ES2713488T3 - Un proceso para la concentración de un polipéptido - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende al menos 10 mg/ml de alfa-manosidasa, y en donde menos del 5 % de la cantidad total de la alfa-manosidasa en dicha composición está presente en la forma de agregados, abarcando dichos agregados cualquier dímero o multímero de la alfa-manosidasa.

Description

DESCRIPCION
Un proceso para la concentracion de un polipeptido
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de una composicion que comprende un polipeptido concentrado de interes como un medicamento para la inyeccion subcutanea y a una composicion que comprende al menos 10 mg/ml del polipeptido de interes.
Antecedentes de la invencion
Algunos polipeptidos son utiles como un medicamento para la prevencion y/o el tratamiento de determinadas enfermedades. La capacidad para inyectar un medicamento por via subcutanea es una ventaja que facilita a los pacientes la autoadministracion del medicamento.
Hay restricciones fisiologicas en cuanto a como de grande es el volumen posible que se puede inyectar por via subcutanea. Por lo tanto, es una ventaja para los medicamentos que se van a administrar por via subcutanea que esten disponibles en una alta concentracion para asegurar que el paciente recibe una cantidad adecuada del medicamento y(o para evitar multiples inyecciones subcutaneas.
El documento WO 99/37325 desvela metodos de tratamiento y de prevencion de la enfermedad provocados por la ausencia o la deficiencia de la actividad de enzimas que pertenecen a la via biosintetica del grupo hemo. El documento WO 03/002731 desvela un proceso para la purificacion de una porfobilinogeno desaminasa recombinante a escala industrial y al uso del producto purificado para la preparacion de un medicamento. De forma similar, los documentos WO 02/099092 y WO 2005/094874 proporcionan alfa-manosidasa lisosomica y usos terapeuticos de las mismas. Por ultimo, el documento WO 2005/073367 proporciona un procedimiento para la purificacion de arilosulfatasa A y el uso de la enzima en el tratamiento de leucodistrofia metacromatica.
El documento WO 02/099092 desvela una celula capaz de producir alfa-manosidasa lisosomica humana recombinante (rh-LAMAN, del ingles recombinant human lysosomal alpha-mannosidase), comprendiendo dicha celula un fragmento EcoRI-Xbal de 3066 pares de bases de un ADNc humano que codifica la protema LAMAN en la que la posicion se corresponde con la posicion 186 de la protema hLAMAN de longitud completa es acido aspartico (Asp, D). Asimismo, el documento WO 02/099092 desvela un metodo para la preparacion de LAMAN humana recombinante asf como la LAMAN humana recombinante producida mediante este metodo.
El documento WO 2005/094874 desvela un metodo de reduccion de los niveles intracelulares de oligosacaridos neutros ricos en manosa en celulas dentro de una o mas regiones del sistema nervioso central de un sujeto, comprendiendo dicho metodo la administracion a dicho sujeto de una formulacion de alfa-manosidasa lisosomica, que no comprende un componente con una capacidad conocida para dirigir el sistema nervioso central.
El documento WO 03/029403 desvela un metodo de tratamiento de un sujeto que padece un trastorno de almacenamiento lisosomico que no sea la enfermedad de Fabry provocado por una deficiencia de una protema espedfica que comprende: (a) producir dicha protema o un fragmento activo de la misma en un cultivo de celulas de insecto, y (b) administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de dicha protema a dicho sujeto. Tambien el documento WO 03/029403 desvela una composicion farmaceutica que comprende una protema util para el tratamiento de un trastorno de almacenamiento lisosomico que no sea la enfermedad de Dabry que se importa de manera selectiva a los macrofagos cuando se administra a un sujeto y un vehmulo farmaceuticamente aceptable, en donde dicha protema se produce en un cultivo celular de insecto.
La presente invencion se refiere al uso de una composicion que comprende un polipeptido concentrado de interes para la fabricacion de un medicamento para inyeccion subcutanea en un mairnfero.
Sumario de la invencion
Otro aspecto de la presente invencion se refiere a una composicion que comprende al menos 10 mg/ml de alfamanosidasa, y en donde menos del 5 % de la cantidad total de la alfa-manosidasa en dicha composicion esta presente en la forma de agregados, abarcando dichos agregados cualquier dfmero o multimero de la alfa-manosidasa.
En otro aspecto mas, la presente invencion se refiere al uso de una composicion que comprende 50-300 mg/ml de alfa-manosidasa para la fabricacion de un medicamento para inyeccion subcutanea en un mam^era. En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso una composicion que comprende 50-300 mg/ml de alfa-manosidasa como medicamento, y en donde la composicion es para inyeccion subcutanea en un mam^era.
DEFINICIONES
Para los fines de la presente invencion, las alineaciones de secuencias y el calculo de las puntuaciones de homolog^a se pueden hacer usando una alineacion completa de Smith-Waterman, util para alineacion de protemas y de ADN. Las matrices de puntuacion por defecto BLOSUM50 y la matriz de identidad se usan para las alineaciones de protema y de ADN, respectivamente. La penalizacion para el primer resto en un hueco es - l2 para las protemas y - l6 para el ADN, mientras que la penalizacion para restos adicionales en un hueco es -2 para las protemas y -4 para el ADN. La alineacion se puede hacer con el paquete FASTA version v20u6 (W. R. Pearson y D. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", pNAS 85:2444-2448, y W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with Fa STP and Fa STA", Methods in Enzymology, 183:63-98).
Se pueden hacer alineaciones multiples de secuencias proteicas usando "ClustalW" (Thompson, J. D., Higgins, D. G. y Gibson, TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673­ 4680). Las alineaciones multiples de secuencias de ADN se pueden hacer usando la alineacion de la protema como un molde, sustituyendo los aminoacidos con el correspondiente codon de la secuencia de ADN.
En el contexto de la presente invencion, el termino "C. E." (Clase Enzimatica) se refiere al sistema de clasificacion de enzimas reconocido a nivel internacional, de Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes, Academic Press, Inc.
El termino "origen" usado en el contexto de las secuencias de aminoacidos, por ejemplo, secuencias de protemas o de acidos nucleicos, se debe entender que se refiere al organismo del que procede. Dicha secuencia se puede expresar por otro organismo usando los metodos de tecnologfa genetica bien conocidos por el experto en la materia. Esto tambien abarca secuencias que se han sintetizado qmmicamente. Ademas, dichas secuencias pueden comprender pequenos cambios tales como la optimizacion por codon, es decir, cambios en las secuencias de acidos nucleicos que no afectan a la secuencia de aminoacidos.
Descripcion detallada de la invencion
Polipeptido de interes
El polipeptido de la presente invencion puede ser en particular una hormona o una variante de hormona, una enzima, un receptor o porcion del mismo, un anticuerpo o porcion del mismo, un alergeno o un reportero. El polipeptido de interes puede ser en particular una enzima seleccionada de uno de seis grupos principales, tal como una oxidorreductasa (C.E. 1), una transferasa (C.E. 2), una hidrolasa (C.E. 3), una liasa (C.E. 4), una isomerasa (C.E. 5), o una ligasa (C.E. 6). En un aspecto mas particular, el polipeptido de interes puede ser una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, celobiohidrolasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolftica, peroxidasa, fosfolipasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolttica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa o beta-xilosidasa.
El polipeptido de interes puede ser en particular un polipeptido que es util como un medicamento.
Los ejemplos de un polipeptido adecuado de interes incluyen pero sin limitacion uno seleccionado del grupo que consiste en una porfobilinogeno desaminasa, una arilo sulfatasa, una alfa-manosidasa y una galactocerebrosidasa.
En principio, un polipeptido de interes que proviene de cualquier origen se puede tratar de acuerdo con los metodos de la presente divulgacion.
En una realizacion particular, el polipeptido de interes puede ser de origen humano. Especialmente en el ambito del uso de un polipeptido de interes para la fabricacion de un medicamento que se va a administrar a seres humanos, el polipeptido puede ser de origen humano, ya que esto puede minimizar el riesgo de reacciones alergicas indeseadas. Las variaciones naturales del polipeptido humano debido a, por ejemplo, el polimorfismo estan incluidas en la expresion "origen humano" en el ambito de la presente invencion.
El polipeptido de interes se puede producir en particular como una protema recombinante, es decir, una secuencia de nucleotidos que codifica el polipeptido de interes se puede introducir en una celula para la expresion del polipeptido de interes. La expresion recombinante puede ser homologa o heterologa, es decir, el polipeptido de interes se pueden expresar en la celula que lo expresa de forma natural (expresion homologa) o se puede expresar en una celula que no lo expresa de forma natural (expresion heterologa).
El polipeptido recombinante de interes se puede expresar por cualquier celula adecuada para la produccion recombinante del polipeptido particular de interes. Los ejemplos de celulas adecuadas incluyen pero no se limitan a celulas procariotas, tales como una celula E. coli o una celula de Bacillus. Los ejemplos de celulas eucariotas adecuadas incluyen pero no se limitan a una celula de levadura o a una celula de mairftfero tal como una celula de ovario de hamster chino (CHO). Como alternativa, puede ser una celula humana.
Las celulas hospedadoras adecuadas para la expresion de polipeptidos glucosilados provienen de organismos multicelulares. Los ejemplos de celulas de invertebrados incluyen celulas vegetales y de insecto. Sin embargo, la celula hospedadora tambien puede ser una celula de vertebrado, y la propagacion de las celulas de vertebrado en cultivo (cultivo tisular) ha llegado a ser un procedimiento habitual. La expresion "polipeptido recombinante" o "polipeptido recombinante de interes" indica en el presente documento un polipeptido producido de manera recombinante.
La referencia a un polipeptido particular de interes incluye en el ambito de la presente invencion tambien las partes o analogos funcionalmente equivalentes del polipeptido de interes. Por ejemplo, si el polipeptido de interes es una enzima, una parte funcionalmente equivalente de la enzima podna ser un dominio o subsecuencia de la enzima que incluye el sitio catalftico necesario para permitir que el dominio o la subsecuencia ejerza la misma actividad enzimatica que la enzima de longitud completa o, como alternativa, un gen que codifica el catalizador. La expresion "sustancialmente la misma actividad enzimatica" se refiere a una parte equivalente o analogo que tiene al menos un 50 %, preferentemente al menos un 60 %, mas preferentemente al menos el 70 %, mas preferentemente al menos el 75 %, mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el 90 %, mas preferentemente, al menos en un 95 % y lo mas preferentemente, al menos en un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de la actividad enzimatica de la enzima natural. Un ejemplo de un analogo enzimaticamente equivalente de la enzima podna ser una protema de fusion que incluye el sitio catalftico de la enzima en una forma funcional, pero tambien puede ser una variante homologa de la enzima procedente de otra especie. Asimismo, las moleculas completamente sinteticas que imitan la actividad enzimatica espedfica de la enzima relevante tambien podnan constituir los "analogos enzimaticamente equivalentes".
En general, el experto en la materia sera facilmente capaz de disenar ensayos adecuados para la determinacion de la actividad enzimatica. Para PBGD, sin embargo, se describe un ensayo adecuado en el documento WO 03/002731, en el ejemplo 2, asf como en las secciones experimentales de las presentes solicitudes. La arilo sulfatasa, ademas de sus sustratos naturales, tambien es capaz de catalizar la hidrolisis del sustrato cromogenico sintetico, para-Nitrocatecol sulfato (pNCS). El producto, para-Nitrocatecol (pNC), absorbe luz a 515 nm. Un ensayo para la determinacion de la actividad arilo sulfatasa se describe en detalle en el documento WO 2005/073367 y en Fluharty et al. 1978, Meth. Enzymol. 50:537-47. Para LAMAN, se desvela un ensayo de actividad enzimatica adecuado en el documento WO 02/099092.
Porfobilinogeno desaminasa
En una realizacion, el polipeptido de interes de la divulgacion puede ser porfobilinogeno desaminasa, (tambien conocido como porfobilinogeno amomaco-liasa (polimerizante)), C.E. 4.3.I.8. (Waldenstrom 1937, J. Acta.Med. Scand. Supl.8). La porfobilinogeno desaminasa es la tercera enzima en la via biosintetica del grupo hemo. Se ha transferido la C.E. 4.3.1.8 a la C.E. 2.5.1.61, de manera que la porfobilinogeno desaminasa (PBGD) esta ahora colocada dentro de este numero de C.E.
La porfobilinogeno desaminasa cataliza la reaccion de 4 porfobilinogeno H2O = hidroximetilbilano 4 NH3.
La PBDG es importante en relacion con la porfiria aguda intermitente (PAI), que es un trastorno autosomico dominante en el ser humano provocado por un defecto (reduccion del 50 % de la actividad) de la PBDG (vease el documento WO01/07065 para mas detalles en relacion con esto).
La porfobilinogeno desaminasa se conoce de forma abreviada como PBGD, y en el contexto de la presente divulgacion, estos dos terminos se pueden usar de manera intercambiable entre sf.
Para la expresion recombinante de PBGD, una celula hospedadora puede ser en particular una celula de levadura o una celula E. coli.
Para un ejemplo detallado de la construccion de una celula E. coli, se hace referencia al ejemplo 1 del documento WO01/07065 y para la construccion de celulas HeLa recombinantes y celulas NIH 3T3 capaces de expresar PBGD de raton se hace referencia al ejemplo 6 del documento WO01/07065.
La expresion "porfobilinogeno desaminasa recombinante (rPBGD)" indica en el presente documento una PBGD producida de manera recombinante. En lo sucesivo, esta enzima y la forma humana recombinante se citaran como "PBGD" y "rhPBGD", respectivamente. Dentro de este termino tambien se incluye una parte o analogo enzimaticamente equivalente de la PBGD. Un ejemplo de una parte enzimaticamente equivalente de la enzima podna ser un dominio o subsecuencia de la enzima que incluye el sitio catalftico necesario para permitir que el dominio o la subsecuencia ejerza la misma actividad enzimatica que la enzima de longitud completa o, como alternativa, un gen que codifica el catalizador. La expresion "sustancialmente la misma actividad enzimatica" se refiere a una parte equivalente o analogo enzimatico que tiene al menos un 50 %, preferentemente al menos un 60 %, mas preferentemente al menos el 70 %, mas preferentemente al menos el 75 %, mas preferentemente al menos el 80 %, mas preferentemente al menos el 85 %, mas preferentemente al menos el 90 %, mas preferentemente, al menos en un 95 % y lo mas preferentemente, al menos en un 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 % de la actividad de la rhPBGD humana natural medida en el ensayo de actividad de rhPBGD descrito en el ejemplo 2 del documento WO 03/002731. Un ejemplo de un analogo enzimaticamente equivalente de la enzima podna ser una protema de fusion que incluye el sitio catalftico de la enzima en una forma funcional, pero tambien puede ser una variante homologa de la enzima procedente de otra especie. Asimismo, las moleculas completamente sinteticas que imitan la actividad enzimatica espedfica de la enzima relevante tambien podnan constituir los "analogos enzimaticamente equivalentes".
Un ejemplo de PBGD que se puede usar en la presente divulgacion incluye cualquiera de los mostrados en las Secuencias 1-10 de la presente solicitud, o en los numeros de Genebank X04217, X04808 o M95623.
Arilo sulfatasa
En otra realizacion de la presente divulgacion, el polipeptido de interes puede ser una arilosulfatasa A.
La arilosulfatasa A cataliza la reaccion de un cerebrosido 3-sulfato H2O = un cerebrosido sulfato.
Se ha purificado ASA a partir de una variedad de fuentes que incluyen el hngado humano, la placenta y la orina. Es una glucoprotema acida con un punto isoelectrico bajo. Por encima de pH 6,5, la enzima existe como un dfmero con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. La ASA se somete a una polimerizacion dependiente del pH formando un octamero a pH 4,5. En la orina humana, la enzima consiste en dos subunidades no identicas de 63 y 54 kDa. La ASA purificada a partir del hngado humano, de la placenta y de los fibroblastos tambien consiste en dos subunidades ligeramente diferentes que vanan entre 55 y 64 kDa. Como en el caso de otras enzimas lisosomicas, la ASA se sintetiza en los ribosomas unidos a la membrana como un precursor glucosilado. Despues pasa a traves del retmulo endoplasmatico y del Golgi, en donde se procesan sus oligosacaridos N-ligados con la formacion de oligosacaridos fosforilados y sulfatados de tipo complejo (Waheed A et al. Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53-61, Braulke T et al. Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178-185). En fibroblastos normales cultivados, se produce un polipeptido precursor de 62 kDa, que se transloca a traves de la union del receptor de manosa-6-fosfato (Braulke T et al. J Biol Chem. 1990, 265, 6650-6655) a un endosoma prelisosomico acido (Kelly BM et al. Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71-78).
La arilosulfatasa A puede ser en particular de origen humano. La longitud (18 aminoacidos) del peptido senal de ASA humana se basa en la secuencia consenso y en un sitio de procesamiento espedfico para una secuencia senal. Por lo tanto, del ADNc de ASA humana deducido (numeros de registro de EMBL Genbank J04593 y X521151) la escision del peptido senal se debena de hacer en todas las celulas despues del resto numero 18 (Ala), dando como resultado la forma madura de la ASA humana. En lo sucesivo, la arilosulfatasa A recombinante se abreviara rASA, la forma madura de arilosulfatasa A que incluye la forma madura de ASA humana se citara como "mASA" y la ASA madura recombinante humana se citara como "mrhASA".
Se ha identificado una modificacion proteica en dos sulfatasas eucarioticas (ASA y arilosulfatasa B (ASB)) y para una del alga verde Volvox carteri (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278, Selmer T et al. Eur J Biochem. 1996, 238, 341­ 345). Esta modificacion lleva a la conversion de un resto de cistema, que se conserva entre las sulfatasas conocidas, en un resto de acido 2-amino-3-oxopropionico (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278). El nuevo derivado de aminoacido tambien se reconoce como C*-formilglicina (FGly). En ASA y ASB derivados de celulas MSD, se conserva el resto Cys-69. En consecuencia, se propone que la conversion de Cys-69 a FGly-69 se requiere para generar ASA y ASB cataltticamente activas, y que la deficiencia de esta modificacion proteica es la causa de MSD. Cys-69 se refiere al precursor de ASA que tiene un peptido senal de 18 restos. En la mASA, el resto de cistema mencionado es Cys-51. Las investigaciones posteriores han demostrado que una secuencia lineal de 16 restos que rodea la Cys-51 en la mASA es suficiente como para dirigir la conversion y que la modificacion de la protema tiene lugar despues o en una etapa tardfa de la translocacion cotraduccional de la protema en el retmulo endoplasmatico cuando el polipeptido aun no se ha plegado en su estructura natural (Dierks T et al. Proc Natl Acad Sci. 1997, 94, 11963-1196, Wittke, D. et al. (2004), Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261-271).
Se han demostrado multiples formas de ASA en electroforesis e isoelectroenfoque de preparaciones enzimaticas de orina humana, leucocitos, plaquetas, fibroblastos cultivados e tngado. El tratamiento con endoglucosidasa H, sialidasa y fosfatasa alcalina reduce el tamano molecular y la complejidad del patron electroforetico, lo que sugiere que mucha de la heterogeneidad de la carga de la ASA se debe a variaciones en el contenido en carbohidratos de la enzima.
La arilosulfatasa A puede ser en particular una forma de arilosulfatasa A, que es capaz de atravesar la barrera hematoencefalica y/o una forma de rASA, que posee marcadores espedficos para entrar en las celulas diana en el cerebro. En particular, puede ser una rASA, que se endocita de manera eficaz in vivo a traves de la via de la manosa-6-fosfato.
Por lo tanto, la ASA puede estar en particular unida de manera covalente al denominado marcador, a los peptidos o protemas como vehnculos o toxinas como vehnculos que son capaces de aumentar y/o facilitar el transporte de ASA sobre la barrera hematoencefalica y/o a traves de las membranas celulares en general (Schwarze et al., Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290-295; Lindgren et al., Trends Pharmacol. Sci. 2000; 21(3): 99-103). Se puede producir una molecula de ASA que contiene tales secuencias peptidicas mediante tecnicas de expresion. El proceso de transduccion de protema no es espedfico del tipo celular, y el mecanismo mediante el cual tiene lugar no esta del todo claro, sin embargo, se cree que tiene lugar por algun tipo de alteracion y penetracion de la membrana que es independiente del receptor. Un estado de la molecula parcialmente no plegada puede facilitar el proceso pero no es esencial.
Un ejemplo de un marcador adecuado incluye pero no se limita al marcador de manosa-6-fosfato.
Los ejemplos de los peptidos o protemas como vehmulos incluyen pero no se limitan a los denominados dominios de transduccion de protema. Los ejemplos de dominios de transduccion de protema adecuados incluyen pero no se limitan a los mencionados en el documento WO 2005/073367. Por lo tanto, el dominio de transduccion de protema puede ser el peptido basico de 11 restos de la protema TAT del VIH -YGRKKRRQRRR (Schwarze et al., Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290-295), una version sintetica de TAT -YARAAARQARA que confiere mas helicidad en alfa y naturaleza anfipatica a la secuencia (Ho et al., Cancer Res. 2001; 61(2):474-477), un peptido lfder sintetico compuesto de poli -R o una mezcla de restos -R y -K basicos en combinacion con otros aminoacidos y peptidos basado en restos de secuencia senal hidrofoba de integrina beta-3 o FGF de sarcoma de Kaposi (Dunican et al. Biopolymers 2001; 60(1): 45-60).
Los ejemplos de toxinas adecuadas como vehmulos incluyen pero no se limitan a las descritas en el documento WO 2005/073367.
La ASA puede comprender en particular una secuencia de acido nucleico, que codifica:
(a) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 2 en el documento WO 2005/073367;
(b) una parte de la secuencia en (a), que es enzimaticamente equivalente a una arilosulfatasa A recombinante humana
(c) un analogo de secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 75 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y al mismo tiempo comprende una secuencia de aminoacidos, que es enzimaticamente equivalente a la arilosulfatasa A recombinante humana.
En el presente contexto, una secuencia de aminoacidos o una porcion de una secuencia de aminoacidos que es un polipeptido capaz de hidrolizar una cantidad del sustrato pNCS de arilosulfatasa A a 37 °C a una tasa que se corresponde con una actividad espedfica de al menos 20 U/mg de polipeptido (preferentemente 50 U/mg de polipeptido) cuando se determina en un ensayo para medir la actividad de la arilosulfatasa A tal como se describe en el ejemplo 1 del documento WO 2005/073367, y/o un polipeptido, que es capaz de hidrolizar al menos el 40 % de sustrato marcado de arilosulfatasa A, fx. palmitoil sulfato de 14c , cargado en fibroblastos de LDM, cuando se ensaya por incubacion a un nivel de dosis de 25 mU/ml en un ensayo tal como se describe en el ejemplo 2 del documento WO 2005/073367.
La ASA puede comprender en particular en otra realizacion:
(a) la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 1 en el documento WO 2005/073367
(b) una parte de la secuencia en (a), que codifica una secuencia de aminoacidos, que es enzimaticamente equivalente a una arilosulfatasa A recombinante humana
(c) un analogo de secuencia de acidos nucleicos que tiene al menos el 75 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y al mismo tiempo codifica una secuencia de aminoacidos, que es enzimaticamente equivalente a una arilosulfatasa A recombinante humana
Se puede preferir que el grado de identidad de secuencia entre la secuencia de acidos nucleicos mencionada anteriormente y la SEQ ID NO: 1 del documento WO 2005/073367 sea al menos el 80 %, tal como al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %. Igualmente se puede preferir que el grado de identidad de secuencia entre la secuencia de aminoacidos codificada por la secuencia de acidos nucleicos mencionada anteriormente y la SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/073367 sea al menos el 80 %, tal como al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %.
Para el fin de la presente divulgacion se prefiere que la arilosulfatasa A sea una enzima recombinante, en particular, se prefiere una arilosulfatasa A recombinante humana (rhASA).
Se prefiere que la rASA se produzca en una celula o lmea celular de mairnfero y que dicha celula o lmea celular de mairnfero produzca una glucoforma de rASA, que se endocita de manera eficaz in vivo a traves de la via del receptor de manosa-6-fosfato. Espedficamente, la glucoforma preferida de rASA comprende una cantidad de manosa-6-fosfato expuesta, que permite la endocitosis eficaz de rASA in vivo a traves de la via de manosa-6-fosfato.
En una realizacion particular, al menos una de las glucoformas de rASA producidas es similar a una glucoforma producida en las celulas CHO.
La modificacion postraduccional del resto de cistema en la posicion 51 en la arilosulfatasa A madura humana es relevante para la actividad de la enzima. En consecuencia, en una realizacion preferida de la presente divulgacion, la produccion de la arilosulfatasa A o su equivalente tiene lugar a una tasa y en unas condiciones, que dan como resultado un producto que comprende una isoforma de la enzima en la que el aminoacido que se corresponde con Cys-69 en la SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/073367 se convierte a formilglicina, que se corresponde con Fgly-51 en la SEQ ID NO: 3 del documento WO 2005/073367. La SEQ ID NO:4 del documento WO 2005/073367 representa la arilosulfatasa A madura humana despues de la escision del peptido senal de 18 aminoacidos pero antes de la modificacion de C-51.
Por lo tanto, en otra realizacion de la presente divulgacion, la ASA o su equivalente enzimatico se pueden seleccionar del grupo que consiste en
(a) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:3 del documento WO 2005/073367;
(b) una parte de la secuencia en (a), que es enzimaticamente equivalente a una arilosulfatasa A recombinante humana
(c) un analogo de secuencia de aminoacidos que tiene al menos el 75 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y al mismo tiempo es enzimaticamente equivalente a la arilosulfatasa A recombinante humana.
Se puede preferir que el grado de identidad de secuencia entre la enzima producida de acuerdo con la divulgacion y la SEQ ID NO: 3 del documento WO 2005/073367 o la SEQ ID NO: 4 del documento 2005/073367 es al menos el 80 %, tal como al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 97 %, al menos el 98 % o al menos el 99 %.
Para que la actividad biologica y los efectos de la enzima in vivo requieran ser optimos, es una ventaja si una cantidad adecuada de la enzima ha adquirido un patron de glucosilacion tal como se describio anteriormente y se ha modificado de manera postraduccional en la posicion 51. Por lo tanto, al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 98 % de la ASA de la presente divulgacion puede estar en la glucoforma/isoforma descrita anteriormente.
La ASA de la presente divulgacion puede, en terminos de su estructura, ser diferente de la rASA de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 del documento 2005/073367. Puede ser una ventaja que la secuencia de restos de aminoacidos que rodean al Cys-51 sea identica o tenga un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente en la SEQ ID NO: 3. Por lo tanto, se puede preferir que una secuencia lineal de 20 aminoacidos, tal como 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 restos de aminoacidos que rodean al Cys-51 en la arilosulfatasa A sea identica o al menos el 90 % identica, tal como un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia correspondiente en la SEQ ID NO: 3 del documento 2005/073367. Como la forma activa de rASA en los lisosomas es un octamero, la ASA de la presente divulgacion puede ser en particular una rASA que es un octamero o que se ensambla en un octamero en condiciones fisiologicas.
La actividad enzimatica de ASA, que se entiende como la actividad catalftica de la rASA, se puede medir en un ensayo enzimatico basado en la hidrolisis mediada por rASA de un sustrato detectable o un sustrato, que lleva a un producto final detectable. En un aspecto preferido, el ensayo se basa en la hidrolisis del sustrato cromogenico sintetico, para-Nitrocatecol sulfato (pNCS) que tiene un producto final, para-Nitrocatecol (pNC) que absorbe luz a 515 nm.
Alfa-manosidasa lisosomica
En otra realizacion mas, el polipeptido de interes puede ser una alfa-manosidasa lisosomica (LAMAN). La alfamanosidasa lisosomica pertenece a la CE 3.2.1.24 y es una exoglucosidasa que hidroliza los restos terminales no reductores de alfa-D-manosa en alfa-D-manosidos del extremo no reductor durante la degradacion ordenada de las glucoprotemas N-ligadas (Aronson y Kuranda FASEB J 3:2615-2622. 1989). En el contexto de la presente invencion, la alfa-manosidasa lisosomica se puede usar de forma intercambiable con el termino acortado LAMAN.
La LAMAN de la presente invencion puede ser en particular de origen humano. La enzima humana se sintetiza como un solo polipeptido de 1011 aminoacidos con un posible peptido senal de 49 restos que se procesa en tres glucopeptidos principales de 15, 42 y 70 kD (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997).
El gen que codifica LAMAN (MANB) esta ubicado en el cromosoma 19 (19cen-q12), (Kaneda et al. Chromosoma 95:8­ 12. 1987). MANB consta de 24 exones, que abarcan 21,5 kb (numeros de referencia de GenBank U60885-U60899; Riise et al. Genomics 42:200-207. 1997). El transcrito de LAm An tiene » 3.500 nucleotidos (nt) contiene un marco de lectura abierta que codifica 1.011 aminoacidos (GenBank U60266.1).
La clonacion y secuenciacion del ADNc humano que codifica LAMAN se ha publicado en tres artfculos (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997; Liao et al. J.Biol.Chem. 271,28348-28358. 1996; Nebes et al.
Biochem.Biophys.Res.Commun. 200, 239-245. 1994). Curiosamente, las tres secuencias no son identicas. Cuando se compara con la secuencia de Nilssen et al (n.° de registro U60266.1), se descubrio un cambio de TA a AT en las posiciones 1670 y 1671 que da como resultado la sustitucion de valina a acido aspartico por Liao et al. y Nebes et al.
En una realizacion mas preferida, la alfa-manosidasa lisosomica comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO.: 1 del documento WO 2005/094874.
Por razones practicas y economicas se prefiere que la LAMAN de la presente invencion se produzca de manera recombinante. Mediante la produccion recombinante tambien puede ser posible obtener una preparacion de la enzima en donde una gran parte contiene manosa-6-fosfato. La produccion recombinante se puede lograr tras la transfeccion de una celula usando una secuencia de acido nucleico que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 del documento WO 2005/094874.
La alfa-manosidasa preferentemente se genera en un sistema de celula de mairnfero, ya que esto dara como resultado un perfil de glucosilacion, que asegura una absorcion eficaz mediada por receptor en celulas de por ejemplo organos viscerales del cuerpo. En particular, se ha descubierto que la produccion de la enzima en celulas CHO, COS o BHK asegura una adecuada modificacion postraduccional de la enzima mediante la adicion de restos de manosa-6-fosfato. Ademas, se obtiene un correcto perfil de sialilacion. Se sabe que la correcta sialilacion es importante con el fin de evitar la absorcion por el tngado, debido a los restos de galactosa expuestos.
En realizaciones incluso mas preferidas, el sistema de celula de m ai^ero, por lo tanto, se selecciona del grupo que comprende celulas CHO, celulas COS o celulas BHK (Stein et al. J Biol Chem.1989, 264, 1252-1259). Se puede preferir ademas que el sistema de celula de m a i^e ro sea una lmea celular de fibroblastos humanos.
En una realizacion mas preferida, el sistema de celulas de marnffero es una lmea de celulas CHO.
En otra realizacion, la alfa-manosidasa lisosomica puede ser una preparacion de alfa-manosidasa lisosomica en donde una fraccion de dicha preparacion consiste en alfa manosidasa lisosomica que tiene uno o mas oligosacaridos N-ligados que llevan grupos de manosa 6-fosfato.
Se prefiere ademas que una fraccion de una preparacion de dicha alfa-manosidasa lisosomica sea capaz de unirse a los receptores de manosa 6-fosfato.
La capacidad de la enzima para unirse a los receptores de manosa-6-fosfato se puede determinar en un ensayo in vitro tal como se describe en el ejemplo 1 del documento WO 2005/094874. En este caso, la union de la enzima a una matriz de afinidad MPR 300 proporciona una medida de su capacidad para unirse a los receptores de manosa-6-fosfato. En una realizacion preferida de la invencion, la union de la enzima a los receptores de manosa-6-fosfato tiene lugar in vitro.
En realizaciones mas preferidas de la invencion, esta fraccion se corresponde con del 1 al 75 % de la actividad de una preparacion de alfa-manosidasa lisosomica, tal como del 2 al 70 %, tal como del 5 al 60 %, tal como del 10 al 50 %, tal como del 15 al 45 %, tal como del 20 al 40 %, tal como del 30 al 35 %.
En consecuencia, se prefiere que la alfa-manosidasa lisosomica tiene un contenido de restos de manosa 6-fosfato que permite la union dependiente de manosa 6-fosfato del 2 al 100 %, del 5 al 95 %, del 10 al 90 %, del 20 al 80 %, del 30 al 70 % o del 40 al 60 % de la cantidad de enzima a una matriz de receptor de Man-6-P. Actualmente, se ha analizado el grado de fosforilacion en varios lotes de enzima y, normalmente, del 30 al 45 % de la enzima se fosforila y se une a la matriz de afinidad.
Se prefiere ademas que una fraccion que constituye el 2 - 100 %, 5 - 90 %, 10 - 80 %, 20 - 75 %, 30 - 70 %, 35 - 65 % o 40 - 60 % de la cantidad de dicha alfa-manosidasa lisosomica se une al receptor de Man-6-P con alta afinidad. Teoricamente, se deben colocar dos grupos manosa 6-fosfato cercanos entre sf con el fin de que la enzima se una al receptor de Man-6-P con alta afinidad. Las ultimas observaciones sugieren que la distancia entre los restos de manosa fosforilados debe ser de 40 A o menos con el fin de obtener la union de alta afinidad. En la alfa-manosidasa lisosomica humana de acuerdo con la SEQ ID NO:1 del documento WO 2005/094874, los dos restos de manosa 6-fosfato se pueden colocar en los restos de asparaginas en las posiciones 367 y 766. En consecuencia, se prefiere que el medicamento de acuerdo con la presente invencion comprenda alfa-manosidasa lisosomica, una parte de la cual lleva grupos de manosa 6-fosfato en ambos restos de asparagina.
Preferentemente, la alfa-manosidasa se crea por tecnicas recombinantes. En una realizacion adicional, la alfamanosidasa es de origen humano (hLAMAN) y aun mas preferido, una alfa-manosidasa madura humana (mhLAMAN) o un fragmento de la misma. El fragmento se puede modificar, sin embargo, los sitios activos de la enzima se debenan conservar.
Debe esperarse que, en preparaciones de alfa-manosidasa de acuerdo con la presente invencion, una fraccion de la enzima se representa por su forma precursora, mientras que otras fracciones representan las formas proteoltticamente procesadas de aproximadamente 55 y 70 kDa.
Galactocerebrosidasa
En otra realizacion, el polipeptido de interes puede ser una galactocerebrosidasa, que se puede acortar a GALC. La galactocerebrosidasa pertenece a la C.E. 3.1.6.46 y son enzimas capaces de catalizar la reaccion de D-galactosil-N-acilesfingosina H2O = D-galactosa N-acilesfingosina, por lo tanto, GALC cataliza la degradacion de galactolfpidos en, por ejemplo, mielina.
La enzima GALC que proviene de humanos es una enzima lisosomica glucosilada que comprende 643 aminoacidos y con un peso molecular de 72,8 kDa. La GALC de la presente divulgacion puede ser en particular de origen humano. En una realizacion adicional, la GALC se puede expresar de manera recombinante en una de las celulas hospedadoras mencionadas anteriormente. La celula hospedadora para la expresion recombinante de GALC puede ser en particular una celula CHO.
En la descripcion y en las reivindicaciones se hace referencia a las siguientes secuencias de aminoacidos y de acidos nucleicos:
Figure imgf000009_0001
Con referencia a estas secuencias, el polipeptido de interes, de acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia de aminoacidos tal como se define por la SEQ ID NO.: 21;
ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i); y
iii) un analogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii), siendo la secuencia de aminoacidos de dicho analogo al menos el 75 % identica a una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii).
En realizaciones particulares, el analogo en iii) es al menos el 80 % identicos a una secuencia tal como se define en i) o ii), tal como al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o tal como al menos el 99,5 % identica a una secuencia tal como se define en i) o ii).
Ademas, el polipeptido de interes se puede obtener mediante expresion recombinante usando una secuencia de acido nucleico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
i) una secuencia de acidos nucleicos tal como se define mediante cualquiera de las SEQ ID NO.: 22;
ii) una secuencia de acido nucleico que es al menos el 75 % identica a una secuencia de acido nucleico tal como se define en i).
Para la produccion recombinante del polipeptido se puede preferir ademas que la secuencia de acido nucleico en ii) sea al menos el 80 % identica a una secuencia tal como se define en i), tal como al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o tal como al menos el 99,5 % identica a una secuencia tal como se define en i).
Composicion que comprende un polipeptido de interes
La siguiente descripcion de una composicion que comprende un polipeptido de interes se refiere tanto a una composicion que comprende un polipeptido que se concentra de acuerdo con un metodo de la presente divulgacion y tambien se refiere a una composicion de la presente invencion que comprende al menos 10 mg/ml de polipeptido de interes.
La presente invencion tambien se refiere a una composicion que comprende al menos 10 mg/ml de polipeptido de interes, en donde el polipeptido de interes es alfa-manosidasa. Dicha composicion puede comprender en particular al menos 25 mg/ml de polipeptido de interes, tal como al menos 50 mg/ml o al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml de polipeptido de interes. Por lo tanto, dicha composicion puede comprender en particular entre 10-1000 mg/ml de polipeptido de interes, tal como entre 10-500 mg/ml o entre 10-300 mg/ml o entre 10-200 mg/ml o entre 25-500 mg/ml o entre 25-400 mg/ml o entre 40-400 mg/ml o entre 40-300 mg/ml o entre 50-400 mg/ml o entre 50-300 mg/ml o entre 75-400 mg/ml o entre 75-300 mg/ml o entre 100-200 mg/ml o entre 100-150 mg/ml de polipeptido de interes.
La composicion que comprende un polipeptido de interes puede ser en particular una solucion acuosa.
Ademas de comprender una alta concentracion de polipeptido de interes, dicha composicion puede ademas no comprender agregados del polipeptido de interes o al menos solo muy pocos agregados. Por lo tanto, la cantidad de polipeptido de interes presente como agregados puede constituir en particular menos del 5 % en p/p de la cantidad total de polipeptido de interes en la composicion. En particular, dichos agregados pueden constituir menos del 4 % en p/p, tal como menos del 3 % en p/p, o menos del 2 % en p/p, o menos del 1 % en p/p, o menos del 0,5 % en p/p, o menos del 0,1 % en p/p de la cantidad total del polipeptido de interes. En el presente contexto, el termino "agregados" se refiere a cualquier forma del polipeptido de interes que no es monomerica. Por lo tanto, el termino abarca cualquier dfmero o multimero del polipeptido de interes.
Ademas, es una ventaja si dicha composicion comprende solo el polipeptido de interes o al menos solo pequenas trazas de otras protemas, es decir, protemas diferentes del polipeptido de interes. Por lo tanto, en una realizacion particular, dicha composicion comprende menos del 1 % en p/p, tal como menos del 0,5 % en p/p, o menos del 0,1 % en p/p, o menos del 0,05 % en p/p, o menos del 0,01 % en p/p de otras protemas que no son el polipeptido de interes.
Por lo tanto, se puede optimizar un intervalo de factores que afectan a la estabilidad y a la actividad de los polipeptidos y la composicion que comprende un polipeptido de interes en particular para mantener el polipeptido de interes tan estable como sea posible.
El pH generalmente afecta a la estabilidad de un polipeptido de interes, por lo tanto, el pH de una composicion que comprende un polipeptido de interes puede estar en particular en el intervalo de 7,5-8,5, tal como en particular entre pH 7,7-8,2, mas en particular, entre pH 7,8-8,0 o entre pH 7,85-7,95, tal como pH 7,8 o pH 7,9. Esto puede ser en particular el caso si el polipeptido de interes es PBGD.
Por lo tanto, la composicion que comprende un polipeptido de interes puede comprender en particular un tampon capaz de mantener la composicion en el intervalo de pH descrito. Los ejemplos de dichos tampones incluyen, pero sin limitacion TRIS-HCl, Na-Citrato y Na2HPO4. La concentracion de tal tampon puede depender de la eleccion del tampon en particular y de la presencia de otros componentes en la composicion. Si el tampon es Na2HPO4 la concentracion de Na2HPO4 puede estar en el intervalo de 0,5-15 mM, tal como en el intervalo de 1-10 mM, o en el intervalo de 1,5­ 7,5 mM, tal como en el intervalo de 1,83-7,4 mM, o en el intervalo de 1,5-3 mM, tal como en el intervalo de 1,83-3,7 mM, o en el intervalo de 1,83-2,45 mM, o en el intervalo de 3,5-7,5 mM, tal como en el intervalo de 3,6-7,4 mM, o en el intervalo de 5,4-7,4 mM, tal como 1,84 mM, o 2,45 mM, o 3,67 mM o 5,51 mM o 7,34 mM.
Si el tampon es TRIS-HCl, la concentracion de TRIS-HCl puede estar en particular en el intervalo de 2-50 mM, tal como 2-40 mM, o 2-30 mM, o 2-20 mM, o 2-10 mM, o 5-25 mM, o 5-20 mM, o 8-12 mM, o 9-11 mM, por ejemplo 10 mM.
Los ejemplos de otros compuestos que puede comprender la composicion que comprende un polipeptido de interes incluyen pero no se limitan a aminoacidos, azucares, alcoholes y detergentes. Los ejemplos de tales compuestos adecuados incluyen pero no se limitan a glicina, manitol, sacarosa, L-serina, Tween 80 o una combinacion de uno o mas de dichos compuestos. La concentracion de estos compuestos depende del compuesto particular, pero para la glicina, la concentracion puede estar en particular en el intervalo de 1-200 mM, tal como en el intervalo de 5-190 mM, o en el intervalo de 10-180 mM, o en el intervalo de 10-170 mM, o en el intervalo de 20-160 mM, o en el intervalo de 20-150 mM, o en el intervalo de 25-125 mM, o en el intervalo de 5-100 mM, o en el intervalo de 5-90 mM, o en el intervalo de 5-80 mM, o en el intervalo de 5-70 mM, o en el intervalo de 5-60 mM, o en el intervalo de 10-100 mM, o en el intervalo de 10-90 mM, o en el intervalo de 10-80 mM, o en el intervalo de 10-70 mM, o en el intervalo de 10­ 60 mM, o en el intervalo de 12-60 mM, o en el intervalo de 12-55 mM, o en el intervalo de 13,5-54 mM, o en el intervalo de 10-30 mM, tal como en el intervalo de 13,5-27 mM, o en el intervalo de 13,5-18 mM, o en el intervalo de 25-55 mM, tal como en el intervalo de 27-54 mM, o en el intervalo de 40-55, tal como en el intervalo de 40,5-54 mM, tal como 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5, o 53, 53,5, 53, 54,5 o 55 mM.
La concentracion de manitol en particular puede estar en el intervalo de 50-1000 mM, tal como en el intervalo de 50­ 900 mM, o en el intervalo de 50-800 mM, o en el intervalo de 50-700 mM, o en el intervalo de 50-600 mM, o en el intervalo de 100-900 mM, o en el intervalo de 100-800 mM, o en el intervalo de 100-700 mM, o en el intervalo de 100­ 600 mM, o en el intervalo de 100-500 mM, o en el intervalo de 120-525 mM, o en el intervalo de 125-500 mM, o en el intervalo de 100-300 mM, tal como en el intervalo de 120-275 mM, o en el intervalo de 120-170 mM, o en el intervalo de 200-600 mM, tal como en el intervalo de 225-550 mM, o en el intervalo de 240-510 mM, o en el intervalo de 370­ 525 mM, tal como 120, 125, 130, 160, 165, 166,7, 170, 175, 200, 221, 225, 250, 275, 300, 365, 370, 375, 380, 385, 490, 495, 500, 505 o 510 mM.
La concentracion de sacarosa en particular puede estar en el intervalo de 1-200 mM, tal como en el intervalo de 5­ 190 mM, o en el intervalo de 10-180 mM, o en el intervalo de 10-170 mM, o en el intervalo de 20-160 mM, o en el intervalo de 20-150 mM, o en el intervalo de 25-125 mM, o en el intervalo de 5-100 mM, o en el intervalo de 5-90 mM, o en el intervalo de 5-80 mM, o en el intervalo de 5-70 mM, o en el intervalo de 5-60 mM, o en el intervalo de 10­ 100 mM, o en el intervalo de 10-90 mM, o en el intervalo de 10-80 mM, o en el intervalo de 10-70 mM, o en el intervalo de 10-60 mM, o en el intervalo de 12-60 mM, o en el intervalo de 12-55 mM, o en el intervalo de 13,5-54 mM, o en el intervalo de 10-30 mM, tal como en el intervalo de 13,5-27 mM, o en el intervalo de 13,5-18 mM, o en el intervalo de 25-55 mM, tal como en el intervalo de 27-54 mM, o en el intervalo de 40-55, tal como en el intervalo de 40,5-54 mM, , tal como 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41,41,5, o 53, 53,5, 53, 54,5 o 55 mM. Si se incluye la sacarosa en una composicion que tambien comprende manitol, la concentracion de manitol en particular se puede reducir en correspondencia con la concentracion de sacarosa; es decir, la concentracion de manitol y sacarosa juntas pueden ser en particular la misma que la concentracion de manitol si se fuese a usar solo.
La concentracion de Tween 80 en particular puede estar en el intervalo de 0,001-1 % en p/v, tal como en el intervalo de 0,005-1 % en p/v, o en el intervalo de 0,01-1 % en p/v, o en el intervalo de 0,001-0,5 % en p/v, o en el intervalo de 0,005-0,5 % en p/v, o en el intervalo de 0,01-0,5 % en p/v, o en el intervalo del 0,05-0,4 % en p/v, o en el intervalo de 0,05-0,3 % en p/v, o en el intervalo de 0,05-0,2 % en p/v, o en el intervalo de 0,075-0,4 % en p/v, o en el intervalo de 0,075-0,3 % p/v, o en el intervalo de 0,075-0,2 % en p/v, o en el intervalo de 0,09-0,2 % en p/v, tal como 0,075, 0,08, 0,09, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175 o 0,2 % en p/v.
La composicion que comprende un polipeptido de interes, en donde el polipeptido en particular puede ser una PBGD, una arilo sulfatasa, una alfa-manosidasa lisosomica o una galactocerebrosidasa, pueden comprender en particular una combinacion de uno o mas de los compuestos mencionados anteriormente. Un ejemplo adecuado de tal composicion puede ser una que, ademas del polipeptido de interes, comprende Na2HPO4, glicina y manitol. El pH de la composicion y la concentracion de los diferentes compuestos puede ser tal como se describe anteriormente. Por lo tanto, en una realizacion, dicha composicion puede comprender Na2HPO40,5-15 mM, glicina 1-200 mM, manitol 50­ 1000 mM y un pH en el intervalo de 7,5-8,5. Cualquier combinacion de las concentraciones mencionadas anteriormente de los compuestos y el pH se abarcan por la presente invencion. Un ejemplo espedfico de una combinacion adecuada de otros compuestos y pH en la composicion que comprende un polipeptido de interes es uno que comprende Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y tiene un pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Otros ejemplos de composiciones adecuadas incluyen, pero sin limitacion, cualquiera de los siguientes:
Na2HPO41,84 mM, glicina 13,5 mM, manitol 125 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO42,45 mM, glicina 18 mM, manitol 167 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO45,51 mM, glicina 40,5 mM, manitol 375 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO47,34 mM, glicina 54 mM, manitol 500 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 30 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO43,67 mM, manitol 245 mM, sacarosa 32 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO43,67 mM, L-serina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Tris-HCl 10 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na-Citrato 3,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 29 mM, Tween 80 al 0,1 % (p/v) y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 29 mM, Tween 80 al 0,1 % (p/v) y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.
La composicion que comprende un polipeptido de interes se puede usar en particular para aplicaciones terapeuticas en mairnferos. Por lo tanto, la composicion que comprende un polipeptido de interes puede ser, en particular, isotonica, en relacion con el tejido de los m ai^eras, por ejemplo, en particular, puede tener una osmolalidad en el intervalo de 200-400 mOsm/kg, tal como en el intervalo de 250-350 mOsm/kg o en el intervalo de 275-325 mOsm/kg o en el intervalo de 295-305 mOsm/kg, tal como 295 mOsm/kg o 300 mOsm/kg o 305 mOsm/kg.
Metodo de concentracion de un polipeptido de interes
El metodo de la presente divulgacion comprende las etapas de a) centrifugacion y/o filtracion de una composicion que comprende un polipeptido de interes y b) concentrar la composicion de la etapa a). Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que mediante centrifugacion y/o filtracion de una composicion que comprende un polipeptido de interes antes de concentrar dicha composicion es posible obtener una composicion que comprende un polipeptido de interes altamente concentrado sin ningun o con al menos solo unos pocos agregados del polipeptido de interes. Ademas, generalmente es una ventaja para aplicaciones terapeuticas de un polipeptido que se reduzca la cantidad de agregados del polipeptido, por ejemplo, ya que pueden aumentar el riesgo de generar una respuesta inmunitaria hacia el polipeptido.
Para la administracion de un polipeptido por via subcutanea es una ventaja que la composicion del polipeptido tenga una alta actividad en un pequeno volumen ya que solo los pequenos volumenes se pueden inyectar por via subcutanea.
Las protemas o los polipeptidos pueden formar en general agregados cuando estan concentrados. Por lo tanto, es una ventaja que cuando el metodo d la presente invencion se usa para concentrar un polipeptido de interes, no provoque una alta tasa de formacion de agregados de polipeptido. Tal como se muestra en los ejemplos, la cantidad de agregados de PBGD en la composicion obtenida mediante el metodo de concentracion de la presente invencion es similar a la de una composicion de PBGD no concentrada.
En una realizacion particular, la etapa a) del metodo se realiza antes de la etapa b).
Etapa a) centrifugacion y/o filtracion
Los inventores de la presente divulgacion han descubierto que antes de concentrar una composicion que comprende un polipeptido de interes, es una ventaja pretratar la composicion mediante centrifugacion y/o filtracion de la composicion, ya que mediante este pretratamiento se eliminan muchos o la mayona de los agregados de polipeptido.
Cuando la concentracion de la composicion en la etapa b) se realiza mediante un metodo que se basa en el uso de un filtro o membrana, tal como ultrafiltracion, la presencia de agregados puede bloquear el filtro o la membrana, de manera que las pequenas moleculas y lfquidos no sean capaces de atravesar el filtro o la membrana. Esto puede reducir la velocidad mediante la cual se concentra la composicion y/o bloquear por completo cualquier concentracion adicional.
Por lo tanto, para este tipo de concentracion, el pretratamiento de acuerdo con la etapa a) es una ventaja, ya que la eliminacion de los agregados hace posible obtener composiciones de un polipeptido de interes que estan mas concentradas que si dicha composicion no se hubiese pretratado.
Cuando la concentracion de la composicion en la etapa b) se realiza mediante un metodo que se basa en la eliminacion de agua, tal como la liofilizacion o la evaporacion, el pretratamiento en la etapa a) tiene la ventaja de que reduce la cantidad de agregados presentes en la composicion concentrada.
La etapa a) se puede realizar mediante una de las tres siguientes alternativas:
• Centrifugacion,
• Filtracion, o
• Centrifugacion y filtracion.
Si la etapa a) comprende tanto centrifugacion como filtracion, es una ventaja realizar la centrifugacion antes de la filtracion, ya que los inventores de la presente divulgacion han descubierto que la centrifugacion elimina la mayona de los agregados grandes y la filtracion elimina posteriormente los agregados mas pequenos restantes.
Centrifugacion
Para ser capaz de eliminar los agregados, la composicion que comprende un polipeptido de interes se puede centrifugar a una fuerza en el intervalo de 1500 - 3000 g, tal como en el intervalo de 1800-2500 g, o en el intervalo de 2000-2300 g.
Normalmente, la composicion se puede centrifugar durante 10-60 minutos, tal como durante 15-50 minutos o durante 20-40 minutos.
Dado que la temperatura puede afectar a la estabilidad del polipeptido de interes, la centrifugacion se puede realizar a una temperatura en el intervalo de 2-20 °C, tal como de 3-15 °C o en el intervalo de 3-10 °C, o en el intervalo de 3­ 8 °C, tal como a 4 °C o 5 °C o 6 °C.
La centrifugacion da como resultado que los agregados del polipeptido de interes sedimentan, es decir, forman un sedimento, mientras que las moleculas individuales del polipeptido de interes permanecen en la solucion. De manera que es el sobrenadante de la composicion centrifugada el que se usa posteriormente en el metodo de la presente invencion.
Filtracion
La composicion que comprende un polipeptido de interes se puede filtrar a traves de un filtro que tiene un tamano de poro en el intervalo de 0,20-5 pm, tal como en el intervalo de 0,2-2,5 pm.
Ademas del tamano de poro del filtro, tambien el material del que esta hecho el filtro puede afectar a la filtracion del polipeptido de interes. Los ejemplos de filtros de membrana adecuados incluyen pero no se limitan a polietersulfona (PES), acetato de celulosa, celulosa regenerada y fluoruro de polivinilideno (PVDF).
Cuando se filtran moleculas tales como protemas, normalmente son las pequenas moleculas las que se eliminan, por lo tanto, despues de la filtracion, el polipeptido de interes generalmente puede estar presente en el retenido. Por lo tanto, es generalmente el retenido de la filtracion el que se usa en las posteriores etapas de la presente invencion.
Etapa b) concentracion
En principio, cualquier metodo de concentracion del polipeptido de la composicion de interes se puede usar en la etapa b) de la presente invencion.
Los ejemplos de tales metodos adecuados incluyen pero no se limitan a ultrafiltracion y concentracion mediante eliminacion de agua.
Ultrafiltracion
La ultrafiltracion es un metodo de separacion en el que se usa presion hidraulica para forzar a las moleculas y al disolvente a traves de una membrana que comprende poros de un tamano concreto, tambien conocido como valor umbral del tamano. Solo las moleculas que tienen un peso molecular mas pequeno que el valor umbral de la membrana son capaces de atravesar la membrana, mientras que aquellos con un peso molecular mas grande no atraviesan la membrana y forman el denominado retenido. Por lo tanto, las moleculas presentes en el retenido se concentran de este modo a medida que el disolvente fluye a traves de la membrana.
En una realizacion particular, la concentracion de la solucion o la composicion que comprende un polipeptido de interes se puede realizar mediante filtracion de flujo tangencial (TFF). Este metodo es particularmente util para concentracion a gran escala, es decir, para la concentracion de soluciones con un volumen de un litro a varios cientos de litros. Por lo tanto, este metodo es particularmente util para la produccion de soluciones concentradas de un polipeptido de interes a escala industrial.
La tecnica de la TFF esta basada en el uso de un aparato concreto que hace que la solucion que se va a filtrar fluya a traves de una membrana semipermeable; unicamente las moleculas que son mas pequenas que los poros de la membrana pasaran a traves de la membrana, formando el filtrado, dejando atras la materia que se va a recoger (retenido). Con el metodo de la TFF, se aplican dos presiones diferentes; una para bombear la solucion al sistema y para hacerla circular en el sistema (presion de entrada) y se aplica otra presion sobre la membrana (presion de membrana) para forzar a las moleculas pequenas y al disolvente a traves de la membrana. La presion de entrada puede estar tipicamente en el intervalo de 1-3 bar, tal como entre 1,5-2 bar. La presion de membrana puede ser tipicamente mayor de 1 bar.
La composicion concentrada de un polipeptido de interes puede recogerse en forma de retenido cuando se usa la TFF para concentrar la composicion.
Las membranas utiles para la TFF pueden estar hechas tipicamente de celulosa regenerada o de polietersulfona (PES).
El tamano de poro de la membrana normalmente puede tener un umbral de peso molecular que es menor de 10.000 Pm, tal como en el intervalo de 10-10.000 Pm.
En otra realizacion, la concentracion de la composicion que comprende un polipeptido de interes se puede realizar mediante el uso de un dispositivo de centrifugacion. El principio de este metodo es que la solucion se filtra sobre una membrana mediante la aplicacion de una fuerza centnfuga sobre la membrana. Tales membranas a menudos se caracterizan por un umbral de peso molecular (Pm), es decir, este es el tamano molecular maximo de los compuestos que son capaces de atravesar la membrana, y los compuestos con un tamano molecular mayor que este no atravesaran la membrana. El umbral de Pm de las membranas usadas en la presente invencion puede ser menor de 30.000 Pm, tal como entre 10-30.000 Pm.
La membrana en particular puede estar hecha de polietersulfona (PES) o de celulosa regenerada.
Los ejemplos de tales dispositivos de filtracion comerciales adecuados pueden ser Centricon Plus-80 o Centricon Plus-15.
La concentracion se puede realizar normalmente mediante centrifugacion a 2000-4500 g, tal como a entre 2500-4000 g, o entre 2750-3500 g, o entre 3000-3500 g, tal como a 3000 g o 3100 g o 3200 g o 3300 g o 3400 g o 3500 g. Normalmente, la centrifugacion se puede poner en marcha durante varias horas, por ejemplo, durante mas de una hora, tal como durante 1-10 horas.
Para minimizar cualquier efecto negativo sobre la estabilidad del polipeptido de interes, la centrifugacion en particular se puede realizar a una temperatura en el intervalo de 2-20 °C, tal como en el intervalo de 3-15 °C o en el intervalo de 3-10 °C o en el intervalo de 3-6 °C.
Concentracion mediante eliminacion de agua
El principio de concentracion mediante eliminacion de agua normalmente es que todo o la mayona del agua se elimina para obtener un solido, y despues se diluye o se disuelve posteriormente este solido en un volumen de agua que es menos que en el que se diluyo o disolvio previamente. Sin embargo, en principio se puede realizar simplemente eliminando la cantidad necesaria de agua para obtener la concentracion deseada sin rediluir o redisolver posteriormente el compuesto.
Los ejemplos de metodos de concentracion adecuados mediante eliminacion de agua incluyen la liofilizacion y la evaporacion.
Tanto para la liofilizacion como para la evaporacion, los tres parametros mas relevantes son la temperatura, la presion y el tiempo.
El metodo de liofilizacion puede comprender las siguientes tres o cuatro etapas; una fase de congelacion, una fase de secado primario y una fase de secado secundario y opcionalmente una etapa de recocido tras la fase de congelacion. La liofilizacion en particular se puede realizar tal como se describe en relacion con la liofilizacion incluida como una etapa adicional del metodo de la presente invencion.
Etapas adicionales
El polipeptido de interes puede provenir de una fuente natural, es decir, de celulas que expresan de forma natural el polipeptido de interes, o se puede expresar en particular de forma recombinante.
Independientemente de donde proviene el polipeptido de interes se puede haber purificado antes de someterlo a un metodo de la presente invencion.
T al "purificacion" puede incluir en particular pero no se limita a la eliminacion de los sedimentos celulares, la eliminacion de otras protemas que no son el polipeptido de interes y la eliminacion de otros componentes que pueden estar presentes en la fuente de la que proviene el polipeptido de interes. Por lo tanto, en una realizacion particular de la presente invencion, la composicion que comprende un polipeptido de interes comprende menos del 5 % en p/p, o menos del 1 % en p/p o menos del 0,5 % en p/p o menos del 0,1 % en p/p o menos del 0,05 % en p/p o menos del 0,01 % en p/p de otras protemas que el polipeptido de interes.
Por lo tanto, otras protemas que se expresan por, por ejemplo, una celula hospedadora se pueden eliminar de la composicion que comprende un polipeptido de interes antes de que se use en un metodo de la presente invencion.
Por lo tanto, en una realizacion particular, el metodo de la presente invencion puede comprender una o mas de las siguientes etapas antes de la etapa a):
i) expresion recombinante de un polipeptido de interes
ii) purificacion de la composicion del polipeptido de interes por una o mas etapas de la cromatograffa iii) intercambio del tampon de formulacion
La expresion recombinante de un polipeptido de interes se puede realizar en particular tal como se describe anteriormente en relacion con el polipeptido de interes.
Si el polipeptido de interes es PBGD, los ejemplos de los tipos adecuados de cromatograffa incluyen pero no se limitan a cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico (IEC) y cromatograffa en una columna de hidroxiapatito. En principio, se puede usar cualquier combinacion de estos metodos de cromatograffa. Los inventores de la presente invencion han descubierto anteriormente para PBGD que es una ventaja realizar al menos la etapa de cromatograffa de afinidad y que si esto se combina con cualquiera de los otros metodos de cromatograffa, es una ventaja realizar la etapa de cromatograffa de afinidad antes de las otras etapas de cromatograffa (vease, por ejemplo, el documento WO 03/002731).
Para la realizacion en la que el polipeptido de interes es PBGD, los ejemplos de las columnas de cromatograffa de afinidad disponibles incluyen columnas de acoplamiento por afinidad, afinidad espedfica de grupo, y afinidad del quelato de metal.
El catalogo de productos de 2001 de la comparffa Amersham Pharmacia Biotech da ejemplos de columnas de acoplamiento por afinidad tales como columnas que comprenden la inmovilizacion de ligandos que contienen -NH2 y columnas que comprenden ligandos que contienen grupos amino primarios.
Las columnas de afinidad de quelato de metal se prefieren especialmente para purificar protemas a traves de la formacion de complejos de iones metalicos con grupos histidina expuestos. El ejemplo 3 del documento WO01/07065 describe la construccion de una porfobilinogeno desaminasa humana recombinante con un "marcador His" (rhPBGD-His). Con el fin de purificar rhPBGD-His se prefiere usar una columna de afinidad de quelatos de metal, tal como una columna que tiene una resina de afinidad de metal de cobalto.
Los ejemplos de otros metodos adecuados de cromatograffa de afinidad incluyen, pero sin limitacion, columnas que tienen heparina porcina como ligando o columnas que tienen acido 1-Amino-4-[[4-[[4-cloro-6-[[3 (o 4)-sulfofenil]amino]-1,3,5-triazin-2-il]amino]-3-sulfofenil]amino]-9,10-dihidro-9,10-dioxo-2-antracenosulfonico, tambien conocido como Cibracon Blue 3g , como ligando y usando el acoplamiento de triazina como el metodo de acoplamiento de ligando. Un ejemplo comercialmente disponible de esta ultima es Blue Sepharose 6 Fast Flow (FF) de Amersham Pharmacia Biotech. En consecuencia, una realizacion preferida de la invencion se refiere al procedimiento, tal como se describe en el presente documento, en onde la columna de cromatograffa de afinidad de la etapa (i) es una columna que usa un acoplamiento de triazina como metodo de acoplamiento de ligando, y mas preferentemente en donde el ligando es Cibacron Blue 3G.
La expresion "cromatograffa de intercambio ionico (IEC)" se debena de entender en el presente documento de acuerdo con la materia como una columna que separa moleculas tales como protemas basandose en su carga neta a un determinado pH por union electrostatica a un grupo cargado en la columna. El intercambio ionico indica la absorcion de iones de un tipo en una columna en intercambio por otros que estan perdidos en la solucion.
Los ejemplos de columnas IEC son columnas tales como una columna de Q Sepharose, una columna de Q SP Sepharose, o una columna de CM Sepharose, puede ser en particular una columna de DEAE Sepharose.
Un ejemplo de una columna de hidroxiapatito adecuada es una columna de hidroxiapatito de ceramica. El hidroxiapatito (Ca5(PO4)3OH)2 es una forma de fosfato de calcio que se puede usar para la separacion y la purificacion de protemas, enzimas, acidos nucleicos, virus y otras macromoleculas. El hidroxiapatito ceramico es una forma esferica y macroporosa de hidroxiapatito. c Ht Type I (Bio-Rad) es un ejemplo de una columna de cromatograffa con hidroxiapatito ceramico adecuada y comercialmente disponible.
En una realizacion, el metodo de la presente invencion puede comprender las siguientes etapas antes de la etapa a): i) expresion recombinante de PBGD
ii) someter la composicion de PBGD de la etapa i) a cromatograffa de afinidad
iii) someter la composicion de PBGD de la etapa ii) a cromatograffa de intercambio ionico
En una realizacion adicional, el metodo de la presente invencion puede comprender las siguientes etapas antes de la etapa a):
i) expresion recombinante de PBGD
ii) someter la composicion de PBGD de la etapa i) a cromatograffa de afinidad
iii) someter la composicion de PBGD de la etapa ii) a cromatograffa de intercambio ionico
iv) someter la composicion de PBGD de la etapa iii) a una columna de hidroxiapatito
Ambos metodos pueden incluir opcionalmente una etapa adicional de dilucion de diafiltracion de la composicion de PBGD obtenida de la etapa ii). Por lo tanto, dicha etapa debena ser despues de la etapa ii) y antes de la etapa iii), es decir, una etapa iia). La etapa iia) tiene la finalidad de reducir la concentracion de sales para una conductividad adecuada, por ejemplo < 10 mS/cm. Esto puede ser relevante en particular si se usa DEAE Sepharose como resina en la etapa de cromatograffa de intercambio ionico, es decir, la etapa iii), ya que esto puede facilitar la union de la PBGD a la resina DEAE Sepharose. Se puede obtener la dilucion mediante la adicion de agua purificada directamente o mediante ultrafiltracion frente a agua purificada.
La expresion recombinante de PBGD, etapa i) se puede realizar mediante cualquiera de los metodos descritos anteriormente.
Los ejemplos de columnas de cromatograffa de afinidad adecuadas en la etapa ii) pueden ser cualquiera de los mencionados anteriormente.
Los ejemplos de metodos adecuados de realizacion de cromatograffa de intercambio ionico en la etapa iii) pueden ser cualquiera de los mencionados anteriormente.
Los ejemplos de columnas de cromatograffa de hidroxiapatito adecuadas en la etapa iv) pueden ser cualquiera de las mencionadas anteriormente.
En una realizacion particular, la columna de cromatograffa de afinidad puede ser una columna que usa un acoplamiento de triazina como metodo de acoplamiento de ligando, y en particular, tal metodo en donde el ligando es Cibracon Blue 3G. Esta puede ser en particular una columna de Blue Sepharose 6 Fast Flow, y la columna de cromatograffa de intercambio ionico puede ser una columna de DEAE Sepharose, y en la realizacion en donde el metodo tambien comprende una etapa iv) esta columna puede ser en particular una columna de hidroxiapatito ceramico.
El metodo de la presente invencion tambien puede comprender etapas adicionales despues de la etapa b) del metodo. Tales etapas incluyen, pero sin limitacion, una o mas de las siguientes:
• liofilizar la composicion que comprende un polipeptido concentrado de interes,
• cambiar el tampon de la composicion que comprende un polipeptido de interes concentrado,
• filtracion esteril de la composicion que comprende un polipeptido de interes concentrado
• evaporacion
Se pueden usar diferentes liofilizadores, volumenes de soluciones a liofilizar y otros parametros en el metodo de la presente invencion. Un ejemplo de un liofilizador adecuado incluye pero no se limita a un liofilizador Lyostar (FTM-systems) tal como se usa en los ejemplos de la presente invencion, en donde las soluciones que comprenden un polipeptido de interes concentrado, es decir, en este caso PBGD, se cargaron en frascos de vidrio de inyeccion de 2 y 6 ml (tipo 1) y se taparon con tapones de goma (clorobutilo). La liofilizacion se puede realizar mediante las siguientes tres etapas;
i) congelacion,
ii) secado primario, y
iii) secado secundario.
La etapa i) de congelacion en particular se puede realizar cargando en primer lugar una muestra a temperatura ambiente y enfriandola a 0 °C y manteniendola a 0 °C durante 30 minutos, antes de reducir la temperatura a 1 °C por minuto hasta -40 °C y manteniendola a -40 °C durante 30 minutos.
La etapa ii) de secado primario se puede realizar en particular mediante extraccion de la presion de vacfo de 126 mTorr, elevando la temperatura en 1 °C por minuto hasta 0 °C y manteniendo la muestra a 0 °C durante 360 minutos.
La etapa iii) de secado secundario se puede realizar en particular mediante la extraccion del vado completo elevando simultaneamente la temperatura en 0,5 °C por minuto hasta 30 °C y manteniendo la muestra a 30 °C durante 360 minutos.
Despues del secado secundario, la muestra se puede cerrar al vado o cerrar tras la carga con nitrogeno.
Un ejemplo de metodo de liofilizacion adecuado incluye el descrito en los ejemplos de la presente invencion.
La liofilizacion puede comprender en realizaciones adicionales una etapa de recocido antes de la fase de secado primario. Los inventores de la presente invencion han descubierto que la inclusion de una etapa de recocido en el metodo de liofilizacion mejora el aspecto visual, tal como se visualiza por menos roturas y/o da como resultado un tiempo de reconstitucion mas corto del producto liofilizado en comparacion con cuando se usa el mismo metodo de liofilizacion pero sin la etapa de recocido. Es una ventaja que el tiempo para la reconstitucion de un producto liofilizado se reduce, especialmente si se va a usar como un producto farmaceutico que se administra como una solucion. Un aspecto visual mejorado generalmente tambien se considera una ventaja para la mayona de los productos.
Por lo tanto, la liofilizacion puede comprender las siguientes etapas:
i) congelacion
ii) recocido
iii) secado primario
iv) secado secundario.
Las etapas de congelacion, secado primario y secado secundario se pueden realizar en particular tal como se describe anteriormente. La etapa de recocido, es decir, la etapa ii) se puede realizar despues de 30 minutos de congelacion, elevando la temperatura a, por ejemplo, una velocidad de 2 °C por minuto a -10 °C o -20 °C y manteniendo esta temperatura durante 120 o 420 minutos y despues bajando la temperatura, por ejemplo, a una velocidad de 2 °C por minuto a -40 °C, temperatura a la cual la muestra se puede mantener a 60-90 minutos antes del comienzo de la etapa de secado primario.
El cambio del tampon de la composicion que comprende un polipeptido de interes concentrado se puede realizar en particular mediante a) dilucion, por ejemplo, 5-15 veces, comprendiendo la composicion un polipeptido de interes concentrado en un tampon o formulacion, b) concentrando la composicion diluida de nuevo y realizando las etapas a) y b) un numero suficiente de veces como para que la cantidad de excipientes en el tampon o la formulacion presente en la composicion antes de estas etapas constituya menos de, por ejemplo, el 5 % en v/v o menos del 1 % en v/v de excipientes en el tampon o la formulacion presente en dicha composicion despues de que dichas etapas se hayan realizado.
En particular, la composicion que comprende un polipeptido de interes obtenido de la etapa b) comprende ademas una etapa de filtracion esteril de dicha composicion y/o una etapa de liofilizacion de la composicion.
La filtracion esteril generalmente se realiza mediante la filtracion de la composicion a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,22 pm o 0,20 pm. La liofilizacion se puede realizar en particular tal como se describe anteriormente. La presente invencion tambien se refiere a una composicion liofilizada obtenida por un metodo de la presente invencion.
Inyeccion subcutanea
La presente invencion tambien se refiere al uso de una composicion que comprende en el intervalo de 50-300 mg/ de polipeptido de interes para la fabricacion de un medicamento para inyeccion subcutanea en un mairnfero.
El polipeptido de interes puede ser cualquier polipeptido de interes de acuerdo con la presente divulgacion, que incluye, pero sin limitacion, PBGD, arilosulfatasa A, una alfa-manosidasa lisosomica y una galactocerebrosidasa.
El termino subcutaneo a menudo se acorta a s.c. y los dos terminos se pueden usar de manera intercambiable en el contexto de la presente invencion.
Cuando la inyeccion se realiza por via subcutanea, normalmente no es posible inyectar mas de 1,5 ml debido a restricciones fisiologicas.
Dado que el paciente normalmente necesita una determinada cantidad del polipeptido de interes particular hay una correlacion entre el volumen de la composicion que comprende un polipeptido de interes que necesita ser administrado al paciente y de la concentracion de polipeptido de interes en dicha composicion.
Por lo tanto, es una ventaja de la presente invencion que la composicion que comprende un polipeptido de interes comprenda una concentracion del polipeptido de interes y que esta alta concentracion del polipeptido de interes se pueda obtener sin la formacion de grandes cantidades de agregados de polipeptido. El uso de tales composiciones concentradas del polipeptido de interes hace posible inyectar un menor volumen de dicha composicion y, al mismo tiempo, asegurarse de que el paciente recibe una cantidad adecuada del polipeptido de interes; haciendo, por lo tanto, mas facil administrar el polipeptido de interes por via subcutanea.
La composicion mencionada anteriormente que comprende un polipeptido de interes puede comprender en particular entre 75-250 mg/ml, tal como entre 75-200 mg/ml o entre 75-150 mg/ml o entre 100-15o mg/ml o entre 100-125 mg/ml o entre 125-150 mg/ml de polipeptido de interes.
Tal como se describe anteriormente, el volumen de la composicion que comprende un polipeptido de interes que es necesario inyectar al paciente para asegurarse de que el paciente recibe una cantidad adecuada del polipeptido de interes se correlaciona con la concentracion del polipeptido de interes en dicha composicion.
Por lo tanto, el volumen de tal composicion generalmente se ajustara de acuerdo con la concentracion del polipeptido de interes en la composicion. Sin embargo, el volumen generalmente puede estar en el intervalo de 0,1-1,5 ml, tal como en el intervalo de 0,1-1,5 ml o en el intervalo de 0,5-1,5 ml o en el intervalo de 0,5-1,5 ml o en el intervalo de 0,75-1,5 ml o en el intervalo de 0,75-1,5 ml o en el intervalo de 1-1,5 ml o en el intervalo de 1-1,5 ml.
La cantidad de polipeptido de interes que es relevante para administrar a un paciente generalmente depende del peso del individuo y del polipeptido de interes en particular.
En una realizacion, la presente divulgacion se refiere a un metodo de tratamiento de porfiria aguda intermitente en un mairnfero que comprende la inyeccion subcutanea de una composicion de 50-300 mg/ml de PBGD.
La administracion de PBGD en particular puede ser util para el tratamiento de porfiria aguda intermitente. Sin embargo, se contempla que la administracion de PBGD tambien pueda ser util para el tratamiento de otras porfirias, tales como coproporfiria hereditaria o porfiria variegata. Porfiria es un termino usado para describir de manera colectiva una serie de enfermedades provocadas por diferentes deficiencias en la via biosintetica del grupo hemo. Por lo tanto, se contempla que la administracion de PBGD, por ejemplo, en combinacion con otros agentes terapeuticos, a un paciente que padece cualquier tipo de porfiria pueda ayudar a aumentar la renovacion total de los diferentes intermediarios en la via. Por ejemplo, Meissner PN et al., 1986, European Journal of Clinical Investigation, vol. 16, 257-261; Hift RJ et al., 1997, S. Afr. Med. J., vol. 87, 718-27 y Meissner P et al., 1993, J. Clin. Invest., vol. 91, 1436-44 describen la acumulacion de ALA y PBG en coproporfiria hereditaria y porfiria variegata. En estas enfermedades, la acumulacion de ALA y PBG es resultado de defectos enzimaticos que se localizan cuatro y cinco etapas aguas abajo de la conversion de ALA a PBG, respectivamente. En los dos artmulos mas recientes se describe como el porfirinogeno que se acumula en los pacientes con porfiria variegata es capaz de inhibir la PBG-desaminasa.
En una realizacion adicional, la presente divulgacion se refiere a un metodo de tratamiento de leucodistrofia metacromatica en un m a i^e ro que comprende la inyeccion subcutanea de una composicion de 50-300 mg/ml de arilosulfatasa A.
La leucodistrofia metacromatica (LDM) esta causada por un defecto genetico autosomico recesivo en la enzima lisosomica arilosulfatasa A (ASA), que da como resultado una degradacion progresiva de las membranas de la vaina de mielina (desmielinizacion) y la acumulacion de galactosil sulfato (cerebrosido sulfato) en la sustancia blanca del sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periferico. En preparaciones histologicas, el galactosil sulfato forma masas granulares esfericas que se tinen metacromaticamente. El galactosil sulfato tambien se acumula en el rinon, en la vesfcula biliar, y en otros determinados organos viscerales, y se secreta en cantidades excesivas en la orina.
El galactosil sulfato normalmente se metaboliza mediante la hidrolisis del enlace de 3-O-sulfato para formar galactocerebrosido a traves de la accion combinada de la enzima lisosomica arilosulfatasa A (CE 3.1.6.8) (Austin et al. Biochem J. 1964, 93, 15C-17C) y una protema activadora de esfingolfpido llamada saposina B. Una deficiencia profunda de arilosulfatasa A tiene lugar en todos los tejidos de pacientes con las formas tardfas infantil, juvenil y adulta de LDM (vease a continuacion). En lo sucesivo, la protema arilosulfatasa A se denominara "ASA". Una profunda deficiencia de ASA tiene lugar en todos los tejidos de pacientes con LDM.
En otra realizacion mas, la presente divulgacion se refiere a un metodo de tratamiento de un m a i^e ro para el trastorno de almacenamiento lisosomico alfa-manosidosis que comprende la inyeccion subcutanea de una composicion de 50­ 300 mg/ml de alfa-manosidasa lisosomica.
La alfa-manosidosis es una enfermedad autosomica recesiva que se produce en todo el mundo con una frecuencia de entre 1/1.000.000 y 1/500.000. La manosidosis se da en todos los grupos etnicos en Europa, America, Africa y tambien Asia. Se detecta en todos los pafses con un buen servicio de diagnostico para trastornos de almacenamiento lisosomico, con una frecuencia similar. Los pacientes nacen aparentemente sanos; aunque los smtomas de la enfermedad son progresivos. La alfa-manosidosis presenta heterogeneidad clmica, variando desde formas muy graves hasta muy leves. Los smtomas clmicos son: retraso mental, cambios esqueleticos, alteraciones del sistema inmunitario que dan como resultado infecciones recurrentes, deterioro auditivo y normalmente, la enfermedad se asocia con caractensticas faciales tfpicas, tales como cara gruesa, una frente prominente, un puente nasal aplanado, una nariz pequena y una boca ancha. En los casos mas graves (manosidosis de tipo I) los ninos padecen hepatoesplenomegalia y fallecen durante los primeros anos de vida. Esta muerte temprana esta posiblemente causada por infecciones graves debida a la inmunodeficiencia causada por la enfermedad. En los casos mas leves (manosidosis de tipo 2) los pacientes normalmente alcanzan la edad adulta. La debilidad esqueletica de los pacientes provoca que los pacientes necesiten una silla de ruedas cuando alcanzan la edad de 20 a 40 anos. Esta enfermedad provoca una disfuncion difusa en el cerebro que normalmente da como resultado un rendimiento mental debil que excluye cualquier cosa salvo las competencias mas basicas de leer y escribir. Estos problemas asociados con las incapacidades auditivas y otras manifestaciones clmicas impiden que los pacientes desarrollen una vida independiente, con la consecuencia de que necesiten cuidados de por vida.
En otra realizacion mas, la presente divulgacion se refiere a un metodo de tratamiento de enfermedad de Krabbe en un mairnfero que comprende la inyeccion subcutanea de una composicion de 50-300 mg/ml de galactosilcerebrosidasa.
En seres humanos, una deficiencia en la enzima GALC da como resultado una enfermedad genetica hereditaria de almacenamiento lisosomico conocida como enfermedad de Krabbe o leucodistrofia de celulas globoides. La enzima generalmente se expresa en los testfculos, rinones, placenta, tugado y cerebro de los seres humanos y una deficiencia en la enzima GALC generalmente da como resultado un trastorno en el metabolismo de la mielina y en los sistemas nerviosos central y periferico (el SNC y el SNP, respectivamente).
La enfermedad de Krabbe se ha observado en seres humanos de cualquier edad, nacionalidad y sexo.
Cabe senalar que las realizaciones y caractensticas descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invencion tambien se aplican a otros aspectos de la invencion. En particular, todas las realizaciones descritas para la composicion que comprende un polipeptido de interes, tal como la presencia de compuestos adicionales, tampones y pH tambien se aplican a la composicion que comprende un polipeptido de interes usado en las presentes solicitudes.
Cuando un objeto de acuerdo con la presente invencion o uno de los rasgos o caractensticas se cita en singular, esto tambien se refiere al objeto o a sus rasgos o caractensticas en plural. Como ejemplo, cuando se refiere a "un polipeptido" se debe de entender que se refiere a uno o mas polipeptidos.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende", o "comprendiendo", se entendera que implican la inclusion de un elemento indicado, numero entero o etapa, o grupo de elementos, numeros enteros o etapas, pero no la exclusion de cualquier otro elemento, numero entero o etapa, o grupo de elementos, numeros enteros o etapas.
A continuacion, se describira la invencion en mas detalle en las siguientes secciones experimentales no limitantes.
SECCION EXPERIMENTAL
Materiales
rhPBGD
La rhPBGD usada en los siguientes experimentos se obtuvo de acuerdo con el proceso 2 en el ejemplo 1 del documento WO 03/002731, en donde el proceso 2 es el proceso que incluye la etapa IV, es decir, la etapa de cromatograffa con hidroxiapatito ceramico.
Tampon de formulacion
La rhPBGD recombinante y purificada estaba presente en el siguiente tampon de formulacion acuosa:
Na2HPO43,67 mM
glicina 27 mM
manitol 250 mM
y un pH de 7,9
El tampon de formulacion despues se esterilizo por filtracion a traves de un filtro de 0,22 pm.
Metodos
Liofilizacion
La liofilizacion de las soluciones de rhPBGD purificada se realizo en un liofilizador Lyostar (FTM-systems) de acuerdo con las siguientes pautas:
Figure imgf000020_0001
Observacion visual (transparencia y color)
El lfquido se estudio visualmente con respecto al color, transparencia y precipitados de acuerdo con el esquema a continuacion.
Color: 1: Incoloro; 2: Ligeramente amarillo; 3: Amarillo
Transparencia: 1: Transparente; 2: Ligeramente turbio; 3: Turbio
Otras observaciones: En algunos casos se incluyeron otras observaciones del operador (por ejemplo, precipitados, material no disuelto, etc.)
Medicion del pH
El pH-metro (pH-metro Metrohm 691) y el electrodo (electrodo de pH combinado LL) se calibraron con 3 soluciones patron de referencia (Merck) en el intervalo de 4,00 a 9,00. Finalmente se analizo el lfquido.
Concentracion de proteina
La concentracion de proteina en el extracto, las muestras en proceso, la sustancia de farmaco en masa y producto final se determinaron mediante un metodo que utiliza los principios de la reduccion de Cu2+ a Cu+ mediante proteina en un medio alcalino (la reaccion de Biuret). Los iones Cu+ se hicieron reaccionar despues con un reactivo que contiene acido bicinconmico y dio como resultado una deteccion colorimetrica altamente sensible y selectiva.
Pureza
La porfobilinogeno desaminasa recombinante humana (rhPBGD) y las variantes de rhPBGD se separaron de acuerdo con su capacidad de adsorcion y desorcion en medios estacionarios basados en sflice dependiendo del porcentaje de modificador organico (acetonitrilo) en la fase movil.
Actividad de rhPBGD
La porfobilinogeno desaminasa (PBGD) cataliza la adicion de 4 moleculas de porfobilinogeno (PBG) para formar un tetramero lineal, preuroporfirinogeno, que se libera de la enzima y se circulariza in vivo a uroporfirinogeno III por la accion de la Uroporfirinogeno III sintasa. El preuroporfirinogeno se puede oxidar qmmicamente con benzoquinona para formar uroporfirina, que absorbe luz a 405 nm.
Los analisis se realizaron en un solo frasco en cada caso de prueba. Para la determinacion de la actividad de rhPBGD y la concentracion de proteina, se realizaron ensayos por duplicado y triplicado, respectivamente, para cada frasco. Osmolalidad
Se resuspendio un frasco de rhPBGD en 1,00 ml de agua MilliQ. El frasco de solucion acuosa de rhPBGD congelada se descongelo. El osmometro (osmometro Vapro) se calibro con 3 soluciones patron en el intervalo de 100-1000 mOsm/kg (100, 290, 1000 mOsm/kg). Despues se analizo el lfquido.
Ejemplo 1
Concentracion con dispositivos de filtracion centrifuga
La solucion de PBGD-carga (7 mg/ml de rhPBGD, Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM, a pH 7,9) se descongelo en un bano de agua a 20 °C, se centrifugo a 3200 g durante 10 min y despues se esterilizo por filtracion mediante filtros de PES de 0,20 pm (filtros de polietersulfona de Nalgene). La solucion PBGD-carga se concentro a 100 mg/ml mediante la puesta en marcha de los dispositivos de filtracion centnfuga Centricon Plus-80 (umbral de Pm de 30000) y Centricon Plus-15 (umbral de Pm de 30000) a 3200 g durante varias horas. La solucion concentrada, es decir, el retenido, se esterilizo por filtracion en filtros de 0,22 pm (Millex GV) y finalmente una parte de esta solucion se diluyo con tampon de formulacion esteril para obtener 50 mg/ml. La solucion de 5 mg/ml se preparo diluyendo directamente la hPBGD recombinante y purificada con tampon de formulacion esteril.
Las rhPBGD de 5 mg/ml, de 50 mg/ml y de 100 mg/ml se liofilizaron despues tal como se describe anteriormente. Varios frascos de cada una de las soluciones de rhPBGD liofilizadas anteriores con 5, 50 y 100 mg/ml de rhPBGD y de la solucion acuosa de 5 mg/ml de rhPBGD se almacenaron a 40 °C ± 2 °C, 75 % ± 5 % de humedad relativa (HR). Los frascos se almacenaron protegidos de la luz en un paquete secundario bien sellado (caja de papel).
A los puntos temporales indicados (es decir, el tiempo de almacenamiento) un vial de cada una de las muestras liofilizadas se resuspendieron en 1,00 ml de agua Millipore.
Cada uno de los frascos resuspendidos y el frasco acuoso de rhPBGD se observaron de forma visual en relacion con el color, la transparencia y los precipitados, y se midio la concentracion de protema, la pureza y la actividad de rhPBGD tal como se describe anteriormente.
Los resultados se dan en las siguientes tablas 1-4:
Tabla 1: Producto liofilizado 5 m /ml
Figure imgf000021_0001
T l 2 r li filiz m ml
Figure imgf000021_0002
Tabla 3: Producto liofilizado 100 m /ml
Figure imgf000021_0003
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T l 4: Pr m ml
Figure imgf000022_0003
Ejemplo 2
Concentracion de una composicion de rhPBGD mediante dispositivos de filtracion centrifuga
La solucion de PBGD-carga (7 mg/ml de rhPBGD, Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM, a pH 7,9) se descongelo en un bano de agua a 20 °C, se centrifugo a 3200 g durante 10 min y despues se esterilizo por filtracion mediante filtros de PES de 0,20 pm (filtros de polietersulfona de Nalgene). La solucion PBGD-carga se concentro a 100 mg/ml mediante la puesta en marcha de los dispositivos de filtracion centrifuga Centricon Plus-80 (umbral de Pm de 30000) y Centricon Plus-15 (umbral de Pm de 30000) a 3200 g durante varias horas. La solucion concentrada, es decir, el retenido, se esterilizo por filtracion mediante filtros de 0,22 pm (Millex GV) y se diluyo con tampon de formulacion esterilizado por filtracion (vease anteriormente) para obtener soluciones de concentraciones mas bajas. Una parte en volumen de cada concentracion se liofilizo tal como se describe anteriormente.
Las diferentes concentraciones de rhPBGD liofilizado y la solucion acuosa de rhPBGD se almacenaron a 5 °C ± 3 °C o a -20 °C ± 5 °C (humedad relativa (RH) ambiental). Todos los frascos se almacenaron protegidos de la luz en un paquete secundario bien sellado (caja de papel).
A los puntos temporales indicados (es decir, el tiempo de almacenamiento) un frasco de cada muestra liofilizada se resuspendio en 1,00 ml de agua Millipore y despues se probo junto con la solucion acuosa de rhPBGD mediante observacion visual del color, la transparencia y los precipitados, y mediante medicion del pH, la concentracion de protema, la pureza, la osmolalidad y la actividad de rhPBGD.
Los resultados se dan en las siguientes tablas 5-19:
T l : Pr 11 m ml T m . lm n mi n :+ °
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000023_0001
Tabla 6: Producto acuoso: 11 m /ml Tem . de almacenamiento: -20 °C
Figure imgf000023_0002
Tabla 7: Producto liofilizado 11 m /ml Tem . de almacenamiento:+5 °C
Figure imgf000023_0003
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T l : Pr 17 m ml T m . lm n mi n :+ °
Figure imgf000024_0002
Tabla 9: Producto acuoso 17 m /ml Tem . de almacenairiiento: -20 °C
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000025_0001
Tabla 10: Producto liofilizado 17 m /ml Tem . de almacenamiento: 5 °C
Figure imgf000025_0002
Tabla 11: Producto acuoso 36 m /ml Tem . de almacenamiento: 5 °C
Figure imgf000025_0003
Figure imgf000026_0001
T l 12: Pr m ml T m . lm n mi n : -2 °
Figure imgf000026_0002
Tabla 13: Producto liofilizado 36 m /ml Tem . de almacenamiento: 5 °C
Figure imgf000026_0003
Tabla 14: Producto acuoso 50 m /ml Tem . de almacenamiento: 5 °C
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Figure imgf000027_0001
T l 1: Pr m ml T m . lm n mi n : -2 °
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000028_0001
Tabla 16: Producto liofilizado 50 m /ml Tem . de almacenamiento: 5 °C
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Tabla^ 17: Producto acuoso 100 m /ml Tem . de almacenamiento: 5 °C
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Figure imgf000030_0001
T l 1: Pr 1 m ml T m . lm n mi n : -2 °
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Tabla 19: Producto liofilizado 100 m /ml Tem . de almacenamiento: 5 °C
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Ejemplo 3
Concentracion de una composicion de rhPBGD mediante filtracion por flujo tangencial (TFF)
La solucion de carga de rhPBGD se descongelo despues durante un mmimo de tres d^as a 5 °C y en la oscuridad. La solucion descongelada se centrifugo con tubos de centnfuga conicos de 200 ml durante aproximadamente 10 minutos a 2200 g.
La solucion despues se filtro a traves de una serie de filtros con los siguientes tamanos de poro: 5,0 pm; 0,65 pm; 0,45 pm y 0,20 pm antes de que se concentrase mediante filtracion por flujo tangencial (TFF).
La concentracion por TFF se realizo con un sistema Millipore Labscale TFF y un filtro Pellicon® XL con una presion de entrada de la bomba de aproximadamente 20-25 psi y una presion sobre el filtro Pellicon® XL de aproximadamente 4-6 psi. Las rhPBGD se protegieron de la luz durante el procedimiento cubriendo el recipiente de la muestra del sistema de TFF con laminas de papel de aluminio.
A la solucion de rhPBGD concentrada obtenida del procedimiento de TFF se le cambio el tampon frente a un tampon de concentracion que contiene Na2HPO4 x 2 H2O 3,67 mM, glicina 27 mM y manitol 220 mM preparada en agua esteril. Esto se realizo anadiendo continuamente dicho tampon al sistema de TFF y presionandolo a traves de la membrana hasta que dicho tampon haya sustituido el tampon anterior.
La solucion de rhPBGD concentrada y con el tampon cambiado se esterilizo por filtracion pasandola a traves de un filtro con un tamano de poro de 0,22 pm. Esta esterilizacion por filtracion se realizo dos veces con un nuevo filtro cada vez.
La solucion de rhPBGD esteril concentrada se coloco despues en frascos antes de que se liofilizase tal como se describe en la seccion del metodo.
Ejemplo 4
El efecto de los diferentes modos de liofilizacion y/o de la cantidad de excipientes sobre el tiempo de reconstitucion La PBGD se concentro tal como se describe en el ejemplo 3 y despues del intercambio del tampon se determino la concentracion de PBGD.
La solucion concentrada de PBGD se liofilizo despues en un liofilizador Lyostar (FTM-systems). Las soluciones se cargaron en frascos de vidrio de inyeccion de 2 y 6 ml (tipo 1) y se taparon con tapones de goma (clorobutilo).
Ciclo de liofilizacion original:
Las muestras se cargaron a temperatura ambiente y los estantes se enfriaron a 0 °C durante 30 minutos. La temperatura se bajo a -40 °C (1 °C por minuto) y se mantuvo a h durante 30 minutos y despues la presion de vacfo se extrajo a 126 mTorr y el secado primario comenzo a subir la temperatura hasta 0 °C (1 °C por minuto). Despues de 360 minutos de secado primario, la temperatura se elevo hasta 30 °C (0,5 °C por minuto) y se extrajo el vacfo completo de manera simultanea (comienzo del secado secundario). La temperatura se mantuvo a 30 °C durante 360 minutos y los frascos se taparon despues al vacfo.
Liofilizacion con inclusion de una etapa de recocido:
Despues de 30 minutos a -40 °C, la temperatura se elevo con una tasa de 2 °C por minuto a -10 °C o -20 °C, temperatura a la cual se mantuvo durante 120 o 420 minutos antes de que la temperatura bajase de nuevo con 2 °C por minuto a -40 °C, donde las muestras se mantuvieron durante 60-90 minutos antes del comienzo del secado primario.
Los resultados se muestran en la Tabla 20, en donde los terminos acortados usados en relacion con los excipientes y el ciclo de liofilizacion significan lo siguiente:
cantidad de excipientes de 1x se refiere a que la solucion de PBGD comprende Na2HPO4 x 2 H2O, 3,67 mM, glicina 27 mM y manitol 220 mM preparada en agua esteril.
cantidad de excipientes de 1,5x se refiere a que la solucion de PBGD comprende Na2HPO4 x 2 H2O, 5,51 mM, glicina 40,5 mM y manitol 375 mM preparada en agua esteril, es decir, 1,5x de cada uno de los componentes presentes en el tampon de 1x.
excipientes de 2x se refiere a que la solucion de PBGD comprende Na2HPO4 x 2 H2O, 7,34 mM, glicina 54 mM y manitol 500 mM preparada en agua esteril, es decir, 2x de cada uno de los componentes presentes en el tampon de 1x. El ciclo de liofilizacion original es tal como se describe anteriormente.
El ciclo de liofilizacion con recocido es tal como se describe anteriormente, en donde la etapa de recocido comprende elevar la temperatura a -10 °C y mantener la muestra a esta temperatura durante 120 minutos antes de bajarla de nuevo a -40 °C.
El ciclo de liofilizacion con recocido prolongado es tal como se describe anteriormente, en donde la etapa de recocido comprende elevar la temperatura a -20 °C y mantener la muestra a esta temperatura durante 420 minutos antes de bajarla de nuevo a -40 °C.
Tabla 20:
Figure imgf000033_0001
Ejemplo 5
El efecto de los diferentes modos de liofilizacion y/o de la cantidad de excipientes sobre el aspecto del producto liofilizado
Las soluciones de PBGD concentradas y liofilizadas se prepararon tal como se describe en el ejemplo 4 y las referencias a la cantidad de excipientes y al tipo de ciclo de liofilizacion tienen el mismo significado que en el ejemplo 4.
Los siguientes resultados se obtuvieron mediante inspeccion visual de los productos liofilizados:
A: La comparacion de tres productos preparados a partir de soluciones que comprenden, respectivamente, 4,6 mg/ml 66,6 mg/ml y 109,4 mg/ml de rhPBGD mostro que el numero de roturas en el producto liofilizado aumento con el aumento de la concentracion de rhPBGD.
B: La comparacion de dos productos, preparados a partir de una solucion que comprende 150 mg/ml de rhPBGD, y que comprende una cantidad de 1x y 1,5x de excipientes mostro que el numero de roturas en el producto liofilizado era menor para el producto que comprendfa una cantidad de 1,5x de excipientes que el producto que comprende una cantidad de 1x de excipientes.
C: La comparacion de dos productos liofilizados preparados a partir de una solucion de 150 mg/ml de rhPBGD que comprende una cantidad de 1x y 2x de excipientes mostro que el numero de roturas en el producto liofilizado con una cantidad de excipientes de 2x era menor que el producto que comprende la cantidad de 1x de excipientes.
D: La comparacion de tres productos liofilizados preparados a partir de una solucion de 150 mg/ml de rhPBGD usando los ciclos de liofilizacion original, con recocido y con recocido prolongado, mostro que el numero de roturas en el producto liofilizado era menor en el producto que se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion con recocido que en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de liofilizacion original. Ademas, el numero de roturas en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de liofilizacion con recocido prolongado era menor que en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de liofilizacion con recocido.
E: Se prepararon tres productos liofilizados a partir de una solucion de rhPBGD de 150, 175 y 200 mg/ml, respectivamente. Los productos liofilizados comprendfan cada uno una cantidad de 1,5x excipientes y se liofilizaron con el ciclo de recocido. Ninguno de los productos liofilizados comprendieron ninguna rotura.
F: Se prepararon dos productos de rhPBGD liofilizados a partir de una solucion de 150 mg/ml de rhPBGD. Uno de ellos comprendfa una cantidad de excipientes de 1x y se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion original, mientras que el otro comprendfa una cantidad de 1,5x excipientes y se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion con recocido prolongado. El producto que comprende una cantidad de 1,5x de excipientes y se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion con recocido prolongado comprendio menos roturas que el producto que comprende una cantidad de excipientes de 1x y se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion original.
G: Se prepararon dos productos de rhPBGD liofilizados a partir de una solucion de 150 mg/ml de rhPBGD. Uno de ellos comprendfa una cantidad de excipientes de 1x y se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion original, mientras que el otro comprendfa Tween 80 al 0,1 % en combinacion con una cantidad de 1x de excipientes y se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion con recocido prolongado. El producto que comprende Tween 80 al 0,1 % en combinacion con una cantidad de 1x de excipientes y que se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion con recocido prolongado comprendio menos roturas que el producto que comprende una cantidad de excipientes de 1x y que se preparo de acuerdo con el ciclo de liofilizacion original.
Ejemplo 6
El efecto de volumen de recuperacion, la cantidad de excipientes y el modo de liofilizacion sobre la estabilidad de rhPBGD liofilizada
Las muestras liofilizadas de soluciones concentradas de rhPBGD se prepararon tal como se describe en el ejemplo 4.
La "solucion de carga" es una solucion concentrada de PBGD antes de la liofilizacion.
La Tabla 21 muestra los resultados de soluciones de rhPBGD que tienen las siguientes caractensticas en relacion con la concentracion de rhPBGD, cantidad de excipientes (en donde se usan las mismas definiciones que en el ejemplo 4), el modo de liofilizacion (en donde se usan las mismas definiciones que en el ejemplo 4) y la proporcion de volumen de carga (vol. de carga que es el volumen de la composicion antes de que se liofilice) frente al tiempo de recuperacion (vol. de recuperacion que es el volumen en el que el producto liofilizado se resuspende):
Solucion 1:
• Aproximadamente 5 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion original
• Vol. de carga = Vol. de rec.
Solucion 2:
• Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion original
• Vol. de carga = Vol. de rec. a 2x
Solucion 3:
• Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion original
• Vol. de carga = Vol. de rec.
Solucion 4:
• Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion original
• Vol. de carga = Vol. de rec. a 1,5x
Solucion 5:
• Aproximadamente 90 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 2/3x
• Ciclo de liofilizacion original
• Vol. de carga = Vol. de rec. a 1,5x
Solucion 6:
• Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1/2x
• Ciclo de liofilizacion original
• Vol. de carga = Vol. de rec. a 2x
Solucion 7:
• Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion con recocido
• Vol. de carga = Vol. de rec.
Solucion 8:
• Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion con recocido
• Vol. de carga = Vol. de rec. a 2x
Solucion 9:
• Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion con recocido
• Vol. de carga = Vol. de rec.
Solucion 10:
• Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD
• cantidad de excipiente de 1x
• Ciclo de liofilizacion original
• Vol. de carga = Vol. de rec.
Aunque no se muestra en la Tabla 21, tambien se probo la pureza de cada punto temporal y se descubrio que era el 100 % en todos los casos.
Para el punto temporal de la semana 4 y 9 en la solucion 2 y para el punto temporal de la semana 9 en la solucion 4 se uso un volumen de recuperacion incorrecto.
Tabla 21:
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
Ejemplo 7
Ejemplo de diferentes excipientes sobre la estabilidad de rhPBGD
La rhPBGD se concentro tal como se describe en el ejemplo 4 y despues se le cambio el tampon por uno de los cuatro tampones descritos a continuacion. Los productos se liofilizaron tal como se describe en el Ejemplo 4 con una etapa de recocido original incluida, y se probo la estabilidad de las muestras tal como se describe en el ejemplo 6.
Se probo el efecto de las cuatro formulaciones sobre la estabilidad de la rhPBGD:
Formulacion A (se corresponde con la solucion 9 en el ejemplo 6): manitol 250 mM, glicina 27 mM y Na2HPO43,67 mM
Formulacion B: manitol 250 mM, glicina 27 mM y Tris-HCl 10 mM.
Formulacion C: manitol 250 mM, glicina 27 mM, Na2HPO43,67 mM y Tween 80 al 0,1 %.
Formulacion D: manitol 221 mM, sacarosa 29 mM, glicina 27 mM, Na2HPO43,67 mM y Tween 80 al 0,1 %. Los resultados se muestran en la Tabla 22.
Figure imgf000037_0002

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una composicion que comprende al menos 10 mg/ml de alfa-manosidasa, y en donde menos del 5 % de la cantidad total de la alfa-manosidasa en dicha composicion esta presente en la forma de agregados, abarcando dichos agregados cualquier dfmero o multfmero de la alfa-manosidasa.
2. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde la alfa-manosidasa comprende:
i) una secuencia de aminoacidos tal como se define por la SEQ ID NO: 21; y/o
ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i); y/o iii) un analogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii), siendo la secuencia de aminoacidos de dicho analogo al menos el 75 % identica a una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii), y en donde
la parte funcionalmente equivalente en ii) y/o el analogo funcionalmente equivalente en iii) comprende un dominio o una subsecuencia de la alfa-manosidasa que incluye el sitio catalftico necesario para permitir que el dominio o la subsecuencia ejerza sustancialmente la misma actividad enzimatica que la alfa-manosidasa de longitud completa.
3. Uso de una composicion que comprende 50-300 mg/ml de alfa-manosidasa para la fabricacion de un medicamento para inyeccion subcutanea a un mamfero.
4. El uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde la alfa-manosidasa comprende un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en:
i) una secuencia de aminoacidos tal como se define por la SEQ ID NO: 21; y/o
ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i); y/o iii) un analogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii), siendo la secuencia de aminoacidos de dicho analogo al menos el 75 % identica a una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii), y en donde
la parte funcionalmente equivalente en ii) y/o el analogo funcionalmente equivalente en iii) comprende un dominio o una subsecuencia de la alfa-manosidasa que incluye el sitio catalftico necesario para permitir que el dominio o la subsecuencia ejerza sustancialmente la misma actividad enzimatica que la alfa-manosidasa de longitud completa.
5. El uso de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, en donde el medicamento es para su uso en el tratamiento de alfamanosidosis.
6. Una composicion que comprende 50-300 mg/ml de alfa-manosidasa para su uso como un medicamento y en donde la composicion es para inyeccion subcutanea a un m ai^ero.
7. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6, para su uso en el tratamiento de alfa-manosidosis.
8. La composicion para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en donde la alfa-manosidasa comprende:
i) una secuencia de aminoacidos tal como se define por la SEQ ID NO: 21; y/o
ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i); y/o iii) un analogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii), siendo la secuencia de aminoacidos de dicho analogo al menos el 75 % identica a una secuencia de aminoacidos tal como se define en i) o ii), y en donde
la parte funcionalmente equivalente en ii) y/o el analogo funcionalmente equivalente en iii) comprende un dominio o una subsecuencia de la alfa-manosidasa que incluye el sitio catalftico necesario para permitir que el dominio o la subsecuencia ejerza sustancialmente la misma actividad enzimatica que la alfa-manosidasa de longitud completa.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1713904B1 (en) 2004-01-30 2016-06-29 Shire Pharmaceuticals Ireland Limited Production and purification of recombinant arylsulfatase a
HUE042402T2 (hu) * 2006-04-04 2019-06-28 Chiesi Farm Spa Eljárás polipeptid töményítésére
CA2790786C (en) * 2010-02-24 2019-09-24 Zymenex A/S Process for production and purification of recombinant lysosomal alpha-mannosidase
LT2588130T (lt) * 2010-06-25 2016-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Terapinės priemonės pristatymas cns
JP6073783B2 (ja) 2010-06-25 2017-02-01 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド ヘパランｎ−スルファターゼのｃｎｓ送達のための方法および組成物
HRP20191923T1 (hr) * 2010-06-25 2020-01-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Postupci i sastavi za isporuku arilsulfataze a u cns
PT3103469T (pt) 2010-06-25 2021-03-04 Shire Human Genetic Therapies Administração de agentes terapêuticos no snc
US10336992B2 (en) 2011-07-08 2019-07-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of arylsulfatase A
US20140377244A1 (en) 2011-12-23 2014-12-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
NZ707753A (en) * 2012-11-13 2019-07-26 Chiesi Farm Spa Purification of recombinant human galactocerebroside β-galactosidase (rhgalc)
CA2893609A1 (en) * 2012-12-11 2014-06-19 Centogene Ag Method for the diagnosis of metachromatic leukodystrophy
CN112126634A (zh) 2013-01-09 2020-12-25 夏尔人类遗传性治疗公司 含用于纯化芳基硫酸酯酶a的方法
WO2014144549A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
AU2015236340B2 (en) * 2014-03-24 2020-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Lyophilized factor IX formulations
EP3676375A4 (en) * 2017-08-31 2021-04-07 Green Cross Corporation PROCESS FOR PURIFYING A SULFATASE PROTEIN
KR102290596B1 (ko) * 2020-09-10 2021-08-19 주식회사 파이안바이오테크놀로지 분리된 미토콘드리아를 포함하는 주사용 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2041280A1 (en) 1990-05-10 1991-11-11 Yosuke Sawada Arylsulfatase
NO960163D0 (no) * 1996-01-15 1996-01-15 Thomas Berg Mutasjonsdeteksjon av bovin
DE69901536T2 (de) 1998-01-27 2003-01-16 Hemebiotech A/S, Hellerod Behandlung von akuter intermittierender porphyria oder anderen porphyrischen krankheiten
IL140155A (en) * 1998-06-09 2005-12-18 Statens Seruminstitut Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products
DK2270044T3 (en) * 1998-06-09 2015-01-26 Csl Behring Ag Liquid immunoglobulin G (IgG) product
US6537777B1 (en) 1998-07-27 2003-03-25 Hemebiotech A/S Human porphobilinogen deaminase sequences
AUPQ026799A0 (en) * 1999-05-10 1999-06-03 Csl Limited Method of increasing protein stability by removing immunoglobulin aggregates
JP2003505057A (ja) 1999-07-27 2003-02-12 ヘム−バイオテック エイ／エス ｒｈＰＢＧＤの製造及び急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）及び他のポルフィリン症の患者を処置するための新規な治療方法
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
CA2429210A1 (en) 2000-11-15 2002-05-23 Jason C. Goodrick Expression system for recombinant proteins
WO2002099092A2 (en) * 2001-06-07 2002-12-12 Hemebiotech A/S Production of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase
AU2002317700A1 (en) * 2001-06-07 2002-12-16 Hemebiotech A/S Production of recombinant human arylsulfatase a
EP1402014A1 (en) 2001-06-29 2004-03-31 Hemebiotech A/S A process for purification of recombinant porphobilinogen deaminase
US7232670B2 (en) * 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
WO2003057179A2 (en) 2002-01-11 2003-07-17 Biomarin Pharmaceutical, Inc. Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
WO2003066669A2 (en) * 2002-02-04 2003-08-14 Millipore Corporation Process for removing protein aggregates and virus from a protein solution
CH694697A5 (de) 2004-01-29 2005-06-15 Koelbl Engineering Und Consult Gummimehl-enthaltende Elastomerlegierungen.
EP1713904B1 (en) * 2004-01-30 2016-06-29 Shire Pharmaceuticals Ireland Limited Production and purification of recombinant arylsulfatase a
WO2005094874A1 (en) 2004-04-01 2005-10-13 Zymenex A/S Medical use of alpha-mannosidase
US20060051347A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Winter Charles M Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof
HUE042402T2 (hu) * 2006-04-04 2019-06-28 Chiesi Farm Spa Eljárás polipeptid töményítésére

Also Published As

Publication number Publication date
US20090246187A1 (en) 2009-10-01
US20180289777A1 (en) 2018-10-11
AU2008229659B2 (en) 2013-01-31
JP2014051503A (ja) 2014-03-20
BRPI0709737A2 (pt) 2011-07-26
IL194267A0 (en) 2011-08-01
ZA200809540B (en) 2019-09-25
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KR101504969B1 (ko) 2015-03-24
JP5878152B2 (ja) 2016-03-08
JP2009532394A (ja) 2009-09-10
EP2631242B1 (en) 2022-08-03
KR20150103339A (ko) 2015-09-09
CA2644642C (en) 2016-01-26
JP2014058521A (ja) 2014-04-03
HUE042402T2 (hu) 2019-06-28
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IL241654A0 (en) 2015-11-30
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JP5384232B2 (ja) 2014-01-08
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NZ623123A (en) 2015-04-24
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