ES2713979T3

ES2713979T3 - Formulación líquida de conjugado de hormona de crecimiento humana altamente concentrada de acción prolongada

Info

Publication number: ES2713979T3
Application number: ES13769126T
Authority: ES
Inventors: Hyung Kyu Lim; Hyun Uk Kim; Sung Hee Hong; Sung Min Bae; Se Chang Kwon
Original assignee: Hanmi Science Co Ltd
Current assignee: Hanmi Science Co Ltd
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2013-03-29
Publication date: 2019-05-24
Anticipated expiration: 2033-03-29
Also published as: JP6386441B2; US10064951B2; JP2015514704A; EP2830649B1; US20180344866A1; EP2830649A1; EP2830649A4; US20150118255A1; JP2018115166A; TWI617324B; WO2013147559A1; AR090583A1; KR20130111462A; TW201343198A; DK2830649T3

Abstract

Una formulación líquida de un conjugado de hormona de crecimiento humana (hGH) de acción prolongada altamente concentrado, que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz del conjugado de hormona de crecimiento humana de acción prolongada en la que la hormona de crecimiento humana (hGH) está unida a una región Fc de inmunoglobulina, un conservante, y un estabilizante libre de albúmina, comprendiendo dicho estabilizante un tampón, un tensioactivo no iónico, un alcohol azúcar y cloruro sódico como agente isotónico.

Description

DESCRIPCION

Formulacion ftquida de conjugado de hormona de crecimiento humana altamente concentrada de accion prolongada Campo tecnico

La presente invencion se refiere a una formulacion ftquida de un conjugado de hormona de crecimiento humana altamente concentrada de accion prolongada, que comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz del conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada en el que la hormona de crecimiento humana (hGH) se une a una region Fc de inmunoglobulina, un conservante, y un estabilizante libre de albumina, comprendiendo dicho estabilizante un tampon, un tensioactivo no ionico, un alcohol azucar, y cloruro sodico como agente isotonico, y un procedimiento para preparar el mismo.

Tecnica antecedente

La hormona de crecimiento humana (a la que se hace referencia de aqm en adelante como 'hGH') es una hormona polipeptfdica que consiste en 191 aminoacidos que tiene un peso molecular de aproximadamente 22.000 Da que se secreta en la glandula pituitaria anterior. Se ha utilizado una hormona de crecimiento human para el tratamiento principalmente del enanismo pituitario pediatrico. Anteriormente, se utilizaba la hGH extrafda de la glandula pituitaria human, pero su suministro es limitado. Por lo tanto, solo se podfa tratar un numero de personas muy limitado. Tambien, despues de informarse de la incidencia del trastorno neurologico degenerativo de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob en algunos de los pacientes que recibfan la hGH recolectada de la glandula pituitaria, el uso de hGH extrafda de glandulas pituitarias se prohibio. Actualmente, con el desarrollo de tecnicas de modificacion genetica, es posible la produccion de hGH en E. coli y levaduras. Por lo tanto, las medicinas de hGH biosinteticas producidas por modificacion genetica estan disponibles en el mercado superando los ensayos toxicologicos y cftnicos y siendo aprobadas en varios pafses desde 1985.

En general, los polipeptidos como la hGH tienen baja estabilidad y por lo tanto se desnaturaliza facilmente. Tambien se degrada facilmente por las proteasas del suero y se eliminan por el rinon o el tftgado. Por lo tanto, los farmacos proteicos que contienen polipeptidos como ingrediente farmaceutico tienen que administrarse a los pacientes frecuentemente con el fin de mantener su concentracion y tftulo en la sangre. Sin embargo, como los farmacos proteicos a menudo se administran en forma de inyeccion, la inyeccion frecuente de farmacos proteicos para mantener la concentracion sangumea optima de los polipeptidos activos produce mucho dolor a los pacientes. Para resolver estos problemas se han hecho muchos intentos para aumentar la estabilidad del farmaco proteico en la sangre y mantener su concentracion sangumea a un alto nivel durante un largo periodo de tiempo, con el fin de maximizar los efectos terapeuticos de la medicina. Para el desarrollo de una formulacion de accion prolongada del farmaco proteico, se tiene que estar seguro de que la formulacion aumenta la estabilidad del farmaco proteica a la vez que se mantienen un tftulo alto del propio farmaco, sin producir ninguna respuesta inmunitaria en los pacientes. Como un procedimiento para estabilizar las protemas y evitar el contacto con las proteasas y la perdida renal, se ha anadido qmmicamente un poftmero altamente soluble tal como el polietilenglicol (PEG) a la superficie de los farmacos proteicos. El PEG se une a un sitio espedfico de una protema diana o a varios sitios no espedficamente y aumenta la solubilidad de la protema, estabilizando de esta manera la protema. Tambien, el PEG es eficaz en la prevencion de la hidrolisis de la protema y no produce ningun efecto secundario particular. Aunque la union con PEG puede aumentar la estabilidad de la protema, el tftulo de protema fisiologicamente activo se vuelve significativamente bajo, y segun aumenta el peso molecular del PEG, se reduce su reactividad con la protema, reduciendo de esta manera el rendimiento.

Como un procedimiento alternativo para aumentar la estabilidad in vivo de las protemas fisiologicamente activas, se ha desarrollado un procedimiento de produccion de protemas de fusion conectando un gen que codifica una protema con alta estabilidad en la sangre y un gen de la protema fisiologicamente activa mediante recombinacion genetica y cultivo de las celulas animales que se transforman con los genes recombinantes. Por ejemplo, se puede unir albumina o un fragmento de la misma, que se sabe que es altamente eficaz en el aumento de la estabilidad proteica a una protema fisiologicamente activa dirigida mediante recombinacion genetica para producir una protema de fusion (Publicaciones de Patente Internacional N.° WO 93/15199 y WO 93/15200, Publicacion de Patente Europea EP 413.622).

Ademas, como un procedimiento para la utilizacion de inmunoglobulinas, la Patente de EE. UU. N.° 5.045.312 desvela que cuando la hGH se conjuga con seroalbumina bovina (BSA) o una inmunoglobulina murina utilizando un agente de entrecruzamiento, la actividad del conjugado de hGH aumenta en comparacion con la hormona de crecimiento sin modificar. Sin embargo, la patente anterior solo desvela compuesto de bajo peso molecular, tales como carbodiimida o glutaraldetftdo como agente de entrecruzamiento. Cuando se utilizan estos agentes de entrecruzamiento de bajo peso molecular, es diffcil obtener composiciones homogeneas debido a la conjugacion no espedfica, y pueden ser toxicos in vivo. Ademas, la patente a la que se hace referencia anteriormente simplemente desvela el aumento de actividad de hormona de crecimiento por acoplamiento qmmico, pero no describe el efecto del acoplamiento qmmico en la actividad de otros tipos de farmacos polipeptidos, sin entender la correlacion con la estabilidad de las protemas tal como el aumento de durabilidad y la semivida serica.

Recientemente, la Patente Coreana N.° 10-0567902 (Physiologically Active Polypeptide Conjugate Having Improved In vivo Durability) y la Patente Coreana N.° 10-0725315 (Protein Complex Using An Immunoglobulin Fragment And Method For The Preparation Thereof) desvelan conjugados preparados mediante la union de polipeptidos fisiologicamente activos con una region Fc de inmunoglobulina y un polfmero no peptfdico, como formulaciones de accion prolongada de farmacos proteicos que permite tanto una minima reduccion de la actividad proteica como un aumento de la estabilidad proteica. De acuerdo con estos procedimientos, se puede utilizar la hGH como un polipeptido fisiologicamente activo para preparar un conjugado de hGH de accion prolongada. Para la comercializacion del farmaco que contiene conjugados de hGH de accion prolongada, es esenciar evitar los cambios fisicoqmmicos tales como desnaturalizacion, agregacion, adsorcion, o hidrolisis debido a la degradacion inducida por la luz, calor o impurezas en los aditivos durante el procedimiento de almacenamiento y transporte, mientras que se mantenga el efecto in vivo de la hGH. En comparacion con una hGH polipeptfdica, un conjugado de hGH de accion prolongada tiene un tamano mayor y un aumento de peso molecular, y por lo tanto existe una dificultad en la estabilizacion el conjugado.

En la industria farmaceutica, la estabilidad proteica baja en un lfquido ha sido una imitacion. Por lo tanto, las protemas se tienen que secar por congelacion para resolver el problema de la estabilidad. Aunque una formulacion proteica secada por congelacion tiene la ventaja de mantener la estabilidad durante un largo periodo de tiempo, cuando se inyecta tiene que reformularse con auxiliares de disolucion. Tambien, cuando se reformula con el auxiliar de disolucion en el secado por congelacion, existfan desventajas por perdida de actividad a menudo debido a la formacion de polfmeros, etc., y el coste del tiempo necesario para el procedimiento de secado por congelacion tambien era alto. Con el fin de superar estas limitaciones, las Publicaciones de Patente Internacional N.° WO 93/019776 y N.° WO 94/003198 desvelan una formulacion lfquida estable de hGH. Para el desarrollo de formulaciones de hGH lfquidas estables, es importante controlar la degradacion de la hGH tal como la regulacion de la tasa de produccion de productos de degradacion por desamidacion, formacion de polfmeros y proceso de oxidacion. La temperatura, pH y aditivos de la formulacion lfquida afectan la tasa de produccion del producto de degradacion, pero la formulacion que pueda estabilizar todos los tipos de protemas permitiendo su aplicacion clmica no se conoce todavfa. Ademas, la formulacion lfquida que tiene un efecto estabilizante para la protema espedfica a menudo no es aplicable para la estabilizacion de otras protemas. A este respecto, las referencias anteriores desvelan que se necesita primero llevar a cabo la seleccion y combinacion de factores y aditivos que pueden minimizar la tasa de produccion de un producto de degradacion de la protema de manera anticipada para maximizar la estabilidad de la hGH proteica en forma lfquida.

Ademas, las diferentes protemas se pueden inactivar gradualmente en diferentes proporciones y condiciones durante el almacenamiento debido a la diferencia de sus propiedades qmmicas. Es decir, los efectos de un estabilizante para aumentar el periodo de almacenamiento no son los mismos para diferentes protemas. Por esta razon. Los estabilizantes utilizados para la estabilidad en el almacenamiento tienen distintas relaciones, concentraciones y tipos adecuados de acuerdo con las propiedades fisicoqmmicas de una protema diana. Sin embargo, cuando se utilizan diferentes estabilizantes simultaneamente, puede producir resultados contrarios debido a la interaccion competitiva entre ellos y efectos secundarios. Ademas, como las propiedades y concentracion de la protema almacenada pueden cambiar durante su almacenamiento, los estabilizantes pueden presentar efectos diferentes a los esperados. Por lo tanto, la estabilizacion de una protema en solucion conlleva muchos esfuerzos y precauciones.

Particularmente, como los conjugados de hGH de accion prolongada con un aumento de la durabilidad y estabilidad in vivo se preparan uniendo una hGH peptfdica fisiologicamente activa con regiones Fc de inmunoglobulina y tienen un peso molecular y volumen significativamente diferentes de otras hGH tfpicas, necesitan una composicion especial para la estabilizacion de la protema. Tambien cada uno de entre la hGH peptfdica fisiologicamente activa y la region Fc de inmunoglobulina tiene diferentes propiedades fisicoqmmicas, ambas necesitan estabilizarse simultaneamente. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, los diferentes peptidos o protemas se pueden inactivar gradualmente en diferentes proporciones y condiciones durante el almacenamiento debido a la diferencia en sus propiedades fisicoqmmicas. Tambien, cuando se utilizan simultaneamente estabilizantes adecuado para cada peptido o protema, pueden causar resultados contrarios debido a la interaccion competitiva entre ellos y los efectos secundarios. Ademas, como las propiedades y concentracion de la protema almacenada pueden cambiar durante su almacenamiento, los estabilizantes pueden presentar diferentes efectos de los esperados. Por lo tanto, para un conjugado de hGH de accion prolongada, es diffcil encontrar una formulacion estabilizante que pueda estabilizar ambos, la hGH peptfdica fisiologicamente activa y la region Fc de inmunoglobulina simultaneamente.

El documento WO 2012/068779 A2 describe una formulacion lfquida libre de albumina de un conjugado de hormona de crecimiento humana (hGH) de accion prolongada que comprende la hormona de crecimiento humana unida a una region Fc de inmunoglobulina.

Divulgacion de la invencion

Problema tecnico

En un esfuerzo para encontrar una composicion para aumentar la estabilidad de una formulacion lfquida de un conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada altamente concentrado de manera que se pueda almacenar durante un largo periodo de tiempo sin preocuparse por la contaminacion vmca y para reducir la precipitacion proteica, los presentes inventores han descubierto que cuando se utiliza un estabilizante comprende un tampon, una alcohol azucar, un tensioactivo no ionico, y cloruro sodico como agente isotonico, aumentaba la estabilidad de un conjugado de hGH de accion prolongada concentrado, y por lo tanto se podfa preparar una formulacion Kquida estable y barata. Se confirmo que, con la adicion de un conservante, el conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado podfa almacenarse establemente, completando de esta manera la presente invencion.

Solucion al problema

La presente invencion proporciona una formulacion lfquida de un conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada altamente concentrado, que comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz del conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada en la que la hormona de crecimiento humana hGH esta unida a una region Fc de inmunoglobulina, un conservante, y un estabilizante libre de albumina, comprendiendo dicho estabilizante un tampon, un tensioactivo no ionico, una alcohol azucar y cloruro sodico como agente isotonico. Tambien se proporciona un procedimiento para la preparacion de una formulacion lfquida de la invencion, que comprende la mezcla de un conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada con un conservante y un estabilizante, comprendiendo dicho estabilizante un tampon, un alcohol azucar, un surfactante no ionico y cloruro sodico como agente isotonico.

Efectos ventajosos de la invencion

La formulacion lfquida del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado de la presente invencion comprende un estabilizante que contiene un tampon, un alcohol azucar, un tensioactivo no ionico, y cloruro sodico como agente isotonico, pero no tiene una seroalbumina humana y cualquier factor potencialmente perjudicial para el cuerpo. Por lo tanto, no existe el problema de contaminacion vmca. Ademas, la presente formulacion permite una alta estabilidad en el conjugado de hGH de accion prolongada que se prepara uniendo la hGH polipeptfdica y la region Fc de inmunoglobulina, teniendo de esta manera un mayor peso molecular en comparacion con la de tipo silvestre y aumentando la durabilidad in vivo. Tambien, la formulacion lfquida es estable incluso cuando comprende adicionalmente un conservante y, por lo tanto, se puede utilizar como una formulacion para su administracion multiple.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 demuestra los resultados de un ensayo de estabilidad acelerado de una formulacion lfquida de conjugado de hGH de accion prolongada que comprende 20 mM de tampon de acetato sodico (pH 5,6), 150 mM de cloruro sodico, un 5 % de manitol y un 0,005 % de polisorbato 80 durante el almacenamiento del mismo, de acuerdo con la concentracion de conjugado de hGH de accion prolongada, que presenta el cromatograma de IE-HPLC para analizar la estabilidad de la muestra. Se demuestra que las formulaciones lfquidas de conjugado de hGH de accion prolongada a una concentracion baja y una concentracion alta mantienen un nivel de estabilidad similar.

La Figura 2 demuestra los resultados de un ensayo de estabilidad acelerado de una formulacion lfquida de conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado que comprende adicionalmente 9 mg/ml de alcohol bendlico o 3 mg/ml de m-cresol ademas de 20 mM de acetato sodico (pH 5,6), 150 mM de cloruro sodico, un 5 % de manitol y un 0,005 % de polisorbato 80 durante el almacenamiento del mismo, de acuerdo con la concentracion del conjugado de hGH de accion prolongada, que presenta el cromatograma de IE-HPLC para el analisis de la estabilidad de la muestra. Demuestra que las formulaciones lfquidas de conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado al que se anade un conservante tal como el alcohol bendlico mantiene una estabilidad similar que lo que no tienen conservantes (control).

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

En una realizacion, la presente invencion proporciona una formulacion lfquida de un conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada altamente concentrado, que comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz del conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada en un conservante, en el que la hormona de crecimiento humana (hGH) esta unida a una region Fc de inmunoglobulina, y un estabilizante libre de albumina, comprendiendo dicho estabilizador un tampon, un tensioactivo no ionico, un alcohol azucar y cloruro sodico como agente isotonico.

La formulacion lfquida del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado de la presente invencion comprende un estabilizante libre de albumina, que asegura una estabilidad en el conjugado de hGH de accion prolongada sin riesgo de contaminacion vmca. Ademas, es una formulacion simple que tiene una estabilidad de almacenamiento excelente, y por lo tanto permite una provision mas barata de farmacos en comparacion con otros estabilizadores o una formulacion secada por congelacion. Tambien , como la formulacion lfquida de la presente invencion comprende el conjugado de hGH de accion prolongada que tiene una durabilidad in vivo aumentada en comparacion con la protema tipo silvestre, puede mantener una actividad proteica in vivo durante un largo periodo de tiempo en comparacion con otras formulaciones de hGH comunes, y por lo tanto se puede utilizar como una formulacion farmacologicamente eficaz que asegura una alta estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion “conjugado de hGH de accion prolongada” se refiere a un conjugado en el que una hormona de crecimiento humana (hGH) peptfdica fisiologicamente activa esta unida a una region Fc de inmunoglobulina cuya actividad fisiologica tiene un aumento de duracion in vivo en comparacion con la hGH de tipo silvestre. La expresion 'de accion prolongada', como se utiliza en el presente documento significa que la actividad fisiologica tiene una duracion mas larga que un hGH de tipo silvestre. Como se utiliza en el presente documento, el termino 'conjugado' se refiere a una hGH que esta acoplada a una region Fc de inmunoglobulina. Como se utiliza en el presente documento, la expresion 'hormona de crecimiento humana (hGH)' se refiere a una hormona peptfdica que estimula el crecimiento, la reproduccion celular y la regeneracion en seres humanos. La informacion de la secuencia de hGH se puede obtener de una base de datos comun tal como NCBI GenBank. Ademas, el ambito de hGH en la presente invencion incluye una protema que posee una secuencia de aminoacidos que tiene una homologfa de secuencia del 70 % o mas, preferentemente del 80 % o mas, mas preferentemente del 90 % o mas, incluso mas preferentemente del 95 % o mas, y mas preferentemente del 98 % o mas respecto a la secuencia de aminoacidos de una hormona de crecimiento humana de tipo silvestre, a condicion de que tenga la actividad de la hGH. Tambien, a condicion de que su actividad biologica no cambie significativamente, se puede utilizar en la presente invencion cualquier mutante derivado de una hGH de tipo silvestre por sustitucion, eliminacion o insercion de restos de aminoacidos.

La hGH util en la presente invencion puede tener una secuencia de aminoacidos de una hGH, su variante, su derivado, o fragmentos de la misma.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion 'variante de hGH' se refiere a un peptido que tiene una o mas secuencias de aminoacidos diferentes de las de la hGH de tipo silvestre a la vez que presenta actividad de hGH. La variante de hGH se puede preparar por sustitucion, adicion, eliminacion, o modificacion de algunos aminoacidos de una hGH de tipo silvestre o una combinacion de las mismas.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion 'derivado de hGH' se refiere a un peptido que tiene al menos un 80 % de homologfa de secuencia de aminoacidos con una hGH de tipo silvestre y una actividad de hGH, en la que algunos grupos de restos de aminoacidos se han sustituido qmmicamente (por ejemplo, alfa-metilacion, alfahidroxilacion), eliminado (por ejemplo, desaminacion), o modificado (por ejemplo, N-metilacion).

Como se utiliza en el presente documento, la expresion 'fragmento de hGH' se refiere a un peptido en el que se anaden o eliminan uno o mas aminoacidos en el extremo N o el extremo C de hGH mientras mantenga la actividad de hGH, y los aminoacidos anadidos pueden no ser aminoacidos de origen natural (por ejemplo, aminoacidos tipo D).

Ademas, la hGH utilizada en la presente invencion puede obtenerse de una protema nativa o recombinante. Preferentemente, es la hGH recombinante que se prepara utilizando E. coli como celula huesped, pero no se limita a esta.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion 'region Fc de inmunoglobulina' se refiere a una parte de la inmunoglobulina excluyendo las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, la region constante de cadena pesada (CH1) y la region constante 1 de cadena ligera (CL|) de la inmunoglobulina. La region Fc de inmunoglobulina puede ser la region constante 2 de cadena pesada (CH2) y la region constante 3 de cadena pesada (CH3) de una inmunoglobulina y puede comprender adicionalmente la region bisagra en la region constante de cadena pesada, pero no se limita a esto. Tambien la region Fc de inmunoglobulina de la presente invencion puede ser una region Fc extendida que comprende una parte o toda la region constante 1 de cadena pesada (CH1) y/o la region constante 1 de cadena ligera (CL1) excepto las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina, a condicion de que tenga sustancialmente el mismo efecto o mejorado que la protema de tipo silvestre. Tambien, la region Fc de inmunoglobulina puede ser un fragmento en el que se ha eliminado una parte considerablemente larga de la secuencia de aminoacidos correspondiente con la CH2 y/o CH3. Es decir, la region Fc de inmunoglobulina de la presente invencion puede comprender 1) un dominio CH1, un dominio CH2 un dominio CH3 y un dominio CH4, 2) un dominio CH1 y un dominio CH2, 3) un dominio CH1 y un dominio CH3, 4) un dominio CH2 y un dominio CH3, 5) una combinacion de uno o mas dominios y una region bisagra de inmunoglobulina (o una parte de la region bisagra), y 6) un dfmero de un dominio o las regiones constantes de cadena pesada y una region constante de cadena ligera, pero no se limita a esto.

La region Fc de inmunoglobulina de la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos nativa y una secuencia de aminoacidos derivada de la misma (mutante) La secuencia de aminoacidos derivada se refiere a la secuencia que tiene una secuencia diferente de la secuencia nativa por eliminacion, insercion, sustitucion no conservadora o conservador de uno o mas restos de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos nativa, o combinaciones de la misma. Por ejemplo, en la Fc de IgG, los restos de aminoacidos de las posiciones 214 a 238, 297 a 299, 318 a 322, o 327 a 331 que se sabe que son importantes para la union proteica pueden ser dianas adecuadas para la modificacion.

Tambien, se pueden utilizar otros tipos de derivados, incluyendo los derivados en los que se ha eliminado una region capaz de formar un enlace disulfuro, unos pocos restos de aminoacidos en el extremo N de una Fc nativa, o se ha anadido un resto de metionina en el extremo N de una Fc nativa. Ademas, con el fin de eliminar una funcion de efector, se puede eliminar un sitio de union al complemento, por ejemplo, un sitio de union a C1q o sitio de citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC). Las tecnicas para preparar dichos derivados de la secuencia de la region Fc de inmunoglobulina se desvelan en los documentos WO 97/34631 y WO 96/32478. La sustitucion de aminoacidos en las protemas y peptidos, que no cambian la actividad general de la protema, se conocen en la tecnica (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Los cambios que se producen mas comunmente son Ala/Ser, Val/ Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly, en ambas direcciones. En algunos casos, la region Fc se puede modificar por fosforilacion, sulfacion, acrilacion, glicosilacion, metilacion, farnesilacion, acetilacion, amidacion, y similares. Los derivados de Fc mencionados anteriormente demuestran la misma actividad biologica de la region Fc de la presente invencion, y tiene una estabilidad estructural contra el color, pH y similares. Ademas, estas regiones Fc se pueden obtener de protemas intactas aisladas de seres humanos y otros animales incluyendo vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hamsteres, ratas y cobayas, o pueden ser recombinantes obtenidas de celulas animales transformadas o microorganismos o derivados de las mismas. Aqm, el procedimiento para la obtencion de regiones Fc de la inmunoglobulina nativa puede incluir el aislamiento de las inmunoglobulinas completas del cuerpo humano o animal y tratarlas con una proteasa. Cuando se utiliza la papama para digerir inmunoglobulinas, se escinden en las regiones Fab y Fc, y cuando se utiliza pepsina, la inmunoglobulina se escinde en pF'c y F(ab')2. Estos fragmentos se pueden separar utilizando una cromatograffa de exclusion por tamano para aislar Fc o pF'c. Preferentemente, una region Fc derivada de seres humanos es una region Fc de inmunoglobulina recombinante obtenida de un microorganismo.

Ademas, la region Fc de inmunoglobulina de la presente invencion puede estar en forma de cadenas de azucar nativas, cadenas de azucar mas largas que la forma nativa, cadenas de azucar mas cortas que la forma nativa, o una forma desglicosiladas. La extension o retirada de las cadenas de azucar de Fc de inmunoglobulina se puede hacer utilizando procedimientos comunes en la tecnica e incluyen procedimientos qmmicos, procedimientos enzimaticos, y procedimientos de modificacion genetica utilizando un microorganismo. La retirada de las cadenas de azucar de una region Fc de inmunoglobulina da como resultado un descenso brusco de su afinidad de union al C1q del primer componente de complemento C1 y por lo tanto se reduce o elimina la toxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo o la citotoxicidad dependiente del complemento, y se puede evitar la presencia de respuestas inmunitarias innecesarias in vivo. A este respecto, la region Fc de inmunoglobulina desglicosilada o aglicosilada es una forma mas preferible de vehmulo farmacologico para el objetivo de la presente invencion.

Como se utiliza en la presente invencion, el termino ‘desglicosilacion' se refiere a la retirada de restos de azucar de la region Fc utilizando una enzima, y el termino ‘aglicosilacion' se refiere al estado no glicosilado de la region Fc que se produce a partir de una procariota, preferentemente E. coli.

Entre tanto, la region Fc de inmunoglobulina se puede derivar de seres humanos u otros animales incluyendo vacas, cabras, cerdos, ratones, conejos, hamsteres, ratas, y cobayas, y preferentemente de seres humanos.

Ademas, la region Fc de inmunoglobulina puede derivarse de IgG, IgA, IgD, IgE e IgM, o los preparados por una combinacion o hubridos de los mismos. Preferentemente, se deriva de IgG o IgM, que estan entre las protemas mas abundantes de la sangre humana, y mas preferentemente de la IgG, que se sabe que aumenta la semivida de la union del ligando a la protema.

Entre tanto, el termino 'combinacion', como se utiliza en el presente documento, se refiere a una conjugacion entre un polipeptido que codifica regiones Fc de inmunoglobulinas de cadena sencilla. En la presente invencion, se pueden utilizar distintos tipos de hfbridos. Es decir, un hforido de dominios puede estar compuesto por uno a cuatro dominios seleccionados de entre el grupo que consiste en CH1, CH2, CH3 y CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE y Fc de IgD, y puede comprender una region bisagra.

El termino ‘hforido’, como se utiliza en el presente documento, se refiere a cuando una region Fc de inmunoglobulina de cadena sencilla posee las secuencias que codifican dos o mas fragmentos Fc de inmunoglobulinas de diferentes ongenes. En la presente invencion, la presente invencion, se pueden utilizar distintos tipos de hfbridos. Es decir, un hfbrido de dominios puede estar compuesto de uno a cuatro dominios seleccionados de entre el grupo que comprende CH1, CH2, CH3 y CH4 de Fc de IgG, Fc de IgM, Fc de IgA, Fc de IgE y Fc de IgD, y puede comprender una region bisagra.

Entre tanto, la IgG tambien se puede dividir en subclases, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y una combinacion o hfbrido de las mismas tambien es posible en la presente invencion, preferentemente las subclases IgG2 e IgG4, y mas preferentemente la region Fc de IgG4 que carece de una funcion efectora tal como de citotoxicidad dependiente de complemento.

En otras palabras, la region Fc de inmunoglobulina mas preferida del conjugado de la presente invencion es una region Fc no glicosilada derivada de IgG4 humana. La region Fc derivada de seres humanos actua como un antigeno en el cuerpo humano y por lo tanto es preferible a una region Fc derivada de un no humano que pueda producir respuestas inmunitarias no deseables talles como la produccion de nuevos anticuerpos contra el antigeno. El conjugado de hGH de accion prolongada de la presente invencion se puede preparar combinando una hGH preparada de una forma nativa o recombinante por cualquier procedimiento y una region Fc de inmunoglobulina preparada tratando la IgG de tipo silvestre conciertas proteasas o producida a partir de una celula transformada utilizando una tecnica de recombinacion.

Como el procedimiento de combinacion utilizado para este fin, se puede preparar el conjugado mediante entrecruzamiento de una hGH y una region Fc de inmunoglobulina utilizando un polfmero no peptfdico o producida como una protema de fusion en el que la hGH y la region Fc de inmunoglobulina se unen utilizando una tecnica de recombinacion. Es decir, el conjugado se puede producir en una forma en la que la hormona de crecimiento humana y la Fc de inmunoglobulina se unen mediante un engarce no peptfdico, o en forma de protema de fusion de hGH y Fc de inmunoglobulina. La protema de fusion comprende una forma en la que la hGH y la Fc de inmunoglobulina se combinan mediante un engarce peptfdico, pero no se limita a esto.

La expresion ‘polfmero no peptidico’, como se utiliza en el presente documento, se refiere a un polfmero biocompatible en el que dos o mas unidades de repeticion se combinan y las unidades de repeticion se conectan entre ellas por cualquier conjugacion, pero no un enlace peptfdico. En la presente invencion, se puede utilizar un polfmero no peptfdico de manera intercambiable con el engarce no peptidico.

El polfmero no peptfdico utilizando para el entrecruzamiento se puede seleccionar de entre el grupo que consiste en un polfmero biodegradable incluyendo polietilenglicol, polipropilenglicol, copolfmero etilenglicol-propilenglicol, poliol polioxietilado, alcohol polivimlico, un polisacarido, dextrano, polivinil etil eter, acido polilactico (PLA) o acido polilactico-glicolico (PLGa , un polfmero lipfdico, quitina, acido hialuronico, y una combinacion de los mismos, y preferentemente polietilenglicol (PEG), pero no se limita a estos. Ademas, sus derivados que ya se conocen en la tecnica y derivados que se pueden preparar facilmente por un procedimiento conocido en la tecnica puede incluirse en el ambito de la presente invencion.

Para la preparacion del conjugado de hGH de accion prolongada de la presente invencion, se desvelan referencias tales como la Patente Coreana N.° 0725315 en la presente invencion como una referencia citada. Los expertos en la tecnica pueden producir conjugados de hGH de accion prolongada de la presente invencion de acuerdo con la referencia, pero no se limita estos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion ‘formulacion lfquida de un conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado’ se refiere a una formulacion lfquida que comprende conjugados de hormona de crecimiento humana de accion prolongada en una cantidad farmaceuticamente eficaz. En general, la cantidad farmaceuticamente eficaz de hGH corresponde con aproximadamente 1 a 3 mg en un vial de un solo uso, pero no se limita a este.

Ademas, la concentracion de un conjugado de hGH de accion prolongada comprendido en la formulacion lfquida de la presente invencion vana desde 1 a 150 mg/ml, preferentemente desde 15 a 100 mg/ml, y mas preferentemente de 20 a 100 mg/ml, pero no se limita a estas.

La formulacion lfquida de un conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado de la presente invencion contiene una alta concentracion del conjugado de hGH por unidad de formulacion, comparado con la formulacion lfquida existente previamente con baja concentracion y por lo tanto puede llevar una forma estable de hGH en el cuerpo y almacenar una alta concentracion de conjugados de hGH sin producir una precipitacion proteica a diferencia de la formulacion lfquida existente previamente. Especialmente, incluso cuando la formulacion contiene 20 a 100 mg/ml de conjugados de hGH, todavfa se mantiene la estabilidad del conjugado.

La formulacion lfquida de un conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz del conjugado de hGH de accion prolongada y un estabilizante libre de albumina. Como se utiliza en el presente documento, el termino ‘estabilizante’ se refiere a una sustancia que permite que el conjugado de hGH de accion prolongada se almacene establemente. El estabilizador comprende un tampon, un tensioactivo no ionico, un alcohol azucar y cloruro sodico como agente isotonico. Con respecto a las protemas tipo conjugados de hGH de accion prolongada, la estabilidad del almacenamiento es importante para asegurar la precision de la dosis y la supresion de la formacion de antígenos potenciales contra el conjugado de hGH de accion prolongada.

Como se utiliza en el presente documento, el termino ‘tampon’ se refiere a una solucion que esta comprendida en el estabilizante de la presente invencion y actua para mantener estable el nivel de pH de la formulacion lfquida evitando un cambio brusco del pH para mantener la actividad del conjugado de hGH de accion prolongada estable. El tampon puede incluir una sal alcalina (sodio, potasio, fosfato, o sales monobasicas o sales dibasicas de los mismos), citrato sodico/acido cftrico, acetato sodico/acido acetico, asf como cualquier otro tampon de pH farmaceuticamente aceptable que se conoce en la tecnica, y una combinacion de los mismos. Para los objetivos de la presente invencion, el tampon es preferentemente un tampon de acetato, pero no se limita a este. La concentracion de bases de acetato que constituyen el tampon de acetato sodico esta preferentemente en el intervalo de 5 a 100 mM y mas preferentemente en un intervalo de 10 a 50 mM, pero no se limita a esto. Preferentemente, el pH del tampon esta en el intervalo de 4,0 a 7,0, mas preferentemente en el intervalo de 5,0 a 6,0, y mas preferentemente en el intervalo de 5,2 a 6,0. En un ejemplo de la presente invencion, se confirmo que el tampon de acetato sodico con un pH de 5,6 es adecuado para el mantenimiento de la estabilidad de conjugados de hGH de accion prolongada que tienen distintas concentraciones (Tabla 5).

Como se utiliza en el presente documento, la expresion ‘azucar alcohol' se refiere a un carbohidrato hidrogenado que esta comprendido en la formulacion lfquida de la presente invencion y actua para mejorar la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada. La concentracion de alcohol azucar en la presente invencion esta preferentemente en un intervalo de 1 al 10 % (p/v) de un volumen total de la formulacion, y mas preferentemente en un intervalo del 5 a 10 % (p/v), pero no se limita a estos El alcohol azucar utilizado en la presente invencion puede ser uno o mas alcoholes azucares seleccionados de entre el grupo que consiste en manitol y sorbitol, preferentemente manitol, pero no se limita a estos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion ‘agente isotonico' se refiere a un agente que mantiene una presion osmotica apropiada cuando se inyecta una solucion altamente concentrada de conjugado de hGH de accion prolongada en el cuerpo. El agente isotonico puede tener un efecto de estabilizar adicionalmente el conjugado de hGH de accion prolongada en solucion. Un ejemplo del agente isotonico es una sal inorganica hidrosoluble y preferentemente cloruro sodico. La concentracion de cloruro sodico utilizado en la presente invencion esta preferentemente en un intervalo de 5 a 200 mM, pero no se limita a este. Tambien dependiendo del tipo y cantidad de las sustancias comprendidas en la formulacion, la cantidad de agente isotonico incluido se puede ajustar de manera que la formulacion lfquida que comprende todos los ingredientes sea isotonica.

Como se utiliza en el presente documento, la expresion ‘tensioactivo no ionico' se refiere a una sustancia que reduce la tension superficial de la solucion proteica para evitar la absorcion o agregacion de protemas en una superficie hidrofoba. Ejemplos preferibles del tensioactivo que se puede utilizar en la presente invencion incluye tensioactivos no ionicos de tipo polisorbato y tipo poloxamero y una combinacion de los mismos, con preferencia por un tensioactivo no ionico tipo polisorbato. Ejemplos de los tensioactivos no ionicos tipo polisorbato son polisorbato 20, polisorbato 40, polisorbato 60 y polisorbato 80, y entre ellos se prefiere el polisorbato 80, pero no se limita a este. Entre tanto, no es apropiado anadir el tensioactivo no ionico a una alta concentracion a la formulacion lfquida, ya que una alta concentracion de tensioactivos no ionicos produce efectos de interferencia cuando se analiza la protema para determinar la concentracion proteica o estabilidad mediante procedimientos analfticos tales como un procedimiento espectrometrico UV o enfoque isoelectrico (IEF) y esto hace difmil determinar la estabilidad proteica con precision. Por lo tanto, la formulacion lfquida de la presente invencion puede comprender el tensioactivo no ionico preferentemente a una concentracion del 0,1 % (p/v) o menos, mas preferentemente en un intervalo de un 0,001 a 0,1 % (p/v), e incluso mas preferentemente en un intervalo de un 0,001 a 0,05 % (p/v), pero no se limita a estos. En un ejemplo de la presente invencion, se confirmo que cuando la concentracion de polisorbato 80 era de un 0,2 % (p/v) en un estabilizante que comprende un tampon de acetato, alcohol azucar, cloruro sodico como agente isotonico, y polisorbato 80, induce la precipitacion de un conjugado de hGH de accion prolongada despues de 2 semanas (Tabla 8).

El estabilizante de la presente invencion no contiene albumina.

Como una seroalbumina humana que se puede utilizar como estabilizador proteico se produce a partir de suero humano, existe un riesgo de que se contamine con virus patogeno derivado del ser humano. Ademas, la gelatina o la seroalbumina bovina puede producir enfermedades o puede inducir una respuesta alergica en algunos pacientes. El estabilizando libre de albumina de la presente invencion no contiene protemas heterologas tales como seroalbuminas derivadas del ser humano o animales ni gelatina purificada, y por lo tanto no tiene riesgo de infeccion vmca.

Preferentemente, el estabilizador de la presente invencion puede comprender adicionalmente azucares, alcoholes polifudricos o aminoacidos neutros.

Ejemplos preferidos de los azucares y azucares en alcoholes polifudricos que se puede incluir adicionalmente en la formulacion apara aumentar la estabilidad de almacenamiento del conjugado de hGH de accion prolongada son monosacaridos tales como manosa, glucosa, fucosa y xilosa, y polisacaridos tales como lactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa y dextrano. Ejemplos preferidos de polialcoholes incluyen el propilenglicol, polietilenglicol de bajo peso molecular, glicerol, propilenglicol de bajo peso molecular, y una combinacion de los mismos.

Ademas, la formulacion lfquida de la presente invencion puede comprender adicionalmente otros ingredientes o materiales que se conocen en la tecnica selectivamente ademas del tampon descrito anteriormente, agente isotonico, alcoholes azucares, y tensioactivos no ionicos, a menos de que disminuyan los efectos de la presente invencion.

La formulacion lfquida de la presente invencion comprende adicionalmente un conservante.

Como se utiliza en el presente documento, 'conservante' se refiere a una sustancia que reduce sustancialmente la contaminacion bacteriana de la formulacion. Especialmente, esta comprendido en la formulacion para facilitar la produccion de la formulacion para dosificacion multiple. Ejemplos de conservantes incluyen el cloruro de octadecildimetil-bencil amonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (mezcla de cloruro de alquilbencildimetilamonio que tiene una cadena alquilo larga), y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromaticos tales como el alcohol fenolico, alcohol butilico, y alcohol bendlico; alquil parabenos tales como metilparabeno o propilparabeno; catecol; resorcinol, ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol, pero no se limitan a estos. El conservante en la formulacion lfquida de la presente invencion es preferentemente el alcohol bendlico o el m-cresol, pero no se limita a estos. La concentracion del conservante esta preferentemente en un intervalo de 1 a 10 mg/ml.

En un ejemplo, de la presente invencion, la estabilidad de la region Fc de inmunoglobulina se examino a diferentes pH y tampones. En el caso del pH, la region Fc de inmunoglobulina era estable a un pH de 5,6 a 6,0, y a pH 5,6 la estabilidad era incluso mayor (Ejemplo 2 y Tabla 1). Entre los tampones de citrato sodico, acetato sodico, y de histidina, la estabilidad era mayor en tampon de acetato sodico (Ejemplo 3 y Tabla 2). Basandose en estos resultados, se preparo la composicion lfquida que comprendfa un conjugado de hGH de accion prolongada con una alta concentracion de 20 mg/ml o mas, tampon, cloruro sodico como agente isotonico, manitol como alcohol, y polisorbato 80 como tensioactivo. Cuando se utilizaba el acetato sodico como tampon, el conjugado no precipitaba incluso despues de 2 semanas. Tambien, en comparacion con un grupo de control, la estabilidad del conjugado era mayor que el grupo de control (Ejemplo 4). Ademas, se examino el efecto de concentracion de alcoholes azucares y tensioactivos comprendida en la formulacion lfquida de un conjugado de hGH de accion prolongada. Entonces se determino que el conjugado era estable en un 5 % a 10 % de manitol, y no precipitaba en un 0,2 % (p/v) o menor concentracion de polisorbato 80 (Ejemplo 5). Tambien se examino si la adicion de conservante en la formulacion lfquida de la presente invencion tema un efecto sobre la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada. Los resultados demuestran que la estabilidad del conjugado era similar a un grupo de control incluso cuando se anadfa un conservante tal como el alcohol bendlico o el cresol. Por lo tanto, se confirmo que la presente formulacion lfquida puede comprender adicionalmente un conservante si es necesaria una dosificacion repetida (Ejemplo 6). En otra realizacion, la presente invencion proporciona un procedimiento para la preparacion de una formulacion lfquida de un conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada altamente concentrado. El procedimiento de la presente invencion puede preparar una formulacion lfquida estable de un conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado, que comprende un conjugado de hGH de accion prolongada, y un estabilizante libre de albumina, comprendiendo dicho estabilizante el tampon, tensioactivo no ionico, alcohol azucar y cloruro sodico como agente isotonico.

El conjugado de hGH de accion prolongada, la formulacion lfquida, el tampon, alcohol azucar, agente isotonico y tensioactivo no ionico son los mismos que se han descrito anteriormente.

El procedimiento para la preparacion de la formulacion lfquida de un conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado puede comprender la etapa de mezclar el conjugado de hGH de accion prolongada con un estabilizante que comprende un tampon, un tensioactivo no ionico, un alcohol azucar y cloruro sodico como agente isotonico. Mas espedficamente, el procedimiento puede comprender la etapa de (a) producir un conjugado de hGH de accion prolongada o preparar el conjugado de hGH de accion prolongada producido; y (b) mezclar el conjugado de hGH de accion prolongada preparado en la etapa (a) con un estabilizante que comprende un tampon, un tensioactivo no ionico, un alcohol azucar y cloruro sodico como agente isotonico, pero no se limita a esto.

Ademas, mientras se mezcla el conjugado de hGH de accion prolongada con el estabilizante en la etapa (b) del procedimiento, se puede anadir adicionalmente un conservante, pero no se limita a esto.

Como la formulacion lfquida preparada por el procedimiento de la presente invencion comprende un conservante, tambien se puede utilizar para dosificacion multiple.

De acuerdo con los ejemplos de la presente invencion, un estabilizante que comprende un tampon de acetato sodico, cloruro sodico como agente isotonico, manitol como alcohol azucar, y polisorbato 80 como tensioactivo no produce precipitacion del conjugado incluso cuando se anade una alta concentracion del conjugado de hGH de accion prolongada manteniendo su estabilidad (Ejemplos 1 a 5). Es decir, el conjugado de hGH de accion prolongada a una concentracion alta de 20,0 mg/ml o mas puede ser estable en la formulacion lfquida de la presente invencion sin presentar precipitacion proteica. Tambien incluso cuando se anade alcohol bendlico o m-cresol como conservante a la formulacion lfquida, se mantiene la estabilidad. Por lo tanto, se confirmo que, si es necesaria una dosificacion repetida, el conservante se puede anadir adicionalmente la formulacion (Ejemplo 6 y Figura 2).

Modo de la invencion

De aqrn en adelante, la presente invencion se describe con mas detalle en referencia a Ejemplos. Sin embargo, estos Ejemplos son solo con fines ilustrativos, y la infeccion no pretende limitarse por estos Ejemplos.

Ejemplo comparativo 1: Preparacion del conjugado de hGH de accion prolongada

Se conjugo el ALD-PEG-ALD, que es un polietilenglicol con un peso molecular (PM) de aproximadamente 3,4 kDa que tiene un grupo aldehndo en ambos extremos, con hGH (PM 22 kDa), y entonces se unieron al extremo N de una region Fc aglicosilada derivada de IgG4 humana (PM 50 kDa). Mediante esto, se preparo y purifico el producto final conjugado hGH-PEG-Fc que es un conjugado de hGH de accion prolongada representativo de la presente invencion.

Ejemplo comparativo 2: Analisis de la estabilidad de la region Fc de inmunoglobulina a diferentes pH Se evaluo la estabilidad del polipeptido hGH y la region de Fc de inmunoglobulina que constituyen el conjugado de hGH de accion prolongada en diferentes condiciones. La estabilidad de la region Fc se comparo con diferentes pH en una formulacion lfquida que comprende un tampon, cloruro sodico, manitol, y polisorbato 80.

Se utilizo cada una de las composiciones de la Tabla 1 como tampon para la region Fc de inmunoglobulina, que entonces se almacenaron en el tampon al 40 °C durante 4 semanas, y se analizo la estabilidad de la inmunoglobulina utilizando una cromatograffa de intercambio ionico (IE-HPLC). En la tabla 2, IE-HPLC (%) indica la pureza residual de la region Fc de inmunoglobulina en comparacion con la pureza inicial, representada por (Area %/Area de inicio) en %.

Tabla 1

[Tabla 1]

Tabla 2

[Tabla 2]

(continuacion)

Como se muestra en la Tabla 2, la IE-HPLC (%) era del 67,9 % a un pH de 5,6 (n° 5) despues de 4 semanas, presentando la estabilidad mas alta de la region Fc de inmunoglobulina. Tambien, a un pH 4,8 a 5,2 (n° 1 a n° 3), la precipitacion proteica estaba inducida desde el inicio, por lo tanto, no se pudo analizar su estabilidad. Y a un pH de 5,4 (n° 4), la precipitacion se produda despues de 3 semanas.

Ejemplo comparativo 3: Analisis de la estabilidad de la inmunoglobulina en relacion al tampon Basandose en formulaciones disponibles en el mercado de hGH, se comparo la estabilidad de la region Fc de inmunoglobulina en diferentes tampones, incluyendo de acetato, citrato y de histidina que se utilizan comunmente como tampones.

Cada una de las composiciones de la Tabla 3 se utilizo como tampon para la region Fc de inmunoglobulina que se almacenaron entonces durante 3 semanas a 40 °C, y se analizo la estabilidad de la region Fc de inmunoglobulina utilizando una cromatograffa de intercambio ionico. En la Tabla 4, IE-HPLC (%) indica la pureza residual de la region Fc de inmunoglobulina en comparacion con la pureza inicial, representada por (Area %/Area de inicio) en %.

Tabla 3

[Tabla 3]

Tabla 4

[Tabla 4]

Como se muestra en la Tabla 4, cuando se utilizo el acetato sodico de pH 5,6 (n° 2) como tampon, la pureza residual de la region Fc de inmunoglobulina era del 88,9 % (1 semana), 77,6 % (2 semanas), y 68,2 % (3 semanas).

Estos resultados sugieren que cuando se utilizo el acetato sodico (n° 2) como tampon la estabilidad de la region Fc de inmunoglobulina era mayor que cuando se utilizaron el citrato sodico (n° 1) y la histidina (n° 3).

Ejemplo comparativo 4: Analisis de la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada en relacion a la concentracion proteica y el tampon

Utilizando los tampones examinados en el Ejemplo 3, se comparo la estabilidad de un conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado. Cada una de las composiciones de la Tabla 5 se utilizo como una formulacion ifquida para el conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado, que entonces se almaceno a 25 °C durante 4 semanas, y se analizo la estabilidad del conjugado utilizando una cromatograffa de intercambio ionico y una cromatograffa de exclusion por tamano (SE-HPLC).

En la Tabla 6, IE-HPLC (%) y SE-HPLC (%) indican la pureza del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado en el punto del analisis.

Tabla 5

[Tabla 5]

Tabla 6

[Tabla 6]

(continuacion)

Como se muestra en la Tabla 6, cuando se utilizaron 20 mM de acetato sodico con un pH 5,6 (n° 3, n° 6, n° 9) como tampon, despues de 4 semanas de almacenamiento, la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado era mayor que cuando se utilizaron 20 mM de citrato sodico de un pH 5,6 (n° 2, n° 5, n° 8). Tambien, con una concentracion de protema alta como de 39,0 mg/ml a 78 mg/ml, cuando se utilizaba el citrato sodico de pH 3,2 (n° 1, n° 4, n° 7) o citrato sodico de pH 5,6 (n° 2, n° 5, n° 8) como tampon, la protema comenzaba a precipitar despues de 2 semanas de almacenamiento y el nivel de precipitacion aumentaba despues de 3 semanas de almacenamiento.

Ejemplo comparativo 5: Analisis de la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado en relacion con la concentracion de alcohol azucar y tensioactivo

Utilizando la formulacion lfquida examinada en el Ejemplo 4 (que comprende 20 mM de acetato sodico con un pH de 5,6, 150 mM de cloruro sodico, un 5% (p/v) de manitol, un 0,005 % (p/v) de polisorbato 80), se examino la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado a diferentes concentraciones de alcohol azucar y tensioactivo. Aqu la concentracion de alcohol azucar y tensioactivo se selecciono para que estuvieran en el conjunto del intervalo maximo permitido por la formulacion disponible o sugerido por la institucion de aprobacion.

Cada una de las composiciones de la Tabla 7 se utilizo como una composicion lfquida para el conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado, que entonces se almacenaron a 25 °C durante 4 semanas, y se analizo la estabilidad del conjugado utilizando cromatograffa de intercambio ionico y cromatograffa de exclusion por tamano. En la Tabla 8, IE-HPLC (%) y SE-HPLC (%) indica la pureza del conjugado de hGH de accion prolongada en el momento del analisis.

Tabla 7

[Tabla 7]

(continuacion)

Tabla 8

[Tabla 8]

Como se muestra en la Tabla 8, cuando se utilizaron 20 mM de acetato sodico con un pH 5,6 junto con manitol y polisorbato 80, la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado era mayor en el control-1 y el control-2. Tambien, cuando la concentracion de polisorbato 80 era de un 0,2% (p/v), los grupos de ensayo n° 2, n° 3, n° 5 y n° 6 presentaban precipitacion proteica con cualquier concentracion despues de 2 semanas.

Ejemplo 6: Analisis de la estabilidad de conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado en relacion con un conservante

Utilizando la formulacion lfquida identificada en el Ejemplo 5 (que comprende 20 mM de acetato sodico con un pH de 5,6, 150 mM de cloruro sodico, un 5% (p/v) de manitol, un 0,005 % (p/v) de polisorbato 80), se examino la estabilidad del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado en relacion al conservante. Aqrn, como conservante representativo se utilizaron alcohol bendlico y m-cresol.

Espedficamente, cada una de las composiciones de la Tabla 9 se utilizo como una formulacion lfquida para el conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado, que se almacenaron entones a 25 °C durante 4 semanas, y se examino la estabilidad de la formulacion utilizando una cromatograffa de intercambio ionico y una cromatograffa de exclusion por tamano.

En la Tabla 10, IE-HPLC (%) y SE-HPLC (%) indican la pureza del conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado en el momento de la comparacion temprana.

Tabla 9

[Tabla 9]

Tabla 10

[Tabla 10]

Como se muestra en la Tabla 10, cuando se utilizaron 9 mg/ml de alcohol bendlico o 3 mg/ml de m-cresol como conservante, la estabilidad de la formulacion era similar a la del grupo de control.

Este resultado demuestra que incluso cuando la formulacion que comprende un conjugado de hGH de accion prolongada altamente concentrado de la presente invencion comprende un conservante, no afecta a la estabilidad de hGH. Por lo tanto, la formulacion de la prense invencion que comprende un conservante se pueden aplicar para la dosificacion repetida.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulacion Ifquida de un conjugado de hormona de crecimiento humana (hGH) de accion prolongada altamente concentrado, que comprende una cantidad farmaceuticamente eficaz del conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada en la que la hormona de crecimiento humana (hGH) esta unida a una region Fc de inmunoglobulina, un conservante, y un estabilizante libre de albumina, comprendiendo dicho estabilizante un tampon, un tensioactivo no ionico, un alcohol azucar y cloruro sodico como agente isotonico.

2. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el tampon es un tampon de acetato.

3. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la concentracion del conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada vana de 20 a 100 mg/ml.

4. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el alcohol azucar se selecciona de entre el grupo que consiste en manitol, sorbitol y una combinacion de los mismos.

5. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que el alcohol azucar se utiliza a una concentracion que vana del 1 al 10 % (p/v) del volumen total de la formulacion.

6. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el pH del tampon vana desde 5,0 a 6,0.

7. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el cloruro sodico se utiliza a una concentracion que vana desde 5 a 200 mM.

8. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el tensioactivo no ionico es polisorbato 80.

9. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el tensioactivo no ionico se utiliza a una concentracion que vana desde el 0,001 al 0,05 % (p/v) del volumen total de la formulacion.

10. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el estabilizador comprende adicionalmente uno o mas ingredientes seleccionados de entre el grupo que consiste en un azucar, un alcohol polihfdrico y un aminoacido.

11. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el conservante es un alcohol bendlico o mcresol.

12. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que el conservante se utiliza a una concentracion que vana desde 1 a 10 mg/ml.

13. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la region Fc de inmunoglobulina se deriva de IgG, IgA, IgD, IgE, o IgM,

preferentemente en la que cada dominio de la region Fc de inmunoglobulina es un hfbrido de dominios con diferentes ongenes que se derivan de una inmunoglobulina seleccionada de entre el grupo que consiste en IgG, IgA, IgD, IgE, e IgM; o

en la que la region Fc de inmunoglobulina es un dfmero o multfmero compuesto por una inmunoglobulina de cadena sencilla que consiste en dominios con el mismo origen.

14. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 13, en la que la region Fc de inmunoglobulina es una region Fc de IgG4, opcionalmente una region Fc de IgG4 aglicosilada humana.

15. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada es un conjugado en el que la hormona de crecimiento humana esta unida con la region Fc de inmunoglobulina mediante un polfmero no peptfdico, o utilizando una tecnica de recombinacion genetica.

16. La formulacion lfquida de acuerdo con la reivindicacion 15, en la que el polfmero no peptfdico se selecciona de entre el grupo que consiste en polfmeros biodegradables tales como polietilenglicol, polipropilenglicol, copolfmeros de etilenglicol y propilenglicol, polioles polioxietilados, alcohol polivimlico, polisacaridos, dextrano, polivinil etil eter, acido polilactico (^pL^a), y acido polilactico-glicolico (PLGA), polfmeros lipfdicos, quitinas, acido hialuronico, y una combinacion de los mismos, opcionalmente polietilenglicol.

17. Un procedimiento de preparacion de la formulacion lfquida de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende la mezcla de un conjugado de hormona de crecimiento humana de accion prolongada con un conservante y un estabilizante, comprendiendo dicho estabilizante un tampon, un alcohol azucar, un tensioactivo no ionico y cloruro sodico como agente isotonico.