union al ADN de la proteina Stat3 e inhibir sustancialmente las actividades de transcripcion de la proteina Stat3.

En un decimo aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar un sujeto para cancer resistente a un tratamiento estandar, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion. El tratamiento estandar puede ser, por ejemplo, una quimioterapia, una radioterapia y/o cirugia. En una realizacion, el cancer es inherentemente resistente a la quimioterapia.

En un undecimo aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar o prevenir la recaida del cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion. En una realizacion, la composicion farmaceutica se administra como una terapia adyuvante despues de la cirugia.

En un duodecimo aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar o prevenir la metastasis del cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion. En una realizacion, la composicion farmaceutica se administra como una terapia adyuvante despues de la cirugia.

En un decimotercer aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para dirigirse selectivamente a las celulas cancerosas en un sujeto, por ejemplo, para tratar una enfermedad maligna, comprendiendo el metodo administrar a un sujeto una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion de tal manera que la concentracion de compuestos en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion critica durante mas de 24 horas despues de cada dosis, matando asi selectivamente las celulas cancerosas mientras que protege sustancialmente las celulas normales. Alternativamente, segun el metodo, la concentracion plasmatica del compuesto no esta por encima de la concentracion critica en un cierto punto de tiempo despues de cada dosis, por ejemplo, 12, 16, 20 o 24 horas. En una realizacion, la composicion farmaceutica se administra de tal manera que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion critica, por ejemplo, continuamente, por mas de una duracion seleccionada del grupo que consiste en 12, 16 y 20 horas despues de cada dosis. En diversas realizaciones, la concentracion critica es de aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 30 pM o aproximadamente 20 pM. En una realizacion, las celulas cancerosas son parte de un cancer seleccionado del grupo, o cualquiera de sus subgrupos, que consiste en cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, leucemia, linfoma, cancer de esofago, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer de endometrio, cancer de tiroides, cancer de vias biliares, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de vesicula biliar, cancer de pituitaria, cancer de recto, cancer de glandula salival, cancer nasofaringeo, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de ovario, neuroblastoma, cancer de cuello uterino, leucemia, melanoma, epitermoide oral, queratinocitos y cancer de piel. En otra realizacion, las celulas cancerosas forman parte de un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de mama (incluido el tipo metastasico), cancer cervical, carcinoma colorrectal, cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico, y el cancer de prostata.

En un decimocuarto aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar el cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende el compuesto de la divulgacion. Los metodos de acuerdo con este aspecto de la divulgacion se pueden aplicar para tratar el cancer similar a los descritos con respecto a los aspectos previos de la divulgacion. En una caracteristica, el sujeto del tratamiento es un mamifero, por ejemplo, un ser humano.

En un decimoquinto aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion, es decir, un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1 -hidroxietil)-nafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1 -(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos, y un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. En una caracteristica, la composicion es adecuada para administracion oral, nasal, topica, rectal, vaginal o parenteral, o inyeccion intravenosa, subcutanea o intramuscular.

En un decimosexto aspecto, la presente divulgacion tambien proporciona un proceso de preparacion de algunos de los Compuestos de la Divulgacion. El metodo prepara un compuesto de formula 4-6,

en donde R¹es H, Cl o F, haciendo reaccionar un compuesto de formula 4-4,

con una cetona en un solvente en presencia de una base y un agente oxidante. El agente oxidante puede ser, por ejemplo, O², Br²o CBrCh. En una realizacion, la reaccion se lleva a cabo en un contenedor al aire libre. En una caracteristica, todas las etapas del proceso tienen lugar en un recipiente, es decir, en el mismo contenedor. En varias realizaciones de ejemplo, el disolvente puede ser tetrahidrofurano (THF), dioxano o tolueno, y la base puede ser 1,8 diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU), trietilamina o diisopropiletilamina.

En una realizacion del proceso anterior, la cetona es un compuesto de formula 4-3.

El proceso anterior puede incluir las siguientes etapas:

haciendo reaccionar un compuesto de formula 4-1,

con bromuro con o sin solvente para producir un compuesto de formula 4-2,

y posteriormente hacer reaccionar el compuesto de formula 4-2 en un disolvente en presencia de una base para producir el compuesto de formula 4-3.

En un decimoseptimo aspecto, la presente divulgacion proporciona un compuesto de la formula mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinilester] del acido fosforico.

En un decimoctavo aspecto, la presente divulgacion proporciona un compuesto de la formula 1 -(4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico.

En un decimonoveno aspecto, la presente divulgacion proporciona un proceso para preparar el compuesto 1 -(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il) vinil ester dimetil ester del acido fosforico, el proceso comprende hacer reaccionar el compuesto 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona con una solucion seleccionada del grupo que consiste en bis(trimetilsilil) amida de litio, bis(trimetilsilil) amida de sodio, y potasio bis(trimetilsilil)amida, seguido de la adicion de una solucion de clorofosfato de dimetilo. El proceso puede comprender ademas purificar un producto crudo obtenido a partir de la reaccion disolviendo el producto en CH₂Cl², lavandolo con NH4Cl saturado y agua, secandolo sobre MgSO², y posteriormente desarrollando el producto a traves de cromatografia en columna.

En un vigesimo aspecto, la presente divulgacion proporciona un proceso para preparar el compuesto mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furano-2-il)-vinil] ester del acido fosforico,

comprendiendo el proceso hacer reaccionar el compuesto1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b] furan-2-il)vinil] ester dimetil ester del acido fosforico con bromuro de trimetilsililo. El proceso puede comprender ademas purificar un producto crudo obtenido a partir de la reaccion mediante una HPLC semipreparativa.

Otros aspectos y realizaciones de la presente divulgacion se exponen o seran facilmente evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada de la invencion.

Breve descripcion de las figuras.

La Figura 1 ilustra las diferencias entre las terapias contra el cancer especificas para las celulas madre de cancer y las convencionales.

La figura 2 muestra la ruta Stat3 en el cancer.

La Figura 3A muestra que Stat3 es constitutivamente activo en las celulas de Hoechst Side Population.

La Figura 3B muestra que Stat3 es constitutivamente activo en celulas CD133+.

Las figuras 4A y 4B muestran que la anulacion de Stat3 en las celulas madre de cancer induce la apoptosis.

La Figura 5 muestra que la anulacion de Stat3 en las celulas madre de cancer inhibe la esferogenesis de las celulas madre de cancer.

La Figura 6 muestra que el compuesto 401 inhibe la actividad de activacion de la transcripcion de Stat3.

La Figura 7A muestra que el compuesto 401 inhibe la actividad de union al ADN de Stat3 en el extracto nuclear. La Figura 7B muestra que los compuestos 401,416 y 418 inhiben la actividad de union al ADN de Stat3 en el extracto nuclear.

La Figura 8A muestra que el compuesto 401 inhibe la actividad de union al ADN de Stat3 en tejidos tumorales de xenoinjerto.

La Figura 8B muestra que el compuesto 401 inhibe el nivel de expresion de los efectores corriente abajo de Stat3 en tejidos con tumores de xenoinjerto.

La Figura 9A muestra la clasificacion y el analisis de Hoechst Side Population.

La Figura 9B muestra que Hoechst Side Population es tan sensible como la poblacion no lateral al compuesto 401. La Figura 10A muestra que el compuesto 401 es apoptotico a las celulas de la poblacion lateral Hoechst.

La Figura 10B muestra que el compuesto 401 es apoptotico a las celulas CD133+.

La Figura 11 muestra que el compuesto 401 bloquea la formacion de la esfera de CD44alta.

La Figura 12 muestra que el tratamiento del compuesto 401 in vivo disminuye la esferogenesis de las celulas tumorales xenoinjertadas.

La Figura 13 muestra que el compuesto 401 induce apoptosis en celulas cancerosas.

La Figura 14 muestra que el compuesto 401 exhibe actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de cancer pancreatico humano y se comporta de manera diferente a la quimioterapia estandar en que elimina el rebote del tumor. La Figura 15 muestra que el compuesto 401 exhibe actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de cancer de cabeza y cuello humano.

La Figura 16 muestra que el compuesto 401 exhibe actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de cancer de mama humano.

La Figura 17 muestra que el compuesto 401 exhibe actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de cancer de prostata humano.

La Figura 18 muestra que el compuesto 401 exhibe actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de cancer gastrico humano.

La Figura 19 muestra que el compuesto 401 exhibe actividad antitumoral en el modelo de xenoinjerto de cancer de higado humano.

La Figura 20 muestra que el compuesto 401 inhibe la metastasis en el modelo ISMS.

La Figura 21 muestra la farmacocinetica del compuesto 401 en ratas.

Descripcion detallada

Como se usa en este documento, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el termino "una celula" incluye una pluralidad de celulas que incluyen mezclas de las mismas.

Los terminos "aislado" o "purificado", como se usan en este documento, se refieren a un material que esta sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompanan en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan tipicamente mediante tecnicas de quimica analitica como la electroforesis en gel de poliacrilamida o la cromatografia liquida de alto rendimiento.

Como se usa en el presente documento, los terminos "celulas madre de cancer" y "CSC" son intercambiables. Las CSC son de mamiferos y, en realizaciones preferidas, estas CSC son de origen humano, pero no pretenden limitarse a ellas. Las celulas madre de cancer se definen y se caracterizan funcionalmente como una poblacion de celulas que se originan a partir de un tumor solido que: 1) tiene una capacidad proliferativa extensa; 2) son capaces de una division celular asimetrica para generar uno o mas tipos de progenie diferenciada con un potencial proliferativo o de desarrollo reducido; y (3) son capaces de divisiones celulares simetricas para la autorrenovacion o el mantenimiento propio. Otras metodologias comunes para caracterizar las CSC incluyen la morfologia y el examen de los marcadores de la superficie celular, el perfil transcripcional y la respuesta farmacologica. Las CSC tambien se denominan en la literatura de investigacion celulas tumorales/iniciadoras de cancer, celulas similares a celulas madre cancerosas, celulas cancerosas similares a celulas madre, celulas altamente tumorigenicas, celulas madre tumorales, celulas madre tumorales solidas, celulas con supervivencia a farmacos (DSC), celulas resistentes a farmacos (DRC) o celulas supermalignas.

Como se usa en el presente documento, el termino "autorrenovacion" se refiere a la capacidad de las celulas madre de cancer para dar lugar a nuevas celulas madre cancerosas tumorigenas para reponer o aumentar su numero.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "cancer" y "canceroso" se refieren a o describen la condicion fisiologica en los mamiferos en los que una poblacion de celulas se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. "Celulas cancerosas" y "celulas tumorales", como se usa en el presente documento, se refieren a la poblacion total de celulas derivadas de un tumor que incluye ambas celulas no tumorigenicas, que comprenden la mayor parte de la poblacion de celulas tumorales y las celulas madre tumorigenicas (celulas madre cancerosas). Ejemplos de cancer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos mas particulares de tales canceres incluyen cancer de celulas escamosas, cancer de pulmon de celulas pequenas, cancer de pulmon de celulas no pequenas, adenocarcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon escamoso, cancer de peritoneo, cancer hepatocelular, cancer gastrointestinal, cancer de pancreas, glioblastoma, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de higado, cancer de vejiga, hepatoma, cancer de mama, cancer de colon, cancer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glandula salival, cancer de rinon, cancer de higado, cancer de prostata, cancer de vulva, cancer de tiroides, carcinoma hepatico y varios tipos de cancer de cabeza y cuello.

"Tumor" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier masa de tejido que resulta del crecimiento o proliferacion celular excesivo, ya sea benigno (no canceroso) o maligno (canceroso) que incluye lesiones precancerosas.

"Metastasis" como se usa en este documento se refiere al proceso por el cual un cancer se disemina o transfiere desde el sitio de origen a otras regiones del cuerpo con el desarrollo de una lesion cancerosa similar en la nueva ubicacion. Una celula "metastasica" o "que hace metastasis" es aquella que pierde los contactos adhesivos con las celulas vecinas y migra a traves del torrente sanguineo o la linfa desde el sitio primario de la enfermedad para invadir las estructuras corporales vecinas.

Como se usa en el presente documento, el termino "sujeto" se refiere a cualquier animal (por ejemplo, un mamifero), que incluye, entre otros, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que debe ser el receptor de un tratamiento particular. Tipicamente, los terminos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento en referencia a un sujeto humano.

Terminos tales como "que trata" o "tratamiento" o " tratar" o "que alivia" o "aliviar" como se usa en el presente documento se refieren a 1) medidas terapeuticas que curan, desaceleran, disminuyen los sintomas y/o detienen la progresion de una afeccion o trastorno patologico diagnosticado y 2) medidas profilacticas o preventivas que previenen o retardan el desarrollo de una afeccion o trastorno patologico especifico. Asi, aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya tienen el trastorno; aquellos propensos a tener el desorden; y aquellos en quienes se debe prevenir el trastorno. Un sujeto se "trata" con exito de acuerdo con los metodos de la presente divulgacion si el paciente muestra uno o mas de los siguientes: una reduccion en el numero o ausencia completa de celulas cancerosas; una reduccion en el tamano del tumor; inhibicion o ausencia de infiltracion de celulas cancerosas en organos perifericos, incluida la propagacion del cancer en tejidos blandos y huesos; inhibicion o ausencia de metastasis tumoral; inhibicion o ausencia de crecimiento tumoral; alivio de uno o mas sintomas asociados con el cancer especifico; reduccion de la morbilidad y la mortalidad; y mejora en la calidad de vida.

Como se usa en el presente documento, el termino "que inhibe", "inhibir" y sus equivalentes gramaticales, cuando se usan en el contexto de una bioactividad, se refieren a una regulacion negativa de la bioactividad, que puede reducir o eliminar la funcion objetivo, como la produccion de una proteina o la fosforilacion de una molecula. En realizaciones particulares, la inhibicion puede referirse a una reduccion de aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de la actividad dirigida. Cuando se utilizan en el contexto de un trastorno o enfermedad, los terminos se refieren al exito en la prevencion de la aparicion de sintomas, el alivio de los sintomas o la eliminacion de la enfermedad, afeccion o trastorno.

El termino "excipiente, portador o diluyente farmaceuticamente aceptable" como se usa en este documento significa un material, composicion o vehiculo farmaceuticamente aceptable, tal como un agente de relleno liquido o solido, diluyente, excipiente, solvente o material de encapsulacion, involucrado en el transporte o transportar el agente farmaceutico objtivo de un organo, o parte del cuerpo, a otro organo, o parte del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulacion y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen: azucares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidon de maiz y almidon de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sodica, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodon, aceite de cartamo, aceite de sesamo, aceite de oliva, aceite de com y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; esteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar agentes tamponantes, tales como hidroxido de magnesio e hidroxido de aluminio; acido alginico; agua libre de pirogenos; solucion salina isotonica; Solucion de Ringer; alcohol etilico; soluciones reguladoras de fosfato; y otras sustancias compatibles no toxicas empleadas en formulaciones farmaceuticas. Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio, estearato de magnesio y copolimero de oxido de polietileno-oxido de polipropileno, asi como agentes colorantes, agentes de liberacion, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes, tambien pueden estar presentes en las composiciones.

Los compuestos de la presente divulgacion pueden formar sales que tambien estan dentro del alcance de esta divulgacion. Se entiende que la referencia a un compuesto de la presente divulgacion en el presente documento incluye una referencia a sus sales, a menos que se indique lo contrario. El termino "sal", como se emplea en este documento, denota sales acidas y/o basicas formadas con acidos y bases inorganicos y/u organicos. Ademas, cuando un compuesto de la presente divulgacion contiene una unidad estructural basica, tal como pero sin limitarse a una piridina o imidazol, y una unidad estructural acida, como, pero sin limitarse a, un acido carboxilico, pueden formarse zwitteriones ("sales internas") y se incluyen dentro del termino "sal(es)" como se usa en el presente documento. Se prefieren las sales farmaceuticamente aceptables (es decir, no toxicas, fisiologicamente aceptables), aunque tambien son utiles otras sales, por ejemplo, en etapas de aislamiento o purificacion que pueden emplearse durante la preparacion. Las sales de los compuestos de la presente divulgacion pueden formarse, por ejemplo, haciendo reaccionar un compuesto I, II o III con una cantidad de acido o base, tal como una cantidad equivalente, en un medio tal como uno en donde la sal precipita o en un medio acuoso seguido de liofilizacion.

Los solvatos de los compuestos de la divulgacion tambien se contemplan en el presente documento. Los solvatos de los compuestos de la presente divulgacion incluyen, por ejemplo, hidratos.

Estudios recientes han descubierto la presencia de celulas madre cancerosas (CSC) con una capacidad exclusiva para regenerar tumores. Estos CSC existen en casi todos los tipos de tumores y estan vinculados funcionalmente con el crecimiento maligno continuo, la metastasis del cancer, la recurrencia y la resistencia a los medicamentos contra el cancer. Las CSC y sus progenies mas diferenciadas parecen tener caracteristicas biologicas marcadamente diferentes. Las pruebas de deteccion de farmacos convencionales contra el cancer dependen de la medicion de la cantidad de masa tumoral, por lo tanto, es posible que no necesariamente seleccionen farmacos que actuen especificamente en las CSC. De hecho, se ha demostrado que las CSC son resistentes a las quimioterapias y radioterapia estandar, y se enriquecen despues de los tratamientos anticancerigenos estandar, lo que resulta en cancer recurrente y recurrencia. Los metodos para aislar estas celulas incluyen, entre otros, la identificacion por su capacidad de eflujo Hoechst 33342, la identificacion por los marcadores de superficie que expresan estas celulas, como CD133, CD44, CD166 y otros, y el enriquecimiento por su propiedad tumorigenica. La creciente evidencia que vincula las celulas madre de cancer con la tumorigenesis desentrana la enorme oportunidad terapeutica de atacar a las celulas madre de cancer.

La clave para desbloquear este potencial sin explotar es la identificacion y validacion de rutas que son selectivamente importantes para la autorrenovacion y supervivencia de CSC. Aunque en el pasado se han dilucidado multiples rutas que subyacen a la tumorigenesis en el cancer y en las celulas madre embrionarias o en las celulas madre adultas, no se ha identificado y validado ninguna ruta para la autorrenovacion y supervivencia de la CSC.

La presente divulgacion proporciona evidencia de que la actividad de la ruta Stat3 es critica tanto para la supervivencia como para la autorrenovacion de las CSC (Ejemplo 1). La presente divulgacion proporciona ademas compuestos que son inhibidores efectivos de las actividades de la ruta Stat3 (Ejemplo 2). La presente divulgacion tambien proporciona datos tanto in vitro como in vivo de que estos inhibidores de Stat3 inhiben la autorrenovacion de las CSC y son apoptoticos a las CSC (Ejemplo 3). La presente divulgacion tambien muestra que estos compuestos pueden destruir selectivamente un amplio espectro de celulas cancerosas in vitro (Ejemplo 4) e inhibir una amplia gama similar de canceres in vivo (Ejemplo 5). Ademas, la presente divulgacion confirma empiricamente la eficacia de los inhibidores de Stat3 contra el cancer metastasico (Ejemplo 6). Ademas, la presente divulgacion confirma empiricamente que estos compuestos pueden lograr una exposicion a PK deseada para la destruccion selectiva de celulas cancerosas in vivo (Ejemplo 7).

Los datos proporcionados en el presente documento, combinados con avances recientes en la investigacion de CSC, permiten que la presente divulgacion proporcione una serie de metodos dirigidos a inhibir CSC, o tratar canceres que tienen CSC en canceres especificos o en general. En el presente documento tambien se proporcionan metodos dirigidos a inhibir la actividad de la ruta de Stat3 en las celulas, o tratar trastornos, tanto cancerosos como no cancerosos, que estan asociados con actividades aberrantes de la ruta de Stat3. La presente divulgacion tambien proporciona metodos relacionados (por ejemplo, fabricacion y criba de candidatos a farmaco), materiales, composiciones y kits.

Con el hallazgo de que la regulacion negativa o el bloqueo de la ruta de Stat3 inhibe la autorrenovacion y la supervivencia de las CSC (Ejemplo 1), la presente descripcion proporciona un metodo para inhibir las celulas madre de cancer donde se inhibe al menos cierta actividad de la ruta de Stat3 en las CSC. Un inhibidor de la ruta STAT3. En una realizacion, la mayoria, es decir, mas del 50%, de la actividad de la ruta Stat3 esta inhibida. En otra realizacion, sustancialmente toda la actividad de la ruta Stat3 esta inhibida. El metodo puede evitar que las CSC se renueven automaticamente, de modo que ya no puedan reponer sus numeros al dividirse en celulas CSC tumorigenicas. O bien, el metodo puede inducir la muerte celular en CSC.

Este metodo puede usarse para tratar el cancer de un sujeto. Los canceres que se sabe que tienen CSC y actividades aberrantes (por ejemplo, hiperactivas o constitutivamente activas) de la ruta STAT3 son buenos candidatos para dicho tratamiento e incluyen, entre otros: cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer pancreatico, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, melanoma, carcinomas hepatocelulares, cancer cervical, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, mieloma multiple, leucemia y linfomas. En una realizacion, el metodo se usa para tratar canceres de higado, canceres de cabeza y cuello, canceres pancreaticos y/o canceres gastricos. En otra realizacion, el metodo se usa para tratar el mieloma multiple, los tumores cerebrales y los sarcomas.

Ademas, como se ha demostrado que las CSC son fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la recurrencia del cancer, se puede practicar cualquier metodo de la divulgacion dirigido a inhibir las CSC para tratar el cancer que es metastasico, refractario a una quimioterapia o radioterapia, o ha recaido en el sujeto despues de un tratamiento inicial.

En una realizacion, el inhibidor es aislado, purificado o sintetico, y puede seleccionarse del grupo que consiste en un inhibidor de la molecula Stat3 pequena, un agente de ARNi contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor peptidomimetico de Stat3 y una Inhibidor de los oligodesoxinucleotidos del cuarteto G Stat3. El inhibidor tambien puede aislarse o purificarse a partir de un producto natural.

El mecanismo de inhibicion se puede seleccionar para direccionar a cualquier etapa en la ruta de Stat3. Por ejemplo, el inhibidor puede inhibir sustancialmente la fosforilacion de la proteina Stat3, inhibir sustancialmente la dimerizacion de la proteina Stat3, inhibir sustancialmente la translocacion nuclear de la proteina Stat3, inhibir sustancialmente la actividad de union al ADN de la proteina Stat3 y/o inhibir sustancialmente las actividades de transcripcion de la proteina Stat3. Alternativamente, el inhibidor de la ruta Stat3 puede inhibir uno o mas componentes en sentido ascendente o descendente en la ruta Stat3.

La ruta de Stat3 puede activarse en respuesta a citoquinas, tales como IL-6, o por una serie de tirosina quinasas, tales como EGFR, JAKs, Abl, KDR, c-Met, Src y Her2. Los efectores posteriores de Stat3 incluyen, entre otros, Bcl-xl, c-Myc, cyclinDI, Vegf, MMP-2 y survivina (Figura 2). La ruta Stat3 se encuentra aberrantemente activa en una amplia variedad de enfermedades humanas, como se muestra en la Tabla 1. Las muestras clinicas existentes examinadas mostraron que la ruta Stat3 persistentemente activa ocurre en mas de la mitad de los canceres de mama y pulmon, carcinomas hepatocelulares, mielomas multiples y mas del 95% de los canceres de cabeza y cuello. La Stat3 activada tambien se ha demostrado en varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Ademas, puesto que las citoquinas, como la interleucina 6, la inflamacion mediada es el origen causal comun de aterosclerosis [38], enfermedad vascular periferica [39, 40], enfermedad de la arteria coronaria [39, 40], hipertension [41], osteoporosis [42], diabetes tipo 2 [39], y demencia [43] y gp130-Jaks-Stats es la principal via activada por IL-6, la inhibicion de la ruta STAT3 tambien puede prevenir estas enfermedades.

Tabla 1. Activacion de la ruta STAT3 en enfermedades humanas.

ENFERMEDADES REF.

Cancer de mama [44] ENFERMEDADES _ONCOLOGICASTumores solidos

Cancer de cabeza y cuello (SCCHN) [45] ENFERMEDADES REF.

Cancer de pulmon [46]

Cancer de ovarios [47]

Cancer pancreatico [48]

Carcinoma colorrectal [49]

Cancer de prostata [50]

Carcinoma de celulas renales [51]

Melanoma [52]

Carcinomas hepatocelulares [34]

Cancer cervical [53]

^{C a n c e r e n d o m e t r i a l}[53]

Sarcomas [54, 55]

Tumores cerebrales [56]

Canceres gastricos [27]

Mieloma multiple [57]

Leucemia dependiente de HTLV-₁[58]

Leucemia mielogena cronica [51] Leucemia

Leucemia mielogena aguda [59]

Leucemia de linfocitos Tumores granulares grandes ^[60]hematologicos

Relacionada con EBV-/Burkitt [61] Micosis fungoides [51]

Linfomas ^{HSV dependiente de Saimiri} _{(celulas T)}[51]

Linfoma cutaneo de celulas T [62]

Enfermedades de Hodgkin [51] ENFERMEDADES REF.

Linfoma anaplasico de celulas grandes ^[63]

Enfermedades inflamatorias del intestino [64]

Artritis Inflamatoria [65-67] Enfermedades

inflamatorias

Enfermedad de Crohn [68]

Condiciones inflamatorias cronicas [69]

ENFERMEDADESINMUNES Artritis reumatoide [65, 66, 70

72] Autoimmune

Lupus eritematoso sistemico [73]

Asma [74]

Alergias [75]

Infecciones [76]

Psoriasis [77]

Queloides [78] TRASTORNOS

Verrugas

PROLIFERATIVOS [79]

Sindrome mielodisplasico [80]

Policitemia vera [81] Alzheimer [36, 82, 83] ENFERMEDADES DEL SNC

Esclerosis multiple (MS) [36, 82, 84]

En una realizacion, el inhibidor de Stat3 de acuerdo con la presente divulgacion es: 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1 -(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester] del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, un enantiomero, diastereomero, tautomero y una sal o solvato de los mismos (el "Compuesto de la invencion") (Ejemplo 2). La presente descripcion tambien proporciona datos tanto in vitro como in vivo de que el Compuesto de la Divulgacion inhibe la autorrenovacion de las CSC e induce la apoptosis en las CSC (Ejemplo 3).

Habiendo proporcionado evidencia de que la regulacion por disminucion de la ruta de Stat3 inhibe las CSC, la presente divulgacion proporciona un metodo para identificar un farmaco candidato capaz de inhibir una celula madre de cancer. El metodo comprende la seleccion de un farmaco candidato que inhibe la actividad de la ruta Stat3. En diversas realizaciones, el farmaco candidato es un inhibidor de Stat3 de molecula pequena, un agente de IARN contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor de Stat3 peptidomimetico o un inhibidor de oligodesoxinucleotido Stat3 del cuarteto G.

En una realizacion, el candidato a farmaco es capaz de inducir la muerte celular en CSC o al menos inhibir su autorrenovacion. Pueden seleccionarse diversas fases en la ruta para seleccionar al farmaco candidato. Por ejemplo, diversas formas de realizacion del metodo pueden detectar farmacos candidatos que inhiban sustancialmente la fosforilacion de la protefna Stat3, inhiben sustancialmente la dimerizacion de la protema Stat3, inhiben sustancialmente la translocacion nuclear de la protema Stat3, inhiben sustancialmente las actividades de union al ADN de la protema Stat3, o inhibe sustancialmente las actividades de transcripcion de la protema Stat3.

Como muestra el Ejemplo 2 a continuacion, el Compuesto de la Divulgacion inhibe la actividad de transcripcion de Stat3, y la actividad de union al ADN de Stat3 in vitro. El Ejemplo 2 muestra ademas que el Compuesto de la Divulgacion inhibe in vivo tanto la expresion de los efectores posteriores de Stat3 (por ejemplo, ciclina D1 y survivina) como la actividad de union al ADN de Stat3.

Por consiguiente, en otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para inhibir la actividad de la ruta celular Stat3 en donde se administra una cantidad eficaz del Compuesto de la Divulgacion. En otro aspecto, el Compuesto de la Divulgacion puede usarse para formular una composicion farmaceutica para tratar o prevenir trastornos o afecciones asociadas con actividades aberrantes de la ruta Stat3. Un trastorno se considera aquf "asociado con" actividades aberrantes de la ruta Stat3 si un paciente que padece el trastorno, que puede ser un subtipo dentro de un tipo de trastorno, tiene tfpicamente en al menos algunas de las celulas del paciente actividad aberrante de la ruta Stat3, que puede, pero no necesariamente, contribuye a la patologfa del trastorno. Algunos de los trastornos que se sabe se asocian con actividades aberrantes de la ruta STAT3 incluyen, entre otros, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis, trastorno de desmielinizacion autoinmune, enfermedad de Alzheimer, derrame cerebral, lesion por reperfusion de isquemia y esclerosis multiple. Algunos de los trastornos que se sabe se asocian con actividades aberrantes de la ruta STAT3 son los canceres e incluyen, entre otros, diversos tipos de cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, cancer de rinon carcinoma de celulas, melanoma, carcinomas hepatocelulares, canceres cervicales, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, mieloma multiple, leucemia y linfomas.

En relacion con este aspecto de la divulgacion, se proporciona un kit que incluye uno o mas agentes para diagnosticar un trastorno asociado con actividades aberrantes de la ruta Stat3, y una cantidad terapeuticamente efectiva del Compuesto de la Divulgacion u otro inhibidor eficaz de la ruta Stat3. El agente de diagnostico puede ser cualquier reactivo adecuado segun el trastorno sospechoso y puede incluir agentes necesarios para extraer una muestra de sangre, tomar una biopsia, detectar una biomolecula (por ejemplo, un antfgeno o un anticuerpo) o extraer informacion genetica de una muestra. El agente puede incluir un disolvente, un detergente, un anticoagulante, un antfgeno, un anticuerpo, una enzima, un cebador de PCR, y asf sucesivamente.

Si un paciente es diagnosticado o no con un trastorno que se sabe que implica actividad aberrante de Stat3, un medico siempre puede ordenar una prueba para ver si hay actividad aberrante de Stat3 en una muestra de biopsia tomada del paciente. Por lo tanto, se proporciona un kit que incluye: uno o mas agentes para diagnosticar actividades aberrantes de la ruta Stat3, y una cantidad terapeuticamente efectiva del Compuesto de la Divulgacion u otro inhibidor de la ruta Stat3 efectiva. En una caracterfstica, la actividad aberrante de la ruta Stat3 se puede identificar a traves de cualquier medio analftico adecuado para examinar cualquier indicio de dicha actividad, por ejemplo, la expresion (nivel, duracion, etc.) de Stat3 fosforilado o de un regulador sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3. Al igual que en el kit descrito anteriormente, el agente de diagnostico puede ser cualquier reactivo adecuado dependiendo de las indicaciones de actividad aberrante de la ruta Stat3 que analiza la prueba.

Como muestra el Ejemplo 3 mas adelante, el Compuesto de la Divulgacion, que es al menos un inhibidor de la ruta Stat3, destruye las celulas madre de cancer. El ejemplo 3 tambien demuestra que el compuesto de la divulgacion tambien inhibe la esferogenesis de CSC, una indicacion de la inhibicion exitosa de la autorrenovacion de CSC, tanto in vitro como in vivo.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para inhibir celulas madre cancerosas en las que se administra una cantidad eficaz del Compuesto de la Divulgacion a las celulas. Los canceres que se sabe que tienen CSC son buenos candidatos para tales tratamientos e incluyen, entre otros, diversos tipos de cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, cancer de hfgado, melanoma, mieloma multiple, tumores cerebrales, sarcomas, meduloblastoma y leucemia.

Ademas, como se ha demostrado que las CSC son fundamentalmente responsables de la tumorigenesis, la metastasis del cancer y la recurrencia del cancer, cualquier metodo de la divulgacion dirigida a la inhibicion de las CSC se puede practicar para tratar el cancer que es metastasico, refractario a una quimioterapia o radioterapia, o que haya causado recafda en el sujeto despues de un tratamiento inicial. El Ejemplo 6 a continuacion prueba especfficamente in vivo la eficacia antimetastasica del Compuesto de la Divulgacion, y los datos muestran una reduccion significativa en el numero de focos de tumores primarios y la metastasis hepatica espontanea.

En el Ejemplo 4 a continuacion, se muestra que el Compuesto de la Divulgacion no solo causa apoptosis en un amplio espectro de celulas cancerosas, sino que tambien muestra selectividad en su citotoxicidad que es crftica para el desarrollo de agentes terapeuticos de baja toxicidad. La citotoxicidad selectiva, como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de un compuesto para matar celulas cancerosas y al mismo tiempo preservar sustancialmente las celulas normales, a veces bajo ciertas condiciones. Las celulas normales generalmente se refieren a celulas sanas no tumorigenicas. Las condiciones que resultan en una citotoxicidad selectiva para un farmaco candidato son dificiles de predecir porque requieren un conocimiento del mecanismo subyacente de la citotoxicidad. Por ejemplo, para reducir la toxicidad de un farmaco anticanceroso que ataca la formacion de microtubulos durante la mitosis, existen factores muy diferentes para trabajar que un farmaco que bloquee los procesos metabolicos celulares. Una condicion adecuada para generar una citotoxicidad selectiva debe equilibrar la necesidad de que el medicamento sea lo suficientemente toxico para matar efectivamente las celulas cancerosas mientras que sea lo suficientemente tolerable para las celulas normales. Por ejemplo, si se usa una concentracion mas baja, a menudo significa que se necesita una infusion prolongada para matar las celulas cancerosas.

A partir de los datos generados en los ejemplos de esta divulgacion, incluidos los que se muestran en el Ejemplo 4, parece que se puede lograr una citotoxicidad selectiva para el Compuesto de la Divulgacion si las celulas afectadas no estan expuestas a una concentracion critica del compuesto de manera continua mas alla de cierta duracion. En un metodo destinado a destruir selectivamente las celulas cancerosas en un sujeto, se administra al sujeto una composicion farmaceutica que tiene el Compuesto de la Divulgacion, de manera que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion critica durante mas de 24 horas despues de cada dosis. Este metodo se puede usar para tratar todos los canceres, incluido cualquiera de los grupos de canceres descritos aqui, y para tratar el trastorno asociado a Stat3, una lista de ejemplo de los cuales ya se proporciono anteriormente y no se repite aqui. Alternativamente, la duracion puede restringirse aun mas a 12, 16 y 20 horas despues de cada dosis. La concentracion critica para cada compuesto puede variar. En diversas realizaciones de la presente divulgacion, la concentracion critica es aproximadamente 100 gM, aproximadamente 50 gM, aproximadamente 30 gM o aproximadamente 20 gM.

En una realizacion del metodo, el cancer que se esta tratando se selecciona del siguiente grupo: cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, cancer de prostata metastasico, leucemia, linfoma, cancer de esofago, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer de endometrio, cancer de tiroides, cancer de vias biliares, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de vesicula biliar, cancer de pituitaria, cancer de recto, cancer de glandula salival y cancer nasofaringe.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar el cancer en un sujeto, en donde se administra al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion. El cancer puede ser metastasico. El sujeto puede ser un mamifero, por ejemplo, un ser humano.

Para cualquiera de los metodos de tratamiento de un sujeto descrito en el presente documento, la presente divulgacion proporciona intervalos de dosificacion efectivos, frecuencias de dosificacion y concentraciones en plasma de los compuestos. En diversas realizaciones, la composicion farmaceutica se administra en una dosis: (a) de aproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 5000 mg/m2 (I.V.) o de aproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 50000 mg/m2 (PO); (b) de aproximadamente 2 mg/m2 a aproximadamente 3.000 mg/m2 (I.V.) o de aproximadamente 10 mg/m2 a aproximadamente 50000 mg/m2 (PO). En diversas realizaciones, el compuesto de la presente divulgacion se puede administrar cada dos dias (Q2D), diario (QD), o dos veces al dia (BID). En una realizacion, la composicion farmaceutica se administra por via oral y no mas de cuatro veces al dia (QID).

En una caracteristica, la composicion farmaceutica se administra al sujeto de tal manera que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion critica durante mas de 24 horas (o 12, 16 y 20 horas) despues de cada dosis. De acuerdo con realizaciones alternativas de la divulgacion, la concentracion plasmatica del compuesto no excede la concentracion critica en un cierto punto de tiempo despues de que cada uno lo hace, por ejemplo, 12, 16, 20 o 24 horas, como un regimen que evita la toxicidad no selectiva. En diversas realizaciones de la presente divulgacion, la concentracion critica es aproximadamente 100 gM, aproximadamente 50 gM, aproximadamente 30 gM o aproximadamente 20 gM. Las composiciones, en ciertos casos, son aisladas, purificadas o sintetizadas.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion farmaceutica que comprende el Compuesto de la Divulgacion, y un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. En una caracteristica, la composicion es adecuada para administracion oral, nasal, topica, rectal, vaginal o parenteral, o inyeccion intravenosa, subcutanea o intramuscular.

Las formulaciones de la presente divulgacion incluyen aquellas adecuadas para administracion oral, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificacion unitaria y pueden prepararse mediante cualquier metodo bien conocido en la tecnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion unica variara dependiendo del mamifero que se este tratando y del modo particular de administracion. La cantidad de ingrediente activo, que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificacion unica, sera generalmente esa cantidad del compuesto que produce un efecto terapeutico. Generalmente, del 100%, esta cantidad variara, por ejemplo, de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 99% del ingrediente activo, de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 70%, de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 30%.

Las composiciones terapeuticas o formulaciones de la divulgacion adecuadas para administracion oral pueden estar en forma de capsulas, sellos, pildoras, comprimidos, pastillas (usando una base aromatizada, usualmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto), polvos, granulos o solucion o una suspension en un liquido acuoso o no acuoso, o como una emulsion liquida de aceite en agua o agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arabiga) y/o como enjuagues bucales y similares, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del Compuesto de la Divulgacion como ingrediente activo. El Compuesto de la Divulgacion tambien se puede administrar como un bolo, electuario o pasta.

En las formas de dosificacion solidas para administracion oral (capsulas, tabletas, pildoras, grageas, polvos, granulos y similares), el Compuesto de la Divulgacion se mezcla con uno o mas vehiculos farmaceuticamente aceptables, como el citrato de sodio o el fosfato dicalcico. y/o cualquiera de los siguientes: rellenos o diluyentes, como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o acido silicico; aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o acacia; humectantes, tales como glicerol; agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidon de patata o tapioca, acido alginico, ciertos silicatos, carbonato de sodio y glicolato de almidon de sodio; agentes retardantes de la solucion, tales como parafina; aceleradores de la absorcion, tales como compuestos de amonio cuaternario; agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetilico, monoestearato de glicerol y copolimero de oxido de polietileno-oxido de polipropileno; absorbentes, tales como caolin y arcilla de bentonita; lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles solidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y agentes colorantes. En el caso de capsulas, comprimidos y pildoras, las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes tamponantes. Las composiciones solidas de un tipo similar tambien se pueden emplear como rellenos en capsulas de gelatina blandas y de relleno duro usando excipientes como lactosa o azucares lacteos, asi como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.

Las formas de dosificacion liquidas para la administracion oral del Compuesto de la Divulgacion incluyen emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmaceuticamente aceptables. Ademas del ingrediente activo, las formas de dosificacion liquidas pueden contener diluyentes inertes comunmente utilizados en la tecnica, como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, como alcohol etilico, alcohol isopropilico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencilico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, semillas de algodon, mani, maiz, germen, aceite de oliva, ricino y sesamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurilico, polietilenglicoles y esteres de acidos grasos de sorbitan, y mezclas de los mismos. Adicionalmente, se pueden usar ciclodextrinas, por ejemplo, hidroxipropil-p-ciclodextrina, para solubilizar compuestos.

Ademas de los diluyentes inertes, las composiciones orales tambien pueden incluir adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes de suspension, edulcorantes, saborizantes, colorantes, perfumantes y conservantes. Las suspensiones, ademas de uno o mas Compuestos de la Divulgacion, pueden contener agentes de suspension como, por ejemplo, alcoholes isoestearilicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de sorbitan, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.

Las formulaciones de las composiciones farmaceuticas de la divulgacion para administracion rectal o vaginal pueden presentarse como un supositorio, que puede prepararse mezclando uno o mas compuestos de la divulgacion, con uno o mas excipientes o vehiculos no irritantes adecuados que comprenden, por ejemplo, manteca de cacao, polietilenglicol, una cera para supositorio o un salicilato, que es solido a temperatura ambiente, pero liquido a temperatura corporal y, por lo tanto, se fundira en el recto o cavidad vaginal y liberara los agentes farmaceuticos activos de la invencion. Las formulaciones de la presente divulgacion que son adecuadas para la administracion vaginal tambien incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen los vehiculos que se conocen en la tecnica como apropiados.

Las formas de dosificacion para la administracion topica o transdermica de una composicion de acuerdo con la divulgacion incluyen polvos, aspersores, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones esteriles con un vehiculo farmaceuticamente aceptable y con cualquier conservante, regulador o propelente que pueda ser necesario.

Los unguentos, pastas, cremas y geles pueden contener, ademas del Compuesto de la Divulgacion, excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, acido silicico, talco y oxido de zinc, o mezclas de los mismos.

Los polvos y aerosoles pueden contener, ademas de un compuesto de esta Divulgacion, excipientes como lactosa, talco, acido silicico, hidroxido de aluminio, silicatos de calcio y poliamida en polvo, o mezclas de estas sustancias. Ademas, los aerosoles pueden contener propelentes habituales, como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos volatiles no sustituidos, como el butano y el propano.

Las formulaciones oftalmicas, pomadas oculares, polvos, soluciones y similares, tambien se contemplan dentro del alcance de esta descripcion.

Las composiciones farmaceuticas de esta divulgacion adecuadas para administracion parenteral comprenden uno o mas compuestos de acuerdo con la divulgacion en combinacion con una o mas soluciones acuosas o no acuosas isotonicas esteriles farmaceuticamente aceptables, dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos esteriles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables esteriles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostaticos, solutos que hacen que la formulacion sea isotonica con la sangre del receptor deseado o agentes de suspension o espesantes.

En algunos casos, para prolongar el efecto de la composicion de acuerdo con la descripcion, es deseable disminuir su absorcion por parte del cuerpo de la inyeccion subcutanea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspension liquida de material cristalino o amorfo que tiene poca solubilidad en agua. La velocidad de absorcion del farmaco depende entonces de su velocidad de disolucion, que, a su vez, puede depender del tamano del cristal y de la forma cristalina. Alternativamente, la absorcion retardada de una composicion administrada por via parenteral se logra disolviendo o suspendiendo el compuesto en un vehiculo oleoso. Una estrategia para las inyecciones de deposito incluye el uso de copolimeros de oxido de polietileno-oxido de polipropileno en los que el vehiculo es fluido a temperatura ambiente y se solidifica a temperatura corporal.

Los compuestos farmaceuticos de esta divulgacion pueden administrarse solos o en combinacion con otros agentes farmaceuticos, o con otras terapias anticancerosas como se describe en el presente documento, asi como en combinacion con un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

En una realizacion, el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable comprende un lipido para administracion intravenosa. Los lipidos pueden ser: fosfolipidos, fosfatidilcolinas sinteticas, fosfatidilcolinas naturales, esfingomielinas, ceramidas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, acidos fosfatidicos, colesterol, sulfato de colesterol y hapteno y lipidos conjugados con PEG. El lipido puede estar en forma de nanoemulsion, micelas, emulsiones, suspension, nanosuspension, niosomas o liposomas. En una realizacion, el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable esta en forma de emulsion micelar, suspension o suspension de nanoparticulas, y ademas comprende una proteina aceptable por via intravenosa, por ejemplo, albumina humana o un derivado de la misma, para administracion intravenosa.

En una realizacion, el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable comprende un material ceroso para administracion oral. El material ceroso puede ser mono-, di- o trigliceridos, esteres de mono-, di-acidos grasos de PEG, vitamina E conjugada con PEG (vitamina E TPG) y/o Gelucire. El Gelucire puede seleccionarse entre Gelucire 44/14, Gelucire 43/01, Gelucire 50/02, Gelucire 50/13, Gelucire 37/02, Gelucire 33/01, Gelucire 46/07 y Gelucire 35/10. En una realizacion, el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable se selecciona de capriol, transcutol hp, labrafil M, labrasol, triacetina, pharmasoil, etanol, polivinilpirrolidina, carboximetil celulosa, Tween 20 y Tween 80. En una realizacion, el excipiente farmaceuticamente aceptable, por ejemplo, Gelucire 44/14, se mezcla con un tensioactivo, que puede ser Tween 80 o Tween 20. Estas realizaciones de composiciones farmaceuticas pueden formularse adicionalmente para la administracion oral.

El Compuesto de la Divulgacion se puede sintetizar usando materiales de partida disponibles comercialmente y procesos bien conocidos por los expertos en la tecnica de la quimica organica. En los Ejemplos 8-10, la presente divulgacion proporciona un proceso de fabricacion para algunos de los compuestos reivindicados.

De acuerdo con una o mas realizaciones de la presente divulgacion, un inhibidor de Stat3 de molecula pequena se refiere a cualquier farmaco de bajo peso molecular que muestra actividad inhibidora contra Stat3. En comparacion con los productos farmaceuticos de mayor peso molecular, como las proteinas, los peptidos y los carbohidratos, las moleculas pequenas pueden penetrar mas facilmente en las membranas celulares y en la barrera hematoencefalica. Estas moleculas tienden a incurrir en menores costes de desarrollo y fabricacion.

De acuerdo con una o mas realizaciones de la presente divulgacion, una terapia de IARN es el uso directo de la interferencia de ARN (ARNi) en el tratamiento de enfermedades mediante el silenciamiento de genes que dan lugar a proteinas malas y, por lo tanto, a enfermedades. El IARN es un proceso natural que suprime cierta actividad genica en las celulas vivas. Es una funcion eucariotica ampliamente conservada que el ARN de doble cadena se desencadena en las celulas a traves de intermedios de duplex cortos de ARN, como pequenos ARN interferentes (ARNsi). A traves de una serie de etapas de procesamiento, una de las dos hebras de los complejos ARNsi con proteinas para formar RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). El RISC reconoce la secuencia de ARN complementaria mediante el emparejamiento de bases de Watson-Crick y luego la escinde. Los IARN tambien incluyen ARNsh, ARNmi y otros.

Segun una o mas realizaciones de la presente divulgacion, una terapia antisentido es una forma de tratamiento para trastornos geneticos o infecciones. Cuando se sabe que la secuencia genetica de un gen en particular es causante de una enfermedad en particular, es posible sintetizar una cadena de acido nucleico (ADN, ARN o un analogo quimico) que se unira al ARN mensajero (ARNm) producido por ese gen e inactivarlo, efectivamente desactivando ese gen. Esto se debe a que el ARNm tiene que ser de cadena sencilla para que se traduzca. Este acido nucleico sintetizado se denomina oligonucleotido "anti-sentido" porque su secuencia de bases es complementaria al ARN mensajero (ARNm) del gen, que se denomina secuencia "en sentido" (de modo que un segmento en sentido del ARNm "3'-Aa GGUC-3"' seria bloqueado por el segmento de ARNm antisentido "3'-Uu CCAG-5'").

Segun una o mas realizaciones de la presente divulgacion, un peptidomimetico es una pequena cadena similar a una proteina disenada para imitar un peptido. Tipicamente surgen de la modificacion de un peptido existente para alterar las propiedades de la molecula. Por ejemplo, pueden surgir de modificaciones para cambiar la estabilidad o la actividad biologica de la molecula. Esto puede tener un papel en el desarrollo de compuestos similares a farmacos a partir de peptidos existentes. Estas modificaciones implican cambios en el peptido que no se produciran de forma natural (como las cadenas principales alteradas y la incorporacion de aminoacidos no naturales).

De acuerdo con una o mas realizaciones de la presente divulgacion, los inhibidores de oligodesoxinucleotidos del cuarteto G son moleculas de ADN cataliticas (ADNzimas) disenadas para inhibir proteinas independientemente de su actividad de escision de ARN en las celulas.

Materiales y metodos

Ensayos biologicos

Los compuestos de la presente divulgacion se pueden probar de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente. La Tabla 2 muestra la lista de compuestos descritos en el protocolo.

Tabla 2

Nombre del Compuesto Codigo del Compuesto

2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona 301

2-Acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona 416

2-Acetil-7-Fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona 418

2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona 401

2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona 101

mono-[1 -(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil] ester del acido fosforico 4011

1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico 4012

Cultivo celular: Las celulas HeLa, DU145, H1299, DLD1, SW480, A549, MCF7, LN18, HCT116, HepG2, Paca2, Panel, LNcap, FaDu, HT29 y PC3 (ATCC, Manassas, VA) se mantuvieron en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA) y un 5% de penicilina/estreptomicina/anfotericina B (Invitrogen).

Poblacion Hoechst Side: Para identificar y aislar la poblacion lateral (SP) y las fracciones no SP, las celulas SW480 se retiraron de la placa de cultivo con tripsina y EDTA, se sedimentaron por centrifugacion, se lavaron con solucion salina regulada con fosfato (PBS) y se resuspendio a 37°C en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 2% de FBS y HEPES 1 mM. Las celulas se marcaron con Hoechst 33342 (Invitrogen) a una concentracion de 5 pg/mL. Las celulas marcadas se incubaron durante 120 minutos a 37°C, solas o con verapamilo 50 pM (Sigma-Aldrich, St. Louis). Despues de la tincion, las celulas se suspendieron en solucion salina equilibrada de Hanks (HBSS; Invitrogen) que contenia FBS al 2% y HEPES 1 mM, pasaron a traves de un filtro de malla de 40 pm y se mantuvieron a 4°C hasta el analisis de citometria de flujo. El colorante Hoechst se excito a 350 nm, y su fluorescencia se midio a dos longitudes de onda utilizando un filtro de paso de banda de 450 DF10 (filtro de paso de banda de 450/20 nm) y un filtro optico de 675LP (filtro de borde de paso largo de 675 nm). El control de la dispersion hacia adelante y lateral no fue estricta, y solo se excluyeron los residuos [15].

Aislamiento de CSC con marcadores de superficie: La clasificacion de celulas tumorales basada principalmente en la expresion diferencial del (de los) marcador(s) de superficie, como CD44 o CD133, ha tenido en cuenta la mayoria de las CSC altamente tumorigenicas descritas hasta la fecha. El aislamiento de CD133 se basa en el metodo de Ricci-Vitiani et al. [20], con ligera modificacion. Las celulas CD133+ se aislaron mediante clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o separacion magnetica basada en nanoparticulas. En resumen, se marcaron 107 celulas/mL con CD133/1 (AC133)-PE para la clasificacion de celulas basada en FACS; o con CD133/1 (AC133)-biotina (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) para la separacion basada en campo magnetico utilizando el kit de seleccion de biotina EasySep® (Miltenyi Biotec) segun las recomendaciones del fabricante. La marcacion no especifica se bloqueo con el reactivo de bloqueo FcR suministrado y las incubaciones de anticuerpos (1:11) se llevaron a cabo en hielo durante 15 minutos en PBS con FBS al 2% y EDTa 1 mM. Se realizaron cinco lavados para el aislamiento de EasySep®, mientras que las celulas se sedimentaron a 400 x g durante 5 minutos y se resuspendieron a 2 x 107/mL, antes de la clasificacion por FACS.

Las celulas CD44alta se aislaron mediante FACS de acuerdo con los metodos descritos en Ponti et al, con una ligera modificacion [85]. En resumen, despues de la tripsinizacion y recuperacion de las celulas durante 30 minutos a 37°C en medios de crecimiento, las celulas se sedimentaron a 400 x g y se resuspendieron en PBS con FBS al 2% y EDTA 1 mM a 1 x 106 celulas/mL. Las celulas se incubaron luego en hielo con una dilucion 1:100 de CD44-FITC (BD Biosicences, San Diego, CA) durante 15 minutos. Alternativamente, se utilizo CD24-PE (BD Bioscences, San Diego, CA) (1:100) para la seleccion negativa. Despues de lavar tres veces, las celulas se resuspendieron a 2 x 106/mL y se pasaron a traves de una malla de 40 pM antes de la clasificacion.

Ensayo de esfera: Un metodo confiable para medir la capacidad de autorrenovacion de la poblacion celular es la capacidad de cultivarlas como esferas en ausencia de suero o union. Las celulas madre cancerosas CD44alta FaDu o Hoechst de la poblacion lateral fueron cultivadas en placas de fijacion ultrabajas en medio de celulas madre cancerosas (DMEM/F12, suplemento de Neurobasal B27, 20 ng/mL de EGF, 10 ng/mL de FGF, 4 pg/mL de insulina y 0.4% BSA) para permitir la formacion de esferas. Tipicamente, la formacion de esferas se evaluo mediante microscopia despues de 10-14 dias en cultivo y se puntuaron esferas con >50 celulas.

Ensayo de indicador de luciferasa: Las celulas HeLa se cotransfectaron con el vector indicador Stat3-luciferasa (Stat3-Luc) (Panomics, Fremont, CA) y luciferasa de Renilla (Promega, Madison, WI) utilizando Lipofectamine 2000 como lo describe el fabricante (Invitrogen). Despues de la transfeccion, las celulas se mantuvieron en medio que contenia FBS al 0.5% durante 24 horas. Las celulas se trataron con el compuesto indicado durante 30 minutos antes de la adicion de 25 ng/mL de oncostatina M (OSM) (R&D Systems, Minneapolis, MN) al medio. A 6 horas despues de la adicion de OSM, las celulas se recolectaron y los niveles de luciferasa de luciernaga y renilla se midieron utilizando el Sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo segun lo descrito por el fabricante (Promega).

Analisis de apoptosis: Las celulas tratadas con o sin compuesto se recogieron 5 horas despues del tratamiento para la tincion con anexina-V. Las celulas recolectadas se lavaron con PBS y se resuspendieron en regulador que contenia Anexina-V-FITC y se tineron segun las instrucciones del fabricante (Roche). Las celulas positivas para anexina-V se determinaron por citometria de flujo.

Ensayo de union al ADN de STAT3: El ensayo de cambio de movilidad electroforetica (EMSA) se realizo segun lo descrito por el fabricante (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE). En resumen, los extractos nucleares se hicieron a partir de celulas HeLa utilizando el kit de extraccion de proteinas NucBuster tal como lo describe el fabricante (EMD Biosciences, San Diego, CA). Se preincubaron 5 pg de extracto nuclear con la dosis indicada del compuesto indicado durante 30 minutos antes de una incubacion de 15 minutos con el oligonucleotido Stat3 consenso marcado con IR700. Las muestras se sometieron a electroforesis en un gel de poliacrilamida y se escanearon directamente utilizando el sistema de generacion de imagenes infrarrojas Odyssey (Li-Cor Biosciences). Para el ensayo inmunoenzimatico (ELISA), se preincubaron 5 pg de extracto nuclear con la concentracion indicada del compuesto indicado durante 30 minutos antes de la adicion de oligo biotinilado (5'-Biotina-GATCCTTCTGGGAATTCCTAGATC-3', SEQ ID NO. 1). Los complejos de Stat3-DNA se capturaron luego en placas de 96 pozos recubiertas con estreptavidina (Pierce, Rockford, IL). Los complejos unidos se incubaron luego con el anticuerpo policlonal Stat3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) seguido por un anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). El anticuerpo unido se visualizo luego mediante la adicion de sustrato TMB (Pierce) y se midio la absorbancia a 450 nm.

Determinacion de la viabilidad celular: Para el analisis de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), las celulas se colocaron en placas de 96 pozos en 10000 celulas por pozo. A 24 horas despues de la siembra, el compuesto se anadio a las celulas en las dosis indicadas. A 22 horas despues de la adicion del compuesto, se anadio MTT a cada pozo (0.5 mg/ml, concentracion final) y las placas se incubaron durante 2 horas adicionales a 37°C. Luego se aspiro el medio y el producto de formazan se solubilizo en 100 pl de alcohol isopropilico. La absorbancia de cada pozo se midio a 570 nm utilizando un lector de microplacas.

Inmunofluorescencia: Las celulas tratadas con el compuesto indicado durante un tiempo indicado se fijaron en formaldehido al 4% o metanol frio para la deteccion de anexina V, caspasa 3 escindida o stat3, respectivamente. Los cubreobjetos se secaron al aire y se rehidrataron en PBS a temperatura ambiente durante 10 min. Las muestras se incubaron luego en regulador de bloqueo (PBS, 5% FBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente en una camara humeda. Las celulas se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios. Despues del lavado, las celulas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con una dilucion 1:500 de anticuerpo anti-conejo conjugado con FITC. Las imagenes se capturaron con un microscopio Nikon TE200 equipado con epifluorescencia y se obtuvo un anticuerpo anti-caspasa 3 escindidapoliclonal en mosaico SPOT camara CCD (1:100) de Cell Signaling Technology, Danvers, MA. La anexina-V-FITC se obtuvo de Roche, Penzberg, Alemania. El anticuerpo policlonal anti-Stat3 se obtuvo de Santa Cruz.

Eliminacion de genes mediante tecnologia TPIV®: La tecnologia TPIV® (identificacion y validacion de vias terapeuticas) (Boston Biomedical Inc., Norwood, MA, Estados Unidos) proporciona plasmidos que se pueden usar para transfectar primero las bacterias que, a su vez, son captadas por un sujeto mamifero. Despues de la lisis bacteriana, el ARNds codificado por los plasmidos TPIV® y procesado por las bacterias se libera en el citoplasma de las celulas de los mamiferos y efectua la eliminacion selectiva de genes. La tecnologia TPIV® se describe en la Solicitud de Patente PCT No. PCT/US08/68866 presentado el 30 de junio de 2008.

Especificamente, se construyo un plasmido TPIV® que codifica secuencias de ARNip efectivas contra Stat3, mediante clonacion por PCR de un plasmido Stat3 adquirido de Origene Technologies (Rockville, MD, Estados Unidos) utilizando los siguientes cebadores:

TPIV-Stat3 (insercion de 300 bp)

Cebadores:

Stat3 TPIV para 5'-GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC (SEQ ID NO. 2)

Stat3 TPIV Rev 5'-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG (SEQ ID NO. 3)

El plasmido de control se construye utilizando un plasmido pGL2 adquirido de Promega (Madison, WI, Estados Unidos).

TPIV-GL2 (insercion de 300 bp)

Cebadores:

GL2 TPIV para 5'-CCCTCTAGATGGTTCCTGGAAC (SEQ ID NO. 4)

GL2 TPIV Rev 5'-GCTCTAGAAACCCCTTTTTGG (SEQ ID NO. 5)

Las bacterias de E. coli BL21 (DE3) pLYSe quimicamente competentes (50-100 pl) se transformaron con un control o 100 ng de plasmido TPIV® dirigido a Stat3 segun las instrucciones del fabricante (Stratagene). Luego se inoculo una unica colonia en medio BHI que contenia 100 pg/ml de ampicilina y se cultivo durante la noche a 37°C. Al dia siguiente, se diluyeron 5 ml de cada cultivo durante la noche a 1:40 en medio BHI fresco que contenia 100 pg/ml de ampicilina y se cultivaron durante otras 2-4 horas (hasta el OD⁶⁰⁰= 0.5). Cada cultivo se trato luego con IPTG (concentracion final 1 mM) durante 2 a 4 horas para inducir la transcripcion de los ARN de doble cadena largos que se procesarian en un ARNip de coctel por las bacterias. Despues de la induccion de IPTG, el numero total de bacterias en cada cultivo se calculo midiendo el valor de OD⁶⁰⁰(8x108 bacterias/ml de cultivo tiene un OD⁶⁰⁰= 1). El numero de bacterias para el tratamiento celular se calculo de acuerdo con la confluencia celular y la multiplicidad necesaria de infeccion (MOI; rangos de prueba de 20:1 a 2000:1, bacterias a celulas) en un volumen de reaccion apropiado. Como regla general, el volumen de reaccion debe elegirse para dar como resultado 3x108/ml para una MOI de 1000:1. El volumen requerido de cultivo de bacterias se centrifugo luego a 2500 g durante 10 minutos a 4°C y el sedimento se lavo una vez con medio de cultivo libre de suero que se uso para las celulas que se estaban bactofectando mas 100 pg/ml de ampicilina y 1 mM de IPTG y resuspendido en el mismo medio a la densidad requerida para la infeccion bacteriana (bactofeccion).

Al mismo tiempo, se aislaron celulas cancerosas o celulas madre cancerosas. A 30 minutos antes de la bactofeccion, el medio de cultivo celular se reemplazo con 2 ml de medio fresco sin suero que contenia 100 pg/ml de ampicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias preparadas anteriormente se agregaron a las celulas a la MOI deseada durante 2 horas a 37°C.

Despues del periodo de infeccion, las celulas se lavaron 3 veces utilizando medio de cultivo celular libre de suero. Luego, las celulas se incubaron con 2 ml de medio de cultivo celular completo fresco que contenia 100 pg/ml de ampicilina y 150 pg/ml de gentamicina durante 2 horas para matar cualquier bacteria extracelular restante. Despues del tratamiento con ampicilina y gentamicina, las celulas se incubaron con 3 ml de medio RPMI 1640 completo nuevo que contenia 10 pg/ml de ofloxacina para matar cualquier bacteria intracelular. Las celulas se recolectaron o se analizaron en diversos puntos temporales para evaluar el alcance del silenciamiento del gen diana y los fenotipos resultantes.

En evaluaciones de vida: Tambien se realizaron examenes diarios del estado de salud de cada animal. Los pesos corporales se verificaron cada tres dias. Los alimentos y el agua se suministraban diariamente de acuerdo con los procedimientos de cria de animales de la instalacion. El tratamiento que produjo >20% de letalidad y >20% de perdida de peso corporal neto se considero toxico. Los resultados se expresan como volumen tumoral medio (mm3) ± SE. Los valores de p <0.05 se consideran estadisticamente relevantes.

Cria de animales: Ratones desnudos atimicos machos o hembras de 4-5 semanas (Charles River Laboratories, Wilmington, MA.), se aclimataron a la instalacion de alojamiento de animales durante al menos 1 semana antes del inicio del estudio. Todos los procedimientos experimentales utilizados fueron consistentes con las pautas descritas por la American Physiology Society y la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals y tambien fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee de Boston Biomedical Inc. Los animales fueron alojados en grupos de cuatro en jaulas con lechos de madera en una habitacion con temperatura controlada (68°F-72°F), luz (ciclo de luzoscuridad de 12 h) y humedad (45-55%). A los animales se les permitio el libre acceso a agua y comida durante el experimento.

Sistema de modelo de raton desnudo intrabazo (modelo ISMS): Se anestesiaron ratones hembra desnudos y, en condiciones asepticas, se realizo una incision en el flanco izquierdo para exponer el bazo. Se inyecto un millon de celulas HT29 de cancer de colon humano en 0.1 ml de PBS bajo la capsula del bazo utilizando una aguja de calibre 27. Se recoloco el bazo en la cavidad peritoneal y se cerro la incision. El tratamiento comenzo al dia siguiente despues de la implantacion hasta el dia del examen. El regimen de los tratamientos es 5 qd/semana via i.p. Los ratones se sacrificaron cuando estaban moribundos o 30 dias despues de la inyeccion. Se extirparon y examinaron el bazo y el higado, y se registro el numero de lesiones tumorales.

Ejemplo 1

Identificacion de Stat3 como un objetivo de celulas madre anticancer

La anulacion de Stat3 en CSC induce apoptosis. Para determinar si las celulas madre de cancer expresaron Stat3 y si Stat3 fue constitutivamente activo, se realizo microscopia de inmunofluoracion, que permite no solo el analisis de poblaciones de celulas raras, sino que tambien brinda informacion adicional sobre la localizacion de proteinas y la capacidad de correlacionar la tincion con el fenotipo (es decir, apoptosis). Despues de la deteccion inmunofluorescente de p-Stat3 y Stat3 en celulas NSP y SP aisladas por FACS de celulas de cancer de colon SW480, determinamos que Stat3 estaba efectivamente presente en celulas SP y que estaba modestamente enriquecido en el nucleo (Figura 3A). Ademas, tambien se observo un aumento en la tincion de p-Stat3 en celulas SP sobre celulas NSP, lo que sugiere que las celulas SP pueden depender mas de Stat3 para sobrevivir.

El estado de Stat3 tambien se evaluo en celulas CD133+ aisladas de celulas de cancer de cabeza y cuello humanas FaDu y celulas de glioblastoma humano LN18. Como se muestra en la Figura 3B, Stat3 tambien es constitutivamente activo en estas celulas. En conjunto, estos datos sugieren que Stat3 es un objetivo particularmente importante para las celulas madre de cancer.

A continuacion, se probo el efecto de la anulacion de Stat3 en CSC utilizando TPIV®. El analisis de inmunofluorescencia revelo que se podria lograr un agotamiento significativo de Stat3 dentro de las 24 horas posteriores a la infeccion (Figura 4A) en CSC (SP) recien aisladas y se encontro que la mayoria de las celulas tratadas con plasmidos TPIV® dirigidos a Stat3 se sometieron a apoptosis dentro de las 24 horas de la infeccion mientras que los plasmidos TPIV® de control no indujeron la apoptosis a niveles por encima de celulas no infectadas de control (Figura 4B). Estos datos demuestran que las celulas madre de cancer dependen de Stat3 para sobrevivir.

La anulacion de Stat3 en CSCs inhibe la esferogenesis de CSC. Las celulas madre cancerosas de la poblacion lateral CD44alto/CD24bajo FaDu o Hoeschst se aislaron mediante FACS y se cultivaron en placas de fijacion ultrabajas en medio de celulas madre cancerosas (DMEM/F12, suplemento Neurobasal B27, 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF, 4 pg/mL de insulina, y 0.4% de BSA) para permitir la formacion de esferas. Las esferas primarias se recolectaron, se desagregaron con tripsina y se distribuyeron a placas de fijacion ultrabajas de 96 pozos antes del tratamiento con TPIV®. Las bacterias se administraron a una MOI de 1000 durante dos horas antes de la adicion del coctel antibiotico (penstrep, gentamicina, oflaxacina). La formacion de la esfera se evaluo despues de 10-14 dias en cultivo. Las imagenes representativas de la esfera se capturaron antes (Figura 5, paneles superiores izquierdos) o despues de la adicion de azul de tripano para identificar las celulas muertas (Figura 5, panel inferior izquierdo). La esferogenesis relativa se mostro en el panel derecho de la Figura 5. Los datos mostraron claramente que la eliminacion de Stat3 en las celulas madre de cancer inhibe la esferogenesis, lo que demuestra que Stat3 es un factor clave de autorrenovacion de las celulas madre de cancer.

Ejemplo 2

Identificacion de compuestos que inhiben la actividad de la ruta Stat3.

Inhibicion de la actividad de transcripcion de Stat3. Los compuestos se probaron para determinar su capacidad para inhibir la actividad de activacion de la transcripcion de Stat3 en celulas utilizando un constructo informador de Stat3-luciferasa (Stat3-luc). Las celulas transfectadas con Stat3-luc se cultivaron en medio de suero reducido antes de la adicion del compuesto indicado durante 30 minutos. Luego, las celulas se estimularon con 25 ng/ml de oncostatina M (OSM) durante 6 horas, seguida de la deteccion de la actividad informadora Stat3-luc. La incubacion de celulas con el compuesto 401 inhibio la actividad del indicador Stat3 estimulada por OSM (Figura 6, panel izquierdo). AG490, un inhibidor conocido de la via de Jak-Stat, se incluyo como control positivo para la inhibicion de Stat3. El etoposido, incluido como control de la actividad genotoxica, mostro poca o ninguna inhibicion de Stat3. El compuesto 1001, que es naftaleno en lugar de naftoquinona como los compuestos en esta descripcion, no inhibio la actividad del indicador Stat3 estimulada por OSM incluso a una concentracion mucho mas alta (Figura 6, panel derecho).

Se ensayaron compuestos adicionales en los ensayos de indicador de luciferasa Stat3 y los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3

Compuesto # IC⁵⁰en los ensayos Stat3-Luc

401 -0.25 |uM

416 -0.75 |uM

418 -0.75 |uM

301 -2 |uM

Inhibicion de la actividad de union al ADN de Stat3. Se utilizaron extractos nucleares de celulas HeLa, que contienen Stat3 activada de forma constitutiva detectada por la fosforilacion en el residuo de tirosina 705, para realizar los EMSA de Stat3 para controlar la actividad de union al ADN de Stat3. Los extractos nucleares se incubaron con el compuesto indicado antes de la incubacion con el oligonucleotido Stat3 consenso marcado con IR700. La union de Stat3 al oligonucleotido se controlo mediante electroforesis en gel y deteccion utilizando un escaner infrarrojo LiCor Odyssey. La banda retardada de Stat3 se identifico y confirmo mediante superdesplazamiento con el anticuerpo anti-Stat3 (Figura 7A, panel izquierdo) y la inhibicion dependiente de la dosis con el peptido Stat3 (Figura 7A, panel central). La inhibicion dependiente de la dosis de la union del ADN de Stat3 se observo despues de la incubacion de la sonda marcada con el compuesto 401 (Figura 7A, panel derecho).

Se ensayaron compuestos adicionales en los ensayos de EMSA. Como se muestra en la Figura 7B, los compuestos 401,416 y 418 pueden inhibir la actividad de union al ADN de Stat3.

Inhibicion de los efectores descendentes de Stat3 en tejidos de tumores de xenoinjerto. Los extractos se prepararon a partir de tumores de Paca2 xenoinjertados que se trataron con el compuesto 401 o el control de vehiculo 4 horas antes de la recoleccion. Las muestras se analizaron mediante transferencias de Western y EMSA para evaluar el nivel de expresion del efector descendente de Stat3 y la actividad de union al ADN de Stat3. La muestra tratada con el compuesto 401 (T) mostro una disminucion en la actividad de union al ADN de Stat3 sobre el control (V) (Figura 8A). Ademas, el tratamiento con el compuesto 401 resulto en una disminucion en el nivel de expresion de los efectores corriente abajo de Stat3 ciclina D1 y survivina (Figura 8B).

Ejemplo 3

Identificacion de compuestos que atacan a las celulas madre de cancer

Identificacion de compuestos que son apoptoticos a celulas madre cancerosas. Dado que se ha demostrado que las celulas madre de cancer expulsan activamente a Hoechst, las celulas SW480 se tineron con Hoechst y la poblacion lateral (que se muestra en la Figura 9A, area cerrada del panel izquierdo) se clasifico para enriquecer las celulas madre de cancer. Para confirmar que esta poblacion lateral esta enriquecida con celulas madre cancerosas, un conjunto de control de celulas SW480 se trato primero con Verapamil, un inhibidor de los transportadores ABC, antes de tenir con Hoechst. Como se muestra en el panel derecho de la Figura 9A, el tratamiento con verapamilo resulta en la perdida de la poblacion lateral.

Se accedio a la IC⁵⁰del compuesto 401 contra la poblacion lateral de Hoechst en ensayos de MTT y se comparo con la IC⁵⁰frente a la poblacion no lateral. Los resultados muestran que la poblacion lateral es tan sensible como la poblacion no lateral al compuesto 401 (Figura 9B, paneles de la derecha). Sin embargo, la poblacion lateral es mucho mas resistente que la poblacion no lateral a la doxorrubicina (Figura 9B, paneles de la izquierda), lo que concuerda con publicaciones anteriores [7, 86]. Estos datos sugieren que el compuesto 401 mata las celulas madre de cancer.

Las celulas de la poblacion lateral de Hoechst se trataron con el compuesto 401 y se accedio al modo de muerte celular mediante tincion con Anexina V (un marcador temprano para la apoptosis). Los resultados muestran que las celulas moribundas son anexina V positivas (Figura 10A), lo que demuestra que el compuesto 401 es apoptotico a las celulas madre cancerosas.

Como alternativa, realizamos CD133 (uno de los marcadores de superficie de celulas madre de cancer comunes), descensos de perlas magneticas para enriquecer las celulas madre de cancer. Las celulas CD133⁺se trataron luego con el compuesto 401 seguido por tincion con anticuerpo contra la Caspasa 3 escindida (un sello de la apoptosis). Como se muestra en la Figura 10B, muchas de las celulas CD133⁺se vuelven positivas a Caspasa 3 escindida despues del tratamiento con el compuesto 401, lo que corrobora que el compuesto 401 es apoptotico a las celulas madre cancerosas.

Ademas, se probaron las actividades de varios otros compuestos contra las celulas madre de cancer. En resumen, se expusieron CSC recien aisladas (celulas SW480 Hoechst SP o CD44^altacon celulas FaDu) a un rango de dosis (30 0.117 pM) de compuesto durante 48 h antes de examinar la viabilidad celular mediante el ensayo MTT. Las IC⁵⁰se estimaron trazando el porcentaje de celulas supervivientes. Como se muestra en la Tabla 4 y la Tabla 5, los compuestos de la presente divulgacion pueden dirigirse a las celulas madre de cancer.

Tabla 4

IC⁵⁰(pM)

Compuesto NSP SP

401 0.33 0.34

418 0.33 0.34

4011 0.34 0.38

4012 0.81 0.57

Tabla 5

IC⁵⁰(pM)

Compuesto CD44^bajaC D44^alta

4011 0.42 0.27

4012 0.76 1.05

Identificacion de compuestos que inhiben la esferogenesis de CSC in vitro. Una de las caracteristicas distintivas de las celulas madre de cancer es su capacidad de autorrenovacion [87]. Un metodo confiable para medir la capacidad de autorrenovacion de las poblaciones celulares es la capacidad de ser cultivadas como esferas en ausencia de suero o union [88]. Para comparar la capacidad del compuesto 401 con otros agentes dirigidos y quimioterapeuticos, las CSC CD44 ^altaaisladas con FACS se cultivaron como esferas durante 72 horas antes de ser atacadas con un panel de agentes terapeuticos. De los agentes probados, solo el compuesto 401 fue eficaz para prevenir la proliferacion de esferas (Figura 11). Tenga en cuenta que las esferas fueron resistentes a la doxorrubicina y al docetaxel a pesar de que se aplicaron aproximadamente diez veces sus concentraciones de IC⁵⁰para la muerte celular en ensayos similares. Se agregaron Tarceva, Sutent y Gleevec aproximadamente a tres veces sus concentraciones terapeuticas reportadas. Esto demuestra que, si bien las celulas madre de cancer son resistentes a los agentes quimioterapeuticos y dirigidos convencionales, el compuesto 401 es altamente efectivo para inhibir su crecimiento.

Identificacion de compuestos que inhiben la esferogenesis de CSC in vivo. Se obtuvieron ratones atimicos hembra nu/nu de seis semanas de edad de Charles River Labs (Wilmington, MA). Los ratones se inyectaron por via subcutanea en el flanco con 6x10⁶celulas cancerosas FaDu o Paca2 en 0.2 mL de DMEM sin suero. Despues de que los xenoinjertos alcanzaron los ~200 mm³de tamano, los animales que portaban tumores de xenoinjerto Paca2 se administraron con vehiculo, gemcitabina (120 mg/kg, dos veces por semana) o compuesto 401 (20 mg/kg) por ip durante una semana y animales con FaDu los tumores de xenoinjerto se administraron diariamente con vehiculo, carboplatino (30 mg/kg) o compuesto 401 (20 mg/kg) por via ip durante dos semanas antes del sacrificio. Luego se recolectaron los tumores para celulas Paca2 y FaDu, respectivamente. Se obtuvieron suspensiones de celulas individuales despues del sacrificio del animal y la eliminacion esteril de tumores. En resumen, los tumores se trituraron con bisturies esteriles en piezas de 0.1 mm³antes de ser digeridos en 1 mg/ml de colagenasa/HBSS durante 15-30 minutos con agitacion constante. Despues de la etapa a traves de un filtro de malla de 40 pm, se eliminaron los globulos rojos, las celulas muertas y los residuos celulares mediante la colocacion en capas de la suspension celular en 1 ml de Histopaque y la capa de interfase de recoleccion despues de la centrifugacion a 1440 x g durante 30 minutos. Las celulas vivas se contaron y se usaron para medir su capacidad para formar esferas. Las celulas se distribuyeron en placas de 96 pozos de union ultrabajas a una densidad de 100 celulas por pozo en medio de celulas madre cancerosas (DMEM/F12, suplemento de neurobasal B27, 20 ng/ml de EGF, 10 ng/ml de FGF, 4 gg/ml de insulina, y 0.4% BSA). Se anadieron medios nuevos cada tres dias y se determino la formacion de la esfera despues de 10-14 dias de cultivo. Se puntuaron esferas con >50 celulas. Al final del experimento, se anadio azul tripan para identificar las celulas muertas. Como se muestra en la Figura 12, las quimioterapias estandar gemcitabina (panel superior) y carboplatino (panel inferior) enriquecieron a las celulas madre de cancer evidenciadas por el aumento de la esferogenesis. En contraste, los tratamientos con el compuesto 401 disminuyeron las celulas madre de cancer evidenciadas por la disminucion de la esferogenesis.

Ejemplo 4

Identificacion de compuestos que matan selectivamente un amplio espectro de celulas cancerosas Identificacion de compuestos que son apoptoticos para un amplio espectro de celulas cancerosas in vitro. Las celulas colocadas en placas de 96 pozos y tratadas con los compuestos indicados se sometieron a analisis de MTT a las 24 horas despues del tratamiento con el compuesto para determinar la viabilidad celular. Los valores de IC⁵⁰calculados a traves de multiples lineas celulares se resumen en la Tabla 6 a continuacion. Los datos demuestran que estos compuestos tienen una potente actividad contra un amplio espectro de celulas cancerosas.

Tabla 6

IC⁵⁰(gM)

Linea celular Tejido 4011 4012 101 301 401 416 418

A549 Pulmon 0.95 1.90 1.06

H1299 Pulmon 3-10 0.794 0.23 0.25 0.34

MCF7 Mama 0.46 0.75 0.46

HeLa Cervix 11.7 3.358 0.43 0.62 0.80

DLD1 Colon 0.33 0.54 0.64

SW480 Colon 0.32 0.44 0.76

HCT116 Colon 0.58 0.69 0.61

HT29 Colon 1.27 1.91 1.83

HepG2 Higado 0.25

Paca2 Pancreas 0.446 0.11 0.21 0.21

Panel Pancreas 1.70 2.59 1.54

DU145 Prostata 3.7 0.835 0.12 0.22 0.18

PC3 Prostata 2.37 3.10 3.04

LNCap Prostata 0.63

FaDu Cabeza y cuello 0.353 1.041 0.39

Ademas, las celulas DU145 se trataron primero con DMSO o las concentraciones indicadas del compuesto 401, luego se tineron con Anexina V y se siguieron con un analisis de citometria de flujo 5 horas despues del tratamiento. Los resultados muestran que el tratamiento con 401 resulta en un aumento dependiente de la dosis en la tincion con anexina V (Figura 13), lo que demuestra que el compuesto 401 es apoptotico a estas celulas cancerosas.

Ejemplos de la selectividad de los compuestos. En condiciones de ensayo que resultan en la muerte de practicamente todas las celulas cancerosas, las celulas normales permanecen sustancialmente viables. Las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) fueron relativamente resistentes al compuesto 401, con un IC⁵⁰de MTT de 14 pM despues de una incubacion de 24 horas con el compuesto 401. Este IC⁵⁰es entre 6 a 116 veces mayor que los observados en una variedad de lineas celulas cancerosas, lo que indica una ventana terapeutica razonable en comparacion con las celulas cancerosas.

De forma similar a los PMBC, las celulas madre hematopoyeticas de medula osea CD34⁺se salvaron cuando se trataron con el compuesto 401. Como se muestra en la Tabla 7, la incubacion de celulas mononucleares de medula osea CD34⁺durante 6 horas con el compuesto 401 dio como resultado un IC⁵⁰mayor que 30 pM tanto para la linea osea de la medula osea como para los linajes mieloides, mientras que las celulas de cancer de prostata DU145 y de colon HT29 tienen IC⁵⁰menor a 0.5 pM en condiciones similares. Estos datos sugieren una amplia ventana terapeutica (mas de 50 veces) para el compuesto 401 de acuerdo con los datos in vitro.

Tabla 7. El compuesto 401 es relativamente no toxico para las celulas madre de medula osea CD34⁺

Compuesto 401 IC⁵⁰(pM)

Celulas Normales Celulas cancerigenas

CD34⁺BM Eritroide CD34⁺BM Mieloide DU145 HT29

>30 >30 <0.2 <0.5

BM = medula osea

Comparacion de la IC⁵⁰del compuesto 401 en celulas mononucleares de medula osea CD34⁺, celulas DU145 y celulas FaDu en ensayos de formacion de colonias.

Ejemplo 5

Eficacia antitumoral in vivo

Modelo de xenoinjerto de cancer pancreatico. Se inocularon celulas Paca-2 por via subcutanea en ratones atimicos hembra (4x10⁶celulas/raton). Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 450 mm³, los animales se dividieron aleatoriamente en 2 grupos con cinco ratones por grupo. Los ratones se trataron por via intraperitoneal con cualquiera de los compuestos 401 a 20 mg/kg o con el control de vehiculo diariamente. El compuesto 401 se formulo a 5 mg/ml en lipidos al 1.5% y H₂O. Los animales recibieron un total de 14 dosis y se dejaron para la observacion posterior al tratamiento. Los tumores se midieron durante todo el tratamiento y se monitorizaron durante otros 22 dias despues del tratamiento. Como se muestra en el panel izquierdo de la Figura 14, el compuesto 401 inhibio potentemente el crecimiento del tumor. Se calculo que la inhibicion del crecimiento tumoral era del 64% en el dia 60 y fue estadisticamente significativa (p<0.001). Mas importante aun, los volumenes de tumores permanecieron estaticos durante los 22 dias posteriores al tratamiento.

En un experimento similar, las celulas de cancer pancreatico humano panc-1 se inocularon por via subcutanea en ratones atimicos hembra desnudos (2x10⁶celulas/raton) y se les permitio formar tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 60 mm³, los animales se dividieron aleatoriamente en 2 grupos con 5 ratones por grupo. Los ratones se trataron por via intraperitoneal (ip) con gemcitabina con un regimen estandar (120 mg/kg una vez cada tres dias) o control con vehiculo, para un total de 6 dosis de control con gemcitabina o vehiculo. Los tumores se midieron durante todo el tratamiento y se monitorizaron durante otros 19 dias despues del tratamiento. Como se muestra en el panel derecho de la Figura 14, el tratamiento con gemcitabina como monoterapia inhibio el crecimiento tumoral con una inhibicion del crecimiento tumoral del 47.5% en el dia 41. Despues de interrumpir el tratamiento, los tumores en el grupo tratado con gemcitabina pronto superaron a los del grupo de control.

No se observo ningun rebrote tumoral durante el tratamiento del compuesto 401 o el periodo posterior al tratamiento en el modelo de cancer pancreatico humano Paca-2 xenoinjertado, que es consistente con su mecanismo de accion de direccionamiento de celulas madre cancerosas. En contraste, los tumores de xenoinjerto pancreatico humanos tratados con la quimioterapia estandar actual con gemcitabina respondieron inicialmente, pero se recuperaron durante el tratamiento continuo o superaron los tumores de control despues de que se detuvo la dosificacion. La abolicion del rebote tumoral diferencia el compuesto 401 de las quimioterapias estandar, lo que ofrece la posibilidad de mejorar la terapia contra el cancer de manera drastica y fundamental.

Modelo de xenoinjerto de cancer de cabeza y cuello. Se inocularon celulas de cancer de cabeza y cuello humanas FaDu por via subcutanea en ratones atimicos hembra (6x106 celulas/raton) y se les permitio formar tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3, los animales se trataron por via intraperitoneal (ip) con el compuesto 401 a 20 mg/kg o el control de vehiculo diariamente (5 dias consecutivos, seguido de un receso de dosificacion de 2 dias). El compuesto 401 se formulo a 5 mg/ml en 2% de lipidos, 0.1% de colesterol y H₂O. Los animales recibieron un total de 15 dosis de compuesto 401 o control de vehiculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Como se muestra en la Figura 15 en este modelo altamente agresivo de xenoinjerto de cabeza y cuello, los animales a los que se les administro el compuesto 401 por via intraperitoneal como monoterapia inhibieron de manera potente el crecimiento del tumor. La inhibicion del crecimiento tumoral del compuesto 401 se calculo que era del 75% con un valor de p de 0.007. No hubo cambios significativos en el peso corporal debido a la administracion intraperitoneal del vehiculo o compuesto 401 a 20 mg/kg.

Modelo de xenoinjerto de cancer de mama. Las celulas de cancer de mama humano MDA-MB-231 se inocularon por via subcutanea en ratones atimicos hembra (8x106 celulas/raton) y se les permitio formar tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3, los animales se trataron por via oral (po) con el compuesto 401 a 200 mg/kg o el control de vehiculo diariamente (5 dias consecutivos, seguido de un receso de dosificacion de 2 dias). El compuesto 401 se formulo a 20 mg/ml en gelucire al 8% y vitamina E al 20%. Los animales recibieron un total de 15 dosis de compuesto 401 o control de vehiculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Como se muestra en la Figura 16, la dosificacion oral del compuesto 401 en monoterapia a 200 mg/kg inhibio potentemente el crecimiento del tumor. La inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 se calculo en un 66% con un valor de p de 0.0068. No hubo cambios significativos en el peso corporal debido a la administracion p.o.del vehiculo o compuesto 401 a 200 mg/kg. Estos datos sugieren que el compuesto 401 se puede administrar de manera segura en un regimen que es eficaz en este modelo de cancer de mama humano.

Modelo de xenoinjerto de cancer de prostata. Las celulas de cancer de prostata humano PC3 se inocularon por via subcutanea en ratones atimicos hembra (8x106 celulas/raton) y se permitio la formacion de tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 100 mm3, los animales se trataron por via intraperitoneal (ip) con el compuesto 401 a 20 mg/kg o el control de vehiculo diariamente. El compuesto 401 se formulo a 5 mg/ml en 2% de lipidos, 0.1% de colesterol y H₂O. Los animales recibieron un total de 30 dosis de compuesto 401 o control de vehiculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Como se muestra en la Figura 17, la dosificacion ip del compuesto 401 en monoterapia a 20 mg/kg inhibio el crecimiento del tumor. Se calculo que la inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 era del 55% con un valor de p de 0.015. No hubo cambios significativos en el peso corporal debido a la administracion ip del vehiculo o compuesto 401 a 20 mg/kg. Estos datos sugieren que el compuesto 401 se puede dosificar de manera segura en un regimen que sea efectivo en este modelo de cancer de prostata humano.

Modelo de xenoinjerto de cancer gastrico. Se inocularon celulas cancerosas gastricas humanas MKN-45 por via subcutanea en ratones atimicos hembra (8x106 celulas/raton) y se les permitio formar tumores palpables. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 180 mm3, los animales se administraron por via oral (p.o.) con el compuesto 401 a 200 mg/kg o el control de vehiculo a diario. El compuesto 401 se formulo a 20 mg/ml en gelucire al 8% y vitamina E al 20%. Los animales recibieron un total de 20 dosis de compuesto 401 o control de vehiculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Como se muestra en la Figura 18, la dosis oral del compuesto 401 en monoterapia a 200 mg/kg inhibio el crecimiento del tumor. La inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 se calculo en un 70% con un valor de p de 0.01. No hubo cambios significativos en el peso corporal debido a la administracion oral del vehiculo o compuesto 401 a 200 mg/kg. Estos datos sugieren que el compuesto 401 se puede dosificar de manera segura en un regimen que es eficaz en este modelo de cancer gastrico humano.

Modelo de xenoinjerto de cancer de higado. Se inocularon celulas de cancer de higado humano HepG2 por via subcutanea en ratones atimicos hembra (8x106 celulas/raton) y se les permitio formar tumores palpables. En este estudio, la dosificacion comenzo cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 700 mm3. Los animales se trataron por via intravenosa (iv) con el compuesto 401 a 10 mg/kg o el control de vehiculo diariamente. El compuesto 401 se formulo a 2 mg/ml en albumina al 1.5%. Los animales recibieron un total de 10 dosis de compuesto 401 o control de vehiculo. Los tumores se midieron a lo largo del tratamiento. Como se muestra en la Figura 19, a pesar de que el tratamiento comenzo en una etapa muy posterior del crecimiento del tumor, el tratamiento iv con el compuesto 401 en monoterapia a 10 mg/kg todavia inhibio potencialmente el crecimiento del tumor. La inhibicion optima del crecimiento tumoral del compuesto 401 se calculo en un 52.3% con un valor de p de 0.05. No hubo cambios significativos en el peso corporal debido a la administracion iv del vehiculo o compuesto 401 a 10 mg/kg. Estos datos sugieren que el compuesto 401 se puede dosificar de manera segura en un regimen que es eficaz en este modelo de cancer de higado humano.

Ejemplo 6

Eficacia antimetastasis

El compuesto 401 tambien se probo en cuanto a su capacidad para inhibir la metastasis en el modelo ISMS. El sistema de modelo de raton intrabazo-desnudo (modelo ISMS) es apropiado para estudios del comportamiento maligno de los carcinomas colorrectales, ya que esta tecnica puede producir metastasis experimentales en el higado. En este modelo, un millon de celulas HT29 en 0.1 ml de PBS se inyectaron bajo la capsula de bazo de los ratones desnudos. Se reemplazo el bazo en la cavidad peritoneal y se cerro la incision. Los ratones se sacrificaron cuando estaban moribundos o 30 dias despues de la inyeccion. Se extirparon y examinaron el bazo y el higado, y se registro el numero de lesiones tumorales. Los ratones se dividieron en 2 grupos, un grupo de control de vehiculo dado (n=4) y el otro grupo que recibio 20 mg/kg de compuesto 401 (n=4). El farmaco se administro via ip. 5 dias/semana desde el dia 2 hasta el dia 30 despues de la inyeccion i.s. Los numeros de tumores primarios y tumores metastasicos del higado se estimaron microscopicamente. Las imagenes representativas se muestran en la Figura 20. En el grupo de control de vehiculo, habia una gran carga de tumores primarios en el bazo (Figura 20, panel superior izquierdo). Tambien se observaron metastasis hepaticas masivas espontaneas (Figura 20, panel superior derecho). Los tratamientos con el compuesto 401 reducen significativamente el numero de focos de tumores primarios y la metastasis hepatica espontanea (Figura 20, paneles inferiores).

Ejemplo 7

Farmacocinetica y perfil de toxicidad.

Se realizo un analisis farmacocinetico del compuesto 401 en ratas. Se dosificaron ratas Sprague Dawley hembras para la evaluacion farmacocinetica (9 ratas/grupo) mediante sonda oral. El volumen de dosis fue de 10 ml/kg y cada grupo recibio preparaciones que contenian el articulo de control (9% Gelucire 44/14 y 18% de vitamina E TPGS en agua esteril) o 10 o 30 mg/kg/dia de compuesto 401 en el articulo de control. Las muestras de sangre se tomaron de 3 animales/sexo/punto de tiempo predosis y aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10 y 24 horas despues de la dosis inicial. El plasma se recogio por centrifugacion y se almaceno en un congelador para mantenerlo a -75°C ± 15°C hasta el analisis. La parte bioanalitica de este estudio se realizo utilizando un metodo validado de LC/MS/MS. El limite inferior de cuantificacion (LLOQ) fue de 10.0 ng/mL. Como se muestra en la Figura 21, los datos farmacocineticos mostraron que el compuesto 401 logro y mantuvo una concentracion critica de hasta 7 pM hasta 8 horas.

A estas dosis, no se observaron efectos toxicos en ratas con dosis continuas durante 28 dias. Esto incluyo la observacion clinica, las pruebas de laboratorio, los resultados brutos e histologicos. Juntos, estos datos demostraron que el compuesto 401 puede lograr la exposicion deseada a la PK para la actividad anticancerigena selectiva.

Ejemplo 8

Preparación de 2-acetil-4H,9H-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona (compuesto de fórmula 4-6 en donde R1 = R7 = H y R3 = -CH₃)

A una solucion de 18.8 gramos (22 ml, 0.268 moles) de 3-buten-2-ona (Formula 4-1 en el esquema 1) en 200 ml de pentano en bano de hielo con agitacion vigorosa, se agregaron lentamente 39.0 gramos (12.54 ml, 0.244 moles) de bromo en 50 ml de pentano durante 30 minutos. Despues de agitar durante 5 minutos adicionales en un bano de hielo, la mezcla se evaporo para eliminar la mayor parte del pentano. El pequeno volumen de residuo de 3,4-dibromo-2-butanona (4-2) de la etapa 1 se disolvio en 400 ml de THF y luego se enfrio en un bano de hielo. A la solucion en bano de hielo con agitacion vigorosa, se agregaron lentamente 37.2 gramos (36.5 ml, 0.244 moles) de DBU en 50 ml de THF en 30 minutos. Se genero gran cantidad de sal precipitada. La mezcla se uso directamente para la siguiente etapa de reaccion. A la mezcla de reaccion de 3-bromo-3-buten-2-ona (4-3), se agregaron 38.5 gramos (0.220 moles) de 2-hidroxi-1,4-naftoquinona (4-4). La mezcla resultante se agito vigorosamente en un bano de agua a temperatura ambiente. Luego se agregaron lentamente a la mezcla 44.6 gramos (43.8 ml, 0.293 moles) de DBU dentro de los 30 minutos. La temperatura de la mezcla de reaccion aumento por el calor generado por la reaccion y se controlo a menos de 35°C agregando hielo al bano de agua. Despues de agitarse vigorosamente durante 3 horas adicionales al aire libre a temperatura ambiente, se agregaron 1.800 ml de agua a la mezcla. La mezcla resultante se enfrio a 0°C y luego se filtro. El solido filtrado se lavo sucesivamente con 500 ml de agua, 500 ml de bicarbonato de sodio acuoso al 5%, 500 ml de acido acetico al 1% y 250 ml de acetona enfriada con hielo. El solido lavado se recristalizo en 200 ml de acido formico para producir 12 gramos de producto con un rendimiento total de 22.8% para el Compuesto 4-6 o 3-2 (R1 = H, R3 = CHs, R7 = H) 1H RMN (en CDCls) 52.67 (s, 3H), 7.61 (s, 1H-3), 7.79-7.84 (m, 2H), 8.22-8.28 (m, 2H).

Ejemplo 9

Esquema 2

Preparacion del compuesto 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico

A una solucion de BBI6002 (240 mg, 1 mmol) en 50 THF a -78°C se le anadio una solucion de bis(trimetilsilil)amida de litio (1.0M en THF, 1.2 mL). Despues de agitarse a esta temperatura durante 1 hora, la mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 30 min. Luego se anadio una solucion de clorofosfato de dimetilo (217 mg, 1.5 mmol) en 5 mL de THF a esta mezcla a -78°C. La mezcla resultante se agito y se dejo calentar a temperatura ambiente lentamente. Despues de 1 h de agitacion a temperatura ambiente, el disolvente se evaporo, el residuo se disolvio en CH₂Cl², se lavo con NH4Cl saturado y agua y se seco sobre MgSO4. La evaporacion del disolvente produjo la mezcla de reaccion cruda, que se purifico a partir de cromatografia en columna para producir 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico como un solido amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 58.20 - 8.28 (m, 2H), 7,78 - 7.82 (m, 2H), 7.07 (s, 1H), 5.78 (t, 1H, J = 2.8 Hz), 5.50 (t, 1H, J = 2.8 Hz), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H); MS m /z347.20 (M-H).

Ejemplo 10

Esquema 3

Preparacion del compuesto mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil] ester del acido fosforico

A una solucion de 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico (40 mg, 0. 114.mmol) en CH₂Cl²(2 mL) a temperatura ambiente se anadio bromuro de trimetilsililo (71 mg, 0.46 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 horas y luego se concentro al vacio. El residuo se purifico por HPLC semipreparativa para obtener el producto mono-[1 -(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico como un solido amarillo. 1H RMN (400 MHz, CDC13) 5 1H RMN (400 MHz, CDCl3) 57.98 -8.02 (m, 2H), 7,57 - 7.62 (m, 2H), 6.92 (s, 1H), 5.54 (t, 1H, J = 2.8 Hz), 5.36 (t, 1H, J = 2.8 Hz); MS m/z 319.20 (M-H).

Todos los numeros que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reaccion, resultados analiticos, etc., utilizados en la especificacion y las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el termino "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parametros numericos establecidos en la especificacion y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente divulgacion. Como minimo, y no como un intento de limitar la aplicacion de la doctrina de equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parametro numerico debe interpretarse a la luz del numero de digitos significativos y los enfoques de redondeo ordinarios.

Las modificaciones y variaciones de esta invencion pueden realizarse sin apartarse de su alcance, como sera evidente para los expertos en la materia. Las realizaciones especificas descritas en este documento se ofrecen solo a modo de ejemplo y no pretenden ser limitativas de ninguna manera. Se pretende que la especificacion y los ejemplos se consideren solo como ejemplos, con un verdadero alcance de la invencion indicado en las reivindicaciones que siguen mas adelante.

Referencias:

1. Bonnet, D., Normal and leukaemic stem cells. Br J Haematol, 2005.130(4): p. 469-79.

2. Bonnet, D. and J.E. Dick, Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med, 1997. 3(7): p. 730-7.

3. Hambardzumyan, D., M. Squatrito, and E.C. Holland, Radiation resistance and stem-like cells in brain tumors. Cancer Cell, 2006. 10(6): p. 454-6.

4. Baumann, M., M. Krause, and R. Hill, Exploring the role of cancer stem cells in radioresistance. Nat Rev Cancer, 2008. 8(7): p. 545-54.

5. Ailles, L.E. and I.L. Weissman, Cancer stem cells in solid tumors. Curr Opin Biotechnol, 2007.18(5): p. 460-6.

6. Jones, R.J., W.H. Matsui, and B.D. Smith, Cancer stem cells: are we missing the target? J Natl Cancer Inst, 2004.

96(8): p. 583-5.

7. Ho, M.M., et al., Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells. Cancer Res, 2007. 67(10): p. 4827-33,

8. Wang, J., et al., Identification of cancer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line. Cancer Res, 2007. 67(8): p. 3716-24.

9. Haraguchi, N., et al., Characterization of a side population of cancer cells from human gastrointestinal system. Stem Cells, 2006. 24(3): p. 506-13.

10. Doyle, L.A. and D.D. Ross, Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP (ABCG2). Oncogene, 2003. 22(47): p. 7340-58.

11. Alvi, A.J., et al., Functional and molecular characterisation of mammary side population cells. Breast Cancer Res, 2003. 5(1): p. R1-8.

12. Frank, N.Y., et al., ABCB5-mediated doxorubicin transport and chemoresistance in human malignant melanoma. Cancer Res, 2005. 65(10): p. 4320-33.

13. Schatton, T., et al., Identification of cells initiating human melanomas. Nature, 2008. 451 (7176): p. 345-9.

14. Kondo, T., T. Setoguchi, and T. Taga, Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101 (3): p. 781 -6.

15. Goodell, M.A., et al., Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med, 1996. 183(4): p. 1797-806.

16. Collins, A.T., et al., Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res, 2005. 65(23): p. 10946-51.

17. Li, C., et al., Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Res, 2007. 67(3): p. 1030-7.

18. Ma, S., et al., Identification and characterization of tumorigenic liver cancer stem/progenitor cells. Gastroenterology, 2007.132(7): p. 2542-56.

19. Prince, M.E., et al., Identification of a subpopulation of cells with cancer stem cell properties in head and neck squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007.104(3): p. 973-8.

20. Ricci-Vitiani, L., et al., Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature, 2007. 445(7123): p. 111-5.

21. Singh, S.K., et al., Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res, 2003. 63(18): p. 5821 8.

22. Dalerba, P., et al., Phenotypic characterization of human colorectal cancer stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(24): p. 10158-63.

23. Yu, H. Stat3: Linking oncogenesis with tumor immune evasion. in AACR 2008 Annual Meeting. 2008. San Diego, CA.

24. Pedranzini, L., A. Leitch, and J. Bromberg, Stat3 is required for the development of skin cancer. J Clin Invest, 2004.

114(5): p. 619-22.

25. Catlett-Falcone, R., et al., Constitutive activation of Stat3 signaling confers resistance to apoptosis in human U266 myeloma cells. Immunity, 1999. 10(1): p. 105-15.

26. Bromberg, J.F., et al., Stat3 as an oncogene. Cell, 1999. 98(3): p. 295-303.

27. Kanda, N., et al., STAT3 is constitutively activated and supports cell survival in association with survivin expression in gastric cancer cells. Oncogene, 2004. 23(28): p. 4921 -9.

28. Schlette, E.J., et al., Survivin expression predicts poorer prognosis in anaplastic large-cell lymphoma. J Clin Oncol, 2004. 22(9): p. 1682-8.

29. Niu, G., et al., Constitutive Stat3 activity up-regulates VEGF expression and tumor angiogenesis. Oncogene, 2002.

21(13): p. 2000-8.

30. Xie, T.X., et al., Stat3 activation regulates the expression of matrix metalloproteinase-2 and tumor invasion and metastasis. Oncogene, 2004. 23(20): p. 3550-60.

31. Kortylewski, M., et al., Inhibiting Stat3 signaling in the hematopoietic system elicits multicomponent antitumor immunity. Nat Med, 2005. 11(12): p. 1314-21.

32. Burdelya, L., et al., Stat3 activity in melanoma cells affects migration of immune effector cells and nitric oxidemediated antitumor effects. J Immunol, 2005. 174(7): p. 3925-31.

33. Wang, T., et al., Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nat Med, 2004. 10(1): p. 48-54.

34. Darnell, J.E., Validating Stat3 in cancer therapy. Nat Med, 2005. 11(6): p. 595-6.

35. Zhang, L., et al., Intratumoral delivery and suppression of prostate tumor growth by attenuated Salmonella enterica serovar typhimurium carrying plasmid-based small interfering RNAs. Cancer Res, 2007. 67(12): p. 5859-64.

36. Campbell, I.L., Cytokine-mediated inflammation, tumorigenesis, and disease-associated JAK/STAT/SOCS signaling circuits in the Cn S. Brain Res Brain Res Rev, 2005. 48(2): p. 166-77.

37. Harris, T.J., et al., Cutting edge: An in vivo requirement for STAT3 signaling in TH17 development and TH17-dependent autoimmunity. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4313-7.

38. Libby, P., P.M. Ridker, and A. Maseri, Inflammation and atherosclerosis. Circulation, 2002. 105(9): p. 1135-43.

39. Stephens, J.W., et al., A common functional variant in the interleuquina-6 gene is associated with increased body mass index in subjects with type 2 diabetes mellitus. Mol Genet Metab, 2004. 82(2): p. 180-6.

40. Cesari, M., et al., Inflammatory markers and onset of cardiovascular events: results from the Health ABC study. Circulation, 2003. 108(19): p. 2317-22.

41. Orshal, J.M. and R.A. Khalil, Interleuquina-6 impairs endothelium-dependent NO-cGMP-mediated relaxation and enhances contraction in systemic vessels of pregnant rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2004. 286(6): p. R1013-23.

42. Manolagas, S.C., Role of cytokines in bone resorption. Bone, 1995. 17(2 Suppl): p. 63S-67S.

43. Yaffe, K., et al., Inflammatory markers and cognition in well-functioning African-American and white elders. Neurology, 2003. 61(1): p. 76-80.

44. Watson, C.J. and W.R. Miller, Elevated levels of members of the STA T family of transcription factors in breast carcinoma nuclear extracts. Br J Cancer, 1995. 71(4): p. 840-4.

45. Song, J.I. and J.R. Grandis, STAT signaling in head and neck cancer. Oncogene, 2000. 19(21): p. 2489-95.

46. Song, L., et al., Activation of Stat3 by receptor tyrosine kinases and cytokines regulates survival in human non small cell carcinoma cells. Oncogene, 2003. 22(27): p. 4150-65.

47. Savarese, T.M., et al., Coexpression of oncostatin M and its receptors and evidence for STAT3 activation in human ovarian carcinomas. Cytokine, 2002. 17(6): p. 324-34.

48. Toyonaga, T., et al., Blockade of constitutively activated Janus kinase/signal transducer and activator of transcription-3 pathway inhibits growth of human pancreatic cancer. Cancer Lett, 2003. 201 (1): p. 107-16.

49. Corvinus, F.M., et al., Persistent STAT3 activation in colon cancer is associated with enhanced cell proliferation and tumor growth. Neoplasia, 2005. 7(6): p. 545-55.

50. Gao, B., et al., Constitutive activation of JAK-STAT3 signaling by BRCA1 in human prostate cancer cells. FEBS Lett, 2001.488(3): p. 179-84.

51. Buettner, R., L.B. Mora, and R. Jove, Activated STAT signaling in human tumors provides novel molecular targets for therapeutic intervention. Clin Cancer Res, 2002. 8(4): p. 945-54.

52. Carson, W.E., Interferon-alpha-induced activation of signal transducer and activator of transcription proteins in malignant melanoma. Clin Cancer Res, 1998. 4(9): p. 2219-28.

53. Chen, C.L., et al., Stat3 activation in human endometrial and cervical cancers. Br J Cancer, 2007. 96(4): p. 591-9.

54. Lai, R., et al., STAT3 is activated in a subset of the Ewing sarcoma family of tumours. J Pathol, 2006. 208(5): p.

624-32.

55. Punjabi, A.S., et al., Persistent activation of STAT3 by latent Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of endothelial cells. J Virol, 2007. 81(5): p. 2449-58.

56. Schaefer, L.K., et al., Constitutive activation of Stat3alpha in brain tumors: localization to tumor endothelial cells and activation by the endothelial tyrosine kinase receptor (VEGFR-2). Oncogene, 2002. 21(13): p. 2058-65.

57. Puthier, D., R. Bataille, and M. Amiot, IL-6 up-regulates mcl-1 in human myeloma cells through JAK / STAT rather than ras / Ma p kinase pathway. Eur J Immunol, 1999. 29(12): p. 3945-50.

58. Migone, T.S., et al., Constitutively activated Jak-STATpathway in T cells transformed with HTLV-I. Science, 1995.

269(5220): p. 79-81.

59. Spiekermann, K., et al., Constitutive activation of STAT transcription factors in acute myelogenous leukemia. Eur J Haematol, 2001.67(2): p. 63-71.

60. Epling-Burnette, P.K., et al., Inhibition of STAT3 signaling leads to apoptosis of leukemic large granular lymphocytes and decreased Mcl-1 expression. J Clin Invest, 2001. 107(3): p. 351-62.

61. Weber-Nordt, R.M., et al., Constitutive activation of STAT proteins in primary lymphoid and myeloid leukemia cells and in Epstein-Barr virus (EBV)-related lymphoma cell lines. Blood, 1996. 88(3): p. 809-16.

62. Sommer, V.H., et al., In vivo activation of STAT3 in cutaneous T-cell lymphoma. Evidence for an antiapoptotic function of STAT3. Leukemia, 2004. 18(7): p. 1288-95.

63. Lai, R., et al., Signal transducer and activator of transcription-3 activation contributes to high tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in anaplastic lymphoma kinase-positive anaplastic large cell lymphoma. Am J Pathol, 2004. 164(6): p. 2251-8.

64. Fu, X.Y., STAT3 in immune responses and inflammatory bowel diseases. Cell Res, 2006. 16(2): p. 214-9.

65. Feldmann, M., F.M. Brennan, and R.N. Maini, Role of cytokines in rheumatoid arthritis. Annu Rev Immunol, 1996.

14: p. 397-440.

66. Krause, A., et al., Rheumatoid arthritis synoviocyte survival is dependent on Stat3. J Immunol, 2002. 169(11): p.

6610-6.

67. Pfitzner, E., et al., The role of STATs in inflammation and inflammatory diseases. Curr Pharm Des, 2004. 10(23): p. 2839-50.

68. Lovato, P., et al., Constitutive STAT3 activation in intestinal T cells from patients with Crohn's disease. J Biol Chem, 2003. 278(19): p. 16777-81.

69. Ishihara, K. and T. Hirano, IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. Cytokine Growth Factor Rev, 2002. 13(4-5): p. 357-68.

70. Ivashkiv, L.B. and I. Tassiulas, Can SOCS make arthritis better? J Clin Invest, 2003. 111 (6): p. 795-7.

71. Sengupta, T.K., et al., Activation of monocyte effector genes and STAT family transcription factors by inflammatory synovial fluid is independent of interferon gamma. J Exp Med, 1995. 181(3): p. 1015-25.

72. Shouda, T., et al., Induction of the cytokine signal regulator SOCS3/CIS3 as a therapeutic strategy for treating inflammatory arthritis. J Clin Invest, 2001. 108(12): p. 1781 -8.

73. Harada, T., et al., Increased expression of STAT3 in SLE T cells contributes to enhanced chemokine-mediated cell migration. Autoimmunity, 2007. 40(1): p. 1-8.

74. Simeone-Penney, M.C., et al., Airway epithelial STAT3 is required for allergic inflammation in a murine model of asthma. J Immunol, 2007. 178(10): p. 6191-9.

75. Hagler, M., Smith-Norowitz, T., Chice, S., Wallner, S., Viterbo, D., Mueller, C., Groos, R., Nowakowski, M., Schulze, R., Zenilman, M., Sophorolipids decrease IgE production in U266 cells by downregulation of BSAP (Pax5), TLR-2, STAT3 and iL-6. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007. 119(S1): p. S263-S263.

76. Benkhart, E.M., et al., Role of Stat3 in lipopolysaccharide-induced IL-10 gene expression. J Immunol, 2000. 165(3): p. 1612-7.

77. Sano, S., et al., Stat3 links activated keratinocytes and immunocytes required for development of psoriasis in a novel transgenic mouse model. Nat Med, 2005. 11(1): p. 43-9.

78. Lim, C.P., et al., Stat3 contributes to keloid pathogenesis via promoting collagen production, cell proliferation and migration. Oncogene, 2006. 25(39): p. 5416-25.

79. Arany, I., et al., Correlation between pretreatment levels of interferon response genes and clinical responses to an immune response modifier (Imiquimod) in genital warts. Antimicrob Agents Chemother, 2000. 44(7): p. 1869-73.

80. Tefferi, A., Classification, diagnosis and management of myeloproliferative disorders in the JAK2V617F era. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2006: p. 240-5.

81. Roder, S., et al., STAT3 is constitutively active in some patients with Polycythemia rubra vera. Exp Hematol, 2001.

29(6): p. 694-702.

82. Kim, O.S., et al., JAK-STAT signaling mediates gangliosides-induced inflammatory responses in brain microglial cells. J Biol Chem, 2002. 277(43): p. 40594-601.

83. Wyss-Coray, T., Inflammation in Alzheimer disease: driving force, bystander or beneficial response? Nat Med, 2006. 12(9): p. 1005-15.

84. Stelmasiak, Z., et al., Interleuquina-6 concentration in serum and cerebrospinal fluid in multiple sclerosis patients. Med Sci Monit, 2000. 6(6): p. 1104-8.

85. Ponti, D., et al., Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res, 2005. 65(13): p. 5506-11.

86. Szotek, P.P., et al., Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(30): p. 11154-9.

87. Al-Hajj, M., et al., Therapeutic implications of cancer stem cells. Curr Opin Genet Dev, 2004. 14(1): p. 43-7.

88. Bleau, A.M., et al., New strategy for the analysis of phenotypic marker antigens in brain tumor-derived neurospheres in mice and humans. Neurosurg Focus, 2008. 24(3-4): p. E28.

Los siguientes parrafos numerados definen realizaciones particulares de la presente divulgacion:

1. Un metodo para inhibir una celula madre cancerosa, comprendiendo el metodo inhibir al menos cierta actividad de la ruta Stat3 en la celula madre cancerosa a traves de un inhibidor de la ruta Stat3.

2. El metodo del parrafo 1, en donde el metodo inhibe la renovacion de las celulas madre de cancer.

3. El metodo del parrafo 1, en donde el metodo mata las celulas madre de cancer.

4. El metodo del parrafo 1, en donde el metodo se lleva a cabo in vitro.

5. El metodo del parrafo 1, en donde el metodo se lleva a cabo in vivo para tratar un cancer en un sujeto.

6. El metodo del parrafo 5, en donde se sabe que el cancer tiene celulas madre de cancer y tiene actividades aberrantes de la ruta STAT3.

7. El metodo del parrafo 6 en donde se sabe que las celulas madre de cancer tienen actividades aberrantes de la ruta Stat3.

8. El metodo del parrafo 5, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, melanoma, sarcoma, cancer de higado, tumores cerebrales, mieloma multiple y leucemia.

9. El metodo del parrafo 8, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de mama, cancer cervical, carcinoma colorrectal, cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico y cancer de prostata.

10. El metodo del parrafo 5, en donde el cancer es metastasico.

11. El metodo del parrafo 5, en donde el cancer es refractario a una quimioterapia o radioterapia.

12. El metodo del parrafo 5, en donde el cancer es inherentemente resistente a la quimioterapia.

13. El metodo del parrafo 5, en donde el cancer ha causado recaida en el sujeto despues de un tratamiento inicial.

14. El metodo del parrafo 1, en donde el inhibidor de la ruta Stat3 es aislado, purificado o sintetico.

15. El metodo del parrafo 1, en donde el inhibidor de la ruta Stat3 se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la molecula Stat3 pequena, un agente de ARNi contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un inhibidor peptidomimetico de Stat3 y un inhibidor de los oligodesoxinucleotidos Stat3 del cuarteto G.

16. El metodo del parrafo 1, en donde el mecanismo de inhibicion de la inhibicion de la ruta STAT3 se selecciona del grupo que consiste en inhibir sustancialmente la fosforilacion de la proteina Stat3, inhibiendo sustancialmente la dimerizacion de la proteina Stat3, inhibiendo sustancialmente la translocacion nuclear de la proteina Stat3, inhibiendo sustancialmente la actividad de union al ADN de la proteina Stat3, y que inhibe sustancialmente las actividades de transcripcion de la proteina Stat3.

17. El metodo del parrafo 1, en donde el inhibidor de la ruta Stat3 es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1 -hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b] furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a, 4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b] furan-2-il)vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b] furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos.

18. Un metodo para inhibir la actividad de la ruta celular de Stat3 en una celula, que comprende administrar a la celula una cantidad eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos, de modo que al menos la actividad de la ruta Stat3 no deseada en la celula se reduzca.

19. El metodo del parrafo 18, en donde la celula es una celula madre de cancer.

20. El metodo del parrafo 18, en donde la celula es una celula cancerosa.

21. El metodo del parrafo 18, en donde se induce la muerte celular en la celula.

22. El metodo del parrafo 18, en donde el metodo se lleva a cabo in vitro.

23. El metodo del parrafo 18, en donde el metodo se lleva a cabo in vivo.

24. Un metodo para tratar o prevenir un trastorno asociado con una actividad aberrante de la ruta Stat3 en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietilo)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furano-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1 -(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos farmaceuticamente aceptable, tal que la actividad de la ruta Stat3 menos aberrante se reduce.

25. El metodo del parrafo 24, en donde la actividad aberrante de la ruta Stat3 se puede identificar mediante la expresion de Stat3 fosforilada o un sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3.

26. El metodo del parrafo 24, en donde el trastorno es un cancer.

27. El metodo del parrafo 26, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, melanoma, carcinomas hepatocelulares, cancer cervical, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, mieloma multiple, leucemia y linfomas.

28. El metodo del parrafo 24, en donde el trastorno se selecciona del grupo que consiste en una enfermedad autoinmune, una enfermedad inflamatoria, enfermedades inflamatorias del intestino, artritis, trastorno de desmielinizacion autoinmune, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, lesion por reperfusion isquemica y esclerosis multiple.

29. Un metodo para tratar a un paciente, comprendiendo el metodo las etapas de:

identificar a un paciente por la actividad aberrante de la ruta STAT3; y

administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2- (1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1 -(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furano ester 2-il) vinil dimetil ester del acido fosforico y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos.

30. El metodo del parrafo 29, en donde la etapa de identificar al paciente mediante una actividad aberrante de la ruta Stat3 comprende probar la expresion de Stat3 fosforilada o de un sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3.

31. El metodo del parrafo 29, en donde la etapa de identificar al paciente mediante una actividad aberrante de la ruta Stat3 comprende analizar tejido enfermo o fluido extraido del paciente.

32. El metodo del parrafo 31, en donde el tejido o fluido enfermo es parte de un tumor.

33. Un metodo para tratar a un paciente, comprendiendo el metodo las etapas de:

identificar a un paciente diagnosticado con un trastorno asociado con una actividad aberrante de la ruta STAT3; y administrar al paciente una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1 -hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1 -(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furano-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos.

34. El metodo del parrafo 33, en donde la etapa de identificar al paciente comprende probar al menos un biomarcador que indique el trastorno en el paciente.

35. Un kit que comprende:

al menos un agente para diagnosticar un trastorno asociado con una actividad aberrante de la ruta Stat3; y una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1 -hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9atetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos.

36. El kit del parrafo 35, en donde al menos un agente analiza al menos un biomarcador que indica la presencia del trastorno.

37. Un kit que comprende:

al menos un agente para diagnosticar la actividad aberrante de la ruta Stat3; y

una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1 -hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9atetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos.

38. El kit del parrafo 37, en donde al menos un agente prueba la expresion de Stat3 fosforilado o de un regulador sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3.

39. Un metodo para inhibir una celula madre cancerosa, comprendiendo el metodo administrar a una celula madre cancerosa una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b] furano-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos.

40. El metodo del parrafo 39, en donde el metodo se lleva a cabo in vitro.

41. El metodo del parrafo 39, en donde el metodo se lleva a cabo in vivo para tratar un cancer en un sujeto.

42. El metodo del parrafo 41, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, cancer de higado, cancer gastrico, melanoma, mieloma multiple, tumores cerebrales, sarcomas, meduloblastoma y leucemia.

43. El metodo del parrafo 41, en donde el cancer es metastasico.

44. El metodo del parrafo 41, en donde el cancer es refractario a una quimioterapia o radioterapia.

45. El metodo del parrafo 41, en donde el cancer es inherentemente resistente a la quimioterapia.

46. El metodo del parrafo 41, en donde el cancer ha causado recaida en el sujeto despues de un tratamiento inicial.

47. Un metodo para identificar un farmaco candidato capaz de inhibir una celula madre de cancer, comprendiendo el metodo la deteccion de un farmaco candidato que inhibe la actividad de la ruta Stat3.

48. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato es capaz de inducir la muerte celular en las celulas madre de cancer.

49. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato es capaz de inhibir la autorrenovacion de las celulas madre de cancer.

50. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato se selecciona del grupo que consiste en una molecula pequena Stat3 inhibidor, un agente de IARN contra Stat3, un agente antisentido contra Stat3, un peptidomimetico inhibidor de Stat3 y un cuarteto G inhibidor de oligodesoxinucleotidos de Stat3.

51. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato inhibe sustancialmente la fosforilacion de la proteina Stat3.

52. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato inhibe sustancialmente la dimerizacion de la proteina Stat3.

53. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato inhibe sustancialmente la translocacion nuclear de la proteina Stat3.

54. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato inhibe sustancialmente las actividades de union al ADN de la proteina Stat3.

55. El metodo del parrafo 47, en donde el farmaco candidato inhibe sustancialmente las actividades de transcripcion de la proteina Stat3.

56. Un metodo para tratar a un sujeto para cancer refractario a un tratamiento estandar, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloronafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etilnafto[2,3-b] furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)vinil] ester del acido fosforico, 1 - (4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos farmaceuticamente aceptable.

57. El metodo del parrafo 56, en donde el tratamiento estandar comprende un tratamiento seleccionado del grupo que consiste en una quimioterapia, una radioterapia y cirugia.

58. El metodo del parrafo 56, en donde el cancer es inherentemente resistente a la quimioterapia.

59. Un metodo para tratar o prevenir la recaida del cancer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9atetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable.

60. El metodo del parrafo 59, en donde la composicion farmaceutica se administra como una terapia adyuvante despues de la cirugia.

61. Un metodo para tratar o prevenir la metastasis del cancer en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9atetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il) vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos.

62. El metodo del parrafo 61, en donde la composicion farmaceutica se administra como una terapia adyuvante despues de la cirugia.

63. Un metodo para atacar selectivamente celulas cancerosas en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar a un sujeto una composicion farmaceutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]fura-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1 -(4,9-dioxo-3a,4,9,9a tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1 -(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos farmaceuticamente aceptable, de modo que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantenga por encima de una concentracion durante mas de 24 horas despues de cada dosis, matando de forma selectiva las celulas cancerosas y preservando sustancialmente las celulas normales.

64. El metodo del parrafo 63, en donde la composicion farmaceutica se administra de manera tal que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion critica por mas de una duracion seleccionada del grupo que consiste en 12, 16 y 20 horas despues de cada dosis.

65. El metodo del parrafo 63, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 100 pM.

66. El metodo del parrafo 63, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 50 pM.

67. El metodo del parrafo 63, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 30 pM.

68. El metodo del parrafo 63, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 20 pM.

69. El metodo del parrafo 63, en donde las celulas cancerosas forman parte de un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, leucemia, linfoma, cancer de esofago, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer de endometrio, cancer de tiroides, cancer de conductos biliares, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de vesicula biliar, cancer de pituitaria, cancer de recto, cancer de glandula salival y cancer de faringe.

70. El metodo del parrafo 63, en donde las celulas cancerosas forman parte de un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de mama, cancer cervical, carcinoma colorrectal, cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer gastrico y cancer de prostata.

71. El metodo del parrafo 63, en donde las celulas cancerosas forman parte de un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, leucemia, linfoma, cancer de esofago, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer de endometrio, cancer de tiroides, cancer de la via biliar, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de vesicula biliar, cancer de pituitaria, cancer de recto, cancer de glandula salival, cancer de faringe nasal, cancer de mama, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de prostata, cancer de ovario, neuroblastoma, cancer de cuello uterino, leucemia, melanoma, epitermoide oral, queratinocitos y cancer de piel.

72. Un metodo para tratar el cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una composicion farmaceutica que comprende un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furano-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1 -(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos farmaceuticamente aceptable.

73. El metodo del parrafo 72, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico, cancer renal, sarcoma, mieloma multiple, cancer de mama metastasico, leucemia, linfoma, cancer de esofago, tumor cerebral, glioma, cancer de vejiga, cancer de endometrio, cancer de tiroides, cancer de vias biliares, cancer de hueso, cancer de ojo (retinoblastoma), cancer de vesicula biliar, cancer de pituitaria, cancer de recto, cancer de glandula salival y faringe.

74. El metodo del parrafo 72, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de mama, cancer cervical, carcinoma colorrectal, cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer gastrico y cancer de prostata.

75. El metodo del parrafo 72, en donde el cancer se selecciona del grupo que consiste en cancer de higado, cancer de cabeza y cuello, cancer pancreatico, cancer gastrico y cancer de mama metastasico.

76. El metodo del parrafo 72, en donde el cancer es metastasico.

77. El metodo del parrafo 72, en donde el sujeto es un mamifero.

78. El metodo de uno cualquiera de los parrafos 56 a 77, en donde la composicion farmaceutica se administra en una dosis de aproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 5000 mg/m2 (I.V.) o de aproximadamente 1 mg/m2 a aproximadamente 50000 mg/m2 (PO).

79. El metodo de uno cualquiera de los parrafos 56 a 77, en donde la composicion farmaceutica se administra en una dosis de aproximadamente 2 mg/m2 a aproximadamente 3000 mg/m2 (I.V.) o de aproximadamente 10 mg/m2 a aproximadamente 50000 mg/m2 (PO).

80. El metodo de uno cualquiera de los parrafos 56 a 77, en donde la composicion farmaceutica se administra por via oral y no mas de cuatro veces al dia (QID).

81. El metodo de uno cualquiera de los parrafos 56 a 62, y 72 a 77, en donde la composicion farmaceutica se administra de tal manera que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion critica durante mas de 24 horas despues de cada dosis.

82. El metodo del parrafo 81, en donde la composicion farmaceutica se administra de manera tal que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantiene por encima de una concentracion critica por mas de una duracion seleccionada del grupo que consiste en 12, 16 y 20 horas despues de cada dosis.

83. El metodo del parrafo 81, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 100 pM.

84. El metodo del parrafo 81, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 50 pM.

85. El metodo del parrafo 81, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 30 pM.

86. El metodo del parrafo 81, en donde la concentracion critica es de aproximadamente 20 pM.

87. El metodo de uno cualquiera de los parrafos 56 a 77, en donde la composicion se aisla, purifica o sintetiza. 88. Una composicion farmaceutica que comprende:

un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloronafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-3a,4,9,9a-tetrahidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos; y

un excipiente, portador o diluyente farmaceuticamente aceptable.

89. La composicion farmaceutica del parrafo 88, en donde la composicion es adecuada para administracion oral, nasal, topica, rectal, vaginal o parenteral, o inyeccion intravenosa, subcutanea o intramuscular.

90. La composicion farmaceutica del parrafo 88, en donde el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable comprende un lipido para administracion intravenosa.

91. La composicion farmaceutica del parrafo 90, en donde el lipido se selecciona del grupo que consiste en fosfolipidos, fosfatidilcolinas sinteticas, fosfatidilcolinas naturales, esfingomielina, ceramidas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilgliceroles, acidos fosfatidicos, sulfato de colesterol y hapteno y lipidos conjugados con PEG.

92. La composicion farmaceutica del parrafo 90, en donde el lipido esta en una forma seleccionada del grupo que consiste en una nanoemulsion, micelas, emulsiones, suspension, nanosuspension, noisoma o liposomas.

93. La composicion farmaceutica del parrafo 88, en donde el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable esta en una forma seleccionada del grupo que consiste en emulsion micelar, suspension y suspension de nanoparticulas, y ademas comprende una proteina aceptable por via intravenosa para administracion intravenosa.

94. La composicion farmaceutica del parrafo 93, en donde la proteina aceptable por via intravenosa es albumina humana o un derivado de la misma.

95. La composicion farmaceutica del parrafo 88, en donde el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable comprende un material ceroso para administracion oral.

96. La composicion farmaceutica del parrafo 95, en donde el material cereo se selecciona del grupo que consiste en mono-, di- o tri-gliceridos, esteres de mono-, di-acidos grasos de PEG, vitamina E conjugada con PEG (vitamina E TPGs) y Gelucire.

97. La composicion farmaceutica del parrafo 96, en donde Gelucire se selecciona del grupo que consiste en Gelucire 44/14, Gelucire 43/01, Gelucire 50/02, Gelucire 50/13, Gelucire 37/02, Gelucire 33/01, Gelucire 46/07, y Gelucire 35/10.

98. La composicion farmaceutica del parrafo 88, en donde el excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en capriol, transcutol hp, labrafil M, labrasol, triacetina, pharmasolv, etanol, polivinil pirrolidina, carboximetil celulosa, Tween 20, y Tween 80.

99. La composicion farmaceutica del parrafo 88, en donde el excipiente farmaceuticamente aceptable se mezcla con un tensioactivo.

100. La composicion farmaceutica del parrafo 99, en donde el tensioactivo es Tween 80 o Tween 20.101. La composicion farmaceutica de los parrafos 99 a 100, en donde la composicion esta formulada para administracion oral.

102. Un proceso de preparacion de un compuesto de formula 4-6,

en donde R1 es H, Cl o F,

que comprende hacer reaccionar un compuesto de formula 4-4,

con una cetona en un solvente en presencia de una base y un agente oxidante.

103. El proceso del parrafo 102, en donde el agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en O², Br²y CBrCh.

104. El proceso del parrafo 102, en donde la reaccion se lleva a cabo en un recipiente al aire libre.

105. El proceso del parrafo 102, en donde la cetona es un compuesto de formula 4-3.

106. El proceso del parrafo 105, que comprende ademas las etapas de:

hacer reaccionar un compuesto de formula 4-1,

con bromuro con o sin solvente para producir un compuesto de formula 4-2,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloronafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoronafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato de los mismos farmaceuticamente aceptable, o una composicion farmaceutica que comprende dicho compuesto, para uso en: (i) un metodo para tratar a un sujeto, comprendiendo el metodo las etapas de identificar a un sujeto por actividad aberrante de la ruta de Stat3 y administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva del compuesto;

(ii) un metodo in vivo para inhibir una celula madre cancerosa para tratar el cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar a una celula madre cancerosa una cantidad eficaz del compuesto;

(iii) un metodo para tratar a un sujeto para cancer refractario a una quimioterapia y/o radioterapia, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion farmaceutica;

(iv) un metodo para tratar o prevenir la recaida del cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion farmaceutica;

(v) un metodo para tratar o prevenir la metastasis del cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion farmaceutica;

(vi) un metodo para inhibir una celula madre cancerosa para tratar el cancer en un sujeto, en donde el metodo se dirige selectivamente a las celulas cancerosas en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar a un sujeto una composicion farmaceutica, de manera que la concentracion del compuesto en el plasma del sujeto no se mantenga por encima de una concentracion critica durante mas de 24 horas despues de cada dosis, destruyendo de esa forma las celulas cancerosas de forma selectiva y al mismo tiempo protegiendo las celulas normales;

(vii) un metodo para inhibir una celula madre de cancer para tratar el cancer en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de la composicion farmaceutica.

2. El compuesto o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 1, partes (ii) a (vii) en donde el cancer: (a) se selecciona del grupo que consiste en cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de pancreas, carcinoma colorrectal, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, melanoma, carcinoma hepatocelular, cancer de cuello uterino, sarcomas, tumores cerebrales, canceres gastricos, cancer gastrointestinal, cancer de esofago, cancer de vejiga, mieloma multiple, leucemia y linfomas; y / o

(b) tiene actividad de celulas madre cancerosas y de la ruta STAT3 aberrante.

3. El compuesto o composicion farmaceutica para el uso de la reivindicacion 1(i), en donde la actividad aberrante de la ruta Stat3 se puede identificar mediante la expresion de Stat3 fosforilado o un sustituto corriente arriba o corriente abajo de la fosforilacion de Stat3.

4. El compuesto o composicion farmaceutica para uso de la reivindicacion 1, parte (ii) o (vii) en donde:

(a) el cancer es metastasico;

(b) el cancer es refractario a una quimioterapia o radioterapia;

(c) el cancer es inherentemente resistente a la quimioterapia; o

(d) el cancer ha causado recaida en el sujeto despues de un tratamiento inicial.

5. Un metodo para inhibir una celula madre cancerosa, comprendiendo el metodo administrar a una celula madre cancerosa una cantidad efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1-hidroxietil)-nafto[2,3-b] furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloronafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato farmaceuticamente aceptable de los mismos, en donde el metodo se lleva a cabo in vitro.

6. Un kit que comprende:

al menos un agente para diagnosticar un trastorno asociado con actividad aberrante de la ruta Stat3 o al menos un agente para diagnosticar actividad aberrante de la ruta Stat3; y

una cantidad terapeuticamente efectiva de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en 2-(1 -hidroxietil)-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-cloronafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetil-7-fluoro-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona, 2-etil-nafto[2,3-b]furan-4,9-diona, mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2 il)-vinil] ester del acido fosforico, 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, y una sal o solvato aceptable de los mismos.

7. Un compuesto de formula mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico o 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)vinil ester dimetil ester del acido fosforico.

8. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la reivindicacion 7 y un excipiente, vehiculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

9. Un proceso de preparacion del 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidronafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico, comprendiendo el proceso hacer reaccionar el compuesto 2-acetilnafto[2,3-b]furan-4,9-diona con una solucion seleccionada del grupo que consiste en bis(trimetilsilil) amida de litio, bis(trimetilsilil)amida de sodio y bis(trimetilsilil)amida de potasio, seguido de la adicion de una solucion de clorofosfato de dimetilo y, opcionalmente, purificar un producto crudo obtenido de la reaccion disolviendo el producto en CH₂Cl², lavandolo con NhUCl saturado y agua, secandolo sobre MgSO², y posteriormente pasando el producto a traves de cromatograf fa en columna.

10. Un proceso de preparacion del compuesto mono-[1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil] ester del acido fosforico, comprendiendo el proceso hacer reaccionar el compuesto 1-(4,9-dioxo-4,9-dihidro-nafto[2,3-b]furan-2-il)-vinil ester dimetil ester del acido fosforico con bromuro de trimetilsililo, y opcionalmente purificar un producto crudo obtenido de la reaccion por una HPLC semipreparativa.