ES2713560T3 - Péptidos que tienen dominios de dedos de zinc y usos de estos - Google Patents

Péptidos que tienen dominios de dedos de zinc y usos de estos Download PDF

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Abstract

Un péptido con dedos de zinc que comprende la secuencia: N'- [(Fórmula 2) - X6]n0 - {[(Fórmula 2) - X5 - (Fórmula 2) - X6]n1 - [(Fórmula 2) - X5 - (Fórmula 2) - XL]}n2 - [(Fórmula 2) - X5 - (Fórmula 2) - X6]n3 - [(Fórmula 2) - X5 - (Fórmula 2)] - [X6 - (Fórmula 2) -]n4 -C', n donde n0 es 0 o 1, n1 es de 1 a 4, n2es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, X5 es una secuencia enlazadora de aminoácidos, X6 es una secuencia enlazadora de 6 o7 aminoácidos, y XL es una secuencia enlazadora de al menos 8 aminoácidos, y la Fórmula 2 es un dominio de dedos de zinc de la secuencia - X0-2 C X1-5 C X2-7 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3-6 H/C -, en donde X es cualquier aminoácido, los números en el subíndice indican los posibles números de residuos representados por X en esa posición, y el número en superíndice indica la posición del aminoácido en la secuencia de reconocimiento del dominio de dedos de zinc; en donde al menos una secuencia X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 es la secuencia de aminoácidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1).

Description

DESCRIPCION
Peptidos que tienen dominios de dedos de zinc y usos de estos
Campo de la Invencion
Esta invencion se refiere a peptidos con dedos de zinc novedosos que tienen propiedades convenientes, lo que incluye especificidad de union y afinidad por secuencias de acidos nucleicos seleccionadas y represion de la expresion del gen objetivo. En particular, la invencion se refiere a protemas represoras transcripcionales de dedos de zinc y a la represion de genes implicados en trastornos neurologicos, y a metodos de creacion y usos que involucran dichas protemas y acidos nucleicos.
Antecedentes de la Invencion
Los trastornos neurologicos son enfermedades que afectan el sistema nervioso central (cerebro y medula espinal), el sistema nervioso periferico (nervios perifericos y nervios craneales), y el sistema nervioso autonomo (partes del cual se localizan tanto en el sistema nervioso central como en el periferico). Se han identificado mas de 600 enfermedades neurologicas en los seres humanos, que en conjunto afectan todas las funciones del cuerpo, lo que incluye la coordinacion, la comunicacion, la memoria, el aprendizaje, la alimentacion, y en algunos casos la mortalidad.
Aunque muchos tejidos y organos en animales son capaces de autorreparacion, generalmente el sistema neurologico no lo es. Por lo tanto, los trastornos neurologicos se caracterizan a menudo por ser de naturaleza progresiva, al comenzar con problemas menores que permiten la deteccion y el diagnostico, pero que se tornan cada vez mas graves, lo que a veces resulta en la muerte del individuo afectado. Si bien aun se desconocen las causas o desencadenantes exactos de muchos trastornos neurologicos, para otros las causas estan bien documentadas e investigadas. Para algunas de estas enfermedades existen tratamientos "eficaces", que alivian los smtomas y/o prolongan la supervivencia. Sin embargo, a pesar de esfuerzos intensos de investigacion, para la mayona de los trastornos neurologicos, y particularmente para las enfermedades mas graves, todavfa no existe cura. Por lo tanto, existe una clara necesidad de nuevos agentes terapeuticos y tratamientos para los trastornos neurologicos.
El conocimiento actual de los trastornos neurologicos muestra que estos pueden causarse por muchos factores diferentes, lo que incluye (pero no se limitan a): anomalfas geneticas hereditarias, problemas en el sistema inmunitario, lesiones al cerebro o al sistema nervioso, o diabetes. Una causa conocida de trastorno neurologico es una anomalfa genetica que conduce a la expansion patologica de las repeticiones de CAG en ciertos genes, lo que resulta en regiones de poliglutamina (poliQ) extensas en productos de genes mutados expresados (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228). Se cree que las protemas resultantes se agregan y causan enfermedades de ganancia de funcion toxicas, lo que incluye las ataxias espinocerebelosas, la atrofia muscular espinobulbar y la enfermedad de Huntington (HD; Orr y Zoghbi (2007) Annu. Rev. Neurosci. 30: 575-621; Cha (2007) Prog. Neurobiol. 83(4): 228-248). La neuropatologfa de la HD se asocia con la muerte celular neuronal selectiva, principalmente de las neuronas espinosas medias del nucleo caudado y el putamen, y en menor medida de las neuronas corticales, lo que conduce a disfuncion cognitiva y corea (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228; y Kumar y otros Pharmacol. Rep. 62(1): 1-14). Desde el descubrimiento, en 1993, de que el gen htt causa la HD (The-Huntington's-Disease-Collaborative-Research-Group (1993) Cell 72(6): 971-983), se ha centrado mucha atencion en como el numero de repeticiones de CAG afecta la patologfa y la progresion de esta enfermedad. Normalmente, el numero de repeticiones de CAG en el gen htt de tipo salvaje vana de 10 a 29 (con una mediana de 18), mientras que en los pacientes con HD se encuentra tfpicamente en el intervalo de 36 a 121 (con una mediana de 44). Ademas, se ha demostrado que la edad de aparicion de la enfermedad HD se correlaciona con el numero de repeticiones de CAG (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228; y Kumar y otros Pharmacol. Rep. 62(1): 1-14).
Aunque ha habido una gran cantidad de investigaciones sobre curas para la enfermedad HD, las terapias disponibles actualmente tratan solo los smtomas de la enfermedad, y por lo tanto todavfa no hay forma de detener o retrasar la aparicion o progresion de la HD (Walker (2007) Lancet 369(9557): 218-228; y Kumar y otros Pharmacol. Rep. 62(1): 1­ 14). Por esta razon, sena extremadamente conveniente tener un tratamiento para la enfermedad HD que se dirija a la causa antes que a los smtomas de la enfermedad.
Recientemente, se demostro que la interferencia de ARN (ARNi) reduce la expresion del htt mutante (van Bilsen y otros (2008) Hum. Gene Ther. 19(7): 710-719; Zhang y otros (2009) J. Neurochem. 108(1): 82-90; Pfister y otros (2009) Curr. Biol. 19(9): 774-778). Aunque se ha demostrado que el ARNi es una herramienta muy poderosa, el exito de esta tecnica depende de dirigirse a un solo nucleotido o polimorfismos de delecion que diferencian entre alelos mutantes y wt,y estos a menudo difieren de paciente a paciente. El requerimiento aparente de disenos de ARNip personalizados plantea actualmente desafms para ensayos clmicos y su uso aprobado en seres humanos.
En un enfoque mas general, Hu y otros usaron acido nucleico peptfdico (PNA), y oligomeros antisentido de acido nucleico bloqueado (LNA), para dirigirse a las repeticiones de CAG expandidas de los genes ataxina-3 y htt (Hu y otros (2009) Nat. Biotecnol. 27(5): 478-484; Hu y otros (2009) Ann. NY Acad. Sci. 1175: 24-31). Ellos informaron la inhibicion selectiva del alelo mutante con acidos nucleicos peptfdicos (PNA) por hasta 22 dfas. Aunque estos resultados fueron prometedores, los PNA no pueden suministrarse al sistema nervioso central. Por lo tanto, los autores probaron, ademas, los acidos nucleicos bloqueados (LNA), que quizas son mas adecuados para su uso in vivo. Aunque se observo una inhibicion selectiva del alelo mutante, solo se observo una inhibicion de hasta el 30 % del htt wt a la concentracion mas alta y eficaz de LNA usada.
Por lo tanto, sena altamente conveniente tener moleculas y tratamientos terapeuticos alternativos y/o mas eficaces para la HD y los trastornos relacionados causados por repeticiones de CAG expandidas.
En consecuencia, la presente invencion busca superar o al menos aliviar uno o mas de los problemas en la tecnica anterior.
Resumen de la Invencion
En terminos generales, la presente invencion proporciona nuevos marcos de peptidos con dedos de zinc (y moleculas que codifican acidos nucleicos) que pueden usarse para la modulacion de la expresion genica in vitro y/o in vivo. Los nuevos peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden ser utiles particularmente en la modulacion de genes objetivo asociados con repeticiones de nucleotidos expandidas, tales como repeticiones de CAG, y mas espedficamente en la represion de dichos genes. En algunas modalidades, los nuevos peptidos con dedos de zinc de la invencion contienen un numero mayor de dominios de dedos de zinc individuales que cualquier otro peptido con dedos de zinc artificial conocido que demuestre poseer actividad de modulacion transcripcional ya sea in vitro o in vivo y, por lo tanto, abre la posibilidad de dirigirse a secuencias de acido nucleico mas largas de lo que se crefa posible anteriormente y, como consecuencia, la posibilidad de un direccionamiento genico mas espedfico, lo que puede ser util particularmente para la modulacion de la expresion genica dentro del genoma y/o para distinguir entre secuencias similares de longitudes diferentes. Ademas, la invencion se refiere a moleculas y composiciones terapeuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con secuencias de repeticion de c Ag expandidas, tales como enfermedades neurologicas y particularmente la enfermedad de Huntington (HD). Ademas, se describen metodos y regfmenes de tratamientos terapeuticos para el tratamiento de pacientes afectados por o diagnosticados con HD. Por ejemplo, las moleculas terapeuticas de la invencion pueden usarse para retrasar la aparicion de los smtomas y/o para tratar o aliviar los smtomas de la enfermedad, y/o para reducir la gravedad o evitar la progresion de la enfermedad.
Por lo tanto, en esta invencion, el solicitante ha creado peptidos con dedos de zinc (ZFP) novedosos que pueden usarse para reducir la expresion de genes htt mutantes. Ademas, dado que los dedos de zinc pueden volver a disenarse facilmente para unirse a diferentes secuencias de ADN (Annu. Rev. Biochem. 70: 313-340 (2001); Chem. Rev. 104(2): 789-799; Bioqmmica 41(22): 7074-7081 (2002); Nucleic Acids Res. 34 (edicion del servidor web): W516-52392006); Nat. Methods 7(2): 91-9, (2009); Genome Res. 19(7): 1279-1288 (2009); Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 100(21): 12271­ 12276 (2003); Nat. Protoc. 1(3): 1637-1652 (2006); Mol. Cell 31(2): 294-301 (2008), lo que incluye las repeticiones de CAG (Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 106(24): 9607-9612, (2009)), pueden ser utiles para dirigirse a genes tales como el htt a un nivel transcripcional.
Se uso un diseno racional para crear ZFP capaces de reconocer y unir poli-5'-GC(A/T)-3', de manera que reconocenan tanto las secuencias de poli-CAG como su cadena de ADN complementaria. Se demostro que la expresion estable de los ZFP reduce la expresion del gen htt mutante cromosomal en una lmea celular modelo, tanto a nivel de protema como de ARN. Ademas, se demostro que la represion del gen mutante persiste durante penodos extensos de al menos 20 dfas.
Se sintetizaron ZFP que vanan de 4 a 18 dedos y se demostro que reprimen un gen objetivo con 35 o mas repeticiones de CAG preferentemente, cuando se comparan con repeticiones mas cortas, lo que demuestra la utilidad de estas moleculas para dirigirse preferentemente a repeticiones de CAG extensas. En consecuencia, la expresion del gen htt mutante puede reprimirse a la vez que se deja el alelo de tipo salvaje sin afectacion relativamente.
Mediante la concatenacion de dominios de dedos de zinc individuales en cadenas largas mediante el uso de secuencias enlazadoras seleccionadas, los peptidos con dedos de zinc de la invencion se han disenado y sintetizado con un numero mayor de dominios de dedos de zinc que los conocidos anteriormente; y se ha demostrado que estos ZFP extensos se dirigen selectivamente a secuencias de acidos nucleicos con una afinidad y especificidad alta.
En consecuencia, en un primer aspecto de la invencion se proporciona un peptido con dedos de zinc que comprende la secuencia: N'- [(Formula 2) - X6]n0 - {[(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - Xe]n1 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - XJ}n2 -[(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - X6]n3 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2)] - [X6 - (Formula 2)]n4 -C', en donde n0 es 0 o 1, n1 es de 1 a 4, n2 es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, X5 es una secuencia enlazadora de 5 aminoacidos, X6 es una secuencia enlazadora de 6 o 7 aminoacidos, y Xl es una secuencia enlazadora de al menos 8 aminoacidos; y la Formula 2 es un dominio de dedos de zinc de la secuencia - X0-2 C X1-5 C X2-7 X '1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5X+6 H X3-6 h/c-, en donde X es cualquier aminoacido, los numeros en el submdice indican los posibles numeros de residuos representados porXen esa posicion, y el numero en supermdice indica la posicion del aminoacido en la secuencia de reconocimiento del dominio de dedos de zinc. Adicionalmente, al menos una secuencia X’1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 es la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1). Ventajosamente, n0 y/o n4 = 0. Adecuadamente, X6 es un enlazador de 6 aminoacidos. Por lo tanto, el peptido con dedos de zinc de la invencion puede tener la formula N'- {[(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - Xe]n1 -[(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - XL]}n2 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - X6]n3 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2)] -C', en donde X6 es una secuencia enlazadora de 6 aminoacidos, y n1, n2, n3, n4, X5 y Xl son como se describio anteriormente.
En algunas modalidades beneficiosas, la secuencia enlazadora extensa Xl es de 8 a 50 aminoacidos, o de 11 a 40 aminoacidos; n1 es preferentemente 2, y n3 es preferentemente 2.
Al configurar la secuencia X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 para ser la misma o similar secuencia de aminoacidos en una pluralidad de dominios de dedos de zinc adyacentes (de modo que cada uno de la pluralidad de dedos se une preferentemente a la misma secuencia de trinucleotidos), los peptidos de la invencion son capaces ventajosamente de dirigirse (o unirse) a secuencias de repeticion de trinucleotidos en el ADN, las que pueden asociarse con anomalfas geneticas. En este y otros aspectos de la invencion, por lo tanto, al menos una secuencia X-1 X+1X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 es la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1), lo que permite el direccionamiento a secuencias de repeticion de
CAG.
En consecuencia, la invencion proporciona un peptido con dedos de zinc que comprende al menos 4 dominios de dedos de zinc de Formula 2: X0-2 C X1-5 C X2-7 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3-6 h/c, numeros en el subrndice indican los posibles numeros de residuos representados por X en esa posicion, y el numero en supermdice indica la posicion del aminoacido en la secuencia de reconocimiento del dominio de dedos de zinc; y al menos una secuencia X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 es la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1). En algunas modalidades, al menos 4 (por ejemplo, 4, 6, 11, 12 o 18) dominios de dedos de zinc adyacentes del peptido pueden tener la secuencia QRATLQR; y adecuadamente, todos los dominios de dedos de zinc del peptido tienen esta secuencia.
Peptidos particularmente utiles de la invencion comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
10, SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 14.
En otro aspecto, la invencion se refiere a protemas quimericas o de fusion que comprenden los peptidos con dedos de zinc de la invencion conjugados a un dominio sin dedos de zinc.
En otro aspecto, la invencion se refiere a una biblioteca de peptidos con dedos de zinc virgen. Por lo tanto, se contempla el uso de una biblioteca de peptidos con dedos de zinc virgen en la seleccion de un peptido con dedos de zinc capaz de unirse a una secuencia de acidos nucleicos objetivo deseada, asf como tambien peptidos con dedos de zinc identificados a partir de las bibliotecas de la invencion.
En otro aspecto, la invencion proporciona usos terapeuticos y no terapeuticos (por ejemplo, diagnosticos) para los peptidos con dedos de zinc y las protemas de fusion de la invencion. Los aspectos y modalidades de la invencion incluyen, por lo tanto, composiciones farmaceuticas que comprenden los peptidos con dedos de zinc. En una modalidad, la invencion se refiere a un peptido con dedos de zinc para su uso en medicina. Mas espedficamente, los peptidos con dedos de zinc y los agentes terapeuticos de la invencion pueden usarse para modular la expresion de un gen objetivo en una celula. Los peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden usarse en el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones del cuerpo humano o animal, tales como enfermedades neurologicas, por ejemplo, enfermedad de Huntington; y otras enfermedades causadas por o diagnosticadas por la expansion de genes de secuencias de nucleotidos repetidos, particularmente secuencias de repeticion de trinucleotidos. La descripcion se refiere, ademas, al tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con el gen de repeticion de CAG mutado y/o la expresion de productos genicos que contienen regiones de poliglutamina (poliQ) extensas. El tratamiento puede incluir, ademas, tratamientos preventivos asf como tambien terapeuticos y el alivio de una enfermedad o afeccion.
La invencion abarca, ademas, acidos nucleicos que codifican los peptidos con dedos de zinc, bibliotecas de peptidos y protemas de fusion de la invencion, por ejemplo: vectores de expresion y vectores virales, tales como AAV (por ejemplo, para su uso en terapia genica).
En aun otro aspecto, la invencion proporciona un metodo para crear una secuencia de acido nucleico que codifica un peptido con poli-dedos de zinc que comprende al menos 8 dominios de dedos de zinc de Formula 1: X0-2 C X1-5 C X9-14 H
X3-6H/c, en donde X es cualquier aminoacido y los numeros en el subrndice indican el posible numero de residuos representados porXen esa posicion.
El metodo comprende: (a) proporcionar al menos 4 moleculas de acido nucleico que codifican un par de dominios de dedos de zinc de Formula 1, en donde los dominios de dedos de zinc adyacentes de cada par se separan por una secuencia enlazadora de 5 aminoacidos; (b) unir 2 o 3 moleculas de acido nucleico de la etapa (a) para crear al menos 2 moleculas de acido nucleico que codifican una matriz de 4 o 6 dominios de dedos de zinc, en donde los pares adyacentes de dominios de dedos de zinc de la etapa (a) se separan por una secuencia enlazadora de 6 o 7 aminoacidos; y (c) unir las al menos 2 moleculas de acido nucleico de la etapa (b) para crear una secuencia de acido nucleico que codifica un peptido con poli-dedos de zinc, en donde las matrices adyacentes de dominios de dedos de zinc de la etapa (b) se separan por un secuencia enlazadora de al menos 8 aminoacidos. Opcionalmente, el metodo puede comprender, ademas, anadir un unico dominio de dedos de zinc para crear un peptido con poli-dedos de zinc que tiene un numero impar de dominios de dedos de zinc. Adicionalmente, el metodo comprende, ademas, la etapa (d) unir al extremo 5' o 3' de la secuencia de acido nucleico de la etapa (c), un acido nucleico que codifica un unico dominio de dedos de zinc y una secuencia enlazadora de 5 a 7 aminoacidos para crear opcionalmente un peptido con poli-dedos de zinc que tenga un numero impar de dominios de dedos de zinc. Las etapas del metodo de la invencion pueden realizarse en cualquier orden apropiado.
Se apreciara que existen muchos metodos diferentes mediante los cuales puede obtenerse una secuencia de acido
nucleico que codifica dicho peptido con poli-dedos de zinc. Por lo tanto, la invencion se dirige, ademas, a acidos nucleicos que codifican dichos peptidos con poli-dedos de zinc no importa como se obtengan, y a peptidos con poli-dedos de zinc que pueden obtenerse mediante la expresion de las secuencias de acido nucleico anteriores.
En consecuencia, la descripcion proporciona ademas un metodo para crear un peptido con poli-dedos de zinc que comprende al menos 8 dominios de dedos de zinc de Formula 1: X0-2 C X1-5 C X9-14 H X3.6 h/c, en donde X es cualquier aminoacido y los numeros en el subrndice indican el posible numero de residuos representados por X en esa posicion, el metodo comprende la expresion de una secuencia de acido nucleico que puede obtenerse mediante el metodo anterior.
La descripcion proporciona, ademas, un metodo para crear un peptido con poli-dedos de zinc que comprende al menos 8 dominios de dedos de zinc de Formula 1: X0-2 C X1-5 C X9-14 H X3-6 h/c, en donde X es cualquier aminoacido y los numeros en el subrndice indican el posible numero de residuos representados por X en esa posicion, el metodo comprende: (a) crear al menos 4 pares de dominios de dedos de zinc de Formula 1, los dominios de dedos de zinc adyacentes de cada par se separan por una secuencia enlazadora de 5 aminoacidos; (b) crear al menos 2 matrices de 4 o 6 dominios de dedos de zinc cada una mediante la union de 2 o 3 pares de dedos de zinc de la etapa (a) mediante el uso de una secuencia enlazadora de 6 o 7 aminoacidos; y (c) unir las al menos 2 matrices de dominios de dedos de zinc de la etapa (b) mediante el uso de una secuencia enlazadora de al menos 8 aminoacidos. Adecuadamente, el metodo es para crear un peptido con poli-dedos de zinc de acuerdo con la descripcion.
Se apreciara que los peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden formar derivados o conjugarse despues a moleculas adicionales, y que dichos derivados y conjugados caen dentro del alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se especifique de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en la presente descripcion tienen el mismo significado que el conocido comunmente por el experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La invencion se ilustra adicionalmente mediante los dibujos adjuntos, en los que:
Figura 1 Las matrices de dedos de zinc de acuerdo con la invencion se unen a las repeticiones de CAG. (A) Una ilustracion esquematica de una matriz de 12 dedos, que muestra las helices de reconocimiento que entran en contacto con las bases 5'-GCT-3' en la cadena de ADN inferior. Se construyeron matrices similares de 4, 6, 12 o 18 dedos de zinc (ZF4xHunt, ZF6xHunt, ZF12xHunt y ZF18xHunt). Se anadieron senales de localizacion nuclear (NLS) y efectores (por ejemplo, el dominio de represion de la transcripcion Kox-1) a los extremos terminales N- y C-, respectivamente. (B) Los ensayos de retardo en gel muestran matrices de 4, 6 o 12 dedos que unen ADNbc de poli-CAG y forman complejos distintos; control negativo, mezcla de transcripcion-traduccion (TNT). (C) Columna de la mano izquierda: una ilustracion esquematica de un diseno de dedos de zinc hubrido de acuerdo con una modalidad de la invencion, que reconoce la secuencia de acido nucleico 5'-GC(A/T)-3', lo que permite la union a las cadenas complementarias (GCA)n o (GCT)n de la secuencia de ADNbc de repeticion de CAG. Columna de la mano derecha: un ensayo de retardo en gel que demuestra que el dedo de zinc hforido se une por igual a tripletes GCA o GCT en secuencias mixtas. (D) Ensayo de retardo en gel de especificidad que ilustra que un peptido con dedos de zinc de acuerdo con una modalidad de la invencion (ZF6xHunt), se une preferentemente a repeticiones de CAG en comparacion a secuencias mutantes (D=A,G,T; S=C,G; H=A,C,T).
Figura 2 Represion del informador de poli-CAG episomal mediante peptidos con dedos de zinc de la invencion. Los resultados se ilustran para ZFP sin dominios efectores (paneles B a D), o fusionados al dominio represor Kox-1 (paneles E a G). (A) El plasmido informador pEH contiene EGFP, fusionado a secuencias codificantes de poli-Q de longitud diferente, bajo un promotor de SV40. Un gen HcRed control, bajo un promotor de CMV, mide la represion fuera de objetivo o de largo alcance; clave: Constructos de expresion de ZFP que contienen 0, 4, 6, 11 o 18 dedos. (B) Ensayo FACS que mide la reduccion en veces en celulas fluorescentes EGFP y HcRED, en respuesta a la exposicion a diferentes dedos de zinc. Una represion de 10 veces es equivalente a una reduccion del 90 % en la fluorescencia de la protema. (C) Ilustra una transferencia de Western de EGFP para la represion por ZFP de objetivos pEH-Qx. (D) Muestra los resultados de un ensayo de qRT-PCR para medir la represion en veces del ARNm de EGFP o HcRED por los ZFP. (E a G) Los mismos tres ensayos (FACS, Western, qRT-PCR) repetidos para ZFP fusionados a Kox-1. En los paneles E a G, las escalas verticales son mas grandes, lo que refleja la represion mas fuerte causada por el dominio Kox-1 (represion >100 veces; >99 % de reduccion en la fluorescencia de la protema), y la represion de largo alcance del gen HcRed por Kox-1.
Figura 3 Represion del informador episomal por ZFxHunt-Fokl. Las celulas se transfectaron conjuntamente con los plasmidos de expresion informador y ZFP-Fok1: el plasmido informador pEH contiene EGFP, fusionado a secuencias codificantes de poli-Q de longitudes diferentes, bajo un promotor de SV40. Un gen HcRed control, bajo un promotor de CMV, mide la represion fuera de objetivo o de largo alcance. Los constructos de expresion de ZF-Fokl (promotor de CMV) contienen cadenas de ZFxHunt (0, 4, 6 o 12 dedos, como se indico). El vector pTarget no contiene ZFP y se usa como un control. (A) Ensayo FACS que mide la reduccion en veces en celulas fluorescentes EGFP o HcRED, en respuesta a diferentes dedos de zinc. Una represion de 2,5 veces equivale a una reduccion del 60 %. (B) Ensayo qRTPCR para medir la represion en veces de ARNm de EGFP o HcRED por ZFP. (C) Transferencia de Western de EGFP para la represion por ZFP de objetivos pEH-Qx. La tincion con p-actina se usa como un control de carga.
Figura 4 Represion del informador episomal por los ZFP de la invencion. Las celulas se transfectaron conjuntamente con plasmidos informadores y con dedos de zinc: el plasmido informador pEH contiene EGFP, fusionado a secuencias codificantes de poli-Q de longitudes diferentes, bajo un promotor de SV40. Un gen HcRed control, bajo un promotor de CMV, mide la represion fuera de objetivo o de largo alcance. Los constructos de expresion pPGK-ZF (promotor PGK) contienen cadenas de ZFxHunt (0, 4, 6, 12 o 18 dedos, como se indico). Los ZFP no se fusionan a ningun dominio efector. El vector pTarget no contiene un ZFP y se usa como control. (A) Ensayo FACS que mide la reduccion en veces en celulas fluorescentes EGFP o HcRED, en respuesta a diferentes dedos de zinc. Una represion de 5 veces equivale a una reduccion del 80 %. (B) Ensayo qRTPCR para medir la represion en veces de ARNm de EGFP o HcRED por ZFP. (C) Transferencia de Western de EGFp para la represion por ZFP de objetivos pEH-Qx. La tincion con p-actina se usa como un control de carga.
Figura 5 Ensayo de competicion de ZFP contra pares de secuencias de repeticion de CAG de longitudes diferentes. Cada cuadrado pequeno representa un experimento de transfeccion, donde las celulas reciben simultaneamente dos plasmidos informadores: poli-Q-EGFP y poli-Q-mCherry de repeticiones de CAG de longitudes diferentes (Q0 = sin repeticiones; Q10 = 10 repeticiones; Q22 = 22 repeticiones; Q35 = 35 repeticiones; Q63 = 63 repeticiones; y Q104 = 104 repeticiones). Los peptidos con dedos de zinc de la invencion con 4, 6, 11 o 18 dedos se probaron para determinar su capacidad de reducir el numero de celulas verdes y rojas detectables en los ensayos FACS (%). Fila superior: las cajas de color gris claro representan niveles altos de expresion de la protema GFP, las cajas de color gris oscuro representan niveles bajos de expresion de la protema GFP; fila central: las cajas de color gris claro representan niveles altos de expresion de la protema mCherry, las cajas de color gris oscuro representan niveles bajos de expresion de la protema mCherry; fila de la parte inferior: las cajas (gris) claro representan niveles mas altos de expresion de la protema GFP en comparacion con mCherry, las cajas de color gris oscuro representan niveles mas altos de expresion de la protema mCherry en comparacion con GFP. Se obtuvieron resultados similares mediante el uso de ZFP fusionados al dominio de nucleasa Fokl (no se muestra).
Figura 6 Expresion de genes de repeticion de CAG cromosomicos, 20 dfas despues del suministro retroviral de ZFP. Los ensayos se llevaron a cabo en celulas STHDH de tipo salvaje (wt) de raton con 7 repeticiones de CAG asociadas con cada copia del gen Hdh (Q7/Q7); en ratones mutantes STHDH poli-Q con 111 repeticiones de CAG asociadas con cada copia del gen Hdh (Q111/Q111); y en HEK293T humanas, como se indico. (A) Ilustra la represion de htt endogeno por los peptidos de 6 y 11 dedos de la invencion (ZF6xHunt y ZF11xHunt, respectivamente), con o sin el dominio represor Kox-1. Las transferencias de Western para Htt (fila superior) se controlaron con tincion con p-actina y se cuantificaron mediante el uso de ImageJ (represion en veces de la protema; fila central). Se uso qRT-PCR para comparar los niveles de ARNm de htt (represion en veces del ARN; fila de la parte inferior). (B) Muestra que los niveles de ARNm de otros genes de repeticiones de CAG wt no se afectan en general. Los niveles de expresion de siete genes wt asociados con repeticiones de CAG se analizaron mediante qRT-PCR (atrofina 1: ATN1; ataxina 1, 2, 3 y 7: ATXN1, ATXN2, ATXN3 y ATXN7; subunidad alfa 1A del canal de calcio: CACNA1A; y protema de union TATA: TBP). Los numeros de repeticiones de CAG se ilustran en la Tabla 3. Dos vecinos genomicos de htt (el receptor cinasa 4 acoplado a la protema G: GRK4; y la senalizacion de protema G 12: Rgs12) tampoco se afectaron en celulas STHdh. (C) Los niveles de ARNm de los siete genes CAG wt y HTT wt (huntingtina; 21 repeticiones de CAG) tampoco se afectaron en general en celulas HEK293T (N.B. CACNA1A no se expresa en celulas HEK293T).
Figura 7 Ensayo de toxicidad de ZFP. Las celulas HEK-293T se transfectaron con los constructos de vector indicados. Se usaron como control celulas no transfectadas (negativo) o solo con Lipofectamina 2000. La citotoxicidad se analizo mediante el uso del ensayo de toxicidad celular Guava (PCA) y las barras muestran el porcentaje de celulas muertas, en apoptosis intermedia y viables. Los resultados son un promedio de al menos 3 experimentos independientes.
Descripcion detallada de la invencion
A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos que se usan en la presente descripcion tienen el mismo significado que el que se entiende comunmente por un experto en la tecnica (por ejemplo, en cultivo celular, genetica molecular, qmmica y bioqmmica de acidos nucleicos).
A menos que se indique de otra forma, la practica de la presente invencion emplea tecnicas convencionales de qmmica, biologfa molecular, microbiologfa, tecnologfa de ADN recombinante, metodos qmmicos, formulaciones farmaceuticas y suministro y tratamiento de pacientes, que estan dentro de las capacidades de un experto en la tecnica. Dichas tecnicas tambien se explican en la literatura, por ejemplo, J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. y otros (1995 y suplementos periodicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J.M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press; M.J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Ir L Press; y D.M.J. Lilley y J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Parte A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Para ayudar con la comprension de la invencion, se definen varios terminos en la presente descripcion.
El termino "aminoacido" en el contexto de la presente invencion se usa en su sentido mas amplio y se pretende que incluya L a-aminoacidos o residuos de origen natural. Las abreviaturas de una y tres letras usadas comunmente para los aminoacidos de origen natural se usan en la presente descripcion: A = Ala; C = Cys; D = Asp; E = Glu; F = Phe; G = Gly; H = His; I = Ile; K = Lys; L = Leu; M = Met; N = Asn; P = Pro; Q = Gln; R = Arg; S = Ser; T = Thr; V = Val; W = Trp; e Y = Tyr (Lehninger, A.L., (1975) Biochemistry, 2da ed., pp. 71-92, Worth Publishers, Nueva York). El termino general "aminoacido" incluye ademas D-aminoacidos, aminoacidos retroinversos, asf como tambien aminoacidos modificados qmmicamente tales como los analogos de aminoacidos, aminoacidos de origen natural que no se incorporan usualmente en protemas tales como la norleucina, y compuestos sintetizados qmmicamente que tienen propiedades conocidas en la tecnica por ser caractensticos de un aminoacido, tal como los p-aminoacidos. Por ejemplo, los analogos o mimeticos de fenilalanina o prolina, que permiten la misma restriccion conformacional de los compuestos peptfdicos como lo hacen los Phe o Pro naturales, se incluyen dentro de la definicion de aminoacido. Dichos analogos y mimeticos se denominan en la presente descripcion como "equivalentes funcionales" del aminoacido respectivo. Otros ejemplos de aminoacidos se enumeran por Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, eds., Vol. 5 p. 341, Academic Press, Inc., N.Y. 1983.
El termino "peptido" como se usa en la presente (por ejemplo, en el contexto de un marco o peptido con dedos de zinc (ZFP)) se refiere a una pluralidad de aminoacidos unidos en una cadena lineal o circular. El termino oligopeptido se usa tipicamente para describir peptidos que tienen entre 2 y aproximadamente 50 o mas aminoacidos. Los peptidos mas grandes que aproximadamente 50 aminoacidos se denominan a menudo como polipeptidos o protemas. Para los propositos de la presente invencion, sin embargo, el termino "peptido" no se limita a ningun numero particular de aminoacidos, y se usa indistintamente con los terminos "polipeptido" y "protema".
Como se usa en la presente, el termino "dominio de dedo de zinc" se refiere a un "dedo" individual, que comprende un pliegue ppa estabilizado por un ion de zinc (como se describe en otra parte en la presente descripcion). Cada dominio de dedos de zinc incluye tipicamente 30 aminoacidos aproximadamente. El termino "dominio" (o "modulo"), de acuerdo con su uso habitual en la tecnica, se refiere a una parte continua discreta de la secuencia de aminoacidos de un polipeptido que puede equipararse con una funcion en particular. Los dominios de dedos de zinc son en gran parte independientes estructuralmente y pueden conservar su estructura y funcion en entornos diferentes. Tfpicamente, un dominio de dedos de zinc se une a una secuencia de nucleotidos en triplete o cuadruplete (superposicion). Los dominios de dedos de zinc adyacentes dispuestos en tandem se unen mediante secuencias enlazadoras. Un peptido con dedos de zinc de la invencion se compone de una pluralidad de "dominios de dedos de zinc", que en combinacion no existen en la naturaleza. Por lo tanto, pueden considerarse peptidos con dedos de zinc artificiales o sinteticos.
Los terminos "acido nucleico", "polinucleotido" y "oligonucleotido" se usan indistintamente y se refieren a un polfmero de desoxirribonucleotidos (ADN) o ribonucleotidos (ARN), en conformacion lineal o circular, y en forma monocatenaria o bicatenaria. Para los propositos de la presente invencion, dichos polfmeros de ADN o ARN pueden incluir nucleotidos naturales, nucleotidos no naturales o sinteticos, y mezclas de estos. Los nucleotidos no naturales pueden incluir analogos de nucleotidos naturales, asf como tambien nucleotidos que se modifican en los restos base, azucar y/o fosfato (por ejemplo, cadenas principales de fosforotioato). Ejemplos de acidos nucleicos modificados son los PNA y los acidos nucleicos morfolino. Generalmente, un analogo de un nucleotido en particular tiene la misma especificidad de emparejamiento de bases, es decir, un analogo de G se emparejara por bases con C. Para los propositos de la invencion, estos terminos no deben considerarse limitantes con respecto a la longitud de un polfmero.
Un "gen", como se usa en la presente, es el segmento de acido nucleico (tfpicamente ADN) que se involucra en la produccion de un producto genico polipeptfdico o de acido ribonucleico. Incluye las regiones que preceden y siguen a la region de codificacion (lfder y remolque), asf como tambien a las secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones). Convenientemente, este termino incluye ademas las secuencias de control necesarias para la expresion genica (por ejemplo, potenciadores, silenciadores, promotores, terminadores, etcetera), que pueden estar adyacentes o distantes a la secuencia de codificacion relevante, asf como tambien las regiones de codificacion y/o transcritas que codifican el producto genico.
Como se usa en la presente, el termino "modulacion", en relacion con la expresion de un gen, se refiere a un cambio en la actividad del gen. La modulacion incluye tanto la activacion (es decir, el aumento de la actividad o el nivel de expresion) como la represion o inhibicion de la actividad del gen. En modalidades preferidas de la invencion, las moleculas terapeuticas (por ejemplo, peptidos) de la invencion son represores de la expresion o actividad de genes.
Un acido nucleico "objetivo", "sitio objetivo" o "secuencia objetivo", como se usa en la presente, es una secuencia de acido nucleico a la que se unira el peptido con dedos de zinc de la invencion, siempre y cuando las condiciones de la reaccion de union no sean prohibitivas. Un sitio objetivo puede ser una molecula de acido nucleico o una porcion de un polinucleotido mas grande. Los sitios objetivo particularmente adecuados comprenden secuencias de acido nucleico repetitivas; especialmente las secuencias de repeticion de trinucleotidos. Las secuencias objetivo preferidas de acuerdo con la invencion incluyen aquellas definidas por secuencias de repeticion de CAG (por ejemplo, CAGCAG...; AGCAGC...; y GCAGCA...), y sus secuencias complementarias, repeticiones de CTG (por ejemplo, CTGCTG...; TGCTGC...; y GCTGCT...). De acuerdo con la descripcion, una secuencia objetivo para un peptido con poli-dedos de zinc de la invencion puede comprender una secuencia de acido nucleico contigua unica, o mas de una secuencia de acido nucleico no contigua (por ejemplo, dos secuencias contiguas separadas, y cada una representa un sitio objetivo parcial), que se intercalan por uno o mas nucleotidos o secuencia de nucleotidos intermedios. Estos terminos, ademas, pueden sustituirse o complementarse con los terminos "sitio de union", "secuencia de union", "sitio de reconocimiento" o "secuencia de reconocimiento", los que se usan indistintamente.
Como se usa en la presente, "union" se refiere a una interaccion no covalente entre macromoleculas (por ejemplo, entre un peptido con dedos de zinc y un sitio objetivo de acido nucleico). En algunos casos, la union sera espedfica de secuencia, tal como entre uno o mas nucleotidos espedficos (o pares de bases) y uno o mas aminoacidos espedficos. Sin embargo, se apreciara que no todos los componentes de una interaccion de union necesitan ser espedficos de secuencia (por ejemplo, interacciones no covalentes con residuos de fosfato en una cadena principal de ADN). Las interacciones de union entre una secuencia de acido nucleico y un peptido de dedos de zinc de la invencion pueden caracterizarse mediante la afinidad de union y/o la constante de disociacion (Kd). Una constante de disociacion adecuada para un peptido con dedos de zinc de la invencion que se une a su sitio objetivo puede estar en el orden de 1 pM o inferior, 1 nM o inferior, o 1 pM o inferior. "Afinidad" se refiere a la fuerza de la union, de manera que un aumento en la afinidad de union se correlaciona con un valor de Kd inferior. Los peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden tener actividad de union a ADN, actividad de union a ARN y/o incluso actividad de union a protema. Preferentemente, los peptidos con dedos de zinc de la invencion se disenan o seleccionan para tener una actividad de union a ADNbc espedfica de secuencia. Preferentemente, el sitio objetivo para un peptido con dedos de zinc en particular es una secuencia a la que el dedo de zinc de interes es capaz de unirse en forma espedfica con el nucleotido. Sin embargo, se apreciara que, en dependencia de la secuencia de aminoacidos de un peptido con dedos de zinc, puede unirse a o reconocer mas de una secuencia objetivo, aunque tfpicamente una secuencia se unira en preferencia a cualesquiera otras secuencias reconocidas, en dependencia de la especificidad relativa de las interacciones individuales no covalentes. Generalmente, la union espedfica se logra preferentemente con una constante de disociacion (Kd) de 1 nM o inferior, 100 pM o inferior; o 10 pM o inferior. Preferentemente, un peptido con dedos de zinc de la invencion se une a una secuencia objetivo espedfica con una constante de disociacion de 1 pM o inferior; tal como 0,1 pM o inferior, o incluso 10 fM o inferior.
Por "no objetivo" se entiende que la secuencia de acido nucleico en cuestion no se une apreciablemente por el peptido con dedos de zinc relevante. En algunas modalidades, puede considerarse que, cuando un peptido con dedos de zinc de la invencion tiene una secuencia objetivo espedfica de secuencia conocida, todas las demas secuencias de acido nucleico pueden considerarse no objetivo. Desde una perspectiva practica, puede ser conveniente definir una interaccion entre una secuencia no objetivo y un peptido con dedos de zinc en particular como que es subfisiologica (es decir, que no es capaz de crear una respuesta fisiologica bajo concentraciones de peptido con dedos de zinc/secuencia objetivo fisiologicas). Por ejemplo, si puede medirse cualquier union entre el peptido con dedos de zinc y la secuencia no objetivo, la constante de disociacion (Kd) es tfpicamente mas debil que 1 pM, tal como 10 pM o mas debil, 100 pM o mas debil, o al menos 1 mM.
El termino "biblioteca" se usa de acuerdo con su uso comun en la tecnica, para denotar una coleccion de polipeptidos diferentes o una coleccion de acidos nucleicos que codifican polipeptidos diferentes. Los marcos de peptidos con dedos de zinc de la invencion son utiles para crear bibliotecas de peptidos con dedos de zinc que tienen series extensas de dominios de dedos de zinc adyacentes, que comprenden o codifican un repertorio de polipeptidos de secuencias diferentes, cada uno de los cuales puede tener una secuencia de union preferida diferente. Las bibliotecas de marcos de dedos de zinc preferidas comprenden al menos 8 dedos de zinc adyacentes, y con mayor preferencia al menos 11 o 12 dedos de zinc adyacentes. En algunas modalidades, una biblioteca de marcos de dedos de zinc comprende 18 dominios de dedos de zinc adyacentes. Como se usa en la presente, una biblioteca "virgen" se refiere a una coleccion de peptidos con dedos de zinc diferentes o los acidos nucleicos codificantes correspondientes que no se han predeterminado o seleccionado para tener un sitio de union objetivo preferido en particular.
Peptidos con dedos de zinc
La presente invencion se refiere a dedos de zinc que no son de origen natural para su union a cualquier secuencia de acido nucleico deseada, y su uso como moleculas terapeuticas; por ejemplo, en el tratamiento de la HD. La invencion proporciona, ademas, el uso de modulos de dedos de zinc en peptidos con poli-dedos de zinc para unirse a secuencias de acido nucleico repetitivas, tales como repeticiones detrinucleotidos, y particularmente repeticiones de CAG expandidas en secuencias de ADN genomico. Preferentemente, los peptidos con poli-dedos de zinc de la invencion se unen a repeticiones de CAG expandidas asociadas con secuencias de genes mutados preferentemente y/o selectivamente sobre las secuencias de repeticiones de CAG mas cortas de los genes normales.
Un dedo de zinc es un dominio polipeptfdico pequeno relativamente que comprende aproximadamente 30 aminoacidos, que se pliega para formar una helice a adyacente a una lamina p antiparalela (conocido como pliegue ppa). El pliegue se estabiliza mediante la coordinacion de un ion de zinc entre cuatro residuos de Cys y/o His en gran parte no variantes (en dependencia del tipo de marco de dedos de zinc), como se describe mas abajo. Los dominios de dedos de zinc naturales se han estudiado y descrito bien en la literatura, ver, por ejemplo, Miller y otros, (1985) EMBO J. 4: 1609-1614; Berg (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 99-102; y Lee y otros, (1989) Science 245: 635-637. Un dominio de dedos de zinc reconoce y se une a un triplete de acido nucleico, o a un cuadruplete superpuesto (como se explica mas abajo), en una secuencia objetivo de ADN bicatenario. Sin embargo, tambien se conoce que los dedos de zinc se unen al Ar N y a las protemas (Clemens, K.R. y otros (1993) Science 260: 530-533; Bogenhagen, D.F. (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 5149-5158; Searles, M.A. y otros (2000) J. Mol. Biol. 301: 47-60; Mackay, J.P. y Crossley, M. (1998) Trends Biochem. Sci.
23: 1-4).
Las protemas con dedos de zinc contienen generalmente hebras o cadenas de dominios de dedos de zinc (o modulos). Por lo tanto, una protema con dedos de zinc natural puede incluir 2 o mas dominios de dedos de zinc, que pueden estar adyacentes directamente entre sf (es decir, separados por una secuencia enlazadora corta (canonica)), o pueden separarse por secuencias polipeptfdicas mas largas, flexibles o estructuradas. Se espera que los dominios de dedos de zinc adyacentes directamente se unan a secuencias de acido nucleico contiguas, es decir, a trinucleotidos/tripletes adyacentes. En algunos casos, puede producirse tambien union cruzada entre dedos de zinc adyacentes y sus respectivos tripletes objetivo, lo que ayuda a fortalecer o mejorar el reconocimiento de la secuencia objetivo, y conduce a la union de secuencias cuadrupletes superpuestas (Isalan y otros, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 94: 5617-5621.). En comparacion, los dominios de dedos de zinc distantes dentro de la misma protema pueden reconocer (o unirse a) secuencias de acido nucleico no contiguas o incluso a moleculas diferentes (por ejemplo, protema en lugar de acido nucleico).
La mayona de las cadenas laterales de aminoacidos en un dominio de dedos de zinc que son importantes para el reconocimiento de bases del ADNbc se localizan en la helice a del dedo. Convenientemente, por lo tanto, las posiciones de aminoacidos en un dominio de dedos de zinc se numeran desde el primer residuo en la helice a, al que se le asigna el numero (+)1; y se considera generalmente que la helice termina en el residuo final de Cys o His que se coordina con el zinc, que es tfpicamente la posicion 11. Por lo tanto, "-1" se refiere al residuo en la estructura marco inmediatamente anterior al primer residuo de la helice a. Como se usa en la presente, los residuos denominados como "++" se ubican en el dominio de dedos de zinc inmediatamente adyacente (C-terminal). Generalmente, el reconocimiento de acido nucleico por un modulo de dedos de zinc se logra principalmente por las cadenas laterales de aminoacidos en las posiciones -1, 3, 6 y +2; aunque otras posiciones de aminoacidos pueden contribuir a veces a la union entre el dedo de zinc y la molecula objetivo. Por lo tanto, es conveniente definir la secuencia de un dominio de dedos de zinc de -1 a (+)6 (es decir, residuos -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6) como una "secuencia de reconocimiento" de dedos de zinc. El primer residuo de histidina no variable que coordina el ion de zinc es la posicion (+)7 del dominio de dedos de zinc.
Cuando se une a una secuencia de acido nucleico, un dominio de dedos de zinc generalmente interactua principalmente con una cadena de una molecula de acido nucleico bicatenaria (la cadena o secuencia primaria). Sin embargo, puede haber interacciones subsidiarias entre los aminoacidos de un dominio de dedos de zinc y la cadena complementaria (o secundaria) de la molecula de acido nucleico bicatenaria. La helice a del dominio de dedos de zinc se encuentra casi invariablemente dentro del surco principal del ADNbc y se alinea antiparalelamente a la cadena de acido nucleico objetivo. En consecuencia, la secuencia de acido nucleico primaria se dispone de 3' a 5' para corresponder con la secuencia N-terminal a C-terminal del peptido con dedos de zinc. Dado que las secuencias de acido nucleico se escriben convencionalmente de 5' a 3', y las secuencias de aminoacidos del extremo N-terminal al extremo C-terminal, cuando una secuencia de acido nucleico objetivo y un peptido con dedos de zinc se alinean de acuerdo con la convencion, la interaccion primaria del peptido con dedos de zinc es con la cadena complementaria (o negativa) de la secuencia de acido nucleico, ya que es esta cadena la cual se alinea de 3' a 5'. Estas convenciones se siguen en la nomenclatura usada en la presente descripcion.
Los peptidos con dedos de zinc de acuerdo con la descripcion son no naturales y contienen adecuadamente 3 o mas, por ejemplo, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o mas (por ejemplo, hasta aproximadamente 30 o 32) dominios de dedos de zinc dispuestos de forma adyacente entre sf en tandem. Dichos peptidos pueden denominarse como "peptidos con poli-dedos de zinc". Los peptidos con dedos de zinc particularmente beneficiosos de la invencion incluyen al menos 6 dominios de dedos de zinc, al menos 11 o al menos 12 dominios de dedos de zinc; y en algunos casos al menos 18 dominios de dedos de zinc. Los peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden unirse a sitios de union de acidos nucleicos no contiguos o contiguos. Cuando se dirigen a sitios de union no contiguos, cada subsitio (o sitio medio donde hay dos secuencias no contiguas) es adecuadamente de una longitud de 18 bases aproximadamente, pero puede ser alternativamente de una longitud de 12 o 24 bases aproximadamente.
En los peptidos con (poli-)dedos de zinc de la presente invencion, los dominios de dedos de zinc adyacentes se unen entre sf mediante "secuencias enlazadoras" que pueden ser canonicas, similares a canonicas, flexibles o estructuradas, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 01/53480 (Moore y otros, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 1437-1441). Generalmente, una secuencia enlazadora de dedos de zinc natural carece de estructura secundaria en la forma libre del peptido. Sin embargo, cuando la protema se une a su sitio objetivo, un enlazador canonico esta tfpicamente en una conformacion lineal, extendida, y las cadenas laterales de aminoacidos dentro del enlazador pueden formar interacciones locales con el ADN. En una matriz en tandem de dominios de dedos de zinc, la secuencia enlazadora es la secuencia de aminoacidos que se encuentra entre el ultimo residuo de la helice a en un dedo de zinc N-terminal y el primer residuo de la lamina p en el siguiente dedo de zinc (es decir, adyacente al extremo C-terminal). Para los propositos de la presente invencion, se considera que el ultimo aminoacido de la helice a en un dedo de zinc es el residuo final de histidina (o cistema) que coordina el zinc, mientras que el primer aminoacido del siguiente dedo es generalmente una tirosina, fenilalanina u otro residuo hidrofobico.
Marcos y bibliotecas de peptidos con dedos de zinc
Los peptidos con dedos de zinc han demostrado ser andamios extremadamente versatiles para la ingeniena de nuevos dominios de union al ADN (por ejemplo, Rebar y Pabo (1994) Science 263: 671-673; Jamieson y otros, (1994) Biochemistry 33: 5689-5695; Choo y Klug (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91: 11163-11167; Choo y otros, (1994) Nature 372: 642-645; Isalan y Choo (2000) J. Mol. Biol. 295: 471-477; y muchos otros).
Para la funcionalidad biologica espedfica y el uso terapeutico, particularmente in vivo (por ejemplo, en terapia genica y en animales transgenicos), es conveniente que un peptido con poli-dedos de zinc de la invencion sea capaz de dirigirse a sitios unicos o virtualmente unicos dentro de cualquier genoma. Para genomas complejos, tales como en humanos, se considera generalmente que se requiere una direccion de al menos 16 pb para especificar una secuencia de ADN potencialmente unica. Las secuencias de ADN mas cortas tienen una probabilidad significativa de aparecer varias veces en un genoma, lo que aumenta la posibilidad de obtener efectos biologicos y de direccionamiento genico no espedfico no convenientes. Dado que los dedos de zinc individuales generalmente se unen a 3 nucleotidos consecutivos, 6 dominios de dedos de zinc con un sitio de union de 18 pb podnan, en teona, usarse para el reconocimiento espedfico de una secuencia objetivo unica dentro de cualquier genoma. En consecuencia, se ha realizado una gran cantidad de investigaciones sobre los llamados "factores de transcripcion de diseno" para la regulacion de genes espedficos, los que involucran tfpicamente 4 o 6 dominios de dedos de zinc que pueden disponerse en tandem o en grupos dimerizables (por ejemplo, de 3 unidades de dedo). Sin embargo, no se ha demostrado previamente que puedan sintetizarse y expresarse matrices en tandem de mas de 6 dominios de dedos de zinc, tales como 8, 9, 10, 11, 12 o mas (por ejemplo, 15, 16 o 18) dedos de zinc. Ademas, nunca se ha demostrado previamente que dichas matrices largas de dominios de dedos de zinc no naturales puedan tener actividad de union a acido nucleico (espedfica) in vitro o in vivo. Ciertamente, no se ha informado previamente que dichas matrices extensas de peptidos con dedos de zinc puedan dirigirse a secuencias de ADN genomico e incluso tener actividad de modulacion genica in vitro y/o in vivo.
En la presente invencion, se han creado nuevos marcos peptfdicos con dedos de zinc extensos que comprenden al menos 4, al menos 6, al menos 11, al menos 12 o al menos 18 dominios de dedos de zinc. Por lo tanto, los marcos de peptidos con dedos de zinc preferidos de la invencion comprenden 6, 11, 12 o 18 dominios de dedos de zinc.
Los marcos de peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden comprender dominios de dedos de zinc directamente adyacentes que tienen secuencias enlazadoras canonicas (o similares a canonicas) entre dominios de dedos de zinc adyacentes, de manera que se unen preferentemente a secuencias de acido nucleico contiguas. En consecuencia, un (marco) peptido con 6 dedos de zinc de la invencion es particularmente adecuado para unirse a tramos contiguos de aproximadamente 18 bases de acido nucleico, particularmente de la cadena de acido nucleico negativa; un (marco) peptido con 12 dedos de zinc de la invencion es particularmente adecuado para unirse a aproximadamente 36 bases de acidos nucleicos, los que pueden disponerse como un tramo contiguo o como subsitios no contiguos de, por ejemplo, 18 bases de acido nucleico; un peptido con 11 dedos de zinc es adecuado para unir aproximadamente 33 bases de acido nucleico, lo que demuestra que los numeros impares de cadenas de dedos largos tambien son funcionales; y un (marco) peptido con 18 dedos de zinc de la invencion es particularmente adecuado para unirse a aproximadamente 54 bases de acido nucleico, los que pueden disponerse de forma contigua o en subsitios no contiguos de, por ejemplo, 18 bases de acido nucleico.
De acuerdo con la invencion, uno o mas pares de dominios de dedos de zinc adyacentes se separan por secuencias enlazadoras flexibles cortas (por ejemplo, de 6 o 7 aminoacidos). En este caso, dichos peptidos con poli-dedos de zinc se unen tfpicamente a sitios objetivo de ADN contiguos, como se indico anteriormente. En algunas otras modalidades, uno o mas pares de dominios de dedos de zinc adyacentes pueden separarse por secuencias enlazadoras flexibles mas largas, por ejemplo, que comprenden 8 o mas aminoacidos, tal como entre 8 y 50 aminoacidos. Los enlazadores flexibles largos particularmente adecuados tienen aproximadamente entre 11 y 40 aminoacidos, entre 15 y 35 aminoacidos, o entre 19 y 30 aminoacidos. Los enlazadores flexibles largos preferidos tienen 15, 18 o 29 aminoacidos. Los dominios de dedos de zinc adyacentes separados por enlazadores flexibles largos tienen la capacidad de unirse a sitios de union no contiguos, ademas de la capacidad de unirse a sitios de union contiguos. La longitud del enlazador flexible puede influir en la longitud del ADN que puede estar entre dichos subsitios de union no contiguos.
Los marcos con dedos de zinc de la invencion pueden comprender dos o mas (por ejemplo, 2, 3 o 4) matrices de 4, 6 u 8 dominios de dedos de zinc directamente adyacentes separados por enlazadores flexibles largos (o estructurados). Preferentemente, dichos peptidos con (poli-)dedos de zinc extensos se disponen en matrices multiples de unidades de 6 dedos separadas por enlazadores flexibles largos.
Los inventores han demostrado por primera vez que dichos peptidos con dedos de zinc extensos de mas de 6 dedos de zinc pueden exhibir una union espedfica y de afinidad alta a las secuencias objetivo deseadas, tanto in vitro como in vivo. Ademas, se ha demostrado que estos peptidos con dedos de zinc extensos pueden expresarse de manera estable dentro de una celula objetivo, pueden ser no toxicos para la celula objetivo, y pueden tener una actividad de modulacion genica espedfica y deseada.
Los peptidos con dedos de zinc extensos de la invencion son adecuados particularmente para unirse a secuencias de repeticion (por ejemplo, repeticiones de trinucleotidos) en los genes objetivo. Las secuencias de repeticion objetivo adecuadas comprenden al menos 10 repeticiones de trinucleotidos, al menos 12 repeticiones de trinucleotidos, o al menos 20 repeticiones de trinucleotidos. Beneficiosamente, existen al menos 22 repeticiones de trinucleotidos, al menos 29 repeticiones de trinucleotidos o mas.
En una modalidad, los peptidos con dedos de zinc extensos de la invencion se unen a secuencias dentro de secuencias de repeticion de CAG y/o CTG expandidas en ADN bicatenario, por ejemplo, moleculas de ADN, fragmentos, secuencias de genes o cromatina. Adecuadamente, el sitio de union comprende repeticiones de 5'- GCA -3' y/o 5'- GCT -3'. Por lo tanto, el sitio de union comprende preferentemente repeticiones de la secuencia 5'- GCt/a -3'. Convenientemente, las secuencias objetivo para los peptidos con dedos de zinc extensos preferidos de la invencion comprenden 22 o mas repeticiones de CAG (o CTG) contiguas, tales como al menos 35 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas, al menos 63 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas, al menos 104 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas, o al menos 111 repeticiones de CAG (o CTG) contiguas.
Una ventaja sorprendente de los peptidos con dedos de zinc de una modalidad de la invencion es que se unen a matrices mas largas de secuencias de repeticion de CTG o de CAG en preferencia a matrices mas cortas. En consecuencia, los peptidos con dedos de zinc dirigidos a CAG (o CTG) de la invencion se unen mas eficazmente (por ejemplo, con mayor afinidad o mayor capacidad de modulacion genica) a las secuencias de repeticion de CTG o CAG expandidas que contienen al menos 22 repeticiones, en comparacion con las secuencias que contienen, por ejemplo, 10 o menos repeticiones. De manera similar, las secuencias que contienen al menos 35 repeticiones de CAG o CTG pueden unirse preferentemente sobre las secuencias que contienen 22 o menos repeticiones (lo que incluye 10 o menos); las secuencias que contienen al menos 63 repeticiones de CAG o CTG pueden unirse preferentemente a las secuencias que contienen 35 repeticiones o menos (lo que incluye 22 o menos, o 10 o menos); y las secuencias que contienen al menos 104 repeticiones de CAG o CTG pueden unirse preferentemente a secuencias que contienen 63 o menos repeticiones (lo que incluye 35 o menos, 22 o menos, o 10 o menos).
Los marcos de peptidos con dedos de zinc extensos de la invencion son adecuados, ademas, para la generacion de bibliotecas de peptidos con dedos de zinc vfrgenes, los que pueden analizarse o probarse de cualquier otra manera para determinar las propiedades convenientes, tales como la afinidad de union a una secuencia objetivo seleccionada (tal como ADN o ARN). Por lo tanto, en un aspecto, la presente invencion se refiere a un marco de peptido con dedos de zinc extenso que puede formar un andamio para la seleccion o diseno de factores de transcripcion de dedos de zinc artificiales y/o protemas de union a ADN. Por ejemplo, el marco de la matriz de dedos de zinc extenso puede comprender 12 o mas dominios de dedos de zinc (tal como 18), los que pueden diversificarse en una o mas posiciones de aminoacidos.
Hay una serie de marcos de dedos de zinc naturales conocidos en la tecnica, y cualquiera de estos marcos puede adecuarse para su uso en los marcos de peptidos con dedos de zinc extensos de la invencion. En general, un marco de dedos de zinc natural tiene la secuencia, Formula 1: X0-2 C X1-5C X9-14 H X3-6 h/c; o Formula 2: X0-2 C X1-5 X+2 X+3X+4 X+5 X+6 H X3-6 h/c donde X es cualquier aminoacido, los numeros en el subrndice indican los posibles numeros de residuos representados por X, y los numeros en supermdice indican la posicion del aminoacido en la helice a. De acuerdo con la invencion, el marco de peptido con dedos de zinc extenso se basa en una matriz de dominios de dedos de zinc de Formula 1 o 2. Alternativamente, el motivo de dedos de zinc puede representarse mediante la secuencia general , Formula 3: X2 C X2,4 C X12 H X3 ,4,5 h/c; o Formula 4: X2 C X2,4 C X5 X‘1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3 ,4,5 h/c. Aun con mayor preferencia, el motivo de dedos de zinc puede representarse mediante la secuencia general, Formula 5: X2 C X2 C X12 H X3 H; o Formula 6: X2 C X2 C X5 X’1 X+1X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3 H. En consecuencia, un marco de peptido de dedo de zinc extenso como se describe en la presente puede basarse en los dominios de dedos de zinc de las Formulas 1 a 6, o combinaciones de las formulas 1 a 6, unidas en una matriz mediante el uso de las secuencias enlazadoras descritas en la presente.
En estas formulas, los residuos fijos C y H coordinan el ion zinc para estabilizar la estructura del dedo de zinc: el primer residuo H es la posicion 7 de la helice a. Las posiciones preferidas particularmente para la diversificacion dentro de los marcos de dominio de dedos de zinc de la invencion son aquellas dentro de o adyacentes a la helice a, por ejemplo, las posiciones -1, 2, 3 y 6.
En una modalidad de la invencion, el marco de peptido con dedos de zinc extenso comprende al menos 11 dominios de dedos de zinc de una de las Formulas 1 a 6, unidos por secuencias enlazadoras, es decir, Formula 7: [(Formula 1-6) -enlazador]n - (Formula 1-6)], donde n es >10, tal como entre 10 y 31. Como se indica, en la Formula 7 puede usarse cualquier combinacion de las Formulas 1 a 6. En otra modalidad, el marco de peptido con dedos de zinc extensa comprende entre 11 y 18 dominios de dedos de zinc de las formulas anteriores. Adecuadamente, por lo tanto, n es 10 a 17; mas adecuadamente, n es 10, 11, 13, 14, 15 o 17; y n es preferentemente 10, 11 o 17.
De acuerdo con la invencion, la secuencia de reconocimiento de uno o mas de los dominios de dedos de zinc (es decir, las posiciones X-1, X+1, X+2, X+3, X+4, X+5 y X+6 en las Formulas 2, 4 y 6 anteriores se representa por la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, en una modalidad, se proporciona un peptido con dedos de zinc (union a ADN) disenado que comprende al menos 11 dominios de dedos de zinc, en donde al menos una secuencia de reconocimiento de dedos de zinc tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1. De manera beneficiosa, el peptido con dedos de zinc disenado de la invencion comprende al menos 11 secuencias de reconocimiento de dedos de zinc de la SEQ ID NO: 1. Adecuadamente, el peptido con dedos de zinc comprende entre 11 y 18 (por ejemplo, 12) secuencias de reconocimiento de dedos de zinc de la SEQ ID NO: 1. El peptido con dedos de zinc de la invencion se une preferentemente a secuencias de repeticion de CAG; y con mayor preferencia a secuencias genicas htt expandidas humanas.
Como ya se ha descrito, los dominios de dedos de zinc adyacentes se unen mediante secuencias enlazadoras. En una protema con dedos de zinc natural, la treonina es a menudo el primer residuo en el enlazador, y la prolina es a menudo el ultimo residuo del enlazador. Sobre la base de la homologfa de secuencia, la secuencia enlazadora canonica natural se considera que es -TGEKP- (enlazador 1 o L1) [SEQ ID NO: 20]. Sin embargo, los enlazadores naturales pueden variar grandemente en terminos de longitud y secuencia de aminoacidos. Por lo tanto, una secuencia de consenso comun basada en secuencias enlazadoras naturales puede representarse por-TGe/qk/rP- (enlazador 2 o L2) [SEQ ID NO: 21], y esta secuencia se prefiere para su uso como un enlazador "canonico" (o "similar a canonico") de acuerdo con la invencion.
Sin embargo, en matrices de dedos de zinc extensas de, por ejemplo, 4 o mas dominios de dedos de zinc, se ha demostrado que puede ser beneficioso interrumpir periodicamente la secuencia enlazadora canonica, cuando se usa entre dedos de zinc adyacentes en una matriz, mediante la adicion de uno o mas residuos de aminoacidos (por ejemplo, Gly y/o Ser), para crear submatrices de dominios de dedos de zinc (por ejemplo, grupos de 2 o 3) dentro de la matriz (Moore y otros, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 1437-1441; y el documento WO 01/53480). Por lo tanto, las secuencias enlazadoras adecuadas para su uso de acuerdo con la invencion incluyen secuencias enlazadoras canonicas de 5 aminoacidos (por ejemplo, enlazador 1 o enlazador 2, anteriores), o secuencias enlazadoras similares a canonicas relacionadas de entre 5 y 7 aminoacidos.
Los enlazadores similares a canonicos para su uso de acuerdo con la invencion pueden basarse adecuadamente en la secuencia, -TGg/se/qk/rP- (enlazador 3 o L3) [SEQ ID NO: 22]. Por lo tanto, los enlazadores similares a canonicos preferidos incluyen las secuencias espedficas: TGGERP [SEQ ID NO: 23], TGSERP [SEQ ID NO: 24], TGGQRP [SEQ ID NO: 25], TGSQRP [SEQ ID NO: 26], TGGEKP [SEQ ID NO: 27], TGSEKP [SEQ ID NO: 28], TGGQKP [SEQ ID NO: 29], o TGSQKP [SEQ ID NO: 30]. Un enlazador similar a canonico preferido particularmente es TGSERP (enlazador 4 o L4) [SEQ ID NO: 24]. Sin embargo, tambien pueden usarse otras secuencias enlazadoras entre uno o mas pares de dominios de dedos de zinc, por ejemplo, enlazadores de la secuencia -TG(g/s)0-2E/qk/rP- (enlazador 5 o L5) [SEQ ID NO: 33] o -T(g/s)o-2Ge/qk/rP- (enlazador 6 o L6) [SEQ ID NO: 34].
En algunas modalidades pueden usarse enlazadores flexibles aun mas largos de 8 o mas aminoacidos, como se describio previamente. Los enlazadores de 8 aminoacidos incluyen las secuencias - TG(g/s)3E/qk/rP- [SEQ ID NO: 31] y -T(g/s)sGe/qk/rP- (L12) [SEQ ID NO: 32]. Enlazadores flexibles largos ilustrativos son: LRQKDGGGGSQLVGTAERP (enlazador 7 o L7) [SEQ ID NO: 35], LRQKDGGGGSGGGGSQLVGTAERP (enlazador 8 o L8) [SEQ ID NO: 36], LRQKDGGGGSGGGGSGGGGSQLVGTAERP (enlazador 9 o L9) [SEQ ID NO: 37], LRQKDGGGSQLVGTAERP (enlazador 10 o L10) [SEQ ID NO: 38] y LRQKDGGGSGTAERP (enlazador 11 o L11)[SEQ ID NO: 39].
Los presentes inventores han demostrado que mediante la seleccion de secuencias enlazadoras apropiadas y combinaciones adecuadas de secuencias enlazadoras dentro de una matriz de dedos de zinc, las matrices extensas de peptidos con dedos de zinc de al menos 11 dedos de zinc (tal como 11, 12 o 18) pueden sintetizarse, expresarse y pueden tener actividad selectiva de direccionamiento genico. Las matrices extensas de peptidos con dedos de zinc de la invencion se disponen preferentemente en tandem. Dichos peptidos con 11 o 12 dedos de zinc pueden reconocer y unirse espedficamente a 33 o 36 residuos de acido nucleico, respectivamente, y las matrices mas largas (tales como los peptidos con 18 dedos de zinc) reconocen secuencias de acido nucleico aun mas largas. De esta manera, los peptidos con dedos de zinc extensos de la invencion pueden dirigirse a secuencias genomicas unicas. Ademas, la longitud de reconocimiento de secuencia proporciona un numero mayor de combinaciones de secuencia unicas dentro de la secuencia de reconocimiento, lo que puede proporcionar potencialmente una selectividad mayor para que la secuencia objetivo se distinga sobre las secuencias no objetivo. De esta manera, los peptidos con dedos de zinc de la invencion tienen el potencial de ser mas espedficos que cualquier factor de transcripcion artificial sintetizado hasta la fecha.
Ademas, podna esperarse ademas un aumento significativo en la afinidad de union, en comparacion con los peptidos con dedos de zinc con menos dedos. Por ejemplo, donde un peptido con 3 dedos (con una secuencia de reconocimiento de 9 pb) se une al ADN con afinidad nanomolar, podna esperarse que un peptido con 6 dedos se una a una secuencia de 18 pb con una afinidad de entre 10-9 y 10'18 M, en dependencia de la disposicion y secuencia de los peptidos con dedos de zinc. Para optimizar tanto la afinidad como la especificidad de los peptidos de 6 dedos, se ha demostrado que es ventajosa una fusion de tres dominios de 2 dedos (Moore y otros, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98: 1437­ 1441; y el documento WO 01/53480). Por lo tanto, en algunas modalidades de la invencion, los peptidos con dedos de zinc de la invencion comprenden submatrices de unidades de 2 dedos dispuestas en tandem. En otras modalidades, los peptidos con dedos de zinc de la invencion comprenden submatrices de unidades de 3 dedos dispuestas en tandem.
En consecuencia, el marco con dedos de zinc extenso de la descripcion puede comprender una secuencia seleccionada de:
SEQ ID NO: 2 N'- [(Formula 2) - X6]no - {[(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - Xa]n1 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - XJ}n2 -[(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - X6]n3 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2)] - [X6 - (Formula 2) -]n4 -C', en donde n0 es 0 o 1, n1 es de 1 a 4, n2 es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, X5 es una secuencia enlazadora de 5 aminoacidos, X6 es una secuencia enlazadora de 6 o 7 aminoacidos, y Xl es un enlazador de al menos 8 aminoacidos;
SEQ ID NO: 3 N'- [(Formula 1-6) - L3]no- {[(Formula 1-6) - L2 - (Formula 1-6) - L3]n1 - [(Formula 1-6) - L2 - (Formula 1-6) -XL]}n2- [(Formula 1-6) - L2 - (Formula 1-6) - L3]n3 - [(Formula 1-6) - L2 - (Formula 1-6)] - [L3 - (Formula 1-6)]n4-C' donde nO, n1, n2, n3, n4 y Xl son como se definio anteriormente;
SEQ ID NO: 4 N'- [(Formula 1-6) - L4]no - {[(Formula 1-6) - L1 - (Formula 1-6) - L4]n1 - [(Formula 1-6) - L1 - (Formula 1-6) -XL]}n2- [(Formula 1-6) - L1 - (Formula 1-6) - L4]n3 - [(Formula 1-6) - L1 - (Formula 1-6)] - [L4 - (Formula 1-6)]n4-C', donde nO, n1, n2, n3, n4 y Xl son como se definio anteriormente;
SEQ ID NO: 5 N'- [(Formula 6) - L4]no - {[(Formula 6) - L1 - (Formula 6) - L4]n1 - [(Formula 6) - L1 - (Formula 6) - XJ}n2 -[(Formula 6) - L1 - (Formula 6) - L4]n3 - [(Formula 6) - L1 - (Formula 6)] - [L4 - (Formula 6 )]n4 -C', donde nO, n1, n2, n3, n4 y Xl son como se definio anteriormente.
Para evitar dudas, los guiones ("-") en las formulas y las SEQ ID NO de la invencion representan solo enlaces, y por lo tanto estas formulas y las SEQ ID NO tambien pueden representarse sin guiones.
Preferentemente en las SEQ ID NO: 2 a 5, nO es 0 o 1, n1 es de 1 a 3, n2 es 1 o 2, n3 es 2 o 3, n4 es 0 y Xl es aproximadamente de 8 a 50. Con mayor preferencia, nO es 0, n1 es 2 o 3, n2 es 1 o 2, n3 es 2 y n4 es 0, y/o Xl es aproximadamente de 11 a 40 aminoacidos. Aun con mayor preferencia, nO es 0, n1 es 2, n2 es 1 o 2, n3 es 2 y n4 es 0; y/o Xl es aproximadamente de 15 a 35 aminoacidos. Aun con mayor preferencia Xl es aproximadamente de 15 a 29 aminoacidos. Con la maxima preferencia Xl se selecciona entre L7, L8, L9, L10, L11 y L12.
En consecuencia, la invencion proporciona ademas metodos para la construccion y el uso de peptidos con poli-dedos de zinc que comprenden al menos 8, y preferentemente al menos 11 o 12 (por ejemplo, 11, 12 o 18) dominios de dedos de zinc. Los metodos de la invencion son adecuados particularmente para construir matrices de dominios de dedos de zinc identicos, los que pueden unirse a secuencias objetivo de trinucleotidos repetidos.
En los marcos con dedos de zinc anteriores, el numero total de dominios de dedos de zinc es preferentemente de 11 a 18 y la secuencia de reconocimiento de dedos de zinc es preferentemente la SEQ ID NO: 1. Los peptidos con dedos de zinc preferidos tienen 6, 11, 12 o 18 dominios de dedos de zinc, y comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 14 respectivamente (verTabla 1).
La invencion abarca, ademas, moleculas de acido nucleico que codifican las secuencias de peptidos de la invencion. Las secuencias codificantes de peptidos con dedos de zinc preferidas comprenden las SEQ ID NO: 9, 11, 13 y 15, las que codifican los peptidos con dedos de zinc de las SEQ ID NO: 8, 10, 12 y 14, respectivamente.
Se apreciara que las secuencias de los marcos de peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden incluir ademas secuencias lfder opcionales (N-terminales), tales como: aminoacidos para ayudar a la expresion (por ejemplo, dipeptido Met-Ala N-terminal); etiquetas de purificacion (por ejemplo, etiquetas FLAG); y secuencias de localizacion/direccionamiento (por ejemplo, secuencias de localizacion nuclear (NLS), tales como PKKKRKV). Ademas, los peptidos pueden incluir opcionalmente secuencias C-terminales adicionales, tales como: secuencias enlazadoras para fusionar dominios de dedos de zinc a moleculas efectoras; y moleculas efectoras. Pueden emplearse otras secuencias para propositos de clonacion. Las secuencias de cualesquiera secuencias N o C-terminales pueden variar, tipicamente sin alterar la actividad de union del marco con dedos de zinc, y dichas variantes se abarcan dentro del alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Los marcos con dedos de zinc de la descripcion pueden usarse para disenar o seleccionar matrices de peptidos con dedos de zinc dirigidos a cualquier secuencia de acido nucleico deseada. En este caso, los marcos con dedos de zinc pueden diversificarse en una o mas posiciones. En algunas modalidades, el marco se diversifica en una o mas de las posiciones de aminoacidos -1, 1, 2, 3, 4, 5 y 6 de las Formulas 1 a 6, y por lo tanto de las SEQ ID NO: 2 a la 5. Los cambios en la secuencia polipeptfdica pueden lograrse convenientemente mediante la diversificacion de la secuencia de acido nucleico que codifica los marcos de peptidos con dedos de zinc en los codones para al menos una de esas posiciones, para codificar mas de una variante polipeptfdica. En otra modalidad, el marco de acido nucleico o peptido se vana espedfica o aleatoriamente en una o mas (por ejemplo, todas) de las posiciones -1,2, 3 y 6. En aun otra modalidad, el marco se vana en las posiciones -1, 3 y 6. De manera beneficiosa, se diversifican al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 de las posiciones en la secuencia de reconocimiento de cada dominio de dedos de zinc. Todas estas variantes de acidos nucleicos y polipeptidos se comprenden dentro del alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Por lo tanto, en un aspecto, la invencion se relaciona con una biblioteca virgen de acidos nucleicos o polipeptidos que comprende mas de un peptido con dedos de zinc o una secuencia de acido nucleico codificante, lo que permite la seleccion de peptidos con dedos de zinc que tienen propiedades convenientes (tales como la afinidad de union por una secuencia de acido nucleico objetivo seleccionada), a partir de un metodo de seleccion/tamizaje de biblioteca adecuado. Para los propositos de esta invencion, una biblioteca quetiene una mezcla de peptidos o acidos nucleicos que no se ha optimizado o seleccionado para tener una funcionalidad en particular se denomina en la presente descripcion una biblioteca "virgen". Una ventaja potencial del marco del peptido con dedos de zinc de la invencion es que los sitios objetivo que pueden unirse por miembros individuales de la biblioteca de marco pueden no restringirse a un tipo o conformacion particular de molecula (por ejemplo, ADN bicatenario). Por lo tanto, cualquier molecula o secuencia objetivo conveniente puede reconocerse (es decir, unirse), tales como acidos nucleicos (por ejemplo, ADN o ARN), protemas o peptidos. Una molecula objetivo preferida es un acido nucleico bicatenario, y es mas adecuadamente el ADN.
Los residuos de aminoacidos en cada una de las posiciones diversificadas pueden aleatorizarse de forma no selectiva, es decir, al permitir que el aminoacido en la posicion de interes sea cualquiera de los 20 aminoacidos comunes de origen natural; o puede aleatorizarse selectivamente, es decir, permitir que el aminoacido especificado sea uno de un subgrupo definido de los 20 aminoacidos de origen natural. Se apreciara que una forma conveniente de crear una biblioteca de peptidos mutantes con aminoacidos aleatorizados en cada localizacion seleccionada, es aleatorizar el codon de acido nucleico de la secuencia de acido nucleico correspondiente que codifica el aminoacido seleccionado. Por otro lado, dado el conocimiento que ahora se ha acumulado en relacion con la union espedfica de secuencia de los dominios de dedos de zinc a los acidos nucleicos, en algunas modalidades puede ser conveniente seleccionar un aminoacido espedfico (o un subgrupo pequeno de aminoacidos) en una o mas posiciones seleccionadas en el dominio de dedos de zinc, por ejemplo, cuando se conoce que un aminoacido espedfico proporciona una union optima a un residuo de nucleotido en particular en una secuencia objetivo espedfica. Dichos peptidos o marcos son el resultado de un diseno "inteligente". Convenientemente, la totalidad de la secuencia de reconocimiento de dedos de zinc puede seleccionarse mediante un diseno inteligente e insertarse/incorporarse en un marco con dedos de zinc apropiado. El experto en la tecnica conoce bien las secuencias de codones que pueden usarse para especificar uno o mas de un residuo de aminoacido en particular dentro de una biblioteca. Las posiciones de aminoacidos no aleatorias en cada dominio de dedos de zinc pueden elegirse a partir de estructuras de dedos de zinc de tipo salvaje o artificiales conocidas.
La presente descripcion tambien se dirige hacia la seleccion, identificacion y/o caracterizacion de peptidos con dedos de zinc que tienen una propiedad deseada, a partir de un marco con dedos de zinc virgen de la invencion. Una biblioteca virgen comprende una pluralidad de secuencias de acido nucleico (por ejemplo, al menos 106, 108, 109, 1012 o mas secuencias de codificacion diferentes) que pueden expresarse y tamizarse para identificar peptidos con dedos de zinc que tienen la propiedad deseada.
La descripcion se refiere, ademas, a derivados de los peptidos con dedos de zinc de la invencion. Con respecto a esto, se apreciara que pueden realizarse modificaciones, tales como sustituciones de aminoacidos en una o mas posiciones en el peptido, sin afectar adversamente sus propiedades ffsicas (tales como especificidad de union o afinidad). Por "derivado" de un peptido con dedos de zinc se entiende una secuencia peptfdica que tiene la actividad deseada seleccionada (por ejemplo, afinidad de union por una secuencia objetivo seleccionada), pero que incluye ademas una o mas mutaciones o modificaciones a la secuencia de aminoacidos primaria. Por lo tanto, un derivado de la invencion puede tener una o mas cadenas laterales de aminoacidos modificadas qmmicamente (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o mas) tales como modificaciones por pegilacion, sialilacion y glicosilacion. Ademas o alternativamente, un derivado puede contener una o mas mutaciones, sustituciones o deleciones de aminoacidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 o mas) a la secuencia primaria de un peptido con dedos de zinc seleccionado. En consecuencia, la descripcion abarca los resultados de los experimentos de maduracion realizados en un peptido con dedos de zinc seleccionado o en un marco de peptido con dedos de zinc para mejorar o cambiar una o mas caractensticas del peptido identificado inicialmente. A manera de ejemplo, uno o mas residuos de aminoacidos de un dominio de dedos de zinc seleccionado pueden mutarse (o sustituirse) de forma aleatoria o espedfica mediante el uso de procedimientos conocidos en la tecnica (por ejemplo, mediante modificacion de la secuencia de ADN o ARN codificante). La biblioteca o poblacion resultante de peptidos derivados puede seleccionarse adicionalmente, mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, de acuerdo con requerimientos predeterminados: tal como una especificidad mejorada frente a sitios objetivo en particular; o propiedades mejoradas del farmaco (por ejemplo, solubilidad, biodisponibilidad, inmunogenicidad, etcetera). Los peptidos seleccionados para exhibir dichas caractensticas adicionales o mejoradas y que muestran la actividad para la que se selecciono el peptido inicialmente son derivados de los peptidos con dedos de zinc de la invencion y caen, ademas, dentro del alcance de la descripcion.
Moduladores de peptidos con dedos de zinc y efectores
Si bien los peptidos con dedos de zinc de la invencion pueden tener propiedades biologicas utiles por separado, pueden recibir, ademas, funciones biologicas utiles mediante la adicion de dominios efectores. Por lo tanto, en algunos casos es conveniente conjugar un peptido con dedos de zinc de la invencion con uno o mas dominios sin dedos de zinc, y crear de esta forma peptidos con dedos de zinc quimericos o de fusion. Ademas, puede ser conveniente, en algunos casos, crear un multimero (por ejemplo, un dfmero), de un peptido con dedos de zinc de la invencion, por ejemplo, para unir mas de una secuencia objetivo simultaneamente.
Por lo tanto, una vez identificado un peptido con dedos de zinc conveniente, entonces se le puede unir, conjugar o fusionar un efector o grupo funcional apropiado al peptido con dedos de zinc. La protema resultante de la invencion, la que comprende al menos una porcion de dedos de zinc (de mas de un dominio de dedos de zinc) y un dominio, porcion o resto efector sin dedos de zinc, puede denominarse como peptido con dedos de zinc de "fusion", "quimerico" o "compuesto". De manera beneficiosa, el peptido con dedos de zinc se enlazara al otro resto a traves de sitios que no interfieran con la actividad de ninguno de los restos.
Un "dominio sin dedos de zinc" (o resto) como se usa en la presente, se refiere a una entidad que no contiene un pliegue de dedos de zinc (ppa-). Por lo tanto, los restos sin dedos de zinc incluyen acidos nucleicos y otros polfmeros, peptidos, protemas, acidos nucleicos peptidicos (PNA), anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y moleculas pequenas, entre otros.
De manera beneficiosa, los peptidos con dedos de zinc o las protemas de fusion quimericas de la invencion se usan para regular negativamente o positivamente los genes objetivo deseados, in vitro o in vivo. Por lo tanto, los dominios efectores potenciales incluyen dominios represores transcripcionales, dominios activadores transcripcionales, dominios aisladores transcripcionales, dominios de remodelacion, condensacion o descondensacion de cromatina, dominios de escision de acido nucleico o protema, dominios de dimerizacion, dominios enzimaticos, secuencias o dominios de senalizacion/direccionamiento, o cualquier otro dominio biologicamente funcional apropiado. Otros dominios que tambien pueden adjuntarse a los peptidos con dedos de zinc de la invencion (y que tienen funcionalidad biologica) incluyen secuencias peptfdicas involucradas en el transporte de protemas, secuencias de localizacion (por ejemplo, secuencias de localizacion subcelular, localizacion nuclear, direccionamiento de protemas) o secuencias senal. Los peptidos con dedos de zinc tambien pueden fusionarse a etiquetas epftopos (por ejemplo, para su uso para senalar la presencia o ubicacion de una secuencia de nucleotidos objetivo reconocida por el peptido con dedos de zinc). Ademas, pueden usarse fragmentos funcionales de cualquier dicho dominio.
La expresion de muchos genes se logra tambien mediante el control del destino del transcripto de ARN asociado. Las moleculas de ARN a menudo contienen sitios para las protemas de union al ARN, las que determinan la vida media del ARN y, por lo tanto, los niveles de expresion de protemas. Por lo tanto, los moduladores de peptidos con dedos de zinc de la invencion tambien pueden controlar la expresion genica al dirigirse espedficamente a los transcriptos de ARN para aumentar o disminuir su vida media dentro de una celula.
De manera beneficiosa, los peptidos con dedos de zinc y las protemas de fusion de la invencion tienen actividad transcripcional y, por lo tanto, los dominios efectores biologicos preferidos incluyen dominios de modulacion transcripcional tales como activadores transcripcionales y represores transcripcionales, asf como tambien sus fragmentos funcionales. El dominio efector puede derivarse directamente de un factor de transcripcion basal o regulado tal como, por ejemplo, transactivadores, represores, y protemas que se unen a secuencias aislantes o silenciadoras (ver Choo y Klug (1995) Curr. Opin. Biotech. 6: 431-436; Choo y Klug (1997) Curr. Opin. Str. Biol. 7: 117-125; y Goodrich y otros (1996) Cell 84: 825-830); o a partir de receptores tales como los receptores de hormonas nucleares (Kumar y Thompson (1999) Steroids 64: 310-319); o coactivadores y corepresores (Ugai y otros (1999) J. Mol. Med. 77: 481-494).
Otros dominios funcionales utiles para el control de la expresion genica incluyen, por ejemplo, dominios modificadores de protemas tales como las histonas acetiltransferasas, quinasas, metilasas y fosfatasas, las que pueden silenciar o activar los genes mediante la modificacion de la estructura del ADN o de las protemas que se asocian con los acidos nucleicos (Wolffe (1996) Science 272: 371-372; y Hassig y otros, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95: 3519-3524). Los dominios efectores utiles adicionales incluyen aquellos que modifican o reorganizan las moleculas de acido nucleico tales como las metiltransferasas, endonucleasas, ligasas, recombinasas y los dominios de escision de acido nucleico (ver, por ejemplo, Smith y otros (2000) Nucleic Acids Res., 17: 3361-9; documento WO 2007/139982 y referencias citadas en este).
Los dominios transcripcionales/de activacion genica potenciales para la fusion a los peptidos con dedos de zinc de la invencion incluyen el dominio VP64 (ver Seipel y otros, (1996) e Mb O J. 11: 4961-4968) y el dominio VP16 del virus del herpes simplex (HSV) (Hagmann y otros (1997) J. Virol. 71: 5952-5962; Sadowski y otros (1988) Nature 335: 563-564); y el dominio de transactivacion 1 y/o 2 de la subunidad p65 del factor nuclear-KB (NPkB; Schmitz y otros (1995) J. Biol. Chem. 270: 15576-15584).
Un dominio de represion transcripcional preferido es el dominio de caja asociada a Kruppel (KRAB), el cual es un represor poderoso de la actividad genica. En algunas modalidades preferidas, por lo tanto, los peptidos o marcos con dedos de zinc de la invencion se fusionan al dominio represor KRAB de la protema Kox-1 humana para reprimir la actividad de un gen objetivo (por ejemplo, ver Thiesen y otros (1990) New Biologist 2: 363-374). Los fragmentos de la protema Kox-1 que comprenden el dominio KRAB, hasta y con inclusion de la protema Kox de longitud completa, pueden usarse como dominios de represion transcripcional, como se describe en Abrink y otros (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 98: 1422-1426. Una secuencia de dominio de Kox-1 util se muestra en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17). Pueden usarse alternativamente otros dominios represores transcripcionales conocidos en la tecnica, tales como el dominio engrailed, el dominio snag, y el dominio de represion transcripcional de v-erbA.
Se incorporan todos los metodos conocidos de conjugacion de un dominio efector a una secuencia peptfdica. El termino "conjugado" se usa en su sentido mas amplio para abarcar todos los metodos de ligacion o union que se conocen en la tecnica, y se usa indistintamente con los terminos tales como "enlazado", "unido", "asociado" o "ligado". El(los) dominio(s) efector(es) pueden unirse covalentemente o no covalentemente al dominio de union: por ejemplo, cuando el dominio efector es un polipeptido, puede enlazarse directamente a un peptido con dedos de zinc (por ejemplo, en el extremo terminal C) mediante una secuencia de aminoacidos flexible o estructurada (enlazador) codificada por la molecula de acido nucleico correspondiente. En la Tabla 2 (SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19) se ilustra una secuencia enlazadora adecuada para unir un dominio efector al extremo C terminal de un peptido con dedos de zinc. Alternativamente, puede usarse un enlazador no aminoaddico o qmmico sintetico, tal como polietilenglicol, un enlace maleimida-tiol (util para unir acidos nucleicos a aminoacidos), o un enlace disulfuro. Los enlazadores sinteticos estan disponibles comercialmente, y los metodos de conjugacion qmmica se conocen en la tecnica.
Pueden formarse enlaces no covalentes entre un peptido con dedos de zinc y un dominio efector mediante el uso, por ejemplo, de dominios de cremallera de leucina/bobina en espiral, u otros dominios de dimerizacion sinteticos o de origen natural (Luscher & Larsson (1999) Oncogene 18: 2955-2966; y Gouldson y otros (2000) Neuropsychopharm. 23: S60-S77. Otros medios no covalentes de conjugacion pueden incluir un enlace de biotina-(estrept) avidina o similares. En algunos casos, tambien pueden emplearse adecuadamente las interacciones anticuerpo (o fragmento de anticuerpo)-antigeno, tal como la interaccion fluorescerna-antifluorescerna.
Para causar un efecto biologico deseado a traves de la modulacion de la expresion genica, se permite que los peptidos con dedos de zinc o sus peptidos de fusion correspondientes interaction con, o se unan a, una o mas secuencias de nucleotidos objetivo asociadas con el gen objetivo, ya sea in vivo o in vitro en dependencia de la aplicacion. Por lo tanto, de manera beneficiosa, un dominio de localizacion nuclear se une al dominio de union al ADN para dirigir la proterna al nucleo.
Cuando la secuencia objetivo es el ADN, las regiones de ADN preferidas desde las cuales se efectua la regulacion negativa o positiva de genes espedficos incluyen promotores, potenciadores o regiones de control de locus (LCR). Otras regiones adecuadas dentro de los genomas, las que pueden proporcionar objetivos utiles para los peptidos con dedos de zinc de la invencion, incluyen los telomeros y centromeres. En una modalidad, la secuencia objetivo de ADN genomico comprende una secuencia de repeticion de trinucleotidos que comprende al menos 10 de dichas repeticiones. En otra modalidad, la secuencia objetivo de ADN genomico comprende una secuencia de repeticion de CAG como la que se encuentra en repeticiones de CAG expandidas de genes mutantes. En aun otra modalidad, la secuencia objetivo de ADN comprende una secuencia de repeticion de CTG, la que es el complemento de una secuencia de repeticion de CAG expandida.
Acidos nucleicos y expresion de peptidos
Los peptidos con dedos de zinc de acuerdo con la invencion y, cuando sea apropiado, el conjugado peptido con dedos de zinc/moleculas efectoras de la invencion puede producirse mediante tecnologfa de ADN recombinante y procedimientos estandar de expresion y purificacion de proternas. Por lo tanto, la invencion proporciona ademas moleculas de acido nucleico que codifican los peptidos con dedos de zinc de la invencion, asf como tambien sus derivados; y constructos de acidos nucleicos, tales como vectores de expresion que comprenden acidos nucleicos que codifican peptidos y derivados de acuerdo con la invencion.
Por ejemplo, el ADN que codifica el peptido relevante puede insertarse en un vector de expresion adecuado (por ejemplo, pGEM®, Promega Corp., Estados Unidos), donde se une operativamente a las secuencias de expresion apropiadas, y se transforma en una celula hospedadora adecuada para la expresion de proternas de acuerdo con las tecnicas convencionales (Sambrook J. y otros, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Las celulas hospedadoras adecuadas son aquellas que pueden crecer en cultivo y son susceptibles de transformacion con ADN exogeno, lo que incluye bacterias, celulas fungicas y celulas de origen eucariotico superior, preferentemente celulas de mairnferos.
Para ayudar en la purificacion, los peptidos con dedos de zinc (y los acidos nucleicos correspondientes) de la invencion pueden incluir una secuencia de purificacion, tal como una etiqueta His. Ademas, o alternativamente, los peptidos con dedos de zinc pueden, por ejemplo, cultivarse en fusion con otra proterna y purificarse como cuerpos de inclusion insolubles a partir de celulas bacterianas. Esto es conveniente particularmente cuando el peptido con dedos de zinc o el resto efector puede sertoxico para la celula hospedadora en la que va a expresarse. Alternativamente, los peptidos de la invencion pueden sintetizarse in vitro mediante el uso de un sistema de (transcripcion y) traduccion in vitro adecuado (por ejemplo, el sistema del extracto S30, E. coli, Promega corp., Estados Unidos).
El termino "unida operativamente", cuando se aplica a secuencias de ADN, por ejemplo, en un vector de expresion o constructo, indica que las secuencias se disponen de modo que funcionen cooperativamente para lograr sus propositos previstos, es decir, una secuencia promotora permite el inicio de la transcripcion que procede a traves de una secuencia de codificacion enlazadora hasta la secuencia de terminacion.
Se apreciara que, en en dependencia de la aplicacion, el peptido con dedos de zinc o la proterna de fusion de la descripcion pueden comprender una secuencia o secuencias de peptidos adicionales en el extremo N-terminal y/o C-terminal para facilitar la expresion de proternas, la clonacion y/o la estabilidad del peptido o ARN, sin cambiar la secuencia de ningun dominio de dedos de zinc. Por ejemplo, las secuencias peptfdicas lfder N-terminales adecuadas son MA, MAERP [SEQ ID NO: 41] o MAEERP [SEQ ID NO: 42].
En algunas aplicaciones puede ser conveniente controlar la expresion de polipeptidos con dedos de zinc (fusion) de la invencion mediante secuencias promotoras o promotores inducibles espedficos de tejido, los que pueden proporcionar los beneficios de la expresion inducible y/o espedfica de organos o tejidos de polipeptidos de la invencion. Estos sistemas pueden ser particularmente ventajosos para aplicaciones in vivo y terapia genica. Los ejemplos de promotores espedficos de tejido incluyen el promotor CD2 humano (para celulas T y timocitos, Zhumabekov y otros (1995) J. Immunological Methods 185: 133-140); el promotor de la cinasa II dependiente de alfa calcio calmodulina (para celulas del hipocampo y neocortex, Tsien y otros (1996) Cell 87: 1327-1338); el promotor de la protema acida del suero (glandula mamaria, Wagner y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25: 4323-4330); el promotor de la miogenina del raton (musculo esqueletico, Grieshammer y otros (1998) Dev. Biol. 197: 234-247); y muchos otros promotores espedficos de tejido que se conocen en la tecnica. Para la terapia genica de la enfermedad de Huntington, es conveniente infectar partes particulares del cerebro (el cuerpo estriado). Por lo tanto, los vectores de subtipo AAV2/1 (ver, por ejemplo, Molecular Therapy (2004) 10: 302-317) son ideales para este proposito y pueden usarse con un promotor de AAV fuerte incluido en los vectores.
Los sistemas inducibles adecuados pueden usar la induccion de moleculas pequenas, tales como los sistemas controlados portetraciclina (tet-on y tet-off), el promotor del gen-1 de respuesta temprana a crecimiento (EGR1) inducible por radiacion, y cualquier otro sistema inducible apropiado conocido en la tecnica.
Expresion y caracterizacion de peptidos con dedos de zinc a partir de bibliotecas
Los peptidos con dedos de zinc que tienen una actividad de union conveniente pueden seleccionarse mediante el tamizaje de bibliotecas de peptidos a partir de un marco de peptidos con dedos de zinc de la invencion. De acuerdo con un aspecto de la descripcion, se expresan bibliotecas de acido nucleico que codifican una pluralidad de peptidos con dedos de zinc, y los peptidos sintetizados se seleccionan inicialmente por su capacidad para unirse a una secuencia objetivo deseada. El tamizaje puede realizarse mediante el uso de cualquier sistema de generacion y seleccion de bibliotecas conocido por los expertos en la tecnica, tales como aquellos identificados mas abajo.
Un enfoque consiste en producir una poblacion mixta de peptidos candidatos mediante la clonacion de una biblioteca de oligonucleotidos aleatorizada en un gen de fago filamentoso Ff, lo que permite que se expresen grandes peptidos en la superficie del bacteriofago (H. Lowman (1997) Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26: 401-424; y G. Smith y otros (1993) Meth. Enz., 217: 228-257). Tambien se han creado bibliotecas de peptidos aleatorios de hasta 38 aminoacidos de longitud, y pueden lograrse peptidos mas largos mediante el uso de este sistema. Las bibliotecas de peptidos que se producen se mezclan despues tfpicamente con una secuencia objetivo de acido nucleico unida a una matriz seleccionada previamente. Los peptidos que se unen se afslan, y se determinan sus secuencias. A partir de esta informacion, se sintetizan nuevos peptidos y pueden evaluarse sus propiedades biologicas.
Una desventaja potencial de los procedimientos anteriores es que el tamano de las bibliotecas que se generan tfpicamente con la visualizacion de fagos y la smtesis qrnmica se limita dentro del intervalo de 106-109. Esta limitacion puede resultar en el aislamiento de peptidos de afinidad de union relativamente baja para el ligando objetivo, a menos que se use subsecuentemente un proceso de maduracion que consume mucho tiempo. Esta limitacion del tamano de la biblioteca ha conducido al desarrollo de tecnicas para la generacion in vitro de bibliotecas de peptidos que incluyen: presentacion en ARNm (Roberts, y Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 94, 12297-12302); presentacion en ribosoma (Mattheakis y otros, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 91, 9022-9026); y presentacion CIS (Odegrip y otros, (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 101: 2806-2810) entre otras. Estas bibliotecas pueden ser superiores a las bibliotecas de presentacion de fagos (y otros procedimientos basados in vivo), en que el tamano de las bibliotecas generadas puede ser de 2 a 5 ordenes de magnitud mas grande de lo que es posible con la presentacion en fagos.
Cuando el tamano de la biblioteca es demasiado grande o la longitud del peptido demasiado larga para una estrategia de tamizaje de biblioteca en particular, los dominios de peptidos con dedos de zinc pueden tamizarse y seleccionarse como parte de subdominios mas pequenos (por ejemplo, de 2 o 3 dominios de dedos de zinc adyacentes), y despues unirse mediante el uso de enlazadores, tales como la disposicion de enlazadores descrita en relacion con los peptidos marco de la invencion. Alternativamente, las secuencias de acido nucleico que codifican los residuos de union a acido nucleico (por ejemplo, la secuencia de reconocimiento) de cada dominio de dedos de zinc pueden sintetizarse e injertarse o clonarse en la secuencia genetica que codifica cada dominio de dedos de zinc del marco.
La afinidad de union de un peptido con dedos de zinc seleccionado para la secuencia objetivo seleccionada puede medirse mediante el uso de tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica, tales como resonancia de plasmon de superficie, o interferometna de biocapa. Los enfoques de biosensor se revisan por Rich y otros (2009), "A global benchmark study using affinity-based biosensors", Anal. Biochem., 386:194-216. Alternativamente, los ensayos de union en tiempo real entre un peptido con dedos de zinc y un sitio objetivo pueden realizarse mediante el uso de interferometna de biocapa con un sistema Octet Red (Fortebio, Menlo Park, CA).
Los peptidos con dedos de zinc de la invencion tienen una afinidad de union |jM o superior para una secuencia de acido nucleico objetivo. Adecuadamente, un peptido con dedos de zinc de la invencion tiene una afinidad de union nM o subnM por su secuencia objetivo espedfica; por ejemplo, 10'9 M, 10'1° M, 10'11 M, o 10'12 M o menos. En algunos ejemplos preferidos particularmente, la afinidad de un peptido con dedos de zinc de la invencion por su secuencia objetivo esta en el rango pM o mas abajo, por ejemplo, en el rango de 10'13 M, 10'14 M, o 10'15 M o menos.
En algunas modalidades de peptidos con dedos de zinc para el direccionamiento a repeticiones de CAG expandidas, el peptido con dedos de zinc tiene una constante de disociacion para secuencias de 35 o mas repeticiones de CAG que es al menos 2 veces mas alta, al menos 5 veces, o al menos 10 veces mas alta que para secuencias de menos de 22 repeticiones de CAG. Adecuadamente, la afinidad de dichos peptidos con dedos de zinc de la invencion para secuencias de ADN que tienen al menos 63 repeticiones de CAG es al menos 2 veces, al menos 5 veces o al menos 20 veces mas alta que para secuencias que tienen menos de 22 repeticiones de CAG. En algunas modalidades ventajosas particularmente, la afinidad de dichos peptidos con dedos de zinc por las secuencias de ADN que tienen al menos 104 repeticiones de CAG es al menos 2 veces, al menos 10 veces o al menos 50 veces mas alta que para las secuencias que tienen menos de 22 repeticiones de CAG.
Los metodos de tamizaje y seleccion usados de acuerdo con la descripcion pueden aplicarse a la seleccion de peptidos con dedos de zinc para unirse a cualquier sitio objetivo o secuencia de acido nucleico deseada; las secuencias de reconocimiento adecuadas particularmente comprenden 18 o mas, 36 o mas, o 54 o mas nucleotidos, los que pueden ser contiguos, o no contiguos, que comprenden preferentemente subsitios de 18 nucleotidos contiguos. Las secuencias objetivo de acido nucleico adecuadas son aquellas asociadas con trastornos geneticos, particularmente con trastornos neurologicos, y aun mas adecuadamente con trastornos asociados con la duplicacion, insercion, y expansion de secuencias genomicas, tales como HD.
Composiciones terapeuticas
Un peptido con dedos de zinc o un modulador quimerico de la invencion puede incorporarse en una composicion farmaceutica para su uso en el tratamiento de un animal; preferentemente un humano. Un peptido terapeutico de la invencion (o un derivado de este) puede usarse para tratar una o mas enfermedades o infecciones, en dependencia de que sitio de union del peptido con dedos de zinc se selecciono o diseno para reconocerlo. Alternativamente, un acido nucleico que codifica el peptido terapeutico puede insertarse en un constructo/vector de expresion e incorporarse en formulaciones farmaceuticas/medicamentos para el mismo proposito.
Los peptidos con dedos de zinc y los moduladores quimericos de la invencion contienen tipicamente residuos de aminoacidos de origen natural, pero en algunos casos tambien pueden presentar residuos de aminoacidos de origen no natural. Por lo tanto, los llamados "mimeticos peptidicos" y los "analogos peptidicos", los que pueden incluir estructuras qmmicas no aminoaddicas que imitan la estructura de un aminoacido o peptido en particular, tambien pueden usarse dentro del contexto de la invencion. Dichos mimeticos o analogos se caracterizan generalmente por exhibir caractensticas ffsicas similares tales como tamano, carga o hidrofobicidad, y la orientacion espacial apropiada que se encuentra en sus contrapartes de peptidos naturales. Un ejemplo espedfico de un compuesto mimetico peptfdico es un compuesto en el que el enlace amida entre uno o mas de los aminoacidos se reemplaza por, por ejemplo, un enlace carbono-carbono u otro enlace diferente de amida, como se conoce bien en la tecnica (ver, por ejemplo, Sawyer, en Peptide Based Drug Design, pags. 378-422, ACS, Washington D.C. 1995). Dichas modificaciones pueden ser ventajosas particularmente para aumentar la estabilidad de los productos terapeuticos de peptidos con dedos de zinc y/o para mejorar o modificar la solubilidad, la biodisponibilidad y las caractensticas de suministro (por ejemplo, para aplicaciones in vivo).
Los peptidos terapeuticos y los acidos nucleicos de la invencion pueden ser adecuados particularmente para el tratamiento de enfermedades, afecciones y/o infecciones que pueden dirigirse (y tratarse) intracelularmente, por ejemplo, mediante el direccionamiento a secuencias geneticas dentro de una celula animal; y tambien para aplicaciones in vitro y ex vivo. Como se usa en la presente, los terminos "agente terapeutico" y "agente activo" abarcan tanto a los peptidos como a los acidos nucleicos que codifican un peptido con dedos de zinc terapeutico de la invencion. Los acidos nucleicos terapeuticos incluyen vectores, genomas virales y virus modificados, tales como AAV, los que comprenden secuencias de acido nucleico que codifican peptidos con dedos de zinc y protemas de fusion de la invencion.
Los usos y aplicaciones terapeuticos para los peptidos con dedos de zinc y acidos nucleicos de la descripcion incluyen: agentes anti-VEGF para el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos neoplasicos y no neoplasicos; canceres/enfermedades neoplasicas y afecciones relacionadas; afecciones no neoplasicas, tales como trastornos neurologicos, lo que incluye lesion en la cabeza, lesion de la medula espinal, hipertension aguda, meningitis, encefalitis, malaria cerebral, esclerosis multiple y encefalopatfa; retinopatfas diabeticas y otras retinopatfas proliferativas; inflamacion y afecciones relacionadas con la inflamacion. Otros usos terapeuticos para las moleculas y composiciones de la presente descripcion incluyen el tratamiento de infecciones microbianas y afecciones asociadas, por ejemplo, infeccion bacteriana, viral, fungica o parasitaria. Las enfermedades de expansion de repeticion de trinucleotidos son preferidas particularmente y susceptibles a las terapias de la presente invencion, por ejemplo: Enfermedad de Huntington (poli-CAG), ataxias espinocerebelosas (poli-CAG), atrofia dentatorubropalidoluisiana (poli-CAG), epilepsia mioclonica juvenil (repeticiones dodecamericas; poli-CCCCGCCCCGCG), ataxia de Friedreich (poli-GAA), smdrome X fragil (poli-CGG), smdrome X-E fragil (poli-CCG), distrofia miotonica (poli-CTG).
Uno o mas portadores adicionales aceptables farmaceuticamente (tales como diluyentes, adyuvantes, excipientes o vehmulos) pueden combinarse con el peptido terapeutico de la invencion en una composicion farmaceutica. Los portadores farmaceuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. Las formulaciones y composiciones farmaceuticas de la descripcion se formulan para cumplir con los estandares regulatorios y pueden administrarse por via oral, intravenosa, topica o por otras vfas estandar.
De acuerdo con la invencion, el peptido o el acido nucleico terapeutico pueden fabricarse en medicamentos o pueden formularse en composiciones farmaceuticas. Cuando se administra a un sujeto, un agente terapeutico se administra adecuadamente como un componente de una composicion que comprende un vetnculo aceptable farmaceuticamente. Las moleculas, compuestos y composiciones de la invencion pueden administrarse por cualquier via conveniente, por ejemplo, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intravaginal, transdermica, rectal, por inhalacion, o topicamente a la piel. La administracion puede ser sistemica o local. Los sistemas de suministro que se conocen incluyen ademas, por ejemplo, la encapsulacion en microgeles, liposomas, micropartfculas, microcapsulas, capsulas, etcetera, y pueden usarse para administrar los compuestos de la invencion. Cualquier otro sistema de suministro adecuado conocido en la tecnica tambien se contempla en el uso de la presente invencion.
Los vetnculos aceptables farmaceuticamente pueden ser lfquidos, tales como agua y aceites, lo que incluye aquellos de origen a partir del petroleo, animal, vegetal o sintetico tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sesamo y similares. Los vetnculos farmaceuticos pueden ser solucion salina, goma de acacia, gelatina, pasta de almidon, talco, queratina, sflice coloidal, urea, y similares. Ademas, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes, y colorantes. Cuando se administran a un sujeto, los vetnculos aceptables farmaceuticamente son esteriles preferentemente. El agua es un vetnculo adecuado cuando el compuesto de la invencion se administra por via intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerina acuosas pueden emplearse tambien como vetnculos lfquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los vetnculos farmaceuticos adecuados tambien incluyen excipientes tales como almidon, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sflice, estearato de sodio, monoestearato de glicerilo, talco, cloruro de sodio, leche seca descremada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y similares. La presente composicion, si se desea, puede contener, ademas, cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tampones.
Los medicamentos y composiciones farmaceuticas de la invencion pueden tomar la forma de lfquidos, soluciones, suspensiones, lociones, geles, tabletas, pfldoras, granulos, polvos, formulaciones de liberacion modificada (tales como de liberacion lenta o sostenida), supositorios, emulsiones, aerosoles, atomizadores, capsulas (por ejemplo, capsulas que contienen lfquidos o polvos), liposomas, micropartfculas o cualquier otra formulacion adecuada conocida en la tecnica. Otros ejemplos de vetnculos farmaceuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Alfonso R. Gennaro ed., Mack Publishing Co. Easton, Pa., ed. 19, 1995, ver por ejemplo las paginas 1447-1676.
Adecuadamente, las composiciones o medicamentos terapeuticos de la invencion se formulan de acuerdo con procedimientos rutinarios tales como una composicion farmaceutica adaptada para la administracion oral (mas adecuadamente para seres humanos). Las composiciones para el suministro por via oral pueden estar en forma de comprimidos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, granulos, polvos, emulsiones, capsulas, jarabes, o elfxires, por ejemplo. Por lo tanto, en una modalidad, el vetnculo aceptable farmaceuticamente es una capsula, comprimido o pfldora.
Las composiciones administradas por via oral pueden contener uno o mas agentes, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes saborizantes tales como menta, aceite de gaulteria, o cereza; agentes colorantes; y agentes conservantes, para proporcionar una preparacion palatable farmaceuticamente. Cuando la composicion esta en forma de un comprimido o pfldora, las composiciones pueden recubrirse para retardar la desintegracion y absorcion en el tracto gastrointestinal, para proporcionar una liberacion sostenida del agente activo durante un penodo prolongado de tiempo. Las membranas selectivamente permeables, que rodean el compuesto primario osmoticamente activo tambien son convenientes para las composiciones que se administran oralmente. En estas formas de dosificacion, el fluido del ambiente que rodea la capsula se embebe por el compuesto primario, el que se hincha para desplazar el agente o la composicion del agente a traves de una abertura. Estas formas de dosificacion pueden proporcionar un perfil de liberacion esencialmente de orden cero en oposicion a los perfiles en picos de las formulaciones de liberacion inmediata. Ademas, puede usarse un material retardante como el monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo. Las composiciones orales pueden incluir vetnculos estandares tales como manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio, etcetera. Dichos vetnculos son preferentemente de grado farmaceutico. Para las formulaciones orales, la localizacion de la liberacion puede ser el estomago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno o el Aeon) o el intestino grueso. Un experto en la tecnica es capaz de preparar formulaciones que no se disolveran en el estomago, pero que liberaran el material en el duodeno o en cualquier otra parte del intestino. Adecuadamente, la liberacion evitara los efectos nocivos del entorno estomacal, ya sea mediante la proteccion del peptido (o derivado) o mediante la liberacion del peptido (o derivado) mas alla del entorno estomacal, tal como en el intestino. Para garantizar una resistencia gastrica total, sena esencial un recubrimiento impermeable al menos a un pH 5,0. Ejemplos de los ingredientes inertes mas comunes que se usan como recubrimientos entericos son el trimelitato de acetato de celulosa (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinilo (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulosa (CAP), Eudragit L, Eudragit S, y Shellac, los que pueden usarse como pelfculas mixtas.
Para ayudar a la disolucion del agente o acido nucleico (o derivado) terapeutico en el entorno acuoso, puede anadirse un tensioactivo como agente humectante. Los tensioactivos pueden incluir detergentes anionicos, tales como laurilsulfato de sodio, dioctil sulfosuccinato de sodio y dioctil sulfonato de sodio. Podnan usarse detergentes cationicos y podnan incluir cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. Los detergentes no ionicos potenciales que podnan incluirse en la formulacion como tensioactivos incluyen: lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polisorbato 20, 40, 60, 65 y 80, ester de acido graso y sacarosa, metil celulosa y carboximetil celulosa. Estos tensioactivos, cuando se usan, podnan presentarse en la formulacion del peptido o acido nucleico o derivado ya sea solo o como una mezcla en relaciones diferentes.
Tfpicamente, las composiciones para la administracion intravenosa comprenden tampon acuoso isotonico esteril. Cuando sea necesario, la composicion puede incluir ademas un agente de solubilizacion.
Otra v^a de administracion adecuada para las composiciones terapeuticas de la invencion es mediante suministro pulmonar o nasal.
Pueden incluirse aditivos para mejorar la captacion celular del peptido (o derivado) o acido nucleico terapeutico de la invencion, tales como los acidos grasos acido oleico, acido linoleico y acido linolenico.
En una composicion farmaceutica, un peptido con dedos de zinc o un acido nucleico de la invencion (y opcionalmente cualquier resto sin dedos de zinc asociado, por ejemplo, un modulador de la expresion genica y/o el resto de direccionamiento) puede mezclarse con una poblacion de liposomas (es decir, una vesfcula lipfdica u otro compartimento encapsulado con membrana artificial), para crear una poblacion terapeutica de liposomas que contienen el agente terapeutico y opcionalmente el resto modulador o efector. La poblacion terapeutica de liposomas puede administrarse a un paciente mediante cualquier medio adecuado, tal como por inyeccion intravenosa. Cuando sea necesario que la composicion de liposomas terapeuticos se dirija espedficamente a un tipo de celula en particular, tal como una especie microbiana en particular o una celula infectada o anormal, la composicion de liposoma puede formularse adicionalmente con un dominio de anticuerpo apropiado o similar (por ejemplo, Fab, F(ab)2 , scFv etcetera) o un resto de direccionamiento alternativo, el que reconoce el tipo de celula objetivo. Dichos metodos se conocen por el experto en la tecnica.
Los peptidos o acidos nucleicos terapeuticos de la invencion tambien pueden formularse en composiciones para la aplicacion topica en la piel de un sujeto.
Los peptidos con dedos de zinc y los acidos nucleicos de la invencion pueden ser utiles, ademas, en aplicaciones no farmaceuticas, tales como en pruebas de diagnostico, formacion de imagenes, como reactivos de afinidad para la purificacion y como vetnculos de suministro.
Terapia genica
Un aspecto de la descripcion se refiere a tratamientos de terapia genica que usan peptidos con dedos de zinc de la invencion para el tratamiento de enfermedades.
La terapia genica consiste en la insercion de genes en las celulas de un individuo (por ejemplo, animales o humanos) y tejidos biologicos para tratar enfermedades, por ejemplo, mediante el reemplazo de alelos mutantes nocivos por versiones funcionales/corregidas. Las enfermedades objetivo mas prometedoras hasta la fecha son aquellas causadas por defectos de un solo gen, tales como la fibrosis qmstica, la hemofilia, la distrofia muscular, la anemia de celulas falciformes, y la HD. Otros objetivos comunes de la terapia genica se dirigen al cancer y las enfermedades hereditarias relacionadas con un defecto genetico, tales como las repeticiones de nucleotidos expandidos.
La terapia genica se clasifica en dos tipos: la terapia genica de la lmea germinal, en la cual las celulas germinales (es decir, los espermatozoides o los ovulos), se modifican mediante la introduccion de genes terapeuticos, que se integran tfpicamente en el genoma y tienen la capacidad de ser hereditarios (es decir, transmitidos a las generaciones posteriores); y la terapia genica somatica, en la que los genes terapeuticos se transfieren a las celulas somaticas de un paciente, lo que significa que pueden localizarse y que no se heredan por las generaciones futuras.
Los tratamientos de terapia genica requieren el suministro del gen terapeutico (o molecula de ADN o ARN) a las celulas objetivo. Existen dos categonas de sistemas de suministro, ya sea mecanismos de suministro basados en virus o mecanismos no virales, y ambos mecanismos se preveen para su uso con la presente invencion.
Los sistemas virales pueden basarse en cualquier virus adecuado, tales como: los retrovirus, que portan ARN (por ejemplo, influenza, SIV, HIV, lentivirus, y leucemia murina de Moloney); adenovirus, que portan ADNbc; virus adenoasociados (AAV), que portan ADNmc; virus del herpes simple (HSV), que porta ADNbc; y virus quimericos (por ejemplo, cuando la envoltura del virus se ha modificado mediante el uso de protemas de la envoltura de otro virus).
Un sistema de suministro viral preferido particularmente es el AAV. El AAV es un virus pequeno de la familia del parvovirus con un genoma de ADN monocatenario. Una caractenstica clave del AAV de tipo salvaje es que casi invariablemente inserta su material genetico en un sitio espedfico en el cromosoma humano 19. Sin embargo, el AAV recombinante, que contiene un gen terapeutico en lugar de sus genes virales normales, puede no integrarse en el genoma animal, y en su lugar puede formar ADN circular episomal, que probablemente sea la causa principal de la expresion genica a largo plazo. Las ventajas de los vectores de terapia genica basados en AAV incluyen: que el virus no es patogeno para los humanos (y ya es portado por la mayona de las personas); la mayona de las personas tratadas con AAV no desarrollaran una respuesta inmunitaria para eliminar el virus o las celulas con las que se han infectado exitosamente; infectara celulas en division asf como tambien las que no estan en division (quiescentes); y se muestra promisorio particularmente para los tratamientos de terapia genica de musculos, ojos, y cerebro. Hasta la fecha, los vectores de AAV se han usado para ensayos clmicos de primera y segunda fase para el tratamiento de la fibrosis qmstica; y se han llevado a cabo ensayos clmicos de primera fase para el tratamiento de la hemofilia. Ademas, se han obtenido resultados alentadores de ensayos clmicos de fase I para la enfermedad de Parkinson, lo que proporciona esperanzas para los tratamientos que requieren el suministro al sistema nervioso central. Ademas, se han informado ensayos de terapia genica mediante el uso de AAV para el tratamiento de la enfermedad de Canavan, la distrofia muscular y la lipofuscinosis neuronal ceroidea infantil tardfa. El HSV, que infecta naturalmente las celulas nerviosas en los seres humanos, tambien puede ofrecer ventajas para la terapia genica de enfermedades que involucran el sistema nervioso.
Adecuadamente, de acuerdo con la descripcion, los constructos de acido nucleico que codifican dedos de zinc (como se describio en otra parte en la presente descripcion) se insertan en un vector de virus adenoasociado (AAV), particularmente el subtipo AAV2/1 (ver, por ejemplo, Molecular Therapy (2004) 10: 302-317). Este vector es adecuado particularmente para la inyeccion y la infeccion del cuerpo estriado, en el cerebro, donde los efectos nocivos de la agregacion de Htt mutante tienen mas prevalencia en la HD. De esta manera, los constructos de acido nucleico que codifican dedos de zinc de la invencion pueden suministrarse a las celulas objetivo deseadas, y los peptidos con dedos de zinc se expresan para reprimir la expresion de genes htt mutantes.
Los enfoques no basados en virus para la terapia genica pueden proporcionar ventajas sobre los metodos virales, por ejemplo, en vista de la produccion simple a gran escala y la baja inmunogenicidad del hospedero. Los tipos de mecanismos no virales incluyen: ADN desnudo (por ejemplo, plasmidos); oligonucleotidos (por ejemplo, antisentido, ARNip, oligodesoxinucleotidos senuelo y oligonucleotidos ADNmc); lipoplexos (complejos de acidos nucleicos y liposomas); poliplexos (complejos de acidos nucleicos y polfmeros); y dendnmeros (macromoleculas muy ramificadas y aproximadamente esfericas).
En consecuencia, los acidos nucleicos que codifican dedos de zinc de la invencion pueden usarse en metodos para tratar enfermedades mediante terapia genica. Las enfermedades particularmente adecuadas son las del sistema nervioso (periferico y/o central); y una enfermedad preferida es la HD.
En particular, los agentes terapeuticos y regfmenes de terapia genica de la descripcion pueden proporcionar la expresion de dedos de zinc terapeuticos en celulas objetivo para reprimir la expresion de genes objetivo, tales como aquellos que tienen secuencias de repeticion de CAG expandidas de tipo no salvaje, y especialmente el gen htt mutante. Las nucleasas con dedos de zinc de la descripcion (por ejemplo, como las protemas de fusion con el dominio de nucleasa Fok-1) tambien pueden ser utiles en tratamientos de terapia genica para cortar o dirigir el sitio de integracion de genes terapeuticos a sitios cromosomicos espedficos, como se informo anteriormente por Durai y otros (2005) Nucleic Acids Res. 33, 18: 5978­ 5990.
Enfermedad de Huntington (HD) y terapias
A diferencia de otros trastornos neurologicos, tales como las enfermedades de Alzheimer y Parkinson, la HD es monogenica (The Huntington's Disease Collaborative Research Group (1993) Cell, 72(6): 971-983). Por lo tanto, una estrategiaterapeutica util contra la HD puede que solotenga que dirigirse a la expresion del gen causal unico para revertir y tratar los efectos de la protema mutante. Sin embargo, dado que la protema Htt wt se expresa ampliamente (Sharp y otros (1995) Neuron 14(5): 1065-1074); es esencial para el desarrollo embrionariotemprano (Duyaoy otros (1995) Science 269(5222): 407-410); y se requiere para la funcion neuronal y la supervivencia en el cerebro (Dragatsis y otros (2000) Nat. Genet. 26(3): 300-306); es importante reducir espedficamente la expresion de la protema mutante, y dejar la expresion de la protema wt sin afectar.
Recientemente, se demostro que la interferencia de ARN (ARNi) reduce la expresion del htt mutante (van Bilsen y otros (2008) Hum. Gene Ther. 19(7): 710-719; Zhang y otros (2009) J. Neurochem. 108(1): 82-90; Pfister y otros (2009) Curr. Biol. 19(9): 774-778). Aunque esta tecnica puede tener el potencial de ser muy potente, el exito del ARNi depende del direccionamiento a un solo nucleotido o a los polimorfismos de delecion que diferencian entre alelos mutantes y wt, y estos a menudo difieren de un paciente a paciente. El requerimiento para los disenos de ARNip personalizados plantean actualmente desafms para los ensayos clmicos y el uso aprobado en humanos.
En un enfoque mas general, Hu y otros usaron acido nucleico peptfdico (PNA), y oligomeros antisentido de acido nucleico bloqueado (LNA) para dirigirse a las repeticiones de CAG expandidas de los genes ataxina-3 y htt (Hu y otros (2009) Nat. Biotecnol. 27(5): 478-484; Hu y otros (2009) Ann. NY Acad. Sci. 1175: 24-31). Ellos observaron una inhibicion selectiva del alelo mutante con acidos nucleicos peptfdicos (PNA) por hasta 22 dfas. Aunque estos resultados tambien parecen ser prometedores, los PNA no pueden suministrarse al sistema nervioso central. Por lo tanto, los autores tambien intentaron usar acidos nucleicos bloqueados (LNA), que son mas adecuados para aplicaciones in vivo. En este experimento se observo la inhibicion del alelo mutante, pero tambien se observo una inhibicion de hasta el 30 % del htt wt en la concentracion mas eficaz de LNA usada.
Por lo tanto, aun existe una clara necesidad en la tecnica de terapias eficaces para inhibir la expresion de la protema Htt mutante, a la vez que se deja la expresion del alelo de tipo salvaje en gran medida sin afectacion.
En consecuencia, en este trabajo, los inventores disenaron racionalmente peptidos con dedos de zinc para ser capaces de reconocer y unir secuencias de poli- 5' -GC(A/T) -3', de manera que reconocenan tanto poli-CAG como su cadena de ADN complementaria, poli-CTG. Los peptidos con dedos de zinc beneficiosos de la invencion fueron capaces de reprimir un gen objetivo con secuencias de repeticion de CAG expandidas sobre preferentemente las secuencias de repeticion mas cortas en ensayos informadores de transfeccion transitoria. Mediante el uso de una lmea celular modelo para HD, los inventores lograron una expresion estable de peptidos con dedos de zinc, lo que redujo, ademas, la expresion del gen htt mutante cromosomico (que tiene 111 repeticiones de CAG). La represion de la expresion genica se demostro tanto en la protema como en los niveles de ARN. Se demostro que la represion de los genes mutantes que fueron objetivo persiste durante penodos prolongados (por ejemplo, durante 20 dfas), y se encontro que la expresion de los genes que tienen secuencias de repeticion de CAG genomicas mas cortas permanece inalterada ampliamente. De esta forma, los peptidos con dedos de zinc de la invencion se dirigen a las repeticiones de CAG expandidas asociadas con el gen Htt mutante en preferencia a las repeticiones de CAG normales asociadas con el gen Htt de tipo salvaje. Por lo tanto, los peptidos con dedos de zinc de la invencion son represores eficientes y selectivos de genes con regiones de CAG largas.
Igualmente, los peptidos con dedos de zinc de la invencion son adecuados para el direccionamiento y la modulacion de genes que contienen secuencias repetidas largas (particularmente, repeticiones de trinucleotidos) asociadas con genes distintos de Htt, como se ha indicado anteriormente.
La invencion se ilustrara ahora aun mas por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
A menos que se indique de cualquier otra manera, se usaron reactivos disponibles comercialmente y tecnicas estandar en biologfa molecular y bioqmmica.
Materiales y Metodos
Los procedimientos siguientes usados por el solicitante se describen en Sambrook, J. y otros 1989 citado mas arriba: analisis de productos de digestion con enzimas de restriccion sobre geles de agarosa y preparacion de solucion salina tamponada con fosfato. Los reactivos de proposito general, oligonucleotidos, productos qmmicos y solventes se adquirieron de Sigma-Aldrich Qmmica SA (Madrid, Espana). Las enzimas y las polimerasas se obtuvieron de New England Biolabs (NEB Inc.; c/o IZASA, S.A. Barcelona, Espana).
Construccion de vectores y peptidos con dedos de zinc (ZFP)
Para crear un marco de peptido con dedos de zinc (ZFP) que reconozca tanto las secuencias de ADN de GCA como de GCT (que se encuentran dentro de las repeticiones de cAg expandidas), se selecciono un andamio de dedos de zinc basado en la secuencia de cadena principal de tipo salvaje de la region de dedos de zinc de zif268 tipo salvaje. Los residuos de aminoacidos responsables del reconocimiento del ADN objetivo (es decir, la "secuencia de reconocimiento", la que corresponde esencialmente a la region de a-helice del marco) se disenaron y se tuvo en consideracion dos estudios informados previamente: (1) Choo y otros (1994) Nature 372(6507): 642-645, ZFP disenadas con las secuencias de reconocimiento a-helice siguientes (residuos -1 a 6), QAATLQR para la union al triplete GCA, y QAQTLQR [SEQ ID NO: 44] para la union al triplete GCT; y (2) Isalan y otros (1998) Biochemistry 37(35): 12026-12033, informaron que la secuencia QRASRKR [SEQ ID NO: 46] fue capaz de reconocer tripletes GN(T/A). Estas secuencias de aminoacidos de a-helice se combinaron para generar una secuencia tnbrida de a-helice nueva, QRATLQR (SEQ ID NO: 1), que comprende las posiciones -1, 1 y 2 de Isalan y otros y los residuos 3, 4, 5 y 6 de Choo y otros. Se esperaba que el dominio de dedos de zinc resultante se uniera a la secuencia GC(T/A), y se denomino ZFxHunt (Fig. 1C). Se sintetizo un vector pUC57 que contiene 6 de dichos dominios de dedos de zinc, denominado ZF6xHunt (Genscript Corporation (Piscataway, nJ)). Ademas, este vector incluyo un promotor T7, un NLS N-terminal (PKKKRKV [SEQ ID NO: 40]) y sitios de restriccion para derivar peptidos con 4 (ZF4), 11 (ZF11), 12 (ZF12) y 18 (ZF18) dedos de zinc en matrices en tandem mediante subclonacion (ver la Tabla 1 para las secuencias de dedos de zinc; SEQ ID NO: 6 a 15). Por ejemplo, para clonar el ZF4 pUC57, el vector ZF6 pUC57 se corto con Eag1 y se volvio a ligar (peptido con dedos de zinc SEQ ID NO: 6). Para clonar ZF12, se digirio ZF6 pUC con SpeI, y un fragmento de PCR que contiene ZF6 (con enlazadores SpeI) se clono en el sitio SpeI (peptido con dedos de zinc, SEQ ID NO: 12). Se anadio un sitio KpnI para propositos de clonacion futuros (fragmento de PCR: "Spel-Kpnl-ZF6-Spel"). El ZF11 se derivo de ZF12 mediante la delecion del dedo N-terminal por recombinacion homologa (peptido con dedos de zinc, SEQ ID NO: 10). El ZF18 se construyo con una estrategia de clonacion por PCR similar a la de ZF12, lo que resulto en enlazadores ligeramente mas cortos (peptido con dedos de zinc, SEQ ID NO: 14).
Los peptidos con dedos de zinc se subclonaron despues en el vector de expresion de mairnferos pTarget (Promega). Se introdujo una secuencia etiqueta 3xFLAG (DYKDHDG DYKDHDI DYKDDDDK [SEQ ID NO: 47]) mediante PCR en el extremo N-terminal, y se introdujeron en el extremo C-terminal ya sea las secuencias codificantes de Kox-1 (dominio de represion KRAB) o el dominio de endonucleasa Fokl, con un enlazador 3xGGGGS [SEQ ID NO: 48] entre el peptido con dedos de zinc y el dominio efector.
La serie de vectores pEH se clono en dos etapas. Primero, la region codificante de EGFP se escindio de pEGFP-N1 (Clontech), mediante el uso de HindIII/XbaI, y se clono en pGL4.13 (Promega) para dar pSV40-EGFP. Despues, un producto de PCR que contema enlazadores CMV-HcRed-poliA y Clal se clono en pSV40-EGFP (digerido parcialmente con ClaI). El codon de inicio EGFP se muto a alanina por mutagenesis dirigida al sitio, y los fragmented de PCR que conteman el exon I de Htt humano de plantillas genomicas humanas diferentes (para obtener numeros de repeticiones de CAG diferentes), se clonaron en el sitio EcoRI de pEH, aguas arriba y en marco con EGFP (serie pEH-Q). Las series de vectores pSV40-mCherry se generaron mediante el reemplazo del EGFP de las series de vectores pSV40-EGFP con mCherry mediante el uso de los sitios Xmal/Xbal.
Ensayos de retardo en gel in vitro
Primero, se usaron los cebadores pUC57-ZFxHunt, M13fwd y M13rev (M13directo, GTAAAACGACGGCCAG; M13inverso, CAGGAAACAGCTATGAC; ver Tabla 3), para generar productos de PCR para la expresion in vitro del ZFP, mediante el uso del kit de ADN de PCR Quick TNT T7 (Promega). Las sondas de ADN bicatenario con diferentes numeros de repeticiones de CAG basadas en la secuencia estandar: 5'- Ac G TAC (CAG)n TCA CAG TCA GTC CAC ACG TC -3' [SEQ ID NO: 49] se produjeron mediante relleno Klenow. Se usaron 100 ng de ADN bicatenario en una reaccion de marcaje con DIG mediante el uso del kit Gel Shift, 2da generacion (Roche), y se siguieron las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de retardo en gel, se incubaron 0,005 pmol de la sonda marcada con DIG con cantidades crecientes de protema expresada en TNT en una reaccion de 20 pl que contema 0,1 mg/ml de BSA, 0,1 pg/ml de polidil:dC, glicerol al 5 %, propano Bis-Tris 20 mM, NaCl 100 mM, MgCh 5 mM, 50 mg/ml de ZnCl2, NonidetP40 al 0,1 % y TDT 5 mM durante 1 hora a 25 °C. Las reacciones de union se separaron en un gel de acrilamida no desnaturalizante al 7 % durante 1 hora a 100 V, se transfirieron a una membrana de nailon durante 30 minutos a 400 m Ay se realizo la visualizacion de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cultivo celular y suministro de genes
La lmea celular HEK-293T (ATCC) se cultivo en CO2 al 5 % a 37 °C en DMEM (Gibco) suplementado con FBS al 10 % (Gibco). El ADN purificado de Qiagen se transfecto en celulas mediante el uso de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las celulas se colocaron en placas de 10 mm a una densidad del 50 % y se mezclaron y se anadieron a las celulas 70 ng del plasmido indicador, 330 ng del plasmido de expresion de ZFP y 2 pl de Lipofectamina 2000. Las celulas se cosecharon para su analisis 48 horas despues.
Se cultivaron celulas STHdh+ / Hdh+ y STHdhQ111/Hdh111 (donacion de M.E. MacDonald) en CO2 al 5 % a 33 °C en DMEM suplementado con FBS al 10 % (Gibco) y 400 pg/ml de G418 (PAA). Las celulas se infectaron con partteulas retrovirales mediante el uso del sistema pRetroX (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Analisis de citometna de flujo
Las celulas se cosecharon 48 horas despues de la transfeccion y se analizaron en un citometro de flujo BD FACS Canto mediante el uso del software BD FACSDiva.
Transferencia de Western
Las celulas 293T se cosecharon 48 horas despues de la transfeccion en 100 pl de colorante de carga 2xSDS con inhibidor de proteasa Complete (Roche). Se separaron 20 pl de muestra en geles listos Tris-HCl Criterion al 4-15 % (BioRad) durante 2 horas a 100 V, se transfirieron a una membrana Hybond-C (GE Healthcare) durante 1 hora a 100 V. Las protemas se detectaron ya sea con el anticuerpo primario anti p-actina (Sigma A1978) a una dilucion de 1:3.000 o con anti-EGFP (Roche) a una dilucion de 1:1.500 y con un anticuerpo secundario anti-raton de burro conjugado con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch) a una dilucion 1:10.000. La visualizacion se realizo con el sistema ECL (GE Healthcare) mediante el uso de un sistema de formacion de imagenes LAS-3000 (Fujifilm). Las celulas STHdh se tripsinizaron y se cosecharon en PBS que contema inhibidor de proteasa Complete (Roche). Las celulas se resuspendieron en tampon RIPA (TritonX-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, Tris-HCl 40 mM, NaCl 150 mM, SDS al 0,2 %, Complete), se incubaron en hielo durante 15 minutos y se centrifugaron a 13.000 rpm durante 15 minutos. Se colecto el sobrenadante y se determino la concentracion de protema mediante el uso de un ensayo de protemas Dc de BioRad. Se separaron 60 pg de protema en un gel listo Tris-HCl Criterion al 5 % (BioRad) durante 2 horas a 100 V, se transfirieron mediante el uso de iBlot Dry Blotting System (Invitrogen) durante 8 minutos y se detecto protema Htt endogena con anticuerpo primario antihuntingtina (Millipore MAB2166) a una dilucion 1:1.000.
qRT-PCR
El ARN se preparo con el kit RNeasy (Qiagen) y se transcribio de forma inversa con Superscript II (Invitrogen). El PCR en tiempo real se realizo en un instrumento LightCycler® 480 (Roche) mediante el uso de LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche). Los conjuntos de cebadores se presentan en su totalidad en la Tabla 3.
Ejemplo 1
Diseno de matrices de peptidos con dedos de zinc (ZFP) para unirse a repeticiones de CAG
Se conoce que los dominios de dedos de zinc pueden concatenarse para formarcadenas de multiples dedos (porejemplo, 6 dedos) (Moore y otros (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 98(4): 1437-1441; y Kimy Pabo (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 95(6): 2812-2817), pero hasta la fecha, no se ha informado una exploration sistematica de los modos de union de ZFP de longitudes diferentes a regiones de ADN repetitivas largas.
Los inventores, por lo tanto, usaron un diseno racional para construir un dominio de dedos de zinc (ZFxHunt) que se uniria a la secuencia 5'- GC(A/T) -3' en el ADN bicatenario. Por lo tanto, se esperaba que las protemas poli-dedos que comprendian matrices de ZfxHunt se unieran a las secuencias de poli-GCA y poli-GCT (ver Materiales y Metodos mas arriba y la Figura 1). Ambas cadenas de ADN de la repetition bicatenaria de CAG se tomaron como objetivo porque: (i) se penso que esto aumentaria la avidez de los peptidos con dedos de zinc por objetivos cromosomicos de baja copia; y (ii) permitio probar los disenos de fusion de nucleasa Fok-I (como se describe mas abajo). Para intentar evitar que los peptidos con dedos de zinc perdieran su registro con el ADN relacionado (despues de 3 o mas dedos adyacentes y 9 pares de bases contiguas de ADN de doble helice), las secuencias enlazadoras se disenaron cuidadosamente. En particular, se modulo la longitud de los enlazadores entre los dedos de zinc adyacentes en las matrices. De esta manera, podria optimizarse el registro entre las matrices mas largas de peptidos con dedos de zinc, especialmente en la union al ADNbc. Mediante el uso de consideraciones estructurales, se decidio modificar periodicamente las secuencias enlazadoras canonicas estandaren las matrices. Porlo tanto, se incluyeron secuencias enlazadoras similares a canonicas que contienen un residuo extra Gly (o Ser) o secuencias enlazadoras flexibles (hasta 29 residuos) en la matriz de dedos de zinc larga despues de cada 2 y 6 dedos, respectivamente (ver la Tabla 1 y las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 y 14). De esta manera, podrian probarse diferentes numeros de dedos de zinc para determinarla discrimination optima dependiente de la longitud.
Tabla 1: Aminoacidos del marco de peptido con dedos de zinc y secuencias de acidos nucleicos codificantes. En las secuencias de aminoacidos, las secuencias de reconocimiento se subrayan y las secuencias enlazadoras se muestran en negrita.
Secuencia de aminoacidos de ZF4xHunt (SEQ ID NO: 6):
FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH
Secuencia de acido nucleico de ZF4xHunt (SEQ ID NO: 7):
TTCCAGTGCCGCATTTGTATGCGCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCAC CCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCGTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCC TGCAGCGCCATACCAAAATTCACACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCAGGATTTGCATGCGT AATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGCACCCATACTGGTGAAAAACCGTTTGC CTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCTACCTTACAGCGCCATACCAAAATTCAT
Secuencia de aminoacidos de ZF6xHunt (SEQ ID NO: 8):
FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP
FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FAC DIC GRKFAQRATLQRHTKIH
(continuation)
Secuencia de acido nucleico de ZF6xHunt (SEQ ID NO: 9):
TTCCAGTGCCGCATTTGTATGCGCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCAC CCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCGTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCC TGCAGCGCCATACCAAAATTCACACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGT AATTTTAGCCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGC CTGCGATATTTGTGGCCGTAAATTTGCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATA CCGGTTCTGAACGGCCGTTTCAGTGCAGGATTTGCATGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTG CAGCGCCATATTCGCACCCATACTGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATT TGCGCAGCGTGCTACCTTACAGCGCCATACCAAAATTCAT
Secuencia de aminoacidos de ZF11xHunt (SEQ ID NO: 10):
FQCRICMRNFSQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH LRQKDGGGGSGGGGSGGGGSQLVGTAERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH
Secuencia de acido nucleico de ZF11xHunt (SEQ ID NO: 11):
TTCCAGTGCCGCATTTGTATGCGCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAAT TCACACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGTAATTTTAGCCAGCGTGCGA CCCTGCAGCGCCATATTCGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGTGGCCGT AAATTTGCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATACCGGTTCTGAACGGCCGTT TCAGTGCAGGATTTGCATGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGCACCC ATACTGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCTACCTTA CAGCGCCATACCAAAATTCATCTGCGCCAGAAAGATGGTGGCGGCGGCTCAGGTGGCGGCGGTAG TGGTGGCGGCGGCTCACAACTAGTCGGTACCGCCGAGCGCCCCTTCCAGTGCCGCATTTGTATGC GCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCACCCATACCGGTGAAAAACCGTTT GCGTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCA CACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGTAATTTTAGCCAGCGTGCGACCC TGCAGCGCCATATTCGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGTGGCCGTAAA TTTGCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATACCGGTTCTGAACGGCCGTTTCA GTGCAGGATTTGCATGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGCACCCATA CTGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCTACCTTACAG CGCCATACCAAAATTCAT
Secuencia de aminoacidos de ZF12xHunt (SEQ ID NO: 12):
FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH LRQKDGGGGSGGGGSGGGGSQLVGTAERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP
(continuation)
FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH
Secuencia de acido nucleico de ZF12xHunt (SEQ ID NO: 13):
TTCCAGTGCCGCATTTGTATGCGCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCAC CCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCGTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCC TGCAGCGCCATACCAAAATTCACACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGT AATTTTAGCCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGC CTGCGATATTTGTGGCCGTAAATTTGCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATA CCGGTTCTGAACGGCCGTTTCAGTGCAGGATTTGCATGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTG CAGCGCCATATTCGCACCCATACTGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATT TGCGCAGCGTGCTACCTTACAGCGCCATACCAAAATTCATCTGCGCCAGAAAGATGGTGGCGGCG GCTCAGGTGGCGGCGGTAGTGGTGGCGGCGGCTCACAACTAGTCGGTACCGCCGAGCGCCCCTTC CAGTGCCGCATTTGTATGCGCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCACCCA TACCGGTGAAAAACCGTTTGCGTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCCTGC AGCGCCATACCAAAATTCACACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGTAAT TTTAGCCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCCTG CGATATTTGTGGCCGTAAATTTGCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATACCG GTTCTGAACGGCCGTTTCAGTGCAGGATTTGCATGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTGCAG CGCCATATTCGCACCCATACTGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGC GCAGCGTGCTACCTTACAGCGCCATACCAAAATTCAT
Secuencia de aminoacidos de ZF18xHunt (SEQ ID NO: 14):
FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH LRQKDGGGSQLVGTAERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH LRQKDGGGSGTAERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH TGSERP FQCRICMRNFSQRATLQRHIRTH TGEKP FACDICGRKFAQRATLQRHTKIH
Secuencia de acido nucleico de ZF18xHunt (SEQ ID NO: 15):
TTCCAGTGCCGCATTTGTATGCGCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCAC CCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCGTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCC TGCAGCGCCATACCAAAATTCACACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGT AATTTTAGCCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGC CTGCGATATTTGTGGCCGTAAATTTGCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATA CCGGTTCTGAACGGCCGTTTCAGTGCAGGATTTGCATGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTG CAGCGCCATATTCGCACCCATACTGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATT TGCGCAGCGTGCTACCTTACAGCGCCATACCAAAATTCATCTGCGCCAGAAAGATGGTGGCGGCT (continuacion)
CACAACTAGTCGGTACCGCCGAGCGCCCCTTCCAGTGCCGCATTTGTATGCGCAACTTTAGCCAG CGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCGTGCGATATTTG CGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCACACCGGATCCGAAC GGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGTAATTTTAGCCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATATT CGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGTGGCCGTAAATTTGCCCAGCGCGC GACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATACCGGTTCTGAACGGCCGTTTCAGTGCAGGATTTGCA TGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGCACCCATACTGGTGAAAAACCG TTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCTACCTTACAGCGCCATACCAAAAT TCATCTGCGCCAGAAAGATGGTGGCGGCtcaggtaccGCCGAGCGCCCCTTCCAGTGCCGCATTT
GTATGCGCAACTTTAGCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGTCATATTCGCACCCATACCGGTGAAAAA CCGTTTGCGTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCGACCCTGCAGCGCCATACCAA AATTCACACCGGATCCGAACGGCCGTTTCAGTGCCGTATTTGCATGCGTAATTTTAGCCAGCGTG CGACCCTGCAGCGCCATATTCGTACCCATACCGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGTGGC CGTAAATTTGCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATACCAAAATTCATACCGGTTCTGAACGGCC GTTTCAGTGCAGGATTTGCATGCGTAATTTTTCCCAGCGCGCGACCCTGCAGCGCCATATTCGCA CCCATACTGGTGAAAAACCGTTTGCCTGCGATATTTGCGGTCGTAAATTTGCGCAGCGTGCTACC TTACAGCGCCATACCAAAATTCAT
Ejemplo 2
Union de peptidos con dedos de zinc a secuencias de ADN objetivo in vitro
Para mostrar que los peptidos con dedos de zinc de la invencion son capaces de unirse a secuencias de repeticion de CAG, los ensayos de retardo en gel in vitro se llevaron a cabo como sigue.
Se construyeron matrices de peptidos con dedos de zinc que conteman 4, 6 o 12 dominios ZFxHunt y se probaron en ensayos de retardo en gel, para determinar su union a sondas CAG bicatenarias (Figura 1B). Estos resultados muestran que los ZFP mas largos produjeron una union mas completa de la sonda. Curiosamente, se observaron complejos unidos distintos en el retardo en gel, lo que indica que los ZFP encontraron un equilibrio termodinamico unico y no se atraparon por los intermediarios cineticos. Podria esperarse que las secuencias de ADN y de dedos de zinc altamente repetitivas formaran eventos de union parcial contiguos, lo que se esperaba que produjera manchas extensas en el retardo en gel; pero este no fue el caso. Notablemente, el ZFP de 12 dedos produjo un retardo secundario inferior, lo que presumiblemente se debe a un subproducto de degradacion de 6 dedos (los dedos de zinc pueden ser inestables en las regiones enlazadoras; Miller y otros (1985) EMBO J. 4(6): 1609-1614). Se cree que los constructos de 12 dedos y subsecuentemente de 18 dedos (ver mas abajo) descritos en la presente son las cadenas de ZFP artificiales funcionales mas largas jamas construidas.
Para probar si los dominios de dedos de zinc ZFxHunt fueron capaces de unirse a ambas cadenas de una sonda de ADN con repeticion de CAG, se ensayo el ZF6xHunt (es decir, el peptido de 6 dedos) mediante retardo en gel, y se mostro que se uma por igual tanto a una sonda repetitiva de CAG, (GCA)x6, como a una sonda CAG-CTG alternada, (GCA-GCT)x3, como se muestra en la Figura 1C. Ademas, cuando se comparo con las secuencias mutadas, ZF6xHunt mostro especificidad por la secuencia (CAG)x7 (ver Figura 1D).
En resumen, se sintetizaron ZFP de 4, 6 y 12 dedos y se demostraron capaces de unir las sondas de ADN poli 5'- GC(A/T) -3 in vitro; y se demostro que los ZFP mas largos se unen de forma mas espedfica y eficiente a sus secuencias objetivo.
Ejemplo 3
Represion de genes indicadores poliQ in vivo
La actividad intracelular del dominio de dedos de zinc ZFxHunt se probo in vivo mediante el uso de vectores indicadores con diferentes numeros de repeticiones de CAG 5' en marco con EGFP (Q0, Q10, Q35 y Q104; donde Q = CAG y el numero indica el numero de repeticiones). Para evaluarsi hubo algun efecto no espedfico causado por las protemas con dedos de zinc, se clono un indicador HcRed en una region diferente del mismo vector, bajo un promotor independiente (Figura 2A).
Las celulas HEK293T se transfectaron conjuntamente de forma transitoria con los vectores indicadores y ZFxHunt indicados, en los que la expresion de los dedos de zinc se dirigio por los promotores de CMV. Se llevaron a cabo tres conjuntos de ensayos: cuantificacion de celulas fluorescentes con EGFP y HcRed mediante el uso de clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS); los niveles de protema EGFP en transferencias de Western; y los niveles de ARNm de EGFP y HcRed en qRT-PCR (Figura 2B-D). Mientras que las repeticiones de CAG mas cortas (Q0, Q10) no se afectaron esencialmente por cualquiera de ZF4, ZF6, ZF11 o ZF18xHunt, los objetivos de repeticion de CAG mas largos (Q35, Q104) se reprimieron fuertemente en los tres ensayos, por ejemplo, hasta una represion de 10 veces de EGFP por FACS, lo que equivale a una reduccion del 90 % (Figura 2B).
Ademas, se encontro que las cadenas de dedos de zinc mas largas produjeron una mayor represion de la expresion del gen objetivo como se determino en qRT-PCR (Figura 2D). Se encontro que la protema con 6 dedos, ZF6xHunt, fue optima en FACs (Figura 2B) y en transferencias de Western (Figura 2C).
Para probar el potencial de una represion aun mas fuerte, el dominio de represion KRAB Kox-1 (Groner y otros PLoS Genet 6(3): el0o0869) se fusiono al extremo C-terminal de las protemas ZFxHunt (Figuras 2E-G; Tabla 2). Como se esperaba, la represion por Kox-1 fue en efecto mas fuerte. Por ejemplo, hubo una reduccion de hasta el 98 % de las celulas verdes por FACS para Q35- y Q104-EGFP, con niveles indetectables de protema EGFP por analisis de transferencia de Western (Figura 2F). Aunque la represion fue generalmente mas fuerte, aun fue proporcional a ZFP y la longitud de CAG: por ejemplo, el constructo EGFP que carece de repeticiones de CAG no se reprimio, y los constructos que tienen repeticiones de CAG mas largas (por ejemplo, Q35) se reprimieron con mas fuerza que los constructos con repeticiones mas cortas (por ejemplo, Q10-EGFP). En este ensayo, se encontro que la protema ZF11xHunt-Kox-1 proporciona el nivel mas fuerte de represion, como se muestra en las Figuras 2E y G. Esto demuestra que, con disenos de enlazador adecuados, las cadenas largas que contienen numeros impares de dedos de zinc tambien pueden funcionar. Ademas, se demuestra que el mecanismo de la represion de HcRed mediado por Kox-1 depende de la presencia de repeticiones largas de c Ag en el plasmido. El nivel no deseado de represion del gen vecino con las protemas Kox-1 puede deberse a los efectos de largo alcance de Kox-1 en la estructura de la cromatina.
Se realizo un ensayo similar para probar la capacidad de los peptidos ZF4, ZF6 y ZF12xHunt para inhibir la expresion del indicador episomal cuando se fusiona con el dominio de nucleasa Fok1, y los resultados se muestran en la Figura 3A-C. Los resultados de estos experimentos fueron similares a los informados para los peptidos con dedos de zinc "desnudos" (es decir, que carecen del dominio Kox-1), aunque la reduccion en la fluorescencia celular medida por FACS fue menos significativa para las protemas de fusion Fok1. Los resultados sugieren que el dominio de la nucleasa Fok1 puede actuar por impedimento esterico en estos ensayos porque no se observo escision del ADN y el nivel de represion fue similar al de los dedos de zinc desnudos (sin ningun dominio de represion, que solo pueden funcionar por mecanismos estericos). Para verificar que estos resultados no fueron puramente espedficos para los ZFP bajo el control del promotor de CMV, tambien se llevaron a cabo pruebas equivalentes con ZFP que se expresaron bajo el control del promotor de fosfoglicerato cinasa (PGK). Como se ilustra en la Figura 4, se obtuvieron esencialmente los mismos resultados para los constructos de peptidos con dedos de zinc desnudos.
Es importante destacarque no se observo represion no espedfica de HcRed con el ZFP desnudo, lo que sugiere que se requiere la union espedfica de las protemas ZFxHunt a repeticiones largas de CAG para la represion.
En resumen, en ensayos de transfeccion transitoria, las protemas ZFxHunt desnudas reprimieron espedficamente la expresion de un gen indicador que contiene 35 o mas repeticiones de CAG. Las protemas ZFxHunt fusionadas con el dominio Kox-1 tuvieron un efecto represivo mas fuerte, y redujeron la expresion de todos los genes indicadores que contienen CAG, y los constructos mas largos tambien tienen un efecto menoren un gen indicador control vecino.
Tabla 2: Secuencia peptidica y del acido nucleico codificante del dominio Kox-1, y secuencia peptidica y del acido nucleico codificante del enlazador dominio efector-dedos de zinc.
Secuencia de aminoacidos del dominio Kox-1 (SEQ ID NO: 16):
SSLSPQHSAVTQGSIIKNKEGMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVML ENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPWLVEREIHQETHPDSETAFEIKSSV
Secuencia de acido nucleico del dominio Kox-1 (SEQ ID NO: 17):
TCTAGTTTGTCTCCTCAGCACTCTGCTGTCACTCAAGGAAGTATCATCAAGAACAAGGAGGGCAT GGATGCTAAGTCACTAACTGCCTGGTCCCGGACACTGGTGACCTTCAAGGATGTATTTGTGGACT TCACCAGGGAGGAGTGGAAGCTGCTGGACACTGCTCAGCAGATCGTGTACAGAAATGTGATGCTG GAGAACTATAAGAACCTGGTTTCCTTGGGTTATCAGCTTACTAAGCCAGATGTGATCCTCCGGTT GGAGAAGGGAGAAGAGCCCTGGCTGGTGGAGAGAGAAATTCACCAAGAGACCCATCCTGATTCAG AGACTGCATTTGAAATCAAAT CAT CAGTT
(continuation)
Secuencia pepridica del dominio efector-dedos de zinc (SEQ ID NO: 18):
LRQKDGGGGSGGGGGSGGGGSQLV
Secuencia de acido nucleico del dominio efector-dedos de zinc (SEQ ID NO: 19):
CTGCGCCAGAAAGATGGTGGCGGCGGCTCAGGTGGCGGCGGTAGTGGTGGCGGCGGCTCACAACT AGTC
Ejemplo 4
Ensayos de union competitiva para la represion de repeticiones de CAG largas
Para su uso terapeutico en humanos, los ZFP deben reprimir preferentemente los alelos CAG mutantes largos y tener menos efecto en los alelos wt cortos (por ejemplo, de 10 a 29 repeticiones; la longitud del htt wt varia en la poblacion humana, pero esta usualmente en ese intervalo; mediana = 18). Porlo tanto, desarrollamos un ensayo de competencia para medir la preferencia de longitud directamente. Las celulas HEK293T se transfectaron conjuntamente con tres plasmidos: los vectores indicadores poliQ-EGFP y poliQ-mCherry indicados, junto con diversos vectores ZFxHunt.
La expresion relativa de los dos indicadores se midio mediante FACS (celulas positivas a EGFP o mCherry), y los resultados se muestran en la Figura 5. En la fila superior, los cuadros de color gris claro representan niveles altos de expresion de la protema GFP, mientras que los cuadros de color gris oscuro representan niveles bajos de expresion de la protema GFP; en la fila central, los cuadros de color gris claro representan niveles altos de expresion de la protema mCherry, mientras que los cuadros de color gris oscuro representan niveles bajos de expresion de la protema mCherry; y en la fila inferior, los cuadros claros (grises) representan niveles mas altos de expresion de la protema GFP en comparacion con la mCherry, los cuadros grises oscuros representan niveles mas altos de expresion de la protema mCherry en comparacion con la GFP. Los resultados demuestran que las repeticiones de CAG mas largas son tomadas como objetivo y reprimidas preferencialmente por todos los peptidos ZfxHunt, por lo que esas celulas se dominan por la expresion de los constructos verdes o rojos mas cortos cuando el numero de secuencias de repetition de CAG de su contraparte opuesta es mayor. Esto se ve directamente mediante la observation de la relation de la expresion de verde con respecto a rojo en la fila inferior, en la que la esquina superior derecha de cada cuadricula es de un color mas claro, lo que indica niveles de expresion mas altos de GFP; y la esquina inferior izquierda de cada cuadricula es de un color mas oscuro, lo que indica niveles de expresion mas altos de mCherry. Todos los constructos, de cadenas de hasta 18 dedos, demuestran la represion activa de los indicadores de repeticiones de CAG mas largas.
El experimento se repitio mediante el uso de los mismos peptidos con dedos de zinc fusionados con el dominio efector (nucleasa) de Fok1, y se observaron los mismos resultados generales (datos no mostrados). Este resultado confirma una vez mas que las protemas con dedos de zinc son capaces de unirse a ambas cadenas de la secuencia de repeticiones de CAG y que las protemas con dedos de zinc de la invention son capaces de dirigirse preferentemente a repeticiones de CAG expandidas.
Es posible que la inhibicion selectiva de secuencias objetivo mas largas se deba al menos en parte a un efecto de action de masa (es decir, las repeticiones de CAG mas largas contienen mas sitios de union potenciales para los peptidos con dedos de zinc). Sin embargo, tambien es posible que en el caso de matrices con dedos de zinc mas largas y secuencias de repeticion de CAG mas cortas, los peptidos puedan competir entre si por el sitio de union, y como consecuencia, las matrices con dedos de zinc mas largas pueden unirse de manera mas transitoria o mas debilmente (por ejemplo, a secuencias de reconocimiento parciales o suboptimas).
Ejemplo 5
Represion cromosomica del htt mutante
A continuacion, probamos los efectos de los peptidos represores con dedos de zinc, ZF6xHunt y ZF11xHunt, en genes htt cromosomicos. Las celulas STHDH (Trettel y otros (2o0o) Hum. Mol. Genet. 9(19): 2799-2809) son una lmea de celulas progenitoras neuronales establecidas a partirde primordio estriatal E14, derivadas de ratones wt (STHdhQ7/HdhQ7), o con inserciones de secuencias genicas, donde el primer exon del gen htt de raton con 7 repeticiones de CAG se ha reemplazado por un exon humano con 111 repeticiones de CAG (STHdhQ111/HdhQ111). Las celulas STHDH que expresan de manera estable ZF6xHunt y ZF11xHunt desnudos o fusionados con Kox-1 se cosecharon 20 dias despues de la infection retroviral, y se analizaron los niveles de htt mediante transferencia de Western y qRT-PCR. El experimento se repitio independientemente dos veces, y se obtuvieron resultados similares en ambas ocasiones; los resultados de un experimento se muestran en la Figura 6.
Como se ilustra en la Figura 6A, ni la protema ni los niveles de ARN del htt wt (Q7) se redujeron con ZF6xHunty ZF11xHunt desnudos o fusionados con Kox-1. Por el contrario, los niveles de protema y de ARN del htt mutante-Q111 se reprimieron con ZF6xHunt-Kox-1 por hasta 2,5 veces (reduccion del 60 %) y 2 veces (reduccion del 50 %), respectivamente. El ZF11xHunt-Kox-1 mostro una represion aun mas fuerte, con una reduccion de casi el 80 % en la expresion del ARNm y una reduccion del 95 % en los niveles de protema. El ZF6xHunt y el ZF11xHunt desnudos tuvieron menos efecto en la represion del gen htt mutante cromosomico, lo que sugiere que el efecto de represion de Kox-1 mas fuerte es beneficioso para la represion cromosomica de htt.
Ejemplo 6
Especificidad de la represion en genomas de tipo salvaje
Los genomas normales contienen varios genes endogenos que se conoce que tienen secuencias de repeticion de CAG. Por lo tanto, los efectos secundarios potenciales de las protemas ZFxHunt expresadas de forma estable en las celulas se analizaron mediante qRT-PCR para los genes wt atrofinal, ataxina-1, ataxina-2, ataxina-3, ataxina-7, subunidad alfa 1A del canal de calcio, y protema de union TATA, todos los cuales contienen secuencias de repeticion de CAG. El numero de secuencias de repeticion de CAG en cada gen de tipo salvaje se muestra en la Tabla 3 mas abajo.
Los resultados de estos ensayos se presentan en las Figuras 6B y 6C. Como se ilustra, no se midieron efectos adversos ni en las celulas de raton STHdh (Figura 6B), ni en las celulas humanas HEK293T (Figura 6C). En estas ultimas, incluso el htt humano, que tiene la mayor cantidad de repeticiones de CAG wt en esta lmea celular en particular (21 repeticiones), tampoco se reprimio.
Dado que la represion por Kox-1 se propaga mediante el establecimiento de heterocromatina (Groner y otros PLoS Genet 6(3): e1000869), tambien probamos los efectos de ZF6xHunt-Kox-1 y ZF11xHunt-Kox-1 en genes htt vecinos en celulas STHdh transducidas establemente, mediante qRT-PCR (Figura 6B). Los dos genes adyacentes, el receptor cinasa 4 acoplado a la protema G, que esta aproximadamente 7 kb aguas arriba; y senalizacion de protema G 12, que esta aproximadamente 188 kb aguas abajo, se analizaron y se encontro que no se afectaron por la presencia de las protemas represoras con dedos de zinc. Esto sugiere que ambos genes vecinos estan fuera del rango de efectos de Kox-1.
Los resultados indican que la represion tanto de ZF6xHunt-Kox-1 como de ZF11xHunt-Kox-1 es espedfica para el htt mutante en el loci cromosomico.
Tabla 3: Numero de repeticiones de CAG por gen y conjuntos de cebadores correspondientes para qRT-PCR. Prefijos de los nombres: h = humano; m = raton. El numero aproximado de repeticiones de CAG para los genes de tipo salvaje se obtuvo a partir de los datos de ARNm de Genbank.
Gen Longitud de la repeticion Cebador Directo Cebador Inverso de CAG
EGFP 0-104 CCTGAAGTTCATCTGCACCA AAGTCGTGCTGCTTCATGTG
HcRed 0 AGATGCTGCGGAAGAAGAAG GGTACCGTCGACTGCAGAA hHPRT N/A CTTTGCTTTCCTTGGTCAGG TATCCAACACTTCGTGGGGT
hATN1 15 GTCTCCCTCCGATCTGGATA CACACTTCCAGGGCTGTAGA hATXN1 12 CCAGCACCGTAGAGAGGATT AGCCCTGTCCAAACACAAA
hATXN2 13 GACGCAGCTGAGCAAGTTAG GAAGGAACGTGGGTTGAACT
hATXN3 7 AGAGCTTCGGAAGAGACGAG ACTCCCAAGTGCTCCTGAAC hATXN7 10 AACTGTGTGGCTCACTCTGG TGGGAAGATGTTACCGTTGA
hCACNA1A 13 GGGAACTACACCCTCCTGAA CGCTGCTTCTTCTTCCTCTT
hTBP 19 ACGCCGAATATAATCCCAAG CTTCACTCTTGGCTCCTGTG
hHtt 21 CAGATGTCAGAATGGTGGCT GCCTTGGAAGATTAGAATCCA
mATN1 3 CACCTGCCTCCACCTCATGGC ATGCTCCTTGGGGGCCCTGG mATXN1 2 TGTGGAGAGAATCGAGGAGA CAGCCCTGTCCAAATACAAA mATXN2 6 ATCCCAATGCAAAGGAGTTC CTGCTGATGACCCACCATAG
mATXN3 5 ACCTCGCACTATTCTTGGCT TGCATCTGTTGGACCTTGATAT mATXN7 5 TGCCCGTGTTCCTCACCGGA GCGCGGAGACAGTGGTTGCT
mCACNA1A 2 CACTGGCAATAGCAAAGGAA TTCTTGAGCGAGTTCACCAC
mTBP 3 ACTTCGTGCAAGAAATGCTG GCTCATAGCTCTTGGCTCCT mGRK4 N/A TCCTGGCTTTGAGGAGCCGA CCACAGCACAGCTCTGCAGCAT
mRgs12 N/A GGGGGCTCAAGCAGGCATGG GGGAGCCAGCCTCCGAGTCA
mHtt 7 o 111 CAGATGTCAGAATGGTGGCT GCCTTGGAAGATTAGAATCCA
mHPRT N/A GGTTAAGCAGTACAGCCCCA AGAGGTCCTTTTCACCAGCA M13 N/A GTAAAACGACGGCCAG CAGGAAACAGCTATGAC
Ejemplo 7
Ensayo de toxicidad celular
Dado que creemos que una terapia represora con ZFP requerina una baja toxicidad, llevamos a cabo un ensayo de viabilidad celular con marcaje por colorante para probar la toxicidad (no espedfica) de los ZFP.
Las celulas HEK-293T se transfectaron con 400 ng de los constructos de vectores indicados mediante el uso de Lipofectamina 2000 y se cosecharon 48 horas despues de la transfeccion. Se usaron como control celulas no transfectadas (negativo) o solo con Lipofectamina 2000. La citotoxicidad se analizo mediante el uso del ensayo de toxicidad celular Guava (PCA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se presentan como el porcentaje de celulas muertas, en apoptosis intermedia y viables (ver Figura 7), en la que las barras expresan los resultados de al menos 3 experimentos independientes.
Estos datos muestran que no se produjeron efectos de toxicidad significativos estadfsticamente en celulas que expresan los peptidos con dedos de zinc de la invencion, en comparacion con los experimentos control. Ademas, ZF6xHunt-Kox-1 y zFl1xHunt-Kox-1 se toleraron durante mas de 20 dfas despues de la transfeccion retroviral estable, sin ningun efecto celular adverso aparente. En general, las propiedades represoras de los peptidos con dedos de zinc de la invencion y el potencial de expresion estable, particularmente de las protemas ZF6xHunt-Kox-1 y ZF11xHunt-Kox-1, sugieren que los peptidos de la invencion tienen un potencial significativo para aplicaciones terapeuticas genicas.
Ejemplo 8
Represion del gen Htt mutante en un modelo de raton para la enfermedad de Huntington
Como se describio anteriormente, los inventores han disenado cadenas de protemas con dedos de zinc (ZFP) largas para reprimir preferentemente genes objetivo con 35 o mas repeticiones de CAG. Ademas, se ha demostrado que la expresion estable de las protemas con dedos de zinc de la invencion en una lmea celular HD modelo reduce la expresion cromosomica del gen htt mutante (con 111 repeticiones de CAG), tanto a nivel de protema como de ARNm. Mientras tanto, el gen htt de tipo salvaje mas corto (con 7 repeticiones de CAG en esta lmea celular de raton en particular) no se vio afectado, al igual que otros genes de repeticion de CAG genomicos detipo salvaje.
Los ratones R6/2 son un modelo animal bien establecido para el estudio de la HD y agentes terapeuticos potenciales. Estos ratones expresan el exon 1 del gen HD humano con aproximadamente 150 repeticiones de c A g . Los ratones R6/2 tienen un inicio temprano de los smtomas de la HD y una rapida progresion de la enfermedad, y muestran una esperanza de vida de 12 a 17 semanas (Gil y Rego (2009) Brain Res. Rev. 59: 410-431).
En este estudio, las protemas con dedos de zinc de la invencion se ensayan para determinar su capacidad para reducir la expresion del htt mutante en un modelo de raton transgenico de HD, de acuerdo con la lmea de tiempo que se muestra mas abajo.
Primero, las protemas represoras ZF6xHunt-Kox-1, ZF11xHunt-Kox-1 y ZF12xHunt-Kox-1 se insertan en vectores de virus adenoasociados (AAV) (subtipo AAV2/1; Molecular Therapy (2004) 10: 302-317). En experimentos paralelos, los vectores dedos de zinc-AAV se inyectan en el cuerpo estriado de ratones R6/2 para mediar la expresion de las protemas de fusion ZFP-Kox-1 en las celulas del cuerpo estriado. La capacidad de las protemas de fusion ZFP-Kox-1 expresadas en las celulas del cuerpo estriado para reducir los smtomas de la HD en ratones R6/2 se evalua durante un penodo de al menos 20 semanas mediante la evaluacion periodica del comportamiento y los smtomas de los ratones R6/2 infectados con dedos dezinc-AAV, asf como tambien los niveles de expresion de la protema htt mutante, en comparacion con los ratones R6/2 controles infectados con el vector control AAV-GFP.
Lmea de tiempo:
Semana 0: - Raton R6/2 recien nacido.
Semana 4: - Inyeccion estereotaxica en el cuerpo estriado de ratones R6/2 con AAV - por ejemplo, ZF6xHunt-Kox-1-ires-GFP y control AAV-GFP.
Semana 4 a 20: -Prueba de comportamiento semanal: prueba de barra rotatoria acelerada, agarre de miembros posteriores y analisis de la longitud de zancada.
- Cada dos semanas: sacrificio de ratones para qRT-PCR para verificarla reduccion de la expresion de fragmentos HD mutantes e inmunohistoqu^mica para mostrar una reduccion en los agregados de poliQ y la expresion de otros marcadores neuronales tales como DARPP-32 y NeuN.
Se ha demostrado que las protemas de fusion ZFP-Kox1 de la invencion reducen la expresion de la protema htt mutante, mejoran las anomalfas motoras y neuropatologicas y prolongan la longevidad (es decir, la edad de los ratones que mueren naturalmente antes del sacrificio), de ratones R6/2 en comparacion con los controles negativos.
Discusion
En estos ejemplos, los inventores han descrito el diseno de peptidos con dedos de zinc capaces de reconocer y unirse a ambas cadenas de ADN de un tramo de repeticiones de CAG, mediante el reconocimiento tanto de tripletes de poli-GCA como de poli-GCT; y demostrado que dichas protemas son capaces de inducir la represion de la transcripcion de genes objetivo, tanto in vitro como in vivo.
Recientemente, Mittelman y otros (2009), Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 106(24): 9607-9612 emplearon un enfoque de ZFP diferente para explorar la inestabilidad de la region CAG, despues de inducir roturas bicatenarias con fusiones de nucleasa Fok-I de 3 dedos emparejadas. Describieron dos protemas ZFP, zfGCT (secuencia de reconocimiento alfa-helicoidal: QSSDLTR [SEQ ID No : 96]) y zfGCA (QSGd Lt R [SEQ ID NO: 97]), disenadas para reconocer GCT y GCA, respectivamente. Se observaron eventos de escision que inducen el acortamiento de la region CAG en hasta 1 en 104 colonias celulares.
Los inventores tambien probaron originalmente los peptidos con dedos de zinc de la invencion, ZFxHunt (con secuencia de reconocimiento, QRATLQR [SEQ ID NO: 1]) como fusiones a FokI y encontraron que redudan la transcripcion de poli-CAG-EGFP de una manera similar al ZFP desnudo (Figura 3). Este efecto es mucho mas fuerte que el efecto de nucleasa ya que la GFP se reprime en hasta aproximadamente el 85 % de las celulas, segun lo evaluado por FACS de celulas transfectadas de forma transitoria.
Ademas, se cree que el efecto esta en el nivel de ARN ya que tanto los niveles de ARN como de protema se redujeron (Figura 3). Los plasmidos indicadores se extrajeron de las celulas transfectadas y se secuenciaron para buscar cambios de marco no homologos de union en el extremo que pudieran explicar la represion de EGFP observada (es decir, hasta aproximadamente el 85 % de reduccion). Sin embargo, los inventores no pudieron detectar ningun cambio de marco no homologo de union en el extremo en los 30 plasmidos que se extrajeron y secuenciaron. Esto sugiere que los efectos de represion transcripcional de los peptidos con dedos de zinc simplemente mediante la union a sus secuencias objetivo son mucho mas fuertes que cualquier posible efecto de nucleasa; e indica que el mecanismo de accion de los peptidos ZFxHunt de la invencion es diferente completamente al mecanismo informado por Mittelman y otros.
Los inventores han demostrado ademas, que los peptidos con dedos de zinc desnudos (es decir, que carecen de dominios efectores adicionales) pueden ser inhibidores altamente eficientes de la expresion del gen objetivo (la expresion de poliQ-EGFP se redujo hasta en un 90 %), particularmente, cuando el numero de repeticiones de CAG es igual o superior a 35. Este es un hallazgo significativo, ya que el numero de repeticiones de CAG en genes de tipo salvaje en el genoma humano (lo que incluye el gen htt), es menor de 35. Sin estar limitado por la teona, es probable que el mecanismo de represion en estos casos se deba al impedimento esterico de la progresion del complejo a Rn polimerasa, segun lo informado por Choo y otros para un ZFP sintetico contra el oncogen Bcr-Abl (Choo y otros (1994) Nature 372(6507): 642-645).
Se encontro que la fusion del dominio de represion de Kox-1 con los peptidos con dedos de zinc de la invencion reduce adicionalmente la expresion de los genes objetivo. En estos experimentos, se demostro que la represion requena de la union a las repeticiones de CAG, ya que los vectores control que caredan de repeticiones de CAG no se afectaron. Sin embargo, en algunos casos tambien hubo un efecto represivo sobre un control de un gen informador vecino, HcRed, especialmente para los objetivos mas largos. Sin embargo, es probable que esta falta de especificidad sea un efecto del dominio represor espedfico mas que del peptido con dedos de zinc: se conoce que Kox-1 recluta al represor conjunto KAP-1 e induce una represion de largo alcance a traves de la propagacion de la heterocromatina (Groner y otros PLoS Genet. 6(3): e1000869).
Aunque se ha demostrado que la reduccion parcial de la protema htt de tipo salvaje mas corta se tolera hasta 4 meses en modelos animales (Boudreau y otros (2009) Mol. Ther. 17(6): 1053-1063), se considera generalmente que una terapia segura y eficaz para la HD debe dirigirse preferentemente al alelo htt mutante. Mediante el uso de un ensayo de competencia, se ha demostrado que los peptidos con dedos de zinc de la invencion reprimen preferentemente la expresion de genes informadores que contienen mas de 35 repeticiones de CAG, lo que sugiere que constituyen una promesa significativa de una estrategia terapeutica para reducir los niveles de la protema huntingtina mutante en pacientes heterocigotos.
Vale la pena senalar que existen algunas diferencias relevantes entre la represion cromosomica y del plasmido, que reflejan presumiblemente el numero de copias objetivo y la accesibilidad dentro de la cromatina. Episomalmente, se ha demostrado que los peptidos con 6 dedos solos son represores eficaces de los genes objetivo. Sin embargo, la represion de Kox-1 parece ser demasiado fuerte para una discriminacion de longitud optima. A la inversa, en los loci endogenos, las protemas de fusion Kox-1 parecen ser mejores para la represion del mutante, mientras que evitan el alelo de tipo salvaje. En este caso, los constructos Kox-1 de 6 y 11 dedos son fuertes represores tanto de la protema objetivo como de la expresion de ARN. Despues de 20 dfas de expresion estable de los peptidos con dedos de zinc, se encontro que la protema de 11 dedos exhibfa la represion mas fuerte del alelo mutante objetivo. De hecho, cuando se fusionaron con el dominio de represion Kox-I, los peptidos con dedos de zinc mas activos de la invencion pudieron reducir dramaticamente los niveles de la protema mutante endogena en un 95 %, y los niveles del ARNm mutante en aproximadamente el 80 %, con un efecto insignificante en la expresion del alelo de tipo salvaje, o en cualesquiera otros genes que contienen un numero de repeticiones de CAG de tipo salvaje. La expresion terapeutica sostenida es, por lo tanto, factible potencialmente.
La terapia genica es una estrategia terapeutica atractiva para diversas enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, se han usado vectores lentivirales para mediar en la expresion generalizada y a largo plazo de transgenes en celulas que no se dividen, tales como las neuronas maduras (Dreyer, Methods Mol. Biol. 614: 3-35). Un vector rAAV tambien se uso por Rodriguez-Lebron y otros (2005) Mol. Ther. 12(4): 618-633, para suministrar ARNhp anti-Htt mutante en modelo de ratones HD; lo que reduce de esta manera los niveles de mHtt en el cuerpo estriado y retrasan la progresion del fenotipo similar a la HD. Ademas, como el ARNi (van Bilsen y otros (2008) Hum. Gene Ther. 19(7): 710-719; Zhang y otros (2009) J. Neurochem. 108(1): 82-90; Pfistery otros(2009) Curr. Biol. 19(9): 774-778), y el LNA(Huy otros(2009) Nat. Biotechnol.
27(5): 478-484; y Hu y otros (2009) Ann. NY Acad. Sci. 1175: 24-31) se han mostrado recientemente prometedores para el tratamiento de la HD, es probable que los vehmulos de suministro adecuados se optimicen en los proximos anos, y el enfoque de ZFP complementario descrito en la presente se beneficiara probablemente de dichos avances.
En consecuencia, se ha desarrollado y usado una lmea celular modelo derivada de celulas del cuerpo estriado de un modelo de raton de HD con insercion de secuencia genica (Trettel y otros (2000) Hum. Mol. Genet. 9(19): 2799-2809) para demostrar los efectos de los peptidos con dedos de zinc de la invencion en condiciones terapeuticas apropiadas (es decir, alelos de una sola copia en loci cromosomicos).
En conclusion, dado que reducir los niveles de protema de huntingtina mutante mejora las anomalfas motoras y neuropatologicas, y prolonga ademas la longevidad en los modelos de ratones con HD (Rodriguez-Lebron y otros (2005) Mol. Ther. 12(4): 618-633; Harper y otros (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 102(16): 5820-5825; Wang y otros (2005) Neurosci. Res. 53(3): 241-249; y Harper (2009) Arch. Neurol. 66(8): 933-938), las protemas con dedos de zinc desarrolladas aqrn son muy prometedoras para el tratamiento de enfermedades basadas en poliglutamina; asf como tambien otros trastornos geneticos asociados con secuencias repetidas, por ejemplo, repeticiones de trinucleotidos que tienen al menos 10 repeticiones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un peptido con dedos de zinc que comprende la secuencia:
N'- [(Formula 2) - X6]no - {[(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - Xe]ni - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - XL]}n2 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2) - X6]n3 - [(Formula 2) - X5 - (Formula 2)] - [X6 - (Formula 2) -]n4 -C',
en donde nO es 0 o 1, n1 es de 1 a 4, n2 es 1 o 2, n3 es de 1 a 4, n4 es 0 o 1, X5 es una secuencia enlazadora de 5 aminoacidos, X6 es una secuencia enlazadora de 6 o 7 aminoacidos, y Xl es una secuencia enlazadora de al menos 8 aminoacidos, y la Formula 2 es un dominio de dedos de zinc de la secuencia - X0-2 C X1-5 C X2-7 X '1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3-6 h/c -, en donde X es cualquier aminoacido, los numeros en el subrndice indican los posibles numeros de residuos representados porXen esa posicion, y el numero en supermdice indica la posicion del aminoacido en la secuencia de reconocimiento del dominio de dedos de zinc;
en donde al menos una secuencia X’1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 es la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1).
2. El peptido con dedos de zinc de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende la secuencia:
N'- [(Formula 6) - L3]no- {[(Formula 6) - L2 - (Formula 6) - L3]n1 - [(Formula 6) - L2 - (Formula 6) - XL]}n2 - [(Formula 6) - L2 - (Formula 6) - L3]n3 - [(Formula 6) - L2 - (Formula 6)] - [L3 - (Formula 6) -]n4-C',
en donde nO es 0 o 1, n1 es 1 o 2, n2 es 1 o 2, n3 es 2, n4 es 0, Xl es de 11 a 40 aminoacidos, L2 tiene la secuencia -TGe/qk/rP-, L3 tiene la secuencia -TGg/se/qk/rP-, y la Formula 6 tiene la secuencia - X2 C X2 C X5 X‘1X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3 H -, en donde X es cualquier aminoacido.
3. Un peptido con dedos de zinc que comprende al menos 4 dominios de dedos de zinc de Formula 2:
X0-2 C X1-5 C X2-7 X_1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3.6 h/c, en donde X es cualquier aminoacido, los numeros en el subrndice indican los posibles numeros de residuos representados por X en esa posicion, y el numero en supermdice indica la posicion del aminoacido en la secuencia de reconocimiento del dominio de dedos de zinc, y al menos una secuencia X_1 X+1 X+2 X+3X+4 X+5 X+6 es la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1).
4. El peptido con dedos de zinc de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde al menos cuatro dominios de dedos de zinc adyacentes comprenden una secuencia X_1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 que tiene la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1).
5. El peptido con dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que contiene 4, 6, 11, 12 o 18 dominios de dedos de zinc de Formula 6:
X2 C X2 C X5 X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 H X3 H, en donde cada secuencia X‘1X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 X+6 es la secuencia de aminoacidos QRATLQR (SEQ ID NO: 1).
6. El peptido con dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 14.
7. Una biblioteca de peptidos virgen que comprende una pluralidad de peptidos con dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al menos un dominio de dedos de zinc se diversifica en una o mas de las posiciones X-1 X+1 X+2 X+3 X+4 X+5 y X+6.
8. Una protema de fusion que comprende el peptido con dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y al menos un dominio efector, seleccionado entre dominios represores de la transcripcion, dominios activadores de la transcripcion, dominios aisladores transcripcionales, dominios de remodelacion, condensacion o descondensacion de la cromatina, dominios de escision de acido nucleico o protema, dominios de dimerizacion, dominios enzimaticos, secuencias o dominios de senalizacion/direccionamiento.
9. Un polinucleotido que codifica el polipeptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. El peptido con dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o el polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 9 para su uso en la modulacion de la expresion de un gen objetivo en una celula, y en donde el uso es en medicina o para propositos no medicos.
11. El uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde el gen objetivo se asocia con o comprende al menos 10 repeticiones contiguas de trinucleotidos; preferentemente, en donde las repeticiones de trinucleotidos son repeticiones de CAG.
12. El uso de acuerdo con la reivindicacion 10 o la reivindicacion 11, en donde el peptido con dedos de zinc reprime la expresion del gen objetivo y el uso es para tratar una enfermedad o afeccion de poliglutamina; preferentemente en donde la enfermedad o afeccion se selecciona de enfermedad de Huntington (HD), ataxias espinocerebelosas, atrofia dentatorubropalidoluisiana y epilepsia mioclonica juvenil.
13. Una composicion farmaceutica que comprende el peptido con dedos de zinc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o el polinucleotido de acuerdo con la reivindicacion 9.
14. Un metodo para crear un peptido con poli-dedos de zinc que comprende al menos 8 dominios de dedos de zinc de Formula 1:
Xq.2 C X1.5 C X9-14 H X3.6 H/C,
en donde X es cualquier aminoacido y los numeros en el subrndice indican el posible numero de residuos representados porXen esa posicion,
el metodo comprende expresar una secuencia de acido nucleico obtenible mediante:
(a) proporcionar al menos 4 moleculas de acido nucleico, cada una de las cuales codifica un par de dominios de dedos de zinc de Formula 1, los dominios de dedos de zinc adyacentes de cada par se separan por una secuencia enlazadora de 5 aminoacidos;
(b) unir 2 o 3 moleculas de acido nucleico de la etapa (a) para crear al menos 2 moleculas de acido nucleico, cada una de las cuales codifica una matriz de 4 o 6 dominios de dedos de zinc, los pares adyacentes de dominios de dedos de zinc de la etapa (a) se separan por una secuencia enlazadora de 6 o 7 aminoacidos; y
(c) unir las al menos 2 moleculas de acido nucleico de la etapa (b) para crear una secuencia de acido nucleico que codifica un peptido con poli-dedos de zinc, las matrices adyacentes de los dominios de dedos de zinc de la etapa (b) se separan por una secuencia enlazadora de al menos 8 aminoacidos; y opcionalmente
(d) unir al extremo 5' o 3' de la secuencia de acido nucleico de la etapa (c), una molecula de acido nucleico que codifica un unico dominio de dedos de zinc y una secuencia enlazadora de 5 a 7 aminoacidos, para crear opcionalmente una secuencia de acido nucleico que codifica un peptido con poli-dedos de zinc que tiene un numero impar de dominios de dedos de zinc; y
en donde la secuencia de acido nucleico codifica un peptido con poli-dedos de zinc que tiene la secuencia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
15. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 14, en donde el enlazador de 5 aminoacidos de la etapa (a) se selecciona de un enlazador de la secuencia -TGe/qk/rP-, el enlazador de 6 aminoacidos de la etapa (b) y (d) se selecciona de un enlazador de la secuencia -TGg/se/qk/rP-, y el al menos un enlazador de 8 aminoacidos de la etapa (c) tiene de 8 a 50 aminoacidos.
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